DE69535282T2

DE69535282T2 - Verwendung von bakteriellen enzymen z.b. heparinasen, chodroitinasen um wundheilungprozesse zu modulieren

Info

Publication number: DE69535282T2
Application number: DE69535282T
Authority: DE
Inventors: Joseph Elm Grove ZIMMERMANN; Israel Vlodavsky; Clark D. Pierrefonds BENNETT; Pamela Montreal DANAGHER; Richard Montreal BROUGHTON
Original assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Current assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2015-07-08
Also published as: DE69535282D1; WO1996001648A1; CA2194370C; JPH10506609A; JP4152433B2; ES2279514T3; CA2194370A1; AU3094995A; ATE344051T1; AU707007B2; US5997863A; EP0769961A1; EP0769961B1

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung bakterieller Glycosaminoglycanabbauender Enzyme zur Modulierung von Vorgängen beim Wundheilungsprozess.
Wachstumsfaktoren sind natürlich vorkommende Polypeptide, die eine hormonartige Modulierung der Zellproliferation und -differenzierung bewirken. Der Mechanismus, durch den diese Vorgänge passieren, wird typischerweise dadurch eingeleitet, dass der Wachstumsfaktor mit spezifischen Rezeptoren oder Rezeptorsystemen, die auf der Zelloberfläche lokalisiert sind, in Kontakt kommt. Die Abfolge der intrazellulären Ereignisse, die im Anschluss an die Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Wachstumsfaktor ablaufen, ist für mitogene und differenzierende Wirkungen auf die Zelle verantwortlich. Diese Mechanismen hat man nicht vollständig verstanden, aber zu ihnen können eine Aktivierung von Tyrosinkinasen, des Nucleotidmetabolismus sowie Veränderungen der Spiegel von Elektrolyten in den Zellen gehören (Burgess and Macaig, Ann. Rev. Biochem. 58: 575-606, 1989).
Bei den meisten Zelltypen sind die Mitogenese- und Differenzierungsvorgänge im normalen, ausgewachsenen Tier unterdrückt. Diese Wachstumsfaktor-vermittelten Vorgänge sind in der Regel eher mit sich entwickelnden Organismen oder mit Prozessen der Wundheilung oder mit verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich von Krebs- und Gefäßerkrankungen, assoziiert. Zum Beispiel liegt die normale Turnoverzeit von Endothelzellen, einschließlich der Auskleidungen von Mikrogefäßen und Arterien, in der Größenordnung von Tausenden von Tagen. Bei der normalen Wundheilung proliferieren diese Endothelzellen jedoch schnell, mit einer Turnoverzeit von ungefähr 5 Tagen (Folkman und Shing, J. Biol. Chem. 267(16): 10931-10934, 1992). Die Steigerung der Proliferation, zu der es während der Wundheilung kommt, ist offenbar das Ergebnis einer Zunahme der lokalen Konzentration verschiedener angiogener Moleküle, einschließlich von Wachstumsfaktoren.
Zur Familie des Fibroblast Growth Factor gehören wenigstens sieben Polypeptide, für die gezeigt wurde, dass sie in verschiedenen Zelllinien die Proliferation stimulieren, einschließlich von Endothelzellen, Fibroblasten, glatten Muskelzellen und epidermalen Zellen. In dieser Gruppe enthalten sind der Acid Fibroblast Growth Factor (FGF-1 ), der Basic Fibroblast Growth Factor (FGF-2), Int-2 (FGF-3), der Kaposi Sarcoma Growth Factor (FGF-4), Hst-1 (FGF-5), Hst-2 (FGF-6) und der Keratinocyte Growth Factor (FGF-7)(Baird und Klagsbrun, Ann. N. Y. Acad. Sci. 638:xiv, 1991). Diese Moleküle und andere Cytokine, zu denen die Tissue Growth Factors TGFα und TGFβ, die Platelet-derived Growth Factors, PDGF, der Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor, GM-CSF, Interleukin 3, IL-3, und der Platelet Factor 4, PF4, gehören, habe alle eine Affinität für Heparin gemeinsam (Clark, Dermatol. Clin. 11: 647-666, 1993). Reaktionen spezifischer Zelltypen sind auch mit bestimmten Faktoren in Verbindung gebracht worden. EGF und TGFα stimulieren die Proliferation von Keratinozyten, TGFβ stimuliert die Synthese von Collagen und Fibronectin, PDGF stimuliert die Angiogenese und die Bildung von Granulationsgewebe, und FGF-7 stimuliert die Proliferation von Epithelzellen (Staiano-Coico et al., J. Exp. Med. 178: 865-878, 1993). PDGF, FGF-2 und ein kürzlich beschriebener heparinbindender Wachstumsfaktor (Heparin Binding Epidermal Growth Factor, HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251: 936-939, 1991) sind außerdem an der Proliferation und Migration der glatten Gefäßmuskelzellen und der Endothelzellen von Gefäßen beteiligt.
Der Übergang des metabolischen Zustandes einer Zelle vom Ruhezustand in einen proliferativen oder migratorischen Zustand setzt eine verstärkte Verfügbarkeit der richtigen Signalmoleküle in der Nachbarschaft der Zelle voraus. Im Prinzip könnte es dazu entweder über eine Zunahme der Synthese der Wachstumsfaktoren oder der Freisetzung der Wachstumsfaktoren aus Speichern kommen. In der Natur werden beide Mechanismen beobachtet. Die Expression von FGF-1, FGF-2, FGF-5 und FGF-7 wird nach einer Verletzung der Haut, die ihre gesamte Dicke betrifft, hochreguliert (Werner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 6896), während die Synthese von TGFβ, FGF-2 und PDGF in glatten Muskelzellen als Reaktion auf eine Gefäßschädigung ansteigt. Wachstumsfaktoren sind auch in den meisten festen Geweben nachgewiesen worden, die aus normalen, unverletzten Proben Erwachsener gewonnen wurden. Trotz des Vorliegens von Wachstumsfaktoren in diesen Bereichen befinden sich die sie enthaltenden Zellen nicht in einem proliferierenden Zustand. Offenbar werden Wachstumsfaktoren außerhalb der Zelle in Basalmembranen und der Extrazellulärmatrix gespeichert, wo sie daran gehindert sind, mit ihren zugehörigen Zelloberflächenrezeptoren in Kontakt zu treten. Auf diese Weise stehen sie im Notfall für eine Wundreparatur und die Bildung von Blutgefäßen bereit (Vlodavsky et al., TIBS 16: 268-271, 1991).
Ein frühes Ereignis bei der Verletzung von Geweben oder Gefäßen kann eine mechanische Austreibung von Wachstumsfaktoren aus dem Extrazellulärraum beinhalten, die sie für Rezeptoren verfügbar macht, an denen sie die Zellproliferation und die zelluläre Synthese weiterer Wachstumsfaktoren stimulieren. Alternativ können gestresste Zellen Moleküle sezernieren, die die extrazellulären Wachstumsfaktoren aus diesen Speichern verdrängen. Für Tumorzellen wurde gezeigt, dass sie abbauende Enzyme sezernieren, einschließlich von Proteoglycanasen, Collagenasen und Metalloproteinasen, und dass das mit einer Metastasierung zusammenfällt (Nicolson, Curr. Opinion Cell Biol. 1: 1009-1019, 1989). Zusätzlich zur Erleichterung der Wanderung des Tumors durch Blutgefäße setzt die Zerstörung von Komponenten der extrazellulären Matrix Wachstumsfaktoren frei, wodurch die Bildung neuer Blutgefäße gefördert wird, die die wachsende Tumormasse ernähren (Folkman et al., Am. J. Pathol. 130: 393-400, 1988).
Extrazelluläre Matrices (ECM) sind aus zahlreichen Komponenten bestehende Strukturen, die von verschiedenen Zelltypen, einschließlich von Endothel-, Epithel-, Epidermis- und Muskelzellen, synthetisiert werden und diese umgeben. Die ECM besteht zum großen Teil aus Collagen und Heparansulfatproteoglycanen. Sie enthält auch Fibronectin, Chondroitinsulfatproteoglycane und kleinere Proteine. Wachstumsfaktoren werden in diesen Matrices über die Assoziation mit dem Glycosaminoglycanteil der Heparansulfatproteoglycane abgesondert. Heparin und Heparansulfat sind Polysaccharide, die aus alternierenden Hexuronsäure-Einheiten, und zwar entweder D-Glucuronsäure- oder L-Iduronsäure-Einheiten, und Glucosamin-Einheiten, N-acetyliert oder N-sulfatiert, mit verschiedenen Sulfatierungsmustern bestehen. Aus dem Darm von Schweinen, der Lunge von Rindern oder menschlichen Mastzellen extrahiertes Heparin ist in hohem Maße sulfatiert, wobei es bis zu 2,6 Sulfate pro Disaccharid-Einheit enthält, und weist einen größeren Gehalt an Iduronsäure als an Heparansulfat auf. Umgekehrt ist Heparansulfat in geringerem Ausmaß sulfatiert, und es enthält vorzugsweise Glucuronsäure in der alternierenden Saccharidposition. „Heparinartige" Bereiche mit hohem Iduronsäure-Gehalt und hohem Sulfatierungsgrad wurden mit dem bFGF-bindenden Bereich des Heparansulfats aus menschlichen Fibroblasten in Verbindung gebracht (Turnbull et al., J. Biol. Chem. 267(15), 10337-10341, 1992). Die Zusammensetzung des Heparansulfats in der extrazellulären Matrix ist jedoch nicht vollständig aufgeklärt worden.
Die Stimulierung der Zellproliferation und -migration durch Wachstumsfaktoren stellt einen der Vorgänge beim Prozess der Wundheilung dar, der ein multifaktorieller, interaktiver Prozess ist, an dem biochemische Mediatoren, die Extrazellulärmatrix und Parenchymzellen beteiligt sind. Der Prozess der Wundheilung wird generell in drei sich zeitlich überlappende Phasen unterteilt: die Entzündung, die Proliferation und die Remodellierung. Bei der Entzündung infiltrieren aus dem Blut stammende Zellen die Stelle der Wunde und setzen verschiedene Signalmoleküle frei, zu denen der Platelet-derived Growth Factor, der von Willebrand Factor, Thrombospondin, Fibronectin, Fibrinogen, 5-Hydroxytryptophan, Thromboxan A2 und Adenosindiphosphat gehören (Kirsner und Eaglstein, J. Dermatol. 151: 629-640, 1993). Ein Pfropf aus Blutplättchen und ein Thrombus bilden sich, und diese stellen eine Matrix für Monozyten, Fibroblasten und Keratinozyten bereit. Chemotaktische Moleküle locken Monozyten an, die sich in Makrophagen umwandeln und weitere Wachstumsfaktoren sezernieren (Nathan und Sporn, J. Cell Biol. 113: 981-986, 1991).
Neutrophile können diesen Prozess unterstützen, indem sie die abbauenden Enzyme Elastase und Collagenase sezernieren, die das Durchtreten von Zellen durch die Basalmembranen fördern.
Keratinozyten und epidermale Zellen, die an der Schließung von Hautwunden beteiligt sind, wandern während der proliferativen Phase zur Stelle der Wunde. Während der proliferativen Phase kommt es auch zu einer Angiogenese, der Bildung neuer Blutgefäße als Reaktion auf chemoattraktive und angiogene Signale (Folkman und Klagsbrun, Science 235: 442-447, 1987), und zu einer Fibroplasie, der Ansammlung von Fibroblasten und Bildung von Granulationsgewebe. Die Geweberemodellierung wird von der Sekretion von Matrixkomponenten begleitet, zu denen Fibronectin, Collagen und Proteoglycane gehören, die als ein Gerüst für die Wanderung der Zellen und als Gewebestütze dienen. Das Collagen vom Typ III, das in den früheren Stadien der Wundheilung synthetisiert wird, wird über einen proteolytischen Turnoverprozess durch den dauerhafteren Typ I ersetzt.
Ischämie bezieht sich auf den pathologischen Zustand als Folge der lokalen Fehlfunktion des Gefäßsystems, die zu einer unzureichenden Blutversorgung mit anschließendem Gewebeschaden führt. In diesem Falle muss eine Revaskularisierung, sei es über die Stimulation der Angiogenese oder mittels chirurgischer Verfahren, dem normalen Verlauf der Wundheilung des geschädigten Gewebes vorausgehen.
Die Wirkung von Enzymen, die Komponenten der extrazellulären Matrix und der Basalmembranen abbauen, kann die Vorgänge bei der Gewebereparatur über verschiedene Mechanismen erleichtern, zu denen die Freisetzung gebundener Cytokine gehört, die von Heparansulfat eingeschlossen sind, und die Erhöhung der Permeabilität der Matrix, durch die die Mobilität von Signalmolekülen, Wachstumsfaktoren und chemotaktischen Mitteln sowie von Zellen, die am Heilungsprozess beteiligt sind, verstärkt wird. Glycosaminoglycane können von verschiedenen eukaryotischen und prokaryotischen Enzymen abgebaut werden. Eine Heparansulfat-abbauende Aktivität wurde in Blutplättchen (Oldberg et al., Biochemistry 19: 5755-5762, 1980), Tumorzellen (Nakajima et al., J. Biol. Chem. 259: 2283-2290, 1984) und Endothelzellen (Gaal et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 604-614, 2989) nachgewiesen. Diese Heparanaseenzyme wirken, indem sie die Hydrolyse des Kohlenhydratrückgrats des Heparansulfats an der (1 → 4)-Verknüpfung zwischen Hexuronsäure und Glucosamin katalysieren (Nakajima et al., J. Cell. Biochem. 36: 157-167, 1988). Die Heparanasen von Säugetieren werden typischerweise durch die hochsulfatierte Heparinform der Heparin-Heparansulfat-Familie gehemmt. Eine genaue biochemische Charakterisierung dieser Enzyme ist jedoch bis jetzt vom Fehlen eines Verfahrens zur Gewinnung homogener Präparationen der Moleküle verhindert worden.
Heparin-abbauende Enzyme sind auch in Mikroorganismen gefunden worden, zu denen Flavobacterium heparinum (Lohse und Linhardt, J. Biol. Chem. 267: 24347-24355, 1992), Bacteroides-Stämme (Saylers et al., Appl. Environ. Microbiol. 33: 319-322, 1977; Nakamura et al., J. Clin. Microbiol. 26: 1070-1071, 1988), Flavobacterium Hp206 (Yoshida et al., 10th Annual Symposium of Glycoconjugates, Jerusalem 1989) und Cytophagia-Species (Bohn et al., Drug Res. 41(I), Nr. 4: 456-460, 1991) gehören. Chondroitinsulfat-abbauende Enzyme sind aus verschiedenen Mikroorganismen isoliert worden, zu denen Flavobacterium heparinum (Michaleacci et al., Biochem. J. 151: 123, 1975), Bacteroides-Species (Saylers et al., J. Bacteriol. 143: 781, 1980; Linn et al., J. Bacteriol. 156: 859, 1983; Steffen et al., J. Clin. Microbiol. 14: 153, 1981), Proteus vulgaris (Uamagata et al., J. Biol. Chem. 243: 1523, 1968; Suzuki, Meth. Enzymol. 28: 911, 1972), Beneckea, Microcossus- und Vibrio-Spezies (Kitamikada und Lee, Appl. Microbiol. 29: 414, 1975) und Arthrobacter aurescens (Hiyam und Okada, J. Biol. Chem. 250: 1824-1828, 1975) gehören.
F. heparinum bildet drei Heparinaseformen, die Heparinase 1, die Heparinase 2 und die Heparinase 3 (Heparitinase) (Lohse und Linhardt, J. Biol. Chem. 267: 24347-24355, 1992). Alle drei Enzyme spalten an den (1 → 4)-Bindungen zwischen dem Glucosamin und der Hexuronsäure, und zwar mit unterschiedlicher Spezifität in Abhängigkeit von den Sulfatierungsmustern und dem jeweiligen Hexuronsäurerest, Iduronsäure oder Glucuronsäure, an der jeweiligen Spaltstelle (Desai et al., Arch. Biochem. Biophys. 306: 461-468, 1993). F. heparinum bildet auch zwei Enzyme, die Mitglieder der Chondroitinsulfat/Dermatansulfat-Familie abbauen. Das sind die Chondroitinlyase AC, die sowohl Chondroitinsulfat A als auch Chondroitinsulfat C über eine Spaltung der (1 → 4)-Bindung zwischen dem Galactosamin und der Glucuronsäure im Polysaccharidrückgrat spaltet, und die Chondroitinlyase B, die Dermatansulfat (Chondroitinsulfat B) über eine Spaltung der (1 → 4)-Bindung zwischen dem Galactosamin und der Iduronsäure im Polysaccharid-Rückgrat abbaut. Der enzymatische Mechanismus der F.-heparinum-Enzyme besteht aus einer Eliminierungsreaktion, wodurch sie sich von den Glycosaminoglycan-abbauenden Enzymen von Säugetieren unterscheiden. Weiterhin wird anscheinend keines der Lyaseenzyme von F. heparinum durch Glycosaminoglycan-Moleküle gehemmt, im Gegensatz zu den Säugetierenzymen.
