DE69532279T3

DE69532279T3 - Methoden und zusammensetzung zur inhibition der angiogenese

Info

Publication number: DE69532279T3
Application number: DE69532279T
Authority: DE
Inventors: Peter Brooks; David A. Cheresh
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1994-03-18
Filing date: 1995-03-09
Publication date: 2011-11-17
Anticipated expiration: 2015-03-10
Also published as: CZ271196A3; ES2211901T3; ES2211901T5; EP0754059A4; EP0754059B2; DK1410807T3; SK284586B6; ZA952214B; KR100327081B1; EP1468695B1; UA44729C2; EP1410807A1; DK0754059T3; HU221988B1; SK119096A3; RU2162712C2; NO322441B1; US7354586B2; FI963692A; US7329406B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin im Allgemeinen und die Verwendung von Antagonisten des Vitronektin-Rezeptors α_vβ₃ im Besonderen.
Hintergrund
Integrine stellen eine Klasse zellulärer Rezeptoren dar, von denen bekannt ist, dass sie extrazelluläre Matrixproteine binden und daher Zell-Zell- sowie Zell-Extrazellulärmatrix-Interaktionen vermitteln, Prozesse, die im Allgemeinen als Zelladhäsions-Ereignisse bezeichnet werden. Obwohl jedoch viele Integrine und Liganden, die an Integrine binden, in der Literatur beschrieben sind, ist die biologische Funktion vieler Integrine noch unklar. Die Integrin-Rezeptoren stellen eine Proteinfamilie dar, deren Mitglieder als gemeinsame Struktur nicht-kovalente heterodimere Glykoproteinkomplexe, die aus α- und β-Untereinheiten bestehen, aufweisen.
Der Vitronektin-Rezeptor, benannt nach seiner ursprünglich beschriebenen Eigenschaft, bevorzugt an Vitronektin zu binden, umfasst nach derzeitigem Wissen drei unterschiedliche Integrine, die wie folgt benannt werden: α_vβ₁, α_vβ₃, und α_vβ₅, Horton, Int. J. Exp. Pathol., 71: 741–759 (1990). α_vβ₁ bindet an Fibronektin und Vitronektin. α_vβ₃ bindet an eine große Anzahl unterschiedlicher Liganden, einschließlich Fibrin, Fibrinogen, Laminin, Thrombospondin, Vitronektin, von Willebrand's Faktor, Osteopontin und Knochen-Sialoprotein I. α_vβ₅ bindet an Vitronektin. Die besonderen Funktionen bei der Zell-Adhäsion, die diese drei Integrine bei den vielen zellulären Interaktionen in Geweben spielen, ist noch Gegenstand der Forschung, es ist aber klar, dass es unterschiedliche Integrine mit unterschiedlichen biologischen Funktionen gibt.
Eine wichtige Erkennungsstelle für viele Integrine ist die Arginin-Glycin-Asparaginsäure-(RGD)Tripeptid-Sequenz im Liganden. Eine RGD-Sequenz wurde in allen oben genannten Liganden für die Vitronektin-Rezeptor-Integrine gefunden. Die RGD-Erkennungsstelle kann durch Polypeptide („Peptide”) nachgeahmt werden, die die RGD-Sequenz enthalten, solche RGD-Peptide sind als Inhibitoren der Integrin-Funktion bekannt. Es ist jedoch wichtig festzustellen, dass in Abhängigkeit von der Sequenz und Struktur der RGD-Sequenz, die Spezifität der Inhibierung so geändert werden kann, dass sie auf spezifische Integrine gerichtet sind.
Die RGD-Erkennungsstelle wird in Pierschbacher et al., Nature, 309: 30–33 (1984) und Pierschbacher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5985–5988 (1984) diskutiert. Verschiedene RGD-Polypeptide verschiedener Integrinspezifität wurden schon beschrieben: Grant et al., Cell, 58: 933–943 (1989), Cheresh, et al., Cell, 58: 945–953 (1989), Aumailley et al., FEBS Letts., 291: 50–54 (1991), und Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269: 20233–20238 (1994), und im U.S. Pat. Nos. 4,517,686 , 4,578,079 , 4,589,881 , 4,614,517 , 4,661,111 , 4,792,525 , 4,683,291 , 4,879,237 , 4,988,621 , 5,041,380 und 5,061,693 .
Die Angiogenese beschreibt einen Prozess der Gewebe-Vaskularisierung, der unter anderem im Wachstum neu entwickelnder Blutgefässe in ein Gewebe hinein besteht. Der Prozess, auch als Neovaskularisierung genannt, wird durch eine Infiltration von Endothelzellen und glatten Muskelzellen vermittelt. Man nimmt an, dass der Prozess auf einem von drei möglichen Wegen abläuft: die Gefälle können aus schon existierenden Gefäßen aussprossen, Gefäße können de novo aus Vorläuferzellen entstehen (Vaskulogenese) oder existierende kleine Gefäße können ihren Durchmesser vergrößern. Blond et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032: 89–118 (1990). Von vaskulären Endothelzellen ist bekannt, dass sie mindestens 5 RGD-abhängige Integrine enthalten, einschliesslich des Vitronektin Rezeptors α_vβ₃ oder α_vβ₅), des Kollagen Typ I und IV Rezeptors (α_vβ₁), des Laminin-Rezeptors (α_vβ₁), des Fibronektin/Laminin/Kollagen Rezeptors (α_vβ₁) und des Fibronektin-Rezeptors (α_vβ₁). Davis et al., J. Cell. Biochem., 51: 206–218 (1993). Man weiß, dass die glatte Muskelzelle mindestens sechs RGD-abhängige Integrine enthält, einschließlich (α₅β₁, α_vβ₃ und α_vβ₅.
Die Angiogenese ist ein wichtiger Vorgang während des neonatalen Wachstums, spielt aber auch eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und in der Pathogenese einer großen Anzahl verschiedener Krankheiten, einschließlich Gewebsentzündungen, Arthritis, Tumorwachstum, diabetische Retinopathie, Makuladegeneration durch Neovaskularisierung der Retina und ähnliche Zustände. Diese klinischen Manifestationen, die mit der Angiogenese assoziiert sind, werden auch also angiogene Krankheiten bezeichnet. Folkman et al., Science, 235: 442–447 (1987). Im Allgemeinen gibt es keine Angiogenese in adulten oder reifen Geweben, sie tritt allerdings in der Wundheilung und beim zyklischen Wachstum des Corpus Luteum auf. Siehe zum Beispiel, Moses et al., Science, 248: 1408–1410 (1990).
Es wurde vorgeschlagen, dass die Inhibierung der Angiogenese eine nützliche Therapie für eine Hemmung des Tumorwachstums sein könnte. Weiter wurde vorgeschlagen, die Angiogenese dadurch zu hemmen, dass (1) die Freisetzung „angiogener Moleküle” wie β-FGF (Fibroblasten Wachstumsfaktor) gehemmt wird, (2) angiogene Moleküle neutralisiert werden, wie durch Verwendung von anti-β-FGF Antikörpern und (3) die Antwort von Endothelzellen auf einen angiogenen Stimulus gehemmt wird. Letztere Strategie hat eine große Aufmerksamkeit erfahren und Folkman et al., Cancer Biology, 3: 89–96 (1992), haben mehrere Inhibitoren beschrieben, die die Antwort der Endothelzellen hemmen, einschließlich Kollagenase-Inhibitor, Inhibitoren, die den Umsatz der Basalzellmembran hemmen, angiostatische Steroide, Angiogenese-Inhibitoren aus Pilzen, Plättchenfaktor 4, Thrombospondin, Arthritis-Medikamente wie D-Penicillamin und Gold-Thiomalat, Vitamin D₃-Analoge, alpha-Interferon und ähnliche, die verwendet werden könnten, um die Angiogenese zu hemmen. Für weitere vorgeschlagene Hemmstoffe der Angiogenese, siehe Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032: 89–118 (1990), Moses et al., Science, 248: 1408–1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59: 44–51 (1988), und U.S. Pat. Nos. 5,092,885 , 5,112,946 , 5,192,744 , und 5,202,352 . Keiner der in den vorhergehenden Referenzen beschriebenen Angiogenese-Inhibitoren ist auf eine Inhibierung des α_vβ₃ Rezeptors gerichtet. RGD-enthaltene Peptide, die den α_vβ₃ Vitronektin-Rezeptor hemmen, wurden auch beschrieben. Aumailley et al., FEBS Letts., 291: 50–54 (1991), Choi et al., J. Vasc. Surg., 19: 125–134 (1994), Smith et al., J. Biol. Chem., 265: 12267–12271 (1990), und Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269: 20233–20238 (1994). Bis zur vorliegenden Erfindung, wurde eine Rolle des α_vβ₃ Integrins bei der Angiogenese jedoch nie beschrieben, auch wurde nie auf eine solche Rolle hingewiesen.
Die Hemmung der Zell-Adhäsion in vitro durch Verwendung monoklonaler Antikörper, die immunspezifisch für verschiedene α- oder β-Untereinheiten der Integrine sind, hat nahegelegt, dass α_vβ₃ bei der Zell-Adhäsion unterschiedlicher Zelltypen, einschließlich mikrovaskulärer Endothelzellen, beteiligt ist. Davis et al., J. Cell. Biol., 51: 206–218 (1993). Darüber hinaus haben Nicosia et al., Am. J. Pathol., 138: 829–833 (1991) die Verwendung des RGD-Peptids GRGDS für die in vitro Hemmung der Bildung von Mikrogefäßen aus der Rattenaorta, kultiviert im Kollagengel, beschrieben. Jedoch ist die Hemmung der Bildung von Mikrogefäßen in vitro in Kollagengel-Kulturen kein Modell für die Hemmung der Angiogenese in einem Gewebe, weil bislang nicht gezeigt wurde, dass die Mikrogefäßstrukturen die gleichen sind, wie die der kapillären Sprosse, oder dass die Bildung von Mikrogefäßen in Kollagengel-Kulturen auf die gleiche Weise stattfindet wie das neovaskuläre Wachstum in intakte Gewebe hinein, wie arthritisches Gewebe, Tumorgewebe oder Krankheitsgewebe, wo die Hemmung der Angiogenese wünschenswert ist.
Daher, abgesehen von den beschriebenen Studien, sind den Anmeldern irgendwelche anderen Hinweise nicht bekannt, dass die Angiogenese in einem Gewebe durch die Verwendung von Inhibitoren der Zell-Adhäsion gehemmt werden kann. Im Besonderen wurde vorher nie gezeigt, dass eine α_vβ₃ Funktion für die Angiogenese in einem Gewebe erforderlich ist oder dass α_vβ₃-Antagonisten die Angiogenese in einem Gewebe inhibieren können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart, dass für Angiogenese in Geweben das α_vβ₃ Integrin nötig ist, und dass Hemmstoffe von α_vβ₃ die Angiogenese inhibieren können. Die Offenbarung zeigt auch, dass Antagonisten anderer Integrine, wie α_vβ₅ oder α_vβ₁ die Angiogenese nicht inhibieren, vermutlich, weil diese anderen Integrine nicht essentiell für den Prozess der Angiogenese sind.
Die Erfindung beschreibt daher die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Arthritis, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, einem Hämangiom oder einem festen Tumor der Brust oder des Kolons, benanntes Medikament umfasst eine Angiogenese hemmende Menge des benannten α_vβ₃-Antagonisten.
Das zu behandelnde Gewebe kann irgendein Gewebe sein, in dem die Hemmung der Angiogenese wünschenswert ist, wie krankes Gewebe, in dem Neovaskularisierung auftritt. Beispiele für solche Gewebe schließen solide Tumore und ähnliche Gewebe ein. Ein α_vβ₃-Antagonist für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann an α_vβ₃ binden und kompetitiv die Bindung von α_vβ₃ an einen natürlichen Liganden hemmen. Vorzugsweise zeigt der Antagonist Spezifität für α_vβ₃ im Vergleich mit anderen integrinen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform hemmt der α_vβ₃-Antagonist die Bindung von Fibrinogen oder anderen RGD-enthaltenden Liganden an α_vβ₃, hemmt aber nicht wesentlich die Bindung von Fibrinogen an α_IIbβ₃. Ein bevorzugter α_vβ₃-Antagonist kann ein Polypeptid oder ein monoklonaler Antikörper oder ein funktionelles Fragment aus diesen sein, das mit α_vβ₃ spezifisch reagiert.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die Abbildungen, die ein Teil dieser Offenbarung darstellen, sind:
Die –1D zeigen die Gewebeverteilung der Integrin-Untereinheiten β₃ und β₁ in normaler Haut und in Haut, die im Prozess der Wundheilung begriffen ist, bezeichnet als Granulationsgewebe. Die Immunhistochemie wurde mit Antikörpern, die gegen β₃ und β₁ gerichtet sind, durchgeführt, wie in Beispiel 3A beschrieben. Die beziehungsweise zeigen die Immunreaktivität von anti-β₃ in normaler Haut und in Granulationsgewebe. Die beziehungsweise zeigen die Immunreaktivität von anti-β₁ in normaler Haut und Granulationsgewebe.
Die – zeigen die Gewebeverteilung des von Willebrand Faktors und des Ligandens für Laminin, die an die β₃ beziehungsweise β₁ Integrin Untereinheiten binden, sowohl in normaler Haut als auch in Haut, die sich im Prozess der Wundheilung befindet, als Granulationsgewebe bezeichnet. Immunhistochemie mit Antikörpern gegen von Willebrand Faktor (anti-vWF) und Laminin (anti-Laminin) wurde wie in Beispiel 3B beschrieben, durchgeführt. Die und , zeigen jeweils die Immunreaktivität des anti-vWF in normaler Haut und Granulationsgewebe. Die und zeigen jeweils die Immunreaktivität von anti-Laminin in normaler Haut und Granulationsgewebe.
–3D zeigen die Gewebeverteilung des Vitronektin Integrin Rezeptors, α_vβ₃, jeweils in Gewebebiopsien aus Blasenkrebs, Kolonkrebs, Brustkrebs und Lungenkrebs. Die Immunhistochemie mit dem LM609 Antikörper gegen α_vβ₃ wurde wie in Beispiel 3C beschrieben, durchgeführt.
zeigt eine typische Fotomikrographie einer erfindungsgemäßen CAM von einem 10 Tage alten unbehandelten Hühnerembryos, hergestellt wie in Beispiel 56 beschrieben, dem die Blutgefäße fehlen.
Die – zeigen die Gewebeverteilung der β₁ und α_vβ₃-Integrine im erfindungsgemäßen CAM Präparat. zeigt die Verteilung der β₁ Untereinheit in einer unbehandelten 10 Tage alten CAM Präparation, wie sie durch Immunfluoreszenz-Immunreaktivität mit CSAT, einem anti-β₁ Antikörper, detektiert werden kann. zeigt die Verteilung des α_vβ₃ Rezeptors in einem unbehandelten 10 Tage alten CAM Präparat, wie sie durch Immunfluoreszenz-Immunreaktivität mit LMB09, einem anti-α_vβ₃ Antikörper detektiert werden kann. Die zeigt die Verteilung des α_vβ₃ Rezeptors in einem β-FGF behandeltem 10 Tage altem CAM Präparat, wie sie durch Immunfluoreszenz-Immunreaktivität mit LM609, einem anti-α_vβ₃-Antikörper detektiert werden kann. Die Behandlungen und Ergebnisse sind in Beispiel 5C beschrieben.
Die zeigt die Quantifizierung der relativen Expression von α_vβ₃ und β₁ in unbehandelten und β-FGF behandelten 10 Tage alten CAMs, wie in Beispiel 6A beschrieben, in einem Säulendiagramm. Die mittlere Fluoreszenzintensität ist auf der Y-Achse aufgetragen, die Integrinprofile auf der X-Achse.
Die – zeigen das Erscheinungsbild einer unbehandelten 10 Tage alten CAM, einer β-FGF behandelten CAM beziehungsweise das einer TNF_α behandelten CAM, die Vorgehensweisen und Ergebnisse sind in Beispiel 6A beschrieben.
Die – zeigen den Effekt einer topischen Antikörper-Behandlung von FGF-induzierter Angiogenese in einer 10 Tage alten CAM, wie in Beispiel 7A1) beschrieben. zeigt ein unbehandeltes CAM Präparat, dem die Blutgefäße fehlen. zeigt die Infiltration neuer Vaskulatur, ausgelöst durch β-FGF Behandlung, in ein Gebiet, das vorher gefäßfrei war. Die , und zeigen die Effekte von Antikörpern gegen β₁ (anti-β₁; CSAT), α_vβ₅ (anti-α_vβ₅; P3G2) beziehungsweise α_vβ₃ (anti-α_vβ₃; LM609).
Die – zeigen den Effekt einer intravenösen Injektion des synthetischen Peptids 66203 auf die Tumor-induzierte Angiogenese, wie in Beispiel 7D2) beschrieben. Die zeigt die Abwesenheit eines hemmenden Effekts einer intravenösen Injektion mit einem Kontroll-Peptid (Kontroll-Peptid Tumor) auf die Angiogenese, die aus der Tumor-Induktion resultiert. Die Hemmung einer solchen Angiogenese durch intravenöse Injektion mit dem Peptid 66203 (zyklisches RGD Tumor) ist in gezeigt. Die Abwesenheit eines hemmenden Effekts oder Zytotoxizität auf reife, schon vorher existierende Gefäße in einem Gebiet benachbart zu dem Tumor-behandelten Gebiet, folgend auf eine intravenöse Infusion mit dem Peptid 66203, ist in gezeigt (zyklisches RGD benachbart CAM).
Die – zeigen den Effekt einer intravenösen Injektion monoklonaler Antikörper auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese, wie in Beispiel 7B1) beschrieben. zeigt β-FGF-induzierte Angiogenese, die nicht einer Antikörper-Behandlung ausgesetzt war (Kontrolle). Keine Hemmung der Angiogenese resultierte, wenn eine ähnliche Präparation mit anti-α_vβ₅ Antikörper P3G2 behandelt wurde, wie in gezeigt. Eine Hemmung der Angiogenese resultierte aus einer Behandlung mit anti-α_vβ₃ Antikörper LM609, wie in gezeigt.
Die und zeigen den Effekt einer topischen Applikation mit anti-Integrin Antikörpern auf die embryonale Angiogenese, wie in Beispiel 7C beschrieben. Die Angiogenese wurde nicht durch die Behandlung einer 6 Tage alter CAM mit anti-β₁ und anti-α_vβ₅-Antikörpern gehemmt, wie in den und gezeigt. Im Gegensatz dazu resultierte die Behandlung mit anti-α_vβ₃ Antikörper LM609 in einer Hemmung der Blutgefäßbildung, wie in gezeigt.
Die zeigt die Quantifizierung der Zahl der Gefäße, die in einem Tumor in einem CAM Präparat hineinwachsen, wie in Beispiel 7D1 beschrieben. Das Säulendiagramm gibt die Zahl der Gefäße, auf der Y-Achse aufgetragen, an, die aus einer topischen Applikation von entweder CSAT (anti-β₁), LM609 (anti-α_vβ₃) oder P3G2 (anti-α_vβ₅) resultiert.
Die – zeigen einen Vergleich zwischen feuchten Tumorgewichten 7 Tage nach Behandlung und den Tumorgewichten zu Beginn der Behandlung, wie in Beispiel 9A1)a beschrieben. Jede Säule repräsentiert das Mittel ± SE von 5–10 Tumoren pro Gruppe. Die Tumore sind von humanem Melanom-(M21-L) ( ), Pankreaskarzinom-(Fg) ( ), Lungenkarzinom-(UCLAP-3) ( ), und Kehlkopfkarzinom-(HEp3) ( ) CAM Präparaten abgeleitet und wurden intravenös mit PBS, CSAT (anti-β₁) oder LM609 (anti-α_vβ₃ ₎ behandelt. Das Säulendiagramm zeigt das Tumorgewicht, auf der Y-Achse aufgetragen, das aus intravenöser Applikation von entweder CSAT (anti-β₁), LM609 (anti-α_vβ₃) oder PBS resultiert, wie auf der X-Achse angegeben.
Die und zeigen histologische Schnitte von Tumoren, die mit P3G2 (anti-α_vβ₅) ( ) beziehungsweise LM609 (anti-α_vβ₃) ( ) behandelt und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt wurden, wie in Beispiel 9A1)a beschrieben. Wie in zu sehen, zeigen die Tumoren, die mit dem Kontroll-Antikörper (P3G2) behandelt wurden, zahlreiche lebende und aktiv sich teilende Tumorzellen, angedeutet durch die mitotischen Abbildungen (Pfeilspitzen) sowie durch zahlreiche Blutgefäße (Pfeile), die das Tumor-Stroms durchziehen. Im Gegensatz dazu wurden wenige, wenn nicht gar keine lebenden Tumorzellen oder Blutgefäße in Tumoren detektiert, die mit LM609 (anti-α_vβ₃) behandelt wurden, siehe .
Die – korrespondieren zu M21L Tumoren, die mit Peptiden, wie in Beispiel 9A1)b beschrieben, behandelt wurden, und sind wie folgt: , zyklisches Kontroll-RAD Peptid (69601); , zyklisches RGD-Peptid (66203); , benachbartes CAM Gewebe, das von den gleichen Embryonen entnommen wurde, die mit zyklischem RGD-Peptid (66203) behandelt wurden und eine hohe Vergrößerung (13×) von Tumoren, die mit Kontroll-RAD Peptid (69601), , oder zyklischem RGD-Peptid (66203) behandelt wurden ( ). Die zeigt normale Gefäße von dem mit RAD-Kontrollpeptid (69601) behandelten Tumor. Die zeigt genauer Beispiele von unterbrochenen Blutgefäßen von mit zyklischem RGD-Peptid (66203) behandelten Tumoren (Pfeile).
Die – zeigen die Hemmung der Angiogenese durch Antagonisten der Angiogenese in dem in vivo Kaninchenaugen-Modell, wie in Beispiel 10 beschrieben. Die und zeigen genauer die Angiogenese des Kaninchenauges in der Anwesenheit von β-FGF and mAb P1F6 (anti-α_vβ₅). Die , und zeigen genauer die Hemmung der Angiogenese des Kaninchenauges in der Anwesenheit von β-FGF and mAb LM609 (anti-α_vβ₃).
Die zeigt einen Arbeitsablauf, wie das in vivo Maus:Mensch chimäre Mausmodell gewonnen wurde, wie in Beispiel 11A beschrieben. Ein Teil der Haut einer SCID Maus wurde durch humane neonatale Vorhaut ersetzt und einer 4 wöchigen Heilung unterworfen. Nachdem das Transplantat geheilt war, wurde die menschliche Vorhaut mit humanen Tumorzellen inokuliert. Während der folgenden Periode von 4 Wochen bildete sich ein messbarer Tumor, der einem menschlichen Tumor mit humaner Vaskulatur, die von der menschlichen Haut in den menschlichen Tumor wächst, entspricht.
Die zeigt den Prozentsatz einzelner Zellen, die von mit mAb und Peptid behandelten CAMs abstammen, mit Apop Tag gefärbt und mittels FACS ausgewertet wurden, wie in den Beispielen 12A beziehungsweise 12B beschrieben. Die schwarzen und gepunkteten Säulen stellen Zeilen von Embryonen dar, die 24 beziehungsweise 48 Stunden vor dem Assay behandelt wurden. Jede Säule repräsentiert das Mittel ± SE von drei Wiederholungen. Die CAMs wurden mit mAb LM609 (anti-α_vβ₃) oder CSAT (anti-β₁) oder PBS wie in Beispiel 12A2) beschrieben, behandelt. Die CAMs wurden auch mit dem zyklischen Peptid 69203 (cyclo-RGDfV, bezeichnet als Peptid 203) oder zyklischem Kontroll-Peptid 69601 (cyclo-RADfV, bezeichnet als Peptid 601) behandelt, wie in Beispiel 12B beschrieben.
Die und zeigen die kombinierten Ergebnisse von Einzelzell-Suspensionen aus CAMs, die von Embryonen stammen, die entweder mit CSAT (anti-β₁) ( ) oder LM609 (anti-α_vβ₃) ( ), behandelt wurden, mit Apop Tag und Propidiumjodid gefärbt wurden und mittels FACS analysiert wurden, wie in Beispiel 12C beschrieben. Auf der Y-Achse ist die Zahl Apop Tag gefärbter Zeilen (Apoptose) aufgetragen, auf der X-Achse die Propidiumjodid Färbung (DNA Gehalt). Die horizontale Linie repräsentiert die Nachweisgrenze für Apop Tag Färbung. Die linken und rechten Bildabschnitte zeigen CAM Zellen von CSAT (anti-β₁) ( ) beziehungsweise LM609 (anti-α_vβ₃) ( ) behandelten Embryonen. Eine Zellzyklus-Analyse wurde durch Analyse von ungefähr 8000 Ereignissen pro Zustand durchgeführt.
– stellen CAM Gewebe von CSAT (anti-β₁) behandelten Embryonen dar und bis zeigen CAM Gewebe von LM609 (anti-α_vβ₃) behandelten Embryonen, wie in Beispiel 12C beschrieben. und zeigen genauer Gewebe, die mit Apop Tag gefärbt und mit Fluoreszenz (FITC) sichtbar gemacht wurden, überlagert auf ein D. I. C. Bild. und zeigen genauer die gleichen Gewebe, mit mAb LM609 (anti-α_vβ₃) gefärbt und sichtbar gemacht mit Fluoreszenz (Rhodamin). und stellen zusammengefügte Bilder der gleichen Gewebe dar, die mit Apop Tag und LM609 gefärbt wurden, wobei die Gelbfärbung eine Kolokalisation anzeigt. Der Maßstab entspricht 15 und 50 μm im linken beziehungsweise rechtem Bildabschnitt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
A. Definitionen
Aminosäurereste: Eine Aminosäure, die durch einen chemischen Verdau (Hydrolyse) eines Polypeptids an seinen Peptidbindungen entsteht. Die Aminosäurereste, die hier beschrieben werden, sind vorzugsweise die ”L” Isomere. Jedoch können Aminosäurereste als ”D” Isomere jede der L-Aminosäurereste ersetzen, so lange wie die gewünschte funktionale Eigenschaft im Polypeptid erhalten bleibt. NH2 bezieht sich auf die freie Aminogruppe, die das aminoterminale Ende des Polypeptids repräsentiert.

