DE69531666T2 - Verfahen zum Ausrichten von Makromolekülen durch Vorbeiführung eines Meniskus und Anwendung dafür - Google Patents

Verfahen zum Ausrichten von Makromolekülen durch Vorbeiführung eines Meniskus und Anwendung dafür Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ausrichtung von Makromolekülen, wie Polymeren, oder Makromolekülen mit biologischer Aktivität, insbesondere DNA, oder Proteinen. Die Erfindung betrifft gleichfalls die Anwendung dieser Methode in Verfahren zum Nachweis, zur Messung des intramolekularen Abstands, zur Trennung und/oder zur quantitativen Bestimmung eines Makromoleküls in einer Probe.
  • Die Konformation von Makromolekülen zu kontrollieren, stellt einen bedeutenden industriellen Einsatz dar, beispielsweise bei der Herstellung von Fängermolekülen oder kontrollierten Molekülzusammenlagerungen oder ferner bei Nachweis- und Analyseproblemen. Es kann interessant sein, über eine langgestreckte Molekülkonformation zu verfügen. Als Beispiel wurde in dem Falle, wo Polymere auf ein Substrat aufgepfropft sind, vorgeschlagen, diese durch Einwirkung eines elektrischen Felds, eine Strömung oder mit Hilfe von optischen Zangen zu strecken. Insbesondere auf dem Gebiet der Biologie eröffnet die Ausrichtung von DNA – durch Elektrophorese (Zimmerman und Cox, Nucl. Acid Res. 22, S. 492, 1994), freie Strömung (Parra und Windle, Nature Genetics, 5, S. 17, 1993 und WO 93/22463) oder in einem Gel (Schwartz et al., Science 262, S. 110, 1993, und U.S.-Patent 33531) oder mit Hilfe von optischen Zangen (Perkins et al., Science 264, S. 819, 1994, und auch U.S.-Patent 5079169) zahlreiche Möglichkeiten bei der Kartierung oder beim Nachweis von Pathogenen.
  • Diese Methoden erlauben im allgemeinen lediglich eine unvollkommene oder ferner vorübergehende Ausrichtung – d. h., dass eine Relaxation des Moleküls auftritt, sobald der äußere Zwang verschwunden ist. In dem Falle von optischen Zangen ist die Methode schwerfällig, auf ein einziges Molekül zu einem Zeitpunkt beschränkt und durch nicht qualifiziertes Personal schwierig auszuführen.
  • Es wurde eine besondere Technik zur Ausrichtung von DNA durch Strömung nach einer Zelllyse, dann Trocknung, vorgeschlagen (I. Parra und B. Windle und WO 93/22463). Die erhaltene Ausrichtung ist sehr unvollkom men und inhomogen und es werden zahlreiche, nicht ausgerichtete Bündel oder Knäuel beobachtet.
  • Die Erfindung hat ein originäres und einfaches Verfahren zur Ausrichtung von Makromolekülen auf der Oberfläche S eines Trägers zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man auf der Oberfläche S die Tripel-Linie S/A/B/ (Meniskus), welche aus dem Kontakt eines Lösemittels A mit der Oberfläche S und einem Medium B resultiert, sich verschieben lässt, wobei die Makromoleküle einen Abschnitt, insbesondere ein Ende, haben, der auf der Oberfläche S verankert ist, wobei der andere Abschnitt, insbesondere das andere Ende, sich in Lösung in dem Lösemittel A befindet.
  • Es wurde gemäß der Erfindung beobachtet, dass allein die Passage eines Meniskus über Moleküle, von denen ein Abschnitt auf einem Substrat verankert ist, wobei der Rest des Moleküls frei in Lösung verbleibt, es erlaubt, diese gleichförmig senkrecht zu dem in Bewegung befindlichen Meniskus auszurichten, wobei diese adsorbiert auf der Oberfläche hinter dem Meniskus verbleiben. Dieses Phänomen wird hier als "Molekülkämmen" ("peignage moleculaire") bezeichnet.
  • Genauer erfolgt das Strecken des freien Abschnitts des Moleküls durch die Passsage der Tripel-Linie S/A/B, welche den Meniskus zwischen der Oberfläche S, dem Lösemittel A und einem Medium B, welches ein Gas (im allgemeinen Luft) oder ein anderes Lösemittel sein kann, bildet.
  • In einer besonderen Ausführungsweise ist der Meniskus ein Wasser-Luft-Meniskus, d. h. dass das Lösemittel A eine wässrige Lösung ist und das Medium B Luft ist.
  • Außerdem ist es möglich, den Luft/Wasser-Meniskus, der hier eingesetzt wird, um das Molekül zu strecken, um andere Systeme, wie insbesondere Öl/Wasser oder Wasser/Tensid/Luft, zu erweitern.
  • Die Verschiebung des Meniskus kann durch ein jegliches Mittel zur Verschiebung bezüglich der Fluide A und B bezogen auf die Oberfläche S erfolgen. In einer Ausführungsweise kann die Oberfläche S von dem Lö semittel A zurückgezogen werden oder umgekehrt, das Lösemittel A kann von der Oberfläche S zurückgezogen werden.
  • Der Meniskus kann insbesondere mit Hilfe eines mechanischen, insbesondere pneumatischen Mittels, indem ein Gas angesaugt oder abgeblasen wird, oder insbesondere hydraulischen Mittels, indem das Lösemittel A oder das Medium B nach vorne gedrückt oder angesaugt wird, verschoben werden.
  • So kann die Verschiebung des Meniskus durch fortschreitende Verdampfung des Lösemittels A erfolgen.
  • Wenn die Verschiebung des Meniskus auf mechanischem Wege erfolgt, kann sie entweder durch Parallelverschiebung der Grenzfläche A/B oder durch Parallelverschiebung der Oberfläche S erfolgen.
  • In einer besonderen Ausführungsweise wird das Lösemittel zwischen zwei Trägern plaziert, von denen wenigstens einer dem Träger mit der Oberfläche S entspricht, und der Meniskus wird beispielsweise durch Verdampfung verschoben.
  • Man versteht hier unter "Träger" ein jegliches Substrat, dessen Zusammenhalt ausreichend ist, um der Passage des Meniskus zu widerstehen.
  • Der Träger kann wenigstens an der Oberfläche aus einem organischen oder anorganischen Polymer, einem Metall, insbesondere Gold, einem Metalloxid oder -sulfid, einem Halbleiterelement oder einem Halbleiterelementoxid, wie einem Oxid von Silicium, oder einer Kombination von diesen, wie Glas oder einer Keramik, gebildet werden.
  • Man kann insbesondere Glas, an der Oberfläche oxidiertes Silicium, Graphit, Glimmer und Molybdänsulfid aufführen.
  • Als "Träger" kann man einen einzigen Träger, wie einen Streifen, Kugeln, insbesondere aus Polymer, aber auch irgendwelche Formen, wie Stäbe, Fasern oder einen strukturierten Träger, und gleichfalls Teilchen, unabhängig davon, ob es sich um Pulver handelt, insbesondere Siliciumdioxidpulver, die außerdem magnetisch, fluoreszierend gemacht oder gefärbt sein können, wie dies im Bereich der verschiedenen Techniken der quantitativen Bestimmung bekannt ist, einsetzen.
  • Der Träger liegt vorteilhafterweise in Form von Platten vor. Der Träger weist vorzugsweise lediglich wenig oder gar keine Fluoreszenz auf.
  • Makromoleküle, wie irgendwelche Polymere, oder biologische Polymere, wie DNA, DNA oder Proteine, können durch irgendwie geartete Methoden auf einem Träger verankert werden.
  • Das auszurichtende Makromolekül kann unter den biologischen Makromolekülen, wie den Proteinen, insbesondere den Antikörpern, Antigenen, Liganden oder deren Rezeptoren, den Nukleinsäuren, DNA, DNA oder PNA, den Lipiden, den Polysacchariden und deren Derivaten, ausgewählt werden.
  • Es wurde gemäß der Erfindung beobachtet, dass die Streckkraft örtlich in der unmittelbaren Umgebung des Meniskus wirkt. Sie ist unabhängig von der Länge des Moleküls, der Anzahl von verankerten Molekülen und, in einem breiten Bereich, von der Geschwindigkeit des Meniskus. Diese Merkmale sind besonders interessant, um die Moleküle auf homogene und reproduzierbare Weise auszurichten.
  • Man kann gemäß der Erfindung grenzflächenaktive Elemente dem Lösemittel A und/oder dem Medium B zusetzen, die die Eigenschaften der Grenzflächen modifizieren werden. Gemäß der Erfindung kann das Strecken tatsächlich durch die Zugabe von grenzflächenaktiven Mitteln oder Tensiden oder durch eine adäquate Oberflächenbehandlung kontrolliert werden.
  • Eine zu große Anziehung zwischen Oberfläche und Makromolekül (beispielsweise ein zu hohes Adsorptionsniveau) kann die Ausrichtung der Moleküle durch den Meniskus behindern, indem diese an der Oberfläche in einem Zustand, welcher nicht notwendigerweise gestreckt ist, adsorbiert bleiben. Die Oberfläche weist vorzugsweise einen geringen Adsorptionsgrad bezogen auf das Makromolekül auf derart, dass allein die verankerten Moleküle ausgerichtet werden, wobei die anderen durch den Meniskus mitgerissen werden.
  • Indessen kann man mit den Adsorptionsunterschieden zwischen einem Abschnitt des Makromoleküls, insbesondere dessen Enden, und dessen anderen Abschnitten (insbesondere für lange Moleküle, wie DNA oder Kollagen) spielen, um durch Adsorption die Moleküle durch einen Abschnitt, insbesondere deren Ende(n), allein, wobei der Rest des Moleküls frei in Lösung verbleibt, auf einer sehr großen Vielzahl von Oberflächen zu verankern und diese durch Passage des Meniskus, wie zuvor beschrieben, auszurichten.
  • Die Adsorption eines Makromoleküls auf einer Oberfläche kann leicht mit Hilfe des pH oder des Ionengehalts des Mediums oder einer elektrischen Spannung, mit welcher die Oberfläche beaufschlagt wird, kontrolliert werden. Man verändert beispielsweise die Oberflächenladungen und die elektrostatischen Wechselwirkungen (abstoßende oder anziehende) zwischen der Oberfläche und dem Molekül, was es erlaubt, von einem Zustand vollständiger Adsorption des Moleküls auf der Oberfläche zu einem vollständigen Fehlen von Adsorption zu gelangen. Zwischen diesen beiden extremen Fällen existiert ein Spektrum von Kontrollparametern, wo die Adsorption bevorzugt durch das Ende der Moleküle erfolgt und welche man folglich mit Vorteil einsetzen wird, um diese auf der Oberfläche zu verankern und diese dann durch die Passage des Meniskus auszurichten.
  • Die Moleküle, sind sie einmal ausgerichtet, haften stark an der Oberfläche. Im Falle von DNA konnten diese durch Fluoreszenz mehrere Monate nach ihrer Ausrichtung beobachtet werden.
  • Die Erfindung unterscheidet sich folglich sehr stark von dem von Parra und Windle vorgeschlagenen Verfahren, denn die Moleküle werden gemäß der Erfindung auf der Oberfläche verankert, dann durch die Passage des Meniskus gleichförmig ausgerichtet, wohingegen in dem Verfahren von Parra und Windle eine hydrodynamische Strömung eingesetzt wird, um die Moleküle auf inhomogene Weise zu Strecken, die auf nicht-spezifische Weise an der Oberfläche adsorbieren werden.
  • Andere Techniken können ebenfalls zur Streckung und Ausrichtung von Molekülen führen. So kann eine dynamische Orientierung von in Lösung befindlichen, an einem Ende verankerten Molekülen durch Elektrophorese oder durch hydraulische Strömung erhalten werden. Gleichwohl zeigen die beobachteten Ergebnisse, dass diese Techniken viel weniger leistungsfähig sind als die Verwendung des Meniskus.
  • Unter "Verankerung" des Makromoleküls auf der Oberfläche soll man eine aus einer chemischen Reaktivität resultierende Anheftung ebenso gut durch ein kovalentes Verbindungsglied wie durch ein nicht-kovalentes Verbindungsglied, wie eine Bindung, welche aus physikalisch-chemischen Wechselwirkungen resultiert, wie die Adsorption, wie vorstehend beschrieben, verstehen.
