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Diese
Erfindung betrifft Plasma- oder Serumentfettung von tierischem (wobei
dieser Ausdruck Menschen kennzeichnen soll) Blut oder Blutfraktionen.
Insbesondere ist die Erfindung gerichtet auf die Entfernung von
Cholesterin, Triglyceriden und anderen Lipiden sowie fettlöslichen
Toxinen wie beispielsweise Insektiziden aus dem Blutplasma oder
-serum von tierischem Blut.
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Hintergrund des Fachgebiets
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Kardiovaskuläre Erkrankungen
sind in den meisten Industrieländern
für eine
signifikante Zahl an Todesfällen
verantwortlich.
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Arterienverkalkung
ist eine derartige Erkrankung, die durch lokale Fettverdickungen
auf der Innenseite großer
Blutgefäße gekennzeichnet
ist, welche Herz, Gehirn und andere Vitalorgane mit Blut versorgen.
Diese Läsionen
blockieren das Lumen des Gefäßes und
führen
zu Ischämie
des Gewebes, welches durch das Gefäß versorgt wird. Anhaltende
oder plötzliche
Ischämie
kann zu einem klinischen Herzanfall oder Schlaganfall führen, von
welchem sich der Patient erholen oder nicht erholen kann.
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Die
Beziehung zwischen Nahrungslipid (dietary lipid), Serumcholesterin
und Arterienverkalkung ist seit langem anerkannt. In vielen epidemiologischen
Studien wurde gezeigt, dass eine einzige Messung von Serumcholesterin
sich als signifikantes Vorhersagemittel für ein Auftreten einer koronaren
Herzerkrankung bewiesen hat.
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Daher
ist Diät
das grundlegende Element aller Therapien für Hyperlipidämie (überschüssige Menge an
Fett im Plasma). Jedoch erfordert die Verwendung einer Diät als primäres Therapieverfahren
einen großen Aufwand für Mediziner,
Ernährungsberater,
Diätspezialisten
und anderer Fachleute im Gesundheitsbereich.
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Wenn
eine diätische
Veränderung
nicht erfolgreich ist, stellt eine Arzneimitteltherapie eine Alternative dar.
Es stehen mehrere Arzneimittel, welche allein oder in Kombination
verwendet werden, zur Verfügung.
Es gibt jedoch keinen direkten Beweis, dass ein cholesterinsenkendes
Arzneimittel über
einen verlängerten
Zeitraum sicher verabreicht werden kann.
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Eine
Kombination sowohl von Arzneimittel als auch Diät kann erforderlich sein, um
die Konzentration an Plasmalipiden zu verringern. Hypolipidämische Arzneimittel
werden deshalb als Ergänzung
zur diätischen Kontrolle
eingesetzt.
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Viele
Arzneimittel sind bei der Verringerung von Blutlipiden wirksam,
aber keines wirkt bei allen Arten von Hyperlipidämie und alle weisen unerwünschte Nebenwirkungen
auf. Es gibt keinen endgültigen
Beweis, dass hypolipidämische
Arzneimittel zum Rückgang
von Arterienverkalkung führen
können.
Deshalb bleibt trotz Fortschritten beim Erreichen einer Erniedrigung
von Plasmacholesterin zur Verhinderung von Herzerkrankungen durch
Diät, Arzneimitteltherapien,
chirurgische Revaskularisierungsverfahren und Angioplastie Arterienverkalkung
die Haupttodesursache in den westlichen Ländern.
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Angesichts
der obigen Ausführungen
wurden neue Ansätze
gesucht, um die Lipidmenge im Plasma von Homozygoten und dem von
Heterozygoten zu verringern, für
welche orale Arzneimittel nicht wirksam sind.
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Plasmapherese
(Plasmaaustausch)-Therapie wurde entwickelt und umfasst einen Austausch
des Patientenplasmas mit Donorplasma oder öfter üblich einer Plasmaproteinfraktion.
Diese Behandlung kann aufgrund der möglichen Einführung von
Fremdproteinen und der Übertragung
von Infektionserkrankungen zu Komplikationen führen. Darüber hinaus entfernt Plasmaaustausch
sowohl alle Plasmaproteine als auch Lipoproteine mit sehr niedriger
Dichte (VLDL), Lipoproteine mit niedriger Dichte (LDL) und Lipoproteine
mit hoher Dichte (HDL).