COOH bezieht sich auf die freie Karboxygruppe, die das karboxyterminale Ende des Polypeptids repräsentiert. Der Standard-Polypeptid Nomenklatur angepasst (beschrieben in J. Biol. Chem., 243: 3552–59 (1969) und angepasst durch 37 CFR §1.822(b) (2)), sind die Abkürzungen für die Aminosäurereste in der folgenden Korrespondenz-Tabelle gezeigt: KORRESPONDENZ-TABELLE

SYMBOL	AMINOSAÜRE
Einzelbuchstabe	Triplett
Y	Tyr	Tyrosin
G	Gly	Glycin
F	Phe	Phenylalanin
M	Met	Methionin
A	Ala	Alanin
S	Ser	Serin
I	Ile	Isoleucin
L	Leu	Leucin
T	Thr	Threonin
V	Val	Valin
P	Pro	Prolin
K	Lys	Lysin
H	His	Histidin
Q	Gln	Glutamin
E	Glu	Glutaminsäure
Z	Glx	Glu und/oder Gln
W	Trp	Tryptophan
R	Arg	Arginin
D	Asp	Asparaginsäure
N	Asn	Asparagin
B	Asx	Asn und/oder Asp
C	Cys	Cystein
X	Xaa	Unbekannt oder Andere

Zusätzlich haben die folgenden nachstehende Bedeutung:

BOC	tert-Butyloxycarbonyl
DCCI	Dihexylcarbodiimid
DMF	Dimethylformamid
OMe	Methoxy
HOBt	1-Hydroxybenzotriazol