Für die Säugetier-Heparanase, die aus Extrakten von Tumorzelllinien partiell gereinigt wurde, sowie die Heparinase 1 und die Heparinase 3 aus Flavobacterium heparinum wurde gezeigt, dass sie ¹²⁵I-markiertes FGF-2 freisetzen, das an extrazelluläre Matrix präadsorbiert worden war, die in vitro von Endothelzellen aus der Rinderaorta synthetisiert worden war (Bashkin et al., J. Cell. Physiol. 167: 126-137, 1992). Da jedoch unfraktioniertes Heparin und Heparin mit niedrigem Molekulargewicht eine ähnliche Freisetzung des exogen adsorbierten, ¹²⁵I-markierten FGF-2 bewirkten, geht aus ihren Berichten nicht eindeutig hervor, ob die gemessene Freisetzung auf dem enzymatischen Abbau des Heparansulfats in der ECM oder auf einer elektrolytischen Verdrängung vom Ionenaustauschtyp des FGF-2 vom negativ geladenen Heparansulfat beruhte. Die gleiche Forschergruppe berichtete die Freisetzung wachstumsfördernder Aktivität aus glatten Gefäßmuskelzellen durch eine Behandlung mit der Heparinase 3 und aus der extrazellulären Matrix über eine Behandlung mit Extrakten von Neutrophilen oder Lymphomzellen. Es ist jedoch noch keine Freisetzung einer wachstumsfördernden Aktivität aus der extrazellulären Matrix über den Kontakt mit bakteriellen Glycosaminoglycan-abbauenden Enzymen gezeigt worden, und für diese Enzyme ist auch noch nicht gezeigt worden, dass sie eine Gewebereparatur oder ein neues Gefäßwachstum in vivo fördern.
Zusammenfassung der Erfindung
Glycosaminoglycane, einschließlich der Heparinasen 1, 2 und 3 sowie der Chondroitinasen AC und B aus dem Gram-negativen Bakterium Flavobacterium heparinum können entweder getrennt oder gemeinsam zur Manipulation der Zellproliferation eingesetzt werden. Bei einer Ausführungsform werden Heparinasen verabreicht, um Heparansulfat-Komponenten der extrazellulären Matrix abzubauen, wodurch es den heparinbindenden Wachstumsfaktoren, die in der extrazellulären Matrix gespeichert vorliegen, ermöglicht wird, zu angrenzenden Zellen zu wandern. Die Mobilität von chemoattraktiven Mitteln, Wachstumsfaktoren und Zellen kann auch durch das Behandeln von Geweben mit Glycosaminoglycan-abbauenden Enzymen, sowohl Chondroitinasen als auch Heparinasen, erhöht werden. Die enzymatische Entfernung von Chondroitinsulfaten von Zelloberflächen erhöht auf wirksame Weise die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktorrezeptoren auf der Oberfläche der Zelle. Das selektive Entfernen von Heparansulfaten von Zelloberflächen, wobei die extrazelluläre Matrix intakt bleibt, hemmt umgekehrt die Zellproliferation über eine Herunterregulierung der Reaktion der Zelle auf Wachstumsfaktoren. Das wird dadurch erreicht, dass die Heparin- oder Heparansulfat-abbauenden Aktivitäten auf die Zelloberfläche gelenkt werden. Das Steuern der Heparin-abbauenden Aktivität kann über das Aufbringen einer ligandenbindenden Funktionalität in die Heparinaseproteine mittels gentechnologischer Verfahren erreicht werden, oder indem die lokale Enzymkonzentration über das Verabreichungsverfahren physikalisch gesteuert wird.
Es werden Verfahren zur Präparation von Glycosaminoglycan-Enzymen und gentechnologisch hergestellten Derivaten von diesen sowie Verfahren zur Erzeugung pharmazeutischer Präparationen hochgereinigter Glycosaminoglycan-abbauender Enzyme beschrieben. Es werden Verfahren zur Erzeugung von Derivaten der Heparin-abbauenden Enzyme offenbart, die Bindungseigenschaften anderer Proteine aufweisen. Diese Moleküle können dazu eingesetzt werden, die Heparin-abbauende Aktivität auf die Zelloberfläche zu lenken, was die Reaktion einer Zelle auf endogene Wachstumsfaktoren hemmt.
Beispiele demonstrieren die Freisetzung von wachstumsfördernder Aktivität aus ECM und intakten Zellen und Geweben mittels Glycosaminoglycanasen, die Verstärkung der Zellproliferation in vitro über eine Behandlung mit Glycosaminoglycanasen, insbesondere der Heparinase 3, die wachstumsfördernde Aktivität von Heparansulfat-Fragmenten, die von Zellen, die mit Glycosaminoglycanasen behandelt wurden, freigesetzt werden und die Wirksamkeit von Heparinase 3 bezüglich der Stimulierung der Wundheilung in Tiermodellen in vivo.
Demgemäß stellt die Erfindung die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Wundheilung über die Freisetzung von heparinbindenden Wachstumsfaktoren und von Molekülen der extrazellulären Matrix, die Entfernung von Chondroitinsulfat von Zelloberflächenrezeptoren und/oder die Entfernung der Heparansulfatkomponente ihres Wachstumsfaktorrezeptor-Komplexes bereit, wobei die Zusammensetzung umfasst ein bakterielles Glycosaminoglycanabbauendes Enzym, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus der Heparinase 1 von Flavobacterium heparinum, der Heparinase 2 von Flavobacterium heparinum, der Heparinase 3 von Flavobacterium heparinum, der Chondroitinase AC von Flavobacterium heparinum und der Chondroitinase B von Flavobacterium heparinum, Heparinase von Bacteroides-Stämmen, Heparinase von Flavobacterium Hp206, Heparinase von Cytophagia-Species, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Proteus vulgaris, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Microcossus, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Vibrio-Species, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Arthrobacter aurescens, wobei diese Enzyme von rekombinanten, in Bakterien exprimierten Nucleotidsequenzen exprimiert werden, und Kombinationen von diesen, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für eine lokalisierte Verabreichung.
Die Erfindung stellt auch bereit

– ein Zuführungsvehikel für die Zuführung von einem, und umfassend ein, Enzym in Kombination mit dem Träger in einer Dosierung, die wirksam ist, die Wundheilung über die Freisetzung von heparinbindenden Wachstumsfaktoren und von Molekülen der extrazellulären Matrix, die Entfernung von Chondroitinsulfat von Zelloberflächenrezeptoren und/oder die Entfernung der Heparansulfatkomponente ihres Wachstumsfaktorrezeptor-Komplexes zu verbessern, wobei das Enzym ein bakterielles Glycosaminoglycan-abbauendes Enzym ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus der Heparinase 1 von Flavobacterium heparinum, der Heparinase 2 von Flavobacterium heparinum, der Heparinase 3 von Flavobacterium heparinum, der Chondroitinase AG von Flavobacterium heparinum und der Chondroitinase B von Flavobacterium heparinum, Heparinase von Bacteroides-Stämmen, Heparinase von Flavobacterium Hp206, Heparinase von Cytophagia-Species, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Proteus vulgaris, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Microcossus, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Vibrio-Species, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Arthrobacter aurescens, wobei diese Enzyme von rekombinanten, in Bakterien exprimierten Nucleotidsequenzen exprimiert werden, und Kombinationen von diesen, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei, wenn das Enzym die Heparinase 1, 2 oder 3 von Flavobacterium heparinum ist, die Zusammensetzung dann nicht eine zur Hemmung der Angiogenese an einer ausgewählten Stelle in einem nicht-heparinisierten Patienten wirksame Menge einer Heparinase in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst,
– die Verwendung eines erfindungsgemäßen Zuführungsvehikels bei der Herstellung einer Vorrichtung zur Verbesserung der Wundheilung über die Freisetzung von heparinbindenden Wachstumsfaktoren und von Molekülen der extrazellulären Matrix, die Entfernung von Chondroitinsulfat von Zelloberflächenrezeptoren und/oder die Entfernung der Heparansulfatkomponente ihres Wachstumsfaktorrezeptor-Komplexes.
– eine Zusammensetzung, die ein bakterielles Glycosaminoglycan-abbauendes Enzym, wie es oben beschrieben wurde, umfasst, wobei, wenn das Enzym die Heparinase 1, 2 oder 3 von Flavobacterium heparinum ist, die Zusammensetzung dann nicht eine zur Hemmung der Angiogenese an einer ausgewählten Stelle in einem nicht-heparinisierten Patienten wirksame Menge einer Heparinase in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
– eine Zusammensetzung, die ein bakterielles Glycosaminoglycan-abbauendes Enzym, wie es oben beschrieben wurde, umfasst, wobei der Träger aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus PoLymerfolien, Mikropartikeln, Mikrokapseln, Proteosomen, Liposomen, transdermalen Pflastern und Bandagen besteht.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1a, 1b und 1c sind Schemata, die die Funktion von Glycosaminoglycanen in der extrazellulären Matrix (ECM – obere Hälfte) und auf Zelloberflächen (untere Hälfte) zeigen. 1a zeigt, dass die Heparansulfatkomponente (einfache Zick-Zack-Linie) der Heparansulfatproteoglycane (HSPG) an heparinbindende Wachstumsfaktoren (Heparin-binding Growth Factors, HBGF) sowohl in der extrazellulären Matrix als auch auf der Zelloberfläche bindet. Wachstumsfaktoren, die nicht an Heparansulfat gebunden sind, sind nicht in der Lage, an ihren Zelloberflächenrezeptor zu binden. Das Heparansulfat oder Fragmente des Heparansulfats heftet bzw. heften sich an die Wachstumsfaktoren an und bewirkt bzw. bewirken eine Konformationsänderung, die eine Bindung an den Rezeptor ermöglicht. Chondroitinsulfat (schraffierte Zick-Zack-Linie)-Proteoglycane (CSPG) sind auch in der extrazellulären Matrix und auf der Zelloberfläche lokalisiert. An der Zelloberfläche können die Chondroitinsulfatmoleküle die Zugänglichkeit von Rezeptoren für den heparinbindenden Wachstumsfaktor sterisch behindern. Die 1b zeigt, dass die Behandlung mit Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen einen besseren Zugang zu den Zelloberflächenrezeptoren ermöglicht und die Beweglichkeit von Molekülen, wie chemoattraktiven Stoffen und Wachstumsfaktoren, und Zellen durch die extrazelluläre Matrix erhöht. Die 1c zeigt, dass die Behandlung mit Heparin- oder Heparansulfat-abbauenden Enzymen Heparansulfat-Fragmente und heparinbindende Wachstumsfaktoren aus der extrazellulären Matrix freisetzt, wobei sie ihre Verfügbarkeit für die Oberflächenrezeptoren der angrenzenden Zelle erhöht und die Mobilität von Molekülen, wie chemoattraktiven Stoffen und Wachstumsfaktoren, und Zellen durch die extrazelluläre Matrix erhöht.
2 ist eine graphische Darstellung der Desorption (Penetration in Agarose (mm) in Abhängigkeit von der Zeit (Minuten)) der Heparinase in halbfeste Gele als Maß für die vorhandene Enzymmenge.
3 ist eine graphische Darstellung der relativen wachstumsfördernden Aktivität, die aus enzymbehandelter extrazellulärer Matrix (als Vielfaches der Kontrolle) freigesetzt wurde, für die Kontrolle, die Heparinase 1, die Heparinase 2, die Heparinase 3, die Chondroitinase AC und die Chondroitinase B. Die Ergebnisse sind als das Verhältnis des Thymidineinbaus durch Balb/c-3T3-Fibroblasten, die gegen Überstände der enzymbehandelten Matrix und Überstände der unbehandelten Matrix exponiert wurden, ausgedrückt.
4 ist eine graphische Darstellung der relativen wachstumsfördernden Aktivität, die aus enzymbehandelten Corneas von Rindern (als Vielfaches der Kontrolle) freigesetzt wurde, für die Kontrolle, für Heparinase 1, die Heparinase 2 und die Heparinase 3. Die Ergebnisse sind als das Verhältnis des Thymidineinbaus durch Balb/c-3T3-Fibroblasten, die gegen die Überstände enzymbehandelter Corneas und Überstände unbehandelter Corneas exponiert wurden, ausgedrückt.
5 ist eine graphische Darstellung der Freisetzung von ³⁵S aus der extrazellulären Matrix (cpm) für die Kontrolle, die Heparinase 1, die Heparinase 2, die Heparinase 3, die Chondroitinase AG und die Chondroitinase B.
6 ist eine graphische Darstellung der relativen Absorption von FGF-2 durch enzymbehandelte glatte Muskelzellen von Rindern (% der Kontrolle) für die Kontrolle, die Heparinase 1, die Heparinase 2 und die Chondroitinase AC.
7 ist eine graphische Darstellung der relativen proliferativen Reaktion von Balb/c-3T3-Fibroblasten auf eine enzymatische Behandlung entweder der Zelloberfläche, der extrazellulären Matrix oder von beiden. Die Proliferation wurde über den Einbau von ³H-Thymidin bestimmt und ist als das Verhältnis der Inkorporation, die nach der Behandlung bestimmt wurde, zu derjenigen der Kontrolle (unbehandelte Zellen, die gegen den Überstand der unbehandelten Matrix exponiert wurden) ausgedrückt.
8 ist eine graphische Darstellung der proliferativen Reaktion ruhender Balb/c-3T3-Fibroblasten auf lösliches Material, das aus enzymbehandelter extrazellulärer Matrix freigesetzt wurde, für die Heparinasen 1, 2, 3 und die Chondroitinase AC (schraffierte Säulen). Die proliferative Reaktion von Zellen, die vor ihrer Exposition gegen Überstände enzymbehandelter Matrix mit der Heparinase 1, 2, 3 oder der Chondroitinase AC behandelt wurden, ist ebenfalls gezeigt (ausgefüllte Säulen). Diese Ergebnisse sind als Counts pro Minute an ³H-Thymidin, das von Balb/c-3T3-Fibroblasten inkorporiert wurde, die gegen die Überstände enzymbehandelter Matrix exponiert wurden, ausgedrückt. Die Negativkontrolle „unbehandelte Zellen" repräsentiert die proliferative Reaktion von Zellen, die gegen den Überstand der unbehandelten Matrix exponiert wurden.
9 ist eine graphische Darstellung der proliferativen Reaktion ruhender Balb/c-3T3-Fibroblasten, sowohl mit Heparinase 3 behandelter als auch unbehandelter, auf lösliches Material, das aus enzymbehandelter extrazellulärer Matrix freigesetzt wurde, für die Heparinase 3. Es ist die proliferative Reaktion ruhender Balb/c-3T3-Fibroblasten, sowohl mit Heparinase 3 vorbehandelt als auch unbehandelt, auf Material dargestellt, das spontan aus der extrazellulären Matrix freigesetzt wurde. Diese Ergebnisse sind als Counts pro Minute an ³H-Thymidin dargestellt, das von Balb/c-3T3-Fibroblasten inkorporiert wurde, die gegen Überstände enzymbehandelter Matrix exponiert wurden. Die unbehandelten Zellen sind Zellen, die gegen den Überstand der unbehandelten Matrix exponiert wurden. Zellen + hep 3 sind Zellen, die vor der Exposition gegen den Überstand der unbehandelten Matrix mit Heparinase 3 behandelt wurden; ECM + hep 3 sind Zellen, die gegen den Überstand der mit Heparinase 3 behandelten Matrix exponiert wurden; und ECM + hep 3-Zellen + hep 3 sind Heparinase-3-behandelte Zellen, die gegen den Überstand der mit Heparinase 3 behandelten Matrix exponiert wurden.
10 ist eine graphische Darstellung der proliferativen Reaktion ruhender Balb/c-3T3-Fibroblasten auf lösliches Material, das aus enzymbehandelten Corneas von Rindern freigesetzt wurde, für drei Konzentrationen der Heparinase 3, und zwar 0,1, 0,01 und 1,0 IE/mL. Der Wert der Negativkontrolle „unbehandelte Zellen" repräsentiert die proliferative Reaktion von Zellen, die gegen den Überstand unbehandelter Corneas exponiert wurden.
11 ist eine graphische Darstellung, die die Freisetzung von bFGF aus Rinderendothelzellen (schraffierte Säulen), glatten Rindermuskelzellen (ausgefüllte Säulen) und extrazellulärer Matrix (graue Säulen), die gegen die Heparinase 1, 2 oder 3 exponiert wurde, darstellt.
12 ist eine graphische Darstellung der Hemmung der Proliferation glatter Muskelzellen durch die Behandlung der Zellen mit der Heparinase 1, der Heparinase 2 und der Heparinase 3. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als die prozentuale Zellproliferation nach der Enzymbehandlung im Vergleich zu derjenigen unbehandelter Kontrollzellen. Unbehandelte Zellen haben eine Proliferation von 100 %. Die Säulen mit diagonalen Linien stammen aus Behandlungen mit 0,1 IE/mL Enzym. Die ausgefüllten Säulen stammen aus Behandlungen mit 0,5 IE/mL Enzym.
13A ist eine graphische Darstellung des Abbaus von Sulfat-markierter ECM durch die Heparinase 1, 2 oder 3. Die mit ECM, die metabolisch mit Sulfat markiert worden war, beschichteten 4-Well-Gewebekulturplatten wurden 18 Stunden bei 37°C mit 0,1 E/mL Heparinase 1 (o), Heparinase 2 (Δ) oder Heparinase 3 (☐) inkubiert. Das im Inkubationsmedium freigesetzte Sulfat-markierte Material wurde über eine Gelfiltration auf Sepharose 6B analysiert.
13B ist eine graphische Darstellung der Freisetzung von ECM-gebundener mitogener Aktivität. Aliquots des Inkubationsmediums auf Plastik (diagonale Schraffierung) oder ECM (kreuzweise Schraffierung) wurden hinsichtlich der Stimulation des Einbaus von ³H-Thymidin in wachstumsarretierte 3T3-Fibroblasten getestet.
