DE69535746T2

DE69535746T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Quantifizierung eines Substrats in einer flüssigen Probe mit einem Biosensor

Info

Publication number: DE69535746T2
Application number: DE69535746T
Authority: DE
Inventors: Shin Katano-shi Ikeda; Toshihiko Hirakata-shi Yoshioka; Shiro Hirakata-shi Nankai
Original assignee: Panasonic Corp
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1995-07-10
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2015-07-11
Also published as: EP1352969B1; EP1352969A1; CA2153350C; US5582697A; EP0732406A1; DE69535746D1; CA2153350A1; DE69533666D1; DE69533666T2; EP0732406B1

Description

1. Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Quantifizieren eines Substrats durch Verwenden eines Biosensors, der einfach ein Substrat (eine bestimmte Komponente) in einer Probenflüssigkeit schnell und genau quantifizieren kann. Genauer bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Quantifizieren eines Substrats durch Verwenden eines Biosensors, der ein Substrat in einer Probenflüssigkeit durch elektrochemisches Messen der Menge eines Elektronen-Akzeptors quantifizieren kann, der durch ein Elektron reduziert worden ist, das in einer Reaktion zwischen dem Substrat in der Probenflüssigkeit und einer Oxidoreduktase erzeugt wurde, die spezifisch mit dem Substrat reagiert.
2. Beschreibung des Standes der Technik:
Das optische Rotationsverfahren, das kolorimetrische Verfahren, das reduktometrische Verfahren und weitere Verfahren, die verschiedene Arten von Chromatographien verwenden, wurden als Verfahren für eine quantitative Analyse von Sacchariden wie etwa Saccharose und Glukose entwickelt. Keines dieser Verfahren kann jedoch wegen der relativ geringen Spezifität gegenüber Sacchariden eine hohe Genauigkeit bieten. Unter diesen Verfahren ist das optische Rotationsverfahren einfach durchzuführen, es wird jedoch durch die Betriebstemperatur stark beeinflusst. Somit ist es für eine allgemeine Verwendung zu Hause und dergleichen nicht geeignet.
In letzter Zeit wurden verschiedene Typen von Biosensoren entwickelt, die eine spezifische Katalyse eines Enzyms nutzen. Als ein Beispiel für Verfahren zum Quantifizieren eines Substrats in einer Probenflüssigkeit wird nun ein Verfahren zum Quantifizieren von Glukose beschrieben. Zum elektrochemischen Quantifizieren von Glukose ist ein Verfahren allgemein bekannt, das Glukose-Oxidase (EC1.1.3.4; nachfolgend als GOD bezeichnet) und eine Sauerstoffelektrode oder eine Wasserstoffperoxid-Elektrode verwendet (beispielsweise "Biosensor", herausgegeben von Shuichi Suzuki, Kodansha Kabushiki Kaisha).
GOD oxidiert gezielt β-D-Glukose zu D-Glukono-δ-Lacton durch Verwendung von Sauerstoff als einen Elektronen-Akzeptor. In einer Oxidationsreaktion unter der Verwendung von GOD in der Anwesenheit von Sauerstoff wird Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. Bei dem zuvor erwähnten Verfahren wird die Menge an reduziertem Sauerstoff durch Verwendung einer Sauerstoffelektrode gemessen, oder die Menge der Wasserstoffperoxid-Zunahme wird durch Verwendung einer Wasserstoffperoxid-Elektrode gemessen. Da die Mengen des reduzierten Sauerstoffs und der Wasserstoffperoxid-Zunahme proportional zum Glukosegehalt in der Probenflüssigkeit sind, kann anhand der Menge des reduzierten Sauerstoffs oder der Wasserstoffperoxid-Zunahme Glukose quantifiziert werden.
Das zuvor erwähnte Verfahren weist jedoch ein Problem dahingehend auf, dass das Messergebnis durch die Sauerstoffkonzentration in der Probenflüssigkeit stark beeinflusst wird, wie aus dem Reaktions-Prozess zu vermuten ist. Ferner kann das zuvor erwähnte Verfahren nicht eingesetzt werden, wenn in der Probenflüssigkeit kein Sauerstoff enthalten ist.
Um dieses Problem zu lösen, wurde ein neuer Typ eines Glukosesensors entwickelt, bei dem eine organische Komponente wie etwa Ferrizyankalium, ein Ferrocen-Derivat und ein Chinon-Derivat oder ein Metallkomplex als ein Elektronen-Akzeptor anstelle von Sauerstoff verwendet wird. Bei diesem Sensortyp wird die reduzierte Form eines Elektronen-Akzeptors, der aus der enzymatischen Reaktion resultiert, an einer Elektrode oxidiert, und die in einer Probenflüssigkeit enthaltene Glukosekonzentration wird anhand der Höhe des gemessenen Oxidationsstroms erhalten. Durch Verwenden einer organischen Komponente oder eines Metallkomplexes als ein Elektronen-Akzeptor anstelle von Sauerstoff ist es möglich, eine bekannte Menge von GOD und ihrem Elektronen-Akzeptor an einer Elektrode stabil und genau zu halten, um so eine Reaktionsschicht auszubilden. In diesem Fall kann die Reaktionsschicht mit der Elektrode in einem im Wesentlichen trockenen Zustand integriert sein. Somit erlangte ein auf dieser Technik beruhender Einweg-Glukosesensor in letzter Zeit öffentliche Aufmerksamkeit. Bei diesem Einweg-Glukosesensor kann die Glukosekonzentration in einer Probenflüssigkeit mit einer Messvorrichtung lediglich durch Einleiten der Probenflüssigkeit in den Sensor, der mit der Messvorrichtung lösbar verbunden ist, einfach gemessen werden. Dieses Verfahren kann nicht nur zum Quantifizieren von Glukose, sondern auch zum Quantifizieren irgendeines anderen Substrats, das in einer Probenflüssigkeit enthalten ist, angewendet werden.
Die japanische Offenlegungsschrift Nr. 6-109688 offenbart einen Biosensor, wie er in 9 gezeigt ist. Der Biosensor umfasst ein Substrat 40, eine Abdeckung 47 und ein Abstandselement 46, das zwischen dem Substrat 40 und der Abdeckung 47 angeordnet ist. Ein Probenversorgungsanschluss 48 ist in dem Abstandselement 46 ausgebildet, und ein Luftanschluss 49 ist in der Abdeckung 47 ausgebildet. Wenn die Abdeckung 47 über dem Substrat 40 angeordnet ist, wobei das Abstandselement 46 dazwischen angeordnet ist, so es mit beiden zusammenhängt, wird eine Aussparung 50 durch das Substrat 40, das Abstandselement 46 und die Abdeckung 47 definiert, die zum Probenversorgungsanschluss 48 hin offen ist. Das andere Ende der Aussparung 50 steht mit dem Luftanschluss 49 in Verbindung.
