DE69628221T2

DE69628221T2 - Einheit und Verfahren zur Detektion und/oder Analyse mit Hilfe der Kapillarelektrophorese

Info

Publication number: DE69628221T2
Application number: DE69628221T
Authority: DE
Inventors: Jacques Janssens; Roland Chevigne; Philippe Louis
Original assignee: Analis SA
Current assignee: Analis SA
Priority date: 1995-03-22
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-03-23
Also published as: EP0733900B1; JP3124993B2; DE69628221D1; JPH09105739A; EP0733900A3; US5611903A; EP0733900A2

Description

Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Detektion und/oder eine Analysenmethode und Einrichtung mit Hilfe der Kapillarelektrophorese.
Technischer Hintergrund der Erfindung
Bei der Elektrophorese, bei der Siliziumdioxid als Base verwendet wird, ist die Elektroosmose (EOF) ein induzierter Fluss, der durch das Vorhandenseinsein eines Ionengradienten an der Schnittstelle zwischen Siliziumdioxid und Wasser hervorgerufen wird und zu einem leichten Überschuss an positiven Ionen führt, die in Richtung der Kathode wandern. Dies wiederum führt zu einem Nettofluss in Richtung der Kathode, der den Ionen, die sich im elektrischen Feld bewegen, eine zusätzliche Geschwindigkeitskomponente verleiht:
v_tot: Gesamtgeschwindigkeit
v: Elektrophoretische Geschwindigkeit
v_eo: Elektroosmotische Geschwindigkeit
L_d: Gesamtlänge der Kapillare
t_eo: Wanderungszeit eines elektroosmotisches Markers
Somit ist eine konstante elektroosmotische Mobilität erforderlich, um von einer Kapillare zur anderen oder zwischen verschiedenen Kapillaren von Durchlauf zu Durchlauf und Tag zu Tag reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, wenn mit verschiedenen kapillaren Instrumenten gearbeitet wird.
Normalerweise wurde der elektroosmotische Fluss dadurch gesteuert, dass mit extremen pH-Werten gearbeitet wurde: unter pH 2,5, wo der elektroosmotische Fluss nahezu nicht vorhanden ist oder über pH 8, wo der elektroosmotische Fluss maximal ist oder durch Verwendung eines Additivs im Puffer, das den elektroosmotischen Fluss abtötet oder durch den Einsatz von beschichteten Kapillaren oder durch Anlegen eines zusätzlichen externen elektrischen Feldes. Allerdings führen alle dieses Verfahren in der Regel zu einer Verlängerung der Analysezeit.
Vorteile dieser Erfindung
Die vorliegende Erfindung bietet ein verbessertes Verfahren zur Detektion und/oder eine Analysenmethode und Einrichtung mit Hilfe der Kapillarelektrophorese, das die Schattenseiten des derzeitigen Stands der Technik ausschließt und das günstig, praktisch und einfach einzusetzen ist. Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren und eine Einrichtung, wodurch die direkte Stabilisierung des elektroosmotischen Flusses der Kapillare nach dem anfänglichen Ätzen mit Natriumhydroxid möglich wird. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass sie ein Verfahren und eine Einrichtung zur Verfügung stellt, wodurch die Äquilibrierung der Kapillare so standardisiert werden kann, dass bei Einsatz unterschiedlicher Kapillare unter den gleichen Bedingungen der gleiche elektroosmotische Fluss erzeugt wird.
Des weiteren bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Einrichtung, womit mit einer vorgegebenen Kapillare der erwartete elektroosmotische Fluss erzielt werden kann, wenn man den Puffer oder einen oder mehrere Bestandteile des Puffers austauscht, um den pH-Wert, die Ionenstärke oder die Molarität zu modifizieren oder Additive zugibt, um das Auflösungsvermögen zu modifizieren. Variationen im elektroosmotischen Fluss eines vorgegebenen Puffers in Funktion mit dem pH-Wert des Puffers werden ebenfalls minimiert. Außerdem kann für verschiedene Puffer nahezu der gleiche elektroosmotische Fluss mit der gleichen ionischen Stärke bei einem vorgegebenen pH-Wert erzeugt werden. Ein höherer elektroosmotischer Fluss wird möglich, woraus sich kürzere Analysezeiten (oder höheren Geschwindigkeiten) ergeben, was wiederum zu einer höheren Durchflussrate und niedrigeren Kosten führt. Diese Erfindung liefert eine bessere Reproduzierbarkeit der Wanderungszeiten und der quantitativen Bestimmungen (der Bereich jedes Spitzenwertes) von Durchlauf zu Durchlauf, von Kapillare zu Kapillare und zwischen verschiedenen Kapillaren.
Aufgrund des Verfahrens und der Einrichtung der Erfindung können auch Puffer verwendet werden, die höhere Molaritäten haben oder Substanzen enthalten, von denen bekannt ist, dass sie die Geschwindigkeiten der Proben herabsetzen, ohne dabei Analysezeit zu opfern. Negative Substanzen können bei saurem pH-Wert separiert werden, ohne die Polarität zu ändern und sie können mit der Erfindung in einem Durchlauf entweder von neutralen oder positiven Substanzen oder beidem gleichzeitig separiert werden. Die Gesamtanzahl der theoretischen Böden kann erhöht und die Effektivität der Elektrophorese trotz kürzerer Wanderungszeiten gesteigert werden.
Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Einrichtung zur Verfügung, womit eine stärkere Auflösung zwischen eng verwandten Spezies (zum Beispiel Chemikalien, Biochemikalien, Peptiden oder Proteinen), die nur über geringfügig unterschiedliche Ladungen, Massen, Substituentpositionen, räumliche Konfigurationen, etc verfügen, in kürzerer Zeit durchgeführt werden kann. Spezies mit der gleichen Ladung, aber unterschiedlichen funktionalen oder polarisierbaren Gruppen, oder mit unterschiedlichen Positionen oder einer unterschiedlichen Anzahl funktionaler oder polarisierbarer Gruppen können ebenfalls separiert werden.
Bei Verwendung längerer Kapillare kann in der gleichen Zeit eine höhere Auflösung erreicht werden als mit einer kurzen Kapillare ohne die Erfindung. Die Auflösung positiver Spezies mit der gleichen elektrophoretischen Mobilität, aber unterschiedlichen Ionenpaarungs-konstanten mit einem Polyanion oder einer Mischung von Polyanionen, kann mit der Erfindung ebenfalls mit höheren Geschwindigkeiten und somit kürzeren Wanderungszeiten erreicht werden, obwohl die Mobilität der Ionenpaare der Spezies abnimmt.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass Verfahren und Einrichtung sehr vielseitig sind, d. h. dass der Anwender viele Separationen vornehmen kann, ohne die Kapillare auszuwechseln. Das Verfahren ist somit im Gegensatz zu statischen Beschichtungen, die bestimmten Separationsklassen zugeordnet sind, dynamisch. Die oben erwähnten Vorteile der Erfindung können ebenfalls erzielt werden, wenn ein elektrophoretisches Verfahren mit einer Polaritätsumkehrung durchgeführt wird, aber auch durch Verlängerung der Wanderungszeiten und Verringerung der Geschwindigkeiten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Detektion und/oder eine Analysenmethode mit Hilfe der Kapillarelektrophorese, welches die folgenden Schritte umfasst:

– Spülen einer gebrauchsfertigen Kapillare mit einem Initiator (dynamische Spülung)
– Zugabe eines kapillaren Puffers in die initialisierte Kapillare
– Injektion einer zu analysierenden Probe (nach Bedarf möglicherweise mit einem Probeverdünner versetzt) in die Kapillare
– Optionale Zugabe eines Kathodenpuffers an der Kathodenseite der Kapillare
– Vornahme einer Kapillarelektrophorese an der besagten Probe, wobei der kapillare und/oder der kathodische Puffer ein Polyanion oder eine Mischung von Polyanionen enthalten, allerdings mit der Maßgabe, dass das Polyanion oder die Mischung von Polyanionen zumindest in dem kapillaren oder dem kathodischen Puffer enthalten ist und
– Spülen mit NaOH nach der Elektrophorese.