  • Diese Verankerung des Makromoleküls kann direkt auf (oder mit) der Oberfläche oder indirekt, d. h. durch das Zwischenglied eines Verbindungsglieds (Linkers), wie eines anderen Moleküls, insbesondere eines anderen Moleküls mit biologischer Aktivität, erfolgen. Wenn die Verankerung auf indirekte Weise erfolgt, kann das Makromolekül chemisch auf das Verbindungsglied aufgepfropft werden oder auf physikalisch-chemische Weise mit dem Verbindungsglied wechselwirken, insbesondere wenn das zwischengeschaltete Verbindungsglied ein Molekül mit biologischer Aktivität ist, welches das Makromolekül erkennt und mit diesem wechselwirkt.
  • Bei einer Ausführungsweise sind das Makromolekül und das Verbindungsglied alle beide Moleküle mit biologischer Aktivität, die Wechselwirken, wie Antigen bzw. Antikörper, komplementäre Nukleinsäuren oder Lipide. In diesen Fällen besteht die nicht-kovalente Anheftung des Makromoleküls in einer Bindung vom Typ Antigen-Antikörper, Ligand-Rezeptor, Hybridisierung zwischen komplementären Nukleinsäurefragmenten oder hydrophobe oder hydrophile Wechselwirkung zwischen Lipiden.
  • Man zieht so Nutzen aus der sehr großen Spezifität und der sehr großen Selektivität von bestimmten biologischen Reaktionen, insbesondere den Antigen/Antikörper-Reaktionen, den DNA- oder DNA-Hybridisierungsreaktionen, den Inter-Protein-Reaktionen oder Reaktionen vom Typ Avidin/ Streptavidin/Biotin ebenso wie den Reaktionen von Liganden und von deren Rezeptoren.
  • So kann man, um die direkte oder indirekte Verankerung des Makromoleküls auf der Oberfläche S zu bewirken, eine feste Oberfläche einsetzen, welche bestimmte Spezifitäten aufweist. Es ist insbesondere möglich, bestimmte vorbehandelte Oberflächen einzusetzen, welche es erlauben, bestimmte Proteine oder DNA, unabhängig davon, ob sie modifiziert worden ist oder nicht, anzuheften.
  • Solche Oberflächen sind (beispielsweise Covalink, Costar, Estapor, Bangs, Dynal) in verschiedenen Formen, die auf ihrer Oberfläche beispielsweise COOH-, NH2- oder OH-Gruppen aufweisen, kommerziell erhältlich.
  • Man kann die DNA dann mit einer reaktiven Gruppe, Amin zum Beispiel, funktionalisieren und eine Reaktion mit diesen Oberflächen vornehmen. Diese Methoden erfordern indessen eine spezielle Funktionalisierung der anzuheftenden DNA.
  • Es wurde gleichfalls eine Technik beschrieben, die die Verankerung von DNA ohne vorab erfolgende Behandlung erlaubt. Dieses Verfahren besteht darin, ein freies Phosphat des 5'-Endes des DNA-Moleküls mit einem sekundären Amin der Oberfläche (NH-Oberfläche Covalink) reagieren zu lassen.
  • Die Verankerung durch Adsorption kann durch Adsorption des Endes des Moleküls erfolgen, indem die Oberflächenladung mit Hilfe des pH, des Ionengehalts des Mediums oder der Anwendung einer elektrischen Spannung auf die Oberfläche kontrolliert wird unter Berücksichtigung der Adsorptionsunterschiede zwischen den Enden des Moleküls und seinem dazwischenliegenden Abschnitt. Gemäß der Erfindung wurden auf diese Weise beispielsweise nicht-funktionalisierte DNA-Moleküle auf Oberflächen, welche mit Molekülen bedeckt waren, deren Ende eine Vinyl- oder Amingruppe bildete, wie Moleküle von Polylysin, oder unterschiedlichen Oberflächen, wie Glas, die mit Molekülen vom Silan-Typ, deren Ende Vinyl- oder Amingruppen bildeten, bedeckt waren, oder ferner vorab in einem Säurebad gereinigten Glasplättchen verankert. In diesem letzteren Falle weist die Oberfläche des Glases tatsächlich SiOH-Gruppen auf.
  • In allen diesen Fällen wird der pH-Bereich, innerhalb von welchem die DNA verankert wird, so gewählt, dass er zwischen einem Zustand vollständiger Adsorption und einem Fehlen von Adsorption, wobei dieser Letztere bei einem basischeren pH vorliegt, liegt. Es versteht sich, dass diese Technik sehr allgemein ist und durch den Fachmann auf diesem Gebiet auf sehr zahlreiche Arten von Oberflächen ausgedehnt werden kann.
  • Man kann die DNA auch mit einer ersten reaktiven Gruppe oder einem Protein P0 funktionalisieren, um diese(s) mit einer Oberfläche, die mit einer zweiten reaktiven Gruppe oder einem Protein P1, welche(s) in der Lage ist, jeweils spezifisch miteinander zu reagieren, d. h. beispielsweise P1 mit P0, bedeckt ist, reagieren zu lassen. Das Paar P0/P1 kann beispielsweise ein Paar vom Typ Biotin/Streptavidin (Zimmerman und Cox) oder Digoxigenin/gegen Digoxigenin gerichteter Antikörper (anti-DIG) (Smith et al., Science 258, 1122 (1992)) sein.
  • Die Verankerungsoberflächen weisen vorzugsweise einen niedrigen Fluoreszenzgrad auf, damit sie den Nachweis der Moleküle nach deren Ausrichtung nicht behindern, insbesondere wenn dieser durch Fluoreszenz erfolgt.
  • Gemäß der Erfindung wird man vorzugsweise einen festen Träger einsetzen, welcher unter den Reaktionsbedingungen eine Oberfläche aufweist, welche eine Affinität für nur einen Teil des Makromoleküls aufweist, wobei der Rest von diesem frei in Lösung verbleibt.
  • Bei einer Ausführungsweise setzt man einen festen Träger ein, welcher an der Oberfläche wenigstens eine Schicht aus einer organischen Verbindung aufweist, welche auf der Außenseite der Schicht eine exponierte Gruppe oder Gruppierung mit einer Affinität für einen Molekültyp mit biologischer Aktivität, der das Makromolekül selbst oder ein Molekül, welches dieses erkennt und/oder mit diesem wechselwirkt, sein kann, präsentiert.
  • Der Träger kann folglich eine Oberfläche aufweisen, die mit einer reaktiven Gruppe oder einem Molekül mit biologischer Aktivität bedeckt ist.
  • Unter "Affinität" soll man hier ebenso eine chemische Reaktivität wie auch eine Adsorption irgendeiner Art, dies unter den etwaigen Bedingungen einer Anheftung der Moleküle an die modifizierte oder nicht-modifizierte exponierte Gruppe oder Gruppierung, verstehen.
  • Bei einer Ausführungsweise ist die Oberfläche im wesentlichen kompakt, d. h. sie begrenzt den Zugang des Makromoleküls mit biologischer Aktivität zu den inneren Schichten und/oder zu dem Träger, dies um die nicht-spezifischen Wechselwirkungen zu minimieren.
  • Man kann auch Oberflächen einsetzen, welche bedeckt sind mit einer exponierten reaktiven Gruppierung (beispielsweise NH2, COOH, OH, CHO) oder einem Makromolekül mit biologischer Aktivität (beispielsweise: Proteine, wie Streptavidin oder Antikörper, Nukleinsäuren, wie Oligonukleotide, Lipide, Polysaccharide und deren Derivate), welche s) in der Lage ist, einen gegebenenfalls modifizierten Abschnitt des Moleküls anzuheften.
  • Beispielsweise sind Oberflächen, die mit Streptavidin oder einem Antikörper gemäß bekannten Verfahren ("Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S.C. Wong, CRC Press (1991)) bedeckt sind, in der Lage, ein Makromolekül zu binden, welches an einer besonderen Stelle ein Biotin oder ein Antigen aufweist bzw. präsentiert.
  • Ebenso können Oberflächen, die derart behandelt worden sind, dass sie einzelsträngige Oligonukleotide präsentieren, dazu dienen, daran DNA/RNA-Moleküle, welche eine komplementäre Sequenz aufweisen, zu verankern.
  • Unter den Oberflächen, welche eine reaktive exponierte Gruppierung umfassen, kann man jene aufführen, bei denen die exponierte Gruppe eine Gruppierung -COOH, -CHO, -NH2, -OH oder eine Vinylgruppe, welche eine Doppelbindung -CH=CH2 umfasst, welche als solche eingesetzt wird oder die aktiviert werden kann, um insbesondere die Gruppen -CHO, -COOH, -NH2 oder -OH zu ergeben, ist.
  • Die Träger mit hoch spezifischen Oberflächen gemäß der Erfindung können durch das Ausführen von verschiedenen Verfahren erhalten werden. Man kann als Beispiel aufführen:
    • (A) eine Schicht von kohlenstoffhaltigem, gegebenenfalls verzweigtem Polymer mit einer Dicke von wenigstens 1 nm, welche reaktive Gruppen, wie nachfolgend definiert, aufweist, und
    • (B) Oberflächen, welche durch Abscheidung oder Verankerung von einer oder mehreren Molekülschichten auf einem festen Träger erhalten werden, wobei diese durch die Bildung von aufeinanderfolgenden Schichten, die durch nicht-kovalente Bindungen angeheftet werden, als nicht einschränkendes Beispiel die Langmuir-Blodgett-Filme, oder durch selbsttätige Molekülzusammenlagerung, wobei dies die Bildung einer durch kovalente Bindungen angehefteten Schicht erlaubt, erhalten werden können.
  • In dem ersten Falle kann die Oberfläche durch Polymerisation von wenigstens einem Monomer, welches an der Oberfläche des Polymers die exponierte Gruppierung erzeugt, oder ebenso durch partielle Depolymerisation der Oberfläche eines Polymers, um die exponierte Gruppierung zu erzeugen, oder ferner durch Abscheidung von Polymer erhalten werden.
  • In diesem Verfahren weist das gebildete Polymer Vinylbindungen auf, wie ein Polyen-Derivat, insbesondere Oberflächen von Typ synthetischen Kautschuks, wie Polybutadien, Polyisopren oder Naturkautschuk.
  • In dem zweiten Falle umfasst die hoch spezifische Oberfläche:
    • – auf einem Träger eine im wesentlichen monomolekulare Schicht einer organischen Verbindung von langgestreckter Struktur, welche wenigstens aufweist:
    • eine Anheftungsgruppe, die eine Affinität für den Träger aufweist, und
    • eine exponierte Gruppierung, die keine oder nur geringe Affinität für den Träger und die Anheftungsgruppe unter den Anheftungsbedingungen aufweist, aber gegebenenfalls, nach einer chemischen Modifizierung nach der Anheftung, eine Affinität für einen biologischen Molekültyp aufweist.
  • Die Anheftung kann zuallererst vom nicht-kovalenten Typ, insbesondere vom Typ hydrophil/hydrophil und hydrophob/hydrophob, wie in den Filmen von Langmuir-Blodgett (K. B. Blodgett, J. Am. Chem. Soc. 57, 1007 (1935), sein.
  • In diesem Falle wird die exponierte Gruppierung oder die Anheftungsgruppe, seien sie hydrophil, seien sie hydrophob, insbesondere Alkyl- oder Halogenalkylgruppen, wie CH3, CF3, CH F3, CH2F, sein, wobei die andere Gruppe hydrophil ist.
  • Die Anheftung kann gleichfalls vom kovalenten Typ sein; die Anheftungsgruppe wird dann auf dem Träger chemisch reagieren.
  • Bestimmte Oberflächen mit nahekommender Struktur wurden bereits auf dem Gebiet der Elektronik erwähnt, insbesondere wenn die Anheftungen kovalent sind, L. Netzer und J. Sagiv, J. Am. Chem. Soc. 105, 674 (1983) und US-A-4 539 061.
  • Unter den Anheftungsgruppen kann man insbesondere die Gruppierungen vom Metall- oder Halbleiteralkoxid-Typ, beispielsweise Silan, insbesondere Chlorsilan, Silanol, Methoxy- und Ethoxysilan, Silazan, wie auch die Phosphat-, Hydroxy-, Hydrazid-, Hydrazin-, Amin-, Amid-, Diazonium-, Pyridin-, Sulfat-, Sulfonsäure-, Carbonsäure-, Boronsäure-, Halogen-, Säurehalogenid-, Aldehydgruppen aufführen.