Auf dem Substrat 40 sind eine Arbeitselektrode 41, eine Gegenelektrode 42, eine Elektrode 43 zum Detektieren eines Flüssigkeitsübergangs und Leitungen 41a, 42a und 43a, die jeweils mit diesen Elektroden verbunden sind, ausgebildet. Eine Reaktionsschicht 51 ist über der Arbeitselektrode 41, der Gegenelektrode 42 und der Elektrode 43 zum Detektieren eines Flüssigkeitsübergangs ausgebildet. Das Bezugszeichen 52 in 9 bezeichnet eine isolierende Schicht.
Die Elektrode 43 zum Detektieren eines Flüssigkeitsübergangs ist bei einer Position ausgebildet, die von dem Probenversorgungsanschluss 48 weiter entfernt ist als die Arbeitselektrode 41 und die Gegenelektrode 42, so dass eine Probenflüssigkeit, die durch den Probenversorgungsanschluss 48 zugeführt wird, zuerst die Arbeitselektrode 41 und die Gegenelektrode 42 erreichen kann, bevor sie die Elektrode 43 erreicht.
Bei dem zuvor erwähnten herkömmlichen Biosensor kann die Tatsache, dass eine Probenflüssigkeit, die durch den Probenversorgungsanschluss 48 zugeführt wurde, die Reaktionsschicht 51 erreicht hat, durch die Elektrode 43 detektiert werden. Wenn die Elektrode 43 diese Tatsache detektiert, wird zwischen der Arbeitselektrode 41 und der Gegenelektrode 42 eine Spannung angelegt, um so eine Stromantwort zu erhalten. Somit wird ein Strom, der zwischen der Arbeitselektrode 41 und der Gegenelektrode 42 fließt, gemessen und die Quantifizierung wird anhand des Messergebnisses durchgeführt. Wenn eine Spannung zwischen der Arbeitselektrode 41 und der Gegenelektrode 42 angelegt wird, um eine Stromantwort zu erhalten, wie es zuvor beschrieben wurde, kann jedoch das Potenzial der Gegenelektrode 42, das als Referenz verwendet wird, durch die Oxidations-Reduktions-Reaktion in manchen Fällen verändert werden, wodurch Fehler und Abweichungen im Messergebnis der Substratmenge in der Probenflüssigkeit verursacht werden.
Es wird auf EP-A-0537761 verwiesen, das einen Biosensor beschreibt, der ein elektrisch isolierendes Substrat, ein Hauptelektrodensystem, das auf dem Substrat ausgebildet ist und eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode hat, eine Reaktionsschicht, die in Kontakt mit oder in der Nähe von dem Hauptelektrodensystem vorgesehen ist und eine Oxidoreduktase enthält, und ein Nebenelektrodensystem als Referenz umfasst, das mit einem Abstand zum Hauptelektrodensystem vorgesehen ist und eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode aufweist. Im Einsatz wird das Vorhandensein einer ausreichenden Flüssigkeitsmenge durch Detektieren einer Änderung in der Impedanz zwischen der Arbeitselektrode des Hauptelektrodensystems und der Arbeitselektrode des Nebenelektrodensystems detektiert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert.
Somit ermöglicht die hier beschriebene Erfindung die folgenden Vorteile: (1) Schaffen eines Verfahrens und einer Vorrichtung zum Quantifizieren eines Substrats, bei dem eine dritte Elektrode als Referenz für die einfache, schnelle und genaue Quantifizierung eines bestimmten Substrats in einer Probenflüssigkeit verwendet wird, um Fehler und Abweichungen im Messergebnis der Substratmenge in der Probenflüssigkeit zu verringern; und (2) Schaffen eines Verfahrens und einer Vorrichtung zum Quantifizieren eines Substrats durch Verwenden eines Biosensors mit einem vergleichsweise einfachen Aufbau und den zuvor beschriebenen Merkmalen.
Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen für einen Fachmann auf dem Gebiet beim Lesen und Verstehen der folgenden ausführlichen Beschreibung in Bezug auf die beigefügte Zeichnung hervor.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein beispielhaftes Schaltbild des in dieser Erfindung verwendeten Biosensors und einer damit verbundenen Messvorrichtung.
2 ist ein weiteres beispielhaftes Schaltbild des in dieser Erfindung verwendeten Biosensors und einer damit verbundenen Messvorrichtung.
3 ist eine perspektivische Explosionsansicht eines Glukosesensors als ein Beispiel für einen in dieser Erfindung verwendeten Biosensor, von dem eine Reaktionsschicht entfernt wurde.
4 ist eine Draufsicht auf ein Substrat mit einem Elektrodensystem, das in einem in 3 gezeigten Glukosesensor verwendet wird.
5 ist ein Schaltbild des Biosensors von 3 und einer damit verbundenen Messvorrichtung.
6 ist eine Draufsicht auf ein Substrat mit einem Elektrodensystem, das in einem Glukosesensor verwendet wird, als nochmals weiteres Beispiel des Biosensors, wobei dies keinen Bestandteil dieser Erfindung darstellt.
7 ist eine Draufsicht auf ein Substrat mit einem Elektrodensystem, das in einem Glukosesensor verwendet wird, als nochmals weiteres Beispiel des Biosensors, wobei dies keinen Bestandteil dieser Erfindung darstellt.
8 ist eine Draufsicht auf ein Substrat mit einem Elektrodensystem, das in einem Glukosesensor verwendet wird, als nochmals weiteres Beispiel des Biosensors, wobei dies keinen Bestandteil dieser Erfindung darstellt.
9 ist eine perspektivische Explosionsansicht eines herkömmlichen Biosensors.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein in dieser Erfindung verwendeter Biosensor umfasst ein elektrisch isolierendes Substrat, ein Elektrodensystem, das auf dem Substrat ausgebildet ist und eine Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode und eine dritte Elektrode umfasst, und eine Reaktionsschicht, die über der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode des Elektrodensystems ausgebildet ist. Die Arbeitselektrode, die Gegenelektrode und die dritte Elektrode des Elektrodensystems sind vorzugsweise auf der gleichen Ebene auf dem Substrat ausgebildet.
Das elektrisch isolierende Substrat kann aus einer Platte gebildet sein, die aus einem Kunstharz wie etwa Polyethylenterephthalat oder irgendeinem anderen geeigneten Harz hergestellt ist, das auf dem Gebiet bekannt ist.
