DE69532970T2 - Sprühgetrocknetes erythropoietin - Google Patents

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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816Erythropoietin [EPO]

Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von sprühgetrocknetem Erythropoietin und dem dadurch hergestellten trockenen Erythropoietin-Pulver.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Erythropoietin (EPO) ist ein Glycoproteinhormon, das in erster Linie in der Niere synthetisiert wird und ein Hauptregulator der Produktion von Erythrozyten im Körper ist. Kommerziell erhältliches menschliches EPO wird vermittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt und ist als rekombinantes menschliches EPO (rhEPO) bekannt. rhEPO weist eine Molekülmasse von etwa 36.000 Dalton auf, wie durch SDS-PAGE bestimmt. Die Molekülmasse des Proteinrückgrates beträgt 18.398 Dalton, was anzeigt, dass das ganze Molekül umfänglich glycosylisiert ist. Die Kohlenhydratseitenketten sind für die biologische in vivo-Aktivität wichtig.
  • Proteine, wie beispielsweise rhEPO, in wässriger Lösung oder in fester Phase in ihrem nativen Zustand zu halten, ist eine große Herausforderung für jene, die auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierungen arbeiten. Die Existenz eines Proteins in seinem nativen Zustand hängt von der Proteinkonzentration, der Temperatur und der Art des Lösungsmittels, Ionenstärke des Puffers etc. ab. Änderungen in einem jeden dieser Parameter können die Stabilität eines Proteins in Lösung oder in fester Phase beeinträchtigen.
  • Kommerzielle Präparate von rhEPO werden derzeit entweder als verdünnte wässrige Lösungen oder in einer lyophilisierten Form verkauft, die verwendet wird, um eine verdünnte wässrige Lösung zu bilden, wobei beide dem Körper durch Injektion zugeführt werden. Die Konzentration von rhEPO in diesen Präparaten ist sehr gering und das rhEPO wird vergleichsweise schnell nach der Verabreichung aus dem Körper entfernt. Infolge dieser Beschränkung der derzeitigen Präparate besteht ein Bedarf für konzentrierte Formulierungen von rhEPO, z. B. für jene, die größere Mengen an rhEPO enthalten, die in alternativen Wirkstoffabgabesystemen verwendet werden können. Wir verwendeten Sprühtrocknungstechniken, um derartige Präparate herzustellen.
  • Das Sprühtrocknen von pharmazeutischen Produkten ist in der Technik bekannt. Siehe z. B. Broadhead, J. et al., „The Spray Drying of Pharmaceuticals", in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11) & (12), 1169–1206 (1992). Neben kleinen Molekülen, die als Pharmazeutika verwendet werden, sind eine Vielzahl von biologischen Materialien sprühgetrocknet worden und diese umfassen: Enzyme, Seren, Plasma, Mikroorganismen und Hefen. Das Sprühtrocknen ist eine nützliche Technik, da es flüssige pharmazeutische Präparate in einem einstufigen Verfahren in feine, staubfreie oder agglomerierte Pulver umwandeln kann. Die Basistechnik umfasst die folgenden vier Schritte:
    • a) Zersprühen der Zufuhrlösung in eine Sprühflüssigkeit;
    • b) Sprühflüssigkeit-Luft-Kontakt;
    • c) Trocknen der Sprühflüssigkeit; und
    • d) Abtrennen des getrockneten Produktes von der Trocknungsluft.
  • Obwohl es auf dem Gebiet der Pharmazeutika bekannt ist, ist das Sprühtrocknen für therapeutische Proteine, wie beispielsweise rhEPO, nicht umfänglich verwendet worden. Ein offensichtlicher Grund dafür sind die Bedenken, dass derartige Proteine thermisch durch die beim Sprühtrocknungsprozess verwendeten hohen Temperaturen abgebaut werden könnten. Dies gilt insbesondere für komplexe Glycoproteine, wie beispielsweise rhEPO, die, zusätzlich zu ihrem Polypeptid-Rückgrat, auch komplex verzweigte Kohlenhydratanteile aufweisen, die für die biologische Aktivität erforderlich sind. Die Verfügbarkeit von Lyophilisierung als eine einfache Alternative brachte die auf dem Gebiet Tätigen noch weiter davon ab, Sprühtrocknung für pharmazeutische Proteine zu verwenden. Das Sprühtrocknen geht jedoch mit Vorteilen gegenüber der Lyophilisierung insoweit einher, als dass es ökonomischer ist, schneller und leichter im Maßstab zu vergrößern ist. Außerdem sind sprühgetrocknete Pulver oft dem weiteren Verarbeiten zugänglicher als lyophilisierte Pulver.