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Es
ist bekannt, dass HDL sowohl mit der Schwere von Herzkranzläsionen als
auch mit der Wahrscheinlichkeit, dass diese fortschreiten, invers
korreliert. Eine Entfernung von HDL ist daher nicht vorteilhaft.
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Es
gibt auch bekannte Apharesetechniken, welche LDL aus Plasma entfernen
können.
Diese Techniken umfassen Absorption von LDL an Heparinagarosekügelchen
(Affinitätschromatographie)
oder die Verwendung immobilisierter LDL-Antikörper. Andere Verfahren, welche
gegenwärtig
zur Entfernung von LDL zur Verfügung
stehen, umfassen Kaskadenfiltrationsabsorption an immobilisiertem
Dextransulfat und LDL-Präzipitierung
bei niedrigem pH-Wert in Gegenwart von Heparin. Jedes Verfahren
entfernt spezifisch LDL, aber nicht HDL.
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Die
LDL-Apharese weist jedoch Nachteile auf. Während der Apharese werden signifikante
Mengen anderer Plasmaproteine entfernt und um eine anhaltende Verringerung
von LDL-Cholesterin zu erreichen, muss die LDL-Apharese häufig durchgeführt werden
(bis zu einmal wöchentlich).
Darüber
hinaus kann die LDL-Entfernung kontraproduktiv sein, da niedrige
LDL-Mengen im Blut zu erhöhter
zellulärer
Cholesterinsynthese führen
können.
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Um
das Bedürfnis
nach einem Verfahren zum Erreichen einer Verringerung von Plasmacholesterin
bei homozygotem familiärem
erhöhtem
Cholesteringehalt, heterozygotem familiärem erhöhtem Cholesteringehalt und
Patienten mit erworbenem erhöhtem
Cholesteringehalt zu befriedigen, welches sich von Diät, Arzneimitteltherapie,
LDL-Apharese oder einer Kombination davon unterscheidet, wird im
Fachbereich ein extrakorporales Verfahren zur Lipidentfernung, welches
als „Cholesterinapharese" bezeichnet wird,
beschrieben. Bei der Cholesterinapharese wird Blut aus einem Subjekt
entnommen, Plasma vom Blut abgetrennt und mit einem Lösungsmittelgemisch
gemischt, welches Lipid aus dem Plasma extrahiert, wonach das entfettete
Plasma wieder mit den Blutzellen kombiniert wird und wieder dem
Subjekt zugeführt
wird.
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Ausführlicher
beschrieben, führt
Cholesterinapharese zur Entfernung von Fetten aus Plasma oder Serum.
Jedoch bleiben im Gegensatz zur LDL- Apharese die Proteine, welche das Fett
transportieren (Apolipoproteine) im behandelten Plasma oder Serum
löslich.
Daher liegen die Apolipoproteine von VLDL, LDL und HDL im behandelten
Plasma oder Serum vor. Diese Apolipoproteine, insbesondere Apolipoproteine
A1 aus dem entfetteten HDL im Plasma oder Serum, sind für die Mobilisierung überschüssiger Mengen
an abgeschiedenen Fetten wie beispielsweise Cholesterin in Arterien,
Plaques oder überschüssige Mengen
an Triglyceriden, Fettgewebe, oder fettlöslichen Toxinen, welche im
Fettgewebe vorliegen, verantwortlich. Diese überschüssigen Mengen an Fetten oder
Toxinen werden, gebunden an die neu zusammengesetzten Lipoproteine, in
das Plasma oder das Serum überführt. Daher
werden durch Anwenden eines weiteren Cholesterinapharesearbeitsschritts
diese unerwünschten
Fette oder Toxine nacheinander aus dem Plasma und somit aus dem Körper entfernt.
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Der
Hauptvorteil dieses Arbeitsverfahrens liegt darin, dass LDL und
HDL auf diese Art und Weise nicht aus dem Plasma entfernt werden,
sondern nur Cholesterin, einige Phospholipide und beträchtliche
Triglyceride. Das Patent der Vereinigten Staaten Nr. 4,895,558 beschreibt
ein derartiges System.
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Während durch
Cholesterinapharese die Schwächen
von diätischen
und/oder Arzneimittelbehandlungen und anderen apharetischen Techniken
ausgeräumt
werden können,
stellt die bestehende Vorrichtung zur Cholesterinapharese ein nicht
ausreichend schnelles und sicheres Verfahren bereit. Zur Verwendung
in klinischen Einrichtungen bedarf es einer Vorrichtung, welche
die Entfettung effizienter bewirkt. Darüber hinaus sind zur Cholesterinapharese
eines menschlichen Subjekts Flussraten in der Größenordnung von 70 ml/min erforderlich.