13C ist eine graphische Darstellung des Abbaus von Sulfat-markierter ECM durch die Heparinasen 1, 2 und 3. Sulfatmarkierte ECM wurde 18 h bei 37°C mit 0,1 E/mL der Heparinase 1, 2 oder 3 inkubiert. Es wurde die Gesamtmenge des in das Inkubationsmedium freigesetzten Sulfat-markierten Materials (diagonale Schraffierung) bestimmt. Das verbleibende ECM wurde eine Stunde bei 37°C mit Trypsin (5 μg/mL) verdaut, und die solubilisierte Radioaktivität (kreuzweise Schraffierung) wurde in einem β-Szintillationszähler bestimmt.
Die 14A, 14B, 14C und 14D sind graphische Darstellungen der Stimulation der Proliferation lymphoider F32-Zellen durch Heparansulfat-Fragmente, die von Zellen und ECM, die gegen die Heparinase 1, 2 oder 3 auf unterschiedlichen Oberflächen exponiert wurden, freigesetzt wurden. Normale (Kunststoff) (14B) und ECM-beschichtete (14A) 4-Well-Platten sowie konfluente Kulturen von Gefäßendothelzellen (EC) (14G) und glatten Muskelzellen (SMC) (14D) wurden 1 h bei 37°C mit 0,1 E/mL Heparinase 1 (☐), Heparinase 2 (☐) oder Heparinase 3 (o) inkubiert. Aliquots (1-40 μL) der Inkubationsmedien wurden dann zu F32-Zellen gegeben, die auf 96-Well-Platten in Gegenwart von 5 mg/mL bFGF ausgesät worden waren. ³H-Thymidin (1 μCi/Well) wurde 48 h nach dem Aussäen zugegeben, und 6 h später wurden die Zellen geerntet und auf ihren ³H-Thymidineinbau untersucht. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert ± S.D. für sechs Kulturwells.
Die 15A und 15B sind graphische Darstellungen der Stimulation der Proliferation lymphoider F32-Zellen durch die Heparinase 3. Die 15A ist eine graphische Darstellung der Inkubation lymphoider F32-Zellen in 96-Well-Platten mit 5 ng/mL bFGF in Abwesenheit und Gegenwart von 0,1 E/mL nativer (keine Schraffierung) oder hitzeinaktivierter (10 min, 95°C) (diagonale Schraffierung) Heparinase 3. Das Heparinase-3-Enzym (0,1 E/mL) wurde auch auf DEAE-Cellulose (0,5 mL) aufgetragen, und sowohl das bindende Material (keine Schraffierung) als auch der Durchfluss (diagonale Schraffierung) wurde zu den lymphoiden F32-Zellen gegeben. Die 15B ist eine graphische Darstellung der Inkubation von lymphoiden F-32-Zellen in 96-Well-Platten mit 5 ng/mL bFGF in Abwesenheit und Gegenwart von 1 μg/mL an nativem (keine Schraffierung) oder hitzeinaktiviertem (10 min, 95°C) (diagonale Schraffierung) Heparin. Das Heparin wurde auch auf DEAE-Cellulose (0,5 mL) aufgetragen, und sowohl das bindende Material (keine Schraffierung) als auch der Durchfluss (diagonale Schraffierung) wurde zu den lymphoiden F32-Zellen gegeben. ³H-Thymidin (1 μCi/Well) wurde 48 h nach dem Aussäen zu jedem Well gegeben, und 6 h später wurden die Zellen geerntet und bezüglich der Inkorporation von ³H-Thymidin untersucht. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert ± S.D. für sechs Kulturwells.
16 ist eine graphische Darstellung der Stabilität (Belastung, g/mm²) von Haut, die eine Wunde enthielt, wobei die Haut von sechs Gruppen von Ratten gewonnen wurde, und zwar nach der in-vivo-Testung der Fähigkeit der Heparinase zur Stimulierung der Wundheilung, wobei die Wirkung des Trägerstoffes, der Heparinase (Tag 1) und der geschädigten (hitzeinaktivierten) Heparinase an den Tagen 1, 3 und 7 verglichen wurde.
17 ist eine graphische Darstellung der Stabilität (Belastung, g/mm²) der Haut, die eine Wunde enthielt, wobei die Haut von sechs Gruppen von Ratten nach der in-vivo-Testung der Heparinase in Dosierungen von 0,02, 0,2 und 2,0 IE Heparinase 3 bezüglich der Stimulierung der Wundheilung gewonnen wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es wird ein Verfahren zur Steuerung von Vorgängen, die an Wundheilungsprozessen beteiligt sind, über die Verwendung hochgereinigter Enzyme, die Glycosaminoglycane abbauen und von Flavobacterium-heparinum-Genen abstammen, offenbart. Glycosaminoglycane, zu denen Heparansulfat, Chondroitinsulfat und Dermatansulfat gehören, sind die sulfatierten Polysaccharid-Komponenten von Proteoglycanen, die auf Zelloberflächen, wo sie als Cytokin-Rezeptoren wirken, und im Extrazellulärraum, wo sie die Struktur der extrazellulären Matrix bilden und als Speicher für Wachstumsfaktoren dienen, vorkommen. Die Glycosaminoglycanabbauenden Enzyme von F. heparinum, die Heparinase 1 (EG 4.2.2.7), die Heparinase 2, die Heparinase 3 (EC 4.2.2.8), die Chondroitinase AC (EG 4.2.2.5) und die Chondroitinase B modulieren die Wechselwirkungen, die an der Zellproliferation und Migration beteiligt sind, indem sie i) heparinbindende Wachstumsfaktoren und Moleküle aus der extrazellulären Matrix freisetzen, wodurch deren Verfügbarkeit für angrenzende Zellen für eine Stimulation der Proliferation und Migration erhöht wird, ii) Komponenten der extrazellulären Matrix abbauen, wodurch sie die Mobilität von Cytokinen, chemoattraktiven Stoffen und Zellen erhöhen, iii) Chondroitinsulfat von Zelloberflächen entfernen, wodurch sie die Zugänglichkeit von Zelloberflächenrezeptoren erhöhen, und iv) die proliferative Reaktion von Zellen auf Wachstumsfaktoren hemmen, indem sie die Heparansulfat-Komponente ihrer Wachstumsfaktorrezeptor-Komplexe entfernen.
Wechselwirkungen zwischen dem heparinbindenden Wachstumsfaktor und dem Rezeptor erfordern die Gegenwart einer dritten Komponente: Heparansulfat, das auf Zelloberflächen vorkommt oder das den Zellen zugesetzt werden kann oder das lytisch als ein Heparansulfat-Fragment aus der extrazellulären Matrix freigesetzt werden kann. Die Zugabe von Heparin- oder Heparansulfat-abbauenden Enzymen im Bereich zwischen 0,001 und 5 IE/mL fördert die Zellproliferation über die gleichzeitige Freisetzung von heparinbindenden Wachstumsfaktoren und Heparansulfatfragmenten aus der extrazellulären Matrix und das Erhöhen ihrer Verfügbarkeit für angrenzende Zellen.
Umgekehrt hemmt die selektive Entfernung von Heparansulfat von Zelloberflächen, wobei die extrazelluläre Matrix intakt bleibt, die Zellproliferation über eine Herunterregulation der Reaktion der Zellen auf Wachstumsfaktoren. Das wird durch die Lenkung von Heparin- oder Heparansulfat-abbauenden Aktivitäten auf die Zelloberfläche erreicht. Das Lenken der Heparinabbauenden Aktivität kann durch das Anbringen einer Liganden-bindenden Funktionalität in den Heparinaseproteinen mittels gentechnologischer Verfahren erreicht werden oder durch das physikalische Steuern der lokalen Enzymkonzentration über das Verabreichungsverfahren. Zum Beispiel können permeable Doppelballonkatheter Heparinasen vorzugsweise zu exponierten glatten Muskelzellen in geschädigten Gefäßen lenken.
Präparierung Glycosaminoglycan-abbauender Enzyme
Glycosaminoglycanlyase-Enzyme können durch eine Isolierung aus Bakterien oder Säugerzellen gewonnen werden, entweder solchen, die natürlicherweise die Enzyme produzieren, oder solchen, die gentechnologisch so manipuliert wurden, dass sie die Enzyme produzieren.
Isolierung natürlich erzeugter Enzyme
Glycosaminoglycanlyase-Enzyme können aus Kulturen von Flavobacterium heparinum wie folgt gereinigt werden. F. heparinum wird in computergesteuerten Fermentern von 15 L kultiviert, und zwar in einer Abwandlung des definierten Nährstoffmediums, das von Galliher et al., Appl. Environ. Microbiol. 31(2): 360-365, 1981, beschrieben wurde. Für Fermentationen, die für die Produktion von Heparinlyasen ausgelegt sind, wird halbgereinigtes Heparin (Celsus Laboratories) dem Medium in einer Konzentration von 1,0 g/L als Induktor der Synthese der Heparinase zugefügt. Für Fermentationen, die für die Produktion von Chondroitinlyasen ausgelegt sind, wird Chondroitinsulfat A (Sigma) dem Medium in einer Konzentration von 1,0 g/L als Induktor der Synthese der Chondroitinase AC und der Chondroitinase B zugefügt. Bei beiden Fermentationstypen werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, und die gewünschten Enzyme werden aus dem periplasmatischen Raum mittels einer Variation des osmotischen Schockverfahrens freigesetzt, das im US-Patent Nr. 5 169 772 an Zimmermann et al. (1992) beschrieben wurde.
Die Proteine aus dem rohen Osmolat werden bei einer Leitfähigkeit zwischen einem und sieben μmho an ein Kationenaustauscherharz (CBX, J.T. Baker) adsorbiert. Die nichtgebundenen Proteine des Extrakts werden verworfen, und das Harz wird in eine Chromatographiesäule (5,0 cm Innendurchmesser × 100 cm) gepackt. Die gebundenen Proteine eluieren bei einer linearen Flussgeschwindigkeit von 3,75 cm·min^–1 mit Stufengradienten aus 0,01 M Phosphat, 0,01 M Phosphat/0,1 M Natriumchlorid, 0,01 M Phosphat/0,25 M Natriumchlorid und 0,01 M Phosphat/1,0 M Natriumchlorid, alle mit einem pH von 7,0 ± 0,1. Die Heparinase 2 eluiert in der 0,1-M-NaCl-Fraktion, während die Heparinasen 1 und 3 in der 0,25-M-Fraktion eluieren. Alternativ wird der Schritt mit 0,1 M Natriumchlorid eliminiert, und die drei Heparinasen werden mit 0,25 M Natriumchlorid gemeinsam eluiert. Die Heparinasefraktionen werden direkt auf eine Säule geladen, die Cellufinsulfat enthält (5,0 cm Innendurchmesser × 30 cm, Amicon) und bei einer linearen Flussgeschwindigkeit von 2,50 cm·min^–1 mit Stufengradienten aus 0,01 M Phosphat, 0,01 M Phosphat/0,2 M Natriumchlorid, 0,01 M Phosphat/0,4 M Natriumchlorid und 0,01 M Phosphat/1,0 M Natriumchlorid, alle mit einem pH von 7,0 ± 0,1, eluiert. Die Heparinasen 2 und 3 eluieren in der 0,2-M-Natriumchlorid-Fraktion, während die Heparinase 1 in der 0,4-M-Fraktion eluiert. Die 0,2-M-Natriumchlorid-Fraktion von der Cellufinsulfat-Säule wird mit 0,01 M Natriumphosphat verdünnt, wodurch eine Leitfähigkeit von unter 5 μmhos erhalten wird. Die Lösung wird weiter gereinigt, indem das Material auf eine Hydroxylapatitsäule (2,6 cm Innendurchmesser × 20 cm) geladen wird und das gebundene Protein bei einer linearen Flussgeschwindigkeit von 1,0 cm·min^–1 mit Stufengradienten aus 0,01 M Phosphat, 0,01 M Phosphat/0,35 M Natriumchlorid, 0,01 M Phosphat/0,45 M Natriumchlorid, 0,01 M Phosphat/0,65 M Natriumchlorid und 0,01 M Phosphat/1,0 M Natriumchlorid, alle mit einem pH von 7,0 ± 0,1, eluiert wird. Die Heparinase 3 eluiert in einem einzigen Proteinpeak in der 0,45-M-Natriumchlorid-Fraktion, während die Heparinase 3 in einem einzigen Proteinpeak in der 0,65-M-Natriumchlorid-Fraktion eluiert. Die Heparinase 1 wird weiter gereinigt, indem das Material von der Cellufinsulfatsäule nach einer Verdünnung auf eine Leitfähigkeit von unter 5 μmhos auf eine Hydroxylapatitsäule (2,6 cm Innendurchmesser × 20 cm) geladen wird und das gebundene Protein mit einer linearen Flussgeschwindigkeit von 1,0 cm·min^–1 mit einem linearen Gradienten aus Phosphat (0,01 bis 0,25 M) und Natriumchlorid (0,0 bis 0,5 M) eluiert wurde. Die Heparinase 1 eluiert in einem einzigen Proteinpeak bei ungefähr der Hälfte des Gradienten.
Die mittels dieses Verfahrens erhaltenen Heparinase-Enzyme haben eine Reinheit von über 98,5 %, wie mittels Reverse-Phase-HPLC bestimmt wurde (BioCad, POROS II). Die Ergebnisse der Reinigung sind für die Heparinase-Enzyme in der Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1: Reinigung von Heparinase-Enzymen aus Fermentationen von Flavobacterium heparinum
Osmolate, die aus Fermentationen von mit Chondroitinsulfat A induzierten F. heparinum erhalten wurden, werden zur Entfernung von Zellen und Zelltrümmern einer Zentrifugation unterzogen, und der Überstand wird auf eine Kationenaustauschersäule (5,0 cm × 30 cm, Sepharose^TM S Big Beads, Pharmacia) bei einer linearen Flussgeschwindigkeit von 10 cm·min^–1 aufgetragen. Die gebundenen Proteine werden bei einer linearen Flussgeschwindigkeit von 5,1 cm·min^–1 mit Stufengradienten aus 0,01 M Phosphat, 0,01 M Phosphat/0,25 M Natriumchlorid und 0,01 M Phosphat/1,0 M Natriumchlorid, alle mit einem pH von 7,0 ± 0,1, eluiert. Die Chondroitinaseaktivität eluiert in der 0,25-M-Natriumchlorid-Fraktion, die weiter gereinigt wird, indem die Chondroitinase-haltige Fraktion zweifach mit 0,01 M Natriumphosphat verdünnt wird, und das Material wird auf eine Säule aufgetragen, die Cellufinsulfat enthält (2,6 cm Innendurchmesser × 100 cm, Amicon), und bei einer linearen Flussgeschwindigkeit von 1,88 cm·min^–1 mit einem linearen Natriumchloridgradienten, 0,0 bis 0,4 M, eluiert. Die Chondroitinase AC eluiert in erster Linie bei 0,23 bis 0,26 M Natriumchlorid, während die Chondroitinase B bei 0,27 bis 0,3 M Natriumchlorid eluierte. Die einzelnen Fraktionen wurden zweifach mit 0,01 M Natriumphosphat verdünnt und auf eine Hydroxylapatitsäule (2,6 cm Innendurchmesser × 30 cm) aufgetragen. Die gebundenen Proteine werden mit einem Stufengradienten aus 0,25 M Natriumchlorid, gefolgt von einem linearen Gradienten aus 0,25 bis 1,0 M Natriumchlorid, alle in 0,025 M Natriumphosphat mit einem pH von 7,0 ± 0,1, eluiert. Die Chondroitinase B eluiert im 0,25-M-Natriumchlorid-Schritt, während die Chondroitinase AC bei 0,85 bis 0,95 M Natriumchlorid eluiert. Die Chondroitinase-B-Fraktion wird zweifach mit 0,01 M Natriumphosphat verdünnt und auf eine Säule mit einem starken Kationenaustauscher (CBX-S, J.T. Baker, 1,6 cm Innendurchmesser × 10 cm) aufgetragen. Das gebundene Material wird bei einer Flussgeschwindigkeit von 1,0 cm·min^–1 mit einem linearen Gradienten aus 0,125 bis 0,325 M Natriumchlorid in 0,025 M Natriumphosphat mit einem pH von 7,0 ± 0,1 eluiert. Die Chondroitinase B eluiert in einem Proteinpeak bei 0,175 bis 0,225 M Natriumchlorid und enthält eine kleine Menge eines kontaminierenden Proteins mit einem Molekulargewicht von 20 000 Da. Dieses Protein wird durch Gelfiltrationschromatographie entfernt, indem die Chondroitinase-B-Probe auf eine Superdex^TM-200-Säule (1,0 × 30 cm, Pharmacia) geladen wird und mit 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,2, bei einer linearen Flussgeschwindigkeit von 1,25 cm·min^–1eluiert wird und die proteinhaltigen Fraktionen gesammelt werden. Die aus der Hydroxylapatit-Chromatographie erhaltene Chondroitinase-AC-Fraktion wird dreifach mit 0,01 M Natriumphosphat verdünnt und auf eine Säule mit einem starken Kationenaustauscher (CBX-S, J.T. Baker, 1,6 cm Innendurchmesser × 10 cm) aufgetragen. Das gebundene Material wird bei einer Flussgeschwindigkeit von 1,0 cm·min^–1mit einem linearen Gradienten aus 0,125 bis 0,325 M Natriumchlorid in 0,025 M Natriumphosphat mit einem pH von 7,0 ± 0,1 eluiert. Die Chondroitinase AC eluiert in einem einzigen Proteinpeak bei 0,175-0,225 M Natriumchlorid. Die Ergebnisse der Reinigung sind für die Chondroitinase-Enzyme in der Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2: Reinigung von Chondroitinase-Enzymen aus Fermentationen von Flavobacterium heparinum
Isolierung rekombinanter Enzyme
Glycosaminoglycan-abbauende Enzyme können auch aus rekombinanten Expressionssystemen gereinigt werden, wie dem Heparinase-1-Expressionssystem, das von Sasisekharan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8660-8664, 1993 beschrieben wurde, den Heparinase-2- und -3-Expressionssystemen, die in der US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/258 639 „Nucleic Acid Sequences and Expression Systems for Herparinase 2 and Haparinase 3 Derived From Flavobacterium heparinum" von Su et al., eingereicht am 10. Juni 1994, offenbart wurden, oder den Chondroitinase-AC- und -B-Expressionssystemen, die in der US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/272 247 „Chondroitin Lyase Enzymes" von Bennett et al., eingereicht am B. Juli 1994, offenbart werden und deren Inhalt hier mit aufgenommen wird. Bei diesen Expressionssystemen werden die Gene von F. heparinum isoliert und stromabwärts eines induzierbaren Promotors in Plasmide kloniert. Die Plasmide werden in E. coli eingeführt, und die Expression des gewünschten Enzyms wird mit einem geeigneten Induktionsverfahren, wie einer Temperaturänderung und mittels des Zusatzes von IPTG zum Medium, gesteuert.