  • Als Anheftungsgruppe wird man insbesondere bevorzugt Gruppen einsetzen, welche in der Lage sind, in Querrichtung mit einer äquivalenten, in der Nachbarschaft befindlichen Gruppe zu reagieren, um die quer verlaufenden Bindungen bereitzustellen; es wird sich beispielsweise um Derivate vom Metall- oder Halbleiteralkoxid-Typ, beispielsweise Silan, insbesondere Dichlorsilan, Trichlorsilan, Dimethoxysilan oder Diethoxysilan und Trimethoxy- oder Triethoxysilan, handeln.
  • Die Wahl der Anheftungsgruppe wird selbstverständlich von der Natur des Trägers abhängen; die Gruppierungen vom Silan-Typ sind für die kovalente Anheftung auf Glas und Siliciumdioxid gut angepasst.
  • Was die exponierten Gruppierungen angeht, werden diese, und unabhängig von der Oberfläche, vorzugsweise unter den ethylenischen, acetylenischen Gruppierungen oder aromatischen Resten, den primären, tertiären oder sekundären Aminen, den Estern, den Nitrilen, den Aldehyden, den Halogenen ausgewählt. Es kann sich aber insbesondere um die Vinylgruppe handeln; tatsächlich kann diese entweder nach der Anheftung chemisch modifiziert werden, um beispielsweise zu einer Carboxylgruppe oder Derivaten von Carboxylgruppen, wie Alkohol-, Aldehyd-, Keton-, Säure-, primären, sekundären oder tertiären Amingruppen, zu gelangen, oder zu einer direkten pH-abhängigen Verankerung der biologischen Makromoleküle, wie Nukleinsäuren und Proteinen, ohne chemische Modifizierung der Oberfläche oder der Makromoleküle führen.
  • Die Ketten, die die exponierte Gruppierung mit der Anheftungsgruppe verbinden, sind vorzugsweise Ketten, welche wenigstens 1 Kohlenstoffatom, vorzugsweise mehr als 6 und im allgemeinen 3 bis 30 Kohlenstoffatome umfassen.
  • Was den Träger selbst betrifft, setzt man allgemein bevorzugt Glas, an der Oberfläche oxidiertes Silicium, ein Polymer oder Gold mit oder ohne Vorbehandlung der Oberfläche ein.
  • Man kann vorteilhafterweise im Falle von Glas oder Siliciumdioxid die bekannten Oberflächenfunktionalisierungstechniken, welche Silanderivate einsetzen, beispielsweise: Si-OH + Cl3-Si-R-CH=CH2 liefert Si-O-Si-R-CH=CH2, wobei R beispielsweise aus (CH2)4 besteht, einsetzen. Eine solche Reaktion ist in der Literatur bekannt, mit einer Verwendung von ultrareinen Lösemitteln. Die Reaktion führt zu einem Teppich von Molekülen, die ihr C=C-Ende auf der Oberfläche exponiert nach Außen präsentieren.
  • In dem Falle von Gold, wobei dieses gegebenenfalls in Form einer dünnen Schicht auf einem Substrat vorliegt, setzen die bekannten Techniken zur Oberflächenfunktionalisierung Thiolderivate, beispielsweise: Au + HS-R-CH=CH2 liefert Au-S-R-CH=CH2, wobei R beispielsweise aus (CH2)4 besteht, ein. Eine solche Umsetzung ist in flüssigem Medium beschrieben worden und führt, ebenso wie die vorangegangene Trichlorsi lan-Siliciumdioxid-Reaktion, zu einem Teppich von Molekülen, welche ihr C=C-Ende auf der Oberfläche exponiert nach Außen präsentieren.
  • Selbstverständlich umfasst die Terminologie des "Trägers" ebenso eine einzige Oberfläche, wie einen dünnen Streifen, aber gleichfalls Teilchen, unabhängig davon, ob es sich um Siliciumdioxidpulver oder Polymerkugeln handelt, und auch irgendwelche Formen, wie Stäbe, Fasern oder einen strukturierten Träger, die außerdem magnetisch, fluoreszierend gemacht oder gefärbt sein können, wie dies im Rahmen der verschiedenen Techniken der quantitativen Bestimmung bekannt ist.
  • Der Träger wird vorzugsweise so ausgewählt, dass er nicht oder nur wenig fluoreszierend ist, wenn der Nachweis durch Fluoreszenz erfolgt.
  • Die gemäß den obigen Modalitäten (A) und (B) erhaltenen Oberflächen weisen auf:
    • (i) ein sehr geringes Ausmaß von eigener Fluoreszenz, wenn dies erforderlich ist, einen geringeren Fluoreszenz-Hintergrund (einer typischen Fläche von 100 × 100 μm) als das Fluoreszenzsignal eines einzelnen nachzuweisenden Moleküls;
    • (ii) die Möglichkeit, isolierte Moleküle mit einem S/N-Verhältnis unabhängig von der Anzahl von Molekülen nachzuweisen, was dank unterschiedlicher Techniken mit hohem S/N-Verhältnis, welche weiter unten beschrieben werden und auf der Identifizierung des Vorhandenseins eines makroskopischen Markers, welcher eine schwache nicht-spezifische Wechselwirkung mit der Oberfläche aufweist, beruhen, möglich ist.
  • Die so erhaltenen Oberflächen sind vorzugsweise mit einem Makromolekül mit biologischer Aktivität bedeckt, das ausgewählt ist unter:
    • – den Proteinen,
    • – den Nukleinsäuren,
    • – den Lipiden,
    • – den Polysacchariden und deren Derivaten.
  • Unter den Proteinen kann man die Antigene und die Antikörper, die Liganden, die Rezeptoren, aber gleichfalls Produkte vom Typ Avidin oder Streptavidin wie auch die Derivate dieser Verbindungen aufführen.
  • Unter den RNAs und DNAs kann man gleichfalls die α,β-Derivate wie auch die Thio-Derivate und die gemischten Verbindungen, wie die PNA, aufführen.
  • Man kann gleichfalls gemischte Verbindungen, wie beispielsweise die Glycopeptide und die Lipopolysaccharide, oder ebenso andere Elemente, wie insbesondere Viren, Zellen, oder chemische Verbindungen, wie Biotin, anheften.
  • Die Anheftung der biologischen Makromoleküle kann kovalent oder nicht-kovalent, beispielsweise durch Adsorption, Wasserstoffbrückenbindungen, beispielsweise hydrophobe, ionische Wechselwirkungen, in welchem Falle man vorteilhafterweise eine Brückenbildung ("cross-linking", Vernetzung) zwischen den aufgepfropften Molekülen durch die bekannten Methoden ("Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S.C. Wong, CRC Press (1991)) vornehmen könnte, und dies, um ihren Zusammenhalt zu verstärken, erfolgen.
  • Wie dies zuvor erwähnt worden ist, ist es möglich, über eine exponierte Gruppierung zu verfügen, die die direkte Reaktion mit den Molekülen mit biologischer Aktivität erlaubt, aber es ist gleichfalls möglich, vorzusehen, dass die exponierte Gruppe nach der Anheftung behandelt wird, um, wie dies zuvor bereits angegeben worden ist, in einen Hydroxy-, Amin-, Alkohol-, Aldehyd-, Keton-, COOH-Rest oder ein Derivat dieser Gruppen vor der Anheftung des biologischen Moleküls umgewandelt zu werden.
  • Wenn solche Gruppen exponiert worden sind, sind die Techniken zur Anheftung von beispielsweise Proteinen und/oder DNA bekannt; es handelt sich tatsächlich um Reaktionen, die an Oberflächen ausgeführt werden, die bereits im Rahmen der biologischen Analysen eingesetzt werden, insbesondere an Costar-Oberflächen und Nunc-Oberflächen oder Mikrokugeln, wie Estapor, Bang und Dynal zum Beispiel, auf welchen man Moleküle von biologischem Interesse, beispielsweise DNA, RNA, PNA, Proteine oder Antikörper, verankert.
  • In dem Falle, wo die exponierte Gruppierung ein Rest -CH=CH2 ist, welche nachfolgend als "Oberflächen-C=C" oder "Oberfläche mit ethylenischer Bindung" bezeichnet wird, existiert kein Dokument, welches die direkte Verankerung insbesondere von DNA oder Proteinen erwähnt.
  • Im Rahmen der Erfindung wurde gezeigt, dass diese Oberflächen eine stark pH-abhängige Reaktivität aufweisen. Diese Besonderheit erlaubt es, die Nukleinsäuren oder die Proteine zu verankern, indem pH-Bereiche eingesetzt werden, und häufig mit einer Reaktionsgeschwindigkeit, die durch den pH gesteuert werden kann.
  • Man kann die Verankerung von DNA durch ihr Ende auf einer Oberfläche, welche Gruppen mit ethylenischer Doppelbindung aufweist, ausführen, indem die DNA bei einem pH unter 8 mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird.
  • Die Reaktion wird insbesondere bei einem pH zwischen 5 und 6 ausgeführt, dann bei pH 8 gestoppt.
  • So ist für DNA bei pH 5,5 die Verankerungsreaktion in einer Stunde vollständig abgelaufen (wenn sie nicht durch die Diffusion begrenzt wird) und erfolgt durch die Enden. Im Gegenzug ist bei pH 8 die Verankerung sehr gering (Reaktionsgeschwindigkeit um 5 bis 6 Größenordnungen geringer). Dieser pH-abhängige und für die Enden spezifische Verankerungseffekt bedingt eine Verbesserung bezogen auf die anderen Oberflächen, die eine Funktionalisierung der DNA (Biotin, DIG, NHS, ...) oder spezielle Reagenzien (Carbodiimid, Dimethylpimelidat), die eine Peptid- oder Phosphorimidbindung zwischen -NH2 und -COOH oder -POOH realisieren, erfordern.
  • Man kann die Verankerung von DNA auch durch Adsorption von deren Enden allein auf einer Oberfläche, welche mit Polylysin oder einer Silangruppe, deren Ende eine Amingruppe bildet, bedeckt ist, realisieren.
  • Um die Verankerung von DNA durch ihr Ende auf einer mit einer Amingruppe bedeckten Oberfläche zu realisieren, bringt man die DNA bei einem pH zwischen 8 und 10 mit der Oberfläche in Kontakt.
  • Ebenso kann man die Verankerung von DNA durch ihr Ende auf einer zuvor in einem Säurebad behandelten Glasoberfläche ausführen, indem man die DNA bei einem pH zwischen 5 und 8 mit der Oberfläche in Kontakt bringt.
  • Es versteht sich von selbst, dass die Erfindung in dem gleichen Sinne die gegebenenfalls pH-abhängige Verankerung aller Makromoleküle von biologischem Interesse impliziert.
  • Ebenso können diese Oberflächen Proteine direkt verankern (Protein A, anti-DIG, Antikörper, Streptavidin u.s.w.). Es ist beobachtet worden, dass (i) die Aktivität des Moleküls bewahrt werden kann und (ii) dass die Reaktivität der hergestellten Oberfläche (anfänglich C=C) vollständig verborgen wird, um einzig der Reaktivität des Moleküls von Interesse Platz zu lassen. Es ist folglich möglich, ausgehend von einer anfänglich relativ breiten Reaktivität zu einer Oberfläche zu gelangen, welche eine sehr hoch spezifische Reaktivität, beispielsweise jene für spezielle Stellen auf einem Protein, aufweist.
  • Indem ein spezifischer Antikörper auf der Oberfläche verankert wird (beispielsweise anti-DIG), erzeugt man eine Oberfläche, deren Reaktivität auf das Antigen (beispielsweise die DIG-Gruppierung) beschränkt ist. Dies zeigt, dass die anfänglichen chemischen Gruppierungen durch die aufgepfropften Antikörper allesamt verborgen worden sind.
  • Man kann auf den (chemisch oder biochemisch) reaktiven Oberflächen auch andere Moleküle mit biologischer Aktivität, insbesondere Viren oder andere Bestandteile: insbesondere Membranen, Membranrezeptoren, Polysaccharide, PNA, verankern.
  • Es ist gleichfalls möglich, das Produkt aus einer Reaktion von biologischem Interesse (beispielsweise der PCR) auf den hergestellten bzw. vorbereiteten Oberflächen anzuheften.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt den Nachweis und/oder die Quantifizierung von biologischen Molekülen, aber gleichfalls die Messung von intramolekularen Abständen, die Trennung von bestimmten biolo gischwen Molekülen, insbesondere eine Entnahme durch Ausführen der Antigen/Antikörper- und/oder DNA-RNA-Kopplungs-Techniken.