Nach Zugabe des kapillaren Puffers in die initialisierte Kapillare kann die Kapillare auf Wunsch mit einem Puffer gespült werden, der frei von jeglichen Polyanionen ist, wobei die injizierte Probe unter Verwendung eines Puffers der Elektrophorese unterzogen wird, der ebenfalls frei von Polyanionen ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Einrichtung (d. h. ein Gerät) zur Detektion der kapillaren Elektrophorese und/oder der Analyse von Proben, die einen Initiator und eine Kapillare und/oder einen kathodischen Puffer einschließen, der wiederum ein Polyanion oder eine Mischung von Polyanionen beinhaltet, wobei das Polyanion oder die Mischung von Polyanionen zumindest in dem kapillaren oder dem kathodischen Puffer enthalten ist.
Es wäre von Vorteil, wenn der Initiator ein Polymerderivat mit der folgenden Struktur wäre:
Mit m × n > 12,
wobei

– A = H, OH, NH₂, ein Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl- oder heterozyklisches Gerüst oder ein Derivat davon.
– B = H, OH, NH₂, ein Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl- oder heterozyklisches Gerüst oder ein Derivat davon.
– R¹ bis R^m Monomere darstellen (wobei m eine ganze Zahl größer ist als 1) , R¹ = R² = . . . R^m oder nicht, das sich ergebende Polymer ein Homopolymer ist, wenn R¹ = R² = ... R^m oder das sich ergebende Polymer ein Heteropolymer ist, wenn mindestens ein R sich von den anderen unterscheidet, wobei R ein Aminoalkly-, Aminoaryl-Aminoalkylaryl- oder aminoheterozyklisches Gerüst oder eine Gruppe oder ein stickstoffhaltiges heterozyklisches Gerüst oder eine Gruppe oder ein Derivat davon, eine basische Aminosäure- oder Peptidgruppe (die mindestens eine basische Aminosäure enthält) oder ein Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl- oder heterozyklisches Gerüst oder eine Gruppe ist.
– W¹ bis W^m (d.h. W¹,...., W^m) H oder eine basische Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus einem Imin, Amin (primäre, sekundäre, tertiäre oder quaternäre Amine) einer Guanidin- oder Hydrazingruppe oder einer anderen Gruppe besteht und
– Y¹ bis Y^m (d. h. Y¹,..., Y^m) H oder eine andere Gruppe einschließlich eines Säureradikals ist, allerdings mit der Maßgabe, dass der Initiator bei dem eingesetzten pH eine positive Nettoladung trägt.

Je nach bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Initiator ein Homopolymer R, das mindestens ein Stickstoffatom enthält. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Initiator ein Polypeptid oder ein Protein. Es wäre von Vorteil, wenn, das Polyanion aus der Gruppe ausgewählt würde, die aus einem Polysaccharinderivat, einem synthetischen Polymerderivat, einer mehrsäurigen Aminosäure, einem Polynukleotid, einem Polyphosphat oder Polyphosphonat, einer Polyphosphorsäure und/oder einer Mischung daraus bestünde.
Das Polyanion sollte vorzugsweise die nachfolgende Struktur haben:
Mit m × n > 12, wobei

– R¹ bis R^m Monomere darstellen, R¹ = R² = ... R^m oder nicht, das sich ergebende Polymer ein Homopolymer ist, wenn R¹ = R² = ... R^m oder das sich ergebende Polymer ein Heteropolymer ist, wenn ein R sich von den anderen unterscheidet, wobei R entweder P (phosphorig) oder ein Alkly-, Aryl-Alkylaryl- oder heterozyklisches Gerüst darstellt
– A = H, OH, NH₂, ein Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl- oder heterozyklisches Gerüst oder ein Derivat davon
– B = H, OH, NH₂, ein Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl- oder heterozyklisches Gerüst und Derivate davon
– W¹ bis W^m sind OH, ein Säureradikal oder ein Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl- oder heterozyklisches Gerüst, das ein Säureradikal trägt
– Y¹ bis Y^m sind H, OH, ein Säureradikal oder ein Alkyl-, Aryl-, Alkylaryl- oder heterozyklisches Gerüst oder Derivate davon, ein Amin (primäres, sekundäres, oder tertiäres Amin), ein stickstoffhaltiges heterozyklisches Gerüst oder einer Mischung daraus mit der Maßgabe, dass das Polyanion bei dem eingesetzten pH eine negative Nettoladung trägt.

Vorzugsweise wird das Säureradikal von W¹ bis W^m aus der Gruppe ausgewählt, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfatgruppe, einer Sulfonatgruppe und aus Phosphatgruppen (Mono-, Di- oder Triphosphatgruppe) besteht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat das Polyanion die folgende Struktur:
Wobei n > 12,
A ist H, OH,
B ist H, OH.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Polyanion ein Homopolynukleotid, ein Heteropolynukleotid, eine Ribonukleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure.
Vorzugsweise beträgt der Inhalt des Polyanions und dem Initiator in der Kapillare zwischen 10^–12% und 10% in Relation zum gesamten flüssigen Kapillarvolumen. Bei einer Ausführungsform beträgt das Polyanion ca. 1% des Flüssigkeitsvolumens in der Kapillare.
Es wäre vorteilhaft, wenn der pH-Wert der/des Puffers) zwischen 0,5 und 10 liegen würde.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Ergebnisses eines Scans mit der Auflösung zwischen HbAla, HbAlb, HbAlc, Methämoglobin und HbA. 2 zeigt die Ergebnisse eines Scans mit der Auflösung zwischen HbAla, HbAlb, HbF, HbAlc, Methämoglobin HbA und Hbs.
Definitionen
Nachstehend finden Sie die Definition der in diesem Dokument verwendeten Ausdrücke:

– Der Ausdruck „Kapillarpuffer" bezeichnet den Puffer, der sich in der Kapillare befindet, bevor die Probe injiziert wird.
– Der Ausdruck „kathodischer Puffer" bezeichnet den Puffer an der Kathodenseite der Kapillare.
– Der Ausdruck „anodischer Puffer" bezeichnet den Puffer an der Anodenseite der Kapillare.
– Der Ausdruck „laufender Puffer" bezeichnet einen Puffer, der als kapillarer Puffer, kathodischer Puffer und als anodischer Puffer eingesetzt wird.
– Der Ausdruck „Verdünnungsmittel für Proben" bezeichnet jedes geeignete Verdünnungsmittel für Proben, einschließlich des laufenden Puffers bei unterschiedlichen Konzentrationen und pH-Werten, wozu auch der laufende Puffer gehört, der frei von Polyanionen ist.
– Der Ausdruck „herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese" bezeichnet ein Verfahren zur Elektrophorese, bei dem kein Initiator und kein e) Puffer verwendet werden, die frei von Polyanionen sind.
– Der Ausdruck „initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrohorese" bezeichnet ein Verfahren zur Elektrophorese, bei dem die Kapillare im ersten Schritt mit einem Initiator gespült wird, dem der Schritt des Spülens der Kapillare mit einem kapillaren oder laufender Puffer folgt; danach wird die Probe zugegeben, wonach die Separation unter Verwendung eines laufender Puffers oder kathodischen Puffers und anodischen Puffers erfolgt.
– Der Ausdruck „Initiator" bezeichnet eine Spüllösung aus beliebigen Molekülen oder Molekülmischungen mit einem hohen Molekulargewicht (Molekulargewicht höher als 1000 M. W., vorzugsweise höher als 5000 M. W), die bei dem pH-Wert des Verdünnungsmittels, in dem sie gelöst werden oder bei dem pH-Wert des Puffers positive Ladungen tragen. Der Initiator arbeitet dynamisch. Er ist ein Polykation, wenn er nur positive Ladungen trägt und ein Polyelektrolyt, wenn er positive und negative Ladungen trägt.
– Der Ausdruck „gebrauchsfertige Kapillare" bezeichnet eine stabilisierte oder nicht stabilisierte Kapillare, die einem Verfahren wie dem nachstehenden unterzogen wurde: 15 Minuten lang mit NaOH 0,1 M/L spülen, dann 5 Minuten lang mit H₂O, dann 5 Minuten lang mit NaOH 0,1 M/L, dann 5 Minuten lang mit H₂O, dann 10 Minuten lang mit einem geeigneten Puffer.
– Der Ausdruck „stabilisierte Kapillare" bezeichnet eine Kapillare, die über eine Äquilibrierungszeit stabilisiert wurde, die zwischen 30 Minuten und mehreren Tagen liegt, wobei die Äquilibrierung vom Puffer und dem pH-Wert des Puffers abhängt und sogar bei Kapillaren mit der selben Produktionschargennummer von Kapillare zu Kapillare variiert. Wiederholte Gleichanalysen mit einer stabilisierten Kapillare ergaben Messungen des elektroosmotischen Flusses mit einer Dispergierung um den Mittelwert.
– Der Ausdruck „nicht stabilisierte Kapillare" bezeichnet eine Kapillare, die nicht stabilisiert wurde. Wiederholte Gleichanalysen mit einer nicht stabilisierten Kapillare ergaben Messungen des elektroosmotischen Flusses, die ständig entweder ansteigende oder absteigende Abweichungen aufwiesen.
– Die „elektrophoretische Geschwindigkeit einer Komponenten (v_tot) wird berechnet, indem man gemäß nachstehender Formel die Länge der Kapillare vom Injektions-(Zugabe-) Punkt bis zum Detektor L_D durch die beobachtete Wanderungszeit der Komponente dividiert:
– Die „elektroosmotische Geschwindigkeit" oder v_eo wird wie folgt definiert:
wobei teo die beobachtete Wanderungszeit eines neutralen Markers wie Dimethylformamid (DMF) ist.
– Die „Nettogeschwindigkeit einer Komponente" V wird wie folgt definiert:
– Der Ausdruck "v_ip" bezeichnet die Geschwindigkeit einer positiv geladenen Komponente, deren Nettoladung durch Interaktion mit einem negativ geladenen Polyanion gemindert, aufgehoben oder negativ umgekehrt wurde und
– Die „Mobilität einer Komponente" μ wird anhand der nachstehenden Formel ermittelt:
wobei E das elektrische Feld, V die Spannung und Lt die Gesamtlänge der Kapillare ist.

Wenn die Kapillare vorgegeben ist, bei der gleichen Spannung gearbeitet wird und die mit der Kapillare durchgeführten Versuche verglichen werden, ist der Faktor
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
Das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich dadurch von dem herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese, dass vor dem herkömmlichen Spülschritt der Kapillare mit einem laufender Puffer eine kurze Spülung mit einer Initiatorlösung vorgenommen wird, der ein Spülschritt mit einem laufender Puffer folgt, der ein Polyanion oder eine Mischung von Polyanionen enthält.
Gemäß der Erfindung handelt es sich bei dem Initiator, für den einige typische Vertreter in Tabelle 1 aufgelistet sind, um ein Polyelektrolyt oder eine Mischung aus Polyelektrolyten und hierbei vorzugsweise um ein Makromolekül, dass saure oder basische Gruppen trägt, die negativ oder positiv geladen werden können. Ein solches Polyelektrolyt kann ein Protein oder eine Mischung aus Proteinen sein.
Gemäß der Erfindung handelt es sich bei dem Initiator um ein Polykation oder eine Mischung von Polykationen mit einem hohen Molekulargewicht und einem Monomer, das eine oder mehrere basische Gruppen trägt, die positiv geladen werden können. Ein derartiges Polykation kann ein synthetisches Polymer sein, dass primäre, sekundäre, tertiäre oder quaternäre Amine trägt. Ein derartiges Polykation kann ein Polyelektrolyt wie eine Polyaminosäure sein, dessen Aminosäuren basische Aminosäuren sind oder ein beliebiges Kopolymer derartiger basischer Aminosäuren.
In Tabelle 1 sind die Auswirkungen eines herkömmlichen Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese und die des initialisierten Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese auf den elektroosmotischen Fluss unter Einsatz verschiedener Initiatoren und des selben Polyanions aufgeführt.
Tabelle 1 Beispiele für Initiatoren und deren Auswirkungen auf den elektroosmotischen Fluss
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: TRIS/Apfelsäuresäure 150 mM/L, pH-Wert 4, 625
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: Wie beim herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese mit 0,01% Chondroitinsulfat

Initiator:
Verschiedene Proteine, Polypeptide, Polykatione oder Polymere in Konzentrationen von 0,25 (wenn nicht anders angegeben), andere in anderen Konzentrationen (angegeben).
Instrument:
PAGE 2000, gleiche Patrone, gleiche stabilisierte Kapillare 25 μ × 23 cm Separation erfolgte bei 12 KV.
Im allgemeinen gilt: Je mehr überschüssige basische Gruppen vorhanden sind, je effektiver ist der Initiator.
Gemäß der Erfindung sind die Polyanionen, für die einige typische Vertreter in Tabelle 2 aufgelistet sind, durch folgende Eigenschaften charakterisiert: Es sind lösliche Polymere mit Repetiereinheiten (Monomer, das mindestens eine Säuregruppe wie Carboxylat, Sulfat, Sulfonat, Phospat....) einschließt, die dem Polymer eine negative Ladung verleiht.
Tabelle 2 zeigt einen Vergleich des herkömmlichen Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese und des initialisierten Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese unter Einsatz verschiedener Polyanione.
Tabelle 2 Beispiele für einige Polyanione und deren Auswirkungen auf den elektroosmotischen Fluss
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: TRIS/Apfelsäure 150 mM/L, pH-Wert 4, 605
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: Wie beim herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese mit 0,01% unterschiedlicher Polyanione
– Initiator: Albumin vom Schwein 0,2% gemäß dem herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese aufgelöst.