Die Enzyme können mittels einer Modifikation der hier beschriebenen Verfahren in gereinigter Form gewonnen werden. Das Aufbrechen der Zellen wird über eine Homogenisierung, eine Ultraschallbehandlung oder eine Enzymbehandlung zur Zerstörung der Zellwand und Freisetzung der cytoplasmatischen Komponenten erreicht. Wenn die Enzymsynthese zu einer Aggregation führt, kann das Aggregat mit einem Denaturierungsmittel, 3 bis 6 M Guanidin-HCl oder 4 bis 8 M Harnstoff, aufgelöst werden, und das Protein kann durch die Entfernung des Denaturierungsmittels über eine Dialyse oder Verdünnung neu gefaltet werden. Das neu gefaltete Enzym kann mittels der oben beschriebenen flüssigchromatographischen Verfahren weiter gereinigt werden.
Konstruktion von Fusionsproteinen
Fusionsproteine, die Glycosaminoglycan-abbauende Enzyme enthalten, die an Proteine mit spezifischen Bindungseigenschaften ligiert sind, können mittels gentechnologischer Verfahren erzeugt werden. Über die Auswahl eines geeigneten Bindungsproteins kann die Glycosaminoglycan-abbauende Aktivität in vivo auf spezifische Stellen gelenkt werden. Zum Beispiel bindet der Epidermal Growth Factor an Zellrezeptoren, die vorzugsweise auf der Oberfläche glatter Muskelzellen exprimiert werden, wie von Pickering et al., J. Clin. invest. 91: 724-729, 1993 beschrieben wurde. Fusionsproteine, die diese Gruppe an ein Heparinaseprotein ligiert enthalten, lenken die Heparin- oder Heparansulfat-abbauende Aktivität auf die Oberfläche glatter Muskelzellen, wodurch sie deren Reaktion auf verfügbare Cytokine verringern. Dieser Typ von Fusionsproteinen ist für die Bekämpfung von Krankheiten wertvoll, die aus einem übermäßigen Wachstum glatter Muskelzellen resultieren, wie die Gefäßerkrankungen bei der Atherosklerose und der erneute Verschluss von Gefäßen nach einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie.
Heparinase-Fusionsproteine, die mittels gentechnologischer Verfahren erzeugt werden, behalten die Bindungseigenschaften und die katalytischen Eigenschaften der Heparinase und des Proteins bei, an das sie fusioniert ist. Zum Beispiel wurde das Gen für die Heparinase 1 aus F. heparinum isoliert, wie es von Sasisekharan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 3660-3664, 1993, beschrieben wurde, und eine EcoRI-Restriktionsstelle wurde 5' des Codons, das für den Glutamin-21-Rest codiert, über eine Polymerasekettenreaktion eingefügt. Ein Fragment, das das Heparinase-1-Gen enthielt, wurde über einen Verdau mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI präpariert und in das mit EcoRI/BamHI geschnittene pMALc2-Plasmid (New Englang Biolabs) ligiert. Das resultierende Plasmid enthielt ein Hybridgen, das für ein Protein von 82 000-85 000 Da codierte und das Maltose-bindende Protein (MalB) 5' mit dem Heparinase-1-Gen fusioniert enthielt. Dieses Plasmid wurde mittels des von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110-211 beschriebenen Calciumchlorid-Verfahrens in Escherichia-coli-HB101-Zellen eingeführt. Diese Zellen zeigten eine Heparinaseaktivität unter der Kontrolle des lac-Promotors, was die Synthese des Fusionsproteins über die Zugabe von 0,1 mM des induzierenden Mittels IPTG zum Wachstumsmedium ermöglichte.
Man ließ die HB101-(pMALc2-HEP1Q21)-Zellen bis zu einer Zelldichte von 1,0 g/L Trockenzellgewicht in 500 mL M9-Medium, das 0,1 mM IPTG enthielt, bei 37°C wachsen, und dann wurden sie durch Zentrifugieren bei 10 000 g für 10 Minuten konzentriert. Das Zellpellet wurde in 10 mL 0,025 M Tris, pH 7,7, suspendiert, und die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung mittels eines Heat Systems Model XL2020, für 4,5 Minuten bei der Einstellung 3 in Zyklen aus 30 Sekunden Beschallung und 30 Sekunden Pause aufgebrochen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren bei 10 000 g für 10 Minuten entfernt, und der Überstand wurde auf eine Amylose-Affinitätssäule (Innendurchmesser 1,0 × 2 cm, New England Biolabs) aufgetragen. Das gebundene Protein wurde mit einem Stufengradienten aus 0,025 M Tris, das 0,01 M Maltose enthielt, bei pH 7,5 eluiert. Das Fusionsprotein eluierte in einem Proteinpeak, der eine spezifische Heparinaseaktivität von 23,77 IE/mg aufwies.
Das Fusionsprotein aus der Heparinase und dem Maltose-bindenden Protein kann auch über Standardtechniken der Proteinreinigung, die auf den Eigenschaften der Heparinase beruhen, gereinigt werden. Die ultraschallbehandelten Zellen wurden über eine Ammoniumsulfatfällung fraktioniert. Unspezifische Proteine wurden über einen Fällungsschritt mit 1,7 M Ammoniumsulfat entfernt, und der Überstand wurde durch das Erhöhen der Ammoniumsulfatkonzentration auf 3,2 M ausgefällt. Das ausgefällte Material enthielt das Fusionsprotein und wurde in 0,025 M Natriumphosphat, pH 6,5, resuspendiert. Das Material wurde auf eine Säule mit einem schwachen Kationenaustauscher (Innendurchmesser 1,6 × 10 cm, CBX, J.T. Baker) aufgetragen und mit aufeinanderfolgenden Stufengradienten aus 0,0 M Natriumchlorid, 0,01 M Natriumchlorid, 0,25 M Natriumchlorid und 1,0 M Natriumchlorid, alle in 0,025 M Natriumphosphat, eluiert. Das Fusionsprotein eluierte in der 0,25-M-Natriumchlorid-Fraktion und hatte eine spezifische Heparinaseaktivität von 29,95 IE/mL. Diese beiden Reinigungsverfahren zeigen, dass funktionelle Heparinase-Fusionsproteine über das genetische Verknüpfen eines Proteins mit gewünschten Bindungseigenschaften mit dem N-terminalen Ende des Heparinaseproteins hergestellt werden können, und dass das resultierende Fusionsprotein die Funktionalität sowohl der Heparinase als auch des Proteins, mit dem sie fusioniert wurde, beibehält. Beispiele für andere Targeting-Moleküle, die spezifisch an Rezeptoren wie ECM-Moleküle binden, sind Fibronectin, Laminin, Tenascin, Thrombospondin und Collagene.
Während der letzten zwei Jahrzehnte ist das Grundwissen über die Zelladhäsion und -migration in extrazellulären Matrices (ECMs) auf molekularer Ebene schnell angewachsen. Frühe Anstrengungen in diesem Forschungsgebiet konzentrierten sich auf das die Adhäsion fördernde ECM-Protein Fibronectin (FN). Sequenzanalysen und ein Peptidmapping der an Zellen bindenden FN-Domäne lieferten eine minimale Sequenz, die die zellbindende Aktivität beibehält, in Form des Tetrapeptids Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS). Die biologische Wechselwirkung der RGDS-Sequenz mit Fibronectin-Rezeptoren auf der Zelloberfläche wurde festgestellt, indem gezeigt wurde, dass synthetische RGDS-haltige Peptide in Lösung die Ausbreitung von Fibroblastenzellen auf Fibronectin-beschichteten Substraten kompetitiv hemmen konnten. Nachdem die RGD-Erkennungsstelle für die Zelladhäsion im Fibronectin identifiziert worden war, wurden die Sequenzen anderer Zelladhäsionsproteine auf verwandte Signale untersucht. Zu anderen Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie funktionelle RGD-Sequenzen tragen, gehören die Blutplättchen-Adhäsionsproteine Fibrinogen und der von-Willebrand-Faktor, Osteopontin und Laminin. Diese Befunde implizieren, dass RGD ein ubiquitäres Zelladhäsionssignal ist. Die Verwendung von Fibronectin als Affinitätsligand führte zu einem Rezeptor, der ein Heterodimer mit einer α-Untereinheit von 160 kDa und einer β-Untereinheit von 150 kDa war. Ähnliche affinitätschromatographische Experimente haben zu definierten heterodimeren, auf RGD abzielende Rezeptoren geführt, die spezifisch für Vitronectin sind, und zu einem Blutplättchen-Rezeptor mit Affinitäten für Fibrinogen und Fibronectin. Diese RGD-Rezeptoren, die als Integrine bekannt sind, haben eine heterodimere Struktur, die charakteristisch für auf RGD abzielende Rezeptoren ist, mit α-Untereinheiten im Bereich zwischen 140 und 160 kDa und β-Untereinheiten im Bereich zwischen 90 und 140 kDa. Integrine sind charakteristischerweise durch die Membran reichende, heterodimere Proteinkomplexe, die aus einer α-Untereinheit und einer β-Untereinheit bestehen. Integrin-Komplexe, die β₁- und β₃-Untereinheiten enthalten, sind generell an der Adhäsion von Zellen an der extrazellulären Matrix beteiligt, währen die β₂-Integrine an der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt sind.
Weitere Bindungsproteine können Antikörper oder Antikörperfragmente sein, die spezifische Zellmarker erkennen, Hormone oder andere Moleküle, die von Zelloberflächenrezeptoren gebunden werden. Ein Beispiel für ein Hormon, das von einem bestimmten Zelltyp gebunden wird, ist Östrogen, das in größerem Umfang von bestimmten Typen von Krebszellen gebunden wird. Ein weiteres Beispiel ist Melanin, das ebenfalls in höheren Konzentrationen in bestimmten Krebszellen vorhanden ist. Es sind Antikörper gegen viele spezifische Zelloberflächenmarker bekannt.
Schutz von Proteinen in vivo
Verfahren zur Verlängerung der In-vivo-Halbwertszeit sind bekannt und werden routinemäßig eingesetzt, insbesondere im Falle von Enzymen. Ein Beispiel für ein geeignetes Verfahren ist die Anbringung von Polyethylenglykolgruppen am Protein, die die Aufnahme in das Retikuloendothelialsystem verhindern. Die Präparation und Charakterisierung von „pegylierten" Proteinen wird von Lu et al., Pept. Res. 6(3), 140-146, 1993 und Delgado et al., Critical Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9(3-4), 249-304, 1992, beschrieben, wobei diese Techniken hier mit aufgenommen werden.
Präparation pharmazeutischer Zusammensetzungen
Die Enzyme können topisch, lokal oder systemisch verabreicht werden. Die topische oder lokale Verabreichung wird wegen der besseren Steuerbarkeit bevorzugt. Die Enzyme, allein oder in Kombination, werden mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger gemischt und dann in einer wirksamen Menge verabreicht, um die gewünschte Wirkung auf die behandelten Zellen zu erzielen, wobei Verfahren eingesetzt werden, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, zum Beispiel für die topische Verabreichung, die direkte Verabreichung auf eine Stelle oder für die lokale Verabreichung mittels einer Injektion oder eines Katheters.
Ein Targeting und Dosierungen mit wirksamen Konzentrationen können erhalten werden, indem auf bestimmte Ziele gerichtete Enzyme wie oben beschrieben präpariert werden, oder über den Einsatz von Targetingvehikeln, wie eines Katheters oder eines polymeren Zuführungssystems, um eine gesteuerte ortsspezifische Zuführung des Enzyms zu erzielen.
Präparation von Heparinasegelen
Glycosaminoglycan-abbauende Enzyme können mit einer Vielzahl der üblichen Gele, Cremes oder Salben gemischt werden, um ihre Verabreichung bei der Behandlung von Hautwunden zu erleichtern. Diese Gele oder Salben können allein oder in einem transdermalen Pflaster oder einer Bandage verabreicht werden, um die Penetration einer wirksamen Menge des Enzyms zu den Zellen, die behandelt werden sollen, zu ermöglichen.
Verabreichung von Enzymen über Matrices für eine verzögerte Freisetzung oder mittels einer Injektion
Enzyme können auch in einem Träger für die Verabreichung mittels einer Injektion formuliert werden, zum Beispiel in Saline oder einem wässrigen Puffer unter Einsatz von Standardverfahren, oder sie können in einer polymeren Matrix verkapselt werden.
Die Verkapselung von Enzymen in Formulierungen für eine verzögerte Freisetzung ist gut bekannt. Zu den Materialien gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, Liposomen, Lipospheres, biologisch abbaubare polymere Matrices und Vesikel. Diese Verkapselungsmittel sind typischerweise Mikropartikel mit einem Durchmesser von 60 nm bis 100 μm, aber vorzugsweise von weniger als 10 μm und, noch bevorzugter, von 1 μm oder weniger im Durchmesser.
Proteosomen werden aus den Proteinen der äußeren Membran der Meningococcus-Bakterien präpariert, und für sie wurde von Lowell et al., Science 240: 800 (1988) berichtet, dass sie an Proteine binden, die hydrophobe Anker enthalten. Proteosomproteine sind in hohem Maße hydrophob, was ihre Rolle als Transmembranproteine und Porine widerspiegelt. Nach der Isolierung führen ihre hydrophoben Protein-Protein-Wechselwirkungen dazu, dass die auf natürliche Weise multimolekulare, membranhaltige Vesikel von 60 bis 1000 nm oder Membranvesikelfragmente bilden, in Abhängigkeit von der Stärke des Detergens, das bei ihrer Isolierung verwendet wird. Das Enzym kann auch im Inneren eines Proteoliposoms verkapselt werden, wie es von Miller et al., J. Exp. Med. 176: 1739-1744 (1992) beschrieben wurde, wobei diese Arbeit mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen wird, wie es oben unter Bezugnahme auf die Proteosomen beschrieben wurde. Alternativ kann das Enzym in Lipidvesikeln, wie in Novasome^TM-Lipidvesikeln (Micro Vescular Systems Inc., Nashua, New Hampshire), verkapselt werden. Ein weiterer Träger wird in PCT US 90/06590 von Nova Pharmaceuticals beschrieben, wobei der entsprechende Inhalt hier aufgenommen wird, und wobei der Träger als ein „Liposphere" bezeichnet wird, mit einem festen Kern und einer äußeren Hülle aus Phospholipid.
Der Träger kann auch ein polymeres System für eine verzögerte Freisetzung sein. Biologisch abbaubare synthetische Polymere sind besonders nützlich für die Bewirkung einer verzögerten Freisetzung von Enzymen. Eine Mikroverkapselung wurde auf die Injektion mikroverkapselter Pharmazeutika zur Erzielung einer verzögerten Freisetzung angewandt. Verschiedene Faktoren sind an der Auswahl eines bestimmten Polymers für eine Mikroverkapselung beteiligt. Die Reproduzierbarkeit der Polymersynthese und des Verkapselungsprozesses, die Kosten für die Materialien für die Mikroverkapselung und den Prozess, das toxikologische Profil, der Bedarf an variablen Freisetzungskinetiken und die physikochemische Kompatibilität des Polymers und der Antigene sind alles Faktoren, die berücksichtigt werden müssen. Beispiele für nützliche Polymere sind Polycarbonate, Polyester, Polyurethane, Polyorthoester und Polyamide, insbesondere diejenigen, die biologisch abbaubar sind.
Eine häufige Wahl eines Trägers für Pharmazeutika ist Poly(D,L-lactid-co-glycolid) (PLGA). Dabei handelt es sich um einen biologisch abbaubaren Polyester, der eine lange Geschichte der medizinischen Verwendung in abbaubaren Nähten, Knochenplatten und anderen temporären Prothesen hat, wobei er keinerlei Toxizität gezeigt hat. Eine große Vielzahl von Pharmaka, einschließlich von Peptiden und Antigenen, ist in Form von Mikrokapseln aus PLGA formuliert worden. Der Prozess der PLGA-Mikroverkapselung setzt eine Phasentrennung einer Wasser-in-Öl-Emulsion ein. Die interessierende Verbindung wird als eine wässrige Lösung hergestellt, und das PLGA wird in einem geeigneten organischen Lösemittel, wie Methylenchlorid und Ethylacetat, gelöst. Diese beiden nicht miteinander mischbaren Lösungen werden durch ein Rühren bei hoher Geschwindigkeit emulgiert. Dann wird ein Nichtlösemittel für das Polymer zugesetzt, was zum Ausfallen des Polymers um die wässrigen Tröpfchen herum unter Bildung noch nicht ausgereifter Mikrokapseln führt. Die Mikrokapseln werden gesammelt und mit einem Mittel aus einer größeren Gruppe (Polyvinylalkohol (PVA), Gelatine, Alginate, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Methylcellulose) stabilisiert, und das Lösemittel wird entweder durch ein Trocknen im Vakuum oder eine Läsemittelextraktion entfernt. Zu weiteren Verfahren für eine Verkapselung gehören ein Sprühtrocknen, eine Copräzipitation und eine Lösemittelextraktion.