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Deshalb
wurde die Cholesterinapharese, welche im zuvor erwähnten US-Patent Nr. 4,895,558
beschrieben ist, verbessert durch Aufnahme eines Spinners in das
System zur lateralen Verteilung des eintretenden Plasmas in das
extrahierende Lösungsmittel
in Form von feinen Tröpfchen
zur Verbesserung der Trennungseffizienz. Dieses verbesserte System
wird in der internationalen Patentanmeldung mit der Nummer WO 95
03840 A beschrieben.
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Unglücklicherweise
hat die praktische Anwendung gezeigt, dass die oben beschriebenen
Cholesterinapharesesysteme noch immer mehrere Nachteile aufweisen.
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Der
erste Nachteil ist der explosive Charakter der zur Entfettung des
Plasmas verwendeten Lösungsmittel.
Diese Lösungsmittel
befinden sich durch die tatsächliche
Beschaffenheit der kontinuierlichen Systeme in enger räumlicher
Nähe zum
Patienten und zum medizinischen Personal. Dieses Risiko liegt für die Dauer des
Entfettungsverfahrens, welches üblicherweise über mehrere
Stunden läuft,
eindeutig vor.
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Der
zweite Nachteil ist der, dass in den herkömmlichen kontinuierlichen Systemen
ein betriebssicheres Arbeitsverfahren zur vollständigen Entfernung aller bei
der Entfettung verwendeten Lösungsmittel
vor der Rückführung des
behandelten Plasmas zum Patienten nicht zur Verfügung steht.
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Insbesondere
stellt die Verwendung des bevorzugten Lösungsmittels 1-Butanol bei der Entfettung
ein Anliegen dar, da nun festgestellt werden kann, dass das Lösungsmittel
als 1% bis 5% des behandelten Plasmas vorliegen kann, welches dem
Patienten wieder zugeführt
wird. Dies liegt darin begründet,
dass kontinuierliche Systeme nur einen einzigen Waschschritt zur
Entfernung von Lösungsmitteln
wie beispielsweise 1-Butanol umfassen können und es wurde nun herausgefunden,
dass ein einzelner Waschschritt nicht ausreichend ist. Es ist nicht
möglich,
mehrere aufeinander folgende Waschschritte in einem kontinuierlichen
System bereitzustellen, da der Patient ein unannehmbares Blutvolumen
bereitstellen müsste,
um jeden Schritt des Systems insgesamt aufrecht zu erhalten und
der Patient würde
aufgrund der verlängerten
Exposition gegenüber
den Lösungsmitteln
auch einem erhöhten
Risikofaktor ausgesetzt.
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Die
Langzeittoxizität
von 1-Butanol ist unbekannt, insbesondere, wenn es direkt im Blutstrom
vorliegt – es
könnte
die Blut-Hirn-Schranke durchqueren. Zweifellos ist bekannt, dass
externer Kontakt mit diesem Lösungsmittel
Irritation von Schleimmembranen, Kontaktdermatitis, Kopfschmerzen,
Schwindel und Benommenheit verursacht.
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Ein
dritter Nachteil ist der, dass die oben beschriebenen kontinuierlichen
Systeme zur Entfettung von Serum nicht geeignet sind. Wenn Serum
entfettet werden könnte,
läge in
sofern der Vorteil einer vorteilhaften Veränderung der Blutrheologie vor,
dass die Viskosität
im Anschluss an die Entfettung abnimmt, wobei dies zu verbesserter
Hämodynamik
für die
ursprünglich
beeinträchtigte
Blutzirkulation führt.
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Ein
weiterer vierter Nachteil ist der, dass die Entfettung in einem
kontinuierlichen System über
mehrere Stunden hinweg durchgeführt
wird. Abgesehen von der verlängerten
Exposition gegenüber
den schädlichen Lösungsmitteln,
wie oben beschrieben, sind die Ausrüstung und das Personal auf
einen einzigen Patienten festgelegt. Da die Entfernung von Plasma
oder anderen Blutfraktionen und ihre anschließenden Wiederzuführung an
den Patienten als einzelne Schritte jeweils nur weniger Minuten
bedürfen,
wäre es
vorteilhaft, wenn der relativ lang andauernde Entfettungsschritt
außerhalb
durchgeführt
werden könnte,
wodurch der Patient, das medizinische Personal und die Ausrüstung für andere
Sachen freigestellt werden würden.