Instrument:
PAGE 2000, gleiche Patrone, gleiche stabilisierte Kapillare 25 μ × 23 cm für das herkömmliche Verfahren zur kapillaren Elektrophorese.
Für das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese wurde keine Stabilisierung durchgeführt.
Die Spannung betrug 12 KV Der elektroosmotische Fluss (DMF) wurde 5 mal ermittelt, die mittlere Zeit in Minuten und RSD sind in der Tabelle festgehalten.
Auch andere Polyanione wie Chondroitinsulfat aus verschiedenen Tieren und aus verschiedenen Geweben, Heparinsulfat, Dermatansulfat, Polykieselsäure, Kolominsäure, Polyaspertinsäure und Polyglutaminsäure und Derivate von beiden, willkürlich gewählte Kopolymere von Aspertinsäuren und Glutaminsäuren, Polyacrylsäuren mit einem MW (Molekulargewicht) bis zu 4000.000 wurden erfolgreich, aber nicht unter den oben erwähnten Bedingungen, getestet.
Wenn ein elektrisches Feld vorhanden ist, wandern die Polyanionen in Richtung der Anode, d. h. entgegen der oder gegen die Strömung des elektroosmotischen Flusses (Tabelle 3), was nicht nur zu einer Stabilisierung des elektroosmotischen Flusses, sondern unerwarteterweise auch zu einer Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Geschwindigkeiten des elektroosmotischen Flusses und somit der Geschwindigkeiten der zu separierenden Spezies führt.
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese (UCEM): Apfelsäure/TRIS/150 mM/L, pH-Wert 4,629
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese ( ICEM) Wie beim herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese, aber mit vier unterschiedlichen Prozentanteilen von Chondroitinsulfat.

Initiator:
Albumin vom Schwein 0,2% ohne Chondroitinsulfat.
Kapillare:
25 μ × 23,7 cm, Detektor 6,7 cm von der Kathode entfernt Geschwindigkeit des Chondroitinsulfats und des DMF mit Polyanion nur im kathodischen Puffer oder nur im kapillaren Puffer vorhanden.
Wenn das Chondroitinsulfat nur im kathodischen Puffer vorhanden ist, wird die Zeit aufgrund der Erhöhung der Absorption festgelegt, sobald das Chondroitinsulfat den Detektor vom kathodischen Puffer kommend passiert (Wanderungslänge 6,7 cm).
Wenn das Chondroitinsulfat nur im kathodischen Puffer vorhanden ist, wird die Zeit aufgrund der Abnahme der Absorption festgelegt, sobald kein Chondroitinsulfat mehr vor dem Detektor vorhanden ist (Wanderungslänge 6,7 cm).
Wenn stark positiv geladene Initiatoren verwendet werden, induzieren diese in Abwesenheit von Polyanionen eine Umkehr des elektroosmotischen Flusses, der sich dann zur Anode bewegt, womit diese Initiatoren für die positive Ladung der Wand der Kapillare verantwortlich sind (Tabelle 4).
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: TRIS/Apfelsäure 150 mM/L, pH-Wert 4,625, kein Polyanion Phosphat/NaOH 100 mM/L pH-Wert 2,617
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: Wie beim herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese, aber mit TRIS/Apfelsäure 0,01% Chondroitinsulfat Phosphat 0,1% Chondroitinsulfat

Arbeiten mit der Polaritätsumkehr (12 KV). Der elektroosmotische Fluss fließt in Richtung der Anode und die Geschwindigkeiten sind negativ, während in Anwesenheit von Polyanionen (Arbeiten bei normaler Polarität) die Geschwindigkeiten positiv sind.
Aber unerwarteterweise führte der Einsatz eines Initiators gemeinsam mit einem Polyanion wie beim initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese zu einer Verstärkung der Auswirkungen der Polyanionen.
Unter Verwendung einer gebrauchsfertigen oder nicht stabilisierten Kapillare erzeugt das initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese den selben elektroosmotischen Fluss (Tabelle 5) für den selben Puffer, was bedeutet, dass durch den Austausch oder Ersatz einer Kapillare innerhalb einer Batterie von mehreren kapillaren Instrumenten die Notwendigkeit zur Stabilisierung oder Äquilibrierung der neuen Kapillare vermieden werden kann, was wiederum bedeutet, dass der Anwender nur den Schritt mit der gebrauchsfertigen Kapillare durchführen muss und dann direkt mit der Analyse fortfahren kann. Ebenso erhält man mit dem initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese durch den Ersatz eines Puffers durch einen anderen sofort den erwarteten elektroosmotischen Fluss für den neuen Puffer und kann somit den Äquilibrierungsschritt auslassen (Tabelle 6).
Tabelle 5 Direkte Stabilisierung des elektroosmotischen Flusses für verschiedene Kapillare
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: TRIS/Apfelsäure/TRIS 150 mM/L, pH-Wert 4,605 Chondroitinsulfat 1

Initiator:
0,25% Albumin vom Schwein im Puffer des herkömmlichen Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese.

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese TRIS/Apfelsäure 150 m/ML pH-Wert 4,605

Marker:
Für jede (gebrauchsfertige) Kapillare und jedes Verfahren neun mal analysierte DMF, zuerst anhand des ICEM und dann anhand des UCEM für Kapillare 1 bis 5 und erst anhand des UCEM und dann anhand des ICEM für Kapillare 6 bis 11.
Die Zahlen in den Klammern wurden nach vorheriger 60-minütigerÄquilibrierung der Kapillare erzielt und demonstrieren, dass die Kapillare nicht stabilisiert waren und dass beim UCEM die Wanderungszeit konstant ansteigt. Unter Verwendung einer stabilisierten Kapillare liegt die Zeit des elektroosmotischen Flusses für diesen Puffer normalerweise bei 14 Minuten.
Tabelle 6 Direkte Stabilisierung des elektroosmotischen Flusses unter Austausch der Puffer
Puffer:

– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: Apfelsäure 150 mM/L, Maleinsäure 175 mM/L, alle bei pH-Wert 4,605 Chondroitinsulfat 1

- Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese 150 m/ML bei pH-Wert 4,605 – kein Chondroitinsulfat

