DE69615406T3 - Verfahren zur herstellung von polynukleotiden mit gewünschten eigenschaften durch iterative selektion und rekombination - Google Patents

Verfahren zur herstellung von polynukleotiden mit gewünschten eigenschaften durch iterative selektion und rekombination Download PDF

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Description

  • Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polynukleotiden, die einen gewünschten Phänotyp verleihen und/oder für ein Protein codieren, das eine vorteilhafte vorbestimmte Eigenschaft aufweist, die auswählbar ist oder nach der im Screening gesucht werden kann. In einem Aspekt der Erfindung wird das Verfahren verwendet zur Erzeugung und Selektion oder Screening-Suche nach gewünschten Nukleinsäure-Fragmenten, die für mutante Proteine codieren.
  • Hintergrund der Erfindung und Beschreibung des verwandten Standes der Technik
  • Der komplexe Inhalt einer aktiven Sequenz eines biologischen Makromoleküls, z. B. von Proteinen, DNS usw., wurde ”der Informationsgehalt” des Makromoleküls (”IC”; 5–9) genannt. Der Informationsgehalt eines Proteins wurde definiert als die Resistenz des aktiven Proteins gegenüber Variationen der Aminosäure-Sequenz, berechnet aus der Minimalzahl nicht veränderbarer Aminosäuren (Bits), die erforderlich sind, eine Familie verwandter Sequenzen mit derselben Funktion zu beschreiben (9, 10). Proteine, die empfindlich gegenüber einer statistischen Mutagenese sind, haben einen neuen Informationsgehalt. Im Jahre 1974, als die so definierten Ausdrücke geprägt wurden, existierte eine Vielgestaltigkeit von Proteinen nur als taxonome Vielgestaltigkeit.
  • Entwicklungen der Molekularbiologie wie beispielsweise molekulare Bibliotheken erlaubten die Identifikation einer viel größeren Zahl variabler Basen und erlaubten sogar das Auswählen funktioneller Sequenzen aus statistischen Bibliotheken. Die meisten Reste können variiert werden, obwohl typischerweise nicht alle zur selben Zeit, und zwar in Abhängigkeit von kompensierenden Änderungen im Kontext. So kann ein 100 Aminosäuren umfassendes Protein nur 2.000 verschiedene Mutationen, jedoch 20100 mögliche Kombinationen von Mutationen enthalten.
  • Die Informationsdichte ist definiert als Informationsgehalt-Einheitslänge einer Sequenz. Aktive Bereiche von Enzymen tendieren dazu, eine hohe Informationsdichte aufzuweisen. Im Gegensatz dazu weisen flexible Linker in Enzymen eine geringe Informationsdichte auf (8).
  • Derzeit in verbreiteter Verwendung befindliche Verfahren zur Schaffung mutanter Proteine im Format einer Bibliothek sind die fehlerbehaftete Polymerase-Kettenreaktion (11, 12, 19) und die Kassetten-Mutagenese (8, 20, 21, 22, 40, 41, 42), in der die spezielle Region, die optimiert werden soll, durch ein synthetisch mutagenisiertes Oligonukleotid ersetzt wird. Alternativ dazu wurden Mutator-Stämme von Wirtszellen dazu verwendet, um die Häufigkeit von Mutationen zu erhöhen (Greener und Callahan (1995); Strategies in Mol. Biol. 7, 32). In jedem Fall wird eine ”Mutanten-Wolke” (4) um bestimmte Stellen in der ursprünglichen Sequenz erzeugt.
  • In der fehlerbehafteten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden Polymerisationsbedingungen geringer Genauigkeit eingesetzt, um einen geringen Grad an Punkt-Mutationen statistisch über eine lange Sequenz einzuführen. Eine fehlerbehaftete PCR kann verwendet werden, um eine Mischung von Fragmenten unbekannter Sequenz zu mutagenisieren. Jedoch haben Computersimulationen gezeigt, daß eine Punkt-Mutagenese allein oft zu stufig sein kann, um Änderungen des Blocks zu ermöglichen, die für eine kontinuierliche Evolution der Sequenz erforderlich sind. Die publizierten Protokolle von fehlerbehafteten PCR(s) sind allgemein ungeeignet für eine zuverlässige Amplifikation von DNS-Fragmenten mit einer Größe über 0,5 bis 1,0 kb, was ihre praktische Anwendung begrenzt. Weiter führen wiederholte Zyklen einer fehlerbehafteten PCR zu einer Akkumulation neutraler Mutationen, die beispielsweise ein Protein immunogen machen können.
  • In einer auf Oligonukleotide gerichteten Mutagenese wird eine kurze Sequenz durch ein synthetisch mutagenisiertes Oligonukleotid ersetzt. Dieser Ansatz erzeugt keine Kombinationen distanter Mutationen und ist daher nicht signifikant kombinatorisch. Die begrenzte Größe der Bibliothek relativ zu der riesigen Sequenzlänge bedeutet, daß viele Schritte der Selektion für eine Optimierung des Proteins unvermeidlich sind. Eine Mutagenese mit synthetischen Oligonukleotiden erfordert ein Sequenzieren individueller Klone nach jeder Selektionsrunde und eine anschließende Gruppierung in Familien, ein willkürliches Auswählen einer einzelnen Familie und ein Reduzieren der ausgewählten Familie auf ein übereinstimmendes Motiv, das erneut synthetisiert und erneut in ein einzelnes Gen eingesetzt wird; diesem Schritt folgt eine weitere Selektion. Dieser Prozeß stellt einen statistischen Flaschenhals dar, er ist arbeitsintensiv und für viele mutagenese Schritte praktisch nicht handhabbar.
  • Die fehlerbehaftete PCR und eine Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese sind daher nützlich für einzelne Zyklen eines Sequenz-Feintunings, werden jedoch beschränkend, wenn sie für viele Zyklen angewendet werden.
  • Die fehlerbehaftete PCR kann verwendet werden, um eine Mischung von Fragmenten unbekannter Sequenz zu mutagenisieren (11, 12). Jedoch leiden die veröffentlichten Protokolle von fehlerbehafteten PCR(s) (11, 12) an einer geringen Prozessierbarkeit der Polymerase. Daher ist das Protokoll sehr schwierig für die statistische Mutagenese eines Gens mit durchschnittlicher Größe einzusetzen. Dieses Unvermögen beschreibt die praktische Anwendung der fehlerbehafteten PCR.
  • Eine weitere starke Beschränkung der fehlerbehafteten PCR besteht darin, daß die Rate von Down-Mutationen mit dem Informationsgehalt der Sequenz wächst. Bei einem bestimmten Informationsgehalt, einer bestimmten Größe der Bibliothek und einer bestimmten Mutagenese-Rate verhindert das Gleichgewicht von Down-Mutationen zu Up-Mutationen statistisch die Selektion weiterer Verbesserungen (statistische Deckelung).
  • Letztlich führen wiederholte Zyklen einer fehlerbehafteten PCR auch zu einer Akkumulation neutraler Mutationen, die beispielsweise die Immunogenizität beeinflussen kann, nicht jedoch die Bindungsaffinität.
  • Es wurde also gefunden, daß die fehlerbehaftete PCR zu abgestuft ist, um die Blockänderungen zu ermöglichen, die für eine kontinuierliche Evolution der Sequenz erforderlich sind (1, 2).
  • Bei der Kassetten-Mutagenese wird typischerweise ein Sequenz-Block eines einzigen Templats durch eine (teilweise) randomisierte Sequenz ersetzt. Daher ist der maximale Informationsgehalt, der erhalten werden kann, statistisch durch die Zahl zufälliger Sequenzen beschränkt (d. h. die Größe der Bibliothek). Dies stellt einen statistischen Flaschenhals dar, was andere Sequenz-Familien eliminiert, die aktuell nicht die besten sind, die jedoch ein größeres Langzeit-Potential aufweisen können.
  • Weiter erfordert eine Mutagenese mit synthetischen Oligonukleotiden ein Sequenzieren individueller Klone nach jeder Selektionsrunde (20). Daher ist dieser Ansatz langwierig und ist für viele Runden der Mutagenese nicht praktisch brauchbar.
  • Die fehlerbehaftete PCR und die Kassetten-Mutagenese sind daher am besten geeignet, und wurden in weitem Umfang angewendet, für die Bereiche des Fein-Tunings von vergleichsweise geringem Informationsgehalt. Ein Beispiel ist die Selektion eines RNS-Ligase-Ribozyms aus einer statistischen Bibliothek unter Verwendung vieler Runden der Vervielfachung durch fehlerbehaftete PCR und Selektion (13).
  • Es wird in zunehmenden Maße klar, daß unsere wissenschaftlichen Werkzeuge für das Design rekombinanter linearer biologischer Sequenzen wie beispielsweise Proteine, RNS und DNS, nicht geeignet sind zur Erzeugung der notwendigen Sequenz-Vielgestaltigkeit, wie sie zum Optimieren vieler gewünschter Eigenschaften eines Makromoleküls oder Organismus benötigt wird. Das Auffinden immer besserer Mutanten hängt von der Untersuchung von immer mehr Sequenzen innerhalb immer größerer Bibliotheken ab, und zunehmende Zahlen von Zyklen einer mutagenen Vervielfältigung und Selektion sind erforderlich. Wie jedoch oben diskutiert wurde, weisen die bestehenden Mutagenese-Verfahren, die in breiter Anwendung sind, konkrete Beschränkungen auf, wenn sie für wiederholte Zyklen verwendet werden.
  • Die Evolution der meisten Organismen erfolgt durch natürliche Selektion und sexuelle Reproduktion. Eine sexuelle Reproduktion stellt das Mischen und Kombinieren der Gene der Nachkommenschaft der selektierten Individuen sicher. Im Verlauf der Meiose schließen sich homologe Chromosome von den Eltern miteinander zusammen und kreuzen sich im Verlauf ihrer Länge, wodurch genetisches Material ausgetauscht wird. Ein derartiger Austausch oder ein derartiges Hin- und Herschieben der DNS macht es möglich, daß sich Organismen viel schneller evolutionär entwickeln (1, 2). Bei der sexuellen Rekombination ist es deswegen, weil die eingeschobenen Sequenzen in einer homologen Umgebung von geprüfter Brauchbarkeit sind, wahrscheinlich, daß die eingeschobenen Sequenzen nach wie vor einen erheblichen Informationsgehalt aufweisen, sobald sie einmal in die neue Sequenz eingebaut sind.
  • Marton et al. (27) beschreiben die Verwendung der PCR zum Überwachen einer Rekombination in einem Plasmid, das direkt wiederkehrende Sequenzen aufweist. Marton et al. offenbaren, daß eine Rekombination während der PCR als Ergebnis eines Brechens oder Eischneidens der DNS auftritt. Dies gibt Anlaß zur Entstehung rekombinanter Moleküle. Meyerhans et al. (23) offenbaren ebenfalls das Auftreten einer DNS-Rekombination während einer PCR in vitro.
  • Der Begriff ”Applied Molecular Evolution” (”AME”) bedeutet die Anwendung eines evolutionären Design-Algorithmus an einer speziellen, nützlichen Aufgabe. Zwar wurde über viele unterschiedliche Bibliothek-Formate für AME für Polynukleotide (3, 11–14) Peptide und Proteine (Phagen (15–17), IacI (18)) und Polysome berichtet; es wurde jedoch in keinem dieser Formate eine Rekombination durch zufällige Cross-Over-Vorgänge angewendet, um gezielt eine kombinatorische Bibliothek zu schaffen.
  • Theoretisch gibt es 2.000 verschiedene einzelne Mutanten eines aus 100 Aminosäuren bestehenden Proteins. Ein Protein aus 100 Aminosäuren weist 20100 mögliche Kombinationen von Mutationen auf, eine Zahl, die zu riesig ist, als daß man sie mit herkömmlichen Verfahrensweisen erschöpfend erforschen könnte. Es wäre vorteilhaft, ein System zu entwickeln, das die Erzeugung und das Screening aller dieser möglichen Mutationskombinationen erlaubte.
  • Winter und Mitarbeiter (43, 44) haben ein in vivo verwendbares, für spezielle Stellen spezifisches Rekombinationssystem zum Kombinieren von Antikörper-Genen, die leichte Ketten umfassen, mit Antikörper-Genen, die schwere Ketten umfassen, zur Expression in einem Phagen-System verwendet. Jedoch vertraut ihr System auf spezielle Stellen der Rekombination und ist daher beschränkt. Hayashi et al. (48) berichten über eine simultane Mutagenese von Antikörper-CDR-Regionen in Einzelketten-Antikörpern (scFv) durch überlappende Erstreckung und PCR.
  • Caren et al. (45) beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen einer großen Population multipler Mutanten unter Anwendung einer Zufallsrekombination in vivo. Jedoch erfordert ihr Verfahren die Rekombination von zwei verschiedenen Bibliotheken von Plasmiden, wobei jede Bibliothek einen unterschiedlichen selektierbaren Marker aufweist. Damit ist diese Verfahrensweise auf eine finite Zahl von Rekombinationen beschränkt, die gleich der Zahl bestehender selektierbarer Marker ist, und erzeugt einen gleichzeitigen linearen Anstieg der Zahl von Marker-Genen, die mit der/den selektierten Sequenz(en) verbunden sind. Caren et al. beschreiben nicht die Verwendung von Mehrfach-Selektionszyklen. Eine Rekombination wird nur zum Aufbau größerer Bibliotheken verwendet.
  • Calogero et al. (46) und Galizzi et al. (47) berichten, daß eine In-vivo-Rekombination zwischen zwei homologen, jedoch trunkierten Insekten-Toxin-Genen auf einem Plasmid zur Erzeugung eines Hybrid-Gens führen kann. Radman et al. (49) berichten über eine In-vivo-Rekombination von im wesentlichen nicht zueinander passenden DNS-Sequenzen in einer Wirtszelle, die defekte Enzyme zum Reparieren der fehlenden Übereinstimmung aufweist, was zur Bildung eines Hybrid-Moleküls führt.
  • Es wäre vorteilhaft, ein Verfahren zum Herstellen von Mutanten-Proteinen zu entwickeln, wobei das Verfahren die Entwicklung großer Bibliotheken von mutanten Nukleinsäure-Sequenzen erlaubte, die leicht recherchiert werden können. Die in der vorliegenden Beschreibung beschriebene Erfindung ist gerichtet auf die Verwendung wiederholter Zyklen einer Punkt-Mutagenese, eines Hin- und Herschieben von Nukleinsäuren und einer Selektion, die die direkte molekulare Evolution hochgradig komplexer linearer Sequenzen wie beispielsweise Proteine in vitro durch statistische Rekombination gestattet.
  • Dementsprechend wäre es vorteilhaft, ein Verfahren zu entwickeln, das die Herstellung großer Bibliotheken mutanter DNS, RNS oder Proteine und die Selektion spezieller Mutanten für eine gewünschte Aufgabe gestattet. Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Erfindung ist gerichtet auf die Anwendung wiederholter Zyklen der Mutagenese, In-vivo-Rekombination und Selektion, die die direkte molekulare Evolution, in vivo und in vitro, von hochgradig komplexen linearen Sequenzen, z. B. DNS, RNS oder Proteinen, durch Rekombination ermöglicht.
  • Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der vorliegenden Beschreibung der Erfindung in bezug auf beigefügten Figuren offenbar.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf ein Verfahren zum Erzeugen einer ausgewählten Polynukleotid-Sequenz oder Population ausgewählter Polynukleotid-Sequenzen, typischerweise in Form amplifizierter und/oder geklonter Polynukleotide, wodurch die ausgewählte(n) Polynukleotid-Sequenz(en) eine gewünschte charakteristische Phänotyp-Eigenschaft besitzt (besitzen) (z. B. für ein Polypeptid codieren, die Transkription verbundener Polynukleotide fördern, ein Protein binden und dergleichen), nach der selektiert werden kann. Ein Verfahren zum Identifizieren von Polypeptiden, die eine gewünschte Struktur oder funktionelle Eigenschaft besitzen, wie beispielsweise das Binden an ein vorbestimmtes biologisches Makromolekül wie z. B. einen Rezeptor, schließt das Durchsuchen/Screening einer großen Bibliothek von Polypeptiden nach einzelnen Mitgliedern der Bibliothek ein, die die gewünschte Struktur oder funktionelle Eigenschaft besitzen, die von der Aminosäure-Sequenz des Polypeptids verliehen wird.
  • In einem allgemeinen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, das ”Sequenz-Shuffling” genannt wird, zur Erzeugung von Bibliotheken rekombinanter Polynukleotide, die eine gewünschte charakteristische Eigenschaft aufweisen, nach der selektiert oder gescreent werden kann. In einem Protokoll des ”Sequenz-Shuffling”-Verfahrens werden Bibliotheken rekombinanter Polynukleotide aus einer Population von Polynukleotiden mit verwandter Sequenz erzeugt, die Sequenz-Bereiche umfassen, die im wesentlichen Sequenz-Identität aufweisen und die homolog in vitro oder in vivo rekombiniert werden können. In dem Verfahren werden wenigstens zwei Spezies von Polynukleotiden mit verwandter Sequenz in einem Rekombinationssystem kombiniert, das zur Erzeugung von Polynukleotiden mit rekombinierter Sequenz geeignet ist, worin die Polynukleotide mit rekombinierter Sequenz einen Abschnitt von wenigstens einer ersten Spezies eines Polynukleotids mit verwandter Sequenz mit wenigstens einem benachbarten Abschnitt von wenigstens einer zweiten Spezies eines Polynukleotids mit verwandter Sequenz umfassen. Rekombinations-Systeme, die zur Erzeugung von Polynukleotiden mit rekombinierter Sequenz geeignet sind, können sein: entweder (1) In-vitro-Systeme für eine homologe Rekombination oder ein Sequenz-Shuffling über Amplifikation oder andere, in der vorliegenden Beschreibung beschriebene Formate; oder (2) In-vivo-Systeme für eine homologe Rekombination oder ortsspezifische Rekombination, wie sie in der vorliegenden Beschreibung beschrieben sind. Die Population von Polynukleotiden mit rekombinierter Sequenz umfaßt eine Sub-Population von Polynukleotiden, die gewünschte oder vorteilhafte charakteristische Eigenschaften besitzen und die mittels eines geeigneten Selektions- oder Screening-Verfahrens selektiert werden können. Die selektierten Polynukleotide mit rekombinierter Sequenz, die typischerweise Polynukleotide mit verwandter Sequenz sind, können anschließend wenigstens einem rekursiven Zyklus unterworfen werden, in dem wenigstens ein selektiertes Polynukleotid mit rekombinierter Sequenz mit wenigstens einer verschiedenen Spezies eines Polynukleotids mit verwandter Sequenz (das selbst ein selektiertes Polynukleotid mit rekombinierter Sequenz sein kann) in einem Rekombinationssystem kombiniert wird, das zum Erzeugen von Polynukleotiden mit rekombinierter Sequenz geeignet ist, so daß weitere Generationen von Polynukleotid-Sequenzen mit rekombinierter Sequenz aus den selektierten Polynukleotiden mit rekombinierter Sequenz erzeugt werden, die durch das verwendete Selektions- oder Screening-Verfahren erhalten wurden.
  • Noch spezieller stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Entwickeln eines varianten Polynukleotids zur Aneignung einer gewünschten funktionellen Eigenschaft bereit, das die Schritte umfaßt, daß man eine Amplifikationsreaktion von Polynukleotiden mit Ausgangssubstraten durchführt, welche eine Vielzahl von Varianten eines Polynukleotids umfassen, worin zumindest ein Zyklus der Amplifikationsreaktion ein unvollständiger Amplifikationszyklus ist, der unter Bedingungen ausgeführt wird, die zumindest 20% Amplifikationsprodukte erzeugen, die unvollständig verlängerte Varianten des Polynukleotids umfassen, die Amplifikationsprodukte in die Bestandteil-Stränge denaturiert, welche in unterschiedlichen Paarungen wieder aneinandergelagert werden, um rekombinierte Amplifikationsprodukte zu bilden, welche die Substrate für einen nach folgenden Amplifikationszyklus bilden, bis die Amplifikationsprodukte rekombinante Varianten des Polynukleotids, die Mehrfach-Cross-Overs aufweisen, beinhalten; und die rekombinanten Varianten des Polynukleotids selektiert und screent, um zumindest eine rekombinante Variante zu identifizieren, welche eine gewünschte funktionelle Eigenschaft aufweist.
  • Auf diese Weise erzeugt eine rekursive Sequenz-Rekombination Glieder einer Bibliothek, die Polynukleotide mit rekombinierter Sequenz sind, die die gewünschten charakteristischen Eigenschaften aufweisen. Solche charakteristischen Eigenschaften können beliebige Eigenschaften oder Attribute sein, nach denen selektiert werden kann oder die in einem Screening-System nachgewiesen werden können, und können Eigenschaften umfassen wie beispielsweise ein codiertes Protein, ein Transkriptionselement, eine die Transkription, die Verarbeitung der RNS, die Lebensfähigkeit der RNS, die Chromatinkonformation, die Translation oder eine andere Expressions-Eigenschaft eines Gens oder Transgens steuernde Sequenz, ein replikatives Element, ein ein Protein bindendes Element oder dergleichen, wie jedes beliebige Merkmal, das eine selektierbare oder nachweisbare Eigenschaft verleiht.
  • Aspekte der folgenden Beschreibung, die sich nicht speziell auf die beanspruchte Erfindung beziehen, dienen zum Vergleich und zur Veranschaulichung.
  • Ein Verfahren gemäß der Erfindung kann zur Erzeugung von Bibliotheken von gezeigten Polypeptiden oder gezeigten Antikörpern angewendet werden, die geeignet sind für ein Screening unter Affinitäts-Wechselwirkung oder ein Phänotyp-Screening. Das Verfahren umfaßt die Schritte, daß man (1) eine erste Mehrzahl von ausgewählten Gliedern einer Bibliothek erhält, die ein gezeigtes Polypeptid oder einen gezeigten Antikörper und ein damit assoziiertes Polynukleotid umfassen, das für das gezeigte Polypeptid oder den gezeigten Antikörper codiert, und die assoziierten Polynukleotide oder Kopien erhält, worin die assoziierten Polynukleotide einen Bereich von im wesentlichen identischer Sequenz umfassen, gegebenenfalls Mutationen in die Polynukleotide oder Kopien einführt, und (2) die assoziierten Polynukleotide oder Kopien poolt und fragmentiert und so Fragmente davon unter Bedingungen bildet, die für eine PCR-Amplifikation geeignet sind, eine PCR-Amplifikation und gegebenenfalls eine Mutagenese durchführt und dadurch homogen die Fragmente unter Bildung eines ges huffelten Pools von rekombinierten Polynukleotiden homogen rekombiniert, wodurch eine erhebliche Teilmenge (z. B. mehr als 10%) der rekombinierten Polynukleotide des geshuffelten Pools nicht in der ersten Mehrzahl von selektierten Gliedern der Bibliothek zugegen sind, wobei der geshuffelte Pool eine Bibliothek von gezeigten Polypeptiden oder gezeigten Antikörpern aufbaut, die für ein Screening unter Affinitäts-Wechselwirkung geeignet sind. In wenigstens einem derartigen Shuffling-Zyklus folgt dem Schritt des Poolens eine partielle Ausdehnungs-PCR-Amplifikation. Das Verfahren umfaßt weiter den zusätzlichen Schritt des Screenens der Glieder der Bibliothek des geshuffelten Pools unter Identifizieren individueller geshuffelter Glieder der Bibliothek, die die Fähigkeit haben, sich an ein vorbestimmtes Makromolekül zu binden oder in anderer Weise mit diesem wechselzuwirken (z. B. beispielsweise katalytische Antikörper), wobei das vorbestimmte Makromolekül beispielsweise ein proteinartiger Rezeptor, ein Peptid, ein Oligosaccharid, ein Virion oder eine andere vorbestimmte Verbindung oder Struktur ist. Die gezeigten Polypeptide, Antikörper, peptidomimetischen Antikörper und Sequenzen mit variablen Bereichen, die im Rahmen derartiger Bibliotheken identifiziert werden, können für therapeutische, diagnostische, Forschungs- und verwandte Zwecke (z. B. als Katalysatoren, gelöste Stoffe zur Erhöhung der Osmolarität einer wäßrigen Lösung oder dergleichen) verwendet werden, und/oder sie können einem oder mehreren zusätzlichen Zyklen des Shufflings und/oder der Affinitätsselektion unterworfen werden. Das Verfahren kann in der Weise modifiziert werden, daß der Schritt des Selektieren ein Selektieren im Hinblick auf eine Phänotyp-Eigenschaft erfolgt, die verschieden ist von derjenigen der Bindungsaffinität gegenüber einem vorbestimmten Molekül (z. B. für katalytische Aktivität, Stabilität, Oxidationsbeständigkeit, Beständigkeit gegenüber Arzneimitteln oder ein nachweisbarer Phänotyp, der einer Wirtszelle verliehen wird).
  • In einer Ausführungsform wird die erste Mehrzahl von selektierten Gliedern der Bibliothek fragmentiert und homogen durch PCR in vitro rekombiniert. Die Bildung von Fragmenten erfolgt durch Verdauen mit einer Nuklease, PCR-Amplifikation unter partieller Ausdehnung, PCR-Stuttering oder andere geeignete Fragmentierungsmittel, wie sie in der vorliegenden Beschreibung beschrieben werden, mit der Maßgabe, daß PCR-Stuttering in wenigstens einem Shuffling-Zyklus durchgeführt wird. Der Begriff ”Stuttering” wird nachfolgend in der Weise verwendet, daß er sich auf eine Fragmentierung durch unvollständige Polymerase-Ausdehnung von Templaten bezieht. Ein Rekombinations-Format, das auf sehr kurzen PCR-Ausdehnungszeiten basiert, wurde zur Schaffung partieller PCR-Produkte verwendet, die sich weiter von einem verschiedenen Muster (Template) in dem/den nächsten (und dem/den darauffolgenden) Zyklus/Zyklen ausdehnen.
  • In einer Ausführungsform werden Kombinationen von In-vitro- und In-vivo-Shuffling bereitgestellt, um die kombinatorische Vielgestaltigkeit zu erhöhen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Erzeugen von Bibliotheken gezeigter Antikörper, die für ein Screening durch Affinitätswechselwirkung geeignet sind. Das Verfahren umfaßt die Schritte, daß man (1) eine erste Mehrzahl von selektierten Gliedern einer Bibliothek erhält, die einen gezeigten Antikörper und ein damit assoziiertes Polynukleotid umfassen, das für den gezeigten Antikörper codiert, und die assoziierten Polynukleotide oder Kopien davon erhält, worin die assoziierten Polynukleotide einen Bereich einer Sequenz mit im wesentlichen identischem Rahmen eines variablen Bereichs umfassen; und (2) die assoziierten Polynukleotide oder Kopien poolt und fragmentiert und so Fragmente davon unter Bedingungen bildet, die für eine PCR-Amplifikation geeignet sind und dadurch homogen die Fragmente rekombiniert und so einen geshuffelten Pool von rekombinierten Polynukleotiden bildet, die neue Kombinationen von CDRs umfassen, wodurch eine wesentliche Teilmenge (z. B. mehr als 10%) der rekombinierten Polynukleotide des geshuffelten Pools CDR-Kombinationen umfassen, die in der ersten Mehrzahl von selektierten Gliedern der Bibliothek nicht vorhanden sind, wobei der geshuffelte Pool eine Bibliothek von gezeigten Antikörpern aufbaut, die CDR-Mutationen umfassen und für ein Screening über Affinitäts-Wechselwirkung geeignet sind. Gegebenenfalls wird der geshuffelte Pool einem Affinitätsscreening unterworfen und so geshuffelte Glieder der Bibliothek selektiert, die sich an ein vorbestimmtes Epitop (Antigen) binden, wodurch eine Mehrzahl von selektierten geshuffelten Gliedern der Bibliothek selektiert wird. Gegebenenfalls kann die Mehrzahl von selektierten geshuffelten Gliedern der Bibliothek wiederholt geshuffelt und gescreent werden, und zwar über 1 bis etwa 1000 Zyklen oder so lange wie gewünscht, bis Glieder der Bibliothek erhalten werden, die eine gewünschte Bindungsaffinität aufweisen.
  • Dementsprechend schafft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Einführen einer oder mehrerer Mutationen in ein doppelsträngiges Templat-Polynukleotid, wobei das doppelsträngige Templat-Polynukleotid in statistische Fragmente einer gewünschten Größe gespalten oder mittels PCR amplifiziert wurde (über partielle Ausdehnung oder Stuttering), indem man der resultierenden Population doppelsträngiger Fragmente ein oder mehrere einsträngige oder doppelsträngige Oligonukleotide zusetzt, wobei die Oligonukleotide einen Identitätsbereich und einen Heterologiebereich gegenüber dem Templat-Polynukleotid umfassen, die resultierende Mischung doppelsträngiger statistischer Fragmente und Oligonukleotide zu einzelsträngigen Fragmenten denaturiert, die resultierende Population einzelsträngiger Fragmente mit einer Polymerase unter Bedingungen inkubiert, die zu einem Zusammenfügen der Einzelstrang-Fragmente in Bereichen der Identität zwischen den Einzelstrang-Fragmenten und zur Bildung mutagenisierter doppelsträngiger Polynukleotide führen, und die vorgenannten Schritte wiederholt, sofern dies erwünscht ist.
  • In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zum Herstellen rekombinanter Proteine mit biologischer Aktivität durch die Schritte, daß man eine Probe, die doppelsträngige Templat-Polynukleotide umfaßt, die für ein Protein des Wild-Typs codieren, unter Bedingungen behandelt, die für die Spaltung der Templat-Polynukleotide in statistische Doppelstrang-Fragmente führt, die eine gewünschte Größe aufweisen; der resultierenden Population statistischer Fragmente ein oder mehrere einzel- oder doppelsträngige Oligonukleotide zusetzt, wobei die Oligonukleotide Bereiche mit Identität und Bereiche mit Heterologie gegenüber dem Templat-Polynukleotid umfassen; die resultierende Mischung doppelsträngiger Fragmente und Oligonukleotide in einzelsträngige Fragmente denaturiert; die resultierende Population einzelsträngiger Fragmente mit einer Polymerase unter Bedingungen inkubiert, die zum Zusammenfügen der einzelsträngigen Fragmente in Bereichen der Identität und zur Bildung eines mutagenisierten Doppelstrang-Polynukleotids führen; die obigen Schritte wiederholt, wenn dies erwünscht ist; und anschließend das rekombinante Protein aus dem mutagenisierten Doppelstrang-Polynukleotid exprimiert.
  • Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist gerichtet auf ein Verfahren zum Erhalt eines Chimär-Polynukleotids mit den Schritten, daß man eine Probe, die verschiedene Doppelstrang-Templat-Polynukleotide umfaßt, worin die verschiedenen Templat-Polynukleotide Bereiche mit Identität und Bereiche mit Heterologie enthalten, unter Bedingungen behandelt, die zur Spaltung der Templat-Polynukleotide in statistische Doppelstrang-Fragmente mit gewünschter Größe führen; die resultierenden statistischen Doppelstrang-Fragmente, die in der behandelten Probe enthalten sind, zu Einzelstrang-Fragmenten denaturiert; die resultierenden Einzelstrang-Fragmente mit Polymerase unter Bedingungen inkubiert, die zum Zusammenfügen der Einzelstrang-Fragmente in den Bereichen mit Identität und zur Bildung einer doppelsträngigen Chimär-Polynukleotid-Sequenz führen, die Templat-Polynukleotid-Sequenzen umfaßt; und die obigen Schritte wiederholt, sofern dies erwünscht ist.
  • Ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist gerichtet auf ein Verfahren zur Replikation eines Templat-Polynukleotids mit den Schritten, daß man in vitro Einzelstrang-Template-Polynukleotide mit kleinen statistischen einzelsträngigen Fragmenten zusammengibt, die aus der Spaltung und Denaturierung des Templat-Polynukleotids resultieren, und die Mischung aus Nukleinsäure-Fragmenten in Gegenwart einer Nukleinsäurepolymerase unter Bedingungen inkubiert, bei denen eine Population aus Doppelstrang-Templat-Polynukleotiden gebildet wird.
  • Ein Polynukleotid-Shuffling gemäß der Erfindung kann durchgeführt werden, um Polynukleotide, die für Polypeptide codieren, und/oder Polynukleotide, die Transkriptions-Regulation-Sequenzen umfassen, zu shuffeln.
  • Ein Verfahren gemäß der Erfindung kann auch angwendet werden, um eine Population von Virus-Genen (z. B. Capsid-Proteinen, Spike-Glykoproteinen, Polymerasen, Proteasen usw.) oder Virus-Genomen (z. B. von Paramyxoviriden, Orthomyxoviriden, Herpesviren, Retroviren, Reoviren, Rhinoviren usw.) zu shuffeln. In einer Ausführungsform schafft die Erfindung ein Verfahren zum Shuffeln von Sequenzen, die für alle oder für Teilmengen von immunogenen Virus-Proteinen codieren, unter Erzeugung neuer Kombinationen von Epitopen sowie von neuen Epitopen, die durch Rekombination geschaffen werden. Solche geshuffelten viralen Proteine können Epitope oder Kombinationen von Epitopen umfassen, von denen es wahrscheinlich ist, daß sie in der natürlichen Umgebung als Folge einer viralen Evolution entstehen (z. B. durch Rekombination von Influenzavirus-Stämmen).
  • Ein Polynukleotid-Shuffling gemäß der Erfindung kann auch angewendet werden zum Shuffeln einer Population von Protein-Varianten wie beispielsweise taxonomisch verwandten, strukturell verwandten und/oder funktionell verwandten Enzymen und/oder mutierten Varianten davon unter Schaffung und Identifikation vorteilhafter neuer Polypeptide beispielsweise von Enzymen mit geänderten Eigenschaften bei der Katalyse, geändertem Temperaturprofil, geänderter Stabilität, geänderter Oxidationsbeständigkeit oder eines anderen gewünschten Merkmals, nach dem selektiert werden kann. Es werden Verfahren geschaffen, die für eine molekulare Evolution und eine gerichtete molekulare Evolution geeignet sind. Zum fokussierenden Richten von Selektionsdruck bzw. Selektionsdrücken auf spezielle Teile von Polynukleotiden (wie beispielsweise ein Segment eines codierenden Bereichs) werden geschaffen.
  • Die Erfindung schafft auch ein Verfahren, das zum Shuffeln von Polynukleotid-Sequenzen geeignet ist, um Gentherapie-Vektoren und durch Replikation defekte Gentherapie-Konstrukte zu erzeugen, wie sie beispielsweise zur Human-Gentherapie verwendet werden können, die einschließen, jedoch nicht beschränkt sind auf Vaccinationsvektoren für eine Impfung auf DNS-Basis, sowie Antineoplasie-Gentherapie und andere Gentherapie-Formate.
  • Als spezielles Beispiel kann ein Sequenz-Shuffling angewendet werden zur Erzeugung eines verstärkten Grünfluoreszenz-Proteins (GFP) und von Polynukleotiden, die für dieses codieren, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, daß man ein DNS-Shuffling an einem für GFP codierenden Expressionsvektor durchführt und nach Varianten selektiert oder screent, die eine verstärkte gewünschte Eigenschaft aufweisen, wie beispielsweise eine verstärkte Fluoreszenz. In einer Variation des Verfahrens umfaßt eine Ausführungsform einen Schritt der fehlerbehafteten oder mutagenen Amplifikation, Propagation in einem Mutator-Stamm (z. B. in einer Wirtszelle, die einen Hypermutations-Phänotyp aufweist; mut2; usw.; in Hefe-Stämmen, wie beispielsweise denjenigen, die beschrieben wurden in ”Klein (1995), Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 51, 217), der chemischen Mutagenese oder der auf bestimmte Stellen gerichteten Mutagenese. In einer Ausführungsform umfaßt das verstärkte GFP-Protein eine Punktmutation außerhalb des chromophoren Bereichs (Aminosäuren 64 bis 69), vorzugsweise in dem Bereich von Aminosäure 100 bis Aminosäure 173, mit speziell bevorzugten Ausführungsformen bei Rest 100, 154 und 164. Typischerweise ist die Mutation eine Substitutionsmutation wie beispielsweise F100S, M154T oder V164V. In einer Ausführungsform wird bei der Mutation ein hydrophiler Rest anstelle eines hydrophoben Rest substituiert. In einer Ausführungsform sind mehrere Mutationen in dem verstärkten GFP-Protein und dem für dieses codierenden Polynukleotid zugegen.
  • Zur Verbesserung des Sequenz-Shuffling-Verfahrens kann wenigstens ein Zusatzstoff verwendet werden, der die Geschwindigkeit oder das Ausmaß des Wiederzusammenfügens oder der Rekombination von Polynukleotiden mit verwandter Sequenz verbessert. In einer Ausführungsform ist dieser Zusatzstoff Polyethylenglykol (PEG), das typischerweise einer Shuffling-Reaktion in einer Endkonzentration von 0,1 bis 25% zugesetzt wird, häufig bis zu einer Endkonzentration von 2,5 bis 15%, bevorzugt bis zu einer Endkonzentration von etwa 10%. In einer Ausführungsform ist der Zusatzstoff Dextransulfat, das typischerweise einer Shuffling-Reaktion bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 25% zugesetzt wird, häufig in einer Konzentration von etwa 10%. In einer Ausführungsform ist der Zusatzstoff ein Mittel, das die Sequenz-Spezifität des Wiederzusammenfügens verringert und die Misch-Hybridisierung und/oder -Rekombination in vitro fördert. In einer alternativen Ausführungsform ist der Zusatzstoff ein Mittel, das die Sequenzspezifität des Wiederzusammenfügens erhöht und eine hochgradig getreue Hybridisierung und/oder Rekombination in vitro fördert. Andere langkettige Polymere, die die Reaktion nicht stören, können auch verwendet werden (z. B. Polyvinylpyrrolidon usw.).
  • Ein verbessertes Shuffling-Verfahren kann den Zusatz wenigstens eines Zusatzstoffs einschließen, der ein kationisches Detergens (oberflächenaktives Mittel) ist. Beispiele geeigneter kationischer Detergenzien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB) und Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) und dergleichen.
  • Ein verbessertes Shuffling-Verfahren kann den Zusatz wenigstens eines Zusatzstoffes einschließen, der ein rekombinogenes Protein ist, das das homologe Paaren und/oder den Strang-Austausch in vitro katalysiert oder nicht-katalytisch verstärkt. Beispiele geeigneter rekombinogener Proteine schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: E. coli recA-Protein, das T4-uvsX-Protein, das rec1-Protein von Ustilago maydis, andere Rekombinasen der recA-Familie aus anderen Spezies, Einzelstrang-Bindungsproteine (SSB-Proteine), Ribonukleoprotein A1 und dergleichen. Das Shuffling kann angewendet werden, um eine oder mehrere Eigenschaft(en) eines rekombinogenen Proteins zu verbessern. Beispielsweise können recA codierende Mutanten-Sequenzen geshuffelt werden, und verbesserte hitzestabile Varianten können durch rekursive Sequenz-Rekombination selektiert werden.
  • Nichtspezifische (für eine allgemeine Rekombination geeignete) Rekombinasen, wie beispielsweise Topoisomerase I, Topoisomerase II (Tse et al. (1980), J. Biol. Chem. 255, 5560; Trask et al. (1984), EMBO J. 3, 671) und dergleichen können verwendet werden, um In-vitro-Rekombinations-Reaktionen zu katalysieren, um eine Mehrzahl von Polynukleotid-Spezies mit verwandter Sequenz durch die rekursiven Verfahren gemäß der Erfindung zu shuffeln.
  • Ein verbessertes Shuffling-Verfahren kann den Zusatz wenigstens eines Zusatzstoffes einschließen, der ein Enzym ist, das eine Exonuklease-Aktivität aufweist, die bei dem Schritt des Entfernens von Nicht-Templat-Nukleotiden aktiv ist, die an den 3'-Enden von Produkt-Polynukleotiden bei Shuffling-Amplifikation-Reaktionen eingeführt werden, die durch eine nichtkontrollierende Polymerase katalysiert werden. Ein Beispiel eines geeigneten Enzyms, das Exonuklease-Aktivität aufweist, schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf Pfu-Polymerase. Andere geeignete Polymerasen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf:
    Thermus flavus-DNS-Polymerase (Tf1);
    Thermus thermophilus-DNS-Polymerase (Tth);
    Thermococcus litoralis-DNS-Polymerase (T1i, Vent);
    Pyrococcus Woesei-DNS-Polymerase (Pwo);
    Thermotoga maritima-DNS-Polymerase (UltMa);
    Thermus brockianus-DNS-Polymerase (Thermozyme);
    Pyrococcus furiosus-DNS-Polymerase (Pfu);
    Thermococcus sp.-DNS-Polymerase (9'Nm);
    Pyrococcus sp.-DNS-Polymerase ('Deep Vent');
    Bacteriophage T4-DNS-Polymerase;
    Bacteriophage T7-DNS-Polymerase;
    E. coli-DNS-Polymerase I (native und Klenow);
    E. coli-DNS-Polymerase III.
  • Die vorliegende Erfindung schafft ein Shuffling-Verfahren, in dem wenigstens ein Amplifikation-Zyklus (d. h. eine Extension mit einer Polymerase) von wiederzusammengefügten fragmentierten Polynukleotiden, die Glieder der Bibliothek sind, unter Bedingungen zum ”Stuttern” durchgeführt wird, die eine wesentliche Fraktion, typischerweise wenigstens 20% oder mehr, unvollständig extendierter Amplifikationsprodukte erzeugen. Die Amplifikationsprodukte, einschließlich der unvollständig extendierten Amplifikationsprodukte, werden denaturiert und wenigstens einem weiteren Zyklus des Wiederzusammenfügens und der Amplifikation unterworfen. In diesem zusätzlichen Zyklus fügen sich die unvollständig extendierten Produkte zu verschiedenen Templat-Spezies mit verwandter Sequenz zusammen und bilden eine Prime-Extension daran aus.
  • Wenigstens ein Amplifikationszyklus kann unter Verwendung einer Sammlung von überlappenden Einzelstrang-DNS-Fragmenten variierender Längen durchgeführt werden, die einer ersten Polynukleotid-Spezies oder einem Satz von Polynukleotid-Spezies mit verwandter Sequenz entsprechen, worin jedes überlappende Fragment jeweils hybridisieren kann, und exprimieren kann, eine Polynukleotidketten-Ausdehnung aus einer zweiten Polynukleotid-Spezies, die als Templat dient, wodurch hinsichtlich der Sequenz rekombinierte Polynukleotide gebildet werden und worin die hinsichtlich der Sequenz rekombinierten Polynukleotide einen Abschnitt aus wenigstens einer ersten Polynukleotid-Spezies mit einem benachbarten Abschnitt der zweiten Polynukleotid-Spezies umfassen, die als Templat dient. In einer Variation dieses Verfahrens enthält die zweite Polynukleotid-Spezies, die als Templat dient, Uracil (d. h. ist ein Templat des Kunkel-Typs) und ist im wesentlichen in Zellen nicht replizierbar. Dieser Aspekt der Erfindung kann auch wenigstens zwei rekursive Zyklen dieser Variation umfassen.
  • In einer Ausführungsform kann die PCR durchgeführt werden, wobei der Nukleotid-Mix eine Nucleotid-Spezies umfaßt, die Uracil als die Base aufweist. Das/die PCR-Produkt(e) kann/können dann durch Verdauung mit einer UDG-Glykosylase fragmen tiert werden, die Strang-Bruchstücke erzeugt. Die Fragment-Stelle kann durch den Anteil an Uracil enthaltendem NTP in dem PCR-Mix gesteuert werden.
  • Ein Verfahren gemäß der Erfindung kann wenigstens einen Amplifikationszyklus umfassen, der mit einem Zusatzstoff oder einer Polymerase unter geeigneten Bedingungen durchgeführt wird, die ein Templat-Switching fördern. In einer Ausführungform, in der Taq-Polymerase zur Amplifikation verwendet wird, verstärkt ein Zusatz von RecA oder anderen Polymerasen (z. B. Virus-Polymerasen, reverse Transkriptase) das Templat-Switching. Das Templat-Switching kann auch verstärkt werden durch Erhöhen der DNS-Templat-Konzentration, neben anderen Mitteln, die Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt sind.