  • Die Erfindung hat insbesondere ein Verfahren zum Nachweis eines Makromoleküls, bestehend aus einer DNA-Sequenz oder einem Protein, in einer Probe gemäß der Erfindung zum Gegenstand, das dadurch gekennzeichnet ist, dass:
    • – man die Probe, entsprechend dem Lösemittel A, in welchem sich das Makromolekül in Lösung befindet, in Kontakt mit der Oberfläche des Trägers bringt unter Bedingungen für die Bildung eines DNA/DNA-, DNR/RNA-Hybrids oder für die Bildung des Produkts aus der Protein/Protein-Reaktion,
    • – man, wobei das Hybrid oder ein Markierungs-Makromolekül des Hybrids oder des Reaktionsprodukts in einem Abschnitt verankert ist, wobei der Rest sich frei in Lösung befindet, dieses streckt durch Verschieben des Meniskus, der durch den Kontakt des Lösemittels mit der Oberfläche erzeugt wird, um die Hybride oder die Markierungs-Makromoleküle zu orientieren, und man die Messung oder die Beobachtung der so orientierten Hybride oder Markierungs-Makromoleküle vornimmt.
  • Vorteilhafterweise sind die angeheftete DNA und die DNA der Probe auf unterschiedliche Weise gefärbt und man misst nach dem Strecken die Lage der komplementären Sequenz bezogen auf das Ende der DNA der Probe.
  • In geeigneter Weise kann man die ELISA- oder FISH-Nachweismethoden einsetzen.
  • Die DNA-Probe kann das Produkt oder das Substrat einer enzymatischen DNA-Amplifizierung, wie der PCR, sein, d. h. man kann die Amplifizierung der DNA, ist diese einmal gemäß dem Verfahren der Erfindung verankert und ausgerichtet, oder vor ihrer Verankerung und ihrer Ausrichtung ausführen.
  • Die Passage des Meniskus, wobei die Moleküle linear in Form von Stäbchen gestreckt werden, macht diese viel leichter nachweisbar, wenn sie markiert sind. Außerdem sind diese langgestreckten Moleküle an der frischen Luft stabil und können sogar nach mehreren Monaten noch beobachtet werden, ohne dass sie einen offensichtlichen Abbau zeigen.
  • Während einer Rehydratisierung können die DNA-Moleküle adsorbiert und langgestreckt bleiben. Außerdem ist es möglich, an dem langgestreckten Molekül eine Hybridisierung vorzunehmen.
  • Außerdem unterscheiden sich diese Moleküle vom umgebenden Hintergrund, da sie durch ihre Streckung ein korreliertes Signal mit einer gleichförmigen Orientierung aufweisen. Es ist folglich leicht, die Stäube, die Inhomogenitäten, die keine besondere räumliche Korrelation aufweisen, zu ignorieren. Die Ausrichtung ist ebenfalls interessant, da in Lösung die in Form von Knäueln vorliegenden Moleküle thermisch fluktuieren, was sehr bedeutende Variationen ihres vorzugsweise mit einer geringen Schärfentiefe gesammelten Fluoreszenzsignals mit sich bringt und deren Beobachtung begrenzt. Die Erfindung erlaubt folglich die Beobachtung von isolierten Molekülen mit einem sehr hohen Signal-Rausch (S/N)-Verhältnis.
  • Es ist bemerkenswert, dass dieses Verhältnis von der Anzahl von verankerten Molekülen unabhängig ist. Das S/N-Verhältnis, das bei dem Nachweis eines Moleküls auftritt, ist das gleiche wie für 10000. Außerdem erlaubt diese Strecktechnik, leicht zwischen Molekülen unterschiedlicher Längen zu unterscheiden.
  • Man kann vorteilhafterweise die folgenden Schritte vornehmen, um das S/N-Verhältnis weiter zu verbessern:
    • – Da das Molekül unbeweglich ist, kann man sein Fluoreszenzsignal integrieren.
    • – Die Beobachtung mit dem Mikroskop präsentiert einen kleinen Bereich (typischerweise 100 μm × 100 μm mit einem Immersionsobjektiv mit hundertfacher Vergrößerung, N.A. = 1,25). Für eine 1 cm2-Probe kann man entweder eine Abtastung vornehmen, oder die Verwendung von Objektiven mit geringerer Vergrößerung (10-fach oder 20-fach), aber mit hoher numerischer Apertur in Betracht ziehen.
    • – Da die kleinen Stäbchen stets parallel vorliegen, kann man eine Methode einer optischen räumlichen Filterung in Betracht ziehen, um das S/N-Verhältnis weiter zu verbessern.
    • – Es sind andere globale Fluoreszenzmethoden denkbar wie jene, die in der Europäischen Patentanmeldung 103426 beschrieben worden sind.
    • – Die Linearisierung der Moleküle beobachtet man im Rahmen einer physikalisch-chemischen Verankerung ebenso wie im Falle von Bindungen vom immunologischen Typ (DIG/anti-DIG).
    • – Befindet sich die Oberfläche einmal an der frischen Luft, sind die DNA-Moleküle stabil (bleiben unversehrt, sogar nach mehreren Wochen) und fluoreszierend. Man kann diese Eigenschaft in vorteilhafter Weise einsetzen, um den Verankerungsschritt von dem (Positions)Bestimmungs-/Zählungsschritt der verankerten Moleküle zeitlich zu trennen, wenn dieser Nachweis beispielsweise, aber ohne sich darauf zu beschränken, durch Fluoreszenzmikroskopie erfolgt. Eine solche Verwendung wird durch die Erfindung mit abgedeckt.
    • – Eine Doppel- (oder Mehrfach)-Fluoreszenztechnik kann gegebenenfalls dazu dienen, das S/N-Verhältis zu verbessern oder eine doppelte oder mehrfache Funktionalität nachzuweisen.
  • Die gestreckten Moleküle können durch verschiedene enzymologische oder andersartige Methoden, wie Fluoreszenz oder die Verwendung von radioaktiven (heißen) oder nicht-radioaktiven (kalten) Sonden, nachgewiesen werden. Ihr Nachweis kann durch Messung eines globalen Signals (beispielsweise der Fluoreszenz) oder durch individuelle Beobachtung der Moleküle durch optische Fluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie, Methoden mit lokalen Sonden (STM, AFM u.s.w.) erfolgen.
  • So erlaubt die Erfindung allgemein den Nachweis, die Trennung und/oder die quantitative Bestimmung eines Moleküls in einer Probe durch ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Oberfläche einsetzt, welche in der Lage ist, das Molekül spezifisch zu binden, und dass der Nachweis, die Trennung oder die quantitative Bestimmung dank eines fluoreszierenden oder nicht fluoreszierenden Reagens, welches die Anwesenheit des gebundenen oder angehefteten Moleküls nachweist, bewirkt werden.
  • Unter den Reagenzien unterscheidet man die fluoreszierenden Reagenzien und die nicht-fluoreszierenden Reagenzien.
  • Die fluoreszierenden Reagenzien enthalten fluoreszierende Moleküle, welche mit Vorteil so ausgewählt werden, dass sie lange Moleküle mit einer Größe über 0,1 μm sind und auf spezifische Weise direkt oder indirekt mit den vorbehandelten Oberflächen reagieren. Beispielsweise, aber ohne sich deshalb darauf zu beschränken, kann ein doppelsträngiges DNA-Molekül, das mit Hilfe von fluoreszierenden Sonden (Ethidiumbromid, YOYO, fluoreszierenden Nukleotiden u.s.w.) gefärbt worden ist, sich direkt durch ein oder mehrere Enden auf einer Oberfläche, welche gegebenenfalls eine Gruppe vom Typ Vinyl, Amin oder eines andersartigen Typs aufweist, verankern, insbesondere durch eine kluge Wahl des pH oder des Ionengehalts des Mediums oder durch Anlegen einer elektrischen Spannung an die Oberfläche.
  • Es ist gleichfalls möglich, eine besondere Funktionalisierung des Moleküls (DIG, Biotin u.s.w.) einzusetzen, um dieses an einer oder mehreren Stellen auf einer Oberfläche, welche komplementäre Stellen (anti-DIG, Streptavidin u.s.w.) aufweist, zu verankern.
  • Die nicht-fluoreszierenden Reagenzien, welche den Nachweis vor vorab ausgerichteten Molekülen gemäß der Erfindung erlauben, können insbesondere aus Kugeln oder Mikroteilchen bestehen, welche durch das Zwischenglied eines anderen Moleküls, welches auf spezifische Weise direkt oder indirekt an das ausgerichtete Molekül angeheftet worden ist und lediglich eine schwache nicht-spezifische Wechselwirkung mit der Oberfläche zeigt, verankert werden.
  • Man kann beispielsweise die mit Streptavidin bedeckten Dynal-Kugeln aufführen, die die Verankerung auf biotinylierter DNA, welche gemäß der Erfindung ausgerichtet worden ist, erlauben.
  • Je nachdem, ob das gesuchte Molekül direkt durch Fluoreszenz oder indirekt mit Hilfe der obigen Reagenzien nachgewiesen wird, wird man von "direktem Nachweis" oder "mittels einer Markierung" sprechen.
  • Um die mit zu langen Reaktionszeiten verbundenen Probleme zu begrenzen, kann man vorteilhafterweise die Diffusionszeiten der Reagenzien in Richtung der Oberfläche verringern, indem kleine Reaktionsvolumen eingesetzt werden. Beispielsweise, aber ohne sich darauf zu beschränken, führt man die Reaktion in einem Volumen von einigen Mikrolitern, welches bestimmt wird durch den Raum zwischen zwei Oberflächen, von denen eine behandelt ist, so dass sie reaktive Stellen präsentiert, und die andere inert oder behandelt worden ist, damit sie unter den Reaktionsbedingungen keine reaktiven Stellen aufweist, aus.
  • Der Nachweis der Anzahl von ausgerichteten Molekülen kann an einer kleinen Anzahl von Molekülen (typischerweise 1 bis 1000) durch einen makroskopischen physikalischen Test mit geringem Hintergrund, welcher weder ein Elektronenmikroskop noch Radioaktivität noch notwendigerweise die PCR erfordert, erfolgen.
  • Die Verfahren zur Ausrichtung und zum Nachweis gemäß der Erfindung können durch Personal, welches lediglich geringe Laborerfahrung hat, ausgeführt werden.
  • Die Spezifität von bestimmten biologischen Reaktionen kann begrenzt sein. So können im Rahmen der Hybridisierung die Hybride unvollkommen sein (Reaktionen mit anderen Stellen), indem sie eine geringere Anzahl von Paarbildungen und folglich eine schlechtere Bindungsqualität aufweisen. Die Erfindung deckt gleichfalls den möglichen Einsatz eines Schritts eines Tests der Qualität der erhaltenen Bindungen ab. Dieser Test erlaubt, die auf nicht-spezifische, schwache Weise durch insbesondere Adsorption, hydrophobe Kräfte, unvollkommene Wasserstoffbrückenbindungen, unvollkommene Hybridisierung gepaarten Produkte zu dissoziieren.
  • Aus diesem Grund betrifft die Erfindung gleichfalls im Rahmen eines Verfahrens zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung, wie zuvor beschrieben, ein Verfahren, wo man das Reaktionsprodukt zwischen dem Molekül mit biologischer Aktivität und dem Molekül der Probe einer Beanspruchung aussetzt, um vor dem Nachweis die schlechten Paarungen zu zerstören.
  • Dieses Verfahren bietet außer der Möglichkeit, die fehlgepaarten Paare zu zerstören, die Möglichkeit, die Kopplungsprodukte zu orientieren, was die Messungen oder die Beobachtungen erleichtert.
  • Man kann so die Oberflächen nach Anheftung der komplementären Elemente einer Beanspruchung aussetzen, die gebildet werden kann durch die einzelne oder kombinierte Verwendung von:
    • – Zentrifugation,
    • – Magnetfeldgradient, welcher auf die nicht-fluoreszierenden Reagenzien, die dann so ausgewählt sind, dass sie magnetisierbare oder magnetische Mikrokugeln umfassen, angewendet wird,
    • – Bewegung/Rühren,
    • – Flüssigkeitsströmung,
    • – Meniskus-Passage,
    • – Elektrophorese
    • – Variation von Temperatur und/oder Temperaturgradient.
  • Man bestimmt dann durch die oben beschriebenen Nachweistechniken mit geringem Hintergrund die Anzahl von Systemen, die unversehrt geblieben oder zerstört worden sind.
