DE69531667T2

DE69531667T2 - Festphasen, spezifisch für biologische reaktionen, ihre herstellung und anwendung

Info

Publication number: DE69531667T2
Application number: DE69531667T
Authority: DE
Inventors: David Bensimon; Aaron Bensimon; François HESLOT
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1994-02-11
Filing date: 1995-02-10
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2015-02-11
Also published as: CA2182905C; KR100424939B1; US20020031774A1; FR2716263B1; EP0743988A1; US6265153B1; US6548255B2; EP1369494A3; AU1712095A; US6130044A; DE69531666D1; DE69531667D1; US5846724A; CN1144561A; KR100395018B1; AU1814595A; PT743988E; ES2206494T3; JP3741718B2; ATE249045T1

Description

Die Erfindung betrifft insbesondere sehr hoch spezifische Oberflächen, welche auf dem Gebiet der Biologie einsetzbar sind, sowie deren Anwendungen und Verfahren zu deren Herstellung.
Man kennt seit langem die sehr große Spezifität und die sehr große Selektivität von bestimmten biologischen Reaktionen, insbesondere den Antigen/Antikörper-Reaktionen, den Hybridisierungsreaktionen von DNA oder RNA, den Inter-Protein-Reaktionen oder Reaktionen vom Typ Avidin/Streptavidin/Biotin ebenso wie den Reaktionen von Liganden und von deren Rezeptoren.
Man versteht jetzt, Vorteil aus diesen Spezifitäten zu ziehen, insbesondere um das Vorhandensein oder das Fehlen von einem der Elemente des Reaktionspaars in einer Probe nachzuweisen, oder ebenso, um gegebenenfalls eines der Elemente des Paars von einem komplexeren Medium abzutrennen.
Wenn man gleichwohl wünscht, das Vorhandensein eines Moleküls in sehr geringer Konzentration in einem sehr komplexen Medium nachzuweisen, liefern die gegenwärtig bekannten Verfahren manchmal sehr auf Zufall beruhende Ergebnisse, berücksichtigt man insbesondere das Problem des Hintergrunds, welches sich während der Schritte der Abtrennung und/oder des Nachweises auswirkt.
Aus diesem Grund war das, was im Folgenden als "Molekülfischen" bezeichnet werden wird, d. h. die Möglichkeit, jedes der Moleküle, nach denen gesucht wird, wenn sie in sehr geringen Konzentrationen vorliegen, nachweisen zu können, bis dahin nicht möglich gewesen.
Als Beispiel erfolgt die Analyse einer DNA-Probe durch Verwendung einer sogenannten "Hybridisierungs"sonde, welche der zu der gesuchten Sequenz komplementären Sequenz entspricht. Unter diesen Bedingungen besteht das sich stellende Problem darin, das Hybrid aus dem Medium zu isolieren und mit einem guten Signal/Rausch (S/N)-Verhältnis die gegebenenfalls geringere Anzahl von positiven Reaktionen nachzuweisen.
Aus diesem Grunde verwendet man jetzt in der Hauptzahl der Fälle einen zwischengeschalteten Schritt, welcher dazu bestimmt ist, die Sequenz, die man nachzuweisen wünscht, zu amplifizieren, beispielsweise indem man die PCR-Methode oder Amplifizierungsmethoden, die zu den gleichen Ergebnissen führen, einsetzt; unter diesen Bedingungen erhöht man die Konzentration der zu bestimmenden Sequenz in der Probe und dieser Nachweis ist natürlich viel bequemer.
Indessen ist der Amplifizierungsschritt empfindlich gegenüber Verunreinigungen und führt zu Fehlern, die diesem eigen sind.
Es wäre dementsprechend vorzuziehen, im Rahmen des Möglichen das Vorhandensein der Nukleinsäuresequenz ohne Amplifizierungsphase nachweisen zu können.
Es wurde vorgeschlagen, um die spezifische Hybridisierungsreaktion nachweisen zu können, einen zwischengeschalteten Schritt einer Verankerung des Hybridisierungsprodukts auf einer festen Oberfläche, welche bestimmte Spezifitäten aufweist, einzusetzen. Es ist beispielsweise möglich, bestimmte vorbehandelte Oberflächen einzusetzen, die es erlauben, bestimmte Proteine oder DNA, die modifiziert worden ist oder nicht, anzuheften.
Solche Oberflächen sind kommerziell erhältlich (zum Beispiel Covalink, Costar, Estapor, Bangs, Dynal) in Form von Kugeln oder von Vertiefungen, welche auf ihrer Oberfläche beispielsweise COOH-, NH₂- oder OH-Gruppen aufweisen.
Es wurde gleichfalls vorgeschlagen, um solche Gruppen zu erhalten, einen zwischengeschalteten Schritt einzusetzen, um eine Vinylgruppe zu präsentieren, die dann oxidiert wird, damit COOH- oder OH-Gruppen präsentiert werden (USA 4.539.061 und EP 435 785 ).
EP 0 388 940 beschreibt magnetische Teilchen auf Basis von Polyacrylamid oder Polystyrol, die mit einer monomolekularen Schicht bedeckt sind, welche einen hydrophilen Teil (COOH-, NH₂-, OH- ... -Reste) und einen hydrophoben Teil (Olefin, wie Vinylen oder Vinyliden) umfasst. Diese Teilchen erlauben die Adsorption von Antikörpern und werden in Immunagglutinationstests eingesetzt.
Man kann dann die DNA mit einer reaktiven Gruppe, Amin zum Beispiel, funktionalisieren und eine Reaktion mit diesen Oberflächen vornehmen. Diese Methoden erfordern indessen eine spezielle Funktionalisierung der zu bindenden DNA.
Es wurde gleichfalls eine Technik beschrieben, die die Verankerung von DNA ohne vorab erfolgende Behandlung erlaubt. Dieses Verfahren besteht darin, das freie Phosphat des 5'-Endes des Moleküls mit einem sekundären Amin (NH-Oberfläche Covalink) reagieren zu lassen.
Man kann die DNA auch an eine Gruppe oder ein Protein P₀ binden, um diese(s) mit einer Oberfläche, die mit einer Gruppe oder einem Protein P₁, welche(s) in der Lage ist, spezifisch mit P₀ zu reagieren, bedeckt ist, reagieren zu lassen. Das Paar P₀/P₁ kann beispielsweise ein Paar vom Typ Biotin/Streptavidin oder Digoxigenin/gegen Digoxigenin gerichteter Antikörper (anti-DIG) sein.
Solche Oberflächen sind indessen in der Hauptzahl der Fälle von unzureichender Spezifität (V. Lund et al., Nucl. Acids Res., 16, 1861 (1988)). So führt beispielsweise das Vorhandensein von parasitären Wechselwirkungen, sogar wenn sie schwach sind, vom Typ einer nicht-spezifischen Adsorption zu wirksamen Adsorptionen für lange Moleküle, welche in der Lage sind, mit dem Feststoff eine große Anzahl von schwachen Wechselwirkungsstellen einzugehen. Diese Oberflächen führen zu Anwendungen, denen potentiell Empfindlichkeit fehlt und/oder mit einem hohen Hintergrundniveau in dem Falle einer kleinen Anzahl von zu fischenden Molekülen. Außerdem weisen bestimmte von diesen Oberflächen einen hohen parasitären Fluoreszenzgrad auf, welcher potentiell während der Nachweisphase stört.
Was den Nachweis im engeren Sinne betrifft, insbesondere für den Nachweis von DNA, beschreibt das französische Patent 78 10975 ein Verfahren, bei welchem die Sonde an ein Enzym gekoppelt wird, welches den Nachweis mit Hilfe eines chromogenen Substrats erlaubt. Es ist außer dem möglich, die Reaktion durch eine kolorimetrische Messung zu quantifizieren.
Eine solche Technik ist indessen nicht direkt für den Nachweis von Spuren angepasst, aus welchem Grunde dieser auch hier wieder in der Hauptzahl der Fälle ein Schritt einer Amplifizierung der Menge der gesuchten Nukleinsäure, beispielsweise durch die PCR-Methode, vorangehen muss.
Dieses sogenannte Nachweisverfahren "mittels kalter Sonde" wurde entwickelt, um die Verwendung von radioaktiven Markern zu vermeiden, welche Ergebnisse liefern, die hinsichtlich Empfindlichkeit nahekommen, bei denen es aber selbstverständlich Handhabungsprobleme, berücksichtigt man das Vorhandensein von radioaktiven Produkten, und Probleme mit langen Entwicklungszeiten, wenn man eine hohe Empfindlichkeit wünscht, gibt.
Für bestimmte besondere Anwendungen, insbesondere Verfahren, die sich von der Bildgebung ex vivo ableiten, wurde eine direkte Methode zur Beobachtung der Reaktion vorgeschlagen, indem man das Hybridisierungsprodukt mit Mikrokugeln, insbesondere PMMA, welche an ihrer Oberfläche in geeigneter Weise chemisch vorbehandelt worden sind, koppelt. Die Methode beruht auf der direkten Identifizierung des Vorhandenseins dieser Mikrokugeln mit einem typischen Durchmesser von 60 nm unter dem Rasterelektronenmikroskop und beruht außerdem auf den bekannten, aber unzureichend spezifischen Techniken einer Verankerung auf Feststoffen, wie dies weiter oben beschrieben worden ist.
Die obigen Techniken sind selbstverständlich nicht auf den Nachweis von Nukleinsäuren beschränkt. In demselben Sinne wurde beispielsweise der Nachweis von Antikörpern vorgeschlagen. Es handelt sich um Tests vom ELISA-Typ, die wir hier nicht erneut beschreiben werden und die, um dies zusammenzufassen, es erlauben, die Anwesenheit eines Antikörpers mit einer Verankerung verbunden mit einem Antigenmolekül auf einem Feststoff zu koppeln. Erneut stellen sich die Probleme von Spezifität und parasitären Reaktionen. Die Nachweisphase kann dann auf einer Kopplung mit einer chromogenen Reaktion, welche ihre eigenen Probleme hinsichtlich Empfindlichkeit aufweist, beruhen.
Zusammengefasst, weisen die Verfahren des Standes der Technik oder deren Kombinationen eine bestimmte Anzahl von Nachteilen auf, insbesondere:

– entweder, dass sie durch Einsatz von radioaktiven Produkten potentiell gefährlich sind,
– oder dass sie zu lange Entwicklungszeiten erfordern,
– oder dass sie durch spezielle Probleme auf der Ebene der Amplifizierungsphase behindert werden,
– oder dass sie mittels unzureichend spezifischer fester Oberflächen erfolgen,
– oder dass sie zu wenig empfindlich sind,
– oder dass sie schließlich zusätzlich zu der Verankerungsphase auf einem Feststoff die natürlich wenig bequeme Verwendung eines Elektronenmikroskops erforden.