Enzyme können auch als Filme oder Implantate appliziert werden, zum Beispiel um ein Gewebe zu beschichten, dessen Wachstum gehemmt werden soll. Beispiele für Materialien, die für eine verzögerte Freisetzung eingesetzt werden und die als Gele oder Filme verabreicht werden, die das Mittel inkorporiert enthalten, das freigesetzt werden soll, gehören Pluronics^TM (BASF), Copolymere von Polyethylenoxid und Polypropylenglykol.
Wege der Verabreichung
Die Enzyme können topisch verabreicht werden, wie es oben beschrieben wurde, oder über eine Injektion. Typischerweise erfolgt die Injektion unter Verwendung entweder einer Spritze oder eines Katheters. Der Vorteil des Katheters besteht darin, dass Material auf Oberflächen aufgebracht werden kann, wie auf die Innenseite von Blutgefäßen während eines Verfahrens wie einer Angioplastie, bei der das Ziel darin besteht, eine Restenose über das Hemmen der anormalen Proliferation von Zellen, zu der es häufig nach den chirurgischen Eingriffen kommt, zu verhindern. Es können auch gleichzeitig mit dem chirurgischen Eingriff Enzyme verabreicht werden, so dass das Heilen der Wunde gefördert wird. Enzyme können auch während des chirurgischen Eingriffs verabreicht werden, um das Heilen der Operationswunde zu beschleunigen. Das könnte dadurch erreicht werden, dass das Enzym in einem biokompatiblen Gel oder einer biokompatiblen Salbe formuliert wird, die zum Abschluss der korrektiven Maßnahme direkt auf die Stelle der Wunde appliziert wird.
Glycosaminoglycan-abbauende Enzyme können intradermal verabreicht werden, um eine beschleunigte Bildung neuer Gefäße in ischämischen Gebieten zu bewirken. Was den Mechanismus betrifft, so wird dies durch die Entfernung von Wachstumsfaktoren aus ihrem intrazellulären Speicher, wo sie durch Heparansulfatprnteoglycane abgesondert sind, und durch die Verstärkung der Beweglichkeit von Cytokinen und chemoattraktiven Stoffen durch den Bereich des erkrankten Gewebes erreicht.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Bezugnahme auf die folgenden, nichteinschränkenden Beispiele besser verstanden werden.
Beispiel 1: Präparation topischer Enzymzusammensetzungen
0,5 mL einer Lösung von 0,01 M Natriumphosphat, 0,4 M Natriumchlorid und 200 IE Heparinase 1, die wie hier beschrieben gereinigt wurde, wurden entweder mit 9,5 mL eines Gels gemischt, das aus 1 % Carboxymethylcellulose (Sigma), 40 % USP Glycerol und Nanopure^TM-Wasser bestand, oder mit 9,5 mL eines Gels auf der Basis eines Carbomers (Carbomer^TM 950, Keystone Laboratories).
Ein Teil einer jeden Mischung wurde mittels des von Yang et al., J. Biol. Chem. 260(3): 1849-1857, 1985 beschriebenen spektralphotometrischen Verfahrens bezüglich der Heparinaseaktivität analysiert. Es wurde eine Modifikatidon des von Zimmermann et al., Appl. Environ. Microbiol. 56(11): 3593-3594, 1990, beschriebenen Agaroseplatten-Assays zur Verfolgung der Desorption der Heparinase von verschiedenen Trägern inkorporiert. Eine Lösung, die 0,5 % USP Natriumheparin (Celsus Laboratories) und 1,0 % gereinigte Agarose (Bio-Rad) in 0,25 M Natriumacetat und 0,0025 M Calciumacetat, pH 7,0 ± 0,5, enthielt, wurde bei 95-100°C gemischt, auf 45-60°C abgekühlt, in Portionen von 3 mL in Einmal-Kunststoffküvetten von 5 mL gegossen, und dann ließ man sie fest werden, indem man sie auf Raumtemperatur abkühlte. Heparinaselösungen (0,5 mL, 20 IE/mL) und Heparinase-haltige Gele (0,3-0,7 mL) wurden auf die Oberseite der Heparin/Agarose-Gele aufgebracht und bei 37°C 1 h inkubiert. Die Heparinaseformulierungen wurden verworfen, es wurde ein zylindrischer Querschnitt der Gele mit einer Pasteur-Pipette aus Glas entnommen, und die Zylinder wurden in eine 2%ige Protaminsulfatlösung (Sigma) gegeben. Nach 4-12 h wurde eine Ausfällung von Heparin-Protamin in Form einer opaken weißen Substanz beobachtet. Das Ausmaß der Desorption der Heparinase wurde über die Tiefe der klaren Zone bestimmt, die auf der Oberseite der ausgestochenen zylindrischen Gele lokalisiert war.
Dieses Experiment wurde mit der Formulierung aus Carboxymethylcelfulose/Glycerol unter Verwendung von entweder 20 IE/mL Chondroitinase AC oder 20 IE/mL Chondroitinase B als aktivem Inhaltsstoff und Chondroitinsulfat A oder Dermatansulfat B als Testreagens wiederholt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3: Enzymatische Aktivität und Desorption der Heparinase 1 aus pharmazeutischen Gelformulierungen
Beispiel 2: Präparation einer Heparinase- oder Chondroitinase-Bandage
Die drei bakteriellen Heparinasen und zwei Chondroitinasen, die wie hier beschrieben gereinigt worden waren, wurden in Lösungen gegeben, die 0,01 M Natriumphosphat, 0,2 M Natriumchlorid, pH 7,0, und 35 IE/mL Enzym enthielten. Halbfeste Gele, die aus 4 % Polyethylenoxid (7,5 cm × 5 cm × 0,3 cm) bestanden, wurden 3 h mit 6 m L Enzymlösung in Kontakt gebracht, und während dieser Zeit absorbierte die Gelmatrix mehr als 70 % der Enzymlösung.
Die enzymhaltigen Gele wurden dann hinsichtlich der Bioverfügbarkeit (Desorption) über die Protamin-Präzipitation von Glycosaminoglycan-Agarose-Gelen wie hier beschrieben getestet. Man ließ enzymhaltige Pflaster 90 Minuten bei 37°C die Glycosaminoglycan-Agarose-Gele absorbieren, ehe sie auf ein frisches Agarosegel transferiert wurden. Die Prozedur wurde über einen Gesamtzeitraum von 7,5 Stunden wiederholt. Halbfeste Gele, die aus 4 Polyethylenoxid (7,5 × 5 × 0,3 cm) bestanden, wurden 3 Stunden in 6 bis 8 mL Heparinase 1 in einer Konzentration zwischen 35 und 60 IE/mL eingeweicht, und während dieser Zeit wurde das Enzym in die Matrix absorbiert. Die Matrices wurden auf 1 %ige Agarosegele aufgetragen, die 0,05 % Heparin enthielten, und bei 37°C inkubiert. Die enzymhaltigen Gele wurden jeweils 90 Minuten über einen Gesamtzeitraum von 7,5 Stunden auf frische Agarosegele transferiert. Nach der Inkubation wurden die Agarosegele mit 2,0 % Protaminsulfat in Kontakt gebracht, um unfraktioniertes Glycosaminoglycan auszufällen. Das Eindringen der Enzyme wurde über das Messen der Tiefe der klaren Zone in den ausgefällten Agarosegelen beobachtet. Die Ergebnisse sind in der 2 veranschaulicht.
Beispiel 3: Freisetzung von wachstumsfördernder Aktivität aus extrazellulärer Matrix
Heparinabbauende Enzyme von Flavobakterien können Substanzen, die wachstumsfördernde Aktivitäten aufweisen, aus extrazellulären Matrices freisetzen. Primäre Endothelzellen wurden aus Corneagewebe von Rindern isoliert und in DMEM inkubiert, das 10 % fötales Kälberserum und 5 % Kälberserum enthielt. Zellen aus konfluenten Petrischalen wurden 10-fach verdünnt und 12 bis 14 Tage in 96-Well-Platten mit DMEM gezüchtet, das 10 % fötales Kälberserum, 4 % Dextran und 5 % Kälberserum enthielt, und sie wurden täglich mit 0,5 ng/mL FGF-2 supplementiert. Die Endothelzellen wurden durch eine 0,5- bis 5-minütige Behandlung mit einer Lösung entfernt, die 0,5 % Triton und 0,02 M Natriumhydroxid in Phosphat-gepufferter Saline enthielt, woran sich drei Waschungen mit Phosphat-gepufferter Saline anschlossen. Diese Prozedur führt zu Platten, die mit einer Schicht extrazellulärer Matrix beschichtet sind, die, wenn sie bei 4°C in Phosphat-gepufferter Saline aufbewahrt wird, zwei Jahre stabil ist.
Unterschiedliche Mengen der Glycosaminoglycan-abbauenden Enzyme, die wie hier beschrieben gereinigt worden waren, wurden zur extrazellulären Matrix in 0,2 mL/Well gegeben, die 0,16 % fötales Kälberserum in DMEM enthielten. Man ließ einen einstündigen Kontakt bei 37°C mit den Glycosaminoglycan-abbauenden Enzymen zu. Die Überstände dieser Reaktionsmischungen aus Enzym und extrazellulärer Matrix wurden dann auf die mitogene Aktivität getestet, indem der Einbau von ³H-Thymidin in ruhende Balb/c-3T3-Fibroblasten bestimmt wurde, wie es von Vlodavsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2292-2296, 1987, beschrieben wurde.
Extrazelluläre Matrices, die in vitro von einer primären Endothelzelllinie gebildet worden waren, wurden entweder mit den Heparinasen 1, 2 oder 3 in einer Konzentration von 0,1 IE/mL, der Chondroitinase AC in einer Konzentration von 1,0 IE/mL oder der Chondroitinase B in einer Konzentration von 0,5 IE/mL 60 Minuten behandelt. Die Überstände der Ansätze wurden über einen Thymidineinbau-Test auf mitogene Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in der 3 gezeigt.
Beispiel 4: Heparin- und Heparansulfat-abbauende Enzyme können auch dazu verwendet werden, wachstumsfördernde Aktivität aus intakten tierischen Geweben freizusetzen.
Rindercorneas wurden von Kühen zum Zeitpunkt ihrer Schlachtung gewonnen. Jede Cornea wurde in zwei gleichgroße Teile zerschnitten, und jeder Teil wurde in 0,4 mL DMEM gegeben. Heparinase in einer Konzentration von 0,1 IE/mL wurde zu einem der Corneastücke gegeben und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Das andere Stück der gleichen Cornea diente als Kontrolle. Aliquots von 20 μL eines jeden Ansatzes wurden in 96-Well-Platten transferiert, die gehungerte 3T3-Fibroblasten in einem Gesamtvolumen von 200 μL DMEM, das 0,2 % fötales Kälberserum enthielt, enthielten. Es wurde ³H-Thymidin zu jedem Well gegeben, und die Zellen wurden 48 Stunden bei 37°C inkubiert.
Es wurden Corneas von Rindern gewonnen, in gleiche Teile zerschnitten und mit der Heparinase 1, 2 oder 3 in einer Konzentration von 0,1 IE/mL behandelt. Die Überstände der Ansätze wurden über den Einbau von ³H-Thymidin, der mittels des Verfahrens von Vlodavsky et al. bestimmt wurde, auf das Vorliegen mitogener Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in der 4 gezeigt.
Beispiel 5: Behandlung extrazellulärer Matrix mit Glycosaminoglycan-Lyasen
Glycosaminoglycan-abbauende Enzyme verändern die extrazelluläre Matrix, indem sie die Glycosaminoglycan-Komponenten des Proteoglycans der extrazellulären Matrix spalten. Die Präparation einer extrazellulären Matrix mit ³⁵S-Sulfat-haltigem Proteoglycan und der nachfolgende Verdau dieser radioaktiv markierten Matrix mit Glycosaminoglycan-abbauenden Enzymen aus Flavobacterium ermöglicht die quantitative Bestimmung der Wirkung der Enzyme. ³⁵S-Sulfat-haltige extrazelluläre Matrix wurde gebildet, indem Platten mit primären Endothelzellen aus der Rindercornea besät wurden, die man in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum und 5 % Kälberserum hatte konfluent werden lassen und die man 10-fach in Fischer-Medium verdünnte, das mit 10 % fötalem Kälberserum, 5 % Kälberserum, 4 % Dextran und 25 μCi/mL Na₂ ³⁵SO₄ supplementiert war, und man die Zellen dann 12 bis 14 Tage unter täglicher Zugabe von 0,5 ng/mL FGF-2 kultivierte. Die Endothelzellen wurden von der radioaktiv markierten extrazellulären Matrix entfernt, indem sie 0,5 bis 5 Minuten mit einer Lösung behandelt wurden, die 0,5 % Triton und 0,02 M Natriumhydroxid in Phosphat-gepufferter Saline, behandelt wurden, woran sich drei Waschungen mit Phosphat-gepufferter Saline anschlossen.
Extrazelluläre Matrix, die ³⁵S-Sulfat im Glycosaminoglycan-Teil enthielt, wurde mit Phosphat-gepufferter Saline oder den Heparinasen 1, 2 oder 3 oder den Chondroitinasen AC oder B in einer Konzentration von 0,1 IE/mL in Platten mit 1 mL/Well, die Phosphat-gepufferte Saline enthielten, behandelt, und man ließ den Verdau 0,5 Stunden bei 37°C ablaufen. Die Menge des freigesetzten Glycosaminoglycans wurde über das Bestimmen des in den Überstand freigesetzten radioaktiv markierten Sulfats mittels eines Packard-Flüssigszintillationszählers 1600 TR gemessen. Ungefähr 80 000 cpm waren insgesamt an radioaktiv markiertem Sulfat in jeder Reaktion vorhanden. Die Ergebnisse sind in der 5 gezeigt.
Die Wirkung der Heparin-abbauenden Enzyme von Flavobacterium tritt extrem schnell ein, und zur Bildung von ³⁵S-Sulfat-markierten Material kommt es innerhalb von Sekunden nach ihrer Zugabe zu radioaktiv markierter extrazellulärer Matrix, wie es oben beschrieben wurde. Im Gegensatz dazu zeigt die gleiche Menge einer aus menschlicher Plazenta isolierten Säugetier-Heparanase eine Verzögerungszeit von 15 bis 20 Minuten nach dem Zusatz zur radioaktiv markierten Matrix, ehe ein messbarer Anstieg der Menge an löslichem ³⁵S-Sulfat-markiertem Material nachgewiesen werden kann. Diese Beobachtung zeigt einen weiteren Unterschied zwischen den Säugetier- und den Bakterienenzymen.
Währen die Behandlung der extrazellulären Matrix mit Glycosaminoglycan-abbauenden Enzymen die Glycosaminoglycan-Komponente des Proteoglycans der extrazellulären Matrix verändert, bleibt der gesamte Strukturzusammenhalt der Matrix unverändert, wie die Elektronenmikroskopie zeigt, obwohl strukturell intakte, enzymbehandelte extrazelluläre Matrix eine verbesserte Permeabilität für Makromoleküle zeigt. Diese erhöhte Permeabilität kann über die Untersuchung der Fähigkeit der Glycosaminoglycan-abbauenden Enzyme von Flavobakterien, den Durchtritt von Fragmenten aus 25 Nucleotidbasen bis zu 2000 Nucleotiden durch eine mit extrazellulärer Matrix beschichtete Membran aus Polyethylenterephthalat (PET) mit einer Porengröße von 0,45 μm zu erleichtern, demonstriert werden. Primäre Endothelzellen aus der Rindercornea, die wie oben beschrieben kultiviert wurden, werden ausgehend von konfluenten Platten 1:10 verdünnt und in Gewebekultureinsätze aus PET-Membranen mit einer Porengröße von 0,45 μm (Falcon) in DMEM verdünnt, das 10 % fötales Kälberserum, 5 % Kälberserum und 4 % Dextran enthält, und 12 bis 14 Tage unter täglicher Zugabe von 0,5 ng/mL FGF-2 kultiviert. Die Endothelzellen werden wie oben beschrieben entfernt, und die mit extrazellulärer Matrix beschichteten PET-Einsätze werden entweder mit der Heparinase 1, 2 oder 3 in einer Konzentration von 0,1 IE/mL oder mit der Chondroitinase AC oder B in einer Konzentration von 1 IE/mL in Phosphat-gepufferter Saline 1 Stunde bei 39°C behandelt und 3-mal mit Phosphat-gepufferter Saline gespült.
Die mit enzymbehandelter extrazellulärer Matrix beschichteten PET-Einsätze werden gleichzeitig mit einem mit unbehandelter extrazellulärer Matrix beschichteten PET-Einsatz und einem unbeschichteten PET-Einsatz in 12-Well-Platten gegeben, und 2 mL Phosphat gepufferte Saline werden zu jedem Well gegeben. Radioaktiv markierte Makromoleküle werden ins Innere eines jeden PET-Einsatzes gegeben, und Aliquots von 100 μL der Phosphatgepufferten Salinelösung im Well, der den PET-Einsatz umgibt, werden nach 15-minütiger Inkubation bei 37°C entnommen. Die Aliquots werden über eine Flüssigszintillationszählung in einem Packard-Szintillationszähler 1600 TR auf ³²P-haltiges Material getestet.
