DE69535242T2

DE69535242T2 - Somatostatin bindende peptide-metallchelat konjugate

Info

Publication number: DE69535242T2
Application number: DE69535242T
Authority: DE
Inventors: Richard Bedford DEAN
Original assignee: CIS Bio International SA
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1994-05-12
Filing date: 1995-05-12
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2015-05-13
Also published as: US5965108A; EP0759786B1; US5972308A; AU2550095A; JPH10500411A; WO1995031221A1; AU708797B2; DE69535242D1; ATE340594T1; PT759786E; DK0759786T3; US5783170A; ES2274517T3; US5985241A; EP0759786A1; CN1078480C; US5981477A; CN1155248A; JP3918157B2; ZA953878B

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft therapeutische Mittel, radiotherapeutische Mittel, radiodiagnostische Mittel und nicht-radioaktive diagnostische Mittel sowie Verfahren zur Herstellung solcher diagnostischer und therapeutischer Mittel. Die Erfindung betrifft weiterhin zyklische Peptide, die spezifisch an Somatostatinrezeptoren binden, welche an der Oberfläche von Säugetierzellen, insbesondere neoplastischen oder metastatischen Säugetierzellen exprimiert werden. Nach einem Aspekt betrifft die Erfindung szintigraphische bildgebende Mittel zur Abbildung von Stellen in einem Säugetierkörper. Nach diesem Aspekt umfassen die bildgebenden Mittel ein spezifisch bindendes Peptid, welches in vivo spezifisch an Zellen bindet, die Somatostatinrezeptoren exprimieren, und welches mit Technetium 99m (Tc-99m) markiert ist, und zwar über eine radiomarkerbindende Gruppe, die mit Tc-99m einen Komplex bildet. Nach einem weiteren Aspekt schafft die Erfindung radioiodierte bildgebende Mittel. Die Erfindung schafft weiterhin therapeutische Mittel, einschließlich radioiodierter Mittel, radioaktiver Komplex des Typs Metall-Reagens sowie nicht-radioaktive Komplexe des Typs Metall-Reagens, von denen alle einen therapeutischen Nutzwert ausweisen. Die Erfindung schafft Reagentien zur Herstellung der jeweiligen diagnostischen und therapeutischen Ausführungsformen der diagnostischen und therapeutischen Mittel der Erfindung, deren radioaktiv markierten Ausführungsformen und deren nicht-radioaktive Metallkomplexen, sowie Verfahren zur Markierung der Reagentien sowie Kits, welche nicht-radioaktive Ausführungsformen der Reagenzien der Erfindung und andere Bestandteile für die zweckmäßige Herstellung der radioaktiv markierten diagnostischen und therapeutischen Mittel der Erfindung umfassen.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Somatostatin ist ein Tetradecapeptid, welches endogen vom Hypothalamus und von der Bauchspeicheldrüse in Menschen und anderen Säugetieren hergestellt wird. Das Peptid weist folgende Formel auf
Formel I
(Für die einbuchstabigen Abkürzungen für Aminosäuren siehe G. Zubav, Biochemistry, (2te Ausg.), 1988, (MacMillan Publishing: New York), S. 33). Dieses Peptid übt in vivo ein breites Spektrum an biologischen Wirkungen aus. Es ist dafür bekannt, physiologisch auf das zentrale Nervensystem, den Hypothalamus, die Bauchspeicheldrüse und den Magen-Darm-Trakt einzuwirken.
Somatostatin hemmt die Freisetzung von Insulin und Glucagon aus der Bauchspeicheldrüse sowie die Freisetzung von Wachstumshormon aus dem Hypothalamus, und es vermindert die Sekretion im Magen. Somit findet Somatostatin klinische und therapeutische Anwendungen bei der Linderung einer Reihe von Leiden und Krankheiten, sowohl bei Menschen als auch bei anderen Tieren. Natives Somatostatin ist indes aufgrund seiner kurzen Halbwertszeit in vivo, wo es schnell von Peptidasen abgebaut wird, von begrenztem Nutzen. Aus diesem Grund sind dem Somatostatin analoge Verbindungen mit verbesserter in vivo-Stabilität entwickelt wurden, wobei diese dem Stand der Technik zuzurechnen sind.
Freidinger, US-Patentschrift Nr. 4,235,886, offenbart zyklische Hexapeptid-Somatostatinanaloga zur Verwendung bei der Behandlung einer Reihe von Krankheiten beim Menschen.
Coy und Murphy, US-Patentschrift Nr. 4,485,101, offenbaren synthetische Dodecapeptid-Somatostatinanaloga.
Freidinger, US-Patentschrift Nr. 4,611,054, offenbart zyklische Hexapeptid- Somatostatinanaloga zur Verwendung bei der Behandlung einer Reihe von Krankheiten beim Menschen.
Nutt, US-Patentschrift Nr. 4,612,366, offenbart zyklische Hexapeptid-Somatostatinanaloga zur Verwendung bei der Behandlung einer Reihe von Krankheiten beim Menschen.
Coy et al., US-Patentschrift Nr. 4,853,371, offenbaren synthetische Octapeptid-Somatostatinanaloga.
Coy und Murphy, US-Patentschrift Nr. 4,871,717, offenbaren synthetische Heptapeptid-Somatostatinanaloga.
Coy et al., US-Patentschrift Nr. 4,904,642, offenbaren synthetische Octapeptid-Somatostatinanaloga.
Taylor et al., US-Patentschrift Nr. 5,073,541, offenbaren ein Verfahren zur Behandlung von kleinzelligem Lungenkrebs.
Brady, Europäische Patentanmeldung Nr. 83111747.8 offenbart dizyklische Hexapeptid-Somatostatinanaloga zur Verwendung bei der Behandlung einer Reihe von Krankheiten beim Menschen.
Bauer et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 85810617.2, offenbaren Somatostatinderivate zur Verwendung bei der Behandlung einer Reihe von Krankheiten beim Menschen.
Eck und Moreau, Europäische Patentanmeldung Nr. 90302760.5, offenbaren therapeutische Octapeptid-Somatostatinanaloga.
Coy und Murphy, Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US90/07074, offenbaren Somatostatinanaloga für therapeutische Anwendungen.
Schally et al., Europäische Patentanmeldung Nr. EPA 911048445.2, offenbaren zyklische Peptide zur therapeutischen Anwendung.
Bodgen und Moreau, Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US92/01027 offenbaren Zusammensetzungen und Verfahren für die Behandlung sich ausbreitender Hautkrankheiten.
Somatostatin übt seine Wirkungen aus, indem es an spezifische Rezeptoren bindet, die an der Zelloberfläche von Zellen, einschließlich solcher der zentralen Nervensystems, des Hypothalamus, der Bauchspeicheldrüse und des Magen-Darm-Trakts, exprimiert werden. Es ist entdeckt worden, dass diese Somatostatinbindungsstellen, die eine hohe Affinität aufweisen, in großer Zahl an der Zelloberfläche der meisten endokrin aktiven Tumoren, die in diesen Gewebetypen entstehen, exprimiert werden.
In der klinischen Praxis ist es für den Arzt oft vorteilhaft, die genaue Stelle, an welcher pathologische Bedingungen vorherrschen, in einem Patienten mit Hilfe nicht-invasiver Mittel zu bestimmen. Zu solchen pathologischen Bedingungen gehören Krankheiten der Lunge, des Herzens, der Leber, der Nieren, der Knochen und des Gehirns sowie Krebserkrankungen, Thrombose, Lungenembolie, Infektionen, Entzündungen und Atherosklerose.
Auf dem Gebiet der Nuklearmedizin werden bestimmte pathologische Bedingungen lokalisiert oder deren Ausmaß bewertet, indem die Verteilung kleiner Mengen an intern verabreichten radioaktiv markierten Verbindungen (auch Radiopharmazeutika genannt) detektiert wird. Die Verfahren zum Detektieren dieser Radiopharmazeutika werden im Allgemeinen als bildgebende und radioaktive bildgebende Verfahren bezeichnet.
Bei der radioaktiven Bildgebung handelt es sich bei dem radioaktiven Marker um ein gamma-Strahlung aussendendes Radionuklid, und die radioaktiv markierte Verbindung wird mittels einer gamma-Strahlung detektierenden Kamera lokalisiert (diese Vorgehensweise wird oft als gamma-Szintigraphie bezeichnet). Die bildlich dargestellte Stelle kann detektiert werden, weil die radioaktiv markierte Verbindung derart ausgewählt wird, dass sie sich an einer pathologischen Stelle aufhält (positiver Kontrast genannt), oder die radioaktiv markierte Verbindung wird, alternativ dazu, derart ausgewählt, dass sie auf spezifische Weise sich nicht an solchen pathologischen Stellen aushält (negativer Kontrast genannt). In vielen Situationen ist es besonders vorteilhaft, eine spezifisch bindende radioaktiv markierte Verbindung, welche sich in vivo auf spezifische Weise an der pathologischen Stelle aufhält, als Radiopharmazeutikon au verwenden.
Zum Beispiel zeichnen sich bestimmte Tumorzellen dadurch aus, dass sie Somatostatinbindungsstellen mit hoher Affinität exprimieren, und die spezifische Bindung von Somatostatin kann zur Lokalisierung und Erkennung solcher Tumorzellen in vivo genutzt werden.
Verfahren zur radioaktiven Markierung von Somatostatinanaloga, die derart modifiziert wurden, dass sie die Aminosäure Tyrosin (Tyr oder Y) enthalten, sind nach dem Stand der Technik bekannt.
Albert et al., UK-Patentanmeldung 8927255.3 offenbaren ein radioaktives Bildgebungsverfahren unter Verwendung von Somatostatinderivaten wie etwa Octreotid, die mit ¹²³I markiert wurden.
Bakker et al., 1990, J. Nucl. Med. 31: 1501-1509 beschreiben die radioaktive Iodierung eines Somatostatinanalogons und dessen Nutzwert bei der in vivo Detektion von Tumoren.
Bakker et al., 1991, J. Nucl. Med. 32: 1184-1189 geben Aufschluss über den Nutzwert von radioaktiv markiertem Somatostatin bei der radioaktiven Bildgebung in vivo.
Bomanji et al.. 1992, J. Nucl. Med. 33: 1121-1124 beschreiben die Verwendung von iodiertem (Tyr-3) Octreotid zur bildlichen Darstellung von metastatischen karzinomartigen Tumoren.
Alternativ dazu wurden nach dem Stand der Technik Verfahren zur radioaktiven Markierung von Somatostatin offenbart, bei denen das Peptid durch kovalente Modifikation dahingehend verändert wird, dass es eine Gruppe enthält, die Radionuklide chelatisiert.
Albert et al., UK-Patentanmeldung 8927255.3, offenbaren ein radioaktives Bildgebungsverfahren unter Verwendung von Somatostatinderivaten wie etwa Octreotid, die über eine chelatbildende Gruppe, die sich am Aminoende befindet, mit ¹¹¹In markiert wurden.
Albert et al., Internationale Patentanmeldung WO 91/01144, offenbaren ein radioaktives Bildgebungsverfahren, bei welchem radioaktiv markierte Peptide, die mit Wachstumsfaktoren, Hormonen, Interferonen und Zytokinen in Verbindung zu bringen sind, verwendet werden, wobei die radioaktiv markierten Peptide ein Peptid zur spezifischen Erkennung aufweisen, welches mit einer Gruppe, die Radionuklide chelatisiert, über eine kovalente Bindung verknüpft ist.
Albert et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 92810381.1, offenbaren Somatostatinpeptide, welche Chelatbildner aufweisen, die mit dem Aminoende verbunden sind.
Faglia et al., 1991, J. Clin. Endocrine Metab. 73: 850-856 beschreiben die Detektion von Somatostatinrezeptoren in Patienten.
Kwekkeboom et al., 1991, J. Nucl. Med. 32: 981, Abstract Nr. 305, betrifft Somatostatinanaloga mit ¹¹¹In zur radioaktiven Markierung.
Albert et al., 1991, Abstract LM10, 12th American Peptide Symposium: 1991 beschreiben Anwendungen für ¹¹¹In-markierte Somatostatinanaloga, die mit Diethylentriaminopentaessigsäure derivatisiert wurden.
Krenning et al., 1992, J. Nucl. Med. 33: 652-658 beschreiben klinische Szintigraphieanwendungen unter Einsatz von [¹¹¹In][DTPA]Octreotid.
Mehrere Radionuklide sind können bekanntermaßen zur radioaktiven Bildgebung verwendet werden, einschließlich ⁶⁷Ga, ^99mTc (Tc-99m), ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹⁶⁹Yb oder ¹⁸⁶Re. Eine Reihe von Faktoren muss für die optimale radioaktive Bildgebung bei Menschen berücksichtigt werden. Um eine möglichst hohe Wirksamkeit der Detektion zu erreichen, wird vorzugsweise ein Radionuklid, das gamma-Energie im Bereich von 100 bis 200 keV aussendet, verwendet. Um die Strahlungsdosis, die der Patient aufnimmt, möglichst gering zu halten, sollte die physikalische Halbwertszeit des Radionuklids so gering sein, wie dies im Rahmen des bildgebenden Verfahrens möglich ist. Damit die Untersuchungen an einem beliebigen Tag und zu einer beliebigen Tageszeit durchgeführt werden können, ist es vorteilhaft, im Klinikbereich stets eine Radionuklidquelle zur Verfügung zu haben. Tc-99m ist ein bevorzugtes Radionuklid, da es gamma-Strahlung bei 140 keV aussendet, eine physikalische Halbwertszeit von 6 Stunden aufweist und auf einfache Weise vor Ort verfügbar ist, indem ein Molybdän-99/Technetium-99-Generator benutzt wird. Andere Radionuklide, die nach dem Stand der Technik verwendet werden, sind weniger vorteilhaft als Tc-99m. Dies kann daran liegen, dass die physikalische Halbwertszeit solcher Radionuklide länger ist, wodurch der Patient eine größere Strahlungsdosis aufnimmt (z.B. Indium-111). Darüber hinaus können viele unvorteilhafte Radionuklide nicht mittels eines Generators vor Ort hergestellt werden.