  • Die beschriebenen erfindungsgemäßen Ausrichtungs- und Nachweistechniken können für zahlreiche Anwendungen eingesetzt werden, darunter, aber ohne sich darauf zu beschränken:
    • – die Identifizierung von einem oder mehreren DNA- oder RNA-Sequenzelementen, das bzw. die man mit Vorteil für die Diagnose von Pathogenen oder die physische Kartierung eines Genoms einsetzen kann. Die oben beschriebenen Techniken erlauben insbesondere die Erzielung einer direkten physischen Kartierung an genomischer DNA, ohne dass diese eine Klonierungsschritt durchläuft. Es versteht sich, dass man, da das gekämmte Molekül bezogen auf seine kristallographische Länge gestreckt worden ist, diesbezügliche Messungen vornimmt. Es ist so möglich, die Größe von DNA-Fragmenten und den Abstand zwischen Fragmenten mit einer Auflösung in der Größenordnung von 200 nm für optische Methoden oder in der Größenordnung von 1 nm durch die Verwendung von Nahfeldmethoden, wie AFM oder STM, um den Abstand zwischen Sonden auf der ausgerichteten DNA sichtbar zu machen und zu messen, zu messen.
  • Dies führt natürlicherweise zu:
    • 1) dem Nachweis von Deletionen, Additionen oder Translokationen von genomischen Sequenzen, insbesondere im Rahmen der Diagnose von genetisch bedingten Krankheiten (beispielsweise Duchenne-Muskeldystrophie);
    • 2) der Identifizierung von Promotoren von verschiedenen Genen durch die Messung des Abstands zwischen den regulatorischen Sequenzen und jener, die exprimiert wird;
    • 3) der Lokalisierung von regulatorischen Proteinen durch die Identifizierung von deren Lage entlang der DNA oder der Lage von deren Zielsequenz;
    • 4) der partiellen oder vollständigen Sequenzierung durch Messung des Abstands mit Hilfe von Nahfeldmikroskopiemethoden (beispielsweise AFM oder STM) zwischen hybridisierten Sonden, welche zu einer Grundlage von Oligonukleotiden von gegebener Länge gehören.
    • – Der enzymatischen in situ-Amplifizierung an ausgerichteten DNAs.
    • – Der Verbesserung der Empfindlichkeit der ELISA-Techniken mit der Möglichkeit, eine geringe Anzahl (gegebenenfalls unter 1000) von immunologischen Reaktionen nachzuweisen.
  • So kann man eine physische Kartierung direkt an einer genomischen DNA vornehmen, ohne dass diese einen Klonierungsschritt durchläuft. Die genomische DNA wird extrahiert, gereinigt, gegebenenfalls durch ein oder mehrere Restriktionsenzyme geschnitten, dann auf Oberflächen gemäß dem Verfahren der Erfindung gekämmt.
  • Die Lage und die Größe des gesuchten Gens auf der genomischen DNA werden dann durch Hybridisierung mit für das Gen spezifischen Sonden, welche insbesondere aus Abschnitten von zu dem Produkt des gesuchten Gens komplementärer DNA (cDNA) extrahiert werden, bestimmt.
  • Auf ähnliche Weise identifiziert man, indem man eine gekämmte, dann denaturierte genomische DNA mit gesamter, durch Fluoreszenz oder einen jeglichen anderen Marker, welcher es erlaubt, das Hybrid zu lokalisieren, markierter cDNA hybridisiert, die Lage, die Größe und die Anzahl der Exons des fraglichen Gens, woraus man dessen Größe und seine genetische Organisation (Exons, Introns, regulatorische Sequenzen) ableitet.
  • Nachdem die Lage des Gens bestimmt worden ist, wie oben beschrieben, oder bekannt ist, ist es dann möglich, durch Hybridisierung die flankierenden Sequenzen des Gens zu identifizieren. Dafür wird man mit Vorteil eine Hybridisierung mit markierten Sonden, welche beispielsweise aus einer Bibliothek von Oligonukleotiden stammen, vornehmen, um zwei oder mehrere Sonden zu identifizieren, die auf der einen und der anderen Seite des Gens hybridisieren.
  • Ausgehend von dieser Bestimmung ist es dann durch die Techniken enzymatischer Amplifizierung, beispielsweise der in situ-PCR (Nuovo, G.J., PCR in situ hybridization: protocoles and applications, Raven Press (1992)), möglich, das durch die flankierenden Sonden, die als Primer der Reaktion dienen können, begrenzte Fragment zu amplifizieren, welches Fragment das gesuchte Gen mit seinen regulatorischen Regionen, die gewebe- oder entwicklungsspezifisch sein können und die man dann isolieren und reinigen kann, enthalten kann.
  • Man kann auch eine in situ-Polymerisation an den aus der cDNA des fraglichen Gens extrahierten Primern vornehmen, um zu den flankierenden Regionen des Gens komplementäre DNA-Fragmente zu extrahieren, wie von Mortimer et al. (Yeast 5, 321, 1989) erwähnt wurde. Diese Fragmente können dann zur Herstellung von Primern für ein enzymatisches Amplifizierungsverfahren des Gens und seiner flankierenden Fragmente dienen.
  • Man kann auch die von A. Thierry und B. Dujon (Nucl. Acid Research 20, 5625 (1992)) aufgeführten Methoden, um durch homologe oder zufallsgesteuerte Rekombination spezifische bekannte Endonukleasestellen in eine genomische DNA oder ein Fragment von genomischer DNA einzuführen, einsetzen. Das Kämmen dieser DNA erlaubt die Identifizierung des Gens von Interesse und der insertierten spezifischen Stellen durch die oben beschriebenen in situ-Hybridisierungsmethoden. Ausgehend von dieser Identifizierung und bevorzugt, wenn die Stellen von Interesse Regionen von Interesse sind, die nahe bei dem Gen liegen, wird man diese als Primer für eine enzymatische Amplifizierungsreaktion (in situ oder andersartig) des fraglichen Gens und seiner flankierenden Sequenzen einsetzen.
  • Die Amplifizierung des gesuchten Gens erfolgt dann durch die bekannten enzymatischen Amplifizierungstechniken, wie PCR, an dem, wie zuvor beschrieben, amplifizierten Fragment, indem Primer, welche durch die die cDNA bildenden Exons zugänglich sind, oder Primer, welche flankierenden Sequenzen entsprechen, eingesetzt werden.
  • Durch das Kämmen von genomischer oder andersartiger DNA ist es auch möglich, durch Hybridisierung das Vorhandensein oder das Fehlen von regulatorischen Sequenzen eines bestimmten proximalen Gens zu bestimmen, ausgehend von welchen man die möglichen Familien von regulatorischen Proteinen dieses Gens (beispielsweise: Helix-Schleife-Helix, Zinkfinger, Leucin-Zipper) bestimmen wird.
  • Die spezifischen Reaktionen zwischen speziellen DNA/RNA/PNA-Sequenzen und einem anderen Molekül (DNA, RNA, Protein) können vor oder nach Ausrichtung der Moleküle gemäß der Erfindung erfolgen.
  • So setzt man im Rahmen der genetischen Diagnostik und der physischen Kartierung mit Vorteil die bekannten FISH-Verfahren (Pinkel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83, 2934 (1986)) ein, um markierte einzelsträngige Oligonukleotide mit zuvor ausgerichteter, dann denaturierter DNA zu hybridisieren. Die Sichtbarmachung der Hybride wird durch bekannte Techniken (Fluoreszenz, Mikrokugeln u.s.w.) mit einer Auflösung nach Maßgabe der Abstände, welche von 0,2 μm (optisch) bis 1 nM (mittels Nahfeldmikroskopie; AFM, STM u.s.w.) gehen, erfolgen.
  • Alternativ kann man zunächst fluoreszierende Marker-DNAs mit einzelsträngiger DNA in Lösung hybridisieren, dann diese Konstruktionen durch die Einwirkung des Meniskus ausrichten, nachdem man sie in doppelsträngige DNA umgewandelt und an einer adäquaten Oberfläche verankert hat.
  • Man kann die Erfindung auch für den Nachweis des Vorhandensein eines Pathogens einsetzen. Als Beispiel kann man auf zwei unterschiedliche Weisen vorgehen, je nachdem, ob die Erkennungsreaktion (Hybridisierung, Anheftung von Protein) vor oder nach der Ausrichtung durch den Meniskus stattfindet.
  • So werden beispielsweise ein oder mehrere Oligonukleotid-Sonden an einer oder mehreren Regionen einer Oberfläche verankert. Die Hybridisierung der potentiell pathogenen DNA erfolgt in situ unter stringenten Bedingungen derart, dass lediglich hybridisierte Moleküle verankert werden. Deren Nachweis und Quantifizierung erfolgen nach Ausrichtung durch den Meniskus gemäß der Erfindung.
  • Alternativ wird die potentiell pathogene DNA zunächst ausgerichtet, dann denaturiert und mit einer Oligonukleotid-Sonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Der Nachweis des Hybrids erfolgt dann durch die bekannten Methoden, insbesondere FISH, wie oben beschrieben.
  • Auf eine ähnliche Weise kann man das Vorhandensein (oder das Fehlen) einer geringen Anzahl von Molekülen, wie Proteinen, Lipiden, Zuckern oder Antigenen, nachweisen. Man wird mit Vorteil eine geringfügige Modifizierung der ELISA-Techniken vornehmen, wobei die übliche Nachweismethode durch den Nachweis eines gemäß der Erfindung ausgerichteten und an eines der Reagenzien der ELISA-Reaktion gekoppelten fluoreszierenden Moleküls ersetzt wird.
  • Außerdem kann, wie von K. R. Allan et al. (U.S. 84 114) erwähnt, die genetische Kartierung durch eine Messung der Größe von DNA-Fragmenten erfolgen. Nun erlauben die weiter oben beschriebenen originären Techniken zum Strecken der Moleküle (das Strecken durch den Meniskus) eine Messung der Länge der gestreckten Moleküle und dies an einer sehr kleinen Probe (einige Tausend Moleküle).
  • Man kann beispielsweise, aber ohne sich darauf zu beschränken, auf die folgende Weise vorgehen:
    Eine DNA-Probe wird fragmentiert (mit Hilfe von Restriktionsenzymen), mit einem Fluorophor gefärbt, dann auf einer Oberfläche verankert. Die Moleküle werden dann durch den Meniskus gestreckt und die Größe der gestreckten Fragmente durch optische Fluoreszenzmikroskopie mit einer Auflösung und einer Größengrenze in der Größenordnung von 1000 bp (0,3 μm) bestimmt.
  • Mit diesem Ziel, aber auch, wenn man sehr lange Moleküle (≥ 10 μm) ausrichten möchte, wird man mit Vorteil Techniken einsetzen, die dafür bekannt sind, den Abbau von langen Makromolekülen während ihrer Handhabung (durch hydrodynamische Scherung) zu begrenzen.
  • Wie dies von D.C. Schwartz erwähnt worden ist, wird man mit Vorteil eine Kondensation der Moleküle mit Hilfe eines Kondensationsmittels (beispielsweise Spermin oder ein Alkohol) während deren Handhabung vornehmen. Gegebenenfalls wird deren Dekondensation während des Kontakts des Lösemittels A mit der Verankerungsoberfläche S erfolgen.
  • Um den Abbau von Makromolekülen während des Streckens durch den Meniskus zu verringern, wird man Techniken zur Parallelverschiebung des Meniskus einsetzen, die die hydrodynamische Scherung minimieren. Beispielsweise, aber ohne sich deswegen darauf zu beschränken, indem man die Oberfläche S sehr langsam (≤ 200 μ/s) von einem folgerichtigen Volumen (≥ 100 μl) des Lösemittels A zurückzieht.
  • Die Erfindung ist nützlich, um eine Oberfläche zu erhalten, welche einen oder mehrere Typen von ausgerichteten Makromolekülen, welche gemäß der Erfindung erhalten werden, aufweist. Man kann insbesondere eine Oberfläche oder eine Stapelung von Oberflächen erhalten, welche elektrische oder optische anisotrope Eigenschaften aufweist.
  • Die Erfindung hat auch ein Verfahren zur Ausrichtung und zum Nachweis von DNA zum Gegenstand, in welchem die DNA durch ein erfindungsgemäßes Ausrichtungsverfahren gestreckt wird, dann denaturiert wird, dann mit spezifischen Sonden hybridisiert wird, um die Lage oder die Größe von einer oder mehreren speziellen Sequenzen zu bestimmen.