  • Es ist üblicherweise nicht praktisch, Formulierungen nur basierend auf der Lyophilisierung des Rohwirkstoffes zu konzipieren. Dies ist so, weil viele Peptide vergleichsweise instabil sind, wenn sie in niedrigen Konzentrationen lyophilisiert sind und sie an die Produktverpackung adsorbieren können und an Aktivität verlieren. Um diese Probleme zu vermeiden, vertrauen viele lyophilisierte pharmazeutische Zusammensetzungen auf die Verwendung von festen Verdünnungsmitteln, Kryoschutzmitteln oder Füllstoffen, um die Menge an während des Lyophilisierungsverfahrens vorhandenen Feststoffen zu erhöhen. Als ein Ergebnis enthält das lyophilisierte Material einen geringen Prozentsatz (w/w) des aktiven Wirkstoffes gemischt mit einem größeren Prozentsatz von anderen festen Materialien.
  • Im Gegensatz dazu liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines rhEPO-Pulvers aus rhEPO-Rohwirkstoff, wobei das Pulver reines oder im Wesentlichen reines rhEPO ist oder einen höheren Prozentsatz (w/w) von rhEPO aufweist als unter Verwendung herkömmlicher Lyophilisierungstechniken hergestellt werden kann.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen von stabilem, sprühgetrocknetem rhEPO und das dadurch hergestellte rhEPO-Pulver bereit.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst zuerst das Bereitstellen einer wässrigen Lösung von rhEPO mit einer Konzentration innerhalb des Bereichs von etwa 20 mg/ml bis etwa 100 mg/ml. Diese Lösung wird dann in eine Sprühflüssigkeit zersprüht und die Sprühflüssigkeit wird mit Heißluft getrocknet, um das Wasser aus der Sprühflüssigkeit zu verdampfen. Das dadurch hergestellte getrocknete rhEPO wird dann von der Trocknungsluft entfernt.
  • Die anfängliche wässrige Lösung kann, zusätzlich zu rhEPO, Bindemittel wie beispielsweise Mannitol, Glycin und/oder ein oberflächenaktives Mittel enthalten. Die getrocknete rhEPO-Zusammensetzung, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, umfasst rhEPO in einer Konzentration im Bereich von 4,0% bis 100% (w/w) und weist einen Restfeuchtegehalt innerhalb des Bereichs von etwa 3% bis etwa 5% (w/w) auf. Die Größe der Partikel der Zusammensetzung ist innerhalb des Bereichs von etwa 2,0 μm bis etwa 6,0 μm.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Eine konzentrierte rhEPO-Lösung mit wenigstens 20 mg/ml wurde für das Sprühtrocknen verwendet. Die konzentrierte wässrige Lösung wurde in feine Tröpfchen zersprüht, indem sie mit Druckluft durch eine Düse gepumpt wurde. Die Tröpfchen traten dann in eine Trockenkammer ein und das Wasser wurde verdampft durch die heiße Trocknungsluft, die im Gleichstrom mit der Zufuhrlösung strömte. Während das Wasser verdampfte, trennte sich das feste rhEPO und, sofern vorhanden, die Bindemittel von den wässrigen Tröpfchen. Das getrocknete rhEPO wurde durch den Trocknungsluftstrom in einen Zyklonabscheider zum Klären getragen, d. h. das getrocknete rhEPO wurde von der Trocknungsluft abgetrennt und das getrocknete Produkt wurde in dem Sammelgefäß gesammelt, das am Boden des Zyklonabscheiders angebracht war. Die Trocknungsluft wurde dann durch einen Feingutwäscher in die Atmosphäre ausgestoßen.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „rhEPO" ein jegliches Protein, das das vollständige oder einen Teil des Polypeptidrückgrates aufweist, wie es für rhEPO in US 4,703,008 beschrieben ist, und das die biologische Eigenschaft aufweist, Knochenmarkszellen zu veranlassen, die Produkten von Retikulozyten und Erythrozyten und die Hämoglobinsynthese oder Eisenaufnahme zu erhöhen. Es wird ins Auge gefasst, dass biologisch aktive Fragmente, Analoga oder chemisch synthetisierte Derivate von EPO in der vorliegenden Erfindung anstelle von rhEPO verwendet werden können, vorausgesetzt, dass derartige Fragmente oder Derivate die biologische Aktivität von rhEPO beibehalten. Bestimmte EPO-Analoga sind in US 4,703,008 beschrieben. Deshalb wird die Verwendung derartiger biologisch aktiver EPO-Analoga, Fragmente oder Derivate als im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten betrachtet.