  • In einer Ausführungsform werden Bibliotheken von Polynukleotiden mit rekombinierter Sequenz erzeugt aus Polynukleotiden mit verwandter Sequenz, die in der Natur vorkommende Gene oder Allele eines Gens sind. In diesem Aspekt werden wenigstens zwei in der Natur vorkommende Gene und/oder Allele, die Regionen von wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfassen, die wenigstens 70% Identität hinsichtlich der Sequenz aufweisen, vorzugsweise wenigstens 90% Identität hinsichtlich der Sequenz, aus einem Pool von Gen-Sequenzen ausgewählt, beispielsweise durch Hybrid-Selektion oder über eine computerisierte Sequenz-Analyse unter Verwendung von Sequenzdaten aus einer Datenbank. In einem Aspekt werden wenigstens drei in der Natur vorkommende Gene und/oder Allele, die Bereiche von wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfassen, die wenigstens 70% Identität hinsichtlich der Sequenz aufweisen, vorzugsweise, die wenigstens 90% Identität hinsichtlich der Sequenz aufweisen, aus einem Pool von Gen-Sequenzen ausgewählt, beispielsweise durch Hybrid-Selektion oder über eine computerisierte Sequenz-Analyse unter Verwendung von Sequenzdaten aus einer Datenbank. Die ausgewählten Sequenzen werden als Polynukleotide erhalten, entweder durch Klonen oder über eine DNS-Synthese, und werden nach einer der verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung geshuffelt.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Multipool-Shuffling-Prozeß durchgeführt. Ein Shuffling von Mehrfach-Pools von Polynukleotid-Sequenzen macht es möglich, daß jeder getrennte Pool eine unterschiedliche kombinatorische Lösung zur Schaffung der gewünschten Eigenschaft erzeugt. Bei dieser Variation wird der Pool aus parentalen Polynukleotid-Sequenzen (oder irgendeine nachfolgende geshuffelte Bibliothek oder ein selektierter Pool von Gliedern einer Bibliothek) unterteilt (oder aufgeteilt) in zwei oder mehr einzelne Pools von Sequenzen, und diese werden getrennt einer oder mehreren Runden der rekursiven Sequenz-Rekombination und Selektion (oder Screening) unterworfen. Sofern erwünscht, können gegebenenfalls ausgewählte Glieder der Bibliothek aus jedem getrennten Pool in den letztgenannten Runden des Shufflings rekombiniert (integriert) werden. Alternativ können mehrere getrennte parentale Pools verwendet werden. Ein Prozeß des Einzüchtens, in dem selektierte (oder gescreente) Glieder der Bibliothek innerhalb eines Pools miteinander durch rekursive Sequenz-Rekombinationsverfahren gemäß der Erfindung gekreuzt werden, kann durchgeführt werden, und zwar allein oder in Kombination mit einem Auszüchten, in dem Glieder von Bibliotheken verschiedener Pools miteinander durch rekursive Sequenz-Rekombinationsverfahren gemäß der Erfindung gekreuzt werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren weiter den Schritt, daß man nicht-geshuffelte Produkte (z. B. parentale Sequenzen) von Polynukleotiden mit rekombinierter Sequenz entfernt, die nach irgendeinem der offenbarten Shuffling-Verfahren hergestellt werden. Nicht-geshuffelte Produkte können entfernt oder vermieden werden, indem man eine Amplifikation durchführt mit (1) einem ersten PCR-Primer, der zu einer ersten parentalen Polynukleotid-Spezies hybridisiert, jedoch nicht wesentlich zu einer zweiten parentalen Polynukleotid-Spezies hybridisiert; und (2) einem zweiten PCR-Primer, der zu einer zweiten parentalen Polynukleotid-Spezies hybridisiert, jedoch nicht wesentlich zu der ersten parentalen Polynukleotid-Spezies hybridisiert, so daß eine Amplifikation von Templaten erfolgt, die den Anteil der ersten parentalen Sequenz umfassen, der zu dem ersten PCR-Primer hybridisiert, und auch den Anteil der zweiten parentalen Sequenz umfassen, der zu dem zweiten PCR- Primer hybridisiert, so daß nur Polynukleotide mit rekombinierter Sequenz amplifiziert werden.
  • Es versteht sich für den Fachmann, daß verschiedene In-vitro-Mutagen-Verfahren bei der Herstellung einer Start-Population von Polynukleotid-Varianten verwendet werden können, einschließlich der Verabreichung chemischer oder radiologischer Mutagene an Wirtszellen. Beispiele solcher Mutagene schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf MNU, NEU, MNNG, Nitrosoharnstoff, BuDR und dergleichen. Ultraviolettes Licht kann auch verwendet werden, um Mutationen zu erzeugen.
  • Ionisierende Strahlung und clastogene Mittel können auch verwendet werden, um die Mutationsfrequenz zu erhöhen und/oder die Rekombination zu beschleunigen und/oder eine Fragmentierung von Polynukleotiden zu bewirken.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist ein schematisches Diagramm, das das mutagene Shuffling mit der fehlerbehafteten PCR vergleicht; (a) bedeutet die anfängliche Bibliothek; (b) bedeutet den Pool selektierter Sequenzen in der ersten Runde der Affinitäts-Selektion; (c) bedeutet fehlerbehaftete PCR; (d) bedeutet In-vitro-Rekombination der selektierten Sequenzen (”Shuffling”); (e) bedeutet den Pool selektierter Sequenzen in einer zweiten Runde der Affinitätsselektion nach der fehlerbehafteten PCR; (f) bedeutet den Pool von selektierten Sequenzen in einer zweiten Runde der Affinitätsselektion nach dem Shuffling.
  • 2 veranschaulicht den Zusammenbau eines 1,0 kb großen LacZ-Alpha-Gen-Fragments aus 10 bis 50 bp großen statistischen Fragmenten. (a) ist eine Photographie eines Gels eines mit PCR amplifizierten DNS-Fragments, das das LacZ-Alpha-Gen aufweist. (b) ist eine Photographie eines Gels eines DNS-Fragments nach dem Verdauen mit DNAseI. (c) ist eine Photographie eines Gels eines DNS-Fragments mit 10 bis 50 bp, das durch Reinigung aus dem verdauten LacZ-Alpha-Gen-DNS-Fragment erhalten wurde. (d) ist eine Photographie eines Gels der 10 bis 50 bp großen DNS-Fragmente nach der angegebenen Zahl von Zyklen des DNS-Zusammenbaus; (e) ist eine Photographie eines Gels der Rekombinations-Mischung nach der Amplifikation durch PCR mit Primern.
  • 3 ist eine schematische Veranschaulichung der LacZ-Alpha-Gen-Stopcodon-Mutanten und ihrer DNS-Sequenzen. Die in einem Kasten gezeichneten Regionen sind heterologe Bereiche, die als Marker dienen. Die Stopcodons sind in kleineren Kästen angeordnet oder unterstrichen. ”+” zeigt ein Gen des Wild-Typs an und ”–” zeigt einen mutierten Bereich in dem Gen an.
  • 4 ist eine schematische Veranschaulichung der Einführung oder des Spikings eines synthetischen Oligonukleotids in den Zusammenbau-Prozeß des LacZ-Alpha-Gens.
  • 5 veranschaulicht die Bereiche von Homologie zwischen einem Mause-IL1-B-Gen (M) und einem menschlichen IL1-B-Gen (H) bei Gebrauch als Codon in E. Coli. Regionen mit Heterologie sind mit einem Kasten eingerahmt. Die Angaben ”T” zeigen Cross-Over an, die erhalten werden bei Shuffling der beiden Gene.
  • 6 ist ein schematisches Diagramm des Antikörper-CDR-Shuffling-Modellsystems bei Verwendung des scFv von Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (A10B).
  • 7 (Abbildungen A–D) veranschaulicht die beobachtete Häufigkeit des Auftretens bestimmter Kombinationen von CDR(s) in der geshuffelten DNS des scFv. Abbildung (A) zeigt die Länge und Mutagenese-Rate aller sechs synthetischen CDRs. Abbildung (B) zeigt den Aufbau der Bibliothek, die erhalten wurde durch Shuffling von scFv mit allen sechs CDRs. Abbildung (c) zeigt den CDR-Einschub, der bestimmt wurde durch PCR mit Primern für native CDRs. Abbildung (D) zeigt die Einschub-Raten und -Verteilungen der synthetischen CDR-Einschübe.
  • 8 veranschaulicht die verbesserte Avidität des scFv-Anti-Kaninchen-Antikörpers nach DNS-Shuffling mit jedem Zyklus der Selektion.
  • 9 stellt schematisch pBR322-Sfi-BL-LA-Sfi und eine In-vivo-intraplasmidische Rekombination über direkte Wiederholvorgänge sowie die Rate der Erzeugung Ampicillin-resistenter Kolonien durch intraplasmidische Rekombination dar, die ein funktionelles Beta-Lactamase-Gen rekonstituiert.
  • 10 stellt schematisch pBR322-Sfi-2Bla-Sfi und eine In-vivo-intraplasmidische Rekombination über direkte Wiederholungsschritte sowie die Rate der Bildung von Ampicillin-resistenten Kolonien durch intraplasmidische Rekombination dar, die ein funktionelles Beta-Lactamase-Gen rekonstituiert.
  • 11 stellt das Verfahren zum Testen der Effizienz mehrerer Runden homologer Rekombination nach der Einführung der Polynukleotid-Fragmente in Zellen für die Erzeugung rekombinanter Proteine dar.
  • 12 stellt schematisch die Erzeugung einer Bibliothek von Vektoren durch Shuffeln von Kassetten an den folgenden Orten dar: Promoter, Leader-Peptid, Terminator, selektierbares Medikament-Resistenz-Gen und Ursprung der Replikation. Die zahlreichen parallelen Linien an jedem Ort (Lokus) stehen für die Multiplizität von Kassetten für die jeweilige Kassette.
  • 13 zeigt schematisch einige Beispiele von Kassetten, die an verschiedenen Loci (Orten) zum Konstruieren prokaryotischer Vektor-Bibliotheken durch Shuffling geeignet sind.
  • 14 zeigt den prokaryotischen GFP-Expressionsvektor PBAD-GFP (5.371 bp), der abgeleitet wurde von pBAD18 (Guzman et al. (1995), J. Bacteriol. 177, 4121).
  • Der eukaryotische GFP-Expressionsvektor Alpha+GFP (7.591 bp) wurde abgeleitet von dem Vektor Alpha+ (Whitehorn et al. (1995), Bio/Technology 13, 1215).
  • 15A und 15B zeigen einen Vergleich der Fluoreszenz-Daten verschiedener GFP-Konstrukte in ganzen E. coli-Zellen. Verglichen werden das ”Clontech”-Konstrukt, das eine 24 Aminosäuren lange N-terminale Ausdehnung enthält, das ”Affymax”-Wildtyp-Konstrukt (”wt”, mit verbessertem Codon-Gebrauch) und die Mutanten, die erhalten wurden nach 2 und nach 3 Zyklen einer sexuellen PCR und Selektion (”Zyklus 2”, ”Zyklus 3”). Das ”Clontech”-Konstrukt wurde mit IPTG induziert, während die anderen Konstrukte mit Arabinose induziert wurden. Alle Proben wurden bei gleichem OD600 getestet. 15A zeigt Fluoreszenzspektren, die angeben, daß das Fluoreszenzsignal für die gesamte Zelle aus dem ”WT”-Konstrukt um das 2,8-fache größer ist als das Signal von dem ”Clontech”-Konstrukt. Das Signal der ”Zyklus 3”-Mutante ist um das 16-fache erhöht gegenüber demjenigen der Affymax-”wt”-Mutante und um das 45-fache gegenüber dem ”Clontech”-wt-Konstrukt. 15B ist ein Vergleich der Anregungsspektren von GPF-Konstrukten in E. coli. Die Anregungs-Peak-Wellenlängen sind unverändert durch die Mutationen, die selektiert wurden.
  • 16 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von relativen GPF-Protein-Expressionsniveaus. Abbildung (a) 12% Tris-Glyzin-SDS-PAGE-Analyse (Novex, Encinitas, CA) gleicher Mengen (OD600) ganzer E. coli-Zellen, die den Wild-Typ, die Mutante des Zyklus 2 oder die Mutante des Zyklus 3 von GFP exprimieren. Gefärbt wurde mit Coomassie-Blau. GFP (27 kD) stellt etwa 75% des Gesamt-Proteins dar, und die Selektion erhöhte das Expressionsniveau nicht. Abbildung (b): 12% Tris-Glyzin-SDS-PAGE-Analyse (Novex, Encinitas, CA) gleicher Mengen (OD600) von E. Coli-Fraktionen; Spur 1: Pellet lysierter Zellen, die wt-GFP exprimieren; Spur 2: Überstand lysierter Zellen, die wt-GFP exprimieren. Die überwiegende Menge des wt-GFP liegt in Einschlußkörpern vor; Spur 3: Pellet aus lysierten Zellen, die das GFP der Zyklus-3-Mutante exprimieren; Spur 4: Überstand lysierter Zellen, die das GFP der Zyklus-3-Mutante exprimieren. Die überwiegende Menge des wt-GPF ist unlöslich. Das GFP, das in Einschlußkörpern endet, enthält das Chromophor nicht, da es in dieser Fraktion keine nachweisbare Fluoreszenz gibt.
  • 17 zeigt eine Mutationsanalyse der Mutanten der Zyklen 2 und 3 gegenüber dem GFP des Wild-Typs. Abbildung (A) zeigt, daß die Mutationen auseinandergezogen sind und nicht nahe dem Chromophor-Tripeptid zusammen in Clustern vorliegen. Die Mutationen F100S, M154T und V164A schließen den Ersatz hydrophober Reste durch mehr hydrophile Reste ein. Die erhöhte Hydrophilie kann dazu beitragen, das Protein in einen natürlichen Falt-Pfad zu leiten und weniger in Richtung auf eine Aggregation oder Bildung von Einschlußkörpern. Abbildung (B) zeigt eine Selektionskarte, die den Chromophor-Bereich und die Positionen der eingeführten Mutationen angibt.
  • 18A und 18B zeigen einen Vergleich von CHO-Zellen, die verschiedene GFP-Proteine exprimieren. 18A ist eine FACS-Analyse von Klonen von CHO-Zellen, die verschiedene GFP-Mutanten exprimieren. 18B zeigt die Fluoreszenz-Spektroskopie von Klonen von CHO-Zellen, die verschiedene GFP-Mutanten exprimieren.
  • 19 zeigt die Verstärkung der Resistenz gegenüber Arsenat-Toxizität als Ergebnis des Shuffelns des pGJ103-Plasmids, das das Arsenat-Detoxifikationsweg-Operon enthält.
  • 20 zeigt schematisch die Erzeugung von kombinatorischen Bibliotheken unter Verwendung synthetischer oder in der Natur vorkommender Intron-Sequenzen als Basis für eine Rekombination einer Vielzahl von Extron-Spezies, denen Sequenzidentität fehlen kann (wie beispielhaft durch statistische Sequenz-Exons gezeigt wird), worin eine homologe und/oder hinsichtlich des Orts spezifische Rekombination zwischen Intron-Sequenzen bestimmter Glieder einer Bibliothek auftritt.
  • 21 zeigt schematisch Variationen des Verfahrens zum Shuffling von Exons. Die Zahlen beziehen sich auf Leserahmen, wie in Abbildung (A) gezeigt wird. Abbildung (B) zeigt die verschiedenen Klassen von Intron und Exon, bezogen auf ihre jeweiligen einzelnen Spleißrahmen. Abbildung (C) liefert ein Beispiel eines in der Natur vorkommenden Gens (Immunoglobulin-V-Gene), die für ein Shuffling geeignet sind. Die Abbildungen D bis F zeigen, wie mehrere Exons über PCR unter Verwendung von Primern concatemerisiert werden können, die Intron-Segmente spannen, so daß passende Spleiß-Rahmen erhalten werden, wenn dies erwünscht ist. Abbildung (G) veranschaulicht den Exon-Shuffling-Prozeß (IG: Immunoglobulin-Exon; IFN: Interferon-Exon).
  • 22 zeigt schematisch ein Exon-Spleiß-Rahmen-Diagramm für einige Human-Gene, das zeigt, daß bevorzugte Einheiten für das Shuffling von Exons in demselben Speiß-Rahmen beginnen und enden, so daß ein Spleiß-Modul (oder Shuffling-Exon) mehrere natürlich vorkommende Exons umfassen kann, jedoch typischerweise denselben Spleiß-Rahmen an jedem Ende aufweist.
  • 23 zeigt schematisch, wie eine partielle PCR-Extension (”Stuttering”) dazu verwendet werden kann, eine rekursive Sequenz-Rekombination (”Shuffling”) zu ergeben, die zu einer Bibliothek von Chimären führt, die Mehrfach-Cross-Overs darstellen.
  • 24 zeigt, wie der Prozeß des Stuttering verwendet werden kann, um eine Wild-Typ-Sequenz mit einer mehrfach mutierten Sequenz zu shuffeln und so einen optimalen Satz von Mutationen über Shuffling zu erzeugen.
  • 25 zeigt schematisch eine Plasmid-Plasmid-Rekombination über Elektroporation einer Zellpopulation, die eine Spezies mit mehreren Plasmiden darstellt, die anfänglich als Spezies mit einem einzigen Plasmid pro Zelle vor dem Elektroporation-Verfahren und als Mehrfach-Plasmid-Spezies pro Zelle, die geeignet ist für eine In-vivo-Rekombination im Anschluß an die Elektroporation der Zellpopulation zugegen war.
  • 26 zeigt eine Plasmid-Plasmid-Rekombination.
  • 27 zeigt eine Plasmid-Virus-Rekombination.
  • 28 zeigt eine Virus-Virus-Rekombination.
  • 29 zeigt eine Plasmid-Chromosom-Rekombination.
  • 30 zeigt eine durch Konjugation vermittelte Rekombination.
  • 31 zeigt die Rate der Gewinnung von Ab-Phage gegen den Selektionszyklus. Ein Prozeß des Shufflings wurde nach den Selektionsrunden 2 bis 8 angewendet. Der Gesamt-Anstieg ist ein Anstieg auf das 440-fache.
  • 32 zeigt die Bindungsspezifität nach zehn Selektionsrunden, einschließlich zwei Runden des Backcrossings. Das ELISA-Signal ist ein Signal verschiedener Ab-Phage-Klone für acht Humanprotein-Targets.
  • 33 zeigt die Rate der Wiedergewinnung von Ab-Phage gegen das Mutagenese-Verfahren.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Wiederzusammenbau von Nukleinsäure-Molekülen nach statistischer Fragmentierung und seine Anwendung auf die Mutagenese von DNS-Sequenzen. Auch beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-Fragmenten, die für Mutanten-Proteine codieren, die eine ver stärkte biologische Aktivität aufweisen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Durchführung wiederholter Zyklen der Mutagenese, des Nukleinsäure-Shufflings und der Selektion, die die Schaffung von Mutanten-Proteinen ermöglichen, die eine verstärkte biologische Aktivität aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf ein Verfahren zur Erzeugung einer sehr großen Bibliothek aus DNS-, RNS- oder Protein-Mutanten. In Ausführungsformen, in denen ein metabolisches Enzym oder ein Multikomponenten-Weg einem Prozeß des Shufflings unterworfen wird, kann eine Bibliothek die resultierenden Metaboliten zusätzlich zu einer Bibliothek des/der geshuffelten Enzyme(s) umfassen. Dieses Verfahren hat spezielle Vorteile bei der Erzeugung verwandter DNS-Fragmente, von denen das/die gewünschte(n) Nukleinsäurefragment(e) selektiert werden kann/können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren der Durchführung wiederholter Zyklen der Mutagenese, homologen Rekombination und Selektion, die die Schaffung von Mutanten-Proteinen erlauben, die eine verstärkte biologische Aktivität aufweisen.
  • Jedoch werden vor einer Diskussion der vorliegenden Erfindung im weiteren Detail die folgenden Begriffe zuerst definiert.
  • Definitionen
  • Die folgenden, im Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendeten Begriffe bzw. Terme haben die folgenden Bedeutungen:
    Der Begriff ”DNS-Zusammenbau” wird verwendet, wenn eine Rekombination zwischen identischen Sequenzen stattfindet.
  • Im Gegensatz dazu wird der Begriff ”DNS-Shuffling” in der vorliegenden Beschreibung verwendet, um eine Rekombination zwischen im wesentlichen homologen, je doch nicht-identischen Sequenzen anzugeben. In einigen Ausführungsformen kann ”DNS-Shuffling” einen Cross-Over über nicht-homologe Rekombination einschließen, wie beispielsweise über cre/lox-Systeme und/oder flp/frt-Systeme und dergleichen, so daß eine Rekombination nicht im wesentlichen homologe Polynukleotid-Sequenzen erfordern muß. Homologe und nicht-homologe Rekombinations-Formate können angewendet werden, und können – in einigen Ausführungsformen – Molekül-Chimären und/oder Molekül-Hybride von im wesentlichen unähnlichen Sequenzen erzeugen.
  • Der Begriff ”Amplifikation” bedeutet, daß die Zahl von Kopien eines Nukleinsäure-Fragments erhöht wird.
  • Der Begriff ”identisch” oder ”Identität” bedeutet, daß zwei Nukleinsäuresequenzen dieselbe Sequenz oder eine komplementäre Sequenz aufweisen. Damit bedeutet der Begriff ”Bereiche mit Identität” oder ”Identitätsbereiche”, daß Regionen oder Bereiche eines Nukleinsäure-Fragments oder eines Polynukleotids identisch oder komplementär zu einem anderen Polynukleotid oder Nukleinsäure-Fragment sind.
  • Der Begriff ”entspricht” wird in der vorliegenden Beschreibung in der Weise verwendet, daß er bedeutet, daß eine Polynukleotid-Sequenz homolog ist (d. h. identisch ist, nicht strikt evolutionär verwandt) zu einer gesamten Referenz-Polynukleotid-Sequenz oder einem Teil davon oder daß eine Polypeptid-Sequenz identisch zu einer Referenz-Polypeptid-Sequenz ist. Im Gegensatz dazu wird der Begriff ”komplementär” in der vorliegenden Beschreibung in der Weise verwendet, daß er bedeutet, daß die komplementäre Sequenz homolog zu einer gesamten Referenz-Polynukleotid-Sequenz oder einem Teil davon ist. Zur Veranschaulichung wird angeführt, daß die Nukleotid-Sequenz ”TATAC” einer Referenz-Sequenz ”TATAC” entspricht und komplementär zu einer Referenz-Sequenz ”GTATA” ist.
  • Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Sequenz-Beziehungen zwischen zwei oder mehreren Polynukleotiden zu beschreiben: ”Referenz-Sequenz”, ”Vergleichsfenster”, ”Sequenz-Identität”, ”Prozentwert der Sequenz-Identität” und ”wesentliche Identität”. Eine ”Referenz-Sequenz” ist eine definierte Sequenz, die als Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird. Eine Referenz-Sequenz kann ein Unter-Satz einer größeren Sequenz sein, beispielsweise als Segment einer cDNS voller Länge oder einer Gen-Sequenz, die in einer Sequenz-Listung angegeben ist, wie beispielsweise eine Polynukleotid-Sequenz von 1 oder 2(b) oder kann eine vollständige cDNS oder Gensequenz umfassen. Allgemein weist eine Referenz-Sequenz wenigstens eine Länge von 20 Nukleotiden auf, hat häufig eine Länge von wenigstens 25 Nukleotiden und hat häufig eine Länge von wenigstens 50 Nukleotiden. Da zwei Polynukleotide jeweils (1) eine Sequenz (d. h. einen Teil der vollständigen Polynukleotid-Sequenz) umfassen können, die bei den beiden Polynukleotiden ähnlich ist, und (2) weiter eine Sequenz umfassen können, die zwischen den beiden Polynukleotiden verschieden ist, werden Sequenz-Vergleiche zwischen zwei (oder mehreren) Polynukleotiden typischerweise durchgeführt, indem man Sequenzen der beiden Polynukleotide über ein ”Vergleichsfenster” hinweg vergleicht und so lokale Bereiche von Sequenz-Ähnlichkeit identifiziert und vergleicht.
  • Der Begriff ”Vergleichsfenster”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf ein gedachtes Segment von wenigstens 20 benachbarten Nukleotid-Positionen, worin eine Polynukleotid-Sequenz mit einer Referenz-Sequenz von wenigstens 20 benachbarten Nukleotiden verglichen werden kann und worin der Abschnitt der Polynukleotid-Sequenz in dem Vergleichsfenster Zusätze oder Streichungen (z. B. Lücken) von 20% oder weniger umfassen kann, verglichen mit der Referenz-Sequenz (die Zusätze oder Streichungen nicht umfaßt), für eine optimale lineare Anordnung der beiden Sequenzen. Eine optimale lineare Anordnung von Sequenzen zur Anordnung eines Vergleichsfensters kann durchgeführt werden mittels des lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2, 482, mittels des Homologie-Anordnungs-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48, 443, mittels der Verfahrensweise der Suche nach Ähnlichkeit gemäß Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 2444, mittels computerisierter Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem ”Wisconsin Genetics Software Package, Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Anschauen, und es wird die beste lineare Anordnung (d. h. die aus dem höchsten Prozentwert Homologie im Bereich des Vergleichsfensters resultiert), die nach den verschiedenen Verfahrensweisen erzeugt wird, ausgewählt.
  • Der Begriff ”Sequenzidentität” bedeutet, daß zwei Polynukleotid-Sequenzen identisch sind (d. h. auf der Grundlage der Überprüfung Nukleotid für Nukleotid) über den Bereich des Vergleichsfensters. Der Begriff ”Prozentwert der Sequenz-Identität” wird berechnet durch Vergleichen von zwei optimal in Reihe befindlichen Sequenzen über das Vergleichsfenster, Bestimmen der Zahl von Positionen, an denen die identische Nukleinsäure-Base (z. B. A, T, C, G, U oder I) in beiden Sequenzen auftritt, wodurch man die Zahl von übereinstimmenden Positionen erhält, Teilen der Zahl von übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl von Positionen in dem Vergleichsfenster (d. h. die Fenstergröße), und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100 unter Erhalt des Prozentwerts der Sequenz-Identität. Der Begriff ”wesentliche Identität”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, gibt eine charakteristische Eigenschaft der Polynukleotid-Sequenz dahingehend an, daß das Polynukleotid eine Sequenz umfaßt, die wenigstens 80% Sequenzidentität, vorzugsweise wenigstens 85% Identität und häufig 90 bis 95% Sequenzidentität, noch mehr üblich wenigstens 99% Sequenz-Identität aufweist, verglichen mit einer Referenz-Sequenz über ein Vergleichs-Fenster von wenigstens 20 Nukleotid-Positionen, häufig über ein Fenster von wenigstens 25 bis 50 Nukleotiden, worin die Prozentzahl der Sequenz-Identität berechnet wird durch Vergleichen der Referenz-Sequenz mit der Polynukleotid-Sequenz, die Streichungen oder Zusätze einschließen kann, die einen Gesamtwert von 20% oder weniger der Referenz-Sequenz über das Vergleichsfenster erreichen.
  • Konservative Werte des Ersatzes von Aminosäuren beziehen sich auf die Austauschbarkeit von Werten, die ähnliche Seitenketten aufweisen. Beispielsweise ist eine Gruppe von Aminosäuren, die aliphatische Seitenketten aufweisen, die Gruppe aus Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin; eine Gruppe aus Aminosäuren, die aliphatische, mit Hydroxygruppen substituierte Seitenketten aufweisen, ist Serin und Threonin; eine Gruppe von Aminosäuren, die Amid enthaltende Seitenketten aufweisen, ist Asparagin und Glutamin; eine Gruppe von Aminosäuren, die aromatische Seitenketten aufweisen, ist Phenylalanin, Thyrosin und Tryptophan; eine Gruppe von Aminosäuren, die basische Seitenketten aufweisen, ist Lysin, Arginin und Histidin; und eine Gruppe von Aminosäuren, die Schwefel enthaltende Seitenketten aufweisen, ist Cystein und Methionin. Bevorzugte konservative Aminosäure-Substitutionsgruppen sind: Valin-Leucin-Isoleucin; Phenylalanin-Tyrosin; Lysin-Arginin; Alanin-Valin; und Asparagin-Glutamin.
  • Der Begriff ”homolog” oder ”homöolog” bedeutet, daß eine einsträngige Nukleinsäure-Sequenz zu einer komplementären einsträngigen Nukleinsäure-Sequenz hybridisieren kann. Der Grad der Hybridisierung kann von einer Anzahl von Faktoren abhängen, die die Menge an Identität zwischen den Sequenzen und die Hybridisierungsbedingungen, wie beispielsweise Temperatur und Salz-Konzentration einschließen, wie dies später diskutiert wird. Vorzugsweise ist die Region der Identität größer als etwa 5 bp, noch mehr bevorzugt ist die Region der Identität größer als 10 bp.
  • Der Begriff ”heterolog” bedeutet, daß eine einsträngige Nukleinsäure-Sequenz nicht in der Lage ist, zu einer anderen einsträngigen Nukleinsäure-Sequenz oder deren Komplement zu hybridisieren. So bedeutet der Begriff ”Bereiche mit Heterologie”, daß Nukleinsäure-Fragmente oder Polynukleotide Bereiche oder Regionen in der Sequenz aufweisen, die nicht in der Lage sind, mit einer anderen Nukleinsäure oder einem anderen Polynukleotid zu hybridisieren. Solche Regionen oder Bereiche sind beispielsweise Bereiche von Mutationen.
  • Der Begriff ”Cognat”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf eine Gen-Sequenz, die zwischen Spezies evolutionär und funktionell verwandt ist. Beispielsweise, jedoch nicht als Beschränkung gedacht, ist in dem menschlichen Genom das menschliche CD4-Gen das Cognat-Gen zu dem Mause-CD4-Gen, da die Sequenzen und Strukturen dieser beiden Gene anzeigen, daß sie hochgradig homolog sind und beide Gene für ein Protein codieren, das bei der Signalgebung für die T-Zellen-Aktivierung über eine MHC-Klasse II-beschränkte Antigen-Erkennung funktioniert.
  • Der Begriff ”Wild-Typ” bedeutet, daß das Nukleinsäure-Fragment irgendwelche Mutationen nicht enthält. Der Begriff ”Protein des Wild-Typs” bedeutet, daß das Protein auf einem Aktivitätsniveau, wie es in der Natur gefunden wird, aktiv ist und typischerweise die Aminosäure-Sequenz umfaßt, die in der Natur gefunden wird. In einem Aspekt der Erfindung kann der Begriff ”Wild-Typ” oder ”Parental-Sequenz” eine Start- oder Referenz-Sequenz vor einer Anwendung der Erfindung angeben.
  • Der Begriff ”verwandte Polynukleotide” bedeutet, daß Regionen oder Bereiche der Polynukleotide identisch sind und Regionen oder Bereiche der Polynukleotide heterolog sind.
  • Der Begriff ”Chimären-Polynukleotid” bedeutet, daß das Polynukleotid Regionen umfaßt, die Regionen des Wild-Typs sind, und Regionen umfaßt, die mutiert sind. Der Begriff kann auch bedeuten, daß das Polynukleotid Regionen des Wild-Typs von einem Polynukleotid und Regionen des Wild-Typs von einem anderen verwandten Polynukleotid umfaßt.
  • Der Begriff ”Spalten” bedeutet das Verdauen des Polynukleotids mit Enzymen oder das Brechen des Polynukleotids oder das Erzeugen von über eine Teillänge verlaufenden Kopien einer oder mehrerer Eltern-Sequenz(en), über partielle PCR-Ausdehnung, PCR-Stuttering, Differential-Fragment-Amplifikation oder andere Mittel der Erzeu gung von über eine Teillänge laufenden Kopien einer oder mehrerer parentaler Sequenzen.
  • Der Begriff ”Population”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bedeutet eine Sammlung von Komponenten wie beispielsweise Polynukleotiden, Nukleinsäure-Fragmenten oder Proteinen. Eine ”gemischte Population” bedeutet eine Sammlung von Komponenten, die zu derselben Familie von Nukleinsäuren oder Proteinen gehören (d. h. die verwandt sind), die jedoch in ihrer Sequenz und damit auch in ihrer biologischen Aktivität unterschiedlich sind (d. h. nicht identisch sind).
  • Der Begriff ”spezifisches Nukleinsäure-Fragment” bedeutet ein Nukleinsäure-Fragment, das bestimmte Endpunkte aufweist und das eine bestimmte Nukleinsäure-Sequenz aufweist. Zwei Nukleinsäure-Fragmente, in denen ein Nukleinsäure-Fragment die identische Sequenz wie ein Teil des zweiten Nukleinsäure-Fragments ist, die jedoch unterschiedliche Enden aufweisen, umfassen zwei unterschiedliche spezielle Nukleinsäure-Fragmente.
  • Der Begriff ”Mutationen” bedeutet Änderungen der Sequenz einer Nukleinsäure-Sequenz des Wild-Typs oder Änderungen der Sequenz eines Peptids. Solche Mutationen können Punkt-Mutationen, wie beispielsweise Übergänge oder Umformungen sein. Die Mutationen können Streichungen, Einschübe oder Duplikationen sein.
  • In der in der vorliegenden Beschreibung verwendeten Polypeptid-Notation ist die nach links gerichtete Richtung die amino-terminale Richtung, und die nach rechts gerichtete Richtung ist carboxy-terminale Richtung, in Übereinstimmung mit dem Standardgebrauch und der Konvention. In ähnlicher Weise und so lange dies nicht speziell anders angegeben ist, ist das linke Ende von einsträngigen Polynukleotid-Sequenzen das 5'-Ende; die nach links gerichtete Richtung der doppelsträngigen Polynukleotid-Sequenzen wird als die 5'-Richtung bezeichnet. Die Richtung der 5'- nach 3'-Zugabe entstehender RNS-Transkripte wird als die Transkriptionsrichtung bezeichnet; Se quenz-Regionen auf dem DNS-Strang, die dieselbe Sequenz wie die RNS aufweisen und die in 5'-Richtung zu dem 5'-Ende des RNS-Transkripts liegen, werden als ”stromaufwärtsliegende Sequenzen” bezeichnet. Sequenz-Regionen auf dem DNS-Strang, die dieselbe Sequenz wie die RNS aufweisen und die in 3'-Richtung zu dem 3'-Ende des codierenden RNS-Transkripts liegen, werden als ”stromabwärtsliegende Sequenzen” bezeichnet.
  • Der Begriff ”natürlich auftretend” oder ”in der Natur auftretend”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird und auf ein Objekt angewendet wird, bezieht sich auf die Tatsache, daß ein Objekt in der Natur gefunden werden kann. Beispielsweise ist ein Polypeptid oder eine Polynukleotid-Sequenz, die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorhanden ist, die aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann und die nicht beabsichtigt vom Menschen im Labor modifiziert wurde, in der Natur vorkommend oder natürlich vorkommend. Allgemein bezieht sich der Begriff ”natürlich vorkommend” auf ein Objekt, wie es in einem nicht-pathologischen ”nicht-kranken” Individuum vorhanden ist, wie es beispielsweise typisch für die Spezies wäre.
  • Der Begriff ”Mittel” wird in der vorliegenden Beschreibung dazu verwendet, eine chemische Verbindung, eine Mischung chemischer Verbindungen, eine Anordnung von im Raum lokalisierten Verbindungen (z. B. eine VLSIPS-Peptid-Anordnung, eine Polynukleotid-Anordnung und/oder eine kombinatorisch kleine Molekül-Anordnung), ein biologisches Makromolekül, eine Bakteriophagen-Peptid-Zeige-Bibliothek, eine Bakteriophagen-Antikörper(z. B. scFv)-Zeige-Bibliothek, eine Polysom-Peptid-Zeige-Bibliothek oder ein Extrakt zu bezeichnen, das aus biologischen Materialien wie beispielsweise Bakterien-, Pflanzen-, Pilz- oder Tier-(insbesondere Säuger-)zellen oder -geweben hergestellt wurde. Mittel werden bewertet hinsichtlich einer potentiellen Aktivität als Antineoplasie-Mittel, gegen Entzündungen gerichtete (antiinflammatorische) Mittel oder Apoptose-Modulatoren, indem man sie in Screening-Anordnungen einschließt, wie sie nachfolgend beschrieben werden. Mittel werden bewertet hinsichtlich potentieller Aktivität als spezielle Protein-Wechselwirkungs-Inhibitoren (d. h. ein Mittel, das selektiv eine Bindungs-Wechselwirkung zwischen zwei vorbestimmten Polypeptiden inhibiert, das jedoch nicht wesentlich die Lebensfähigkeit der Zelle beeinträchtigt) durch Einschluß in nachfolgend beschriebene Screenings-Tests.
  • Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff ”im wesentlichen rein” bedeutet, daß eine Objekt-Spezies im wesentlichen die vorherrschende vorhandende Spezies ist (d. h. auf Basis der molaren Menge ist diese häufiger vorhanden als die beliebige andere individuelle makromolekulare Spezies in der Zusammensetzung), und bedeutet vorzugsweise, daß eine im wesentlichen gereinigte Fraktion eine Zubereitung ist, in der die Objekt-Spezies wenigstens etwa 50% (auf Mol-Basis) aller makromolekularer Spezies umfaßt, die vorhanden sind. Allgemein umfaßt eine im wesentlichen reine Zubereitung mehr als etwa 80 bis 90% aller makromolekularen Spezies, die in der Zubereitung vorhanden sind. Am meisten bevorzugt ist die Objekt-Spezies bis zu – im wesentlichen – Homogenität gereinigt (verunreinigende bzw. kontaminierende Spezies können in der Zubereitung mit herkömmlichen Nachweis-Methoden nicht nachgewiesen werden), worin die Zubereitung im wesentlichen aus einer einzigen makromolekularen Spezies besteht. Lösungsmittel-Spezies, kleine Moleküle (< 500 D (Dalton)) und elementare ionische Spezies werden nicht als makromolekulare Spezies angesehen.
  • Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, bezieht sich der Begriff ”physiologische Bedingungen” auf Temperatur-, pH-, Ionenstärke-, Viskositäts- und ähnliche biochemische Parameter, die mit einem lebensfähigen Organismus kompatibel sind und/oder die typischerweise intrazellulär in einer lebensfähigen kultivierten Hefe-Zelle oder Säuger-Zelle existieren. Beispielsweise sind die intrazellulären Bedingungen in einer Hefe-Zelle, die unter typischen Labor-Kultur-Bedingungen gezüchtet wurde, physiologische Bedingungen. Geeignete In-vitro-Reaktionsbedingungen für In-vitro-Transkriptions-Cocktails sind allgemein physiologische Bedingungen. Im allgemeinen umfassen In-vitro-physiologische Bedingungen 50 bis 200 mM NaCl oder KCl, einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5, eine Temperatur von 20 bis 45°C und eine Konzentration von 0,001 bis 10 mM an zweiwertigen Kationen (z. B. Mg++, Ca++); vorzugsweise eine Konzentration von etwa 150 mM NaCl oder KCl, einen pH-Wert von 7,2 bis 7,6 und eine Konzentration an divalenten Kationen von 5 mM und schließen oft eine Konzentration von 0,1 bis 1,0% an nicht-spezifischem Protein (z. B. BSA) ein. Ein nicht-ionisches Detergens (oberflächenaktives Mittel) (Tween, NP-40, Triton X-100) kann häufig zugegen sein, üblicherweise in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 2%, typischerweise von 0,05 bis 0,2% (v/v). Besondere wäßrige Bedingungen können von einem in diesem technischen Bereich praktisch Erfahrenen nach herkömmlichen Verfahrensweisen gewählt werden. Als allgemeine Leitlinie können die folgenden gepufferten wäßrigen Bedingungen anwendbar sein: 10 bis 250 mM NaCl; 5 bis 50 mM Tris-HCl; pH: 5 bis 8; bei optionaler Zugabe eines oder mehrerer zweiwertiger Kation(en) und/oder Metall-Chelator(en) und/oder nicht-ionischer Detergens/Detergentien und/oder Membran-Fraktion(en) und/oder Antischaum-Mittel und/oder Scintillationsmittel.
  • Eine spezielle Hybridisierung ist in der vorliegenden Beschreibung definiert als Bildung von Hybriden zwischen einem ersten Polynukleotid und einem zweiten Polynukleotid (z. B. einem Polynukleotid, das eine eigene, jedoch im wesentlichen identische Sequenz wie das erste Polynukleotid aufweist), worin das erste Polynukleotid vorzugsweise mit dem zweiten Polynukleotid unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen hybridisiert und wobei im wesentlichen nicht verwandte Polynukleotid-Sequenzen keine Hybride in der Mischung bilden.
  • Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, bezieht sich der Begriff ”Einzelketten-Antikörper” auf ein Polypeptid, das eine VH-Domäne und eine VL-Domäne in Polypeptid-Bindung zueinander umfaßt, allgemein über ein Spacer-Peptid miteinander verbunden (z. B. das Peptid [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x) und das zusätzliche Aminosäure-Sequenzen an den Amino- und/oder Carboxy-Termini umfassen kann. Beispielsweise kann ein Einzelketten-Antikörper ein Tether-Segment zum Binden an ein codierendes Polynukleotid umfassen. Als Beispiel kann genannt werden, daß scFv ein Einzelketten-Antikörper ist. Einzelketten-Antikörper sind allgemein Proteine, die aus einem oder mehreren Polypeptidsegment(en) von wenigstens 10 benachbarten Aminosäuren bestehen, die im wesentlichen codiert werden von Genen der Immunoglobulin-Überfamilie (z. B. siehe ”The Immunoglobulin Gene Superfamily, A. F. Williams and A. N. Barclay”; in: ”Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F. W. Alt, and T. H. Rabbitts, (Herausgeber), 1989, Academic Press, San Diego, CA, Seiten 361 bis 387”). Am häufigsten werden sie codiert von einer schwerkettigen oder leichtkettigen Gensequenz von Nagern, nicht-menschlichen Primaten, Vögeln, Schweinen, Rindern, Brütern, Ziegen oder Menschen. Ein funktioneller Einzelketten-Antikörper enthält allgemein einen ausreichenden Anteil eines Immunoglobulin-Überfamilien-Genprodukts und behält dadurch die Fähigkeit, sich an ein spezielles Target-Molekül zu binden, typischerweise an einen Rezeptor oder ein Antigen (Epitop).
  • Wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, bezieht sich der Begriff ”Komplementarität bestimmende Region” und ”CDR” auf den in diesem technischen Bereich anerkannten Begriff, wie er beispielhaft durch die CDR-Definitionen von Kabat und Chothia angegeben wird, die auch allgemein bekannt sind als hypervariable Regionen oder hypervariable Schleifen (Chothia and Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196, 901; Chothia et al. (1989), Nature 342, 877; E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD) (1987); und Tramontano et al. (1990), J. Mol. Biol. 215, 175). Domänen mit variablen Regionen umfassen typischerweise die aminoterminalen etwa 105 bis 115 Aminosäuren einer in der Natur vorkommenden Immunoglobulin-Kette (z. B. die Aminosäuren 1 bis 110), obwohl variable Domänen, die geringfügig kürzer oder länger sind, ebenfalls zur Ausbildung von Einzelketten-Antikörpern geeignet sind.
  • Eine leichtkettige oder schwerkettige variable Region eines Immunoglobulins besteht aus einer ”Rahmen”-Region, die durch drei hypervariable Regionen unterbrochen wird, die auch CDR's genannt werden. Der Umfang der Rahmen-Region und der CDR's wurden präzise definiert (siehe ”Sequences of Proteins of Immunological Interest, ” E. Kabat et al., 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD (1987)). Die Sequenzen der Rahmen-Regionen verschiedener leichter oder schwerer Ketten werden relativ innerhalb einer Spezies bewahrt. Der Ausdruck ”Human-Netz-Bereich”, wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, ist ein Rahmen-Bereich der im wesentlichen identisch ist (etwa 85% oder mehr, üblicherweise 90 bis 95% oder mehr) dem Rahmen-Bereich eines natürlich vorkommenden Human-Immunoglobulins. Der Rahmen-Bereich eines Antikörpers, d. h. die kombinierten Rahmen-Bereiche der leichten und schweren Ketten, die diesen ausmachen, dient dazu, die CDR's zu positionieren und in Reihe zu bringen. Die CDR's sind vornehmlich verantwortlich für das Binden an ein Epitop eines Antigens.
  • Der Begriff ”variables Segment”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf einen Abschnitt eines entstehenden Peptids, das eine statistische, pseudostatistische oder definierte Kern-Sequenz umfaßt. Ein variables Segment kann Positionen sowohl mit varianten als auch mit invarianten Resten umfassen, und der Grad der Variation der Reste in einer bestimmten Position varianter Reste kann beschränkt werden. Beide Optionen werden nach Kenntnis und Auswahl des Praktikers gewählt. Typischerweise haben variable Segmente eine Länge von etwa 5 bis 20 Aminosäure-Resten (z. B. 8 bis 10), obwohl variable Segmente länger sein können und Antikörper-Abschnitte oder Rezeptor-Proteine umfassen können, wie beispielsweise ein Antikörper-Fragment, ein Nukleinsäure-Bindungsprotein, ein Rezeptor-Protein und dergleichen.
  • Der Begriff ”statistische Peptid-Sequenz”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf eine Aminosäure-Sequenz, die aus zwei oder mehreren Aminosäure-Monomeren aufgebaut ist und im Rahmen eines stochastischen oder statistischen Prozesses aufgebaut wird. Ein statistisches Peptid kann Rahmen-Motive oder Gerüst-Motive einschließen, die invariante Sequenzen umfassen können.
  • Der Begriff ”statistische Peptid-Bibliothek”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf einen Satz Polynukleotid-Sequenzen, der für einen Satz statistischer Peptide codiert, und auf den Satz statistischer Peptide, für die durch diese Polynukleotid-Sequenzen codiert wird, sowie die Fusionsproteine, die diese statistischen Peptide enthalten.
  • Der Begriff ”pseudostatistisch”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf einen Satz von Sequenzen, die eine beschränkte Variabilität aufweisen, so daß beispielsweise der Grad der Variabilität der Reste an einer Position verschieden ist von dem Grad der Variabilität der Reste an einer anderen Position. Für jede pseudostatistische Position wird ein gewisser Grad an Variation der Reste zugelassen, wenn auch umschrieben.