  • Die Erfindung hat gleichfalls ein Verfahren zur physischen Kartierung eines Gens auf einer genomischen DNA zum Gegenstand, in welchem die DNA gemäß einem Verfahren der Erfindung ausgerichtet oder nachgewiesen wird.
  • Insbesondere werden die Lage und die Größe des gesuchten Gens auf der genomischen DNA durch Hybridisierung mit für das zu kartierende Gen spezifischen Sonden bestimmt.
  • Die Erfindung ist gleichfalls nützlich für die Herstellung
    • – eines Kits, welcher für die Ausführung eines erfindungsgemäßen Kartierungsverfahrens nützlich ist, welcher gebildet wird aus vollständiger genomischer DNA eines Referenzwirts,
    • – eines Trägers (einem Träger), welcher eine Oberfläche aufweist, welche die Verankerung und die Ausrichtung der DNA des Patienten gemäß dem Verfahren der Erfindung erlaubt,
    • – von für das oder die zu kartierende(n) Gen(e) spezifischen Sonden und Reagenzien (für das oder die zu kartierende(n) Gen(e) spezifische Sonden und Reagenzien) für die Hybridisierung und den Nachweis der DNA.
  • Die Erfindung hat gleichfalls ein Verfahren zur Ausrichtung und zum Nachweis von DNA zum Gegenstand, in welchem die DNA gestreckt, dann denaturiert, dann mit spezifischen Sonden hybridisiert wird, um das Vorhandensein oder das Fehlen von einer oder mehreren DNA-Sequenzen in der ausgerichteten DNA zu bestimmen.
  • Die Erfindung erlaubt die Ausführung eines Verfahrens zur Diagnose einer Pathologie, welche mit dem Vorhandensein oder dem Fehlen einer für die Pathologie spezifischen DNA-Sequenz verbunden ist, in welchem man ein erfindungsgemäßes Ausrichtungsverfahren einsetzt.
  • Die Erfindung ist gleichfalls nützlich, um einen Kit herzustellen, welcher für das Ausführen eines erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens nützlich ist, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er einen Träger, dessen Oberfläche die Verankerung und die Ausrichtung der DNA eines Patienten gemäß einem Verfahren der Erfindung erlaubt, für das an der gesuchten Pathologie beteiligte Gen spezifische Sonden und Reagenzien für die Hybridisierung und den Nachweis der DNA umfasst.
  • Die Erfindung ist gleichfalls nützlich, um einen Kit herzustellen, welcher für das Ausführen eines erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens nützlich ist, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er einen Träger, dessen Oberfläche für das an einer Pathologie beteiligte Gen spezifische Sonden, insbesondere gegebenenfalls markierte, pathogene DNA, welche gemäß dem Verfahren der Erfindung ausgerichtet und gegebenen falls denaturiert worden sind, aufweist; Reagenzien zur Präparation und Markierung der DNA des Patienten in Hinblick auf deren Hybridisierung (beispielsweise Photobiotin, "Nick-Translations"- oder "Random Priming"-Kit) und Reagenzien für die Hybridisierung und den Nachweis der DNA gemäß den oben beschriebenen in situ-Hybridisierungstechniken umfasst.
  • Es versteht sich, dass gekämmte Sonden, welche sich auf unterschiedliche Pathogene beziehen, auf unterschiedlichen Trägern oder auf ein und demselben Träger vorhanden sein können. Die Identifizierung des entsprechenden Pathogens kann nach der Hybridisierung entweder räumlich (die unterschiedlichen Sonden sind räumlich beispielsweise durch photochemische Verankerung vor deren Kämmen getrennt) oder durch einen Unterschied des Fluoreszenzspektrums der verschiedenen Hybride, welches aus einer vorab erfolgten differenziellen Markierung der Sonden resultiert, erfolgen.
  • Schließlich hat die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Gens zum Gegenstand, bei welchem man die Lage dieses Gens auf durch das erfindungsgemäße Verfahren ausgerichteter genomischer DNA mit Hilfe einer für das Gen spezifischen Sonde identifiziert und man die Sequenz dieses Gens und gegebenenfalls dessen flankierende Sequenzen durch enzymatische Amplifizierung, insbesondere PCR, amplifiziert.
  • Die Erfindung erlaubt folglich, ein Verfahren zum Ersetzen eines Gens in dem Genom einer eukaryotischen Zelle durch gezielte Insertion eines Fremdgens mit Hilfe eines Vektors, welcher dieses Fremdgen, das gemäß dem obigen Verfahren zur Herstellung eines Gens hergestellt worden ist, enthält, auszuführen.
  • Die gezielte Insertion kann gemäß den in WO 90/11354 beschriebenen Techniken ausgeführt werden, indem man eukaryotische Zellen mit einem Vektor, welcher die zu insertierende fremde DNA flankiert von zwei genomischen Sequenzen, die neben der gewünschten Insertionsstelle in dem Empfängergen liegen, enthält, transfiziert. Die zu insertierende DNA kann entweder eine kodierende Sequenz oder eine regulatorische Sequenz umfassen. Die flankierenden Sequenzen werden so ausgewählt, um durch homologe Rekombination je nach Fall entweder die Expression der kodie renden Sequenz der zu insertierenden DNA unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen des Empfängergens oder die Expression einer kodierenden Sequenz des Empfängergens unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen der zu insertierenden DNA zu erlauben.
  • Die genomischen Gene und die cDNAs, die erhalten werden, indem man das Verfahren zur Lokalisierung von Genen gemäß der Erfindung einsetzt, können in Expressionsvektoren insertiert werden, die in der Lage sind, sich in eine prokaryotische, eukaryotische oder virale Wirtszelle zu insertieren. Die sich davon ableitenden Proteine, Polypeptide und Peptide werden von der Erfindung mit umfasst.
  • Die folgende Beschreibung erfolgt unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren, in denen:
  • die 1 den Nachweis eines Pathogens in einem fluoreszierenden DNA-Molekül durch Hybridisierung mit einem verankerten Molekül schematisch darstellt;
  • die 2 die genetische Kartierung durch Streckung der DNA und Verwendung einer Marker-DNA schematisch darstellt;
  • die 3 den Nachweis einer immunologischen Reaktion (ELISA) mit Hilfe eines "Markierungs"moleküls schematisch darstellt: als Reaktionsmarker wird eine fluoreszierende DNA eingesetzt;
  • die 4 eine Fluoreszenzmikrophotographie ist, welche die Streckung von DNA des Phagen λ durch Vorwärtsbewegung des Meniskus zeigt; links sieht man DNA-Moleküle in Lösung, welche durch Verdunstungsströmung parallel zu dem Meniskus gestreckt worden sind, rechts DNA-Moleküle an der frischen Luft nach deren Streckung senkrecht zu dem Meniskus;
  • die 5(a) und 5(b) Fluoreszenzmikrophotographien sind, die eine mit Digoxigenin (DIG) markierte DNA auf einer mit anti-DIG bedeckten Oberfläche, und welche durch den Meniskus getreckt worden ist, bzw. als Kontrolle eine nicht-markierte DNA auf einer anti-DIG-Oberfläche zeigen; man wird die sehr große Spezifität der Oberflächen und das Fehlen einer nicht-spezifischen Verankerung feststellen;
  • die 6 das Schema der Streckung von DNA durch Passage des Meniskus darstellt. Die in Lösung befindliche DNA wird auf einer behandelten Oberfläche verankert. Die DNA-Lösung ist mit einem runden, nicht-behandelten Plättchen abgedeckt;
  • die 7 Histogramme der Länge der gekämmten λ-DNA-Moleküle auf Glasoberflächen:
    • a) welche mit Silanmolekülen bedeckt sind, deren Ende durch eine Amingruppe gebildet wird,
    • b) welche mit Polylysin bedeckt sind;
    • c) welche in einer Mischung von Wasserstoffperoxid/Schwefelsäure gereinigt worden sind,

    repräsentiert.
  • die 8 gekämmte DNA-Moleküle auf mit Polylysin bedeckten Glasoberflächen repräsentiert. Man stellt fest, dass die durch ihre beiden Enden angehefteten Moleküle Schleifen bilden.
  • die 9 YACs repräsentiert, welche durch Zurückziehen eines behandelten Plättchens von einer Lösung dieser Moleküle gekämmt worden sind.
  • die 10 die Identifizierung des Vorhandenseins und der Größe eines Cosmids auf einem YAC durch in situ-Hybridisierung zeigt.
  • In dem Modus "Diagnostik" weisen die Sonden (die "Anker") eine reaktive Gruppe (DIG, Biotin u.s.w.) auf, welche in der Lage ist, sich auf spezifische Weise auf einer erfindungsgemäßen Oberfläche (welche beispielsweise als Verankerungsstelle einen anti-DIG-Antikörper oder Streptavidin aufweist) zu verankern. Der Nachweis der Verankerungsreaktion kann direkt durch Nachweis der Fluoreszenz des durch fluoreszierende Moleküle (Ethidiumbromid, YOYO, fluoreszierende Nukleotide) gefärbten DNA-Moleküls erfolgen (1). Er kann auch indirekt durch Nachweis eines "Markierungsmoleküls": eines Reagens, welches in der Lage ist, sich an das DNA/RNA-Molekül (beispielsweise durch Hybridisierung, Protein-DNA-Wechselwirkung u.s.w.) anzuheften, aber keine Affinität für die Verankerungsstellen der Sonde aufweist, erfolgen.
  • In dem Modus "Kartierung" kann man die in situ-Hybridisierungstechniken (FISH) einsetzen. Es ist auch möglich, andere Techniken in Betracht zu ziehen, beispielsweise indem DNA in Lösung mit Sonden, welche fluoreszierende Reagenzien aufweisen, gemäß der Erfindung hybridisiert wird. Der Nachweis der Lage der Sonden erfolgt nach der Ausrichtung des Moleküls gemäß der Erfindung.
  • BEISPIEL 1
  • Materialien und Methoden
  • λ-DNA und der monoklonale Antikörper (Anti-DIG) stammen von Boehringer-Mannheim. Die Trichlorsilane stammen von Roth-Sochiel. Die fluoreszierenden Nukleinsäuresonden (YOYO1, YOYO3 und POPO1) stammen von Molecular Probes. Die ultrareinen Glasplättchen stammen von Erie Scientific (Plättchen (ESCO). Die magnetischen Teilchen stammen von Dynal. Das Mikroskop ist ein umgekehrtes Diaphot-Mikroskop von NIKKON, welches mit einer Xenon-Lampe für die Epifluoreszenz und einer verstärkten Hamamatsu-CCD-Kamera für die Visualisierung ausgerüstet ist.
  • Oberflächenbehandlung
  • Glasplättchen werden eine Stunde durch UV-Bestrahlung unter Sauerstoffatmosphäre (durch Bildung von Ozon) gereinigt. Sie werden dann unverzüglich in einen Exsiccator, aus welchem vorab Spuren von Wasser durch einen Argonstrom herausgespült worden sind, gelegt. Ein Volumen von ungefähr 100 bis 500 μl des geeigneten Trichlorsilans (H2C=CH-(CH2)N-SiCl3) wird in den Exsiccator eingeführt, aus welchem die Oberflächen nach ungefähr 12 h (n = 6) oder 1 h (n = 1) herausgenommen werden. Beim Herausnehmen sind die Oberflächen sauber und nicht-benetzend.
  • Die funktionellen Gruppen dieser Oberflächen mit Doppelbindung (H2C=CH-) können zu Carboxylgruppen (-COOH) umgewandelt werden, indem die, wie zuvor beschrieben, behandelten Plättchen während ungefähr 10 min in eine Lösung von 25 mg KMnO4, 750 mg NaIO4 in 1 l Wasser eingetaucht werden, dann dreimal in ultrareinem Wasser gespült werden.
  • Die so funktionalisierten Plättchen können mit Proteinen reagieren. Ein Volumen von 300 μl einer wässrigen Lösung (20 μg/ml) von Proteinen (Protein A, Streptavidin u.s.w.) wird auf ein mit (H2C=CH-)-Gruppen funktionalisiertes Plättchen aufgetragen. Dieses Plättchen wird ungefähr zwei Stunden bei Umgebungstemperatur inkubiert, dann dreimal in ultrareinem Wasser gespült. Die so behandelten Oberflächen sind sauber und benetzend. Die mit Protein A behandelten Oberflächen können dann mit einem Antikörper, beispielsweise anti-DIG, durch Inkubation in einer Lösung von 20 μg/ml Antikörper reagieren.
