DE69534855T2

DE69534855T2 - Enzymaktive dna moleküle

Info

Publication number: DE69534855T2
Application number: DE69534855T
Authority: DE
Inventors: Gerald F. Encinitas JOYCE; Ronald R. San Diego BREAKER
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1994-12-02
Filing date: 1995-12-01
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2015-12-02
Also published as: RU2220204C2; EP0792375A4; JP2007105047A; FI972333A0; EP0792375B1; CA2205382A1; CN1254547C; JP2006136333A; EP0792375A1; FI972333A; US5807718A; US6326174B1; JPH10510165A; ATE319854T1; JP4001624B2; DE69534855D1; EP0792375B9; WO1996017086A1; NO972483D0; AU4595096A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäureenzyme oder katalytische (enzymatisch aktive) DNA-Moleküle, welche in der Lage sind, andere Nukleinsäuremoleküle, insbesondere RNA, zu spalten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, welche die offenbarten enzymatisch aktiven DNA-Moleküle enthalten, und Verfahren der Herstellung und Verwendung solcher Enzyme und Zusammensetzungen.
HINTERGRUND
Der Bedarf an Katalysatoren, die außerhalb ihres nativen Umfelds arbeiten oder Reaktionen katalysieren, die nicht in der Natur vorkommen, hat zur Entwicklung der Technologie der „Enzymtechnik" geführt. Die übliche Weg, der bei der Enzymtechnik eingeschlagen wird, ist ein Ansatz der „rationalen Konzeption", der auf dem Verständnis natürlicher Enzyme basiert, um die Konstruktion neuer Enzyme zu unterstützen. Leider sind die Kenntnisse in den Gebieten der Proteinstruktur und – chemie nicht ausreichend, um die Herstellung neuer biologischer Katalysatoren zur Routine zu machen.
Unlängst wurde ein anderer Ansatz zur Entwicklung neuer Katalysatoren angewendet. Dieses Verfahren umfasst die Herstellung eines heterogenen Pools aus Makromolekülen und die Anwendung eines in-vitro-Selektionsverfahrens, um Moleküle, welche die gewünschte Reaktion katalysieren, aus diesem Pool auszuwählen. Die Selektion von Katalysatoren aus einem Pool von Makromolekülen ist nicht von einem umfassenden Verständnis ihrer strukturellen und chemischen Eigenschaften abhängig. Entsprechend wurde dieses Verfahren „irrationale Konzeption" genannt (Brenner and Lerner, PNAS USA 89: 5381–5383 (1992)).
Die meisten Bemühungen, die bis heute der rationalen Konzeption von enzymatisch aktiven RNA-Molekülen oder Ribozymen galten, haben nicht zu Molekülen mit fundamental neuen oder verbesserten katalytischen Funktionen geführt. Die Anwendung der irrationalen Konzeptionsverfahren durch einen Prozess, den wir als „gerichtete molekulare Evolution" oder „in-vitro-Evolution" beschrieben haben, und welcher nach dem Muster der Darwinschen Evolution von Organismen in der Natur abläuft, hat jedoch das Potenzial, zur Herstellung von DNA-Molekülen zu führen, welche gewünschte funktionale Eigenschaften haben.
Diese Technik wurde mit unterschiedlichem Erfolg auf RNA-Moleküle in Lösung (vgl. z. B. Mills et al., PNAS USA 58: 217 (1967), Green, et al., Nature 347: 406 (1990); Chowrira et al., Nature 354: 320 (1991), Joyce, Gene 82: 83 (1989), Beaudry und Joyce, Science 257: 635–641 (1992), Robertson and Joyce, Nature 344: 467 (1990)) sowie auf RNAs, die an einen Liganden gebunden sind, der an einen festen Untergrund gebunden ist (Tuerk et al., Science 249: 505 (1990), Ellington et al., Nature 346: 818 (1990)) angewendet. Sie wurde auch auf Peptide, die direkt an einen festen Untergrund gebunden waren (Lam, et al., Nature 354: 82 (1991)), und auf Peptidepitope, die innerhalb eines viralen Hüllprotein exprimiert wurden (Scott et al., Science 249: 386 (1990), Devlin et al., Science 249: 249 (1990), Cwirla et al., PNAS USA 87: 6378 (1990)), angewendet.
Es ist mehr als ein Jahrzehnt her, dass die katalytische RNA entdeckt wurde (Kruger et al., Cell 31: 147–157 (1982), Guerrier-Takada et al., Cell 35: 849–857 (1983)). Die Liste der bekannten, natürlich vorkommenden Ribozyme wächst weiter (vgl. Cech in The RNA World, Gesteland & Atkins (Hrsg.), S. 239–269, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1993), Pyle, Science 261: 709–714 (1993), Symons, Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 322–330 (1994)) und wurde in den letzten Jahren durch synthetische, durch in vitro-Evolution erhaltene Ribozyme erweitert. (Vgl. z. B. Joyce, Curr. Opin. Struct. Biol. 4, 331–336 (1994), Breaker & Joyce, Trends Biotech. 12: 268–275 (1994), Chapman & Szostak, Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 618–622 (1994).)
Yang et al., Biochemistry 31, 5005–5009 (1992), haben die minimalen Ribonukleotid-Anforderungen von Hammerkopf-Ribozymen untersucht und kamen zu dem Schluss, dass ein überwiegend aus DNA bestehendes Analog eines ausschließlich aus RNA bestehenden Ribozyms einige kritische Ribonukleotidreste im aktiven Zentrum benötigt, um die endonukleolytische Aktivität zu bewahren.
Es erscheint vernünftig, anzunehmen, dass auch DNA katalytische Aktivität haben kann, wenn man bedenkt, dass sie zum größten Teil dieselben funktionellen Gruppen wie RNA enthält. Mit Ausnahme bestimmter viraler Genome und Replikationszwischenprodukte tritt jedoch beinahe die gesamte DNA in biologischen Organismen als vollständiger Doppelstrang auf, was verhindert, dass sie eine komplexe Sekundär- und Tertiärstruktur annimmt. Es ist daher nicht überraschend, dass DNA-Enzyme nicht in der Natur gefunden wurden.
Chartraud et al. postulieren und beschreiben ein katalytisches DNA-Molekül in RNA Processing, Band 77, Mai 1994, XP002119603; es werden jedoch sehr wenige Details bereitgestellt.
Bis zum Aufkommen der vorliegenden Erfindung wurde die Konzeption, die Synthese und die Verwendung von katalytischen DNA-Molekülen mit Nukleotid spaltenden Fähigkeiten nicht offenbart oder gezeigt. Daher sind die hier offenbarten Entdeckungen und Erfindungen besonders dahingehend von Bedeutung, dass sie das Potenzial der in-vitro-Evolution als ein Mittel der zunehmend effizienteren Gestaltung katalytischer Moleküle, einschließlich enzymatisch aktiver DNA-Moleküle, welche andere Nukleinsäuren, insbesondere RNA, spalten, hervorheben.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung zieht daher ein synthetisches oder verändertes (d. h. nicht natürlicherweise vorkommendes) katalytisches DNA-Molekül (oder enzymatisch aktives DNA-Molekül), das in der Lage ist, eine Substrat-Nukleinsäure (NA)-Sequenz an einer definierten Spaltstelle zu spalten, in Betracht. Die Erfindung zieht auch ein enzymatisch aktives DNA-Molekül mit einer Endonukleaseaktivität in Betracht.
In einer bevorzugten Variation ist die Endonukleaseaktivität spezifisch für eine Nukleotidsequenz, welche eine Spaltstelle definiert, die eine einzelsträngige Nukleinsäure in einer Substrat-Nukleinsäuresequenz umfasst. In einer anderen bevorzugten Variation ist die Spaltstelle eine doppelsträngige Nukleinsäure. In ähnlicher Weise können Substrat-Nukleinsäuresequenzen einzelsträngig, doppelsträngig, teilweise einzel- oder doppelsträngig, mit einer Schleife oder eine beliebige Kombination davon sein.
In einer anderen in Betracht gezogenen Ausführungsform umfasst die Substrat-Nukleinsäure ein oder mehrere Nukleotidanaloga. In einer Variation ist die Substrat-Nukleinsäuresequenz ein Teil eines größeren Moleküls oder daran angebunden.
In verschiedenen Ausführungsformen wird das größere Molekül aus einer Gruppe, bestehend aus RNA, modifizierter RNA, DNA, modifizierter DNA, Nukleotidanaloga oder Gemischen davon, ausgewählt. In einem anderen Beispiel umfasst das größere Molekül eine Zusammensetzung aus einer Nukleinsäuresequenz und einer nicht aus Nukleinsäure bestehenden Sequenz.
In einer anderen Ausführungsform zieht die Erfindung in Betracht, dass eine Substrat-Nukleinsäuresequenz ein Nukleotidanalog oder mehrere Nukleotidanaloga umfasst. Eine weitere Variation zieht in Betracht, dass die einzelsträngige Nukleinsäure RNA, DNA, modifizierte RNA, modifizierte DNA, ein Nukleotidanalog oder mehrere Nukleotidanaloga oder eine beliebige Zusammensetzung davon sein kann. In einer Ausführungsform der offenbarten Erfindung umfasst die Endonukleaseaktivität die hydrolytische Spaltung einer Phosphoresterbindung an der Spaltstelle.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen katalytischen DNA-Moleküle ganz oder teilweise einzelsträngig. Diese katalytischen DNA-Moleküle können vorzugsweise eine Vielzahl von Formen annehmen, die mit ihrer katalytischen Aktivität konsistent sind. Daher umfasst in einer Variation ein erfindungsgemäßes katalytisches DNA-Molekül eine oder mehrere Haarnadelschleifenstrukturen. In noch einer anderen Variation kann ein katalytisches DNA-Molekül eine Form annehmen, die ähnlich zu „Hammerkopf"-Ribozymen ist. In noch anderen Ausführungsformen kann ein katalytisches DNA-Molekül eine Konformation annehmen, die ähnlich zu der von Ribozymen aus Tetrahymena thermophila ist, d. h. solche, die aus Introns der Gruppe I abgeleitet sind.
In ähnlicher Weise sind die bevorzugten erfindungsgemäßen katalytischen DNA-Moleküle in der Lage, eine ortspezifische Endonukleaseaktivität zu zeigen, unabhängig von der ursprünglichen Orientierung des Substratmoleküls. Daher ist in einer bevorzugten Ausführungsform ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül in der Lage, eine Substrat-Nukleinsäuresequenz zu spalten, die vom enzymatisch aktiven DNA-Molekül getrennt ist – d. h. sie ist nicht mit dem DNAzym verbunden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist ein enzymatisch aktives DNA-Molekül in der Lage, eine gebundene Substrat-Nukleinsäuresequenz zu spalten – d. h. sie ist in der Lage, eine der Selbstspaltung ähnliche Reaktion durchzuführen.
Die Erfindung zieht auch enzymatisch aktive DNA-Moleküle (katalytische DNA-Moleküle, Desoxyribozyme oder DNAzyme) mit Endonukleaseaktivität in Betracht, wobei die Endonukleaseaktivität das Vorhandensein eines divalenten Kations benötigt. In verschiedenen bevorzugten alternativen Ausführungsformen wird ein divalentes Kation aus der Gruppe, bestehend aus Pb²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ und Ca²⁺ ausgewählt. Eine andere Variation zieht in Betracht, dass die Endonukleaseaktivität die Gegenwart eines monovalenten Kations benötigt. In solchen alternativen Ausführungsformen wird das monovalente Kation vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus Na⁺ und K⁺ ausgewählt.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst ein enzymatisch aktives DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21 und SEQ ID NO 22. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst ein erfindungsgemäßes katalytisches DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31,SEQ ID NO 32,SEQ ID NO 33,SEQ ID NO 34,SEQ ID NO 35,SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 38 und SEQ ID NO 39.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform zieht in Betracht, dass ein erfindungsgemäßes katalytisches DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO 50 und SEQ ID NO 51, umfasst. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes katalytisches DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOS 52 bis 101. Wie hier offenbart, werden katalytische DNA-Moleküle mit Sequenzen, die im Wesentlichen zu den hier offenbarten ähnlich sind, ebenfalls in Betracht gezogen. Daher kann eine große Vielfalt an Substitutionen, Deletionen, Insertionen, Duplikationen und anderen Mutationen mit den hier beschriebenen Molekülen durchgeführt werden, um eine Vielzahl anderer nützlicher enzymatisch aktiver DNA-Moleküle zu schaffen; solange die Moleküle eine ortspezifische Spaltungsaktivität, wie hier offenbart, zeigen, liegen sie innerhalb der Grenzen dieser Offenbarung.
In einer weiteren Variation der vorliegenden Erfindung hat ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül vorzugsweise eine Substratbindungsaffinität von etwa 1 μM oder weniger. In einer anderen Ausführungsform bindet das erfindungsgemäße enzymatisch aktive DNA-Molekül Substrat mit einer K_D von weniger als 0,1 μM.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch enzymatisch aktive DNA-Moleküle mit nützlichen Umsatzgeschwindigkeiten. In einer Ausführungsform ist die Umsatzgeschwindigkeit geringer als 5 h^–1; in einer bevorzugten Ausführungsform ist die Geschwindigkeit geringer als 2 h^–1; in einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Geschwindigkeit geringer als 1 h^–1; in einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Umsatzgeschwindigkeit etwa 0,6 h^–1 oder weniger.
In noch einer anderen Ausführungsform zeigt ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül eine nützliche Umsatzgeschwindigkeit, wobei die k_obs weniger als 1 min^–1, vorzugsweise weniger als 0,1 min^–1, stärker bevorzugt weniger als 0,01 min^–1 und noch stärker bevorzugt weniger als 0,005 min^–1 ist. In einer Variation ist der Wert von k_obs etwa 0,002 min^–1 oder weniger.
Die vorliegende Erfindung zieht auch Ausführungsformen in Betracht, in denen die katalytische Geschwindigkeit der offenbarten DNA-Enzyme voll optimiert ist. Daher ist in verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen die K_m für Reaktionen, die durch die Anwesenheit von Mg²⁺ verstärkt werden, etwa 0,5–20 mM, vorzugsweise etwa 1–10 mM und noch stärker bevorzugt etwa 2–5 mM.
Die vorliegende Erfindung zieht auch eine Ausführungsform in Betracht, wobei die Nukleotidsequenz, welche die Spaltstelle definiert, mindestens ein Nukleotid umfasst. In verschiedenen anderen bevorzugten Ausführungsformen ist ein erfindungsgemäßes katalytisches DNA-Molekül in der Lage, eine Nukleotidsequenz, welche eine Spaltstelle von zwei oder mehr Nukleotiden definiert, zu erkennen und zu spalten.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen umfasst ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül einen konservierten Kern, der durch eine oder mehrere Substratbindungsregionen flankiert wird. In einer Ausführungsform umfasst ein enzymatisch aktives DNA-Molekül erste und zweite Substratbindungsregionen. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein enzymatisch aktives DNA-Molekül zwei oder mehr Substratbindungsregionen.
Wie zuvor festgestellt, können bevorzugte erfindungsgemäße katalytische DNA-Moleküle auch einen konservierten Kern umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der konservierte Kern eine oder mehrere konservierte Regionen. In anderen bevorzugten Variationen umfassen die eine oder mehreren konservierten Regionen eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CG, CGA, AGCG, AGCCG, CAGCGAT, CTTGTTT und CTTATTT (vgl. z. B. 3).
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül weiterhin eine oder mehrere variable oder Spacer-Nukleotide zwischen den konservierten Regionen im konservierten Kern. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül weiterhin eine oder mehrere variable oder Spacer-Nukleotide zwischen dem konservierten Kern und der Substratbindungsregion.
In einer Variation umfasst die erste Substratbindungsregion vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CATCTCT, GCTCT, TTGCTTTTT, TGTCTTCTC, TTGCTGCT, GCCATGCTTT (SEQ ID NO 40), CTCTATTTCT (SEQ ID NO 41), GTCGGCA, CATCTCTTC, und ACTTCT.
In einer anderen bevorzugten Variation umfasst die zweite Substratbindungsregion eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
TATGTGACGCTA (SEQ ID NO 42), TATAGTCGTA (SEQ ID NO 43). ATAGCGTATTA, (SEQ ID NO 44), ATAGTTACGTCAT (SEQ ID NO 45). AATAGTGAAGTGTT (SEQ ID NO 46), TATAGTGTA. ATAGTCGGT, ATAGGCCCGGT SEQ ID NO 47), AATAGTGAGGCTTG (SEQ ID NO 48), und ATGNTG.
In verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung variieren die Substratbindungsregionen in der Länge. Daher kann z. B. die Substratbindungsregion von einem einzelnen Nukleotid bis zu Dutzenden von Nukleotiden umfassen. Es ist jedoch selbstverständlich, dass die Substratbindungsregionen von etwa 3–25 Nukleotiden Länge, vorzugsweise etwa 3–15 Nukleotiden Länge und stärker bevorzugt etwa 3–10 Nukleotiden Länge, besonders bevorzugt werden. In verschiedenen Ausführungsformen sind die einzelnen Nukleotide der Substratbindungsregionen in der Lage, komplementäre Basenpaare mit den Nukleotiden der Substratmoleküle zu bilden; in anderen Ausführungsformen werden nicht komplementäre Basenpaarungen gebildet. Es wird auch in Betracht gezogen, dass ein Gemisch aus komplementärer und nicht komplementärer Basenpaarung in den Geltungsbereich der offenbarten Ausführungsformen der Erfindung fällt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes katalytisches DNA-Molekül weiterhin eine dritte Substratbindungsregion umfassen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst die dritte Region eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus TGTT, TGTTA und TGTTAG. Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung offenbart ein enzymatisch aktives DNA-Molekül, welches weiterhin eine oder mehrere variable oder „Spacer"-Regionen zwischen den Substratbindungsregionen umfasst.
In einer anderen offenbarten Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung ein gereinigtes synthetisches enzymatisch aktives DNA-Molekül, welches von anderen DNA-Molekülen und Oligonukleotiden getrennt wurde, in Betracht, wobei das enzymatisch aktive DNA-Molekül Endonukleaseaktivität hat, wobei die Endonukleaseaktivität spezifisch für eine Nukleotidsequenz ist, die eine Spaltstelle, umfassend einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäure, in einer Substrat-Nukleinsäuresequenz definiert. In einer Variation wird ein synthetisches (oder verändertes) enzymatisch aktives DNA-Molekül mit einer Endonukleaseaktivität offenbart, wobei die Endonukleaseaktivität spezifisch für eine Nukleotidsequenz ist, die eine im Wesentlichen aus einer einzel- oder doppelsträngigen Region einer Substrat-Nukleinsäuresequenz bestehende Spaltstelle definiert.
In noch einer anderen Ausführungsform zieht die Erfindung ein enzymatisch aktives DNA-Molekül in Betracht, welches ein Desoxyribonukleotidpolymer mit einer katalytischen Aktivität zur Hydrolyse eines Nukleinsäure enthaltenden Substrats zur Produktion von Substrat-Spaltprodukten umfasst. In einer Variation findet die Hydrolyse in einer ortspezifischen Art und Weise statt. Wie zuvor erwähnt, kann das Polymer einzelsträngig, doppelsträngig oder eine Kombination von beiden sein.
Die Erfindung zieht weiterhin in Betracht, dass das Substrat eine Nukleinsäuresequenz umfasst. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst das Nukleinsäuresequenz-Substrat RNA, modifizierte RNA, DNA, modifizierte DNA, ein Nukleotidanalog oder mehrere Nukleotidanaloga oder Gemische von beliebigen der Vorstehenden. Eine Ausführungsform zieht in Betracht, dass das Substrat ein einzelsträngiges Segment umfasst; noch eine andere Ausführungsform zieht in Betracht, dass das Substrat doppelsträngig ist.
Die vorliegende Erfindung zieht auch ein enzymatisch aktives DNA-Molekül, umfassend ein Desoxyribonukleotidpolymer mit katalytischer Aktivität, zur Hydrolyse eines Nukleinsäure enthaltenden Substrats zur Produktion eines Spaltprodukts in Betracht. In einer Variation hat das enzymatisch aktive DNA-Molekül eine effektive Bindungsaffinität für das Substrat und ihm fehlt eine effektive Bindungsaffinität für das Spaltprodukt.
In einer bevorzugten Ausführungsform offenbart die Erfindung ein nicht natürlicherweise vorkommendes enzymatisch aktives DNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche einen konservierten Kern, flankiert von Erkennungsdomänen, variablen Regionen und Spacer-Regionen definiert. Daher definiert in einer bevorzugten Ausführungsform die Nukleotidsequenz eine erste variable Region, die angrenzend oder benachbart zum 5'-Terminus des Moleküls ist, eine erste Erkennungsdomäne, die sich 3'-terminal der ersten variablen Region befindet, eine erste Spacer-Region, die sich 3'-terminal der ersten Erkennungsdomäne befindet, eine erste konservierte Region, die sich 3'-terminal der ersten Spacer-Region befindet, eine zweite Spacer-Region, die sich 3'-terminal der ersten konservierten Region befindet, eine zweite konservierte Region, die sich 3'-terminal der zweiten Spacer-Region befindet, eine zweite Erkennungsdomäne, die sich 3'-terminal der zweiten konservierten Region befindet, und eine zweite variable Region, die sich 3'-terminal der zweiten Erkennungsdomäne befindet.
In einer anderen Ausführungsform definiert die Nukleotidsequenz vorzugsweise eine erste variable Region, die angrenzend oder benachbart zum 5'-Terminus des Moleküls ist, eine erste Erkennungsdomäne, die sich 3'-terminal der ersten variablen Region befindet, eine erste Spacer-Region, die sich 3'-terminal der ersten Erkennungsdomäne befindet, eine erste konservierte Region, die sich 3'-terminal der ersten Spacer-Region befindet, eine zweite Spacer-Region, die sich 3'-terminal der ersten konservierten Region befindet, eine zweite konservierte Region, die sich 3'-terminal der zweiten Spacer-Region befindet, eine zweite Erkennungsdomäne, die sich 3'-terminal der zweiten konservierten Region befindet, eine zweite variable Region, die sich 3'-terminal der zweiten Erkennungsdomäne befindet, und eine dritte Erkennungsdomäne, die sich 3'-terminal der zweiten variablen Region befindet.