Beispiel 6: Behandlung der Zelloberfläche mit Glycosaminoglycan-Lyasen
Glycosaminoglycan-abbauende Enzyme können die Reaktion einer Zelle auf Wachstumsfaktoren abschwächen, indem sie die Glycosaminoglycan-Komponente von Proteoglycanen der Zelloberfläche spalten. Glatte Gefäßmuskelzellen ließ man in 96-Well-Platten mit DMEM wachsen, das mit 10 % fötalem Serum supplementiert war, bis sie konfluent waren. Die Zellen wurden entweder mit der Heparinase 1, 2 oder 3 oder der Chondroitinase AC in einer Konzentration von 0,1 IE/mL 1 Stunde bei 37°C behandelt, dann auf Eis gekühlt und zweimal mit einem Inkubationsmedium gewaschen, das 0,025 M HEPES, 0,002 M Tris und 0,1 % BSA in DMEM, pH 7,5, umfasste. Die Zellen wurden in 0,25 mL Inkubationspuffer suspendiert, der 5 ng ¹²⁵I-FGF-2 (0,5 μCi) enthielt, und 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Adsorption von FGF-2 an Glycosaminoglycane der Zelloberfläche wurde bestimmt, indem die Zellen mit einem Elutionspuffer gewaschen wurden, der aus 0,025 M HEPES und 2 M Natriumchlorid, pH 7,4, bestand und das erhaltene ¹²⁵I mit einem Gamma-Counter (Wallac, Modell 1740) gemessen wurde.
Balb/c-3T3-Fibroblasten wurden mit 0,1 IE/mL der Heparinase 1, 2 oder 3 oder der Chondroitinase AC behandelt und gegen ¹²⁵I-FGF-2 exponiert. Die Menge des an das Glycosaminoglycan der Zelloberfläche adsorbierten FGF-2 wurde bestimmt, indem die an Glycosaminoglycan gebundene Fraktion in 0,025 M HEPES, 2,0 M Natriumchlorid extrahiert wurde und das FGF-2 mittels eines Gamma-Counters gemessen wurde, und sie wird als Prozentsatz des an unbehandelte Zellen gebundenen FGF-2 ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der 6 gezeigt.
Beispiel 7: Steuerung der Proliferation von Endothelzellen über eine Behandlung des Glycosaminoglycans
Die Behandlung von Zellflächen mit einem Glycosaminoglycan-abbauenden Enzym kann entweder die Bindung von Wachstumsfaktoren verstärken, wie im Falle von Chondroitinabbauenden Enzymen, oder sie kann die Bindung von Wachstumsfaktoren hemmen, wie im Falle von Heparin- und Heparansulfat-abbauenden Enzymen. Die Entfernung von Heparansulfat von der Zelloberfläche kann durch Heparin- oder Heparansulfat-Fragmente kompensiert werden, die durch eine Enzymbehandlung aus der extrazellulären Matrix freigesetzt werden.
Behandelte glatte Gefäßmuskelzellen wurden 20 Minuten gegen 0,1 IE/mL Heparinase 2 bei 37°C exponiert. Behandelte Matrix wurde 20 Minuten gegen 0,1 IE/mL Heparinase 2 bei 37°C exponiert. Nach der Enzymbehandlung wurden die Zellen mit 0,1 mL PBS gewaschen und gegen 50 μL Matrixüberstand exponiert.
³H-Thymidin wurde dem Inkubationsansatz zugegeben, und die Proliferation wurde wie von Vlodavsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 84: 2292-6 (1987), Trends Biochem. Sci. 16: 268-271 (1991) beschrieben bestimmt. Die Proliferation der glatten Gefäßmuskelzellen wurde über den Thymidineinbau verfolgt und wird als das Verhältnis zwischen den Zellen, die gegen enzymbehandeltes Material exponiert wurden, und den Zellen, die gegen nicht behandelte Matrices exponiert wurden, ausgedrückt für a) nicht behandelte ECM, nicht behandelte Zellen, b) Heparinase-2-behandelte ECM, nicht behandelte Zellen und c) Heparinase-2-behandelte ECM, nicht behandelte Zellen. Die Ergebnisse sind in der 7 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass, wenn man die Zellmatrix von der Zelloberfläche trennt, man den Rezeptor durch die Behandlung der Oberfläche ausschaltet und wachstumsfördernde Aktivität durch die Behandlung der Matrix freisetzt, und dass, wenn man die Matrix und die Zelloberfläche behandelt, eine Wachstumsförderung beobachtet wird, da die Matrix Wachstumsfaktor freisetzt, der den Verlust an heparinbindendem Rezeptor kompensiert.
Beispiel 8: Untersuchung der lokalen Verabreichung von Heparinase zur Förderung der Revaskularisierung
Das Hinterlaufs-Ischämie-Modell des Kaninchens, das von Pu et al., Circulation 88: 208-215, 1993, beschrieben wurde, wurde zur Beurteilung der Wirksamkeit der Heparinase 1 bezüglich der Wiederherstellung der Vaskularisation eingesetzt. Es wurden drei Behandlungsgruppen (n = 4) untersucht. Die Kaninchen in den einzelnen Gruppen erhalten entweder Saline als Kontrolle, FGF-2 in einer Konzentration von 100 mg/Tag^–1 oder Heparinase 1 in einer Konzentration von 100 IE/Tag^–1. Eine Ischämie wurde chirurgisch im linken Hinterlauf hervorgerufen, und die Verbindungen wurden 10 Tage lang verabreicht, wobei am 11. Tag nach dem chirurgischen Eingriff begonnen wurde. Die Geschwindigkeiten der Vaskularisation wurden über die Messung des Blutdruckes in beiden Läufen mit einem Doppler-Flowmeter und das Berechnen des Verhältnisses des Blutflusses im ischämischen Lauf zu demjenigen der Kontrolle (unbehandelter Lauf) bestimmt.
Heparinase 1 und FGF-2 beschleunigten sowohl die Zunahme des Blutdruckverhältnisses als auch das Ausmaß des 30 Tage nach der Behandlung erreichten Blutdruckverhältnisses. Am Tag 40 nach der Operation wurden Angiogramme zur Bestimmung der Bildung neuer Gefäße erstellt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4: Behandlung ischämischer Hinterläufe
Die Daten zeigen die potentielle Nützlichkeit von Zusammensetzungen, die ein von Flavobacterium heparinum gewonnenes Glycosaminoglycan-abbauendes Enzym oder eine Kombination von aus Flavobacterium heparinum gewonnenen Enzymen enthalten, für die Beschleunigung der Gewebereparatur beim Menschen.
Beispiel 9: Freisetzung von wachstumsfördernder Aktivität aus der extrazellulären Matrix
Extrazelluläre Matrices (ECM), die präpariert wurden, wie es im Beispiel 3 beschrieben wurde, wurden mit der Heparinase 1, 2 oder 3 in einer Konzentration von 0,1 IE/mL oder mit der Chondroitinase AC in einer Konzentration von 1,0 IE/mL 10 Minuten bei 37°C behandelt. Unbehandelte Kontrollproben wurden mit einer Kontrolllösung behandelt, die kein Enzym enthielt. Ein Volumen von 0,01 mL des Überstandes eines jeden Ansatzes wurde über de_n Transfer auf ruhende Balb/c-3T3-Fibroblasten mittels des im Beispiel 7 beschriebenen Proliferationsassays auf das Vorhandensein mitogener Aktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in der 8 dargestellt.
Jede der Testbehandlungen, die Heparinase 1, 2, 3 oder die Chondroitinase AC, setzte lösliches Material aus der ECM frei, das die Proliferation der Fibroblasten über das Ausmaß erhöhte, das mit nicht behandelter ECM erzielt wurde.
Beispiel 10: Behandlung der Zelloberfläche und der extrazellulären Matrix mit Heparinase
Heparinase, die einer Wunde in vivo verabreicht wird, wird nicht nur auf die extrazelluläre Matrix wirken, sondern auch auf die Glycosaminoglycane auf der Oberfläche von Zellen, die am Wundheilungsprozess beteiligt sind. Zur Modellierung dieser Wirkung in vitro wurden ruhende Balb/c-3T3-Fibroblasten mit Heparinase 3 auf die gleiche Weise behandelt wie die extrazelluläre Matrix, ehe sie den Reaktionsüberstand der extrazellulären Matrix erhielt. Sowohl extrazelluläre Matrices als auch ruhende Balb/c-3T3-Fibroblasten wurden mit der Heparinase 3 in einer Konzentration von 0,1 IE/mL 10 min bei 37°C behandelt, und danach wurde der enzymhaltige Überstand von den Zellen entfernt und durch DMEM, das 0,2 % fötales Kälberserum enthielt, ersetzt. Nach dieser Behandlung wurde die Proliferation der 3T3-Fibroblasten durch das Verfolgen des ³H-Thymidineinbaus bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 9 dargestellt.
Höhere Proliferationen wurden gesehen, wenn die Fibroblasten, ehe sie die behandelte extrazelluläre Matrix erhielten, mit Enzym behandelt wurden. Die Ergebnisse unterstützen die Verwendung von Heparinase 3 am Ort der Wunde zur Stimulierung der Wundheilung.
Beispiel 11: Heparinase-vermittelte Freisetzung wachstumsfördernder Aktivität aus intakten tierischen Geweben
Rindercorneas wurden von Kühen zum Zeitpunkt der Schlachtung gewonnen und mit verschiedenen Konzentrationen der Heparinase 3 behandelt. Die Corneas wurden, wobei jeweils 3 Rindercorneas für jede Konzentration eingesetzt wurden, so in sterile 24-Well-Gewebekulturplatten gegeben, dass nur die innere Membran exponiert war, und 0,2 mL Phosphat-gepufferte Saline wurden zu jeder Cornea gegeben. Heparinase 3 wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 0,01, 0,1 oder 1,0 IE/mL zugegeben, und man ließ den Verdau 5 Minuten bei 37°C ablaufen. Eine Kontrollgruppe aus 3 Corneas erhielt kein Enzym. Aliquots von 0,045 mL des Reaktionsüberstandes wurden dann von jeder Cornea auf ruhende Balb/c-3T3-Fibroblasten übertragen. Die Proliferation der Fibroblasten wurde mittels des im Beispiel 7 beschriebenen Proliferationsassays bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 10 dargestellt.
Alle drei Konzentrationen der Heparinase 3 führten zur Freisetzung von Verbindungen aus der Rindercornea, die die Proliferation stimulieren, wobei die größte Wirkung aus der Behandlung mit 0,1 IE Heparinase 3/mL resultierte.
Beispiel 12: Heparinase-vermittelte Freisetzung von bFGF aus Zellen und der extrazellulären Matrix in vitro
Zur Bestimmung der relativen Wirksamkeit der Heparinasen 1, 2 und 3 bezüglich der Freisetzung heparinbindender Wachstumsfaktoren aus Geweben und extrazellulären Matrices wurden die Überstände der Heparinase-1-, -2- oder -3-behandelten Zellen oder Matrix auf das Vorliegen von bFGF untersucht. Konfluente Endothelzellen und glatte Muskelzellen des Rindes, die in 10-cm-Gewebekulturschalen gehalten wurden, wurden 1 Stunde bei 37°C in 2 mL Phosphat-gepufferter Saline inkubiert, die 0,1 IE/mL Heparinase 1, 2 oder 3 enthielt. Extrazelluläre Matrix, die wie im Beispiel 3 beschrieben präpariert worden war, wurde auf identische Weise behandelt. Aliquots wurden zur Bestimmung der bFGF-Konzentration mittels des Quantikine^TM-ELISA (R&D Systems) für humanes bFGF entnommen. Die Ergebnisse sind in der 11 dargestellt.
Die Heparinase 3 führte zur Freisetzung der größten Menge an bFGF aus allen drei Zelltypen, gefolgt von der Heparinase 2 und dann der Heparinase 1. ECM setzte mit allen der drei getesteten Enzyme mehr bFGF frei als Rinderendothelzellen und glatte Muskelzellen des Rindes.
Beispiel 13: Heparinase-vermittelte Freisetzung von bFGF aus Zellen und extrazellulärer Matrix in vitro
Glatte Muskelzellen aus der Rinderaorta (Passagen 1-8) wurden, bis sie beinahe konfluent waren, in mit 10 % fötalem Serum und 100 Einheiten/mL Penicillin/Streptomycin supplementiertem DMEM (hohe Glucose-DMHG) bei 37°C in 96 Well-Platten in einer Umgebung von 7,5 % CO₂ gezüchtet. Man ließ die Zellen 3,5 bis 4 Tage hungern, indem das Wachstumsmedium gegen DMHG und 2 % BSA ausgetauscht wurde. Nach der Hungerperiode wurden die Zellen mit einer Lösung aus DMHG und 0,5 % BSA, die die Heparinase 1, 2 oder 3 in Konzentrationen von 0,1 oder 0,5 IE/mL enthielt, 10 min bei 37°C behandelt. Die Enzymlösung wurde entfernt, und die Zellen wurden dreimal mit Phosphat-gepufferter Saline mit Calcium und Magnesium (PBS + Ca + Mg) gewaschen. Es wurden 180 μL DMHG mit 0,5 % BSA und 1,1 μCi/mL ³H-Thymidin zu jedem Well gegeben. Außerdem wurden 20 μL einer Lösung von 20 ng/mL bFGF in DMHG und 0,5 % BSA zu den induzierten Wells gegeben, und 20 μL DMHG mit 0,5 % BSA wurden zu den Kontrollwells gegeben. Die Zellen wurden 48 h wie oben beschrieben inkubiert. Nach 48 Stunden wurde das Medium entfernt, und die Wells wurden einmal mit PBS + Ca + Mg, einmal mit 200 μL 100 % Methanol, zweimal mit 5 % TCA und zweimal mit Wasser gewaschen. Nach diesen Waschschritten wurden 100 μL 0,2 N NaOH zu jedem Well gegeben. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurde der Inhalt der Wells zu Gefäßen mit Szintillator gegeben, und es wurde die Menge des eingebauten ³H gemessen. Es wurde der Mittelwert aus zwei getrennten Experimenten bestimmt, und diese Mittelwerte sind in der 12 gezeigt.
Beispiel 14: Aktivierung des Rezeptors des Basic FGF durch aus dem Abbau von Heparinsulfat stammende, von Zellen und extrazellulärer Matrix freigesetzte Fragmente
Materialien und Methoden
Rekombinantes humanes bFGF wurde von Takeda Chemical Industries (Osaka, Japan) bereitgestellt. Sepharose^TM 6B war von Pharmacia (Uppsala, Schweden). Natriumheparin aus der Darmmucosa des Schweins (PM-Heparin, Mr 14 000, anti-FXa 165 IE/mg) wurde von Hepar Industries (Franklin, Ohio) bezogen. Bakterielle (Flavobacterium heparinum) Heparinasen 1 (EC 4.2.2.7), 2 und 3 wurden von IBEX Technologies (Montreal, Kanada) produziert. Die Heparansulfat-abbauende Endoglycosidase (Heparanase) wurde aus menschlicher Plazenta gereinigt. Die Enzymreinigung beinhaltete eine Ammoniumsulfatfällung und aufeinanderfolgende Chromatographieschritte unter Verwendung von Carboxymethylsepharose, Heparinsepharose und Con-A-Sepharose.
Zellen. Glatte Muskelzellen (smooth muscle cells, SMC) wurden aus der Media der Rinderaorta isoliert, wie es von Castellot, J.J. et al., J. Cell. Biol. 102, 1979-1984 (1986) und Schmidt, A. et al., J. Biol. Chem. 267, 19242-19247 (1992) beschrieben wurde. Es wurde, um das ganze kurz zusammenzufassen, das abdominale Segment der Aorta entfernt, und die Faszien wurden unter einem Mikroskop ebenfalls entfernt. Die Aorta wurde der Länge nach aufgeschnitten, und kleine Stücke der Media wurden vorsichtig von der Gefäßwand abgestreift. Zwei oder drei derartige Streifen mit durchschnittlichen Abmessungen von 2 mm³ wurden in 100-mm-Gewebekulturschalen gegeben, die mit 10 % FCS, 100 E/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin supplementiertes DMEM (4,5 g Glucose/Liter) enthielten. Innerhalb von 7-14 Tagen wanderten große Inseln vielschichtiger Zellen aus den Explantaten aus. Ungefähr 1 Woche später wurden die Zellen in 100-mm-Gewebekulturschalen subkultiviert (4-6 × 10⁵ Zellen/Platte). Die Kulturen (Passage 38) zeigten typische morphologische Eigenschaften von Gefäß-SMC, und die Zellen wurden spezifisch durch monoklonale Antikörper angefärbt, die selektiv die Muskelform des Actins erkennen (HS-35). Dieser Antikörper erkennt keine Endothelzellen oder Fibroblasten.