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Abschließend ist
es in einem kontinuierlichen System eindeutig nur des Patienten
eigene Blutfraktion, die dem Patienten wieder zugeführt werden
kann. Wenn jedoch beispielsweise das Plasma oder Serum des Patienten
entnommen und außerhalb
des Patienten behandelt werden könnte,
könnte
dem Patienten zu einem späteren
Zeitpunkt entweder autologes oder nichtautologes Plasma oder Serum
wieder zugeführt
werden.
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Deshalb
gibt es noch immer Bedarf für
ein effizientes Verfahren zur extrakorporalen Entfernung von Lipiden
aus tierischem Plasma.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die oben beschriebenen
Nachteile auszuräumen
oder wenigstens teilweise zu verbessern durch Bereitstellung eines
Verfahrens zur Entfettung von nicht nur Plasma sondern auch von
Serum oder anderen Blutfraktionen, wobei das Verfahren die Exposition
des Bluts gegenüber
möglicherweise
schädlichen
verwendeten Lösungsmitteln
verringert und auch alle Spuren von Lösungsmittel(en), welche bei
der Entfettung verwendet werden, effizient entfernt.
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Es
ist noch eine andere Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, wobei
Plasma oder Serum außerhalb des
Patienten behandelt werden kann.
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In
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt
zur Entfernung von Cholesterin, Triglyceriden und anderen Lipiden
aus tierischem Plasma, Serum oder anderen geeigneten Blutfraktionen
als diskontinuierliches Fließsystem,
wobei das Verfahren umfasst: Abtrennen der erforderlichen Fraktion
aus dem Blut und Mischen mit einem Lösungsmittelgemisch, welches
die Lipide aus der Fraktion extrahiert, wonach die entfettete Fraktion
wieder mit den Blutzellen kombiniert werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass
der Lösungsmittelextraktionsschritt
abgetrennt und außerhalb
vom Subjekt durchgeführt
wird.
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Insbesondere
wird ein Verfahren bereitgestellt zur extrakorporalen Entfernung
von Lipiden, ausgewählt
aus Cholesterin, Triglyceriden und anderen Lipiden aus tierischem
Plasma, Serum oder anderen geeigneten Blutfraktionen, wobei das
Verfahren umfasst: Bereitstellen von Plasma, Serum oder einer anderen
geeigneten Blutfraktion, Mischen mit einem Extraktionslösungsmittel
oder einem Extraktionslösungsmittelgemisch,
welches die Lipide aus der Fraktion extrahiert, Entfernen des Extraktionslösungsmittels
aus der entfetteten Fraktion durch Mischen den entfetteten Fraktion
mit einem Absorptionsmittel, welches für das Extraktionsmittel spezifisch
ist in Gegenwart gesinterter Kugeln, dadurch gekennzeichnet, dass
das Absorptionsmittel in den Poren der gesinterten Kugeln enthalten
ist.
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Vorzugsweise
werden als Teil des Lösungsmittelextraktionsschritts
beim Mischen der Blutfraktionen mit dem Lösungsmittel Kügelchen
verwendet. Stärker
bevorzugt weisen die Kügelchen
eine Dichte auf, welche im Wesentlichen zwischen der Dichte der
Fraktion und der Dichte des Lösungsmittelgemischs
liegt. Dies stellt ein effizientes Mischen mit einem großen Oberflächenbereich
sowie eine Erhöhung
der Extraktionseffizienz sicher und dient auch als gutes Trennmittel
für das
Plasma vom Lösungsmittel,
wenn Zentrifugation eingesetzt wird, um die Phasen nach der Extraktion
zu isolieren.
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Vorzugsweise
enthalten die Kügelchen
eingeschlossene Luft, um eine Dichte im Wesentlichen zwischen der
Dichte der Fraktion und der Dichte des Lösungsmittelgemischs zu erhalten.
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Stärker bevorzugt
beträgt
die Dichte der Kügelchen
etwa 0,9 g/ml, da die Dichte des Plasmas etwa 1,006 g/ml beträgt und die
verwendeten Lösungsmittel
im Allgemeinen eine Dichte von etwa 0,8 g/ml aufweisen.
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Die
Kügelchen
können
aus einem beliebigen annehmbaren Material wie beispielsweise Glas
oder Kunststoff hergestellt sein.
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Sobald
die sich ergebende entfettete fraktionshaltige Phase isoliert worden
ist, müssen
alle Spuren des Extraktionsmittels entfernt werden, bevor die Fraktion
wieder mit den Blutzellen kombiniert wird.