In einer Variation des Vorstehenden beinhaltet das Molekül eine konservierte Kernregion, die durch zwei Substratbindungsregionen flankiert wird; in einer anderen umfasst die konservierte Kernregion eine oder mehrere konservierte Domänen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst die konservierte Kernregion weiterhin ein oder mehrere variable Spacer-Nukleotide. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül eine oder mehrere Spacer-Regionen.
Die vorliegende Erfindung zieht weiterhin eine breite Vielfalt von Zusammensetzungen in Betracht. Zum Beispiel werden Zusammensetzungen, umfassend ein enzymatisch aktives DNA-Molekül, wie hier vorstehend beschrieben, offenbart und in Betracht gezogen. In einer alternativen Ausführungsform umfasst eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zwei oder mehr Populationen enzymatisch aktiver DNA-Moleküle, wie vorstehend beschrieben, wobei jede Population enzymatisch aktiver DNA-Moleküle in der Lage ist, eine unterschiedliche Sequenz in einem Substrat zu spalten. In einer anderen Variation umfasst die Zusammensetzung zwei oder mehr Populationen enzymatisch aktiver DNA-Moleküle, wie hier vorstehend beschrieben, wobei jede Population enzymatisch aktiver DNA-Moleküle in der Lage ist, ein unterschiedliches Substrat zu erkennen. In verschiedenen Ausführungsformen wird es auch bevorzugt, dass die Zusammensetzungen ein monovalentes oder divalentes Kation umfassen.
Die vorliegende Erfindung zieht weiterhin Verfahren zur Herstellung, Selektion und Isolierung erfindungsgemäßer enzymatisch aktiver DNA-Moleküle in Betracht. In einer Variation umfasst ein Verfahren zur Selektion enzymatisch aktiver DNA-Moleküle, welche eine Nukleinsäuresequenz (z. B. RNA) an einer spezifischen Stelle spalten, die folgenden Schritte: (a) Erhalt einer Population möglicher enzymatisch aktiver DNA-Moleküle – ganz gleich, ob die Sequenzen natürlich vorkommen oder synthetisch sind – und vorzugsweise sind sie einzelsträngige DNA-Moleküle, (b) Beimengung von nukleotidhaltigen Substratsequenzen mit der vorstehend erwähnten Population von DNA-Molekülen, um eine Beimengung zu bilden, (c) Erhalten der Beimengung für eine ausreichende Zeitspanne und unter vorab bestimmten Reaktionsbedingungen, um den möglichen enzymatisch aktiven DNA-Molekülen in der Population zu erlauben, Substratsequenzen zu spalten, um dadurch Substrat-Spaltprodukte zu produzieren, (d) Trennung der Population von DNA-Molekülen von den Substratsequenzen und den Substratspaltprodukten und (e) Isolierung von DNA- Molekülen, welche Substrat-Nukleinsäuren (z. B. RNA) an einer spezifischen Stelle spalten, aus der Population.
In einer weiteren Variation des vorstehenden Verfahrens sind die DNA-Moleküle, welche Substrat-Nukleinsäuresequenzen an einer spezifischen Stelle spalten, mit einem immobilisierenden Mittel markiert. In einem Beispiel umfasst das Mittel Biotin.
In noch einer anderen Variation des zuvor erwähnten Verfahrens beginnt man mit der Auswahl einer Sequenz – z. B. eine zuvor bestimmte „Ziel"-Nukleotidsequenz – die man unter Verwendung eines enzymatisch aktiven DNA-Moleküls, das für diesen Zweck verändert wurde, zu spalten wünscht. Daher wird in einer Ausführungsform die vorab ausgewählte (oder vorab bestimmte) „Ziel"-Sequenz verwendet, um eine Population von DNA-Molekülen zu schaffen, welche in der Lage sind, Substratnukleinsäuresequenzen an einer spezifischen Stelle durch Anheftung oder „Anhängen" an eine Desoxyribonukleinsäuresequenz, die eine oder mehrere zufallsveränderte Sequenzen oder Segmente enthält, zu spalten. In einer Variation ist die zufallsveränderte Sequenz etwa 40 Nukleotide lang; in einer anderen Variation ist die zufallsveränderte Sequenz etwa 50 Nukleotide lang. Zufallsveränderte Sequenzen, welche 1–40, 40–50 und 50–100 Nukleotide lang sind, werden auch von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die zur Erstellung einer Population enzymatisch aktiver DNA-Moleküle verwendete Nukleotidsequenz aus einer Gruppe, bestehend aus SEQ OD NO 4, 23, 50 und 51, ausgewählt. In einer anderen Ausführungsform umfasst die „Ziel"- oder „Substrat"-Nukleotidsequenz eine Sequenz von einem oder mehreren Ribonukleotiden – vgl. z. B. die relevanten Anteile von SEQ ID NOS 4 und 23 und SEQ ID NO 49. Es wird auch von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, dass eine nützliche „Ziel"- oder „Substrat"-Nukleotidsequenz DNA, RNA oder ein Gemisch davon umfassen kann.
Die Erfindung zieht auch Verfahren, wie vorstehend beschrieben, in Betracht, worin der Isolierungsschritt weiterhin umfasst, dass die markierten DNA-Moleküle einer festen Oberfläche, an die Avidin geknüpft ist, ausgesetzt werden, wodurch die markierten DNA-Moleküle an die feste Oberfläche angeheftet werden. Wie zuvor kann das Substrat RNA, DNA, ein Gemisch der beiden oder ein Nukleotidsequenzen umfassendes Molekül sein.
Die vorliegende Erfindung zieht auch ein Verfahren zur spezifischen Spaltung einer Substratnukleinsäure an einer bestimmten Spaltstelle in Betracht, umfassend die Schritte des (a) Bereitstellens eines enzymatisch aktiven DNA-Moleküls, das in der Lage ist, eine Substratnukleinsäuresequenz an einer spezifischen Spaltstelle zu spalten und (b) des Inkontaktbringens des enzymatisch aktiven DNA-Moleküls mit der Substrat-Nukleinsäuresequenz, um eine spezifische Spaltung der Nukleinsäuresequenz an der Spaltstelle zu bewirken. In einer Variation ist das enzymatisch aktive DNA-Molekül ein nicht natürlicherweise vorkommendes (oder synthetisches) DNA-Molekül. In einer anderen Variation ist das enzymatisch aktive DNA-Molekül einzelsträngig.
In noch einer anderen Variation des vorstehenden Verfahrens umfasst das Substrat eine Nukleinsäure. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst die Substratnukleinsäure RNA, modifizierte RNA, DNA, modifizierte DNA, ein Nukleotidanalog oder mehrere Nukleotidanaloga oder Gemische von beliebigen der vorstehend Genannten. In noch einer anderen Ausführungsform wird die spezifische Spaltung durch die Endonukleaseaktivität des enzymatisch aktiven DNA-Moleküls bewirkt. Die Änderung der Reaktionsbedingungen – z. B. die Anpassung von pH-Wert, Temperatur, Prozentsatz der Kationen, Prozentsatz des Enzyms, Prozentsatz des Substrats und Prozentsatz des Produkts – wird hier ebenfalls in Betracht gezogen.
Die vorliegende Erfindung zieht auch ein Verfahren zur Spaltung einer Phosphoesterbindung, umfassend (a) die Beimengung eines katalytischen DNA-Moleküls, welches in der Lage ist, eine Substratnukleinsäuresequenz an einer spezifischen Spaltstelle zu spalten, mit einem eine Phosphoesterbindung enthaltendem Substrat, um eine Reaktionsbeimengung zu bilden und (b) Erhalten der Beimengung unter vorab bestimmten Reaktionsbedingungen, um den enzymatisch aktiven DNA-Molekülen zu erlauben, die Phosphoesterbindung zu spalten, um dadurch eine Population von Substratprodukten zu produzieren. In einer Ausführungsform ist das enzymatisch aktive DNA-Molekül in der Lage, die Phosphoesterbindung in einer ortspezifischen Art und Weise zu spalten. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin die Schritte der (c) Trennung der Produkte vom katalytischen DNA-Molekül und (d) der Zugabe von zusätzlichem Substrat zum enzymatisch aktiven DNA-Molekül, um eine neue Reaktionsbeimengung zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung zieht auch Verfahren zur Veränderung von enzymatisch aktiven DNA-Molekülen, welche Phosphoesterbindungen spalten, in Betracht. Ein beispielhaftes Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Erhalt einer Population von einzelsträngigen DNA-Molekülen, (b) Einführung einer genetischen Variation in die Population, um eine abweichende Population herzustellen, (c) Auswahl von Individuen aus der abweichenden Population, welche die vorab bestimmten Auswahlkriterien erfüllen, (d) Trennung der ausgewählten Individuen vom Rest der abweichenden Population und (e) Amplifizierung der ausgewählten Individuen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 verdeutlicht ein selektives Amplifizierungsschema zur Isolierung von DNAs, welche einen Ziel-RNA-Phosphoester spalten. Wie gezeigt, wird die doppelsträngige DNA, welche einen Abschnitt von 50 zufälligen Nukleotiden (das Molekül, das oberhalb mit „N₅₀" bezeichnet ist) enthält, unter Anwendung eines 5'-biotinylierten DNA-Primers, welcher am 3'-Ende durch ein Adenosin-Ribonukleotid (rA) terminiert wird, durch PCR amplifiziert. (Die Biotin-Markierung wird durch den eingekreisten Buchstaben „B" angezeigt). Dieser Primer wird durch die Taq-Polymerase verlängert, um ein DNA-Produkt zu erhalten, welches ein einzelnes eingebettetes Ribonukleotid enthält. Die entstehende doppelsträngige DNA wird auf einer Streptavidinmatrix immobilisiert und der nicht biotinylierte DNA-Strang wird durch Waschen mit 0,2 N NaOH entfernt. Nachdem die Säule mit einer gepufferten Lösung erneut äquilibriert wurde, wird die Säule mit derselben Lösung mit hinzugefügtem 1 mM PbOAc gewaschen. DNAs, welche eine Pb²⁺-abhängige Selbstspaltung unterlaufen, werden von der Säule freigesetzt, im Elutionsmittel gesammelt und durch PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte werden dann verwendet, um die nächste Runde der selektiven Amplifizierung zu beginnen.
2 stellt die selbstspaltende Aktivität der Ausgangspools der DNA (G0) und der Populationen dar, welche nach der ersten bis fünften Runde der Selektion (G1–G5) in Gegenwart von Bleikation (Pb²⁺) erhalten wurden. Das Symbol Pre repräsentiert die 108 Nukleotide lange Vorläufer-DNA (SEQ ID NO 4), Clv das 28 Nukleotide lange 5'-Spaltprodukt (SEQ ID NO 5) und M den Primer 3a (SEQ ID NO 6), welcher in der Länge dem 5'-Spaltprodukt entspricht.
3 stellt die Sequenzalignment von individuellen Varianten dar, welche nach fünf Runden der Selektion aus der Population isoliert wurden. Die festgelegte Substratdomäne wird oben gezeigt, wobei das Ziel-Riboadenylat mittels eines umgedrehten Dreiecks identifiziert wird. Substratnukleotide die üblicherweise an angenommenen Basenpaarwechselwirkungen beteiligt sind, werden durch senkrechte Balken angezeigt. Sequenzen, die den 50 ursprünglich zufallsveränderten Nukleotiden entsprechen, sind antiparallel zur Substratdomäne ausgerichtet. Alle Varianten enden am 3'-Ende mit der festgelegten Sequenz 5'-CGGTAAGCTTGGCAC-3' (nicht gezeigt, SEQ ID NO 1). Nukleotide innerhalb der ursprünglich zufallsveränderten Region, von welchen angenommen wird, dass sie Basenpaarungen mit der Substratdomäne ausbilden, werden an der rechten und linken Seite der Figur angegeben; die vermutlichen Basenpaar-bildenden Regionen der enzymatisch aktiven DNA-Moleküle sind individuell in jeder gezeigten Sequenz eingerahmt. Konservierte Regionen werden durch zwei große, in der Mitte befindliche Kästen dargestellt.
Die 4A und 4B stellen die durch DNA katalysierte Spaltung eines RNA-Phosphoesters in einer intermolekularen Reaktion dar, die mit einem katalytischen Umsatz voranschreitet. 4A ist eine schematische Darstellung des Komplexes, der zwischen dem 19-mer-Substrat (3'-TCACTATrAGGAAGAGATGG-5', SEQ ID NO 2) und einem 38-mer-DNA-Enzym (5'-ACACATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGACGCTA-3', SEQ ID NO 3) gebildet wird. Das Substrat enthält ein einzelnes Adenosin-Ribonukleotid („rA", neben dem Pfeil), flankiert von Desoxyribonukleotiden. Das synthetische DNA-Enzym ist ein 38-Nukleotid-Anteil der in 3 gezeigten, am häufigsten vorkommenden Variante. Hochkonservierte Nukleotide, die innerhalb der vermutlichen katalytischen Domäne lokalisiert sind, sind „eingerahmt". Wie dargestellt, ist eine konservierte Sequenz „AGCG", während eine andere „CG" ist (gelesen in 5'-3'-Richtung).
4B zeigt eine Eadie-Hofstee-Auftragung, die zur Bestimmung von K_m (negative Steigung) und V_max (y-Achsenabschnitt) für die durch DNA katalysierte Spaltung von [5'-³²P]-markiertem Substrat unter Bedingungen, die zu denen identisch sind, die während der in-vitro-Selektion angewendet werden, verwendet wird. Anfängliche Spaltungsgeschwindigkeiten wurden für Reaktionen bestimmt, die 5 nM DNA-Enzym und entweder 0,125, 0,5, 1, 2 oder 4 μM Substrat enthielten.
5 ist eine photographische Darstellung, die ein Polyacrylamidgel zeigt, welches eine spezifische Endoribonukleaseaktivität von vier Familien ausgewählter katalytischer DNAs aufzeigt. Die Auswahl einer Pb²⁺-abhängigen Familie von Molekülen wurde nebeneinander als Kontrolle wiederholt (erste Gruppe). In der zweiten Gruppe wurde Zn²⁺ als Kation verwendet, in Gruppe drei ist das Kation Mn²⁺ und in der vierten Gruppe ist das Kation Mg²⁺. Eine fünfte Stelle auf dem Gel besteht allein aus dem Spaltprodukt als Größenstandard.
Wie erwähnt, gibt es drei Spuren innerhalb der zuvor erwähnten vier Gruppen. In jeder Gruppe von drei Spuren zeigt die erste Spur das Fehlen der Aktivität der ausgewählten Population in Abwesenheit des Metallkations, die zweite Spur zeigt die beobachtete Aktivität bei Vorhandensein des Metallkations und die dritte Spur zeigt das Fehlen von Aktivität im Ausgangspool (G0).
Die 6A und 6B stellen zweidimensionale Darstellungen eines katalytischen „Vorläufer"-DNA-Moleküls beziehungsweise eines von mehreren katalytischen DNA-Molekülen, welche durch die hier offenbarten selektiven Amplifikationsverfahren erhalten wurden, bereit. 6A stellt ein exemplarisches Molekül aus dem Ausgangspool dar und zeigt die gesamte Konfiguration der Moleküle, die durch SEQ ID NO 23 repräsentiert werden. Wie dargestellt, flankieren verschiedene komplementäre Nukleotide die zufällige (N₄₀)-Region. 6B ist eine schematische Darstellung eines der Mg²⁺-abhängigen katalytischen DNA-Moleküle (oder „DNAzyme"), welche durch die hier beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Lokalisation der Ribonukleotide in der Substratnukleinsäure wird durch den Pfeil in beiden 6A und 6B angezeigt.
7 stellt einige der Ergebnisse aus zehn Runden der selektiven in-vitro-Amplifizierung dar, welche im Wesentlichen, wie im nachstehenden Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt wird. Wie gezeigt, traten zwei Stellen und zwei Familien von Katalysatoren als diejenigen hervor, welche die effizienteste Spaltung der Zielsequenz zeigten. Die Spaltungsbedingungen waren im Wesentlichen, wie in 7 angegeben, nämlich 10 mM Mg²⁺, pH 7,5 und 37°C. Daten, die erhoben wurden, nachdem die Reaktion für 2 Stunden gelaufen war, werden gezeigt. Es wird die Spaltung (%), aufgetragen gegen die Anzahl der Generationen (hier 0 bis 10), gezeigt. Die Zahl/das Vorherrschen der katalytischen DNA-Moleküle, die in der Lage sind, die Zielsequenz an den angegebenen Stellen im Substrat zu spalten, ist durch die senkrechten Balken angegeben, wobei die Spaltung bei GIUAACUAGAGAU durch g estreifte Balken gezeigt und die Spaltung bei GUAACUAIGAGAU durch die offenen (leicht schattierten) Balken dargestellt wird.
8 stellt die Nukleotidsequenzen, Spaltstellen und Umsatzgeschwindigkeiten von zwei erfindungsgemäßen katalytischen DNA-Molekülen, Klone 8–17 und 10–23, dar. Die Reaktionsbedingungen waren, wie gezeigt, nämlich 10 mM Mg²⁺, pH 7,5 und 37°C. Das DNAzym, welches als Klon 8–17 identifiziert wurde, ist auf der linken Seite dargestellt, wobei die Spaltstelle des RNA-Substrats durch einen Pfeil gekennzeichnet ist. Die Substratsequenz (5'-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG 3') – welche vom DNAzym getrennt ist (d. h. die intermolekulare Spaltung wird gezeigt) – ist als solche markiert. In ähnlicher Weise wird das hier als 10–23 identifizierte DNAzym auf der rechten Seite gezeigt, wobei die Spaltstelle des RNA-Substrats durch den Pfeil gekennzeichnet ist. Wiederum wird die Substratsequenz angezeigt. Für das Enzym 8–17 war die Umsatzgeschwindigkeit etwa 0,6 h^–1, für das Enzym 10–23 war die Umsatzgeschwindigkeit etwa 1 h^–1. Nicht komplementäre Paarungen werden mit einem ausgefüllten Kreis (•) angezeigt, während komplementäre Paarungen mit einer senkrechten Linie (|) angezeigt werden.
9 stellt weiterhin die Nukleotidsequenzen, Spaltstellen und Umsatzgeschwindigkeiten von zwei erfindungsgemäßen katalytischen DNA-Molekülen, Klone 8–17 und 10–23, dar. Die Reaktionsbedingungen waren, wie gezeigt, nämlich 10 mM Mg²⁺, pH 7,5 und 37°C. Wie in 8 wird das DNAzym, welches als Klon 8–17 identifiziert wurde, auf der linken Seite dargestellt, wobei die Spaltstelle des RNA-Substrats durch einen Pfeil gekennzeichnet ist. Die Substratsequenz (5'-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAGG-3') – welche vom DNAzym getrennt ist (d. h. die intermolekulare Spaltung wird gezeigt) – ist als solche markiert. In ähnlicher Weise wird das hier als 10–23 identifizierte DNAzym auf der rechten Seite gezeigt, wobei die Spaltstelle des RNA-Substrats durch den Pfeil gekennzeichnet ist. Wiederum wird die Substratsequenz angezeigt. Für das Enzym 8–17 war k_obs etwa 0,002 min^–1; für das Enzym 10–23 war k_obs etwa 0,01 min^–1. Nicht komplementäre Paarungen werden mit einem ausgefüllten Kreis (•) angezeigt, während komplementäre Paarungen mit einer senkrechten Linie (|) angezeigt werden.
GENAUE BESCHREIBUNG
A. Definitionen
Wie er hier gebraucht wird, wird der Begriff „Desoxyribozym" verwendet, um eine DNA enthaltende Nukleinsäure zu beschreiben, welche in der Lage ist, als ein Enzym zu funktionieren. In der vorliegenden Offenbarung umfasst der Begriff „Desoxyribozym" Endoribonukleasen und Endodesoxyribonukleasen, obwohl Desoxyribozyme mit Endoribonukleaseaktivität besonders bevorzugt werden. Andere Begriffe, welche hier mit Desoxyribozym austauschbar verwendet werden, sind „enzymatisch aktives DNA-Molekül", „DNAzym" oder „katalytisches DNA-Molekül", wobei diese Begriffe alle so verstanden werden sollten, dass sie enzymatisch aktive Teile davon umfassen, ganz gleich, ob sie synthetisch hergestellt werden oder von Organismen oder anderen Quellen stammen.
Der Begriff „enzymatisch aktive DNA-Moleküle" umfasst auch DNA-Moleküle, welche eine Komplementarität in der Substrat-bindenden Region zu einem spezifizierten Oligonukleotid-Ziel oder -Substrat aufweisen; solche Moleküle haben auch eine enzymatische Aktivität, welche wirksam ist, ein Oligonukleotidsubstrat spezifisch zu spalten. Anders ausgedrückt ist das enzymatisch aktive DNA-Molekül in der Lage, das Oligonukleotidsubstrat intermolekular zu spalten. Diese Komplementarität bewirkt, dass eine ausreichende Hybridisierung des enzymatisch aktiven DNA-Moleküls an das Substrat-Oligonukleotid ermöglicht wird, um zu ermöglichen, dass die intermolekulare Spaltung des Substrats stattfindet. Während einhundert Prozent (100%) Komplementarität bevorzugt werden, ist eine Komplementarität im Bereich von 75–100% ebenfalls nützlich und wird durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen.
Erfindungsgemäße enzymatisch aktive DNA-Moleküle können alternativ so beschrieben werden, dass sie Nuklease- oder Ribonukleaseaktivität aufweisen. Diese Begriffe können hier austauschbar verwendet werden.
Der Begriff „enzymatisch aktive Nukleinsäure", so wie er hier gebraucht wird, umfasst enzymatisch aktive RNA- oder DNA-Moleküle, enzymatisch aktive RNA-DNA-Polymere und enzymatisch aktive Anteile oder Derivate davon, obwohl enzymatisch aktive DNA-Moleküle eine besonders bevorzugte Klasse enzymatisch aktiver Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung sind.
Der Begriff „Endodesoxyribonuklease", so wie er hier gebraucht wird, ist ein Enzym, welches in der Lage ist, ein Substrat, welches vorwiegend aus DNA besteht, zu spalten. Der Begriff „Endoribonuklease", so wie er hier gebraucht wird, ist ein Enzym, welches in der Lage ist, ein Substrat, welches vorwiegend aus RNA besteht, zu spalten.