Das Elektrodensystem, das die Arbeitselektrode, die Gegenelektrode, die der Arbeitselektrode entspricht, und die dritte Elektrode umfasst, kann auf dem Substrat durch ein bekanntes Verfahren ausgebildet werden. Beispielsweise werden nach der Ausbildung von Leitungen auf dem Substrat die Arbeitselektrode, die Gegenelektrode und die dritte Elektrode so ausgebildet, dass sie mit den entsprechenden Leitungen verbunden und voneinander isoliert sind. Das Material für die Leitungen und die Elektroden kann irgendein bekanntes leitfähiges Material wie etwa Silberpaste und Kohlenstoffpaste sein. Ferner kann eine Silber/Silberchlorid-Elektrode verwendet werden.
Die Formen und Positionen der jeweiligen Elektroden des Elektrodensystems können unterschiedlich abgewandelt werden. Beispielsweise kann die Gegenelektrode in der Form eines Rings sein oder sie kann in einer Draufsicht im Wesentlichen eine C-Form haben. Die Arbeitselektrode kann in einer Aussparung innerhalb der ringförmigen oder C-förmigen Gegenelektrode angeordnet sein, so dass sie davon elektrisch isoliert ist. Durch Vorsehen der Arbeitselektrode in der Gegenelektrode können diese Elektroden aneinander angrenzend angeordnet werden. In diesem Fall kann die Reaktionsschicht, die die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode bedeckt, einfach ausgebildet werden.
Wenn die Gegenelektrode so ausgebildet ist, dass sie einen im Wesentlichen C-förmigen Hauptelektrodenabschnitt und eine Öffnung enthält, die in dem Hauptelektrodenabschnitt ausgebildet ist, wird eine Leitung, die mit der innerhalb des Hauptelektrodenabschnitts angeordneten Arbeitselektrode verbunden ist, vom Innenraum des Hauptelektrodenabschnitts durch die Öffnung in die äußere Umgebung geführt.
In einem Umfangsabschnitt der Gegenelektrode kann ein Elektrodenaufnahmeabschnitt für die dritte Elektrode ausgebildet sein. Die Form des Elektrodenaufnahmeabschnitts und der dritten Elektrode können gemäß der erforderlichen Anwendung unterschiedlich abgewandelt werden. Ferner kann die Position des Elektrodenaufnahmeabschnitts in der Gegenelektrode abhängig von der Anwendung des Biosensors geändert werden.
Beispielsweise kann die dritte Elektrode weiter entfernt von einem Probenversorgungsanschluss des Biosensors angeordnet sein als die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode, so dass eine Probenflüssigkeit, die durch den Probenversorgungsanschluss zugeführt wird, die dritte Elektrode erreichen kann, nachdem sie die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode erreicht hat. Alternativ kann die dritte Elektrode näher bei dem Probenversorgungsanschluss angeordnet sein als die Arbeitselektrode, so dass eine Probenflüssigkeit, die durch den Probenversorgungsanschluss zugeführt wird, die dritte Elektrode erreichen kann, bevor sie die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode erreicht, wobei dies keinen Bestandteil der Erfindung darstellt.
Wenn die dritte Elektrode weiter entfernt vom Probenversorgungsanschluss angeordnet ist als die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode, kann die Änderung eines Widerstandswerts zwischen der Gegenelektrode und der dritten Elektrode nicht detektiert werden, bis eine Aussparung, die alle drei Elektroden umfasst, mit einer Probenflüssigkeit gefüllt ist.
Durch Verwenden dieser dritten Elektrode zum Detektieren eines Flüssigkeitsübergangs kann entsprechend definitiv ermittelt werden, ob eine Probenflüssigkeit, die durch den Probenversorgungsanschluss zugeführt wurde, die gesamte Reaktionsschicht bedeckt hat oder nicht.
Wenn die dritte Elektrode näher bei dem Probenversorgungsanschluss angeordnet ist als die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode, wird andererseits die dritte Elektrode auf alle Fälle mit der zugeführten Probenflüssigkeit getränkt. Entsprechend kann durch Verwenden dieser dritten Elektrode als Referenz elektrode ein Referenzpotenzial besser stabilisiert werden, was das Erzielen einer Messung mit geringerer Abweichung zur Folge hat.
Die dritte Elektrode kann auch zwischen der Gegenelektrode und der Arbeitselektrode angeordnet werden, so dass sie von diesen elektrisch isoliert ist.
Die Reaktionsschicht kann über der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode des Elektrodensystems ausgebildet werden. Alternativ kann die Reaktionsschicht nicht nur über der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode, sondern auch über der dritten Elektrode ausgebildet werden, wobei dies keinen Bestandteil der Erfindung darstellt.
Die Reaktionsschicht kann mit einer Schicht oder mit zwei Schichten ausgebildet werden, die zumindest ein Enzym (Oxidoreduktase) umfassen, und stärker bevorzugt umfasst sie ferner einen Elektronen-Akzeptor. Wenn die Reaktionsschicht mit zwei Schichten gebildet wird, können die zwei Schichten aus einer ersten Schicht, die aus einem hydrophilen Polymer hergestellt ist, die direkt auf dem Elektrodensystem ausgebildet ist, und aus einer zweiten Schicht bestehen, die wenigstens ein Enzym und einen Elektronen-Akzeptor umfasst, die auf die erste Schicht laminiert wird.
Beispiele des hydrophilen Polymers, das die erste hydrophile Polymerschicht bildet, umfassen: Carboxymethylzellulose (nachfolgend als CMC bezeichnet), Hydroxyethylzellulose (nachfolgend als HEC bezeichnet), Hydroxypropylzellulose (nachfolgend als HPC bezeichnet), Methylzellulose, Ethylzellulose, Ethylhydroxyethylzellulose, Carboxymethylethylzellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyaminosäuren wie etwa Polylysin, Polystyrolsulfonat, Gelatine oder ihr Derivat, Acrylsäure oder ihr Salz, Methacrylsäure oder ihr Salz, Stärke oder ihr Derivat und Maleinsäureanhydrid oder ihr Salz. Von den zuvor Genannten sind CMC, HEC, HPC, Methylzellulose, Ethylzellulose, Ethylhydroxyethylzellulose und Carboxymethylethylzellulose bevorzugt.
Die Art der Oxidoreduktase, die in der Reaktionsschicht enthalten ist, hängt von einem Substrat ab, das in einer zu quantifizierenden Probenflüssigkeit enthalten ist, und es wird hier nicht speziell definiert. Beispiele der Oxidoreduktase umfassen Fructose-Dehydrogenase, Invertase, Mutarotase, Glukoseoxidase, Alkohol oxidase, Milchsäureoxidase, Cholesterinoxidase, Xanthinoxidase und Aminosäureoxidase.
Beispiele des Elektronen-Akzeptors umfassen Ferrizyankalium, p-Benzochinon, Phenazinmethosulfat, Methylenblau und ein Ferrozen-Derivat. Einer dieser Stoffe oder eine Kombination aus zwei oder mehreren der zuvor genannten Stoffe kann als Elektronen-Akzeptor verwendet werden.