  • Die durch die vorliegende Erfindung produzierten konzentrierten rhEPO-Pulver können in alternativen Wirkstoffabgabesystemen verwendet werden, um das rhEPO abzugeben. Ein derartiges System ist ein Abgabesystem mit kontrollierter Freigabe, das rhEPO mit einer vorher bestimmten Geschwindigkeit für eine bestimmte Zeitspanne in den Körper abgibt. Alternativ können die konzentrierten rhEPO-Pulver mit Wasser zur Injektion oder normaler Saline rekonstruiert werden, um wässrige Lösungen zu bilden, die für die humantherapeutische Anwendung geeignet sind. Es wird ins Auge gefasst, dass die oben erwähnten kontrollierten Freisetzungssysteme rhEPO enthalten, das in einem Polymermaterial, Vesikel oder einer Miniaturpumpe plaziert ist, ebenso wie makromolekulare Konjugate von rhEPO und anderen Polymermaterialien. Diese Systeme können dann als subdermale Reservoirimplantate aus konzentriertem rhEPO verwendet werden. Nicht beschränkende Beispiele für derartige Systeme umfassen Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die das rhEPO umgeben, wie beispielsweise nicht-abbaubare Ethylen- Vinylacetat-Copolymere oder abbaubare Milchsäure-Glycolsäure-Copolymere. Derartige hydrophobe Polymere können zusätzlich die Form von Mikrosphären einnehmen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt stabile rhEPO-Pulver bereit. Wie hierin verwendet, bedeutet „stabil", dass das rhEPO seine biologische Aktivität über die Zeit aufrechterhält und seine Struktur in seinem nativen Zustand beibehalten wird, d. h. es wird nicht oxidiert oder anderweitig in eine andere chemische Spezies umgewandelt. Die Stabilität kann durch RIA, Western Blot und in vivo oder in vitro Bioassays bewiesen werden.
  • Die folgenden Beispiele werden angeführt, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen. Die Erfindung soll nicht durch diese Beispiele, sondern lediglich durch die beigefügten Ansprüche als beschränkt erachtet werden.
  • BEISPIEL 1
  • SPRÜHTROCKNUNGSPROZESS FÜR rhEPO
  • Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Sprühtrocknen, das verwendet wird, um amorphes rhEPO ausschließlich in fester Form oder in Verbindung mit inerten, pharmazeutisch akzeptablen Bindemitteln herzustellen. Der solchermaßen formulierte amorphe rhEPO-Rohwirkstoff ist für wenigstens sechs Monate bei 5°C Lagerung (Kühlschrank) stabil. Die derzeitige Literatur, die Sprühtrocknung von therapeutischen Proteinen beschreibt, ist beschränkt und diskutiert die Stabilität von therapeutischen Proteinen in der getrockneten Form bei höheren Konzentrationen, wie beispielsweise 25% (w/w) und größer, nicht. Siehe, z. B., Mumenthaler, et al., Pharm. Res. 11: 12–20 (1994). Weiterhin liefert die derzeitige Literatur keinen ausreichenden Beweis für die Stabilität dieser Proteine in der festen Form. Tatsächlich zeigen einige Literaturstellen eine nicht zufriedenstellende Stabilität, die den Bindemitteln oder den Verarbeitungsbedingungen, die verwendet wurden, zugeschrieben werden können. Zum Beispiel ist bekannt, dass bestimmte anorganische Salze, Aminosäuren, oberflächenaktive Mittel etc. Proteine in Lösung stabilisieren. Die Anwesenheit bestimmter Citratsalze in rhEPO-Rohwirkstoff ergab kein stabiles sprühgetrocknetes rhEPO. Deshalb wurde der rhEPO-Rohwirkstoff vor dem Sprühtrocknen in Wasser für Injektionszwecke dialysiert. Um eine zufriedenstellende Ausbeute des Produktes nach dem Sprühtrocknen zu erhalten, wurde die Dialyse fortgesetzt, bis die Konzentration des rhEPO innerhalb des Bereichs von 20–100 mg/ml lag. Diese konzentrierten Lösungen von rhEPO-Rohwirkstoff in Wasser für Injektionszwecke zeigten nach Lagerung bei 5°C für wenigstens sechs Monate eine zufriedenstellende Stabilität. Eine alternative Technik zum Herstellen von trockenen Proteinen, nämlich Gefriertrocknen, war für rhEPO infolge seiner geringen Stabilität nicht geeignet, unabhängig von der Anwesenheit von Citratsalzen (siehe Beispiel 2).