Wie er hier gebraucht wird, wird der Begriff „Basenpaar" (Bp) allgemein verwendet, um eine Partnerschaft von Adenin (A) mit Thymin (T) oder Uracil (U) oder von Cytosin (C) mit Guanin (G) zu beschreiben, obwohl es anerkannt werden sollte, dass weniger übliche Analoga der Basen A, T, C und G (sowie U) gelegentlich an den Basenpaarungen beteiligt sein können. Nukleotide, welche sich normalerweise paaren, wenn DNA oder RNA eine doppelsträngige Konfiguration einnehmen, können hier auch als „komplementäre Basen" bezeichnet werden.
„Komplementäre Nukleotidsequenz" bezieht sich allgemein auf eine Sequenz von Nukleotiden in einem einzelsträngigen Molekül oder Segment von DNA oder RNA, welches ausreichend komplementär zu einem anderen einzelnen Oligonukleotidstrang ist, um spezifisch unter Ausbildung einer dann folgenden Wasserstoffbindung daran zu hybridisieren.
„Nukleotid" bezieht sich allgemein auf eine monomere Einheit von DNA oder RNA, bestehend aus einem Zuckerrest (Pentose), einer Phosphatgruppe und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base. Die Base ist über den glycosidischen Kohlenstoff (1'-Kohlenstoff der Pentose) mit dem Zuckerrest verknüpft und diese Kombination von Base und Zucker ist ein „Nukleosid". Wenn das Nukleosid eine Phosphatgruppe enthält, die mit der 3'- oder 5'-Position der Pentose verbunden ist, wird es als Nukleotid bezeichnet. Eine Sequenz von funktionell verknüpften Nukleotiden wird typischerweise hier als eine „Basensequenz" oder „Nukleotidsequenz" einschließlich ihrer grammatikalischen Äquivalente bezeichnet und wird hier durch eine Formel repräsentiert, deren Orientierung von rechts nach links in der konventionellen Richtung von 5'-Terminus zum 3'-Terminus ist, wenn nicht anders angegeben.
„Nukleotidanalog" bezieht sich im Allgemeinen auf ein Purin- oder Pyrimidin-Nukleotid, welches sich strukturell von A, T, G, C oder U unterscheidet, aber hinreichend ähnlich ist, um das normale Nukleotid im Nukleinsäuremolekül zu ersetzen. Wie er hier gebraucht wird, umfasst der Begriff „Nukleotidanalog" geänderte Basen, andere oder unübliche Zucker (d. h. andere Zucker als die „übliche" Pentose) oder eine Kombination der beiden. Eine Auflistung der beispielhaften Analoga, in denen die Base geändert wurde, wird im hier nachstehenden Abschnitt C bereitgestellt.
„Oligonukleotid oder Polynukleotid" bezieht sich allgemein auf ein Polymer aus einzel- oder doppelsträngigen Nukleotiden. Wie es hier gebraucht wird, umfasst „Oligonukleotid" und seine grammatikalischen Äquivalente den vollen Umfang an Nukleinsäuren. Ein Oligonukleotid bezieht sich typischerweise auf ein Nukleinsäuremolekül, welches aus einem linearen Strang aus Ribonukleotiden besteht. Die genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, welche wiederum von den endgültigen Bedingungen der Verwendung abhängen, wie es im Fachgebiet wohlbekannt ist.
Wie er hier verwendet wird, beabsichtigt der Begriff „physiologische Bedingungen" Reaktionsbedingungen vorzuschlagen, welche jene, die in Säugerorganismen, insbesondere Menschen, gefunden werden, nachahmen. Während, wie nachstehend genauer beschrieben wird, Variablen wie Temperatur, Verfügbarkeit von Kationen und pH-Bereiche variieren können, umfassen „physiologische Bedingungen" allgemein eine Temperatur von etwa 35–40°C, wobei 37°C besonders bevorzugt wird, sowie einen pH-Wert von etwa 7,0–8,0, wobei 7,5 besonders bevorzugt wird, und umfassen weiterhin die Verfügbarkeit von Kationen, vorzugsweise divalenten und/oder monovalenten Kationen, wobei eine Konzentration von etwa 2–15 mM Mg²⁺ und 0–1,0 M Na⁺ besonders bevorzugt wird. „Physiologische Bedingungen", wie hier gebraucht, kann wahlweise die Anwesenheit von freiem Nukleosid-Kofaktor umfassen. Wie zuvor erwähnt, werden die bevorzugten Bedingungen nachstehend genauer beschrieben.
B. Enzymatisch aktive DNA-Moleküle
In verschiedenen Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül eine oder mehrere Modifikationen oder Mutationen einschließlich Additionen, Deletionen und Substitutionen kombinieren. In alternativen Ausführungsformen können solche Mutationen oder Modifikationen unter Verwendung von Verfahren, welche zufällige oder spezifische Mutationen oder Modifikationen hervorbringen, hergestellt werden. Diese Mutationen können zum Beispiel die Länge oder die Nukleotidsequenz einer Schleife, einer Spacer-Region oder der Erkennungssequenz (oder Domäne) verändern. Eine oder mehrere Mutationen innerhalb eines katalytisch aktiven enzymatischen DNA-Moleküls können mit der/den Mutation/en innerhalb eines zweiten katalytisch aktiven enzymatischen DNA-Moleküls kombiniert werden, um ein neues enzymatisch aktives DNA-Molekül, enthaltend die Mutationen beider Moleküle, hervorzubringen.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül viele zufällige Mutationen besitzen, welche unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, darin eingeführt werden. Zum Beispiel werden die Verfahren, die von Cadwell und Joyce (PCR Methods and Applications 2: 28–33 (1992)), mit einigen Modifikationen, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, besonders zur hier offenbarten Verwendung bevorzugt. (Vgl. auch Cadwell und Joyce, PCR Methods and Applications 3 (Erg.): S136–S140 (1994).) Gemäß diesem modifizierten PCR-Verfahren können zufällige Punktmutationen in die klonierten Gene eingeführt werden.
Die zuvor erwähnten Verfahren wurden zum Beispiel verwendet, um Gene, welche Ribozyme codieren, einer Mutagenese mit einer Mutationsrate von 0,66% ± 0,13% (95% Vertrauensintervall) pro Position, wie durch Sequenzanalyse bestimmt wurde, ohne dass starke Präferenzen hinsichtlich des Typs der Basensubstitution beobachtet wurden, zu unterziehen. Dies erlaubt die Einführung von zufälligen Mutationen an einer beliebigen Stelle der erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven DNA-Moleküle.
Ein anderes Verfahren, welches bei der Einführung von definierten oder zufälligen Mutationen nützlich ist, wird bei Joyce und Inoue, Nucleic Acids Research 17: 711–722 (1989) offenbart. Dieses letztere Verfahren schließt das Ausschneiden eines Matrizen (codierenden)-Strangs aus einer doppelsträngigen DNA, die Rekonstruktion des Matrizenstrangs mit Einschluss der mutagenen Oligonukleotide und die anschließende Transkription der teilweise fehlgepaarten Matrize ein. Dies erlaubt die Einführung von definierten oder zufälligen Mutationen an einer beliebigen Stelle des Moleküls durch Einschluss von Polynukleotiden, enthaltend bekannte oder zufällige Nukleotidsequenzen an ausgewählten Positionen.
Erfindungsgemäße enzymatisch aktive DNA-Moleküle können von unterschiedlichen zweckdienlichen Längen und Faltungsmustern sein, abhängig vom Typ und der Funktion des Moleküls. Zum Beispiel können enzymatisch aktive DNA-Moleküle von etwa 15 bis etwa 400 oder mehr Nukleotiden Länge sein, obwohl eine Länge, die etwa 250 Nukleotide nicht überschreitet, bevorzugt wird, um zu vermeiden, dass die therapeutische Nützlichkeit von Molekülen eingeschränkt wird, dadurch dass sie zu groß oder sperrig sind. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül mindestens etwa 20 Nukleotide lang und, während nützliche Moleküle eine Länge von 100 Nukleotiden überschreiten können, sind bevorzugte Moleküle im Allgemeinen nicht mehr als etwa 100 Nukleotide lang.
In verschiedenen therapeutischen Anwendungen umfassen erfindungsgemäße enzymatisch aktive DNA-Moleküle die enzymatisch aktiven Teile von Desoxyribozymen. In verschiedenen Ausführungsformen umfassen erfindungsgemäße enzymatisch aktive DNA-Moleküle vorzugsweise nicht mehr als etwa 200 Nukleotide. In anderen Ausführungsformen umfasst ein erfindungsgemäßes Desoxyribozym nicht mehr als etwa 100 Nukleotide. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen sind erfindungsgemäße Desoxyribozyme etwa 20–75 Nukleotide lang, stärker bevorzugt etwa 20–65 Nukleotide lang. Andere bevorzugte enzymatisch aktive DNA-Moleküle haben eine Länge von etwa 10–50 Nukleotiden.
In anderen Anwendungen können enzymatisch aktive DNA-Moleküle Konfigurationen annehmen, die ähnlich zu denen von „Hammerkopf"-Ribozymen sind. Solche enzymatisch aktiven DNA-Moleküle sind vorzugsweise nicht länger als etwa 75–100 Nukleotide, wobei eine Länge von etwa 20–50 Nukleotiden besonders bevorzugt wird.
Im Allgemeinen gilt, wenn jemand beabsichtigt, Moleküle zur hier offenbarten Verwendung zu synthetisieren, je größer das enzymatisch aktive Nukleinsäuremolekül ist, desto schwieriger ist es zu synthetisieren. Der Fachmann wird sicherlich diese Einschränkungen bei der Gestaltung verstehen. Nichtsdestotrotz verbleiben solche größeren Moleküle innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Es versteht sich auch, dass ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül enzymatisch aktive Teile eines Desoxyribozyms oder ein Desoxyribozym mit einer oder mehreren Mutationen umfassen kann, z. B. sind eine oder mehrere Basenpaar-bildende Sequenzen oder Spacer abwesend oder modifiziert, solange solche Deletionen, Additionen oder Modifikationen nicht die Fähigkeit des Moleküls beeinträchtigen, als Enzym zu arbeiten.
Die Erkennungsdomäne eines erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven DNA-Moleküls umfasst typischerweise zwei Nukleotidsequenzen, welche eine katalytische Domäne flankieren, und enthält typischerweise eine Sequenz von mindestens etwa 3 bis etwa 30 Basen, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 15 Basen, welche in der Lage sind, an eine komplementäre Sequenz von Basen innerhalb der Substratnukleinsäure zu hybridisieren, was dem enzymatisch aktiven DNA-Molekül seine hohe Sequenzspezifität verleiht. Modifikation oder Mutation der Erkennungsstelle über wohlbekannte Verfahren erlaubt es einem, die Sequenzspezifität eines enzymatisch aktiven Nukleinsäuremoleküls zu ändern. (Vgl. z. B. Joyce et al., Nucleic Acid Research 17: 711–712 (1989).)
Erfindungsgemäße enzymatisch aktive DNA-Moleküle umfassen auch solche mit geänderten Erkennungsstellen oder -domänen. In verschiedenen Ausführungsformen verleihen diese veränderten Erkennungsdomänen dem enzymatisch aktiven Nukleinsäuremolekül einzigartige Sequenzspezifitäten, einschließlich solcher Erkennungsdomänen. Die exakten Basen, die in der Erkennungsdomäne vorhanden sind, bestimmen die Basensequenz, bei welcher die Spaltung stattfinden wird. Die Spaltung der Substratnukleinsäure findet innerhalb der Erkennungsdomäne statt. Diese Spaltung lässt eine 2'-, 3'-, oder 2',3'-zyklische Phosphatgruppe an der Substratspaltungssequenz und ein 5'-Hydroxyl am Nukleotid, welches sich ursprünglich unmittelbar 3'-seitig der Substratspaltungssequenz im ursprünglichen Substrat befand, zurück. Die Spaltung kann durch Änderung der in der Erkennungssequenz vorhandenen Basen (interne Leitsequenz) auf eine Stelle der Wahl umgeleitet werden. Vgl. Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9218–9222 (1989).
Darüber hinaus kann es nützlich sein, ein Polyamin zuzugeben, um die Erkennung und Bindung zwischen dem enzymatisch aktiven DNA-Molekül und seinem Substrat zu erleichtern. Beispiele für nützliche Polyamine umfassen Spermidin, Putrescin oder Spermin. Eine Spermidin-Konzentration von etwa 1 mM kann in bestimmten Ausführungsformen wirksam sein, während Konzentrationen von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM ebenfalls nützlich sein können.
In verschiedenen alternativen Ausführungsformen hat ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül eine verstärkte oder optimierte Fähigkeit, Nukleinsäuresubstrate zu spalten, vorzugsweise RNA-Substrate. Wie der Fachmann anerkennen wird, variiert die Geschwindigkeit einer Enzym-katalysierten Reaktion abhängig von der Substrat- und der Enzymkonzentration und pendelt sich allgemein bei hohen Substrat- oder Enzymkonzentrationen ein. Um solche Effekte zu berücksichtigen, kann die Kinetik einer Enzym-katalysierten Reaktion mit den nachstehenden Größen beschrieben werden, welche die Reaktion definieren.
Die verstärkte oder optimierte Fähigkeit eines erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven DNA-Moleküls, ein RNA-Substrat zu spalten, kann in einer Spaltungsreaktion mit variierenden Mengen markierten RNA-Substrats bei Vorhandensein von enzymatisch aktivem DNA-Molekül bestimmt werden. Die Fähigkeit, das Substrat zu spalten, wird allgemein durch die katalytische Geschwindigkeit (k_cat), geteilt durch die Michaelis-Konstante (K_M), definiert. Das Symbol k_cat repräsentiert die maximale Geschwindigkeit einer Enzymreaktion, wenn sich das Substrat dem Sättigungswert nähert. K_M repräsentiert die Substratkonzentration bei der die Reaktionsgeschwindigkeit halbmaximal ist.
Zum Beispiel können die Werte für K_M und k_cat in dieser Erfindung durch Experimente bestimmt werden, in welchen die Substratkonzentration [S] gegenüber der Konzentration des enzymatisch aktiven DNA-Moleküls [E] im Überschuss ist. Anfangsgeschwindigkeiten der Reaktion (v₀) über einen Bereich von Substratkonzentrationen werden aus der anfänglichen linearen Phase geschätzt, im Allgemeinen die ersten 5% der Reaktion oder weniger. Die Datenpunkte werden durch die Methode der kleinsten Quadrate an eine theoretische Linie angepasst, welche durch die Gleichung beschrieben wird: v = –K_M(v₀/[S]) + V_max. Daher werden k_cat und K_M durch die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit v₀ und die Substratkonzentration [S] bestimmt.
In verschiedenen alternativen Ausführungsformen hat ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül eine verstärkte oder optimierte Fähigkeit, Nukleinsäuresubstrate zu spalten, vorzugsweise RNA-Substrate. In bevorzugten Ausführungsformen zeigt die verstärkte oder optimierte Fähigkeit eines enzymatisch aktiven DNA-Moleküls, RNA-Substrate zu spalten, eine etwa 10- bis 10⁹-fache Verbesserung gegenüber der nicht katalysierten Geschwindigkeit. In stärker bevorzugten Ausführungsformen ist das erfindungsgemäße enzymatisch aktive DNA-Molekül in der Lage, RNA-Substrate in einer Geschwindigkeit zu spalten, welche etwa 10³- bis 10⁷-fach gegenüber der „Vorläufer"-Spezies verbessert ist. In noch stärker bevorzugten Ausführungsformen drückt sich die verstärkte oder optimierte Fähigkeit, RNA-Substrate zu spalten, als eine 10⁴- bis 10⁶-fache Verbesserung gegenüber der Vorläufer-Spezies aus. Ein Fachmann wird anerkennen, dass die verstärkte oder optimierte Fähigkeit eines enzymatisch aktiven DNA-Moleküls, Nukleinsäuresubstrate zu spalten, abhängig von den Selektionszwängen, welche während des erfindungsgemäßen in-vitro-Evolutionsverfahrens angewendet werden, variieren können.
Verschiedene bevorzugte Verfahren zur Modifizierung von Desoxyribozymen und anderen erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven DNA-Molekülen und Nukleasen werden in den nachstehend Beispielen 1–3 weiter beschrieben.
C. Nukleotidanaloga
Wie vorstehend erwähnt, bezieht sich der Begriff „Nukleotidanalog", wie er hier gebraucht wird, allgemein auf ein Purin- oder Pyrimidinnukleotid, welches sich strukturell von A, T, G, C oder U unterscheidet, jedoch ausreichend ähnlich ist, um solche „normalen" Nukleotide in einem Nukleinsäuremolekül zu ersetzen. Wie er hier gebraucht wird, umfasst der Begriff „Nukleotidanalog" veränderte Basen, andere (oder unübliche) Zucker, veränderte Phosphatrückgrate oder beliebige Kombinationen dieser Änderungen. Beispiele für Nukleotidanaloga, welche gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen jene in der folgenden Tabelle aufgeführten, von denen sich die meisten in der anerkannten Liste der modifizierten Basen bei 37 CFR § 1.822 finden.
Tabelle 1
Andere nützlich Analoga umfassen jene, welche in der veröffentlichten internationalen Anmeldung Nr. WO 92/20823 beschrieben werden, oder Analoga, die gemäß den hier offenbarten Verfahren hergestellt wurden. Analoga, die in DeMesmaeker, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 226–229 (1994), DesMesmaeker, et al., Synlett: 733–736 (Okt. 1993), Nielsen, et al., Science 254: 1497–1500 (1991) und Idziak, et al., Tetrahedron Letters 34: 5417–5420 (1993) beschrieben werden, sind ebenfalls gemäß der hier offenbarten Erfindung nützlich.
D. Verfahren zur Veränderung enzymatisch aktiver DNA-Moleküle
Die vorliegende Erfindung zieht auch Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuremolekülen mit einer vorab bestimmten Aktivität in Betracht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül ein enzymatisch aktives DNA-Molekül. In einer anderen Variation ist die gewünschte Aktivität eine katalytische Aktivität.
In einer Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung Verfahren zur Synthese von enzymatisch aktiven DNA-Molekülen in Betracht, welche dann „verändert" werden können, um eine spezifische oder vorab bestimmte Reaktion zu katalysieren. Verfahren zur Herstellung enzymatisch aktiver DNA-Moleküle sind hier beschrieben; vgl. z. B. die hier nachstehenden Beispiele 1–3. In anderen Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül verändert werden, um kleine Moleküle oder Liganden wie Adenosintriphosphat (ATP) zu binden. (Vgl. z. B. Sassanfar et al., Nature 364: 550–553 (1993).) In einer anderen Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung in Betracht, dass eine Population enzymatisch aktiver DNA-Moleküle mutagenisierenden Bedingungen unterzogen wird, um eine diverse Population mutierter enzymatisch aktiver DNA-Moleküle herzustellen (welche alternativ „Desoxyribozyme" oder „DNAzyme" genannt werden können). Danach werden enzymatisch aktive DNA-Moleküle mit den gewünschten Eigenschaften ausgewählt und/oder von der Population getrennt und werden anschließend amplifiziert.
Alternativ können durch Änderung der Länge der Erkennungsdomänen des enzymatisch aktiven DNA-Moleküls Mutationen in das enzymatisch aktive DNA-Molekül eingeführt werden. Die Erkennungsdomänen des enzymatisch aktiven DNA-Moleküls assoziieren mit einer komplementären Sequenz von Basen innerhalb einer Substrat-Nukleinsäuresequenz. Verfahren zur Änderung der Länge der Erkennungsdomänen sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel PCR; nützliche Verfahren werden in den nachstehenden Beispielen näher beschrieben.
Die Änderung der Länge der Erkennungssequenzen eines enzymatisch aktiven DNA-Moleküls kann einen wünschenswerten Effekt auf die Bindungsspezifität des enzymatisch aktiven DNA-Moleküls haben. Zum Beispiel kann eine Steigerung der Länge der Erkennungsdomänen die Bindungsspezifität zwischen dem enzymatisch aktiven DNA-Molekül und der komplementären Basensequenz eines Oligonukleotids in einem Substrat erhöhen oder die Erkennung einer bestimmten Sequenz in einem Hybridsubstrat verstärken. Zusätzlich kann eine Steigerung der Länge der Erkennungsdomänen auch die Affinität erhöhen, mit der sie an das Substrat bindet. In verschiedenen Ausführungsformen verleihen diese veränderten Erkennungsdomänen im enzymatisch aktiven DNA-Molekül eine erhöhte Bindungsspezifität und -affinität zwischen dem enzymatisch aktiven DNA-Molekül und seinem Substrat.
Es wurde unlängst festgestellt, dass bestimmte Oligonukleotide in der Lage sind, andere Moleküle als Oligonukleotide mit komplementären Sequenzen zu erkennen und zu binden. Diesen Oligonukleotiden wird oft der Name „Aptamere" gegeben. Zum Beispiel beschreiben Ellington und Szostak RNA-Moleküle, welche in der Lage sind, an eine Vielzahl von organischen Farbstoffen zu binden (Nature 346: 818–822 (1990)), während Bock, et al. ssDNA (einzelsträngige DNA)-Moleküle beschreiben, welche menschliches Thrombin binden (Nature 355: 564–566 (1992)). In ähnlicher Weise beschreiben Jellinek et al. RNA-Liganden für den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (PNAS USA 90: 11227–11231 (1993)). Daher wird es weiterhin hier in Betracht gezogen, dass die erfindungsgemäßen katalytisch aktiven DNA-Enzyme gemäß der hier beschriebenen Verfahren verändert werden können, um eine Vielzahl von Fähigkeiten zu zeigen, welche typischerweise mit Aptameren assoziiert sind.
Ein Fachmann sollte daher anerkennen, dass die erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven DNA-Moleküle an einer beliebigen Nukleotidsequenz wie den Erkennungsdomänen durch verschiedene hier offenbarte Verfahren, einschließlich PCR und 3SR (von selbst weiterlaufende Sequenzreplikation -vgl. nachstehendes Beispiel 1) geändert werden können. Zum Beispiel können zusätzliche Nukleotide an das 5'-Ende des enzymatisch aktiven DNA-Moleküls durch Einschluss zusätzlicher Nukleotide angefügt werden.
Erfindungsgemäße enzymatisch aktive DNA-Moleküle können auch in einer eher nicht zufälligen Art und Weise wie ortspezifische Mutagenese hergestellt oder verändert werden. Zum Beispiel kann die ortspezifische Mutagenese im Wesentlichen, wie bei Morinaga, et al., Biotechnology 2: 636 (1984) beschrieben, modifiziert, wie hier beschrieben, zur Anwendung an Desoxyribozymen ausgeführt werden. Nützliche Verfahren zur Veränderung enzymatisch aktiver DNA-Moleküle werden in den nachstehenden Beispielen näher beschrieben.