Tc-99m ist ein Übergangsmetall, das vorteilhafterweise von einer metallkomplexierenden Gruppe chelatisiert werden kann. Gruppen, die radioaktive Marker komplexieren und dazu befähigt sind, Tc-99m zu binden, können über kovalente Bindungen mit verschiedenen spezifisch bindenden Substanzen verknüpft werden, wodurch ein Mittel zur radioaktiven Markierung solcher spezifisch bindenden Substanzen bereitgestellt wird. Dies liegt daran, dass die am einfachsten erhältliche chemische Spezies von Tc-99m, Pertechnetat (TcO₄ ^–) nicht direkt mit den meisten spezifisch bindenden Substanzen verknüpft werden kann, zumindest nicht so fest, dass diese als Radiopharmazeutikon verwendet werden könnten. Das Komplexieren von Tc-99m mit solchen Gruppen, die radioaktive Marker komplexieren, bringt es mit sich, dass das Pertechnetat mittels eines Reduktionsmittel wie etwa Zinn(II)chlorid chemisch reduziert wird.
Die Verwendung von chelatbildenden Mitteln zur Komplexierung von Tc-99m ist nach dem Stand der Technik bekannt.
Byrne et al., US-Patentschrift Nr. 4,434,151, beschreiben Homocystein, das chelatbildende Mittel für Tc-99m enthält.
Fritzberg, US-Patentschrift Nr. 4,444,690, beschreibt eine Reihe von Mitteln zur Chelatisierung von Technetium, die auf 2,3-bis(Mercaptoacetamido)propanoat basieren.
Byrne et al., US-Patentschrift Nr. 4,571,430, beschreiben Homocystein, das chelatbildende Mittel für Tc-99m enthält.
Byrne et al., US-Patentschrift Nr. 4,575,556, beschreiben Homocystein, das chelatbildende Mittel für Tc-99m enthält.
Nosco et al., US-Patentschrift Nr. 4,925,650, beschreiben Komplexe, die Tc-99m chelatisieren.
Kondo et al., Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. 483704 A1 offenbaren ein Verfahren zur Herstellung eines Tc-99m-Komplexes mit einer Mercapto-Gly-Gly-Gly-Gruppe.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 84109831.2 beschreibt Tc-99m-Liganden des Typs Bisamido, Bisthiol sowie deren Salze als Mittel zur Überwachung der Nierenfunktion.
Davison et al., 1981, Inorg. Chem. 20: 1629-1632 offenbaren Oxotechnetium-Chelatkomplexe.
Fritzberg et al., 1982, J. Nucl. Med. 23: 592-598 offenbaren einen Mittel zur Chelatisierung von Tc-99m, welches auf N,N'-bis(Mercaptoacetyl)-2,3-diaminopropanoat basiert.
Byrne et al., 1983, J. Nucl. Med. 24: P126 beschreiben Homocystein, das chelatbildende Mittel für Tc-99m enthält.
Bryson et al., 1988, Inorg. Chem. 27: 2154-2161 beschreiben neutrale Technetium-99-Komplexe, die gegenüber Liganden im Überschuss instabil sind.
Misra et al., 1989, Tet. Lett. 30: 1885-1888 beschreiben Verbindungen des Typs Bisamin-Bisthiol zum Zwecke der radioaktiven Markierung.
Die Verwendung von chelatbildenden Mitteln für spezifisch bindende Substanzen zur radioaktiven Markierung ist nach dem Stand der Technik bekannt.
Gansow et al., US-Patentschrift Nr. 4,472,509, geben Aufschluss über Verfahren zur Herstellung und Aufreinigung von Konjugaten aus Tc-99m-Chelat und monoklonalen Antikörpern.
Stavrianopoulos, US-Patentschrift Nr. 4,943,523, gibt Aufschluss über detektierbare Moleküle, die Gruppen umfassen, welche Metalle chelatisieren.
Fritzberg et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 86100360.6, beschreiben Komplexe des Typs Dithiol, Diamino oder Diamidocarbonsäure oder -amin, welche zur Herstellung von Technetium-markierten bildgebenden Mitteln verwendet werden können.
Albert et al., UK-Patentanmeldung 8927255.3, offenbaren ein radioaktives Bildgebungsverfahren unter Verwendung von Somatostatinderivaten wie etwa Octreotid, die über eine chelatbildende Gruppe, die sich am Aminoende befindet, mit ¹¹¹In markiert wurden.
Albert et al., Internationale Patentanmeldung WO 91/01144, offenbaren ein radioaktives Bildgebungsverfahren, bei welchem radioaktiv markierte Peptide, die mit Wachstumsfaktoren, Hormonen, Interferonen und Zytokinen in Verbindung zu bringen sind, verwendet werden, wobei die radioaktiv markierten Peptide ein Peptid zur spezifischen Erkennung aufweisen, welches mit einer Gruppe, die Radionuklide chelatisiert, über eine kovalente Bindung verknüpft ist.
Fischman et al., Internationale Patentanmeldung WO 93/13317, offenbaren chemotaktische Peptide, die mit chelatisierenden Gruppen verbunden sind.
Kwekkeboom et al., 1991, J. Nucl. Med. 32: 981, Abstract Nr. 305, betrifft Somatostatinanaloga mit ¹¹¹In zur radioaktiven Markierung.
Albert et al., 1991, Abstract LM10, 12th American Peptide Symposium: 1991 beschreiben Anwendungen für ¹¹¹In-markierte Somatostatinanaloga, die mit Diethylentriaminopentaessigsäure derivatisiert wurden.
Cox et al., 1991, Abstract, 7th International Symposium on Radiopharmacology, p. 16, offenbaren die Verwendung von Somatostatinanaloga, die mit Tc-99m, ¹³¹I bzw. ¹¹¹In markiert sind zur radioaktiven Lokalisierung von endokrinen Tumoren in vivo mittels Szintigraphie.
Verfahren zur Markierung bestimmter spezifisch bindender Substanzen mit Tc-99m sind nach dem Stand der Technik bekannt.
Hnatowich, US-Patentschrift Nr. 4,668,503, beschreiben die radioaktive Markierung von Proteinen mit Tc-99m.
Toklman, US-Patentschrift Nr. 4,732,684, beschreiben die Herstellung von Konjugaten aus Zielmolekülen und Metallothioneinfragmenten.
Nicoletti et al., US-Patentschrift Nr. 4,861,869, beschreiben bifunktionelle Kupplungsmittel, die verwendet werden können, um Konjugate mit biologischen Molekülen wie etwa Antikörpern zu bilden.
Fritzberg et al., US-Patentschrift Nr. 4,965,392, beschreiben verschiedenartige S-geschützte Chelatbildner auf Basis von Mercaptoacetylglycylglycin für die Markierung von Proteinen.
Schochat et al., US-Patentschrift Nr. 5,061,641, offenbaren die direkte radioaktive Markierung von Proteinen, die mindestens eine "hervorstehende" Sulfhydrylgruppe aufweisen.
Fritzberg et al., US-Patentschrift Nr. 5,091,514, beschreiben verschiedenartige S-geschützte Chelatbildner auf Basis von Mercaptoacetylglycylglycin für die Markierung von Proteinen.
Gustavson et al., US-Patentschrift Nr. 5,112,953, offenbaren Mittel, die Tc-99m chelatisieren und zur radioaktiven Markierung von Proteinen dienen.
Kasina et al., US-Patentschrift Nr. 5,175,257, beschreiben verschiedene Kombinationen von Zielmolekülen und Gruppen, die Tc-99m chelatisieren.
Dean et al., US-Patentschrift Nr. 5,180,816, offenbaren Verfahren zur radioaktiven Markierung eines Proteins mit Tc-99m mit Hilfe eines bifunktionellen Chelatbildners.
Sundrehagen, Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 85/03231, offenbart das Markieren von Proteinen mit Tc-99m.
Reno und Bottino, Europäische Patentanmeldung 87300426.1, offenbaren das radioaktive Markieren von Antikörpern mit Tc-99m.
Bremer et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 87118142.6, offenbaren das radioaktive Markieren von Antikörpermolekülen mit Tc-99m.
Pak et al., Internationale Anmeldung WO 88/07382 offenbaren ein Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit Tc-99m.
Goedemans et al., Internationale Patentanmeldung WO 89/07456, beschreiben das radioaktive Markieren von Proteinen mit Hilfe von zyklischen Thiolverbindungen, insbesondere von 2-Iminothiolan und dessen Derivaten.
Dean et al., Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 89/12625, geben Aufschluss über bifunktionelle Kupplungsmittel zur Markierung von Proteinen mit Tc-99m.
Schoenmaker et al., Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 90/06323, offenbaren chimäre Proteine, die eine metallbindende Region umfassen.
Thornback et al., EP-Anmeldung Nr. 90402206.8, beschreiben die Herstellung und Anwendung von radioaktiv markierten Proteinen oder Peptiden, wobei thiolhaltige Verbindungen, insbesondere 2-Iminothiolan, zum Einsatz kommen.
Gustavson et al., Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 91/09876, offenbaren Tc-99m-Chelatbildner für die radioaktive Markierung von Proteinen.
Rhodes, 1974, Sem. Nucl. Med. 4: 281-293 gibt Aufschluss über das Markieren von menschlichem Serumalbumin mit Technetium-99m.
Khaw et al., 1982, J. Nucl. Med. 23: 1011-1019 offenbaren Verfahren zur Markierung biologisch aktiver Makromolemüle mit Tc-99m.
Schwartz et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 333, beschreiben ein Verfahren zur Markierung von Proteinen mit Tc-99m mittels einer Hydrazinonicotinamid-Gruppe.
Der Stand der Technik berichtet von Versuchen, Peptide radioaktiv zu markieren.
Ege et al., US-Patentschrift Nr. 4,832,940, geben Aufschluss über radioaktiv markierte Peptide für die bildliche Darstellung lokalisierter T-Lymphozyten.
Morgan et al., US-Patentschrift Nr. 4,986,979, offenbaren Verfahren zur bildlichen Darstellung von Entzündungsherden.
Flanagan et al., US-Patentschrift Nr. 5,248,764, beschreiben Konjugate aus einer radioaktiv markierten Chelatbildnergruppe und atrialen Peptiden, die sich aus natriuretischen Faktoren ableiten.
Ranby et al., 1988, PCT/US88/02276, offenbaren ein Verfahren zur Detektion von Fibrinablagerungen in einem Tier, wobei das Verfahren das Verknüpfen den Fibrin mit einer radioaktiv markierten Substanz über eine kovalente Bindung umfasst.
Lees et al., 1989, PCT/US89/01854 geben Aufschluss über radioaktiv markierte Peptide zur bildlichen Darstellung im Bereich der Arterien.
Morgan et al., Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 90/10463 offenbaren Verfahren zur bildlichen Darstellung von Entzündungsherden.
Flanagan et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 90306428.5, offenbaren die Tc99m-Markierung von synthetischen Peptidfragmenten mit Hilfe einer Reihe von organischen chelatbildenden Molekülen.
Stuttle, Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 90/15818 beschreibt die Tc-99m-Markierung von RGD-haltigen Oligopeptiden.
Rodwell et al., 1991, PCT/US91/03116, offenbaren Konjugate aus "Molekülerkennungseinheiten" und "Wirkbereichen".
Cox, Internationale Patentanmeldung PCT/US92/04559, offenbart radioaktiv markierte Somatostatinderivate, die zwei Cysteinreste enthalten.
Rhodes et al., Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 93/12819, geben Aufschluss über Peptide, die metallionenbindende Bereiche enthalten.
Lyle et al., Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 93/15770, offenbaren Tc-99m-Chelatbildner und Peptide, die mit Tc-99m markiert sind.
Coughlin et al., Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. WO 93/21151, offenbaren bifunktionelle chelatbildende Mittel, die Thioharnstoffgruppen umfassen, für die radioaktive Markierung von Zielmolekülen.
Knight et al., 1990, 37th Annual Meeting of the Society of Nuclear Medicine, Abstract Nr. 209, beanspruchen die bildliche Darstellung von Thromben mit Hilfe von Tc-99m-markierten Peptiden.
Babich et al., 1993, J. Nucl. Med. 34: 1964-1974 beschreiben Tc-99m-markierte Peptide, die Hydrazinonicotinamid-Derivate umfassen.
Verfahren zur direkten Markierung von Somatostatin, Somatostatinderivaten, Somatostatinanaloga oder Peptiden, die an den Somatostatinrezeptor binden und mindestens 2 Cysteinreste enthalten, welche ein Disulfid bilden könnten, oder bei denen das Disulfid durch Reduktion in die Sulfhydrylform überführt wurde, sind der US-Patentschrift Nr. 5,225,180, offenbart, die am 6. Juli 1993 herausgegeben wurde, an der eine Miteigentümerschaft besteht und die mit diesem Literaturhinweis vollständig in die vorliegende Patentanmeldung einbezogen wird.
Die Verwendung von chelatbildenden Mitteln zur radioaktiven Markierung von Peptiden sowie Verfahren zur Markierung von Peptiden mit Tc-99m sind nach dem Stand der Technik bekannt und werden in den ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldungen mit den Nummern 07/653,012, 07/807,062, 07/871,282, 07/893,981, 07/955,466, 08/092,355, und 08/095,760 offenbart.