  • Außerdem kann man auf die Oberflächen, die Carboxylgruppen aufweisen, Oligonukleotide aufpfropfen, welche ein Amin-Ende (-NH2) aufweisen. 200 μl einer MES-Lösung (50 mM, pH 55), Carbodiimid (1 mg/ml) und 5 ml aminiertes Oligo (10 pmol/140 μl) werden auf eine carboxylierte Oberfläche aufgetragen und ungefähr 8 h bei Umgebungstemperatur inkubiert. Das Plättchen wird schließlich dreimal in NaOH (0,4 M), dann viermal in ultrareinem Wasser gespült. Die so hergestellten Plättchen können mit zu dem verankerten Oligonukleotid komplementären DNAs hybridisieren.
  • Verankerung von nativer DNA auf Oberflächen mit Doppelbindung
  • Ein 2 μl-Tropfen einer Lösung von durch Fluoreszenz (YOYO1, POPO1 oder YOYO3, aber ohne besondere Beendigung) markierter λ-DNA von variabler Konzentration und in unterschiedlichen Puffern (Gesamtanzahl von Molekülen < 107) wird auf ein vorbehandeltes (C=C-) Plättchen aufgetragen und mit einem nicht behandelten Glasplättchen (Durchmesser 18 mm) bedeckt. Die Zubereitung wird ungefähr 1 h bei Umgebungstemperatur in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre inkubiert. In einem 0,05 M MES-Puffer (pH = 5,5) beobachtet man eine praktisch vollständige Verankerung der DNA-Moleküle. Im Gegenzug gibt es in einem 0,01 M Tris-Puffer (pH = 8,0) nahezu keinerlei verankertes Molekül (Verhältnis > 106). Diese Abhängigkeit kann die Kontrolle der Aktivierung/Desaktivierung der Oberflächen (gegenüber der DNA) durch das Zwischenglied des pH erlauben.
  • Die Wirkung des Meniskus auf das Molekül ist auf die unmittelbare Umgebung von diesem begrenzt. Der in Lösung befindliche Teil des Moleküls vor dem Meniskus fluktuiert frei und der an der Oberfläche angeheftet bleibende Teil hinter dem Meniskus ist für eine Richtungsänderung des Meniskus unempfindlich. Der Ausdehnungs- oder Streckungsgrad des Moleküls ist folglich gleichförmig und unabhängig von dessen Größe.
  • Ausrichtung und Nachweis der Verankerung durch Einwirkung des Meniskus
  • Indem man die vorangegangene Zubereitung in eine trockene Atmosphäre überführt, wird die daraus verdunstende Lösung die DNA-Moleküle, die an der Oberfläche verankert sind, senkrecht zum Meniskus strecken. Die auf das DNA-Molekül einwirkende Kapillarkraft (einige Zehn Pikonewton) ist tatsächlich ausreichend, um das Molekül vollständig zu strecken (größer als die Entropieelastizitätskräfte), aber zu gering, um die Bindung zwischen dem Ende des Moleküls und der behandelten Oberfläche zu zerreißen. Da die DNA durch Fluoreszenz markiert ist, beobachtet man individuell und leicht die gestreckten Moleküle (gesamte Länge ungefähr 22 μm). Da die Verankerung zwischen der Oberfläche und der DNA auf die Enden beschränkt ist, konnte man gleichermaßen gut DNAs des Phagen λ, von YAC oder von E. coli (gesamte Länge über 400 μm) strecken. Dieses Präparat von gestreckten, fluoreszierenden und an der frischen Luft befindlichen DNAs ist mehrere Tage lang stabil und kann auf nicht zerstörerische Weise durch Epifluoreszenz (umgekehrtes Nikkon-Diaphot-Mikroskop mit einem Objektiv mit hundertfacher Vergrößerung, O.N.: 1,25) beobachtet werden.
  • Spezifische(r) Verankerung und Nachweis
  • Indem man die Oberflächen, wie zuvor beschrieben, mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper behandelt, kann man sehr genau deren Spezifität kontrollieren. So wurde die Spezifität von mit anti-DIG behandelten Oberflächen gegenüber λ-DNAs, welche mit einem Oligonukleotid, welches zu einem der Cos-Enden komplementär war, hybridisiert worden waren und eine Digoxigenin (DIG)-Gruppierung aufwiesen, und gegenüber nicht hybridisierten DNAs getestet. In dem ersten Fall wurde eine praktisch allgemeine Streckung der verankerten Moleküle durch Einwirkung des Meniskus beobachtet. In dem zweiten Fall wurden lediglich einige verankerte DNA-Moleküle (< 10) in der gesamten Probe beobachtet. Man schätzt folglich, dass die Spezifität der erfindungsgemäßen Methode besser als 106 ist.
  • λ-DNAs wurden auch mit Oligonukleotiden, die zu einem der COS-Enden komplementär waren und an carboxylierte Oberflächen, wie oben beschrieben, angeheftet waren, hybridisiert. Die Hybridisierungsbedingungen (reines Wasser bei 40°C) waren nicht stringent, da unter stringenten Bedingungen (hoher Salzgehalt) die Fluoreszenz der YOYO1-Sonden verschwindet und die hybridisierten DNAs nicht gesehen werden können. Die so hybridisierten DNAs konnten ebenfalls durch Passage des Meniskus ausgerichtet werden.
  • Nachweisempfindlichkeit
  • Um die Empfindlichkeit der Nachweismethode durch Meniskus-Streckung zu bestimmen, wurden auf Oberflächen mit Doppelbindung 2,5 μl-Tropfen einer λ-DNA-Lösung in 0,05 M MES (pH = 5,5), enthaltend insgesamt 105, 104 und 1000 Moleküle, aufgetragen. Die Verankerung und die Ausrichtung erfolgen, wie zuvor beschrieben. Die Plättchen werden dann im Mikroskop durch Epifluoreszenz beobachtet, um die Dichte von gekämmten Molekülen zu bestimmen. Diese entspricht jener, die abgeschätzt wurde, gut: ungefähr 4–6 DNA-Moleküle pro Beobachtungsfeld (100 μm × 100 μm) bei einer Gesamtmenge von 105 DNA-Molekülen. Bei der geringsten Konzentration konnten ungefähr 10 DNA-Moleküle beobachtet werden, die durch die Einwirkung des Meniskus gestreckt wurden. Diese Anzahl wird im wesentlichen durch die große Anzahl von Sichtfeldern, welche erforderlich sind, um die gesamte Probe abzudecken (ungefähr 25000), begrenzt, was eine manuelle Untersuchung schwierig macht, aber vorteilhaft automatisch und mit einem schwächeren Objektiv, aber mit einem größeren Feld ausgeführt werden kann. Als Schlussfolgerung erlaubt die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Methode einen individuellen Nachweis und eine individuelle Zählung von weniger als 1000 DNA-Molekülen.
  • Abhängigkeit der Streckung von der Oberflächenbehandlung
  • Das Histogramm der Längen von λ-DNA-Molekülen, welche auf unterschiedliche Oberflächen aufgepfropft, dann durch Passage des Meniskus ausgerichtet wurden, zeigt einen gut definierten Peak, der aber für die verschiedenen Oberflächen unterschiedlich ist. So wird die DNA auf Oberflächen, die mit einem Silan, welches Enden in Form einer Vinylgruppe aufweist, bedeckt sind, bis zu ungefähr 22 μm gestreckt (siehe oben); für silanisierte Oberflächen mit einer Amingruppe (-NH2) weist das Histogramm einen Peak bei 21 μm (7(a)) und auf sauberem Glas bei ungefähr 18,5 μm (7(c)) auf.
  • Die Streckung hängt folglich von der Oberflächenbehandlung ab.
  • BEISPIEL 2
  • Kämmen von DNA-Molekülen auf unterschiedlichen Oberflächen
  • Es wurde das Molekülkämmen von DNA auf auf unterschiedliche Weise behandelten Glasoberflächen beobachtet. Man spielt mit dem Adsorptions unterschied zwischen den Enden des Moleküls und dem Rest von jenem. Indem positiv geladene Polymere auf einer Glasoberfläche adsorbiert werden, begünstigt man eine Adsorption der negativ geladenen DNA-Moleküle; wenn diese Ladung indessen hoch ist, wird das DNA-Molekül über seine gesamte Länge angeheftet und das Kämmen ist unmöglich. Es ist aber möglich, die Ladung der auf dem Glas adsorbierten Polymere zu modifizieren, indem die pH-Bedingungen modifiziert werden; tatsächlich werden die positiven Ladungen beispielsweise durch NH2-Gruppen getragen, die bei einem pH unterhalb des pK der entsprechenden Base in den protonierten Zustand NH3 + übergehen. Bei basischem pH verschwinden die Ladungen und die Oberfläche zieht keine DNA mehr an. Indem man den pH fein kontrollierte, wurde beobachtet, dass die DNA-Moleküle in Lösung von einem Zustand, wo sie an der Oberfläche vollständig angeheftet sind, zu einer Zwischenphase, wo sie lediglich durch ihre Enden angeheftet sind, dann zu einer Phase, wo die Oberfläche keine Affinität für die DNA mehr aufweist, übergehen. In der Zwischenphase ist das Molekülkämmen ausführbar.
  • Es wurden mit einem Silan, welches Enden in Form einer NH2-Gruppe aufweist, bedeckte Oberflächen untersucht, bei denen man eine vollständige Anheftung bei pH < 8, ein Kämmen für 8,5 < pH < 9,5 beobachtet. Die Anzahl von gekämmten Molekülen ist bei pH = 8,5 maximal, sie ist bei pH = 9 durch zwei geteilt und bei pH = 9,5 durch 4. Es wurde auch die relative Streckung auf dieser Oberfläche bestimmt, die 1,26 entspricht, wie man dies sehen kann in dem Histogramm 2 der 7, welche Histogramme der Länge der λ-DNA-Moleküle, welche auf Glasoberflächen:
    • a) welche mit Silanmolekülen bedeckt sind, deren Ende durch eine Amingruppe gebildet wird,
    • b) welche mit Polylysin bedeckt sind;
    • c) welche in einer Mischung von Wasserstoffperoxid/Schwefelsäure gereinigt worden sind,

    gekämmt worden sind, repräsentiert.
  • Man hat auch mit Polylysin bedeckte Oberflächen berücksichtigt, die ähnliche pH-Verankerungseigenschaften aufweisen: Kämmbereich 8,5, und eine relativ geringere Streckung zeigen: 1,08. Man kann ein typisches Beispiel in 8 ersehen, welches auf mit Polylysin bedeckten Glas oberflächen gekämmte DNA-Moleküle repräsentiert. Man stellt fest, dass die durch ihre beiden Enden angehefteten Moleküle Schleifen bilden.
  • Schließlich wurde das gleiche Verhalten auf in einer Mischung von Wasserstoffperoxid/konzentrierter Schwefelsäure frisch gereinigten Glasoberflächen gefunden. Diese Oberflächen sind sehr benetzend und verschmutzen schnell, indessen wurde ein Kämmbereich zwischen 5,5 < pH < 7,4 beobachtet, wohingegen der Bereich starker Adsorption bei pH = 4,5 liegt. Die relative Ausdehnung oder Streckung der Moleküle entspricht 1,12.
  • BEISPIEL 3
  • Gleichförmige und gerichtete Ausrichtuung von YAC
  • 1 μl von vorab in ihrem Agaroseblock mit Hilfe einer fluoreszierenden YOYO1-Sonde gefärbten YAC wird bei 68°C erwärmt, mit Agarase behandelt, dann in 10 ml MES (50 mM, pH 5,5) verdünnt. Zwei silanisierte Plättchen (Oberflächen-C=C) werden ≈ 1,5 h in dieser Lösung inkubiert, dann mit ungefähr 170 μm/s zurückgezogen. Die YAC-Moleküle werden allesamt parallel zu der Richtung des Zurückziehens der Plättchen ausgerichtet (9). Die Unversehrtheit der so ausgerichteten Moleküle ist besser als durch Verdampfung nach Abscheidung zwischen zwei Plättchen.
  • Hybridisierung eines Cosmids an ein gekämmtes YAC
  • Ein wie zuvor beschrieben gefärbtes YAC wird auf einer Oberfläche mit C=C (zwischen zwei Plättchen) verankert, dann durch den Meniskus im Verlauf der Verdampfung der Lösung ausgerichtet. Die Sonden (Cosmide) werden durch Einbau eines biotinylierten Nukleotids durch die "random priming"-Technik markiert. Die markierten Sonden (100 ng) und 5 μg beschallte (≈ 500 bps) Lachssperma-DNA werden durch Präzipitation in Naacetat und Ethanol gereinigt, dann in Formamid denaturiert.