In einer offenbarten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül einen konservierten Kern, der von zwei Substratbindungs- (oder Erkennungs-)Domänen oder Sequenzen, welche durch Basenpaarungswechselwirkungen mit dem Substrat interagieren, flankiert wird. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst der konservierte Kern eine oder mehrere konservierte Domänen oder Sequenzen. In einer anderen Variation umfasst das enzymatisch aktive DNA-Molekül weiterhin eine „Spacer"-Region (oder -Sequenz) zwischen den Regionen (oder Sequenzen), welche an der Basenpaarung beteiligt sind. In noch einer anderen Variation wird der konservierte Kern in verschiedenen Abständen durch eine oder mehrere weniger konservierte variable oder „Spacer"-Nukleotide „unterbrochen".
In verschiedenen Ausführungsformen besteht die Population der enzymatisch aktiven DNA-Moleküle aus mindestens 2 verschiedenen Typen von Desoxyribozym-Molekülen. Zum Beispiel haben die Moleküle in einer Variation unterschiedliche Sequenzen. In einer anderen Variation sind die Desoxyribozyme Nukleinsäuremoleküle mit einer Nukleinsäuresequenz, welche eine Erkennungsdomäne definiert, die angrenzend oder benachbart zum 5'-Terminus der Nukleotidsequenz ist. In verschiedenen alternativen Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven DNA-Moleküle weiterhin eine oder mehrere Spacer-Regionen, welche 3'-terminal der Erkennungsdomänen lokalisiert sind, ein oder mehrere Schleifen, welche 3'-terminal der Erkennungsdomänen lokalisiert sind, und/oder Spacer-Regionen umfassen. In anderen Variationen kann ein erfindungsgemäßes Desoxyribozym eine oder mehrere Regionen umfassen, welche in der Lage sind, an andere Regionen desselben Moleküls zu hybridisieren. Andere Charakteristika enzymatisch aktiver DNA-Moleküle, welche gemäß der hier offenbarten Verfahren hergestellt werden, werden hier an anderer Stelle beschrieben.
In anderen Ausführungsformen umfassen mutagenisierende Bedingungen solche Bedingungen, welche entweder definierte oder zufällige Nukleotidsubstitutionen innerhalb eines enzymatisch aktiven DNA-Moleküls einführen. Beispiele für typische mutagenisierende Bedingungen umfassen Bedingungen, welche in anderen Teilen dieser Spezifikation offenbart werden, und die Verfahren, welche bei Joyce et al., Nucl. Acids Res. 17: 711–722 (1989), Joyce, Gene 82: 83–87 (1989) und Beaudry und Joyce, Science 257: 635–41 (1992) beschrieben werden.
In noch anderen Ausführungsformen ist eine diverse Population von mutierten erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven DNA-Molekülen eine solche, die mindestens 2 Nukleinsäuremoleküle enthält, die nicht exakt dieselbe Nukleotidsequenz haben. In anderen Variationen wird dann aus solch einer diversen Population ein enzymatisch aktives DNA-Molekül oder andere enzymatisch aktive Nukleinsäuren mit einer vorab bestimmten Aktivität auf Basis der Fähigkeit, die vorab bestimmte Aktivität auszuüben, ausgewählt. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst die vorab bestimmte Aktivität, ohne sie einzuschränken, eine verstärkte katalytische Aktivität, eine verringerte K_M, erhöhte Substratbindungsfähigkeit, veränderte Substratspezifität und Ähnliches.
Andere Parameter, welche als Aspekte der Enzymleistung angesehen werden können, umfassen katalytische Aktivität oder Kapazität, Substratbindungsfähigkeit, Enzymumsatzgeschwindigkeit, Enzymsensitivität gegenüber Rückkopplungsmechanismen und Ähnliches. In bestimmter Hinsicht kann die Substratspezifität als ein Aspekt der Enzymleistung angesehen werden, insbesondere in Situationen, in welchen ein Enzym in der Lage ist, zwei oder mehr kompetitierende Substrate zu erkennen und zu binden, von denen jedes die Enzymleistung hinsichtlich der/des anderen Substrate/s beeinflusst.
Die Substratspezifität, wie sie hier verwendet wird, kann sich auf die Spezifität eines enzymatisch aktiven Nukleinsäuremoleküls für ein bestimmtes Substrat beziehen, wie es hier beschrieben wird, wie eines, welches nur Ribonukleotide, nur Desoxyribonukleotide oder eine Zusammensetzung von beiden umfasst. Substratmoleküle können auch Nukleotidanaloga umfassen. In verschiedenen Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives Nukleinsäuremolekül vorzugsweise eine bestimmte Region eines hybriden oder nicht hybriden Substrats binden.
Der Begriff oder Parameter, welcher hier als „Substratspezifität" identifiziert wird, kann auch die Sequenzspezifität umfassen; d. h. ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives Nukleinsäuremolekül kann ein Nukleinsäuresubstrat mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz „erkennen" und binden. Zum Beispiel, wenn die Substraterkennungsdomänen eines erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven Nukleinsäuremoleküls nur an Substratmoleküle mit einer Serie von einem oder zwei Ribonukleotiden (z. B. rA) in einer Reihe binden, dann wird das enzymatisch aktive Nukleinsäuremolekül dazu tendieren, das Nukleinsäuresubstrat ohne eine solche Sequenz nicht zu erkennen oder zu binden.
Im Hinblick auf das Auswahlverfahren umfasst in verschiedenen Ausführungsformen das Auswählen ein beliebiges Mittel der physikalischen Trennung von mutierten enzymatisch aktiven Nukleinsäuren mit einer vorab bestimmten Aktivität aus einer diversen Population mutierter enzymatisch aktiver Nukleinsäuremoleküle. Oftmals umfasst das Auswählen die Trennung aufgrund der Größe, des Vorhandenseins katalytischer Aktivität oder der Hybridisierung der mutierten Nukleinsäure an eine andere Nukleinsäure, an ein Peptid oder ein anderes Molekül, welches entweder in Lösung oder an eine feste Matrix angeheftet ist.
In verschiedenen Ausführungsformen ist die vorab bestimmte Aktivität so, dass die mutierte enzymatisch aktive Nukleinsäure mit der vorab bestimmten Aktivität in irgendeiner Art und Weise aufgrund ihrer die Aktivität markiert wird. Zum Beispiel kann die vorab bestimmte Aktivität eine enzymatisch aktive DNA-Molekül-Aktivität sein, wobei die Aktivität der mutierten enzymatisch aktiven Nukleinsäure auf ihr Substrat bewirkt, dass die mutierte enzymatisch aktive Nukleinsäure kovalent damit verbunden wird. Die mutierte enzymatisch aktive Nukleinsäure wird dann aufgrund der kovalenten Verknüpfung ausgewählt.
In anderen Ausführungsformen umfasst das Auswählen der mutierten enzymatisch aktiven Nukleinsäure mit einer vorab bestimmten Aktivität die Amplifizierung der mutierten enzymatisch aktiven Nukleinsäure (vgl. z. B. Joyce, Gene 82: 83–87 (1989), Beaudry und Joyce, Science 257: 635–41 (1992)). Andere Verfahren des Auswählens eines enzymatisch aktiven Nukleinsäuremoleküls mit einer vorab bestimmten Eigenschaft oder Aktivität werden im Beispielteil beschrieben.
E. Zusammensetzungen
Die Erfindung zieht auch Zusammensetzungen, enthaltend eine(n) oder mehrere Typen oder Populationen erfindungsgemäßer enzymatisch aktiver DNA-Moleküle, in Betracht; z. B. können verschiedene Typen oder Populationen verschiedene Nukleotidsequenzen erkennen und spalten. Die Zusammensetzungen können weiterhin ein Ribonukleinsäure enthaltendes Substrat umfassen. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können weiterhin das Blei-Ion, Magnesium-Ion oder andere divalente oder monovalente Kationen, wie hier diskutiert, umfassen.
Vorzugsweise ist das enzymatisch aktive DNA-Molekül in einer Konzentration von etwa 0,05 μM bis etwa 2 μM vorhanden. Typischerweise ist das enzymatisch aktive DNA-Molekül in einem Konzentrationsverhältnis von enzymatisch aktivem DNA-Molekül zu Substrat von etwa 1:5 bis etwa 1:50 vorhanden. Stärker bevorzugt ist das enzymatisch aktive DNA-Molekül in der Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 1 μM vorhanden. Sogar noch stärker bevorzugt enthalten Zusammensetzungen das enzymatisch aktive DNA-Molekül in einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 0,5 μM. Vorzugsweise ist das Substrat in der Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 0,5 μM bis etwa 1000 μM vorhanden.
Ein Fachmann wird verstehen, dass es viele Quellen von Nukleinsäure enthaltenden Substraten gibt, einschließlich der natürlich vorkommenden und synthetischen Quellen. Quellen von geeigneten Substraten umfassen ohne Beschränkung eine Vielzahl von viralen und retroviralen Mitteln, einschließlich HIV 1, HIV-2, HTLV-I und HTLV-II.
Andere geeignete Substrate umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, virale und retrovirale Mittel, einschließlich solche, die Picornaviren, Hepadnaviridae (z. B. HBV, HCV), Papillomaviren (z. B. HPV), Gammaherpesvirinae (z. B. EBV), Lymphocryptoviren, Leukämieviren (z. B. HTLV-I und -II), Flaviviren, Togaviren, Herpesviren (einschließlich Alphaherpesviren und Betaherpesviren), Cytomegalieviren (CMV), Influenzaviren und Viren und Retroviren, welche zu Immunschwächeerkrankungen oder -syndromen (z. B. HIV-1 und -2) beitragen, umfassen oder durch sie produziert werden. Zusätzlich umfassen geeignete Substrate virale und retrovirale Mittel, welche nicht-menschliche Primaten und andere Tiere infizieren, einschließlich und ohne Beschränkung darauf, die Affen- und Katzen-Immunschwächeviren und Rinder-Leukämieviren.
Magnesium-Ionen, Blei-Ionen oder andere geeignete monovalente oder divalente Kationen können auch, wie zuvor beschrieben, in einer Konzentration im Bereich von etwa 1–100 mM in der Zusammensetzung vorhanden sein. Stärker bevorzugt ist das vorab ausgewählte Ion in der Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 2 mM bis etwa 50 mM vorhanden, wobei eine Konzentration von etwa 5 mM besonders bevorzugt wird. Ein Fachmann wird verstehen, dass die Ionenkonzentration nur durch die Grenzen der Löslichkeit seiner Quelle (z. B. Magnesium) in wässriger Lösung und durch den Wunsch, das enzymatisch aktive DNA-Molekül in derselben Zusammensetzung in einer aktiven Konformation vorliegen zu haben, eingeschränkt wird.
Die Erfindung zieht auch Zusammensetzungen, enthaltend ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives Nukleinsäuremolekül, hybride Desoxyribonukleotid-Ribonukleotid-Moleküle und Magnesium- oder Blei-Ionen in Konzentrationen, wie vorstehend beschrieben, in Betracht. Wie vorstehend erwähnt, können andere monovalente oder divalente Ionen (z. B. Ca²⁺) anstelle des Magnesiums verwendet werden.
Ebenfalls durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden Zusammensetzungen, enthaltend ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives Nukleinsäuremolekül, ein Nukleinsäure enthaltendes Substrat (z. B. RNA) und ein vorab ausgewähltes Ion in einer Konzentration, die größer als etwa 1 millimolar ist, wobei das Substrat länger als die auf dem enzymatisch aktiven DNA-Molekül vorhandenen Erkennungsdomänen ist.
In einer Variation umfasst die Zusammensetzung einen Komplex aus enzymatisch aktivem Molekül-Substrat, wobei die Basenpaarung zwischen einem enzymatisch aktiven DNA-Molekül und seinem Substrat zusammenhängend ist. In einer anderen Ausführungsform wird die Basenpaarung zwischen einem enzymatisch aktiven DNA-Molekül und seinem Substrat durch eine oder mehrere nicht komplementäre Paare unterbrochen. In einer Vielzahl von alternativen Ausführungsformen kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung weiterhin ein monovalentes Kation, ein divalentes Kation oder beides umfassen.
In einer anderen Variation ist ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül in der Lage, effizient in Gegenwart oder Abwesenheit eines divalenten Kations zu funktionieren. In einer Variation ist ein divalentes Kation anwesend und umfasst Pb²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ oder Ca²⁺. Alternativ ist ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives Nukleinsäuremolekül in der Lage, effizient in Gegenwart oder Abwesenheit von monovalenten Kationen zu funktionieren. Es wird vorhergesehen, dass monovalente oder divalente Kationenkonzentrationen ähnlich denen, welche hier für Pb²⁺ oder Mg²⁺ beschrieben werden, nützlich sein werden, wie hier offenbart wird.
Optional können monovalente Kationen auch zusätzlich oder als „Alternative" zu divalenten Kationen vorhanden sein. Zum Beispiel können monovalente Kationen wie Natrium (Na⁺) oder Kalium (K⁺), entweder als dissoziierte Ionen oder in Form von dissoziierbaren Verbindungen wie NaCl oder KCl vorhanden sein.
In einer Ausführungsform reicht die Konzentration des in der Zusammensetzung vorhandenen monovalenten Kations von 0–1,0 M. In einer anderen Ausführungsform ist ein monovalentes Kation in einer Konzentration im Bereich von 0–200 mM vorhanden. In anderen Ausführungsformen sind monovalente Kationen in einer Konzentration in einem Bereich von 1–100 mM vorhanden. Alternativ reicht die Konzentration monovalenter Kationen von etwa 2 mM–50 mM. In noch anderen Ausführungsformen reicht die Konzentration von etwa 2 mM–25 mM.
F. Verfahren zur Verwendung enzymatisch aktiver DNA-Moleküle
Die Verfahren zur Verwendung enzymatisch aktiver DNA-Moleküle, wie sie hier offenbart werden, sind zahlreich. Wie zuvor diskutiert, haben die Moleküle, die in der Lage sind, benachbarte Nukleinsäuren verknüpfende Bindungen (z. B. Phosphoesterbindungen), zu spalten, vielfältige Verwendungen, umfassend eine breite Vielzahl von Anwendungen. Zum Beispiel sind enzymatisch aktive DNA-Moleküle mit den hier offenbarten Fähigkeiten, Strukturen und/oder Funktionen nützlich in pharmazeutischen und medizinischen Produkten (z. B. für die Wundreinigung, Auflösung von Blutgerinnseln etc.) sowie in Haushaltsmitteln (z. B. Detergenzien, Zahnhygieneprodukten, Fleischzartmachern). Die industrielle Nutzung der hier offenbarten Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren wird auch in Betracht gezogen und liegt sehr wohl innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch nützliche Verfahren zur Spaltung einer beliebigen einzelsträngigen, schleifenförmigen, teilweise oder vollständig doppelsträngigen Nukleinsäure; die Mehrzahl dieser Verfahren wenden die neuen, erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven Nukleinsäuren an. In verschiedenen Ausführungsformen umfasst das einzelsträngige Nukleinsäure-Segment oder der einzelsträngige Nukleinsäure-Anteil des Substrats (oder das gesamte Substrat selbst) DNA, modifizierte DNA, RNA, modifizierte RNA oder Zusammensetzungen davon. Vorzugsweise muss das Nukleinsäuresubstrat nur einzelsträngig an oder in der Nähe der Substratspaltungssequenz sein, so dass ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives Nukleinsäuremolekül mittels der Erkennungssequenz des Enzyms an die Substratspaltstelle hybridisieren kann.
Ein Nukleinsäuresubstrat, welches durch ein erfindungsgemäßes Verfahren gespalten werden kann, kann chemisch synthetisiert oder enzymatisch hergestellt werden oder es kann aus verschiedenen Quellen wie Phagen, Viren, prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, einschließlich Tierzellen, Pflanzenzellen, Hefezellen und Bakterienzellen, isoliert werden. Chemisch synthetisierte einzel- und doppelsträngige Nukleinsäuren sind im Handel von vielen Quellen erhältlich, einschließlich, ohne Beschränkung darauf, Research Genetics (Huntsville, AL).
RNA-Substrate können auch unter Verwendung eines Applied Biosystems (Foster City, CA)-Oligonukleotid-Synthesegeräts gemäß der Gebrauchsanleitung des Hersteller synthetisiert werden. Einzelsträngige Phagen sind auch eine Quelle für Nukleinsäuresubstrate. (Vgl. z. B. Messing et al., PNAS USA 74: 3642–3646 (1977) und Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103–119 (1985)). Bakterienzellen, die einen einzelsträngigen Phagen enthalten, wären auch eine verfügbare Quelle geeigneter einzelsträngiger Nukleinsäuresubstrate.
Einzelsträngige RNA, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren spaltbar ist, könnte durch einen beliebigen der RNA-Viren wie Picornaviren, Togaviren, Orthomyxoviren, Paramyxoviren, Rhabdoviren, Coronaviren, Arenaviren oder Retroviren bereitgestellt werden. Wie zuvor festgestellt, kann eine breite Vielfalt von prokaryontischen und eukaryontischen Zellen ebenfalls eine ausgezeichnete Quelle für geeignete Nukleinsäuresubstrate sein.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können auf einzelsträngige Nukleinsäuren oder einzelsträngige Bereiche von schleifenförmigen oder doppelsträngigen Nukleinsäuren angewendet werden, welche sich innerhalb einer Zelle befinden, einschließlich eukaryontischer, prokaryontischer, Pflanzen-, Tier-, Hefe- oder Bakterienzellen. Unter diesen Bedingungen könnte ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives Nukleinsäuremolekül (z. B. ein enzymatisch aktives DNA-Molekül oder Desoxyribozym) als antivirales Mittel oder als ein Regulator der Genexpression fungieren. Beispiele für solche Verwendungen von erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven DNA-Molekülen werden nachstehend weiter beschrieben.
In der Mehrzahl der erfindungsgemäßen Verfahren tritt die Spaltung von einzelsträngigen Nukleinsäuren am 3'-Terminus einer vorab bestimmten Basensequenz auf. Diese vorab bestimmte Basensequenz oder Substratspaltungssequenz enthält typischerweise 1 bis etwa 10 Nukleotide. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives Nukleinsäuremolekül in der Lage, Nukleotide entweder stromaufwärts oder stromaufwärts und stromabwärts der Spaltstelle zu erkennen. In verschiedenen Ausführungsformen ist ein enzymatisch aktives DNA-Molekül in der Lage, etwa 2–10 Nukleotide stromaufwärts der Spaltstelle zu erkennen; in anderen Ausführungsformen ist ein enzymatisch aktives DNA-Molekül in der Lage, etwa 2–10 Nukleotide stromaufwärts und etwa 2–10 Nukleotide stromabwärts der Spaltstelle zu erkennen. Andere bevorzugte Ausführungsformen ziehen ein enzymatisch aktives DNA-Molekül in Betracht, welches in der Lage ist, eine Nukleotidsequenz von bis zu etwa 30 Nukleotiden Länge zu erkennen, wobei eine Länge von bis zu etwa 20 Nukleotiden noch stärker bevorzugt wird.
Die hier offenbarten Verfahren erlauben die Spaltung einer beliebigen Nukleotidsequenz durch Änderung der Nukleotidsequenz der Erkennungsdomänen des enzymatisch aktiven DNA-Moleküls. Dies erlaubt die Spaltung von einzelsträngigen Nukleinsäuren in Abwesenheit einer Restriktionsendonukleasenstelle an der ausgewählten Position.
Ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül kann von einem beliebigen Teil eines einzelsträngigen Nukleinsäuresubstrats, welches an dem enzymatisch aktiven DNA-Molekül angeheftet bleibt, durch ortspezifische Hydrolyse an der geeigneten Spaltstelle getrennt werden. Die Trennung des enzymatisch aktiven DNA-Moleküls vom Substrat (oder „Spaltprodukt") erlaubt dem enzymatisch aktiven DNA-Molekül, eine andere Spaltungsreaktion auszuführen.
Im Allgemeinen wird das Nukleinsäuresubstrat unter geeigneten Nukleinsäurespaltungsbedingungen – vorzugsweise physiologische Bedingungen – mit einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven DNA-Moleküls behandelt. Wenn das Nukleinsäuresubstrat DNA umfasst, können die Spaltungsbedingungen die Anwesenheit eines divalenten Kations in einer Konzentration von etwa 2–10 mM umfassen.
Eine wirksame Menge eines enzymatisch aktiven DNA-Moleküls ist die Menge, die benötigt wird, um eine vorab bestimmte Basensequenz, die innerhalb einer einzelsträngigen Nukleinsäure vorhanden ist, zu spalten. Vorzugsweise ist das enzymatisch aktive DNA-Molekül in einem molaren Verhältnis von DNA-Molekül zu Substratspaltstellen von 1 zu 20 vorhanden. Dieses Verhältnis kann abhängig von der Länge der Behandlung und der Effizienz des jeweiligen enzymatisch aktiven DNA-Moleküls unter den jeweiligen angewendeten Nukleinsäurespaltungsbedingungen variieren.
Daher beinhaltet in einer bevorzugten Ausführungsform die Behandlung typischerweise die Beimengung in wässriger Lösung des RNA enthaltenden Substrats und des Enzyms, um eine Spaltungsbeimischung zu bilden und dann das Beibehalten der so unter RNA spaltenden Bedingungen gebildeten Beimengung für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, damit das enzymatisch aktive DNA-Molekül das RNA-Substrat an einer beliebigen der vorab bestimmten Nukleotidsequenzen in der RNA spalten kann. In verschiedenen. Ausführungsformen wird auch eine Quelle für Ionen bereitgestellt – d. h. monovalente oder divalente Kationen oder beides.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde die Menge an Zeit, die notwendig ist, um die einzelsträngige Nukleinsäure durch das enzymatisch aktive DNA-Molekül zu spalten, vorab bestimmt. Die Menge an Zeit reicht von etwa 1 Minute bis etwa 24 Stunden und variiert abhängig von der Konzentration der Reaktanden und der Temperatur der Reaktion. Üblicherweise ist die Zeitspanne von etwa 10 Minuten bis etwa 2 Stunden, so dass das enzymatisch aktive DNA-Molekül die einzelsträngige Nukleinsäure an einer beliebigen der vorab bestimmten vorhandenen Nukleotidsequenzen spaltet.