Es soll festgehalten werden, dass alle Aminosäuresequenzen hier durch Formeln repräsentiert werden, deren linke und rechte Orientierung der konventionellen Richtung des Amino- und Karboxyendes entspricht. Darüber hinaus bedeutet ein Strich am Anfang oder Ende eines Aminosäurerestes eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz mit einer oder mehreren Aminosäureresten.
Polypeptid: bezeichnet eine lineare Kette aus Aminosäureresten, die über Peptidbindungen zwischen der α-Aminogruppe und Karboxygruppe von benachbarten Aminosäureresten verbunden sind.
Peptid: so wie es hier gebraucht wird, meint es eine Kette von nicht mehr als ungefähr 50 Aminosäureresten, die wie in Polypeptiden miteinander verbunden sind.
Zyklisches Peptid: ist abgeleitet von einem korrespondierenden linearen Peptid und bezeichnet ein Peptid, in dem keine freien N- oder C-Termini existieren und von dem die N-Termini der korrespondierenden linearen Peptide eine Amidbindung mit dem C-terminalen Karboxylat des benannten korrespondierenden linearen Peptids bilden.
Protein: bezeichnet eine lineare Kette von mehr als 50 Aminosäureresten, die wie in Polypeptiden miteinander verbunden sind.
Synthetisches Peptid: bezieht sich auf eine auf chemischem Weg hergestellte Kette an Aminosäureresten, die über Peptidbindungen miteinander verbunden sind und frei von natürlich vorkommenden Proteinen oder deren Fragmenten sind.
B. Allgemeine Betrachtungen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf die Beobachtung, dass die Angiogenese durch den spezifischen α_vβ₃ Vitronektin Rezeptor vermittelt ist, und dass die Hemmung der α_vβ₃ Funktion die Angiogenese inhibiert. Diese Beobachtung ist wichtig aufgrund der, Rolle, die die Angiogenese bei einer Vielzahl verschiedener Krankheitsprozesse spielt. Durch Hemmung der Angiogenese kann in die Krankheit eingegriffen werden, die Symptome verbessert werden und in einigen Fällen die Krankheit sogar geheilt werden.
Wenn das Wachstum von neuen Blutgefäßen die Ursache ist oder zur Pathologie einer Erkrankung beiträgt, wird eine Hemmung der Angiogenese die schädlichen Effekte der Krankheit reduzieren. Beispiele schließen Rheumatoide Arthritis, diabetische Retinopathie, und ähnliche ein. Wo das Wachstum neuer Blutgefäße erforderlich ist, um das Wachstum schädlicher Gewebe zu unterstützen, wird eine Hemmung der Angiogenese die Blutzufuhr zu den Geweben reduzieren und so dazu beitragen, dass die Gewebemasse zurückgeht, da eine ausreichende Blutzufuhr nicht länger gewährleistet ist. Beispiele schließen das Wachstum von Tumoren ein, in denen eine Neovaskularisierung permanent erforderlich ist, damit der Tumor größer als ein paar Millimeter in der Dicke wächst und sich feste Tumormetastasen entwickeln können.
Die Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind teilweise deswegen wirksam, weil die Therapie hoch selektiv für die Angiogenese und nicht für andere biologische Prozesse ist. Wie in den Beispielen gezeigt, enthalten nur neu wachsende Gefäße wesentliche Mengen an α_vβ₃ und daher beeinflussen die therapeutischen Methoden reife Gefäße nicht nachteilig. Darüber hinaus ist α_vβ₃ in normalen Geweben nicht weit verbreitet, sondern ist selektiv auf neuen Gefäßen lokalisiert, so dass sichergestellt ist, dass die Therapie selektiv auf das Wachstum neuer Gefäße abzielt.
Die Beobachtung, dass allein die Hemmung von α_vβ₃ wirksam die Angiogenese inhibieren kann, erlaubt die Entwicklung therapeutischer Zusammensetzungen mit einer potenziell hohen Spezifität, und daher relativ geringer Toxizität. Obwohl die Erfindung die Verwendung von Peptid-basierten Reagenzien offenbart, die die Fähigkeit haben, ein oder mehrere Integrine zu hemmen, können andere Reagenzien hergestellt werden, die α_vβ₃ noch selektiver hemmen, und daher nicht die Nebenwirkung aufweisen, andere biologische Prozesse zu hemmen oder andere als die, die durch α_vβ₃ vermittelt sind.
Zum Beispiel ist es möglich, wie die vorliegende Lehre zeigt, monoklonale Antikörper herzustellen, die hoch selektiv für Immunreaktionen mit α_vβ₃ sind und, die ähnlich selektiv für eine Hemmung der α_vβ₃ Funktion sind. Weiter können RGD-enthaltende Peptide konzipiert werden, die selektiv für die Hemmung von α_vβ₃ sind, wie unten beschrieben ist.
Vor den Beobachtungen der vorliegenden Erfindung, war es nicht bekannt, dass die Angiogenese und irgendeiner der Prozesse, die von der Angiogenese abhängen, in vivo durch die Verwendung von Reagenzien gehemmt werden kann, die die biologische Funktion von α_vβ₃ antagonisieren.
C. Methoden der Hemmung der Angiogenese
Die Erfindung liefert eine Methode für die Hemmung der Angiogenese in einem Gewebe, wodurch auch Ereignisse in den Geweben inhibiert werden, die von der Angiogenese abhängig sind. Im Allgemeinen umfasst die Methode die Anwendung einer Zusammensetzung, die eine Angiogenese-hemmende Menge eines α_vβ₃-Antagonisten umfasst, auf das Gewebe.
Wie schon vorher beschrieben, schließt die Angiogenese eine Vielfalt an Prozessen ein, an denen Neovaskularisierung von Geweben beteiligt ist, einschließlich ”Aussprossen”, Vaskulogenese oder Gefäßvergrößerung, all diese Angiogenese Prozesse werden durch die Expression von α_vβ₃ vermittelt und hängen von dieser ab. Man glaubt, dass die Mehrheit der Angiogenese-Vorgänge, mit Ausnahme der traumatischen Wundheilung, der Corpus Luteum Bildung und der Embryogenese, mit Krankheitsprozessen verbunden ist, und daher die Verwendung von den vorliegenden therapeutischen Methoden selektiv für die Ziel-Krankheiten sind und keine schädlichen Nebenwirkungen ausüben.
Man nimmt an, dass es eine Vielzahl an Krankheiten gibt, bei denen die Angiogenese eine wichtige Rolle spielt, diese werden auch als angiogene Krankheiten bezeichnet. Eingeschlossen, aber nicht darauf beschränkt sind entzündliche Erkrankungen wie Immun- und nicht-Immun-Entzündungen, chronischer artikulärer Rheumatismus und Psoriasis, Krankheiten, in denen eine ungeeignete und unpassende Invasion von Gefäßen auftritt, wie diabetische Retinopathie, neovaskuläres Glaukom, Restenose, Proliferation von Kapillaren in atherosklerotischen Plaques und Osteoporosis sowie mit Krebs in Verbindung gebrachte Erkrankungen, wie feste Tumoren, feste Tumormetastasen, Angiofibrome, retrolentale Fibroplasie, Hämangiome, Kaposi Sarkom und ähnliche Krebsarten, die eine Neovaskularisierung benötigen, um das Tumorwachstum zu unterstützen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich jedoch nur auf die Behandlung der in Anspruch 1 aufgezählten Leiden.
So können Methoden, die die Angiogenese in einem Krankheitsgewebe hemmen, Krankheitssymptome verbessern und, in Abhängigkeit von der Krankheit, zur Heilung der Krankheit beitragen. Das Ausmaß der Angiogenese in einem Gewebe und damit das Ausmaß der Hemmung, das durch die vorliegenden Methoden erreicht wird, kann durch eine Vielfalt an Methoden beurteilt werden, wie z. B. in den Beispielen beschrieben, wo die Detektion von α_vβ₃–immunpositiven, unreifen und in Entstehung begriffenen Gefäßstrukturen durch Immunhistochemie gezeigt ist.
Wie hier beschrieben, kann jedes einer Vielfalt von Geweben oder Organen, die organisierte Gewebe umfassen, die Angiogenese in Krankheitszuständen unterstützen, eingeschlossen sind Haut, Muskel, Darm, Bindegewebe, Gelenke, Knochen und ähnliche Gewebe in denen Blutgefäße auf einen angiogenen Stimulus hin eindringen können.
Der in der vorliegenden Erfindung in ihren vielen Ausführungsformen behandelte Patient ist wünschenswerterweise ein humaner Patient, obwohl verstanden werden soll, dass die Prinzipien der Erfindung zeigen, dass die Erfindung alle Säuger betrifft, die absichtlich in der Bezeichnung ”Patient” eingeschlossen sind. in diesem Zusammenhang wird ein Säuger so verstanden, dass er jede Säugerart einschließt, in der die Behandlung von Krankheiten, die mit einer Angiogenese verbunden sind, wünschenswert ist, besonders landwirtschaftlich genutzte Säuger und Haustier-Säugerarten.
In einer anderen verwandten Ausführungsform ist das zu behandelnde Gewebe ein retinales Gewebe eines Patienten mit diabetischer Retinopathie oder Makuladegeneration, und die zu hemmende Angiogenese ist Angiogenese in retinalem Gewebe, in dem eine Neovaskularisierung des retinalen Gewebes auftritt.
In einer weiteren damit in Beziehung stehenden Ausführungsform, ist das zu behandelnde Gewebe ein Tumorgewebe eines Patienten mit einem festen Tumor oder ein Hämangiom, und die zu inhibierende Angiogenese ist Angiogenese in Tumorgeweben, in denen eine Neovaskularisierung des Tumorgewebes vorkommt. Feste Tumorgewebe, die mit den vorliegenden Methoden behandelt werden können, sind Gewebe der Brust oder des Kolons. Exemplarische Angiogenese in Tumorgeweben und deren Hemmung ist in den Beispielen beschrieben.
Die Hemmung von Angiogenese in Tumorgeweben ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform weil die Neovaskularisierung eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum spielt. In der Abwesenheit von Neovaskularisierung in Tumorgeweben erhält das Tumorgewebe nicht die nötigen Nährstoffe, verlangsamt das Wachstum, stoppt zusätzliches Wachstum, entwickelt sich zurück und wird schließlich nekrotisch, was letztlich zum Absterben des Tumors führt.
In einer verwandten Ausführungsform schlägt die Erfindung die Anwendung der vorliegenden Methoden in Verbindung mit anderen Therapien vor, wie konventioneller Chemotherapie, die auf feste Tumore gerichtet ist und zur Verhinderung der Ausbildung von Metastasen dient. Die Anwendung von Angiogenese-Hemmstoffen wird typischerweise während oder nach der Chemotherapie durchgeführt, obwohl die Angiogenese vorzugsweise nach einem Behandlungszyklus einer Chemotherapie zu hemmen ist, zu Zeitpunkten, an denen das Tumorgewebe auf den toxischen Angriff mit einer Induktion der Angiogenese antwortet, um die Versorgung der Blut- und Nährstoffzufuhr in das Tumorgewebe hinein wiederherzustellen. Darüber hinaus ist es bevorzugt, die die Angiogenese hemmenden Methoden nach der Operation anzuwenden, wenn die festen Tumore schon entfernt sind, als Prophylaxe gegen die Ausbildung von Metastasen.
Insoweit als die vorliegende Methode auf die Hemmung von Tumor Neovaskularisierung anzuwenden ist, können die Methoden auch auf eine Hemmung von Tumorgewebewachstum, zur Hemmung der Bildung von Tumormetastasen und zur Rückentwicklung von ausgebildeten Tumoren angewendet werden. Die Beispiele zeigen die Rückentwicklung eines ausgebildeten Tumors, die auf eine einzelne intravenöse Injektion eines erfindungsgemäßen α_vβ₃-Antagonisten folgt.
Die Dosis-Bereiche für die Anwendung des α_vβ₃-Antagonisten hängen von der Form und der Wirksamkeit des Antagonisten ab, wie weiter unten hier beschrieben wird, und davon, ob die Mengen ausreichend sind, um den gewünschten Effekt zu erzielen und die Angiogenese sowie die Angiogenese vermittelten Krankheitssymptome zu verbessern. Die Dosis sollte nicht so hoch sein, dass sie zu ungünstigen Nebenwirkungen führt, wie Hyperviskositätssyndrome, Lungenödeme, Herzinsuffizienz und ähnliche. Im Allgemeinen wird die Dosis mit dem Alter, dem Zustand, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Erkrankung im Patienten variieren und kann durch einen Fachmann auf dem Gebiet bestimmt werden. Die Dosis kann auch durch den individuellen Arzt in dem Fall einer Komplikation angepasst werden.
Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine Menge eines α_vβ₃-Antagonisten, die ausreicht, um eine messbare Hemmung der Angiogenese in dem behandelten Gewebe auszulösen, d. h. eine die Angiogenese hemmende Menge. Die Hemmung der Angiogenese kann in situ durch Immunhistochemie, wie hier beschrieben, oder durch andere Methoden, die der Fachmann kennt, gemessen werden.
Insofern als ein α_vβ₃-Antagonist verschiedene Formen annehmen kann, wie die eines α_vβ₃ Mimetikums, eines RGD-enthaltenden Peptids, eines anti-α_vβ₃ monoklonalen Antikörpers oder Fragments davon, sollte verstanden werden, dass die Wirksamkeit und daher der Ausdruck einer ”therapeutisch effektiven” Menge variieren kann. Wie jedoch durch die vorliegenden Assaymethoden gezeigt, kann ein Fachmann auf seinem Gebiet die Wirksamkeit eines Kandidaten für einen erfindungsgemäßen α_vβ₃-Antagonisten auf einfache Weise bestimmen.
Die Wirksamkeit eines α_vβ₃-Antagonisten kann durch eine Vielfalt verschiedener Mittel gemessen werden, eingeschlossen sind die Hemmung der Angiogenese im CAM Assay, in dem in vivo Kaninchenaugen-Assay, in dem in vivo chimären Maus:Mensch Assay und durch die Messung der Hemmung der Bindung von natürlichen Liganden an α_vβ₃, Methoden, die alle hier beschrieben sind, und ähnliche Assays.
Ein bevorzugter α_vβ₃-Antagonist hat die Fähigkeit, die Bindung eines natürlichem Liganden, wie Fibrinogen oder Vitronektin, an α_vβ₃ in Lösung erheblich zu hemmen und das bei weniger als 0.5 mikromolar (μM), bevorzugt weniger als 0.1 μM, und bevorzugter weniger als 0.05 μM. Mit „erheblich” ist gemeint, dass eine mindestens 50%-ige Reduktion in der Bindung an Fibrinogen in der Anwesenheit von dem α_vβ₃-Antagonisten beobachtet wird und eine 50%-ige Hemmung wird hier als IC₅₀-Wert bezeichnet.
Ein bevorzugterer α_vβ₃-Antagonist zeigt Selektivität für α_vβ₃ gegenüber anderen Integrinen. Somit hemmt ein bevorzugter α_vβ₃-Antagonist die Fibrinogenbindung an α_vβ₃ erheblich, jedoch nicht wesentlich die Bindung von Fibrinogen an andere Integrine, wie α_vβ₁, α_vβ₅ oder α_IIbβ₃ _. Besonders bevorzugt ist ein α_vβ₃-Antagonist, der eine 10-fach bis 100-fach niedrigere IC₅₀-Aktivität für die Hemmung der Fibrinogenbindung an α_vβ₃ aufweist, im Vergleich zu den IC₅₀-Aktivitäten bei der Hemmung der Fibrinogenbindung an andere Integrine. Beispielhafte Assays für die Bestimmung der IC₅₀-Aktivität für die Hemmung von Fibrinogenbindung an ein Integrin sind in den Beispielen beschrieben.
Eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen α_vβ₃-Antagonisten in Form eines monoklonalen Antikörpers ist typischerweise eine Menge die, wenn sie in einer physiologisch tolerierbaren Zusammensetzung angewendet wird, ausreichend ist, um eine Plasmakonzentration von ungefähr 0.01 Mikrogramm (μg) pro Milliliter (ml) bis etwa 100 μg/ml, bevorzugt von etwa 1 μg/ml bis etwa 5 μg/ml und normalerweise von etwa 5 μg/ml zu erreichen. Anders ausgedrückt kann die Dosis zwischen etwa 0.1 mg/kg bis etwa 300 mg/kg, bevorzugt von etwa 0.2 mg/kg bis etwa 200 mg/kg, am meisten bevorzugt von etwa 0.5 mg/kg bis etwa 20 mg/kg, in einer oder mehreren täglichen Dosis-Anwendungen für einen oder mehrere Tage variieren.
Liegt der Antagonist in Form eines Fragments eines monoklonalen Antikörpers vor, kann die Menge unmittelbar aus der Masse des Fragments relativ zur Masse des gesamten Antikörpers abgeleitet werden. Eine bevorzugte Plasmakonzentration in Molarität ist etwa 2 mikromolar (μM) bis etwa 5 millimolar (mM) und bevorzugt etwa 100 μM bis 1 mM des Antikörper-Antagonisten.
Eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen α_vβ₃-Antagonisten in der Form eines Polypeptids oder anderer ähnlich großer niedermolekularer α_vβ₃ Mimetika, ist typischerweise eine Menge eines Polypeptides, die, wenn sie in einer physiologisch tolerablen Zusammensetzung angewendet wird, ausreichend ist, um eine Plasmakonzentration von etwa 0.1 Mikrogramm (μg) pro Milliliter (ml) bis etwa 200 μg/ml, bevorzugt von etwa 1 μg/ml bis 150 μg/ml zu erreichen. Basierend auf einem Polypeptid mit einer Masse von ungefähr 500 Gramm pro Mol, reicht die bevorzugte Plasmakonzentration in Molarität etwa von 2 mikromolar (μM) bis 5 millimolar (mM) und bevorzugt von etwa 100 μM bis 1 mM Polypeptid-Antagonist. Anders ausgedrückt kann die Dosis pro Körpergewicht zwischen etwa 0.1 mg/kg bis etwa 300 mg/kg variieren und bevorzugt von etwa 0.2 mg/kg bis etwa 200 mg/kg in einer oder mehreren täglichen Dosis-Anwendungen für einen oder mehrere Tage.
Die monoklonalen Antikörper oder erfindungsgemäßen Polypeptide können parenteral durch Injektion oder graduelle Infusion über die Zeit appliziert werden. Obwohl die zu behandelnden Gewebe typischerweise im Körper durch systemische Applikation erreicht werden können, und daher meistens durch intravenöse Injektion der therapeutischen Zusammensetzungen behandelt werden, sind auch andere Gewebe und Freisetzungsmethoden denkbar, bei denen es wahrscheinlich ist, dass die zu erreichenden Gewebe das Zielmolekül enthalten. Somit können monoklonale Antikörper oder erfindungsgemäße Polypeptide intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrakavitär und transdermal angewendet werden und können mit peristaltischen Techniken verabreicht werden.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, die einen monoklonalen Antikörper oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthalten, werden konventionell intravenös angewendet, wie zum Beispiel durch Injektion einer Dosiseinheit. Das Wort ”Dosiseinheit”, so wie es in der vorliegenden Erfindung hinsichtlich einer therapeutischen Zusammensetzung gebraucht wird, bezieht sich auf eine physikalisch diskrete Einheit, die als einzelne Dosis für das Subjekt geeignet ist, jede Einheit eine vorher bestimmte Menge des aktiven Materials enthaltend, die so ausgerechnet wurde, das die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, z. B. Träger oder Vehikel, eintritt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der α_vβ₃-Antagonist ist in einer einzelnen Dosis intravenös angewendet, wie in den Beispielen gezeigt. Die Zusammensetzungen werden auf eine Art und Weise angewendet, die kompatibel mit der Formulierung der Dosis ist und in einer therapeutisch wirksamen Menge. Die Menge, die verabreicht wird und der Zeitpunkt der Verabreichung hängen von dem zu behandelten Subjekt ab, der Kapazität des Systems des Subjekts, die aktiven Inhaltsstoffe zu nutzen und dem gewünschten Grad des therapeutischen Effekts. Die genauen Mengen des aktiven Inhaltsstoffes, die für die Verabreichung benötigt werden, hängen von der Beurteilung des Praktikers ab und sind für jedes Individuum besondere. Geeignete Dosisbereiche für die systemische Anwendung sind jedoch hier beschrieben und hängen von der Art der Verabreichung ab. Geeignete Therapiepläne für die Anwendung variieren auch, charakterisiert sind sie jedoch durch eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von wiederholten Dosen in ein oder mehreren Stunden-Intervallen durch eine nachfolgende Injektion oder andere Art der Verabreichung. Alternativ wird eine kontinuierliche intravenöse Infusion vorgeschlagen, um die Konzentrationen im Blut in den Bereichen zu erhalten, die spezifisch für in vivo Therapien sind.
Wie in den Beispielen gezeigt, tritt die Hemmung der Angiogenese und die Tumorregression schon 7 Tage nach dem Anfangskontakt mit dem Antagonisten auf. Eine zusätzliche oder verlängerte Expositionen gegenüber dem Antagonisten dauert vorzugsweise 7 Tage bis 6 Wochen, vorzugsweise etwa 14 bis 28 Tage.
In einer verwandten Ausführungsform zeigen die Beispiele die Beziehung zwischen der Hemmung von α_vβ₃ und der Apoptose-Induktion in den neovaskulären Zellen, die α_vβ₃ enthalten. Die Apoptose manifestiert sich schnell, typischerweise etwa 48 Stunden nach einem ersten Kontakt mit dem Antagonisten, wobei die Hemmung der Angiogenese und die Tumorregression sich langsamer manifestiert, wie hier beschrieben. Dieser Unterschied beeinflusst das therapeutische Regimen hinsichtlich der Zeit der Verabreichung und des gewünschten Effekts. Typischerweise kann die Verabreichung für die Apoptose-Induktion in der Neovaskulatur 24 Stunden bis etwa 4 Wochen dauern, obwohl 48 Stunden bis 7 Tage bevorzugt ist.
D. Therapeutische Zusammensetzungen
Wie hier beschrieben, enthalten die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen einen physiologisch akzeptablen Träger zusammen mit einem α_vβ₃-Antagonisten, der dann als ein aktiver Inhaltsstoff gelöst oder dispergiert vorliegt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die therapeutische α_vβ₃-Antagonist Zusammensetzung nicht immunogen, wenn sie an einem Säuger oder humanem Patienten für therapeutische Zwecke angewendet wird.
So wie sie hier benutzt werden, sind die Ausdrücke „pharmazeutisch akzeptabel, „physiologisch tolerabel” und grammatikalische Varianten davon, wenn sie sich auf Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien beziehen, untereinander austauschbar und bedeuten, dass die Stoffe in einer Weise Säugern verabreicht werden können, dass keine unerwünschten Nebenwirkungen, wie Übelkeit, Schwindel, Magenverstimmung und ähnliche auftreten.
Die Herstellung einer pharmakologischen Zusammensetzung, die aktive, darin gelöste oder dispergierte Inhaltsstoffe enthält, gehört zum Stand der Technik und eine Limitierung basierend auf der Formulierung ist nicht erforderlich. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als injizierbare Lösungen hergestellt, entweder in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen, jedoch können auch feste Formen hergestellt werden, die für eine Lösung oder Suspension in Flüssigkeiten vor der Anwendung geeignet sind. Die Präparation kann auch emulgiert werden.
Der aktive Inhaltsstoff kann mit Arzneistoffträgern gemischt werden, die pharmazeutisch akzeptabel und kompatibel mit dem aktiven Inhaltsstoff sind und in Mengen, die für die Verwendung in den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren geeignet sind. Geeignete Arzneistoffträger sind zum Beispiel Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Äthanol oder ähnliche und Kombinationen aus diesen. Zusätzlich, falls gewünscht, kann die Zusammensetzung kleinere Mengen von Hilfsstoffen enthalten, wie z. B. Befeuchtungsmittel, Emulgatoren, den pH Wert puffernde Agenzien und ähnliche, die die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffes erhöhen.
Die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung kann pharmazeutisch akzeptable Salze ihrer Einzelbestandteile enthalten. Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen Säureadditionssalze ein (gebildet aus den freien Aminogruppen der Polypeptide), die mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel, Salzsäure oder Phosphorsäure, oder solchen organischen Säuren, wie Essigsäure, Weinsäure, Mandelsäure und ähnliche, gebildet werden. Salze, die mit den freien Karboxygruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen, wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Kalzium- oder Eisenhydroxyde, und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Äthylamino-Äthanol, Histidin, Prokain und ähnliche abgeleitet werden.
Bei der Präparation der zyklischen Polypeptid α_vβ₃-Antagonisten sind die Salze der TFA und HCl besonders bevorzugt. Repräsentative Salze der Peptide sind in den Beispielen beschrieben.
Physiologisch tolerable Träger sind dem Fachmann gut bekannt. Exemplarisch für flüssige Träger sind sterile wässrige Lösungen, die keine Inhaltsstoffe zusätzlich zu den aktiven Inhaltsstoffen und Wasser enthalten oder die einen Puffer, wie Natriumphosphat bei physiologischen pH Wert, physiologische Salzlösung oder beides enthalten, wie Phosphat-gepufferte Salzlösung. Darüber hinaus können wässrige Träger ein oder mehrere Puffersalze enthalten sowie Salze, wie Natrium- und Kaliumchlorid, Dextrose, Polyethylenglykol und andere gelöste Stoffe.
Flüssige Zusammensetzungen können auch flüssige Phasen zusätzlich zu Wasser oder zum Ausschluss von Wasser enthalten. Exemplarisch für solche zusätzlichen flüssigen Phasen sind Glycerin, pflanzliche Öle wie Baumwollsamenöl und Wasser-Öl Emulsionen.
Eine therapeutische Zusammensetzung enthält eine die Angiogenese inhibierende Menge eines α_vβ₃-Antagonisten der vorliegenden Erfindung, typischerweise so formuliert, dass sie eine Menge von mindestens 0.1 Gewichtsprozent Antagonist bezogen auf das Gewicht der therapeutischen Zusammensetzung enthält. So entspricht beispielsweise 0.1 Gewichtsprozent 0.1 Gramm eines Inhibitors pro 100 Gramm der Gesamtzusammensetzung.
E. α_vβ₃-Integrin-Antagonisten
α_vβ₃-Antagonisten werden gemäß der vorliegeriden Erfindung für die Inhibierung der Angiogenese in Geweben gebraucht und können eine Vielfalt von Formen annehmen, die Verbindungen einschließen, die mit α_vβ₃ in einer Art reagieren, dass funktionelle Interaktionen mit natürlichen α_vβ₃-Liganden verhindert werden. Exemplarische Antagonisten schließen α_vβ₃-Analoga ein, die von der Liganden-Bindungsstelle von α_vβ₃ abgeleitet sind, Mimetika von entweder α_vβ₃ oder einem natürlichen Liganden von α_vβ₃, die die Strukturregion nachahmen, die an den α_vβ₃-Ligandenbindungs-Interaktionen beteiligt ist, Polypeptide, die eine Sequenz aufweisen, die einer funktionalen Bindungsdomäne des natürlichen Liganden entsprechen, der für α_vβ₃ spezifisch ist, insbesondere den RGD-enthaltenden Domänen eines natürlichen Liganden von α_vβ₃ entsprechen und Antikörper, die entweder mit α_vβ₃ oder einem natürlichen Liganden immunreagieren, all diese genannten üben eine antagonistische Wirkung aus, wie sie hier definiert ist.
1. Polypeptide
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung α_vβ₃-Antagonisten in der Form von Polypeptiden. Ein Polypeptid (Peptid) α_vβ₃-Antagonist kann die Sequenzcharakteristika von entweder einem natürlichem Liganden von α_vβ₃ oder die von α_vβ₃ selbst in einer Region, die an der α_vβ₃-Liganden-Interaktion beteiligt ist, aufweisen und weist, wie hier beschrieben, α_vβ₃-antagonistische Aktivität auf. Ein bevorzugter α_vβ₃-Peptid-Antagonist enthält das RGD-Tripeptid und entspricht in der Sequenz dem natürlichen Liganden in der RGD-enthaltenden Region.
Bevorzugte RGD-enthaltende Polypeptide weisen eine Sequenz auf, die der Aminosäuresequenz der RGD-enthaltenden Region eines natürlichen Liganden von α_vβ₃, wie Fibrinogen, Vitronektin, von Willebrand Faktor, Laminin, Thrombospondin und ähnlichen Liganden entspricht. Die Sequenzen dieser α_vβ₃-Liganden sind gut bekannt. So kann ein α_vβ₃-Peptid-Antagonist von jedem der natürlichen Liganden abgeleitet werden, obwohl Fibrinogen und Vitronektin bevorzugt sind.
Ein besonders bevorzugter α_vβ₃-Peptid Antagonist hemmt vorzugsweise die Bindung von α_vβ₃, an sein(en) natürlichen Ligand(en) im Vergleich zu anderen Integrinen, wie oben beschrieben. Die α_vβ₃-spezifischen Peptide sind zumindest deswegen besonders bevorzugt, weil die Spezifität für α_vβ₃ das Auftreten von unerwünschten Nebenwirkungen, wie die Inhibierung anderer Integrine, reduziert. Die Identifizierung von bevorzugten α_vβ₃ Peptid-Antagonisten, die selektiv für α_vβ₃ sind, kann verhältnismäßig leicht in typischen Inhibitionsassays bestimmt werden, wie der in den Beispielen beschriebene ELISA.
In einer Ausführungsform umfasst ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung nicht mehr als etwa 100 Aminosäurereste, bevorzugt nicht mehr als etwa 60 Reste, bevorzugter nicht mehr als etwa 30 Reste. Die Peptide können linear oder zyklisch sein, obwohl besonders die zyklischen Peptide bevorzugt sind.
Bevorzugte zyklische und lineare Peptide und ihre Bezeichnungen sind in Tabelle 1 in den Beispielen gezeigt.
Es sollte verstanden werden, dass ein erfindungsgemäßes Polypeptid nicht identisch mit der Aminosäuresequenz eines natürlichen Liganden von α_vβ₃ sein muss, so lange es die erforderliche Sequenz einschließt und es in einem hier beschriebenem Assay α_vβ₃-antagonistische Aktivität aufweist.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid schließt ein Analogon, Fragment oder chemisches Derivat eines Polypeptids ein, dessen Aminosäuresequenz hier gezeigt ist, so lange wie das Polypeptid ein α_vβ₃-Antagonist ist. Daher können an einem hier beschriebenem Polypeptid auch verschiedene Veränderungen, Substitutionen, Insertionen und Entfernungen vorgenommen werden, so dass bestimmte bestimmte Vorteile im Gebrauch resultieren. In dieser Hinsicht entsprechen, eher als dass sie identisch sind, die erfindungsgemäßen α_vβ₃-Peptid-Antagonisten der Sequenz eines der zitierten Peptide, wobei ein oder mehrere Veränderungen vorgenommen werden, ihre Fähigkeit als ein α_vβ₃-Antagonist in einem oder mehreren Assays, wie sie hier beschrieben sind, zu wirken, bleibt dabei erhalten.
Daher kann ein Polypeptid in jeder einer Vielzahl verschiedener Farmen von Peptid-Derivaten auftreten, einschließlich Amiden, Konjugaten mit Proteinen, zyklischen Peptiden, polymerisierten Peptiden, Analoga, Fragmente, chemisch modifizierte Peptide und ähnliche Derivate.
Der Ausdruck „Analogon” schließt ein Polypeptid ein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen identisch zu einer Sequenz ist, die im speziellen hier gezeigt wird, in der ein oder mehrere Reste konservativ durch einen funktionell ähnlichen Rest ersetzt wurden, und die α_vβ₃-antagonistische Aktivität, wie hier beschrieben, aufweisen. Beispiele für konservative Austausche schließen den Austausch eines nichtpolaren (hydrophoben) Restes wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen dieser Reste ein, den Austausch eines polaren (hydrophilen) Restes durch einen anderen polaren Rest, wie Arginin durch Lysin, Glutamin durch Asparagin, Glycin durch Serin, den Austausch eines basischen Restes wie Lysin, Arginin oder Histidin durch einen anderen dieser Reste oder den Austausch eines sauren Restes, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure durch einen anderen dieser Reste ein.
Der Ausdruck „konservativer Austausch” schließt auch die Verwendung von chemischen Derivaten der Aminosäurereste an Stelle von nicht-derivatisierten Aminosäureresten ein, vorausgesetzt, dass so ein Polypeptid die erforderliche inhibitorische Aktivität aufweist.
Der Ausdruck „chemische Derivate” bezieht sich auf ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit einem oder mehreren Resten, die durch eine Reaktion einer funktionellen Seitengruppe chemisch derivatisiert wurden. Solche derivatisierten Moleküle schließen zum Beispiel solche Moleküle ein, in denen freie Aminogruppen zu Aminohydrochloriden, p-Toluensulfonylgruppen, Karbobenzoxygruppen, t-Butyloxycarbonylgruppen, Chloroacetylgruppen oder Formylgruppen derivatisiert wurden. Freie Karboxygruppen können so derivatisiert werden, dass Salze, Methyl- und Äthylester oder andere Typen von Estern oder Hydraziden gebildet werden. Freie Hydroxylgruppen können so derivatisiert werden, dass O-Acyl- oder O-Alkyiderivate gebildet werden. Der Imidazol-Stickstoff von Histidin kann so derivatisiert werden, dass er N-im-benzylhistidin bildet. In den chemischen Derivaten sind auch solche Peptide eingeschlossen, die ein oder mehrere natürliche Aminosäurederivate der 20 Standardaminosäuren enthalten. Zum Beispiel: 4-Hydroxyprolin kann Prolin ersetzen, 5-Hydroxylysin kann Lysin ersetzen, 3-Methylhistidin kann Histidin ersetzen, Homoserin kann Serin ersetzen und Ornithin kann Lysin ersetzen. Polypeptide der vorliegenden Erfindung schließen auch jedes Polypeptid ein, das ein oder mehrere Additionen und/oder Entfernungen aufweist oder Reste, die ähnlich der Sequenz eines Polypeptids sind, dessen Sequenz hier gezeigt ist, so lange die erforderliche Aktivität erhalten ist.
Der Ausdruck „Fragment” bezieht sich auf irgendein erfindungsgemäßes Polypeptid, dass eine Aminosäuresequenz aufweist, die kürzer ist als die eines Polypeptids, dessen Aminosäuresequenz hier gezeigt ist.
Wenn ein erfindungsgemäßes Polypeptid eine Sequenz aufweist, die nicht identisch mit der Sequenz eines natürlichen Ligandens von α_vβ₃ ist, dann ist dies typischerweise deshalb der Fall, weil ein oder mehrere konservative oder nicht-konservative Substitutionen vorgenommen wurden, üblicherweise werden nicht mehr als ungefähr 30% und vorzugsweise nicht mehr als 10% der Aminosäurereste substituiert. Auch können zusätzliche Reste an jedem Terminus des Polypeptids angefügt werden, um einen „Linker” bereitzustellen, mit dem die erfindungsgemäßen Polypeptide leicht an eine Markierung, eine feste Matrix oder einem Träger angebunden werden können.
Markierungen, feste Matrizes und Träger, die mit diesen erfindungsgemäßen Polypeptiden verwendet werden können, werden weiter unten beschrieben.
Aminosäurerest-Linker sind normalerweise mindestens einen Rest lang und können 40 oder mehr Reste lang sein, häufiger 1 bis 10 Reste, aber sie bilden keine α_vβ₃ Ligandenepitope. Typische Aminosäurereste, die für die Verknüpfung gebraucht werden, sind Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutaminsäure und Asparaginsäure oder ähnliche. Darüber hinaus kann sich ein erfindungsgemäßes Polypeptid, so lange nicht anders spezifiziert, von der natürlichen Sequenz eine α_vβ₃-Ligandens unterscheiden, indem die Sequenz durch terminale NH₂-Acylierung, zum Beispiel Acetylierung oder Thioglykolsäureamidierung, durch terminale Karboxylamidierung, zum Beispiel mit Ammonium, Methylamin sowie ähnlichen terminalen Modifikationen verändert wird.
Wie bekannt, sind terminale Modifikationen nützlich, um die Empfindlichkeit gegenüber einem proteolytischem Verdau zu reduzieren, und daher dienen sie der Verlängerung der Halbwertszeit der Polypeptide in Lösungen, besonders biologischen Flüssigkeiten, in denen Proteasen vorliegen können. in dieser Hinsicht ist die Zyklisierung der Polypeptide auch eine nützliche terminale Modifikation und ist besonders auch deswegen bevorzugt, weil durch die Zyklisierung stabile Strukturen gebildet werden, ebenso wie hinsichtlich der biologischen Aktivitäten, die für solche zyklischen Peptide beobachtet werden, wie hier beschrieben.
Jedes Peptid der vorliegenden Erfindung kann in der Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes verwendet werden. Geeignete Salze, die fähig sind Salze mit Peptiden dieser Verbindung zu bilden, schließen anorganische Säuren ein, wie Trifluoressigsäure (TFA), Salzsäure (HCl), Hydrobromsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxasäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Naphthalensulfonsäure, Sulfanilinsäure oder ähnliche. HCl und TFA sind besonders bevorzugt.
Geeignete Basen, die Salze mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung bilden können, schließen anorganische Basen ein, wie Natriumhydroxyd, Ammoniumhydroxyd, Kaliumhydroxyd und ähnliche, und organische Basen wie Mono-, Di-, Trialkyl- und Arylamine (z. B. Triäthylamin, Diisopropylamin, Methylamin, Dimethylamin und ähnliche) und optional substituierte Äthanolamine (z. B. Äthanolamin, Diäthanolamin und ähnliche).
Ein Peptid der vorliegenden Erfindung, hier auch als erfindungsgemäßes Polypeptid bezeichnet, kann mit verschiedenen Techniken, einschließlich rekombinanten DNA Techniken synthetisiert werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet der Polypeptide bekannt sind. Die Verfahren der synthetischen Chemie, wie die Festphasen-Synthese vom Typ Merrifield, sind aus Gründen der Reinheit, Antigenspezifität, Abwesenheit von unerwünschten Nebenprodukten, Einfachheit der Herstellung und ähnliches bevorzugt. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der vielen verschiedenen verfügbaren Techniken kann man finden in Steward et al., ”Solid Phase Peptide Synthesis”, W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky, et al., ”Peptide Synthesis”, John Wiley & Sons, Second Edition, 1976; J. Meienhofer, ”Hormonal Proteins and Peptides”, Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983; Merrifield, Adv. Enzvmol., 32: 221–96, 1969; Fields et al., Int. J. Peptide Protein Res., 35: 161–214, 1990; und U.S. Pat. No. 4,244,946 für Festphasen-Peptidsynthese, und Schroder et al., ”The Peptides”, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 für klassische Synthesen in Lösung. Geeignete Schutzgruppen, die in solchen Synthesen verwendet werden, sind in den obigen Texten und in J. F. W. McOmie, ”Protective Groups in Organic Chemistry”, Plenum Press, New York, 1973 beschrieben.
Generell umfassen die hier offenbarten Festphasen-Synthese-Verfahren die sequentielle Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste oder geeigneter geschützter Aminosäurereste zu einer wachsenden Peptidkette. Normalerweise ist entweder die Amino- oder Karboxygruppe des ersten Aminosäurerestes durch eine geeignete, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt. Eine unterschiedliche, selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für die Aminosäuren verwendet, die eine reaktive Seitengruppe enthalten, wie Lysin.
Bei der Verwendung der Festphasen-Synthese beispielsweise, wird die geschützte oder derivatisierte Aminosäure durch ihre ungeschützte Karboxy- oder Aminogruppe an ein inertes festes Trägermaterial gebunden. Die Schutzgruppe der Amino- oder Karboxygruppe wird dann selektiv entfernt und die nächste Aminosäure in der Sequenz, bei der die komplementäre (Amino oder Karboxy) Gruppe in geeigneter Weise geschützt ist, wird zugefügt und reagiert unter Bedingungen, die für eine Amidbrückenbildung mit dem Rest, der schon an dem festen Trägermaterial befestigt ist, geeignet sind. Die Schutzgruppe der Amino- oder Karboxygruppe wird dann von diesem neu zugefügtem Aminosäurerest entfernt, und die nächste Aminosäure (geeignet geschützt) wird zugefügt und so weiter. Nachdem alle der gewünschten Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge verknüpft worden sind, werden die verbliebenen terminalen und Seiten-Schutzgruppen (und das feste Trägermaterial) nacheinander oder gleichzeitig entfernt, um letztlich das lineare Polypeptid zu liefern.
Die resultierenden linearen Polypeptide, die z. B. wie oben beschrieben hergestellt werden, können so reagieren, dass ihre entsprechenden zyklischen Peptide entstehen. Ein exemplarisches Verfahren zum Zyklisieren von Peptiden ist in Zimmer et al., Peptides 1992, pp. 393–394, ESCOM Science Publishers, B. V., 1993 beschrieben. Typischerweise wird ein mit tert-Butoxykarbonyl geschützter Peptidmethylester in Methanol gelöst, Natriumhydroxydlösung zugefügt und die Mischung bei 20°C zur Reaktion gebracht, um die Methylester-Schutzgruppe hydrolytisch zu entfernen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels, wird das tert-Butoxykarbonyl-geschützte Peptid aus der angesäuertem wässrigen Lösung mit Äthylacetat extrahiert. Die tert-Butoxykarbonyl-Schutzgruppe wird dann mit Dioxan als weiterem Lösungsmittel unter milden sauren Bedingungen entfernt. Das so erhaltene, ungeschützte lineare Peptid mit freien Amino- und Karboxyenden wird dann zu seinen entsprechenden zyklischen Peptid umgesetzt, indem eine verdünnte Lösung des linearen Peptids in einer Mischung aus Dichlormethan und Dimethylformamid, mit Dicyclohexylkarbodiimid in der Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol und N-Methylmorpholin zur Reaktion gebracht wird. Das resultierende zyklische Peptid wird anschließend chromatographisch aufgereinigt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Synthese von zyklischen Polypeptiden wurde von Gurrath et al., Eur. J. Biochem., 210: 911–921 (1992) veröffentlicht und ist in den Beispielen beschrieben. Besonders bevorzugte Peptide für die Verwendung in den vorliegenden Verfahren sind c-(GrGDFV) (SEQ ID NO 4), c-(RGDfV) (SEQ ID NO 5), c-(RADfV) (SEQ ID NO 6), c-(RGDFV) (SEQ ID NO 7) und das lineare Peptid YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID NO 8), wobei ”c-” ein zyklisches Peptid anzeigt, die Grossbuchstaben entsprechen dem Einzelbuchstaben Code für L-Aminosäuren und die Kleinbuchstaben entsprechen dem Einzelbuchstaben Code für D-Aminosäuren. Die Aminosäuresequenzen dieser Peptide sind auch in SEQ ID Nos 4, 5, 6, 7 beziehungsweise 8 gezeigt.
2. Monoklonale Antikörper
Die vorliegende Erfindung beschreibt in einer Ausführungsform α_vβ₃-Antagonisten in der Form monoklonaler Antikörper, die mit α_vβ₃ immunreagieren und die Bindung von α_vβ₃ an seinen natürlichen Liganden inhibieren, wie hier beschrieben. Hier sind auch Zelllinien, die Antikörper produzieren, Methoden zur Herstellung der Zelllinien und Methoden für die Herstellung monoklonaler Antikörper beschrieben.
Ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper umfasst Antikörpermoleküle, die 1) mit isoliertem α_vβ₃ immunreagieren und 2) die Fibrinogen-Bindung an α_vβ₃ inhibieren. Bevorzugte monoklonale Antikörper, die präferentiell an α_vβ₃ binden, schließen monoklonale Antikörper ein, die die Immunreaktionscharakteristika des mAb LM609 aufweisen, der von der Hybridomzelllinie ATCC HB 9537 sezerniert wird. Die Hybridomzelllinie ATCC HB 9537 wurde bei der ATCC gemäß den Erfordernissen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection (ATCC), 1301 Parklawn Drive, Rockville, Md., USA, am 15. September 1987 hinterlegt.
Der Ausdruck „Antikörper oder Antikörpermolekül” in den verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier als ein kollektives Substantiv verwendet, das sich auf eine Population von Immunglobulinmolekülen und/oder immunologisch aktiven Teilen eines Immunglobulinmoleküls bezieht, d. h. Moleküle die eine Stelle enthalten, die eine Antikörper-Kombinationsstelle oder ein Paratop enthalten.
Eine „Antikörper-Kombinationsstelle” ist der Strukturanteil eines Antikörpermoleküls, der die variablen und hypervariablen Regionen der schweren und leichten Kette umfasst, die spezifisch das Antigen binden.
Beispielhafte Antikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind intakte Immunoglobulinmoleküle, im Wesentlichen intakte Immunoglobulinmoleküle und die Anteile eines Immunoglobulinmoleküls, welche das Paratop enthalten, einschließlich der Anteile, die im Stand der Technik als Fab, Fab', F(ab')₂ und F(v) bezeichnet werden und auch als Antikörperfragmente bezeichnet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform offenbart die Erfindung ein verkürztes Immunoglobulinmolekül, das ein Fab Fragment umfasst, das von einem monoklonalen erfindungsgemäßen Antikörper abgeleitet ist. Das Fab Fragment, dem der Fc Rezeptor fehlt, ist löslich und ermöglicht therapeutische Vorteile in Bezug auf die Halbwertszeit im Serum sowie auch diagnostische Vorteile hinsichtlich der Art und Weise, wie das lösliche Fab Fragment verwendet werden kann. Die Herstellung eines löslichen Fab Fragments ist allgemein im Stand der Technik auf dem Gebiet der Immunologie bekannt und kann durch eine Vielfalt an Verfahren erreicht werden.
Zum Beispiel werden die Fab und F(ab')₂ Anteile (Fragmente) der Antikörper durch eine proteolytische Reaktion der im wesentlichen intakten Antikörper mit Papain beziehungsweise Pepsin hergestellt, durch Verfahren, die gut bekannt ist. Siehe zum Beispiel im U.S. Pat. No. 4,342,566 von Theofilopolous und Dixon. Fab' Antikörperanteile sind auch gut bekannt und werden aus F(ab')₂ Anteilen hergestellt, gefolgt von einer Reduktion der Disulfidbrücken, die die zwei schweren Ketten verknüpfen, zum Beispiel mit Mercaptoäthanol, gefolgt von einer Alkylierung des resultierenden Proteinmercaptans mit einem Reagenz wie Jodoacetamid. Ein Antikörper, der intakte Immunoglobulinmoleküle enthält, ist bevorzugt und wird so verwendet, wie hier beschrieben.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper” in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen bezieht sich auf eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Spezies einer Antikörperkombinationsstelle enthält, die fähig ist mit einem bestimmten Epitop zu immunreagieren. Ein monoklonaler Antikörper weist demnach typischerweise eine einzige Bindungsaffinität für irgendein Epitop auf, mit dem er immunologisch kreuzreagiert. Ein monoklonaler Antikörper kann folglich ein Antikörpermolekül enthalten, das eine Vielzahl an Kombinationsstellen eines Antikörpers enthält, wobei jedes immunspezifisch für ein unterschiedliches Epitop ist, z. B. ein bispezifischer monoklonaler Antikörper.
Ein monoklonaler Antikörper ist typischerweise aus Antikörpern zusammengesetzt, die von Einzelzellklonen, Hybridome genannt, sezerniert (produziert) werden und die nur eine Art eines Antikörpers sezernieren. Die Hybridomzelle entsteht durch Fusion einer Antikörper produzierenden Zelle mit einem Myelom oder mit anderen sich selbst erhaltenden Zelllinien. Die Herstellung solcher Antikörper wurde zuerst von Köhler and Milstein, Nature 256: 495–497 (1975) beschrieben. Weitere Methoden wurden von Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) beschrieben. Die so gewonnenen Hybridomüberstände können auf die Anwesenheit eines Antikörpermoleküls, das mit α_vβ₃ immunologisch kreuzreagiert oder, das die Bindung von α_vβ₃ an seine natürlichen Liganden inhibiert, durchgemustert werden.
In Kürze, um die Hybridome zu bilden, aus denen die monoklonale Antikörperzusammensetzung gewonnen wird, werden Myelome oder andere sich selbst erhaltende Zelllinien mit Lymphozyten fusioniert, die von der Milz eines mit α_vβ₃ hyperimmunisierten Säugers stammen, α_vβ₃ wurde beispielsweise aus M21 humanem Melanomzellen isoliert, wie bei Cheresh et al., J. Biol. Chem., 262: 17703–17711 (1987) beschrieben.
Es ist bevorzugt, dass die Myelom-Zelllinie, die verwendet wird, um das Hybridom herzustellen, von derselben Tierart wie die Lymphozyten stammt. Typischerweise sind Mäuse des Stammes 129 GIX⁺ die bevorzugte Säugerart. Geeignete Mausmyelome zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-sensitiven (HAT) Zelllinien P3X63-Ag8.653 und Sp2/0-Ag14 ein, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Md., unter den Bezeichnungen CRL 1580 beziehungsweise CRL 1581 erhältlich sind.
Die Milzzellen werden typischerweise mittels Polyethylenglycol (PEG) 1500 mit den Myelomzellen fusioniert. Die fusionierten Hybride werden dann durch ihre Sensitivität gegenüber HAT selektiert. Die Hybridome, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren, werden durch Verwendung des „enzyme linked immunosorbant assay” ELISA wie in den Beispielen beschrieben, identifiziert.
Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung kann auch durch den Start einer monoklonalen Hybridomkultur hergestellt werden, das Nährmedium umfassend, das ein Hybridom enthält, welches Antikörpermoleküle der geeigneten Spezifität sezerniert. Die Kultur wird unter den Bedingungen und für die Dauer gehalten, die ausreichen, dass das Hybridom Antikörpermoleküle in das Medium sezerniert. Das Antikörper enthaltende Medium wird dann gesammelt. Die Antikörpermoleküle können dann weiter durch gut bekannte Techniken isoliert werden.
Medien, die für die Herstellung dieser Zusammensetzungen verwendet werden können, sind in der Technik gut bekannt und kommerziell erhältlich und schließen synthetische Kulturmedien, Inzucht-Mäuse und ähnliches ein. Ein exemplarisches synthetisches Medium ist „Dulbecco's minimal essential medium” (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8: 396, 1959), angereichert mit 4.5 g/l Glukose, 20 mM Glutamin und 20% fötalem Kälberserum. Ein Beispiel für einen Inzucht-Mausstamm ist der Balb/c Stamm.
Andere Verfahren für die Herstellung monoklonaler Antikörper, einer Hybridom-Zelllinie oder einer Hybridom-Zellkultur sind ebenfalls gut bekannt. Siehe z. B. das von Sastry, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5728–5732 (1989) und Huse et al., Science, 246: 1275–1281 (1989) beschriebene Verfahren, monoklonale Antikörper aus einem immunologischen Repertoire zu isolieren.
Die vorliegende Erfindung schlägt auch Hybridomzellen und Kulturen vor, die Hybridomzellen enthalten, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren. Besonders bevorzugt ist die Hybridom-Zelllinie, die den monoklonalen Antikörper mAb LM609, bezeichnet als ATCC HB 9537, sezerniert. Der mAb LM609 wurde, wie bei Cheresh et al., J. Biol. Chem., 262: 17703–17711 (1987) beschrieben, hergestellt und seine Präparation ist auch in den Beispielen beschrieben.
Die Erfindung betrifft in einer Ausführungsform einen monoklonalen Antikörper, der die Immunreaktionscharakteristika des mAb LM609 aufweist.
Es ist auch ohne einen unzumutbaren experimentellen Aufwand möglich, festzustellen, ob ein monoklonaler Antikörper dieselbe (d. h. äquivalente) Spezifität (Immunreaktionscharakteristika) wie ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper aufweist, indem bestimmt wird, ob der Erstere verhindert, dass Letzterer an ein vorher ausgewähltes Zielmolekül bindet. Wenn der zu testende monoklonale Antikörper mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper konkurriert, wie in Standard-Kompetitionsassays durch eine Abnahme der Bindung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers an das an eine feste Phase gebundene Zielmolekül gezeigt werden kann, dann ist es wahrscheinlich, dass die beiden monoklonalen Antikörper an dasselbe oder an ein eng verwandtes Epitop binden.
Eine weitere Möglichkeit zu bestimmen, ob ein monoklonaler Antikörper die Spezifität eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers besitzt, besteht darin, den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mit dem Zielmolekül, mit dem er normalerweise reagiert, vorzuinkubieren und dann den zu testenden monoklonalen Antikörper zufügt, um zu ermitteln, ob der zu testende monoklonale Antikörper inhibiert ist, an das Zielmolekül zu binden. Ist der zu testende monoklonale Antikörper inhibiert, weist er aller Wahrscheinlichkeit nach dieselbe oder eine funktionell äquivalente Spezifität für ein Epitop wie der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper auf.
Eine weitere Methode zu bestimmen, ob ein monoklonaler Antikörper die Spezifität eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers aufweist, besteht darin, die Aminosäuresequenz in der CDR Region der fraglichen Antikörper zu ermitteln. Antikörpermoleküle, die identische, oder funktionell äquivalente Aminosäuresequenzen in ihren CDR Regionen aufweisen, haben dieselbe Bindungsspezifität. im Stand der
Technik sind Verfahren, Polypeptide zu sequenzieren, gut bekannt. Die Immunspezifität eines Antikörpers, seine Kapazität Zielmoleküle zu binden und die damit verbundene Affinität, die der Antikörper gegenüber einem Epitop aufweist, sind durch das Epitop bestimmt, mit dem der Antikörper immunologisch kreuzreagiert. Die Epitop-Spezifität ist zumindest teilweise durch die Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette des Immunglobulins des Antikörpers bestimmt und zum Teil durch die Aminosäuresequenz der leichten Kette.
Die Verwendung des Ausdrucks „die Bindungsspezifität aufweisen von” zeigt an, dass äquivalente monoklonale Antikörper dieselbe oder ähnliche Immunreaktions-(Bindungs-)charakteristika aufweisen und um die Bindung ausgewählter Zielmoleküle konkurrieren.
Humanisierte monoklonale Antikörper bieten besondere Vorteile gegenüber murinen monoklonalen Antikörpern, besonders insofern als sie für therapeutische Zwecke in Menschen verwendet werden können. Im Besonderen werden humanisierte Antikörper nicht so schnell aus dem Blutkreislauf entfernt wie „fremde” Antigene, und außerdem aktivieren sie das Immunsystem nicht in der Weise wie fremde Antigene und fremde Antikörper. Verfahren der Herstellung „humanisierter” Antikörper sind im Stand der Technik gut bekannt und können unmittelbar auf die erfindungsgemäßen Antikörper angewendet werden.
Folglich schlägt die Erfindung in einer Ausführungsform einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper vor, der durch „grafting” humanisiert wurde, um Komponenten des humanen Immunsystems einzuführen, ohne dass die Fähigkeit des Antikörpers Antigene zu binden, wesentlich beeinflusst ist.
3. α_vβ₃-spezifische Mimetika
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass α_vβ₃-Antagonisten allgemein in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, diese Antagonisten schließen Polypeptide, Antikörper und andere Moleküle, „Mimetika” genannt, ein, die die Kapazität aufweisen, mit der α_vβ₃-Funktion zu interferieren. Besonders bevorzugt sind Antagonisten, die spezifisch mit der α_vβ₃-Funktion interferieren und nicht mit der Funktion anderer Integrine interferieren.
In diesem Zusammenhang wird festgestellt, dass eine Vielfalt von Reagenzien für eine Verwendung in den vorliegenden Verfahren geeignet sein kann, so lange wie diese Reagenzien die geforderte biologische Aktivität aufweisen. Diese Reagenzien werden generisch als Mimetika bezeichnet, weil sie die Fähigkeit besitzen, eine Bindungsdomäne von entweder α_vβ₃ oder dem α_vβ₃-Liganden nachzuahmen, die an der funktionellen Interaktion des Rezeptors und Ligandens beteiligt ist, und dadurch mit der normalen Funktion interferieren, d. h. diese inhibieren.
Ein α_vβ₃-Mimetikum ist irgendein Molekül, außer ein Antikörper oder ein von einem Liganden abgeleitetes Peptid, das eine der oben beschriebenen Eigenschaften aufweist. Es kann ein synthetisches Analogon eines Peptids sein, eine Verbindung, die eine Form aufweist, wie die Bindungstasche der oben beschriebenen Bindungsdomäne oder andere Moleküle.
Das Design eines α_vβ₃-Mimetikums kann mit irgendeiner Vielfalt an Strukturanalyse-Verfahren für das Design von Pharmaka, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt werden, einschließlich „molecular modeling”, zweidimensionale Kernspinresonanzanalyse (2-D NMR), Röntgenstrahl-Kristallographie, zufälliges Durchmustern von Peptiden, Peptidanaloga oder anderer chemischer Polymer-Bibliotheken, und ähnliche Verfahren für das Design von Pharmaka.
Angesichts der in der vorliegenden Beschreibung erläuterten, guten strukturellen Hinweise, die zeigen, dass ein α_vβ₃-Antagonist ein kleines Polypeptid oder ein monoklonaler Antikörper sein kann, zwei völlig unterschiedliche chemische Strukturen, die die funktionelle Eigenschaft einer selektiven Hemmung von α_vβ₃ teilen, braucht die Struktur des erfindungsgemäßen α_vβ₃-Antagonisten für eine Anwendung in den vorliegenden Verfahren nicht limitiert zu sein, sondern schließt jedes α_vβ₃-Mimetikum, so wie es hier definiert ist, ein.
F. Verfahren zur Identifikation von α_vβ₃-Antagonisten
Hier sind auch Testverfahren zur Identifikation von Kandidaten für α_vβ₃-Antagonisten zur Verwendung gemäss der vorliegenden Verfahren beschrieben. In diesen Testverfahren werden Kandidatenmolelüle auf ihre Wirksamkeit hinsichtlich einer Inhibition der α_vβ₃-Bindung an natürliche Liganden untersucht und weiter wird ihre Effizienz, die Angiogenese in einem Gewebe zu hemmen, ermittelt.
Der erste Assay misst die Hemmung einer direkten Bindung eines natürlichen Liganden an α_vβ₃ und eine bevorzugte Ausführungsform ist in den Beispielen im Detail beschrieben. Der Assay misst typischerweise das Maß der Inhibition der Bindung eines natürlichen Liganden, wie Fibrinogen, an isoliertes α_vβ₃ in einer festen Phase durch ELISA.
Der Assay kann auch zur Identifikation von Stoffen verwendet werden, die eine Spezifität für α_vβ₃ aufweisen, aber nicht die Bindung von natürlichen Liganden an andere Integrine hemmen. Der Spezifitätstest wird so durchgeführt, dass mehrere ELISAs parallel durchgeführt werden, in denen sowohl α_vβ₃ als auch andere Integrine gleichzeitig in separaten Testkammern auf ihre jeweiligen Eigenschaften hin durchgemustert werden, einen natürlichen Liganden zu binden und es wird getestet, ob die Kandidatenmoleküle die jeweiligen Eigenschaften der Integrine, an vorselektierte Liganden zu binden, inhibieren. Bevorzugte Testformate, die für eine Durchmusterung geeignet sind, werden in den Beispielen angegeben.
Der zweite Assay misst die Angiogenese in der Hühner-Chorioallantois-Membran (CAM) und wir hier als CAM-Assay bezeichnet. Der CAM-Assay wurde im Detail von anderen beschrieben und wurde sowohl zur Messung der Angiogenese als auch der Neovaskularisierung von Tumorgeweben verwendet. Siehe Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79: 597–618 (1975) und Ossonski et al., Cancer Res., 40: 2300–2309 (1980). Der CAM-Assay ist ein gut bekanntes Assaymodell für die in vivo Angiogenese, weil eine Neovaskularisierung eines gesamten Gewebes auftritt und echte Hühnerembryonen-Blutgefäße in die CAM hineinwachsen oder in die Gewebe, die auf der CAM wachsen, hineinwachsen.
Der CAM-Assay zeigt eine Inhibierung der Neovaskularisierung sowohl durch Veränderungen in der Menge als auch des Ausmasses des Wachstums neuer Gefäße an, wie hier beschrieben. Weiterhin ist es leicht, das Wachstum irgendeines Gewebes, das auf die CAM transplantiert wurde, wie z. B. Tumorgewebe, zu verfolgen. Schließlich ist der Assay besonders nützlich, weil er eine interne Toxizitätskontrolle ermöglicht. Der Hühnerembyo wird irgendeinem Testreagenz ausgesetzt, so dass der Gesundheitszustand des Embryos einen Hinweis auf Toxizität des Testreagenzes gibt.
Der dritte Assay misst die Angiogenese in dem in vivo Kaninchenaugen-Modell und wird hier als Kaninchenauge-Assay bezeichnet. Der Kaninchenaugen-Assay wurde im Detail von anderen beschrieben und wurde verwendet, um sowohl die Angiogenese als auch die Neovaskularisierung in der Anwesenheit von angiogenen Inhibitoren, wie z. B. Thalidomid, zu messen. Siehe D'Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 4082–4085 (1994).
Der Kaninchenaugen-Assay ist ein gut bekanntes Assay-Modell für die in vivo Angiogenese, weil der Prozess der Neovaskularisierung, z. B. wenn Blutgefäße des Kaninchens vom Rand der Kornea in die Kornea hineinwachsen, durch die natürliche Transparenz der Kornea leicht erkennbar ist. Darüber hinaus kann sowohl das Ausmaß als auch die Menge der Stimulierung oder Hemmung der Neovaskularisierung oder die Rückbildung der Neovaskularisierung leicht über die Zeit verfolgt werden.
Schließlich wird das Kaninchen irgendeinem Testreagenz ausgesetzt, so dass der Gesundheitszustand des Kaninchens dann einen Hinweis auf die Toxizität des Assayreagenzes gibt.
Der vierte Assay misst die Angiogenese in einem chimären Maus:Mensch Maus-Modell und wird hier als chimärer Maus-Assay bezeichnet. Der Assay wurde im Detail von anderen beschrieben und wird hier als ein Assay beschrieben, mit dem die Angiogenese, die Neovaskularisierung und die Regression von Tumorgeweben gemessen werden kann. Siehe Yan, et al., J. Clin. invest., 91: 986–996 (1993). Der chimäre Maus-Assay ist ein nützliches Assay-Modell für die in vivo Angiogenese, weil die transplantierten Hauttransplantate der normalen humanen Haut histologisch sehr ähneln und die Neovaskularisierung im gesamten Gewebe stattfindet, wobei echte humane Blutgefäße von der transplantierten humanen Haut in das humane Tumorgewebe, das sich auf der Oberfläche der transplantierten humanen Haut befindet, hineinwachsen. Der Ursprung der Neovaskularisierung in dem humanen Transplantat kann durch immunhistochemische Färbeverfahren der Neovaskulatur mit human-spezifischen Endothelzell-Markern nachgewiesen werden.
Wie hier beschrieben, zeigt der chimäre Maus-Assay die Rückbildung der Neovaskularisierung durch die Menge und das Ausmaß der Abnahme neuen Gefäßwachstums an. Weiterhin ist es einfach, die Effekte auf das Wachstum irgendeines Gewebes, das auf die transplantierte Haut transplantiert wird, wie z. B. Tumorgewebe, zu verfolgen. Schließlich ist der Assay auch nützlich, weil eine interne Toxizitätskontrolle in dem Testsystem gegeben ist. Die chimäre Maus wird irgendeinem Testreagenz ausgesetzt, so dass der Gesundheitszustand der Maus einen Hinweis auf die Toxizität gibt.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele, die sich auf diese Erfindung beziehen, sind erläuternd und sollten selbstverständlich nicht als die Erfindung spezifisch begrenzend aufgefasst werden. Weiter sollten solche erfindungsgemäßen Varianten, die schon jetzt bekannt sind oder später entwickelt werden und die im Wissensbereich des Fachmanns auf diesem Gebiet liegen, so betrachtet werden, dass sie in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen, so wie er hier beansprucht wird. Die Beispiele beschreiben, inter alia, die Behandlung von Melanomen, diese Behandlung wird nicht beansprucht und wird nur aus illustrativen Zwecken beschrieben.
1. Herstellung synthetischer Peptide
Die linearen und zyklischen Polypeptide, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, wurden nach Standard-Festphasen-Synthesetechniken synthetisiert, z. B. wie in Merrifield, Adv. Enzymol., 32: 221–96, (1969) und Fields, G. B. and Noble, R. L., Int. J. Peptide Protein Res., 35: 161–214, (1990) beschrieben.
Zwei Gramm (g) BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe (SEQ ID NO 1) wurden zuerst in 60 Millilitern (ml) Methanol gelöst und dann 1.5 ml 2 N Natriumhydroxydlösung zugefügt, um ein Gemisch zu erhalten. Dieses Gemisch wurde dann für 3 Stunden bei 20°C gerührt. Nach Eindampfen wurde der Rückstand in Wasser aufgelöst, mit verdünnter HCl auf einen pH Wert von 3 angesäuert und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde über Na₂SO₄ getrocknet, wieder eingedampft und das resultierende BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp Phe-Val-OH (SEQ ID NO 2) für 2 Stunden mit 20 ml 2 N HCl in Dioxan bei 20°C gerührt. Das resultierende Gemisch wurde verdampft, um H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO 3) zu erhalten, dass nachfolgend in einer Mischung aus 1800 ml Dichlormethan und 200 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst wurde und dann auf 0°C abgekühlt wurde. Danach wurden sukzessive 0.5 g Dicyclocarbodiimid (DCCI), 0.3 g 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 0.23 ml N-Methylmorpholin unter Rühren zugegeben.