  • Der Begriff ”definiertes Sequenz-Netzwerk”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf einen Satz definierter Sequenzen, die auf einer nicht-statistischen Basis ausgewählt werden, allgemein auf der Basis von experimentellen Daten oder Strukturdaten. Beispielsweise kann ein definiertes Sequenz-Netzwerk einen Satz von Aminosäure-Sequenzen umfassen, von denen vorausgesagt wird, daß sie eine β-Sheet-Struktur ausbilden, oder kann – neben anderen Varianten, ein Leucin-Reißverschluß-Heptaden-Wiederholungsmotiv oder eine Zink-Finger-Domäne umfassen. Ein ”definierter Sequenz-Kern” ist ein Satz von Sequenzen, die einen begrenzten Umfang von Variabilität einschließen. Einerseits kann (1) eine vollständig statistische 10-mer-Sequenz der 20 herkömmlichen Aminosäuren irgendeine von (20)10-Sequenzen sein; andererseits kann (2) eine pseudostatistische 10-mer-Sequenz der 20 herkömmlichen Aminosäuren irgendeine von (20)10-Sequenzen sein, jedoch zeigen diese eine Vorbestimmung für bestimmte Reste an bestimmten Positionen und/oder insgesamt; (3) ein definierter Sequenz-Kern ist ein Unter-Satz von Sequenzen, der kleiner ist als die Maximalzahl potentieller Sequenzen, wenn jede Position eines Rests irgendeine der erlaubbaren 20 herkömmlichen Aminosäuren (und/oder erlaubbare nicht-konventionelle Amino-/Iminosäuren) sein kann. Ein definierter Sequenz-Kern umfaßt allgemein variante und nicht-variante Positionen von Resten und/oder umfaßt variante Positionen von Resten, die einen Rest umfassen können (der aus einem definierten Unter-Satz von Aminosäure-Resten gewählt ist) und dergleichen, entweder segmentbezogen oder über die gesamte Länge der individuellen gewählten Sequenz von Gliedern der Bibliothek. Definierte Sequenzkerne können sich entweder auf Aminosäure-Sequenzen oder Polynukleotid-Sequenzen beziehen. Zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung wird angeführt, daß die Sequenzen (NNK)10 und (NNM)10, worin N für A, T, G, oder C steht, K für G oder T steht und M für A oder C steht, als Sequenz-Kerne definiert sind.
  • Der Begriff ”Epitop”, wie er in der vorliegenden Beschreibung definiert ist, bezieht sich auf den Abschnitt eines Antigens oder anderen Makromoleküls, der in der Lage ist, eine bindende Wechselwirkung auszubilden, die mit der Bindungstasche im variablen Bereich eines Antikörpers wechselwirkt. Typischerweise manifestiert sich eine derartige bindende Wechselwirkung als intermolekularer Kontakt mit einer oder mehreren Aminosäure-Resten eines CDR.
  • Der Begriff ”Rezeptor”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das eine Affinität für einen gegebenen Liganden hat. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle sein. Rezeptoren können in unverändertem Zustand oder als Aggregate mit anderen Spezies verwendet werden. Rezeptoren können kovalent oder nicht-kovalent an ein Bindeglied gebunden werden, und zwar entweder direkt oder über eine spezielle bindende Substanz. Beispiele von Rezeptoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Antikörper, einschließlich monoklonaler Antikörper, und Antiseren, die mit speziellen Antigen-Determinanten reagieren (wie beispielsweise auf Viren, Zellen oder anderen Materialien), Zellmembran-Rezeptoren, komplexe Kohlehydrate und Glykoproteine, Enzyme und Hormon-Rezeptoren.
  • Der Begriff ”Ligand”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül wie beispielsweise ein statistisches Peptid oder eine Sequenz mit variablen Segmenten, das von einem speziellen Rezeptor erkannt wird. Wie ein Fachmann in diesem technischen Bereich erkennt, kann ein Molekül (oder makromolekularer Komplex) sowohl ein Rezeptor als auch ein Ligand sein. Allgemein wird der Bindungspartner, der das geringere Molekulargewicht aufweist, als ”Ligand” bezeichnet, und der Bindungspartner, der das größere Molekulargewicht aufweist, wird als ”Rezeptor” bezeichnet.
  • Die Begriffe ”Linker” oder ”Spacer”, wie sie in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, beziehen sich auf ein Molekül oder eine Gruppe von Molekülen, die zwei Moleküle verbinden, wie beispielsweise ein DNS-Bindungsprotein und ein statistisches Peptid, und dieses Molekül dient dazu, die beiden Moleküle in eine bevorzugte Konfiguration zueinander zu bringen, z. B. in der Weise, daß sich das statistische Peptid an einen Rezeptor bei minimaler sterischer Hinderung durch das DNS-Bindungsprotein binden kann.
  • Der Begriff ”operativ verbunden”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf eine Verbindung von Polynukleotid-Elementen in einer funktionellen Beziehung. Eine Nukleinsäure ist ”operativ verbunden”, wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nukleinsäure-Sequenz gebracht wird. Beispielsweise ist ein Promoter oder Verstärker operativ an eine codierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der codierenden Sequenz beinflußt. ”Operativ gebunden” bedeutet, daß die DNS-Sequenzen, die gebunden sind, typischerweise benachbart sind und in den Fällen, in denen es erforderlich ist, zwei codierende Bereiche eines Proteins zu vereinigen, benachbart und in einem Leserahmen sind.
  • Der Begriff ”rekursive Sequenzkombination”, wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf ein Verfahren, durch das eine Population von Polynukleotid-Sequenzen miteinander rekombiniert wird, und zwar mittels irgendeines geeigneten Rekombination-Mittels (z. B. sexuelle PCR, homologe Rekombination, stellen-spezifische Rekomination usw.), wodurch eine Bibliothek von Spezies mit rekombinierter Sequenz erzeugt wird, die anschließend gescreent oder einer Selektion unterworfen wird, wodurch diejenigen Spezies mit rekombinierter Sequenz erhalten werden, die eine gewünschte Eigenschaft aufweisen. Die selektierten Spezies werden dann wenigstens einem zusätzlichen Zyklus der Rekombination miteinander und/oder mit anderen Polynukleotid-Spezies und einer anschließenden Selektion oder einem Screening nach der gewünschten Eigenschaft unterzogen.
  • Das Screening ist allgemein ein in zwei Schritten ablaufender Prozeß, in dem man zuerst bestimmt, welche Zellen einen Screening-Marker exprimieren, oder nicht exprimieren, und man anschließend physikalisch die Zellen abtrennt, die die gewünschte Eigenschaft haben. Selektion ist eine Form des Screenings, in der Identifikation und physikalische Trennung gleichzeitig durch Expression eines Selektionsmarkers erreicht werden, der unter bestimmten genetischen Umständen ermöglicht, daß Zellen, die den Marker exprimieren, überleben, während andere Zellen sterben (oder umgekehrt). Screening-Marker schließen Luziferase, β-Galaktosidase und das grün fluoreszierende Protein ein. Selektionsmarker schließen Gene für Beständigkeit gegenüber Arzneimitteln und Toxinen ein. Obwohl eine spontane Selektion im Verlauf einer natürlichen Evolution passieren kann und tatsächlich passiert, wird in den vorliegenden Verfahren eine Selektion vom Menschen durchgeführt.
  • Methodik
  • Nukleinsäure-Shuffling ist ein Verfahren zur rekursiven homologen In-vitro- oder In-vivo-Rekombination von Pools von Nukleinsäure-Fragmenten oder Polynukleotiden. Mischungen verwandter Nukleinsäure-Sequenzen oder Polynukleotide werden statistisch oder pseudostatistisch fragmentiert und wieder zusammengebaut und ergeben eine Bibliothek oder eine gemischte Population von rekombinanten Nukleinsäure-Molekülen oder Polynukleotiden.
  • Im Gegensatz zur Kassetten-Mutagenese erlauben nur das Shuffling und die fehlerbehaftete PCR (oder die Anwendung anderer mutationsverstärkender Verfahren; chemische Mutagenese, Mutator-Stämme usw.), einen Pool von Sequenzen blind zu mutieren (ohne andere Sequenz-Information als Primer).
  • Der Vorteil des mutagenen Shufflings gemäß der vorliegenden Erfindung gegenüber der fehlerbehafteten PCR allein für eine wiederholte Selektion kann am besten erklärt werden mit einem Beispiel aus dem Antikörper-Engineering. In 1 ist ein schematisches Diagramm des DNS-Shufflings gezeigt, wie es in der vorliegenden Beschreibung beschrieben ist. Die anfängliche Bibliothek kann aus verwandten Sequenzen unterschiedlichen Ursprungs bestehen (d. h. Antikörper aus naivem mRNS) oder kann durch irgendeine Art Mutagenese (einschließlich Shuffling) eines einzelnen Antikörper-Gens abgeleitet sein. Eine Sammlung ausgewählter, die Komplementarität bestimmender Regionen (complementarity determining regions; CDRs) wird erhalten nach der ersten Runde der Affinitäts-Selektion (1). In dem Diagramm verleihen die dicken CDRs dem Antikörper-Molekül erhöhte Affinität für das Antigen. Ein Shuffling ermöglicht die freie kombinatorische Assoziation aller CDR's1 mit allen CDR's2 mit allen CDR's3 usw. (1).
  • Dieses Verfahren unterscheidet sich von der PCR dadurch, daß es eine Inversketten-Reaktion ist. Bei der PCR wächst die Zahl von Molekülen exponentiell. Beim Shuffling bleibt jedoch die Zahl der Polymerase-Start-Stellen und die Zahl von Molekülen im wesentlichen dieselbe. Wenn eine Verdünnung verwendet wird, um ein weiteres Verlängern der Moleküle zu ermöglichen, wird der Shuffling-Prozeß eine Inversketten-Reaktion, die weniger Moleküle erzeugt.
  • Da in Bereichen von Homologie Cross-Overs stattfinden, erfolgt eine Rekombination vornehmlich zwischen Gliedern derselben Sequenz-Familie. Dies verhindert Kombinationen von CDRs, die in breitem Maße inkompatibel sind (z. B. gegen verschiedene Epitope desselben Antigens gerichtet sind). Es wird in Betracht gezogen, daß mehrere Sequenz-Familien in derselben Reaktion geshuffelt werden können. Weiter bewahrt das Shuffling die relative Reihenfolge, so daß beispielsweise CDR1 nicht in der Position von CDR2 gefunden wird. Seltene Shuffle-Mittel enthalten eine große Zahl der besten (z. B. die höchste Affinität aufweisenden) CDRs, und diese seltenen Shuffling-Mittel können auf der Grundlage ihrer überlegenen Affinität gewählt werden (1).
  • CDRs aus einem Pool von 100 verschiedenen selektierten Antikörper-Sequenzen können auf bis zu 1006 verschiedenen Wegen permutiert werden. Diese große Zahl von Mutationen kann nicht in einer einzigen Bibliothek von DNS-Sequenzen wiedergegeben werden. Demgemäß wird in Betracht gezogen, daß mehrere Zyklen von DNS-Shuffling und -Selektion erforderlich sein können, und zwar in Abhängigkeit von der Länge der Sequenz und der gewünschten Sequenz-Vielgestaltigkeit.
  • Im Gegensatz dazu behält die fehlerbehaftete PCR alle selektierten CDRs in derselben relativen Sequenz (1), was eine viel geringere Mutanten-Wolke erzeugt.
  • Das Templat-Polynukleotid, das in den Verfahrensweisen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann eine DNS oder RNS sein. Es kann unterschiedliche Längen aufweisen, abhängig von der Größe des Gens oder DNS-Fragments, das rekombiniert oder wieder zusammengesetzt werden soll. Vorzugsweise hat das Templat-Polynukleotid eine Größe von 50 bp bis 50 kb. Es wird in Betracht gezogen, daß ganze Vektoren, die die Nukleinsäure enthalten, die für das Protein von Interesse codiert, in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können und tatsächlich erfolgreich verwendet wurden.
  • Das Templat-Polynukleotid kann erhalten werden durch Amplifikation unter Anwendung der PCR-Reaktion ( US-Patente Nrn. 4,683,202 und 4,683,195 ) oder durch andere Amplifikations- oder Klonierungs-Verfahren. Jedoch liefert das Entfernen freier Primer von dem PCR-Produkt vor einer Fragmentierung ein effizienteres Ergebnis.
  • Ein Unterlassen des adäquaten Entfernen des Primers kann zu einer niedrigen Frequenz von Cross-Over-Klons führen.
  • Das Templat-Polynukleotid sollte oft doppelsträngig sein. Ein doppelsträngiges Nukleinäure-Molekül ist erforderlich, um sicherzustellen, daß Bereiche der resultierenden einzelsträngigen Nukleinsäure-Fragmente komplementär zueinander sind und damit unter Bildung eines doppelsträngigen Moleküls hybridisieren können.
  • Es kommt in Betracht, daß einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure-Fragmente, die Bereiche von Identität mit dem Templat-Polynukleotid aufweisen und Heterologie-Regionen mit dem Templat-Polynukleotid aufweisen, dem Templat-Polynukleotid in diesem Schritt zugesetzt werden. Es wird auch in Betracht gezogen, daß zwei verschiedene, jedoch verwandte Polynukleotid-Template in diesem Schritt gemischt werden.
  • Das doppelsträngige Polynukleotid-Templat und alle zugesetzten doppelsträngigen oder einsträngigen Fragmente werden statistisch zu Fragmenten mit einer Größe im Bereich von etwa 5 bp bis 5 kb oder mehr verdaut. Vorzugsweise liegt die Größe der statistischen Fragmente im Bereich von etwa 10 bp bis 1000 bp; noch mehr bevorzugt ist die Größe der DNS-Fragmente im Bereich von etwa 20 bp bis 500 bp.
  • Alternativ dazu wird auch in Betracht gezogen, daß eine doppelsträngige Nukleinsäure, die mehrere Einschnitte aufweist, in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Ein Einschnitt ist ein Bruch in einem Strang der doppelsträngigen Nukleinsäure. Die Entfernung zwischen derartigen Einschnitten beträgt vorzugsweise 5 bp bis 5 kb, noch mehr bevorzugt zwischen 5 bp und 1000 bp.
  • Die Nukleinsäure-Fragmente können mit einer Anzahl von verschiedenen Verfahrensweisen verdaut werden. Die Nukleinsäure-Fragmente können verdaut werden mit einer Nuklease wie beispielsweise einer DNS-seI oder einer RNSse. Die Nukleinsäure kann statistisch geschert werden durch das Verfahren der Anwendung von Ultraschall oder durch Hindurchleiten durch ein Rohr mit einer kleinen Öffnung.
  • Es wird auch in Betracht gezogen, daß die Nukleinsäure partiell mit einem oder mehreren Restriktionsenzym(en) verdaut werden kann, so daß bestimmte Punkte eines Cross-Over statistisch erhalten bleiben können.
  • Jedoch erfolgt in wenigstens einem Zyklus der Amplifikation-Reaktion die Fragmentierung im Rahmen einer unvollständigen Extension.
  • Die Konzentration irgendeines speziellen Nukleinsäure-Fragments ist nicht größer als 1 Gew.-% der gesamten Nukleinsäure. Noch mehr bevorzugt beträgt die Konzentration irgendeiner speziellen Nukleinsäure nicht mehr als 0,1 Gew.-% der gesamten Nukleinsäure.
  • Die Zahl verschiedener spezieller Nukleinsäure-Fragmente in der Mischung beträgt wenigstens etwa 100, vorzugsweise wenigstens etwa 500 und noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 1000.
  • In diesem Schritt können einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure-Fragmente, und zwar entweder synthetische oder natürliche, den statistischen doppelsträngigen Nukleinsäure-Fragmenten zugesetzt werden, um die Heterogenität der Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten zu erhöhen.
  • Es wird auch in Betracht gezogen, daß Populationen von doppelsträngigen, statistisch gebrochenen oder eingekerbten Nukleinsäure-Fragmenten in diesem Schritt zugemischt oder mit der Mischung zusammengegeben werden können. Beschädigte DNS kann ausgebeutet werden und so eine Rekombination über die eingekerbten Abschnitte verstärken, die an einer Strang-Invasion teilnehmen können, an einer Bildung von Rekombinations-Verbindungen teilnehmen können, als freie 3'-Enden für die Hybrid-Bildung dienen können und dergleichen.
  • In den Fällen, in denen ein Einarbeiten von Mutationen in das Templat-Polynukleotid erwünscht ist, können einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure-Fragmente, die einen Identitätsbereich mit dem Templat-Polynukleotid aufweisen und einen Heterologie-Bereich mit dem Templat-Polynukleotid aufweisen, in einem 20-fachen Überschuß (bezogen auf das Gewicht) zugegeben werden, verglichen mit der Gesamtmenge an Nukleinsäure. Noch mehr bevorzugt können die einzelsträngigen Nukleinsäure-Fragmente in einem (auf das Gewicht bezogen) 10-fachen Überschuß zugesetzt werden, verglichen mit der Gesamtmenge an Nukleinsäure.
  • Wenn eine Mischung aus verschiedenen, jedoch verwandten Templat-Polynukleotiden erwünscht ist, können Populationen von Nukleinsäure-Fragmenten von jedem der Template in einem Verhältnis von weniger als etwa 1:100 zusammengegeben werden. Noch mehr jedoch bevorzugt ist das Verhältnis geringer als etwa 1:40. Beispielsweise kann eine Rückkreuzung des Polynukleotids des Wild-Typs mit einer Population von mutiertem Polynukleotid erwünscht sein, um neutrale Mutationen zu eliminieren (z. B. Mutationen, die zu einer unwesentlichen Änderung der Phänotyp-Eigenschaft führen, nach der gesucht wird). In einem solchen Beispiel liegt der Anteil statistisch verdauter Polynukleotid-Fragmente des Wild-Typs, die den statistisch verdauten Mutanten-Polynukleotid-Fragmenten zugesetzt werden können, bei etwa 1:1 bis etwa 100:1 und noch mehr bevorzugt bei 1:1 bis 40:1.
  • Die gemischte Population von Nukleinsäure-Fragmenten statistischer Länge wird unter Bildung einzelsträngiger Nukleinsäure-Fragmente denaturiert und anschließend wieder zusammengefügt. Nur solche einzelsträngigen Nukleinsäure-Fragmente, die Bereiche der Homologie mit anderen einzelsträngigen Nukleinsäure-Fragmenten aufweisen, lassen sich wieder zusammenfügen.
  • Die Nukleinsäure-Fragmente statistischer Länge können durch Erhitzen denaturiert werden. Ein Fachmann in diesem technischen Bereich könnte die Bedingungen bestimmen, die erforderlich sind, um die doppelsträngige Nukleinsäure zu denaturieren. Vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 80°C bis 100°C . Noch mehr bevorzugt liegt die Temperatur im Bereich von 90°C to 96°C. Andere Verfahren, die zum Denaturieren der Nukleinsäure-Fragmente verwendet werden können, schließen die Aufbringung von Druck (36) und eine Änderung des pH-Wertes ein.
  • Die Nukleinsäure-Fragmente können durch Kühlen wieder zusammengefügt werden. Vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 20°C bis 75°C, und noch mehr bevorzugt liegt die Temperatur im Bereich von 40°C bis 65°C. Wenn eine hohe Crossover-Frequenz benötigt wird, bezogen auf ein Mittel von nur vier aufeinanderfolgenden Homologie-Basen, kann eine Rekombination dadurch forciert werden, daß man eine niedrige Temperatur des Schritts des Zusammenfügen anwendet, obwohl das Verfahren schwieriger wird. Der Grad der Renaturierung, die eintritt, hängt ab vom Grad der Homologie zwischen der Population einzelsträngiger Nukleinsäure-Fragmente.
  • Eine Renaturierung kann beschleunigt werden durch den Zusatz von Polyethylenglykol (”PEG”) oder Salz. Die Salzkonzentration liegt vorzugsweise im Bereich von 0 mM bis etwa 400 mM. Noch mehr bevorzugt liegt die Salzkonzentration im Bereich von 10 mM bis 100 mM. Das Salz kann KCl oder NaCl sein. Die Konzentration an PEG liegt vorzugsweise im Bereich von 0% bis 20% und liegt weiter bevorzugt im Bereich von 5% bis 10%. Höhere Konzentrationen an Salz und/oder PEG können angewendet werden, wenn dies erwünscht ist.
  • Die zusammengefügten Nukleinsäure-Fragmente werden als nächstes in Gegenwart einer Nukleinsäure-Polymerase und dNTP's inkubiert (d. h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP). Die Nukleinsäure-Polymerase kann das Klenow-Fragment, die Taq- Polymerase oder irgendeine andere DNS-Polymerase sein, das im Stand der Technik bekannt ist.
  • Der Ansatz, der für das Zusammenfügen verwendet werden soll, hängt vom Minimum-Grad der Homologie ab, der noch zu Cross-Over-Reaktionen führen sollte. Wenn die Identitätsbereiche groß sind, kann Taq-Polymerase bei einer Temperatur des Zusammenfügen von zwischen 45 und 65°C angewendet werden. Wenn die Bereiche der Identität klein sind, kann Klenow-Polymerase bei einer Temperatur des Zusammenfügens zwischen 20 und 30°C angewendet werden. Ein Fachmann in diesem technischen Bereich könnte die Temperatur des Zusammenfügen variieren und damit die Zahl von erreichten Cross-Overs erhöhen.
  • Die Polymerase kann den statistischen Nukleinsäure-Fragmenten vor dem Schritt des Zusammenfügen, gleichzeitig mit dem Schritt des Zusammenfügen oder nach dem Schritt des Zusammenfügen zugesetzt werden.
  • Der Zyklus der Denaturierung, Renaturierung und Inkubation in Gegenwart von Polymerase kann als ”Shuffling” oder Wiederzusammenbau der Nukleinsäure bezeichnet werden. Dieser Zyklus wird für eine gewünschte Zahl von Malen wiederholt. Vorzugsweise wird der Zyklus 2 bis 50 Male wiederholt, und noch mehr bevorzugt wird die Sequenz 10 bis 40 Male wiederholt. Der Begriff ”Shuffling” schließt einen größeren Bereich rekursiver Rekombinationsprozesse ein, die einschließen können, jedoch nicht beschränkt sind auf PCR-Amplifikation oder ähnliche Amplifikationsverfahren. Damit kann das Shuffling eine homologe Rekombination, stellenspezifische Rekombination, Chimären-Bildung (z. B. Levichkin et al.; a. a. O.) und dergleichen einschließen, solange die Verfahren rekursiv angewendet werden, d. h. für mehr als einen Zyklus der Sequenz-Rekombination) mit Selektion und/oder Screening. Nicht deterministische Rekombination wie beispielsweise allgemeine Homologen-Rekombination kann in Kombination mit oder anstelle von einer deterministischen Rekombination ange wendet werden, wie beispielsweise die stellenspezifische Rekombination, bei der die Stellen der Rekombination bekannt und/oder definiert sind.
  • Die resultierende Nukleinsäure ist ein größeres, doppelsträngiges Polynukleotid aus etwa 50 bp bis etwa 100 kb, vorzugsweise ist das größere Polynukleotid ein Polynukleotid mit einer Größe im Bereich von 500 bp bis 50 kb.
  • Dieses größere Polynukleotid-Fragment kann eine Zahl von Kopien eines Nukleinsäure-Fragments enthalten, das dieselbe Größe wie das parallel dazu verwendete Templat-Polynukleotid aufweist. Dieses concatemere Fragment wird anschließend zu einzelnen Kopien des Templat-Polynukleotids verdaut. Das Ergebnis ist eine Population von Nukleinsäure-Fragmenten von etwa derselben Größe wie das Templat-Polynukleotid. Die Population ist eine gemischte Population, in der einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäure-Fragmente, die einen Identitätsbereich und einen Heterologie-Bereich aufweisen, dem Templat-Polynukleotid vor dem Shuffling zugesetzt wurden. Alternativ dazu kann das Concatemer direkt ohne Monomerisierung eingeführt werden (z. B. über Elektroporation, Lipofektion und dergleichen). Für große Sequenzen kann es wünschenswert sein, die große Sequenz in einige Unter-Portionen zu unterteilen, die separat mit anderen, im wesentlichen ähnlichen Teilmengen geshuffelt werden, und der Pool der resultierenden geshuffelten Unter-Teilmengen wird dann verbunden, typischerweise in der ursprünglichen Reihenfolge, um einen Pool von geshuffelten von großen Sequenzen zu erzeugen, der dann zur Transformation einer Wirtszelle oder dergleichen verwendet werden kann.
  • Die Fragmente werden dann in den passenden Vektor geklont, und die Ligationsmischung wird anschließend zur Transformation von Bakterien verwendet.
  • Es wird in Betracht gezogen, daß die einzelnen Nukleinsäure-Fragmente aus den größeren concatemeren Nukleinsäure-Fragmenten durch Amplifikation der einzelnen Nukleinsäure-Fragmente vor dem Klonen mittels einer Vielzahl von Verfahrensweisen einschließlich PCR erhalten werden können ( US-Patente Nrn. 4,683,195 und 4,683,202 ), und nicht durch Verdauen des Concatemers. Alternativ dazu kann das Concatemer direkt ohne Monomerisierung eingeführt werden (z. B. über Elektroporation, Lipofektion und dergleichen).
  • Der für den Schritt des Klonen verwendete Vektor ist nicht kritisch, vorausgesetzt, daß er ein DNS-Fragment der gewünschten Größe akzeptiert. Wenn eine Expression des DNS-Fragments erwünscht ist, sollte das klonierende Vehikel weiter eine Transkription und Translationssignale in der Nähe der Stelle der Insertion des DNS-Fragments umfassen, wodurch eine Expression des DNS-Fragments in der Wirtszelle ermöglicht wird. Bevorzugte Vektoren schließen die Vektoren der pUC-Reihe und die pBR-Reihe von Plasmiden ein.
  • Die resultierende Bakterien-Population schließt eine Zahl von rekombinanten DNS-Fragmenten ein, die statistische Mutationen aufweisen. Diese gemischte Population kann getestet werden, um das gewünschte rekombinante Nukleinsäure-Fragment zu identifizieren. Das Verfahren der Selektion hängt von dem gewünschten DNS-Fragment ab.
  • Wenn beispielsweise ein DNS-Fragment erwünscht ist, das für ein Protein mit erhöhter Bindungseffizienz zu einem Liganden codiert, können die Proteine, die durch jedes der DNS-Fragmente in der Population oder Bibliothek exprimiert werden, im Hinblick auf ihr Vermögen getestet werden, sich an den Ligaeden im Rahmen von Verfahren zu binden, die im Stand der Technik bekannt sind (d. h. Panning, Affinitätschromotographie). Wenn ein DNS-Fragment, das für ein Protein mit erhöhter Arzneimittel-Beständigkeit codiert, erwünscht ist, können die Proteine, die von jedem der DNS-Fragmente in der Population oder Bibliothek exprimiert werden, auf ihr Vermögen getestet werden, dem Wirts-Organismus Beständigkeit gegenüber Arzneimitteln zu verleihen. Ein in diesem technischen Bereich erfahrener Fachmann, dem man Kenntnis von dem gewünschten Protein gibt, könnte in einfacher Weise die Population te sten und so DNS-Fragmente identifizieren, die dem Protein die gewünschten Eigenschaften verleihen.
  • Es wird in Betracht gezogen, daß ein in diesem technischen Gebiet bewanderter Fachmann ein Phagen-Display-System, in dem Fragmente des Proteins als Fusionsproteine auf der Phagen-Oberfläche exprimiert werden (Pharmacia, Milwaukee, WI), verwenden könnte. Die rekombinanten DNS-Moleküle werden in die Phagen-DNS an einer Stelle kloniert, die zu der Transkription eines Fusionsproteins führt, von dem ein Teil durch das rekombinante DNS-Molekül codiert wird. Der Phage, der das rekombinante Nukleinsäure-Molekül enthält, unterliegt einer Replikation und Transkription in der Zelle. Die Leader-Sequenz des Fusionsproteins richtet den Transport des Fusionsproteins zur Spitze des Phagen-Partikels. Damit wird das Fusionsprotein, das teilweise durch das rekombinante DNS-Molekül codiert wird, auf dem Phagen-Partikel zum Nachweis und zur Selektion durch die oben beschriebenen Verfahren gezeigt.
  • Es kommt weiter in Betracht, daß eine Zahl von Zyklen des Nukleinsäure-Shufflings mit Nukleinsäure-Fragmenten aus einer Unter-Population der ersten Population durchgeführt werden kann, wobei die Unter-Population DNS enthält, die für das gewünschte rekombinante Protein codiert. Auf diese Weise könnten Proteine mit noch höheren Bindungsaffinitäten oder enzymatischen Aktivitäten erhalten werden.
  • Es kommt auch in Betracht, daß eine Zahl von Zyklen eines Nukleinsäure-Shufflings mit einer Mischung von Nukleinsäure-Fragmenten des Wild-Typs und einer Unter-Population einer Nukleinsäure aus der ersten oder nachfolgenden Runden des Nukleinsäure-Shufflings durchgeführt werden kann, um irgendwelche stillen Mutationen von der Unter-Population zu entfernen.
  • Es kann jede beliebige Quelle von Nukleinsäure in gereinigter Form als Start-Nukleinsäure verwendet werden. So kann in dem Verfahren DNS oder RNS einschließlich Messenger-RNS verwendet werden, wobei die DNS die RNS einzelsträn gig oder doppelsträngig sein kann. Außerdem kann ein DNS-RNS-Hybrid verwendet werden, das jeweils einen Strang der beiden Polymere enthält. Die Nukleinsäure-Sequenz kann von unterschiedlichen Längen sein, abhängig von der Größe der Nukleinsäure-Sequenz, die mutiert werden soll. Vorzugsweise hat die spezielle Nukleinsäure-Sequenz eine Länge im Bereich von 50 bis 50000 Basenpaaren. Es kommt in Betracht, daß ganze Vektoren, die die Nukleinsäure enthalten, die für das Protein von Interesse codiert, in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
  • Die Nukleinsäure kann von jeder beliebigen Quelle erhalten werden, beispielsweise von Plasmiden wie beispielsweise pBR322, von geklonter DNS oder RNS oder von natürlicher DNS oder RNS aus jeder beliebigen Quelle einschließlich Bakterien, Hefen, Viren und höheren Organismen wie beispielsweise Pflanzen oder Tieren. Die DNS oder RNS kann aus Blut- oder Gewebe-Material extrahiert werden. Das Templat-Polynukleotid kann erhalten werden durch Amplifikation unter Verwendung der Polynukleotid-Kettenreaktion (PCR) ( US-Patente Nm. 4,683,202 und 4,683,195 ). Alternativ dazu kann das Polynukleotid in einem Vektor zugegen sein, der in einer Zelle vorhanden ist, und ausreichend Nukleinsäure kann erhalten werden durch Kultivieren der Zelle und Extrahieren der Nukleinsäure aus der Zelle nach Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind.
  • Jede beliebige spezielle Nukleinsäure-Sequenz kann zur Herstellung der Population von Mutanten durch das vorliegende Verfahren verwendet werden. Es ist nur erforderlich, daß eine kleine Population von Mutanten-Sequenzen der speziellen Nukleinsäure-Sequenz existiert oder vor dem vorliegenden Verfahren geschaffen wird.
  • Die anfänglich vorhandene kleine Population der speziellen Nukleinsäure-Sequenzen, die Mutationen aufweisen, können nach einer Anzahl von verschiedenen Verfahren geschaffen werden. Mutationen können geschaffen werden mittels fehlerbehafteter PCR. Die fehlerbehaftete PCR macht Gebrauch von Polymerisationsbedingungen mit niedriger Reproduktionstreue, um so ein niedriges Niveau von Punkt-Mutationen statistisch über eine lange Sequenz einzuführen. Alternativ dazu können Mutationen in das Templat-Polynukleotid durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese eingeführt werden. Bei der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese wird eine kurze Sequenz des Polynukleotids von dem Polynukleotid unter Anwendung eines Verdauungsverfahrens mit einem Restriktionsenzym entfernt, und dieses wird durch ein synthetisches Polynukleotid ersetzt, in dem verschiedene Basen gegenüber der ursprünglichen Sequenz geändert wurden. Die Polynukleotid-Sequenz kann auch durch chemische Mutagenese verändert werden. Chemische Mutagene schließen beispielsweise Natriumbisulfit, salpetrige Säure, Hydroxylamin, Hydrazin oder Ameisensäure ein. Andere Mittel, die Analoge von Nukleotid-Vorstufen sind, schließen Nitrosoguanidin, 5-Bromuracil, 2-Aminopurin oder Acridin ein. Allgemein werden diese Mittel der PCR-Reaktion anstelle der Nukleotid-Vorstufe zugesetzt, wodurch die Sequenz mutiert wird. Intercalierende Mittel wie beispielsweise Proflavin, Acriflavin, Chinacrin und dergleichen können ebenfalls verwendet werden. Eine statistische Mutagenese der Polynukleotid-Sequenz kann auch erreicht werden durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder ultraviolettem Licht. Allgemein werden Plasmid-DNS-Fragmente oder DNS-Fragmente, die auf diese Weise mutagenisiert wurden, in E. coli eingeführt und als Pool- oder Bibliothek von Mutanten-Plasmiden propagiert.
  • Alternativ dazu kann die kleine gemischte Population von spezifischen Nukleinsäuren in der Natur insoweit gefunden werden, als sie aus verschiedenen Allelen desselben Gens oder aus demselben Gen von verschiedenen verwandten Spezies (d. h. Cognaten-Genen) bestehen können. Alternativ dazu können sie verwandte DNS-Sequenzen sein, die innerhalb einer Spezies gefunden werden, beispielsweise die Immunoglobulin-Gene.
  • Sobald einmal die gemischte Population der spezifischen Nukleinsäure-Sequenzen erzeugt ist, können die Polynukleotide direkt verwendet werden oder in einen passenden Klonierungsvektor eingefügt werden, wobei Verfahrensweisen angewendet werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind.
  • Die Wahl des Vektors hängt von der Größe der Polynukleotid-Sequenz und der in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Wirtszelle ab. Die Template gemäß der vorliegenden Erfindung können Plasmide, Phagen, Cosmide, Phagemide, Viren (z. B. Retroviren, Parainfluenzaviren, Herpesviren, Rheoviren, Paramyxoviren und dergleichen) oder ausgewählte Abschnitte davon sein (z. B. ein Coat-Protein, ein Spike-Glykoprotein, ein Capsid-Protein). Beispielsweise sind Cosmide, Phagemide, YACs und BACs bevorzugt in den Fällen, in denen die spezielle Nukleinsäure-Sequenz, die mutiert werden soll, größer ist, da diese Vektoren in der Lage sind, große Nukleinsäure-Fragmente stabil zu propagieren.
  • Wenn die gemischte Population der speziellen Nukleinsäure-Sequenz in einen Vektor kloniert wird, kann sie als Klon amplifiziert werden, indem man jeden Vektor in eine Wirtszelle einsetzt und ermöglicht, daß die Wirtszelle den Vektor amplifiziert. Dieser Prozeß wird als ”klonale Amplifikation” bezeichnet, da trotz der Tatsache, daß die absolute Zahl von Nukleinsäure-Sequenzen steigt, die Zahl der Mutanten nicht steigt.
  • Parallele PCR
  • Bei der parallelen PCR erfolgt eine große Zahl von verschiedenen PCR-Reaktionen parallel in demselben Gefäß, wobei die Produkte einer Reaktion die Produkte einer weiteren Reaktion primen. Da die PCR-Produkte einander primen, steigt die mittlere Produktgröße mit der Zahl der PCR-Zyklen.
  • Durch Verwendung mehrerer Primer in paralleler Weise können Sequenzen mit einer Länge über 50 kb amplifiziert werden. Vollständige Gene und vollständige Plasmide können in einem einzigen Rohr aus synthetischen Oligonukleotiden durch parallele PCR zusammengesetzt werden. Sequenzen können statistisch auf verschiedenen Ebenen durch statistische Fragmentierung und erneuten Zusammenbau der Fragmente durch gegenseitiges Primen mutagenisiert werden. Hinsichtlich der stellenspezifischen Mutationen können in lange Sequenzen durch statistische Fragmentierung des Templats und anschließenden Wieder-Zusammenbau der Fragmente in Gegenwart mutagener Oligonukleotide eingeführt werden. Eine besonders nützliche Anwendung der parallelen PCR wird ”sexuelle PCR” genannt.
  • Bei der sexuellen PCR, die auch ”DNS-Shuffling” genannt wird, wird die parallele PCR angewendet, um eine In-vitro-Rekombination an einem Pool von DNS-Sequenzen durchzuführen. Eine Mischung verwandter, jedoch nicht-identischer DNS-Sequenzen (typischerweise PCR-Produkte, Restriktion-Fragmente oder gesamte Plasmide) wird statistisch fragmentiert, beispielsweise durch Behandlung mit DNA-se1. Die resultierenden statistischen Fragmente werden dann durch parallele PCR wieder zusammengebaut. Da statistische Fragmente und ihre PCR-Produkte einander primen, steigt die mittlere Größe der Fragmente mit der Zahl der PCR-Zyklen. Es tritt eine Rekombination, oder ein Cross-Over, durch Templat-Switching auf, beispielsweise dann, wenn ein von einem Templat abgeleitetes DNS-Fragment an der homologen Position eines verwandten, jedoch verschiedenen Templats primt. Beispielsweise kann eine sexuelle PCR verwendet werden, um Bibliotheken von Chimären von Genen verschiedener Spezies (”Zoo-Bibliotheken”) aufzubauen. Die sexuelle PCR ist auch nützlich für eine In-vitro-Evolution von DNS-Sequenzen. Die Bibliotheken neuer Mutanten-Kombinationen, die durch sexuelle PCR erhalten werden, werden nach den besten Rekombinanten-Sequenzen auf DNS-Ebene, RNS-Ebene, Protein-Ebene oder Ebene kleiner Moleküle selektiert. Dieser Prozeß der Rekombination, Selektion und Amplifikation wird für so viele Zyklen wie erforderlich wiederholt und so eine gewünschte Eigenschaft oder Funktion erhalten.
  • Die meisten Versionen der parallelen PCR verwenden Primer nicht. Die DNS-Fragmente, gleichgültig, ob synthetisch, durch statistische Verdauung erhalten oder mittels PCR mit Primern erhalten, dienen als Templat und auch als Primer. Da die Konzentration jeder verschiedenen End-Sequenz in der Zusammenbau-Reaktion sehr niedrig ist, wird die Bildung eines Primer-Dimers nicht beobachtet, und wenn ein fehlerhaftes Priming auftritt, kann das Produkt nur mit derselben Geschwindigkeit wachsen, wie das korrekt zusammengefügte Produkt. Die parallele PCR erfordert viele Zyklen der PCR, da nur die Hälfte der zusammengefügten Paare ausdehnbare Overhangs aufweist und die Konzentration an 3'-Enden niedrig ist.
  • Brauchbarkeit
  • Das DNS-Shuffling-Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann blind an einem Pool unbekannter Sequenzen durchgeführt werden. Durch Hinzufügen der Oligonukleotide der Zusammenbau-Mischung (mit Enden, die homolog zu den zusammenzubauenden Sequenzen sind), kann jede Sequenz-Mischung an jeder speziellen Position in eine andere Sequenzmischung eingearbeitet werden. So ist in Betracht zu ziehen, daß Mischungen synthetischer Oligonukleotide, PCR-Fragmente oder sogar ganze Gene in eine andere Sequenz-Bibliothek an definierten Positionen eingemischt werden können. Der Einbau einer Sequenz (Mischung) ist unabhängig von dem Einbau einer Sequenz in einem anderen Teil des Templats. So können der Grad der Rekombination, die erforderliche Homologie und die Vielgestaltigkeit der Bibliothek unabhängig voneinander und gleichzeitig entlang der Länge der wiederzusammengefügten DNS variiert werden.
  • Dieser Ansatz des Mischen zweier Gene kann nützlich sein für die Humanisierung von Antikörpern aus Mause-Hybridomen. Der Ansatz des Mischen zweier Gene oder des Einbaus von Mutanten-Sequenzen in Gene kann nützlich sein für jedes beliebige therapeutisch verwendete Protein, beispielsweise für Interleukin I, Antikörper, tPA, Wachstumshormon usw.. Der Ansatz kann auch nützlich sein in jeder beliebigen Nukleinsäure, beispielsweise bei Promotern oder Introns oder einem am 3'-Ende nicht übersetzten Bereich oder am 5'-Ende nicht übersetzten Bereichen von Genen, um die Expression zu erhöhen oder die Spezifität der Expression von Proteinen zu verändern. Der Ansatz kann auch verwendet werden, um Ribozyme oder Aptamere zu mutieren.
  • Das Shuffling erfordert die Gegenwart homologer Bereiche, die Bereiche von Vielgestaltigkeit trennen. Wenn die zu shuffelnden Sequenzen nicht im wesentlichen identisch sind, ist es typischerweise bevorzugt, ein Shuffling auf Intron-Basis und/oder eine für die Einschubstelle spezifische Rekombination zu verwenden. Gerüstartige Protein-Strukturen können besonders geeignet für das Shuffling sein. Das erhaltene Gerüst bestimmt das Gesamt-Falten durch Selbstassoziation, wobei relativ unbeschränkte Schleifen gezeigt werden, die den spezifischen Bindevorgang vermitteln. Beispiele derartiger Gerüste sind das Immunoglobulin-Beta-Barrel und das Vier-Helix Bündel (24). Dieses Shuffling kann verwendet werden, um gerüstartige Proteine mit verschiedenen Kombinationen mutierter Sequenzen zum Binden zu schaffen.
  • Die Äquivalente einiger genetischer Standard-Paarungen können auch durch Shuffling in vitro durchgeführt werden. Beispielsweise kann eine ”molekulare Rückkreuzung” durchgeführt werden durch wiederholtes Mischen der Nukleinsäure der Mutanten mit der Nukleinsäure des Wild-Typs, wobei man nach den Mutationen von Interesse selektiert. Wie bei der traditionellen Fortpflanzung kann dieser Ansatz verwendet werden, um Phänotypen von verschiedenen Quellen in einen Hintergrund der Wahl zusammenzugeben. Es ist nützlich, beispielsweise für das Entfernen neutraler Mutationen, die nicht-selektierte charakteristische Eigenschaften (d. h. die Immunogenizität) beeinflussen. Daher kann dieses Verfahren nützlich sein, um zu bestimmen, welche Mutationen in einem Protein in die verstärkte biologische Aktivität involviert sind und welche nicht, ein Vorteil, der nicht mit den Verfahrensweisen der fehlerbehafteten Mutagenese oder Kassetten-Mutagenese erreicht werden kann.
  • Große funktionelle Gene können korrekt von einer Mischung kleiner statistischer Fragmente zusammengebaut werden. Diese Reaktion kann von Nutzen sein für den Wiederzusammenbau von Genen aus der in hohem Maße fragmentierten DNS von Fossilien (25). Darüber hinaus können statistische Nukleinsäure-Fragmente aus Fossilien mit Nukleinsäure-Fragmenten aus ähnlichen Genen von verwandten Spezies kombiniert werden.
  • Es kommt auch in Betracht, daß die Verfahrensweise gemäß der vorliegenden Erfindung für die In-vitro-Amplifikation eines vollständigen Genoms aus einer einzigen Zelle angewendet werden kann, wie dies für eine Vielzahl von Forschungs- und Diagnostik-Anwendungen benötigt wird. Die DNS-Amplifikation durch PCR ist eine praktische Verfahrensweise, die auf eine Länge von etwa 40 kb beschränkt ist. Die Amplifikation eines vollständigen Genoms, wie beispielsweise desjenigen von E. coli (5.000 kb) durch PCR würde etwa 250 Primer erfordern, die zu 125 Fragmenten mit 40 kb führen. Dieser Ansatz ist nicht praktisch aufgrund der Nicht-Verfügbarkeit ausreichender Sequenzdaten. Andererseits führt eine statistische Verdauung des Genoms mit DNaseI und anschließender Gel-Reinigung kleiner Fragmente zu einer Vielzahl von möglichen Primern. Die Verwendung dieser Mischung aus statistischen kleinen Fragmenten als Primer in einer PCR-Reaktion allein oder mit dem gesamten Genom als Templat sollte zu einer Inversketten-Reaktion mit dem theoretischen Endpunkt (unter Annahme von Verdünnung und zusätzlicher PCR) eines einzigen Concatemers führen, das viele Kopien der Genoms enthält.
  • Die 100-fache Amplifikation der Kopienzahl und eine mittlere Fragment-Größe von über 50 kb können erhalten werden, wenn nur statistische Fragmente verwendet werden (siehe Beispiel 2). Es wird angenommen, daß das größere Concatemer erzeugt wird durch Überlappen vieler kleinerer Fragmente. Die Qualität spezieller PCR-Produkte, die unter Verwendung synthetischer Primer erhalten werden, wird ununterscheidbar von dem Produkt, das aus einer unamplifizierten DNS erhalten wird. Es wird erwartet, daß dieser Ansatz nützlich ist für das Mapping von Genomen.
  • Peptid-Display-Verfahren
  • Das vorliegende Verfahren kann verwendet werden, um Polynukleotid-Sequenzen zu shuffeln, die durch Peptid-Display-Verfahren ausgewählt wurden, worin ein verbundenes Polynukleotid für ein gezeigtes Peptid codiert, nach dem in bezug auf einen Phänotyp gescreent wird (z. B. in bezug auf die Affinität zu einem vorbestimmten Rezeptor (Ligand)).