Die Erfindung zieht weiterhin in Betracht, dass die Nukleinsäure spaltenden Bedingungen die Anwesenheit einer Quelle von divalenten Kationen (z. B. PbOAc) in einer Konzentration von etwa 2–100 mM umfasst. Typischerweise umfassen die Nukleinsäure spaltenden Bedingungen ein divalentes Kation in einer Konzentration von etwa 2 mM bis etwa 10 mM, wobei eine Konzentration von etwa 5 mM besonders bevorzugt wird.
Die optimale, in die Nukleinsäure spaltenden Bedingungen einzuschließende kationische Konzentration, kann leicht durch Bestimmung der Menge der einzelsträngigen Nukleinsäure, die bei einer bestimmten Konzentration gespalten wird, bestimmt werden. Ein Fachmann wird verstehen, dass die optimale Konzentration abhängig vom jeweils angewendeten enzymatisch aktiven DNA-Molekül variieren kann.
Die vorliegende Erfindung zieht weiterhin in Betracht, dass die Nukleinsäure spaltenden Bedingungen einen pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa pH 9,0 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform reicht der pH-Wert von etwa pH 6,5 bis pH 8,0. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform strebt der pH-Wert physiologische Bedingungen an, d. h. der pH-Wert ist etwa 7,0–7,8, wobei ein pH-Wert von etwa 7,5 besonders bevorzugt wird.
Ein Fachmann wird anerkennen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren über einen weiten pH-Wert-Bereich funktionieren, solange der pH-Wert, welcher für die Spaltung von Nukleinsäuren verwendet wird, so ist, dass das enzymatisch aktive DNA-Molekül in der Lage ist, in der aktiven Konformation zu bleiben. Ein enzymatisch aktives DNA-Molekül in einer aktiven Konformation wird leicht durch seine Fähigkeit, einzelsträngige Nukleinsäure an einer vorab bestimmten Nukleotidsequenz zu spalten, nachgewiesen.
In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die Bedingungen zur Spaltung von Nukleinsäure auch eine Vielzahl an Temperaturbereichen. Wie zuvor erwähnt, werden Temperaturbereiche, die mit physiologischen Bedingungen konsistent sind, besonders bevorzugt, obwohl Temperaturbereiche, die mit industriellen Anwendungen konsistent sind, hier auch in Betracht gezogen werden. In einer Ausführungsform reicht die Temperatur von etwa 15°C bis etwa 60°C. In einer anderen Variation umfassen die Nukleinsäure spaltenden Bedingungen eine Temperatur im Bereich von etwa 30°C bis etwa 56°C. In noch einer anderen Variation umfassen die Bedingungen zur Spaltung von Nukleinsäure eine Temperatur von etwa 35°C bis etwa 50°C. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Bedingungen zur Spaltung von Nukleinsäure einen Temperaturbereich von etwa 37°C bis etwa 42°C. Die Temperaturbereiche, welche mit den Bedingungen zur Spaltung von Nukleinsäure konsistent sind, werden nur durch die gewünschte Spaltungsgeschwindigkeit und die Stabilität des jeweiligen enzymatisch aktiven DNA-Moleküls bei der jeweiligen Temperatur eingeschränkt.
In verschiedenen Verfahren zieht die vorliegende Erfindung Bedingungen zur Spaltung von Nukleinsäure, einschließlich das Vorhandensein von Polyamin, in Betracht. Polyamine, welche zur Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Spermidin, Putrescin, Spermin und Ähnliche. In einer Variation ist das Polyamin in einer Konzentration von etwa 0,01 mM bis etwa 10 mM vorhanden. In einer anderen Variation ist das Polyamin in einer Konzentration von etwa 1 mM bis etwa 10 mM vorhanden. Bedingungen zur Spaltung von Nukleinsäure können auch die Anwesenheit von Polyamin in einer Konzentration von etwa 2 mM bis etwa 5 mM umfassen. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist das Polyamin Spermidin.
G. Vektoren
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich auch durch Expressionsvektoren aus, einschließlich eines Nukleinsäureabschnitts, codierend ein erfindungsgemäßes enzymatisch aktives DNA-Molekül, welches innerhalb des Vektors gelegen ist, vorzugsweise in einer Art und Weise, welche die Expression dieses enzymatisch aktiven DNA-Moleküls innerhalb einer Zielzelle (z. B. einer Pflanzen- oder Tierzelle) erlaubt.
Daher umfasst im Allgemeinen ein erfindungsgemäßer Vektor bevorzugt ein Plasmid, Cosmid, Phagemid, Virus oder einen Phagenvektor. Vorzugsweise umfassen geeignete Vektoren einzelsträngige DNA (ssDNA) – z. B. zirkuläre Phagemid-ssDNA. Es sollte auch anerkannt werden, dass erfindungsgemäße nützliche Vektoren nicht zirkulär sein müssen.
In einer Variation werden vorzugsweise Nukleotidsequenzen, welche jede der zusätzlichen, enzymatisch aktive DNA-Moleküle codierende Sequenzen flankieren, bereitgestellt, deren Sequenzen durch das erste enzymatisch aktive DNA-Molekül erkannt werden können. Die dazwischen liegenden oder flankierenden Sequenzen umfassen vorzugsweise mindestens 1 Nukleotid; stärker bevorzugt sind die dazwischen liegenden oder flankierenden Sequenzen etwa 2–20 Nukleotide lang, wobei Sequenzen von etwa 5–10 Nukleotiden Länge besonders bevorzugt werden.
Das Anfügen von Polynukleotidschwänzen kann ebenfalls nützlich sein, um das 3'-Ende des erfindungsgemäßen enzymatisch aktiven DNA-Moleküls zu schützen. Diese können durch Anfügen von polymeren Sequenzen durch Verwendung des Enzyms terminate Transferase bereitgestellt werden.
Ein erfindungsgemäßer Vektor umfasst zwei oder mehr enzymatisch aktive DNA-Moleküle. In einer Ausführungsform hat ein erstes enzymatisch aktives DNA-Molekül eine intramolekulare Spaltungsaktivität und ist in der Lage, Nukleotidsequenzen zu erkennen und zu spalten, um andere enzymatisch aktive DNA-Sequenzen freizusetzen; d. h. es ist in der Lage so funktionieren, dass es andere enzymatisch aktive DNA-Moleküle aus dem Vektor „freisetzt". Zum Beispiel ist ein Vektor vorzugsweise so konstruiert, dass, wenn das erste enzymatisch aktive DNA-Molekül exprimiert wird, dieses erste Molekül in der Lage ist, Nukleotidsequenzen zu spalten, die zusätzliche Nukleotidsequenzen flankieren, codierend ein zweites enzymatisch aktives DNA-Molekül, ein drittes enzymatisch aktives DNA-Molekül und so weiter. Angenommen, dass das erste enzymatisch aktive DNA-Molekül (d. h. das „freisetzende" Molekül) in der Lage ist, Oligonukleotidsequenzen intramolekular zu spalten, müssen die zusätzlichen (z. B. das zweite, dritte und so weiter) enzymatisch aktiven DNA-Moleküle (d. h. das „freigesetzte" Molekül) nicht die zum „freisetzenden" Molekül identischen Eigenschaften besitzen. Zum Beispiel sind in einer Ausführungsform die „freigesetzten" (d. h. das zweite, dritte etc.) enzymatisch aktiven DNA-Moleküle in der Lage, spezifische RNA-Sequenzen zu spalten, während das erste („freisetzende") enzymatisch aktive DNA-Molekül Nukleaseaktivität besitzt, welche ihm erlaubt, die „freigesetzten" Moleküle zu entlassen. In einer anderen Ausführungsform hat das „freigesetzte" enzymatisch aktive DNA-Molekül eine Amidbindung spaltende Aktivität, während das erste („freisetzende") enzymatisch aktive DNA-Molekül Nukleaseaktivität besitzt.
Alternativ kann das erste enzymatisch aktive DNA-Molekül auf einem separaten Vektor durch das zweite (und dritte, vierte etc.) enzymatisch aktive DNA-Moleküle) codiert werden und kann intermolekulare Spaltungsaktivität besitzen. Wie hier festgestellt wurde, kann das erste enzymatisch aktive DNA-Molekül ein selbstspaltendes enzymatisch aktives DNA-Molekül (z. B. ein Desoxyribozym) sein und das zweite enzymatisch aktive DNA-Molekül kann ein beliebiger gewünschter Typ eines enzymatisch aktiven DNA-Moleküls sein. Wenn ein Vektor veranlasst wird, DNA von diesen Nukleinsäuresequenzen zu exprimieren, hat diese DNA die Fähigkeit unter geeigneten Bedingungen jede der flankierenden Regionen zu spalten, um dadurch eine oder mehrere Kopien des zweiten enzymatisch aktiven DNA-Moleküls freizusetzen. Wenn gewünscht, können mehrere verschiedene zweite enzymatisch aktive DNA-Moleküle in dieselbe Zelle oder denselben Träger gebracht werden, um verschiedene Desoxyribozyme zu produzieren. Es wird auch in Betracht gezogen, dass ein oder mehrere beliebige Vektoren ein oder mehrere Ribozyme oder Desoxyribozyme in einer beliebigen Kombination „freisetzender" oder „freigesetzter" enzymatisch aktiver Nukleinsäuremoleküle umfassen, solange eine solche Kombination das gewünschte Ergebnis erzielt: die Freisetzung der enzymatisch aktiven Nukleinsäuremoleküle, welche in der Lage sind, vorab bestimmte Nukleinsäuremoleküle zu spalten.
Verfahren zur Isolierung und Reinigung erfindungsgemäßer enzymatisch aktiver DNA-Moleküle werden ebenfalls in Betracht gezogen. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Verfahren sind im Fachgebiet verschiedene Reinigungsverfahren (z. B. solche, die HPLC verwenden) und chromatographische Isolierungsverfahren verfügbar. Vgl. z. B. die Verfahren, die in der internationalen Anwendung Nr. WO 93/23569 beschrieben werden.
Es sollte sich auch verstehen, dass verschiedene Kombinationen der hier beschriebenen Ausführungsformen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Andere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus den vorstehenden Beschreibungen, aus den folgenden Beispielen und aus den Ansprüchen ersichtlich.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die vorliegende Erfindung, schränken sie jedoch nicht ein.
Beispiel 1
In-vitro-Evolution von enzymatisch aktiven DNA-Molekülen:
Ein Überblick
Die Verfahren der in-vitro-Selektion und in-vitro-Evolution erlauben es, neue Katalysatoren ohne die a priori-Kenntnis ihrer Zusammensetzung oder Struktur zu isolieren. Solche Verfahren wurden angewendet, um RNA-Enzyme mit neuen katalytischen Eigenschaften zu erhalten. Zum Beispiel stammten Ribozyme, welche mit dem Blei-Kation eine autolytische Spaltung unterlaufen, aus einem zufallsveränderten Pool von tRNA^Phe-Molekülen (Pan und Uhlenbeck, Biochemistry 31: 3887–3895 (1992)). Ribozym-Varianten der Gruppe I, welche DNA spalten können (Beaudry und Joyce, Science 257: 635–641 (1992) oder welche eine veränderte Metallabhängigkeit besitzen (Lehman und Joyce, Nature 361: 182–185 (1993)) wurden isoliert. Beginnend mit einem Pool von zufälligen RNA-Sequenzen wurden Moleküle erhalten, welche eine Polymerase-ähnliche Reaktion katalysieren (Bartel und Szostak, Science 261: 1411–1418 (1993)). Im vorliegenden Beispiel wird die Verfeinerung spezifischer katalytischer Eigenschaften eines entwickelten Enzyms durch Änderung der Selektionszwänge während eines in-vitro-Evolutionsverfahrens beschrieben.
Die Darwinsche Evolution erfordert die wiederholte Durchführung von drei Arbeitsgängen: (a) die Einführung einer genetischen Variation, (b) die Selektion von Individuen auf Basis von einigen Kriterien der Tauglichkeit und (c) die Amplifizierung von ausgewählten Individuen. Jeder dieser Arbeitsgänge kann in vitro umgesetzt werden (Joyce, Gene 82: 83 (1989)). Ein Gen kann durch chemische Modifikation, Einbau von zufallsveränderten mutagenen Oligodesoxynukleotiden oder ungenaue Vervielfältigung durch eine Polymerase mutagenisiert werden. (Vgl. z. B. Cadwell und Joyce, in PCR Methods and Applications 2: 28–33 (1992), Cadwell und Joyce, PCR Methods and Applications 3 (Erg.): S136–S140 (1994), Chu et al., Virology 98: 168 (1979), Shortle et al., Meth. Enzymol. 100: 457 (1983), Myers et al., Science 229: 242 (1985), Matteucci et al., Nucleic Acid Res. 11: 3113 (1983), Wells et al., Gene 34: 315 (1985), McNeil et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3545 (1985), Hutchison et al., PNAS USA 83: 710 (1986), Derbyshire et al., Gene 46: 145 (1986), Zakour et al., Nature 295: 708 (1982), Lehtovaara et al., Protein Eng. 2: 63 (1988), Leung et al., Technigue 1: 11 (1989), Zhou et al., Nucl. Acids Res. 19: 6052 (1991).)
Das Genprodukt kann zum Beispiel aufgrund seiner Fähigkeit, einen Liganden zu binden oder eine chemische Reaktion auszuführen, ausgewählt werden. (Vgl. z. B. Joyce id. (1989), Robertson und Joyce, Nature 344: 467 (1990), Tuerk et al., Science 249: 505 (1990).) Das Gen, welches zu dem ausgewählten Genprodukt gehört, kann durch ein reziprokes Primerverfahren wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. (Vgl. z. B. Saiki et al., Science 230: 1350–54 (1985), Saiki et al., Science 239: 487–491 (1988).)
Alternativ kann die Nukleinsäureamplifizierung unter Verwendung der von selbst ablaufenden Sequenzreplikation (3SR) ausgeführt werden. (Vgl. z. B. Guatelli et al., PNAS USA 87: 1874 (1990). Gemäß dem 3SR-Verfahren können Nukleinsäure-Zielsequenzen in vitro unter isothermischen Bedingungen exponentiell amplifiziert (repliziert) werden, wobei drei für die retrovirale Replikation essenzielle enzymatische Aktivitäten verwendet werden: (1) reverse Transkriptase, (2) RNase H und (3) eine DNA-abhängige RNA-Polymerase. Durch Nachahmung der retroviralen Strategie der RNA-Replikation mittels cDNA-Intermediaten werden durch diese Reaktion cDNA- und RNA-Kopien des ursprünglichen Ziels akkumuliert.
Zusammengefasst, wenn jemand die Entwicklung einer Population enzymatisch aktiver DNA-Moleküle in Erwägung zieht, repliziert eine zusammenhängende Serie von reverser Transkription und Transkriptionsreaktionen eine RNA-Zielsequenz mittels cDNA-Intermediaten. Die entscheidenden Elemente dieser Konzeption sind: (a) die Oligonukleotidprimer spezifizieren beide das Ziel und enthalten 5'-Verlängerungen, codierend die T7-RNA-Polymerasebindestelle, so dass die entstehenden cDNAs kompetente Transkriptionsmatrizen sind, (b) die cDNA-Synthese kann bis zur Vollendung beider Stränge durch Abbau der Matrizen-RNA in dem Zwischenprodukt-RNA-DNA-Hybrid durch RNase H fortschreiten und (c) die Reaktionsprodukte (cDNA und RNA) können als Matrizen für nachfolgende Schritte fungieren, was die exponentielle Replikation ermöglicht.
Wenn jemand enzymatisch aktive DNA-Moleküle entwickelt, sind verschiedene kritische Elemente dieses Konzepts etwas anders, wie in diesen Beispielen offenbart wird. Zum Beispiel (1) spezifizieren die Oligonukleotidprimer das Ziel und werden vorzugsweise in irgendeiner Weise – z. B. durch Biotinylieren – „markiert" oder gekennzeichnet, so dass die entstandenen kompetenten Matrizenstränge leicht identifiziert werden können und (2) hängt das verwendete in-vitro-Selektionsverfahren vorzugsweise von der Identifizierung des günstigsten Freisetzungsmechanismus ab.
Ein wesentliches Hindernis bei der Umsetzung der Darwin'schen in-vitro-Evolution ist die Notwendigkeit, Mutation und Amplifikation, von denen beide den Genotyp betreffen, mit Selektion, welche den Phänotyp betrifft, miteinander zu verbinden. Im Fall der Nukleinsäureenzyme, für welche Genotyp und Phänotyp in demselben Molekül verkörpert sind, ist diese Aufgabe vereinfacht.
A. Konzeption der enzymatisch aktiven DNA-Moleküle
Es ist wohlbekannt, dass einzelsträngige DNA interessante Tertiärstrukturen annehmen kann. Die Struktur einer „tDNA" erinnert zum Beispiel stark an die der entsprechenden tRNA. (Vgl. Paquette et al., Eur. J. Biochem. 189: 259–265 (1990).) Weiterhin war es möglich, die hohe Zahl von 31 von 35 Ribonukleotiden innerhalb eines Hammerkopf-Ribozyms zu ersetzen, während zumindest ein wenig der katalytischen Aktivität verblieb. (Vgl. Perreault et al., Nature 344: 565–567 (1990), Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 918–921 (1992), Yang et al., Biochemistry 31: 5005–5009 (1992).)
In-vitro-Selektionsverfahren wurden auf große Populationen von DNAs mit zufälliger Sequenz angewendet, was zu der Gewinnung von spezifischen DNA„Aptameren" führt, welche einen Ziel-Liganden mit hoher Affinität binden (Bock et al., Nature 355: 564–566 (1992), Ellington & Szostak, Nature 355: 850–852 (1992), Wyatt & Ecker, PNAS USA 91: 1356–1360 (1994)). Unlängst führten zwei Gruppen die erste NMR-Strukturbestimmung eines Aptamers, einer 15-mer-DNA durch, welche eine G-Quartett-Struktur bildet und das Protein Thrombin mit hoher Affinität bindet (Wang, et al., Biochemistry 32: 1899–1904 (1993), Macaya et al., PNAS USA 90: 3745–3749 (1993)). Diese Befunde wurden durch eine Röntgen-kristallographische Analyse bestätigt (Padmanabhan et al., J. Biol. Chem. 268: 17651–17654 (1993)).
Die Fähigkeit, ein Substratmolekül mit hoher Affinität und Spezifität zu binden, ist eine Voraussetzung für ein gutes Enzym. Zusätzlich muss ein Enzym von wohlpositionierten funktionellen Gruppen, entweder in sich selbst oder in einem Kofaktor, Gebrauch machen, um eine bestimmte chemische Transformation voranzutreiben. Außerdem muss das Enzym innerhalb des Verlaufs der Reaktion unverändert bleiben und in der Lage sein, mit katalytischem Umsatz zu arbeiten. Einige würden außerdem fordern, dass es ein informatorisches Makromolekül, bestehend aus Untereinheiten, deren spezifische Anordnung für die katalytische Aktivität verantwortlich ist, sein soll. Während diese Kriterien aus semantischen und chemischen Gründen zur Debatte stehen, dienen sie dazu, zwischen Phänomenen zur Erhöhung der chemischen Geschwindigkeit zu unterscheiden, die von einfachen Lösungsmitteleffekten bis zu biologischen Enzymen, die an der Grenze der Substratdiffusion arbeiten, reichen (Albery & Knowles, Biochemistry 15: 5631–5640 (1976)).
Wie nachstehend genauer beschrieben wird, strebten wir danach ein allgemeines Verfahren zur schnellen Gewinnung von DNA-Katalysatoren und DNA-Enzymen, ausgehend von zufälligen Sequenzen, zu entwickeln. Als anfängliches Ziel wählten wir eine Reaktion, von der wir annahmen, dass sie sehr wohl im Rahmen der Fähigkeit von DNA liegt: die hydrolytische Spaltung eines RNA-Phosphodiesters, unterstützt durch einen divalenten Metall-Kofaktor. Dies ist dieselbe Reaktion, die von einer Vielzahl von natürlich vorkommenden RNA-Enzymen ausgeführt wird, einschließlich der Hammerkopf- und Haarnadelmotive. (Vgl. z. B. Forster A. C. & Symons R. H., Cell 49: 211–220 (1987), Uhlenbeck, Nature 328: 596–600 (1987), Hampel & Tritz, Biochemistry 28: 4929–4933 (1989)).
Es wurde unlängst gezeigt, dass man, ausgehend von einer zufallsveränderten Genbank von tRNA-Molekülen, Ribozyme erhalten kann, welche bei neutralem pH-Wert eine Pb²⁺-abhängige, ortspezifische RNA-Phosphoesteraseaktivität haben (Pan & Uhlenbeck, Biochemistry 31: 3887–3895 (1992), Pan & Uhlenbeck, Nature 358: 560–563 (1992)). Dies ist analog zu der zufälligen selbstspaltenden Reaktion der Hefe-tRNA^Phe (Dirheimer & Werner, Biochimie 54: 127–144 (1972), welche von der spezifischen Koordination eines Pb²⁺-Ions an einer definierten Stelle innerhalb der tRNA abhängt. (Vgl. Rubin & Sundaralingam, J. Biomol. Struct. Dyn. 1: 639–646 (1983), Brown et al., Biochemistry 24: 4785–4801 (1985).)
Wie hier offenbart, umfassten unsere Ziele die Entwicklung von DNAs, welche eine Pb²⁺-abhängige Spaltung eines bestimmten RNA-Phosphoesters ausführen konnten, die ursprünglich innerhalb einer kurzen Leadersequenz, am 5'-Ende der DNA angeheftet, präsentiert wurde und schließlich innerhalb eines separaten Moleküls, welches in einer intermolekularen Weise mit schnellem katalytischen Umsatz gespalten werden kann, lokalisiert war. Diese Ziele wurden erfolgreich erreicht, wie nachstehend weiter beschrieben wird.
Es wurden keine Vermutungen angestellt, wie die DNA mit dem Ziel-Phosphorester und den umgebenden Nukleotiden in Wechselwirkung treten würde. Beginnend mit einem Pool von etwa 10¹⁴ zufälligen 50-mer-Sequenzen, ließ man die in-vitro-Selektion ihren Gang gehen. Nach fünf Runden der Selektion, ausgeführt über vier Tage, hatte die Population als Ganzes die Fähigkeit erreicht, den Ziel-Phosphoester in Gegenwart von 1 mM Pb²⁺ in einer Geschwindigkeit von etwa 0,2 min^–1 zu spalten. Dies ist eine etwa 10⁵-fache Steigerung, verglichen zur spontanen Spaltungsgeschwindigkeit unter denselben Reaktionsbedingungen.