Das Enzym und der Elektronen-Akzeptor können in einer Probenflüssigkeit gelöst werden oder die Reaktionsschicht wird auf dem Substrat immobilisiert oder dergleichen, so dass nicht zugelassen wird, dass sich das Enzym und der Elektronen-Akzeptor in einer Probenflüssigkeit lösen. Wenn das Enzym und der Elektronen-Akzeptor immobilisiert sind, umfasst die Reaktionsschicht vorzugsweise das hydrophile Polymer.
Die Reaktionsschicht kann ferner einen pH-Puffer wie etwa Kaliumdihydrogenphosphat-Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat-Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat-Dikaliumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat-Dinatriumhydrogenphosphat, Zitronensäure-Dinatriumhydrogenphosphat, Zitronensäure-Dikaliumhydrogenphosphat, Zitronensäure-Natriumzitrat, Zitronensäure-Kaliumzitrat, Kaliumdihydrogencitrat-Natriumhydroxid, Natriumdihydrogencitrat-Natriumhydroxid, Natriumhydrogenmaleat-Natriumhydroxid, Kaliumhydrogenphthalat-Natriumhydroxid, Bernsteinsäure-Natriumtetraborat, Maleinsäure-Tri(hydroxymethyl)aminomethan, Tri(hydroxymethyl)aminomethan-Tri(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid, [N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-2-Ethansulfonsäure]-Natriumhydroxid, [N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-Aminoethansulfonsäure]-Natriumhydroxid und [Piperazin-N,N'-bis(2-Ethansulfonsäure)]-Natriumhydroxid enthalten.
Die Reaktionsschicht kann ausgebildet werden, indem auf ein Substrat eine Lösung getropft wird, die zumindest das Enzym umfasst, und die stärker bevorzugt ferner den Elektronen-Akzeptor umfasst, und indem die aufgetropfte Lösung getrocknet wird.
Wenn die Reaktionsschicht mit der ersten hydrophilen Polymer-Schicht und der zweiten Schicht ausgebildet wird, die das Enzym und den Elektronen-Akzeptor enthält und auf die erste Schicht laminiert wird, kann die zweite Schicht beispiels weise durch Auftropfen einer gemischten Lösung des Enzyms und des Elektronen-Akzeptors auf die erste Schicht ausgebildet werden.
Der so gebildete Biosensor kann mit einer Messvorrichtung A, die in 1 oder 2 gezeigt ist, lösbar verbunden werden.
In 1 und 2 umfasst der Biosensor B ein Elektrodensystem, das auf einem Substrat ausgebildet ist und eine Arbeitselektrode 5, eine Gegenelektrode 8 und eine zum Detektieren eines Flüssigkeitsübergangs verwendete dritte Elektrode 7 enthält. Die Arbeitselektrode 5 ist mit einem Anschluss 2a über eine Leitung 2 verbunden. Die Gegenelektrode 8 ist mit einem Anschluss 4a über eine Leitung 4 verbunden. Die dritte Elektrode 7 ist einem Anschluss 3a über eine Leitung 3 verbunden. Die in 1 gezeigte Messvorrichtung A umfasst einen Verbinder 25 mit Anschlüssen 31, 32 und 33, die mit den entsprechenden Anschlüssen 2a, 3a und 4a des Biosensors B verbunden werden können, Strom-Spannungs-Wandlerschaltungen 26, die mit dem Anschluss 32 des Verbinders 25 verbunden sind, Analog-Digital-Wandlerschaltungen 27, die mit den entsprechenden Strom-Spannungs-Wandlerschaltungen 26 verbunden sind, Strom-Spannungs-Wandlerschaltungen 26a, die mit dem Anschluss 31 über einen Schalter 29 verbunden werden können, Analog-Digital-Wandlerschaltungen 27a, die mit den entsprechenden Strom-Spannungs-Wandlerschaltungen 26a verbunden sind, und eine Steuerung 28 mit einem Mikrocomputer und dergleichen, die mit den entsprechenden Analog-Digital-Wandlerschaltungen 27 und 27a verbunden ist. Der zuvor erwähnte Schalter 29 wird durch die Steuerung 28 EIN bzw. AUS gesteuert.
Der Betrieb einer Schaltung, die den Biosensor B und die Messvorrichtung A von 1 enthält, wird nun beschrieben.
Zuerst wird der Biosensor B mit der Messvorrichtung A verbunden. Zu diesem Zeitpunkt ist der Schalter 29 durch die Steuerung 28 vom Anschluss 31 getrennt. Andererseits wird eine vorgegebene Spannung (z. B. 0,5 V) zwischen der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 angelegt. Wenn unter dieser Bedingung dem Biosensor B eine Probenflüssigkeit zugeführt wird, fließt ein Strom zwischen der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7. Der Wert dieses Stroms wird durch die Steuerung 28 detektiert. Anhand dieser Detektion wird eine Zeit gemessen. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne wird der Schalter 29 zu dem Anschluss 31 geschaltet und eine vorgegebene Spannung (z. B. 0,5 V) wird an die Arbeitselektrode 5 angelegt, wobei zumindest die dritte Elektrode als Referenz verwendet wird. Beispielsweise wird eine feste Spannung (z. B. 0,5 V), die erforderlich ist, um einen Antwortstrom zu erhalten, zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 angelegt. Ein Strom, der infolgedessen zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 fließt, wird durch die Strom-Spannungs-Wandlerschaltungen 26a in eine Spannung umgesetzt, und der erhaltene Spannungswert wird durch die Analog-Digital-Wandlerschaltungen 27a in eine Anzahl von Impulsen innerhalb einer festen Zeitspanne umgesetzt. Die Steuerung 28 zählt die Anzahl der Impulse, berechnet einen Antwortwert und zeigt das Ergebnis an.
Wenn eine Probenflüssigkeit, die ein Substrat (beispielsweise ein Saccharid) enthält, dem Biosensor B zugeführt wird, wird somit die Reaktionsschicht in der Probenflüssigkeit gelöst. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne seit der Zufuhr der Probenflüssigkeit wird eine feste Spannung zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 angelegt. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne wird hierauf ein Stromwert eines Stroms, der durch die Elektroden fließt, gemessen. Der erhaltene Stromwert ist zur Konzentration des Substrats in der Probenflüssigkeit proportional. Eine große Anzahl von Stromwerten wurde zuvor in Bezug auf eine Vielzahl von Probenflüssigkeiten, die das Substrat mit verschiedenen bekannten Konzentrationen enthalten, gemessen, um das Verhältnis zwischen der Konzentration und dem Stromwert zu erhalten. Hierauf kann das Substrat, das in einer Probenflüssigkeit mit einer unbekannten Konzentration enthalten ist, quantifiziert werden, indem ein Stromwert gemessen wird, wie es zuvor beschrieben wurde.