  • Die gekämmten YACs werden zwischen zwei Plättchen mit 120 μl Denaturierungslösung (70% Formamid, 2 × SSC) auf einer Heizplatte bei 80°C 3 min denaturiert. Die zuvor denaturierten Sonden (20 ng) werden auf das Plättchen in einer Hybridisierungslösung (55% Formamid, 2 × SSC, 10% Dextransulfat) aufgetragen, mit einem Plättchen abgedeckt, welches mit flüssigem Gummi (Kautschukkitt) verklebt bzw. versiegelt wird. Die Hybridisierung erfolgt eine Nacht bei 37°C in einer feuchten Kammer.
  • Die Sichtbarmachung der Hybride erfolgt gemäß den bekannten Protokollen für die in situ-Hybridisierungen an dekondensierten Chromosomen (D. Pinkel et al., PNAS USA 83, 2934 (1986) und PNAS USA 85, 9138 (1988)).
  • Bei einer Fluoreszenzmikroskopie beobachtet man dann hybridisierte Abschnitte, wie jenen, der in der 10 gezeigt ist. Dieses Beispiel zeigt die Möglichkeit, das Vorhandensein eines Gens auf einem DNA-Molekül nachzuweisen, die zu Zwecken einer Diagnose oder einer physischen Kartierung des Genoms eingesetzt werden kann.

Claims (43)

  1. Verfahren zur Ausrichtung von einem oder mehreren Makromolekül(en) auf der Oberfläche S eines Trägers, dadurch gekennzeichnet, dass man auf der Oberfläche S die Tripel-Linie S/A/B/ (Meniskus), welche aus dem Kontakt eines Lösemittels A mit der Oberfläche S und einem fluiden oder gasförmigen Medium B resultiert, sich verschieben lässt, wobei die Makromoleküle einen Abschnitt, insbesondere ein Ende, haben, der auf der Oberfläche S verankert ist, wobei der andere Abschnitt, insbesondere das andere Ende, sich in Lösung in dem Lösemittel A befindet.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verschiebung des Meniskus durch Verdampfen des Lösemittels A erfolgt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verschiebung des Meniskus durch Verschiebung bezüglich der Grenzfläche A/B bezogen auf die Oberfläche 5 erfolgt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass für das Verschieben des Meniskus die Oberfläche 5 von dem Lösemittel A zurückgezogen wird oder das Lösemittel A von der Oberfläche S zurückgezogen wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Meniskus ein Wasser-Luft-Meniskus ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger wenigstens an der Oberfläche aus einem organischen oder anorganischen Polymer, einem Metall, einem Metalloxid oder -sulfid, einem Halbleiterelement, wie Silicium, oder einem Halbleiterelementoxid oder einer von deren Kombinationen gebildet wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger wenigstens an der Oberfläche aus Glas, aus an der Oberfläche oxidiertem Silicium, aus Gold, Graphit, Molybdänsulfid oder Glimmer gebildet wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger in Platten-, Kugel-, Faser- oder Teilchenform vorliegt.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösemittel A, in welchem die auszurichtenden Makromoleküle sich in Lösung befinden, zwischen zwei Trägern, von denen wenigstens einer dem Träger mit der Oberfläche S entspricht, angeordnet ist und der Meniskus durch Verdampfung verschoben wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verankerung des Makromoleküls durch physikalisch-chemische Wechselwirkung, insbesondere Adsorption, oder durch kovalente Bindung entweder direkt zwischen der Oberfläche und dem Makromolekül oder indirekt zwischen der Oberfläche und einem anderen Molekül, das das Makromolekül erkennt und/oder mit diesem wechselwirkt, erfolgt.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Träger einsetzt, der an der Oberfläche eine exponierte reaktive Gruppe mit einer Affinität für das Makromolekül oder ein Molekül mit biologischer Aktivität, das in der Lage ist, das Makromolekül zu erkennen, aufweist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche mit einer Gruppe, ausgewählt unter den Vinyl-, Amin-, Carboxyl-, Aldehyd- oder Hydroxylgruppen, bedeckt ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche umfasst: – auf einem Träger eine im wesentlichen monomolekulare Schicht aus einer organischen Verbindung mit langgestreckter Struktur, welche wenigstens aufweist: – eine Anheftungsgruppe, die eine Affinität für den Träger aufweist, und – eine exponierte Gruppe, die keine oder nur geringe Affinität für den Träger und die Anheftungsgruppe unter den Anheftungsbedingungen aufweist, aber, gegebenenfalls nach einer chemischen Modifizierung nach der Anheftung, eine Affinität für das Makromolekül oder Molekül mit biologischer Aktivität aufweist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verankerung eines Abschnitts eines Makromoleküls durch Adsorption auf eine Oberfläche ausführt, indem man das Makromolekül in einem bestimmten pH- oder Ionengehalt-Bereich des Mediums in Kontakt mit der Oberfläche bringt oder indem man eine bestimmte elektrische Spannung an die Verankerungsoberfläche anlegt.
  15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der pH zur Ausführung der Verankerung in einem Bereich zwischen einem pH, der einen Zustand vollständiger Adsorption begünstigt, und einem pH, der ein Fehlen von Adsorption begünstigt, ausgewählt wird.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei welchem man die Verankerung einer Nukleinsäure oder eines Proteins durch Adsorption auf eine Oberfläche, die ethylenische Doppelbindungen umfassende Gruppen oder Amingruppen aufweist, aus führt, indem man die Nukleinsäure oder das Protein in einem bestimmten pH- oder Ionengehalt-Bereich des Mediums mit der Oberfläche in Kontakt bringt.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verankerung von nicht-funktionalisierter DNA durch Adsorption auf Oberflächen, die von Molekülen, deren Enden aus einer Vinyl- oder Amingruppe bestehen, bedeckt sind, ausführt.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, bei welchem man die Verankerung der DNA durch ihr Ende auf einer Oberfläche, die Gruppen mit ethylenischen Doppelbindungen aufweist, ausführt, indem man die DNA mit der Oberfläche bei einem pH unter 8 in Kontakt bringt.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einem pH zwischen 5 und 6 ausgeführt, dann bei pH 8 gestoppt wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man die DNA-Verankerung durch ihr Ende auf einer Oberfläche, die mit Polylysin oder einer Silangruppierung, deren Ende eine Amingruppe bildet, bedeckt ist, ausführt.
  21. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verankerung der DNA durch ihr Ende auf einer Oberfläche, die mit einer Amingruppe bedeckt ist, ausführt, indem man die DNA mit der Oberfläche bei einem pH zwischen 8 und 10 in Kontakt bringt.
  22. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man die DNA-Verankerung durch ihr Ende auf einer zuvor in einem Säurebad behandelten Glasoberfläche ausführt, indem man die DNA mit der Oberfläche bei einem pH zwischen 5 und 8 in Kontakt bringt.
  23. Verfahren zum Nachweis, zur Abtrennung und/oder zur quantitativen Bestimmung eines Makromoleküls in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Ausrichtungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 einsetzt, bei welchem sich an der Oberfläche S ein Molekül mit biologischer Aktivität, welches in der Lage ist, das Makromolekül der Probe zu erkennen, angeheftet befindet, und dass der Nachweis, die Abtrennung oder die quantitative Bestimmung mit Hilfe eines fluoreszierenden oder nicht-fluoreszierenden Reagens, das die Anwesenheit des angehefteten Moleküls oder des Makromoleküls detektiert, ausgeführt werden.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Makromolekül und das Molekül mit biologischer Aktivität unter den Proteinen, den Nukleinsäuren, den Lipiden, den Polysacchariden und deren Derivaten ausgewählt werden.
  25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Makromolekül und das Molekül mit biologischer Aktivität unter den Antikörpern, den Antigenen, den DNA und RNA, den Liganden oder deren Rezeptoren wie auch deren Derivaten ausgewählt werden.
  26. Verfahren nach den Ansprüchen 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die angeheftete DNA die zu einer Sequenz von aus einer Probe zu isolierender DNA komplementäre Sequenz umfasst.
  27. Verfahren nach den Ansprüchen 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das angeheftete Protein in der Lage ist, ein aus einer Probe zu isolierendes Protein spezifisch zu erkennen und zu binden.
  28. Verfahren nach den Ansprüchen 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül mit biologischer Aktivität unter Biotin, Avidin, Streptavidin, deren Derivaten oder einem Antigen-Antikörper-System ausgewählt wird.
  29. Verfahren nach den Ansprüchen 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche schwach fluoreszierend ist und dass das Reagens fluoreszierend ist.
  30. Verfahren nach den Ansprüchen 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens durch Kugeln gebildet wird.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch optische Mikroskopie oder bei einem Nahfeld erfolgt.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass man das Reaktionsprodukt zwischen dem Molekül mit biologischer Aktivität und dem Makromolekül der Probe einer Beanspruchung unterwirft, um die schlechten Paarungen vor dem Nachweis zu zerstören.
  33. Verfahren zum Nachweis eines Makromoleküls, bestehend aus einer DNA-Sequenz oder einem Protein in einer Probe, gemäß einem der Ansprüche 23 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass: – man die Probe, entsprechend dem Lösemittel A, in welchem sich das Makromolekül in Lösung befindet, in Kontakt mit der Oberfläche des Trägers bringt unter Bedingungen für die Bildung eines DNA/DNA-, DNA/RNA-Hybrids oder für die Bildung des Produkts aus der Protein/Protein-Reaktion, – man, wobei das Hybrid oder ein Markierungs-Makromolekül des Hybrids oder des Reaktionsprodukts in einem Abschnitt verankert ist, wobei der Rest sich in Lösung befindet, dieses streckt durch Verschieben des Meniskus, der durch den Kontakt des Lösemittels mit der Oberfläche erzeugt wird, um die Hybride oder die Markierungs-Makromoleküle zu orientieren, und man die Messung oder die Beobachtung der so orientierten Hybride oder Markierungs-Makromoleküle vornimmt.
  34. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die angeheftete DNA und die DNA der Probe auf unterschiedliche Weise „gefärbt" sind und man nach dem Strecken die Lage der komplementären Sequenz bezogen auf das Ende der DNA der Probe misst.
  35. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass man eine ELISA- oder FISH-Nachweismethode einsetzt.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe das Produkt oder das Substrat einer enzymatischen Nukleinsäureamplifizierung ist.
  37. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA gestreckt, dann denaturiert, dann mit spezifischen Sonden hybridisiert wird, um die Lage oder die Größe von einer oder mehreren bestimmten DNA-Sequenzen zu bestimmen.
  38. Verfahren zur physischen Kartierung oder Restriktionskartierung eines Gens auf einer genomischen DNA, bei welchem die DNA ausgerichtet und/oder nachgewiesen wird gemäß einem Verfahren von einem der Ansprüche 1 bis 37.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Lage und die Größe des untersuchten Gens auf der genomischen DNA durch die Hybridisierung mit für das zu kartierende Gen spezifischen Sonden bestimmt werden.
  40. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA gestreckt, dann denaturiert, dann mit spezifischen Sonden hybridisiert wird, um das Vorhandensein oder das Fehlen von einer oder mehreren gegebenen DNA-Sequenzen zu bestimmen.
  41. Verfahren zur Diagnose einer Pathologie, welche mit dem Vorhandensein oder mit dem Fehlen einer gegebenen DNA-Sequenz, welche für die Pathologie spezifisch ist, verbunden ist, bei welchem man ein Verfahren nach Anspruch 40 einsetzt.
  42. Verfahren zur Herstellung eines Gens ausgehend von genomischer DNA, dadurch gekennzeichnet, dass man die Lage dieses Gens auf der durch das Verfahren von einem der Ansprüche 1 bis 36 ausgerichteten genomischen DNA mit Hilfe einer für das Gen spezifischen Sonde identifiziert und man die enzymatische Amplifizierung der Sequenz dieses Gens und/oder von dessen flankierenden Sequenzen vornimmt und man das amplifizierte Produkt isoliert.
  43. Verwendung eines Gens, das durch ein Verfahren nach Anspruch 42 erhalten worden ist, zur Herstellung eines DNA-Konstrukts, das in einem Verfahren zum Ersetzen eines Gens in dem Genom einer eukaryotischen Zelle durch gezielte Insertion eines Fremdgens nützlich ist, wobei das Fremdgen durch das Verfahren des Anspruchs 42 erhalten wird.
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