Individuen wurden aus der Population isoliert, sequenziert und auf katalytische Aktivität getestet. Basierend auf dieser Information wurde die Reaktion in ein intermolekulares Format umgewandelt und dann vereinfacht, um eine ortspezifische Spaltung eines 19-mer-Substrats durch ein 38-mer-DNA-Enzym in einer Reaktion, die mit einer Umsatzgeschwindigkeit von 1 min^–1 bei 23°C und pH 7,0 in Gegenwart von 1 mM PbOAc abläuft, zu erlauben.
B. In-vitro-Selektionsschema
Ein Ausgangspool von etwa 10¹⁴ einzelsträngigen DNA-Molekülen wurde hergestellt, von denen alle eine 5'-Biotin-Einheit enthielten, anschließend gefolgt von einer festgelegten Domäne, welche ein einzelnes Ribonukleotid, eine potenzielle katalytische Domäne, bestehend aus 50 zufälligen Desoxyribonukleotiden, umfasst, und einer zweiten festgelegten Domäne, die am 3'-Terminus liegt (1).
Der Pool wurde durch ein verschachteltes PCR (Polymerasekettenreaktion)-Verfahren, beginnend mit einer synthetischen DNA, welche 50 zufällige Nukleotide, flankiert von Primer-Bindestellen, enthält, konstruiert. Der Primer für die verschachtelte PCR war ein 5'-biotinyliertes synthetisches Oligodesoxynukleotid mit einem 3'-terminalen Adenosinribonukleotid.
Oligonukleotide mit Ribonukleotid am Ende primen effizient die von der Matrize dirigierte Verlängerung im Kontext der PCR (L. E. Orgel, persönliche Mitteilung), was in diesem Fall zu einem Verlängerungsprodukt führt, welches ein einzelnes eingebettetes Ribonukleotid enthält.
1 stellt ein selektives Amplifizierungsschema zur Isolierung von DNAs dar, welche einen Ziel-RNA-Phosphoester spalten. Doppelsträngige DNA, enthaltend einen Bereich von 50 zufälligen Nukleotiden, wird durch PCR amplifiziert, indem ein 5'-biotinylierter DNA-Primer angewendet wird (z. B. Primer 3–3a oder 3b), der am 3'-Ende durch Adenosin-Ribonukleotid terminiert wird (repräsentiert durch das Symbol „N" oder „rA", wobei sowohl N als auch rA ein Adenosin-Ribonukleotid repräsentieren). Dieser Primer wird durch die Taq-Polymerase verlängert, um ein DNA-Produkt zu erhalten, welches ein einzelnes eingebettetes Ribonukleotid enthält. Die entstehende doppelsträngige DNA wird auf einer Streptavidin-Matrix immobilisiert und der nicht biotinylierte DNA-Strang wird durch Waschen mit 0,2 N NaOH entfernt. Nach erneuter Äquilibrierung der Säule mit einer gepufferten Lösung wird die Säule mit derselben Lösung mit zugegebenem 1 mM PbOAc gewaschen. DNAs, welche eine Pb²⁺-abhängige Selbstspaltung unterlaufen, werden von der Säule freigesetzt, im Elutionsmittel gesammelt und durch PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte werden dann verwendet, um die nächste Runde der selektiven Amplifizierung einzuleiten.
Die PCR-Produkte wurden über eine Streptavidin-Affinitätsmatrix gegeben, was zu einer nicht kovalenten Anheftung des 5'-biotinylierten Strangs der Duplex-DNA führte. Der nicht biotinylierte Strang wurde durch kurzes Waschen mit 0,2 NaOH entfernt und der gebundene Strang wurde in einem Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, 0,5 M KCl, 50 mM MgCl₂ und 50 mM HEPES (pH 7,0), bei 23°C äquilibriert. Als nächstes wurde 1 mM PbOAc in demselben Puffer bereitgestellt, was das Auftreten einer Pb²⁺-abhängigen Spaltung am Ziel-Phosphoester erlaubte, wodurch eine Untergruppe von DNAs aus der Strepavidin-Matrix freigesetzt wurde. Im Prinzip könnte eine individuelle DNA ihre eigene Freisetzung durch verschiedene Mittel erleichtern, wie die Aufhebung der Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin oder die Spaltung einer der Desoxyribonukleotidverknüpfungen. Man dachte, dass, basierend auf der relativen Labilität dieser Verknüpfung, die Spaltung der Ribonukleosid-3'-O-P-Bindung der wahrscheinlichste Mechanismus für die Freisetzung sein würde und dass die Pb²⁺-abhängige hydrolytische Spaltung es zulassen würde, dass die Freisetzung schnellstens auftritt. Im Prinzip sollte jedoch das in-vitro-Selektionsverfahren die günstigsten Freisetzungsmechanismen sowie jene Individuen, die am besten in der Lage sind, diesen Mechanismus auszuführen, identifizieren.
DNA-Moleküle, welche von der Matrix nach Zugaben von Pb²⁺ freigesetzt wurden, wurden im Elutionsmittel gesammelt, durch Fällung mit Ethanol konzentriert und einer verschachtelten PCR-Amplifizierung unterworfen. Wie bei der Konstruktion des Ausgangspools von Molekülen verwendete die erste PCR-Amplifizierung Primer, welche die zufällige Region flankieren (Primer 1 und 2), und die zweite verwendete einen 5'-biotinylierten Primer (Primer 3b), welcher ein 3'-terminates Riboadenylat hat, wodurch der Ziel-RNA-Phosphoester wieder eingeführt wurde. Das gesamte selektive Amplifizierungsverfahren benötigt 3–4 Stunden, um abzulaufen.
Die Moleküle werden auf drei Arten während jeder Runde dieses Verfahrens gereinigt: erstens, nach der PCR-Amplifizierung durch zweimalige Extraktion mit Phenol und einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol, dann Fällung mit Ethanol; zweitens, nach der Anheftung der DNA an Streptavidin, durch Wegwaschen aller nicht biotinylierten Moleküle unter stark denaturierenden Bedingungen und drittens, nach Elution mit Pb²⁺, durch Fällung mit Ethanol. Es gibt keinen Reinigungsschritt über Gelelektrophorese und daher keinen Selektionsdruck, der die Moleküle auf eine bestimmte Länge einschränkt.
C. Selektion der katalytischen DNA
Wir führten fünf aufeinanderfolgende Runden der in-vitro-Selektion durch, wobei die Reaktionszeit nach der Zugabe von Pb²⁺ stufenweise verringert wurde, um die Stringenz der Selektion stufenweise zu erhöhen. Während der Runden 1 bis 3 war die Reaktionszeit 1 Stunde, während Runde 4 war die Reaktionszeit 20 Minuten und während Runde 5 war sie 1 Minute. Der Ausgangspool der einzelsträngigen DNAs wurde, zusammen mit der Population von Molekülen, die nach jeder Runde der Selektion erhalten wurden, auf selbstspaltende Aktivität unter Bedingungen, die zu den während der in-vitro-Selektion angewendeten identisch waren, getestet (vgl. 2).
Für diesen Test wurden die Moleküle eher mit einer 5'-³²P- als mit einer 5'-Biotin-Einheit hergestellt, was den Nachweis von sowohl dem Ausgangsmaterial als auch dem 5'-Spaltprodukt erlaubt. Nach einer 5-minütigen Inkubation war keine nachweisbare Aktivität im Ausgangspool (G0) oder in der Population, die nach den ersten oder zweiten Runden der Selektion erhalten wurde, vorhanden. DNAs, die nach der dritten Runde (G3) erhalten wurden, zeigten ein bescheidenes Aktivitätsniveau; diese Aktivität erhöhte sich ständig und erreichte etwa 50% Selbstspaltung für die DNAs, die nach der fünften Runde der Selektion (G5) erhalten wurden. Die Spaltung wurde nur am Ziel-Phosphoester nachgewiesen, sogar nach langen Inkubationszeiten. Diese Aktivität ging verloren, wenn Pb²⁺ aus dem Reaktionsgemisch weggelassen wurde.
2 stellt die selbstspaltende Aktivität des Ausgangspools von DNA (G0) und von Populationen dar, welche nach der ersten bis fünften Runde der Selektion (G1–G5) erhalten wurden. Die Reaktionsgemische enthielten 50 mM MgCl₂, 0,5 M NaCl, 0,5 M KCl, 50 mM HEPES (pH 7,0 bei 23°C) und 3 nM [5'-³²P]-markierte DNA, die bei 23°C für 5 Minuten entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von 1 mM PbOAc inkubiert wurde. Das Symbol Pre repräsentiert die 108 Nukleotide lange Vorläufer-DNA (SEQ ID NO 4), Clv das 5'-Spaltprodukt von 28 Nukleotiden Länge (SEQ ID NO 5) und M den Primer 3a (SEQ ID NO 6), in der Länge dem 5'-Spaltprodukt entsprechend.
Das vorzugsweise dargestellte 5'-Spaltprodukt (Clv) von 28 Nukleotiden Länge hat die Sequenz 5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN-3', wobei „N" ein Adenosin-Ribonukleotid mit zusätzlichem 2',3'-zyklischem Phosphat am 3'-Ende (SEQ ID NO 5) repräsentiert. In alternativen Ausführungsformen repräsentiert „N" ein Adenosin-Ribonukleotid mit einem zusätzlichem 2'- oder 3'-Phosphat am 3'-Ende des Moleküls.
In 2 umfasst die Spur „G0", Bande „Prä" eine Stichprobe von 108 Nukleotiden langen Vorläufer-DNAs, von denen jede 50 zufällige Nukleotide umfasst. Daher wird eine beliebige „Prä"-Stichprobe eine breite Vielfalt von Vorläufer-DNAs enthalten und jede Stichprobe wird sich wahrscheinlich von vorangegangenen oder nachfolgenden Stichproben unterscheiden. Die Spuren „G1" bis „G5" enthalten „Prä"-Banden, welche zunehmend mit katalytischen DNA-Molekülen angereichert sind, aber immer noch eine große Anzahl von verschiedenen DNA-Sequenzen enthalten (d. h. sie unterscheiden sich in den 50 Nukleotiden der zufallsveränderten Domäne). Eine Probe dieser verschiedenen Sequenzen der „G5-Prä"-DNA wird in 3 bereitgestellt.
Schrotschuss-Klonierungsverfahren wurden angewendet, um Individuen der G5-Population zu isolieren; die vollständigen Nukleotidsequenzen von 20 dieser Subklone wurden dann bestimmt (vgl. 3). (Vgl. auch z. B. Cadwell und Joyce in PCR Methods and Applications 2: 28–33 (1992), Cadwell and Joyce, PCR Methods and Applications 3 (Erg.): S136–S140 (1994).) Von den 20 Sequenzen waren 5 einzigartig, zwei traten zweimal auf, eine trat dreimal auf und eine trat achtmal auf. Alle individuellen Varianten haben gemeinsame Sequenzelemente innerhalb der Region der 50 Nukleotide, welche im Ausgangspool der DNA zufallsverändert worden waren. Sie alle enthalten zwei mutmaßliche Matrizen-Regionen, eine mit Komplementarität zu einem Bereich von Nukleotiden, welcher unmittelbar stromaufwärts der Spaltstelle liegt, und die andere mit Komplementarität zu Nukleotiden, die mindestens vier Nukleotide stromabwärts liegen. Zwischen diesen beiden mutmaßlichen Matrizen-Regionen liegt eine variable Domäne von 1–11 Nukleotiden, gefolgt von der festgelegten Sequenz 5'-AGCG-3', dann eine zweite variable Domäne von 3–8 Nukleotiden und schließlich die festgelegte Sequenz 5'-CG-3' oder 5'-CGA-3'. Nukleotide, die außerhalb der beiden mutmaßlichen Matrizen-Regionen liegen, sind sowohl in der Sequenz als auch in der Länge hoch variabel. In allen sequenzierten Subklonen bleibt die den 50 ursprünglich zufallsveränderten Nukleotiden entsprechende Region bei einer Länge von insgesamt 50 Nukleotiden.
3 stellt die Sequenzausrichtung von individuellen Varianten, die nach fünf Runden der Selektion von der Population isoliert wurden, dar. Die festgelegte Substratdomäne (5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrAGGAAGAGATGGCGAC-3' oder 5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATNGGAAGAGATGGCGAC-3', wobei N ein Adenosin-Ribonukleotid repräsentiert) (SEQ ID NO 13) wird oben gezeigt, wobei das Ziel-Riboadenylat durch ein umgedrehtes Dreieck identifiziert wird. Substrat-Nukleotide, welche üblicherweise an den mutmaßlichen Basenpaar-Wechselwirkungen beteiligt sind, werden durch einen vertikalen Balken angezeigt. Sequenzen, welche den 50 ursprünglich zufallsveränderten Nukleotiden entsprechen, werden antiparallel mit der Substratdomäne ausgerichtet. Alle Varianten enden am 3'-Ende mit der festgelegten Sequenz 5'-CGGTAAGCTTGGCAC-3'(SEQ ID NO 1) („Primerstelle", nicht gezeigt). Nukleotide innerhalb der ursprünglich zufallsveränderten Region, von denen angenommen wird, dass sie mit der Substratdomäne Basenpaarungen eingehen, werden auf den rechten und linken Seiten der Figur angezeigt; die mutmaßlich Basenpaarungen ausbildenden (oder Substrat bindenden) Regionen der enzymatisch aktiven DNA-Moleküle sind in jeder der gezeigten Sequenzen einzeln eingerahmt. Die hochkonservierten Nukleotide innerhalb der mutmaßlichen katalytischen Domäne werden in den beiden eingerahmten Spalten dargestellt.
Während es abzusehen war, dass zusätzliche Daten hilfreich bei der Konstruktion eines aussagekräftigen Sekundärstrukturmodells der katalytischen Domäne sein werden, stellen wir fest, dass die katalytische Domäne unserer enzymatisch aktiven DNA-Moleküle wie die Hammerkopf- und Haarnadelribozyme einen konservierten Kern, flankiert von zwei Substratbindungsregionen (oder Erkennungsdomänen) zu haben scheint, welche durch Basenpaarungswechselwirkungen mit dem Substrat in Wechselwirkung treten. Ähnlich der Hammerkopf- und Haarnadelribozyme scheint die katalytische DNA auch einen kurzen Bereich ungepaarter Substratnukleotide – in diesem Fall 5'-GGA-3' – zwischen den beiden Regionen zu benötigen, welche an der Basenpaarung beteiligt sind.
Es war auch interessant festzustellen, dass jede der neun verschiedenen Varianten ein unterschiedliches Muster angenommener Komplementarität mit der Substratdomäne zeigte. In einigen Fällen war die Basenpaarung zusammenhängend, während sie in anderen Fällen durch eine oder mehrere nicht komplementäre Basen unterbrochen wurde. Die allgemeine Tendenz scheint so zu sein, dass sich mit Nukleotiden, die stromaufwärts der Spaltstelle liegen, verglichen zu denen, die stromabwärts liegen, festere Wechselwirkungen ausbilden. Bindungsstudien und Analysen zur ortspezifische Mutagenese sollten es uns ermöglichen, weitere Einblicke zu erhalten und diese Vermutung weiter zu erhärten.
Um weitere Einblicke in die Anforderungen an die Sequenz für die katalytische Funktion zu gewinnen, wurde die selbstspaltende Aktivität von sechs der neun Varianten getestet und unter den hier beschriebenen Selektionsbedingungen ausgewertet (vgl. 3). Nicht überraschend zeigte sich die Sequenz, die in acht der 20 Subklone auftrat, als die am reaktivste, mit einer Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung von 1,4 min^–1. Alle der untersuchten Varianten waren im Selbstspaltungstest aktiv und alle ergaben ein 5'-markiertes Produkt, welches der Spaltung an einem Ziel-RNA-Phosphoester entsprach.
Der dominante Subklon wurde weiter unter einer Vielzahl von Reaktionsbedingungen analysiert. Seine selbstspaltende Aktivität war von Pb²⁺ abhängig, war aber nicht beeinträchtigt, wenn Mg²⁺ aus dem Reaktionsgemisch weggelassen wurde. Es gab auch eine Notwendigkeit für ein monovalentes Kation, welche entweder durch Na⁺ oder K⁺ erfüllt werden kann. Die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhte sich linear mit der steigenden Konzentration des monovalenten Kations über den Bereich 0–1,0 M (r = 0,998). Andere Variablen, welche die Reaktion beeinflussen könnten, wie pH-Wert, Temperatur und das Vorhandensein von anderen divalenten Metallen, werden gerade weiter untersucht.
Beispiel 2
Materialien und Verfahren
A. Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga
Synthetische DNAs und DNA-Analoga wurden bei Operon Technologies bezogen. Das Substrat von 19 Nukleotiden 5'-pTCACTATrAGGAAGAGATGG--3'(oder 5'-pTCACTATNGGAAGAGATGG-3', wobei „N" ein Adenosin-Ribonukleotid repräsentiert) (SEQ ID NO 7), wurde durch die Verlängerung von 5'-pTCACTATrA-3'(oder 5'-pTCACTATN-3', wobei „N" ein Adenosin-Ribonukleotid repräsentiert), welche durch die reverse Transkriptase katalysiert wird, wie zuvor beschrieben (Breaker, Banerji & Joyce, Biochemistry 33: 11980–11986 (1994), unter Verwendung der Matrize 5'-CCATCTCTTCCTATAGTGAGTCCGGCTGCA-3' (SEQ ID NO 9) hergestellt. Primer 35'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATrA- 3'(oder 5'-GGGACGAATTCTAATACGACTCACTATN-3', wobei „N" ein Adenosin-Ribonukleotid repräsentiert) (SEQ ID NO 6), wurde entweder mit [y-³²P]ATP und T4-Polynukleotidkinase (Primer 3a) 5'-markiert oder 5'-thiophosphoryliert mit [y-S]ATP und T4-Polynukleotidkinase und anschließend mit N-Jodacetyl-N'-biotinylhexylendiamin (Primer 3b) biotinyliert.
B. Herstellung eines DNA-Pools
Der Ausgangspool von DNA wurde mittels PCR unter Verwendung des synthetischen Oligomers 5'-GTGCCAAGCTTACCG-N₅₀-GTCGCCATCTCTTCC-3' (SEQ ID NO 4) hergestellt, wobei N ein äquimolares Gemisch von G, A, T und C ist. Eine 2-ml-PCR, enthaltend 500 pMol des zufallsveränderten Oligomers, 1.000 pMol Primer 1 (5'-GTGCCAAGCTTACCG-3', SEQ ID NO 10), 500 pMol Primer 2 (5'- CTGCAGAATTCTAATACGACTCACTATAGGAAGAGATGGCGAC-3', SEQ ID NO 11), 500 pMol Primer 3b, 10 μCi [α-³²P]dATP und 0,2 U μl^–1 Taq-DNA-Polymerase wurde in Gegenwart von 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCI (pH 8,3 bei 23°C), 0,01 % Gelatine und 0,2 mM von jedem dNTP für 1 min bei 92°C, 1 min bei 50°C und 2 min bei 72°C, dann 5 Zyklen von 1 min bei 92°C, 1 min bei 50°C und 1 min 72°C inkubiert. Das entstehende Gemisch wurde zweimal mit Phenol und einmal Chlororform/Isoamylalkohol extrahiert und die DNA wurde durch Fällung mit Ethanol isoliert.
C. In-vitro-Selektion
Der Ausgangspool von DNA wurde in 500 μl Puffer A (1 M NaCl und 50 mM HEPES (pH 7,0 bei 23°C) resuspendiert und wurde wiederholt über eine Streptavidin-Säule (AffiniTip Strep 20, Genosys, The Woodlands, TX) gegeben. Die Säule wurde mit fünf 100-μl-Volumina Puffer A gewaschen, gefolgt von fünf 100-μl-Volumina 0,2 N NaOH, dann mit fünf 100-μl-Volumina Puffer B (0,5 M NaCl, 0,5 M KCl, 50 mM MgCl₂ und 50 mM HEPES (pH 7,0 bei 23°C)) äquilibriert. Die immobilisierte einzelsträngige DNA wurde im Verlauf von 1 Std. mit drei 20-μl-Volumina Puffer B mit zugesetztem 1 mM PbOAc eluiert. Das gesamte Verfahren der Immobilisierung und der Elution wurde bei 23°C durchgeführt. Das Elutionsmittel wurde in einem gleichen Volumen Puffer C (50 mM HEPES (pH 7,0 bei 23°C) und 80 mM EDTA) gesammelt und die DNA wurde mit Ethanol gefällt.
Die entstehende DNA wurde in einer 100-μl-PCR, enthaltend 20 pMol Primer 1, 20 pMol Primer 2, 0,05 U μl^–1 Taq-Polymerase, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCI (pH 8,3 bei 23°C), 0,01 % Gelatine und 0,2 mM eines jeden dNTP für 30 Zyklen von 10 Sek. bei 92°C, 30 Sek. bei 50°C und 30 Sek. bei 72°C amplifiziert. Die Reaktionsprodukte wurden zweimal mit Phenol und einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und die DNA wurde durch Fällung mit Ethanol gewonnen. Etwa 4 pMol der amplifizierten DNA wurden zu einem zweiten, verschachtelten PCR-Ansatz, enthaltend 100 pMol Primer 1, 100 pMol Primer 3b, 20 μCi[α-³²P]dATP und 0,1 U μl^–1Taq-Polymerase, in einem Gesamtvolumen von 200 μl zugegeben, wobei für 10 Zyklen von 1 Min. bei 92°C, 1 Min. bei 50°C und 1 min bei 72°C amplifiziert wurde. Die PCR-Produkte wurden noch einmal extrahiert und gefällt und die entstehende DNA wurde in 50 μl Puffer A resuspendiert und dann dazu verwendet, die nächste Runde der Selektion zu beginnen.