Kulturen von Endothelzellen aus der Rindercornea wurden aus Stieraugen etabliert, wie es von Gospodarowicz, D. et al., Exp. Eye Res. 25, 75-89 (1977) beschrieben wurde. Ausgangskulturen wurden in mit 10 % Serum neugeborener Kälber, 5 % FCS, 50 E/mL Penicillin und 50 μg/mL Streptomycin supplementiertem DMEM (1 g Glucose/Liter) bei 37°C in feuchtigkeitsgesättigten Inkubatoren mit 10 % CO₂ gehalten. Die Rinderaorta-Endothelzellen wurden kloniert und kultiviert, wie es von Gospodarowicz, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4120-4124 (1976) beschrieben wurde. Es wurde jeden zweiten Tag rekombinantes bFGF (1 ng/mL) zugegeben, bis die Zellen fast konfluent waren. Der Klon F32 von BaF₃-Zellen (Ornitz, D.M. et al., Mol. Cell. Biol. 12, 240-247 (1992)) wurde von Dr. D. Ornitz (Department of Molecular Biology, Washington University in St. Louis) bereitgestellt. Die Zellen wurden in mit 10 % Serum neugeborener Kälber, 10 % Interleukin-3-konditioniertem, von X63-1L3-Zellen produziertem Medium, L-Glutamin und Antibiotika supplementiertem Medium kultiviert. Die F32-Zellen wurden nach der Transfektion von BaF₃-Zellen mit dem Mo/MFR1/SV-Expressionsvektor und einer Selektion in Medium, das bFGF plus Heparin enthielt, erhalten, was Kolonien lieferte, die die mRNA des FGF-Rezeptor-1 der Maus (mFR1) exprimieren, wie es von Ornitz, D.M. et al., Mol. Cell. Biol. 12, 240-247 (1992) beschrieben wurde.
Zellproliferation. F32-Zellen wurden zweimal mit RPMI-1640-Medium gewaschen. Die Zellen (2 × 10⁴/Well/0,2 mL) wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von 5 ng/mL bFGF und zunehmenden Konzentrationen von HS-Abbaufragmenten, die aus Zellen und der ECM durch die Heparinasen 1, 2 und 3 freigesetzt wurden, in 96-Well-Mikrotiterplatten ausgesät. 48 Stunden später wurde 1 μCi ³N-Thymidin zu jedem Well gegeben, die Zellen wurden weitere 6 h inkubiert und dann mit einem PHD Cell Harvester^TM geerntet. Das eingebaute Thymidin wurde mittels Flüssigszintillationszählung bestimmt.
Präparation mit ECM beschichteter Platten. Endothelzellen aus der Rindercornea wurden mit STV aus Ausgangskulturen (zweite bis fünfte Passage) dissoziiert und in einer Ausgangsdichte von 2 × 10⁵ Zellen/mL in 4-Well-Platten ausplattiert. Die Zellen wurden wie oben beschrieben gehalten, außer dass 5 % Dextran T-40 im Wachstumsmedium enthalten war und die Zellen ohne Zusatz von bFGF 12 Tage gehalten wurden. Die subendotheliale ECM wurde exponiert, indem die Zellschicht 5 min bei Raumtemperatur mit PBS, die 0,5 % Triton X-100 und 20 mM NH₄OH enthielt, gelöst wurde, woran sich vier Waschungen mit PBS anschlossen. Die ECM blieb intakt, frei von Zelltrümmern und fest an der gesamten Fläche der Gewebekulturplatte angeheftet. Zur Präparation Sulfat-markierter ECM wurden Endothelzellen aus der Cornea in 4-Well-Platten ausplattiert und wie oben beschrieben kultiviert. Es wurde Na₂[³⁵S]O₄ (540-590 mCi/mmol) einen Tag und 5 Tage nach dem Aussäen zugegeben (40 μCi/mL), und die Kulturen wurden ohne einen Medienwechsel mit der Markierung inkubiert. Zehn bis zwölf Tage nach dem Aussäen wurde der Zellmonolayer gelöst und die ECM exponiert, wie es oben beschrieben wurde. Der Abbau der Sulfat-markierten ECM durch bakterielle Heparinasen wurde wie beschrieben bestimmt (Ishai-Michaeli, R. et al., Cell Reg. 1, 833-842 (1990); Bat-Ner, M. et al., Blood 70, 551-557 (1987); Vlodavsky, 1. et al., Cancer Res. 43, 2704-2711 (1983)). Es wurde, um das ganze kurz zusammenzufassen, die ECM 24 Stunden bei 37°C und pH 6,2 mit der Heparinase 1, 2 oder 3 inkubiert, und das in das Inkubationsmedium freigesetzte Sulfat-markierte Material wurde mittels Gelfiltration auf einer Sepharose-6B-Säule analysiert. Intakte Heparansulfatproteoglycane (HSPG) wurden in der Nähe des Totvolumens (Kav < 0,2) eluiert, und HS-Abbaufragmente eluierten mit 0,5 < Kav < 0,8.
Ergebnisse
Abbau Sulfat-markierter ECM und Freisetzung von ECM-gebundener mitogener Aktivität durch die Heparinasen 1, 2 und 3. Der Abbau von HS in der ECM wurde durch das Inkubieren der Heparinasen 1, 2 oder 3 (0,1 E/mL) mit metabolisch Sulfat-markierter ECM, die durch kultivierte Endothelzellen aus der Rindercornea produziert worden war, für 1 Stunde bei 37°C untersucht. Die Sulfat-markierten, in das Inkubationsmedium freigesetzten Abbauprodukte wurden mittels Gelfiltration auf Sepharose^TM 6B analysiert. Während intaktes HSPG in der Nähe des Totvolumens der Säule eluiert wird, wurden markierte Abbaufragmente von HS-Seitenketten mehr in der Nähe des V_t der Säule (0,5 < Kav < 0,8) eluiert. Wie in der 13A gezeigt ist, führte die Inkubation der ECM mit jedem der bakteriellen Enzyme zur Freisetzung Sulfat-markierter Abbauprodukte mit niedrigem Mr (Peak 11, Fraktionen 20-30). Die HS-Natur dieser Fragmente wurde anhand ihrer Empfindlichkeit gegenüber einer Desaminierung mit salpetriger Säure und ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber einem weiteren Abbau durch Papain oder Chondroitinase ABC verifiziert. Die drei Enzyme führten zu unterschiedlichen Elutionsmustern, die unterschiedliche Größen der Abbaufragmente widerspiegelten. Die Heparinase 1 führte zu einer breiten Verteilung von Fragmenten (0,4 < Kav < 0,6) mit einem durchschnittlichen MG, das über demjenigen der Fragmente lag, die von der Heparinase 3 (Kav – 0,65) und der Heparinase 2 (Kav – 0,8) freigesetzt wurden (13). Die Heparinase 2 baut das ECM-HS zu kleinen Fragmenten ab, die lediglich 2 bis 6 Zuckereinheiten enthalten und in der Nähe des V_t der Säule wandern.
Das durch die Heparinasen 1, 2 und 3 aus der ECM freigesetzte Material wurde zu wachstumsarretierten 3T3-Fibroblasten gegeben und auf seine Fähigkeit zur Stimulation der DNA-Synthese in diesen Zellen getestet. Wie in der 13B gezeigt ist, war das durch die Heparinase 2 und, in etwas geringerem Ausmaß, durch die Heparinase 3 aus der ECM freigesetzte Material hochmitogen für 3T3-Fibroblasten im Vergleich zu demjenigen, das unter den gleichen Bedingungen durch die Heparinase 1 freigesetzt wurde. Tatsächlich war die durch die Heparinase 1 freigesetzte mitogene Aktivität nur geringfügig höher als diejenige, die bei der Inkubation mit lediglich PBS aus der ECM freigesetzt wurde. Die spontane Freisetzung von sowohl HSPG als auch mitogener Aktivität aus ECM, die lediglich mit PBS inkubiert wurde, wird auf proteolytische Enzyme, wie den Tissue Plasminogen Activator (tPA), die Urokinase und die Gelatinase A, die sich in der ECM finden, zurückgeführt. Die Heparinasen 1, 2 und 3 hatten keinerlei mitogene Aktivität, wie aus dem Fehlen einer wachstumsfördernden Aktivität, wenn die Enzyme auf normalen Gewebekulturplatten anstelle von ECM inkubiert wurden, hervorging.
Die Unterschiede bezüglich der durch die Heparinasen 1, 2 und 3 aus ECM-freigesetzten mitogenen Aktivitäten beruhten nicht auf unterschiedlichen Fähigkeiten zum Abbau des ECM-Substrats, da mehr als 90 % des Sulfat-markierten Materials von jedem der Enzyme freigesetzt wurden, wobei weniger als 10 % der Radioaktivität mit der ECM assoziiert blieb, wie in der 13C gezeigt ist. Ähnlich setzten alle drei Enzyme mehr als 90 % des ¹²⁵IbFGF frei, das zunächst an die ECM gebunden war. Außerdem führte(n) eine gleichzeitige Inkubation von Sulfat-markierter ECM mit den Heparinasen 1 und 3 oder die aufeinanderfolgenden Zugaben einer zweiten Dosis des gleichen oder eines anderen Enzyms nur zu einer geringfügigen Zunahme (um weniger als 15 %) der Menge der freigesetzten HS-Abbaufragrnente und der mitogenen Aktivität.
Wachstumsfördernde Aktivität von HS-Fragmenten, die aus Zellen und der ECM durch die Heparinasen 1, 2 und 3 freigesetzt werden. Eine cytokinabhängige lymphoide Zelllinie, die gentechnisch so manipuliert ist, dass sie den FGF-Rezeptor 1 der Maus exprimiert (Ornitz, D.M. et al., Mol. Cell Biol. 12, 240-247 (1992)) wurde zu den Zellen gegeben, um zu untersuchen, ob HS-Abbaufragmente, die durch die Heparinasen 1, 2 und 3 aus Zellen und der ECM freigesetzt werden, die Abhängigkeit von Heparin oder Heparansulfat bezüglich der Ermöglichung der bFGF-induzierten Mitogenese in diesem Zellsystem aufheben können. Es wurde früher gezeigt, dass BaF₃-Zellen, die transfiziert worden waren, damit sie mFR1 exprimieren, eine dosisabhängige Reaktion auf bFGF zeigen, bei einer absoluten Abhängigkeit von Heparin. Die F32-Zellen wurden in diesen Experimenten mit überschüssigem rekombinantem bFGF (5 ng/mL) inkubiert, so dass jeder möglicherweise auftretende wachstumsfördernde Effekt, der von ECM-Abbauprodukten induziert wurde, auch auf Fragmente des Heparansulfats und nicht auf die relativ vernachlässigbare Menge (weniger als 0,5 ng/mL) an ECM-gebundenem bFGF, die unter den gleichen Bedingungen freigesetzt wird, zurückgeführt werden konnte. Endothelzellen der Gefäße und glatte Muskelzellen (EC bzw. SMC) sowie intakte subendotheliale ECM wurden mit 0,1 E/mL der Heparinase 1, 2 oder 3 bei 37°C 1 h inkubiert. Dann wurden zunehmende Mengen des Inkubationsmediums in Gegenwart von 5 ng/mL bFGF zu den F32-Zellen gegeben. 48 Stunden später wurde für 6 h ³H-Thymidin zugegeben, woran sich die Zellernte und die Messung des ³H-Thymidineinbaus anschloss.
Die Vorbehandlung von Gefäßendothelzellen und glatten Muskelzellen mit der Heparinase 3 führte zur Freisetzung von HS-Abbaufragmenten. Im Gegensatz dazu hatten Fragmente, die von der Heparinase 1 oder 2 freigesetzt wurden, keine oder nur eine sehr geringe Wirkung, wie in der 14 gezeigt ist. Ähnliche, mit ECM durchgeführte Studien zeigten eine geringe oder keine Stimulation der bFGF-vermittelten Zellproliferation durch Fragmente, die von der Heparinase 1, 2 oder 3 freigesetzt wurden, über den basalen ³H-Thymidineinbau, der in Gegenwart von bFGF und mit jedem der bakteriellen Enzyme allein erhalten wurde.
Bei der Durchführung dieser Kontrollexperimente wurde eine geringfügige Stimulation der Proliferation von F32-Zellen durch die Heparinase 3 allein oder nach einer Vorinkubation der Heparinase 3, aber nicht der Heparinase 1 oder 2, in normalen Gewebekulturschalen in Abwesenheit von Zellen oder ECM beobachtet. Wie in der 15 gezeigt ist, war diese Stimulation 3-4-mal geringer als diejenige, die vom Medium induziert wurde, das von mit Heparinase 3 behandelten Gefäß-SMC abgenommen worden war. Im Gegensatz zu dem in der 14A gezeigten Effekt von Heparin und von HS-Abbaufragmenten, die von der Zelloberfläche stammten, wurde die Wirkung der Heparinase 3 durch eine 10-minütige Hitzeinaktivierung bei 95°C vor ihrer Zugabe zu den lymphoiden F32-Zellen beseitigt (14B), und zwar unabhängig davon, ob das Heparinase-3-Enzym zuerst auf normalem Gewebekultur-Kunststoff oder auf ECM inkubiert wurde. Dieses Ergebnis zeigt, dass das Enzym aktiv sein muss und/oder seine native Konfiguration behalten muss, um eine mitogene Reaktion zu induzieren. In einem Versuch aufzuklären, ob das Heparinase-3-Enzym stimulatorische HS-artige Fragmente von der Oberfläche der F32-Zellen freisetzt, wurden F32-Zellen zunächst mit der Heparinase 3 (30 min, 0,1 E/mL, 37°C) behandelt, und dann wurde der Überstand mit oder ohne eine Hitzeinaktivierung bezüglich eines stimulatorischen Effektes auf frische, unbehandelte lymphoide F32-Zellen getestet. Wieder wurde der ³H-Thymidineinbau durch die Heparinase 3 stimuliert, unabhängig davon, ob das Enzym zuerst mit F32-Zellen inkubiert wurde, und diese Stimulation wurde durch eine Hitzeinaktivierung beseitigt. In anderen Experimenten wurde das Heparinase-3-Enzym auf DEAE-Cellulose aufgetragen, um Spuren von Heparin zu entfernen, die das Enzym kontaminiert haben könnten. Wie in der 14B gezeigt ist, hatte diese Behandlung keine Wirkung auf die stimulatorische Aktivität der Heparinase 3, beseitigte aber vollständig die Wirkung von Standardheparin (14A). Zusammengenommen legen diese Kontrollexperimente nahe, dass das native Heparinase-3-Enzym selbst imstande ist, eine Rezeptorbindung des bFGF und eine Aktivierung im F32-Zellsystem zu stimulieren.
Freisetzung von an die ECM und die Zelloberfläche gebundenem bFGF. Wie durch die 13B gezeigt ist, führte die Exposition der ECM gegen die Heparinasen 2 und 3 und, in einem viel geringeren Ausmaß, gegen die Heparinase 1 zur Freisetzung einer wachstumsfördernden Aktivität für wachstumsarretierte 3T3-Fibroblasten. Die tatsächlichen Mengen des aus den Zellen und der ECM durch die Heparinasen 1, 2 und 3 freigesetzten bFGF wurden mittels eines Immunoassays bestimmt (R&D Quantikine^TM human bFGF). Wie in der Tabelle 5 gezeigt ist, war die durch die Heparinase 3 aus der ECM freigesetzte Menge des bFGF ungefähr 2,5- und 15-fach höher als diejenige, die durch die Heparinase 2 bzw. die Heparinase 1 freigesetzt wurde, in Korrelation mit der mitogenen Aktivität, die vom jeweiligen Inkubationsmedium ausgeübt wurde (13B). Die Mengen des ECM-gebundenen bFGF, die einer Freisetzung durch die Heparinase 3 zugänglich waren, waren 6- bis 7-mal höher als diejenigen, die auf der Oberfläche der Gefäßendothelzellen und der glatten Muskelzellen verfügbar waren (Tabelle 5). Die Mengen an bFGF, die aus Gefäßendothelzellen durch die Heparinasen 1 und 2 freigesetzt wurden, waren höher als diejenigen, die aus glatten Gefäßmuskelzellen freigesetzt wurden.
Es wurde die Fähigkeit von drei bakteriellen Heparin/HS-abbauenden Enzymen verglichen, aus Zellen und ECM sowohl HS-gebundenen bFGF als auch HS-Abbaufragmente, die die mitogene Aktivität des bFGF unterstützen, freizusetzen. Tatsächliche Messungen des freigesetzten bFGF und der Stimulierung des ³H-Thymidineinbaus in wachstumsarretierte 3T3-Fibroblasten und lymphoide F32-Zellen ohne HS zeigten eindeutig, dass die Heparinase 3 das aktivste wachstumsfördernde Enzym war. Die Überlegenheit der Heparinase 3 wurde am deutlichsten im F32-Zellsystem gezeigt. In diesem System werden HS-Abbaufragmente bezüglich ihrer Fähigkeit zur Bindung von bFGF und zur Präsentation für seinen hochaffinen Tyrosinkinaserezeptor, die zur Rezeptoraktivierung und Zellproliferation führt, untersucht. Es wurde gefunden, dass HS-Fragmente, die von Zelloberflächen durch die Heparinase 3, aber nicht durch die Heparinase 1 oder 2 freigesetzt wurden, imstande waren, als Hilfsrezeptoren zu fungieren, die an einem dualen Rezeptormechanismus teilhaben, der charakteristisch für bFGF und andere Mitglieder der heparinbindenden Familie wachstumsfördernder Faktoren ist. Im Gegensatz dazu war nur eine geringe oder keine derartige Aktivität mit HS-Fragmenten assoziiert, die durch die Heparinase 3 aus der subendothelialen ECM freigesetzt wurden. Dieses Ergebnis unterstützt frühere Beobachtungen, die zeigten, dass, während HS in der ECM ein recht inertes Depot für bFGF in der Nachbarschaft von Zellen, die auf ihn ansprechen, bildet, HS auf Zelloberflächen eine aktivere Rolle bei der tatsächlichen Verdrängung von ECM-gebundenem bFGF und seiner nachfolgenden Präsentation für hochaffine Zelloberflächenrezeptoren spielen könnte (Bernfield, M. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 638, 182-194 (1991)).