Das resultierende Gemisch wurde für weitere 24 Stunden bei 0°C gerührt und dann bei 20°C für weitere 48 Stunden. Die Lösung wurde konzentriert und zur Salzentfernung mit einem gemischten Ionenaustauscherbett behandelt. Nachdem das resultierende Harz durch Filtration entfernt worden war, wurde die geklärte Lösung verdampft und der Rückstand durch Chromatographie aufgereinigt, so dass schließlich cyclo(-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO 4) erhalten wurde. Die folgenden Peptide, die in der Tabelle 1 mit dem für den Aminosäurecode üblichen Einzelbuchstaben-Abkürzungen aufgelistet sind und durch ihre Peptidnummer gekennzeichnet sind, werden analog erhalten: cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO 5); cyclo (Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO 6); cyclo (Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO 9); cyclo (Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID NO 7). Ein Peptid, dass als 66203 bezeichnet wird und eine identische Sequenz zu der des Peptids 62184 aufweist, unterscheidet sich von letzterem nur dadurch, dass es das Salz der HCl anstelle von TFA, wie bei 62184, enthält. in den Angiogenese-Inhibierungsassays, in denen die synthetischen Peptide, wie in dem Beispiel 7 beschrieben, eingesetzt wurden, war das 66203 Peptid mit HCl etwas wirksamer als das identische Peptid mit TFA bei der Inhibierung der Angiogenese. TABELLE 1

Peptid-Nummer	Aminosäuresequenz	SEQ ID NO
62181	cyclo (GrGDFV)	4
62184	cyclo (RGDfV)	5
62185	cyclo (RADfV)	6
62187	cyclo (RGDFv)	7
62880	YTAECKPQVTRGDVF	8
62186	cyclo (RaDFV)	9
62175	cyclo (ARGDfL)	10
62179	cyclo (GRGDfL)	11
62411	TRQVVCDLGNPM	12
62503	GVVRNNEALARLS	13
62502	TDVNGDGRHDL	14

*Kleinbuchstaben zeigen D-Aminosäuren an; Grossbuchstaben zeigen L-Aminosäuren an.