Die zweiten und dritten Runden wurden wie vorstehend ausgeführt, außer dass die verschachtelte PCR am Ende der dritten Runde in einem Volumen von 100 μl durchgeführt wurde. Während der vierten Runde wurde die Elutionszeit nach der Zugabe von Pb²⁺ auf 20 Min. reduziert (zwei 20-μl-Elutionsvolumina) und nur die Hälfte der rückgewonnenen DNA wurde in der ersten PCR verwendet, welche nur 15 Temperaturzyklen umfasste. Während der fünften Runde wurde die Elutionszeit auf 1 Min. reduziert (zwei 20-μl-Elutionsvolumina) und nur ein Viertel der gewonnenen DNA wurde in der ersten PCR verwendet, welche 15 Temperaturzyklen umfasste. Die DNA, welche nach der fünften Runde der Selektion erhalten wurde, wurde, wie zuvor beschrieben (Tsang & Joyce, Biochemistry 33: 5966–5973 (1994)), subkloniert und sequenziert.
D. Kinetische Analyse katalytischer DNAs
Populationen von DNA und verschiedenen subklonierten Individuen wurden mit einer 5'-³²P-Markierung durch asymmetrische PCR in einem 25-μl-Reaktionsgemisch, enthaltend 10 pMol Primer 3a, 0,5 pMol eingesetzte DNA und 0,1 U μl^–1 Taq-Polymerase, unter Bedingungen, wie vorstehend beschrieben, für 10 Zyklen von 1 Min. bei 92°C, 1 Min. bei 50°C und 1 min bei 72°C hergestellt. Die entstehenden [5'-³²P]-markierten Amplifizierungsprodukte wurden durch Elektrophorese in einem 10%-Polyacrylamid/8 M-Gel gereinigt.
Tests auf Selbstspaltung wurden nach Vorinkubation der DNA in Puffer B für 10 Min. ausgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von PbOAc in einer Endkonzentration von 1 mM gestartet und durch die Zugabe eines gleichen Volumens Puffer C gestoppt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese in einem 10%-igen Polyacrylamid/8 M-Gel getrennt. Kinetische Tests unter Bedingungen des mehrfachen Umsatzes wurden in Puffer B ausgeführt, welcher 50 μg ml^–1 BSA enthielt, um die Anheftung des Materials an die Gefäßwände zu verhindern. Substrat- und Enzymmoleküle wurden getrennt für 5 Min. in Reaktionspuffer ohne Pb²⁺ vorinkubiert, dann vereinigt und die Reaktion wurde durch Zugabe von PbOAc in einer Endkonzentration von 1 mM gestartet.
Beispiel 3
Entwicklung von intermolekular spaltenden Desoxyribozymen
A. Umwandlung in ein intermolekulares Format
Basierend auf dem variablen Muster mutmaßlicher Basenpaarungswechselwirkungen zwischen den katalytischen und den Substratdomänen der untersuchten Varianten wurde angenommen, dass es einigermaßen geradlinig sein würde, die durch DNA katalysierte Reaktion in ein intermolekulares Format umzuwandeln. Dadurch wollten wir die beiden Substrat-bindenden Regionen der Katalysatoren vereinfachen, so dass jede einen ununterbrochenen Bereich von 7–8 Basenpaaren mit dem Substrat bilden würde. Zusätzlich wollten wir ein Minimalsubstrat bereitstellen, welches auf die beiden Regionen, die Basenpaare ausbilden, und die dazwischenliegende Sequenz 5'-GGA-3' beschränkt ist (4A).
Die 4A und 4B stellen die durch DNA katalysierte Spaltung eines RNA-Phosphoesters in einer intermolekularen Reaktion dar, welche mit einem katalytischen Umsatz voranschreitet. 4A ist eine schematische Darstellung des zwischen dem 19-mer-Substrat und dem 38-mer-DNA-Enzym gebildeten Komplexes. Das Substrat enthält ein einzelnes Adenosin-Ribonukleotid („rA" oder „N", neben dem Pfeil), flankiert von Desoyxribonukleotiden. Das synthetische DNA-Enzym ist ein Teil von 38 Nukleotiden der am häufigsten vorkommenden Variante, die in 3 gezeigt wird. Hochkonservierte Nukleotide, welche innerhalb der mutmaßlichen katalytischen Domäne liegen, sind „eingerahmt". Wie dargestellt, ist eine konservierte Sequenz „AGCG", während eine andere „CG" ist (in 5'-3'-Richtung gelesen).
4B zeigt eine Eadie-Hofstee-Auftragung, die verwendet wurde, um K_m (negative Steigung) und V_max (y-Achsenabschnitt) für die durch DNA katalysierte Spaltung des [5'-³²P]-markierten Substrats unter Bedingungen, die zu den während der in-vitro-Selektion angewendeten identisch waren, zu bestimmen. Anfängliche Spaltungsgeschwindigkeiten wurden für Reaktionen bestimmt, die 5 nM DNA-Enzym und entweder 0,125, 0,5, 1, 2 oder 4 μM Substrat enthielten.
Bei der Gestaltung der katalytischen Domäne verließen wir uns stark auf die Zusammensetzung der reaktivsten Variante, indem wir um 2 Nukleotide am 5'-Ende und um 11 Nukleotide am 3'-Ende verkürzten. Die 15 Nukleotide, die zwischen den beiden Matrizen-Regionen lagen, blieben unverändert und ein einzelnes Nukleotid wurde in die 3'-Matrizen-Region eingefügt, um einen zusammenhängenden Bereich von Nukleotiden zu bilden, der in der Lage ist, mit dem Substrat Basenpaarungen einzugehen Das Substrat wurde auf die Sequenz 5'-TCACTATrA • GGAAGAGATGG-3'(oder 5'-TCACTATN • GGAAGAGATGG-3' vereinfacht, wobei „N" ein Adenosin-Ribonukleotid repräsentiert) (SEQ ID NO 12), wobei die unterstrichenen Nukleotide den beiden Regionen entsprechen, die an der Basenpaarung mit dem katalytischen DNA-Molekül beteiligt sind.
Das vereinfachte Reaktionssystem, welches ein katalytisches 38-mer-DNA-Molekül (Katalysator), gänzlich Desoxyribonukleotide umfassend, und ein 19-mer-Substrat verwendet, welches ein einzelnes Ribonukleotid, eingebettet in einer ansonsten ganz aus DNA bestehenden Sequenz, enthält, erlaubt eine effiziente durch DNA katalysierte Spaltung von Phosphoester mit schnellem Umsatz. Über eine 90-minütige Inkubation in Gegenwart von 0,01 μM Katalysator und 1 μM Substrat werden 46% des Substrats gespalten, entsprechend 46 Umsätzen des Katalysators. Eine vorläufige kinetische Analyse dieser Reaktion wurde ausgeführt und unter Bedingungen eines Vielfachumsatzes ausgewertet. Der DNA-Katalysator zeigt eine Michaelis-Menten-Kinetik, mit Werten für k_cat und K_m von 1 min^–1 beziehungsweise 2 μM (vgl. 4B). Der Wert für K_m ist erheblich größer als die erwartete Dissoziationskonstante zwischen dem Katalysator und dem Substrat, basierend auf Watson-Crick-Wechselwirkungen. Das Substrat wurde unter identischen Reaktionsbedingungen (jedoch in Abwesenheit eines Katalysators) inkubiert; ein Wert für k_uncat von 4 × 10^–6 min^–1 wurde erhalten. Dies ist konsistent mit dem berichteten Wert von 5 × 10^–3 min^–1 für die Hydrolyse des labileren 1-Nitrophenyl-1,2-Propandiol in Gegenwart von 0,5 mM Pb²⁺ bei pH 7,0 und 37°C (Breslow & Huang, PNAS USA 88: 4080–4083 (1991)).
Es wird nun angenommen, dass die Phosphoester-Spaltungsreaktion durch einen hydrolytischen Mechanismus voranschreitet, welcher einen Angriff durch das Ribonukleosid-2'-Hydroxyl auf das benachbarte Phosphat beinhaltet, was ein 5'-Produkt mit einem endständigen 2'(3')-zyklischen Phosphat und ein 3'-Produkt mit einem endständigen 5'-Hydroxyl erzeugt. Unterstützend für diesen Mechanismus ist, dass das 3'-Spaltprodukt effizient mit der T4-Polynukleotidkinase und [y-³²P]ATP phosphoryliert wird, was mit der Verfügbarkeit eines freien 5'-Hydroxyls konsistent ist (Daten nicht gezeigt).
B. Diskussion
Nach fünf Runden der in-vitro-Selektion wurde eine Population von einzelsträngigen DNA-Molekülen, die effizient die Pb²⁺-abhängige Spaltung eines Ziel-RNA-Phosphoesters katalysieren, erhalten. Basierend auf allgemeinen Eigenschaften von repräsentativen Individuen, die aus dieser Population isoliert wurden, wurde eine vereinfachte Version sowohl der katalytischen als auch der Substratdomänen konstruiert, was zu einem Beweis für den schnellen katalytischen Umsatz in einem intermolekularen Kontext führt. Daher stellt die katalytische 38-mer-Domäne ein Beispiel eines DNA-Enzyms oder was ein „Desoxyribozym" genannt werden könnte, bereit.
Dieses Molekül als ein Enzym zu bezeichnen, basierend auf der Tatsache, dass es ein informatorisches Makromolekül ist, welches in der Lage ist, eine chemische Umwandlung in einer Reaktion zu beschleunigen, die mit einem schnellen Umsatz voranschreitet und einer Michaelis-Menten-Kinetik folgt, wird nicht jedermanns Vorstellung davon, was ein Enzym ausmacht, zufrieden stellen. Einige könnten darauf bestehen, dass ein Enzym per Definition ein Polypeptid sein muss. Wenn man jedoch die Vorstellung eines RNA-Enzyms akzeptiert, dann erscheint es vernünftig, eine ähnliche Sichtweise bezüglich DNA-Enzymen zu übernehmen. Bedenkt man, wie schnell wir in der Lage waren, dieses Molekül aus einem Pool von DNAs mit zufälliger Sequenz zu erstellen, dann erwarten wir, dass viele andere Beispiele synthetischer DNA-Enzyme in der nahen Zukunft auftauchen werden.
Die Pb²⁺-abhängige Spaltung eines RNA-Phosphoesters wurde als ein anfängliches Ziel für die DNA-Katalyse ausgewählt, da es eine geradlinige Reaktion ist, welche nur die richtige Positionierung eines koordinierten Pb²⁺-Hydroxyls benötigt, um die Deprotonierung des 2'-Hydroxyls, welches angrenzend an die Spaltstelle liegt, zu erleichtern. (Vgl. z. B. Pan, et al., in The RNA World, Gesteland & Atkins (Hrsg.), S. 271–302, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1993).) Pb²⁺ ist dafür bekannt, dass es an der N7-Position von Purinen, an der O6-Position von Guanin, der O4-Position von Uracil und der N3-Position von Cytosin koordinativ gebunden wird (Brown et al., Nature 303: 543–546 (1993)). Daher erschien es unwahrscheinlich, dass die Unterschiede bei der Zuckerzusammensetzung und der Konformation der DNA verglichen zu RNA, die DNA daran hindern könnten, eine wohldefinierte Pb²⁺-Bindetasche zu bilden.
Ein Substrat, welches ein einzelnes Ribonukleotid innerhalb einer Sequenz enthielt, die ansonsten ganz aus DNA bestand, wurde ausgewählt, da es eine eindeutig bevorzugte Spaltstelle bereitstellte und sicherstellte, dass irgendeine entstehende katalytische Aktivität nur der DNA zugeschrieben werden kann. Die Substraterkennung scheint von zwei Regionen der Basenpaarungswechselwirkungen zwischen Katalysator und Substrat abhängig zu sein. Die nicht gepaarten Substratnukleotide 5'-GGA-3', welche zwischen diesen beiden Regionen liegen, können jedoch eine wichtige Rolle bei der Substraterkennung, der Metall-Koordination oder anderen Aspekten der katalytischen Funktion spielen.
Es wird weiterhin vorhergesehen, dass ein ganz aus RNA bestehendes Molekül, andere RNA-DNA-Zusammensetzungen und Moleküle, welche ein Nukleotidanalog oder mehrere Nukleotidanaloga enthalten, akzeptable Substrate sein können. Wie hier offenbart wird, können die hier beschriebenen in-vitro-Evolutionsverfahren erfolgreich genutzt werden, um enzymatisch aktive DNA-Moleküle mit den gewünschten Spezifitäten herzustellen. Weitere Analysen in dieser Richtung werden derzeit durchgeführt.
Zusätzlich sind Untersuchungen unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren im Gange, um zu bestimmen, ob die mutmaßlichen Basenpaarungswechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat hinsichtlich der Sequenz zu verallgemeinern sind. Die hier offenbarten Pb²⁺-abhängigen Desoxyribozyme können auch als Modellverbindungen zur Untersuchung der strukturellen und enzymatisch aktiven Eigenschaften von DNA verwendet werden.
Die in der vorliegenden Offenbarung angewendeten Verfahren zur schnellen Entwicklung von DNA-Katalysatoren werden eine beträchtliche Allgemeingültigkeit haben, was es uns erlaubt, andere Kofaktoren zu verwenden, um die Spaltung einer Zielverknüpfung, die an eine potenzielle katalytische Domäne angeheftet ist, einzuleiten. In dieser Hinsicht ist die Entwicklung von Mg²⁺-abhängigen Enzymen, welche Ziel-RNAs unter physiologischen Bedingungen spezifisch spalten, von Interesse, genau wie die Entwicklung von DNA-Enzymen, welche in Gegenwart von anderen Kationen funktionieren (vgl. Beispiel 4). Solche Moleküle stellen eine Alternative zu traditionellen Antisense- und Ribozym-Ansätzen für die spezifische Inaktivierung von Ziel-mRNAs bereit.
DNA ergänzt damit RNA und Protein auf der Liste von biologischen Makromolekülen, welche in der Lage sind, enzymatisch aktive Aktivität auszuüben. Das volle Ausmaß der katalytischen Aktivitäten von DNA bleibt noch zu untersuchen, aber diese Untersuchungen sollten, basierend auf in-vitro-Selektionsverfahren wie den in dieser Untersuchung angewendeten, rasch vorangehen.
DNA-Enzyme bieten verglichen zu anderen makromolekularen Katalysatoren mehrere wichtige Vorteile. Als erstes sind sie in einem Zeitalter, in dem die meisten Labors Zugang zu einem automatisierten DNA-Synthesegerät haben, einfach herzustellen und die Kosten für DNA-Phosphoamidite sind recht günstig geworden. Zweitens sind sie, besonders verglichen mit RNA, sehr stabile Verbindungen, so dass ihre Verwendung bei biophysikalischen Untersuchungen erleichtert wird. Drittens erwarten wir, dass sie an therapeutische Anwendungen angepasst werden können, welche derzeit Antisense-DNAs verwenden, denen RNA spaltende Aktivität fehlt. Eine in-vitro-Selektion könnte mit DNA-Analoga ausgeführt werden, einschließlich Verbindungen, welche Nuklease-resistent sind, wie Phosphorothioat enthaltende DNA, solange diese Analoga in Form eines Desoxynukleosid-5'-Triphosphats hergestellt werden können und von einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase als Substrat akzeptiert werden. Schließlich bieten die DNA-Enzyme eine neue Einsicht in unser Verständnis der makromolekularen Basis der katalytischen Funktion. Es wird interessant sein, zum Beispiel vergleichende Analysen von Protein-, RNA- und DNA-basierten Enzymen, welche dieselbe chemische Transformation katalysieren, durchzuführen.
Beispiel 4
Andere Familien katalytischer DNAs
Ein Ausgangspool von DNA wurde, im Wesentlichen wie in Beispiel 2.B. vorstehend beschrieben, durch PCR hergestellt, mit der Ausnahme, dass der Ausgangspool von DNA Moleküle umfasste, die 40 zufällige Nukleotide enthielten. Daher wurde der hier beschriebene Ausgangspool an DNA mittels PCR unter Verwendung des synthetischen Oligomers 5'-GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CAT CTC N₄₀GT GAC GGT AAG CTT GGC AC-3' (SEQ ID NO 23) hergestellt, wobei N ein äquimolares Gemisch von G, A, T und C ist und wobei die DNA-Moleküle nach ihrer Fähigkeit, Phosphoester nach dem Ziel-rA zu spalten, ausgewählt wurden. (Vgl. auch 6A.)
Eine selektive Amplifizierung wurde in der Gegenwart von entweder Pb²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺ oder Mg²⁺ ausgeführt, wodurch mindestens vier „Familien" katalytischer DNA-Moleküle hergestellt wurden. Wie in 5 dargestellt wird, wurden katalytische DNA-Moleküle, welche spezifische Aktivität zeigen, in Gegenwart einer Vielzahl von Kationen hergestellt.
5 ist eine photographische Darstellung, welche ein Polyacrylamidgel zeigt, das eine spezifische Endoribonukleaseaktivität von vier Familien ausgewählter katalytischer DNAs demonstriert. Die Auswahl einer Pb²⁺-abhängigen Familie von Molekülen wurde in einer parallelen Weise als Kontrolle wiederholt. In jeder Gruppe von drei Spuren zeigt die erste Spur das Fehlen der Aktivität der ausgewählten Population in Abwesenheit des Metallkations, die zweite Spur zeigt die beobachtete Aktivität in Gegenwart des Metallkations und die dritte Spur zeigt das Fehlen der Aktivität im Ausgangspool (GO). Gegenwärtig wird die Reihenfolge der Reaktivität als Pb²⁺ > Zn²⁺> Mn²⁺> Mg²⁺ beobachtet, was den pK_a des entsprechenden Metallhydroxids widerspiegelt.
Nach entweder fünf (G5) oder sechs Runden (G6) der selektiven Amplifizierung in Gegenwart des vorab ausgewählten divalenten Kations wurde die gewünschte Endonukleaseaktivität erhalten. Die folgende Beschreibung der selektiven Amplifizierung in Gegenwart von Mg²⁺ ist als beispielhaft gedacht.
Sechs Runden der selektiven in-vitro-Amplifizierung wurden gemäß dem Verfahren, das hier vorstehend in Beispiel 2 beschrieben wurde, ausgeführt, außer dass das verwendete divalente Metall 1 mM Mg²⁺ statt 1 mM Pb²⁺ war. (Vgl. auch Breaker und Joyce, Chem. & Biol. 1: 223–229 (1994), wo im Wesentlichen dasselbe Verfahren beschrieben wird.
Individuelle Klone wurden nach der sechsten Runde isoliert und die Nukleotidsequenz von 24 dieser Klone wurde bestimmt. All diese Sequenzen begannen mit:
5'-GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CA (SEQ ID NO 23 von Position 1 bis 44) und endeten mit CGG TAA GCT TGG CAC-3' (SEQ ID NO 23 von Position 93 bis 107).
Der Abschnitt in der Mitte, entsprechend TCTC N₄₀ GTGA (SEQ ID NO 23 von Position 45 bis 92) im Ausgangspool, variierte wie folgt:
Die voranstehende Zahl in Klammern zeigt die Zahl der Klone an, die diese bestimmte Sequenz haben. Man beachte, dass einige Mutationen (in Fettdruck hervorgehoben) an anderen Nukleotidpositionen auftraten als diejenigen, die ursprünglich randomisiert waren.
Die zweite vorstehend aufgeführte Sequenz (d. h. SEQ ID NO 25), welche in 5 von 24 Klonen auftrat, wurde als Leitverbindung (d. h. hauptsächliche Verbindung) für weitere Untersuchungen ausgewählt. Ihre Spaltungsaktivität wurde in Gegenwart einer 1 mM Konzentration von verschiedenen divalenten Metallen und 1 M NaCl bei pH 7,0 und 23°C gemessen:

Metall k_obs (min^–1)

keins n.b.

Mg²⁺ 2,3 × 10^–3

Mn²⁺ 6,8 × 10^–3

Zn²⁺ 4,2 × 10^–2

Pb²⁺ 1,1 × 10^–2
Daher ist die Leitverbindung in Gegenwart aller vier divalenten Metalle aktiv, obwohl sie aufgrund der Aktivität in Gegenwart von Mg²⁺ ausgewählt wurde. Umgekehrt zeigten DNA-Moleküle, welche auf Aktivität in Gegenwart von Mn²⁺, Zn²⁺ oder Pb²⁺ ausgewählt wurden, in Gegenwart von Mg²⁺ keine Aktivität.
Zusätzlich zeigte die Population der nach sechs Runden der in-vitro-Selektion bei Vorhandensein von Mg²⁺ erhaltenen DNA, wenn sie als ausschließlich Phosphorothioat enthaltende DNA-Analoga hergestellt wurde, eine Mg²⁺-abhängige Spaltungsaktivität mit einer beobachteten Geschwindigkeit von ~10^–3 min^–1. Die Phosphorothioat enthaltenden Analoga wurden enzymatisch so hergestellt, dass sie eine R_p-Konfiguration an jedem Stereozentrum hatten. Solche Verbindungen sind im Vergleich zu nicht modifizierter DNA relativ resistent gegenüber Abbau durch zelluläre Nukleasen.
Die Leitverbindung wurde an 40 Nukleotidpositionen (unterstrichen) erneut zufallsverändert, wodurch Mutationen in einer Häufigkeit von 15% eingeführt wurden (5% Wahrscheinlichkeit für jede der drei möglichen Basensubstitutionen). Die erneut zufallsveränderte Population wurde sieben zusätzlichen Runden der in-vitro- Selektion unterworfen. Während der letzten vier Runden wurden Moleküle, die bei Vorhandensein von 1 mM Pb²⁺ reaktiv waren, aus der Population entfernt, bevor der Rest zu einer Reaktion bei Vorhandensein von 1 mM Mg²⁺ herausgefordert wurde. Individuelle Klone wurden nach der siebten Runde isoliert und die Nukleotidsequenz von 14 dieser Klone wurde bestimmt. All diese Sequenzen begannen mit:
5'-GGG ACG AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT rA GG AAG AGA TGG CGA CAT CTC (SEQ ID NO 23, von Position 1 bis 48) und endeten mit:
GTG ACG GTA AGC TTG GCA C-3' (SEQ ID NO 23, von Position 89 bis 107). Der Abschnitt in der Mitte, entsprechend den 40 teilweise zufallsveränderten Positionen (N₄₀, SEQ ID NO 23, von Position 49 bis 88), variierte wie folgt:
Die Zahl in Klammern zeigt die Zahl der Klone an, die diese bestimmte Sequenz haben. Nukleotide in Fettdruck sind diejenigen, die sich im Vergleich zur Leitverbindung unterscheiden.