Es besteht weiterhin ein Bedarf an synthetischen Somatostatinanaloga (die in Routineverfahren hergestellt werden können und einfacheren Zulassungsverfahren unterliegen) mit erhöhter in vivo-Stabilität zur therapeutischen Verwendung als szintigraphische Mittel nach radioaktiver Markierung mit Tc-99m oder anderen detektierbaren Radioisotopen, und zwar im Rahmen der bildlichen Darstellung von Tumoren in vivo, sowie als radiotherapeutische Mittel nach radioaktiver Markierung mit einem zytotoxischen Radioisotopen wie etwa Rhenium-188. Diese Erfindung schafft kleine synthetische Somatostatinanaloga, welche diesen Bedarf erfüllen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung schafft Somatostatinanaloga, die zyklische Peptide für therapeutische Anwendungen einschließlich radiotherapeutischer Anwendungen und diagnostischer Anwendungen einschließlich radiodiagnostischer Anwendungen, insbesondere szintigraphischer Bildgebungsanwendungen umfassen. Anders als natives Somatostatin weisen die zyklischen Peptide der Erfindung keine Disulfidbindung auf. Die Erfindung schafft weiterhin zyklische Peptidreagentien, die zyklische Peptide des Typs Somatostatinanalogon umfassen, wobei eine metallionenbindende Gruppe mit kovalenter Bindung Bestandteil solcher Peptide ist. Die Erfindung schafft solche zyklischen Peptide, zyklischen Peptidreagentien und radioaktiv markierten zyklischen Peptidreagentien, wobei es sich dabei um Mittel zur szintigraphischen Bildgebung, radiodiagnostische Mittel und radiotherapeutische Mittel handelt. Die erfindungsgemäßen Mittel zur szintigraphischen Bildgebung umfassen zyklische Peptidreagentien, die mit einem Radioisotop, vorzugsweise mit Technetium-99m, radioaktiv markiert sind. Die erfindungsgemäßen radiotherapeutischen Mittel umfassen zyklische Peptidreagentien, die mit einem zytotoxischen Radioisotop, vorzugsweise mit Rhenium-186 oder Rhenium-188 radioaktiv markiert sind. Darüber hinaus werden Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher zyklischer Peptide, zyklischer Peptidreagentien und deren radioaktiv markierten Ausführungsformen bereitgestellt.
Die Erfindung schafft Stoffzusammensetzungen, die ein spezifisch bindendes Peptid umfassen, welches spezifisch an Somatostatinrezeptoren im Säugetierkörper binden und über eine kovalente Bindung mit einer metallionenkomplexierenden Gruppe verknüpft sind. Die Stoffzusammensetzungen der Erfindung weisen folgende Formel auf: cyclo(N-CH₃)-Phe-Tyr-(_D-Trp)-Lys-Val-Hcy(CH₂CO.X) wobei X für eine metallionenkomplexierende Gruppe mit der Formel (Aminosäure)_n-B-(Aminosäure)_m-Z steht, wobei B für eine thiolhaltige Gruppe steht, bei der es sich um Cystein, Homocystein, Isocystein oder Penicillamin handelt; bei (Aminosäure)_n und (Aminosäure)_m handelt es sich unabhängig voneinander um eine beliebige primäre α- oder β-Aminosäure, die keinerlei Thiolgruppe umfasst; Z steht für -OH oder -NH₂; und bei n und m handelt es sich unabhängig voneinander um ganze Zahlen zwischen 2 und 5 beziehungsweise zwischen 0 und 5.
In den Formeln, welche die Stoffzusammensetzungen der Erfindung beschreiben, ist die Kombination aus dem Begriff "cyclo" und der unterstrichenen Aminosäuresequenz derart zu verstehen, dass die unterstrichene Aminosäuresequenz über eine Peptidbindung zwischen dem Aminoende der ersten Aminosäure der Sequenz und dem Carboxylende der letzten Aminosäure der Sequenz zyklisiert ist. Wenn es Begriff in Klammern wie etwa "(CH₂CO.X)" nachgestellt ist, so ist der Begriff in Klammern derart zu verstehen, dass die Sequenz in Klammern über eine kovalente Bindung mit dem Schwefelatom in der Aminosäureseitenkette der thiolhaltigen Aminosäure in der unterstrichenen Aminosäuresequenz verknüpft ist, und mit diesem eine Sulfidbindung bildet. Somit versteht es sich, dass die Gruppe -CH₂CO.X in der obigen chemischen Struktur über eine kovalente Bindung mit dem Seitenkettenschwefelatom von Homocystein verknüpft ist. Ein Beispiel einer derartigen chemischen Formel ist in Beispiel 2 dargestellt.
Die Stoffzusammensetzungen der Erfindung können für eine Reihe von diagnostischen und therapeutischen Zwecken verwendet werden.
So schafft ein Aspekt der Erfindung Reagentien für die Herstellung von radioaktiv markierten szintigraphischen bildgebenden Mitteln zur bildlichen Darstellung von Stellen innerhalb eines Säugetierkörpers, an denen Somatostatinrezeptoren im Übermaß vorkommen. In solchen Ausführungsformen umfasst die metallionenkomplexierende Gruppe eine Gruppe, welche der radioaktiven Marker bindet, wobei das Reagens mit dem radioaktiven Marker einen Komplex bildet, indem es zur Komplexbildung mit dieser Gruppe kommt. In einer Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung wird das szintigraphische bildgebende Mittel gebildet, indem das Mittel mit Tc-99m unter reduzierenden Bedingungen komplexiert wird.
Somit umfasst die Erfindung auch szintigraphische bildgebende Mittel, bei denen es sich um Komplex aus Reagentien der Erfindung und Tc-99m handelt, sowie Verfahren zur radioaktive Markierung der Reagentien. Die erfindungsgemäßen Komplexe, die mit Tc-99m radioaktiv markiert sind, werden gebildet, indem die Reagentien der Erfindung in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit Tc-99m umgesetzt werden. Zu den bevorzugte Reduktionsmitteln gehören das Dithionit-Ion, das Zinn(II)ion und das Eisen(II)ion, wobei die Auswahl aber nicht auf die genannten Substanzen beschränkt ist. Erfindungsgemäße Komplexe werden weiterhin gebildet, indem die Reagentien der Erfindung durch Ligandenaustausch an einem vorreduzierten Tc-99m-Komplex gemäß den vorliegenden Ausführungen mit Tc-99m markiert werden.
Die bevorzugten bildgebenden Mittel umfassen Tc-99m-Komplexe der Reagentien der Erfindung.
Die Erfindung schafft ferner Kits zur Herstellung von szintigraphischen bildgebenden Mittel, die aus den Reagentien der Erfindung bestehen, wobei diese mit Tc-99m radioaktiv markiert sind. Die Kits zum Tc-99m-Markieren der Reagentien, der durch die Erfindung geschaffen werden, umfassen ein versiegeltes Probengefäß, das eine zuvor festgelegte Menge eines Reagens der Erfindung sowie eine Menge an Reduktionsmittel enthält, die ausreicht, um das Reagens mit Te-99m zu markieren.
Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung werden bildgebende Mittel geschaffen, bei denen die Stoffzusammensetzungen der Erfindung mit einem Radioisotop des Iods, vorzugsweise I-123, I-125 oder I-131 radioaktiv markiert sind. Die Erfindung schafft radioiodiert bildgebende Mittel, bei denen es sich um Komplexe der Reagentien der Erfindung mit radioaktiv markiertem Iod handelt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Reagentien, die durch die Erfindung geschaffen werden, um radioiodierte bildgebende Mittel herzustellen, ist eine Verbindung mit folgender Formel: cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCK.amid).
Zu den bevorzugten bildgebenden Mittel gehören radioiodierte Ausführungsformen dieses Reagens.
Nach einem dritten Aspekt nicht-radioaktiv markierte bildgebende Mittel geschaffen, welche Reagentien umfassen, bei denen es sich um Stoffzusammensetzungen der Erfindung handelt, die mit einem paramagnetischen Metallion oder -partikel einen Komplex bilden. In Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung wird das paramagnetische Metallion von der metallionenkomplexierenden Gruppe komplexiert. In Ausführungsformen, bei denen ein Partikel, vorzugsweise ein superparamagnetischer Metallpartikel, verwendet wird, werden die Stoffzusammensetzungen der Erfindung mit dem superparamagnetischen Partikel entweder kovalent oder assoziativ verbunden, wobei Verfahren, die von Weissleder et al. (1992, Radiology 182: 381-385) beschrieben werden, zur Anwendung kommen. Die Erfindung schafft solche bildgebenden Mittel zur Verwendung im Rahmen der Bildgebung durch Magnetresonanz. Verfahren zur Herstellung dieser nicht-radioaktiv markiert bildgebenden Mittel werden ebenfalls bereitgestellt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Reagentien, die durch die Erfindung geschaffen werden, um solche nicht-radioaktiv markierten bildgebenden Mittel herzustellen, ist eine Verbindung mit folgender Formel: cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCK.amid).
Zu den bevorzugten nicht-radioaktiv markierten bildgebenden Mittel gehören die Komplexe des Eisen(III)-Ions mit diesem Reagens.
Mit dem vorliegenden Schriftstück werden weiterhin therapeutische Mittel geschaffen. Nach einem vierten Aspekt schafft die Erfindung Stoffzusammensetzungen der Erfindung, die nicht mit einem Metallion einen Komplex bilden und die per se als therapeutische Mittel dienen.
Nach einem fünften Aspekt schafft die Erfindung radioaktiv markierte therapeutische Mittel, die ein Reagens zur Herstellung des therapeutischen Mittels umfassen, wobei es sich um eine Stoffzusammensetzung handelt, die durch die Erfindung geschaffen wird. In solchen Ausführungsformen werden Stoffzusammensetzungen der Erfindung geschaffen, bei denen die metallionenkomplexierende Gruppe mit einem Radioisotop, das β-Teilchen oder Umwandlungselektronen aussendet, einen Komplex bildet. Bevorzugte Ausführungsformen der β-Teilchen aussendenden Radioisotope sind Rhenium-186 und Rhenium-188. Ein bevorzugtes Radioisotop, das Umwandlungselektronen aussendet, ist Zinn-117m. Die Erfindung schafft derartige Radioisotopkomplexe der Stoffzusammensetzungen der Erfindung für die radiotherapeutische Behandlung von pathologischen Zellen und Gewebe, die den Somatostatinrezeptor exprimieren, insbesondere von neoplastischen und metastatischen Zellen. Verfahren zur Herstellung solcher therapeutischer Radioisostopkomplexe der Stoffzusammensetzungen der Erfindung werden ebenfalls bereitgestellt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Reagentien, die durch die Erfindung geschaffen werden, um solche radiotherapeutischen Mittel herzustellen, ist eine Verbindung mit folgender Formel: cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCK.amid).
Zu den bevorzugten radiotherapeutischen Mitteln gehören Komplexe von Metallionen, die β-Teilchen oder Umwandlungselektronen aussenden, mit diesem Reagens.
In einem weiteren Aspekt der radiotherapeutischen Mittel der Erfindung werden radiotherapeutische Mittel geschaffen, bei denen die Stoffzusammensetzungen der Erfindung mit einem Radioisotop des Iods, vorzugsweise mit I-125 oder I-131, oder aber mit Astat-211 radioaktiv markiert sind. Die Erfindung schafft auch die radioaktiv markierten therapeutischen Mittel selbst, und sie stellt Verfahren zur radioaktiven Markierung der Reagentien bereit.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Reagentien, die durch die Erfindung geschaffen werden, um diese therapeutischen radioiodiert oder radioastatierten Mittel herzustellen, ist eine Verbindung mit folgender Formel: cyclo(N-methyl)FYW_DKV_DHcy.(CH₂CO.GGCK.amid).
Zu den bevorzugten radiotherapeutischen Mitteln gehören radioiodierte und radioastatierte Ausführungsformen dieses Reagens.
Es werden therapeutische Mittel geschaffen, bei denen es sich um nicht-radioaktiv markierte Mittel handelt, die mit einem Metallatom einen Komplex bilden, wobei diese Reagentien umfassen, bei denen es sich um Stoffzusammensetzungen der Erfindung handelt, die mit einem nicht-radioaktiven Metallatom wie etwa Kupfer, Zink oder Rhenium einen Komplex bilden. In Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung bildet das nicht-radioaktive Metallion mit der metallionenkomplexierenden Gruppe einen Komplex. Die Erfindung schafft solche therapeutischen Mittel zur Verwendung bei der Behandlung von Zuständen, in welchen Somatostatinrezeptoren in Zellen, die bestimmten Gewebe angehören, überexprimiert werden, sowie bei der Behandlung von neoplastischen Zellen, die eine Hyperexpression von Somatostatinrezeptoren zeigen. Verfahren zur Herstellung dieser nicht-radioaktiv markierten therapeutischen Mittel, die mit Metallatomen einen Komplex bilden, werden ebenfalls bereitgestellt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Reagentien, die durch die Erfindung geschaffen werden, um solche nicht-radioaktiv markierten therapeutischen Mittel herzustellen, ist eine Verbindung mit folgender Formel: cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCK.amid).
Zu den bevorzugten nicht-radioaktiv markierten therapeutischen Mitteln gehört der Rheniumkomplex dieses Reagens.
Diese Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung der Peptid-Ausführungsformen der Reagentien der Erfindung mittels chemischer Synthese in vitro bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide mittels Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert.