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Ein
Weg zur Entfernung dieses Lösungsmittels
ist es, mit einem anderen Lösungsmittel
zu waschen, vorzugsweise Diethylether, um so im Wesentlichen vollständig das
ursprüngliche
Lösungsmittel,
welches im Extraktionsschritt verwendet wird, zu entfernen.
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Vorzugsweise
werden vier (4) Waschschritte durchgeführt.
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Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann eine effiziente Entfernung des Extraktionslösungsmittels erreicht werden
durch Mischen der entfetteten Fraktion mit einem Absorptionsmittel,
welches für
das zu entfernende Lösungsmittel
spezifisch ist. Das Absorptionsmittel ist in den Poren gesinterten
Kugeln enthalten.
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Stärker bevorzugt
weisen die gesinterten Kugeln einen Durchmesser von etwa 2 bis 5
mm auf, wobei die Poren der Kugeln einen Durchmesser von weniger
als 50 Å aufweisen.
Am stärksten
bevorzugt sind die Kugeln aus Glas hergestellt.
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Vorzugsweise
sind die Absorptionsmittel, welche in den gesinterten Kugeln verwendet
werden die makroporösen
polymeren Kügelchen
zur Absorption organischer Moleküle
aus wässrigen
Lösungen,
welche von Bio-Rad Laboratories unter dem Handelsnamen Bio-Beads
SM vertrieben werden.
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Wenn
das zur Entfettung der Fraktion verwendete Lösungsmittel 1-Butanol ist, ist
das Absorptionsmittel vorzugsweise Bio-Beads SM-2.
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Vorzugsweise
wird das Absorptionsmittel in einer Kammer gehalten, welche so angepasst
ist, dass es der entfetteten Fraktion ermöglicht wird, wenigstens zweimal
durch oder über
das Absorptionsmittel zu laufen, wenn ein einzelner Durchlauf zur
Entfernung des vollständigen
Lösungsmittels
unzureichend ist.
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Vorzugsweise
wird als Teil des Isolierens der entfetteten fraktionshaltigen Phase,
diese Phase nachfolgend mit einem anderen Lösungsmittel gewaschen, vorzugsweise
Diethylether, um eine wesentliche Menge des ursprünglichen
Lösungsmittels
vor der Behandlung mit dem Absorptionsmittel zu entfernen.
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Stärker bevorzugt
wird die Phase wenigstens drei (3) Mal gewaschen.
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Das
Plasma kann humanes Plasma oder Plasma aus anderen lebenden Tieren
sein. Plasma kann aus menschlichem oder tierischem Blut durch bekannte
Plasmatrenntechniken erhalten werden, welche Zentrifugaltrennung,
Filtration und dergleichen umfassen.
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In ähnlicher
Weise kann Serum oder eine andere lipidhaltige Fraktion aus Menschen
oder anderen lebenden Tieren unter Verwendung bekannter Techniken
erlangt werden.
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Für die Extraktion
geeignete Lösungsmittel
umfassen Gemische aus Kohlenwasserstoffen, Ethern und Alkoholen.
Bevorzugte Lösungsmittel
sind Gemische niederer Alkohole mit niederen Ethern. Die niederen
Alkohole umfassen geeignetermaßen
diejenigen, welche mit dem Plasma nicht nennenswert mischbar sind
und diese können
die Butanole (Butan-1-ol und Butan-2-ol) umfassen. C1-4-Ether
sind ebenfalls bevorzugt und diese können die Propylether (Diisopropylether
und Propylether) umfassen. Andere Lösungsmittel, welche anwendbar
sein können,
umfassen Amine, Ester, Kohlenwasserstoffe und Gemische unter der
Voraussetzung, dass das Lösungsmittel
(1) schnell und vorzugsweise Cholesterin aus dem Plasma entfernen
kann, (2) im Wesentlichen mit dem Plasma nicht mischbar ist, (3)
aus dem Plasma entfernt werden kann und (4) die gewünschten
Gruppen nicht denaturiert. Bevorzugte Lösungsmittelgemische sind Butanol
mit Diisopropylether, diese können
im Verhältnis
von 0%–40%
des Alkohols zu 100%–60%
des Ethers vorliegen.
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Die
folgenden Beispiele veranschaulichen ferner das erfindungsgemäße Verfahren,
welches keine Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers darstellt,
sondern ein Verfahren zur extrakorporalen Entfernung von Lipiden
aus Blut oder Blutfraktionen.