Ein Peptid, das als 69601 bezeichnet wird und eine identische Sequenz zu der des Peptids 62185 aufweist, unterscheidet sich von Letzterem nur dadurch, dass es das Salz der HCl anstelle der TFA, wie bei 62184, enthält.
Es wurde gezeigt, dass das zyklische c-RADfV-Peptid (69601) die Bindung von Fibrinogen an das Integrin α_vβ₃ inhibiert, aber nicht die Bindung von Fibrinogen an die α_IIbβ₃- oder α₅β₁-Integrine (Pfaff, et al., J. Biol. Chem., 269: 20233–20238, 1994). Daher ist das c-RADfV-Peptid spezifisch für α_vβ₃.
2. Monoklonale Antikörper
Der von der Hybridomzelllinie ATCC HB 9537 sezernierte Antikörper LM609 wurde mittels Standard-Hybridom-Methoden durch Immunisierung mit isoliertem α_vβ₃, das an Sepharose-Linsenlektin-Perlen gekoppelt war, hergestellt. Das α_vβ₃ wurde aus humanen Melanomzellen, M21 genannt, isoliert und der Antikörper wie bei Cheresh et al., J. Biol. Chem., 262: 17703–17711 (1987) beschrieben, hergestellt. Die M21 Zellen wurden von Dr. D. L. Morton (University of California, Los Angeles, CA) bereitgestellt und in Suspensionskulturen in RPMI 1640 Zellkulturmedium, 2 mM L-Glutamin, 50 mg/ml Gentamycinsulfat und 10% fötalem Kälberserum enthaltend, wachsen gelassen. Es wurde gezeigt, dass der monoklonale Antikörper LM609 spezifisch mit dem α_vβ₃-Komplex immunologisch kreuzreagiert und nicht mit der α_v-Untereinheit, der β₃-Unterheit oder mit anderen Integrinen.
3. Charakterisierung der Verteilung der α_vβ₃ Expression im Gewebe
A. Immunfluoreszenz mit Anti-Integrinrezeptor-Antikörpern
Während der Wundheilung exprimieren die Basalmembranen der Blutgefäße zahlreiche Adhäsionsproteine, einschließlich des von Willebrand-Faktors, Fibronektins und Fibrins. Darüber hinaus sind zahlreiche Mitglieder der Integrinfamilie der Adhäsionsrezeptoren auf der Oberfläche kultivierter glatter Muskelzellen und Endothelzellen exprimiert. Siehe Cheresh, Proc. Nato. Acad. Sci., USA, 84: 6471 (1987); Janat et al., J. Cell Physiol., 151: 588 (1992); und Cheng et al., J. Cell Physiol., 139: 275 (1989).
Unter diesen Integrinen ist α_vβ₃ der endotheliale Rezeptor für den von Willebrand Faktor, Fibrinogen (Fibrin) und Fibronektin, wie bei Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 6471 (1987) beschrieben. Dieses Integrin vermittelt eine Kalzium-abhängige Signalkette, die zur Wanderung der Endothelzellen führt und daher eine fundamentale Rolle in der Gefäßbiologie spielt, wie bei Leavelsey et al., J. Cell Biol., 121: 163 (1993) beschrieben.
Zur Bestimmung der Expression von α_vβ₃ während der Angiogenese wurde humanes Wundgranulationsgewebe oder benachbarte normale Haut von Patienten, die in diese Prozedur eingewilligt hatten, erhalten, das Gewebe mit 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und in O. T. C. Medium (Tissue Tek) eingebettet. Das eingebettete Gewebe wurde für 30 bis 45 Sekunden in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Sechs Mikrometer dicke Schnitte wurden dann aus den gefrorenen Blöcken mit einem Kryostat-Mikrotom hergestellt und nachfolgend eine Immunperoxidase-Färbung mit Antikörpern durchgeführt, die entweder spezifisch für die β₃-Integrine, (α_vβ₃ oder α_IIbβ₃) oder die β₁-Unterfamilie der Integrine waren.
Die Ergebnisse einer Färbung von normaler Haut und Wundgranulationsgewebe sind in den – gezeigt. Die monoklonalen Antikörper AP3 und LM534, die gegen β₃ bzw. β₁ Integrine gerichtet sind, wurden für immunhistochemische Analyse auf gefrorenen Schnitten verwendet. Die Experimente mit Geweben, die von vier verschiedenen humanen Spendern, erhalten wurden, ergaben identische Resultate. Die mikroskopischen Fotos stellen eine 300-fache Vergrößerung dar.
Das α_vβ₃-Integrin war sehr stark in den Blutgefäßen des Granulationsgewebes exprimiert ( ), war aber nicht in der Dermis und dem Epithelium normaler Haut desselben Spenders nachzuweisen ( ). Im Gegensatz dazu waren die β₁-Integrine sehr stark auf den Blutgefäßen und Stromazellen sowohl in normaler Haut ( ) als auch in Granulationsgewebe ( ) exprimiert und, wie vorher von Adams et al., Cell 63: 425 (1991) gezeigt, auf den Basalzellen innerhalb des Epitheliums.
B. Immunfluoreszenz mit Anti-Liganden Antikörpern
Zusätzliche Schnitte der normalen, humanen Haut und von Granulationsgeweben, herstellt, wie oben beschrieben, wurden auch auf die Anwesenheit von Liganden für die β₃- und β₁-Integrine, von Willebrand Faktor beziehungsweise Laminin untersucht. Der von Willebrand Faktor war in den Blutgefäßen in normaler Haut ( ) und im Granulationsgewebe ( ) nachzuweisen, wohingegen Laminin in allen Blutgefäßen so wie in der epithelialen Basalmembran beider Gewebepräparate auftrat ( und ).
C. Verteilung von Anti-α_vβ₃-Antikörpern auf Krebsgeweben
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Untersuchungen wurden auch Biopsien von Krebsgeweben humaner Patienten auf die Anwesenheit und Verteilung von α_vβ₃ untersucht. Die Gewebe wurden, wie in Beispiel 1A beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, dass sie mit dem monoklonalen Antikörper LM609, hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben, der spezifisch für den Integrin-Rezeptor-Komplex α_vβ₃ ist, gefärbt wurden. Zusätzlich wurden Tumoren auch für die mikroskopisch-histologische Analyse präpariert, indem repräsentative Beispiele von Tumoren in Bulins Fixativ für 8 Stunden fixiert wurden, serielle Schnitte hergestellt und mit H&E gefärbt wurden.
Die Ergebnisse der Immunperoxidase-Färbungen von Blasen-, Kolon-, Brust und Lungenkrebsgeweben sind in den , , beziehungsweise gezeigt. α_vβ₃ ist nur auf den Blutgefäßen stark experimiert, die in den vier untersuchten Krebsbiopsien vorhanden sind, nicht jedoch auf irgendeiner der anderen in den Geweben vorliegenden Zellen.
Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen somit, dass der α_vβ₃-Integrin-Rezeptar selektiv in spezifischen Gewebetypen, nämlich granulierten metastatischen Geweben und anderen Geweben, in denen Angiogenese stattfindet, exprimiert ist und nicht in normalen Geweben, wo die Bildung der Blutgefäße gestoppt ist. Diese Gewebe stellen somit einen idealen Angriffspunkt für therapeutische Behandlungen gemäß dieser Erfindung dar.
4. Identifikation von α_vβ₃-spezifischen synthetischen Peptiden, detektiert durch einen Liganden-Rezeptor-Bindungsassay
Die synthetischen Peptide, synthetisiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden durch Bestimmen der Wirksamkeit, mit der sie die α_vβ₃ und α_IIbβ₃-Rezeptor-Bindungsaktivität in gereinigten Liganden-Rezeptor-Bindungsassays antagonisieren, durchgemustert. Die Methoden für diese Bindungsstudien wurden von Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 10003–10007 (1993), Smith et al., J. Biol. Chem., 265: 11008–11013 (1990) und Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269: 20233–20238 (1994) beschrieben.
Im Folgenden wird eine Methode zur Identifizierung von Antagonisten in einem Liganden-Rezeptor-Bindungsassay beschrieben, in dem der Rezeptor an ein unbewegliches festes Trägermaterial gebunden ist und der Ligand und die Antagonisten löslich sind. Außerdem wird ein Liganden-Rezeptor-Bindungsassay beschrieben, in dem der Ligand an ein festes Trägermaterial gebunden ist und der Rezeptor und die Antagonisten löslich sind.
Kurz gefasst werden ausgewählte, gereinigte Integrine einzeln mit einer Konzentration von 50 Nanogramm (ng) pro Reaktionskammer für die Anheftung in „Titertek Mikrotiterwells” immobilisiert. Die für den Liganden-Rezeptor-Bindungsassay benötigte Aufreinigung der Rezeptoren kann leicht durch Anwendung von Methoden erhalten, die dem Fachmann gut bekannt sind. Nach Inkubation bei 4°C für 18 Stunden wurden nichtspezifische Bindungsstellen auf der Platte durch Zugabe von 10 Milligramm/Milliliter (mg/ml) Rinderserumalbumin (BSA) in Tris-gepufferter Salzlösung blockiert. Für die Inhibitionsuntersuchungen wurden unterschiedliche Konzentrationen der aus Tabelle 1 ausgewählten Peptide auf ihre Fähigkeit getestet, die Bindung von J¹²⁵-Vitronektin oder J¹²⁵-Fribrinogen an die α_vβ₃ und α_IIbβ₃-Integrine zu hemmen.
Obwohl diese Liganden an ein bestimmtes Integrin optimal binden, Vitronektin an α_vβ₃ und Fibrinogen an α_IIbβ₃, erlaubt die Hemmung der Bindung, unter Verwendung von Peptiden, die die Bindung von Fibrinogen an beide Rezeptoren blockieren, die genaue Bestimmung der Konzentration in mikromolar (μM) eines Peptids, die nötig ist, um die Bindung des Rezeptors an den Liganden halbmaximal zu hemmen. Radioaktiv markierte Liganden wurden in Konzentrationen von 1 nM verwendet, und die Bindung wurde separat mit nicht-markierten synthetischen Peptiden beeinflusst.

Auf eine dreistündige Inkubation folgend, wurden die freien Liganden durch Waschen entfernt und die gebundenen Liganden durch Messung der Gammastrahlung ermittelt. Die Ergebnisse dieser Assays, in denen ausgewählte, in Tabelle 1 aufgelistete zyklische Peptide zur Hemmung der Bindung der Rezeptoren und radioaktiv markiertem Fibrinogen an separat immobilisierte α_vβ₃ und α_IIbβ₃ Rezeptoren verwendet wurden, waren hoch reproduzierbar mit Standardfehlern, die zwischen den Datenpunkten lagen und typischerweise kleiner 11% waren. Die IC₅₀-Werte in mikromolar (IC₅₀) μM sind als Durchschnittswert von zwei Datenpunkten ausgedrückt. ± gibt die Standardabweichung, wie in Tabelle 2 gezeigt, an. TABELLE 2

Peptid-Nummer	α_vβ₃ (IC₅₀ μM)	α_IIbβ₃ (IC₅₀ μM)
62181	1.96 ± 0.62	14.95 ± 7.84
62184	0.05 ± 0.001	0.525 ± 0.1
62185	0.885 ± 0.16	100 ± 0.001
62187	0.05 ± 0.001	0.26 ± 0.056
62186	57.45 ± 7.84	100 ± 0.001
62175	1.05 ± 0.07	0.63 ± 0.18
62179	0.395 ± 0.21	0.055 ± 0.007

Somit wiesen die RGD-enthaltenden oder RGD-derivatisierten zyklischen Peptide 62181, 62184, 62185 und 62187, die alle einen D-Aminosäurerest enthalten, eine bevorzugte Hemmung der Fibrinogen-Bindung an den α_vβ₃-Rezeptar auf. Dies zeigen die niedrigeren Peptidkonzentrationen, die für eine halbmaximale Hemmung erforderlich sind, im Vergleich zu denen, die für die Hemmung des α_IIβ₃-Rezeptors nötig sind.
Im Gegensatz dazu waren die anderen RGD-enthaltenden oder RGD-derivatisierten zyklischen Peptide 62186, 62175 und 62179 entweder nicht so wirksam in einer Hemmung der Fibrinogen-Bindung an α_vβ₃ oder zeigten eine bevorzugte Hemmung der Bindung von Fibrinogen an α_IIbβ₃ im Vergleich mit α_vβ₃. Diese Ergebnisse stimmen mit denen überein, die kürzlich von Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269: 20233–20238 (1994) publiziert wurden, in denen das zyklische Peptid RGDFV (wobei F eine D-Aminosäure anzeigt) spezifisch die Bindung von Fibrinogen an das α_vβ₃-Integrin und nicht an die α_IIbβ₃- oder α_vβ₁-Integrine hemmt.
Eine ähnliche Inhibierung von Ligandenbindung in diesen Assays wurden mit linearisierten Peptiden durchgeführt, die entweder ein RGD-Motiv aufwiesen oder nicht und deren Sequenzen von der α_v-Untereinheit, der α_IIb-Rezeptor-Untereinheit oder von Aminosäuresequenzen des Vitronektin-Liganden abgeleitet waren. Die Sequenzen der linearen Peptide 62880 (VN-abgeleitete Aminosäurereste 35–49), 62411 (α_v-abgeleitete Aminosäurereste 676–687); 62503 (α_v-abgeleitete Aminosäurereste 655–667) and 62502 (α_IIb abgeleitete Aminosäurereste 296–306) sind in Tabelle 1 aufgelistet. Jedes dieser Peptide wurde in separaten Assays zur Hemmung der Bindung von entweder Vitronektin (VN) oder Fibrinogen (FG) an entweder α_IIbβ₃ oder α_vβ₃ eingesetzt. In Tabelle 3 sind die IC₅₀-Werte in mikromolar (IC₅₀ μM) eines individuellen Assays für jedes Experiment angegeben. TABELLE 3