Diese Erfindung stellt Verfahren zur Verwendung der diagnostischen und radiodiagnostischen und therapeutischen und radiotherapeutischen Mittel der Erfindung bereit. Was die radioaktiv markierten Ausführungsformen der Mittel der Erfindung, zum Beispiel Tc-99m-markierte szintigraphische bildgebende Mittel, betrifft, wird eine wirksame diagnostische oder therapeutische Menge des diagnostischen oder radiodiagnostischen oder therapeutischen oder radiotherapeutischen Mittels der Erfindung verabreicht. In radiodiagnostischen Ausführungsformen wird der Aufenthaltsort des radioaktiven Markers mit Hilfe herkömmlicher Verfahren wie etwa gamma-Szintigraphie detektiert. In nicht- radioaktiven diagnostischen Ausführungsformen, werden die Anreicherungsstellen der diagnostischen Mittel, die mit einem paramagnetischen Metall markiert sind, lokalisiert, indem bildgebende Magnetresonanzverfahren zum Einsatz gebracht werden. Die bildgebenden Mittel, die durch die Erfindung geschaffen werden, sind für die bildliche Darstellung von Tumoren von Nutzen, insbesondere für die bildliche Darstellung von primären und metastatischen neoplastischen Stellen, an denen die neoplastischen Zellen Somatostatinrezeptoren (SSTR) exprimieren, sowie insbesondere für solche primären und insbesondere metastatischen Tumorzellen, die sich in der klinischen Praxis als nur schwer mit herkömmlichen Detektionsverfahren detektierbar erwiesen haben. Darüber hinaus sind die bildgebenden Mittel der Erfindung bei der Detektion von Stellen von Nutzen, an denen in Verbindung mit einer verborgenen Krankheit oder Pathologie eine Anreicherung von T-Lymphozyten auftritt, wie dies z.B. bei Patienten der Fall ist, die an Tuberkulose leiden.
Die Erfindung stellt Verfahren zur Verwendung der Somatostatinanaloga der Erfindung zum Zwecke der Linderung von Krankheiten oder anderen Leiden bei Tieren, vorzugsweise beim Menschen, bereit. Zu diesen Krankheiten und Leiden gehören Diabetes und diabetische Retinopathie, Leberzirrhose und hepatitisartige Infektionen, blutende Magengeschwüre und andere Blutungen im Magen-Darm-Trakt, Bauchspeicheldrüsenentzündung, Störungen des zentralen Nervensystems, endokrine Störungen, die Alzheimersche Krankheit, Akromegalie und andere Krankheiten und Störungen, die mit der Ausschüttung unangemessener Mengen an Wachstumshormon in vivo in Verbindung stehen, sowie Krebs, insbesondere solche Krebserkrankungen, deren Wachstum von der Ausschüttung von Wachstumshormon anhängt oder beeinflusst wird, wobei die Verwendung aber nicht auf die genannten Krankheiten beschränkt ist. Nicht-radioaktiv markierte therapeutische Ausführungsformen sind darüber hinaus bei der Behandlung von Leiden, die mit der Hyperexpression von SSTR in Verbindung stehen, wie etwa bei Durchfall, der durch ein SSTR-hyperexprimierendes Gastrinom verursacht wird, von Nutzen. Die Dosierung der Somatostatinanaloga, die durch die Erfindung geschaffen werden, kann den Dosierungen nativen Somatostatins, das routinemäßig zur Behandlung der obigen oder anderer Krankheiten verwendet wird, entsprechen, oder es kann von den Verbindungen der Erfindung weniger verabreicht werden, da letztere in vivo eine längere Halbwertszeit aufweisen.
Zu den therapeutischen Verwendungen gehört das radiotherapeutische Abtragen von neoplastischen und metastatischen bösartigen Zellen bei Patienten mit Tumoren, deren Zellen den Somatostatinrezeptor exprimieren. Zu den Verwendungen der radiotherapeutischen Mittel der Erfindung gehört die primäre therapeutische Verwendung bei Tumoren, die auf herkömmliche Therapien nicht ansprechen, und bei Tumoren, die nicht operiert werden können, sowie die ergänzende Therapie bei chirurgischen Eingriffen, Strahlentherapie oder herkömmlicher Chemotherapie.
Die radioaktiv markierten Ausführungsformen der Erfindung sind darüber hinaus als chirurgische Führungshilfen, mit denen Gewebe, das Somatostatinrezeptoren exprimiert, während des chirurgischen Eingriffs erkannt werden kann, von Nutzen. Im Falle eines solchen chirurgischen Eingriffs mit Führung durch Radioisotope, kann Gewebe, das dem Chirurgen anderenfalls verborgen bliebe, erkannt und während eines ansonsten herkömmlichen chirurgischen Eingriffs herausgeschnitten werden.
Spezifische bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich in offensichtlicher Weise aus der folgenden ausführlicheren Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen sowie aus den Ansprüchen.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt ein Bild des ^99mTc-markierten P587 in einer Ratte mit einem Tumor, welcher mit einem Pfeil angezeigt wird, wobei sich eine starke Aufnahme an der Tumorstelle im unteren Beinbereich zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die vorliegende Erfindung schafft zyklische Peptide, die Somatostatinanaloga darstellen und keinerlei Disulfidbindung aufweisen. Solche Somatostatinanaloga weisen daher, verglichen mit nativem Somatostatin, eine erhöhte in vivo-Stabilität auf. Diese zyklischen Peptide stellen an sich bereits therapeutische Mittel zur Linderung von Krankheiten und anderen Leiden bei Tieren einschließlich der Menschen dar.
Weiterhin schafft die Erfindung zyklische Peptide, die radioiodiert oder radioastatisiert sein können und die daher für radiotherapeutische und radiodiagnostische Anwendungen von Nutzen sind.
Bei einer weitere Ausführungsform dieser zyklischen Peptide, die aus von dieser Erfindung geschaffen werden, handelt es sich um zyklische Peptidreagentien, bei denen die zyklischen Peptide der Erfindung über eine kovalente Bindung mit einer metallionenkomplexierenden Gruppe verknüpft sind. Solche zyklischen Peptidreagentien sind dazu befähigt, radioaktiv markiert zu werden, wodurch radiodiagnostische oder radiotherapeutische Mittel geschaffen werden. Ein Beispiel für eine radiodiagnostische Anwendung, bei welcher radioaktiv markierte Mittel der Erfindung zum Einsatz kommen, ist die szintigraphische Bildgebung, bei welcher der Ort und das Ausmaß von Tumoren mit Somatostatinrezeptoren bestimmt werden kann. Die zyklischen Peptidreagentien der Erfindung können für radiotherapeutische Verwendungen weiterhin vorteilhafterweise mit zytotoxischen Radioisotopen wie etwa Rhenium-186 oder Rhenium-188 radioaktiv markiert werden. Die zyklischen Peptidreagentien der Erfindung sind darüber hinaus zur Herstellung von Komplexen mit nicht-radioaktiven Metallen von Nutzen, wobei die Komplex von therapeutischem Nutzen sind.
Das Markieren mit Tc-99m stellt einen Vorteil der vorliegenden Erfindung dar, weil die nuklearen und radioaktiven Eigenschaften dieses Isotops es zum einem idealen szintigraphischen bildgebenden Mittel machen. Dieses Isotop weist eine Einzelphotonenenergie von 140 KeV und eine radioaktive Halbwertszeit von ungefähr 6 Stunden auf, und es ist auf einfache Weise mittels eines ⁹⁹Mo-^99mTc-Generators erhältlich. Weitere Radionuklide können ebenfalls bei der praktischen Umsetzung der im vorliegenden Schriftstück offenbarten Erfindung verwendet werden.
Der Begriff szintigraphisches bildgebendes Mittel ist im vorliegenden Schriftstück derart aufzufassen, dass er ein radioaktiv markiertes Mittel umfasst, welches mit Mitteln zur Detektion von Radioaktivität (einschließlich einer Gammakamera, eines Geiger-Müller-Zählers und einer Szintillationsdetektorsonde, wobei die Auswahl aber nicht auf die genannten Vorrichtungen beschränkt ist) detektiert werden kann.
Die radiotherapeutischen Ausführungsformen der Erfindung werden hingegen vorteilhafterweise mit zytotoxischen Radioisotopen einschließlich Kupfer-67, Iod-125, Iod-131, Rhenium-186, Rhenium-188 und Astat-211 markiert, wobei die Auswahl aber nicht auf die genannten Isotope beschränkt ist und mit größtem Vorzug ¹⁸⁶Re oder ¹⁸⁸Re verwendet werden. Solche Ausführungsformen sind für die Behandlung von Krankheiten oder anderen Leiden, die mit Somatostatin in Verbindung stehen, bei Tieren, vorzugsweise beim Menschen, von Nutzen, wobei dazu Krebs und andere Krankheiten gehören, die dadurch gekennzeichnet sind, dass ein Wachstum bösartiger oder gutartiger Tumoren auftritt, welche dazu befähigt sind, Somatostatin oder Somatostatinanaloga mittels der Expression von Somatostatinrezeptoren an der Zelloberfläche der Zellen, aus denen die Tumoren bestehen, zu binden, und wobei die Möglichkeiten aber nicht auf die genannten Krankheiten beschränkt sind.
Die vorliegende Erfindung schafft Reagentien zur Herstellung von diagnostischen und radiodiagnostischen Mitteln sowie von therapeutischen und radiotherapeutischen Mitteln. Die Reagentien, die durch die Erfindung geschaffen werden, umfassen eine metallionenkomplexierende Gruppe, die über eine kovalente Bindung mit einem spezifisch bindenden Peptid, welches an Somatostatinrezeptor-Stellen innerhalb eines Säugetierkörpers bindet, verknüpft ist.
Kleine Verbindungen, die vorzugsweise ein Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton aufweisen, haben deutliche Vorteile hinsichtlich des gewerbsmäßigen Vertriebs. Solche kleinen Verbindungen können auf einfache Weise hergestellt werden. Darüber hinaus ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass sie nicht immunogen sind und dass sie rasch aus der Blutbahn verschwinden, wodurch eine bessere und schnellere Bildgebung ermöglicht wird. Im Gegensatz dazu sind größere Moleküle wie etwa Antikörper oder deren Fragmente oder aber andere Peptide biologischen Ursprungs, die größer als 10.000 Dalton sind, kostspielig in der Herstellung, und die Wahrscheinlichkeit ist hoch, dass sie immunogen sind und dass sie langsamer aus der Blutbahn verschwinden, was eine rasche in vivo Diagnose beeinträchtigt.
Ein Vorteil der Somatostatinanaloga, die durch diese Erfindung geschaffen werden, besteht darin, dass die in ihnen enthaltene nicht-sulfidische zyklische Bildung unter den Bedingungen stabil ist, welche bei der radioaktiven Markierung der Gruppe zur Bindung des radioaktiven Markers, die über eine kovalente Bindung verknüpft ist, vorherrschen. Im Gegensatz dazu kann es, zum Beispiel, im Falle der Herstellung eines Konjugates aus Tc-99m und einer Tc-99m-bindenden Gruppe, die über eine kovalente Bindung mit nativem Somatostatin oder mit einem Somatostatinanalogon, das eine Disulfidbindung aufweist, verknüpft ist, zu einer Reduktion des Disulfids kommen, mit welcher ein Verlust an biologischer Aktivität einhergeht. Solch ein Verlust an biologischer Aktivität kann auch in vivo bei der Verwendung nativen Somatostatins oder bei einem beliebigen Somatostatinanalogon auftreten, das eine Disulfidbindung aufweist. Die vorliegende Erfindung unterliegt derartigen Verlusten an biologischer Aktivität in vivo nicht, da die nicht-sulfidischen Ringschlüsse in sämtlichen Somatostatinanaloga der Erfindung stabile kovalente Bindungen aufweisen.
Für die Zwecke dieser Erfindung ist der Begriff "spezifisch bindende Peptide" derart aufzufassen, dass eine beliebige Peptidverbindung gemeint sein kann, die spezifisch an eine Zielstelle in einem Säugetierkörper bindet, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie Somatostatinrezeptor(SSTR)-Molekül im Übermaß aufweist. Wie der Fachmann verstehen wird, bedeutet "spezifisch bindend", dass das Peptid sich in einem größeren Ausmaß an der Zielstelle aufhält als in den umgebenden Geweben. Eine solche spezifische Bindung ist bei diagnostischen bildgebenden Mitteln, welche derartige spezifisch bindende Peptide umfassen, von Vorteil, da diese sich nach der Verabreichung über den gesamten Säugetierkörper verteilen und eine solche spezifische Lokalisation der Radioaktivität, die an das Reagens gebunden ist, für eine visuelle Abgrenzung des Zieles in vivo sorgt.
Jede spezifisch bindende, peptidhaltige Ausführungsform der Erfindung umfasst eine Sequenz aus Aminosäuren. Der Begriff Aminosäure wird in dieser Erfindung mit der Absicht verwendet, dass darin sämtliche primären α- und β-Aminosäuren in der L- und in der D-Form enthalten sein sollen, wobei diese natürlich auftreten können und auch modifiziert, substituiert oder abgeändert sein können oder anderweitig auftreten können. Die Ausführungsformen der spezifisch bindenden Peptide in den Reagentien der Erfindung umfassen spezifisch bindende Peptide mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 5.000 Dalton. Zu den besonders bevorzugten Ausführungsformen der spezifisch bindenden Peptide der Erfindung gehören Peptide, die spezifisch und mit hoher Affinität an den Somatostatinrezeptor (SSTR) auf SSTR-exprimierenden Zellen, insbesondere auf Tumorzellen und aktivierten T-Lymphozytenzellen, binden. Zu den Reagentien, die spezifisch bindende Peptide, die durch die Erfindung geschaffen werden, umfassen, gehören Reagentien, welche Peptide mit den folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen, wobei die Auswahl aber nicht auf die genannten Reagentien beschränkt ist (bei den Aminosäuren in den folgenden Peptiden handelt es sich, wenn nichts anderes angegeben ist, um L-Aminosäuren): cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCK.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCR.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRD.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRK.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRR.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCKK.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCKKK.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.Orn.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCKDK.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.Orn.D.Orn.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.Orn.D.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.KKC.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.KRC.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.RRC.amid) cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.KKCK.amid). cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GRCK.amid). cyclo(N-methyl)FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GKCR.amid).