Schließlich erlauben die bekannten Verfahren in der Hauptzahl der Fälle nicht, auf einem gegebenen Molekül die spezielle Position des gesuchten Motivs zu erkennen. Nun ist dieser Erkennungstyp von Bedeutung, wenn man eine Kartierung, insbesondere im Rahmen der Genomkartierung, vorzunehmen wünscht, man danach strebt, zunächst die ungefähre räumliche Position bezogen auf ein Ende des Moleküls eines gegebenen Gens auf einer DNA oder einer RNA kennenzulernen.
Die Erfindung, die sich vorgenommen hat, den Nachteilen der früheren Verfahren abzuhelfen, beruht auf der Verwendung von sehr hoch spezifischen Oberflächen, die während ihres Einsatzes zu überaus stark beschränktem Hintergrund führen, insbesondere aufgrund der Tatsache, dass sie die parasitären Anheftungen eliminieren.
Die Erfindung betrifft insbesondere eine hochspezifische Oberfläche für biologische Reaktionen, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Träger umfasst, welcher an der Oberfläche wenigstens eine im wesentlichen kompakte Schicht von einer organischen Verbindung aufweist, welche auf der Außenseite der Schicht eine exponierte Gruppierung, welche eine ethylenische Doppelbindung umfasst, insbesondere eine Vinylgruppe, mit einer Affinität für einen Molekültyp mit biologischer Aktivität unter bestimmten Reaktionsbedingungen, insbesondere pH- oder Ionengehalt-Bedingungen, aufweist, wobei die anderen Bestandteile der Schicht für die genannten Moleküle unter den genannten Reaktionsbedingungen im wesentlichen unzugänglich sind.
Unter "Affinität" soll hier ebenso eine chemische Reaktivität wie auch eine Adsorption irgendeiner Art, dies unter den Anheftungsbedingungen der genannten biologischen Moleküle, verstanden werden.
Mit "Träger" soll hier gleichermaßen ein fester Träger wie auch ein Träger, welcher aus einem nicht festen Element gebildet wird, wie ein flüssiges oder gasförmiges Teilchen, welcher insbesondere eine kompakte Schicht, wie oben beschrieben, aufweist, bezeichnet werden.
Die Oberfläche ist "im wesentlichen kompakt", d.h sie begrenzt den Zutritt des Moleküls mit biologischer Aktivität zu den inneren Schichten und/oder zu dem Träger, wobei es sich versteht, dass Mängel der Bedeckung der Oberfläche tolerierbar sind.
Diese hoch spezifischen Oberflächen für biologische Reaktionen umfassen einen Träger, welcher an der Oberfläche Gruppen mit einer Doppelbindung, insbesondere Vinyl (-CH=CH₂, im Folgenden Oberflächen -C=C), die für die Lösung zugänglich sind, aufweist. Sie sind in der Lage, Moleküle von biologischem Interesse (DNA, RNA, PNA, Proteine, Lipide, Saccharide) unter bestimmten pH- oder Ionengehalt-Bedingungen des Mediums direkt zu verankern. Diese Oberflächen erfordern insbesondere keine besondere chemische Modifizierung weder der Oberfläche noch der zu verankernden biologischen Moleküle. Es existieren keine Dokumente, die eine solche Verwendung einer Oberfläche mit Vinylgruppen erwähnen.
Unter "Verankerung" soll hier eine Anheftung durch kovalente Bindung, welche aus einer chemischen Reaktivität resultiert, oder nicht-kovalente Bindung, welche aus physikalisch-chemischen Wechselwirkungen, wie einer Adsorption irgendeiner Art, resultiert, dies unter den pH- oder Ionengehalt-Bedingungen des Mediums für die Anheftung der biologischen Moleküle, verstanden werden.
Die erfindungsgemäßen Oberflächen können durch das Ausführen von verschiedenen Verfahren erhalten werden. Man kann als Beispiel aufführen:

(A) eine Schicht von kohlenstoffhaltigem, gegebenenfalls verzweigtem Polymer mit einer Dicke von wenigstens 1 nm, welche aufweist:
– Gruppen, welche eine ethylenische Doppelbindung umfassen,
– wobei der Rest der Schicht aus kohlenwasserstoff- oder fluorkohlenwasserstoffhaltigen Gruppen gebildet wird;
(B) Oberflächen, welche durch Abscheidung oder Verankerung von einer oder mehreren Molekülschichten auf einem Feststoff erhalten werden, wobei diese durch die Bildung von aufeinanderfolgenden Schichten, die durch nicht-kovalente Bindungen vom Typ eines Langmuir-Blodgett-Films angeheftet werden, oder durch selbsttätige Molekülzusammenlagerung, wobei dies die Bildung einer durch kovalente Bindungen angehefteten Schicht erlaubt, erhalten werden können.

In dem ersten Falle kann die Oberfläche durch Polymerisation von wenigstens einem Monomer, welches an der Oberfläche des Polymers die Gruppe, welche eine ethylenische Doppelbindung umfasst, erzeugt, oder ebenso durch partielle Depolymerisation der Oberfläche eines Polymers, um die Gruppe zu erzeugen, oder ferner durch Abscheidung von Polymer erhalten werden.
In diesem Verfahren weist das gebildete Polymer Vinylbindungen auf, wie ein Polyen-Derivat, insbesondere Oberflächen von Typ synthetischen Kautschuks, wie Polybutadien, Polyisopren oder Naturkautschuk.
In dem zweiten Falle umfasst die hoch spezifische Oberfläche für biologische Reaktionen gemäß der Erfindung:

– auf einem Träger eine im wesentlichen monomolekulare und kompakte Schicht einer organischen Verbindung von langgestreckter Struktur, welche wenigstens aufweist:
– eine Anheftungsgruppe, die eine Affinität für den Träger aufweist, und
– eine exponierte Gruppierung, die eine ethylenische Doppelbindung umfasst, die keine oder nur geringe Affinität für den Träger und die Anheftungsgruppe unter den Anheftungsbedingungen aufweist, aber eine Affinität für einen biologischen Molekültyp aufweist.

Um eine im wesentlichen kompakte Schicht zu erhalten, sind die verschiedenen organischen Verbindungen vorzugsweise in der Lage, miteinander außerhalb der exponierten Gruppierung unter Erzeugung von quer verlaufenden Bindungen zu reagierend man erhält so eine monomolekulare, "im wesentlichen" kompakte Schicht, dank welcher der Träger für parasitäre Reaktionen nicht oder nur wenig zugänglich wird.
Die organische Verbindung weist vorzugsweise eine Anheftungsgruppe an einem Ende und eine exponierte Gruppierung am anderen Ende auf. Es ist selbstverständlich möglich, unterschiedliche Ausführungsweisen vorzusehen, bei denen beispielsweise die Anheftungsgruppe sich mitten in dem Molekül befindet, wobei dieses an jedem seiner Enden über eine exponierte Gruppierung verfügt.
Die Oberflächen können zergliedert werden gemäß:

a) dem Träger
b) dem Molekül, welches eine exponierte Gruppierung und eine Gruppe für eine Anheftung an dem Träger aufweist,
c) der Wechselwirkung zwischen dem Träger und dem Molekül, welche die Anheftung sicherstellt.