Marker:
Neun mal analysierte DMF, zuerst anhand des UCEM und dann anhand des ICEM für jeden Puffer.
Kapillare:
23,7 × 25 μ. Für jeden Puffer wurde die selbe Kapillare verwendet, die jedes Mal neu äquilibriert wurde.
DAP: Diaminpropan
ARG: Arginin
Durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese wird der elektroosmotische Fluss besonders bei pH-Werten um 4–5 stabilisiert, wo er normalerweise am wenigsten stabil ist (J. Kohrs und H. Engelhardt, J. Microcol. Sept. 1991, 3: 491), was eine Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Wanderungszeiten, des elektroosmotischen Flusses und jedes Spitzenwertes der Analyte bedeutet (Tabelle 7). Außerdem kann mit diesem Verfahren die Reproduzierbarkeit jedes Spitzenwertbereichs (Tabelle 8) verbessert werden, was bedeutet, dass der Anwender mehr Vertrauen in die Identifizierung eines Spitzenwertes anhand der Berechnung seiner Mobilität (qualitatives Ergebnis) und in die Bestimmung seines Prozentwertes in einer Mischung (quantitatives Ergebnis) haben kann.
Tabelle 7 Reproduzierbarkeit der Wanderungszeiten (RSD)
Tabelle 8 Reproduzierbarkeit des Prozentwertes jedes Spitzenwert (RSD) bei pH-Wert 4,6 (Beispiel 1)
Durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese wird der elektroosmotischer Fluss erhöht und somit auch die Geschwindigkeiten der Substanzen, was sich in einer Verkürzung der Wanderungszeiten widerspiegelt (Tabelle 9). Die Stärke dieses Effekts variiert mit der Beschaffenheit des Puffers, der Molarität des Puffers, der Ionenstärke des Puffers, dem pH-Wert des Puffers, dem Prozentwert des/der Polyanions(e), dem Prozentwert des Initiators oder der Spülzeit mit dem Initiators und ändert sich von einem Polyanion zum anderen Tabelle 2) und von einem Initiator zum anderen (Tabelle 1). per interne Durchmesser der Kapillare beeinflusst ebenfalls die Erhöhung des elektroosmotischen Flusses. Zum Beispiel bei 5 KV und unter Verwendung eines Apfelsäure/TRIS 25 mM/L, Puffers bei pH-Wert 4, 922 mit 75 μ ID wird die t_eof bei 14,615 Minuten gemessen, während sie in Anwesenheit von Polybren 0,001% und Chondroitinsulfat 0,01 bei 3,942 Minuten gemessen wird. Unter Verwendung des selben Puffers mit 37,5 mM/L und pH-Wert 4,8 mit 50 μ ID wird die t_eof bei 3,194 Minuten gemessen, während sie in Anwesenheit von Polybren 0,001% und Chondroitinsulfat 0,01% bei 2,69 Minuten gemessen wird.
Tabelle 9 Verkürzung der Wanderungszeiten in Minuten (Durchschnitt von 9) Beispiel 1
Unter Bedingungen, die zu einem niedrigen elektroosmotischen Fluss führen, wie einer hohen Molarität, einem niedrigen pH-wert, der Anwesenheit von Reduktoren oder Inhibitoren des elektroosmotischen Flusses im Puffer wie PEG, PVP und Aminen, ist die Wirkung des initialisierten Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese auf die Erhöhung des elektroosmotischen Flusses im allgemeinen stark. Unter Bedingungen, die zu einem starken elektroosmotischen Fluss führen, wie einer niedrigen Molarität, einem hohen pH-Wert und der Abwesenheit von Reduktoren des elektroosmotischen Flusses, ist die Wirkung des initialisiertes Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese auf die Erhöhung des elektroosmotischen Flusses allerdings wiederum geringer (Tabellen 10–11).
Tabelle 10 Bei einem starken elektroosmotischen Fluss
Im Hinblick auf die Zahlen in Klammern wurden die Mobilitäten wie folgt berechnet:
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese (UCEM): Puffer Phosphat 0,1 M/L, pH-Wert 10.
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese ( ICEM) Puffer wie im herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese mit 0,1% Dextransulfat MW 500.000.
– Initiator: Polybren 0,00005
– Probe: 4 Positionsisomere aus Dihydroxybenzoesäuren

Tabelle 11 Bei einem starken elektroosmotischen Fluss
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese (UCEM): Borat 140mM/L, pH-Wert 10,005.
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese (ICEM): Der selbe Puffer wie im herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese mit Dextransulfat MW 500,000, 0,01%
– Initiator: Polyethylenimin MW 600,000, 10–6
– Probe: Menschliches Serum gelöst in einem 1/10 Phosphat-Salzpuffer, der DMF und Diäthylbarbitursäure-natrium enthält (neutral und Säuremarker).

Das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese erhöht den elektroosmotischen Fluss unter Bedingungen, die sonst zu einem niedrigen elektroosmotischen Fluss führen in einer Weise, dass unter diesen Bedingungen wie einer hohen Molarität oder einem niedrigen pH-Wert oder der Anwesenheit eines Reduktors des elektroosmotischen Flusses oder jeder Kombination davon (Tabelle 12) gearbeitet werden kann, wobei sogar der Einsatz einer Pufferbasis, die ein Amin oder ein Diamin einschließt, möglich ist. Allerdings werden durch dieses Verfahren Wanderungszeiten produziert, deren absolute Werte sich leicht von denen unterscheiden, die man mit dem selben Puffer, aber unter Bedingungen erhält, bei denen der elektroosmotischer Fluss höher war (Tabelle 13). Dieser Effekt äußert sich so, dass zum Beispiel eine Pufferbasis, in der NaOH durch eine Aminbasis wie TRIS ersetzt wurde, verwendet werden kann. Ein derartiger Ersatz bietet viele Vorteile wie keine (oder weniger) Adsorption der kationischen Spezies, den Einsatz höher Molarität, da diese Amino-Puffer weniger leitfähig sind, (was zu einem niedrigeren Diffusionskoeffizienten führt), eine bessere Definition der Spitzenwerte, die dichter beieinander liegen und eine höhere Auflösung bei einer nur leicht angestiegenen Analysezeit (Tabelle 12).
Das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese gestattet den Einsatz eines Puffers mit höherer Molarität oder größerer Ionenstärke, was zu einer schärferen Abgrenzung der Spitzenwerte führt oder diese weniger diffus und symmetrischer erscheinen lässt, wobei die Wanderungszeiten nur geringfügig ansteigen, wobei dieser Anstieg wesentlich geringer als der Anstieg der Wanderungszeiten beim Einsatz des herkömmlichen Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese unter den selben Bedingungen einer hohen Molarität oder einer hohen Ionenstärke (Tabelle 12) ist.
Tabelle 12 Unter Bedingungen, die zu einem Abfall des elektroosmotischen Flusses führen (Zugabe von Polyethylenglykol 6000)
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese (UCEM): Azetat/TRIS, pH-Wert 4,65 in drei verschiedenen Konzentrationen (0,04%–0,2%–1%).
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese (ICEM): Wie beim herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese, aber mit Chondroitinsulfat, wobei jede Konzentration auch eine unterschiedliche Konzentration von Chondroitinsulfat enthielt.
- Initiator: Albumin vom Schwein 0,25% im Puffer des herkömmlichen Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese.
– :Puffer mit Zusatz von Polyethylenglykol.

Tabelle 13 Vergleich zwischen Apfelsäure/NaOH und Apfelsäure/TRIS Puffern
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese (UCEM): Apfelsäure/NaOH oder Apfelsäure/TRIS, beide 150 mM/L Apfelsäure und pH-Wert 4,605.
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese (ICEM): Wie beim herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese, aber mit 1% Chondroitinsulfat.
– Initiator: Albumin vom Schwein 0,25 % im Puffer des herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese.

Durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese werden die Mobilitäten der negativ geladenen Substanzen nicht verändert (Tabelle 20), vorausgesetzt, dass diese negativ geladenen Substanzen keine polarisierbaren Gruppen enthalten, die mit einer der Säuregruppen des Polyanions oder mit einer polarisierbaren Gruppe des Polyanions zusammenwirken können. Ein Beispiel für ein solchen Zusammenwirken ist in Tabelle 10 für Spitzenwert 3 (2–3-Dihydroxybenzoesäure) zu finden, wo die Veränderung der Mobilität in Anwesenheit des Polyanions dargestellt wird. Dann ist es möglich, anhand des initialisierten Verfahren zur kapillaren Elektrophorese Substanzen zu separieren, welche über die gleiche negative Ladung verfügen, sich aber entweder durch eine polarisierte Gruppe unterscheiden, oder die zwar über die gleichen polarisierbaren Gruppen verfügen, aber an anderen Positionen oder welche über funktionale oder polarisierbare Gruppen mit unterschiedlichen Interaktionen oder Komplexitätskonstanten verfügen. Durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese wird die Mobilität von Substanzen herabgesetzt, die bei dem pH-Wert des laufender Puffers positiv geladen sind (Tabelle 34). Des weiteren können polarisierbare Gruppen neutraler oder positiver Substanzen auch mit dem Polyanion zusammenwirken, wodurch es dann möglich wird, neutrale Substanzen oder positive Substanzen mit der gleichen Ladung anhand des initialisierten Verfahren zur kapillaren Elektrophorese zu separieren, wenn deren Interaktionen oder Komplexitätskonstanten unterschiedlich sind. In der letzten Spalte von Tabelle 14 wird dargestellt, dass dieser Effekt mit der Polarisierbarkeit des Moleküls ansteigt. (OCF₃ > Br > Cl > F > OCH₃)
Tabelle 14 Abnahme der Mobilitäten der positiven Substanzen durch Polyanione (Beispiel 1) und die relative Abnahme der -Mobilitäten in Funktion mit der polarisierbaren Gruppe (in Klammern). „Mobilitäten" werden basierend auf der durchschnittlichen Wanderungszeit (9 wiederholte Gleichversuche) berechnet und wie folgt ausgedrückt:
wobei die relative Abnahme der Mobilitäten wie folgt ausgedrückt wird:
Durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese werden die Anzahl der theoretischen Böden (N) der vorhandenen neutralen und negativen Substanzen und normalerweise auch der positiven Substanzen erhöht und die Wanderungszeiten vermindert.
In der Tat
L : Länge der Kapillare
D : Diffusionskoeffizient
T : Wanderungszeit
wird durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese trotz der Abnahme der Wanderungszeiten unerwarteterweise die Effizienz erhöht. Die Effizienz
wobei t die Wanderungszeit einer Komponente in Sekunden ist und w die Breite des Spitzenwertes in Sekunden an der Grundlinie. Der Anstieg der Effizienz wird in Tabelle 15 dargestellt, woraus ersichtlich wird, dass der durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese entstandene Abfall der Wanderungszeiten durch die Reduktion der Breite der Spitzenwerte, die zu einer höheren Relation führt (t/w)², mehr als kompensiert wird.
Tabelle 15 Effizienzvergleich zwischen dem herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese und dem initialisierten Verfahren zur kapillaren Elektrophorese
Es gelten die selben Bedingungen wie bei Tabelle 16.
Durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese wird die Auflösung erhöht, während sich auch die Geschwindigkeiten erhöhen.
Durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese wird die Analyse einer Mischung neutraler, negativer und positiver Komponenten in einem einzigen Durchlauf ermöglicht (Beispiele 1 und 2).
Außerdem wird durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese die Grundlinie geebnet, was wiederum dazu führt, dass vor der Quantifizierung (Tabelle 16) normalerweise keine Anpassung oder Korrektur der Grundlinie mehr notwendig ist. Diese Eigenschaft spiegelt sich auch in der Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Spitzenwertbereiche wider.
Tabelle 16 Vergleich der Grundlinie oder des Hintergrunds beim UCEM und beim ICEM (5 wiederholte Gleichversuche) Das herkömmliche Verfahren zur kapillaren Elektrophorese
Das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese
Puffer:

– UCEM: Apfelsäure 150 mM/L TRIS pH-Wert 4,625
– ICEM: Der gleiche Puffer wie beim UCEM mit 0,01 Chondroitinsulfat.
– Initiator: Albumin vom Schwein 0,2 % im Buffer des herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese.
– Probe: Sechs Positionsisomere des Dimethylanelins in niedriger Konzentration, um ein niedriges Signal- /Hintergrundverhältnis zu haben.

Da die Detektion in der Kapillare erfolgt, benötigen die sich langsamer bewegende Komponenten mehr Zeit, um das Detektorfenster zu passieren als die schnelleren Komponenten. Somit produzieren die sich langsamer bewegenden Zonen einen Anstieg der Zahlen des Spitzenwertbereichs, was durch eine Erweiterung an der Spitzenwertbasis gekennzeichnet ist. Bei der Quantifizierung von gelösten Stoffen in einer Mischung muss ein Korrekturfaktor angewandt werden, um die Spitzenwertbereiche als eine Funktion der Wanderungsgeschwindigkeit zu normalisieren. Wie aus den Tabellen 9 und 17 zu ersehen ist, werden bei Einsatz des initialisierten Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese sowie des normalen Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese die Wanderungszeiten der langsamsten Spitzenwerte am meisten beeinflusst, was wiederum bedeutet, dass sich der Korrekturfaktor 1 nähern kann, wenn Proben analysiert werden, deren Wanderungszeiten keine großen Unterschiede aufweisen, was auf das herkömmliche Verfahren zur kapillaren Elektrophorese nicht zutrifft (Tabelle 18).
Tabelle 17 Daten bei pH-Wert 2,507 Positiv geladene Substanzen Beispiel 3
Tabelle 18 Vergleich zwischen dem Prozentsatz jedes in Funktion mit der Wanderungszeit korrigierten oder nicht korrigierten Spitzenwertes (Versuch Tabelle 17) – Mittelwert aus 9 – CV in Klammern.
Wie Sie aus Tabelle 19 ersehen können, wird durch das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese die Schwankung des elektroosmotischen Flusses minimiert.
Das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese ist sehr gut reproduzierbar. Für die Wanderungszeiten und den Bereich jedes Spitzenwertes außerhalb der kalkulierbaren Mobilitäten wird kein neutraler Marker benötigt, was bedeutet, dass bei der Analyse von entweder neutralen und positiven oder neutralen und negativen Substanzen oder allen drei Substanzen zusammen keine Störung durch den Marker vorliegt, der zum Beispiel eine neutrale Substanz in geringer Konzentration verbergen kann. Hierdurch wird auch die Quantifikation erleichtert, da es nicht mehr nötig ist, erst den Prozentsatz des Markers zu subtrahieren und die quantitativen Ergebnisse zu normalisieren.
Tabelle 19 Schwankungen und Reproduzierbarkeit des elektroosmotischen Flusses als eine Funktion des pH-Wertes
Puffer

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese HP₃O₄ 100 mM/L wurden durch Zusatz von NaOH auf den benötigten pH-Wert gebracht.
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese Wie beim herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese, aber mit 0,1 % Chondroitinsulfat