  • Ein zunehmend wichtiger Aspekt der biopharmazeutischen Arzneimittelentwicklung und der Molekularbiologie ist die Identifikation von Peptid-Strukturen einschließlich der Aminosäure-Primer-Sequenzen, von Peptiden oder peptidomimetischen Molekülen, die mit biologischen Makromolekülen Wechselwirken. Ein Verfahren zum Identifizieren von Peptiden, die eine gewünschte Struktur oder funktionelle Eigenschaft besitzen, wie beispielsweise die Eigenschaft des Bindens an ein vorbestimmtes biologisches Makromolekül (z. B. einen Rezeptor) schließt das Screening einer großen Bibliothek oder von Peptiden nach einzelnen Gliedern der Bibliothek ein, die die gewünschte Struktur oder funktionelle Eigenschaft besitzen, die durch die Aminosäure-Sequenz des Peptids verliehen wird.
  • Darüber hinaus wurde mit dem Ziel, chemische Synthese-Verfahren auf die Erzeugung von Peptid-Bibliotheken zu richten, über einige rekombinante DNS-Methoden berichtet. Eine Art schließt das Zeigen einer Peptid-Sequenz, eines Antikörpers oder eines anderen Proteins auf der Oberfläche eines Bakteriophagen-Teilchens oder einer entsprechenden Zelle ein. Allgemein dient bei diesen Verfahrensweisen jedes Bakteriophagen-Teilchen oder die entsprechende Zelle als individuelles Glied der Bibliothek, das eine einzelne Spezies eines gezeigten Peptids zusätzlich zu den natürlichen Bakteriophagen- oder Zell-Protein-Sequenzen zeigt. Jeder Bakteriophage oder jede Zelle enthält die Nukleotidsequenz-Information, die die spezielle gezeigte Peptid-Sequenz codiert. Damit kann die gezeigte Peptid-Sequenz durch Nukleotidsequenz-Bestimmung eines isolierten Gliedes der Bibliothek ermittelt werden.
  • Ein wohlbekanntes Peptid-Display-Verfahren schließt die Präsentation einer Peptid-Sequenz auf der Oberfläche eines filament-artigen Bakteriophagen ein, typischerweise als Fusion mit einem Bakteriophagen-Code-Protein. Die Bakteriophagen-Bibliothek kann mit einem immobilisierten, vorbestimmten Makromolekül oder einem kleinen Molekül (z. B. einem Rezeptor) inkubiert werden, so daß Bakteriophagen-Teilchen, die eine Peptid-Sequenz präsentieren, die sich an das immobilisierte Makromolekül bindet, differentiell von denjenigen Teilchen abgetrennt werden kann, die nicht die Peptid-Sequenz präsentieren, die sich an das vorbestimmte Makromolekül bindet. Die Bakteriophagen-Teilchen (d. h. die Glieder der Bibliothek), die an das immobilisierte Makromolekül gebunden werden, werden dann gewonnen und repliziert und so die selektierte Bakteriophagen-Unterpopulation für eine anschließende Runde der Affinitätsanreicherung und Phagen-Replikation amplizifiert. Nach einigen Runden der Affinitätsanreicherung und Phagen-Replikation werden die Glieder der Bakteriophagen-Bibliothek, die so selektiert wurden, isoliert, und die Nukleotid-Sequenz, die für die gezeigte Peptid-Sequenz codiert, wird bestimmt. Dadurch wird/werden die Sequenz(en) von Peptiden identifiziert, die sich an ein vorbestimmtes Makromolekül (z. B. an einen Rezeptor) binden. Solche Verfahrensweisen werden weiter beschrieben in den internationalen (PCT) Patentanmeldungen Nrn. 91/17271 , 91/18980 und 91/19818 und 93/08278 .
  • Die letztgenannte PCT-Veröffentlichung beschreibt ein rekombinantes DNS-Verfahren für das Zeigen von Peptid-Liganden, das die Produktion einer Bibliothek von Fusionsproteinen einschließt, wobei jedes Fusionsprotein aufgebaut ist aus einem ersten Polypeptid-Teil, der typischerweise eine variable Sequenz umfaßt, die verfügbar ist für ein potentielles Binden an ein vorbestimmtes Makromolekül, und aus einem zweiten Polypeptid-Teil, der sich an eine DNS bindet, wie beispielsweise den DNS-Vektor, der für das einzelne Fusionsprotein codiert. Wenn transformierte Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert werden, die eine Expression des Fusionsproteins erlauben, bindet sich das Fusionsprotein an den DNS-Vektor, der es codiert. Bei Lyse der Wirtszelle können die Fusionsprotein-/Vektor-DNS-Komplexe gegenüber einem vorbestimmten Makromolekül in genau derselben Weise gescreent werden, wie Bakteriophagen-Teilchen in dem Display-System auf Phagen-Basis gescreent werden, wobei die Replikation und das Sequenzieren der DNS-Vektoren in den selektierten Fusionsprotein-/Vektor-DNS-Komplexen als Basis für eine Identifikation der gewählten Peptid-Sequenz(en) der Bibliothek dient.
  • Andere Systeme zum Erzeugen von Bibliotheken von Peptiden und ähnlichen Polymeren haben Aspekte sowohl des Rekombinationsverfahrens als auch eines In-vitro-Verfahrens der chemischen Synthese. Bei diesen Hybrid-Verfahren wird eine zell-freie Enzym-Maschinerie verwendet, um die In-vitro-Synthese der Glieder der Bibliothek zustandezubringen (d. h. Peptide oder Polynukleotide). In einer Art eines solchen Verfahrens wurden RNS-Moleküle mit der Fähigkeit zum Binden an ein vorbestimmtes Protein oder ein vorbestimmtes Farbstoff-Molekül durch abwechselnde Runden der Selektion und PCR-Amplifikation selektiert (Tuerk und Gold (1990), Science 249, 505; Ellington und Szostak (1990), Nature 346, 818.) Eine ähnliche Verfahrensweise wurde angewendet zur Identifikation von DNS-Sequenzen, die einen vorbestimmten Human-Transkription-Faktor binden (Thiesen und Bach (1990), Nucleic Acids Res. 18, 3203; Beaudry und Joyce (1992), Science 257, 635; PCT-Patentveröffentlichungen Nm. 92/05258 und 92/14843). In ähnlicher Weise wurde die Verfahrensweise der In-vitro-Translation verwendet zur Synthese von Proteinen von Interesse, und dies wurde vorgeschlagen als Verfahren zur Erzeugung großer Bibliotheken von Peptiden. Diese Verfahrensweisen, die auf eine In-vitro-Translation setzen und allgemein stabilisierte Polysomen-Komplexe umfassen, werden weiter beschrieben in den PCT-Patentanmeldungen Nrn. 88/08453, 90/05785, 90/07003, 91/02076, 91/05058 und 92/02536. Die Anmelder haben Verfahrensweisen beschrieben, in denen Glieder einer Bibliothek ein Fusionsprotein umfassen, das einen ersten Polypeptid-Teil mit DNS-Bindungsaktivität und einen zweiten Polypeptid-Teil aufweist, der die für das Glied der Bibliothek spezielle Peptid-Sequenz aufweist. Solche Verfahren sind – unter anderem – geeignet zur Verwendung in zell-freien In-vitro-Selektions-Formaten.
  • Eine Variation des Verfahren ist die rekursive Sequenz-Rekombination, die durch Rekombination auf Intron-Basis durchgeführt wird. Darin sind die zu rekombinierenden Sequenzen als Exons zugegen (z. B. in Form von Exons, und zwar entweder natürlich vorkommend oder künstlich), die wesentliche, geringe oder keine Sequenz-Identität teilen und die getrennt sind durch ein oder mehrere Intron(s) (die natürlich vorkommende Intron-Sequenzen sein können oder nicht), die wesentliche Sequenz-Identität teilen, um eine homologe Rekombination zwischen Introns zu unterstützen. Um ein Beispiel zu nennen, das jedoch nicht als Beschränkung dienen soll: Eine Population aus Polynukleotiden umfaßt Glieder einer Bibliothek, in der jedes Glied der Bibliothek eine oder mehrere Kopien eines ersten Satzes von Exons aufweist, die über einen ersten Satz von Introns an eine oder mehrere Kopien des zweiten Satzes von Exons gebunden sind, die über einen zweiten Satz von Introns an eine oder mehrere Kopien eines dritten Satzes von Exons gebunden sind. Jedes der Glieder des ersten Satzes von Exons kann wesentliche, geringe oder keine Sequenzidentität miteinander oder mit Gliedern des zweiten oder dritten Satzes von Exons zeigen. In ähnlicher Weise kann jedes der Glieder des zweiten Satzes von Exons wesentliche, geringe oder keine Sequenzidentität miteinander oder mit Gliedern des ersten oder dritten Satzes von Exons zeigen. In ähnlicher Weise kann jedes der Glieder des dritten Satzes von Exons wesentliche, geringe oder keine Sequenzidentität miteinander oder mit Gliedern des ersten oder zweiten Satzes von Exons zeigen. Jedes der Glieder jedes der Sätze (erster Satz, zweiter Satz, dritter Satz usw.) von Introns zeigt wesentliche Sequenzidentität mit den anderen Gliedern des Satzes und stützt so eine Rekombination (homologe oder auf die Stelle spezifische Rekombination, einschließlich einer durch die Restriktionsstelle vermittelten Rekombination) zwischen Gliedern desselben Satzes von Introns, jedoch typischerweise nicht mit Gliedern eines anderen Satzes von Introns (z. B. des zweiten oder dritten Satzes), so daß eine an den Introns orientierte Rekombination zwischen Introns der Glieder der Bibliothek stattfindet und ein Pool von rekombinierten Gliedern der Bibliothek erzeugt, worin der erste Satz von Exons, der zweite Satz von Exons und der dritte Satz von Exons effektiv miteinander geshuffelt werden.
  • Die gezeigten Peptid-Sequenzen können variierende Längen aufweisen, typischerweise im Bereich von 3 bis 5000 Aminosäuren lang oder länger, häufig von 5 bis 100 Aminosäuren lang und oft im Bereich von etwa 8 bis 15 Aminosäuren lang. Eine Bibliothek kann Glieder der Bibliothek umfassen, die variierende Längen der gezeigten Peptid-Sequenz haben oder können Glieder der Bibliothek umfassen, die eine fixierte Länge der gezeigten Peptid-Sequenz haben. Teilmengen oder alle gezeigten Peptid-Sequenzen können statistisch, pseudostatistisch, Kernsequenzen eines definierten Satzes, fixierte Sequenzen oder dergleichen sein. Die vorliegenden Display-Verfahren schließen Verfahren für das Zeigen von Einzelketten-Antikörpern in vitro und in vivo ein, wie beispielsweise entstehendes scFv auf Polysomen oder scFv, gezeigt auf einem Phagen, die ein Screening in großem Umfang der scFv-Bibliotheken ermöglichen, die eine breite Vielgestaltigkeit der Sequenzen mit variablen Bereichen und der Bindungsspezifitäten aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung schafft auch statistische, pseudostatistische und ein definiertes Sequenz-Netzwerk aufweisende Peptid-Bibliotheken und Verfahren zum Erzeugen und zum Screening dieser Bibliotheken, um nützliche Verbindungen zu identifizieren (z. B. Peptide, einschließlich Einzelketten-Antikörper), die sich an Rezeptor-Moleküle oder Epitope von Interesse binden, oder Gen-Produkte, die Peptide oder RNS in einer gewünschten Weise modifizieren. Die statistischen, pseudostatistischen und ein definiertes Sequenz-Netzwerk aufweisenden Peptide werden aus Bibliotheken von Gliedern einer Peptid-Bibliothek hergestellt, die gezeigte Peptide oder gezeigte Einzelketten-Antikörper umfassen, die an ein Polynukleotid-Templat gebunden sind, aus dem das gezeigte Peptid synthetisiert wurde. Die Art der Befestigung kann in Übereinstimmung mit der speziellen Ausführungsform der gewählten Erfindung schwanken und kann eine Einkapselung in einem Phagen-Teilchen oder eine Einarbeitung in eine Zelle einschließen.
  • Ein Verfahren zur Affinitäts-Anreicherung ermöglicht es, daß eine sehr große Bibliothek von Peptiden und Einzelketten-Antikörpern gescreent wird und die Polynukleotid-Sequenz, die für das/die gewünschte(n) Peptid(e) einer Einzelketten-Antikörper codiert, selektiert wird. Der Pool von Polynukleotiden kann dann isoliert und geshuffelt werden, wodurch die Aminosäure-Sequenz des/der gewählten Peptid(e) (oder vorbestimmter Teile davon) oder Einzelketten-Antikörper (oder nur VH-, VL- oder CDR- Teile davon) kombinatorisch rekombiniert werden. Durch Anwendung dieser Verfahrensweisen kann man ein Peptid oder einen Einzelketten-Antikörper dahingehend identifizieren, daß er eine gewünschte Bindungsaffinität für ein Molekül aufweist, und kann das Verfahren des Shufflings dazu ausnutzen, schnell zu einem gewünschten Peptid hoher Affinität oder einem scFv zu kommen. Das Peptid oder der Antikörper kann dann in Masse durch herkömmliche Mittel für jeden geeigneten Gebrauch synthetisiert werden (z. B. als therapeutisches oder diagnostisches Mittel).
  • Ein signifikanter Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß keine Vorab-Information im Hinblick auf eine erwartete Liganden-Struktur erforderlich ist, um Peptid-Liganden oder Antikörper von Interesse zu isolieren. Das identifizierte Peptid kann biologische Aktivität aufweisen, worunter verstanden wird, daß dies wenigstens eine spezielle Bindungsaffinität zu einem gewählten Rezeptor-Molekül einschließt, und schließt in einigen Beispielen weiter das Vermögen ein, das Binden anderer Komponenten zu blockieren, um metabolische Wege zu stimulieren oder zu inhibieren, als Signal oder Botenstoff zu dienen, die Zellaktivität zu stimulieren oder zu inhibieren und dergleichen.
  • Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Verfahren zum Shuffeln eines Pools von Polynukleotid-Sequenzen, die durch Affinitäts-Screening einer Bibliothek von Polysomen selektiert wurden, die entstehende Peptide (einschließlich Einzelketten-Antikörper) zeigen, auf Glieder der Bibliothek, die sich an einen vorbestimmten Rezeptor (z. B. einen Säuger-Protein-Rezeptor wie beispielsweise einen Rezeptor für das peptidergische Hormon, einen Zelloberflächen-Rezeptor, ein intrazelluläres Protein, das sich an ein oder mehrere andere(s) Protein(e) bindet und so intrazellulare Proteinkomplexe wie beispielsweise Heterodimere und dergleichen bildet) oder ein Epitop bindet (z. B. an ein immobilisiertes Protein, ein Glykoprotein, ein Oligosaccharid und dergleichen).
  • Polynukleotid-Sequenzen, die in einer ersten Selektionsrunde (typischerweise durch Affinitäts-Selektion zum Binden an einen Rezeptor (z. B. an einen Liganden)) nach einem dieser Verfahren selektiert wurden, werden gepoolt, und der/die Pool(s) wird/werden im Rahmen einer In-vitro-Rekombination und/oder einer In-vivo-Rekombination geshuffelt. So wird ein geshuffelter Pool hergestellt, der eine Population von rekombinierten selektierten Polynukleotid-Sequenzen umfaßt. Die rekombinierten selektierten Polynukleotid-Sequenzen werden wenigstens einer anschließenden Selektion-Runde unterzogen. Die in der anschließenden Selektion-Runde(n) selektierten Polynukleotid-Sequenzen können direkt verwendet werden (als Pool oder in individuellen Klonen), können sequenziert werden und/oder können einer oder mehreren weiteren Runden des Shufflings und der anschließenden Selektion unterworfen werden. Selektierte Sequenzen können auch mit Polynukleotiden rückgekreuzt werden, die für neutrale Sequenzen codieren (d. h. die nur eine unwesentliche funktionelle Auswirkung auf das Binden haben), wie beispielsweise durch Rückkreuzen mit einer Sequenz des Wild-Typs oder einer natürlich vorkommenden Sequenz, die im wesentlichen identisch ist mit einer selektierten Sequenz, wodurch den nativen Proteinen ähnliche funktionelle Peptide erzeugt werden, die weniger immunogen sein können. Allgemein wird während des Rückkreuzen eine anschließende Selektion angewandt, die Bindungseigenschaft (oder eine andere gewünschte selektierbare oder dem Screening zugängliche Eigenschaft oder einen Phänotyp) für den vorbestimmten Rezeptor (Liganden) zu erhalten. Andere Eigenschaften werden beispielhaft angegeben als Fähigkeit, eine vorbestimmte Bindungs-Wechselwirkung zu blockieren (z. B. als teilweiser oder vollständiger Antagonist oder als kompetitive Bindungsspezies zu fungieren) oder eine katalytische Funktion oder dergleichen zu zeigen, um nur einige zu nennen.
  • Vor dem oder gleichzeitig mit dem Shuffling selektierter Sequenzen können die Sequenzen mutagenisiert werden. In einer Ausführungsform werden ausgewählte Glieder der Bibliothek in einem prokaryotischen Vektor geklont (z. B. in einem Plasmid, Phagemid oder einem Bakteriophagen), wodurch eine Sammlung einzelner Kolonien (oder Plaques) erzeugt wird, die für einzelne Glieder der Bibliothek stehen. Einzelne aus gewählte Glieder der Bibliothek können dann manipuliert werden (z. B. durch auf die Bindungsstelle gerichtete Mutagenese, Kassetten-Mutagenese, chemische Mutagenese, PCR-Mutagenese und dergleichen). Dadurch wird eine Sammlung von Gliedern der Bibliothek erzeugt, die einen Kern einer Sequenzvielfalt wiedergeben, der auf der Sequenz des ausgewählten Gliedes der Bibliothek beruht. Die Sequenz eines einzelnen selektierten Gliedes der Bibliothek oder eines Pools kann in der Weise manipuliert werden, daß man eine statistische Mutation, eine pseudostatistische Mutation, eine definierte Kern-Mutation (d. h. eine solche, die variante und invariante Reste-Positionen umfaßt und/oder variante Reste-Positionen umfaßt, die einen Rest umfassen können, der gewählt ist aus einem definierten Unter-Satz von Aminosäure-Resten), eine Mutation auf Codon-Basis und dergleichen einarbeitet, und zwar entweder segmentmäßig oder über die gesamte Länge der einzelnen selektierten Sequenz des Gliedes der Bibliothek. Die mutagenisierten selektierten Glieder der Bibliothek werden dann durch ein In-vitro- und/oder In-vivo-Rekombinations-Shuffling geshuffelt, wie dies in der vorliegenden Anmeldung offenbart ist.
  • Die Erfindung stellt auch Peptid-Bibliotheken bereit, die eine Mehrzahl von einzelnen Gliedern der Bibliothek gemäß der Erfindung umfassen, worin (1) jedes einzelne Glied der Bibliothek der Mehrzahl von Gliedern eine Sequenz umfaßt, die durch Shuffling eines Pools ausgewählter bzw. selektierter Sequenzen hergestellt wurde; und (2) jedes einzelne Glied der Bibliothek eine variable Sequenz eines Peptid-Segments oder eine Sequenz eines Einzelketten-Antikörper-Segments umfaßt, die verschieden ist von den variablen Peptidsegment-Sequenzen oder Einzelketten-Antikörper-Sequenzen anderer einzelner Glieder der Bibliothek in der Mehrzahl von Gliedern der Bibliothek (obwohl einige Glieder der Bibliothek in Form von mehr als einer Kopie pro Bibliothek zugegen sein können, und zwar aufgrund einer ungleichmäßigen Amplifikation, aufgrund stochastischer Wahrscheinlichkeit oder dergleichen).
  • Die Erfindung schafft auch ein durch das Verfahren gekennzeichnetes Produkt, wobei ausgewählte bzw. selektierte Polynukleotid-Sequenzen, die eine vorbestimmte Bin dungsspezifizität aufweisen (oder für ein Peptid mit vorbestimmter Bindungs-Spezifität codieren) gebildet werden durch das Verfahren, gemäß dem man (1) eine Bibliothek gezeigter Peptide oder gezeigter Einzelketten-Antikörper gegen einen vorbestimmten Rezeptor (z. B. einen Liganden) oder ein Epitop (z. B. ein Antigen-Molekül) screent und Glieder der Bibliothek identifiziert und/oder anreichert, die sich an den vorbestimmten Rezeptor oder das vorbestimmte Epitop binden, und zwar unter Herstellung eines Pools ausgewählter bzw. selektierter Glieder der Bibliothek; (2) die selektierten bzw. ausgewählten Glieder der Bibliothek (oder amplifizierte oder geklonte Kopien davon) durch Rekombination shuffelt, wobei dieser Schritt das vorbestimmte Epitop bindet und dieses dadurch aus der Bibliothek isoliert und/oder anreichert, wodurch eine geshuffelte Bibliothek erzeugt wird; und die geshuffelte Bibliothek gegen den vorbestimmten Rezeptor (z. B. Liganden) oder das vorbestimmte Epitop (z. B. Antigen-Makromolekül) screent und geshuffelte Glieder der Bibliothek identifiziert und/oder anreichert, die sich an den vorbestimmten Rezeptor oder das vorbestimmte Epitop binden und so einen Pool von ausgewählten bzw. selektierten geshuffelten Glieder der Bibliothek erzeugt.
  • Verfahren zum Display und Screening des Antikörpers
  • Das vorliegende Verfahren kann verwendet werden zum Shuffeln von Polynukleotid-Sequenzen, die durch Antikörper-Display-Verfahren ausgewählt wurden, wobei ein assoziiertes Polynukleotid für einen gezeigten Antikörper codiert, der im Hinblick auf einen Phänotyp gescreent wurde (z. B. im Hinblick auf seine Affinität zum Binden eines vorbestimmten Antigens (Liganden)).
  • Verschiedene molekulargenetische Ansätze wurden ersonnen, um das riesige immunologische Repertoire abzudecken, das sich in der extrem großen Zahl von einzelnen variablen Bereichen findet, die in Immunoglobulin-Ketten zugegen sein können. Der natürlich vorkommende Locus der schweren Kette eines Keimbahn-Immunoglobulins besteht aus getrennten Tandem-Anordnungen von Genen mit variablem (V) Segment, die stromaufwärts von einer Tandem-Anordnung von Genen eines Vielgestaltigkeits(D)-Segments angeordnet sind, die ihrerseits stromaufwärts zu einer Tandem-Anordnung von Genen des verbindenden (J) Abschnitts angeordnet sind, welche wiederum ihrerseits stromaufwärts zu Genen mit konstanten (CH) Bereichen angeordnet sind. Während der Entwicklung von B-Lymphozyten erfolgt eine V-D-J-Umordnung, wodurch ein Gen mit einer schweren Kette eines variablen Bereichs (VH) durch Umordnung gebildet wird und so ein verschmolzenes DJ-Segment gebildet wird. Dem folgt eine Umordnung mit einem V-Segment unter Bildung eines vereinigten V-D-J-Produktgens, das – wenn im Rahmen des Produkts umgeordnet – für einen funktionellen variablen Abschnitt (VH) einer schweren Kette codiert. In ähnlicher Weise ordnen Loci mit leichter Kette ein oder mehrere V-Segmente mit einem oder mehreren J-Segmenten um und bilden so ein Gen, das für den variablen Bereich (VL) einer leichten Kette codiert.
  • Das riesige Repertoire variabler Regionen, das in Immunoglobulinen möglich ist, stammt zum Teil von den zahlreichen kombinatorischen Möglichkeiten des Zusammenfügens von V- und J-Segmenten (und im Fall von Loci mit schweren Ketten: von D-Segmenten) während der Umordnung bei der B-Zellen-Entwicklung. Eine zusätzliche Sequenz-Vielgestalt in den variablen Bereichen der schweren Kette entsteht aus den nicht-einheitlichen Umordnungen der D-Segmente während des V-D-J-Vereinigens und aus der Zugabe der N-Bereiche. Weiter führt die Antigen-Selektion spezifischer B-Zellen-Klone zur Selektion von Varianten mit höherer Affinität, die nicht in der Keimbahn befindliche Mutationen in einer oder beiden variablen Bereichen der schweren und der leichten Kette aufweisen. Dieses Phänomen wird ”affinity maturation” oder ”affinity sharpening” genannt. Typischerweise finden sich die Mutationen dieses ”affinity sharpening” in speziellen Bereichen der variablen Region zusammen, am meisten verbreitet, in den die Komplementarität bestimmenden Bereichen (complementarity-determining regions; CDRs).
  • Um viele der Beschränkungen bei der Herstellung und Identifikation von Immunoglobulinen hoher Affinität durch Antigen-stimulierte B-Zellen-Entwicklung (d. h.) die Immunisierung) zu überwinden, wurden verschiedene prokaryotische Expressionssysteme entwickelt, die in der Weise gehandhabt werden können, daß sie zur Herstellung von Bibliotheken kombinatorischer Antikörper führen, die im Hinblick auf Antikörper hoher Affinität gegenüber spezifischen Antigenen gescreent werden können. Jüngste Fortschritte in der Expression von Antikörpern in Escherichia coli und Bakteriophagen-Systemen (siehe: ”Alternative Peptide Display Methods”; siehe unten) haben die Möglichkeit eröffnet, daß nahezu jede beliebige Spezifizität entweder dadurch erreicht werden kann, daß man Antikörper-Gene aus charakterisierten Hybridomen kloniert, oder dadurch, daß man eine de-novo-Selektion unter Verwendung von Antikörper-Gen-Bibliotheken durchführt (z. B. aus Ig cDNS).
  • Kombinatorische Bibliotheken von Antikörpern wurden in Bakteriophage-Lambda-Expressionssystemen generiert, die als Bakteriophagen-Plaquen oder als Kolonien von Lysogenen gescreent werden können (Huse et al. (1989), Science 246, 1275; Caton und Koprowski (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87, 6450; Mullinax et al (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87, 8095; Persson et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88, 2432). Verschiedene Ausführungsformen von Bakteriophagen-Antikörper-Zeige-Bibliotheken und Lambda-Phagen-Expressions-Bibliotheken wurden beschrieben (Kang et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A.) 88, 4363; Clackson et al. (1991), Nature 352, 624; McCafferty et al. (1990), Nature 348, 552; Burton et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88, 10134; Hoogenboom et al. (1991), Nucleic Acids Res. 19, 4133; Chang et al. (1991), J. Immunol. 147, 3610; Breitling et al. (1991), Gene 104, 147; Marks et al. (1991), J. Mol. Biol. 222, 581; Barbas et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89, 4457; Hawkins und Winter (1992), J. Immunol. 22, 867; Marks et al. (1992), Biotechnology 10, 779; Marks et al. (1992), J. Biol. Chem. 267,16007; Lowman et al (1991), Biochemistry 30, 10832; Lerner et al. (1992), Science 258, 1313. Typischerweise wird eine Bakteriophagen-Antikörper-Display-Bibliothek mit einem Rezeptor gescreent (z. B. einem Polypeptid, Kohlehydrat, Glykoprotein, Nukleinsäure), der immobilisiert ist (z. B. durch kovalente Bindung an ein Chromatographie-Harz, um den reaktiven Phagen durch Affinitätschromatographie anzureichern) und/oder ist markiert (z. B. um Plaquen oder Kolonie-Lifts einem Screening zugänglich zu machen).
  • Ein besonders vorteilhafter Ansatz war die Verwendung sogenannter Bibliotheken von Einzelkettenfragment-Variablen (single-chain fragment variable; scFv) (Marks et al. (1992) Biotechnology 10, 779; Winter G und Milstein C (1991), Nature 349, 293; Clackson et al. (1991), op. cit.; Marks et al. (1991), J. Mol. Biol. 222, 581; Chaudhary et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA.) 87, 1066; Chiswell et al. (1992), TIBTECH 10, 80; McCafferty et al. (1990), op. cit.; und Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA.) 85, 5879). Es wurden verschiedene Ausführungsformen von scFv-Bibliotheken beschrieben, die auf Bakeriophagen-Coat-Proteinen gezeigt werden.
  • Beginnend im Jahre 1988 wurden Einzelketten-Analoge von Fv-Fragmenten und ihre Fusionsproteine zuverlässig durch Antikörper-Engineering-Verfahren erzeugt. Der erste Schritt schließt allgemein den Erhalt von Genen ein, die für VH- und VL-Domänen mit den gewünschten Bindungseigenschaften codieren. Diese n-Gene können aus einer speziellen Hybridom-Zellinie isoliert werden, aus einer kombinatorischen V-Gen-Bibliothek selektiert werden oder durch V-Gen-Synthese hergestellt werden. Die Einzelketten-Fv wird gebildet durch Verbinden der Komponenten-V-Gene mit einem Oligonukleotid, das für ein passend aufgebautes Linker-Peptid wie beispielsweise (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 oder äquivalente Linker-Peptid(e) codiert. Der Linker stellt eine Brücke zwischen dem C-Terminus der ersten V-Region und dem N-Terminus der zweiten V-Region her, und die Anordnung ist entweder VH-Linker-VL oder VL-Linker-VH. Im Prinzip kann die scFv-Bindungsstelle zuverlässig sowohl die Affinität als auch die Spezifität der elterlichen Antikörper-Kombinationsstelle replizieren.
  • So bestehen scFv-Fragmente aus VH- und VL-Domänen, die zu einer einzigen Polypeptidkette über ein flexibles Linker-Peptid verbunden sind. Nachdem die scFv-Gene zusammengebaut wurden, werden sie zu einem Phagemid geklont und an der Spitze des M13-Phagen (oder eines ähnlichen fadenartigen Bakteriophagen) als Fusionsproteine zusammen mit dem Bakteriophagen-pIII (Gen-3)-Coat-Protein exprimiert. Das Anreichern eines Phagen, der einen Antikörper von Interesse exprimiert, wird dadurch bewirkt, daß man den rekombinanten Phagen, der eine scFv-Population zeigt, zum Binden an ein vorbestimmtes Epitop (z. B. ein Target-Antigen, einen Rezeptor) schwenkt.
  • Das verknüpfte Polynukleotid eines Glieds der Bibliothek liefert die Basis für die Replikation des Glieds der Bibliothek nach einem Screening- oder Selektion-Verfahren und liefert auch die Basis für die Bestimmung der Identität der gezeigten Peptid-Sequenz oder VH- und VL-Aminosäure-Sequenz durch Nukleotid-Sequenzierung. Das/die gezeigte(n) Peptid(e) oder der Einzelketten-Antikörper (z. B. scFv) und/oder seine VH- und VL-Domänen oder ihre CDRs können geklont oder in einem geeigneten Expressionsystem exprimiert werden. Häufig sind Polynukleotide, die für die isolierenden VH- und VL-Domänen codieren, an Polynukleotide gebunden, die für konstante Regionen (CH und CL) codieren, so daß Polynukleotide gebildet werden, die für komplette Antikörper (z. B. Chimären- oder Voll-Human-Antikörper), Antikörper-Fragmente und dergleichen codieren. Häufig werden Polynukleotide, die für isolierten CDRs codieren, in Polynukleotide eingepropft, die für ein geeignetes Rahmenwerk variabler Regionen (und gegebenenfalls konstanter Regionen) codieren, wodurch Polynukleotide gebildet werden, die für vollständige Antikörper (z. B. humanisierte oder Voll-Human-Antikörper), Antikörper-Fragmente und dergleichen codieren. Antikörper können zum Isolieren präparativer Mengen des Antigens durch Immunoaffinitäts-Chromatographie verwendet werden. Verschiedene andere Anwendungen derartiger Antikörper sind für Diagnose-Anwendung und/oder Krankheitsstadium-Anwendung (z. B. Neoplasie) und für therapeutische Anwendungen zur Behandlung einer Krankheit wie beispielsweise Neoplasie, Autoimmun-Krankheiten, AIDS, Herz-Kreislauf-Krankheiten, Infektionen und dergleichen.
  • Es wurde über verschiedene Verfahrensweisen zur Erhöhung der kombinatorischen Vielgestaltigkeit der scFv-Bibliothek berichtet, um das Repertoire an bindenden Spezies (Idiotypie-Spektrum) zu verbreitern. Die Anwendung von PCR hat ermöglicht, daß die variablen Bereiche schnell geklont werden konnten, und zwar entweder aus einer speziellen Hybridom-Quelle oder als Gen-Bibliothek aus nicht-immunisierten Zellen, was eine kombinatorische Vielgestaltigkeit in der Auswahl der VH- und VL-Kassetten erbrachte, die kombiniert werden können. Weiter können die VH- und VL-Kassetten selbst diversifiziert werden, beispielsweise durch statistische, pseudostatistische oder gerichtete Mutagenese. Typischerweise werden VH- und VL-Kassetten in die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) oder nahe diesen diversifiziert, häufig in der dritten CDR-Region, CDR3. Es wurde gezeigt, daß die enzymatische inverse PCR-Mutagenese ein einfaches und zuverlässiges Verfahren zum Aufbau relativ großer Bibliotheken von auf die scFv-Stelle gerichteten Mutanten ist (Stemmer et al. (1993); Biotechniques 14, 256), wie dies auch für die fehlerbehaftete PCR und die chemische Mutagenese gezeigt wurde (Deng et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 9533). Riechmann et al. (1993), Biochemistry 32, 8848, zeigten ein semirationales Design eines Antikörper-scFv-Fragments unter Verwendung der ortsgerichteten Randomisierung durch degenerierte Oligonukleotid-PCR und anschließendes Phagen-Display der resultierenden scFv-Mutanten. Barbas et al. (1992) a. a. O., versuchten das Problem der begrenzten Repertoire-Größen, die aus der Verwendung beschränkter Sequenzen mit variablem Bereich resultierten, dadurch zu umgehen, daß sie die Sequenz in einem synthetischen CDR-Bereich eines Human-Tetanus-Toxoid-bindenden Fab randomisierten.
  • Die CDR-Randomisierung hat das Potential, etwa 1 × 1020 CDRs für allein das CDR3 mit schwerer Kette zu erzeugen, und grob eine ähnliche Zahl von Varianten des CDR1 mit schwerer Kette und des CDR2, sowie Varianten der CDR1 bis 3 mit leichter Kette. Einzeln oder zusammengenommen, erfordert die Kombination der CDR-Randomisierung von schweren und/oder leichten Ketten die Erzeugung einer prohibitiven Zahl von Bakteriophagen-Klonen zur Erzeugung einer Klon-Bibliothek, die alle möglichen Kombinationen wiedergibt, von denen die überwiegende Mehrzahl nicht-bindend ist. Die Erzeugung derart großer Zahlen von Primärtransformanten ist nicht denkbar mit gängiger Transformationstechnologie und gängigen Bakteriophagen-Display-Systemen. Beispielsweise erzeugten Barbas et al. (1992); a. a. O. nur 5 × 107 Transformanten, was nur eine winzige Teilmenge der möglichen Vielzahl einer Bibliothek von sorgfältig randomisierten CDRs ausmacht.
  • Trotz dieser wesentlichen Beschränkungen hat das Display von Bakteriophagen von scFv schon zu einer Vielzahl von nützlichen Antikörpern und Antikörper-Fusionsproteinen geführt. Es wurde gezeigt, daß ein bispezifischer Einzelketten-Antikörper eine effiziente Lyse von Tumorzellen vermittelt (Gruber et at. (1994), J. Immunol. 152, 5368). Weiter wurde gezeigt, daß die intrazelluläre Expression eines Anti-Rev-scFv die HIV-1-Virus-Replikation in vitro inhibiert (Duan et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91, 5075). Weiter wurde gezeigt, daß die intrazelluläre Expression eines Anti-p21ras-scFv die meiotische Reifung von Xenopus oocytes inhibiert (Biocca et al. (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun. 197, 422). Es wurde auch über rekombinante scFv berichtet, die zur Diagnose einer HIV-Infektion verwendet werden kann, was die diagnostische Brauchbarkeit von scFv zeigt (Lilley et al. (1994), J. Immunol. Meth. 171, 211). Es wurde auch über Fusionsproteine berichtet, in denen ein scFv an ein zweites Polypeptid gebunden ist, wie beispielsweise ein Toxin oder ein fibrinolytisches Aktivator-Protein (Holvost et al. (1992) Eur. J. Biochem. 210, 945; Nicholls et al. (1993), J. Biol. Chem. 268, 5302).
  • Wenn es möglich wäre, scFv-Bibliotheken zu erzeugen, die eine breitere Antikörper-Vielgestaltigkeit aufweisen und viele der Beschränkungen herkömmlicher CDR-Mutagenese- und Randomisierungs-Verfahren überwinden, die nur eine ganz winzige Teilmenge der möglichen Sequenz-Kombinationen abdecken, könnte die Zahl und Qualität der scFv-Antikörper, die für therapeutische und diagnostische Zwecke geeignet sind, in starkem Maße verbessert werden. Um dieses Problem anzugehen, werden die In-vitro- und In-vivo-Shuffling-Verfahren gemäß der Erfindung verwendet, um CDRs zu rekombinieren, die (typischerweise über PCR-Amplifikation oder Klonen) aus Nukleinsäuren erhalten wurden, die von den gewählten gezeigten Antikörpern erhalten wurden. Derartige gezeigte Antikörper können auf Zellen, auf Bakteriophagen-Teilchen, auf Polysomen oder auf beliebigen geeigneten Antikörper-Display-Systemen gezeigt werden, in denen der Antikörper mit der diesen codierenden Nukleinsäure bzw. mehreren Nukleinsäuren assoziiert ist. In einer Variation werden die CDRs anfänglich aus mRNS (oder cDNS) von Antikörper-produzierenden Zellen erhalten (z. B. Plasmazellen/Splenocyten aus einer immunisierten Maus des Wild-Typs, einem Menschen oder einer transgenen Maus, die in der Lage ist, menschliche Antikörper herzustellen, wie dies offenbart ist in den Druckschriften WO92/03918 , WO93/12227 und WO94/25585 ), einschließlich Hybridomen, die davon abgeleitet sind.
  • Polynukleotid-Sequenzen, die in einer ersten Selektionsrunde (typischerweise durch Affinitätsselektion für einen gezeigten Antikörper, der sich an ein Antigen (z. B. an einen Liganden) bindet) nach einem dieser Verfahren selektiert wurden, werden gepoolt, und der/die Pool(s) wird/werden mittels eines In-vitro-Rekombinationsverfahrens und/oder eines In-vivo-Rekombinationsverfahrens geshuffelt, speziell durch ein Shuffeln von CDRs (typischerweise durch Shuffeln von CDRs schwerer Kette mit anderen CDRs schwerer Kette und CDRs leichter Kette mit anderen CDRs leichter Kette), wodurch ein geshuffelter Pool erzeugt wird, der eine Population von rekombinierten ausgewählten Polynukleotid-Sequenzen umfaßt. Die rekombinierten ausgewählten Polynukleotid-Sequenzen werden in einem Selektionsformat als gezeigter Antikörper exprimiert und wenigstens einer nachfolgenden Selektionsrunde unterzogen. Die in der nachfolgenden Selektionsrunde (bzw. mehreren derartigen Runden) selektierten Polynukleotid-Sequenzen können direkt verwendet werden, sequenziert werden und/oder einer oder mehreren zusätzlichen Runden des Shufflings und der anschließenden Selektion unterzogen werden, bis ein Antikörper der gewünschten Bindungsaffinität erhalten wird. Selektierte Sequenzen können auch mit Polynukleotid-Sequenzen rückgekreuzt werden, die für Sequenzen eines neutralen Antikörper-Rahmenwerks codieren (d. h. die nur unwesentlichen funktionelle Auswirkung auf die Bindung des Antigens haben), wie beispielsweise durch Rückkreuzen mit einem Human-Rahmenwerk mit variablen Regionen, wodurch Antikörper mit humanähnlicher Sequenz erzeugt werden. Allgemein wird während des Rückkreuzen eine anschließende Selektion angewendet, um die Eigenschaft des Binden an das vorbestimmte Antigen zu erhalten.
  • Alternativ dazu oder in Kombination mit den vorstehend angesprochenen Variationen kann die Valenz des Target-Epitops variiert werden, so daß die mittlere Bindungsaffinität ausgewählter Glieder der scFv-Bibliothek gesteuert wird. Das Target-Epitop kann an eine Oberfläche oder ein Substrat mit unterschiedlichen Dichten gebunden werden, beispielsweise, indem man ein Competitor-Epitop einschließt, durch Verdünnung oder durch ein anderes Verfahren, wie es Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt ist. Eine hohe Dichte (Valenz) des vorbestimmten Epitops kann verwendet werden, um Glieder einer scFv-Bibliothek anzureichern, die eine relativ niedrige Affinität aufweisen, während eine niedrige Dichte (Valenz) vorzugsweise Glieder einer scFv-Bibliothek mit hoher Affinität anreichern kann.
  • Zum Erzeugen diverser variabler Segmente kann eine Sammlung von synthetischen Oligonukleotiden, die für einen zufälligen, pseudozufälligen oder Kern-Satz mit definierter Sequenz von Peptid-Sequenzen codieren, durch Ligation an eine vorbestimmte Stelle (z. B. ein CDR) eingefügt werden. In ähnlicher Weise kann die Sequenz-Vielfalt eines oder mehrerer CDRs der Einzelketten-Antikörper-Kassette(n) dadurch aufgeweitet werden, daß man die CDR(s) mit auf die Bindungsstelle gerichteter Mutagenese, CDR-Ersatz und dergleichen mutiert. Die resultierenden DNS-Moleküle können in einem Wirt zum Klonen oder zur Amplifikation vor dem Shuffling propagiert werden oder können direkt verwendet werden (d. h. dadurch kann ein Verlust von Vielgestaltigkeit vermieden werden, der bei Propagation in einer Wirtszelle auftreten könnte), und die selektierten Glieder der Bibliothek werden anschließend geshuffelt.
  • Gezeigte Peptid-/Polynukleotid-Komplexe (Glieder der Bibliothek), die für ein variables Segment der Peptid-Sequenz von Interesse oder einen Einzelketten-Antikörper von Interesse codieren, werden aus der Bibliothek über eine Verfahrensweise der Affinitäts-Anreicherung selektiert. Dies wird bewirkt mittels eines immobilisierten Makromoleküls oder Epitops, das für die Peptid-Sequenz von Interesse spezifisch ist, wie beispielsweise einen Rezeptor, ein anderes Makromolekül oder eine andere Epitop-Spezies. Eine Wiederholung des Affinitäts-Selektion-Verfahrens liefert eine Anreicherung der Glieder der Bibliothek, die für die gewünschten Sequenzen codieren, die anschließend zum Pooling und Shuffling, zum Sequenzieren und/oder für weitere Propagation und Affinitätsanreicherung isoliert werden können.
  • Die Glieder der Bibliothek ohne die gewünschte Spezifität werden durch Waschen entfernt. Der erforderliche Grad und die Stringenz des Waschens werden für jede Peptid-Sequenz oder jeden Einzelketten-Antikörper von Interesse und das immobilisierte vorbestimmte Makromolekül oder Epitop bestimmt. Ein bestimmter Grad von Kontrolle kann über die charakteristischen Bindungseigenschaften der entstehenden Peptid-/DNS-Komplexe ausgeübt werden, die dadurch gewonnen werden, daß man die Bedingungen der Bindungsinkubation und des anschließenden Waschens entsprechend einstellt. Die Temperatur, der pH-Wert, die Ionenstärke, die Konzentration an zweiwertigen Kationen und das Volumen und die Dauer des Waschvorgangs führen zur Selektion von entstehenden Peptid-/DNS-Komplexen innerhalb spezieller Bereiche der Affinität für das immobilisierte Makromolekül. Eine Selektion auf der Basis einer niedrigen Dissoziationsrate, die üblicherweise eine hohe Affinität voraussagen läßt, ist häufig die am meisten praktische Verfahrensweise. Dies kann entweder erreicht werden durch kontinuierliche Inkubation in Gegenwart einer sättigenden Menge von freiem vorbestimmten Makromolekül oder durch Erhöhung des Volumens, der Zahl und der Länge der Waschvorgänge. In jedem Fall wird das erneute Binden des dissoziierten entstehenden Peptid-/DNS-Komplexes oder Peptid-/RNS-Komplexes verhindert, und mit zunehmender Zeit werden entstehende Peptid-/DNS-Komplexe oder Peptid-/RNS-Komplexe mit höherer und noch höherer Affinität gewonnen.
  • Weitere Modifikationen der Verfahrensweisen des Bindens und Waschens können angewendet werden, um Peptide mit speziellen charakteristischen Eigenschaften aufzufinden. Die Affinitäten einiger Peptide sind abhängig von der Ionenstärke oder der Kationen-Konzentration. Dies ist eine nützliche charakteristische Eigenschaft für Peptide, die bei der Affinitäts-Reinigung verschiedener Proteine verwendet wird, wenn gemäßigte Bedingungen zum Entfernen des Proteins von den Peptiden erforderlich sind.