Die Anheftung kann zuallererst vom nicht-kovalenten Typ sein, insbesondere vom Typ hydrophil/hydrophil und hydrophob/hydrophob, wie in den Filmen von Langmuir-Blodgett (K. B. Blodgett, J. Am. Chem. Soc. 57, 1007 (1935) und US 5.102.798 ).
In diesem Falle wird die Anheftungsgruppe entweder hydrophil oder hydrophob, insbesondere Alkyl- oder Halogenalkylgruppen, wie CH₃, CF₃, CHF₃, CH₂F, sein.
Die Anheftung kann gleichfalls vom kovalenten Typ sein; die Anheftungsgruppe wird dann auf dem Träger chemisch reagieren.
Bestimmte Oberflächen mit nahekommender Struktur wurden bereits auf dem Gebiet der Elektronik erwähnt, insbesondere wenn die Anheftungen kovalent erfolgen. L. Netzer und J. Sagiv, J. Am. Chem. Soc. 105, 674 (1983) und US-A-4,539 061.
Der Fachmann auf diesem Gebiet verfügt über ein sehr großes Spektrum von Gruppen. Als nicht einschränkendes Beispiel wird man die Gruppen vom Typ Metallalkoxid, wie Silan, Chlorsilan, Ethoxysilan, Methoxysilan, aufführen.
Die Anheftungsgruppe wird selbstverständlich abhängig von dem eingesetzten Träger ausgewählt. Der erfindungsgemäße Träger kann wenigstens an der Oberfläche durch ein Polymer, ein Metall, ein Metalloxid, ein Halbleiterelement oder ein Oxid eines Halbleiterelements, wie ein Siliciumoxid, oder eine von deren Kombinationen gebildet werden. Man kann insbesondere an der Oberfläche befindliches Glas oder oxidiertes Silicium aufführen.
Unter den Anheftungsgruppen kann man insbesondere die Gruppierungen von Metallalkoxidtyp, wie Silan, Chlorsilan, Chlorsilan, Silanol, Methoxysilan, Ethoxysilan, Silazan, vom Typ Phosphat, Hydroxy, Hydrazid, Hydrazin, Amin, Amid, Diazonium, Pyridin, Sulfat, Sulfonsäure, Carbonsäure, Boronsäure, Halogen, Säurehalogenid, Aldehyd aufführen.
Insbesondere wird man als Anheftungsgruppe vorzugsweise Gruppen einsetzen, die in der Lage sind, in Querrichtung mit einer äquivalenten, in der Nähe befindlichen Gruppe zu reagieren, um quer verlaufende Bindungen bereitzustellen; es wird sich beispielsweise um Derivate vom Typ Silan, insbesondere Dichlorsilan, Trichlorsilan, Dimethoxysilan, Trimethoxysilan, Diethoxysilan und Triethoxysilan, handeln.
Diese quer verlaufenden Bindungen können auch an irgendeiner Stelle in der Dicke der Einzelschicht bewirkt werden, indem man diese mit Hilfe von reaktiven Gruppen, die gegebenenfalls auf der Kette zwischen der Anheftungsstelle und der exponierten Gruppierung vorhanden sind, polymerisiert. Beispielsweise sind die diacetylenischen Gruppen bekannt, eine ein- oder zweidimensionale Polymerisation der Einzelschicht zu erlauben.
Die Wahl der Anheftungsgruppe wird selbstverständlich von der Natur des Trägers abhängen; die Gruppen vom Typ Silan sind für die kovalente Anheftung auf Glas und Siliciumdioxid gut geeignet.
Die Ketten, die die exponierte Gruppierung mit der Anheftungsgruppe verbinden, sind vorzugsweise Ketten, welche wenigstens 1 Kohlenstoffatom, vorzugsweise mehr als 6 und im allgemeinen 3 bis 30 Kohlenstoffatome umfassen. Wenn die Bildung einer seitlichen Kopplung sogar im Inneren der Schicht stattfindet, unabhängig davon, ob diese Kopplung ionisch, koordinativ oder kovalent erfolgt, erhält man hochgradig geordnete Schichten, welche durch selbsttätige Zusammenlagerung erhalten werden, sogar wenn die anfängliche Oberfläche lediglich eine geringere Anzahl von aktiven Verankerungsstellen verglichen mit der Anzahl von Molekülen, die in einer kompakten Einzelschicht erhalten werden, aufweist.
Man kann vorteilhafterweise im Falle von Glas oder von Siliciumdioxid die bekannten Oberflächenfunktionalisierungstechniken unter Verwendung von Silanderivaten, beispielsweise: Si-OH + Cl₃-Si-R-CH=CH₂ liefert Si-O-Si-R-CH=CH₂, wobei R beispielsweise aus (CH₂)₄ besteht, einsetzen. Eine solche Reaktion ist in der Literatur bekannt, mit einer Verwendung von ultrareinen Lösemitteln. Die Umsetzung führt zu einem Teppich von Molekülen, welche ihr C=C-Ende auf der Oberfläche exponiert nach Außen präsentieren.
Im Rahmen der Herstellung von Oberflächen mit sehr hoher Spezifität betrifft die Erfindung auch für solche Reaktionen eines Aufpfropfens von Molekülen mit einer C=C-Doppelbindung die Verwendung einer gasförmigen Phase, welches es erlaubt, die Verwendung von Lösemitteln zu vermeiden.
In dem Falle von Gold, wobei dieses gegebenenfalls in Form einer dünnen Schicht auf einem Substrat vorliegt, setzen die bekannten Techniken zur Oberflächenfunktionalisierung Thiolderivate, beispielsweise: Au + HS-R-CH=CH₂ liefert Au-S-R-CH=CH₂, wobei R beispielsweise aus (CH₂)₄ besteht, ein. Eine solche Umsetzung ist in flüssigem Medium beschrieben worden und führt, ebenso wie die vorangegangene Trichlorsilan-Siliciumdioxid-Reaktion, zu einem Teppich von Molekülen, welche ihr C=C-Ende auf der Oberfläche exponiert nach Außen präsentieren.
Selbstverständlich umfasst die Terminologie des "Trägers" ebenso eine einzige Oberfläche, wie einen dünnen Streifen, aber gleichfalls Teil chen, unabhängig davon, ob es sich um Siliciumdioxidpulver oder Polymerkugeln handelt, und auch irgendwelche Formen, wie Stäbe, Fasern oder einen strukturierten Träger, die außerdem magnetisch, fluoreszierend gemacht oder gefärbt sein können, wie dies im Rahmen der verschiedenen Techniken der quantitativen Bestimmung bekannt ist.
Der Träger wird vorzugsweise so ausgewählt, dass er nicht oder nur wenig fluoreszierend ist, wenn der Nachweis durch Fluoreszenz erfolgt.
Die gemäß den obigen Modalitäten (A) und (B) erhaltenen Oberflächen weisen eine sehr große Spezifität dank des Vorhandenseins von spezifischen reaktiven Stellen, welche entweder von den exponierten Gruppierungen oder von dem angehefteten Molekül stammen, auf.
Außerdem weisen die gemäß den Modalitäten (A) oder (B) erhaltenen Oberflächen die folgenden unerwarteten und bemerkenswerten Eigenschaften auf:

(i) eine spezifische, stark pH-abhängige Verankerung von DNA durch deren Enden ohne Notwendigkeit einer besonderen Funktionalisierung des Moleküls, begleitet von einem sehr geringen Ausmaß von nicht-spezifischen Wechselwirkungen;
(ii) die Möglichkeit, Proteine und anderen Moleküle von biologischem Interesse ohne besondere chemische Modifizierung daran zu verankern;
(iii) die Möglichkeit, gegenüber einem Antigen (beispielsweise Digoxigenin) oder einem Ligand (beispielsweise Biotin) spezifische Oberflächen herzustellen;
(iv) ein sehr geringes Ausmaß von eigener Fluoreszenz, wenn dies erforderlich ist, ein geringerer Fluoreszenz-Hintergrund (einer typischen Fläche von 100 × 100 μm) als das Fluoreszenzsignal eines einzelnen nachzuweisenden Moleküls;
(v) die Möglichkeit, isolierte Moleküle mit einem S/N-Verhältnis unabhängig von der Anzahl von Molekülen nachzuweisen, was dank unterschiedlicher Techniken mit hohem S/N-Verhältnis, welche weiter unten beschrieben werden und auf der Identifizierung des Vorhandenseins eines makroskopischen Markers, welcher eine schwache nicht-spezifische Wechselwirkung mit der Oberfläche aufweist, beruhen, möglich ist.

Die so erhaltenen Oberflächen sind vorzugsweise mit einem Molekül mit biologischer Aktivität bedeckt, das ausgewählt ist unter:

– den Proteinen,
– den Nukleinsäuren,
– den Lipiden,
– den Polysacchariden und deren Derivaten.