α_IIbβ₃IC₅₀ μM α_vβ₃IC₅₀ μM

Peptid Nummer FG VN FG VN

62880 4.2 0.98 < 0.1 0.5

62411 > 100 > 100 > 100 > 100

62503 > 100 > 100 > 100 > 100

62502 90 5 > 100 > 100
Die Ergebnisse der Hemmung der Ligandenbindung an ausgewählte Integrin-Rezeptoren mit linearisierten Peptiden zeigen, dass nur Peptid 62880 wirksam war, die halbmaximale Bindung von entweder FG oder VN an α_vβ₃ zu hemmen, wie die niedrigere Peptidkonzentration zeigt, die für eine halb-maximale Hemmung der Bindung an α_vβ₃ im Vergleich zur Bindung an α_IIbβ₃ erforderlich ist. Keines der anderen linearisierten Peptide konnte die Ligandenbindung an α_vβ₃ wirksam blockieren, obwohl Peptid 62502 die Bindung von α_IIbβ₃ an VN wirksam blockierte. Somit kann der Liganden-Rezeptor-Assay, so wie er hier beschrieben ist, für das Durchmustern sowohl von zyklischen als auch von linearisierten Peptiden verwendet werden, die eine selektive Spezifität für einen besonderen Integrin-Rezeptor aufweisen, insbesondere α_vβ₃, und können dann beim Ausüben dieser Erfindung als Vitronektin-Rezeptor-(α_vβ₃)-Antagonisten eingesetzt werden.
5. Charakterisierung von unbehandelten Hühnerembryo-Chorioallantois-Membranen (CAM)
A. Präparation der CAM
Die Angiogenese kann auf der Hühner-Chorioallantois-Membran, nachdem die normale embryonale Angiogenese zur Bildung reifer Blutgefäße geführt hat, induziert werden.
Leibovich et al., Nature, 329: 630 (1987) und Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79: 597 (1975) haben gezeigt, dass die Angiogenese als Reaktion auf spezifische Zytokine oder Tumorfragmente induziert ist. Die CAMs wurden aus Hühnerembryonen präpariert, um anschließend eine Induktion bzw. Hemmung der Angiogenese in diesen zu Induzieren, wie in den Beispielen 6 und 7 beschrieben. 10 Tage alte Hühnerembryonen wurden von McIntyre Poultry (Lakeside, CA) erhalten und bei 37°C bei 60%-iger Luftfeuchtigkeit inkubiert. Dann wurde mit einem kleinen Bohrer (Dremel, Division of Emerson Electronic CI. Racine Wisconsin) an der Spitze des Eis, direkt über der Luftblase, ein Loch in der Schale hergestellt. Ein zweites Loch wurde dann auf der Breitseite des Eis, in einer Region, die frei von embryonalen Blutgefäßen war, wie vorher mittels Durchleuchten des Eis festgestellt wurde, hineingebohrt. Dann wurde ein Unterdruck am ersten Einstichloch angelegt, so dass die CAM (Chorioallantois-Membran) sich von der Eischalmembran ablöste und eine Luftblase über der CAM entstand. Mit Hilfe eines kleinen Schleifrads (Dremel) wurde anschließend ein 1 Zentimeter (cm) mal 1 cm großes Fenster über der zurückgezogenen CAM in die Schale geschnitten. Das kleine Fenster erlaubte den direkten Zugang zu der darunter liegenden CAM.
Das so hergestellte CAM-Präparat wurde dann ohne zusätzliche Behandlung entweder am Tag 6 der Embryogenese, einem Stadium, dass durch aktive Neovaskularisierung gekennzeichnet ist, als Modell für die Untersuchung von Effekten auf die embryonale Neovaskularisierung verwendet oder am Tag 10 der Embryogenese, einem Stadium zu dem die Angiogenese schon nachlässt. Letztere Präparation wurde daher in dieser Erfindung verwendet, um die Angiogenese als Antwort auf eine Zytokinbehandlung oder einen Tumorkontakt neu zu stimulieren, wie in Beispiel 6 beschrieben.
B. Histologie der CAM
Um die mikroskopischen Strukturen der Hühnerembryonen CAMs und/oder humanen Tumoren zu analysieren, die aus den Hühnerembryonen, wie in Beispiel 8 beschrieben, herausgeschnitten wurden, wurden die CAMs und Tumore zum Herstellen von Gefrierschnitten präpariert, wie in Beispiel 3A beschrieben. Sechs Mikrometer dicke Schnitte wurden für eine nachfolgende Immunfluoreszenzanalyse mit einem Kryostat-Mikrotom aus den gefrorenen Blöcken herausgeschnitten.
zeigt ein typisches mikroskopisches Foto eines blutgefäßfreien Gebietes einer unbehandelten 10 Tage alten CAM. Da die Angiogenese in der CAM in diesem Embryogenesestadium schon abklingt, ist dieses System für die Stimulation der Produktion neuer Vaskulatur aus schon existierenden Gefäßen benachbarter Gebiete in Regionen der CAM, die zu diesem Zeitpunkt überhaupt keine Gefäße aufweisen, in dieser Erfindung nützlich.
C. Integrinprofile in der CAM detektiert durch Immunfluoreszenz
Um die Gewebeverteilung der Integrin-Rezeptoren in den CAM-Geweben zu verfolgen, wurden 6 Mikrometer (μm) dicke Gefrierschnitte von sowohl Tumorgeweben als auch Hühnerembryonen-CAM-Geweben in Aceton für 30 Sekunden fixiert und mittels Immunfluoreszenz mit 10 Mikrogramm/Milliliter (μg/ml) mAb CSAT, ein monoklonaler Antikörper, der für die β₁-Integrin-Untereinheit spezifisch ist, gefärbt (siehe Buck et al., J. Cell Biol., 107: 2351 (1988)) und somit für Kontrollen verwendet oder die Schnitte wurden mit LM609 gefärbt, hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Der Markierung durch den primären Antikörper folgte eine Inkubation mit einem 1:250 verdünnten Ziege anti-Maus Rhodamin-markierten sekundären Antikörper (Tago), um das primäre Produkt der Immunreaktion zu detektieren. Die Schnitte wurden dann an einem Zeiss Immunfluoreszenz-Mikroskop analysiert.
Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzanalyse zeigen, dass die reifen Blutgefäße, die in einem unbehandelten 10 Tage alten Hühnerembryo vorliegen, die β₁-Integrin-Untereinheit exprimieren ( ). Im Gegensatz dazu konnte keine Immunreaktivität mit LM609 in einer Schnittserie dieses Gewebes festgestellt werden ( ). Somit folgt, dass das α_vβ₃-Integrin, das von dem LM609 Antikörper erkannt wird, nicht aktiv in den reifen Blutgefäßen 10 Tage alter unbehandelter Hühnerembryonen exprimiert wird. Wie mit dem CAM-Modell gezeigt und ebenso in den folgenden Beispielen, exprimieren die Blutgefäße, die während der normalen Embryogenese neu entstehen, das α_vβ₃-Integrin, ebenso wie die Blutgefässe nach Induktion durch Zytokinen oder Tumoren. Sobald die Gefäße jedoch nach der aktiven Neovaskularisierung aufhören, sich weiter zu entwickeln, nimmt die Expression von α_vβ₃ auf mit Immunfluoreszenz nicht mehr nachweisbare Mengen ab. Diese Regulation der α_vβ₃-Expression in Blutgefäßen, die sich im Prozess der Angiogenese befinden, im Gegensatz zum Fehlen einer Expression in reifen Gefäßen, ist Grundlage für die spezielle Anwendungsmöglichkeit dieser Erfindung, die Angiogenese zu kontrollieren und zu inhibieren, wie in den folgenden Beispielen aufgeführt und durch Verwendung des CAM-Angiogenesesystems modellhaft gezeigt.
6. Der CAM Angiogenese-Assay
A. Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese
Es wurde gezeigt, dass die Angiogenese durch Zytokine oder Wachstumsfaktoren induziert werden kann, Zitate sind in Beispiel 5A aufgeführt. In den hier beschriebenen Experimenten wurde die Angiogenese in den CAM-Präparaten, wie in Beispiel 5 beschrieben, durch Wachstumsfaktoren induziert, die topisch auf die CAM Blutgefäße aufgebracht wurden.
Die Angiogenese wurde durch das Aufbringen von 5 Millimeter (mm) mal 5 mm großen Whatman Filterpapierscheiben (Whatman Filter paper No. 1) auf die CAM von 10 Tage alten Hühnerembryonen in einer blutgefäßfreien Region induziert, wobei die Filterscheiben mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) oder HBSS plus 150 Nanogramm rekombinanten basischen Fibroblasten Wachstumsfaktor (β-FGF) (Genzyme, Cambridge, MA) gesättigt waren und diese wurden anschließend mit Klebefolie abgedichtet.
In weiteren Assays war auch 125 ng/ml β-FGF geeignet, das Blutgefäßwachstum zu induzieren. Die Angiogenese wurde durch mikroskopische Fotografie nach 72 Stunden verfolgt. Die CAMs wurden schockgefroren und 6 μm dicke Kryostat-Schnitte wurden mit Aceton fixiert und mittels Immunfluoreszenz mit 10 μg/ml von entweder anti-β₁ monoklonalem Antikörper CSAT oder LM609 gefärbt, wie in Beispiel 5C beschrieben.
Die mikroskopischen Immunfluoreszenz-Fotos in zeigen eine gesteigerte α_vβ₃-Expression während der β-FGF-induzierten Angiogenese auf der Hühner-CAM im Gegensatz zu der fehlenden α_vβ₃-Expression in der unbehandelten Hühner-CAM, wie in gezeigt. α_vβ₃ konnte auf vielen (75% bis 80%) Gefäßen der β-FGF behandelten CAM leicht detektiert werden. Darüber hinaus veränderte sich die β₁-Integrin-Expression nicht im Vergleich zu der in einer unbehandelten CAM, da β₁ auch unmittelbar auf stimulierten Gefäßen zu detektieren war.
Die relative Expression von α_vβ₃ und β₁-Integrinen wurde dann während der β-FGF-induzierten Angiogenese durch konfokale Lasermikroskopie der CAM Kryostat-Schnitte und Bildanalyse quantifiziert. Die gefärbten Schnitte wurden dann mit einem konfokalen Lasermikroskop von Zeiss analysiert. Fünfundzwanzig Gefäße, die mit LM609 und 15, die mit CSAT gefärbt waren (durchschnittliche Größe ungefähr 1200 mm², Bereich 350 bis 3500 mm²), wurden aus zufälligen Feldern ausgewählt, und die durchschnittliche Rhodamin-Fluoreszenz für jedes Gefäß pro Flächeneinheit wurde in willkürlichen Einheiten durch eine konfokale Laser-Bildanalyse bestimmt. Die Werte sind als mittlere Fluoreszenzintensität der Gefäße in willkürlichen Einheiten ± Standardfehler angegeben (SE).
Die Ergebnisse, aufgetragen in , zeigen, dass die Färbung von α_vβ₃ auf CAMs, die mit β-FGF behandelt waren, signifikant erhöht war (4 mal höher), wie der „Wilcoxon Rank Sum Test” (P < 0.0001) zeigt, wohingegen die β₁-Färbung durch die β-FGF Behandlung nicht signifikant verschieden war.
Der CAM-Assay wurde weiter verwendet, um den Effekt eines anderen sehr wirksamen Angiogenese-Induzierers, Tumornekrose Faktor-alpha (TNFa), auf die Expression der β₁- und β₃-Integrine zu untersuchen. Filterscheiben, die entweder mit β-FGF oder TNFα getränkt waren und auf die CAMs 10 Tage alter Embryonen aufgebracht wurden, stimulierten die lokale Angiogenese nach 72 h.
Die Ergebnisse sind in den mikroskopischen Fotos der entweder unbehandelten CAMs ( ) oder CAMs, die mit β-FGF ( ) oder mit TNFα ( ) behandelt wurden, gezeigt. Die Blutgefäße sind unmittelbar sowohl in den β-FGF als auch den TNFα behandelten Präparaten zu erkennen, jedoch nicht in der unbehandelten CAM. Somit resultierte die topische Applikation von Wachstumsfaktoren/Zytokinen in der Induktion der Angiogenese von reifen Gefäßen in einer benachbarten Region in ein Gebiet hinein, dass ursprünglich frei von Gefäßen war. Hinsichtlich der β-FGF-induzierten Blutgefäße und der gleichzeitigen α_vβ₃-Expression, wie in gezeigt, resultierte die Behandlung mit TNF in vergleichbaren Aktivitäten.
Diese Befunde zeigen, dass sowohl in humanen als auch in Hühner-Geweben Blutgefäße, die an der Angiogenese beteiligt sind, eine gesteigerte α_vβ₃-Expression aufweisen. In Einklang mit dieser Beobachtung kann die Expression von α_vβ₃ auf kultivierten Endothelzellen durch verschiedene Zytokine in vitro induziert werden, wie bei Janat et al., J. Cell Physiol., 151: 588 (1992); Enenstein et al., Exp. Cell Res., 203: 499 (1992) und Swerlick et al., J. Innest. Derm., 99: 715 (1993) beschrieben ist.
Die Wirkung von Antikörpern und Peptid-Inhibitoren auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese wird in den Beispielen 7A und 76 gezeigt.
B. Embryonale Angiogenese
Das CAM-Präparat, das für die Beurteilung der Wirkung von Angiogenese-Inhibitoren auf die natürliche Ausbildung der embryonalen Neovaskulatur verwandt wurde, stammte vom 6 Tage alten Hühnerembryo ab, wie vorher beschrieben. In diesem Entwicklungsstadium wachsen Blutgefäße de novo und liefern so ein geeignetes Modellsystem, um zu ermitteln, ob α_vβ₃ an der embryonalen Angiogenese mitwirkt. Das CAM-System wurde hergestellt- wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass der Assay am Tag 6 anstelle von Tag 10 der embyonalen Entwicklung durchgeführt wurde. Der Einfluss von erfindungsgemäßen Antikörpern und Peptiden auf die embryonale Angiogenese ist in Beispiel 7C gezeigt.
C. Durch Tumoren ausgeloste Angiogenese
Um die Rolle, die α_vβ₃ bei der Tumor-induzierten Angiogenese spielt, zu untersuchen, wurden verschiedene α_vβ₃-negative humane Melanome und Karzinomfragmente in den CAM-Assay eingesetzt, dabei wurden die CAMs vorher aus 17 Tage alten Hühnerembryonen, wie bei Brooks et al., J. Cell Biol., 122: 1351 (1993) beschrieben, isoliert. Die Fragmente induzierten eine ausgedehnte Neovaskularisierung in der blossen Anwesenheit von Puffer.
Die Angiogenese wurde in dem CAM-Assaysystem durch direktes Aufbringen eines Tumorfragments auf die CAM induziert. Die Präparation der Hühnerembryonen-CAM wurde genauso, wie oben beschrieben, vorgenommen. Anstelle einer Filterpapierscheibe wurde ein 50 Milligramm (mg) bis 55 mg schweres Fragment eines humanen Melanomtumors M21L, eines humanen Lungenkarzinomtumors UCLAP-3, einer humanen Pankreaskarzinom-Zelllinie Fg (Cheresh et al., Cell 58: 945–953, 1989) oder einer humanen Kehlkopfkarzinom-Zellline HEp3, alle diese Tumoren sind α_vβ₃-negativ, auf die CAM in einem ursprünglich blutgefäßfreien Gebiet plaziert.
Die M21L humane Melanom-Zelllinie, UCLAP-3 humane Lungenkarzinom-Zelllinie, FG Pankreaskarzinom-Zelllinie oder die HEp3 humane Kehlkopfkarzinom-Zelllinie, alle α_vβ₃-negativ, wurden verwendet, um einen festen Tumor auf den CAMs der Hühnerembryonen wachsen zu lassen. Experimente, die sich auf Melanome, Lungenkarzinome, Pankreaskarzinome und Kehlkopfkarzinome beziehen, sind nur zur Information enthalten. Zuerst wurde einmalig eine Zellsuspension von 8 × 10⁶ M21-L, UCLAP-3 und FG oder 5 × 10⁵ HEp3-Zellen in einem Gesamtvolumen von 30 Mikrolitern (μl) in sterilem HBSS auf die CAM aufgebracht. Die Fenster wurden mit Klebefolie verschlossen und die Embryonen für 7 Tage inkubiert, um das Wachstum von humanen Tumorläsionen zu ermöglichen. Am Ende der 7 Tage, wenn der Embryo 17 Tage alt war, wurden die Tumoren aus den CAMs herausgeschnitten und vom umgebenden CAM Gewebe befreit. Die Tumoren wurden in 50 mg bis 55 mg dicke Tumorfragmente geschnitten, um sie für eine weitere Verwendung in entweder Angiogenese oder Tumorwachstums-Assays vorzubereiten. Die Tumorfragmente wurden auf ein neues Set von 10 Tage alten Hühnerembryonen-CAMs in eine Blutgefäß- freie Zone aufgebracht, wie in Beispiel 6A beschrieben.
Die Tumoren, die in vivo auf den Hühnerembryonen-CAMs gewachsen waren, wurden zur Detektion einer α_vβ₃-Expression mit mAb LM609 gefärbt, wie in Beispiel 3A beschrieben. Es konnte keine spezifische Färbung der Tumorzellen beobachtet werden, was das Fehlen von α_vβ₃-Expression anzeigt.
Die CAM-Tumorpräparate wurden dann nachfolgend behandelt, wie in den Beispielen 7D und 7E beschrieben, um die Wirkung der Antikörper und Peptide auf die Tumorinduzierte Angiogenese zu messen. Die CAM-Tumorpräparate wurden auch wie in den Beispielen 8, 9 und 12 beschrieben, behandelt, um die Wirkung der Antikörper und Peptide auf die Rückbildung des Tumors und die Apoptose von angiogenen Blutgefäßen und Gefäßzellen zu messen.
7. Inhibierung der Angiogenese, gemessen mit dem CAM-Assay
A. Inhibierung der Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese durch topische Applikation der Inhibitoren
1) Behandlung mit monoklonalen Antikörpern
Um zu bestimmen, ob α_vβ₃ eine aktive Rolle bei der Angiogenese spielt, wurden mit β-FGF oder TNFα gesättigte Filterscheiben auf die CAMs plaziert und anschließend wurden die monoklonalen Antikörper (auch als mAb bezeichnet) LM609 (spezifisch für α_vβ₃), CSAT (spezifisch für β₁) oder P3G2 (spezifisch für α_vβ₅) den Präparaten zugefügt. Die Angiogenese wurde auf den CAMs 10 Tage alter Hühnerembryonen durch Filterscheiben, die mit β-FGF gesättigt waren, induziert. Die Scheiben wurden dann mit 50 ml HBSS, 25 mg mAb in einem Gesamtvolumen von 25 μl sterilem HBSS enthaltend, zu 0, 24 und 48 Stunden versetzt. Nach 72 Stunden wurden die CAMs geerntet, in 35 mm Petrischalen überführt und einmal mit 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen. Die Unterseite des Filterpapiers und des CAM-Gewebes wurde dann durch zwei Beobachter im Doppelblind-Modus an einem Olympus Stereomikroskop analysiert. Die Inhibierung der Angiogenese wurde als signifikant erachtet, wenn die CAMs eine > 50%-ige Abnahme in der Blutgefäßinfiltration direkt unter der Scheibe aufwiesen. Die Experimente wurden viermal pro Antikörper wiederholt, mit 6 bis 7 Embryonen pro Versuchsbedingung.
Die Ergebnisse der Auswirkungen der mAb Behandlung auf die β-FGF-induzierte Angiogenese ist in den – gezeigt. Ein unbehandeltes CAM Präparat, das gefäßfrei war, ist in gezeigt, um einen Vergleich mit der β-FGF-induzierten Blutgefäßbildung und den Wirkungen der mAbs darauf, gezeigt in den – , zu ermöglichen. Ungefähr 75% dieser CAMs, die mit mAb LM609 behandelt waren, zeigten eine > 50%-ige Inhibierung der Angiogenese, wie in gezeigt und viele dieser CAMs erschienen sogar frei von einer Gefäßinfiltration zu sein.
Im Gegensatz dazu zeigten die Puffer-Kontrollen ( ) und die Scheiben, die mit mAbs CSAT ( ) und P3G2 ( ) behandelt wurden, durchwegs eine ausgedehnte Vaskularisierung.
Identische Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Angiogenese durch TNFα induziert wurde. Um die Effekte der gleichen Antikörper auf schon vorher existierende, reife Blutgefäße zu untersuchen, die aus der normalen Gefäßentwicklung resultierten und gefäßfreien Gebieten benachbart waren, wurden mit mAbs gesättigte Filterscheiben auf die vaskularisierten Gebiete der CAMs 10 Tage alter Embryonen plaziert, die keine topische Applikation von Zytokinen erhielten. Keiner der drei mAbs hatte einen Einfluss auf schon vorher existierende Gefäße, wie durch Visualisierung am Stereomikroskop festgestellt wurde. Somit hemmte der mAb LM609 spezifisch nur das Wachstum neuer Blutgefäße und hatte keinen Einfluss auf reife Blutgefäße, die in benachbarten Gebieten vorliegen. Die gleiche Wirkung wurde durch Aufbringen von synthetischen Peptiden induziert, die entweder topisch oder intravenös, wie in den Beispielen 7A2) beziehungsweise 7E2) beschrieben, angewendet wurden.
2. Behandlung mit synthetischen Peptiden
Die CAM-Assays wurden auch mit den erfindungsgemäßen synthetischen Peptiden durchgeführt, um den Effekt der zyklischen und linearisierten Peptide auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese zu bestimmen. Die Peptide wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt und 80 μg eines Peptids lagen in einem Gesamtvolumen von 25 μl steriler HBSS vor. Die Peptidlösung wurde sofort auf das CAM-Präparat pipettiert und dann wieder nach 24 und 48 Stunden. Nach 72 Stunden wurde das Filterpapier und das umgebende CAM Gewebe herausgeschnitten und, wie oben beschrieben, betrachtet.
Die aus diesem Assay erhaltenen Ergebnisse waren ähnlich denen, die in – gezeigt und im Beispiel 7E2) beschrieben sind, worin synthetische Peptide intravenös in Tumor-induzierte Blutgefäße injiziert wurden. Hier hatte das Kontroll-Peptid 62186 keinen Einfluss auf die β-FGF-induzierten Blutgefäße, wie in gezeigt. Wenn aber das zyklische RGD-Peptid 62814 auf das Filterpapier pipettiert wurde, war die Bildung der Blutgefäße gehemmt, so dass das Gebiet frei von neuer Vaskulatur blieb. Die Wirkung war ähnlich in der Erscheinung zu der, die in gezeigt und im Beispiel 7E2) unten beschrieben ist. Ausserdem konnte keine Wirkung topisch angewendeter synthetischer Peptide, ebenfalls in Beispiel 9C für intravenös injizierte Peptide gezeigt, auf weiter außen liegende Gefäße gefunden werden, in denen zwar reife Gefäße vorhanden waren, die Wachstumsfaktor-gesättigte Filterscheibe jedoch auf gefäßfreie Bereiche plaziert wurde. Die inhibitorische Wirkung der Peptide auf die Angiogenese ist somit auf Gebiete der durch Wachstumsfaktoren induzierten Angiogenese beschränkt und hat keinen Einfluss auf schon vorher existierende benachbarte, reife Gefälle, noch resultiert sie in irgendeiner schädlichen Zytotoxizität auf das umgebende Gewebe. Ähnliche Assays wurden mit den anderen synthetischen Peptiden, wie in Beispiel 1 hergestellt und in Tabelle 1 aufgelistet, durchgeführt.
B. Inhibierung der Wachstumsfaktor-induzierten Angiogenese durch intravenöse Anwendung der Inhibitoren
1) Behandlung mit monoklonalen Antikörpern
Die Wirkung, die intravenös in die CAM-Präparate injizierte, monoklonale Antikörper auf die durch Wachstumsfaktoren induzierte Angiogenese ausüben, wurde zur Verwendung in dieser Erfindung auch untersucht.
Die Präparation der Hühnerembryonen-CAMs für die intravenöse Injektion war grundlegend die gleiche, wie in Beispiel 7A beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen. Während der Durchleuchtung des Eies wurden auffallende Blutgefäße ausgewählt und auf der Eierschale markiert, um ihre Positionen anzuzeigen. Die Löcher wurden in die Eierschale hineingebohrt, die CAMs absenken gelassen und β-FGF gesättigte Filterpapiere wurden auf den CAMs plaziert, wie oben beschrieben. Die Fenster wurden dann mit steriler Klebefolie abgedichtet und die Embryonen in den Inkubator zurückgebracht. 24 Stunden später wurde ein kleines, zweites Fenster vorsichtig in die laterale Seite des Eies geschnitten, direkt über den vorher ausgewählten, prominenten Blutgefäßen. Die äußere Eierschale wurde vorsichtig entfernt, so dass die embryonalen Membranen intakt blieben. Die Membran wurde durch einen kleinen Tropfen Mineralöl (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, Conn.) transparent gemacht, so dass die Blutgefäße leicht erkannt werden konnten. Mit einer 30 gauge Nadel wurden anschließend gereinigte, sterile mAbs oder synthetische Peptide, letztere unten beschrieben, direkt in die Blutgefäße in einer Dosis von 200 μg IgG pro Embryo, in einem Gesamtvolumen von 100 μl steriler PBS, injiziert. Die Fenster wurden mit Klebefolie abgedichtet und die Embryonen bis zu einem Alter von 72 Stunden inkubiert. Die Filterscheiben und die umgebenden CAM-Gewebe wurden, wie oben beschrieben, analysiert.
Um die Lokalisation des LM609 mAbs in den CAM oder Tumorgeweben zu bestimmen, wie hier und in den folgenden Beispielen gezeigt, wurden die fixierten Schnitte, erhalten von mit LM609 intravenös injizierten Tumoren, mit 2.5% BSA in HBSS für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt und dann mit dem 1:250 verdünnten Ziege anti-Maus Rhodamin-markierten sekundären Antikörper (Tago) inkubiert. Die Schnitte wurden anschließend an einem Immunfluoreszenz-Mikroskop von Zeiss analysiert.
In den – sind die Wirkungen dargestellt, die eine intravenöse Antikörper-Behandlung auf β-FGF induzierte Blutgefäße in den CAM Präparaten hatte. In ist die durch β-FGF induzierte Angiogenese gezeigt. Keine Veränderung in der Anwesenheit von β-FGF-induzierter Vaskulatur kannte nach intravenöser Injektion des mAbs P3G2, ein anti-α_vβ₅-Antikörper, beobachtet werden, wie zeigt. In Gegensatz dazu bewirkte eine Behandlung der β-FGF-induzierten Angiogenese in CAM-Präparaten mit LM609, einem α_vβ₃-Antikörper, eine vollständige Inhibierung des Wachstums neuer Gefäße in die Filtergebiete hinein, wie in gezeigt. Der inhibitorische Effekt auf die Angiogenese resultiert demnach aus einer Hemmung der α_vβ₃-Rezeptoraktivität durch den LM609 anti-α_vβ₃-spezifischen Antikörper. Da eine Blockade von α_vβ₅ die Bildung von Neovaskulatur in die Gebiete der CAMs, auf denen die Filter plaziert waren, nicht inhibiert, ist somit α_vβ₅ im Vergleich zu α_vβ₃ als nicht essentiell für das Wachstum neuer Gefäße anzusehen.
2) Behandlung mit synthetischen Peptiden
Die synthetischen Peptide, wie in Beispiel 1 hergestellt, werden einzeln intravenös in die Wachstumsfaktor-induzierten Blutgefäße der CAM-Präparate, wie oben beschrieben, injiziert. Der Effekt der Peptide auf die Lebensfähigkeit der Gefäße wurde in ähnlicher Weise festgestellt.
C. Hemmung der embryonalen Angiogenese durch topische Applikation
1) Behandlung mit monoklonalen Antikörpern
Um zu bestimmen, ob α_vβ₃ an der embryonalen Angiogenese beteiligt ist, wurde die Wirkung von LM609 auf das de novo Wachstum von Blutgefäßen auf CAMs in 6 Tage alten Embryonen untersucht, ein Stadium, dass durch eine aktive Neovaskularisierung gekennzeichnet ist, wie in Beispiel 5A beschrieben. Der CAM-Assay wurde wie in Beispiel 6C beschrieben, durchgeführt, jedoch mit einer nachfolgenden, topischen Applikation von mit mAbs gesättigten Filterscheiben, die in Abwesenheit von Zytokinen auf CAMs von 6 Tage alten Embryonen plaziert wurden. Nach 3 Tagen wurden die CAMs herausgeschnitten und fotografiert. Jedes Experiment wurde mit 6 Embryonen pro Gruppe durchgeführt und wurde zweimal wiederholt.
Der Antikörper LM609 ( ), aber nicht CSAT ( ) oder P3G2 ( ) verhinderten ein Gefäßwachstum unter diesen Bedingungen; dies zeigt, dass α_vβ₃ eine wesentliche Rolle in der embryonalen Neovaskularisierung spielt, die von zugesetzten Wachstumsfaktoren für eine Induktion der Angiogenese unabhängig war.
2) Behandlung mit synthetischen Peptiden
Die in Beispiel 1 hergestellten Peptide wurden einzeln zu den embryonalen CAM-Präparaten zugefügt, hergestellt, wie oben und in Beispiel 5A2) beschrieben, entweder durch topische Applikation auf die CAM oder intravenöse Injektion in die Blutgefäße. Die Wirkung der Peptide auf die Lebensfähigkeit der Gefäße wurde in ähnlicher Weise untersucht.
D. Hemmung der Tumor-induzierten Angiogenese durch topische Applikation
1) Behandlung mit monoklonalen Antikörpern
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Angiogenese-Assays, in denen die Wirkungen von α_vβ₃-Antagonisten, LM609 und den Peptiden 62181, 62184, 62185, 62187 und 62880 auf die embryonale Angiogenese untersucht worden ist, wurde auch die Rolle von α_vβ₃ in der Tumor-induzierten Angiogenese analysiert. Für die Induktion wurden α_vβ₃-negative humane M21-L Melanomfragmente, die vorher auf der CAM eines 17 Tage alten Hühnerembryos gewachsen waren und von diesen isoliert wurden, verwendet. Die Fragmente wurden wie in Beispiel 6C beschrieben, isoliert.
Wie oben in Beispiel 7A1) beschrieben, wurden die mAbs einzeln auf die Tumorfragmente in einer Konzentration von 25 μg in 25 μl HBSS topisch appliziert und die Fenster wurden anschließend mit Klebefolie abgedichtet. Die mAbs wurden in der gleichen Weise wieder nach 24 und 48 Stunden zugefügt. Nach 72 Stunden wurden die Tumoren und die umgebenden CAM Gewebe, wie oben in Beispiel 7A1) beschrieben, analysiert.
Wie in Beispiel 6C beschrieben, wurden die ersten Tumoren dadurch erhalten, dass kultivierte M21-L Zellen, die das α_vβ₃ Integrin nicht exprimieren, wie von Felding-Habermann et al., J. Clin. Invest., 89: 2018 (1992) gezeigt, auf die CAMs 10 Tage alter Hühnerembryonen transplantiert wurden. Diese α_vβ₃-negativen Fragmente induzierten eine ausgedehnte Neovaskularisierung in der Anwesenheit von Puffer alleine oder den mAbs CSAT (anti-β₁) oder P3G2 (anti-α_vβ₅). Im Gegensatz dazu verhinderte der mAb LM609 (anti-α_vβ₃) die Infiltration der meisten Gefäße in die Tumormasse und die umgebende CAM.
Um die Wirkung der mAbs auf die Tumor-induzierte Angiogenese zu quantifizieren, wurden die Blutgefäße, die innerhalb einer Brennebene der CAM in den Tumor eintreten, von zwei Beobachtern im Doppel-Blind-Modus mit Hilfe eines Stereomikroskops ausgezählt. Jede Säule in repräsentiert die mittlere Gefäßzahl ± SE von 12 CAMs in jeder Gruppe, das Mittel aus zwei Experimenten darstellend.
Die quantitative Auswertung zeigte eine dreifache Reduktion in der Zahl der Gefäße, die in den Tumor wachsen nach mAb LM609 Behandlung im Vergleich zu den Tumoren, die nur mit Puffer oder den anderen mAbs, wie P3G2 oder CSAT (P < 0.0001) behandelt wurden, bestimmt mit dem „Wilcoxon Rank Sum Test”. Da die M21-L Tumoren kein α_vβ₃ exprimieren, kann geschlossen werden, dass der mAb LM609 die Angiogenese durch direkte Wirkung auf die Blutgefäße und nicht auf die Tumorzellen hemmt. Diese Ergebnisse passen zu der histologischen Verteilung von α_vβ₃ in Krebsgewebe-Biopsien, wie in den – gezeigt, wo die Verteilung von α_vβ₃ auf die Blutgefäße im Tumor und nicht auf die Tumorzellen selbst beschränkt war.
2) Behandlung mit synthetischen Peptiden
Die synthetischen Peptide, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden topisch auf das Tumor-induzierte angiogene CAM-Assaysystem appliziert, wir oben beschrieben. Die Wirkungen der Peptide auf die Lebensfähigkeit der Gefäße wurde in ähnlicher Weise festgestellt.
E. Inhibierung der Tumor-induzierten Angiogenese durch intravenöse Anwendung
1) Behandlung mit monoklonalen Antikörpern
Die Tumor-induzierten Blutgefäße, hergestellt wie in Beispiel 7D1 beschrieben, wurden auch mit mAbs behandelt, die mittels intravenöser Injektion angewendet wurden. Die Tumoren wurden auf die CAMs platziert, wie in Beispiel 7D1 beschrieben, die Fenster mit Klebefolie abgedichtet und 24 Stunden später wurden 200 μg gereinigte mAbs auf einmal intravenös in die Blutgefäße der Hühnerembryonen injiziert, wie vorher beschrieben. Die Hühnerembryonen wurden dann für 7 Tage inkubiert. Das Ausmaß der Angiogenese wurde anschließend, wie oben beschrieben, beobachtet. Wie in Beispiel 8 beschrieben, wurden nach dieser Zeitspanne die Tumoren herausgeschnitten und über ihr Gewicht analysiert, um die Wirkung der Antikörperexposition auf das Tumorwachstum oder dessen Unterdrückung, zu untersuchen.
2) Behandlung mit synthetischen Peptiden
Die Wirkungen einer Peptidbehandlung auf Tumor-induzierte Vaskulatur im CAM-Assaysystem wurde auch untersucht. Die Tumor-CAM-Präparate wurden verwendet, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass anstelle einer intravenösen Injektion eines mAbs, synthetische Peptide, hergestellt wie in Beispiel 1 und Beispiel 7A2) beschrieben, einzeln intravenös in sichtbare Blutgefäße injiziert wurden.
Die Ergebnisse der CAM-Assays mit dem zyklischen Peptid 66203, das HCl-Salz enthaltend, und dem Kontroll-Peptid 62186 sind in den – dargestellt. In ist gezeigt, dass die Behandlung mit dem Kontroll-Peptid keine Wirkung auf die reichlich vorhandenen großen Blutgefäße hatte, die durch die Tumorbehandlung induziert waren, in Gebiete der CAM zu wachsen, die ursprünglich frei von Blutgefäßen waren. im Gegensatz dazu, wenn das zyklische RGD-Peptid 66203, ein Antagonist von α_vβ₃, auf die Filter appliziert wurde, war die Ausbildung von Blutgefäßen gehemmt, so dass das Gebiet frei von neuer Vaskulatur blieb, wie in gezeigt. Die inhibitorische Wirkung des RGD-enthaltenden Peptids war spezifisch und trat nur sehr lokal auf, wie das Fehlen jeglicher schädlicher Effekte auf Blutgefäße, die dem Tumor benachbart waren, zeigte. Daher hatten inhibitorische, intravenös in das CAM-Assaysystem injizierte Peptide auf schon vorher in der CAM existierende Gefäße, die benachbart. aber in Distanz zum Ort der Tumorplatzierung waren, keine Auswirkung, siehe . Die schon vorher an diesem Ort existierenden Gefäße wurden durch das inhibitorische Peptid nicht beeinflusst, das in diesen Gefäßen nach Injektion vorlag, obwohl die Ausbildung neuer Gefäße aus diesen schon vorher existierenden Gefäßen in die Tumormasse hinein gehemmt war.
Somit wurde jetzt gezeigt, dass die synthetischen Peptide, einschließend 66203 und 62184, von denen vorher in Liganden-Rezeptor-Assays in Beispiel 4 gezeigt wurde, dass sie Antagonisten von α_vβ₃ sind, die Angiogenese inhibieren, die auf Gefäße beschränkt ist, die sich im Prozess der Entwicklung befinden, und nicht auf reife schon vorher existierende Gefäße. Darüber hinaus resultiert die intravenöse Injektion mit Peptiden nicht in irgendeiner schädlichen Zytotoxizität auf das umgebende Gewebe, wie durch die intakte Vaskulatur in gezeigt.
Ähnliche Assays wurden mit den anderen synthetischen Peptiden, hergestellt wie in Beispiel 1 und aufgeführt in Tabelle 1, durchgeführt.
8. Hemmung des Tumorgewebewachstums mit α_vβ₃-Antagonisten, gemessen im CAM-Assay
Wie in Beispiel 7D1) beschrieben, wurde zusätzlich zum visuellen Ermitteln der Wirkung von α_vβ₃-Antagonisten auf die Wachstumsfaktor- oder Tumor-induzierte Angiogenese, der Effekt der Antagonisten dadurch festgestellt, dass jegliche Änderung in der Tumormasse, der Exposition folgend, gemessen wurde. Für diese Analyse wurde das Tumor-induzierte Angiogenese CAM-Assaysystem hergestellt, wie in den Beispielen 6C und 7D beschrieben. Am Ende der 7 tägigen Inkubationsperiode wurden die resultierenden Tumoren aus den CAMs herausgeschnitten, von restlichem CAM Gewebe befreit, mit 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und die Feuchtgewichte für jeden Tumor bestimmt.
Darüber hinaus umfasste die Präparation des Tumors für die mikroskopischhistologische Analyse die Fixierung repräsentativer Beispiele von Tumoren mit Bulins Fixativ für 8 Stunden und Einbettung in Paraffin. Dann wurden Schnittserien angefertigt und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) für die mikroskopische Analyse gefärbt. Gladson, et al., J. Clin. Invest., 88: 1924 (1991). Die Schnitte wurden an einem Mikroskop von Olympus bei 250-facher Vergrößerung fotografiert.
A. Toxische Applikation

Die Ergebnisse typischer humaner Melanom-Tumorgewichte (M21L), die aus einer topischen Applikation mit Kontroll-Puffer (HBSS), P3G2 (anti-α_vβ₅) oder LM609 (anti-α_vβ₃) resultierten, sind in Tabelle 4 aufgelistet. Eine bestimmte Zahl an Embryonen wurde für jede Behandlung untersucht, das durchschnittliche Tumorgewicht in Milligramm (mg) für jede Behandlung wurde zusammen mit dem Standardfehler des Mittelwertes ausgerechnet, wie am Ende der Tabelle gezeigt. TABELLE 4

Embryo-Nummer	mAb Behandlung	Tumorgewicht (mg)

1	HBSS	108
2		152
3		216
4		270
5		109
6		174

1	P3G2	134
2		144
3		408
4		157
5		198
6		102
7		124
8		99

1	LM609	24
2		135
3		17
4		27
5		35
6		68
7		48
8		59

mAb Behandlung	Durchschnittliches Tumorgewicht (mg)

HBSS Kontrolle		172 ± 26
P3G2		171 ± 36
LM609		52 ± 13

Die Exposition einer α_vβ₃-negativen humanen Melanom-Tumormasse in dem CAM-Assaysystem mit LM609 verursachte eine Abnahme des Tumorgewichts von 172 mg ± 26 (Durchschnittsgewicht eines unbehandelten Tumors) auf 52 mg ± 13. Der P3G2 Antikörper hatte keinen Einfluss auf die Tumormasse. Somit verursachte die Blockade des α_vβ₃-Rezeptors durch topische Applikation des α_vβ₃-spezfischen LM609 Antikörpers eine Abnahme der Tumormasse, einhergehend mit einer Inhibierung der Angiogenese, wie in den vorhergehenden Beispielen gezeigt. Der gemessene Durchmesser der Tumormasse, der aus einer Behandlung mit P3G2 resultierte, war durchschnittlich ungefähr 8 Millimeter bis 1 cm. Im Gegensatz dazu war der durchschnittliche Durchmesser der LM609 behandelten Tumoren nur 2–3 mm.
Gefrierschnitte dieser Tumoren zeigten eine intakte Tumor-Zytoarchitektur bei den Tumoren, die P3G2 exponiert waren, in Gegensatz dazu fehlte den LM609-exponierten Tumoren eine organisierte Zellstruktur. Eine α_vβ₃-Rezeptor-Aktivität ist daher essentiell für α_vβ₃-negative Tumoren, die ihre Masse durch Versorgung über die Entwicklung von α_vβ₃-exprimierender Neovaskulatur erhalten. Die Blockade von α_vβ₃ mit den erfindungsgemäßen α_vβ₃-Antagonisten resultiert in einer Hemmung der Angiogenese in die Tumoren hinein, was sich letztlich in einer abnehmenden Tumormasse auswirkt.
B. Intravenöse Applikation