(Für die einbuchstabigen Abkürzungen für Aminosäuren siehe Zubay, ibid., p.33; die übrigen Abkürzungen entsprechen denjenigen in der Legende zur Tabelle I). Diese Liste der Reagentien, die durch die Erfindung geschaffen wird, dient der Erläuterung und soll keinesfalls einschränkend oder ausschließend wirken, wobei der Fachmann verstehen wird, dass die Reagentien, die Kombinationen aus den im vorliegenden Schriftstück offenbarten Peptiden oder aus Verbindungen, die diesen entsprechen, enthalten, über eine kovalente Bindung mit einer beliebigen der chelatbildenden Gruppen der Erfindung verknüpft sein können und dabei in den Geltungsbereich der Erfindung fallen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Reagens der Erfindung folgende Formel auf:
Die spezifisch bindenden Peptide, die in den Reagentien der vorliegenden Erfindung enthalten sind, können chemisch in vitro synthetisiert werden. Solche Peptide können im Allgemeinen vorteilhafterweise mit Hilfe eines Peptidsynthesizers hergestellt werden. Die Peptide dieser Erfindung können synthetisiert werden, wobei die metallionenkomplexierende Gruppe während der chemischen in vitro-Synthese über eine kovalente Bindung mit dem Peptid verknüpft wird, und zwar unter Einsatz von Techniken, die im vorliegenden Schriftstück erklärt werden (siehe, zum Beispiel, Beispiel 2, Unterabschnitt O).
In Ausführungsformen der Erfindung, die der szintigraphischen Bildgebung dienen, wird ein Komplex aus Technetium-99m und den Reagentien dieser Erfindung gebildet. Um dies zu erreichen, wird Tc-99m, vorzugsweise in Form eines Tc-99m-Pertechnetatsalzes, mit den Reagentien dieser Erfindung in Gegenwart eines Reduktionsmittels umgesetzt. Dithionit-Ionen sowie Zinn(II)- und Eisen(II)ionen sind die bevorzugten Reduktionsmittel; das am stärksten bevorzugte Reduktionsmittel ist ein Zinn(II)salz wie etwa Zinn(II)chlorid. In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Reduktionsmittel um ein Festphasen-Reduktionsmittel. Die Komplex sowie die Mittel zur Herstellung solcher Komplexe werden zweckmäßigerweise in Form eines Kits vorgehalten, welches ein versiegeltes Probengefäß umfasst, das eine zuvor festgelegte Menge eines Reagens der Erfindung sowie eine Menge an Reduktionsmittel enthält, die ausreicht, um das Reagens mit Te-99m zu markieren. Alternativ dazu kann der Komplex gebildet werden, indem ein Reagens dieser Erfindung mit einem zuvor gebildeten labilen Komplex aus Technetium und einer weiteren Verbindung, die als Transferligand bezeichnet wird (wie etwa Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit, zum Beispiel) umgesetzt wird. Dieses Verfahren ist dem Fachmann unter der Bezeichnung Ligandenaustausch bekannt. Zu den Tc-99m-Pertechnetatsalzen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, gehören die Salze der Alkalimetalle wie etwa das Natriumsalz oder aber Ammoniumsalze oder Alkylammoniumsalze.
Die szintigraphischen bildgebenden Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung, die mit Technetium-99m markiert sind, können hergestellt werden, indem eine geeignete Menge an Tc-99m oder Tc-99m-Komplex in die Probengefäße gegeben und unter den Bedingungen, die weiter unten in Beispiel 3 beschrieben sind, zur Reaktion gebracht wird. Das Kit kann weiterhin herkömmliche pharmazeutische Zusatzstoffe wie beispielsweise pharmazeutische unbedenklich Salze zur Einstellung des osmotischen Drucks sowie Puffer, Konservierungsstoffe und Ähnliches enthalten. Die Bestandteile des Kits können in flüssiger, gefrorener oder trockener Form vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die Bestandteile des Kits in gefriergetrockneter Form vor. Die radioaktiv markierten szintigraphischen bildgebenden Reagentien gemäß der vorliegenden Erfindung können durch Umsetzung unter den Bedingungen, die weiter unten in Beispiel 3 beschrieben sind, hergestellt werden.
Die radioaktiv markierten Reagentien, die durch die vorliegende Erfindung geschaffen werden, weisen ein geeignetes Ausmaß an Radioaktivität auf. Bei der Bildung von radioaktiven Tc-99m-Komplexen wird es beispielsweise im Allgemeinen bevorzugt, radioaktive Komplexe in Lösungen zu bilden, deren Radioaktivität Konzentrationen von ungefähr 0,01 Millicurie (mCi) bis 100 mCi pro mL erreicht.
Die bildgebenden Reagentien, die durch die vorliegende Erfindung geschaffen werden, können durch sichtbaren Darstellung von Organen wie etwa den Nieren verwendet werden, um Störungen in diesen Organen feststellen zu können, wobei insbesondere auch Tumoren im Magen-Darm-Trakt, Myelome, kleinzellige Lungenkarzinome und andere Tumoren des APUD-Systems, endokrine Tumoren wie etwa medulläre Schilddrüsenkarzinome und Tumoren der Hirnanhangdrüse, Gehirntumoren wie etwa Meningeome und Astrozytome sowie Tumoren der Prostata, der Brust, des Dickdarms und der Eierstöcke bildlich dargestellt werden können. Gemäß dieser Erfindung werden die Tc-99m-markierten Peptidreagentien in einer einzigen injizierbaren Dosiseinheit verabreicht. Die Tc-99m-markierten Peptidreagentien, die durch die Erfindung geschaffen werden, können intravenös ein einem beliebigen herkömmlichen Medium für intravenöse Injektionen wie etwa in einem wässrigen Salzmedium oder in einem Blutplasmamedium verabreicht werden. Im Allgemeinen weist die zu verabreichende Dosiseinheit eine Radioaktivität von ungefähr 0,01 mCi bis ungefähr 100 mCi auf, vorzugsweise liegt diese zwischen 1 mCi und 20 mCi. Die zu injizierende Lösung umfasst als Dosiseinheit zwischen ungefähr 0,01 mL und ungefähr 10 mL. Nach der intravenösen Verabreichung kann die bildliche Darstellung in vivo innerhalb von wenigen Minuten erfolgen. Wenn dies gewünscht wird, ist es indes möglich, nach der Injektion des radioaktiv markierten Peptids in den Patienten die bildliche Darstellung erst nach Ablauf von Stunden oder einer noch längeren Zeit vorzunehmen. In den meisten Fällen wird sich innerhalb von ungefähr 0,1 Stunden eine Menge der verabreichten Dosis in den darzustellenden Bereichen angereichert haben, die ausreichend ist, um szintigraphische Aufnahmen zu machen. Gemäß dieser Erfindung kann jedes beliebige herkömmliche Verfahren der szintigraphischen Bildgebung zu diagnostischen Zwecken angewendet werden.
Die zyklischen Peptide und die nicht-radioaktiven Metallkomplexe der zyklischen Peptidreagentien der Erfindung, die an den Somatostatinrezeptor binden, können klinisch als therapeutische Mittel eingesetzt werden, um die Rückbildung bestimmter Arten von Tumoren, insbesondere solcher, die Somatostatinrezeptoren exprimieren, zu fördern. Die dem Somatostatin analogen zyklischen Peptide der Erfindung können darüber hinaus verwendet werden, um die übermäßige Hormonsekretion, die oftmals mit bestimmten Krebserkrankungen Somatostatin wie etwa solchen des APUD-Systems einhergeht, zu verringern. Die Peptide der Erfindung, die als therapeutische Mittel verwendet werden, können auf jedem beliebigen geeigneten Wege verabreicht werden, einschließlich der intravenösen, intramuskulären oder oralen Wege, und zwar in jeder beliebigen pharmazeutisch unbedenklichen Trägersubstanz, wobei die Dosis im Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 49 mg/Kg Körpergewicht/Tag liegt.
Diese Erfindung schafft weiterhin Peptide, die mit zytotoxischen Radioisotopen wie etwa Rhenium-186 oder Rhenium-188 radioaktiv markiert sind und wie oben beschrieben in der Strahlentherapie bestimmter Tumore eingesetzt werden können. Zu diesem Zwecke kann eine Menge an radioaktivem Isotop, die zwischen ungefähr 10 mCi und ungefähr 200 mCi liegt, auf jedem beliebigen geeigneten klinischen Wege verabreicht werden, vorzugsweise durch intravenöse Injektion.
Die Verfahren zur Herstellung und Markierung dieser Verbindungen werden auf vollständige Weise in den folgenden Beispielen erläutert. Diese Beispiele erläutern bestimmte Aspekte des oben beschriebenen Verfahrens sowie vorteilhafte Ergebnisse und werden zur Erläuterung, nicht aber zur Einschränkung aufgeführt.
BEISPIEL 1
Festphasen-Peptidsynthese
Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) wurde im Maßstab von 0,25 Millimol (mmol) mittels eines Applied Biosystems Peptidsynthesizer, Modell 431A, durchgeführt, und zwar unter Anwendung von 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) zum Schutz des Aminoendes, unter Kupplung mit Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol oder 2-(1H-Benzo-triazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat/Hydroxybenzotriazol (HBTU/HOBT) und unter Anwendung von Harzen des Typs p-Hydroxymethylphenoxymethylpolystyrene (HMP) oder Sasrin^TM im Falle einer Säurefunktion am Carboxylende bzw. Harzen des Typs Rinkamid im Falle einer Amidfunktion am Carboxylende.
Aus den geeigneten Aminosäuren wurden Fmoc.Hcy(S-trityl) und Fmoc.Pen(S-trityl) durch Tritylierung mit Triphenylmethanol in Trifluoressigsäure mit anschließender Fmoc-Derivatisierung wie von Atherton et al. (1989, Solid phase Peptide Synthesis, IRL Press: Oxford) sowie weiter unten in Beispiel 2, Unterabschnitt J beschrieben, hergestellt. Fmoc-S-(3-Boc-aminopropyl)cystein wurde aus L-Cystein und Boc-aminopropylbromid in methanolischem Natriummethoxid hergestellt, worauf eine Behandlung mit O-9-Fluorenylmethyl-O'-N-succcinimidylcarbonat (FmocOSu) bei einem pH-Wert von 10 erfolgte.
Es wurden 2-Haloacetylgruppen eingeführt, indern entweder die geeignete 2-Haloessigsäure als letzter anzuhängender Rest während der SPPS eingesetzt wurde oder indem das freie Aminopeptid, welches am N-Ende an das Harz gebunden ist, entweder mit 2-Haloessigsäure/Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid in NMP oder mit 2-Haloessigsäureanhydrid/Diisopropylethylamin in NMP behandelt wird.
Thiolhaltige Peptide wurden bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 10 für eine Dauer von 0,5-24 Stunden mit chloracetylhaltigen, thiolgeschützten Tc-99m-komplexierenden Gruppen umgesetzt. Wahlweise folgte eine Ansäuerung von Essigsäure sowie eine Verdampfung der Lösung um, das entsprechende Peptid-Sulfid-Addukt zu erhalten, wie ausführlicher weiter unten in Beispiel 2, Unterabschnitt O beschrieben ist. Die Entfernung der Schutzgruppe und die Aufreinigung wurden routinemäßig wie beschrieben durchgeführt, um das Konjugat aus Chelatbildner und Peptid zu erhalten.
Diejenigen Peptide, die an das Sasrin^TM-Harz gebunden waren, wurden unter Verwendung 1 %igen Lösung von TFA in Dichlormethan abgespalten, um das geschützte Peptide zu erhalten.
Die geschützten Peptid-Vorläufersubstanzen wurden gegebenenfalls durch Ringschluss zwischen den Amino- und Carboxylenden zyklisiert, und zwar durch Reaktion zwischen dem seitenkettengeschützten freien Amin des Aminoendes und der entsprechenden freien Säure des Carboxylendes unter Verwendung von Diphenylphosphorylazid, wie weiter unten in Beispiel 2, Unterabschnitt M, ausführlicher beschrieben ist.
Die Produkte, die an HMP oder Rinkamid-Harz gebunden waren, wurden routinemäßig abgespalten, und die geschützten zyklisierten Peptide wurden bei Raumtemperatur durch 0,5- bis 3stündiges Einwirken einer Lösung, die Trifluoressigsäure (TFA) oder TFA und Dichlormethan sowie wahlweise Wasser, Thioanisol, Ethandithiol und Triisopropylsilan in Mengenverhältnissen von 100 : 5 5 : 2,5 : 2 umfasste, von den Schutzgruppen befreit. Die Produkte wurden gegebenenfalls in Triphenolmethanol/TFA erneut S-trityliert, und das Peptid wurde unter Verwendung von (Boc)₂O erneut mit N-Boc-Gruppen versehen.
Die Rohpeptide wurden durch präparative Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Säule des Typs Waters Delta-Pak C18 und eines Elutionsgradienten mit 0,1 % TFA in Wasser, modifiziert mit Acetonitril, aufgereinigt. Nach dem Eluieren der Säule wurde das Acetonitril aus den eluierten Fraktionen verdampft, welche daraufhin gefriergetrocknet wurde. Die Identität der Produkte, die auf diese Weise hergestellt und aufgereinigt wurden, wurde mittels FABMS (Fast atom bombardment mass spectroscopy) oder ESMS (Electrospray mass spectroscopy) bestätigt.