Initiator:
Polybren 0,001 % im herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese.
Der Marker DMF wurde 9 Mal analysiert, wobei der anfängliche pH-Wert von 1,597 auf 10,003 anstieg, und zwar ohne Äquilibrierungszeiten bei jeder Veränderung des pH-Wertes.
In diesem Fall ist bei pH-Werten über 5 der elektroosmotische Fluss beim ICEM schwächer als beim UCEM, aber durch den Austausch des Initiators und des Polyanions und den Einsatz eines Puffers kann der elektroosmotische Fluss erhöht werden (Tabelle 10).
An dieser Stelle sollte bemerkt werden, dass man die Bedingungen auswählen kann, unter denen das ICEM einen etwas geringeren elektroosmotischen Fluss aufweist als das UCEM, aber bessere Reproduzierbarkeiten erzeugt.
Das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese erzeugt einen elektroosmotischen Fluss der selben Stärke für verschiedene Puffer bei dem selben pH-Wert und der selben Ionenstärke (Tabellen 6–12–13–19).
Wenn man den geeigneten Initiator und das geeignete Polyanion in jeweils definierten Konzentrationen auswählt, ist es somit mit dem initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese möglich, einige Universalpuffer bei unterschiedlichen pH-Werten zu entwickeln. Der Vorteil derartiger Formulierungen liegt darin, dass sie den größten Teil aller Anwendungen abdecken, den gleichen elektroosmotischen Fluss erzeugen, bessere qualitative und quantitative Reproduzierbarkeiten liefern und die Effektivität und die Auflösung erhöhen, während die Analysezeit verkürzt und der Durchfluss erhöht wird, was zu einer Senkung der Analysekosten führt.
Die oben erwähnten Eigenschaften des initialisierten Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese sind auch auf Bereiche der kapillaren Elektrophorese wie den Einsatz von mit Gel gefüllten Kapillaren anwendbar, wobei durch den Einsatz dieser Erfindung eine Erhöhung des elektroosmotischen Flusses in mit Agarose-Gel gefüllten Kapillaren oder die Erzeugung eines elektroosmotischen Flusses in mit Polyacrylamid-Gel gefüllten Kapillaren erzielt werden könnte.
Alle Versuche wurden unter exakt den selben Bedingungen durchgeführt: die selbe stabilisierte Kapillare (von Polymicro Technology), der selbe Puffer, die selbe Spannung und die selbe Probe. Danach wurden die Ergebnisse des „initialisiertes Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese", des „normalen Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese" und des „herkömmlichen Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese" verglichen.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf chirale Separationen anwendbar, wenn der verwendete chirale Selektor nicht selbst ein Polyanion ist. In der Tat sind chirale Selektoren Moleküle wie Cyclodextrine. Die Mehrheit der verwendeten Polyanione ist selbst chiral, da eine chirale Separation auch ohne den Zusatz von anderen chiralen Selektoren erreicht werden kann.
Positive Substanzen wandern mit einer anfänglichen Geschwindigkeit von v_el gleich veo + v zur Kathode, wobei v positiv ist, d. h. dass ihre Wanderungsrichtungen entgegen der Wanderungsrichtung der Polyanione verläuft, wodurch eine Art elektrokinetische Ionenaustausch-Chromatographie realisiert wird, in welcher der Separationsmechanismus auf der Bildung differenzierter Ionenpaare positiver Ionen mit einem Polyanion basiert, die zu der Separationslösung hinzugegeben werden.
Daher ist es möglich, mit dem initialisierten Verfahren zur kapillaren Elektrophorese positive Analyte mit identischen elektrophoretischen Mobilitäten zu separieren, wenn deren Ionenpaar-Bildungskonstaten mit einem vorgegebenen Polyanion unterschiedlich sind.
Die oben erwähnten Eigenschaften des initialisierten Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese sind auch für die chirale Separation und die micellare elektrokinetische Chromatographie wertvoll (Beispiel 4).
Die oben erwähnten Eigenschaften des initialisierten Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese sind auch für die chirale Separation und die micellare elektrokinetische Chromatographie wertvoll (Beispiel 4).
Die nachfolgenden Beispiele dienen ausschließlich der weiteren Veranschaulichung und sind nicht als Einschränkungen der offengelegten Erfindung zu betrachten. Alle Versuche wurden auf einem PACE 2000^® und/oder einem Pilot CE^® Instrument mit 6 Kapillaren (beide von Beckman Instruments, CA). durchgeführt. Mit dem initialisierten Verfahren zur kapillaren Elektrophorese wurde die Anzahl der theoretischen Böden (N) zumindest für die neutralen und negativen Analyte gemäß nachstehender Gleichung erhöht:
wobei L die Länge der Kapillare und D der Diffusionskoeffizient des individuell gelösten Stoffes ist. Wenn v_tot ansteigt, werden die gelösten Stoffe mobiler und die Zeit, in der sie durch die Kapillare diffundieren können, ist minimiert. Es ist ebenfalls wahrscheinlich, dass das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese, das hochpolymere Polyanione einbezieht, die Diffusionskonstante senkt, was dann ebenfalls zu einem Anstieg von N führt.
Das initialisierte Verfahren zur kapillaren Elektrophorese verringert durch den Joule-Effekt die in den Kapillaren produzierte Wärmemenge proportional zu der Zeit, in der die Spannung angelegt wird, da die Analysezeit verkürzt wird. Hier wiederum führt weniger Wärme zu einer Senkung der Konvektionsstärke.
Bei der selben Konzentration variiert die Wirkungsstärke des initialisierten Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese von einem Initiator (Tabelle 1) zum anderen und von einem Polyanion zum anderen (Tabelle 2). Einige Polyanione zeigen die Wirkung bei sehr niedrigen Konzentrationen. Bei Konzentrationen über 1% können Nebeneffekte wie ein Anstieg der Viskosität, exzessive hoher Strom oder eine Umkehr der Wanderung auftreten. Für den Initiator und die Polyanione variieren die sich ergebenden Auswirkungen nichtlinear mit der Konzentration bis zu einem Maximum. Die Auswirkungen variieren mit dem Grad der Polymerisation (Tabellen 1 und 2). Daher variieren die anwendbaren Konzentrationen von Polyanion zu Polyanion als eine Funktion der Viskosität, Löslichkeit und Gelbildungseigenschaften des jeweiligen Polyanions.
Bei einem vorgegebenen Analyten differieren die Ionenpaarungskonstanten von einem Polyanion zu anderen, was bedeutet, dass das vorliegende Konzept ausgesprochen anpassungsfähig ist.
Der Wirkung der Polyanionen existiert in egal welcher Zusammensetzung des verwendeten Puffers, aber die Größenordnung eines vorgegebnen Polyanions kann von einem Puffer zum anderen variieren, selbst wenn beide den selben pH-Wert und/oder die selbe Ionenstärke aufweisen.
Beispiel 1 Tabellen 7–8–9–13)
Bedingungen:
Kapillare:

– 25 μ × 23 cm stabilisiert (die selbe Kapillare für alle Versuche).

Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: 0,142 M/L Apfelsäure, Arginin, pH-Wert 4,6.
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: Genau wie beim herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese, aber mit Chondroitinsulfat in unterschiedlichen Konzentrationen.
– Initiator: – 0,2% Albumin vom Schwein im Puffer des herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese.