Unter den Proteinen kann man die Antigene und die Antikörper, die Liganden, die Rezeptoren, aber gleichfalls Produkte vom Typ Avidin oder Streptavidin wie auch die Derivate dieser Verbindungen aufführen.
Unter den RNAs und DNAs kann man gleichfalls die α,β-Derivate wie auch die Thio-Derivate und die gemischten Verbindungen, wie die PNA, aufführen.
Man kann gleichfalls gemischte Verbindungen, wie beispielsweise die Glycopeptide und die Lipopolysaccharide, oder ebenso andere Elemente, wie insbesondere Viren, Zellen, oder chemische Verbindungen, wie Biotin, anheften.
Die Anheftung der biologischen Moleküle kann kovalent oder nicht-kovalent, beispielsweise durch Adsorption, Wasserstoffbrückenbindungen, beispielsweise hydrophobe, ionische Wechselwirkungen, in welchem Falle man vorteilhafterweise eine Brückenbildung ("cross-linking", Vernetzung) zwischen den aufgepfropften Molekülen durch die bekannten Methoden ("Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S. C. Wong, CRC Press (1991)) vornehmen könnte, und dies, um ihren Zusammenhalt zu verstärken, erfolgen.
Mit einer exponierten Gruppierung, welche einen Rest -CH=CH₂ umfasst, die im Folgenden als "Oberflächen-C=C" oder "Oberfläche mit ethylenischer Bindung" bezeichnet werden wird, ist eine direkte Verankerung insbesondere von DNA oder von Proteinen möglich. Im Rahmen der Erfindung ist gezeigt worden, dass diese Oberflächen eine sehr stark pH-abhängige Reaktivität aufweisen. Diese Besonderheit erlaubt es, die Nukleinsäuren oder die Proteine, insbesondere durch deren Ende(n), zu verankern, indem ein bestimmter pH-Bereich eingesetzt wird, und häufig mit einer Reaktionsgeschwindigkeit, die durch den pH kontrolliert werden kann.
So ist für DNA bei pH 5,5 die Verankerungsreaktion in einer Stunde vollständig abgelaufen (wenn sie nicht durch die Diffusion begrenzt wird) und erfolgt durch die Enden. Im Gegenzug ist bei pH 8 die Verankerung sehr gering (Reaktionsgeschwindigkeit um 5 bis 6 Größenordnungen geringer). Dieser pH-abhängige und für die Enden spezifische Verankerungseffekt bedingt eine Verbesserung bezogen auf die anderen Oberflächen, die eine Funktionalisierung der DNA (Biotin, DIG, NHS, ...) oder spezielle Reagenzien (Carbodiimid, Dimethylpimelidat), die eine Peptid- oder Phosphorimidbindung zwischen -NH₂ und -COOH oder -POOH realisieren, erfordern.
Die erfindungsgemäßen Oberflächen können Proteine direkt verankern (Protein A, anti-DIG, Antikörper, Streptavidin u. s. w.). Es ist beobachtet worden, dass (i) die Aktivität des Moleküls bewahrt werden kann und (ii) dass die Reaktivität der hergestellten Oberfläche (anfänglich C=C) vollständig verborgen wird, um einzig der Reaktivität des Moleküls von Interesse Platz zu lassen. Es ist folglich möglich, ausgehend von einer anfänglich relativ breiten Reaktivität zu einer Oberfläche zu gelangen, welche eine sehr hoch spezifische Reaktivität, beispielsweise jene für spezielle Stellen auf einem Protein, aufweist.
Indem ein spezifischer Antikörper auf der Oberfläche verankert wird (beispielsweise anti-DIG), erzeugt man eine Oberfläche, deren Reaktivität auf das Antigen (beispielsweise die DIG-Gruppierung) beschränkt ist. Dies zeigt, dass die anfänglichen chemischen Gruppierungen durch die verankerten Antikörper allesamt verborgen worden sind.
Man kann auf den (chemisch oder biochemisch) reaktiven Oberflächen auch andere Moleküle mit biologischer Aktivität, insbesondere Viren oder andere Bestandteile: insbesondere Membranen, Membranrezeptoren, Polysaccharide, PNA, verankern.
Es ist gleichfalls möglich, das Produkt aus einer Reaktion von biologischem Interesse (beispielsweise der PCR) auf den hergestellten Oberflächen anzuheften.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Oberflächen, die durch das Ausführen der erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, und alle Verfahren, welche diesen Oberflächentyp einsetzen, unabhängig davon, ob es sich um Verfahren handelt, die den Nachweis und/oder die Quantifizierung von biologischen Molekülen, aber gleichfalls die Trennung von bestimmten biologischen Molekülen, insbesondere eine Entnahme durch Ausführung der Antigen/Antikörper- und/oder DNA-, DNA/RNA-Kopplungstechniken, erlauben.
Die Erfindung betrifft gleichfalls Verfahren zur Herstellung der hochspezifischen Oberflächen für biologische Reaktionen, wie sie zuvor für die Gewinnung von Schichten gemäß (A) und (B) beschrieben worden sind, und insbesondere das Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass:

– man auf einem Träger eine im wesentlichen monomolekulare und im wesentlichen kompakte Schicht von einer organischen Verbindung von langgestreckter Struktur, welche wenigstens aufweist:
– eine Anheftungsgruppe, die eine Affinität für den Träger aufweist, und
– eine exponierte Gruppierung, die eine ethylenische Doppelbindung umfasst, die keine oder nur geringe Affinität für den Träger und die Anheftungsgruppe unter den Anheftungsbedingungen aufweist, aber eine Affinität für einen biologischen Molekültyp aufweist,

Die Erfindung betrifft gleichfalls die Anwendungen der behandelten Oberflächen für den Nachweis von isolierten Molekülen mit Hilfe von spezifischen Reagenzien und Nachweismethoden mit einem S/N-Verhältnis, welches von der Anzahl von nachgewiesenen Molekülen unabhängig ist.
So betrifft die Erfindung allgemein ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung eines Moleküls mit biologischer Aktivität in einer Probe, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine solche Oberfläche, wie zuvor beschrieben, verwendet, auf welcher sich angeheftet ein Molekül mit biologischer Aktivität befindet, welches in der Lage ist, das Molekül aus der Probe zu erkennen, und dass der Nachweis oder die quantitative Bestimmung dank eines fluoreszie renden oder nicht fluoreszierenden Reagens, welches das Vorhandensein des angehefteten Moleküls nachweist, erfolgt.
Unter den Reagenzien unterscheidet man die fluoreszierenden Reagenzien und die nicht-fluoreszierenden Reagenzien.
Die fluorezierenden Reagenzien enthalten fluoreszierende Moleküle, welche mit Vorteil so ausgewählt werden, dass sie lange Moleküle mit einer Größe über 0,1 μm sind und auf spezifische Weise direkt oder indirekt mit den vorbehandelten Oberflächen reagieren. Beispielsweise, aber ohne sich deswegen darauf zu beschränken, kann ein doppelsträngiges DNA-Molekül, welches mit Hilfe von fluoreszierenden Sonden (Ethidiumbromid, YOYO, fluoreszierenden Nukleotiden u. s. w.) gefärbt worden ist, sich direkt auf einer Oberflächen-C=C oder durch eine Modifizierung des Moleküls (DIG, Biotin u. s. w.) auf einer Oberfläche, welche komplementäre Proteine (anti-DIG, Streptavidin u. s. w.) präsentiert, verankern.
Die nicht-fluoreszierenden Reagenzien bestehen insbesondere aus Kugeln, welche durch das Zwischenglied eines angehefteten Moleküls auf spezifische Weise direkt oder indirekt an einer vorbehandelten Oberfläche verankert werden. Dank der Behandlung der Oberflächen zeigen diese Kugeln eine schwache nicht-spezifische Wechselwirkung mit der Oberfläche. Beispielsweise, aber ohne sich deswegen darauf zu beschränken, weisen Dynal-Kugeln, welche mit Streptavidin bedeckt sind und durch das Zwischenglied einer biotinylierten DNA auf einer erfindungsgemäßen Oberfläche verankert werden, Stellen auf, die in der Lage sind, mit dem anderen Ende des DNA-Moleküls zu reagieren.
Je nachdem, ob das gesuchte Molekül direkt durch Fluoreszenz oder indirekt mit Hilfe der obigen Reagenzien nachgewiesen wird, wird man von einer "direkten Detektion" bzw. einem "direkten Nachweis" oder "mittels einer Markierung" sprechen.
Um die mit prohibitiv langsamen Reaktionszeiten verbundenen Probleme zu begrenzen, kann man vorteilhafterweise die Diffusionszeit der Reagenzien in Richtung der Oberfläche verringern, indem kleine Reaktionsvolumen eingesetzt werden. Beispielsweise, aber ohne sich darauf zu beschränken, führt man die Reaktion in einem Volumen von einigen Mikrolitern, welches bestimmt wird durch den Raum zwischen zwei Oberflächen, von denen eine behandelt ist, so dass sie reaktive Stellen gemäß der Erfindung präsentiert, und die andere inert oder behandelt worden ist, damit sie keine reaktiven Stellen aufweist, aus.
Der Nachweis der Anzahl von spezifischen Reaktionen, die ablaufen, kann an einer kleinen Anzahl von Molekülen (typischerweise 1 bis 1000) durch einen makroskopischen physikalischen Test mit geringem Hintergrund, welcher weder ein Elektronenmikroskop noch Radioaktivität noch notwendigerweise die PCR erfordert, erfolgen.
Die Nachweisverfahren können durch Personen, die lediglich geringe Laborerfahrung haben, ausgeführt werden.
Je nach dem Reagens können zwei Ausführungsweisen der Erfindung (Weise X und Weise Y) für den makroskopischen Nachweis mit geringem Hintergrund einer kleinen Anzahl von Verankerungsreaktionen des Reagens eingesetzt werden.
Bei der als Weise X bezeichneten Ausführungsweise der Erfindung wird ein Test der Anzahl von spezifischen Reaktionen, die abgelaufen sind, direkt durch eine Fluoreszenztechnik erhalten, welche es bei bestimmten Formen der Realisierung der Erfindung erlaubt, die Anzahl von Stellen, die reagiert haben, individuell zu identifizieren. In diesem Falle wird die hoch spezifische Oberfläche vorteilhafterweise so gewählt, dass sie einen sehr geringen Fluoreszenzgrad aufweist; insbesondere muss der Träger eine geringe Fluoreszenz aufweisen.
Nach der Verankerung des fluoreszierenden Reagens kann der Nachweis und die Zählung der gegebenenfalls kleinen Anzahl von Verankerungsreaktionen vorteilhafterweise mit Hilfe eines optischen Fluoreszenzmikroskops, welches ein Objektiv mit großer numerischer Apertur einsetzt, erfolgen, welches es erlaubt, die Anzahl von verankerten fluoreszierenden Molekülen entweder direkt mit dem Auge oder nach Signalerfassung festzustellen.
Man kann vorteilhafterweise eine Abtastung des Beobachtungsfelds vornehmen, um eine größere Oberfläche als das einzelne festgelegte Feld zu erforschen.
Bei der als Weise Y bezeichneten Ausführungsweise der Erfindung weist man ein makroskopisches Reagens vom Typ Kugel (beispielsweise fluoreszierend, magnetisch, gefärbt) nach.
Eine solche Technik ist von Manning et al. in dem Sinne abgeleitet, dass die Reaktion durch das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Mikrokugeln nachgewiesen wird. In einer Ausführungsweise umfasst ein neues Verfahren:

(i) die Verwendung von Kugeln mit spezifischer Reaktivität,
(ii) die Verwendung von Kugeln, die Größen aufweisen, die nicht nanoskopisch sind, sondern sich im Bereich von 0,1 μm–200 μm befinden, welche durch eine makroskopische Technik detektierbar sind, und
(iii) das Fehlen einer nicht-spezifischen Reaktion zwischen Kugeln und Oberfläche aufgrund der Verwendung des erfindungsgemäßen Produkts.