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Materialien und Verfahren
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Tiere
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Die
in dieser Untersuchung verwendeten Hähne stammten aus der White
Leghorn Hiline-Linie und wurden als 1 Tag alte Küken erhalten. Alle Hähne wurden
im Alter von 8 Woche auf Einzelkäfige
versetzt. Wasser und Futter wurden ohne Beschränkungen zugeführt. Im
Alter von 8 Wochen wurden 15 Kontrollvögel mit einer handelsüblichen
Geflügelration
für 31
Tage gefüttert
und einer anderen Gruppe von 30 Vögeln wurden täglich 5
mg Diethylstilboestrol (DES) in Sesamöl über einen Zeitraum von 31 Tagen
subkutan injiziert. Darüber hinaus
wurden sie mit derselben handelsüblichen
Diät, welche
mit 2,6% (w/w) Cholesterin angereichert war, über einen Zeitraum von 31 Tagen
gefüttert.
15 Tiere der DES-behandelten Gruppe wurden anschließend einer Lipidapharese
(LA) unterzogen. 15 Tiere der DES-behandelten Gruppe wurden Scheinbehandlungen
unterzogen. Sobald die LA- oder Scheinbehandlungen eingeleitet worden
waren, wurden alle Tiere mit der Standartgeflügelration gefüttert mit
der Ausnahme, dass während
der tatsächlichen
Behandlung selbst, die Tiere von ihrem Futter für 3 Stunden ferngehalten wurden,
wobei sich Reinfusion ihres autologen Bluts anschloss. Die Tiere
wurden 2 Tage im Anschluss an die vierte Behandlung, LA- oder Scheinbehandlung,
geopfert.
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Lipidaphareseverfahren
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Etwa
25% des berechneten Blutvolumens wurde aus einer Begleitvene der
A. brachialis des Tieres mit einer 21 Gauge-Nadel und einer Spritze
entnommen. Das Gesamtblutvolumen wurde auf 8% des Körpergewichts
geschätzt.
Das Blut wurde in mit Heparin behandelten Röhren gesammelt und sofort bei
900 g für
5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Blutzellen wurden
in einer Menge an Salzlösung
suspendiert, welche zum Plasmavolumen äquivalent war und dem Tier
reinfusioniert. Das Plasma wurde für 12 Stunden eingefroren und
anschließend
für 20
Minuten mit einem Gemisch aus Butanol und Diisopropanolether (DIPE), 25:75
(v/v) in einem Verhältnis
von 1 Volumen Plasma zu 2 Volumen Butanol-DIPE-Gemisch (organische
Phase) entfettet. Inerte Kunststoffkügelchen mit einer Dichte von
0,9 g/ml (1 g) wurden zu dem Gemisch gegeben. Nach Extraktion wurde
das Gemisch bei 900 g für
2 Minuten zentrifugiert, um das Plasma und die organischen Phasen
zu trennen. Die organische Phase (obere Schicht) wurde entfernt,
frei von Plasmaphase, durch vorsichtiges Absaugen mit einer Pasteur-Pipette
unter Vakuum. Spuren von Butanol in der Plasmaphase wurden mit 4
Volumen Diethylether (DEE) für
2 Minuten durch Kopfüberrotation
bei 30 Upm ausgewaschen. Das Gemisch wurde anschließend bei
900 g für
2 Minuten zur Trennung von Plasma- und Etherphasen zentrifugiert. Die
Etherphase wurde anschließend
durch Absaugen mit einer Pasteur-Pipette entfernt. Zurückgebliebener Ether
wurde durch Evakuierung mit einem Wasserpumpensaugapparat bei 37 °C entfernt.
Das Plasma wurde anschließend
durch eine 5 ml-Säule
geleitet, welche Bio-Beads SM-2 enthielt.
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Dieses
Arbeitsverfahren ergab entfettetes Plasma. Das entfettete Plasma
wurde wieder mit den Blutzellen einer nachfolgenden 25% Blutspende
vermischt und wurde anschließend
durch eine Begleitvene der A. brachialis in die identischen Donortiere
reinfusioniert. Die Dauer des gesamten Arbeitsverfahrens, d.h. Entnahme
von Blut aus dem Tier bis zur Reinfusion des behandelten Bluts zurück in das
Tier, betrug etwa 1 Stunde. Nach der vierten Lipidapharesebehandlung
wurden die Tiere geopfert und ihre Leber und Aorta wurde seziert. Die
LA-Behandlungsverfahren wurden dreimal nach der ersten Behandlung
wiederholt.