Eine formale Analyse der Spaltungsaktivität dieser Klone dauert an. Die Population als Ganzes zeigt eine Mg²⁺-abhängige Spaltungsaktivität in einer beobachteten Geschwindigkeit von ~10^–2 min^–1 mit einem vergleichbaren Aktivitätsniveau in Gegenwart von Pb²⁺.
Die 6A und 6B stellen zweidimensionale Abbildungen eines katalytischen „Vorläufer"-DNA-Moleküls beziehungsweise eines von mehreren katalytischen DNA-Molekülen, welche durch hier offenbarten selektiven Amplifizierungsverfahren erhalten wurden, bereit. 6A stellt ein beispielhaftes Molekül aus dem Ausgangspool dar, welches die gesamte Konfiguration der durch SEQ ID NO 23 repräsentierten Moleküle zeigt. Wie dargestellt, flankieren verschiedene komplementäre Nukleotide die zufällige (N₄₀)-Region.
6B ist eine schematische Darstellung eines der Mg²⁺-abhängigen katalytischen DNA-Moleküle (oder „DNAzyme"), welche durch die hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. Die Lage der Ribonukleotide in der Substratnukleinsäure wird durch den Pfeil angezeigt. (Das dargestellte Molekül umfasst die hier als SEQ ID NO 25 identifizierte Sequenz sowie die „Anfangs"- und „End"-Sequenzen von SEQ ID NO 23.)
Die Endonukleaseaktivität wird weiterhin in jeder der vorstehend erwähnten „Familien" durch in-vitro-Evolution, wie hier offenbart, verstärkt, so dass erwartet wird, dass enzymatisch aktive DNA-Moleküle mit zunehmend wünschenswerten Spezifitäten erfolgreich unter Verwendung der hier offenbarten Leitlinien hergestellt werden können.
Beispiel 5
Spaltung größerer RNA-Sequenzen
Als eine Erweiterung des Vorstehenden haben wir DNA-Enzyme entwickelt, welche eher ein ganz aus RNA bestehendes Substrat spalten, als ein einzelnes Ribonukleotid, welches in ein ansonsten nur aus DNA bestehendes Substrat eingebettet ist, wie vorstehend gezeigt. (Vgl. auch R.R. Breaker & G.F. Joyce, Chem. & Biol. 1: 223–229 (1994); R.R. Breaker & G.F. Joyce, Chem. & Biol. 2: 655–660 (1995)). Als eine Zielsequenz wählten wir einen Bereich von 12 hochkonservierten Nukleotiden innerhalb der U5-LTR-Region der HIV RNA mit der Sequenz 5' GUAACUAGAGAU 3' (SEQ ID NO 49) aus.
Gemäß den in den vorangehenden Beispielen beschriebenen Verfahren stellten wir einen Pool von 1014 DNA-Molekülen her, welche die folgende Zusammensetzung haben:
5'-GGAAAA r(GUAACUAGAU)GGAAGAGATGGCGAC N₅₀ CGGTAGCTTGGCAC-3' (SEQ ID NO 50),
wobei N ein äquimolares Gemisch der Desoxyribonukleotide G, A, T, und C ist und wobei die Sequenz, die als „r(GUAACUAGAGAU)" identifiziert wird, aus Ribonukleotiden zusammengesetzt ist. (Wahlweise kann man die anfängliche 5'-Nukleotidsequenz ändern, z. B. durch Zugabe eines zusätzlichen dA-Restes zu der Sequenz, die dem Ribonukleotidanteil am 5'-Ende vorangeht, was verursacht, dass die anfängliche Sequenz als „GGAAAAA" gelesen wird und dass SEQ ID NO 50 99 Nukleotide lang ist. Dies ist offenkundig nur ein Beispiel für Modifikationen, welche gemacht wurden, um spezifische enzymatisch aktive DNA-Moleküle zu konstruieren, wie hier genau offenbart wird.)
Die so hergestellten enzymatisch aktiven DNA-Moleküle wurden nach ihrer Fähigkeit einen Phosphoester zu spalten, der innerhalb der eingebetteten RNA-Zielsequenz liegt, ausgewählt. Zehn Runden der selektiven in-vitro-Amplifizierung wurden basierend auf der Aktivität der enzymatisch aktiven DNA-Moleküle bei Vorhandensein von 10 mM Mg²⁺ bei pH 7,5 und 37°C ausgeführt. Während des Selektionsverfahrens gab es eine Konkurrenz um die „bevorzugten" Spaltstellen sowie um den „besten" Katalysator, welcher an jeder der so bevorzugten Stellen spaltet. Für zwei Stellen und zwei Familien von Katalysatoren stellte sich heraus, dass sie die wirksamste Spaltungsfähigkeit zeigten (Vgl. 7).
7 stellt einige der Ergebnisse aus zehn Runden der selektiven in-vitro-Amplifizierung dar, die im Wesentlichen, wie hier beschrieben, durchgeführt wurde. Wie gezeigt, stellten sich zwei Stellen und zwei Familien von Katalysatoren als diejenigen heraus, welche die effizienteste Spaltung der Zielsequenz zeigten. Die Spaltungsbedingungen waren im Wesentlichen, wie in 7 angegeben, nämlich 10 mM Mg²⁺, pH 7,5 und 37°C; die Daten, die gesammelt wurden, nachdem die Reaktion für 2 Stunden gelaufen war, werden gezeigt. Die Spaltung (%) wird gegen die Anzahl der Generationen (hier 0 bis 10) aufgetragen gezeigt. Die Zahl/das Vorherrschen der katalytischen DNA-Moleküle, die in der Lage sind, die Zielsequenz an den angegebenen Stellen im Substrat zu spalten, wird durch senkrechte Balken angezeigt, wobei die Spaltung bei GIUAACUAGAGAU durch gestreifte Balken und die Spaltung bei GUAACUAIGAGAU durch offene (leicht schattierte) Balken dargestellt wird. In der hier gezeigten 7 weist der Pfeil (↓) auf die Stelle zwischen zwei benachbarten Nukleotiden hin, an der die Spaltung stattfindet.
Verschiedene Individuen aus der Population, welche nach der 8ten und 10ten Runde der selektiven Amplifizierung erhalten wurden, wurden kloniert. Die Nukleotidsequenzen von 29 Individuen aus der 8ten Runde und 32 Individuen aus der 10ten Runde wurden dann bestimmt (vgl. Tabelle 2 beziehungsweise 3).
Unter der Überschrift „Nukleotidsequenz" in jeder der Tabellen 2 und 3 wird der Anteil jedes identifizierten Klons gezeigt, welcher den 50 Nukleotiden entspricht, die im Ausgangspool zufallsverändert waren (d. h. N₅₀); daher umfasst die gesamte Nukleotidsequenz eines bestimmten Klons im Allgemeinen die Nukleotidsequenzen, welche dem „N₅₀"-Segment vorausgehen, ihm folgen und dieses beinhalten, unter der Annahme, dass die Substratsequenz angeheftet ist und keine Selbstspaltung aufgetreten ist. Zum Beispiel kann die gesamte Sequenz eines (nicht selbst gespaltenen) Klons im Allgemeinen die Reste Nr. 1–33 von SEQ ID NO 50 umfassen, gefolgt von den Resten, welche die zufallsveränderte N₅₀-Region repräsentieren, gefolgt von den Resten Nr. 84–98 von SEQ ID NO 50 oder von den Resten Nr. 1–34 von SEQ ID NO 51, gefolgt von den Resten, welche die zufallsveränderte Region repräsentieren, gefolgt von den Resten Nr. 85–99 von SEQ ID NO 51. Es wird jedoch angenommen, dass die N₅₀ (oder N₄₀)-Region – oder ein Anteil davon – eines jeden Klons besonders wichtig bei der Bestimmung der Spezifität und/oder Aktivität eines bestimmten enzymatisch aktiven DNA-Moleküls ist. Dies wird insbesondere bei Reaktionen offensichtlich, in denen das Substrat und das DNAzym getrennte Moleküle sind (vgl. z. B. 8 und 9).
Die Klonnummern werden für Individuen, die nach der 10ten oder 10ten Runde erhalten wurden, als 8-x beziehungsweise 10-x bezeichnet. SEQ ID NOS werden auch aufgeführt und entsprechen der „N₅₀"-Region jedes Klons. Tabelle 2 Klonierte Individuen aus der 8ten Runde der Amplifizierung

¹ identisch zu 10–4, 10–40
² zu 8–20, 8–32, 8–38, 10–1, 10–34; 1 Mutation zu 10–11; 3 Mutationen zu 10–29

³ 1 Mutation zu 10–5
⁴ 1 Mutation zu 10–30

Die selbstspaltende Aktivität von verschiedenen Klonen wurde anschließend gemessen. Für die Klone 8–5, 8–17 und 10–3 wurde herausgefunden, dass sie effizient an der Stelle 5' GUAACUIAGAGAU 3' spalten, während für die Klone 10–14, 10–19 und 10–27 herausgefunden wurde, dass sie effizient an der Stelle 5' GIUAACUAGAGAU 3' spalten. Wenn der RNA-Anteil des Moleküls auf die Sequenz 5' GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG 3' (Reste Nr. 1–24 von SEQ ID NO 51) erweitert wurde, behielten die Klone 8–17, 10–14 und 10–27 die volle Aktivität, während die Klone 8–5, 10–3 und 10–19 verminderte Aktivität zeigten. Anschließend wurde für Klon 10–23 gefunden, dass er ein hohes Aktivitätsniveau bei der Selbstspaltungsreaktion unter Einbeziehung der erweiterten RNA-Domäne zeigte.
Es sollte auch angemerkt werden, dass für den Fall, dass ein Fachmann dies nicht anerkennt, die Nukleotidsequenz, die den „N₅₀"-Segmenten der Polynukleotidmoleküle, welche gemäß den Anleitungen der Offenbarung der vorliegenden Erfindung verändert wurden, vorangeht und folgt, in einer Vielzahl von Art und Weisen geändert werden kann, um enzymatisch aktive DNA-Moleküle von bestimmten Spezifitäten herzustellen. Während zum Beispiel die Reste Nr. 1–24 von SEQ ID NO 51 hier als RNA-Nukleotide beschrieben werden, können sie alternativ DNA, RNA oder Zusammensetzungen davon umfassen. (Daher könnte SEQ ID NO 51 zum Beispiel leicht geändert werden, so dass die Nukleinsäurereste Nr. 1–7 DNA, die Reste Nr. 8–19 RNA, die Reste Nr. 20–99 DNA umfassen würden und so weiter.). In ähnlicher Weise können die Nukleotide, welche der „N₅₀"-Region folgen, RNA, DNA oder Zusammensetzungen davon umfassen. Die Länge der Regionen, welche den „N₅₀"- (oder „N₄₀" -vgl. Beispiel 4)-Region/en vorangehen und folgen, können auch variiert werden, wie hier offenbart wird. Weiterhin können Sequenzen, die N₅₀- oder N₄₀-Regionen vorangehen und/oder folgen in ihrer Gesamtheit gekürzt, ausgedehnt oder deletiert werden.
Außerdem wählten wir, wie vorstehend erwähnt, eine spezifische Region der HIV-1-RNA als Zielsequenz in den Verfahren aus, welche in diesem Beispiel beschrieben werden; eine solche Sequenz ist nicht die einzige Sequenz, die man als Ziel verwenden kann. Eindeutig kann ein Fachmann unseren hier gegebenen Anleitungen folgen, um enzymatisch aktive DNA-Moleküle mit Spezifität für andere Zielsequenzen zu verändern und zu entwerfen. Wie hier offenbart, können solche Zielsequenzen konstruiert oder in größere Sequenzen, umfassend DNA, RNA oder Zusammensetzungen davon, eingefügt werden, wie durch SEQ ID NOS 50 und 51 dargestellt.
Die selbstspaltende Reaktion wurde einfach in eine intermolekulare Spaltungsreaktion umgewandelt, indem die Enzym- und Substrat-Domänen in getrennte Moleküle aufgeteilt wurden. Die Klone 8–17 und 10–23 wurden als Prototyp-Moleküle ausgewählt. Für beide wurde gezeigt, dass sie als DNA-Enzyme in der Spaltung von getrennten Substraten, die ganz aus RNA bestehen, in einer Reaktion, welche mit mehrfachem Umsatz voranschreitet, fungieren (8). Die Substratbindungsarme wurden anschließend auf 7 Basenpaare auf jeder Seite des ungepaarten Nukleotids, welches die Spaltstelle markiert, reduziert (9).
8 stellt die Nukleotidsequenzen, Spaltstellen und Umsatzgeschwindigkeiten von zwei erfindungsgemäßen katalytischen DNA-Molekülen, Klone 8–17 und 10–23, dar. Die Reaktionsbedingungen waren wie gezeigt, nämlich 10 mM Mg²⁺, pH 7,5 und 37°C. Das als Klon 8–17 identifizierte DNAzym ist auf der linken Seite dargestellt, wobei die Spaltstelle des RNA-Substrats durch einen Pfeil angezeigt wird. Die Substratsequenz (5'-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3')

– welche getrennt vom DNAzym ist (d. h. die intermolekulare Spaltung wird gezeigt)
– ist als solche markiert. In ähnlicher Weise wird das DNAzym, das hier als 10–23 identifiziert wurde, auf der rechten Seite gezeigt, wobei die Spaltstelle des RNA-Substrats durch den Pfeil angezeigt wird. Wiederum wird die Substratsequenz angezeigt. Für das Enzym 8–17 war die Umsatzgeschwindigkeit etwa 0,6 h^–1; für das Enzym 10–23 war die Umsatzgeschwindigkeit etwa 1 h^–1.

Wie in 8 dargestellt, war die Nukleotidsequenz des katalytischen DNA-Moleküls Klon 8–17, das in Lage war, ein anderes Substratmolekül zu spalten, wie folgt: 5'-CTTCCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACTTTTT-3'(Reste Nr. 1–34 von SEQ ID NO 56). In derselben Figur war die Nukleotidsequenz des katalytischen DNA-Moleküls Klon 10–23, das in Lage war, ein anderes Substratmolekül zu spalten, wie folgt:
5'-CTTTGGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3'(Reste Nr. 3–33 von SEQ ID NO 85).
9 stellt weiterhin die Nukleotidsequenzen, Spaltstellen und Umsatzgeschwindigkeiten von zwei erfindungsgemäßen katalytischen DNA-Molekülen, Klon 8–17 und 10–23, dar. Die Reaktionsbedingungen waren wie gezeigt, nämlich 10 mM Mg²⁺, pH 7,5 und 37°C. Wie in 8 wird das als Klon 8–17 identifizierte DNAzym, auf der linken Seite dargestellt, wobei die Spaltstelle des RNA-Substrats durch einen Pfeil angezeigt wird. Die Substratsequenz (5'-GGAAAAAGUAACUAGAGAUGGAAG-3') – welche getrennt vom DNAzym ist (d. h. die intermolekulare Spaltung wird gezeigt) – ist als solche markiert. In ähnlicher Weise wird das DNAzym, das hier als 10–23 identifiziert wurde, auf der rechten Seite gezeigt, wobei die Spaltstelle des RNA-Substrats durch den Pfeil angezeigt wird. Wiederum wird die Substratsequenz gezeigt. Für das Enzym 8–17 war k_obs etwa 0,002 min^–1; für das Enzym 10–23 war der Wert von k_obs etwa 0,01 min^–1.
Wie in 9 dargestellt, war die Nukleotidsequenz des katalytischen DNA-Moleküls Klon 8–17, das in Lage war, ein anderes Substratmolekül zu spalten, wie folgt: 5'-CCACCTTCCGAGCCGGACGAAGTTACT-3' (Reste Nr. 4–30 von SEQ ID NO 56). In derselben Figur war die Nukleotidsequenz des katalytischen DNA-Moleküls Klon 10–23, der in Lage war, ein anderes Substratmolekül zu spalten, wie folgt: 5'-CTAGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCC-3'(Reste Nr. 5–33 von SEQ ID NO 85, wobei „CTA" „TTG" am 5'-Ende ersetzte).
Die katalytische Geschwindigkeit der RNA spaltenden DNA-Enzyme muss noch vollständig optimiert werden. Wie vorstehend offenbart und in früheren Studien berichtet, waren wir in der Lage, die katalytische Geschwindigkeit durch teilweise Randomisierung des Prototypmoleküls zu verbessern und zusätzliche Runden der selektiven Amplifizierung durchzuführen. Wir haben jedoch herausgefunden, dass K_m für Mg²⁺ gemessen bei pH 7,5 und 37°C etwa 5 mM beziehungsweise 2 mM für die DNA-Enzyme 8–17 beziehungsweise 10–23 ist; dies ist sicherlich mit intrazellulären Bedingungen kompatibel.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein katalytisches DNA-Molekül mit Endonukleaseaktivität, welches spezifisch ist für eine Nukleotidsequenz, welche eine Spaltstelle in einem Substrat definiert.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Spaltstelle einzelsträngige Nukleinsäure umfasst.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 2, wobei die einzelsträngige Nukleinsäure RNA, DNA, modifizierte RNA, modifizierte DNA, Nukleotidanaloga oder Zusammensetzungen davon umfasst.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 2, wobei die Substratnukleinsäure RNA, DNA, modifizierte RNA, modifizierte DNA, Nukleotidanaloga oder Zusammensetzungen davon umfasst.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 2, wobei die Endonukleaseaktivität hydrolytische Spaltung einer Phosphorester-Bindung an der Spaltstelle umfasst.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül einzelsträngig ist.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül eine oder mehrere Haarnadelschleifen-Strukturen enthält.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Substratnukleinsäuresequenz an das katalytische DNA-Molekül gebunden ist.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Substratnukleinsäuresequenz nicht an das katalytische DNA-Molekül gebunden ist.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das katalytische DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO:3 und SEQ ID NOs: 14 bis 22.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das katalytische DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 23 bis 30.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das katalytische DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO: 31 bis 39.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das katalytische DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO: 52 bis 101.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 11, 12, oder 13, wobei die Endonukleaseaktivität verstärkt ist durch das Vorhandensein von Mg²⁺.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das katalytische DNA-Molekül eine Substratbindungsaffinität von ungefähr 1 μM oder weniger hat.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das katalytische DNA-Molekül Substrat mit einer K_D von weniger als 0,1 μM bindet.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 2, wobei die Nukleotidsequenz, welche die Spaltstelle definiert, mindestens ein Nukleotid umfasst.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Endonukleaseaktivität durch das Vorhandensein eines divalenten Kations verstärkt wird.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 18, wobei das divalente Kation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Pb²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ and Ca²⁺.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Endonukleaseaktivität verstärkt wird durch das Vorhandensein eines monovalenten Kations.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 20, wobei das monovalente Kation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Na⁺ und K⁺.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das katalytische DNA-Molekül einen konservierten Kern umfasst, welcher flankiert ist von ersten und zweiten Substratbindungsregionen.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 22, weiterhin umfassend einen oder mehrere Spacer-Nukleotide zwischen dem konservierten Kern und der Substratbindungsregion.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 22, wobei der konservierte Kern eine oder mehrere konservierte Region(en) umfasst.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 24, wobei die eine oder mehrere konservierte Region(en) eine Nukleotidsequenz enthält/enthalten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: CG; CGA; AGCG; AGCCG; CAGCGAT; CTTGTTT und CTTATTT.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 24, weiterhin umfassend ein oder mehrere variables/variable oder Spacer-Nukleotid(e) zwischen den konservierten Regionen im konservierten Kern.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 22, wobei die erste substratbindende Region eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: CATCTCT; GCTCT;TTGCTTTTT; TGTCTTCTC; TTGCTGCT; GCCATGCTTT; CTCTATTTCT GTCGGCA; CATCTCTTC und ACTTCT.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 22, wobei die zweite substratbindende Region eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: TATGTGACGCTA; TATAGTCGTA; ATAGCGTATTA; ATAGTTACGTCAT; AATAGTGAAGTGTT; TATAGTGTA; ATAGTCGGT; ATAGGCCCGGT; AATAGTGAGGCTTG und ATGNTG.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 22, weiterhin umfassend eine dritte Substratbindungsregion, wobei die dritte Region eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: TGTT; TGTTA und TGTTAG.
Katalytisches DNA-Molekül nach Anspruch 29, weiterhin umfassend einen oder mehrere Spacer-Regione(n) zwischen den Substratbindungsregionen.
Zusammensetzung umfassend zwei oder mehr Populationen von katalytischen DNA-Molekülen nach Anspruch 1, wobei jede Population von katalytischen DNA-Molekülen in der Lage ist, eine andere Nukleotidsequenz in einem Substrat zu spalten.
Zusammensetzung umfassend zwei oder mehr Populationen von katalytischen DNA-Molekülen nach Anspruch 1, wobei jede Population von katalytischen DNA-Molekülen in der Lage ist, ein anderes Substrat zu erkennen.
Verfahren zur Isolierung eines katalytischen DNA-Moleküls mit Endonukleaseaktivität umfassend: a) zur Verfügung stellen einer Population von Nukleinsäuremolekülen, welche an eine feste Matrix gebunden sind, wobei jedes Nukleinsäuremolekül eine feststehende Nukleotidsequenz umfasst und eine genetisch variable DNA-Sequenz, wobei die feststehende Nukleotidsequenz in der Nähe der festen Matrix ist relativ zu der genetisch variablen DNA-Sequenz; b) Belassen der Population von Nukleinsäuremolekülen unter Bedingungen, welche die Freisetzung der Nukleinsäuremoleküle von der festen Matrix im Falle einer Spaltung der feststehenden Nukleotidsequenz durch die variable DNA-Sequenz erlauben; c) Isolieren von Nukleinsäuremolekülen, welche von der festen Matrix freigesetzt wurden, wodurch das katalytische DNA-Molekül isoliert wird.
Katalytisches DNA-Molekül mit Endonucleaseaktivität, welche spezifisch für eine Nucleotidsequenz ist, welche eine Spaltstelle in einem Substrat definiert, wobei das Molekül ausgewählt ist aus: i) einem DNA-Molekül umfassend die Gesamtheit der Desoxyribonucleotide, oder ii) einem Derivat dieses DNA-Moleküls nach i), in welchem die normalen A-, T-, G-, oder C-Nucleotide ersetzt sind durch Nucleotidanaloga, wobei die Analoga sich von den normalen Nucleotiden durch eine geänderte Base, einen unterschiedlichen Zucker oder ein geändertes Phosphatrückgrat oder eine Kombination dieser Modifikationen unterscheiden.