  • Das Verfahren zum Herstellen von festem rhEPO und rhEPO-Pulver mit Bindemitteln bestand aus den zwei Schritten:
    • A. Dialyse und Konzentrieren von rhEPO-Rohwirkstoff; und
    • B. Sprühtrocknen des dialysierten rhEPO-Rohwirkstoffes.
  • A. Dialyse und Konzentrierung
  • rhEPO-Rohwirkstoff, der in 20 mM Citratpuffer bereitgestellt war, wurde dialysiert, um das gesamte Citrat zu entfernen, und durch Wasser für Injektionszwecke ersetzt. Die Dialyse wurde wie folgt durchgeführt:
  • rhEPO-Rohwirkstoff, (200 ml) in Citratpuffer (ungefähre Konzentration 2,0 mg/ml) wurde in einem Amicon®-Dialysator aufgenommen, der mit einer Dialysemembran mit einem Cut-off-Molekulargewicht von 10.000 versehen war. Diese Dialysezelle wurde an einem Gefäß aus rostfreiem Stahl angebracht, das Wasser für Injektionszwecke enthielt, und das Gefäß wurde mit einem Stickstoff-Gastank verbunden. Die Dialyse wurde bei 30–40 psi durchgeführt und fortgesetzt, bis wenigstens 2000 ml Dialysat gesammelt waren. Die sich ergebende wässrige Lösung von rhEPO, frei von jeglichem Citrat, wurde dann auf eine Endkonzentration von etwa 20 bis etwa 100 mg/ml rhEPO konzentriert. Die resultierende konzentrierte wässrige Lösung von rhEPO wurde dann bei 5°C gelagert, bis sie sprühgetrocknet wurde. Die konzentrierten rhEPO-Lösungen wurden auch hinsichtlich rhEPO-Stabilität bei 5°C überwacht.
  • B. Sprühtrocknung
  • Das Sprühtrocknungsverfahren bestand aus den folgenden Schritten:
    • 1. Zersprühen der Zufuhrlösung;
    • 2. Sprühflüssigkeit-Luft-Kontakt;
    • 3. Verdampfen des Lösungsmittels;
    • 4. Klären des getrockneten Feststoffes von den Trocknungsgasen. Ein Labormaßstabs-Sprühtrockner (Buchi®, Modell 190) wurde bei diesem Verfahren verwendet.
  • 1. Zersprühen
  • Wässrige rhEPO-Lösung wurde der Düse des Zersprühers (0,5 mm I. D.) bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Peristaltikpumpe zugeführt. Der flüssige Zustrom wurde durch Hochdruckluft in kleine Tröpfchen zersprüht. Eine derartige Zersprühung kann auch unter Verwendung einer rotierenden Scheibe erreicht werden.