Die Anzahl von diesen makroskopischen Kugeln, welche jeweils eine Verankerungsreaktion charakterisieren, wird dann durch eine makroskopische physikalische Methode bestimmt, als zu welchen gehörig man, aber ohne sich darauf zu beschränken, die Lichtstreuung auf den Kugeln, die optische Mikroskopie und die Fluoreszenz der Kugeln aufführen kann.
Die Spezifität von bestimmten biologischen Reaktionen kann begrenzt sein. So können im Rahmen der Hybridisierung die Hybride unvollkommen sein (Reaktionen mit anderen Stellen), indem sie eine geringere Anzahl von Paarbildungen und folglich eine schlechtere Bindungsqualität aufweisen. Die Erfindung deckt gleichfalls den möglichen Einsatz eines Schritts eines Tests der Qualität der erhaltenen Bindungen ab. Dieser Test erlaubt, die auf nicht-spezifische, schwache Weise durch insbesondere Adsorption, hydrophobe Kräfte, unvollkommene Wasserstoffbrückenbindungen, unvollkommene Hybridisierung gepaarten Produkte zu dissoziieren.
Aus diesem Grund betrifft die Erfindung gleichfalls im Rahmen eines Verfahrens zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung, wie zuvor beschrieben, ein Verfahren, wo man das Reaktionsprodukt zwischen dem Molekül mit biologischer Aktivität und dem Molekül der Probe einer Beanspruchung aussetzt, um vor dem Nachweis die schlechten Paarungen zu zerstören.
Dieses Verfahren bietet außer der Möglichkeit, die fehlgepaarten Paare zu zerstören, die Möglichkeit, die Kopplungsprodukte zu orientieren, was die Messungen oder die Beobachtungen erleichtert.
Man kann so die Oberflächen nach Anheftung der komplementären Elemente einer Beanspruchung aussetzen, die gebildet werden kann durch die einzelne oder kombinierte Verwendung von:

– Zentrifugation,
– Magnetfeldgradient, welcher auf die nicht-fluoreszierenden Reagenzien, die dann so ausgewählt sind, dass sie magnetisierbare oder magnetische Mikrokugeln umfassen, angewendet werden kann,
– Bewegung/Rühren,
– Flüssigkeitsströmen,
– Meniskus-Passage,
– Elektrophorese
– Variation von Temperatur und/oder Temperaturgradient.

Man bestimmt dann durch die nachfolgend beschriebenen Nachweistechniken mit geringem Hintergrund die Anzahl von Systemen, die unversehrt geblieben oder zerstört worden sind.
Es empfiehlt sich, anzumerken, dass es dank der erfindungsgemäßen Oberflächen möglich ist, die Moleküle nach deren Anheftung durch wenigstens eine Stelle durch Passage des Luft/Wasser-Meniskus, insbesondere auf DNA, zu orientieren. So wurde festgestellt, dass die Passage des Luft/Wasser-Meniskus auf DNA, welche sich in Lösung befindet und auf der Oberfläche verankert ist, zu einer regelmäßigen Streckung oder Längung der verankerten Moleküle führt. Sie präsentieren sich dann an der frischen Luft in Form von fluoreszierenden langgestreckten kleinen Stäbchen. Diese langgestreckten Moleküle sind an der frischen Luft stabil und können sogar nach mehreren Wochen noch beobachtet werden, ohne dass sie einen offensichtlichen Abbau zeigen.
Diese bemerkenswerten und unerwarteten Beobachtungen legen eine Möglichkeit nahe, die Anzahl von DNA-Molekülen, die auf der Oberfläche verankert sind, zu zählen: einerseits ist, da die Oberflächen sehr wenig fluoreszierend sind, das Signal/Rausch (S/N)-Verhältnis gut, andererseits ist es, da man nach einem sehr gut korrelierten Gegenstand (Form von kleinen Stäbchen) sucht, sehr leicht, das S/N-Verhältnis zu erhöhen. D. h., man ignoriert die Stäube, die Inhomogenitäten, die keine besondere räumliche Korrelation aufweisen. Man sollte anmerken, dass in Lösung die in Form von Knäueln vorliegenden Moleküle thermisch fluktuieren, was sehr bedeutende Variationen von deren gesammeltem Fluoreszenzsignal im allgemeinen mit einer geringen Schärfentiefe mit sich bringt und deren Beobachtung begrenzt. Die Erfindung deckt auch diese Ausrichtungs- und Immobilisierungstechnik ab, die folglich die Beobachtung von isolierten Molekülen mit einem sehr hohen S/N-Verhältnis erlaubt.
Es ist bemerkenswert, dass dieses Verhältnis von der Anzahl von Verankerungsreaktionen unabhängig ist. Das S/N-Verhältnis, das bei dem Nachweis eines Moleküls auftritt, ist das gleiche wie für 10000. Außerdem erlaubt diese Strecktechnik, leicht zwischen Molekülen unterschiedlicher Längen zu unterscheiden.
Man kann vorteilhafterweise die folgenden Schritte vornehmen, um das S/N-Verhältnis weiter zu verbessern:

– Da das Molekül unbeweglich ist, kann man sein Fluoreszenzsignal integrieren.
– Die Beobachtung mit dem Mikroskop präsentiert einen kleinen Bereich (typischerweise 100 μm × 100 μm mit einem Immersionsobjektiv mit hundertfacher Vergrößerung, N.A. = 1,25). Für eine 1 cm²-Probe kann man entweder eine Abtastung vornehmen, oder die Verwendung von Objektiven mit geringerer Vergrößerung (10-fach oder 20-fach), aber mit hoher numerischer Apertur in Betracht ziehen.
– Da die kleinen Stäbchen stets parallel vorliegen, kann man eine Methode einer optischen räumlichen Filterung in Betracht ziehen, um das S/N-Verhältnis weiter zu verbessern.
– Es sind andere globale Fluoreszenzmethoden denkbar (EP Nr. 103426).
– Die Linearisierung der Moleküle beobachtet man im Rahmen einer chemischen Aufpfropfung (C=C) ebenso wie im Falle von Bindungen vom immunologischen Typ (DIG/anti-DIG).
– Befindet sich die Oberfläche einmal an der frischen Luft, sind die DNA-Moleküle stabil (bleiben unversehrt, sogar nach mehreren Wochen) und fluoreszierend. Man kann diese Eigenschaft in vorteilhafter Weise einsetzen, um den Verankerungsschritt von dem (Positions)Bestimmungs-/Zählungsschritt der verankerten Moleküle zeitlich zu trennen, wenn dieser Nachweis beispielsweise, aber ohne sich darauf zu beschränken, durch Fluoreszenzmikroskopie erfolgt. Eine solche Verwendung wird durch die Erfindung mit abgedeckt.
– Eine Doppel- (oder Mehrfach)-Fluoreszenztechnik kann gegebenenfalls dazu dienen, das S/N-Verhältis zu verbessern oder eine doppelte oder mehrfache Funktionalität nachzuweisen.
– Es ist möglich, den Luft/Wasser-Meniskus, der hier eingesetzt wird, um das Molekül zu strecken, auf andere Systeme, wie insbesondere Öl/Wasser oder Wasser/Tensid/Luft, auszudehnen.

Man kann auch eine dynamische Orientierung der in Lösung befindlichen Moleküle, die an einem Ende verankert sind, durch Elektrophorese oder Strömung in einer oder mehreren aufeinanderfolgenden Richtungen einsetzen, wobei eine solche Technik so zu einem synchronen Nachweis des Vorhandenseins von Molekülen in einer gegebenen Richtung durch Analyse der temporären Variationen des Fluoreszenzsignals entsprechend einer gegebenen Richtung führen kann (beispielsweise, ohne sich deshalb darauf zu beschränken, durch Verwendung eines geeignet angeordneten räumlichen optischen Filters, welcher es erlaubt, ein präferentielles Signal für bestimmte Orientierungen der beobachteten Moleküle zu erhalten).
Gleichwohl zeigen die beobachteten Ergebnisse, dass diese Technik in ihrer einfachsten Version (Strecken in einer einzigen Richtung ohne synchronen Nachweis) viel weniger leistungsfähig ist als die Verwendung des Meniskus.
Die Oberflächen und/oder die Reagenzien und/oder die Nachweistechniken, die im Rahmen der Erfindung beschrieben werden, können für zahlreiche Anwendungen eingesetzt werden, darunter, aber ohne sich darauf zu beschränken:

– die Identifizierung von einem oder mehreren DNA- oder -RNA-Sequenzierungselementen, das bzw. die man mit Vorteil für die Diagnose von Pathogenen oder die genetische Kartierung einsetzen kann;
– die Messung der Größe von DNA-Fragmenten, die man mit Vorteil für die genetische Kartierung einsetzen kann;
– die Verbesserung der Empfindlichkeit der ELISA-Techniken mit der Möglichkeit, eine geringe Anzahl (gegebenenfalls unter 1000) von immunologischen Reaktionen nachzuweisen.