  • Eine Variation dieses Verfahrens schließt die Verwendung von Mehrfach-Bindungs-Targets (Mehrfach-Epitop-Spezies, Mehrfach-Rezeptor-Spezies) ein, so daß eine scFv-Bibliothek gleichzeitig im Hinblick auf mehrere scFv gescreent werden kann, die unterschiedliche Bindungsspezifitäten aufweisen. Wenn als gegeben angenommen wird, daß die Größe einer scFv-Bibliothek häufig die Vielgestaltigkeit potentieller scFv-Sequenzen beschränkt, ist es typischerweise wünschenswert, scFv-Bibliotheken mit größtmöglichem Format zu verwenden. Die Zeit und wirtschaftliche Betrachtungen des Erzeugen einer Zahl sehr großer Polysom-scFv-Display-Bibliotheken kann prohibitiv werden. Um dieses wesentliche Problem zu vermeiden, können Spezies mit mehreren vorbestimmten Epitopen (Rezeptorspezies) gleichzeitig in einer einzigen Bibliothek gescreent werden, oder es kann ein schrittweises Screening nach einer Zahl von Epitop-Spezies angewendet werden. In einer Variation dieses Verfahrens können Epitop-Spezies mit mehreren Targets, von denen jedes auf einem separaten Kügelchen (oder einem Untersatz von Kügelchen) codiert ist, gemischt und mit einer Polysom-Display-scFv-Bibliothek unter geeigneten Bindungs-Bedingungen inkubiert werden. Die Sammlung von Kügelchen, die Spezies mit mehreren Epitopen umfassen, kann dann zum Isolieren von Gliedern der scFv-Bibliothek durch Affinitätsselektion verwendet werden. Allgemein können anschließende Runden des Affinitäts-Screenings dieselbe Mischung von Kügelchen, Untersätze davon oder Kügelchen einschließen, die nur eine oder zwei Spezies mit individuellen Epitopen enthalten. Dieser Ansatz führt zu einem wirksamen Screening, und er ist verträglich mit der Automation im Labor, mit Verarbeitung im Batch-Format und mit Screening-Methoden mit hohem Durchsatz.
  • Eine Vielzahl von Verfahrensweisen kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine Peptid-Bibliothek oder eine Einzelketten-Antikörper-Bibliothek zu diversifizieren oder vor dem Shuffling oder gleichzeitig mit dem Shuffling um Peptide mit variablem Segment oder VH, VL oder CDRs zu diversifizieren, die in frühen Runden des Schwenken gefunden werden, damit das vorbestimmte Makromolekül oder Epitop eine ausreichende Bindungsaktivität aufweist. In einem Ansatz werden die positiven selektierten Peptid-/Polynukleotid-Komplexe (diejenigen, die in einer frühen Runde der Affinitäts-Anreicherung identifiziert wurden, sequenziert und so die Identität der aktiven Peptide bestimmt. Oligonukleotide werden dann auf der Basis dieser aktiven Peptid-Sequenzen synthetisiert, wofür man ein niedriges Niveau aller Basen verwendet, die in jeden Schritt eingeschlossen werden, um nur geringe Variationen der Primär-Oligonukleotid-Sequenzen zu erzeugen. Diese Mischung aus (leicht) degenerierten Oligonukleotiden wird dann in die variablen Segment-Sequenzen an den passenden Orten einkloniert. Dieses Verfahren erzeugt systematische, kontrollierte Variationen der Start-Peptid-Sequenzen, die anschließend geshuffelt werden können. Es ist jedoch erforderlich, daß individuelle positive entstehende Peptid-/Polynukleotid-Komplexe vor einer Mutagenese sequenziert werden, und damit ist dieses Verfahren nützlich zur Ausdehnung der Vielgestaltigkeit kleiner Zahlen von gewonnenen Komplexen und zum Selektieren von Varianten, die eine höhere Bindungsaffinität und/oder höhere Bindungsspezifität aufweisen. In einer Variation dieses Verfahren erfolgt eine mutagene PCR-Amplifikation positiv selektierter Peptid-/Polynukleotid-Komplexe (speziell der Sequenzen mit variablen Regionen, deren Amplifikationsprodukte in vitro und/oder in vivo geshuffelt werden) und eine oder mehrere zusätzliche Runden des Screenings vor dem Sequenzieren. Derselbe allgemeine Ansatz kann bei Einzelketten-Antikörpern angewendet werden, um die Vielgestaltigkeit auszudehnen und die Bindungsaffinität/-spezifität zu erhöhen, typischerweise durch Diversifikation von CDRs oder benachbarten Rahmenwerk-Regionen vor dem Shuffling oder gleichzeitig mit dem Shuffling. Sofern erwünscht, können die Shuffling-Reaktionen mit mutagenen Oligonukleotiden gespiked werden, die zu einer In-vitro-Rekombination mit den selektierten Gliedern der Bibliothek in der Lage sind. So können Mischungen synthetischer Oligonukleotide und PCR-Fragmente (die durch fehlerbehaftete oder hochgradig genaue Verfahren synthetisiert wurden), der In-vitro-Shuffling-Mischung zugesetzt werden und in die resultierenden geshuffelten Glieder der Bibliothek (geshuffelte Verbindungen; Shufflants) eingearbeitet werden.
  • Die vorliegende Erfindung des Shufflings ermöglicht die Bildung einer riesigen Bibliothek von CDR-varianten Einzelketten-Antikörpern. Ein Weg zur Erzeugung derartiger Antikörper besteht darin, synthetische CDRs in den Einzelketten-Antikörper einzubauen und/oder besteht in der CDR-Randomisierung vor dem Shuffling oder gleichzeitig mit dem Shuffling. Die Sequenzen der synthetischen CDR-Kassetten werden so ausgewählt, daß sie sich auf bekannte Sequenz-Daten menschlicher CDR beziehen, und werden nach den Kenntnissen des Fachmanns in diesem technischen Bereich gemäß den folgenden Leitlinien ausgewählt: Synthetische CDRs weisen wenigstens 40% Positionssequenz-Identität mit bekannten CDR-Sequenzen auf, und sie haben vorzugsweise wenigstens 50 bis 70% Positionssequenz-Identität zu bekannten CDR-Sequenzen. Beispielsweise kann eine Sammlung von synthetischen CDR-Sequenzen erzeugt werden durch Synthetisieren einer Sammlung von Oligonukleotid-Sequenzen auf der Grundlage der natürlich vorkommenden menschlichen CDR-Sequenzen, wie sie aufgelistet sind in ”Kabat et at. (1991), a. a. O.”; der/die Pool(s) synthetischer CDR-Sequenzen werden so berechnet, daß sie für CDR-Peptid-Sequenzen codieren, die wenigstens 40% Sequenz-Identität mit wenigstens einer bekannten natürlich vorkommenden menschlichen CDR-Sequenz aufweisen. Alternativ dazu kann eine Sammlung von natürlich vorkommenden CDR-Sequenzen verglichen werden, damit sie Übereinstimmungs-Sequenzen erzeugt, so daß Aminosäuren, die an einer Rest-Position häufig verwendet werden (d. h. in wenigstens 5% von bekannten CDR-Sequenzen) in die synthetischen CDRs an der bzw. den entsprechenden Position(en) eingearbeitet werden. Typischerweise werden einige (z. B. 3 bis etwa 50) be kannte CDR-Sequenzen verglichen, und beobachtete natürliche Sequenz-Variationen zwischen den bekannten CDRs werden in Tabellenform aufgelistet, und eine Sammlung von Oligonukleotiden, die für CDR-Peptid-Sequenzen codieren, die alle oder die meisten Permutationen der beobachteten natürlichen Sequenz-Variationen schließen, wird synthetisiert. Als Beispiel, nicht jedoch als Beschränkung, wird folgendes angegeben: Wenn eine Sammlung von Human-VH-CDR-Sequenzen carboxy-terminale Aminosäuren aufweist, die entweder Tyr, Val, Phe oder Asp sind, dann wird/werden der/die Pool(s) synthetischer CDR-Oligonukleotid-Sequenzen so aufgebaut, daß dies ermöglicht, daß der carboxy-terminale CDR-Rest einer dieser Aminosäure-Reste ist. In einigen Ausführungsformen werden andere Reste als diejenigen eingebaut, die natürlicherweise an der Rest-Position in der Sammlung von CDR-Sequenzen auftreten. Erhaltende bzw. konservative Aminosäure-Substitutionen werden häufig eingebaut, und bis zu 5 Reste-Positionen können in der Weise variiert werden, daß sie nicht-konservative Aminosäure-Substitutionen eingearbeitet enthalten, verglichen mit bekannten, natürlich vorkommenden CDR-Sequenzen. Derartige CDR-Sequenzen können bei primären Gliedern der Bibliothek (vor dem Screening der ersten Runde) verwendet werden und/oder können verwendet werden, um In-vitro-Shuffling-Reaktionen von Sequenzen ausgewählter Glieder der Bibliothek zu spiken. Der Aufbau solcher Pools von definierten und/oder degenerierten Sequenzen kann in einfacher Weise durch Fachleute mit üblichem Sachverstand in diesem technischen Bereich erfolgen.
  • Die Sammlung von synthetischen CDR-Sequenzen umfaßt wenigstens ein Glied, das nicht dafür bekannt ist, eine natürlich vorkommende CDR-Sequenz zu sein. Es liegt im Belieben des Praktikers in diesem technischen Bereich, einen Anteil von statistischen oder pseudostatistischen Sequenzen einzuschließen (oder dies nicht zu tun), die einem Zusatz im N-Bereich in der CDR mit schwerer Kette entsprechen. Die Sequenz im N-Bereich reicht von 1 Nukleotid bis zu etwa 4 Nukleotiden, die an den V-D- und D-J-Verbindungsstellen auftreten. Eine Sammlung von synthetischen CDR-Sequenzen mit schwerer Kette umfaßt wenigstens etwa 100 einzigartige CDR-Sequenzen, typischerweise wenigstens etwa 1.000 einzigartige CDR-Sequenzen, vorzugsweise wenig stens etwa 10.000 einzigartige CDR-Sequenzen und häufig mehr als 50.000 einzigartige CDR-Sequenzen, jedoch sind üblicherweise nicht mehr als etwa 1 × 106 einzigartige CDR-Sequenzen in die Sammlung eingeschlossen, obwohl gelegentlich 1 × 107 bis 1 × 108 einzigartige CDR-Sequenzen zugegen sind, speziell dann, wenn konservative Aminosäure-Substitutionen an Positionen erlaubt werden, an denen der konservative Aminosäure-Substituent nicht zugegen ist oder selten (d. h. in weniger als 0,1% der Fälle) in der Position in natürlich vorkommenden Human-CDRs vorhanden ist. Im allgemeinen sollte die Zahl von einzigartigen CDR-Sequenzen, die in eine Bibliothek eingeschlossen sind, allgemein nicht die erwartete Zahl von Primär-Transformanten in der Bibliothek um mehr als einen Faktor von 10 übersteigen. Solche Einzelketten-Antikörper binden sich allgemein an ein vorbestimmtes Antigen (z. B. das Immunogen) mit einer Affinität von etwa wenigstens 1 × 107 M–1, vorzugsweise mit einer Affinität von etwa wenigstens 5 × 107 M–1, noch mehr bevorzugt mit einer Affinität von wenigstens 1 × 108 M–1 bis 1 × 109 M–1 oder mehr, manchmal bis zu 1 × 1010 M–1 oder mehr. Häufig ist das vorbestimmte Antigen ein Human-Protein, wie beispielsweise ein Human-Zellen-Oberflächen-Antigen (z. B. CD4, CD8, IL-2-Rezeptor, EGF-Rezeptor, PDGF-Rezeptor), ein anderes biologisches Human-Makromolekül (z. B. Thrombomodulin, Protein C, Kohlehydrat-Antigen, Sialyl-Lewis-Antigen, L-Selektin) oder ein mit einer nicht-menschlichen Krankheit verbundenes Makromolekül (z. B. Bakterien-LPS, ein Virion-Capsid-Protein oder ein Umschlag-Glykoprotein) und dergleichen.
  • Einzelketten-Antikörper der gewünschten Spezifität und mit hoher Affinität können in einer Vielzahl von Systemen behandelt und exprimiert werden. Beispielsweise wurden scFv in Pflanzen produziert (Firek et al. (1993), Plant Mol. Biol. 23, 861) und können in einfacher Weise in prokaryotischen Systemen hergestellt werden (R. J. Owens und R. J. Young (1994), J. Immunol. Meth. 168, 149; S. Johnson und R. E. Bird (1991), Methods Enzymol. 203, 88). Weiter können die Einzelketten-Antikörper als Basis zum Aufbau ganzer Antikörper oder verschiedener Fragmente davon verwendet werden (Kettleborough et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24, 952). Die den variablen Bereich codierende Sequenz kann isoliert werden (z. B. durch PCR-Amplifikation oder Sub-Klonen) und kann zu einer Sequenz gespleißt werden, die einen gewünschten Human-Konstant-Bereich codiert und so einen Antikörper mit Human-Sequenz codiert, der besser geeignet ist für therapeutische Zwecke im Human-Bereich, in dem die Immunogenizität vorzugsweise minimiert wird. Das/die Polynukleotid(e), das die resultierende vollständige codierende Sequenz für den Human-Bereich aufweist, kann in einer Wirtszelle exprimiert werden (z. B. aus einem Expressions-Vektor in einer Säugerzelle) und kann für eine pharmazeutische Formulierung gereinigt werden.
  • Die DNS-Expressionskonstrukte schließen typischerweise eine Expressionssteuerungs-DNS-Sequenz ein, die operativ an die codierenden Sequenzen gebunden ist, einschließlich natürlicherweise damit verbundener oder heterologer Promoter-Bereiche. Vorzugsweise sind die Expressions-Kontroll-Sequenzen eukaryotische Promoter-Systeme in Vektoren, die zu einer Transformation oder Transfektion eukaryotischer Wirtszellen geeignet sind. Sobald der Vektor in den passenden Wirt eingearbeitet wurde, wird der Wirt unter Bedingungen gehalten, die für eine auf hoher Ebene ablaufende Expression der Nukleotid-Sequenzen und die Gewinnung und Reinigung der mutanten ”behandelten (engineered)” Antikörper geeignet sind.
  • Wie vorstehend festgestellt, werden die DNS-Sequenzen in Wirten exprimiert, nachdem die Sequenzen operativ mit einer Sequenz zur Expressionskontrolle verbunden wurden (d. h. so positioniert wurden, daß die Transkription und Translation des Struktur-Gens sichergestellt ist). Diese Expressionsvektoren sind typischerweise in den Wirtsorganismen replizierbar, und zwar entweder als Episome oder als integraler Teil der Chromosomen-DNS des Wirts. Allgemein enthalten Expressions-Vektoren Selektionsmarker, z. B. Tetracyclin or Neomycin, was den Nachweis dieser Zellen, die mit den gewünschten DNS-Sequenzen transformiert wurden, erlaubt (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4,704,362 , das durch die In-Bezugnahme in die vorliegende Offenbarung übernommen wird).
  • Zusätzlich zu eukaryotischen Mikroorganismen wie beispielsweise Hefen können auch Säugergewebe-Zellkulturen zur Herstellung der Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden (siehe: Wienacker, ”Von Genen zu Klonen”, VCH Publishers, N. Y., N. Y. (1987); diese Druckschrift wird durch die In-Bezugnahme in die vorliegende Offenbarung übernommen). Eukaryotische Zellen sind tatsächlich bevorzugt, da eine Zahl geeigneter Wirtszellinien, die in der Lage sind, intakte Immunoglobuline abzuscheiden, in diesem technischen Bereich entwickelt wurde, und diese schließen die CHO-Zellinien, verschiedene COS-Zellinien, HeLa-Zellen, Myelom-Zellinien usw., jedoch vorzugsweise transformierte B-Zellen oder Hybridome ein. Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontroll-Sequenzen einschließen, wie beispielsweise den Replikationsursprung (origin of replication), einen Promotor, einen Verstärker (Queen et al. (1986), Immunol. Rev. 89, 49) und notwendige Informationsstellen für die Verarbeitung wie beispielsweise Ribosom-Bindungsstellen, RNS-Spleiß-Stellen, Polyadenylierungs-Stellen und Transkriptionsterminator-Sequenzen. Bevorzugte Expressionskontroll-Sequenzen sind Promotoren, die von Immunoglobulin-Genen, Cytomegalovirus, SV40, Adenovirus, Bovine Papilloma-Virus und dergleichen abgeleitet sind.
  • Die eurkaryotische DNS-Transkription kann verstärkt werden durch Einbau einer Verstärker-Sequenz in den Vektor. Verstärker sind auf cis-Basis agierende Sequenzen einer Länge im Bereich zwischen 10 und 300 bp, die eine Transkription durch einen Promoter verstärken. Verstärker können effektiv die Transkription verstärken, wenn sie entweder in 5'-Position oder in 3'-Position zu der Transkriptionseinheit stehen. Sie sind also wirksam, wenn sie innerhalb eines Introns oder innerhalb der codierenden Sequenz selbst angeordnet sind. Typischerweise werden virale Verstärker verwendet, einschließlich SV40-Verstärker, Cytomegalovirus-Verstärker, Polyoma-Verstärker und Adenovirus-Verstärker. Verstärker-Sequenzen aus Säuger-Systemen werden auch weit verbreitet verwendet, wie beispielsweise der Mause-Immunoglobulin-Verstärker mit schwerer Kette.
  • Säuger-Expressions-Vektorsysteme schließen typischerweise auch ein selektierbares Marker-Gen ein. Beispiele geeigneter Marker schließen das Dihydrofolatreduktase-Gen (DHFR), das Thymidinkinase-Gen (TK) oder prokaryotische Gene ein, die Resistenz gegenüber Arzneimitteln verleihen. Die beiden erstgenannten Marker-Gene bevorzugen die Verwendung von Mutanten-Zellinien, denen die Fähigkeit fehlt, ohne den Zusatz von Thymidin zum Wachstumsmedium zu wachsen. Transformierte Zellen können dann identifiziert werden durch ihr Vermögen, auf keinen Zusatz enthaltendem Medium zu wachsen. Beispiele prokaryotischer Gene, die Resistenz gegenüber Arzneimitteln verleihen und die nützlich als Marker sind, schließen Gene ein, die Resistenz gegenüber G418, Mycophenolsäure und Hygromycin verleihen.
  • Die Vektoren, die die DNS-Segmente von Interesse enthalten, können in die Wirtszelle über wohlbekannte Verfahrensweisen transferiert werden, was von der Art des zellulären Wirts abhängt. Beispielsweise wird allgemein ein Calciumchlorid-Transfektion für prokaryotische Zellen angewendet, während eine Calciumphosphat-Behandlung, eine Lipofektion oder eine Elektroporation für andere zelluläre Wirte verwendet werden kann. Andere Verfahren, die zur Transformation von Säugerzellen verwendet werden, schließen die Verwendung von Polybrene, einer Protoplasten-Fusion, Liposome, Elektroporation und Mikroinjektion ein (siehe allgemein: Sambrook et al., siehe oben).
  • Sobald sie exprimiert sind, können die Antikörper, individuellen mutierten Immunoglobulin-Ketten, mutierten Antikörper-Fragmente und anderen Immunoglobulin-Polypeptide gemäß der Erfindung nach Standard-Verfahrensweisen dieses technischen Bereichs gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat-Fällung, fraktionierte Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen (siehe allgemein: R. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, N. Y. (1982)). Sobald sie gereinigt sind, und zwar entweder partiell oder bis zur Homogenität, wenn dies erwünscht ist, können die Polypeptide dann therapeutisch eingesetzt werden oder bei der Entwicklung und Durchführung von Testverfahren, Immunofluoreszenz-Färbungen und der gleichen eingesetzt werden (siehe allgemein: Immunological Methods, Bände 1 und 2, Lefkovits und Pernis (Herausgeber), Academic Press, New York, N. Y. (1979 und 1981)).
  • Die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten Antikörper können zur Diagnose und Therapie verwendet werden. Um ein anschauliches Beispiel zu geben, das jedoch nicht der Beschränkung dienen soll, kann angegeben werden, daß sie verwendet werden zur Behandlung von Krebs, Autoimmun-Krankheiten oder viralen Infektionen. Zur Behandlung von Krebs werden die Antikörper typischerweise an ein Antigen gebunden, das vorzugsweise in Krebszellen exprimiert wird, wie beispielsweise erbB-2, CEA, CD33 und viele andere Antigene und Bindungsglieder, die Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt sind.
  • Hefe-Zwei-Hybrid-Screening-Essays
  • Der Prozeß des Shufflings kann auch verwendet werden, um durch Rekombination einen Pool von ausgewählten Gliedern einer Bibliothek zu diversifizieren, die durch Screening eines Zwei-Hybrid-Screening-Systems erhalten wurden, um Glieder der Bibliothek zu identifizieren, die sich an eine vorbestimmte Polypeptid-Sequenz binden. Die selektierten Glieder der Bibliothek werden gepoolt und im Rahmen eines In-vitro- und/oder In-vivo-Rekombinationsverfahrens geshuffelt. Der geshuffelte Pool kann dann einem Screening in einem Hefe-Zwei-Hybrid-System unterzogen werden, um solche Glieder der Bibliothek zu selektieren, die sich an die vorbestimmte Polypeptid-Sequenz binden (z. B. die and SH2-Domäne) oder die sich an eine alternative vorbestimmte Polypeptid-Sequenz binden (z. B. eine SH2-Domäne einer anderen Protein-Spezies).
  • Ein Ansatz zum Identizifieren von Polypeptid-Sequenzen, die sich an eine vorbestimmte Polypeptid-Sequenz binden, war der Ansatz, ein sogenanntes ”Zwei-Hybrid-System” zu verwenden, in dem die vorbestimmte Polypeptid-Sequenz in einem Fusi onsprotein zugegen ist (Chien et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88, 9578). Dieser Ansatz identifiziert Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo über eine Rekonstitution eines Transkriptionsaktivators (S. Fields und O. Song (1998), Nature 340, 245), nämlich das Hefe-Ga14-Transkriptionsprotein. Typischerweise beruht das Verfahren auf den Eigenschaften des Hefe-Ga14-Proteins, das aus separierbaren Domänen besteht, die für das Binden an eine DNS und die Transkriptionsaktivierung verantwortlich sind. Polynukleotide, die für zwei Hybrid-Proteine codieren, von denen eines aus der Hefe-Ga14-DNS-Bindungsdomäne besteht, die an eine Polypeptid-Sequenz eines bekannten Proteins geknüpft ist, und das andere aus der Ga14-Aktivierungs-Domäne besteht, die an eine Polypeptidsequenz eines zweiten Proteins gebunden ist, werden aufgebaut und in eine Hefe-Wirtszelle eingeschleust. Die intermolekulare Bindung zwischen den beiden Fusionsproteinen stellt die Ga14-DNS-Bindungsdomäne mit der Ga14-Aktivierungsdomäne wieder her, was zur Transkriptions-Aktivierung eines Reporter-Gens führt (z. B. lacZ, HIS3), das operativ mit der Ga14-Bindungsstelle verbunden ist. Typischerweise wird das Zwei-Hybrid-Verfahren zur Identifikation neuer Polypeptid-Sequenzen verwendet, die mit einem bekannten Protein wechselwirken (Silver SC und Hunt SW (1993), Mol. Biol. Rep. 17, 155; Durfee et al. (1993), Genes Devel. 7, 555; Yang et al. (1992), Science 257, 680; Luban et al. (1993), Cell 73, 1067; Hardy et al. (1992), Genes Devel. 6; 80I; Bartel et al. (1993), Biotechniques 14, 920; und Vojtek et al. (1993), Cell 74, 205). Jedoch wurden Variationen des Zwei-Hybrid-Verfahrens verwendet zur Identifikation von Mutationen eines bekannten Proteins, die seine Bindung an ein zweites bekanntes Protein beeinträchtigen (B. Li und S. Fields (1993), FASEB J. 7, 957; Lalo et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90, 5524; Jackson et al. (1993), Mol. Cell. Biol. 13, 2899; und Madura et al. (1993), J. Biol. Chem. 268, 12046). Zwei-Hybrid-Systeme wurden auch verwendet zur Identifikation von wechselwirkenden Struktur-Domänen zweier bekannter Proteine (Bardwell et al. (1993), Med. Microbiolog. 8, 1177; Chakraborty et al. (1992), J. Biol. Chem. 267, 17498; Staudinger et al. (1993), J. Biol. Chem. 268, 4608; und G. T. Milne und D. T. Weaver (1993), Genes Devel. 7, 1755) oder von Domänen, die verantwortlich sind für eine Oligomerisierung eines einzelnen Proteins (Iwabuchi et al. (1993), Oncogen 8, 1963; Bogerd et al. (1993), J. Virol. 67, 5030). Variationen von Zwei-Hybrid-Systemen wurden verwendet zum Studium der In-vivo-Aktivität eines proteolytischen Enzyms (Dasmahapatra et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 89, 4159). Alternativ dazu kann ein E. coli und BCCP umfassendes interaktives Screening-System (Germino et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 90, 933; L. Guarente (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 90, 1639) verwendet werden, um miteinander wechselwirkende Protein-Sequenzen zu identifizieren (d. h. Protein-Sequenzen, die heterodimerisieren oder Heteromultimere höherer Ordnung bilden). Mit einem Zwei-Hybrid-System selektierte Sequenzen können gepoolt und geshuffelt und in ein Zwei-Hybrid-System für eine oder mehrere anschließende Runden des Screenings eingeführt werden, um Polypeptid-Sequenzen zu identifizieren, die sich an das Hybrid binden, das die vorbestimmte Bindungssequenz enthält. Die so identifizierten Sequenzen können verglichen werden und so Konsensus-Sequenzen und Konsensus-Sequenz-Kerne identifiziert werden.
  • Verbesserungen/Alternative Formate
  • Additive
  • In einem Aspekt schließt das verbesserte Shuffling-Verfahren den Zusatz wenigstens eines Additivs ein, das die Geschwindigkeit oder das Ausmaß des Zusammenfügen oder der Rekombination von Polynukleotiden mit verwandter Sequenz erhöht. Allgemein können Additive verwendet werden, die die Hybrid-Stabilität von nicht zueinander passenden Sequenzen erhöhen, um die Frequenz der Bildung wesentlich mutierter Glieder der Bibliothek zu erhöhen (d. h., die eine größere Mutationdichte aufweisen). Zusätzlich zu Additiven kann eine Modulation der Ionenstärke (z. B. der Konzentration an Na+- und/oder K+-Ionen) die relative Stabilität nicht zueinander passender Hybride modulieren, so daß eine erhöhte Salzkonzentration die Frequenz nicht zueinander passender Hybride erhöhen kann und zur Bildung von Gliedern der Bibliothek beitragen kann, die mehrere Mutationen aufweisen.
  • In einer Ausführungsform ist das Additiv Polyethylenglykol (PEG), das typischerweise einer Shuffling-Reaktion bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 25% zugesetzt wird, oft bis zu einer Endkonzentration von 2,5 bis 15% und bevorzugt bis zu einer Endkonzentration von etwa 10%. In einer Ausführungsform ist das Additiv Dextransulfat, das typischerweise einer Shuffling-Reaktion bis zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 25% zugesetzt wird, häufig bis zu etwa 10%. In einer Ausführungsform ist das Additiv ein Mittel, das die Sequenz-Spezifität des Wiederzusammenfügens verringert und die Misch-Hybridisierung und/oder Rekombination in vitro fördert. In einer alternativen Ausführungsform ist das Additiv ein Mittel, das die Sequenz-Spezifität des Wiederzusammenfügens erhöht und eine in hohem Maße getreue Hybridisierung und/oder Rekombination in vitro fördert. Andere langkettige Polymere, die die Reaktion nicht stören, können ebenfalls verwendet werden (z. B. Polyvinylpyrrolidon usw.).
  • In einem Aspekt schließt das verbesserte Shuffling-Verfahren den Zusatz wenigstens eines Additivs ein, das ein kationisches oberflächenaktives Mittel (Detergens) ist. Beispiele geeigneter kationischer Detergenzien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), Dodecyltrimethylammoniumbromid (DTAB) und Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) und dergleichen.
  • In einem Aspekt schließt das verbesserte Shuffling-Verfahren den Zusatz wenigstens eines Additivs ein, das ein rekombinogenes Protein ist, das ein homologes Paaren und/oder einen Strang-Austausch in vitro katalysiert oder nicht-katalytisch verstärkt. Beispiele geeigneter rekombinogener Proteine schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf E. coli-recA-Protein, T4-uvsX-Protein, das rec1-Protein von Ustilago maydis, andere Rekombinasen der recA-Familie von anderen Spezies, ein Einzelstrang-Bindungsprotein (single strand binding Protein; SSB), Ribonucleoprotein A1 und dergleichen. Nukleasen und Korrektur-Polymerasen (proofreading polymerases) werden oft eingeschlossen, um die Aufrechterhaltung der Integrität am 3'-Ende zu verbessern. Jedes dieser Protein-Additive kann selbst verbessert werden durch mehre re Runden der rekursiven Sequenz-Rekombination und Selektion und/oder Screening. Die Erfindung umfaßt solche verbesserten Additive und ihre Verwendung zur weiteren Verbesserung des Shufflings.
  • Rekombinase-Proteine
  • Rekominasen sind Proteine, die dann, wenn sie in ein exogenes Targeting-Polynucleotid eingeschlossen werden, zu einer meßbaren Erhöhung der Rekombination-Frequenz und/oder Lokalisation-Frequenz zwischen dem Target-Polynucleotid und einer endogenen vorbestimmten DNS-Sequenz führen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff ”Rekombinase” auf eine Familie von recA-ähnlichen Rekombination-Proteinen, die alle im wesentlichen alle oder die meisten derselben Funktionen aufweisen, insbesondere (i) das Vermögen des Rekombinase-Proteins, sich passend an seine homologen Targets zu binden und Polynukleotide in Position auf dem Target unterzubringen; und (ii) das Vermögen von Rekombinase-Protein-/Target-Polynukleotid-Komplexen, wirksam komplementäre endogene Sequenzen zu finden und sich an diese zu binden. Das am besten charakterisierte recA-Protein ist dasjenige von E. coli. Zusätzlich zu dem Protein des Wild-Typs wurde eine Zahl von recA-ähnlichen Mutanten-Proteinen identifiziert (z. B. recA803). Weiter haben viele Organismen recA-ähnliche Rekombinasen mit Strang-Übertragungs-Aktivitäten (z. B. Fugisawa et al. (1985), Nucl. Acids Res. 13, 7473; Hsieh et al., (1986), Cell 44, 885; Hsieh et al. (1989), J. Biol. Chem. 264, 5089; Fishel et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3683; Cassuto et al., (1987), Mol. Gen. Genet. 208, 10; Ganea et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7, 3124; Moore et al. (1990), J. Biol. Chem. 19, 11108; Keene et al. (1984), Nucl. Acids. Res. 12, 3057; Kimiec (1984), Cold Spring Harbor Symp. 48, 675; Kimeic (1986), Cell 44, 545; Kolodner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5560; Sugino et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3683; Halbrook et al. (1989), J. Biol. Chem. 264, 21403; Eisen et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7481; McCarthy et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5854; Lowenhaupt et al. (1989), J. Biol. Chem. 264, 20568). Beispiele derartiger Rekombinase-Proteine schließen beispielsweise ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: recA, recA803, uvsX und andere recA-Mutanten und recA-ähnliche Rekombinasen (I. Roca (1990), Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 25, 415), sep1 (Kolodner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 84, 5560; Tishkoff et al., Molec. Cell. Biol. 11, 2593), RuvC (Dunderdale et al. (1991), Nature 354, 506), DST2, KEM1, XRN1 (Dykstra et al. (1991), Molec. Cell. Biol. 11, 2583), STPa/DST1 (Clark et al. (1991) Molec. Cell. Biol. 11, 2576), HPP-1 (Moore et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 88, 9067), andere eukaryotische Rekombinasen (Bishop et al. (1992), Cell 69, 439; Shinohara et al. (1992), Cell 69, 457). recA kann von E. coli-Stämmen gereinigt werden, wie beispielsweise von E. coli-Stämmen JC12772 und JC153369 (erhältlich von A. J. Clark und M. Madiraju, University of California, Berkeley). Diese Stämme enthalten die recA-codierenden Sequenzen in einem ”runaway”-Replikations-Plasmidvektor, der in einer hohen Kopienzahl pro Zelle zugegen ist. Das recA803-Protein ist eine Mutante hoher Aktivität des recA-Wild-Typs. Die technische Literatur in diesem Bereich lehrt einige Beispiele von Rekombinase-Proteinen, beispielsweise von Drosophila-Zellen, Hefe-Zellen, Pflanzen-Zellen, menschlichen Zellen und nicht-menschlichen Säugerzellen, einschließlich Proteinen mit biologischen Eigenschaften, die ähnlich denen von recA sind (d. h. recA-ähnlichen Rekombinasen).
  • Das recA-Protein wird typischerweise erhalten von Bakterienstämmen, die das Protein überproduzieren; recA-Protein des Wild-Typs von E. coli und das mutante recA803-Protein können aus solchen Stämmen gereinigt werden. Alternativ kann das recA-Protein auch beispielsweise von der Firma Pharmacia (Piscataway, NJ) erworben werden.
  • Das recA-Protein bildet ein Nukleoprotein-Filament, wenn es eine einzelsträngige DNS überzieht. Bei diesem Nukleoprotein-Filament wird ein Monomer des recA-Proteins an etwa 3 Nukleotide gebunden. Diese Eigenschaft des recA, einzelsträngige DNS mit einem Überzug zu versehen, ist im wesentlichen sequenzunabhängig, obwohl bestimmte Sequenzen ein anfängliches Laden des recA auf ein Polynukleotid (z. B. Nukleierungssequenzen) bevorzugen. Das/die Nukleoprotein-Filament(e) kann/können auf im wesentlichen jedem beliebigen Polypeptid mit verwandter Sequenz, das geshuffelt werden soll, gebildet werden und kann auch in Zellen gebildet werden (z. B. in Bakterienzellen, Hefezellen oder Säugerzellen), die Komplexe sowohl mit einzelsträngiger als auch mit doppelsträngiger DNS bilden.
  • Eine für die Bindungsstellen spezifische Rekombination kann angewendet werden, um eine rekursive Sequenzrekombination zu erreichen. Typischerweise sind Sequenzen, die geshuffelt werden sollen, flankiert von einer oder mehreren bezüglich der Bindungsstellen spezifischen Rekombinations-Sequenzen wie beispielsweise durch eine FLP-Rekombinations-Target-Stelle (FRT), die häufig aus den zwei invertierten, 13 Basen umfassenden Wiederholungssequenzen und einem 8 Basenpaare umfassenden Spacer besteht (O'Gorman et al. (1991), Science 251, 1351; Parsons et al. (1990), J. Biol. Chem. 265, 4527; Amin et al. (1991), Mol. Cell. Biol. 11, 4497). Wenn FRT-Sequenzen verwendet werden, wird typischerweise auch die FLP-Rekombinase verwendet, entweder in vitro oder in einer Wirtszelle exprimiert, worin die Sequenzen, die rekombiniert werden sollen, eingeführt werden oder bereits zugegen sind. Alternativen zu dem FLP-FRT-System schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf das cre/lox-System des Phagen P1 (Hoess und Abremski (1985), J. Mol. Biol. 181, 351), die γ/δ-Resolvase (Steitz et al. (1990), Quaterly Rev. Biophys. 23, 205), das attB/attP-System von λ (Nunes-Duby et al. (1987), Cell 50, 779) und ähnliche, auf die Bindungsstelle spezifische Rekombinationssysteme von in Bakteriophagen λ, φ80, P22, P2, P4, P1 und andere ähnliche, auf die Bindungsstelle spezifische Rekombinationssysteme, die von einem Fachmann gewählt werden können. Leitlinien bezüglich der Integrase-Familie von Rekombinasen sind zu finden in ”Argos et al. (1986), EM-BO J. 5, 433”, dessen Offenbarung durch die In-Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung übernommen wird.
  • Exonuklease
  • In einem Aspekt schließt das verbesserte Shuffling-Verfahren den Zusatz wenigstens eines Additivs ein, das ein Enzym ist, das Exonuclease-Aktivität hat, das aktiv dahingehend ist, daß es nicht Templat-Nukleotide, die am 3'-Ende der Produkt-Polynukleotide in den Shuffling-Amplifikation-Reaktionen eingeführt wurden, die von einer Nicht-Korrektur-Polymerase katalysiert wurden, entfernt. Beispiele eines geeigneten Enzyms, das Exonuklease-Aktivität aufweist, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Pfu-Polymerase. Beispiele von Exonukleasen sind:
    Ba131
    Bacteriophage Lambda-Exonuclease
    E. coli-Exonuclease I
    E. coli-Exonuclease III
    E. coli-Exonuclease VII
    Bacteriophage-T7-Gene 6.
  • Wenigstens ein Zyklus der Amplifikation in einem Verfahren gemäß der Erfindung kann durchgeführt werden unter Verwendung einer Sammlung von überlappenden einsträngigen DNS-Fragmenten variierender Längen, die einer ersten Polynukleotid-Spezies oder einem Satz von Polynukleotid-Spezies mit verwandter Sequenz entsprechen, worin jedes überlappende Fragment jeweils zu einer zweiten Polynukleotid-Spezies hybridisieren kann und eine Polynukleotid-Ketten-Ausdehnung einer zweiten Polynukleotid-Spezies primen kann, die als Templat dient, wodurch Polynukleotide mit rekombinierter Sequenz gebildet werden, wobei die Polynukleotide mit rekombinierter Sequenz einen Teil von wenigsten einer ersten Polynukleotid-Spezies mit einem benachbarten Teil der zweiten Polynukleotid-Spezies umfassen, die als Templat dient. In einer Variation enthält die zweite Polynukleotid-Spezies, die als Templat dient, Uracil (d. h. ist ein Templat des Kunkel-Typs) und ist im wesentlichen in Zellen nicht replizierbar. Dieser Aspekt der Erfindung kann auch wenigstens zwei rekursive Zyklen dieser Variation umfassen. In einer Ausführungsform werden rekursive Zyklen des Shufflings unter Verwendung der Verfahrensweise von Levitchkin et al. (1995), Mol. Biol. 29, 572, das zu PCR-Fragmenten mit partieller Extension führt, dazu verwendet, Chimären von einem Pool von parentalen Sequenzen zu bilden, die rekursiv geshuffelt wurden.
  • Wie vorstehend angegeben, kann ein Shuffling-Verfahren die Modifikation umfassen, in der wenigstens ein Amplifikationszyklus mit einem Zusatz oder einer Polymerase in geeigneten Bedingungen durchgeführt wird, die ein Templat-Switching fördern. In einer Ausführungsform, in der Taq-Polymerase zur Amplifikation verwendet wird, verstärkt der Zusatz von recA oder anderen Polymerasen das Templat-Switching. Das Templat-Switching kann auch verstärkt werden durch Erhöhen der DNS-Templat-Konzentration, neben anderen Mitteln, die Fachleuten in diesem technischen Bereich bekannt sind.
  • In einer Ausführungsform des Sequenz-Shufflings werden Bibliotheken von Polynukleotiden mit rekombinierter Sequenz aus Polynukleotiden mit verwandter Sequenz gebildet, die natürlich vorkommende Gene oder Allele eines Gens sind. In diesem Aspekt werden wenigstens drei natürlich vorkommende Gene und/oder Allele, die Bereiche von wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfassen, die wenigstens 70% Sequenz-Identität aufweisen, vorzugsweise wenigstens 90% Sequenz-Identität aufweisen, aus einem Pool von Gen-Sequenzen gewählt, beispielsweise durch Hybrid-Selektion oder über eine computerisierte Sequenz-Analyse unter Verwendung von Sequenzdaten aus einer Datenbank. Die ausgewählten Sequenzen werden erhalten als Polynukleotide, entweder durch Klonen oder über DNS-Synthese, und werden nach einer der verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung geshuffelt.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren den weiteren Schritt des Entfernen nicht-geshuffelter Produkte (z. B. parentaler Sequenzen) von den Polynukleotiden mit rekombinierter Sequenz, die nach einem der offenbarten Shuffling-Verfahren hergestellt wurden. Nicht-geshuffelte Produkte können entfernt oder vermieden werden durch Durchführen eines Amplifikation-Schrittes mit (1) einem ersten PCR-Primer, der zu einer ersten parentalen Polynukleotid-Spezies hybridisiert, jedoch im wesentlichen nicht zu einer zweiten parentalen Polynukleotid-Spezies hybridisiert; und (2) einem zweiten PCR-Primer, der zu einer zweiten parentalen Polynukleotid-Spezies hybridisiert, jedoch nicht wesentlich zu der ersten parentalen Polynukleotid-Spezies hybridisiert, so daß eine Amplifikation nur von Templaten eintritt, die den Teil der ersten parentalen Sequenz umfassen, die zu dem ersten PCR-Primer hybridisiert und auch den Teil der zweiten parentalen Sequenz umfassen, die zu dem zweiten PCR-Primer hybridisiert, wodurch nur Polynukleotide mit rekombinierter Sequenz amplifiziert werden.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung können ”verbrückende” Gene synthetisiert werden. Wenn zwei oder mehr parentale Polynukleotide (z. B. Gene) nicht in ausreichender Weise Sequenzähnlichkeit für eine effiziente homologe Rekombination oder für ein effizientes Cross-Priming für die PCR-Amplifikation zeigen, können Zwischen-Gene (oder ”verbrückende” Gene) synthetisiert werden, die gemeinsam eine ausreichende Sequenzidentität mit den parentalen Sequenzen zeigen. Das verbrückende Gen braucht nicht aktiv zu sein oder einen Phänotyp oder eine selektierbare Eigenschaft zu verleihen; es muß nur ein Templat liefern, das eine ausreichende Sequenzidentität hat, um ein Shuffling der parentalen Sequenzen zu bewirken. Die Zwischen-Homologie des Brücken-Gens und die erforderliche(n) Sequenz(en) kann/können per Computer oder manuell bestimmt werden.
  • Wie sich aus der obigen Offenbarung ergibt, hat die vorliegende Erfindung eine große Vielzahl von Anwendungen. Die folgenden Beispiele werden aus Gründen der Veranschaulichung des Sequenz-Shufflings angegeben. Beispiel 18 veranschaulicht das DNS-Shuffling unter Anwendung des Stutterings in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung. Die anderen Beispiele dienen nur Zwecken der Veranschaulichung.
  • Experimentelle Beispiele
  • In den folgenden Beispielen haben die nachfolgend genannten Abkürzungen die folgenden Bedeutungen. Wenn sie nicht nachfolgend definiert sind, haben die Abkürzungen die Bedeutungen, die sie auch im Stand der Technik haben.
    • ml
    = Milliliter
    μl
    = Mikroliter
    μM
    = mikromolar
    nM
    = nanomolar
    PBS
    = phosphate buffered saline; mit Phospat gepufferte Salzlösung
    ng
    = Nanogramm
    μg
    = Mikrogramm
    IPTG
    = Isopropylthio-β-D-galactosid
    bp
    = Basenpaare
    kb
    = Kilobasenpaare
    dNTP
    = Deoxynukleosidtriphosphate
    PCR
    = Polymerase-Kettenreaktion
    X-gal
    = 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactoside
    DNaseI
    = Desoxyribonuklease
    PBS
    = phosphate buffered saline, mit Phospat gepufferte Salzlösung
    CDR
    = Komplementarität bestimmende Bereiche
    MIC
    = Minimale Inhibitor-Konzentration
    scFv
    = Einzelketten-Fv-Fragment eines Antikörpers.
  • Allgemein werden Standard-Verfahren der Rekombinations-DNS-Technologie in verschiedenen Publikationen beschrieben, beispielsweise ”Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory”; „Ausubel et al. 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Bände 1 und 2 und Zusatzbände”; und ”Berger und Kimmel, Methods in Enzymology, Band 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA”. Restriktionsenzyme und Polynukleotide modifizierende Enzyme wurden gemäß den Empfehlungen der Hersteller verwendet. Oligonukleotide wurden auf einer DNS-Synthese-Vorrichtung der Firma Applied Biosystems, Inc. (Bezeichnung: Modell 394) unter Verwendung von ABI-Chemikalien verwendet. Sofern erwünscht, wurden PCR-Amplimere für Amplifikationen einer vorbestimmten DNS-Sequenz gewählt nach Belieben des Praktikers.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Zusammenbau des LacZ-Alpha-Gens
  • (1) Substrat-Vorbereitung
  • Das Substrat für die Zusammenbau-Reaktion war das Produkt der dsDNS-Polymerase-Kettenreaktion (”PCR”) des Wild-Typs von LacZ. Tabelle 1 Mutationen, die durch Mutagen-Shuffling eingeführt wurden
    Übergänge Häufigkeit Übertragungen Häufigkeit
    G-A 6 A-T 1
    A-G 4 A-C 2
    C-T 7 C-A 1
    T-C 3 C-G 0
    G-C 3
    G-T 2
    T-A 1
    T-G 2
  • Eine Gesamtmenge von 4.437 Basen der geshuffelten LacZ-DNS wurde sequenziert.
  • Die Rate der Punkt-Mutagenese während des Zusammenbaus der DNS aus Stücken mit einer Größe von 10 bis 70 bp wurde nach DNS-Sequenzierung bestimmt und betrug 0,7% (N = 4.473). Dieser Wert ist ähnlich dem der fehlerbehafteten PCR. Ohne beschränkend an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die Rate der Punktmutagenese niedriger sein kann, wenn größere Fragmente für den Zusammenbau verwendet werden oder wenn eine Korrektur-Polymerase zugesetzt wird.