Bei diesem Quantifizierungsverfahren, bei dem die Änderung der Substratkonzentration, die durch die Reaktion zwischen einem Enzym und dem Substrat in einer Probenflüssigkeit verursacht wird, anhand einer elektrochemischen Antwort gemessen wird, die durch Anlegen einer Spannung an die Arbeitselektrode 5 erhalten wird, wenn die dritte Elektrode 7 als eine Referenzelektrode zusätzlich zur Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 verwendet wird, kann die Abweichung eines Referenzpotenzials im Wesentlichen vernachlässigt werden.
Wenn die dritte Elektrode 7 zum Detektieren eines Flüssigkeitsübergangs verwendet wird, auch wenn kein Bedarf besteht, eine Spannung zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 zur Detektion des Flüssigkeitsübergangs anzulegen, wie sie im Stand der Technik angelegt wird, kann ferner die Zufuhr der Probenflüssigkeit auf alle Fälle detektiert werden. Wenn die dritte Elektrode 7 gewöhnlich als Referenzelektrode und als eine Elektrode zum Detektieren eines Flüssigkeitsübergangs verwendet wird, kann ferner die Struktur des Elektrodensystems vereinfacht werden.
Die in 2 gezeigte Messvorrichtung A umfasst einen Verbinder 25 mit Anschlüssen 31, 32 und 33, die mit den entsprechenden Anschlüssen 2a, 3a und 4a des Biosensors B verbunden sind, Strom-Spannungs-Wandlerschaltungen 26, die mit den entsprechenden Anschlüssen 31 oder 32 des Verbinders 25 über einen Schalter 29 verbunden sind, Analog-Digital-Wandlerschaltungen 27, die mit den entsprechenden Strom-Spannungs-Wandlerschaltungen 26 verbunden sind, und eine Steuerung 28 mit einem Mikrocomputer und dergleichen, die mit den entsprechenden Analog-Digital-Wandlerschaltungen 27 verbunden ist. Der zuvor erwähnte Schalter 29 wird durch die Steuerung 28 EIN bzw. AUS gesteuert.
Ein Betrieb einer Schaltung, die den Biosensor B und die Messvorrichtung A von 2 enthält, wird beschrieben.
Zuerst wird der Biosensor B mit der Messvorrichtung A verbunden. Zu diesem Zeitpunkt ist der Schalter 29 durch die Steuerung 28 mit dem Anschluss 32 verbunden. Eine vorgegebene Spannung (z. B. 0,5 V) wird zwischen der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 angelegt. Wenn unter dieser Bedingung dem Biosensor B eine Probenflüssigkeit zugeführt wird, fließt ein Strom zwischen der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7. Der Wert dieses Stroms wird durch die Steuerung 28 detektiert. Anhand dieser Detektion wird eine Zeit gemessen. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne wird der Schalter 29 zu dem Anschluss 31 geschaltet und eine vorgegebene Spannung (z. B. 0,5 V) wird an die Arbeitselektrode 5 angelegt. Eine feste Spannung (z. B. 0,5 V), die erforderlich ist, um einen Antwortstrom zu erhalten, wird zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 des Biosensors B angelegt.
Ein Strom, der infolgedessen zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 fließt, wird durch die Strom-Spannungs-Wandlerschaltungen 26 in eine Spannung umgesetzt, und der erhaltene Spannungswert wird durch die Analog-Digital-Wandlerschaltungen 27 in die Anzahl von Impulsen innerhalb einer festen Zeitspanne umgesetzt. Die Steuerung 28 zählt die Anzahl der Impulse, berechnet einen Antwortwert und zeigt das Ergebnis an.
Die in 1 gezeigte Messvorrichtung A benötigt die Strom-Spannungs-Wandlerschaltungen 26 und 26a und die Analog-Digital-Wandlerschaltungen 27 und 27a jeweils für die Arbeitselektrode 5 und die Gegenelektrode B. In der in 2 gezeigten Messvorrichtung können die Strom-Spannungs-Wandlerschaltungen 26 und die Analog-Digital-Wandlerschaltungen 27 für die Arbeitselektrode 5 und die Gegenelektrode 8 gemeinsam verwendet werden.
Gemäß dieser Erfindung können Saccharide in Früchten und Saccharide in Blut, Lymphe, Urin und Speichel quantifiziert werden. Der Biosensor, der in dieser Erfindung verwendet werden kann, ist beispielsweise ein Fructosesensor, ein Saccharosesensor, ein Glukosesensor, ein Alkoholsensor, ein Milchsäuresensor, ein Cholesterinsensor und ein Aminosäuresensor.
Beispiele
Bei der in der folgenden Beschreibung erwähnten Zeichnung hat jedes Element ein übliches Bezugszeichen, und die Beschreibung wird weggelassen, falls es erforderlich ist.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wird ein Verfahren zum Quantifizieren von Glukose beschrieben. Es wurde ein in 3 gezeigter Glukosesensor verwendet. 3 ist eine perspektivische Explosionsansicht eines Glukosesensors, von dem eine Reaktionsschicht entfernt wurde. Der Glukosesensor umfasst ein isolierendes Substrat 1, das aus Polyethylenterephthalat hergestellt ist, eine Abdeckung 9 und ein Abstandselement 10, das zwischen dem Substrat 1 und der Abdeckung 9 angeordnet ist. Das Substrat 1, das Abstandselement 10 und die Abdeckung 9 hängen in der Positionsbeziehung, wie es durch Strichlinien in 3 gezeigt ist, miteinander zusammen, wodurch der Glukosesensor gebildet wird.
Ein Probenversorgungsanschluss 11 ist in dem Abstandselement 10 ausgebildet, und ein Luftanschluss 12 ist in der Abdeckung 9 ausgebildet. Wenn die Abdeckung 9 mit dem Substrat 1 zusammenhängt, wobei das Abstandselement 10 dazwischen angeordnet ist, bilden das Substrat 1, das Abstandselement 10 und die Abdeckung 9 eine (nicht gezeigte) Aussparung, die mit dem Proben versorgungsanschluss 11 in Verbindung steht, und der Endabschnitt der Aussparung steht mit dem Luftanschluss 12 in Verbindung.
Wie es in 4 gezeigt ist, sind auf dem Substrat 1 eine Arbeitselektrode 5, eine dritte Elektrode 7, eine Gegenelektrode 8 und Leitungen 2, 3 und 4 ausgebildet, die mit diesen Elektroden jeweils elektrisch verbunden sind. Die Gegenelektrode 8 umfasst einen im Wesentlichen C-förmigen Hauptelektrodenabschnitt und eine Öffnung 21, die im Hauptelektrodenabschnitt ausgebildet ist. Die Leitung 2, die mit der Arbeitselektrode 5 verbunden ist, wird vom Innenraum der Gegenelektrode 8 durch die Öffnung 21 in die äußere Umgebung geführt.