Die Identifizierung von DNA/RNA-Sequenzen kann zunächst durch Reaktion der DNA/RNA-Moleküle in dem Volumen der Lösung mit komplementären Sonden erfolgen (beispielsweise durch Hybridisierung oder mit Hilfe von für den gesuchten Abschnitt spezifischen Proteinen). Es sind dann zwei Vorgehensweisen möglich.
Die folgenden Beschreibungen erfolgen für Bestimmte unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren, in denen:

– die 1 den Nachweis eines Pathogens in einem fluoreszierenden DNA-Molekül durch Hybridisierung mit einem verankerten Molekül schematisch darstellt;
– die 2 die genetische Kartierung durch Streckung der DNA und Verwendung einer Marker-DNA schematisch darstellt;
– die 3 den Nachweis einer immunologischen Reaktion (ELISA) mit Hilfe eines "Markierungs"moleküls schematisch darstellt: als Reaktionsmarker wird eine fluoreszierende DNA eingesetzt;
– die 4 ist eine Fluoreszenzmikrophotographie, welche die Streckung von DNA des Phagen λ durch Vorwärtsbewegung des Meniskus zeigt; links sieht man DNA-Moleküle in Lösung, welche durch Verdunstungsfließen parallel zu dem Meniskus gestreckt worden sind, rechts DNA-Moleküle an der frischen Luft nach deren Streckung senkrecht zu dem Meniskus;
– die 5(a) und 5(b) Fluoreszenzmikrophotographien sind, die eine mit Digoxigenin (DIG) markierte DNA auf einer mit anti-DIG bedeckten Oberfläche, und welche durch den Meniskus getreckt worden ist, bzw. als Kontrolle eine nicht-markierte DNA auf einer anti-DIG-Oberfläche zeigen; man wird die sehr große Spezifität der Oberflächen und das Fehlen einer nicht-spezifischen Verankerung feststellen;
– die 6 eine Fluoreszenzmikrophotographie ist, welche eine klassische kommerzielle Oberfläche, wie NUNC, zeigt; man wird die sehr großen Fluoreszenzinhomogenitäten feststellen, die bewirken, dass diese Oberflächen unmöglich für den fluoreszierenden Nachweis eines einzigen Moleküls eingesetzt werden können.