  • 2. Sprühflüssigkeit-Luft-Kontakt und Verdampfen
  • Während die Tröpfchen in die Verdampfungskammer (105 mm I. D. × 450 mm L) eintraten, wurde das Wasser verdampft, indem heiße Trocknungsluft in gleicher Richtung strömte. Die Temperatur der Trocknungsluft schwankte von 64–80°C. Während das Wasser verdampfte, trennte sich der Feststoff aus der flüssigen Lösung in der Form von Kugeln oder Halbkugeln ab. Das Trocknen kann auch durch Gegenstromtechniken durchgeführt werden, wo der Trocknungsluftstrom und der Zufuhrlösungsstrom in entgegengesetzten Richtungen geführt werden.
  • 3. Klären
  • Das getrocknete Pulver wurde durch den Trocknungsluftstrom in einen Zyklonabscheider zum Klären getragen. Im Zyklonabscheider wurde die getrocknete Feststoffmasse von der Trocknungsluft abgetrennt. Das getrocknete Produkt wurde in einem Sammelgefäß gesammelt, das am Boden des Zyklonabscheiders angebracht war. Die Trocknungsluft (ohne das getrocknete Produkt) wurde durch einen Feingutwäscher in die Atmosphäre geblasen.
  • C. Chemische Charakterisierung
  • Eine bekannte Menge des sprühgetrockneten rhEPO wurde in Wasser für Injektionszwecke gelöst. Diese wässrige Lösung wurde dann wie folgt analysiert:
  • 1. Radioimmunoassay (RIA)
  • Das verwendete Verfahren war das von Egrie et al., J. Immunol. Meth., 99: 235–241, (1987). Dieses Verfahren besteht aus dem Komplexieren von rhEPO mit polyklonalem Kaninchenantikörper (gegen rhEPO gerichtet). Dies wurde erreicht durch Inkubieren von rhEPO mit dem polyklonalen Kaninchenantikörper über Nacht bei Kühlschranktemperatur. Die Inkubation wurde nach Zugabe von 125I-EPO für einen weiteren zusätzlichen Tag unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt. Der Antigen-Antikörper-Komplex wurde durch Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper, normales Kaninchenserum und Polyethylenglycol präzipitiert. Der präzipitierte Komplex wurde gewaschen und die Menge an gebundenem 125I-EPO unter Verwendung eines γ-Zählers bestimmt. Das Verfahren wurde für Standard-rhEPO-Lösungen mit bekannten Konzentrationen und Testprobenlösungen wiederholt. rhEPO-Konzentrationen der Testproben wurden berechnet durch Vergleich der γ-Zähler-Ablesungen mit jenen von Standard-rhEPO-Lösungen.
  • 2. Western Blot
  • Das verwendete Verfahren war jenes, das von Egrie et al. in Immunobiol. 172: 213–224 (1986) beschrieben worden ist. Ein Aliquot von 0,5 μg denaturiertem rhEPO wurde auf ein Standard (12,5%) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) geladen. Elektrophorese wurde durchgeführt und das Gel wurde auf eine Nitrozellulosemembran unter Verwendung eines Transferpuffers geblottet, der aus TRIS, Glycin und Methanol bestand. Diese Nitrozellulosemembran wurde mit 5% fettfreier Milch in TRIS-gepufferter Saline geblockt. Der geblockte Nitrozelluloseblot, der rhEPO enthielt, wurde dann mit monoklonalem Maus-anti-Human-Antikörper konjugiert, gefolgt von polyklonalem Ziegen-anti-Maus-Antikörper. Dieser Komplex wurde dann unter Verwendung eines Substratkits für ein Konjugat aus alkalischer Phosphatase verwendet. Ein jeder Blot enthielt ein Standard-rhEPO, Standard-rhEPO enthaltend eine bekannte Menge von rhEPO-Aggregaten, und Testprobe(n). Die Intensität des rhEPO-Standards und der Aggregatsstandard wurden mit den Testproben verglichen.
  • 3. Maus-Bioassay
  • Eine bekannte Menge von sprühgetrocknetem rhEPO wurde in Wasser für Injektionszwecke rekonstituiert. Die biologische Aktivität dieser Lösung wurde durch Überwachen der Einbaugeschwindigkeit von Eisen in exhypoxischen Mäusen nach Injektion der rhEPO-Lösung gemessen. Das verwendete Verfahren war jenes von Cotes et al., Nature, 191: 1065–1067 (1961).