Die dritte Elektrode 7 ist weiter entfernt von einem Einlass 11a des Probenversorgungsanschlusses 11 angeordnet als die Arbeitselektrode 8. Mit Ausnahme der dritten Elektrode 7 ist über dem Elektrodensystem eine (nicht gezeigte) Reaktionsschicht ausgebildet (d. h. über der Arbeitselektrode 5 und über der Gegenelektrode 8). Ein Bezugszeichen 6 in 1 bezeichnet eine isolierende Schicht.
Die Arbeitselektrode 5, die Gegenelektrode 8 und die dritte Elektrode 7 liegen gegenüber der zuvor erwähnten Aussparung frei.
Dieser Glukosesensor wird wie folgt hergestellt:
Silberpaste wird durch Siebdruck auf das aus Polyethylenterephthalat hergestellte, isolierende Substrat 1 gedruckt, wodurch die Leitungen 2, 3 und 4 ausgebildet werden. Hierauf wird leitfähige Kohlenstoffpaste einschließlich eines Harzbinders auf das Substrat 1 gedruckt, wodurch die Arbeitselektrode 5 und die Gegenelektrode 8 ausgebildet werden. Die Arbeitselektrode 5 ist mit der Leitung 2 in Kontakt, während die Gegenelektrode 8 mit der Leitung 4 in Kontakt ist.
Nun wird eine isolierende Paste auf das resultierende Substrat 1 gedruckt, wodurch die isolierende Schicht 6 ausgebildet wird. Die isolierende Schicht 6 bedeckt den Umfang der Arbeitselektrode 5, so dass ein fester Bereich der Arbeitselektrode 5 frei liegt. Die isolierende Schicht 6 bedeckt außerdem einen Teil der Leitungen 2, 3 und 4. Die dritte Elektrode 7 wird ausgebildet, indem ein Ende der Leitung 3 freigelegt wird.
Hierauf wird leitfähige Kohlenstoffpaste mit einem Harzbinder auf das resultierende Substrat 1 gedruckt, wodurch die Gegenelektrode 8 ausgebildet wird, so dass sie mit der Leitung 4 in Kontakt ist.
Nun wird eine wässrige Lösung von CMC auf das Elektrodensystem mit Ausnahme der dritten Elektrode 7 getropft (d. h. auf die Arbeitselektrode 5 und die Gegenelektrode 8), die getrocknet wird, wodurch eine CMC-Schicht gebildet wird. Ferner wird eine wässrige Lösung mit GOD als Enzym und Ferrizyankalium als Elektronen-Akzeptor auf das Elektrodensystem mit Ausnahme der dritten Elektrode 7 getropft (d. h. auf die Arbeitselektrode 5 und die Gegenelektrode 8), die getrocknet wird. Somit wird die Reaktionsschicht ausgebildet.
Um eine gleichmäßigere Zufuhr einer Probenflüssigkeit zur Reaktionsschicht zu erzielen, wird eine organische Lösungsmittel-Lösung von Lecithin (zum Beispiel eine Toluol-Lösung) von dem Einlass 11a des Probenzufuhranschlusses 11 über die gesamte zu trocknende Reaktionsschicht verteilt, wodurch eine Lecithinschicht ausgebildet wird. Danach hängen das Substrat 1, die Abdeckung 9 und das Abstandselement 10 miteinander zusammen, wie es mit Strichlinien in 1 gezeigt ist. Somit ist der Glukosesensor hergestellt.
Hierauf wird der Glukosesensor B mit der Messvorrichtung A verbunden, die eine in 5 gezeigte Schaltung hat.
Der Glukosesensor B umfasst das Elektrodensystem, das auf dem Substrat 1 ausgebildet ist, und die Arbeitselektrode 5, die Gegenelektrode 8 und die zum Detektieren eines Flüssigkeitsübergangs verwendete dritte Elektrode 7 enthält. Die Arbeitselektrode 5 ist mit einem Anschluss 2a über eine Leitung 2 verbunden. Die Gegenelektrode 8 ist mit einem Anschluss 4a über eine Leitung 4 verbunden. Die dritte Elektrode 7 ist mit einem Anschluss 3a über eine Leitung 3 verbunden.
Die Messvorrichtung A umfasst einen Verbinder 14 mit Anschlüssen 16 und 15 und einen Erdungsanschluss 17, die jeweils mit den Anschlüssen 2a, 3a und 4a des Glukosesensors verbunden sind, einen Stromdetektionsabschnitt 18, der mit dem Anschluss 15 des Verbinders 14 verbunden ist, eine Analog-Digital-Wandlerschaltung 19, die mit dem Anschluss 16 über einen Schalter 13 verbunden werden kann, und eine Steuerung 20, die aus einem Mikrocomputer und dergleichen besteht.
An den Anschluss 3a wird eine feste Spannung angelegt. Wenn dem Glukosesensor B eine Probenflüssigkeit zugeführt wird, detektiert der Stromdetektionsabschnitt 18 entsprechend einen Strom, der durch die Elektrode 7 fließt, um ein System zum Detektieren der Zufuhr der Probenflüssigkeit zu aktivieren. Hierauf wird über die Steuerung 20 ein Mess-Zeitschalter gestartet.
Nachdem eine vorgegebene Zeitspanne verstrichen ist, beispielsweise nach 55 Sekunden, wird der Schalter 13 durch ein Signal von der Steuerung 20 geschaltet, so dass er den Anschluss 16 mit der Analog-Digital-Wandlerschaltung 19 verbindet. Somit wird eine feste Spannung, die erforderlich ist, um einen Antwortstrom zu erhalten, zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 des Glukosesensors B angelegt. Der Strom, der zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 fließt, wird in eine Spannung umgesetzt. Der erhaltene Spannungswert wird wiederum durch die Analog-Digital-Wandlerschaltung 19 in eine Anzahl von Impulsen innerhalb einer festen Zeitspanne umgesetzt. Die Steuerung 20 zählt die Anzahl von Impulsen, berechnet einen Antwortwert und zeigt das Ergebnis an.
Durch den Probenversorgungsanschluss 11 werden dem Glukosesensor 3 μl einer wässrigen Lösung von Glukose als eine Probenflüssigkeit zugeführt. Die Probenflüssigkeit erreicht den Luftanschluss 12 durch die Aussparung, und die Reaktionsschicht auf dem Elektrodensystems wird darin gelöst.