In dem Modus "Diagnostik" weisen die Sonden (die "Anker") eine reaktive Gruppe (DIG, Biotin u. s. w.) auf, welche in der Lage ist, sich auf spezifische Weise auf einer erfindungsgemäßen Oberfläche (welche beispielsweise als Verankerungsstelle einen anti-DIG-Antikörper oder Streptavidin aufweist) zu verankern. Der Nachweis der Verankerungsreaktion kann direkt durch Nachweis der Fluoreszenz des durch fluoreszierende Moleküle (Ethidiumbromid, YOYO, fluoreszierende Nukleotide) gefärbten DNA-Moleküls erfolgen (1). Er kann auch indirekt durch Nachweis eines "Markierungsmoleküls": eines erfindungsgemäßen Reagens, welches in der Lage ist, sich an das DNA/RNA-Molekül (beispielsweise durch Hybridisierung, Protein-DNA-Wechselwirkung u. s. w.) anzuheften, aber keine Affinität für die Verankerungsstellen der Sonde aufweist, erfolgen.
In dem Modus "Kartierung" können die komplementären Sonden direkt an ein fluoreszierendes Reagens gemäß der Erfindung gekoppelt werden. Es kann sich beispielsweise um einen komplementären DNA-Einzelstrang, welcher Basen aufweist, welche so modifiziert worden sind, dass sie fluoreszierend sind, oder um einen langen DNA-Doppelstrang, welcher mit einem Fluorophor A gefärbt ist und in einem einzelsträngigen, zu der gesuchten Sequenz komplementären Abschnitt endet, handeln. Für unterschiedliche Sonden können Fluorophore mit unterschiedlichen Farben eingesetzt werden. Man kann auch mit Vorteil das DNA-Molekül, mit dem die Sonden hybridisieren werden, mit einem Fluorophor einer anderen Farbe färben. Das DNA-Sonden-Hybrid wird an einem seiner Enden verankert und durch eine der zuvor beschriebenen Methoden gestreckt. Der Abstand von der Verankerungsstelle zu den Hybridisierungsstellen oder zwischen den Hybridisierungsstellen wird durch den Nachweis der Fluoreszenz der Sonde gemäß den zuvor beschriebenen Methoden bestimmt (2).
Beispielsweise wird, ohne sich deshalb darauf zu beschränken, eine Marker-DNA von ungefähr 3000 Basenpaaren, und welche an einem ihrer Enden einen zu dem gesuchten Gen komplementären einzelsträngigen Abschnitt aufweist, mit einem Fluorophor A (beispielsweise YOYO1) gefärbt. Diese DNA wird mit der zu kartierenden einzelsträngigen DNA hybridisiert, dann ligiert, dann wird diese Letztere mit einem zweiten Fluorophor B (POPO1) gefärbt (nach "Random-priming"-Reaktion, um diese in eine doppelsträngige DNA umzuwandeln). Das Molekül wird dann durch eines seiner Enden verankert (beispielsweise durch DIG/anti-DIG-Bindung) und durch die Wirkung des Meniskus gestreckt. Der Abstand zwischen dem Ende des Moleküls und der Position des markierten Gens, welcher bei der Mikroskopie durch doppelte Fluoreszenz beobachtbar ist (2 Farben A und B), erlaubt es, die Position des gesuchten Gens mit einer Genauigkeit in der Größenordnung von 1000 Basenpaaren (0,3 μm) zu ermitteln.
Die Identifizierung von DNA/RNA-Sequenzen kann auch durch Reaktion zwischen der gesuchten Sequenz und den reaktiven Stellen einer Oberfläche gemäß der Erfindung (beispielsweise komplementären Oligonukleotiden oder der Reaktionsstelle eines für den gesuchten Abschnitt spezifischen Proteins) erfolgen. Der Nachweis der Verankerungsreaktion kann dann direkt oder indirekt (mit Hilfe eines "Markierungsmoleküls") erfolgen, wie zuvor beschrieben.
Es versteht sich von selbst, dass die Identifizierung von DNA/RNA-Sequenzen gemäß der Erfindung ebenso gut zu Diagnosezwecken (beispielsweise für den Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines viralen oder chromosomalen Pathogens) wie zu Zwecken einer genetischen Kartierung dienen kann. Ihr kann ein Amplifizierungsschritt durch irgendeine Methode, insbesondere die PC R, vorangehen.
Außerdem kann, wie von K. R. Allan et al. (U.S. 84 114) erwähnt, die genetische Kartierung durch eine Messung der Größe von DNA-Fragmenten erfolgen. Nun erlaubt die Kopplung zwischen den erfindungsgemäßen O berflächen und den originären Techniken zum Strecken der Moleküle, die weiter oben beschrieben worden sind (insbesondere und mit Vorteil das Strecken durch den Meniskus), eine Messung der Länge der gestreckten Moleküle und dies an einer sehr kleinen Probe (einige Tausend Moleküle).
Man kann beispielsweise, aber ohne sich darauf zu beschränken, auf die folgende Weise vorgehen:
Eine DNA-Probe wird fragmentiert (mit Hilfe von Restriktionsenzymen), mit einem Fluorophor gefärbt, dann auf einer Oberfläche, welche reaktive Gruppen aufweist (beispielsweise die Oberflächen -C=C), verankert. Die Moleküle werden dann durch den Meniskus gestreckt und die Größe der gestreckten Fragmente durch optische Fluoreszenzmikroskopie mit einer Auflösung und einer Größengrenze in der Größenordnung von 1000 by (0,3 μm) bestimmt.
Die erfindungsgemäßen Oberflächen können für das Ausführen der bekannten Verfahren, welche den Nachweis und/oder die Quantifizierung eines Antigens oder eines Antikörpers erlauben, insbesondere der ELISA-Verfahren, welche enzymatische Systeme einsetzen, oder der Methoden vom RIA-Typ, welche radioaktive Marker einsetzen, eingesetzt werden. Es handelt sich hier um Technologien, die nicht im Detail erneut beschrieben werden.
Man kann die erfindungsgemäßen Oberflächen auch und mit Vorteil als Träger für immunologische Reaktionen eines ELISA-Verfahrens, welches einen Schritt einer Verankerung eines erfindungsgemäßen Reagens ("Markierung") auf einem der Reagenzien des ELISA umfasst, einsetzen (3). Der Nachweis kann natürlich global durch Fluoreszenzmessung erfolgen. Es ist auch möglich, die Zählung der Anzahl von Reaktionen vorzunehmen, was vorteilhafterweise gemäß den im Rahmen der Erfindung beschriebenen Nachweismethoden, insbesondere der Streckung durch den Meniskus, erfolgen kann, und dies dank dem niedrigem Fluoreszenzniveau und der nicht-spezifischen Wechselwirkung des Produkts der Erfindung. Dies erlaubt den Nachweis einer kleinen Anzahl von Reaktionen, gegebenenfalls unter 1000) mit einem hervorragenden S/N-Verhältnis.
Man kann folglich durch eine geringfügige Modifizierung der ELISA-Sandwich-Methoden (Antikörper-Antigen-modifizierter, beispielsweise biotinylierter Antikörper) in die Lage versetzt werden, auf die Oberfläche ein erfindungsgemäßes Reagens, beispielsweise fluoreszierende DNA, welche mit Streptavidin verankert ist, aufzupfropfen.
Alle Varianten der ELISA-Technik können mit einer deutlich besseren Empfindlichkeit eingesetzt werden. Techniken zur globalen Fluoreszenzmessung werden bereits eingesetzt, um die Qualität der ELISA-Reaktionen zu bestimmen. Indessen erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren einen deutlich besseren, da für das Fluoreszenzsignal eines einzelnen Moleküls empfindlichen Nachweis.
Selbstverständlich ist es möglich, diese Oberfläche als Anheftungsoberflächen für wenigstens ein Produkt einer Reaktion von biologischem Interesse, als Beispiel, ohne sich deshalb darauf zu beschränken, die Produkte aus der Amplifizierungsreaktion, unabhängig davon, ob es sich um PCR oder eine verwandte Methode handelt, einzusetzen, und schließlich ist es möglich, diesen Typ von Oberflächen als Träger für eine Affinitätschromatographie, unabhängig davon, ob sie präparativ ist oder einem Nachweis dient, einzusetzen.
In diesem Falle kann man beispielsweise eine gegebene Population von Oligonukleotiden auf Siliciumdioxidkugeln, die die stationäre Phase einer Chromatographiesäule bilden, aufpfropfen.
Der Chromatographieschritt soll eine besondere Spezifität der Säule gegenüber eluierten Substanzen, beispielsweise einer Mischung von DNA, von denen bestimmte zu dem aufgepfropften Oligonukleotid komplementäre oder sehr nahe verwandte Sequenzen aufweisen, erlauben.
Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung der erfindungsgemäßen Oberflächen in Diagnosekits oder zur Auftrennung dienenden Kits.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden beim Lesen der nachfolgenden Beispiele ersichtlich.
Materialien und Methoden
λ-DNA und der monoklonale Antikörper (Anti-DIG) stammen von Boehringer-Mannheim. Die Trichlorsilane stammen von Roth-Sochiel. Die fluoreszierenden Nukleinsäuresonden (YOYO1, YOYO3 und POPO1) stammen von Molecular Probes. Die ultrareinen Glasplättchen stammen von Erie Scientific (Plättchen (ESCO). Die magnetischen Teilchen stammen von Dynal. Das Mikroskop ist ein umgekehrtes Diaphot-Mikroskop von NIKKON, welches mit einer Xenon-Lampe für die Epifluoreszenz und einer verstärkten Hamamatsu-CCD-Kamera für die Visualisierung ausgerüstet ist.
Oberflächenbehandlung
Glasplättchen werden eine Stunde durch UV-Bestrahlung unter Sauerstoffatmosphäre (durch Bildung von Ozon) gereinigt. Sie werden dann unverzüglich in einen Exsiccator, aus welchem vorab Spuren von Wasser durch einen Argonstrom herausgespült worden sind, gelegt. Ein Volumen von ungefähr 100 bis 500 μl des geeigneten Trichlorsilans (H₂C=CH(CH₂)_N-SiCl₃) wird in den Exsiccator eingeführt, aus welchem die Oberflächen nach ungefähr 12 h (n = 6) oder 1 h (n = 1) herausgenommen werden. Beim Herausnehmen sind die Oberflächen sauber und nichtbenetzend.
Die so funktionalisierten Plättchen können mit Proteinen reagieren. Ein Volumen von 300 μl einer wässrigen Lösung (20 μg/ml) von Proteinen (Protein A, Streptavidin u. s. w.) wird auf ein mit (H_ZC=CH-)-Gruppen funktionalisiertes Plättchen aufgetragen. Dieses Plättchen wird ungefähr zwei Stunden bei Umgebungstemperatur inkubiert, dann dreimal in ultrareinem Wasser gespült. Die so behandelten Oberflächen sind sauber und benetzend. Die mit Protein A behandelten Oberflächen können dann mit einem Antikörper, beispielsweise anti-DIG, durch Inkubation in einer Lösung von 20 μg/ml Antikörper reagieren.
Verankerung von nativer DNA auf Oberflächen mit Doppelbindung
Ein 2 μl-Tropfen einer Lösung von durch Fluoreszenz (YOYO1, POPO1 oder YOYO3, aber ohne besondere Beendigung) markierter λ-DNA von variabler Konzentration und in unterschiedlichen Puffern (Gesamtanzahl von Molekülen < 10⁷) wird auf ein vorbehandeltes (H₂C=CH-) Plättchen aufgetragen und mit einem nicht behandelten Glasplättchen (Durchmesser 15 mm) bedeckt. Die Zubereitung wird ungefähr 1 h bei Umgebungstemperatur in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre inkubiert. In einem 0,05 M MES-Puffer (pH = 5,5) beobachtet man eine praktisch vollständige Verankerung der DNA-Moleküle. Im Gegenzug gibt es in einem 0,01 M Tris-Puffer (pH = 8,0) nahezu keinerlei verankertes Molekül (Verhältnis > 10⁶). Diese Abhängigkeit kann die Kontrolle der Aktivierung/Desaktivierung der Oberflächen (gegenüber der DNA) durch das Zwischenglied des pH erlauben.
Nachweis der Verankerung durch Einwirkung des Meniskus
Indem man die vorangegangene Zubereitung in eine trockene Atmosphäre überführt, wird die daraus verdunstende Lösung die DNA-Moleküle, die auf der Oberfläche verankert sind, senkrecht zum Meniskus Strecken. Die auf das DNA-Molekül einwirkende Kapillarkraft (einige Zehn Pikonewton) ist tatsächlich ausreichend, um das Molekül vollständig zu Strecken (größer als die Entropieelastizitätskräfte), aber zu gering, um die Bindung zwischen dem Ende des Moleküls und der behandelten Oberfläche zu zerreißen. Da die DNA durch Fluoreszenz markiert ist, beobachtet man individuell und leicht die gestreckten Moleküle (gesamte Länge ungefähr 22 μm). Da die Verankerung zwischen der Oberfläche und der DNA auf die Enden beschränkt ist, konnte man gleichermaßen gut DNAs des Phagen λ, von YAC oder von E. coli (gesamte Länge über 400 μm) strecken. Dieses Präparat von gestreckten, fluoreszierenden und an der frischen Luft befindlichen DNAs ist mehrere Tage lang stabil und kann auf nicht zerstörerische Weise durch Epifluoreszenz (umgekehrtes Nikkon-Diaphot-Mikroskop mit einem Objektiv mit hundertfacher Vergrößerung, O.N.: 1,25) beobachtet werden.
Nachweis der Verankerung durch Elektrophorese
Eine Elektrophoresezelle wird durch einen Paraffinring (Dicke ungefähr 100 μm), welcher zwischen einem behandelten Plättchen und einem nichtbehandelten Glasplättchen, zwischen die zwei Platin-Elektroden eingeführt werden, erstarrt ist, gebildet. Die Gesamtheit wird in ein aus einem Stück bestehendes Ganzes überführt, indem der Paraffinring kurz geschmolzen wird. Dank zweier Öffnungen, die in dem Paraffinring gelassen wurden, führt man die DNA-Lösung in diese Zelle durch Kapillarwirkung ein, dann versiegelt man die beiden Öffnungen mit Paraffin. Man inkubiert, wie zuvor, bei Umgebungstemperatur. Indem man eine geringe Spannung (einige Volt) zwischen den beiden Platin-Elektroden an legt, beobachtet man durch Fluoreszenz eine Bewegung der freien DNA-Moleküle (einige Zehn Mikrometer pro Sekunde) und eine Streckung der verankerten Moleküle in der Fließrichtung, die man so leicht und individuell durch Mikroskopie in Epifluoreszenz identifizieren kann.
Spezifische(r) Verankerung und Nachweis
Indem man die Oberflächen, wie zuvor beschrieben, mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper behandelt, kann man sehr genau deren Spezifität kontrollieren. So wurde die Spezifität von mit anti-DIG behandelten Oberflächen gegenüber λ-DNAs, welche mit einem Oligonukleotid, welches zu einem der Cos-Enden komplementär war, hybridisiert worden waren und eine Digoxigenin (DIG)-Gruppierung aufwiesen, und gegenüber nicht hybridisierten DNAs getestet. In dem ersten Fall wurde eine praktisch allgemeine Streckung der verankerten Moleküle durch Einwirkung des Meniskus beobachtet. In dem zweiten Fall wurden lediglich einige verankerte DNA-Moleküle (< 10) in der gesamten Probe beobachtet. Man schätzt folglich, dass die Spezifität der erfindungsgemäßen Methode besser als 10⁶ ist.
Nachweisempfindlichkeit
Um die Empfindlichkeit der Nachweismethode durch Meniskus-Streckung zu bestimmen, wurden auf die Oberflächen mit Doppelbindung 2,5 μl-Tropfen einer λ-DNA-Lösung in 0,05 M MES (pH = 5,5), enthaltend insgesamt 10⁵, 10⁴ und 1000 Moleküle, aufgetragen. Die Verankerung erfolgt, wie zuvor beschrieben. Die Plättchen werden dann im Mikroskop durch Epifluoreszenz beobachtet, um die Dichte von verankerten Molekülen zu bestimmen. Diese entspricht jener, die abgeschätzt wurde, gut: ungefähr 4–6 DNA-Moleküle pro Beobachtungsfeld (100 μm × 100 μm) bei einer Gesamtmenge von 10⁵ DNA-Molekülen. Bei der geringsten Konzentration konnten ungefähr 10 DNA-Moleküle beobachtet werden, die durch die Einwirkung des Meniskus gestreckt wurden. Diese Anzahl wird im wesentlichen durch die große Anzahl von Sichtfeldern, welche erforderlich sind, um die gesamte Probe abzudecken (ungefähr 25000), begrenzt, was eine manuelle Untersuchung schwierig macht, aber vorteilhaft automatisch und mit einem schwächeren Objektiv, aber mit einem größeren Feld ausgeführt werden kann. Als Schlussfolgerung erlaubt die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Methode einen individuellen Nachweis und eine individuelle Zählung von weniger als 1000 DNA-Molekülen.