  • TABELLE 1 Formulierungsbeispiele
    Figure 00090001
  • Beachte
  • WFI
    Wasser für Injektionszwecke
  • Formulierung II wurde bei zwei unterschiedlichen Einlasstemperaturen von 64 und 80°C getrocknet.
  • Fünf Lösungen, eine zu einer Zeit, wurden hergestellt durch Auflösen von Bindemitteln wie beispielsweise Mannitol, Glycin und/oder Tween®80 in konzentrierten Lösungen von rhEPO unter mildem Rühren. Im Falle der Formulierung III wurden keine Bindemittel hinzugegeben. Die Formulierungen für diese Lösungen sind oben in Tabelle 1 angegeben. Alle diese Lösungen wurden gemäß den Sprühtrocknungsparametern sprühgetrocknet, die wie folgt aufgelistet sind:
    Lösungszuführungsgeschwindigkeit: 1 ml/Min
    Luftzerstäubungsgeschwindigkeit: 600–700 Normliter/h
    Trocknungsluftgeschwindigkeit: 32.000–45.000 l/h
    Einlasstemperatur: 64–80°C
    Auslasstemperatur: 46–65°C
  • Nach dem Sprühtrocknen betrug der Endgehalt an festem rhEPO für die Formulierungen I und II etwa 4% w/w, für Formulierung III 100% w/w und für Formulierungen IV und V 25% w/w rhEPO. Der Restfeuchtegehalt schwankte von 3,0% bis 5,0% (w/w), wie durch das Verfahren nach Karl-Fisher bestimmt (USP XX III-NF XVII, S. 1840–1843, Verfahren 1a (1995)). Die Partikelgröße betrug 4,1 μm ± 1,89 für sprühgetrocknete Formulierung III.
  • Vorläufige Experimente unter Verwendung von rhEPO-Rohwirkstoff enthaltend Citratpuffer ergaben kein stabiles sprühgetrocknetes rhEPO mit Mannitol, Glycin und/oder Tween®80. Deshalb war die Dialyse des rhEPO-Rohwirkstoffes für das Sprühtrocknen essentiell, um Citratsalze zu entfernen. Um eine gute Ausbeute nach Sprühtrocknung zu erhalten, musste die Zufuhrlösung einen Feststoffgehalt von wenigstens 2% aufweisen. Deshalb wurde die dialysierte rhEPO-Lösung auf 20–100 mg/ml konzentriert.
  • Es wurde durch Vergleich von Stabilitätsdaten von Formulierungen I und II und Formulierungen IV und V bestimmt, dass Tween®80 nicht erforderlich war, um stabiles sprühgetrocknetes rhEPO zu erzeugen. Auch legen die Sechs-Monats-Stabilitätsdaten von reinem rhEPO nahe, dass Mannitol und/oder Glycin für das Herstellen von stabilem sprühgetrocknetem rhEPO nicht notwendig sind. Wenn sie verwendet werden, scheinen somit Mannitol und Glycin lediglich als Füllstoffe (als isotonische/isoosmotische Einstellagenzien) zu dienen, die verwendet werden können, um die rhEPO-Konzentration in der letztendlichen sprühgetrockneten rhEPO-Formulierung zu ändern.
  • Das sprühgetrocknete rhEPO der vorliegenden Erfindung weist gegenüber lyophilisiertem rhEPO Vorteile auf. Zum Vergleich wurden Formulierungen I, II und III ebenfalls lyophilisiert (siehe Beispiel 2). RIA-Daten für die für zwei Monate bei 5°C gelagerten lyophilisierten Proben reichten jedoch von 73–78% der Etikettenangabe (LC). Diese niedrigen EPO-Wirksamkeitswerte (wie durch RIA bestimmt) bei einer so kurzen Lagerzeit zeigen eine Instabilität an. Auch zeigten die lyophilisierten Sechs-Monats-Proben nach Rekonstitution mehr als 2% EPO-Aggregate auf SDS-PAGE. Dies zeigt die Instabilität des rekonstituierten rhEPO an. Somit waren sprühgetrocknete Formulierungen stabiler als gefriergetrocknete Formulierungen der selben Zusammensetzung.