Gleichzeitig mit der Zufuhr der Probenflüssigkeit wird ein System zum Detektieren der Zufuhr einer Probenflüssigkeit anhand der Änderung eines Widerstandswerts zwischen der Gegenelektrode 8 und der dritten Elektrode 7 betrieben, wodurch der Mess-Zeitschalter betätigt wird. Nach 55 Sekunden wird ein gewünschtes Potenzial anhand des Potenzials bei der dritten Elektrode 7 an die Arbeitselektrode 5 angelegt, und nach 5 Sekunden wird ein Stromwert gemessen. Zwischen Ferrizyanidionen, Glukose und GOD in der Probenflüssigkeit wird eine Reaktion bewirkt, die die Oxidation von Glukose in Glukonolakton und die Reduktion von Ferrizyanidionen in Ferrozyanidionen zur Folge hat. Eine Stromantwort kann durch die Oxidation von Ferrozyanidionen erhalten werden. Auf diese Weise wird ein Stromwert abhängig von der Glukosekonzentrationen in der Probenflüssigkeit erhalten.
In diesem Beispiel ist der Fall beschrieben, bei dem die Reaktionsschicht nicht über der dritten Elektrode 7 ausgebildet ist, wenn eine Reaktionsschicht über der dritten Elektrode 7 ausgebildet ist, wobei dies keinen Bestandteil dieser Erfindung darstellt, wird jedoch das gleiche Ergebnis erhalten.
Ferner wird der Biosensor mit der Abdeckung 9 in diesem Beispiel beschrieben, wenn jedoch ein Biosensor ohne die Abdeckung 9 verwendet wurde, wird ebenfalls eine Sensorantwort abhängig von der Glukosekonzentration erhalten.
Beispiel 2 (nicht erfindungsgemäß)
Das Elektrodensystem eines Glukosesensors, der in diesem Beispiel verwendet wird, ist in 6 gezeigt.
Bei diesem Glukosesensor ist ein von einem Probenversorgungsanschluss 11 weiter entfernter Umfangsabschnitt einer im Wesentlichen C-förmigen Gegenelektrode 8, die auf einem Substrat 1 ausgebildet ist, geöffnet, um einen Elektrodenaufnahmeabschnitt 22 vorzusehen. Eine dritte Elektrode 7 ist in dem Elektrodenaufnahmeabschnitt 22 vorgesehen. Eine Reaktionsschicht ist nicht nur über einer Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8, sondern auch über der dritten Elektrode 7 ausgebildet. Mit Ausnahme des zuvor Beschriebenen gleicht die Konfiguration dieses Glukosesensors im Wesentlichen jener von Beispiel 1.
Der Glukosesensor wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Reaktionsschicht über der dritten Elektrode 7 sowie über der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 ausgebildet wird.
Durch den Probenversorgungsanschluss 11 werden dem Glukosesensor 3 μl einer wässrigen Lösung von Glukose als Probenflüssigkeit zugeführt, und ein Antwortstromwert wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Im Ergebnis wird wie in Beispiel 1 eine Stromantwort in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration in der Probenflüssigkeit erhalten.
Im Glukosesensor dieses Beispiels ist die dritte Elektrode 7 in dem Elektrodenaufnahmeabschnitt 22 ausgebildet, der bei der Gegenelektrode 8 vorgesehen ist, und somit kann die Reaktionsschicht einfach über der dritten Elektrode 7 ausgebildet werden. Ferner ist ein Abstand zwischen der Arbeitselektrode 8 und der dritten Elektrode 7 verringert, was eine Verringerung der Auswirkung eines Spannungsabfalls beim Aufbringen des Potenzials zur Folge hat.
Beispiel 3 (nicht erfindungsgemäß)
Das Elektrodensystem eines Glukosesensors, der in diesem Beispiel verwendet wird, ist in 7 gezeigt.
Bei diesem Glukosesensor ist ein näher am Probenversorgungsanschluss 11 angeordneter Umfangsabschnitt einer im Wesentlichen C-förmigen Gegenelektrode 8, die auf einem Substrat 1 ausgebildet ist, geöffnet, um einen Elektrodenaufnahmeabschnitt 22 vorzusehen. Eine dritte Elektrode 7 ist in dem Elektrodenaufnahmeabschnitt 22 vorgesehen. Eine Reaktionsschicht ist nicht nur über einer Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8, sondern auch über der dritten Elektrode 7 ausgebildet. Mit Ausnahme des zuvor Beschriebenen gleicht die Konfiguration dieses Glukosesensors im Wesentlichen jener von Beispiel 1.
Der Glukosesensor wird auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Reaktionsschicht über der dritten Elektrode 7 sowie über der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 ausgebildet wird.
Durch den Probenversorgungsanschluss 11 werden dem Glukosesensor 3 μl einer wässrigen Lösung von Glukose als Probenflüssigkeit zugeführt und ein Antwortstromwert wird auf die gleiche Weise wie im Beispiel 1 gemessen. Im Ergebnis wird eine Stromantwort in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration in der Probenflüssigkeit wie in Beispiel 1 erhalten.
Da bei dem Glukosesensor dieses Beispiels die dritte Elektrode 7 näher am Probenversorgungsanschluss 11 auf dem Substrat 1 ausgebildet ist, kann ferner die dritte Elektrode 7 auf alle Fälle mit der zugeführten Probenflüssigkeit getränkt werden. Wenn die dritte Elektrode 7 als Referenzelektrode verwendet wird, ist ferner ein Referenzpotential besser stabilisiert, was eine geringere Abweichung der Antwortwerte zur Folge hat.
Beispiel 4 (nicht erfindungsgemäß)
Das Elektrodensystem eines Glukosesensors, der in diesem Beispiel verwendet wird, ist in 8 gezeigt.
Bei diesem Glukosesensor ist eine im Wesentlichen C-förmige Gegenelektrode 8 auf einem Substrat 1 vorgesehen, und eine Arbeitselektrode 5 ist innerhalb der Gegenelektrode 8 vorgesehen. Eine dritte Elektrode 7 ist im Wesentlichen C-förmig innerhalb einer Aussparung 23 zwischen der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8 ausgebildet. Eine Reaktionsschicht ist nicht nur über der Arbeitselektrode 5 und der Gegenelektrode 8, sondern auch über der dritten Elektrode 7 ausgebildet. Abgesehen vom zuvor Beschriebenen gleicht die Konfiguration dieses Glukosesensors im Wesentlichen jener von Beispiel 1.
Der Glukosesensor wird wie folgt hergestellt:
Silberpaste wird durch Siebdruck auf das aus Polyethylenterephthalat hergestellte, isolierende Substrat 1 gedruckt, wodurch die Leitungen 2, 3 und 4 ausgebildet werden. Hierauf wird leitfähige Kohlenstoffpaste einschließlich eines Harzbinders auf das Substrat 1 gedruckt, wodurch die Arbeitselektrode 5 und die dritte Elektrode 7 ausgebildet werden, so dass die Arbeitselektrode 5 mit der Leitung 2 in Kontakt ist und die dritte Elektrode 7 mit der Leitung 3 in Kontakt ist.