Claims

Hochspezifische Oberfläche für biologische Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Träger umfasst, welcher an der Oberfläche wenigstens eine im wesentlichen kompakte Schicht von einer organischen Verbindung aufweist, welche auf der Außenseite der Schicht eine exponierte Gruppierung, welche eine ethylenische Doppelbindung umfasst, mit einer Affinität für einen Molekültyp mit biologischer Aktivität unter bestimmten pH- oder Innengehalt-Bedingungen aufweist, wobei die anderen Bestandteile der Schicht für die genannten Moleküle unter den genannten Reaktionsbedingungen im wesentlichen unzugänglich sind.
Oberfläche nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein fester Träger ist.
Hochspezifische Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die exponierte Gruppierung eine Vinylgruppierung ist.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie erhalten wird durch Polymerisation von wenigstens einem Monomer, welche an der Oberfläche des Polymers mit ethylenischen Doppelbindungen die exponierte Gruppierung erzeugt, durch Abscheidung von Polymer auf dem Träger oder durch partielle Depolymerisation der Oberfläche eines Polymers, um die exponierte Gruppierung zu erzeugen.
Oberfläche nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Polyolefin oder ein Polyen-Derivat ist.
Hochspezifische Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie umfasst: – auf einem Träger eine im wesentlichen monomolekulare und kompakte Schicht von einer organischen Verbindung von langgestreckter Struktur, die wenigstens aufweist: – eine Anheftungsgruppe, die eine Affinität für den Träger aufweist, und – eine exponierte Gruppierung, die eine ethylenische Doppelbindung umfasst, die keine oder nur geringe Affinität für den Träger und die Anheftungsgruppe unter den Anheftungsbedingungen aufweist, aber eine Affinität für einen biologischen Molekültyp aufweist.
Oberfläche nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Anheftung vom nicht-kovalenten Typ ist.
Oberfläche nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Anheftung durch hydrophile oder hydrophobe Wechselwirkungen bewirkt wird.
Oberfläche nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Molekül in der Lage ist, sich unter bestimmten pH- oder Innengehalt-Bedingungen des Mediums direkt durch Adsorption auf der Oberfläche zu verankern.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anheftungsgruppe unter den Alkyl- und halogenierten Alkylgruppen ausgewählt wird, um hydrophobe Bindungen zu realisieren.
Oberfläche nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Anheftungsgruppe ausgewählt wird unter: -CH₃, CF₃, -CH₂F, CHF₂.
Oberfläche nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Anheftung vom kovalenten Typ ist.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die organischen Verbindungen in der Lage sind, miteinander außerhalb der exponierten Gruppierung zu reagieren, um quer verlaufende Bindungen zu erzeugen.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Verbindung eine Anheftungsgruppe an einem Ende und eine exponierte Gruppierung an dem anderen Ende aufweist.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 6 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Anheftungsgruppe ausgewählt wird unter den Gruppen vom Typ Metallalkoxid, Silan, Chlorsilan, Methoxysilan und Ethoxysilan, Silanol, Silazan, vom Typ Phosphat, Hydroxy, Hydrazid, Hydrazin, Amin, Amid, Diazonium, Pyridin, Sulfat, Sulfonsäure, Carbonsäure, Boronsäure, Halogen, Säurehalogenid und Aldehyd.
Oberfläche nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Anheftungsgruppe unter den Silanen, wie Mono-, Di- oder Trichlorsilan, Mono-, Di- oder Triethoxysilanen und Mono-, Di- oder Trimethoxysilanen ausgewählt wird.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die exponierte Gruppierung an die Anheftungsgruppe entweder direkt oder durch Ketten, die wenigstens ein Kohlenstoffatom und vorzugsweise 3 bis 30 Atome umfassen, gebunden ist.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger wenigstens an der Oberfläche durch ein Polymer, ein Metall oder ein Metalloxid, ein Halb leiterelement, ein Oxid eines Halbleiterelements, insbesondere ein Siliciumoxid, oder eine von deren Kombinationen gebildet wird.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger wenigstens an der Oberfläche aus Glas oder Siliciumoxid gebildet wird.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger in Platten-, Kugel-, Faser- oder Teilchenform vorliegt.
Oberfläche nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen magnetisch, fluoreszierend oder gefärbt sind.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül mit biologischer Aktivität ausgewählt wird unter: – den Proteinen, – den Nukleinsäuren, – den Lipiden, – den Polysacchariden und deren Derivaten.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül mit biologischer Aktivität eine chemische Verbindung ist, die eine biologische Aktivität aufweist.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül mit biologischer Aktivität ausgewählt wird unter: – den Proteinen, – DNA, – RNA und deren Derivaten.
Oberfläche nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül mit biologischer Aktivität ausgewählt wird unter: – den Antikörpern, – den Antigenen, – DNA und RNA, – den Liganden oder deren Rezeptoren sowie deren Derivaten.
Verfahren zur Herstellung einer hochspezifischen Oberfläche für biologische Reaktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass: – man auf einem festen Träger eine im wesentlichen monomolekulare und im wesentlichen kompakte Schicht von einer organischen Verbindung von langgestreckter Struktur, welche wenigstens aufweist: – eine Anheftungsgruppe, die eine Affinität für den Träger aufweist, und – eine exponierte Gruppierung, die keine oder nur geringe Affinität für den Träger und die Anheftungsgruppe unter den Anheftungsbedingungen aufweist, aber eine Affinität für einen Molekültyp mit biologischer Aktivität aufweist, anheftet.
Mit einem Molekül mit biologischer Aktivität beschichtete Oberfläche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine hochspezifische Oberfläche für biologische Reaktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 25 umfasst, auf welcher das Molekül mit biologischer Aktivität angeheftet ist.
Oberfläche nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül mit biologischer Aktivität ausgewählt wird unter: – den Proteinen, – den Nukleinsäuren, – den Lipiden, – den Polysacchariden und deren Derivaten.
Oberfläche nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die angeheftete DNA die zu einer Sequenz einer aus einer Probe zu isolierenden DNA komplementäre Sequenz umfasst.
Oberfläche nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das angeheftete Protein in der Lage ist, ein aus einer Probe zu isolierendes Protein spezifisch zu erkennen und zu binden.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 28 und 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül mit biologischer Aktivität unter Biotin, Avidin, Streptavidin oder deren Derivaten ausgewählt wird.
Verfahren zur Identifizierung der Anwesenheit einer DNA oder einer RNA, bei welchem man eine Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 31 einsetzt.
Verfahren zur Identifizierung der Anwesenheit eines Proteins oder eines Antikörpers, bei welchem man eine Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 31 einsetzt.
Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung eines Moleküls mit biologischer Aktivität in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Oberfläche nach einem der Ansprüche 27 bis 31 einsetzt, auf welcher sich ein Molekül mit biologischer Aktivität angeheftet befindet, welches in der Lage ist, das Molekül der Probe zu erkennen, und dass der Nachweis oder die quantitative Bestimmung mit Hilfe eines fluoreszierenden oder nicht-fluoreszierenden Reagens, welches die Anwesenheit des angehefteten Moleküls detektiert, ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche schwach fluoreszierend ist und dass das Reagens fluoreszierend ist.
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens aus Kugeln gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch Mikroskopie erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass man das Produkt der Reaktion zwischen dem Molekül mit biologischer Aktivität und dem Molekül der Probe einer Beanspruchung aussetzt, um vor dem Nachweis die schlechten Paarungen zu zerstören.
Verfahren zum Nachweis einer DNA-Sequenz oder eines Proteins in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass: – man eine hochspezifische Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 31 einsetzt; – man die Probe in Kontakt mit der Oberfläche bringt unter Bedingungen einer Bildung des DNA/DNA-, DNA/RNA- oder Protein/Protein-Hybrids, – man, wenn das Hybrid eine Faltung aufweist, dieses durch ein(e) jegliche(s) physikalisch-chemische(s) Mittel oder Maßnahme streckt oder auseinanderzieht, um die Moleküle zu orientieren, und man die Messung oder die Beobachtung der so orientierten Moleküle vornimmt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 38 und 39, dadurch gekennzeichnet, dass man das Hybrid oder Reaktionsprodukt durch Passage eines Meniskus in der Streckrichtung streckt oder auseinanderzieht.
Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass der Meniskus ein Luft/Wassermeniskus ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 38 und 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Strecken oder Auseinanderziehen durch ein elektrisches Feld, welches auf die Moleküle einwirkt, oder ein Magnetfeld, welches auf ein magnetisierbares oder magnetisches Teilchen einwirkt, bewirkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 38 und 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Strecken oder Auseinanderziehen auf mechanischem Wege ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass die angeheftete DNA und die DNA der Probe auf unterschiedliche Weise „gefärbt" sind und dass man, nach dem Strecken oder Auseinanderziehen, die Lage der komplementären Sequenz bezogen auf das Ende der DNA der Probe bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 44, das für die Kartierung von Genen bestimmt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine ELISA- oder RIA-Methode handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe des Produkt einer Nukleinsäureamplifizierung ist.
Verfahren zur Anheftung einer Nukleinsäure oder eines Proteins auf einer Oberfläche, wie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25 definiert, bei welchem man eine Verankerung der DNA oder des Proteins durch Adsorption insbesondere durch ein Ende realisiert, indem man die DNA oder das Protein in einem bestimmten pH-Bereich in Kontakt mit der Oberfläche bringt.
Verfahren zur Anheftung von DNA auf einer Oberfläche, die Gruppierungen mit ethylenischen Doppelbindungen aufweist, nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass man die DNA bei einem pH unter 8 mit der Oberfläche in Kontakt bringt.
Verfahren zur Anheftung nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einem pH zwischen 5 und 6 ausgeführt, dann bei pH 8 gestoppt wird.
Diagnose-Kit, dadurch gekennzeichnet, dass er wenigstens eine hochspezifische Oberfläche nach einem der Ansprüche 1 bis 33 umfasst.
Diagnose-Kit nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem ein fluoreszierendes Reagens oder ein Reagens, das Kugeln umfasst, umfasst.