  • Wenn Plasmid-DNS aus 14 dieser Punkt-mutierten LacZ–-Kolonien kombiniert und diese erneut zusammengebaut/durch das Verfahren, wie es oben beschrieben wurde, geshuffelt wurden, waren 34% (N = 291) der resultierenden Kolonien LacZ+, und diese Kolonien entstanden vermutlich durch Rekombination der DNS aus den verschiedenen Kolonien.
  • Die erwartete Rate der Reversion einer Einzel-Punkt-Mutation durch fehlerbehaftete PCR unter der Annahme, daß die Mutagenese-Rate 0,7% beträgt (10), wäre den Erwartungen entsprechend kleiner 1%.
  • Somit können große DNS-Sequenzen aus einer statistischen Mischung kleiner Fragmente durch eine Reaktion wieder zusammengebaut werden, die überraschend effizient und einfach ist. Eine Anwendung dieser Verfahrensweise ist die Rekombination oder das Shuffling von verwandten Sequenzen auf der Basis der Homologie.
  • Beispiel 2
  • Shuffling des LacZ-Gens und der gesamten Plasmid-DNS
  • (1) Shuffling des LacZ-Gens
  • Ein Cross-Over zwischen zwei Markern, die durch 75 Basen getrennt waren, wurde gemessen unter Verwendung von zwei LacZ-Gen-Konstrukten. Stop-Codons wurden in zwei separaten Bereichen des LacZ-Alpha-Gens eingesetzt, damit diese als negative Marker dienten. Jeder Marker war eine 25 bp lange, nicht-homologe Sequenz mit vier Stop-Codons, von denen zwei in dem LacZ-Gen-Leserahmen lagen. Die 25 bp große, nicht-homologe Sequenz ist in 3 durch eine große Box angegeben. Die Stop-Codons sind entweder in einer Box angegeben oder unterstrichen. Eine 1:1-Mischung der zwei 1,0 kb großen LacZ-Template, die die ”+–”- und die ”–+”-Version des LacZ/-Alpha-Gens enthielten (3), wurde mit DNaseI verdaut, und 100 bis 200 bp große Fragmente wurden gereinigt, wie dies in 1 beschrieben ist. Das Shuffling-Programm wurde unter Bedingungen durchgeführt, die ähnlich denen waren, wie sie für den Zusammenbau in Beispiel 1 beschrieben sind, mit der Ausnahme, daß 0,5 μm Polymerase zugesetzt wurden und das Gesamtvolumen 100 μl war.
  • Nach dem Klonen war die Zahl der erhaltenen blauen Kolonien 24% (N = 386), dieser Wert ist nahe dem theoretischen Maximalwert für blaue Kolonien (d. h. 25%), was anzeigt, daß die Rekombination zwischen den beiden Markern vollständig war. Alle 10 blauen Kolonien enthielten das erwartete HindIII-NheI-Restriktionsfragment.
  • (2) Shuffling der gesamten Plasmid-DNS
  • Vollständige Plasmide mit einer Größe von 2,7 kb (pUC18–+ und pUC18+–) wurden ebenfalls getestet. Eine 1:1-Mischung der beiden 2,9 kb großen Plasmide, die die ”+–”- und die ”–+”-Version des LacZ-Alpha-Gens enthielten (3), wurde mit DNaseI verdaut, und 100 bis 200 bp große Fragmente wurden gereinigt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Das Shuffling-Programm wurde unter Bedingungen durchgeführt, die ähnlich denen waren, wie sie für den Zusammenbau in dem obigen Schritt (1) beschrieben wurden, mit der Ausnahme, daß das Programm über 60 Zyklen lief (94°C für 30 s; 55°C für 30 s; 72°C für 30 s). Eine Gel-Analyse zeigte, daß nach dem Shuffling-Programm die überwiegende Menge des Produkts größer war als 20 kb. Damit wurden vollständige, 2,7 kb große Plasmide (pUC18–+ und pUC18+–) effizient zusammengebaut aus statistischen 100 bis 200 bp großen Fragmenten, ohne daß Primer zugesetzt worden waren.
  • Nach der Verdauung mit einem Restriktionsenzym, das eine spezielle Bindungsstelle auf dem Plasmid hatte (Eco0109) bestand die überwiegende Menge des Produkts aus einer einzigen Bande der erwarteten Größe. Diese Bande wurde auf einem Gel gereinigt, erneut gebunden, und die DNS wurde zur Transformation von E. coli verwendet. Die Transformanten wurden auf 0,004% X-gal-Platten aufgegeben, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. 11% (N = 328) der resultierenden Plasmide waren blau und waren damit ”++”-Rekominanten.
  • (3) Shuffling von spiked DNS
  • Oligonukleotide, die in die Shuffling-Mischung eingemischt wurden, konnten das Endprodukt eingearbeitet werden, das auf der Homologie der flankiertenden Sequenzen des Oligonukleotids zu der Templat-DNS beruhte (4). Die LacZ–-Stop-Codon-Mutante (pUC18–+), die oben beschrieben wurde, wurde als mit DNaseI verdautes Templat verwendet. Ein 66-mer-Oligonukleotid, das 18 Basen mit Homologie zu dem LacZ-Gen des Wild-Typs an beiden Enden einschloß, wurde in die Reaktionsmischung in einem 4-fachen molaren Übeschuß gegeben, um Stop-Codon-Mutationen zu korrigieren, die in dem ursprünglichen Gen zugegen waren. Die Shuffling-Reaktion wurde unter Bedingungen durchgeführt, die ähnlich denen im obigen Schritt 2 waren. Das resultierende Produkt wurde verdaut, verbunden und in E. coli insertiert, wie dies oben beschrieben wurde. Tabelle 2
    % blaue Kolonien
    Kontrolle 0,0 (N > 1000)
    Spike des obersten Stranges 8,0 (N = 855)
    Spike des untersten Stranges 9,3 (N = 620)
    Spike des obersten und untersten Stranges 2,1 (N = 537)
  • Es schien, daß ssDNS effizienter war als dsDNS, vermutlich aufgrund einer kompetitiven Hybridisierung. Der Grad von Einarbeitung kann über einen weiten Bereich variiert werden, indem man den molaren Überschuß, die Temperatur des Zusammenfügens oder die Länge des homologen Abschnitts entsprechend einstellt.
  • Beispiel 3
  • DNS-Zusammenbau in vollständiger Abwesenheit von Primern
  • Das Plasmid puC18 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI, Eco0109, XmnI und AlwNI verdaut, was zu Fragmenten einer Größe von 370, 460, 770 und 1080 bp führte. Diese Fragmente wurden elektrophoretisch behandelt und separat davon auf einem 2%-igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt (die Banden mit 370 und 460 Basenpaaren konnten nicht getrennt werden), was zu einem großen Fragment, einem mittleren Fragment und einer Mischung aus zwei kleinen Fragmenten in drei getrennten Röhrchen führte.
  • Jedes Fragment wurde mit DNaseI verdaut, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, und die Fragmente mit 50 bis 130 bp wurden auf einem 2%-igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt für jedes der ursprünglichen Fragmente gereinigt.
  • Ein PCR-Mix (wie er oben in Beispiel 1 beschrieben ist) wurde den gereinigten verdauten Fragmenten bis zu einer Endkonzentration von 10 ng/μl der Fragmente zugesetzt. Keine Primer wurden zugesetzt. Die Zusammenbau-Reaktion wurde über 75 Zyklen [94°C für 30 s, 60°C für 30 s] separat an jeder der drei verdauten DNS-Fragment-Mischungen durchgeführt, und die Produkte wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert.
  • Die Ergebnisse zeigten klar, daß die Banden mit 1080, 770 bp und die Banden mit 370 und 460 bp effizient von den gereinigten Fragmenten gebildet wurden, was zeigt, daß der Schritt des Shufflings die Verwendung irgendwelcher Primer überhaupt nicht benötigt.
  • Beispiel 4
  • Shuffling des IL-1β-Gens
  • Dieses Beispiel veranschaulicht, daß Cross-Overs, basierend auf Homologien von weniger als 15 Basen erhalten werden können. Als Beispiel wurde ein Human- und ein Mause-IL-1β-Gen dem Shuffling-Verfahren unterzogen.
  • Ein Mause-IL-1β-Gen (BBG49) und ein Human-IL-1β-Gen unter Verwendung eines E. coli-Codons (BBG2; R&D-Systems, Inc., Minneapolis, MN) wurden als Template in der Shuffling-Reaktion verwendet. Die Bereiche von vollständiger Homologie zwischen den Human-IL-1β-Sequenzen und den Mause-IL-1β-Sequenzen sind im Durchschnitt nur 4,1 Basen lang (5, die Regionen mit Heterologie sind in Boxen eingerahmt).
  • Die Herstellung von dsDNS-PCR-Produkten für jedes der Gene, die Entfernung von Primern, die Verdauung mit DNaseI und die Reinigung der 10 bis 50 bp großen Fragmente war ähnlich derjenigen, wie sie oben in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die Sequenzen der verwendeten Primer in der PCR-Reaktion waren 5'TTAGGCACCCCAGGCTTT3' (SEQ ID NO: 3) und 5'ATGTGCTGCAAGGCGATT3' (SEQ ID NO: 4).
  • Die ersten 15 Zyklen der Shuffling-Reaktion wurden mit dem Klenow-Fragment von DNA-PolymeraseI durchgeführt, indem man 1 Einheit frisches Enzym in jedem Zyklus zusetzte. Die DNS wurde dem PCR-Mix von Beispiel 1 zugesetzt, und die Mischung enthielt keine Polymerase. Das manuell durchgeführte Programm war 94°C für 1 min und anschließend 15 Zyklen aus [95°C für 1 min; 10 s auf Trockeneis- Ethanol (bis gefroren), Inkubieren etwa 20 s bei 25°C; Zusatz von 1U Klenow-Fragment und Inkubieren bei 25°C für 2 min]. In jedem Zyklus nach dem Denaturierungsschritt wurde das Rohr schnell in Trockeneis-Ethanol abgekühlt und erneut auf die Temperatur des Verbindens aufgeheizt. Anschließend wurde die hitzelabile Polymerase zugesetzt. Das Enzym mußte in jedem Zyklus zugesetzt werden. Bei Verwendung dieses Ansatzes wurde ein hoher Grad an Cross-Overs erhalten, bezogen auf nur wenige Basen des ununterbrochenen homologen Abschnitts (5; Positionen von Cross-Overs sind durch ”_⌈” angegeben).
  • Nach diesen 15 manuellen Zyklen wurde Taq-Polymerase zugesetzt, und es wurden 22 zusätzliche Zyklen der Shuffling-Reaktion [94°C für 30 s; 35°C für 30 s] ohne Primer durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde dann 20-fach verdünnt. Die folgenden Primer wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,8 μM zugesetzt: 5'AACGCCGCATGCAAGCTTGGATCCTTATT3' (SEQ ID NO: 5) und 5'AAAGCCCTCTAGATGATTACGAATTCATAT3' (SEQ ID NO: 6), und eine PCR-Reaktion wurde durchgeführt, wie dies oben in Beispiel 1 beschrieben ist. Das zweite Primer-Paar unterschied sich von dem ersten Paar nur aufgrund der Tatsache, daß eine Änderung der Restriktionsstellen für erforderlich gehalten wurde.
  • Nach Verdauen des PCR-Produkts mit XbaI und SphI wurden die Fragmente in pUC18 vereinigt, das mit XbaI und SphI verdaut war. Die Sequenzen der Einschübe aus einigen Kolonien wurden bestimmt durch ein Dideoxy-DNS-Sequenzierungskit (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) in Übereinstimmung mit den Instruktionen des Herstellers.
  • Es wurde eine Gesamtzahl von 17 Cross-Overs durch DNS-Sequenzierung von neun Kolonien gefunden. Einige der Cross-Over basierten auf nur 1 bis 2 Basen mit nicht-unterbrochener Homologie.
  • Es wurde gefunden, daß bei dem Ziel, effiziente Cross-Over auf der Grundlage von kurzen Homologien zu forcieren, eine sehr niedrige wirksame Zusammenfügungstemperatur erforderlich war. Bei irgendeiner hitzestabilen Polymerase verursacht die Abkühlzeit der PCR-Vorrichtung (94°C auf 25°C mit 1 bis 2 Grad/Sekunde), daß die effektive Zusammenfügungstemperatur höher ist als die festgesetzte Zusammenfügungstemperatur. So ergab keines der Protokolle, die auf Taq-Polymerase basierten, Cross-Over, selbst wenn ein zehnfacher Überschuß eines der IL-1β-Gene verwendet wurde. Im Gegensatz dazu kann eine hitzelabile Polymerase, wie beispielsweise das Klenow-Fragment von DNA-PolymeraseI, verwendet werden, um akkurat eine niedrige Zusammenfügungstemperatur zu erhalten.
  • Beispiel 5
  • DNS-Shuffling des TEM-1-Betalactamase-Gens
  • Die Brauchbarkeit des mutagenen DNS-Shufflings für eine gerichtete molekulare Evolution wurde in einem Betalactamase-Modellsystem getestet. TEM-1-Betalactamase ist ein sehr effizientes Enzym, das sich hinsichtlich seiner Reaktionsrate vornehmlich durch die Diffusion beschränkt ist. Dieses Beispiel bestimmt, ob es möglich ist, die Reaktionsspezifität des Enzyms zu ändern und die Beständigkeit gegenüber der Droge Cefotaxim zu erhalten, die es normalerweise nicht hydrolysiert.
  • Die minimale Inhibitor-Konzentration (MIC) von Cefotaxim bei Bakterienzellen, die kein Plasmid haben, wurde bestimmt durch Plattieren von 10 μl einer 10–2-Verdünnung einer Übernacht-Bakterienkultur (etwa 1000 cfu) von E. coli-XL1-Blauzellen (Stratagene, San Diego, CA) auf Platten mit variierenden Konzentrationen von Cefotaxim (Sigma, St. Louis, MO), mit anschließender Inkubation für 24 Stunden bei 37°C.
  • Das Wachstum auf Cefoxatim ist empfindlich für die Dichte der Zellen, und daher müssen ähnliche Zahlen von Zellen auf jeder Platte aufgetragen werden (erhalten durch Plattieren auf blanken LB-Platten). Es wurden Schritte des Plattieren von 1000 Zellen konsistent durchgeführt.
  • (1) Anfängliche Plasmid-Konstruktion
  • Ein pUC18-Derivat, das das bakterielle TEM-1-Betalactamase-Gen trug, wurde verwendet (28). Das TEM-1-Betalactamase-Gen verleiht den Bakterien Resistenz gegen etwa 0,02 μg/μl Cefotaxim. Sfi1-Restriktionsstellen wurden am 5'-Ende des Promoters und am 3'-Ende des Endes des Gens durch PCR der Vektor-Sequenz mit den beiden Primern zugesetzt: Primer A (SEQ ID NO: 7):
    Figure 01070001
    Primer B (SEQ ID NO: 8):
    Figure 01070002
    und durch PCR der Betalactamase-Gen-Sequenz mit zwei weiteren Primern: Primer C (SEQ ID NO: 9):
    Figure 01070003
    Primer D (SEQ ID NO: 10):
    Figure 01070004
  • Die beiden Reaktionsprodukte wurden mit SfiI verdaut, gemischt, zusammengegeben und zum Transformieren von Bakterien verwendet. Das resultierende Plasmid war pUC182Sfi. Dieses Plasmid enthält ein Sfi1-Fragment, das das TEM-1-Gen und den p-3-Promoter trägt.
  • Die minimale Inhibitor-Konzentration von Cefotaxim für E. coli XL1-Blau (Stratagene, San Diego, CA), der dieses Plasmid trug, war 0,02 μg/ml nach 24 Stunden bei 37°C.
  • Das Vermögen zur Verbesserung der Resistenz des Betalactamase-Gens gegenüber Cefotaxim ohne Shuffling wurde bestimmt durch schrittweises Plattieren eines verdünnten Pools aus Zellen (etwa 10 cfu) auf 2-fach steigenden Drogen-Konzentrationen. Ohne Shuffling konnte eine Resistenz bis hinaus zu 1,28 μg/μl erhalten werden. Dies stellte einen 64-fachen Anstieg der Resistenz dar.
  • (2) DNaseI-Verdauung
  • Das Substrat für die erste Shuffling-Reaktion war dsDNA mit 0,9 kb, das erhalten worden war durch PCR von pUC182Sfi mit den Primern C und D, von denen beide eine SfiI-Stelle enthalten.
  • Die freien Primer von dem PCR-Produkt wurden durch Wizard-PCR-Prep (Promega, Madison, WI) in jedem Zyklus entfernt.
  • Etwa 5 μg der DNS-Substrate wurden mit 0,15 Einheiten DNaseI (Sigma, St. Louis, MO) in 100 μl 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM MgCl2 für 10 min bei Raumtemperatur verdaut. Fragmente mit 100 bis 300 bp wurden von 2% Agarose-Gels mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese auf DE81-Ionenaustauschpapier (Whatman, Hillsborough, OR) gereinigt, und es erfolgte eine Elution mit 1 M NaCl und Ethanol-Präzipitation durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren.
  • (3) Gen-Shuffling
  • Die gereinigten Fragmente wurden in einem PCR-Mix (0,2 mM) von jedem dNTP; 2,2 mM MgCl2; 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl; pH 9,0; 0,1% Triton X-100 in einer Konzentration von 10 bis 30 ng/μl resuspendiert. Keine Primer wurden an dieser Stelle zugesetzt. Ein Zusammenbau-Programm von 94°C für 60 s, anschließend 40 Zyklen aus [94°C für 30 s, 50 bis 55°C für 30 s, 72°C für 30 s] und anschließend 72°C für 5 min wurde in einem Thermozyklus-Apparat der Firma MJ Research (Watertown, MA) mit der Serien-Bezeichnung PTC-150 durchgeführt.
  • (4) Amplifikation des Produkts der Zusammenbau-Reaktion mit Primern
  • Nach Verdünnung des Produkts der Zusammenbau-Reaktion in dem PCR-Mix mit 0,8 μM jedes Primers (C und D) und 20 PCR-Zyklen [94°C für 30 s; 50°C für 30 s; 72°C für 30 s] wurde ein einziges Produkt mit einer Größe von 900 bp erhalten.
  • (5) Cloning und Analyse
  • Nach Verdauen des 900 bp großen Produkts mit dem terminalen Restriktionsenzym SfiI und Reinigung auf Agarosegel wurde das 900 bp umfassende Produkt in den Vektor pUC182Sfi an der einzigen SfiI-Stelle mit T4-DNS-Ligase (BRL, Gaithersburg, MD) eingebaut. Die Mischung wurde durch Elektroporation in E. coli-XL1-Blauzellen behandelt und auf LB-Platten mit 0,32 bis 0,64 μg/ml Cefotaxim (Sigma, St. Louis, MO) aufgetragen. Man ließ die Zellen bis zu 24 h bei 37°C wachsen, und die resultierenden Kolonien wurden von der Platte als Pool abgekratzt und als PCR-Templat für die nächste Runde des Shuffling verwendet.
  • (6) Nachfolgende Zusammenbau-Runden
  • Die nach jeder von drei Runden des Shufflings erhaltenen Transformanten wurden auf Platten mit steigenden Konzentrationen von Cefotaxim aufgetragen. Die Kolonien (< 100, um Vielfalt zu erhalten) von der Platte mit der höchsten Konzentration an Cefotaxim wurden gepoolt und als Templat für die PCR-Reaktion für die nächste Runde verwendet.
  • Eine Mischung der Cefotaximr-Kolonien, die bei 0,32 bis 0,64 μg/ml im obigen Schritt (5) erhalten worden waren, wurden als Templat für die nächste Runde des Shufflings verwendet. 10 μl Zellen in LB-Brühe wurden als Templat in einem Zusammenbau-Programm von 10 min bei 99°C, anschließend 35 Zyklen von [94°C für 30 s; 52°C für 30 s; 72°C für 30 s] und anschließend 5 min bei 72°C verwendet, wie dies oben beschrieben wurde.
  • Die aus dem Zusammenbau erhaltenen Produkte wurden verdaut und in pUC182Sfi eingebunden, wie dies oben in Schritt (5) beschrieben worden war. Die Mischung wurde durch Elektroporation in E. coli/XL1-Blau-Zellen behandelt und auf LB-Platten mit einer Konzentration von 5 bis 10 μg/ml Cefotaxim aufgetragen.
  • Kolonien, die bei 5 bis 10 μg/ml erhalten wurden, wurden für die dritte Runde verwendet, die ähnlich der ersten und zweiten Runde war, mit der Ausnahme, daß die Zellen auf LB-Platten mit einer Konzentration von 80 bis 160 μg/ml Cefotaxim aufgetragen wurden. Nach der dritten Runde wurden Kolonien bei 80 bis 160 μg/ml erhalten, und nach erneutem Auftragen auf Platten mit steigenden Konzentrationen an Cefotaxim konnten Kolonien mit bis zu 320 μg/ml nach 24 h bei 37°C erhalten werden (MIC = 320 μg/ml).
  • Das Wachstum auf Cefotaxim ist abhängig von der Zelldichte, was erfordert, daß alle MICs standardisiert werden (im vorliegenden Fall etwa 1.000 Zellen pro Platte). Bei höheren Zelldichten wurde ein Wachstum bei bis zu 1.280 μg/ml erhalten. Die fünf größten Kolonien, die bei 1280 μg/ml wuchsen, wurden für Einzel-Kolonien zweimal auf Platten aufgetragen, und die SfiI-Einschübe wurden durch Restriktionsmapping der Kolonie PCR-Produkte analysiert.
  • Es wurde eine Mutante mit einer um das 16.000-fache erhöhten Resistenz gegenüber Cefotaxim erhalten (MIC = 0,02 μg/ml bis MIC = 320 μg/ml).
  • Nach Selektion wurde das Plasmid selektierter Klone zurück in E. coli XL1-Blau-Zellen des Wild-Typs (Stratagene, San Diego, CA) transferiert, um sicherzustellen, daß keine der gemessenen Werte der Beständigkeit gegenüber der Droge auf chromosomale Mutationen zurückzuführen war.
  • Drei Zyklen des Shufflings und der Selektion ergaben einen 1,6 × 104-fachen Anstieg der minimalen Inhibitor-Konzentration des Breitband-Antibiotikums Cefotaxim für die TEM-1-Betalactamase. Im Gegensatz dazu führte ein wiederholtes Auftragen auf Platten ohne Shuffling nur zu einem 16-fachen Anstieg der Resistenz (fehlerbehaftete PCR oder Kassetten-Mutagenese).
  • (7) Sequenz-Analyse
  • Alle 5 der größten Kolonien, die bei 1.280 μg/ml gewachsen waren, hatten eine Restriktionskarte, die identisch der des Enzyms TEM-1 des Wild-Typs ist. Der SfiI-Insert des Plasmids, das von einer dieser Kolonien erhalten worden war, wurde sequenziert durch Dideoxy-DNS-Sequenzierung (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) entsprechend den Instruktionen des Herstellers. Alle Basenzahlen entsprechen der revidierten pBR322-Sequenz (29), und die Aminosäure-Zahlen entsprechen dem ABL-Standard-Numerierungsschema (30). Die Aminosäuren sind mit ihren Drei-Buchstaben-Codes angegeben, und die Nukleotide sind in ihren Ein-Buchstaben-Codes angegeben. Der Ausdruck ”G4205A” bedeutet, daß das Nukleotid 4205 von Guanidin nach Adenin geändert war.
  • Neun Einzelbasen-Substitutionen wurden gefunden. G4205A ist zwischen den Stellen –35 und –10 des Betalactamase-P3-Promoters (31) angeordnet. Die Promoter-Up-Mutante, die von Chen und Clowes (31) beobachtet worden war, ist außerhalb des Sfi1-Fragments angeordnet, das hier verwendet wurde, und sie konnte daher nicht entdeckt werden. Vier Mutationen waren still (A3689G, G3713A, G3934A und T3959A), und vier führten zu einer Aminosäure-Änderung (C3448T führte zu Gly238Ser; A3615G führte zu Met182Thr; C3850T führte zu Glu104Lys und G4107A führte zu Ala18Val).
  • (8) Molekül-Rückkreuzung
  • Molekulares Rückkreuzen mit einem Überschuß der DNS des Wild-Typs wurde anschließend angewendet, um nicht-essentielle Mutationen zu eliminieren.
  • Das Molekül-Rückkreuzen wurde durchgeführt an einem selektierten Plasmid der dritten Runde des DNS-Shufflings durch das Verfahren, das identisch mit dem normalen Shuffling ist, wie es oben beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß die DNaseI-Verdauung und die Shuffling-Reaktion durchgeführt wurden in Gegenwart eines 40-fachen Überschusses des TEM-1-Genfragments des Wild-Typs. Um den Schritt des Rückkreuzen effizienter zu machen, wurden sehr kleine DNS-Fragmente (30 bis 100 bp) in der Shuffling-Reaktion verwendet. Die rückgekreuzten Mutanten wurden erneut selektiert, und zwar auf LB-Platten mit einer Konzentration von 80 bis 160 μg/ml Cefotaxim (Sigma, St. Louis, MO).
  • Dieses Rückkreuz-Shuffling wurde mit DNS von Kolonien aus der ersten Rückkreuz-Runde in Gegenwart eines 40-fachen Überschusses der TEM-1-DNS des Wild-Typs wiederholt. Kleine DNS-Fragmente (30 bis 100 bp) wurden verwendet, um die Effizienz des Rückkreuzen zu erhöhen. Die zweite Runde der rückgekreuzten Mutanten wurde erneut selektiert, und zwar auf LB-Platten mit einer Konzentration von 80 bis 160 μg/ml Cefotaxim.
  • Die resultierenden Transformanten wurden auf Platten mit einer Konzentration von 160 μg/ml Cefotaxim aufgetragen, und ein Pool von Kolonien wurde erneut auf Platten mit steigenden Konzentrationen von Cefotaxim bis zu 1.280 μg/ml aufgetragen. Die größte Kolonie, die bei 1.280 μg/ml erhalten worden war, wurde auf Platten aufgetragen, um einzelne Kolonien zu gewinnen.
  • Diese rückgekreuzte Mutante war um das 32.000-fache resistenter als der Wild-Typ (MIC = 640 μg/ml). Der Mutanten-Stamm ist um das 64-fache resistenter gegenüber Cefotaxim als in klinischen Versuchen oder über genetic engineering gewonnene, von TEM-1 abgeleitete Stämme, über die bisher berichtet wurde. So scheint es, daß das DNS-Shuffling ein schnelles und leistungsstarkes Mittel für wenigstens einige Zyklen der gerichteten molekularen Evolution ist.
  • Die DNS-Sequenz des SfiI-Inserts der rückgekreuzten Mutante wurde bestimmt unter Verwendung eines Dideoxy-DNS-Sequenzierungskits (United States Biochemical Co., Cleveland, OH), und zwar gemäß den Instruktionen des Herstellers (Tabelle 3). Die Mutanten hatten 9 einzelne Mutationen von Basenpaaren. Wie erwartet, gingen alle vier der oben identifizierten stillen Mutationen verlore, wobei die Sequenz zur Sequenz des Gens des Wild-Typs zurückkehrte. Die Promoter-Mutation (G4205A)' sowie drei der vier Aminosäure-Mutationen (Glu104Lys; Met182Thr und Gly238Ser) blieben in dem rückgekreuzten Klon, was nahelegt, daß sie essentiell für eine Cefotaxim-Resistenz auf hohem Niveau sind. Jedoch wurden zwei neue stille Mutationen (3842C und A3767G) sowie drei neue Mutationen gefunden, die zu Änderungen der Aminosäuren führten (C3441T führte zu Arg241His; C3886T führte zu Gly92Ser; und G4035C führte zu Ala42Gly). Während diese beiden stillen Mutationen die Protein-Primärsequenz nicht beeinflussen, können sie das Protein-Expressionsniveau (beispielsweise über die mRNS-Struktur) und möglicherweise sogar die Proteinfaltung (durch Änderung des Codon-Gebrauchs und daher der Pausen-Stelle, was bei der Protein-Faltung impliziert sein kann) beeinflussen. Tabelle 3 Mutationen in Betalactamase
    Mutation-Typ Nicht-rückgekreuzt Rückgekreuzt
    Aminosäure-Änderung Ala18Lys -
    Glu104Lys Glu104Lys
    Met182Thr Met182Thr
    Gly238Ser Gly238Ser
    - Ala42Gly
    - Gly92Ser
    stumm T395A -
    G393A -
    G3713A -
    A3689G -
    - T3842C
    - A3767G
    Promoter G4205A G4205A
  • Sowohl die rückgekreuzten als auch die nicht-rückgekreuzten Mutanten weisen eine Promoter-Mutation (die für sich selbst oder in Kombination zu einem 2- bis 3-fachen Anstieg des Expressionsniveaus führt) sowie drei gemeinsame Aminosäure-Änderungen auf (Glu104Lys; Met182Thr und Gly238Ser). Die Mutationen Glu104Lys und Gly238Ser sind Mutationen, die in einigen Cefotaxim-resistenten oder anderen TEM-1-Derivaten zugegen sind (Tabelle 4).
  • (9) Vergleich des Expressionsniveaus
  • Das Expressionsnivau des Betalactamase-Gen in dem Plasmid des Wild-Typs, in der nicht-rückgekreuzten Mutante und in der rückgekreuzten Mutante wurde verglichen mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (4 bis 20%; Novex, San Diego, CA) von periplasmischen Extrakten, die durch osmotischen Schock gemäß dem Verfahren von B. Witholt (32) hergestellt worden waren.
  • Gereinigte TEM-1-Betalactamase (Sigma, St. Louis, MO) wurde als Molekulargewichts-Standard verwendet, und E. coli-XL1-Blauzellen, die kein Plasmid hatten, wurden als negativer Kontrollwert verwendet.
  • Die Mutante und die rückgekreuzte Mutante schienen eine 2- bis 3-fach höhere Konzentration des Betalactamase-Proteins zu produzieren, verglichen mit dem Gen des Wild-Typs. Die Mutation des Promoters schien zu einem 2- bis 3-fachen Anstieg an Betalactamase zu führen.
  • Beispiel 6
  • Konstruktion von Mutanten-Kombinationen des TEM-1-Betalactamase-Gens
  • Zur Bestimmung der Resistenz verschiedener Kombinationen von Mutationen und zum Vergleich der neuen Mutanten mit publizierten Mutanten wurden einige Mutanten in einen identischen Plasmid-Hintergrund konstruiert. Zwei der Mutationen (Glu104Lys und Gly238Ser) sind als Cefotaxim-Mutanten bekannt. Alle Mutanten-Kombinationen, die konstruiert wurden, hatten die Promoter-Mutation, was einen Vergleich der selektierten Mutanten erlaubte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
  • Spezielle Kombinationen von Mutanten wurden in die pUC182Sfi des Wild-Typs durch PCR eingeführt, wofür zwei Oligonukleotide pro Mutation verwendet wurden. Die Oligonukleotide zum Erhalt der folgenden Mutanten waren:
    Figure 01160001
  • Diese separaten PCR-Fragmente wurden mit einem Gel gereinigt, und zwar getrennt von den synthetischen Oligonukleotiden. 10 ng jedes Fragments wurden kombiniert, und es wurde eine Zusammenbau-Reaktion bei 94°C für 1 min und anschließend 25 Zyklen [94°C für 30 s; 50°C für 30 s und 72°C für 45 s] durchgeführt. Eine PCR wurde an dem Zusammenbauprodukt für 25 Zyklen in Gegenwart der SfiI enthaltenden Außen-Primer (Primer C und D aus Beispiel 5) durchgeführt. Die DNS wurde mit Sfi1 verdaut und in den Vektor pUC182Sfi des Wild-Typs eingebaut. Die folgenden Mutanten-Kombinationen wurden erhalten (Tabelle 4). Tabelle 4
    Name Gentyp MIC Quelle der MIC
    TEM-1 Wild-Typ 0,02
    Glu104Lys 0,08 10
    Gly238Ser 016 10
    TEM-15 Glu104Lys/Gly238Ser* 10
    TEM-3 Glu104Lys/Gly238Ser/Gln39Lys 10 2–32 37, 15
    ST-4 Glu104Lys/Gly238Ser/Met182Thr* 10
    ST-1 Glu104Lys/Gly238Ser/Met182Thr/Ala18Val/T3959A/G3713A/G3934A/A3689G* 320
    ST-2 Glu104Lys/Gly238Ser/Met182Thr/Ala42Gly/Gly92Ser/Arg241His/T3842C/A3767G* 640
    ST-3 Glu104Lys/Gly238Ser/Met182Thr/Ala42Gly/Gly92Ser/Arg241His* 640
    • Anmerkung: *) Alle diese Mutanten enthalten zusätzlich die G4205A-Promoter-Mutation.
  • Es wurde daraus geschlossen, daß die konservierten Mutationen für 9 der 15 Dopplungen in der MIC stehen.
  • Die Mutation Glu104Lys allein führte – wie gezeigt wurde – nur zu einer Verdoppelung der MIC auf 0,08 μg/ml, und die Mutation Gly238Ser (in einigen Kontexten mit einer weiteren Aminosäure-Änderung) führte nur zu einer MIC von 0,16 μg/ml (26). Die Doppel-Mutante Glu104Lys/Gly238Ser weist eine MIC von 10 μg/ml auf. Diese Mutante entspricht dem TEM-15.
  • Diese selben Mutationen (Glu104Lys und Gly238Ser), in Kombination mit der Mutation Gln39Lys (TEM-3) oder Thr263Met (TEM-4), führen zu einem hohen Grad der Resistenz (2–32 μg/ml für TEM-3 und 8–32 μg/ml für TEM-4 (34, 35).
  • Eine Mutante, die die drei Aminosäure-Änderungen enthält, die nach der Rückkreuzung erhalten blieben (Glu104Lys/Met182Thr/Gly238Ser), hatten auch eine MIC von 10 μg/ml. Dies bedeutete, daß die Mutationen, die jede der neuen selektierten Mutanten zusätzlich zu den drei bekannten Mutationen hatten, verantwortlich waren für einen weiteren 32- bis 64-fachen Anstieg der Resistenz des Gens gegenüber Cefotaxim.
  • Die natürlich vorkommenden, klinisch von TEM-1 abgeleiteten Enzyme (TEM-1-19) enthalten jeweils eine unterschiedliche Kombination von nur 5 bis 7 identischen Mutationen (Berichte). Da sich diese Mutationen in gut voneinander getrennten Orten im Gen befinden, kann eine Mutante mit hoher Cefotaxim-Resistenz nicht durch Kassetten-Mutagenese eines einzelnen Bereichs erhalten werden. Dies kann erklären, warum die maximale MIC, die durch den Standard-Kassetten-Mutagenese-Ansatz erhalten wurde, nur 0,64 μg/ml betrug (26). Beispielsweise wurden sowohl die Glu104Lys-Mutation als auch die Gly238Ser-Mutation separat voneinander in dieser Studie als Mutationen befunden, die MICs unterhalb von 0,16 μg/ml haben. Die Anwendung des DNA-Shuffling-Verfahrens erlaubte Kombinatorialität, und so wurde gefunden, daß die Glu104Lys-/Gly238Ser-Kombination eine MIC von 10 μg/ml hatte.
  • Eine wichtige Beschränkung dieses Beispiels ist die Verwendung eines Einzel-Gens als Startpunkt. Es kommt in Betracht, daß bessere Kombinationen gefunden werden können, wenn eine große Zahl von verwandten, natürlich vorkommenden Genen dem Shuffling unterworfen wird. Die Vielgestaltigkeit, die in einer solchen Mischung zugegen ist, ist bedeutungsvoller als die statistischen Mutationen, die durch das Mutagen-Shuffling erzeugt werden. Beispielsweise kommt es in Betracht, daß man ein Repertoire von verwandten Genen aus einer einzelnen Spezies verwenden könnte, wie beispielsweise die vor-existierende Vielfahl des Immunsystems, oder verwandte Gene, die aus vielen verschiedenen Spezies erhalten werden.
  • Beispiel 7
  • Verbesserung der Eigenschaften von Antikörper-A10B durch DNS-Shuffling einer Bibliothek aller sechs Mutanten-CDRs
  • Der A10B-scFv-Antikörper, ein Mause-Anti-Kaninchen-IgG, war eine Gabe der Firma Phamacia (Milwaukee, WI). Es wurde das im Handel erhältliche Pharmacia-Phage-Displaysystem verwendet, das Gebrauch macht von dem Phagen-Display-Vektor-pCANTAB5. Der ursprüngliche A10B-Antikörper hatte reproduzierbar nur eine niedrige Avidität, da Klone erhalten wurden, die sich nur schwach an immobilisiertes Antigen (Kaninchen-IgG) banden, wie gemessen wurde durch Phagen-ELISA (Pharmacia-Test-Kit) oder durch Phagen-Titer. Die Konzentration an Kaninchen-IgG, die eine 50%ige Inhibierung des Bindens des A10B-Antikörpers in einem kompetitiven Test ergab, war 13 picomolar. Die beobachtete niedrige Avidität kann auch zurückzuführen sein auf die Instabilität des A10B-Klons.
  • Die A10B-scFv-DNS wurde sequenziert (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) nach den Instruktionen des Herstellers. Die Sequenz war ähnlich der existierender Antikörper, bezogen auf einen Vergleich nach Kabat (33).
  • (1) Herstellung der Phagen-DNS
  • Phagen-DNS, die das Gen des Wild-Typs des A10B-Antikörpers anwies (10 μl) wurde bei 99°C für 10 min und anschließend bei 72°C für 2 min inkubiert. Es wurden der Phagen-DNS ein PCR-Mix (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-1000, 200 μM jeder dNTP, 1,9 mM MgCl2)), 0,6 μl jedes Primers und 0,5 μl Taq-DNS-Polymerase (Promega, Madison, WI) zugesetzt. Ein PCR-Program wurde für 35 Zyklen bei (30 s bei 94°C, 30 s bei 45°C, 45 s bei 72°C) durchgeführt. Die verwendeten Primer waren:
    Figure 01190001
  • Das 850 bp PCR-Produkt wurde dann elektrophoretisch behandelt und mit einem 2%igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt.
  • (2) Fragmentierung
  • 300 ng der auf dem Gel gereinigten 850 pb Bande wurden mit 0,18 Einheiten DNaseI (Sigma, St. Louis, MO) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 für 20 min bei Raumtemperatur verdaut. Die verdaute DNS wurde auf einem 2%igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt getrennt, und Banden zwischen 50 und 200 bp wurden von dem Gel gereinigt.
  • (3) Aufbau der Test-Bibliothek
  • Der Zweck dieses Experiments war es, zu testen, ob die Insertion der CDR effizient ist.
  • Es wurden die folgenden CDR-Sequenzen mit internen Enzym-Restriktionsstellen synthetisiert. „CDR H” bedeutet ein CDR in der schweren Kette, und „CDR L” bedeutet ein CDR in der leichten Kette des Antikörpers.
  • CDR Oligomere mit Restriktionsstellen:
    Figure 01200001
    CDR L2 (SEQ ID NO:38)
    Figure 01210001
    CDR L3 (SEQ ID NO:39)
    Figure 01210002
  • Die CDR Oligomere wurden den gereinigten A10B-Antikörper-DNS-Fragmenten mit Größen zwischen 50 und 200 bp, die im obigen Schritt (2) hergestellt worden waren, in einem 10-fachen molaren Überschuß zugesetzt. Der PCR-Mix (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 1,9 mM MgCl2, 200 μM jeder dNTP, 0,3 μl Taq-DNS-Polymerase (Promega, Madison, WI), 50 μl Gesamtvolumen) wurde zugesetzt, und das Shuffling-Programm wurde durchgeführt für 1 min bei 94°C, 1 min bei 72°C und anschließend 35 Zyklen (30 s bei 94°C, 30 s bei 55°C, 30 s bei 72°C).
  • 1 μl der geshuffelten Lösung wurde 100 μl des PCR-Mix zugesetzt (50 mM KCl, 10 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 200 μm jeder dNTP, 1,9 mM MgCl2, 0,6 μM jedes der beiden Außen-Primer (SEQ ID NO: 26 und 27; siehe unten) und 0,5 μl Taq-DNS-Polymerase) und das PCR-Prgramm wurde für 30 Zyklen bei den folgenden Bedingungen durchgeführt (30 s bei 94°C, 30 s bei 45°C, 45 s bei 72°C). Die resultierende Mischung aus DNS-Fragmenten einer Größe von 850 bp wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt.
  • Die Außen-Primer waren: Außen-Primer 1: SEQ ID NO: 27
    Figure 01210003
    Außen-Primer 2: SEQ ID NO: 26
    Figure 01210004
  • Das 850 bp PCR-Produkt wurde verdaut mit den Restriktionsenzymen SfiI und NotI, mit einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt und in den pCANTAB5-Expressionsvektor gebunden, der erhalten worden war von der Firma Pharmacia, Milwaukee, WI. Der eingebundene Vektor wurde elektroporiert nach dem Verfahren, das beschrieben worden war von Invitrogen (San Diego, CA), und zwar in TG1-Zellen (Pharmacia, Milwaukee, WI) und auf Platten aufgetragen, um einzelne Kolonien zu erhalten.
  • Die DNS aus den resultierenden Kolonien wurde 100 μl eines PCR-Mix (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 200 μm jeder dNTP, 1,9 mM MgCl2, 0,6 μM Außen-Primer 1 (SEQ ID NO: 27; siehe oben) und 6 Innen-Primer (SEQ ID NOS: 40 bis 45; siehe unten) und 0,5 μl Taq-DNS-Polymerase) zugesetzt, und ein PCR-Programm wurde für 35 Zyklen bei den Bedingungen (30 s bei 94°C, 30 s bei 45°C, 45 s bei 72°C) durchgeführt. Die Größen der PCR-Produkte wurden durch Agarosegel-Elektrophorese bestimmt, und die Produkte wurden verwendet, um zu bestimmen, welche CDRs mit Restriktionsstellen eingesetzt worden waren.
  • CDR-Innen-Primer:
    Figure 01220001
  • Die sechs synthetischen CDRs wurden an den erwarteten Stellen in der Wild-Typ-A10B-Antikörper-DNS (7) eingesetzt. Diese Studien zeigten, daß trotz der Tatsache, daß jede der sechs CDRs in einem speziellen Klon eine geringe Chance hat, eine CDR mit einer Restriktionsstelle zu sein, die meisten Klone wenigstens eine CDR mit einer Restriktionsstelle trugen, und daß jede mögliche Kombination von CDRs mit einer Restriktionsstelle erzeugt wurde.
  • (4) Konstruktion von Komplementarität bestimmenden Regionen in Mutanten („CDRs”)
  • Auf der Basis unserer Sequenzdaten wurden sechs Oligonukleotide herstellt, die den sechs CDRs entsprachen. Die CDRs (Kabat-Definition) wurden synthetisch in einem Verhältnis von 70 (existierende Basen) zu 10:10:10 mutagenisiert, und sie waren an den 5'- und 3'-Seiten von etwa 20 Basen einer flankierenden Sequenz flankiert, die die Homologie für die Einarbeitung der CDRs liefert, wenn diese in eine Mischung unmutagenisierter Antikörper-Gen-Fragmente im molaren Überschuß eingemischt werden. Die resultierenden Mutanten-Sequenzen sind die folgenden: Oligonukleotide für die CDR-Bibliothek:
    Figure 01230001
  • Fettgedrucke und unterstrichene Sequenzen waren die Mutanten-Sequenzen, die synthetisiert worden waren unter Verwendung einer Mischung von Nukleosiden im Verhältnis 70:10:10:10, wobei 70% für das Nukleosid des Wild-Typs steht.
  • Ein 10-facher molarer Überschuß der CDR-Mutanten-Oligonukleotide wurde den gereinigten A10B-Antikörper-DNS-Fragmenten mit einer Länge von 50 bis 200 bp, wie sie oben in Schritt (2) beschrieben worden waren, zugesetzt. Der PCR-Mix wurde zugesetzt (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 1,9 mM MgCl2, 200 μm jeder dNTP, 0,3 μl Taq-DNS-Polymerase (Promega, Madison, WI), 50 μl Gesamtvolumen), und das Shuffling-Programm wurde durchgeführt für 1 min bei 94°C, 1 min bei 72°C und anschließend 35 Zyklen bei den Bedingungen (30 s bei 94°C, 30 s bei 55°C, 30 s bei 72°C).
  • 1 μl der geshuffelten Mischung wurde 100 μl eines PCR-Mix zugesetzt (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 200 μm jeder dNTP, 1,9 mM MgCl2, 0,6 μM jedes der beiden Außen-Primer (SEQ ID NO: 26 und 27), 0,5 μl Taq-DNS-Polymerase) und das PCR-Programm wurde durchgeführt über 30 Zyklen bei den Bedingungen (30 s bei 94°C, 30 s bei 45°C, 45 s bei 72°C).
  • Die resultierende Mischung aus DNS-Fragmenten mit einer Größe von 850 bp wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und anschließend mit Ethanol gefällt.