BEISPIEL 2
Synthese von cyclo(N-CH₃)Phenylalanyl-tyrosyl-D-tryptophanyl-lysyl-valyl-homocystein, S-2-acetyl-glycyl-glycyl-cysteinyl-lysinamid (P587)
A. Synthese von N-α-Carbobenzoxy-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysin, N-Hydroxy-succinimidester
Zu einer Mischung aus N-α-Carbobenzoxy-N-ε-tert-butoxycarbonyllysin (23 g, 60,5 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (7,1 g, 61,7 mmol) in 180 mL trockenem Tetrahydrofuran (THF), welche durch ein kaltes Wasserbad gekühlt wurde, wurde Diisopropylcarbodiimid (9,66 mL, 61,7 mmol) hinzugefügt. Diese Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und anschließend filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand des Filtrates wurde anschließend wieder der geringstmöglichen Menge an Ethylacetat sowie in 200 mL Ether und 200 mL Hexanen gelöst. Aus dieser Mischung fiel die Titelverbindung aus und wurde durch Filtration gewonnen, mit kalten Hexanen gewaschen und getrocknet, woraufhin 28,1 g (58,9 mmol, 97 % Ausbeute) erhalten wurden.
B. Synthese von N-α-Carbobenzoxy-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester
Zu einer Lösung von Valinmethylester (8,38 g, 50 mmol) und Diisopropylethylamin (12,7 mL, 50 mmol) in 150 mL THF wurden N-α-Carbobenzoxy-N-ε-tert-butoxycarbonyllysin, N-Hydroxysuccinimidester (23,9 g, 50 mmol) sowie anschließend weitere 50 mL THF hinzugefügt. Nach 2 Std. wurde das Lösemittel durch Verdampfen entfernt und dem Rückstand 50 mL Ethylacetat zugesetzt. Diese Lösung wurde nacheinander mit 200 mL 5%iger Zitronensäure, 200 mL gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und 200 mL gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das erhaltene Öl wurde in der geringstmöglichen Menge an Ethylacetat sowie in 200 mL Ether und 200 mL Hexanen gelöst. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert und dann getrocknet, wobei 20 g (40,5 mmol, 81 % Ausbeute) erhalten wurden.
C. Synthese von N-ε-tert-Butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester
Zu einer Lösung von N-α-Carbobenzoxy-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester (19 g, 38,5 mmol) und Essigsäure (1 mL) in 100 mL Ethylacetat wurde ein Katalysator bestehend aus 10 % Palladium auf Kohle (0,19 g) gegeben und über Nacht unter Wasserstoffatmosphäre gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend über Celite filtriert, das Filtrat eingedampft, und der Rückstand wieder in 100 mL Methanol, die 1 mL Essigsäure enthielten, gelöst. Zu dieser Lösung wurde 10%iges Palladium auf Kohle (0,19 g) gegeben, und die Mischung wurde mittels einer Hydrieranlage des Typs Parr unter einem Druck von 45 psi zwei Stunden lang hydriert. Die Reaktionsmischung wurde erneut über Celite filtriert und das Filtrat eingedampft, woraufhin 13,56 g der Titelverbindung (37,7 mmol, 98 % Ausbeute) erhalten wurden.
D. Synthese von Fluorenylmethoxycarbonyl-D-tryptophan, N-Hydroxysuccinimidester
Zu einer Lösung von N-α-Fluorenylmethoxycarbonyltryptophan Hemihydrat (25 g, 82.1 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (9,78 g, 85 mmol) in 250 mL trockenem THF, welche mit einem kalten Wasserbad gekühlt wurde, wurde Diisopropylcarbodiimid (13,3 mL, 85 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt, filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde anschließend wieder in Toluol und Hexanen gelöst. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert und dann getrocknet, um 34 g (66,5 mmol, 81 % Ausbeute) zu erhalten.
E. Synthese von Fluorenylmethoxycarbonyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxy-carbonyl-lysyl-valin, Methylester
Zu einer Mischung aus N-ε-tert-Butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester (13 g, 36,1 mmol) in 200 mL THF wurde Fluorenylmethoxycarbonyl-D-tryptophan, N-Hydroxysuccinimidester (18,9g, 36,1 mmol) hinzufügt. Um den pH-Wert der Reaktionsmischung auf 8 einzustellen, wurde Diisopropylethylamin hinzugefügt, woraufhin die Reaktion 2 Tage lang unter Rühren durchgeführt wurde. Anschließend wurde das Lösemittel durch Verdampfen entfernt, der Rückstand wieder in Ethylacetat gelöst, mit 5%iger Zitronensäure, gesättigtem Hydrogencarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde dann filtriert und eingedampft, und der Rückstand wurde wieder in Ethylacetat gelöst. Nach mehreren Kristallisationen aus dieser Lösung wurden 17,3 g (22,5 mmol, 62 % Ausbeute) der Titelverbindung erhalten.
F. Synthese von N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-tert-butyltyrosin, N-Hydroxysuccinimidester
Zu einer Lösung von N-α-fluorenylmethoxycarbonyl-O-tert-butyltyrosin (25 g, 54,3 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (6,62g, 57,5mmol) in 250 mL trockenem THF, welche mit einem kalten Wasserbad gekühlt wurde, wurde Diisopropylcarbodiimid (9,0 mL, 57,5 mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt, filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde anschließend wieder in Toluol und Hexanen gelöst. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert und dann getrocknet, wobei 27,7 g (49,7 mmol, 92 % Ausbeute) erhalten wurden.
G. Synthese von N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-tert-butyltyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester
Fluorenylmethoxycarbonyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester (17 g, 22.1 mmol) wurde 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 40 mL Diethylamin und 40 mL THF behandelt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend eingedampft, wieder in 100 THF in Suspension gebracht und weitere drei Male eingedampft. Der Rückstand wurde in 120 mL trockenem THF und N-Fluorenylmethoxycarbonyl-O-tert-butyltyrosin aufgenommen, N-Hydroxysuccinimidester wurde hinzugefügt (12,3 g, 22,1 mmol), woraufhin 20 mL trockenes THF und 4 mL Diisopropylethylamin zugesetzt wurden, um eine Lösung mit einem pH-Wert von 9 zu erhalten. Nachdem über Nacht gerührt, wurden die Reaktionsbestandteile eingedampft und der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen. Die Ethylacetatlösung wurde mit 5%iger Zitronensäure, gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat, Ether und Hexanen aufgenommen, und die Titelverbindung fiel als Niederschlag aus. Die ausgefällte Verbindung wurde durch Filtration isoliert und getrocknet, um 14,6 g der Titelverbindung (14,8 mmol, 67 % Ausbeute) zu erhalten.
H. Synthese von N-Fluorenylmethoxycarbonyl-N-methylphenylalanin, N-Hydroxysuccinimidester
Zu einer Lösung von N-α-Fluorenylmethoxycarbonyl-N-methylphenylalanin (25 g, 62,3 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (7,5g, 65 mmol) in 180 mL trockenem THF, welche mit einem kalten Wasserbad gekühlt wurde, wurde Diisopropylcarbodiimid (10 mL, 64,2mmol) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt, filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde anschließend wieder in Toluol und Hexanen gelöst. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert und dann getrocknet, wobei 28,3 g (57 mmol, 91 % Ausbeute) erhalten wurden.
I. Synthese von N-Fluorenylmethoxycarbonyl-N-methylphenylalanin-O-tert-butyl-tyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester
Fluorenylmethoxycarbonyl-O-tert-butyl-tyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester (14 g, 14,2 mmol) wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 35 mL Diethylamin und 35 mL THF behandelt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend eingedampft, wieder in 100 THF in Suspension gebracht und weitere drei Male eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat und Hexanen aufgenommen. Das Produkt, O-tert-Butyltyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester, wurde ausgefällt, durch Filtration isoliert und getrocknet, um 9,7 g (12,7 mmol, 90 % Ausbeute) zu erhalten. Die Substanz O-tert-Butyltyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester wurde in 35 mL trockenem THF und N-Fluorenylmethoxycarbonyl-N-methylphenylalanin aufgenommen, N-Hydroxysuccinimidester (6,35 g, 14,2 mmol) wurde hinzugefügt, woraufhin Diisopropylethylamin zugesetzt wurde, um eine Lösung mit einem pH-Wert von 9 zu erhalten. Nachdem über Nacht gerührt wurde, wurden Reaktionsbestandteile eingedampft und der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen. Die Ethylacetatlösung wurde mit 5%iger Zitronensäure, gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat, Ether und Hexanen aufgenommen, und die Titelverbindung fiel als Niederschlag aus. Die ausgefällte Verbindung wurde durch Filtration isoliert und getrocknet, um 12,4 g der Titelverbindung (11,5 mmol, 81 % Ausbeute) zu erhalten.
J. Synthese von N-Fluorenylmetboxycarbonyl-S-tritylhomocystein

a. Zu ungefähr 400 mL flüssigem Ammoniak, der mit einem Trockeneis/Ethanol-Bad auf –78 °C gekühlt wurde, wurden kleine Mengen elementaren Natriums hinzugefügt, woraufhin jeweils Mengen an Homocystein zugesetzt wurde, die ausreichten, um die sich ergebende blaue Farbe der Natrium/Ammoniak-Lösung zu entfärben, bis schließlich 5,7 g (248 mmol) an Natrium und 9,75 g (36,3 mmol) an Homocystein verbraucht worden waren und die blaue Färbung der Natrium/Ammoniak-Lösung ungefähr 15 min. bestehen blieb. Um die verbleibende blaue Färbung zu beseitigen, wurde Ammoniumchlorid (0,5 g) zugesetzt und der Reaktionsansatz anschließend aus dem Kühlbad entfernt, woraufhin das Ammonium unter einem Argonstrom abgedampft wurde. Der Kolben wurde leicht erwärmt, um im Wesentlichen alles verbleibende Ammoniak auszutreiben. Zu dem Rückstand wurde Triphenylmethanol (23,6g, 91 mmol) hinzugefügt und der Reaktionskolben mit einem Eis/Wasser-Bad gekühlt. 250 mL Trifluoressigsäure (TFA) wurden hinzugefügt, und nach 30 min wurde die Mischung eingedampft und der Rückstand dreimal mit Chloroform erneut gelöst und wieder eingedampft. Anschließend wurde der Rückstand wieder in 300 mL Wasser gelöst und der pH-Wert mit 5%iger Zitronensäure und 1M KOH auf 4 eingestellt. Das in Form eines Gummis ausgefällte Produkt wurde durch Filtration aufgefangen. Der Rückstand wurde anschließend mit Ether trituriert, um S-Tritylhomocystein (7 g, 18,6 mmol, 26 % Ausbeute) zu erhalten. In einem zweiten Ansatz wurde das Produkt durch Kristallisation aus Dimethylformamid (DMF)/Wasser aus dem Filtrat isoliert, um durch Kombination der Ansätze eine Ausbeute von 24,2 g (64 mmol, 89 %) zu erhalten.
b. Zu einer Lösung von S-Trityl-Homocystein (20 g, 53 mmol) in 150 mL Aceton/100 mL Wasser wurde zunächst Natriumcarbonat (11,5 g, 109 mmol) und dann O-Fluorenylmethyl-O'-(N-succinimidyl)carbonat (17,5 g, 52 mmol), das in 200 mL Aceton gelöst war, hinzugefügt, wobei diese Zusätze im Laufe eines Zeitraums von ungefähr 1 Std. erfolgten. Anschließend wurde die Reaktionsmischung ungefähr 2 Tage lang gerührt, woraufhin die organischen Lösemittel verdampft wurden. Zu dem wässrigen Rückstand wurden 300 mL Ethylacetat gegeben, und die Mischung wurde mit 1M HCl angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt und nacheinander mit 1M HCl, 0,5M HCl und 0,25M HCl gewaschen und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Das Rohprodukt wurde auf Kieselgel chromatographisch präpariert (100 % Chloroform → 3 % Methanol in Chloroform), um die Titelverbindung zu erhalten (19,4 g, 32 mmol, 62 % Ausbeute).

K. Synthese von N-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-trityl-homocystein-N-methyl-phenylalanin-O-tert-butyltyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester
Fluorenylmethoxycarbonyl-N-methylphenylalanin-O-tert-butyl-tyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester (9,8 g, 8,5 mmol) wurde bei Raumtemperatur mit 28 mL Diethylamin und 30 mL THF eine Stunde lang behandelt. Anschließend wurde die Reaktionsmischung eingedampft, erneut in 100 THF in Suspension gebracht und weitere drei Male erneut eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat und Hexanen aufgenommen. Das Produkt, N-methylphenylalanin-O-tert-butyltyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester, wurde ausgefällt, durch Filtration isoliert und getrocknet, um 4,9 g (8,1 mmol, 95 % Ausbeute) zu erhalten.
Zu einer Lösung von N-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-trityl-homocystein in 50 mL trockenem THF, welche mit einem Kühlbad auf –15 °C gekühlt wurde, wurden N,N'-bis(2-Oxo-3-oxazolidinyl)phosphinsäurechlorid (BOP-Cl; 2,47 g, 9,7 mmol) und 1,7 mL Diisopropylethylamin (9,7 mmol) hinzugefügt und die Reaktionsmischung 30 min. lang gerührt. Es wurde N-Methylphenylalanin-O-tert-butyltyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester (7,48 g) in 50 mL trockenem THF sowie anschließend weitere 1,7 mL Diisopropylethylamin hinzugefügt. Durch Eindampfen wurde das Volumen des Reaktionsansatzes um 50 % verringert und dann 2 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösemittel wurde durch Verdampfen entfernt, der Rückstand wieder in Ethylacetat gelöst, mit 5%iger Zitronensäure, gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Der Rückstand wurde in Ethylacetat, Ether und Hexanen aufgenommen, und die Titelverbindung fiel als Niederschlag aus. Die Titelverbindung wurde durch Filtration isoliert, wobei 10,2 g (6,77 mmol, 84 Ausbeute) erhalten wurden.