Die Ergebnisse typischer Karzinom-Tumorgewichte (UCLAP-3), die aus einer intravenösen Applikation von Kontroll-Puffer (PBS, Phosphat-gepufferte Salzlösung), CSAT (anti-β1) oder LM609 (anti-α_vβ₃) resultieren, sind in Tabelle 5 aufgeführt. Eine bestimmte Zahl an Embryonen wurde für jede Behandlung untersucht und die durchschnittlichen Tumorgewichte jeder Behandlung zusammen mit dem Standardfehler des Mittelwertes berechnet, wie am Ende der Tabelle gezeigt ist. TABELLE 5

Embryo-Nummer	mAb Behandlung	Tumorgewicht (mg)

1	PBS	101
2		80
3		67
4		90

1	CSAT	151
2		92
3		168
4		61
5		70

1	LM609	16
2		54
3		30
4		20
5		37
6		39
7		12

mAb Behandlung	Durchschnittlic	hes Tumorgewicht (mg)

PBS Kontrolle		85 ± 7
CSAT		108 ± 22
LM609		30 ± 6

Die LM609 Behandlung eines α_vβ₃-negativen humanen Karzinom-Tumorgewebes in dem CAM-Assaysystem verursachte eine Abnahme des Tumorgewichtes von 85 mg ± 7 mg (unbehandeltes durchschnittliches Tumorgewicht) auf 30 mg ± 6 mg. Der CSAT Antikörper dagegen hatte keine signifikante Auswirkung auf die Tumorgewichte. Somit resultierte die Blockade des α_vβ₃-Rezeptors durch intravenöse Applikation von α_vβ₃-spezifischen LM609 Antikörper in einer Rückbildung des Karzinoms, so wie sie den Rückgang der Melanom-Tumormasse einhergehend mit der Inhibierung der Angiogenese verursachte, wie in den vorhergehenden Beispielen gezeigt. Darüber hinaus war das humane Melanom-Tumorwachstum in ähnlicher Weise durch intravenöse Injektion von LM609 gehemmt.
9. Rückbildung des Tumorgewebewachstums durch α_vβ₃-Antagonisten, gemessen im CAM-Assay
Um die Wirkung von α_vβ₃-Antagonisten auf das Wachstum und das Überleben von Tumoren zu untersuchen, wurden Fragmente humaner Melanome und Karzinomfragmente der Lunge, des Pankreas und des Kehlkopfs auf CAMs 10 Tage alter Embryonen platziert, wie in Beispiel 5A beschrieben.
A. intravenöse Applikation
1) Behandlung mit monoklonalen Antikörpern
a. Behandlung mit LM609 (anti-α_vβ₃) und CSAT (anti-β₁)
Vierundzwanzig Stunden nach Implantation der CAM mit Karzinomfragmenten von α_vβ₃-negativen, humanem Melanom M21-L, Pankreaskarzinom FG, humanem Lungenkarzinom UCLAP-3, oder humanem Kehlkopfkarzinom HEp3, wurden die Embryonen intravenös mit PBS alleine oder einer einzelnen Dosis (300 μg/100 μl) von entweder mAb LM609 (anti-α_vβ₃) oder CSAT (anti-β₁) injiziert. Den Tumoren wurden dann sechs Tage Zeit gegeben, sich zu entwickeln. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Tumoren vorsichtig herausgeschnitten und von dem umgebenden CAM Gewebe befreit. Die Tumor-Resektionen wurden von zwei unabhängigen Forschern durchgeführt, die nur die leicht zu bestimmende, harte Tumormasse entfernten. Die Tumoren wiesen gut erkennbare Grenzen auf, so dass die dünne halbtransparente Membran (CAM) leicht von der festen Tumormasse unterscheidbar war und, ohne die Tumormasse selbst zu verletzen, entfernt werden konnte, Die entfernten Tumoren wurden gewogen und sowohl morphologisch als auch histologisch untersucht.
Wie in gezeigt, wurden die Tumorgewichte am Ende von Tag 7 ermittelt und mit den anfänglichen Tumorgewichten vor Beginn der Behandlungen verglichen. Jede Säule stellt das Mittel ± SE von 5–10 Tumoren pro Gruppe dar. Der mAb LM609 hemmte das Tumorwachstum im Vergleich zur Kontrolle in allen untersuchten Tumoren signifikant (p < 0.001). Die Tumoren, die mit PBS oder CSAT behandelt wurden, nahmen in allen Fällen an Gewicht zu. Im Gegensatz dazu verhinderte der mAb LM609 nicht nur das Wachstum dieser Tumore, sondern induzierte auch eine starke Rückbildung in den meisten Fällen. Wichtig ist, festzustellen, dass diese Tumorzellen kein α_vβ₃-Integrin exprimieren, was zeigt, das die Inhibierung des Tumors auf die anti-angiogenen Effekte des Antikörpers auf die Neovaskulatur, und nicht auf die Tumorzellen direkt, zurückzuführen ist.
b. Behandlung mit LM609 (anti-α_vβ₃) und P3G2 (anti-α_vβ₅)
Humane M21-L Melanom-Tumorfragmente (50 mg) wurden auf CAMs 10 Tage alter Embryonen implantiert, wie in Beispiel 5A beschrieben. 24 Stunden später wurden die Embryonen mit PBS alleine oder mit einer einzelnen Dosis (300 μg/100 μl) von entweder mAb LM609 (anti-α_vβ₃) oder P3G2 (anti-α_vβ₅) intravenös injiziert. Den Tumoren wurde dann Zeit gegeben, sich zu entwickeln, wie in Beispiel 9A1)a beschrieben und wurden sowohl morphologisch als auch histologisch untersucht, wie oben beschrieben.
Repräsentative Beispiele von mit mAbs P3G2 (anti-α_vβ₅) oder LM609 (anti-α_vβ₃) behandelten M21-L Tumoren wurden morphologisch untersucht. Die P3G2-behandelten Tumore waren groß (8 mm im Durchmesser) und gut vaskularisiert, wohingegen die, die mit mAb LM609 behandelt wurden, viel kleiner (3 mm im Durchmesser) waren und Blutgefäße in ihnen nicht nachweisbar waren.
Die Tumoren wurden nach Präparation von histologischen Schnitten weiter untersucht und mit Hämatoxylin und Eosin, wie in Beispiel 9A1)a beschrieben, gefärbt. Wie in (oberer Bildabschnitt) gezeigt, lagen in den mit mAb P3G2 (anti-α_vβ₅) behandelten Tumoren zahlreiche lebende und aktiv sich teilende Tumorzellen vor, was die mitotischen Figuren (Pfeilspitzen) sowie die zahlreichen Blutgefäße (Pfeile) innerhalb des Tumor-Stromas anzeigen. Im Gegensatz dazu konnten nur wenige, wenn überhaupt, lebende Tumorzellen oder Blutgefäße in Tumoren detektiert werden, die mit dem mAbLM609 (anti-α_vβ₃) behandelt wurden ( , unterer Bildabschnitt). Diese Ergebnisse zeigen, das α_vβ₃-Integrin-Antagonisten die Tumor-induzierte Angiogenese hemmen und somit zu einem Wachstumsstillstand und einer Rückbildung einer Vielfalt von humanen Tumoren in vivo führen. Es ist wichtig, festzustellen, dass die Embryonen, die nach 7 tägigem Tumorwachstum (Tag 17 der Embryonalentwicklung) untersucht wurden, nach einer ersten Untersuchung normal aussahen, unabhängig davon, ob sie mit einem α_vβ₃-Antagonist behandelt worden waren oder nicht. Diese Befunde sind ein Hinweis darauf, dass Antagonisten dieses Rezeptors nicht toxisch für die entwickelnden Embryonen sind.
2) Behandlung mit synthetischen Peptiden
Humane M21-L Melanom-Tumorfragmente (50 mg) wurden auf CAMs 10 Tage alter Embryonen implantiert, wie in Beispiel 5A beschrieben. Vierundzwanzig Stunden später erhielten die Embryonen eine einzelne intravenöse Injektion von 300 μg/100 μl von entweder einem cyclo-RADfV (69601) oder cyclo-RGFfV (66203) Peptid. Nach insgesamt 72 Stunden wurden die Tumoren entfernt, morphologisch untersucht und an einem Stereomikroskop fotografiert, wie in Beispiel 9A1) beschrieben.
Die Bildabschnitte, die in den bis gezeigt sind, entsprechen folgenden: , parallele Proben, behandelt mit cyclo-RADvF Peptid (69601); , parallele Proben, behandelt mit cyclo-RGDfV Peptid (66203); , benachbarte CAM-Gewebe vom gleichen Embryo, der mit cyclo-RGDfV Peptid (66203) behandelt wurde und und , eine hohe Vergrößerung (13×) eines Peptid-behandelten Tumors. zeigt genauer normale Blutgefäße von mit Kontroll-Peptid behandeltem Tumor (69601). zeigt genauer Beispiele unterbrochener Blutgefäße von mit cyclo-RGDfV Peptid (66203) behandelten Tumoren (Pfeile).
Die Ergebnisse zeigen, dass nur das Peptid 66203 die Gefäßbildung inhibierte und darüber hinaus, dass die Gefäße in den CAM Geweben, die dem Tumor benachbart waren, nicht beeinflusst waren.
10. Rückbildung des Tumorgewebewachstums durch α_vβ₃-Antagonisten, gemessen mit dem in vivo Kaninchenaugen-Modellassay
Die Auswirkungen von α_vβ₃-Antagonisten auf die Wachstumsfaktor-induzierte Angiogenese kann in natürlich vorkommenden, transparenten Strukturen, wie zum Beispiel der Hornhaut des Auges, untersucht werden. Neue Blutgefäße wachsen vom Rand der Hornhaut, die eine sehr gute Blutversorgung aufweist, in Richtung des Hornhautzentrums, das normalerweise keine Blutversorgung hat. Stimulatoren der Angiogenese, wie β-FGF, induzieren das Wachstum neuer Blutgefäße vom Rand der Hornhaut aus, wenn sie auf die Hornhaut appliziert werden. Auf die Hornhaut applizierte Antagonisten der Angiogenese hemmen das Wachstum neuer Blutgefäße vom Rand der Hornhaut aus. So findet in der Hornhaut Angiogenese statt, indem Endothelzellen vom Rand der Hornhaut aus in die dichten, kollagenreichen Schichten des Hornhautgewebes eindringen, was leicht zu sehen ist. Der Kaninchenaugen-Modellassay liefert daher ein in vivo Modell für die direkte Beobachtung einer Stimulation beziehungsweise Inhibierung der Angiogenese, die auf eine Implantation von Substanzen direkt in die Hornhaut des Auges folgen kann.
A. In vivo Kaninchenaugen-Modellassay
1) Durch Wachstumsfaktoren induzierte Angiogenese
Die Angiogenese wurde in dem Kaninchenaugen-Modellassay durch den Wachstumsfaktor β-FGF induziert und wird im folgenden beschrieben.
a. Herstellung von Hydron-Pellets, die Wachstumsfaktoren und monoklonale Antikörper enthalten
Hydron-Polymer-Pellets, die Wachstumsfaktoren und mAbs enthalten, wurden wie bei D'Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 4082–4085 (1994) beschrieben, hergestellt. Die einzelnen Pellets enthielten 650 ng des β-FGF Wachstumsfaktors gebunden an Sukralfat (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation) zur Stabilisierung des β-FGFs, und um seine langsame Freisetzung in das umgebende Gewebe hinein zu bewirken. Zusätzlich wurden Hydron-Pellets hergestellt, die entweder 40 μg des mAbs LM609 (anti-α_vβ₃) oder des mAbs P1F6 (anti-α_vβ₅) in PBS enthielten. Die Pellets wurden in besonderen Teflonvorrichtungen hergestellt, die ein 2.5 mm großes Loch enthielten, das in ihre Oberflächen gebohrt war. Ungefähr 12 μl des einzugießenden Materials wurde in jede Vertiefung gegeben und über Nacht unter einer Sterilbank auspolymerisiert. Die Pellets wurden anschließend durch Ultraviolett-Strahlung sterilisiert.
b. Behandlung mit monoklonalen Antikörpern
Jedes Experiment umfasste drei Kaninchen, wobei jeweils in das eine Auge ein β-FGF und LM609 enthaltendes Pellet implantiert wurde und in das andere Auge ein Pellet, dass β-FGF und Maus mAb P1F6 (anti-α_vβ₅) enthielt. Die Verwendung paariger Augen, um den LM609 (anti-α_vβ₃) mit anderen mAbs und PBS-Kontrollen zu vergleichen, ist eine geeignete Methode, um signifikante Unterschiede zwischen den getesteten mAbs zu ermitteln.
Der P1F6 mAb kreuzreagierte mit dem α_vβ₅ Integrin, das auf der Oberfläche von vaskulären Endothelzellen vorkommt, aber vermutlich nicht an der Angiogenese beteiligt ist. Um zu bestimmen, ob der mAb P1F6 an der Angiogenese beteiligt war, wurden Pellets, die nur diesen Antikörper enthielten, hergestellt und wie oben beschrieben getestet, um zu bestätigen, dass der mAb die Angiogenese nicht induzierte.
Alle der getesteten Antikörper wurden aus Ascites-Flüssigkeit unter Verwendung von Protein-A-Sepharose CL-4B Affinitäts-Säulenchromatographie gereinigt, gemäß gut bekannter Methoden. Die eluierten Immunglobuline wurde dann gegen PBS dialysiert und mit Detoxi-Gel zur Entfernung von Endotoxinen (Pierce Chemicals) behandelt. Von den Endotoxinen ist bekannt, dass sie potente angiogene und inflammatorische Stimulantien sind. Daher wurden die mAbs auf die Anwesenheit von Endotoxinen mit dem chromogenen Limulus-Amoebozyten-Lysat-Assay (Bio-Whittaker) getestet und nur die mAbs ohne nachweisbare Endotoxine wurden in dem Kaninchenaugen-Modellassay eingesetzt.
Ein Hydron-Pellet, β-FGF und mAb LM609 (anti-α_vβ₃) oder P1F6 (anti-α_vβ₅) enthaltend, wurde in die im Kaninchenauge hergestellte Hornhauttasche implantiert. Das Hydron-Pellet enthielt auch Sukralfat zur Stabilisierung des β-FGFs während des Assays. Einzelne Pellets wurden in chirurgisch präparierte „Taschen” innerhalb der mittleren Stromaschicht der Kaninchenhornhaut implantiert. Diese chirurgische Operation wurde unter sterilen Bedingungen an einem Operationsmikroskop (Wild Model M691) durchgeführt, das einen Strahlenteiler aufwies, an dem eine Kamera befestigt war, um die Operation an den Hornhäuten verfolgen zu können. Eine 3 mm mal 5 mm große „Tasche” wurde im Hornhautstroma geschaffen, indem ein 3 mm tiefer Einschnitt bis zur Hälfte der Hornhautdicke mit einem „69 Beaver blade” Messer vorgenommen wurde. Das Stroms wurde am Rand mit einem Irisspatel entfernt und das Pellet mit seinem äußeren Rand 2 mm vom Limbus entfernt, implantiert.
Während der nächsten 14 Tage diffundierten β-FGF und der mAb aus dem implantierten Pellet in die umgebenden Gewebe und beeinflussten dabei die Angiogenese vom Rand der Hornhaut aus.
Repräsentative Ergebnisse von jeder Behandlung sind in den – dargestellt. Die Menge an vorhandenen Gefäßen wurde quantifiziert und mit Uhrzeigerstand-Bezeichnungen beschrieben, wie nachfolgend definiert. Das Auge wurde in 12 gleiche Teile, in der gleichen Weise wie die Uhr in Stunden eingeteilt ist, unterteilt. „Ein Uhr Gefäße” bezeichnen die Gefäße, die das Gebiet eines Auges ausfüllen, das äquivalent zu ein Uhr ist.
Die fünf Kaninchen, die nur mit β-FGF behandelt wurden, zeigten eine ausgedehnte Angiogenese, bei der neue Blutgefäße vom Rand der Hornhaut bis in das Zentrum der Hornhaut gewachsen waren, wo normalerweise keine Blutgefäße zu finden sind. Eines dieser Kaninchen zeigte nur 1 Uhr Gefäße am Pellet. Zwei Kaninchen, die sowohl mit β-FGF als auch den mAb LM609 behandelt wurden, wiesen absolut keine nachweisbare Angiogenese bis zu 14 Tage nach der Operation auf. Eins dieser Kaninchen zeigte drei haemorrhagische Punkte und Gefäß-Aussprossung am Tag 14. Zwei der Kaninchen, die mit β-FGF und mAb P3G2 (anti-α_vβ₅) behandelt wurden, zeigten eine ausgedehnte Vaskularisierung, wobei neue Blutgefäße vom Rand der Hornhaut in das Innere der Hornhaut gewachsen waren. Eines dieser Kaninchen wies nur 1–2 Uhr Gefäße am Pellet auf.
Wie im Kaninchenaugen-Modellassay gezeigt, konnte keine angiogene Wirkung auf normale paralimbale Gefäße in der Anwesenheit des Wachstumsfaktors β-FGFs in Kaninchen beobachtet werden, die mit mAb LM609 (anti-α_vβ₃) behandelt waren. Im Gegensatz dazu trat Angiogenese in Anwesenheit von β-FGF in paralimbalen Gefäßen auf, wenn die Kaninchen mit dem mAb P3G2 (anti-α_vβ₅) behandelt waren. Die vollständige Hemmung der Hornhaut-Angiogenese durch mAb LM609 ist wesentlich größer als die Wirkung irgendeines anderen vorher berichteten anti-angiogenen Reagenzes.
11. In vivo Rückbildung von Tumorgewebewachstum durch α_vβ₃-Antagonisten, gemessen mit dem chimären Maus:Mensch Assay
Ein in vivo chimäres Maus:Mensch Modell wurde dadurch hergestellt, dass ein Teil der Haut einer SCID Maus durch humane neonatale Vorhaut ( ) ersetzt wurde. Nachdem die Hauttransplantation ausgebildet war, wurde die humane Vorhaut mit Karzinomzellen inokuliert. Nach Ausbildung eines messbaren Tumors wurde entweder mAb LM609 (anti-α_vβ₃) oder PBS in die Schwanzvene der Maus injiziert. Nach 2–3 Wochen wurde der Tumor schließlich herausgeschnitten und durch Gewichtsbestimmung und Histologie untersucht.
A. In vivo chimärer Maus-Mensch Assay
Das in vivo chimäre Maus-Mensch Modell wurde im wesentlichen wie bei Yan et al., J. Clin. Invest., 91: 986–996 (1993) beschrieben, hergestellt. In Kürze wurde ein 2 cm² großes Gebiet der Haut chirurgisch von einer SCID Maus entfernt (6–8 Wochen alt) und durch humane Vorhaut ersetzt. Die Maus wurde betäubt und das Haar von einem 5 cm² großem Gebiet entfernt, indem sie auf jeder Seite der lateralen Bauchregion rasiert wurde. Zwei runde, 2 cm² große Wundbetten für die Transplantate wurden durch Entfernen der gesamten Dicke der Haut bis zum Bindegewebe der Muskeln entfernt. Humane Hauttransplantate der gesamten Dicke und der gleichen Größe wurden von humaner neonataler Vorhaut gewonnen, auf die Wundbetten platziert und mit einer Wundnaht festgenäht. Das Transplantat wurde mit einem Pflaster, dass an Haut genäht wurde, bedeckt. Kleinporige Stoffpflaster wurden auch verwendet, um die Wunde zu bedecken.
Die M21-L humane Melanom-Zelllinie oder MDA 23.1 Brustkarzinom-Zelllinie (ATCC HTB 26; α_vβ₃-negativ auf Schnitten, festgestellt durch Immunreaktivität gegenüber mAb LM609) wurden auch verwendet, um feste humane Tumoren auf den humanen Hauttransplantaten auf SCID Mäusen zu generieren. Eine einzelne Zellsuspension von 5 × 10⁶ M21-L oder MDA.23.1 Zellen wurde intradermal in die humanen Hauttransplantate injziert. Die Mäuse wurden dann für weitere 2–4 Wochen, in denen messbare humane Tumoren wuchsen, beobachtet.
B. Intravenöse Applikation
1) Behandlung mit monoklonalen Antikörpern

Nach Ausbildung messbarer Tumoren wurden die SCID Mäuse, die mit M21-L Tumorzellen injiziert wurden, intravenös in die Schwanzvene mit 250 μg von entweder dem mAb LM609 (anti-α_vβ₃) oder PBS zweimal die Woche über 2–3 Wochen injiziert. Anschließend wurden die Tumoren aus der Haut herausgeschnitten und das umgebende Gewebe entfernt. Mehrere Mäuse wurden für jede Behandlung ausgewertet und das durchschnittliche Tumorgewicht von jeder Behandlung wurde ausgerechnet, und ist am Ende von Tabelle 6 gezeigt. TABELLE 6

M21L Tumor-Nummer	Behandlung	Tumorgewicht (mg)