  • Stabilitätstabellen der sprühgetrockneten Formulierungen mit den Nummern III und IV, wie oben angegeben, sind unten angeführt. In beiden Fällen wurden die Proben bei 5°C gelagert und die Gegenwart von rhEPO mit weniger als 2% Aggregaten wurde bei einer jeden Messung vermittels Western Blot-Analyse bestätigt.
  • TABELLE 2 Stabilitätsdaten für Formulierung #4
    Figure 00110001
  • TABELLE 3 Stabilitätsdaten für Formulierung #3
    Figure 00110002
  • BEISPIEL 2
  • LYOPHILISIERUNGSVERFAHREN FÜR EPO
  • Das Verfahren beschreibt ein Lyophilisierungsverfahren, das verwendet wurde, um getrocknetes rhEPO in reiner Form herzustellen oder mit einer Kombination aus pharmazeutisch akzeptablen Bindemitteln. Die Stabilität des rhEPO, das lyophilisiert wurde, wurde bestimmt und die Ergebnisse sind unten angegeben. Alle rhEPO-Formulierungen, die in diesem Beispiel verwendet wurden, wurden auch wie oben beschrieben sprühgetrocknet. Die RIA- und Western Blot-Verfahren wurden im Wesentlichen durchgeführt, wie oben für das sprühgetrocknete rhEPO-Beispiel beschrieben.
  • Ein typischer Lyophilisierungszyklus zum Gefriertrocknen von rhEPO-Lösungen ohne Bindemittel begann damit, dass die Lösung auf etwa –40°C eingefroren und bei dieser Temperatur für etwa drei Stunden gehalten wurde, um zu gewährleisten, dass die Lösung vollständig gefroren war. Als die Lösung gefroren war, wurde die Kühlertemperatur auf etwa –50°C abgesenkt. Die erste Trocknung wurde durchgeführt, indem der Druck in der Trocknungskammer auf etwa 200 mTorr abgesenkt wurde und man erlaubte, dass sich das System für etwa drei Stunden stabilisierte. Die Temperatur wurde dann auf etwa –30°C mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,1°C/Minute erhöht. Das Trocknen (durch Sublimieren von Eis zu Wasserdampf) wurde für etwa 60 Stunden fortgesetzt. Ein zweites Trocknen wurde durchgeführt, indem die Temperatur des Produktes auf etwa 15°C bei einer Geschwindigkeit von etwa 0,5°C/Minute erhöht wurde. Der Druck in der Trocknungskammer wurde weiter von etwa 200 mTorr auf etwa 100 mTorr verringert. Die zweite Trocknungsphase wurde für etwa 16 Stunden fortgesetzt, um ein vollständiges Trocknen zu gewährleisten. Nach dem zweiten Trocknen wurden die Glasfläschchen mit einer Kappe versehen und versiegelt. Die versiegelten Glasfläschchen wurden bei etwa 5°C gespeichert, bevor sie für die unten beschriebene Stabilitätsuntersuchung entnommen wurden. Für die Stabilitätsuntersuchung wurden die Inhalte des Glasfläschchens mit Wasser rekonstituiert und durch RIA und Western Blot analysiert. Die Ergebnisse des Stabilitätstests wurden als ein Prozentsatz des verbliebenen rhEPO zusammengestellt. Geringere Prozentsätze von verbleibendem rhEPO zeigen eine geringe Stabilität an. Western Blot-Ergebnisse bestimmen, ob rhEPO in einer aktiven Form vorliegt oder in einer denaturierten, aggregierten Form. Proben von rhEPO, die verglichen mit einem 2% aggregierten rhEPO-Standard mehr als 2% Aggregate aufweisen, werden als eine geringe Stabilität aufweisend bestimmt. Die Ergebnisse der an lyophilisiertem rhEPO in verschiedenen Formulierungen durchgeführten Stabilitätstests sind in Tabelle IV dargestellt.