  • Die Außen-Primer waren:
    Figure 01240001
  • (5) Klonen der scFv-Anttkörper-DNS in pCATAB5
  • Das 850 bp PCR-Produkt wurde verdaut mit den Restriktionsenzymen SfiI und NotI, mit einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt und in den pCANTAB5-Expressionsvektor eingebunden, der erhalten worden war von der Firma Pharmacia, Milwaukee, WI. Der eingebundene Vektor wurde elektroporiert nach dem Verfahren, das beschrieben worden war von Invitrogen (San Diego, CA), und zwar in TG1-Zellen (Pharmacia, Milwaukee, WI), und die Phagen-Bibliothek wurde aufgebaut unter Verwendung eines Helfer-Phagen, wobei man den Leitlinien folgte, die vom Hersteller empfohlen worden waren.
  • Die Bibliothek, die auf diese Weise erzeugt worden war, wurde auf das Vorhandensein verbesserter Antikörper gescreent, wofür man sechs Zyklen der Selektion durchführte.
  • (6) Selektion der Klone mit hoher Affinität
  • 15 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden mit einem Kaninchen-IgG (Jackson Immunoresearch, Bar Harbor, ME) in einer Konzentration von 10 μg/Vertiefung überzogen und 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Material mit 2% kein Fett enthaltender Trockenmilch in PBS für 1 h bei 37°C blockiert.
  • 100 μl der Phagen-Bibliothek (1 × 1010 cfu) wurde mit 100 μl 2%iger Milch für 30 min bei Raumtemperatur blockiert, und das Produkt wurde anschließend jeder der 15 Vertiefungen zugesetzt; diese Mischung wurde 1 h bei 37°C inkubiert.
  • Die Vertiefungen wurden anschließend dreimal mit PBS gewaschen, das 0,5% Tween-20 enthielt, und zwar bei 37°C für die Zeit von 10 min pro Waschung. Gebundener Phage wurde mit 100 μl Elutionspuffer (Glycin-HCl, pH 2,2) eluiert. Dem folge eine unmittelbare Neutralisation mit 2 M Tris, pH 7,4, und anschließender Transfektion zur Phagen-Produktion. Dieser Selektionszyklus wurde sechsmal wiederholt.
  • Nach dem sechsten Zyklus wurden individuelle Phagen-Klone aufgenommen, und die relativen Affinitäten wurden durch Phagen-ELISA verglichen, und die Spezifität für Kaninchen-IgG wurde mit einem Kit der Firma Pharmacia (Milwaukee, WI) nach dem Verfahren getestet, das vom Hersteller empfohlen wurden.
  • Der beste Klon hatte ein etwa 100-fach verbessertes Expressions-Level, verglichen mit dem Wild-Typ-A10B, wenn dies mit einem Western-Test– getestet wurde. Die Konzentration des Kaninchen IgG, die zu einer 50%igen Inhibierung in einem kompetitiven Test mit dem besten Klon führte, war 1 picomolar. Der beste Klon war reproduzierbar spezifisch für Kaninchen-Antigen. Die Zahl von Kopien des Antikörpers, der auf dem Phagen gezeigt wurde, scheint erhöht worden zu sein.
  • Beispiel 8
  • In-vivo-Rekombination über direkte Repeats partieller Gene
  • Ein Plasmid wurde mit zwei partiellen, inaktiven Kopien desselben Gens (Beta-Lactamase) konstruiert, um zu zeigen, daß eine Rekombination der gemeinsamen Bereiche dieser beiden direkten Repeats zu aktiven Rekombinanten-Genen voller Länge führt.
  • Ein pUC18-Derivat, das das bakterielle TEM-1-Beta-Lactamase trug, wurde verwendet (Yanish-Perron et al., 1985, Gene 33, 103 bis 119). Das TEM-1-Beta-Lactamase-Gen („Bla”) verleiht Bakterien Resistenz gegen etwa 0,02 μg/ml Cefotaxim. Sfi1-Restriktionsstellen wurden in Position 5' zum Promoter und 3' zum Ende des Beta-Lactamase-Gens mittels PCR der Vektor-Sequenz mit zwei Primern Primer A: (SEQ ID NO: 46):
    Figure 01260001
    Primer B (SEQ ID NO: 47):
    Figure 01260002
    und mittels PCR der Beta-Lactamase-Gensequenz mit zwei anderen Primern zugefügt: Primer C (SEQ ID NO: 48):
    Figure 01270001
    Primer D (SEQ ID NO: 49):
    Figure 01270002
  • Die beiden Reaktionsprodukte wurden mit Sfi1 verdaut, gemischt, verbunden und zur Transformation kompetenter E. coli-Bakterien mittels des nachfolgend beschriebenen Verfahrens verwendet: Das resultierende Plasmid war pUC182Sfi-Bla-Sfi. Dieses Plasmid enthält ein Sfi1-Fragment, das das Bla-Gen und den P-3-Promoter trägt.
  • Die minimale Inhibitor-Konzentration von Cefotaxim für E. coli-XL1-Blau (Stratagene, San Diego, CA), der pUC182Sfi-Bla-Sfi trug, war 0,02 μg/ml nach 24 h bei 37°C.
  • Das Tetracyclin-Gen von pBR322 wurde unter Verwendung der homologen Bereiche in pUC182Sfi-Bla-Sfi kloniert. Dies führte zu pBR322TetSfi-Bla-Sfi. Das TEM-1-Gen wurden dann durch Restriktion-Verdauung des pBR322TetSfi-Bla-Sfi mit SspI und FspI und Blunt-End-Ligation entfernt, was zu pBR322TetSfi-Sfi führte.
  • Überlappende Bereiche des TEM-1-Gens wurden unter Anwendung von Standard-PCR-Verfahrensweisen und unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: Primer 2650 (SEQ ID NO: 50):
    Figure 01270003
    Primer 2493 (SEQ ID NO: 51):
    Figure 01270004
    Primer 2651 (SEQ ID NO: 52):
    Figure 01280001
    Primer 2652 (SEQ ID NO: 53)
    Figure 01280002
  • Die beiden resultierenden DNS-Fragmente wurden mit Sfi1 und BstX1 verdaut und in die Sfi-Stelle von pBR322TetSfi-Sfi gebunden. Das resultierende Plasmid wurde pBR322TetSfi-BL-LA-Sfi genannt. Eine Karte des Plasmids sowie eine schematische Aufzeichnung der intraplasmidischen Rekombination und Rekonstruktion der funktionellen Beta-Lactamase ist in 9 gezeigt.
  • Das Plasmid wurde entweder in TG-1- oder in JC8679-E. coli-Zellen elektroporiert. E. coli-JC8679 ist RecBC sbca (Oliner et al., 1993, NAR 21, 5192). Die Zellen wurden auf feste Agarplatten aufgetragen, die Tetracyclin enthielten. Die Kolonien, die wuchsen, wurden dann auf feste Agarplatten aufgetragen, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, und es wurde die Zahl lebensfähiger Kolonien gezählt. Die Beta-Lactamase-Gen-Inserts, in den Transformanten, die Ampicillin-Resistenz zeigten, wurden mittels Standard-PCR-Verfahrensweisen amplifiziert, und zwar mittels der Primer Primer 2650 (SEQ ID NO: 50):
    Figure 01280003
    Primer 2493 (SEQ ID NO: 51):
    Figure 01280004
    und die Länge der Inserts wurde gemessen. Das Vorhandensein eines 1 kb Inserts zeigt, daß das Gen erfolgreich rekombiniert wurde, wie dies in 9 und Tabelle 5 gezeigt ist: Tabelle 5
    Zelle Tet-Kolonien Amp-Kolonien Kolonie PCR
    TG-1 131 21 3/3 bei 1 kb
    JC8679 123 31 4/4 bei 1 kb
    Vektor (Kontrolle 51 0
  • Etwa 17 bis 25% der Tetracyclin-resistenten Kolonien waren auch Ampicillin-resistent, und alle Ampicillin-resistenten Kolonien waren korrekt rekombiniert, wie durch Kolonien-PCR bestimmt wurde. Daher rekombinieren partielle Gene, die auf demselben Plasmid angeordnet sind, erfolgreich und schaffen so ein funktionelles Gen.
  • Beispiel 9
  • In-vivo-Rekombination über direkte Repeats von Genen voller Länge
  • Ein Plasmid wurde mit zwei Kopien voller Länge von verschiedenen Allelen des Beta-Lactamase-Gens wurde konstruiert. Eine homologe Rekombination der beiden Gene führte zu einer einzigen rekombinanten Kopien voller Länge des Gens.
  • Die Konstruktion von pBR322TetSfi-Sfi und pBR322TetSfi-Bla-Sfi wurde oben beschrieben.
  • Die beiden Allele des Beta-Lactamase-Gens wurden wie folgt konstruiert: Zwei PCR-Reaktionen wurden mit pUC18Sfi-Bla-Sfi als Templat durchgeführt. Eine Reaktion wurde mit den folgenden Primern durchgeführt: Primer 2650 (SEQ ID NO: 50)
    Figure 01300001
    Primer 2649 (SEQ ID NO: 51)
    Figure 01300002
  • Die zweite PCR-Reaktion wurde mit den folgenden Primern durchgeführt: Primer 2648 (SEQ ID NO: 54)
    Figure 01300003
    Primer 2493 (SEQ ID NO: 51)
    Figure 01300004
  • Diese Schritte führten zu zwei Bla-Genen, und zwar eines mit einer 5'-Sfi1-Stelle und einer 3'-BstK1-Stelle, und das andere mit einer 5'-BstX1-Stelle und einer 3'-Sfi1-Stelle.
  • Nach Verdauung dieser beiden Gene mit BstX1 und Sfi1 und Ligation in das mit Sfi1 verdaute Plasmid pBR322TetSfi-Sfi wurde ein Plasmid (PBR322-Sfi-2BLA-Sfi) mit einem Tandem-Repeat des Bla-Gens erhalten (siehe 10).
  • Das Plasmid wurde in E. coli-Zellen elektroporiert. Die Zellen wurden auf festen Agarplatten aufgetragen, die 15 μg/ml Tetracyclin enthielten. Die Kolonien, die wuchsen, wurden dann auf feste Agarplatten aufgetragen, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Die Zahl der lebensfähigen Kolonien wurde gezählt. Die Bla-Inserts in diesen Transformanten, die Ampicillin-Resistenz zeigten, wurden mit Standard-PCR-Verfahren unter Verwendung des Verfahrens und der Primer amplifiziert, die in Bei spiel 8 beschrieben sind. Die Gegenwart eines 1 kb Inserts zeigte, daß die Doppelgene rekombiniert worden waren, wie in Tabelle 6 gezeigt ist. Tabelle 6
    Zelle Tet-Kolonien Amp-Kolonien Kolonie PCR
    TG-1 28 54 7/7 bei 1 kb
    JC8679 149 117 3/3 bei 1 kb
    Vektor (Kontrolle 51 0
  • Mit Kolonie-PCR wurde bestätigt, daß der Tandem-Repeat effizient kombiniert worden war und so ein einziges rekombinantes Gen gebildet worden war.
  • Beispiel 10
  • Mehrere Zyklen einer direkten Repeat-Rekombination – interplasmidisch
  • Um zu bestimmen, ob mehrere Zyklen der Rekombination angewendet werden können, um resistente Zellen noch schneller herzustellen, wurden mehrere Zyklen der Verfahrensweise durchgeführt, wie sie in Beispiel 9 beschrieben ist.
  • Die Minus-Rekombinations-Kontrolle bestand aus einer Einzelkopie des Beta-Lactamase-Gens, während das Plus-Rekombinations-Experiment daraus bestand, zwei Kopien von Beta-Lactamase als direkten Repeat einzusetzen. Der Tetracyclin-Marker wurde verwendet, um die Zahl von Kolonien zu equalisieren, die in jeder Runde im Hinblick auf Cefotaxim-Resistenz selektiert worden waren.
  • In der ersten Runde wurde pBR322TetSfi-Bla-Sfi mit EcrI verdaut und einer PCR mit einem 1:1-Mix (1 ml) eines normalen und eines Cadwell-PCR-Mix (Cadwell und Joy ce (1992), PCR Methods and Applications 2: 28–33) für eine fehlerbehaftete PCR unterworfen. Das PCR-Programm wurde anfänglich 70°C für 2 min und anschließend 30 Zyklen unter den Bedingungen (94°C für 30 s, 52°C für 30 s und 72°C für 3 min und 6 s) pro Zyklus unterworfen, und dem folgte eine Behandlung bei 72°C für die Zeit von 10 min.
  • Die in der PCR-Reaktion zur Schaffung des einen Bla-Gen-Kontroll-Plasmids verwendeten Primer waren: Primer 2650 (SEQ ID NO: 50) and Primer 2719 (SEQ ID NO: 55) 5' TTAAGGGATTTTGGTCATGAGATT 3'. Dies führte zu einer gemischten Population aus amplifizierten DNS-Fragmenten, die gemeinsam als Fragment # 59 bezeichnet wurden. Diese Fragmente hatten eine Zahl verschiedener Mutationen.
  • Die Primer, die in zwei verschiedenen PCR-Reaktionen verwendet wurden, um die beiden B1a-Gene-Plasmide zu schaffen, waren Primer 2650 (SEQ ID NO: 50) und Primer 2649 (SEQ ID NO: 51) für das erste Gen; und Primer 2648 (SEQ ID NO: 54) und Primer 2719 (SEQ ID NO: 55) für das zweite Gen. Dies führte zu einer gemischten Population von jeweils den beiden amplifizierten DNS-Fragmenten: Fragment # 89 (amplifiziert mit den Primern 2648 und 2719) und Fragment # 90 (amplifiziert mit den Primern 2650 und 2649). In jedem Fall war eine Zahl verschiedener Mutationen in die gemischte Population jedes der Fragmente eingeführt worden.
  • Nach einer fehlerbehafteten PCR wurde die Population von amplifizierten DNS-Fragmenten # 59 mit Sfi1 verdaut und wurde anschließend in pBR322TetSfi-Sfi geklont, um eine gemischte Population des Plasmids pBR322Sfi-Blas-Sfi1 zu schaffen.
  • Nach einer fehlerbehafteten PCR wurde die Population an amplifizierten DS-Fragmenten # 90 und # 89 mit SfiI und BstXI bei 50°C verdaut und in pBR322TetSfi-Sfi eingebunden, und so eine gemischte Population des Plasmids pBR322TetSfi-2Bla-Sfi1 zu schaffen (10).
  • Die Plasmide pBR322Sfi-Bla-Sfi1 und pBR322TetSfi-2Bla-Sfi1 wurden in E. coli JC 8679 elektroporiert und auf Agarplatten aufgetragen, die verschiedene Konzentrationen von Cefotaxim aufwiesen, um nach resistenten Stämmen zu selektieren, und wurden auf Tetracyclinplatten zum Titrieren aufgetragen.
  • Eine gleiche Zahl von Kolonien (bezogen auf die Zahl von Kolonien, die auf Tetracyclin wuchsen) wurde aufgenommen, in LB-tet kultiviert, und die DNS wurde von den Kolonien extrahiert. Dies war eine Runde der Rekombination. Diese DNS wurde mit EcrI verdaut und wurde für die zweite Runde der fehlerbehafteten PCR verwendet, wie dies oben beschrieben wurde.
  • Nach fünf Runden war die MIC (minimale Inhibitor-Konzentration) für Cefotaxim für das eine Fragment-Plasmid 0,32, während die MIC für die zwei Fragment-Plasmide 1,28 war. Diese Ergebnisse zeigen, daß nach fünf Zyklen die mit Rekombination erhaltene Resistenz um das Vierfache höher war in Gegenwart einer In-vivo-Rekombination.
  • Beispiel 11
  • In-vivo-Rekombination über Elektroporation von Fragmenten
  • Kompetente E. coli-Zellen, die pUC18Sfi-Bla-Sfi enthielten, wurden so hergestellt, wie dies beschrieben wurde. Das Plasmid pUC18Sfi-Bla-Sfi enthält das Standard-TEM1-Beta-Lactamase-Gen, wie dies oben beschrieben wurde.
  • Es wurde ein von TEM-1 abgeleitetes Cefotaxim-Resistenz-Gen von pUC18Sfi-cef-Sfi (Klon ST2) (Stemmer WPC (1994), Nature 370: 389–391; die Druckschrift wird durch die Inbezugnahme in die vorliegende Beschreibung übernommen) erhalten, das E. coli, der der Plasmid trägt, eine MIC von 640 μg/ml gegenüber Cefotaxim verleiht. In einem Experiment wurde die vollständige Plasmid-pUC18Sfi-cef-Sfi-DNS in E. coli-Zellen elektroporiert, die das Plasmid pUC18Sfi-Bla-Sfi trugen.
  • In einem anderen Experiment wurde das DNS-Fragment, das das Cefotaxim-Gen aus pUS18Sfi-cef-Sfi enthielt, durch PCR unter Verwendung der Primer 2650 (SEQ ID NO: 50) und 2719 (SEQ ID NO: 55) amplifiziert. Das resultierende 1 kb PCR-Produkt wurde in DNS-Fragmente einer Größe < 100 pb durch DNase verdaut, und diese Fragmente wurden in kompetente E. coli-Zellen elektroporiert, die bereits pUC18Sfi-Bla-Sfi enthielten.
  • Die transformierten Zellen aus beiden Experimenten wurden anschließend auf ihre Resistenz gegenüber Cefotaxim getestet, indem man die transformierten Zellen auf Agarplatten auftrug, die variierende Konzentrationen von Cefotaxim enthielten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 Kolonien/Cefotaxim-Konzentration
    0,16 0,32 1,28 5,0 10,0
    Keine DNS (Kontrolle) 14
    ST-2-Mutante (ganz) 4000 2000 800 400
    ST-2-Mutante (Fragmente) 1000 120 22 7
    Wild-Typ (ganz) 27
    Wild-Typ (Fragmente) 18
  • Es ist aus den Ergebnissen ersichtlich, daß das gesamte ST-2 Cef-Gen entweder in das bakterielle Genom oder das Plasmid nach der Elektroporierung insertiert war. Da die meisten Insertionen homolog sind, wird erwartet, daß das Gen in das Plasmid insertiert war, wo es das Gen des Wild-Typs ersetzte. Die Fragmente des Cef-Gens aus St-2 ließen sich auch effizient in dem Plasmid in das Gen des Wild-Typs einsetzen. Es wurde kein scharfer Anstieg der Cefotaxim-Resistenz mit der Einführung des Wild-Typ-Gens (gesamt oder in Fragmenten) beobachtet, und dies war auch so in dem Fall ohne DNS. Daher wurde gezeigt, das die St-2-Fragmente zu viel größerer Cefotaxim-Resistenz führen als die Fragmente des Wild-Typs.
  • Es wurde erwartet, daß wiederholte Insertionen von Fragmenten, die von zunehmend resistenten Gen-Pools hergestellt waren, zu einer steigenden Resistenz führen.
  • Dementsprechend wurden diejenigen Kolonien, die eine erhöhte Cefotaxim-Resistenz mit den St-2-Gen-Fragmenten ergaben, isoliert, und die Plasmid-DNS wurde extrahiert. Diese DNS wurde unter Anwendung der PCR im Rahmen des oben beschriebenen Verfahrens amplifiziert. Die amplifizierte DNS wurde mit DNase in Fragmente (< 100 bp) verdaut, und 2 bis 4 μg der Fragmente wurden in kompetente E. coli-Zellen elektroporiert, die bereits pUC322Sfi-Bla-Sfi enthielten, wie dies oben beschrieben ist. Die transformierten Zellen wurden auf Agarplatten aufgetragen, die variierende Konzentrationen von Cefotaxim enthielten.
  • Als Kontrolle wurden kompetente E. coli-Zellen, die das Plasmid pUC18Sfi-Kann-Sfi aufwiesen, ebenfalls verwendet. DNS-Fragmente aus der Verdauung des PCR-Produktes von pUC18Sfi-cef-Sfi wurden in diese Zellen elektroporiert. Es gibt keine Homologie zwischen dem Kanamycin-Gen und dem Beta-Lactamase-Gen, und daher sollte eine Rekombination nicht stattfinden.
  • Dieses Experiment wurde für 2 Runden wiederholt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8
    Runde Cef-Konzentration KAN-Kontrolle Cef-resistente Kolonien
    1 * 0,16–0,64 0,32 „Rasen” 10 klein „Rasen” 1000
    2 * 10 10 100 klein @ 2,5 400 50 @ 10
    3 40 1280 100 klein 100 klein
    • Anmerkung: *) erneut auftragen auf eine Platte
  • Beispiel 12
  • Bestimmung von Rekombinations-Formaten
  • Dieses Experiment wurde dazu angelegt, zu bestimmen, welches Format der Rekombination die meisten Rekombinanten pro Zyklus erzeugt.
  • In einem ersten Ansatz wurde der Vektor pUC18Sfi-Blas-Sfi mit PCR-Primern amplifiziert und so ein großes und ein kleines Fragment erzeugt. Das große Fragment trug das Plasmid und hatte Enden, die Teile des Bla-Gens aufwiesen, und das kleine Fragment codierte für die Mitte des Bla-Gens. Ein drittes Fragment, das das vollständige Bla-Gen trug, wurde erzeugt unter Anwendung von PCR mit der Verfahrensweise gemäß Beispiel 8. Das größere Plasmid-Fragment und das Fragment, das das vollständige Bla-Gen enthielt, wurden in E. coli-JC8679-Zellen elektroporiert, und zwar zur selben Zeit und mit dem oben beschriebenen Verfahren. Die Transformanten wurden auf Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen von Cefotaxim aufgetragen.
  • In einem zweiten Ansatz wurde der Vektor pUC18Sfi-Bla-Sfi amplifiziert und so das große Plasmid-Fragment hergestellt, das im obigen Ansatz 1 isoliert worden war. Die beiden Fragmente, von denen jedes einen Teil des vollständigen Bla-Gens umfaßte, so daß die beiden Fragmente zusammen das vollständige Bla-Gen überspannten, wurden ebenfalls durch PCR erhalten. Das große Plasmid-Fragment und die beiden Bla-Gen-Fragmente wurden alle in kompetente E. coli-JC8679-Zellen elektroporiert, und die Transformanten wurden auf Platten mit variierenden Konzentrationen Cefotaxim aufgetragen.
  • In einem dritten Ansatz wurden sowohl der Vektor als auch das Plasmid in E. coli-JC8679-Zellen elektroporiert, und die Transformanten wurden auf Platten mit variierenden Konzentrationen Cefotaxim aufgetragen.
  • In einem vierten Ansatz wurde das vollständige Bla-Gen in E. coli-JF8679-Zellen elektroporiert, die bereits den Vektor pUCSfi-Sfi enthielten, und die Transformanten wurden auf Platten mit variierenden Konzentrationen Cefotaxim aufgetragen. Als Kontrollversuche wurden die E. coli-JC8679-Zellen entweder mit dem vollständigen Bla-Gen oder mit dem Vektor allein elektroporiert.
  • Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Die Effizienz der Insertion der beiden Fragmente in den Vektor ist hundert Mal niedriger als in dem Fall, in dem ein Fragment, das das vollständige Bla-Gen aufweist, verwendet wurde. Ansatz 3 zeigte, daß die Effizienz der Insertion von der Gegenwart freier DNS-Enden abhängt, da bei diesem Ansatz keine Rekombinanten erhalten wurden. Jedoch waren die Ergebnisse des Ansatzes 3 auch auf die geringe Effizient der Elektroporation des Vektors zurückzuführen. Wenn der Expressionsvektor bereits in den kompetenten Zellen ist, ist die Effizienz der Vektor-Elektroporation nicht länger ein Faktor, und eine effiziente homologe Rekombination kann erreicht werden, selbst mit einem ungeschnittenen Vektor.
  • Beispiel 13
  • Kit für das Kassetten-Shuffling zur Optimierung der Vektor-Leistung
  • Um einen Vektor zur Verfügung zu stellen, der in der Lage ist, einen optimierten Phänotyp zu schaffen (z. B. maximale Expression einer durch den Vektor codierten Sequenz, wie beispielsweise eines geklonten Gens), wird ein Kit bereitgestellt, das eine Vielzahl von Kassetten umfaßt, die geshuffelt werden können, und optimierte geshuffelte Produkte können selektiert werden. 12 zeigt schematisch eine Ausführungsform, in der für jeden Locus eine Mehrzahl von Kassetten zur Verfügung steht. Beispielsweise zeigt für ein bakterielles Expressionssystem 13 beispielhafte Kassetten, die an den jeweiligen Loci verwendet werden. Jede Kassette eines gegebenen Locus (z. B. alle Promotoren in diesem Beispiel) werden flankiert von im wesentlichen identischen Sequenzen, die in der Lage sind, eine oder mehrere flankierende Sequenz(en) von Kassetten eines benachbarten Locus zu überlappen, und vorzugsweise auch in der Lage sind, an der homologen Rekombination oder nicht-homologen Rekombination teilzunehmen (z. B. lox/cre- oder flp/frt-Systeme), um ein Shuffling von Kassetten innerhalb eines Locus zu bewirken, jedoch im wesentlichen nicht zwischen mehreren Loci.
  • Kassetten werden in dem Kit als PCR-Fragmente geliefert, wobei jeder Typ Kassette oder jede einzelne Kassetten-Spezies in einem separaten Röhrchen abgepackt ist. Durch Kombinieren des Gehalts der Röhrchen werden Vektor-Bibliotheken geschaffen, wodurch ganze Plasmide oder wesentliche Teile davon durch Hybridisierung der überlappenden flankierenden Sequenzen von Kassetten an jedem Locus mit Kassetten an den benachbarten Loci zusammengebaut werden. Der zusammengebaute Vektor wird in ein vorbestimmtes Gen von Interesse eingebunden und so eine Vektor-Bibliothek gebildet, in der jedes Glied der Bibliothek das vorbestimmte Gen von Interesse und eine Kombination von Kassetten umfaßt, die durch den Zusammenbau von Kassetten bestimmt werden. Die Vektoren werden in eine geeignete Wirtszelle trans feriert, und die Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, die für eine Expression geeignet sind. Der gewünschte Phänotyp wird selektiert.
  • Beispiel 14
  • Shuffling zum Optimieren der Eigenschaften des grünen Fluoreszenz-Proteins (GFP)
  • Hintergrund:
  • Das grüne Fluoreszenz-Protein („GFP”) ist ein Polypeptid, das von einem Apopeptid mit 328 Aminosäure-Resten und einem Molekulargewicht von etwa 27.000 abgeleitet ist. GFP enthält ein Chromophor, das von den Aminosäure-Resten 65 bis 67 gebildet wird. Wie der Name angibt, fluoresziert GFP. Es zeigt keine Biolumineszenz wie Luciferase. In-vivo wird das Chromophor von GFP aktiviert durch Energieübertragung von Coelenterazin, das mit dem Photoprotein Aequorin komplexiert ist, wobei GFP eine grüne Fluoreszenz bei 510 nm zeigt. Bei Bestrahlung mit blauem oder UV-Licht zeigt GFP grüne Fluoreszenz bei etwa 510 nm.
  • Das grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) der Qualle Aequorea Victoria ist eine sehr nützliche Referenz für die Gen-Expression und -Regulation (Prasher et al. (1992), Gene 111: 229; Prasher et al (1995), Trends in Genetics 11: 320; Chalfie et al. (1994), Science 263: 802). Druckschrift WO95/21191 offenbart eine Polynukleotid-Sequenz, die für ein 238 Aminosäuren großes GFP-Apoprotein codiert, das ein Chromophor enthält, das auf den Aminosäuren 65 bis 67 gebildet ist. Die Druckschrift WO95/21191 offenbart, daß eine Modifikation der cDNS für das Apopeptid des A. Victoria GFP zur Synthese eines Peptids mit geänderten Fluoreszenz-Eigenschaften führt. Es wurde berichtet über ein Mutanten-GFP (S65T), das zu einer 4- bis 6-fachen Verbesserung bei der Anregungsamplitude führt (Heim et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 91: 12501).
  • Überblick:
  • Das grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) ist schnell zu einer in weitem Umfang verwendeten Referenzsubstanz für die Gen-Regulation geworden. Jedoch wurde in vielen Organismen, insbesondere Eukaryoten, das Vollzell-Fluoreszenz-Signal als zu schwach befunden. Es war ein Ziel, die Vollzell-Fluoreszenz von GFP zur Verwendung als Referenzsubstanz für die Gen-Regulation bei E. coli und in Säugerzellen zu verbessern. Die Verbesserung des GFP durch rationale Entwürfe des Proteins schien schwierig, da die Quantenausbeute von GFP bereits 0,7 bis 0,8 beträgt (Ward et al. (1982, Photochem. Photobiol. 35: 803). Das Expressionsniveau von GFP in einem Standard-E. coli-Konstrukt war bereits 75% des Gesamtproteins.
  • Eine Verbesserung von GFP erfolgte zuerst durch Synthese des GFP-Gens bei verbesserter Anwendung von Kodons. Das GFP-Gen wurde dann weiter verbessert durch das/die offenbarte(n) Verfahren, das aus rekursiven Zyklen des DNS-Shufflings oder der sexuellen PCR des GFP-Gens bestand, kombiniert mit visueller Selektion der hellsten Klone. Das gesamte Zell-Fluoreszenz-Signal in E. coli wurde optimiert, und selektierte Mutanten wurden dann in der Weise getestet, daß man die Leistung der besten GFP-Mutanten in eukaryotischen Zellen bestimmte.
  • Ein synthetisches Gen wurde synthetisiert, das eine verbesserte Benutzung des Kodons erbrachte und das eine 2,8-fache Verbesserung des E. coli Fluoreszenz-Signals erbrachte, verglichen mit dem industriellen Standard-GFP-Konstrukt (Clontech, Palo Alto, CA). Eine weitere 16-fache Verbesserung wurde erhalten nach Durchlaufen dreier Zyklen einer sexuellen PCR und visuellen Screening der hellsten E. coli-Kolonien bei einer 45-fachen Verbesserung gegenüber dem Standard-Konstrukt. Bei Expression in Eierstock-Zellen von chinesischen Hamstern (Chinese Hamster Ovary cells; CHO cells) zeigte diese geshuffelte Mutante eine 42-fache Verbesserung des Signals gegenüber dem synthetischen Konstrukt. Das Expressionsniveau in E. coli war bei etwa 75% Gesamtprotein unverändert. Die Emission- und Anregungs-Maxima des GFP waren ebenfalls unverändert. Während in E. coli die überwiegende Menge des GFP des Wild-Typs in Einschlußkörpern endet, wo es nicht fähig ist, das Chromorphor zu aktivieren, war die überwiegende Menge des/der Mutanten-Proteine(s) löslich und aktiv. Die drei Aminosäure-Mutationen leiten also das mutante Protein in den nativen Faltungsweg und nicht in Richtung auf eine Aggregation. Die Ergebnisse zeigen, daß ein DNS-Sequenz-Shuffling (sexuelle PCR) komplexe, praktische Probleme lösen und vorteilhafte Mutanten-Varianten schnell und effizient erzeugen kann.
  • Materialien und Methoden
  • GFP-Gen-Aufbau
  • Ein Gen, das für das GFP-Protein mit der publizierten Sequenz codiert (Prasher et al. (1995) aaO.; die Druckschrift wird durch die Inbezugnahme in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Beschreibung übernommen) (238 AA; 27 kD), wurde aus Oligonukleotiden aufgebaut. Im Gegensatz zu dem im Handel erhältlichen GFP-Konstrukt (Clontech, Palo Alto, CA) schloß die Sequenz den Ala-Rest nach dem fMet ein, wie dies in dem ursprünglichen cDNS-Klon gefunden wird. Vierzehn Oligonukleotide, deren Größe im Bereich von 54 bis 85 Basen lag, wurden in Form von sieben Paaren durch PCR-Extension zusammengebaut. Diese Segmente wurden mit Restriktionsenzymen verdaut und separat in den Vektor Alpha+GFP kloniert (Whitehorn et al. (1995), Bio/Technology 13, 1215) und sequenziert. Diese Segmente wurden dann in den eukariotischen Expressionsvektor Alpha+ gebunden und so das GFP-Konstrukt voller Länge gebildet, und zwar Alpha+GFP (14). Das resultierende GFP-Gen enthielt veränderte Arginin-Kodons in den Aminosäure-Positionen 73 (CGT), 80 (CGG), 96 (CGC) und 122 (CGT). Um die Vorspannung durch das Kodon zu reduzieren und eine Expression in E. coli zu erleichtern, wurde eine Anzahl anderer stiller Mutationen in die Sequenz eingebaut, um die Restriktionsstellen zu schaffen, die beim Zusammenbau des Gens benutzt wurden. Dies waren: S2 (AGT in AGC, um eine NheI-Stelle zu erzeugen), K41 (AAA in Aag; HinDIII), Y74 (TAC in TAT) und P75 (CCA in CCG; BspE1), T108 (AGA in AGG; NnuI), L141 (CTC in TTG) und E142 (GAA in GAG; XhoI), 5175 (TCC in AGC; BamHI) und S202 (TCG in TCC; SalI).
  • Die unübersetzten 5'- und 3'-Enden des Gens enthielten XbaI- bzw. EcoRI-Stellen. Die Sequenz des Gens wurde durch Sequenzieren bestätigt.
  • Andere geeignete GFP-Vektoren und -Sequenzen können erhalten werden aus der GenBank-Datenbank sowie über das Internet im World Wide Web, als Files mit der folgenden Bezeichnung:
    Figure 01420001
  • Das XbaI-EcoRI-Fragment von Alpha+GFP, das das gesamte GFP-Gen enthält, wurde in den prokariotischen Expressionsvektor pBAD18 subkloniert (Guzman et al. (1995), J. Bacteriol. 177, 4121), was zu dem bakteriellen Expressionvektor pBAD18-GFP führte (14). In diesem Vektor ist die GFP-Gen-Expression unter der Kontrolle des Arabionose-Promoters/Repressors (araBAD), der mit Arabinose (0,2%) induzierbar ist. Da dies das einzige Konstrukt mit der Original-Aminosäure-Sequenz ist, wird es als „GFP des Wild-Typs (,wt')” bezeichnet. Ein GFP exprimierender bakterieller Vektor wurde erhalten von der Firma Clontech (Palo Alto, CA), der nachfolgend als „Clontech-Konstrukt” bezeichnet wird. Die GFP-Expression mittels des „Clontech-Konstrukts” erfordert eine Induktion mit IPTG.
  • Gen-Shuffling und Selektion
  • Ein etwa 1 kb großes DNS-Fragment, das das vollständige GFP-Gen enthielt, wurde erhalten aus dem PBAD-GFP Vektor durch PCR mit den Primern 5'-TAG CGGATCCTACCTGACGC (nahe der NheI-Stelle) und 5'-GAAATCTTCTCTCATCCG (nahe der EcoRI-Stelle), und das Produkt wurde gereinigt durch Wizard-PCR-Prep (Promega, Madison, WI). Dieses PCR-Produkt wurde mit DNaseI (Sigma) in statistische Fragmente verdaut, und Fragmente mit einer Größe von 50 bis 300 bp wurden von 2% Agarose Gelen mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt. Die gereinigten Fragmente wurden in einer Konzentration von 10 bis 30 ng/l einer PCR-Mischung resuspendiert (Promega, Madison, WI; 0,2 mM jeder dNTP, 2,2 mM MgCl2; 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl; pH 9,0; 0,1% Triton X-100), und zwar zusammen mit Taq-DNS-Polymerase (Promega) und (ohne Primer) unter Anwendung eines PCR-Programms mit 35 Zyklen bei den Bedingungen [94°C für 30 s, 45°C für 30 s, 72°C für 30 s] zusammengebaut, wie dies beschrieben ist in WPC Stemmer, (1994) Nature 370, 389. Das Produkt dieser Reaktion wurde 40-fach in neues PCR-Mix verdünnt, und das Produkt voller Länge wurde mit denselben beiden Primern ampliziert in einer PCR in 35 Zyklen bei den Bedingungen [94°C für 30 s, 50°C für 30 s, 72°C für 30 s], und im Anschluß daran bei 72°C für 10 min. Nach Verdauung des erneut zusammengebauten Produkts mit NheI und EcoRI wurde diese Bibliothek von Punkt-mutierten und in-vitro rekombinierten GFP Genen zurück in den PBAD-Vektor kloniert, in E. coli TG1 (Pharmacia) elektroporiert und auf LB-Platten mit 100 g/ml Ampicillin und 0,2% Arabinose aufgetragen, um eine GFP-Expression über den Arabinose-Promoter zu induzieren.
  • Mutantenselektion
  • Über einer Standard-UV-Licht-Box (365 nm) wurden die 40 hellsten Kolonien selektiert und gepoolt. Der Pool von Kolonien wurde als Templat für eine PCR-Reaktion verwendet und so ein Pool aus GFP-Genen erhalten. Die Zyklen 2 und 3 wurden identisch zu Zyklus 1 durchgeführt. Die beste Mutante aus Zyklus 3 wurde identifiziert durch Kultivieren von Kolonien in Mikrotiter-Platten und Fluoreszenz Spektrometrie der Mikrotiter-Platten.
  • Zur Charakterisierung von Mutanten in E. coli wurde eine DNS-Sequenzierung auf einem DNS-Sequenzer (Typbezeichnung 391) der Firma Applied Biosystems durchgeführt.
  • CHO-Zell-Expression von GFP
  • Die Wild-Typ-Version und die Mutanten-Versionen des Zyklus 2 und 3 des GFP-Gens wurden in den eukariotischen Expressions-Vektor Alpha+ (16) als EcoRI-XbaI-Fragment transferiert. Die Plasmide wurden in CHO-Zellen durch Elektroporation von 10 Zellen in 0,8 ml mit 40 g Plasma bei 400 V und 250 F transfektiert. Transformanten wurden selektiert unter Verwendung von 1 mg/ml G418 über die Zeit von 10 bis 12 Tagen.
  • Eine FACS-Analyse wurde auf einem Gerät der Firma Becton Dickinson (FACSTAR Plus) unter Verwendung eines Argon-Ionenlasers durchgeführt, der auf 488 nm getunt war. Eine Fluoreszenz wurde beobachtet mit einem 535/30 Run Bandpass Filter.
  • Ergebnisse
  • Gebrauch der Codons
  • E. coli exprimierte das synthetische GFP-Konstrukt („wt”) mit geändertem Kodon-Gebrauch, was zu einem nahezu dreifach größeren Fluoreszenz-Signal der gesamten Zelle führte als bei Zellen, die das „Clontech-Konstrukt” exprimieren (15A). Der Vergleich wurde durchgeführt bei voller Induktion und bei einem Wert gleich der OD500. Zusätzlich zu der Substitution der schwachen Arginin-Kodons in dem „wt”-Konstrukt und der N-terminalen Extension, die in dem „Clontech-Konstrukt” zugegen war, waren die Expressionsvektoren und GFP-Promoter recht verschieden. Der Grund für das verbesserte Fluoreszenz-Signal ist nicht ein erhöhtes Expressionsniveau, es ist vielmehr die verbesserte Leistung des Proteins.
  • Sexuelle PCR
  • Das Fluoreszenz-Signal des synthetischen „wt”-GFP-Konstrukts wurde weiter verbessert durch Aufbauen einer Mutanten-Bibliothek durch sexuelle PCR-Verfahren, wie sie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind und außerdem in den Druckschriften WPC Stemmer (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 91, 10747 und WPC Stemmer (1994) Nature 370, 389. Dem folgte ein Auftrag der hellsten Kolonien auf Platten und eine Selektion. Nach dem 2. Zyklus der sexuellen PCR und Selektion wurde ein Mutant („Zyklus 2”) erhalten, der um etwa das 8-fache verbessert war gegenüber dem „wt-Konstrukt” und um das 23-fache gegenüber dem „Clontech-Konstrukt” . Nach dem dritten Zyklus wurde eine Mutante („Zyklus 3”) erhalten, die um das 16- bis 18-fache verbessert war gegenüber dem „WT-Konstrukt” und um das 45-fache gegenüber dem „Clontech-Konstrukt” (15B). Die Peak-Wellenlängen der Anregung und die Emissionsspektren der Mutanten waren identisch mit denen des „wt-Konstrukts” (15B). Eine SDS-PAGE-Analyse der gesamten Zellen zeigte, daß das Gesamtniveau des GFP-Proteins, das in allen drei Konstrukten exprimiert wurde, unverändert war, und zwar bei einer überraschend hohen Rate von etwa 75% Gesamtprotein (16, Abbildung (a) und (b)). Eine Fraktionierung der Zellen durch Beschallung und Zentrifugation zeigte, daß das „wt-Konstrukt” überwiegend inaktives GFP in Form von Einschlußkörpern enthielt, während das GFP der „Zyklus-3-Mutante” in überwiegendem Maße löslich blieb und in der Lage war, das Chromophor zu aktivieren. Die Mutanten-Gene wurden sequenziert, und es wurde gefunden, daß die „Zyklus-1-Mutante” mehr Mutationen enthielt als die „Zyklus-3-Mutante” (17). Die „Zyklus-3-Mutante” enthielt 3 Protein-Mutationen und 3 stille Mutationen, bezogen auf das „wt-Konstrukt”. Die Mutationen F100S, M154T und V164A schließen den Ersatz hydrophober Reste durch hydrophilere Rest ein (Kyte und Doolittle, 1982). Eine plausible Erklärung dafür ist, daß das native GFP eine hydrophobe Stelle auf seiner Oberfläche aufweist, mittels derer es sich normalerweise an Aequorin oder an ein anderes Protein binden kann. In Abwesenheit dieses anderen Proteins kann die hydrophobe Stelle Aggregationen hervorrufen und eine autokatalytische Aktivierung des Chromophors verhindern. Die drei hydrophilen Mutationen können der hydrophoben Stelle entgegenwirken, was zu einer verringerten Aggregation und einer erhöhten Aktivierung des Chromophors führt. Puls-Chase-Experimente mit ganzen Bakterien bei 37°C zeigten, daß die T1/2 für die Fluorophor-Bildung 95 Minuten be trug, und zwar sowohl für die „wt”-GFP-Mutante als auch für die „Zyklus-3”-GFP-Mutante.
  • CHO-Zellen
  • Verbesserungen der autonomen charakteristischen Eigenschaften wie beispielsweise Selbstfaltung können auf unterschiedliche zelluläre Umgebungen transferierbar sein. Nach Selektion in Bakterien wurde das „Zyklus-3-Mutanten-GFP” in den eukariotischen Alpha+–Vektor transferiert und in Eierstock-Zellen chinesischer Hamster (CHO-Zellen) exprimiert. Während in E. coli das „Zyklus-3-Konstrukt” ein um das 16- bis 18-fache stärkeres Signal als das „wt-Konstrukt” ergab, zeigte eine Fluoreszenz Spektroskopie von CHO-Zellen, die die „Zyklus-3-Mutante” exprimierten, ein um das 42-fache stärkeres Fluoreszenz-Signal der ganzen Zelle als das „wt-Konstrukt” unter identischen Bedingungen (18A). Ein FACS-Sortieren bestätigte, daß das mittlere Fluoreszenz-Signal von CHO-Zell-Klonen, die das „Zyklus-3-Konstrukt” exprimierten, um das 46-fache stärker war als bei Zellen, die das „wt-Konstrukt” exprimieren (18B). Was das „wt-Konstrukt” angeht, wurde gefunden, daß der Zusatz von 2 mM Natriumbutyrat das Fluoreszenz-Signal um das etwa 4- bis 8-fach erhöhte.
  • Screening gegenüber Selektion
  • Diese Ergebnisse wurden erhalten durch visuelles Screening von etwa 10.000 Kolonien, und die hellsten 40 Kolonien wurden bei jedem Zyklus herausgepickt. Signifikante Verbesserungen der Proteinfunktion können erhalten werden bei relativ kleinen Zahlen von Varianten. Im Hinblick auf dieses überraschende Ergebnis kann die sexuelle PCR mit hohen Mengen durchsetzenden Screening-Verfahren als verbesserter Prozess für die Optimierung der großen Zahl von im Handel erhältlichen wichtigen Enzymen kombiniert werden, für die Mutanten-Selektionen im großen Maßstab nicht denkbar oder nicht effizient sind.
  • Beispiel 15
  • Shuffling zum Erzeugen verbesserter Peptid-Display Bibliotheken
  • Hintergrund
  • Sobald einmal Rekombinanten aus einer Phagen-Display-Bibliothek, Polysom-Display-Bibliothek oder dergleichen charakterisiert wurden, ist es oft nützlich, eine Bibliothek der zweiten Generation aufzubauen und zu screenen, die Varianten der ursprünglich gezeigten Sequenz(en) zeigt. Da jedoch die Zahl von Kombinationen für Polypeptide, die länger als 7 Reste sind, so groß ist, sind alle Permutationen nicht allgemein in der Primärbibliothek vorhanden. Außerdem kann durch Mutieren der Sequenzen die „Sequenz-Landschaft” um die isolierte Sequenz herum untersucht werden, um lokale Optima aufzufinden.
  • Es gibt einige Verfahren, die dem Experimentator zu Zwecken einer Mutagenese zur Verfügung stehen. Beispielsweise schließen geeignete Verfahren die auf eine bestimmte Stelle gerichtete Mutagenese, die Kassetten-Mutagenese und die fhlerbehaftete PCR ein.
  • Überblick
  • Das offenbarte Verfahren zur Erzeugung von Mutationen in-vitro ist bekannt als „DNS-Shuffling”. In einer Ausführungsform des DNS-Shufflings werden Gene in kleine, statistische Fragmente mit DNaseI zerbrochen und werden dann in einer PCR-ähnlichen Reaktion wieder zusammengebaut, jedoch typischerweise ohne die Verwendung irgendwelcher Primer. Das Verfahren des Zusammenbauens kann in Abwesenheit einer korrigierenden Polymerase mutagen sein, und es erzeugt eine Fehlerrate bis zu etwa 0,7%. Diese Mutationen bestehen sowohl aus Übergängen (transitions) als auch Transversionen, die häufig statistisch über die Länge des neu zusammengebauten Segments verteilt sind.