1	PBS	158
2		192
3		216
4		277

5	LM609	195
6		42
7		82
8		48
9		37
10		100
11		172

Behandlung	Durchschnittliches	Tumorgewicht (mg)
PBS		198
LM609		113

Der Kontakt von M21-L α_vβ₃-negativen humanen Karzinom-Tumorgewebe in dem Maus:Mensch chimären Assaysystem mit LM609 (anti-α_vβ₃) verursachte eine Abnahme des durchschnittlichen Tumorgewichts von 198 mg in den PBS behandelten Tumoren auf 113 mg.
Repräsentative Beispiele von mit mAb LM609 (anti-α_vβ₃) und PBS behandelten M21-L Tumoren wurden morphologisch untersucht. Die PBS-behandelten Tumoren waren groß (8–10 mm im Durchmesser) und in erheblichem Ausmaß vaskularisiert, wohingegen die, die mit dem mAb LM609 (anti-α_vβ₃) behandelt waren, viel kleiner (3 bis 4 mm im Durchmesser) waren und nachweisbare Blutgefäße fehlten.
Die Tumoren, die sich in den Hauttransplantaten, die mit MDA 23.1 injiziert wurden, ausgebildet hatten, waren nachweisbar und wiesen eine messbare Größe auf. Die morphologische Untersuchung der entstandenen Tumoren zeigte, dass eine Neovaskularisierung von dem transplantierten, humanen Gewebe in die MDA 23.1 Tumorzellen stattgefunden hat.
Somit bewirkte die Blockade des α_vβ₃-Rezeptors durch intravenöse Injektion von α_vβ₃-spezifischem LM609 Antikörper eine Rückbildung eines Karzinoms in diesem Modellsystem, genauso wie im CAM und Kaninchenaugen-Modellsystem, wie in den Beispielen 9 beziehungsweise 10 beschrieben.
12. Stimulierung von Gefäßzellen durch Anwesenheit von α_vβ₃-Integrin-Antagonisten, in den Zellzyklus beziehungsweise den Prozess der Apoptose einzutreten, gemessen mit dem CAM-Assay
Der Angiogenese-Prozess hängt eindeutig von der Eigenschaft der Zytokine, wie β-FGF und VEGF, ab, die Proliferation von Gefäßzellen zu stimulieren. Mignatti et al., J. Cell. Biochem., 471: 201 (1991); Takeshita et al., J. Clin. Invest., 93: 662 (1994); und Koyama et al., J. Cell. Physiol., 158: 1 (1994). Jedoch ist es offensichtlich, dass auch Signaltransduktionsprozesse die Differenzierung dieser Gefäßzellen in reife Blutgefäße regulieren können. So ist es vorstellbar, dass eine Störung von Signalen, die entweder auf das Wachstum oder die Differenzierung von Gefäßzellen wirken, die im neuen Wachstum oder in Angiogenese begriffen sind, in einer Störung der Angiogenese resultieren kann.
Es wurde gezeigt, dass die Bindung an Integrine sowohl eine Rolle bei der Zell-Proliferation als auch bei der Apoptose oder dem programmierten Zelltod in vitro spielt. Schwartz, Cancer Res., 51: 1503 (1993); Meredith et al., Mol. Biol. Cell., 4: 953 (1993); Frisch et al., J. Cell Biol., 124: 619 (1994); und Ruoslahti et al., Cell, 77: 477 (1994). Eine genaue Untersuchung der Wirkungen der α_vβ₃-Antagonisten auf die Angiogenese zeigt das Vorliegen von diskontinuierlichen und unterbrochenen Tumor-assoziierten Blutgefäßen. Daher ist es möglich, dass der Verlust der Blutgefäß-Kontinuität auf eine selektive Nekrose oder Apoptose von Gefäßzellen zurückzuführen ist.
Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden CAMs nach Angiogenese-Induktion mit dem Wachstumsfaktor β-FGF und nach Behandlung mit den erfindungsgemäßen mAbs und erfindungsgemäßen zyklischen Peptiden untersucht.
A. Behandlung mit monoklonalen Antikörpern
Die Apoptose kann durch eine Vielfalt an Methoden detektiert werden, eingeschlossen die direkte Untersuchung isolierter DNA aus Geweben, um die Fragmentierung der DNA zu bestimmen, und die Detektion von 3'OH Enden in intakten Geweben mittels Antikörpern, die spezifisch freie 3'OH-Gruppen fragmentierter DNA erkennen.
1) Analyse der DNA Fragmentierung
Die Angiogenese wurde induziert, indem mit β-FGF gesättigte Filterscheiben auf die CAMs 10 Tage alter Embryonen gebracht wurden, wir in Beispiel 6A beschrieben. Eine immunhistologische Analyse der mit LM609 (anti-α_vβ₃) behandelten CAMs zeigte 12 bis 24 Stunden nach Auslösung der Angiogenese mit β-FGF eine maximale α_vβ₃-Expression auf Blutgefäßen. 24 Stunden nach Stimulierung mit β-FGF wurden die Embryonen daher mit 100 μl PBS alleine oder mit PBS, 300 μg von entweder CSAT (anti-β₁) oder LM609 (anti-α_vβ₃) enthaltend, intravenös injiziert.
Die DNA Fragmentierung wurde dadurch detektiert, dass das CAM-Gewebe direkt unter dem β-FGF gesättigtem Filter herausgeschnitten wurde und zwar 24 Stunden bis 48 Stunden nach intravenöser Injektion mit mAb LM609 (anti-α_vβ₃), CSAT (anti-β₁) oder PBS. Die herausgeschnittenen CAM Gewebe wurden dreimal mit sterilem PBS gewaschen, kleingeschnitten, in 0.25% bakterieller Kollagenase (Worthington Biochemical; Freehold, NJ) resuspendiert und für 90 Minuten bei 37°C unter gelegentlichen Mixen inkubiert. Die DNA wurde von einer gleichen Anzahl an CAM-Zellen von Einzelzellsuspensionen, wie vorher beschrieben, extrahiert. Bissonette, et al., Nature, 359: 552 (1992). Kurz gefasst, wurde eine gleiche Anzahl an CAM Zellen in 10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA in 0.5% (v/v) Triton-X-100 (Sigma, St. Louis, Mo.) lysiert. Die Zell-Lysate wurde dann bei 16 000 g für 15 min bei 4°C zentrifugiert, um die lösliche, fragmentierte DNA vom intakten Chromatin-Pellet zu trennen. Die fragmentierte DNA wurde gewaschen, präzipitiert und auf einem 1.2% (w/v) Agarosegel analysiert.
Die lösliche, fragmentierte DNA wurde aus einer gleichen Anzahl an CAM-Zellen von jeder Behandlung isoliert, elektrophoretisch auf einem Agarosegel aufgetrennt und durch Anfärbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. 24 Stunden nach der Behandlung wurde kein Unterschied in der relativen Menge an DNA Fragmentierung, resultierend aus den drei unterschiedlichen Behandlungen, ermittelt. Jedoch 48 Stunden nach Start der Behandlung mit dem mAb LM609 (anti-α_vβ₃) war eine signifikante Zunahme in der DNA Fragmentierung zu beobachten, im Vergleich zu den Embryonen, die entweder mit mAb CSAT (anti-β₁) oder PBS alleine behandelt wurden.
2) Stimulierung der Gefäßzellen in den Zellzyklus einzutreten
Um die Rolle von α_vβ₃ in diesen Prozessen experimentell zu untersuchen, wurden von CAMs abstammende Zellen, mit oder ohne β-FGF Behandlung, mit Propidiumjodid gefärbt und der mAb LM609 (anti-α_vβ₃) zur Immunreaktion verwendet.
Die 24 und 48 Stunden nach der Behandlung mit den mAbs LM609 (anti-α_vβ₃), CSAT (anti-β₁) oder PBS aus Embryonen isolierten CAMs wurden durch Inkubation mit bakterieller Kollagenase zu Einzelzellsuspensionen dissoziiert, wie oben beschrieben. Anschließend wurden die Einzelzellen permeabilisiert und mit dem Apop Tag in situ Detektionskit gefärbt, entsprechend der Anleitung des Herstellers (Oncor, Gaithersburg, Md.). Apop Tag ist ein Antikörper, der spezifisch freie 3'OH-Gruppen fragmentierter DNA erkennt. Die Erkennung solcher freien 3'OH-Gruppen ist eine etablierte Methode für die Detektion apoptotischer Zellen. Gavrieli et al., J. Cell Biol., 119:493 (1992).
Apop Tag gefärbte Zellen wurden mit 0.1% (v/v) Triton-X-100 Lösung in PBS gewaschen und in FACS Puffer, 0.5% (w/v) BSA, 0.02% (w/v) Natriumazid und 200 μg/ml RNAse A in PBS enthaltend, resuspendiert. Die Zellen wurden dann für 1.5 Stunden inkubiert, gewaschen und durch Fluoreszenz-aktiviertes Sortieren von Zellen analysiert. Die zelluläre Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines FACScan Durchfluss-Zytometers (Becton Dickinson, Mountain View, Calif) gemessen und, wie unten beschrieben, analysiert.
Das seitliche Streulicht (SSC) und das vordere Streulicht (FSC) wurden gleichzeitig bestimmt und alle Daten mit einem Hewlett Packard (HP9000) Computer, ausgerüstet mit einer FACScan Foschungs-Software (Becton Dickinson, Mountain View, Calif). Die Daten wurden mit der P. C. Lysis Version 1 Software ausgewertet (Becton Dickinson, Mountain View, Calif). Die negativen Kontroll-Schwellenwerte wurden von Zellsupsensionen erhalten, denen kein primärer Antikörper aus dem Apop Tag Kit zugesetzt wurde. Identische Schwellenwerte wurden auf beide Zellpopulationen angewendet, was in der Analyse von ungefähr 8000 Zellen pro experimenteller Bedingung resultierte.
Der Prozentsatz der Zellen, die von den mit mAbs behandelten CAMs stammten und mit Apop Tag gefärbt waren, bestimmt mittels FACS Analyse, ist in gezeigt. Die schwarze Säule repräsentiert Zellen von Embryonen, die 24 Stunden vor der Analyse behandelt wurden. Die gepunktete Säule entspricht Zellen von Embryonen, die 48 Stunden vor der Analyse behandelt wurden. Jede Säule stellt den Mittelwert ± SE von drei Wiederholungen dar.
Wie in gezeigt, zeigten die CAMs, die zwei Tage vor der Analyse mit mAb LM609 (anti-α_vβ₃) behandelt wurden, einen 3 bis 4-fachen Anstieg in der Apop Tag Färbung, im Vergleich zu CAMs, die mit PBS alleine oder CSAT (anti-β₁) behandelt wurden.
B. Behandlung mit synthetischen Peptiden
Die CAM-Assays mit Wachstumsfaktor-induzierter Angiogenese wurden auch mit erfindungsgemäßen synthetischen Peptiden, wie in Beispiel 6A beschrieben, durchgeführt, um die Wirkung der zyklischen Peptide auf die Apoptose zu ermitteln. Die Peptide cyclo-RGDfV (66203) und cyclo-RADfV (69601) wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die Peptid-Lösungen oder PBS wurden in die CAM-Präparate in einer Konzentration von 300 μg/ml injiziert. Nach 24 und 48 Stunden wurde das Filterpapier und das umgebende CAM Gewebe herausgeschnitten und mit Apop Tag zur Ermittlung der Apoptose gefärbt, wie oben in Beispiel 12A2) beschrieben. Wie in zu sehen, zeigen die CAMs, die zwei Tage vor der Analyse mit dem Peptid 69203 (cyclo-RGDfV) behandelt wurden, einen 3–4-fachen Anstieg in der Apop Tag Färbung im Vergleich zu den CAMs, die entweder mit PBS alleine oder dem zyklischen Kontroll-Peptid 69601 (cyclo-RADfV) behandelt wurden.
C. Wirkung der Behandlung mit monoklonalen Antikörpern auf die Apoptose und den Zellzyklus
Um die Wirkung der Behandlung mit monoklonalen Antikörpern auf den Zellzyklus und die Apoptose zu bestimmen, wurden Einzelzellsuspensionen mittels Propidiumjodid-Färbung auf die Zahl der Kopien chromosomaler DNA untersucht, beziehungsweise die Zellen mit Apop Tag gefärbt.
Einzelzell-Suspensionen von CAMs, die 24 und 48 Stunden vor der Analyse mit mAb LM609 (anti-α_vβ₃) oder CSAT (Anti-β₁) oder PBS behandelt wurden, sind, wie in Beispiel 12A1) beschrieben, hergestellt worden.
Für die Färbung der Zellen mit Apop Tag wurden die Zellsuspensionen dreimal mit Puffer, 2.5% (w/v) BSA und 0.25% (w/v) Natriumazid in PBS enthaltend, gewaschen. Dann wurden die Zellen mit 1% (w/v) Paraformaldehyd in PBS für 15 Minuten fixiert und anschließend dreimal, wie oben beschrieben, gewaschen. Um eine unspezifische Bindung zu verhindern, wurden die Einzelzellsuspensionen mit 5% (w/v) BSA in PBS über Nacht bei 4°C geblockt. Die Zellen wurden dann, wie vorher, gewaschen, mit Apop Tag gefärbt und die Zell-Fluoreszenz mit einem FACScan, wie oben in Beispiel 12A beschrieben, gemessen.
Die Zellen jeder experimentellen Bedingung wurden mit Propidiumjodid (Sigma, St. Louis, Mo.) in einer Konzentration von 10 μg/ml in PBS für 1 Stunde gefärbt, zweimal mit PBS gewaschen und dann auf für Apoptose typische Kern-Eigenschaften, wie Chromatin-Kondensierung und Fragmentierung, hin untersucht. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde durch eine morphologische Analyse der Zellen von mindesten 10–15 zufällig ausgewählten, mikroskopischen Feldern bestimmt.
Die zusammengefassten Ergebnisse der Einzelzellsuspensionen von embryonalen CAMs, die entweder mit CSAT (anti-β₁) oder LM609 (anti-α_vβ₃) behandelt wurden, mit Apop Tag und Propidiumjodid gefärbt und mittels FACS analysiert wurden, sind in dargestellt. Die Y-Achse stellt die Apop Tag Färbung (Apoptose) dar, die X-Achse die Propidiumjodid-Färbung (DNA-Gehalt). Die horizontale Linie gibt die Nachweisgrenze für die Apop Tag Färbung an. Die linken und rechten Bildabschnitte repräsentieren CAM Zellen von CSAT beziehungsweise LM609 behandelten Embryonen. Die Zellzyklus-Analyse wurde durch Untersuchung von ungefähr 8000 Ereignissen pro experimentelle Bedingung durchgeführt und die Daten sind in einem Konturdiagramm dargestellt.
Die Proben einzelner Zellen, deren DNA mit Propidiumjodid gefärbt war, zeigten, dass 25–30% der LM609-(anti-α_vβ₃)-behandelten CAM-Zellen 48 Stunden nach Behandlungsbeginn eine Kern-Kondensation und/oder Fragmentierung aufweisen. Diese Vorgänge sind charakteristisch für Zellen, die sich im Prozess der Apoptose befinden. Im Gegensatz dazu zeigten 90–95% der Zellen der mit CSAT (anti-β₁) behandelten CAMs eine normale Kernfärbung.
Wie in gezeigt, konnte eine signifikante Anzahl an Zellen im Maximum gemessen werden, die weniger als eine Kopie der DNA aufwiesen (AO), was konsistent mit einer Induktion der Apoptose durch LM609 ist. Es wurde früher gezeigt, dass dieses Maximum fragmentierte DNA in Zellen repräsentiert, die sich in einem späten Apoptose-Stadium befinden, Telford et al., Cytometry, 13: 137 (1992). Darüberhinaus färben sich die AO Zellen leicht mit dem Apop Tag Kit, was die Eigenschaft dieses Reagenzes belegt, apoptotische Zellen zu detektieren. Zusätzlich zur Färbung der Zellen in AO, wurde jedoch auch eine signifikante Zellzahl, die mehr als eine DNA Kopie aufwiesen, mit Apop Tag gefärbt ( ). Diese Ergebnisse zeigen, dass LM609 die Fähigkeit besitzt, die Apoptose von Gefäßzellen zu fördern, die schon in den Zellzyklus eingetreten sind. Im Gegensatz dazu zeigten die von Kontroll-CAMs stammenden Zellen, die in den Zellzyklus eingetreten waren, nur eine minimale Apop Tag Färbung, entsprechend den nur wenigen, apoptotischen Zellen, die in unbehandelten CAMs detektiert werden konnten.
Von den Zellen der β-FGF behandelten CAMs, die in den Zellzyklus eingetreten waren (S und G2/M Phase), zeigten 70% eine positive Färbung mit LM609 (anti-α_vβ₃). Im Vergleich dazu zeigten nur 10% der im Zellzyklus befindlichen Zellen von nicht β-FGF behandelten CAMs eine LM609 Färbung. Diese Befunde zeigen, dass nach β-FGF Induktion, die Mehrzahl der α_vβ₃-positiven Zellen eine aktive Proliferation aufweist.
Zusammen genommen, zeigen die Ergebnisse, dass die intravenöse Injektion des mAbs LM609 oder zyklischer Peptid-Antagonisten von α_vβ₃ die Apoptose in der Hühner-CAM, auf die Angiogenese-Induktion folgend, fördert.
Die CAMs wurden auch histologisch durch Immunreaktivität gegenüber LM609 auf die Expression von α_vβ₃ untersucht, ebenso wie für Zellen, die sich im Prozess der Apoptose befinden, durch Immunreaktion mit Apop Tag. CAM-Schnitte, die aus Embryonen erhalten wurden, die 48 Stunden vor der Analyse mit LM609 (anti-α_vβ₃), CSAT (anti-β₁) oder PBS behandelt wurden, hergestellt wie in Beispiel 5A beschrieben, wurden in OTC (Baxter) eingebettet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Sechs Mikrometer dicke Schnitte von CAM Geweben wurden hergestellt, in Aceton für 30 Sekunden fixiert und bei –70°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Die Gewebeschnitte wurden dann für die Färbung vorbereitet, indem sie kurz mit 70%/v(v) Äthanol (EtOH) gespült wurden und dann dreimal mit PBS gewaschen wurden. Dann wurden die Schnitte mit 5% (w/v) BSA in PBS für 2 Stunden blockiert, gefolgt von der Inkubation mit 10 μg/ml mAb LM609 für 2 Stunden. Die Schnitte wurden anschließend gewaschen und mit einer 1:50 verdünnten Ziege anti-Maus IgG-Rhodamin-Konjugat (Fisher Scientific, Pittsburg, Pa.) Losung für 2 Stunden inkubiert. Schließlich wurden die gleichen Schnitte gewaschen und mit Apop Tag gefärbt, wie in Beispiel 12A2) beschrieben. Die gefärbten Gewebeschnitte wurden befestigt und durch Konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert.
In zeigen die Bildabschnitte A bis C repräsentative CAM Gewebe von CSAT (anti-β₁) behandelten Embryonen und die Bildabschnitte D–F repräsentative CAM Gewebe von LM609 (anti-α_vβ₃) behandelten Embryonen. Die Bildabschnitte A–D zeigen Gewebe, die Apop Tag gefärbt wurden und mit Fluoreszenz (FITC) sichtbar gemacht wurden, überlagert auf ein D. I. C. Bild. Die Bildabschnitte B und E zeigen die gleichen Gewebe mit mAG LM609 (anti-α_vβ₃) gefärbt und durch Fluoreszenz (Rhodamin) sichtbar gemacht. Die Bildabschnitte C und F zeigen überlagerte Bilder des gleichen Gewebes, das sowohl mit Apop Tag als auch mit LM609 gefärbt wurde, wobei die Gelbfärbung eine Kolokalisation anzeigt. Der Maßstab repräsentiert 15 und 50 μm in den linken beziehungsweise rechten Bildabschnitten.
Wie in (A-C) gezeigt, ist die Apop Tag Färbung nur minimal und eher zufällig nach intravenöser Injektion von CSAT oder PBS als Kontrolle, ein Hinweis für ein geringes Ausmaß an Apoptose in diesem Gewebe. Im Gegensatz dazu zeigte die Mehrzahl der Gefäße aus embryonalen CAMs, die mit LM609 oder zyklischem Peptid 203 behandelt waren, eine intensive Apop Tag Färbung, während nur eine minimale Reaktivität in den umgebenden nicht-vaskulären Zellen beobachtet wurde ( –F). Darüber hinaus konnte, wenn sowohl Apop Tag als auch LM609 verwandt wurden, um diese Gewebe ( und ) zu färben, eine signifikante Kolokalisation dieser Marker nur in embryonalen CAMs nach α_vβ₃-Antagonisten Behandlung beobachtet werden ( ). Diese Befunde zeigen, dass nach Induktion der in vivo Angiogenese, die α_vβ₃-Integrin-Inhibitoren selektiv die Apoptose α_vβ₃-positiver Blutgefäße fördern.
Während die Angiogenese ein komplexer Prozess ist, der viele molekulare und zellbiologische Ereignisse einschließt, liegen zahlreiche Hinweise darauf vor, dass das α_vβ₃-Gefäßzell-Integrin eine relativ späte Rolle bei diesem Vorgang spielt.
Erstens zeigt die immunhistologische Analyse, dass die α_vβ₃-Expression auf Gefäßzellen ihr Maximum erst 12–24 Stunden nach der Angiogenese-Induktion mit β-FGF erreicht. Zweitens stören α_vβ₃-Antagonisten die durch multiple Aktivatoren induzierte Angiogenese, was nahe legt, dass dieser Rezeptor Teil eines gemeinsamen Signaltransduktionswegs ist, der möglicherweise allen primären Signaltransduktions-Ereignissen, die zur Angiogenese führen, nachgeschaltet ist.
Drittens zeigen mit mAb LM609 oder mit zyklischen Peptiden behandelte CAMs keine signifikante Zunahme der Apoptose, gemessen durch Ermittlung der DNA Fragmentierung bis zu 48 Stunden nach Start der Behandlung mit diesen Antagonisten. Schließlich fördern Antagonisten von α_vβ₃ die Apoptose von Gefäßzellen, die schon induziert worden sind, in den Zellzyklus einzutreten.
Die Ergebnisse, die hier vorgestellt wurden, liefern den ersten direkten Beweis, dass Integrin-Bindungsereignisse das Überleben von Zellen in vivo regulieren können. Daher kann angenommen werden, dass sobald die Angiogenese beginnt, einzelne Gefäßzellen sich teilen und anfangen, in Richtung der angiogenen Quelle zu wandern, und anschließend die Bindung an α_vβ₃ ein Signal liefert, das ein kontinuierliches Überleben der Zeilen erlaubt und zu einer Differenzierung und Ausbildung reifer Blutgefäße führt. Wenn jedoch die Bindung an α_vβ₃ inhibiert ist, erhält die Zelle diesen molekularen Stimulus nicht und wird zwangsläufig apoptotisch. Diese Annahme würde auch voraussagen, dass nachdem die Differenzierung eingetreten ist, für das Überleben reifer Gefäße eine Signaltransduktion via α_vβ₃ nicht länger erforderlich ist und diese dann unempfindlich gegenüber Antagonisten dieses Integrins sind. Schließlich belegen die hier vorgestellten Ergebnisse, dass α_vβ₃-Antagonisten einen sehr wirkungsvollen therapeutischern Ansatz für die Behandlung von Neoplasie und anderen Krankheiten, die durch Angiogenese charakterisiert sind, liefern können. Erstens zerstören α_vβ₃-Antagonisten die Ausbildung neuer Blutgefäße ohne schon vorher existierende Gefäße zu beeinflussen. Zweitens haben die Antagonisten keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit von Hühnerembryonen, was nahe legt, dass sie nicht toxisch sind. Drittens war die Angiogenese unabhängig vom angiogenen Stimulus signifikant blockiert. Schließlich verursacht die systemische Anwendung von α_vβ₃-Antagonisten eine dramatische Rückbildung einer Vielfalt an histologisch unterschiedlichen Tumoren.
Somit zeigen die genannten Beispiele, dass das α_vβ₃ Integrin eine Schlüsselrolle in der durch eine Vielfalt an Stimuli induzierten Angiogenese spielt, und, dass das α_vβ₃ Integrin zusammen mit den erfindungsgemäßen Antagonisten einen wertvollen therapeutischen Angriffspunkt für die Behandlung von Krankheiten, die durch Neovaskularisierung charakterisiert sind, liefert.
Die vorausgegangene, schriftliche Spezifizierung wird als ausreichend angesehen, dass ein Fachmann auf seinem Gebiert die Erfindung ausführen kann. Die vorliegende Erfindung soll nicht auf die Zelllinie in der Hinterlegung limitiert sein, da die hinterlegte Ausführungsform nur als eine beispielhafte Illustration eines Aspekts dieser Erfindung dienen soll und irgendeine Zelllinie, die funktionell äquivalent ist, im Bereich dieser Erfindung enthalten ist. Die Hinterlegung von Material ist nicht als Zustimmung aufzufassen, dass die schriftliche Beschreibung, die hier enthalten ist, die Ausführung irgendeinen Aspekts dieser Erfindung nicht ermöglicht, einschließlich der besten Methode darin, noch ist sie dazu gedacht, den Bereich der Erfindung auf die spezifischen Illustrationen, die sie repräsentiert, zu limitieren. Tatsächlich werden verschiedene Abänderungen dieser Erfindung, zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen, dem Fachmann auf seinem Gebiet aus der vorhergegangenen Beschreibung einfallen, diese fallen auch in den Bereich der angehängten Ansprüche. Sequenzauflistung

Claims

Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten in der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Arthritis, diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, einem Hämangiom oder einem soliden Tumor der Brust oder des Kolon, wobei das genannte Medikament eine die Angiogenese inhibierende Menge des genannten α_vβ₃-Antagonisten umfasst.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Medikament für die Behandlung eines Tumors ist und die genannte Angiogenese Tumorangiogenese ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Medikament für die Behandlung von Arthritis ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 3, wobei das genannte Medikament für die Behandlung von rheumatoider Arthritis ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Medikament für die Behandlung von diabetischer Retinopathie oder von Makuladegeneration ist und die genannte Angiogenese retinale Angiogenese ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Medikament für die Behandlung eines Hämangioms ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 2, wobei das genannte Medikament in Verbindung mit Chemotherapie verabreicht werden soll.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei (a) der genannte α_vβ₃-Antagonist ein monoklonaler Antikörper ist und das genannte Medikament verabreicht werden soll, um eine Plasmakonzentration des genannten α_vβ₃-Antagonisten von 1 μg/ml bis 5 μg/ml zur Verfügung zu stellen oder (b) der genannte α_vβ₃-Antagonist ein Polypeptid ist und das genannte Medikament verabreicht werden soll, um eine Plasmakonzentration des genannten α_vβ₃-Antagonisten von 1 μg/ml bis 150 μg/ml zur Verfügung zu stellen.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der genannte α_vβ₃-Antagonist ein Polypeptid ist und das genannte Medikament verabreicht werden soll, um den genannten α_vβ₃-Antagonisten in einer Menge im Bereich von 0,1 mg pro kg bis 300 mg pro kg, in einer oder mehreren Dosisverabreichungen täglich, für einen oder mehrere Tage zur Verfügung zu stellen.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das genannte Medikament in einer Form vorliegt, welche geeignet ist für die intravenöse, transdermale, intrasynoviale, intramuskuläre oder orale Verabreichung.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 7, wobei das genannte Medikament in einer Form vorliegt, welche geeignet ist für eine intravenöse Verabreichung.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der genannte α_vβ₃-Antagonist die Bindung von Fibrinogen an α_vβ₃ inhibiert und wenigstens eine 10-fache IC₅₀-Aktivität beim Inhibieren der Bindung von Fibrinogen an α_vβ₃ im Vergleich zu der IC₅₀-Aktivität beim Inhibieren der Bindung von Fibrinogen an α_IIbβ₃ oder α_vβ₁ aufweist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß einem der Anspreche 1 bis 8, wobei der genannte α_vβ₃-Antagonist ein monoklonaler Antikörper ist, welcher immunspezifisch für α_vβ₃ ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 13, wobei der genannte monoklonale Antikörper humanisiert ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 13, wobei der monoklonale Antikörper LM609 (ATCC HB 9537) ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der genannte α_vβ₃-Antagonist ein RGD-enthaltendes Polypeptid ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 16, wobei das genannte Polypeptid ein cyclisches Peptid ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß Anspruch 17, wobei das genannte Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus c-(GrGDFV) (SEQ ID Nr. 4), c-(RGDfV) (SEQ ID Nr. 5), c-(RGDFv) (SEQ ID Nr. 7) und YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID Nr. 8) und einem Salz davon.
Die Verwendung eines Polypeptidsalzes gemäß Anspruch 18, wobei das genannte Salz ein Hydrochlorid oder Trifluoracetat ist.
Die Verwendung eines α_vβ₃-Antagonisten gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das genannte Medikament für die Behandlung eines humanen Patienten ist.