Diese Studien demonstrieren den Vorteil der Anwendung der Heparinase 3 im Vergleich zu den Heparinasen 1 und 2 bezüglich der Freisetzung i) der höchsten Menge an ECM- gebundenem bFGF und ii) von HS-Abbaufragmenten, die imstande sind, die Rezeptorbindung und die Aktivierung von bFGF in Zellen ohne HS zu fördern. Überraschenderweise zeigten Kontrollexperimente, bei denen jedes der bakteriellen Enzyme allein eingesetzt wurde, dass die Heparinase 3 selbst die wachstumsfördernde Aktivität von bFGF im F32-Zellsystem stimuliert. Im Gegensatz zur Wirkung von Heparin und HS-Abbaufragmenten wurde diese Stimulation durch eine Hitzeinaktivierung beseitigt, und sie wurde nicht durch DEAE-Cellulose entfernt, was eine Induktion durch das Heparinase-3-Protein und nicht durch heparinartige Moleküle anzeigt, die mit der Heparinase-3-Präparation assoziiert sein könnten.
Beispiel 15: Wundheilung in den Modellen der normalen und der vorgeschädigten Ratte
Die Wirksamkeit der Heparinase 3 bezüglich der Stimulierung der Wundheilung in vivo wurde mittels eines Modells mit Ratten mit beeinträchtigtem Immunsystem getestet (Mustoe et al., Science 237: 1333-1336 (1987)). Sprague-Dawley-Ratten wurden durch das Zufügen eines 5,0 cm langen linearen Schnittes durch die volle Dicke der Rückenhaut verletzt. Es wurden 0,2 mL des Trägers oder des Testagens auf die verletzte Stelle aufgetragen, und die Wunde wurde mit vier (4) Nähten aus 3-0-Seide in Abständen von 1 cm geschlossen. Den Ratten wurde ungefähr 5 bis 6 Stunden nach der Verletzung für 5 bis 7 Tage nach der Erholung ein Elisabethanischer Kragen angelegt.
Es wurde ein Carboxymethylcellulosegel (Carbopol) als Träger verwendet. Die Heparinase 3 wurde wie oben beschrieben zum Träger gegeben. Die Tabelle 5 gibt das Behandlungsschema für die einzelnen Testgruppen an. Gruppen des Testsystems:

N, Modell der normalen Ratte; 1, Modell der vorgeschädigten Ratte (30 mg/kg Methylprednisolon, Depo-Medrol^®); L, linksseitige Wunde; R, rechtsseitige Wunde
*, drei Anwendungen (Tag 0, Tag 1 und Tag 2)
**, sieben Anwendungen (Tag 0 bis Tag 6)

Die Wundheilung wurde auf der Basis der Vereinigung der Wundränder und der physikalischen Aspekte der Wunde beurteilt. Bezüglich der Coaptation wurden 3 Punkte/Schnitt vergeben für coaptierte Ränder, 2 Punkte/Schnitt für eine Coaptation von weniger als oder gleich 2 mm und 1 Punkt/Schnitt für eine Coaptation für mehr oder gleich 2 mm. Für die Bewertung der physikalischen Aspekte der Wunde wurden 5 Punkte/Schnitt vergeben für eine offensichtliche Heilung und/oder ein Verschwinden des Schorfs, 4 Punkte/Schnitt für trockenen Schorf, 3 Punkte/Schnitt für frischen Schorf, 2 Punkte/Schnitt für eine feuchte Wunde und 1 Punkt/Schnitt für eine frische Wunde. Die Beurteilung der Wunde wurde täglich vom Tag 1 bis zu dem Tag, an dem die Tiere getötet wurden, notiert.
Die Heilung wurde weiterhin auf der Basis der Zugfestigkeit der Wunde beurteilt. Nach der Tötung wurden den Testtieren Hautabschnitte, die den Ort der Wunde enthielten, entnommen. Die Zugfestigkeit der Wunde wurde mit Hilfe des Tensometers 55 MN Mini Merlin^TM gemessen.
Eine einzige intramuskuläre Injektion von Methylprednisolon (30 mg/kg), zwei Tage vor der Verletzung, führte zu einer signifikanten Verminderung (59 %) der Wundheilungsprozesse, wie anhand der Zugfestigkeit der Wunde in Hautabschnitten der vorgeschädigten Gruppe (Gruppe 2: linke Seite: 0,735 ± 0,351 g/mm², rechte Seite: 0,919 ± 0,368 g/mm²) im Vergleich zu derjenigen der normalen Gruppe (Gruppe 1: linke Seite: 2,007 ± 0,888 g/mm², rechte Seite: 1,989 ± 0,562 g/mm²) (p = 0,0001) bestimmt wurde, wie in der 16 gezeigt ist.
Im Modell der normalen Ratte führte eine einzige Verabreichung der Heparinase 3 am Tage 0 (Gruppe 3: rechte Seite: 1,968 ± 0,749 g/mm²) nicht zu einer signifikanten Verbesserung des Messwertes der mittleren Zugfestigkeit der Wunde im Vergleich zu dem für eine einzige Applikation einer Dosis des Vehikels erhaltenen (Gruppe 3: linke Seite: 1,826 ± 0,804 g/mm²). Im Modell der vorgeschädigten Ratte, die mit Methylprednisolon behandelt war, führte eine einzige Applikation des Trägers am Tage 0 (Gruppe 4: linke Seite: 0,774 ± 0,265 g/mm²) zu einem Messwert für die Zugfestigkeit der Wunde, der bei 40 % im Vergleich zu demjenigen der normalen Ratten lag (1,941 ± 0,752 g/mm², Mittelwert aller Messungen der Zugfestigkeiten der Wunden der normalen Ratten: linke und rechte Seiten der Gruppe 1 und linke Seite der Gruppe 3). Eine einzige Applikation der Heparinase 3 am Tage 0 (Gruppe 4: rechte Seite: 1,253 ± 0,623 g/mm²) führte zu einem Messwert für die Zugfestigkeit der Wunde, der bei 65 % von demjenigen der normalen Ratten lag.
Im Modell der vorgeschädigten Ratte führten drei Verabreichungen des Trägers an aufeinanderfolgenden Tagen (Gruppe 5: linke Seite: 0,682 ± 0,301 g/mm²) zu einem Messwert der mittleren Zugfestigkeit der Wunde, der bei 35 % von demjenigen der normalen Ratten lag, im Vergleich zu 68 % für drei Verabreichungen von Heparinase 3 (Gruppe 5: rechte Seite: 1,322 ± 0,543 g/mm²). Im Modell der vorgeschädigten Ratte führten sieben Verabreichungen des Trägers (Gruppe 6: linke Seite: 0,850 ± 0,812 g/mm²) zu einem Messwert für die Zugfestigkeit der Wunde, der bei 44 % von demjenigen der normalen Ratten lag, im Vergleich zu 62 % für sieben Verabreichungen der Heparinase 3 (Gruppe 6: rechte Seite: 1,206 ± 0,655 g/mm²).
Beispiel 16: Vergleich der Heparinase 3 und Dosisabhängigkeit der Wirkung der gereinigten Heparinase 3 bezüglich der Wundheilung in Modellen mit normalen und Glucocorticoid-behandelten Ratten
Die im Beispiel 15 beschriebene Untersuchung wurde unter Verwendung verschiedener Chargen des Heparinase-3-Enzyms (Lot hep3.00123) in Konzentrationen von 0,02, 0,2 oder 2,0 IE/Wunde wiederholt. Außerdem wurde PBS anstelle des Trägers aus dem Carboxymethylcellulosegel, der in Beispiel 15 verwendet wurde, als Träger eingesetzt. Die Behandlung der einzelnen Tiere sah folgendermaßen aus.

N, Modell der normalen Ratte; 1, Modell der vorgeschädigten Ratte (30 mg/kg Methylprednisolon, Depo-Medrol^®); L, linksseitige Wunde; R, rechtsseitige Wunde; WTS, Analyse der Zugfestigkeit der Wunde (Wounded Tensile Strength Analysis); Hep, Heparinase 3; Hep-P, Heparinase 3 – gereinigt

Eine einzige Injektion von Methylprednisolon (30 mg/kg), zwei Tage vor der Verletzung, führte zu einer starken Verminderung (46 %) des Wundheilungsprozesses, wie es anhand der mittleren Zugfestigkeit der Wunde für Hautabschnitte der vorgeschädigten Gruppe (Gruppe 2, linke Seite: 0,70 ± 0,09, ± 0,28 g/mm², rechte Seite: 0,99 ± 0,09, ± 0,28 (Mittelwert ± SE, ± SD)) im Vergleich zu derjenigen der normalen Gruppe (Gruppe 1, linke Seite: 1,52 ± 0,12, ± 0,57 g/mm², rechte Seite: 1,59 ± 0,13, ± 0,64 g/mm²) bestimmt wurde, wie in der 17 und der Tabelle 6 gezeigt ist.
Im Modell der vorgeschädigten Ratte führten drei Verabreichungen des Trägers (Gruppe 3, linke Seite: 0,71 ± 0,07, ± 0,32 g/mm²) zu einem Messwert für die mittlere Zugfestigkeit der Wunde, der eine Beeinträchtigung um 54 % gegenüber demjenigen der normalen Ratten darstellte (Mittelwert aller Messungen der Zugfestigkeiten der Wunde: linke und rechte Seiten der Gruppe 1: 1,55 ± 0,09, ± 0,60 g/mm²). Drei Verabreichungen der Heparinase (Heparinase 3, Lot HEPIII RH-67) führten zu einem mittleren Messwert für die Zugfestigkeit der Wunde, der eine Beeinträchtigung um 47 % gegenüber demjenigen der normalen Ratten darstellte. Die Verabreichung von Heparinase führte zu einer Aufhebung des Schädigungseffektes um 7 %, wie in der 17 und der Tabelle 6 gezeigt ist.
Im Modell der vorgeschädigten Ratte führten drei Verabreichungen des Trägers (Gruppe 4, linke Seite: 0,89 ± 0,09, ± 0,42 g/mm²) zu einem mittleren Messwert für die Zugfestigkeit der Wunde, der eine Beeinträchtigung um 43 % gegenüber demjenigen der normalen Ratten darstellte. Drei Verabreichungen von Hep-P (Heparinase 3, Lot HEPIII.001) in der Dosis 1 (0,02 IE/200 μL) führten zu einem mittleren Messwert für die Zugfestigkeit der Wunde, der eine Beeinträchtigung um 35 % gegenüber demjenigen der normalen Ratten darstellte. Die Verabreichung von Hep-P in der Dosis 1 führte zu einer Aufhebung des Schädigungseffektes um 8 %, wie in der 17 und der Tabelle 6 gezeigt ist.
Im Modell der vorgeschädigten Ratte führten drei Verabreichungen des Trägers (Gruppe 5, linke Seite: 0,74 ± 0,04, ± 0,17 g/mm²) zu einem Messwert für die mittlere Zugfestigkeit der Wunde, der eine Beeinträchtigung um 53 % gegenüber demjenigen der normalen Ratten darstellte. Drei Verabreichungen von Hep-P (Heparinase 3, Lot HEPIII.001) in der Dosis 2 (0,20 IE/200 μL) führten zu einem mittleren Messwert für die Zugfestigkeit der Wunde, der eine Beeinträchtigung um 26 % gegenüber demjenigen der normalen Ratten darstellte. Die Verabreichung von Hep-P in der Dosis 2 führte zu einer Aufhebung des Schädigungseffektes um 27 %, wie in der 17 und der Tabelle 6 gezeigt ist.
Im Modell der vorgeschädigten Ratte führten drei Verabreichungen des Trägers (Gruppe 6, linke Seite: 0,72 ± 0,10, ± 0,30 g/mm²) zu einem mittleren Messwert für die Zugfestigkeit der Wunde, der eine Beeinträchtigung um 54 % gegenüber demjenigen der normalen Ratten darstellte. Drei Verabreichungen von Hep-P (Heparinase 3, Lot HEPIII.001) in der Dosis 3 (2,00 IE/200 μL) führten zu einem mittleren Messwert für die Zugfestigkeit der Wunde, der eine Beeinträchtigung um 4 % gegenüber demjenigen der normalen Ratten darstellte. Die Verabreichung von Hep-P in der Dosis 3 führte zu einer Aufhebung des Schädigungseffektes um 50 %, wie in der 17 und der Tabelle 6 gezeigt ist. Tabelle 6: ZUGFESTIGKEIT DER WUNDE (g/mm²)

Claims

Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Wundheilung über die Freisetzung von heparinbindenden Wachstumsfaktoren und von Molekülen der extrazellulären Matrix, die Entfernung von Chondroitinsulfat von Zelloberflächenrezeptoren und/oder die Entfernung der Heparansulfatkomponente ihres Wachstumsfaktorrezeptor-Komplexes, wobei die Zusammensetzung umfasst ein bakterielles Glycosaminoglycan-abbauendes Enzym, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus der Heparinase 1 von Flavobacterium heparinum, der Heparinase 2 von Flavobacterium heparinum, der Heparinase 3 von Flavobacterium heparinum, der Chondroitinase AC von Flavobacterium heparinum und der Chondroitinase B von Flavobacterium heparinum, Heparinase von Bacteroides-Stämmen, Heparinase von Flavobacterium Hp206, Heparinase von Cytophagia-Species, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Proteus vulgaris, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Microcossus, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Vibrio-Species, Chondroitinsulfatabbauenden Enzymen von Arthrobacter aurescens, wobei diese Enzyme von rekombinanten, in Bakterien exprimierten Nucleotidsequenzen exprimiert werden, und Kombinationen von diesen, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für eine lokalisierte Verabreichung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Träger ein pharmazeutisch annehmbarer Träger für eine topische Verabreichung ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Träger eine Salbe, eine Polymerfolie, ein Gel, ein Mikropartikel, eine Mikrokapsel, ein Liposom, ein Proteosom, ein Liposphere, ein Implantat, ein transdermales Pflaster oder eine Bandage ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Enzym in eine polymere Matrix inkorporiert ist.
Zuführungsvehikel für die Zuführung von einem, und umfassend ein, Enzym in Kombination mit dem Träger in einer Dosierung, die wirksam ist, die Wundheilung über die Freisetzung von heparinbindenden Wachstumsfaktoren und von Molekülen der extrazellulären Matrix, die Entfernung von Chondroitinsulfat von Zelloberflächenrezeptoren und/oder die Entfernung der Heparansulfatkomponente ihres Wachstumsfaktorrezeptor-Komplexes zu verbessern, wobei das Enzym ein bakterielles Glycosaminoglycan-abbauendes Enzym ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus der Heparinase 1 von Flavobacterium heparinum, der Heparinase 2 von Flavobacterium heparinum, der Heparinase 3 von Flavobacterium heparinum, der Chondroitinase AC von Flavobacterium heparinum und der Chondroitinase B von Flavobacterium heparinum, Heparinase von Bacteroides-Stämmen, Heparinase von Flavobacterium Hp206, Heparinase von Cytophagia-Species, Chondroitinsulfatabbauenden Enzymen von Proteus vulgaris, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Microcossus, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Vibrio-Species, Chondroitinsulfat-abbauenden Enzymen von Arthrobacter aurescens, wobei diese Enzyme von rekombinanten, in Bakterien exprimierten Nucleotidsequenzen exprimiert werden, und Kombinationen von diesen, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei, wenn das Enzym die Heparinase 1, 2 oder 3 von Flavobacterium heparinum ist, die Zusammensetzung dann nicht eine zur Hemmung der Angiogenese an einer ausgewählten Stelle in einem nicht-heparinisierten Patienten wirksame Menge einer Heparinase in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Zuführungssystem nach Anspruch 5, wobei das Zuführungsvehikel ein Katheter oder ein Endoskop ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Glycosaminoglycan-abbauende Enzym ein Fusionsprotein ist.
Verwendung nach Anspruch 1, ferner umfassend ein auf eine Zielstruktur abzielendes Molekül, das spezifisch an eine Zielzelle bindet und das an das Glycosaminoglycanabbauende Enzym gebunden ist, wobei das auf die Zielstruktur abzielende Molekül aus Proteinen, Polysacchariden, Nucleinsäuren oder Lipiden ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das auf eine Zielstruktur abzielende Molekül aus Hormonen, Antikörpern, Integrinen oder Bindungsmolekülen der extrazellulären Matrix, die an Zelloberflächenmoleküle binden, ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Enzym von einer rekombinanten Nucleotidsequenz in einem Organismus exprimiert wird, in dem es natürlicherweise nicht vorkommt, und das Enzym anders prozessiert wird als in dem Organismus, in dem es natürlicherweise nicht vorkommt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung die Wundheilung des Gefäßsystems über die Verhinderung einer Restenose verbessert.
Verwendung eines Zuführungsvehikels gemäß Anspruch 5 oder 6 bei der Herstellung einer Vorrichtung zur Verbesserung der Wundheilung über die Freisetzung von heparinbindenden Wachstumsfaktoren und von Molekülen der extrazellulären Matrix, die Entfernung von Chondroitinsulfat von Zelloberflächenrezeptoren und/oder die Entfernung der Heparansulfatkomponente ihres Wachstumsfaktorrezeptor-Komplexes.
Zusammensetzung, wie sie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 oder 7 bis 10 definiert wird, wobei, wenn das Enzym die Heparinase 1, 2 oder 3 von Flavobacterium heparinum ist, die Zusammensetzung dann nicht eine zur Hemmung der Angiogenese an einer ausgewählten Stelle in einem nicht-heparinisierten Patienten wirksame Menge einer Heparinase in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Zusammensetzung, wie sie im Anspruch 13 definiert wird, wobei der Träger eine Polymerfolie, ein Mikropartikel, eine Mikrokapsel, ein Proteosom, ein Liposom, ein transdermales Pflaster oder eine Bandage ist.