  • Sobald man einmal eine von einem Phagen gezeigte Rekombinante mit wünschenswerten Eigenschaften isoliert hat, ist es allgemein geeignet, die Bindungseigenschaften im Rahmen einer Runde der molekularen Evolution mittels DNS-Shuffling zu verbessern oder zu verändern. Bibliotheken gezeigter Peptide und Antikörper der zweiten Generation wurden erzeugt, und es wurde ein isolierter Phage mit einer verbesserten (d. h. 3 bis 1000-fach verbesserter) offensichtlicher Bindungsfestigkeit hergestellt. So ist es über wiederholte Runden der Erzeugung einer Bibliothek und Selektion möglich, sich im Sequenz-Raum bis zur optimalen Bindung „hochzuarbeiten”.
  • Aus Bibliotheken der zweiten Generation können sehr häufig Spezies mit stärkerer Bindung isoliert werden. Eine selektive Anreicherung eines derartigen Phagen kann erreicht werden durch Screening mit geringeren Target-Konzentrationen, die auf einer Mikrotiter-Platte oder in Lösung immobilisiert sind, kombiniert mit extensivem Waschen oder durch andere Mittel, die in diesem technischen Bereich bekannt sind. Eine andere Option ist, die mutagenisierte Population von Molekülen mit einer geringeren Valenz auf einem Phagen zu zeigen und so in Richtung auf Moleküle mit höheren Affinitätskonstanten zu selektieren. Letzten Endes ist es möglich, Bibliotheken der zweiten Generation in Gegenwart einer geringen Konzentration eines Bindungsinhibitors (d. h. eines Targets, Ligands) zu screenen, der das effiziente Binden des parentalen Phagen blockiert.
  • Methoden
  • Beispielhafte Mutagenese-Protokolle
  • Eine Form von Mutagenese auf Basis rekombinanter DNS ist bekannt als durch Oligonukleotide vermittelte, auf bestimmte Stellen gerichtete Mutagenese. Ein Oligonukleotid wird so angelegt, daß es sich hinsichtlich der Basenpaarung mit einer Target-DNS kombinieren kann, wobei es in einer oder mehreren Basen nahe des Zentrum des Oligonukleotids unterschiedlich ist. Wenn dieses Oligonukleotid im Rahmen einer Basenpaarung mit der Einzelstrang-Templat-DNS kombiniert wird, wird der Hete roduplex in vitro in eine doppelstängige DNS umgewandelt. Auf diesem Weg trägt ein Strang des Produkts die Nukleotid-Sequenz, die spezifisch für das mutagene Oligonukleotid ist. Diese DNS-Moleküle werden dann in-vivo fortgepflanzt und die gewünschte Rekombinante wird letztlich in der Population von Transformanten identifiziert.
  • Ein Protokoll für eine Einzelstrang-Mutagenese wird nachfolgend beschrieben.
    • 1. Herstellung einer Einzelstrang-DNS aus M13-Phagen oder Phagemiden. Isolieren von 2 μg der DNS. Die DNS kann aus einem bakteriellen dut–ung–-Wirt (Quelle) isoliert werden, so daß die gewonnene DNS Uracil anstelle vieler Thymin-Reste enthält.
    • 2. Entwurf eines Oligonukleotids, das wenigstens 15 oder 20 Komplementaritätsreste mit den codierenden Bereichen aufweist, die die zu mutierende Stelle flankieren. In dem Oligonukleotid kann der zu randomisierende Bereich durch degenerierte Kodons repräsentiert werden. Wenn der nicht-komplementäre Bereich groß ist (d. h. > 12 Nukleotide), sollten die flankierenden Bereiche ausgedehnt werden, um ein sauberes Paaren der Basen sicherzustellen. Das Oligonukleotid sollte mit einer 5'-PO4-Gruppe synthetisiert werden, da dies die Effizienz des Mutagenese-Verfahrens verbessert. Diese Gruppe kann auch enzymatisch mit einer T4-Polynukleotid-Kinase zugesetzt werden. (In einem Eppendorf Röhrchen inkubiert man 100 ng des Oligonukleotids mit 2 Einheiten T4-Polynukleotid-Kinase in 50 mM (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT und Oa mM ATP für 30 min.)
    • 3. Zusammenfügen des Oligonukleotids mit der Einzelstrang-DNS in einem 500 l Eppendorf Röhrchen, das enthält: 1 μg Einzelstrang-DNS, 10 ng Oligonukleotid, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl.
    • 4. Zusammenmischen der Lösungen und Zentrifugieren des Röhrchens für wenige Sekunden zum Sammeln der Flüssigkeit. Erhitzen des Röhrchens in einem Kolben, der Wasser enthält, das auf 70°C aufgeheizt ist; nach 5 min Überführen des Kolbens auf den Labortisch und langsames Abkühlenlassen auf Raumtemperatur.
    • 5. Herausnehmen des Röhrchens aus dem Wasserbad und Einstellen in Eis. Zusetzen der folgenden Reagenzien in das Röhrchen bis auf ein Gesamtvolumen von 100 μl: 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 2 mM DTT, 0,5 mM dATP, dCTP; dGTP und dTTP, 0,4 mM ATP, 1 Einheit T7-DNS-Polymerase, 2 Einheiten T4-DNS-Ligase.
    • 6. Nach 1 Stunde Zusatz von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 10 mM.
    • 7. Entnehmen von 20 μl der Probe und Laufenlassen auf einem Agarosegel. Die überwiegende Menge der einzelsträngigen DNS sollte in kovalent geschlossene kreisförmige DNS umgewandelt sein. Elektrophorese einiger Kontrollproben in benachbarten Spuren (d. h. Templat, Templat-Reaktion ohne Oligonukleotid). Zugabe von T4-DNS-Ligase, um die doppelsträngige kreisförmige DNS zu schließen.
    • 8. Extrahieren des Restes der DNS (80 μl) durch Phenol-Extraktion und Gewinnen durch Ethanol-Fällung.
    • 9. Elektroporieren in ung+-Bakterien.
    • 10. Gewinnen des Phagen der zweiten Generation durch PEG-Fällung.
  • Kassetten-Mutagenese
  • Ein einfaches Mittel zum Einführen von Mutationen an einer speziellen Stelle innerhalb eines codierenden Bereichs erfolgt durch Kassetten-Mutagenese. Die „Kassette” kann erzeugt werden auf einigen verschiedenen Wegen: A) durch Zusammenfügen von 2 Oligonukleotiden und deren Umwandlung in eine doppelsträngige DNS; B) durch Amplifizieren von DNS-Segmenten mit Oligonukleotiden, die randomisierte Sequenzen tragen, in einem ersten Schritt und anschließendes Reamplifizieren der DNS zur Schaffung der Kassette für das Klonen; C) durch Amplifizieren jeder Hälfte des DNS-Segments mit Oligonukleotiden, die randomisierte Sequenzen tragen, in einem ersten Schritt und anschließendes gemeinsames Erhitzen der beiden Stücke unter Schaffung der Kassette für das Klonen; und D) durch fehlerbehaftete PCR. Die durch diese vier Verfahrensweisen gebildeten Kassetten sind hinsichtlich ihrer Länge und des Leserahmens fixiert, weisen jedoch Kodons auf, die bei einer niedrigen Frequenz unspezifisch sind. So erzeugt ein Klonen und eine Expression der Kassetten eine Vielzahl von Peptiden oder Proteinen, die einen oder mehrere Mutanten-Rest(e) im Bereich der gesamten Länge der Kassette aufweisen.
  • Typischerweise können 2 Arten der Mutagenese angewendet werden. Zum einen können bestimmte Reste in einem auf einem Phagen gezeigten Protein oder Peptid komplett randomisiert werden. Die Kodons an diesen Stellen können NNN, NNK oder NNS sein, die Gebrauch von 32 Kodons machen, um alle 20 Reste zu codieren. Sie können auch in Form vorgeformter Triplets oder dadurch synthetisiert werden, daß man Oligonukleotide mischt, die nach dem Split-Harz-Verfahren synthetisiert wurden, die alle 20 Kodons an jeder gewünschten Position abdecken. Im Gegensatz dazu kann ein Untersatz Kodons verwendet werden, um bestimmte Aminosäuren zu favorisieren und andere auszuschließen. Zum zweiten können alle Kodons der Kassette eine recht geringe Wahrscheinlichkeit haben, mutiert zu werden. Dies wird erreicht durch synthetisierte Oligonukleotide mit Flaschen, die mit den anderen 3 Basen „gespiked” sind, oder durch Ändern des Verhältnisses der im Rahmen des Split-Harz-Verfahrens zusammengemischten Oligonukleotide.
  • Zur Mutagenese kurzer Bereiche wird die Kassetten-Mutagenese mit synthetischem Oligonukleotid allgemein bevorzugt. Mehr als eine Kassette gleichzeitig kann verwendet werden, um verschiedene Bereiche gleichzeitig zu verändern. Dieser Ansatz wird bevorzugt, wenn man eine Bibliothek von Mutanten-Antikörpern schafft, in der alle 6 Komplementarität bestimmenden Bereiche (complementarity determining regions; CDR) gleichzeitig verändert werden.
  • Statistische Kodons
    • 1. Schaffen von Oligonukleotiden mit sowohl fixierten als auch mutierten Positionen. Die fixierten Positionen sollten den Klonierungsstellen und denjenigen codierenden Bereichen entsprechen, von denen angenommen wird, daß sie essentiell für eine Bindung oder eine Funktion sind.
    • 2. Während der Synthese der Oligonukleotide sollte die die Oligonukleotide synthetisierende Vorrichtung equimolare Mengen jeder Base für N, Guanosin und Cytosin für K und Guanosin und Thymidin für S liefern.
  • „Gespikete” Kodons
    • 1. Entwurf von Oligonukleotiden mit sowohl fixierten als auch mutierten Positionen. Die fixierten Positionen sollten den Klonierungsstellen und solchen codierenden Bereichen entsprechen, von denen angenommen wird, daß sie für eine Bindung oder eine Funktion essentiell sind. Die Wahrscheinlichkeit des Auffindens von n Fehlern in einer Polynukleotid-Kassette der Länge m, die mit x Fraktionen der anderen drei Nukleotide an jeder Position synthetisiert wurde, wird wiedergegeben durch die Gleichung: P = [m!/(m – n)n!][xn][1 – x]m-n
    • 2. Während der Synthese des Oligonukleotids werden die Basen-Flaschen ausgeschaltet. Es werden Flaschen mit 100% jeder Base für die fixierten Positionen und eine Flasche mit 100 – x% einer Base und x/3% jeder der anderen 3 Basen verwendet. Das Dotierungsverhältnis kann auch auf der Grundlage des mittleren Aminosäure-Gebrauchs in natürlichen globulären Proteinen oder auf der Grundlage anderer Algorithmen unterschiedlich sein. Es gibt ein im Handel erhältliches Computerprogramm (CyberDope), das dazu verwendet werden kann, bei der Bestimmung der Basenmischungen zum Synthetisieren von Oligonukleotiden unter speziellen Dotierungs-Schemen Hilfestellung zu leisten. Eine Demonstrationskopie des CyberDope-Programms kann erhalten werden durch Sendung einer E-Mail-Anforderung an Cyberpope@aol.com.
  • Gerichtete Kodons
    • 1. Aufbau von Oligonukleotiden mit sowohl fixierten als auch mutierten Positionen. Die fixierten Positionen sollten den Klonierungsstellen und denjenigen Codierungsbereichen entsprechen, von denen angenommen wird, daß sie für ein Binden oder eine Funktion essentiell sind. Ein Verfahren wurde zum Einsetzen eines Satzes von Oligonukleotiden an einer speziellen Restriktionsenzym-Stelle beschrieben, die für alle 20 Aminosäuren codiert (Kegler-Ebo et al. (1994), Nucl. Acids res. 22, 1593; diese Druckschrift wird durch die In-Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung übernommen).
    • 2. Während der Synthese des Oligonukleotids wird das Harz bei jedem Kodon gespalten.
  • Fehlerbehaftete PCR
  • Es gibt einige Protokolle, die basieren auf wechselnden Standard-PCR-Bedingungen (Saiki et al. (1988) Science 239, 487; diese Druckschrift wird durch die In-Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung übernommen), um dadurch das Mutationsniveau während der Amplifikation anzuheben. Die Zugabe von erhöhten dNTP-Konzentrationen und/oder die Zugabe von Mn+2 erhöhen die Mutationsrate signifikant. Da die Mutationen theoretisch in statistischer Weise eingeführt werden, ist dies ein Mechanismus zum Erzeugen von Populationen neuer Proteine. Andererseits ist die fehlerbehaftete PCR nicht sehr gut geeignet zum Ändern kurzer Peptidsequenzen, da die codierenden Bereiche kurz sind und die Änderungsrate zu niedrig sein kann, um eine adäquate Zahl von Mutanten für eine Selektion zu erzeugen. Genauso wenig ist sie ideal für lange Proteine, da es viele Mutationen innerhalb des codierenden Bereichs gibt, was eine Analyse kompliziert macht.
    • 1. Entwurf von Oligonukleotid-Primern, die den codierenden Bereich von Interesse in dem Phagen flankieren. Diese weisen oft eine Länge von etwa 21 Nukleotiden auf und flankieren den zu mutagenisierenden Bereich. Das zu amplifizierende Fragment kann Restriktionsstellen tragen, um ein leichtes Unterklonieren in den geeigneten Vektor zu erlauben.
    • 2. Die folgendende Reaktion wird durchgeführt: 1 pMol jedes Primers, 1 pMol des DNS-Templats, 100 mM NaCl, 1 mM MnCl2, 1 mM DTT, 0,2 mM jeder dNTP; 2 Einheiten Taq-DNS-Polymerase.
    • 3. Die Flüssigkeit wird mit Mineralöl bedeckt.
    • 4. Zum Amplifizieren der Fragmente bis hinauf zu einer Größe von 1 kb werden 24 Zyklen mit den Bedingungen [30 s bei 94°C, 30 s bei 45°C und 30 s bei 72°C] gefahren. Für längere Fragmente wird der Schritt bei 72°C um etwa 30 s für jede kb verlängert.
    • 5. Erstrecken der PCR Reaktion für 5–10 min bei 72°C zur Erhöhung der Fraktion von Molekülen, die ihre volle Länge aufweisen. Dies ist wichtig, wenn die Fragment-Termini Restriktionsstellen enthalten, die später beim Subcloning verwendet werden.
    • 6. Die PCR-Reaktion wird gegebenenfalls durch Gel-Elektrophorese überwacht.
    • 7. Das PCR-Produkt wird mit dem/den passenden Restriktionsenzym(en) verdaut, um „stickt” ends” zu erzeugen. Die Restriktionsfragmente können mittels eines Gels gereinigt werden.
    • 8. Das DNS-Fragment wird in einem geeigneten Vektor durch Ligation einldoniert und in Wirtszellen eingeführt.
  • DNS-Shuffling
  • Beim DNS-Shuffling werden Gene in kleine, statistische Fragmente zerbrochen, und zwar mit einem die Phosphordiester-Bindung auflösenden Mittel wie beispielweise DNaseI, und werden dann in einer PCR-ähnlichen Reaktion wieder zusammengebaut, jedoch ohne das Erfordernis des Zusatzes irgendeines Primers. Der Prozess des Zusammenbauens kann in Abwesenheit einer korrigierenden Polymerase mutagen sein, was bis zu etwa 0,7% Fehler erzeugt, wenn Fragmente einer Länge von 10 bis 50 bp verwendet werden.
    • 1. Das einem Shuffling-Prozess zu unterwerfende Fragment wird mit PCR amplifiziert. Oft ist es brauchbar, die PCR über eine Bakterienkolonie oder ein Plaque durchzuführen. Die Kolonie oder der Plaque werden mit einem sterilen Zahnstocher berührt, und eine PCR-Reaktionsmischung wird eingerührt (Puffer, Deoxinukleotide, Oligonukleotid-Primer). Der Zahnstocher wird entfernt, und die Reaktion wird über 10 min bei 99°C vorangetrieben. Die Reaktionsmischung wird auf 72°C abgekühlt, es werden 1 bis 2 Einheiten Taq-DNS-Polymerase zugesetzt, und die Reaktion wird 35 mal im Zyklus geführt bei den Bedingungen [30 s bei 94°C, 30 s bei 45°C, 30 s bei 72°C]. Am Ende wird die Probe für 5 min auf 72°C erhitzt. (Die angegebenen Bedingungen gelten für ein Gen von einer Größe von 1 kb und werden entsprechend der Länge der Sequenz modifiziert, wie dies oben beschrieben wurde).
    • 2. Die freien Primer werden entfernt. Das vollständige Entfernen des Primers ist wichtig.
    • 3. Etwa 2 bis 4 μg der DNS wird mit 0,15 Einheiten DNaseI (Sigma, St. Lous, MO) in 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM MgCl2, für die Zeit von 5 bis 10 min bei Raumtemperatur fragmentiert. Die Mischung wird auf Trockeneis eingefroren, und die Bereiche der Größe der Fragmente werden auf einem 2% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt oder einem Äquivalent untersucht. Gegebenenfalls wird die Mischung wieder aufgetaut, um die Verdauung fortzusetzen, bis ein gewünschter Größenbereich erreicht ist. Der gewünschte Größenbereich hängt von der Anwendung an; zum Shuffling eines Gens mit einer Größe von 1 kb sind Fragmente mit 100–300 Basen normalerweise passend.
    • 4. Das DNS-Fragment des gewünschten Größenbereichs wird auf einem Gel (2% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt oder Äquivalent) gereinigt. Ein bevorzugtes Verfahren ist, ein kleines Stück eines Whatman-DE-81-Ionenaustauschpapiers genau an der Front der DNS einzusetzen, die DNS in das Papier laufen zu lassen, das Papier in 0,5 ml einer 1,2 M NaCl in TE hineinzutun, das ganze 30 s intensiv zu rühren, danach das gesamte Papier herauszufischen, den Überstand zu übertragen und 2 Volumenteile 100% Ethanol zuzusetzen, um die DNS auszufällen. Ein Kühlen der Probe sollte nicht erforderlich sein. Das DNS-Pellet wird anschließend mit 70% Ethanol gewaschen, um Spuren von Salz zu entfernen.
    • 5. Das DNS-Pellet wird in einem PTA-Mix (Promega, Madison, WI) in einer Konzentration von etwa 10 bis 30 ng Fragmenten pro μl des PCR-Mix (typischerweise 100 bis 600 ng pro 10 bis 20 μl PCR-Reaktionsmischung) resuspendiert. Der Mix enthielt 0,2 mM jeder dNTP, 2,2 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100. Primer müssen nicht notwendigerweise in dieser PCR-Reaktion zugesetzt werden. Taq-DNS-Polymerase (Promega, Madison, WI) allein kann verwendet werden, wenn eine wesentliche Mutagenese-Rate erwünscht ist (bis zu 0,7% bei DNS-Fragmenten einer Größe von 10 bis 50 pb). Es wird erwartet, daß der Einschluß einer Korrektur-Polymerase (wie beispielsweise eine 1:30-Mischung (Volumen/Volumen) von Taq- und Pfu-DNS-Polymerase (Stratagene, San Diego, CA) zu einer niedrigeren Fehlerrate führt und die PCR sehr lange Sequenzen ermöglicht. Ein Programm aus 30 bis 45 Zyklen bei Bedingungen von [30 s bei 94°C, 30 s bei 45 bis 50°C, 30 s bei 72°C, Halten bei 4°C] wird in einem Minicycler der Firma MJ Research (Cambridge, MA), Typ PTC 150, durchgeführt. Der Fortschritt des Zusammenbauens kann durch Gelanalyse überprüft werden. Das PCR-Produkt enthält an diesem Punkt das Produkt korrekter Größe in einer Verschmierung mit Produkten größerer und kleinerer Größen.
    • 6. Das korrekt zusammengebaute Produkt dieser ersten PCR wird in einer zweiten PCR-Reaktion amplifiziert, die Außen-Primer enthält. Aliquote Teile von 7,5 μl der PCR-Zusammenbau-Mischung werden 40-fach mit einem PCR-Mix verdünnt, der 0,8 pM jedes Primers enthält. Ein PCR-Programm für 20 Zyklen bei Bedingungen von [30 s bei 94°C, 30 s bei 50°C und 30–45 s bei 72°C] wird durchgeführt, wobei die Endbehandlung über 5 min bei 72°C lief.
    • 7. Das gewünschte PCR-Produkt wird dann mit einem terminalen Restriktionsenzym verdaut, auf einem Gel gereinigt und in einen Vektor zurückgeklont, der häufig in eine Wirtszelle eingeführt wird.
  • Eine auf die jeweilige Stelle im Enzym spezifische Rekombination kann ebenfalls angewendet werden, beispielsweise um schwere und leichte Antikörper-Ketten innerhalb infizierter Bakterienzellen zu Shuffeln, und zwar als Mittel zur Erhöhung der Bindungsaffinität und Spezifität von Antikörper-Molekülen. Es ist möglich, daß Cre/lox-System anzuwenden (Waterhouse et al. (1993), Nucl. Acids Res. 21, 2265; Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13, 3245) und auch das int-System zu verwenden.
  • Es ist möglich, Rekombionanten zu nehmen und sie zusammen zu shuffeln, um vorteilhafte Mutationen zu kombinieren, die auf verschiedenen DNS-Molekülen auftreten, und es ist auch möglich, ein von einer Rekombinante gezeigtes Insert zu nehmen und dieses mit parentalen Sequenzen durch DNS-Shuffling „rückzukreuzen” , um Mutationen zu entfernen, die nicht zu den gewünschten Merkmalen beitragen.
  • Beispiel 16
  • Shuffling zum Erzeugen von Bakterien zur verbesserten Arsenat-Detoxifikation
  • Eine Arsenat-Detoxifikation ist wichtig im Goldbergbau von Arsenopyrit-haltigen Golderzen und andere Verwendungen wie beispielsweise die Beseitigung von Umweltschäden. Das Plasmid pGJ103, das ein Operon enthält, das für das Arsenat-Detoxifikationsoperon codiert (Wang et al. (1989), Bacteriol. 171, 83), wurde erhalten von Professor Simon Silver (University of Illinois, Chicago, IL). E. coli TG1, das pJH103 enthielt, das das p1258-ars-Operon in puC19 geklont enthielt, hatte eine MIC (minimale Inhibitor-Konzentration) von 4 g/ml auf LB amp-Platten. Das gesamte 5,5 kb lange Plasmid wurde mit DNaseI in Fragmente einer Größe von 100 bis 1000 bp fragmentiert und mittels PCR unter Verwendung der Perkin Elmer-XL-PCR-Reagentien wieder zusammengebaut. Nach dem Zusammenbau wurde das Plasmid mit dem speziellen Restriktionsenzym BamHI verdaut. Das Monomer voller Länge wurde von einem Agarosegel gereinigt, gebunden und in E. coli-TG1-Zellen elektroporiert. Die transformierten Zellen wurden auf Platten mit einem Bereich von Natriumarsenat-Konzentrationen (2, 4, 8, 16 mM in Runde 1) plattiert und etwa 1000 Kolonien von den Platten mit den höchsten Arsenat-Konzentrationen wurden in der Weise gepoolt, daß man sie von den Platten kratzte. Man ließ die Zellen in Flüssigkeit in derselben Konzentration von Arsenat wachsen, und ein Plasmid wurde aus dieser Kultur hergestellt. Die Runden 2 und 3 waren identisch mit der Runde 1, mit der Ausnahme, daß die Zellen auf Platten mit höheren Konzentrationen an Arsenat aufgetragen wurden, 8, 16, 32 und 64 mM wurden in Runde 2 verwendet, und 32, 64, 128, 246 mM wurden zur Selektion in Runde 3 verwendet.
  • Die besten Mutanten wuchsen über Nacht bei bis zu 128 mM Arsenat (MIC=256), was eine 64-fache Verbesserung darstellt. Einer der verbesserten Stämme zeigte, daß der TG1 (Wild-Typ PGGJ103) in Flüssigkeit bei bis zu 10 mM wuchs, während das geshuffelte TG1 (Mutante pGJ103) bei einer Arsenat-Konzentration bis zu 150 mM hinauf wuchs.
  • Das PCR-Programm für den Zusammenbau wurde durchgeführt bei den Bedingungen [94°C für 20 s, 50× (94°C für 15 s, 50°C für 1 min, 72°C für 30 s + 2 s pro Zyklus), wofür man ein kreisförmiges PCR-Format ohne Primer verwendete.
  • Vier Zyklen des Verfahrens führten zu einer 50- bis 100-fachen Verbesserung der Resistenz gegenüber Arsenat, die durch das geshuffelte Arsenat-Resistenz-Operon verliehen wird. Bakterien, die das verbesserte Operon enthielten, wuchsen auf Medium, das bis zu 500 mM Arsenat enthielt.
  • 19 zeigt die Verbesserung der Resistenz gegenüber Arsenat-Toxizität als Ergebnis des Shufflings des pGJ103-Plasmids, das das Arsenat-Detoxifikationsweg-Operon enthielt.
  • Beispiel 17
  • Shuffling zur Erzeugung von Bakterien mit verbesserter Cadmium-Detoxifikation
  • Das Plasmid pYW333, das ein Operon zur Quecksilber-Detoxifikation enthält, ist ein Plasmid mit 15,5 kb Größe, das wenigstens 8 Gene enthält, die für einen Weg zur Quecksilber-Detoxifikation codieren (Wang et al. (1989), Bacteriol. 171, 83). Dieses wurde erhalten von Professor Simon Silver, University of Illinois, Chicago, IL. Fragmente mit 400 bis 1500 bp wurden erhalten bei einem wie oben beschriebenen Vorgehen und wurden mit den XL-PCR-Reagenzien zusammengegeben. Nach direkter Elektroporation der zusammengebauten DNS in E. coli TG1 wurden die Zellen auf Platten mit einem Bereich von Konzentrationen an Quecksilberchlorid (Sigma) aufgetragen, und zwar im Rahmen eines ähnlichen Protokolls wie desjenigen, das in Beispiel 15 für Arsenat beschrieben wurde. Die anfängliche MIC von Quecksilber betrug 50 bis 70 μM. Vier Zyklen des Vollplasmid-Shufflings wurden durchgeführt und verbesserten die Detoxifikation, die gemessen wurde als Resistenz der Bakterien gegenüber Quecksilber, von etwa 50 bis 70 μM. bis auf über 1.000 μM, was eine 15- bis 20-fache Verbesserung darstellt.
  • Beispiel 18
  • Verbesserung der Shuffling-Reaktionen durch Zusatz kationischer Detergentien
  • Die Rate der Renaturierung komplementärer DNS-Stränge wird beschränkend für das Shuffling langer, komplexer Sequenzen. Diese Renaturierungsrate kann um das 10.000-fache erhöht werden durch Zusatz eines einfachen kationischen Detergens (Potius und Berg (1991), PNAS 88, 8237). Die Renaturierung ist spezifisch und unabhängig von einem bis zu 106-fachen Überschuß heterologer DNS. In Gegenwart dieser Mittel wird die Rate, mit der sich komplementäre DNS-Stränge in Lösung treffen, ein begrenzender Faktor.
  • Die Zugabe von TMAC zu einer Zusammenbau-Reaktion eines 15 kb großen Plasmids und anschließende Elektroporation in E. coli führte zu den folgenden Ergebnissen:
    TMAC (mM) # Kolonien
    0 3
    15 88
    30 301
    60 15
    90 3
  • Die Zugabe von CTAB zu einer Zusammenbau-Reaktion eines 15 kb großen Plasmids und anschließende Elektroporation in E. coli führte zu den folgenden Ergebnissen:
    CTAB (mM) # Kolonien
    0 3
    30 34
    100 14
    300 0
  • Beispiel 19
  • Sequenz-Shuffling über PCR-Stuttering
  • Das „Stuttering” ist eine Fragmentierung durch unvollständige Polymerase-Extension von Templaten. Ein Rekombinationsformat auf der Basis sehr kurzer PCR-Extensionszeiten wurde angewendet, um partielle PCR-Produkte zu schaffen, die sich weiter von einem verschiedenen Templat zum nächsten (und weiter darauf folgenden) Zyklus/Zyklen ausdehnen. Es gab einen sehr starken Wachstumsgeschwindigkeits-Zwang bei sehr ähnlichen Templaten, was zeigt, daß dieses Format signifikante Beschränkungen für die Anwendung auf komplexe Pools hat. Wenn dieses Format mit einer schnellen Zyklisiervorrichtung wie beispielsweise einem Aircycler verwendet wird, kann es zu besseren Ergebnissen führen.
  • PCR-Programme, wie sie für das PCR-Stuttering verwendet wurden, waren 100 Zyklen bei den Bedingungen [94°C für 15 s, 60°C für 15 s]. Zwei getrennte PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um 1 kb-PCR-Fragmente zu erhalten, die jeweils die beiden Substrate für einen negativen GFP-Rekombinationsassay enthielten (GFPstop1 und GFPstop2). GFP-positive Rekombinanten können nur erhalten werden durch Rekombination dieser beiden Template. Die an dem 5'-Ende verwendeten Primer waren 5'-TAGCGGATCCTACCTACCTGACGC, der eine NheI-Stelle enthielt, und das Oligonukleotid am 3' Ende war 5'-GAAAATCTTCTCTCATCC, das eine EcoRI-Stelle enthielt. Eine PCR-Reaktion wurde gestartet mit einer 1 ng-Menge jedes bezüglich GFP-negativen Gens als Templat. Taq-PCR-Reagenzien können verwendet werden, jedoch kann die Anwendung von Bedingungen der fehlerbehafteten PCR (Leung, 1989; Cadwell und Joyce, 1992), die die Verarbeitbarkeit verschlechtern, die Prozentmenge an GFP-positiven Rekombinaten erhöhen. Ein Stuttering-Programm von 50 bis 150 Zyklen bei den Bedingungen [94°C für 10 bis 20 s, 60°C für 10 bis 30 s] wurde auf einem Stratogene-Robocycler angewendet. Das gestutterte PCR-Produkt wurde mit NheI und EcoRI verdaut und in einen pBAD-Vektor zurückgeklont, der mit NheI und EcoRI verdaut wurde und anschließend in E. coli elektroporiert wurde und auf amp-Platten aufgetragen wurde. GFP-positive Kolonien entstanden durch Rekombination zwischen den beiden GFP-negativen DNS-Sequenzen und wurden nachgewiesen. Der Prozentsatz an gegenüber GFP-positiven Kolonien, die durch das Stuttern erhalten wurden, lag zwischen 0,1 und 10%, abhängig von den Bedingungen.
  • Es synthetisches Gen wurde für jedes Protein entworfen, wobei man Gebrauch von dem identischen (optimalerweise E. coli-)Kodon machte, und zwar auf der Basis der nativen Aminsäure-Sequenz. Dieser Ansatz erhöht die DNS-Homologie der synthetischen Gene, bezogen auf die natürlich vorkommenden Gene, und ermöglicht es, noch weiter entfernt verwandte Sequenz zu shuffeln, als dies ohne die Einstellung des Kodon-Gebrauchs möglich wäre. Jedes der vier Gene wurde aus 30 60-mer Oligonukleotiden und 6 40-mer Oligonukleotiden zusammengebaut. Der Zusammenbau wurde im Rahmen einer Zusammenbau-PCR durchgeführt, wie dies beschrieben wurde von Stemmer et al. (1995, Gene 164: 49–53). Nach dem Zusammenbau wurden die Gene in Sfi1-Stellen auf dem Vektor pUC322Sfi-Bla-Sfi einkloniert (Stemmer et al. (1995, Gene 164: 49–53), und die Produkte wurden auf Platten mit selektivem Medium aufgetragen. Die minimale Inhibitor-Aktivität dieser vier Konstrukte für eine große Zahl von Beta-Lactam-Antibiotika wurde festgestellt. Cefotaxim war eines der Antibiotika, die für eine Gegen-Optimierung ausgewählt wurden. Die vier Gene wurden in der Weise geshuffelt, daß man 1 μg des CR-Produktes jedes Gens poolte. Diesem Schritt folgte eine DNaseI-Verdauung des Pools und Reinigung von Fragmenten einer Größe von 100 bis 300 bp von Agarosegelen. Die gereinigten Fragmente wurden durch sexuelle PCR, anfänglich ohne Außen-Primer, wieder zusammengebaut, und anschließend wurde das Produkt voller Länge in Gegenwart der Außen-Primer amplifiziert. Die resultierenden Gene voller Länge wurden mit SfiI verdaut und in einen frischen pUC322Sfi-Sfi-Vektor eingebunden und in frische E. coli-Zellen elektroporiert. Anschließend wurden die Produkte auf Platten mit einer steigenden Konzentration verschiedener Antibiotika, einschließlich Cefotaxim, aufgetragen, wie dies vorher beschrieben wurde von Stemmer (1994), Nature 370: 389–391.
  • Ein manuelles Shuffling-PCR-Protokoll ist bevorzugt für das Mischen von Genen, die weniger als 80 bis 90% homolog sind. Die manuelle PCR macht Gebrauch von einer hitzelabilen DNS-Polymerase, wie beispielsweise dem DNS-poll-Klenow-Fragment. Das anfängliche PCR-Programm mit Fragmenten in Klenow-Puffer bei 10 bis 30 ng/μl und dNTPs war:
    • (1) Denaturieren bei 94°C für 20 s;
    • (2) Schnelles Abkühlen: Trockeneis/Ethanol 55, Eis 15 s;
    • (3) Zusatz von Klenow-Enzymen;
    • (4) Zusammenfügen/Ausdehnen für die Zeit von 2 min bei 25°C;
    • (5) Zyklus zurück zum Denaturieren (Zyklus 1).
  • Diese Schritte wurden für 10 bis 20 Zyklen wiederholt und so das Templat-Switching initiiert, wonach eine reguläre PCR mit hitzestabilen Polymerasen für weitere 10 bis 20 Zyklen durchgeführt wird, um die Menge an Produkten zu amplifizieren.
  • Beispiel 20
  • Shuffling von Antikörper-Phagen-Display-Bibliotheken
  • Ein stabiles und exprimiertes Human-Einzelketten-Fv-Rahmenwerk (VH251-VLA25) wurde erhalten von einer Ab-Phagen-Bibliothek, die aufgebaut worden war aus nativer Human-mRNS durch Selektion zum Binden an Diphtherie-Toxin. Dieses scFv-Rahmenwerk wurde verwendet im Aufbau einer naiven Ab-Phagen-Bibliothek, die sechs synthetisch mutierte CDRs enthielt, und zwar auf der Basis von Zellinien-Sequenzen. Der Grad der Mutagenese jedes Restes war ähnlich dem seiner natürlich vorkommenden Variabilität innerhalb der V-Bereich-Familie.
  • Ein PCR-Produkt, das das scFv-Gen enthielt, wurde statistisch durch DNaseI-Verdauung fragmentiert, und Fragmente einer Länge von 50 bis 100 bp wurden gereinigt. Synthetische Oligonukleotide, von denen jedes eine mutierte CDR enthielt, die von 19 bp Homologie zu dem scFv-Templat flankiert war, wurden den statistischen Fragmenten in einem Molverhältnis von 10:1 zugesetzt. Eine Bibliothek von Genen voller Länge mit mutiertem scFV wurde aus den Fragmenten durch sexuelle PCR aufgebaut. Ein Klonieren in das pm-Protein des M13-Phagen führte zu einer Ab-Phagen-Bibliothek mit 4 × 107 plaquebildenden Einheiten. Die Kombinationen von Mutanten und nativen CDRs wurden charakterisiert durch Kolonie-PCR mit Primern, die spezifisch für die nativen CDRs waren (siehe 7). Alle sechs mutierten CDRs wurden mit einer Effizienz von 32 bis 65% eingebaut und führten zu einer großen Vielzahl von Kombinationen. Ein Sequenzieren der CDRs zeigte, daß die beobachtete Mutationsrate mit der erwartenen Mutationsrate gut zusammenpaßte.
  • Diese Ab-Phagen-Bibliothek wurde für zwei Runden in Mikrotiter-Platten zum Binden an zehn Humanprotein-Targets geschüttelt, und sieben dieser Targets ergaben ELISA-positive Klone. Ein Target, das zu positiven Klonen führte, war der Human-G-CSF-Rezeptor. Die in Bezug auf den G-CSF-Rezeptor positiven Klone wurden einer zweiten Runde unterzogen, und ein Viertel der Phagenklone der zweiten Runde waren ELISA-positiv in Bezug auf die Bindung an den G-CSF-Rezeptor.
  • Dieser ungleiche Pool wurde verwendet zur Bewertung der Brauchbarkeit dreier verschiedener Sequenz-Optimierungsstrategien (herkömmliche PCR; fehlerbehaftete PCR und DNA-Shuffling). Nach einem einzigen Zyklus jeder dieser drei Alternativen zeigte das DNA-Shuffling-Verfahren einen siebenfachen Vorteil, und zwar sowohl hinsichtlich der Prozentmenge an gewonnenen Ab-Phagen als auch bezüglich des für den G-CSF-Rezeptor spezifischen ELISA-Signals. Das Schütteln wurde für sechs weitere Zyklen fortgesetzt, wobei man den Pool an scFv-Genen nach jeder Runde shuffelte. Die Stringenz der Selektion wurde schrittweise erhöht bis zu zwei über 1 Stunde laufende Waschvorgänge bei 50°C in PBS/Tween in Gegenwart eines Überschusses des löslichen G-CSF-Rezeptors. In den Runden 3 bis 8 waren nahezu 100 der Klone ELISA-positiv. Wenn Pools aus verschiedenen Zyklen bei identischer Stringenz getestet wurden, stieg die Prozentmenge an gebundenem Phagen um das 440-fache von Zyklus 2 bis zu Zyklus 8, wie in 31 gezeigt ist. Einzelne Phagen-Klone aus jeder Runde zeigten einen ähnlichen Anstieg des speziellen ELISA-Signals. Ein Sequenzieren zeigte, daß der scFv ein Mittel von 34 (n = 4) Aminosäure-Mutationen enthielt, von denen nur vier in allen bewerteten Sequenzen zugegen waren.
  • Um die potentielle Immunogenizität zu reduzieren, wurden neutrale oder nur schwach beitragende Mutationen durch zwei Zyklen des Rückkreuzen entfernt, und zwar bei einem 40-fachen Überschuß eines synthetisch aufgebauten Zellinien-scFv-Gen, ge folgt von stringentem Schütteln. Die mittlere Zahl von Aminosäure-Mutationen in den rückgekreuzten scFvs wurden nahezu halbiert auf 18 (n = 3), von denen nur vier in allen Sequenzen zugegen waren. Es wurde gezeigt, daß die rückgekreuzten Ab-Phagen-Klone sich stark und mit ausgezeichneter Spezifität an den Human-GCSF-Rezeptor binden. 32 zeigt die Wirkung von zehn Selektionsrunden für einige Humanprotein-Targets. Sechs Runden des Shufflings und zwei Runden des Rückkreuzens wurden durchgeführt. 33 zeigt die relativen Gewinnungsraten von Phagen durch Schütteln mit BSA, Ab 179 oder G-CSF-Rezeptor nach herkömmlicher PCR („nicht-geshuffelt”), fehlerbehaftete PCR oder rekursiver Sequenz-Rekombination („geshuffelt”).
  • Beispiel 21
  • Optimierung von GFP in Säugerzellen
  • Der Plasmid-Vektor pCMV-GFP, der für GFP codiert und dieses unter der Kontrolle eines CMV-Promoters exprimiert, wurde in TG1-Zellen gezüchtet und zum Transfektieren von CHO-Zellen für vorübergehende Expressions-Tests verwendet.
  • Plasmid wurde gewonnen aus über FACS selektierten, vorübergehend exprimierenden TG1-Zellen, und zwar durch ein Proteinase-K-Verfahren oder ein PreTaq-Verfahren (Gibco/BRL). Grundsätzlich wurden die über FACS gesammelten Zellen durch Zentrifugation pelletiert, wiederholt eingefroren und aufgetaut, entweder mit Proteinase K oder mit PreTaq inkubiert, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und zum Transformieren von E. coli verwendet, die dann auf Amp enthaltenden Platten aufgetragen wurden. Die Ergebnisse waren:
    Proteinase-K-Verfahren: Input –5 × 104; gewonnen 3 × 104
    PreTaq-Verfahren: Input 5 × 104; gewonnen 2 × 104
  • Das gewonnene Plasmid wurde gezüchtet, und 5 μg wurden partiell mit DNaseI verdaut, und Fragmente einer Größe zwischen 50 und 700 bp wurden mit einem Gel gereinigt, mit Ethanol gefällt und in 330 μl eines Puffers mit der folgenden Zusammensetzung resuspendiert: 330 μl 3,3-facher PCR-Puffer, 44 μl Mg(OAc)2 (Perkin-Elmer), 193 μl 40% PEG, 80 μl 10 mM dNTPs, 20 μl Tth-Polymerase, 2 μl Pfu-Polymerase, 7 μl TMAC (Sigma) und 367 μl H2O. Eine PCR wurde durchgeführt in einem Minicycler der Firma MH Research (Bezeichnung PTC-150), und zwar für 40 Zyklen bei (94°C für 30 s, 50°C für 30 s, 72°C für 60 s) mit drei Sätzen von Primern, die zu drei an den Enden überlappenden PCR-Fragmenten führten, die zusammen und nach Verdauen und Einbinden das gesamte Plasmid aufbauten. Die PCR-Fragmente wurden mit AlwN1 verdaut, und die Fragmente wurden auf einem Gel gereinigt, gebunden und in TG1-Zellen elektroporiert. Eine Plasmid-DNS wurde hergestellt und in CHO-Zellen elektroporiert. Diese wurden mittels FACS gescreent auf die Zellen, die vorübergehend die hellsten GFP-Signale exprimierten.
  • Literaturverzeichnis
  • Die folgenden Literaturstellen werden in dieser Beschreibung im jeweils relevanten Abschnitt der Beschreibung zitiert:
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Claims (11)

  1. Verfahren zur Entwicklung eines varianten Polynukleotids zur Aneignung einer gewünschten funktionellen Eigenschaft, umfassend, dass man eine Amplifikationsreaktion von Polynukleotiden mit Ausgangssubstraten durchführt, welche eine Vielzahl von Varianten eines Polynukleotids umfassen, worin zumindest ein Zyklus der Amplifikationsreaktion ein unvollständiger Amplifikationszyklus ist, der unter Bedingungen ausgeführt wird, welche zumindest 20% Amplifikationsprodukte erzeugen, die unvollständig verlängerte Varianten des Polynukleotids umfassen, die Amplifikationsprodukte in die Bestandteil-Stränge denaturiert, welche in unterschiedlichen Paarungen wieder aneinandergelagert werden, um rekombinierte Amplifikationsprodukte zu bilden, welche die Substrate für einen nachfolgenden Amplifikationszyklus bilden, bis die Amplifikationsprodukte rekombinante Varianten des Polynukleotids, die Mehrfach-Cross-Overs aufweisen, beinhalten; und die rekombinanten Varianten des Polynukleotids selektiert oder screent, um zumindest eine rekombinante Variante zu identifizieren, welche eine gewünschte funktionelle Eigenschaft aufweist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bedingungen, die in einer unvollständigen Verlängerung resultieren, durch Verkürzen der Zeit der Verlängerung im Amplifikationsprozess relativ zu Amplifikationsbedingungen, die in einer vollständigen Verlängerung der Varianten des Polynukleotids resultieren, geschaffen werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bedingungen, die in einer unvollständigen Verlängerung resultieren, durch Zugabe von einem Zusatz oder Polymerase geschaffen werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, das zusätzlich umfasst, dass man Oligonukleotide zugibt, welche sich an Bestandteile der Amplifikationsprodukte im Anlagerungsschritt anlagern.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Amplifikationsreaktion von Polynukleotiden unter Verwendung von taq-Polymerase durchgeführt wird, und recA oder eine zweite Poly merase bei dem zumindest einen Zyklus der unvollständigen Amplifikation zugegeben wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Varianten des Polynukleotids natürliche Varianten, optional allelische Varianten oder Artvarianten umfassen.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die natürlich vorkommenden Varianten des Polynukleotids Artvarianten eines Gens umfassen.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, worin zumindest ein variantes Polynukleotid zumindest eine 80%ige Sequenzidentität zu einem zweiten varianten Polynukleotid über die Sequenz des zweiten varianten Polynukleotids zeigt.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die gewünschte Eigenschaft eines erzeugten rekombinanten Polynukleotids eine Eigenschaft des Polynukleotids oder eines von dessen Expressionsprodukten ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rezeptorbindungsvermögen, Wirkstoffresistenz, therapeutische Aktivität, Eignung zur Gentherapie und Eignung zur Verwendung als DNS-basierter Impfstoff.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das zusätzlich umfasst, dass zumindest die eine rekombinante Variante, welche die gewünschte Eigenschaft aufweist, exprimiert wird, um ein rekombinantes Protein zu erzeugen.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin das Protein ein Enzym, virales Protein oder ein Antikörper ist.
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