L. Synthese von S-Trityl-homocystein-N-methylphenylalanin-O-tert-butyl-tyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin
Eine Lösung von N-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-trityl-homocystein-N-methylphenylalanin-O-tert-butyl-tyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin, Methylester (10 g, 6,6 mmol) und LiOH.2H₂O in 50 mL THF und 4 mL Wasser wurde 3 Tage lang gerührt. Weitere 25 mol% an LiOH.2H₂O wurden hinzugefügt, und zwei Stunden später wurde das Lösemittel verdampft, und der Rückstand wieder in Ethylacetat gelöst. Diese Lösung wurde mit 5%iger Zitronensäure, gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat, Ether und Hexanen aufgenommen, woraufhin die Titelverbindung als Niederschlag ausfiel, durch Filtration isoliert und dann getrocknet wurde. Das erhaltene verunreinigte Produkt wurde unter Verwendung von Chloroform/10 % Methanol in Chloroform einer Flash-chromatographischen Behandlung auf Kieselgel unterzogen, um 3,46 g der reinen Titelverbindung (47 mmol, 41 % Ausbeute) zu erhalten.
M. Synthesis von cyclo-N-methylphenylalanin-O-tert-butyltyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valyl-S-trityl-homocystein
Eine Lösung von S-Trityl-homocystein-N-methylphenylalanin-O-tert-butyl-tyrosyl-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin (3,42 g, 2,69 mmol) in 1740 DMF wurde mit einem Eiswasserbad gekühlt, woraufhin 1,16 mL Diisopropylethylamin sowie Diphenylphosphorylazid (DPPA; 5,4 g, 1,16 mmol) hinzugefügt wurden. Der Reaktionsansatz wurde 5 Tage lang bei –20°C gehalten, woraufhin weitere 25 mol% an DPPA und anschließend weitere 100 mol% an Diisopropylethylamin hinzugefügt wurden. Das Lösemittel DMF wurde anschließend durch Verdampfen entfernt und die rohe Titelverbindung aus Ethylacetat, Ether und Hexanen kristallisiert, um 2,43 g (1,9 mmol, 69 %) zu erhalten.
N. Synthese von cyclo-N-methylphenylalanyl-tyrosyl-D-tryptophanyl-lysyl-valyl-S-trityl-homocystein
cyclo-S-trityl-homocystein-N-methylphenylalanin-O-tert-butyl-tyros-D-tryptophanyl-N-ε-tert-butoxycarbonyl-lysyl-valin (2,34 g, 1,9 mmol) wurde mit 18,7 mL TFA, 2 mL Dichlormethan, 0,94 mL Wasser, 0,47 mL Ethandithiol und 0,37 mL Triisopropylsilan eine Stunde lang bei Raumtemperatur behandelt. TFA wurde durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde dreimal erneut in Chloroform gelöst und wieder eingedampft. Der Rückstand wurde anschließend erneut in 10 mL Chloroform gelöst und in 400 mL kalten Ether gegeben. Der Niederschlag des Rohproduktes wurde durch Filtration entnommen und durch präparative C18-Umkehrphasen HPLC (unter Verwendung eines Gradienten von 30 % Acetonitril → 60 % Acetonitril in Wasser, wobei sämtliche Lösemittel 0,1 % TFA enthielten) aufgereinigt, um die Titelverbindung (1 g, 1,2 mmol, 62 % Ausbeute) zu erhalten. In einer FABMS-Untersuchung (Fast atom bombardment mass spectrometry) wurde ein MH⁺-Wert von 855 bestimmt, wobei zum Vergleich der vorhergesagte (durchschnittliche) theoretische Wert 855,09 betrug.
O. Synthese von cyclo-N-methylphenylalanyl-tyrosyl-D-tryptophanyl-lysyl-valyl-S-trityl-homocystein, S-2-acetyl-glycyl-glycyl-cysteinyl-lysinamid (P587)
Cyclo-N-methylphenylalanyl-tyrosyl-D-tryptophanyl-lysyl-valyl-homocystein (250 mg, 0,29 mmol) und 2-Chloroacetyl-glycyl-glycyl-S-trityl-cysteinyl-lysylamid (hergestellt mittels SPPS wie in Beispiel 1 beschrieben; 238 mg, 0,35 mmol) wurden in 7 mL Acetonitril und 7 mL einer Lösung von 100 mM Natriumcarbonat/0,5 mM EDTA, pH-Wert 10, gelöst und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend bis zur Trockene eingedampft und in TFA, die Triisopropylsilan enthielt, wie oben in Beispiel 1 beschrieben von den Schutzgruppen befreit. Die Titelverbindung wurde dann mittels Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt, wobei 92,4 % der theoretischen Ausbeute erzielt wurden. In einer FABMS-Untersuchung (Fast atom bombardment mass spectrometry) wurde ein MH⁺-Wert von 1258 bestimmt, wobei zum Vergleich der vorhergesagte (durchschnittliche) theoretische Wert 1257,70 betrug. Die Struktur dieses Produktes, das als P587 bezeichnet wird, wird durch folgende Formel wiedergegeben:
BEISPIEL 3
Allgemeine Verfahren zur radioaktiven Markierung
0,1 mg eines Peptidreagens, das wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurden in 0,1 mL Wasser oder 0,9%igen Natriumchlorid oder 10%igem Hydroxypropylcyclodextrin (HPCD) oder 50:50 Ethanol:Wasser oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS-Puffer) oder 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert = 5, 6 oder 7,4) gelöst. Tc-99m Gluceptat wurde hergestellt, indem ein Glucoscan Probengefäß (E.I. DuPont de Nemours, Inc., Wilmington, DE) mit 1,0 mL Tc-99m Natriumpertechnetat, welches bis zu 200 mCi enthielt, aufgefüllt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde. Anschließend wurden 25 μL des Tc-99m-Gluceptats zu dem Reagens gegeben und die Reaktion bei Raumtemperatur oder bei 100 °C 5 bis 30 min. lang voranschreiten gelassen, woraufhin durch ein 0,2 μm Filter filtriert wurde.
Die Reinheit des Tc-99m-markierten Peptidreagens wurde mittels HPLC unter Anwendung der folgenden Bedingungen bestimmt: eine analytische Säule des Typs Waters Delta-Pak RP-18 mit Abmessungen von 5 μm × 4,6 mm × 220 mm wurde mit dem jeweiligen radioaktiv markierten Peptid beladen und dann mit einer Lösemittelflussrate von 1 mL/min. eluiert. Über eine Zeitdauer von 10 bis 20 min. wurde bei der Elution ein linearer Gradient angewendet, der bei 100 % des Lösemittels A (0,1 % TFA/Wasser) begann und bei 100 % der Lösung B (0,1 % TFA/90 % Acetonitril/Wasser) endete. Die radioaktiven Verbindungen wurden mittels eines im Stoffstrom befindlichen radiometrischen Detektors detektiert, welcher mit einem integrierenden Auszeichnungsgerät verbunden war. Tc-99m-Gluceptat und Tc-99m-Natriumpertechnetat werden unter diesen Bedingungen nach 1 bis 4 Minuten eluiert, während die Tc-99m-markierten Peptide nach sehr viel längerer Zeit eluiert werden.
Die folgende Tabelle erläutert das erfolgreiche Tc-99m-Markieren von Peptiden, die gemäß dem Beispiel 1 unter Verwendung des dort beschriebenen Verfahrens hergestellt wurden. TABELLE 1

* Die hochgestellten Zahlen verweisen auf die folgenden Markierungsbedingungen:
¹ = in 10%igem HPCD bei Raumtemperatur
² = in 50/50 Ethanol/Wasser bei Raumtemperatur
³ = in 0.9%igem NaCl bei 100 °C
HPLC-Verfahren (angegeben durch die hochgestellten Zeichen nach R^T): Waters-1 Säule, 100 % Lösung A → 100 M Lösung B in 10 min.

Für die einbuchstabigen Abkürzungen für Aminosäuren siehe Zubay, ibid., p.33. Das Unterstreichen bedeutet, dass eine Amidbindung oder eine Thiolbindung zwischen den verbundenen Aminosäuren der Derivatgruppen gebildet wird. Acm steht für Acetamidomethyl; Orn steht für Ornithin; F_D steht für n-Phenylalanin; Y_D steht für D-Tyrosin; W_D steht für D-Tryptophan; Apc steht für L-[S-(3-aminopropyl)cystein; und Hcy steht für Homocystein.
Die Radioiodierung und Radioastatierung wurde gemäß der Beschreibung von Seevers et al. (1982, Chem. Rev. 82: 575-590) durchgeführt.
Die nicht-radioaktiven Rheniumkomplexe wurden hergestellt, indem Peptidreagentien der Erfindung jeweils gemeinsam mit ungefähr einem Moläquivalent an Tetrabutylammoniumoxotetrabromorhenat (+5), welches wie von Cotton et al. (1966. Inorg. Chem. 5: 9-16) beschrieben hergestellt wurde, in Dimethylformamid oder Acetonitril/Wasser gelöst und dann 0,5 bis 5 Tage lang gerührt wurden. Wie oben für die Tc-99m-markierten Peptide beschrieben, wurden die Rheniumkomplexe wurden mittels Umkehrphasen-HPLC isoliert und dann mittels FABMS oder ESMS charakterisiert.
Die radioaktiven Rheniumkomplexe, bei den zum Beispiel Re-186 oder Re-188 zum Einsatz kommt, werden aus den geeigneten Perrhenatsalzen hergestellt, wobei entweder die gleiche Vorgehensweise zur Anwendung kommt wie für das Markieren mit Tc-99m oder ein Reduktionsmittel zu einer Lösung des Peptids und des Perrhenats gegeben wird, oder wahlweise ein Ligandenübertragungsmittel wie etwa Citrat eingesetzt wird, wobei der Reaktionsansatz bei Temperaturen zwischen der Raumtemperatur und 100 °C für einen Zeitraum zwischen 5 und 60 min. stehen gelassen wird.
BEISPIEL 4
Hemmung der Bindung von [¹²⁵I-Tyr¹¹]Somatostatin-14 an die AR42J-Zellmembran eines Bauchspeicheldrüsentumors in Ratten
Die Fähigkeit verschiedener Reagentien der Erfindung, die an den Somatostatinrezeptor binden, in vitro an Somatostatinrezeptoren zu binden, wurde mittels eines Assays gezeigt, bei welchem mit Hilfe der Peptidreagentien die Bindung eines radioaktiv markierten Somatostatinanalogons an Zellmembranen, die Somatostatinrezeptoren aufweisen, gehemmt wurde.
Die Tumorzell-Linie AR42J aus der Bauchspeicheldrüse der Ratte, welche den Somatostatinrezeptor exprimiert, wurde in Dulbeccos modifiziertem essentiellen Medium (DMEM) in einer befeuchteten Atmosphäre mit einem CO₂-Gehalt von 5 % bei 37 °C angezüchtet, wobei das Medium 10 % fetalem Kälberserum (FCS) und 8 mM Glutamin angereichert war. Die gewonnenen Zellen wurden in einer kalten Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4) homogenisiert, woraufhin das Homogenisat bei 39.000 g und 4 °C 10 min. lang zentrifugiert wurde. Die Pellets wurden einmal mit Puffer gewaschen und dann erneut in eiskaltem 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,4) in Suspension gebracht. Gleichvolumige Aliquote dieser Zellmembranzubereitung wurden anschließend mit [¹²⁵I-Tyr¹¹]Somatostatin-14 (Amersham, Arlington Heights, IL) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 nM bei 750.000 cpm/mL und einer spezifischen Aktivität von 2000 Ci/mmol versetzt sowie entweder mit einem Peptid oder mit einem Peptid-Rhenium-Komplex der Erfindung, und zwar bis zu einer Endkonzentration zwischen 10^–11 M und 10^–6 M in 50 mM HEPES-Puffer, pH-Wert 7,4, der bovines Serumalbumin, 5mM MgCl₂, 0,02 mg/mL Bacitracin, 0,02 mg/mL Phenylmethylsulfonylfluorid und 200.000 IU Trasylol enthielt, wobei die Umsetzungsdauer 25 min. bei 30 °C betrug.
Nach der Umsetzung wurde diese Membranmischung durch ein Polyethylenimingewaschenes GC/F Filter (Whatman Ltd., Maidstone, England) filtriert, wobei ein Filtrationsverteiler zum Einsatz kam, und der im Filter verbleibende Rückstand wurde dreimal mit 5 mL kaltem HEPES-Puffer gewaschen. Das Filter sowie eine Probe der Filterwaschlösungen wurden dann auf einem Gammazähler ausgewertet. Um die unspezifische Bindung berücksichtigen zu können, wurde der Assay darüber hinaus im Wesentlichen gemäß der obigen Beschreibung in Gegenwart von 200 nM unmarkiertem Somatostatin-14 durchgeführt. Die Datenauswertung umfasste Hill-Plots der Daten, die erstellt wurden, um die Inhibitionskonstanten zu erhalten, und zwar gemäß der Beschreibung von Bylund und Yamamura (1990, Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis, Yamamura et al., Hrsg., Raven Press: N.Y.). Die Anwendung dieses Assays mit den Reagentien der Erfindung führte zu den folgenden Ergebnissen:
TABELLE II
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Peptidreagentien der Erfindung mit hoher Affinität in vitro an Somatostatinrezeptoren binden.