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Scheinbehandlungsverfahren
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Dieses
war im Wesentlichen das Gleiche wie das LA-Arbeitsverfahren mit
Ausnahme der Plasmaentfettung mit den organischen Lösungsmitteln.
Das Blut wurde in mit Heparin behandelten Röhren gesammelt und sofort bei
900 g für
5 Minuten zentrifugiert. Das Plasma wurde von den Blutzellen abgetrennt.
Die Blutzellen wurden mit Salzlösung
im gleichen Volumen wie das gewonnene Plasma gemischt und in das
Tier reinfusioniert. Das Plasma wurde für 12 Stunden eingefroren und
anschließend
wieder mit Blutzellen einer nachfolgenden 25% Blutspende vermischt
nach der zweiten und/oder nachfolgenden Plasmaabtrennungen. Nach
der vierten Lipidapharesebehandlung wurden die Tiere geopfert und
ihre Lebern und Aorten wurden seziert. Die Scheinbehandlungsverfahren
wurden nach der ersten Behandlung dreimal wiederholt.
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Gewebelipidpräparation
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Die
Lebern wurden gewogen, mit einer Skalpellklinge zerkleinert und
in einer 0,9% Natriumchloridlösung
durch 10 bis 12 Läufe
eines motorgetriebenen Teflonglashomogenisierers (1900 Upm) homogenisiert. Die
Aorta wurde gewogen und das Dreifache ihres Gewichts an 3 mm Glaskügelchen
wurde in eine Homogenisierungsflasche zugegeben, welche 0,9% Natriumchlorid
enthielt. Der Gesamtinhalt wurde anschließend für eine Minute homogenisiert.
Das Lipid aus den homogenisierten Leber- und Aortaproben wurde durch
das Folch-Arbeitsverfahren extrahiert und gewogen. Tabelle
1 Wirkung von LA- und Scheinbehandlungen auf die Gesamtlipidkonzentration
in Leber und Aorta von hyperlipidämischen Hähnen.
- * Gesamtlipidkonzentrationen
ausgedrückt
als g Lipid pro 100 g Gewebe, Mittelwert ± SD
- b,c p-Werte waren < 0,05, wenn Scheinbehandlungen mit
LA-Behandlungen verglichen wurden.
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Es
lagen keine statistischen Unterschiede zwischen den Werten entsprechender
Gewebe in der unbehandelten Kontrollgruppe und der LA-behandelten Gruppe
vor.
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Alle
Tiere wurden zwei Tage nach der abschließenden Apharesebehandlung geopfert.
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Menschen
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Patienten
wurden den Plasmaphereseverfahren unterzogen, wobei bekannte intravenöse Techniken und
Plasmapheresesysteme verwendet wurden.
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Plasmapherese
wird unter Verwendung einer Vene-zu-Vene oder einer arteriovenösen Fistel
in den Unterarm von Patienten durchgeführt. Heparin wird zu Beginn
des Verfahrens als ein Bolus mit 5000 Einheiten verabreicht und
anschließend
durch kontinuierliche Infusion mit einer Rate von 700 Einheiten
pro Stunde über den
Verlauf des Verfahrens. Zugang durch die Anticubitalvenen sollte
Plasmaflussraten von 25 bis 40 ml pro Minute bereitstellen.
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Das
einem Patienten entnommene Blut wird unmittelbar mit ACD-A (Antikoagulierungsmittel)
in einem Verhältnis
zwischen 1:8 und 1:16 (ACD-A:Blut)
behandelt. Das Plasma wird aus dieser Lösung unter Verwendung einer
herkömmlichen
Plasmapheresemaschine abgetrennt.
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Fünfundzwanzig
Prozent Plasma werden aus dem Patienten entfernt. Dies entspricht
einem Prozent des Idealkörpergewichts.
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Nur
das erste Volumen der Plasmaspende wird im Patienten mit Plasmaersatzflüssigkeit
ersetzt.
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Das
Plasma wird für
bis zu zwölf
Stunden vor der Reinfusion von entfettetem Plasma im Austausch mit
weiteren fünfundzwanzig
Prozent Plasmaspende (wöchentlich
oder zweiwöchentlich)
eingefroren.