  • TABELLE 4 Stabilität als % der Etikettenangabe von EPO in gefriergetrockneter Formulierung bei 5°C
    Figure 00130001
  • Die in Tabelle 4 gezeigten Daten belegen, dass lyophilisiertes rhEPO nicht so stabil bleibt wie sprühgetrocknetes rhEPO. Deshalb liefert Sprühtrocknen von rhEPO ein stabileres Produkt verglichen mit Lyophilisierung. Die vorliegende Erfindung stellt deshalb ein stabiles sprühgetrocknetes rhEPO bereit, welches hergestellt werden kann ohne das Hinzufügen von irgendwelchen Bindemitteln oder Stabilisatoren, wie beispielsweise Cyclodextrin, Glycin, Mannitol oder Tween 80. Eine Bindemittel-freies Präparat von rhEPO ist für bestimmte Wirkstoffabgabesysteme wünschenswert, wie beispielsweise Abgabe über die pulmonare Route, die üblicherweise erfordert, dass der Wirkstoff von Bindemitteln so frei wie möglich ist.
  • Die Erfindung ist unter Bezugnahme auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Beispiele beschrieben worden. Da offensichtliche Variationen den Fachleuten auf dem Gebiet einfallen werden, soll die Erfindung nicht darauf, sondern nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt verstanden werden.

Claims (14)

  1. Verfahren zum Herstellen von sprühgetrocknetem rhEPO, Fragmenten, Analoga oder chemisch synthetisierten Derivaten davon, umfassend: (a) Bereitstellen einer wässrigen Lösung von rhEPO, Fragmenten, Analoga oder chemisch synthetisierten Derivaten davon, mit einer Konzentration innerhalb des Bereichs von 20 mg/ml bis 100 mg/ml; (b) Zersprühen der Lösung in eine Sprühflüssigkeit; (c) Trocknen der Sprühflüssigkeit mit heißer Trocknungsluft, um das Wasser aus der Sprühflüssigkeit zu verdampfen; und (d) Abtrennen des getrockneten rhEPO, der Fragmente, Analoga oder chemisch synthetisierten Derivaten davon, von der Trocknungsluft; wobei das rhEPO, die Fragmente, Analoga oder chemisch synthetisierten Derivate davon, die biologische Eigenschaft besitzen Knochenmarkszellen zu veranlassen, die Herstellung von Retikulozyten und Erythrozyten zu erhöhen und die Hämoglobinsynthese oder Eisenaufnahme zu erhöhen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Lösung von rhEPO, Fragmenten, Analoga oder chemisch synthetisierten Derivaten davon, kein Salz oder andere Zusatzstoffe enthält.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Lösung dialysiert wird, um Salze vor Schritt (b) zu entfernen.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung zersprüht wird, indem sie in eine Düse unter Druck eingespeist wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sprühflüssigkeit und die Trocknungsluft in der gleichen Richtung durch den Trockner geführt werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das getrocknete rhEPO, Fragmente, Analoga oder chemisch synthetisierte Derivate davon, in einem Zyklonabscheider abgetrennt werden.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Trocknung in einem Temperaturbereich von 60°C bis 85°C durchgeführt wird.
  8. Getrocknetes rhEPO, wobei das getrocknete rhEPO weniger als 2% Aggregate nach 6-monatiger Lagerung bei 5°C aufweist.
  9. rhEPO nach Anspruch 8, welches 100% EPO (Gew./Gew.) ist.
  10. Sprühgetrocknetes rekombinantes menschliches Erythropoietin (rhEPO), das die folgende Formulierung aufweist: Bestandteil % (Gew./Gew.) a) rhEPO 25 b) Mannitol 37,5 c) Glycin 37,5
    wobei das sprühgetrocknete rhEPO durch das Verfahren nach Anspruch 1 erhalten worden ist.
  11. rhEPO nach Anspruch 10, das zusätzlich ein oberflächenaktives Mittel enthält.
  12. Sprühgetrocknete rhEPO-Zusammensetzung umfassend rhEPO in einer Konzentration innerhalb des Bereichs von 4,0% bis 100% (Gew./Gew.) und mit einem Restfeuchtegehalt innerhalb des Bereichs von 3,0% bis 5,0% (Gew./Gew.), wobei die rhEPO-Zusammensetzung durch das Verfahren nach Anspruch 1 erhalten worden ist.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Größe der Partikel innerhalb des Bereiches von 2,0 μm bis 6,0 μm ist.
  14. Sprühgetrocknetes rhEPO-Pulver, das im wesentlichen aus rhEPO besteht, wobei das rhEPO-Pulver durch das Verfahren nach Anspruch 1 erhalten worden ist.
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