BEISPIEL 5
Lokalisation und in vivo Bildgebung von Tumoren, die Somatostatinrezeptoren (SSTR) exprimieren, bei Ratten
Die in vivo Bildgebung von Somatostatinrezeptoren, die von Tumorzellen der Ratte exprimiert werden, wurde im Wesentlichen gemäß der Beschreibung von Bakker et al. (1991, Life Sciences 49: 1593-1601) durchgeführt.
Zellen der Linie CA20948 aus einem Bauchspeicheldrüsentumor der Ratte, die durch Auftauen eines gefrorenen Breis aus entnommenen Tumorzellen bereitgestellt wurden, wurden 6 Wochen alten Lewis-Ratten in Mengen von 0,05 bis 0,1 mL Suspension/Tier intramuskulär in das rechte hintere Oberbein implantiert. Nachdem die Tumoren auf einen Größe gewachsen waren, die näherungsweise 0,5 bis 2 g entspricht, wurden sie entnommen und ihr Tumorzellbrei wurde einer zweiten, unbehandelten Reihe von Lewis-Ratten implantiert. Auf diese Weise wurde die Übertragung wiederholt, um aufeinanderfolgende Generationen von Tieren mit Tumoren zu erhalten. Die Tiere mit Tumoren, die für die in vivo-Studien verwendet wurden, stammten üblicherweise aus der dritten bis fünften Übertragung und wiesen Tumoren einer Größe von 0,2 bis 2 g auf.
Um die Spezifizität der Lokalisation über radioaktive Marker zu untersuchen, wurde ausgewählten Tieren 30 Minuten vor der Injektion des radioaktiven Markers subkutan eine SSTR-blockierende Dosis (4 mg/kg) an Octreotid verabreicht. (Diese Vorgehensweise verringert nach den Untersuchungen von Bakker et al. die Aufnahme von ¹¹¹In-[DTPA]Octreotid durch den Tumor um 40 %).
Lewis-Ratten mit einem CA20948-Tumor, die aus der dritten bis fünften Übertragung stammten, wurden fixiert, um ihnen intravenös über die rückenseitige Schwanzvene eine Dosis von 0,15 bis 0,20 mCi ^99mTc-markiertem Peptid zu injizieren, wobei 3 bis 8 μg Peptid in 0,2 bis 0,4 mL enthalten waren.
Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Tiere durch Genickbruch getötet, um ausgewählte Nekropsie-Untersuchungen vorzunehmen. Die entnommenen Gewebeproben wurden gewogen und unter Mitführung eines Aliquots der injizierten Dosis mittels eines Gammaquellenzählers ausgewertet.
Für ausgewählte radioaktiv markierte Peptide sind die Ergebnisse der biologischen Verteilung nach 90 Minuten in Tabelle III aufgeführt. Insbesondere ^99mTc-P587, ^99mTc-P617, ⁹⁹Tc-P726 und ^99mTc-P736 zeigten eine sehr starke Anreicherung im Tumor, und die Tumor/Blut-Mengenverhältnisse belegen die hohe spezifische Aufnahme im Ziel(Tumor)gewebe.
1 zeigt ein Bild von ^99mTc-P587 in einer Ratte mit einem Tumor. Die starke Aufnahme durch den Tumor im unteren Bein (Pfeil) ist eindeutig zu erkennen.
Die Aufnahme von ^99mTc-P587 in Tumoren bei Ratten wurde verglichen, wenn einerseits zuvor eine Injektion von Octreotid, einem Somatostatinanalogon, das bekanntermaßen in vivo an den Somatostatinrezeptor bindet, erfolgte und diese Injektion andererseits unterblieb. In diesen Versuchen verminderte die Blockierung des Rezeptors durch Verabreichen von Octreotid vor der Verabreichung von ^99mTc-P587 die spezifische Aufnahme des radioaktiv markierten Peptids durch den Tumor um 76 %. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Bindung von ^99mTc-P587 in vivo SSTR-spezifisch ist.
TABELLE III
BEISPIEL 6
In vivo-Bildgebung menschlicher Tumoren, die Somatostatinrezeptoren exprimieren, mittels Tc-99m-markiertem P587
In einem klinischen Versuch wurde die szintigraphische bildliche Darstellung von Tumoren menschlichen Patienten unter Verwendung des Tc-99m-markierten P587-Reagens erreicht, wobei es sich um Tumoren handelte, die SSTR exprimieren.
Bei insgesamt 10 Patienten, vier Frauen und sechs Männern im Alter von 27 bis 69 Jahren, war zuvor folgende Erkrankungen diagnostiziert worden: Adenome der Hirnanhangdrüse, die Wachstumshormon absondern (4 Patienten), Melanom (1 Patient), medullärer Schilddrüsenkrebs (1 Patient), kleinzelliges Lungenkarzinom (SCLC; 1 Patient), Non-Hodgkin-Lymphom (1 Patient) oder karzinomartiges Magengeschwür (1 Patient). Jedem dieser Patient wurde Tc-99m-markiertes P587 in einer Dosis von 10 bis 22 mCi pro 0,2 bis 0,5 mg durch intravenöse Injektion verabreicht. Die szintigraphische Bildgebung wurde anschließend bei den jeweiligen Patienten über einen Zeitraum von 4 Stunden nach der Injektion durchgeführt, und zwar gemäß der obigen Beschreibung im vorliegenden Schriftstück.
Die Bildgebung mit der Gammakamera begann zu dem Zeitpunkt, an dem die Injektion erfolgte. Die frühzeitigen Bilder wurden während der ersten 10 min. als dynamische Studie aufgenommen (10-Sekunden-Bildaufnahmen) und anschließend als statische Bilder, und zwar 1, 2, 3 und 4 Stunden nach der Injektion. Die frühzeitigen Bilder wurden bis zu 500.000 Zählereignissen oder bis zu 20 min. lang aufgenommen (wobei stets das zeitlich kürzere Kriterium Anwendung fand), und zwar bei näherungsweise 10 bis 20 min sowie bei näherungsweise 1, 2, 3 and 4 Stunden nach der Injektion.
Es wurde festgestellt, dass das szintigraphische bildgebende Mittel rasch aus der Blutbahn entfernt wird, was dazu führt, dass die im Kreislauf verbleibende Restmenge der injizierten Dosis innerhalb von 30 Minuten nach der Injektion auf weniger als 10 % sinkt. Dies ermöglicht es, die bildliche Aufnahme der Tumorstellen bereits 15 bis 30 min. nach der Injektion des szintigraphischen bildgebenden Mittels durchzuführen. In dieser Studie wurden sämtliche der bekannten Tumoren detektiert sowie zwei bislang unentdeckte metastatische Läsionen, die später mittels Computertomographie (CT-Scan) bestätigt wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die szintigraphischen bildgebenden Mittel dieser Erfindung bei der in vivo Detektion von primären und metastatischen menschlichen Tumoren, die SSTR exprimieren, hochgradig wirksam sind.
Es versteht sich, dass die obige Offenbarung bestimmte spezifische Ausführungsformen der Erfindung hervorhebt und dass sämtliche Modifizierungen und gleichwertigen Alternativen zu diesen Ausführungsformen in den Ideen- und Geltungsbereich der Erfindung, so wie sie in den beigefügten Ansprüchen dargelegt ist, fallen.

Claims

Zusammensetzung von Stoff, umfassend ein spezifisches Bindungspeptid, das kovalent mit einem Metallionen komplexierenden Anteil verknüpft ist, wobei das Peptid spezifisch an Somatostatinrezeptoren bindet, wobei das Reagens die Formel cyclo(N-CH₃)-Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy.(CH₂CO.X) aufweist; wobei X ein Metallionen komplexierender Anteil der Formel -(Aminosäure)_n-B-(Aminosäure)_m-Z ist, wobei B ein thiolhaltiger Anteil ist, der Cystein, Homocystein, Isocystein oder Penicillamin ist; (Aminosäure)_n und (Aminosäure)_m jeweils unabhängig irgendeine primäre α- oder β-Aminosäure sind, die keine Thiolgruppe umfasst; Z -OH oder -NH₂ ist; n eine ganze Zahl zwischen 2 und 5 ist; und m eine ganze Zahl zwischen 0 und 5 ist; mit der Maßgabe, dass das Reagens keine der folgenden Formeln aufweist: cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCR.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRD.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRK.amid), cyclo(N-methyl))-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRR.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCKK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCKKK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.Orn.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCKDK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.Orn.D.Orn.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.Orn.D.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.KKC.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.KRC.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.RRC.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.KKCK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GRCK.amid), oder cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GKCR.amid).
Reagens für die Zubereitung eines szintigraphischen bildgebenden Mittels für das Abbilden einer Stelle innerhalb des Körpers eines Säugers, wahlweise einer Stelle eines primären oder metastatischen Somatostatinrezeptor exprimierenden Tumors, umfassend eine Zusammensetzung von Stoff nach Anspruch 1.
Szintigraphisches bildgebendes Mittel, umfassend ein Reagens nach Anspruch 2, wobei der radiogelabelte Bindungsanteil an Technetium-99m gebunden ist.
Komplex, gebildet entweder durch Reagieren eines Reagens nach Anspruch 2 mit Technetium-99m in Gegenwart eines Reduziermittels, z.B. Zinn(II)-Ion, oder durch Labeln eines Reagens nach Anspruch 2 mit Technetium-99m durch Ligandenaustausch eines vorreduzierten Technetium-99m-Komplexes.
Kit für das Zubereiten einer radiopharmazeutischen Zusammensetzung, wobei der Kit eine versiegelte Phiole umfasst, die eine vorbestimmte Menge eines Reagens nach Anspruch 2 und eine ausreichende Menge Reduziermittel enthält, um das Reagens mit Technetium-99m zu labeln.
Verfahren für das Labeln eines Reagens nach Anspruch 2, umfassend das Reagieren des Reagens mit Technetium-99m in Gegenwart eines Reduziermittels, z.B. Zinn(II)-Ion.
Zusammensetzung von Stoff, umfassend ein spezifisches Bindungspeptid, das kovalent mit einem Metallionen komplexierenden Anteil verknüpft ist, wobei das Peptid spezifisch an Somatostatinrezeptoren bindet, wobei das Reagens die Formel cyclo(N-CH₃)-Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy.(CH₂CO.X) aufweist; wobei X ein Metallionen komplexierender Anteil der Formel -(Aminosäure)_n-B-(Aminosäure)_m-Z ist, wobei B ein thiolhaltiger Anteil ist, der Cystein, Homocystein, Isocystein oder Penicillamin ist; (Aminosäure)_n und (Aminosäure)_m jeweils unabhängig irgendeine primäre α- oder β-Aminosäure sind, die keine Thiolgruppe umfasst; Z -OH oder -NH₂ ist; n eine ganze Zahl zwischen 2 und 5 ist; und m eine ganze Zahl zwischen 0 und 5 ist; wobei der Metallionen komplexierende Anteil an ein Metallion, z.B. Rhenium, Zink oder Zinn gebunden ist; wobei wahlweise das Metallion ein Beta-Teilchen abgebendes Metallion, z.B. Rhenium-186 oder Rhenium-188 oder ein Umwandlungselektronen abgebendes Metallion, z.B. Zinn-117m ist; mit der Maßgabe, dass, wenn das Metallion Technetium-99m ist, das Reagens keine der folgenden Formeln aufweist: cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCR.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRD.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRR.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCKK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCKKK.amid), cyclo(N-methyl-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.Orn.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCKDK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.Orn.D.Orn.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGC.Orn.D.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.KKC.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.KRC.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.RRC.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.KKCK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GRCK.amid), oder cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GKCR.amid).
Zusammensetzung von Stoff nach Anspruch 7, wobei das Reagens die Formel cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCR.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRD.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRK.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCRR.amid), cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.GGCKK.amid), oder cyclo(N-methyl)-FYW_DKV.Hcy.(CH₂CO.KKC.amid) aufweist.
Zusammensetzung von Stoff nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, die radioaktiv gelabelt, bevorzugt mit Iod-123, Iod-125, Iod-131 oder Astatin-211 gelabelt ist.
Zusammensetzung von Stoff nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei der Metallionen komplexierende Anteil an ein paramagnetisches Metallion, z.B. Eisen oder Kupfer gebunden ist, wobei wahlweise das Reagens an ein superparamagnetisches Teilchen gebunden ist.
Diagnostisches bildgebendes Mittel, umfassend die Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Zusammensetzung von Stoff nach Anspruch 1, Anspruch 7, Anspruch 8, Anspruch 9 oder Anspruch 10 und ein pharmazeutisch annehmbarer Träger.
Verwendung einer Zusammensetzung von Stoff nach Anspruch 1, Anspruch 7, Anspruch 8, Anspruch 9 oder Anspruch 10, eines Reagens nach Anspruch 2, eines Mittels nach Anspruch 3 oder eines Komplexes nach Anspruch 4 bei der Zubereitung eines Medikaments für das Abbilden einer Stelle innerhalb des Körpers eines Säugers.
Verwendung einer Zusammensetzung von Stoff nach Anspruch 1, Anspruch 7, Anspruch 8, Anspruch 9 oder Anspruch 10 oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 12 bei der Zubereitung eines Medikaments für das Behandeln eines Tiers, das einen bösartigen oder gutartigen Tumor aufweist oder neoplastische oder metastatische Zellen trägt, die einen Somatostatinrezeptor exprimieren.
Verwendung eines bildgebenden Mittels nach Anspruch 3 oder einer Zusammensetzung von Stoff nach Anspruch 9 für die Zubereitung eines Medikaments für durch Radioisotop geführten chirurgischen Eingriff, bei dem Gewebe, das neoplastische oder metastatische Zellen enthält, die durch Lokalisieren von Radioaktivität aus der verabreichten Zusammensetzung von Stoff identifiziert werden, ausgeschnitten werden.