Nun wird eine isolierende Paste auf das resultierende Substrat 1 gedruckt, wodurch eine isolierende Schicht 6 ausgebildet wird. Die isolierende Schicht 6 bedeckt die Umfänge der Arbeitselektrode 5 und der dritten Elektrode 7, wodurch feste Bereiche der Arbeitselektrode 5 und der dritten Elektrode 7 freigelegt werden. Die isolierende Schicht 6 bedeckt ferner einen Teil der Leitungen 2, 3 und 4.
Hierauf wird leitfähige Kohlenstoffpaste mit einem Harzbinder auf das resultierende Substrat 1 gedruckt, wodurch die Gegenelektrode 8 ausgebildet wird, so dass sie mit der Leitung 4 in Kontakt ist.
Die nachfolgenden Herstellungsverfahren gleichen jenen von Beispiel 1, und somit ist der Glukosesensor hergestellt.
Durch den Probenversorgungsanschluss 11 werden dem Glukosesensor 3 μl einer wässrigen Lösung von Glukose als Probenflüssigkeit zugeführt, und ein Antwortstromwert wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Im Ergebnis wird eine Stromantwort in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration in der Probenflüssigkeit wie im Beispiel 1 erhalten.
Da bei dem Glukosesensor dieses Beispiels die dritte Elektrode 7 am Umfang der Arbeitselektrode 5 ausgebildet ist, kann ferner die Potenzialaufbringung bei der Arbeitselektrode 5 besser stabilisiert werden, indem die dritte Elektrode 7 als Referenzelektrode verwendet wird. Im Ergebnis wird die Sensor-Antwortcharakteristik verbessert.
Verschiedene weitere Abwandlungen gehen für einen Fachmann auf dem Gebiet hervor und können von diesem leicht durchgeführt werden, ohne vom Umfang und Erfindungsgedanken dieser Erfindung abzuweichen. Entsprechend soll der Umfang der beigefügten Ansprüche nicht durch die hier dargelegte Beschreibung beschränkt sein, sondern die Ansprüche können breit ausgelegt werden.

Claims

Verfahren zum Quantifizieren eines Substrats in einer Probenflüssigkeit durch Verwenden eines Biosensors, wobei der Biosensor das Substrat durch elektrochemisches Messen einer Menge eines Elektronen-Akzeptors, der durch Elektronen reduziert worden ist, die in einer Reaktion zwischen dem Substrat in der Probenflüssigkeit und einer Oxidoreduktase erzeugt werden, quantifizieren kann, wobei das Verfahren umfasst: Vorsehen des Biosensors, der umfasst: ein elektrisch isolierendes Substrat; ein Elektrodensystem, das auf dem Substrat ausgebildet ist und eine Arbeitselektrode (5), eine Gegenelektrode (8) und eine zum Detektieren eines Flüssigkeitsübergangs verwendete dritte Elektrode (7) enthält, wobei die dritte Elektrode weiter entfernt von einem Probenversorgungsanschluss als die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode angeordnet ist; und eine Reaktionsschicht, die über der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode, nicht jedoch über der dritten Elektrode des Elektrodensystems ausgebildet ist, wobei die Reaktionsschicht die Oxidoreduktase enthält, und wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Anlegen einer Spannung zwischen der Gegenelektrode (8) und der dritten Elektrode (7); Zuführen der Probenflüssigkeit zu der Reaktionsschicht; Detektieren einer elektrischen Änderung zwischen der Gegenelektrode (8) und der dritten Elektrode (7), die durch die Zufuhr der Probenflüssigkeit zu der Reaktionsschicht erzeugt wird; Anlegen einer Spannung an die Arbeitselektrode (5) nach der Detektion; und Messen eines Stroms, der zwischen der Arbeitselektrode (5) und der Gegenelektrode (8) erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gegenelektrode einen Hauptelektrodenabschnitt, der in einer Draufsicht im Wesentlichen C-förmig ausgebildet ist, und eine Öffnung, die in dem Hauptelektrodenabschnitt ausgebildet ist, enthält, die Arbeitselektrode in der Gegenelektrode angeordnet ist, so dass sie voneinander elektrisch isoliert sind, und eine Leitung, die mit der Arbeitselektrode verbunden ist, von dem Innenraum der Gegenelektrode durch die Öffnung in die äußere Umgebung der Gegenelektrode geführt ist.
Vorrichtung zum Quantifizieren eines Substrats in einer Probenflüssigkeit, die einen Biosensor und eine Messvorrichtung, mit der der Biosensor lösbar verbunden ist, umfasst, wobei der Biosensor das Substrat durch elektrochemisches Messen einer Menge eines Elektronen-Akzeptors, der durch Elektronen reduziert worden ist, die in einer Reaktion zwischen dem Substrat und der Probenflüssigkeit und einer Oxidoreduktase erzeugt werden, quantifizieren kann, wobei der Biosensor umfasst: ein elektrisch isolierendes Substrat; ein Elektrodensystem, das auf dem Substrat ausgebildet ist und eine Arbeitselektrode (5), eine Gegenelektrode (8) und eine dritte Elektrode (7), die verwendet wird, um einen Flüssigkeitsübergang zu detektieren, enthält, wobei die dritte Elektrode weiter entfernt von dem Probenversorgungsanschluss als die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode angeordnet ist; und eine Reaktionsschicht, die über der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode, nicht jedoch über der dritten Elektrode des Elektrodensystems ausgebildet ist, wobei die Reaktionsschicht die Oxidoreduktase enthält, wobei die Messvorrichtung umfasst: Mittel, um eine elektrische Änderung zwischen der Gegenelektrode (8) und der dritten Elektrode (7), die durch die Zufuhr der Probenflüssigkeit zu der Reaktionsschicht erzeugt wird, zu detektieren; Mittel, um an die Arbeitselektrode (5) nach der Detektion eine Spannung anzulegen; und Mittel, um einen Strom zu messen, der zwischen der Arbeitselektrode (5) und der Gegenelektrode (8) fließt.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Gegenelektrode einen Hauptelektrodenabschnitt, der in einer Draufsicht im Wesentlichen C-förmig ausgebildet ist, und eine Öffnung, die in dem Hauptelektrodenabschnitt ausgebildet ist, enthält, die Arbeitselektrode in der Gegenelektrode angeordnet ist, so dass sie elektrisch voneinander isoliert sind, und eine Leitung, die mit der Arbeitselektrode verbunden ist, vom Innenraum der Gegenelektrode durch die Öffnung in die äußere Umgebung der Gegenelektrode geführt ist.