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Das
Plasma wird entfettet und das entfettete Plasma wird getestet, um
sicherzustellen, dass alles Lösungsmittel
entfernt worden ist, bevor das sauber entfettete Plasma gegen neues
unbehandeltes Plasma ausgetauscht wird.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das kontinuierliche Blutflusssystem,
welches im US-Patent Nr. 4,895,558 beschrieben ist, zu einem diskontinuierlichen
System modifiziert, dadurch, dass das entsprechende, zu behandelnde
Blutvolumen an einer Stelle außerhalb
des Patienten einer Entfettung unterzogen wird.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das kontinuierliche Blutflusssystem,
welches in der internationalen Patentveröffentlichung mit der Nr. WO/95
03840 A beschrieben ist, modifiziert zu einem diskontinuierlichen
System durch Dispergieren des Plasmas in kleine Tröpfchen in
das Lösungsmittel
mittels Dispersionsmitteln außerhalb
des Patienten.
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In
den beiden oben beschriebenen Ausführungsformen kann der Extraktionsschritt
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung umfassen: entweder mehrfaches Waschen
der extrahierten Phase und/oder Verwenden eines Absorptionsmittels.
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Beispielsweise
wird das Plasma entfettet mit einem Lösungsmittelgemisch, umfassend
1-Butanol und Diisopropylether. Die entfettete Fraktion wird anschließend dreimal
(3) oder viermal (4) mit Dieethylether gewaschen. Nach dem abschließenden Waschschritt
wird der Dieethylether durch Zentrifugation und Vakuumextraktion
bei 37 °C
entfernt. Die gesinterten Kugeln, welche Bio-Beads SM-2 enthalten,
werden anschließend mit
dem entfetteten Plasma zur Entfernung der letzten Spuren von 1-Butanol
gemischt.
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Schlussfolgerungen
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DES-Verabreichung
an Hähne
führte
zu einer signifikanten Menge an Fett (Lipid)-Akkumulierung in den
Lebern und Aorten.
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Diskontinuierliche
LA-Behandlungen, entsprechend etwa einem Plasmavolumen, das durch
vier Anwendungen eines 25% Plasmavolumens, welches pro Anwendung
behandelt wurde, behandelt wurde, führten in hyperlipidämischen
Tieren zu signifikanten Abnahmen sowohl hinsichtlich hepatischer
als auch aortischer Lipide. Darüber
hinaus zeigten die LA- behandelten
hyperlipidämische
Tiere am Ende Lipidwerte, welche denen von Kontrolltieren ähnlich waren.
- i. Diese Experimente zeigten, dass überschüssige Mengen
an Körperfetten
in Form von Fettgewebe (Triglyceriden) in der Leber durch LA entfernt
werden können;
und, dass
- ii. ein Rückgang
von Arterienverkalkung durch LA-Behandlungen auftritt.
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Ähnliche
Ergebnisse können
für menschliche
Patienten erwartet werden.
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Durch
Anpassen der Verfahren aus dem Stand der Technik an diskontinuierliche
Flusssysteme, kann die vorliegende Erfindung jegliche Gefahr für Patienten
und für
medizinisches Personal, welche aus dem explosiven Charakter der
verwendeten Lösungsmittel
herrührt,
ausschließen
oder wenigstens signifikant verringern.
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Darüber hinaus
können
durch Verwendung der verbesserten Lösungsmittelextraktionsverfahren
der vorliegenden Erfindung alle der möglicherweise giftigen Extraktionslösungsmittel
entfernt werden.
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Das
verbesserte Lösungsmittelextraktionsverfahren
der vorliegenden Erfindung ist auch nicht auf Plasmaentfettung beschränkt, sondern
ist auch zur Entfettung von Serum geeignet.
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Die
vorliegende Erfindung ist ein diskontinuierliches System.
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Es
ist bereits bekannt, dass Plasma oder Serum gesammelt und unter
sterilen Bedingungen in einem Kühlschrank
oder in einem Gefrierschrank für
ausgedehnte Zeitspannen gelagert werden können.
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Diese
Möglichkeit
führt zu
besonderen Vorteilen wie beispielsweise dem ermöglichtem Führen einer Plasma- oder Serumbank,
welche frei von jeglicher Infektion und jeglichen fettlöslichen
Toxinen ist, welche entfettet werden können und gegen Plasma der Serum,
wie erforderlich, ausgetauscht werden können.
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Die
Ausführungsformen
werden nur mittels veranschaulichender Beispiele beschrieben und
es können
verschiedene Veränderungen
und Modifizierungen davon durchgeführt werden ohne vom Bereich,
wie er in den folgenden Ansprüchen
definiert ist, abzuweichen.