Probe:

- Mischung aus para-substituierten Anilinen, Methoxy-, Methyl-, Fluor-, Chrom-, Brom- und Trifluormethoxyanilin und Dimethylformamid (Marker des elektroosmotischen Flusses) gelöst im Puffer des herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese.

Verfahren:
Die Probe wurde 9 Mal mit dem herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese analysiert und danach 9 Mal mit dem initialisierten Verfahren zur kapillaren Elektrophorese und jedes Mal mit einer erhöhten Anzahl an Polyanionen (hier Chondroitinsulfat).
Beispiel 2 (Tabelle 20)
Die selben Bedingungen wie bei Beispiel 1, aber die Probe ist eine äquimolare Mischung of Nikotinsäure, Isonikotinsäure und Picolinsäure und DMF, die 9 Mal analysiert wird.
sUm die selbe Probe anhand des herkömmlichen Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese zu analysieren, muss mit der Polaritätsumkehr gearbeitet werden (Tabelle 21).
Beispiel 3 (Tabelle 17)
Bedingungen:
Kapillare:
25 μ × 23 cm, in einem Phosphatpuffer stabilisiert.
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: Phosphatpuffer – 0,1 M/L pH-Wert 2,507 – 15 KV
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese Phosphatpuffer – 0,1 M/L pH 2,507 mit 0,1 Chondroitinsulfat 15 KV
– Initiator: Polybren 0,0005 % in Phosphatpuffer
– Probe: Nikotinsäure, Isonikotinsäure und Picolinsäure, DMF im herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese

Beispiel 4 (Tabelle 22)
Bedingungen:
Kapillare:
25 μ × 23 cm, in einem Phosphatpuffer stabilisiert.
Puffer:

– Herkömmliches Verfahren zur kapillaren Elektrophorese: Phosphat 0,1 M/L 0 025 M/LK SDS pH-Wert 7,027 – 12 KV
– Initialisiertes Verfahren zur kapillaren Elektrophorese Der selbe Puffer wie beim herkömmlichen Verfahren zur kapillaren Elektrophorese, aber mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen an Chondroitinsulfat
– Probe: Chlor-, Fluor-, Brom-, Methyl- und Methylphenylether – dreifach

Tabelle 8 MEKC Daten
Beispiel 5:
Bedingungen:
Separation von glykosyliertem Hämoglobin aus Hb und aus Hämoglobinvarianten wie HbF, HbS und HbC anhand des initialisierten Verfahrens zur kapillaren Elektrophorese.
Laufender Puffer:
– Apfelsäure: 20,44 g/l
Arginin: 40,15 g/L
Ethylenglykol: 1 g/L
Triton: 0,01 g/L
Chondroitinsulfate: 2,05 g/L
pH-Wert 4,651
Initiator:
Albumin von Pferd in einem Apfelsäure/Argininpuffer (jeweils 14 g und 27,5 g/L)
Probe:
Vollblut
Hämolysierte Lösung:
Apfelsäure 18,2 g/l, die mit Arginin, das 0,1 Ethylenglykol und 0,01% Triton enthält, auf pH-Wert 5,3 eingestellt wurde.
X-100, 1% Saponin, 1% Chondrotinsulfat.
Zubereitung der zu injizierenden Probe:
200 μl Vollblut mit 1000 μl hämolysierte Lösung versetzen und stark verrühren.
Verfahren:

1.30 Sekunden lang mit dem Initiator spülen.
2. 60 Sekunden lang mit dem laufenden Puffer spülen.
3.15 Sekunden lang die hämolysierte Lösung injizieren.
4. 6 Minuten lang bei 8,5 KV separieren, Detektion bei 415 nm.
5. 15 Sekunden lang mit NaOH 0,2 M/L spülen.
6. 105 Sekunden lang mit dem laufenden Puffer spülen.

In 1 sehen Sie einen Scan, der die Auflösung zwischen HbAla, HbAlb, HbAlc, Methämoglobin und HbA darstellt.
In 2 sehen Sie einen Scan, der die Auflösung zwischen HbAla, b, HbF, HbAlc, Methämoglobin, HbA und Hbs darstellt.

Claims

Verfahren zur Detektion und/oder Analyse mit Hilfe der Kapillarelektrophorese, welches die folgenden Schritte aufweist (a) dynamische Spülung einer gebrauchsfertigen Kapillare mit einem Initiator, wodurch eine initialisierte Kapillare erzeugt wird, wobei die besagte Kapillare ein Kathodenende und ein Anodenende aufweist und wobei der besagte Initiator ein Molekül oder eine Mischung von Molekülen enthält mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton und mit positiven Ladungen bei dem pH eines kapillaren Puffers, der in dem nachfolgenden Schritt (b) verwendet wird, wobei aus dem besagten Initiator ein Polykation wird, wenn er nur positive Ladungen trägt, und ein Polyelektrolyt wird, wenn er positive und negative Ladungen trägt; (b) Zugabe eines kapillaren Puffers in die besagte initialisierte Kapillare, wobei der besagte kapillare Puffer ein Polyanion oder eine Mischung von Polyanionen enthält; (c) Injektion einer Probe, die analysiert werden soll, in die besagte initialisierte Kapillare; und (d) Vornahme einer Kapillarelektrophorese an der besagten Probe.
Verfahren gemäss Anspruch 1, das zusätzlich den Schritt der Zugabe eines kathodischen Puffers zu dem Kathodenende der Kapillare umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 2, wobei der kathodische Puffer ein Polyanion oder eine Mischung von Polyanionen enthält.
Verfahren gemäss Anspruch 1, das zusätzlich den Schritt der Zugabe eines Verdünnungsmittels für Probe zu der besagten Probe umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei der besagte Initiator ein Polymerderivat oder eine Mischung von Polymerderivaten ist und die folgende Struktur aufweist:
wobei: – m × n > 12; – A aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, OH, NH₂, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe und einer heterocyclischen Gruppe besteht; – B aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, OH, NH₂, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe und einer heterocyclischen Gruppe besteht; – R¹ ... R^m Monomere in einem Polymer darstellen, wobei das besagte Polymer ein Homopolymer ist, wenn jedes der besagten Monomere, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, dasselbe ist, und wobei das besagte Polymer ein Heteropolymer ist, wenn mindestens eines der besagten Monomere, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, verschieden von den anderen Monomeren ist, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, wobei jedes der besagten Monomere aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Aminoalkylgruppe, einer Aminoarylgruppe, einer Aminoalkylarylgruppe oder einem aminoheterocyclischen Gerüst oder einer solchen Gruppe oder aus einem stickstoffhaltigen heterocyclischen Gerüst oder einer solchen Gruppe und aus deren Derivaten, aus einer basichen Aminosäure oder einer Peptidgruppe (welche mindestens eine basiche Aminosäure enthält) oder aus einem Alkyl-, Aryl-, Alkylarylgerüst oder heterocyclischen Gerüst oder einer solchen Gruppe besteht, und wobei jedes der besagten Monomere mit einer entsprechenden Y Gruppe und mit einer entsprechenden W Gruppe substituiert wird; – jede W Gruppe (W¹ ... W^m) ein Atom oder eine chemische Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, einem Imin, einem primären Amin, einem sekundären Amin, einem tertiären Amin, einem quaternären Amin, einer Guanidingruppe und einer Hydrazingruppe oder aus irgendeiner anderen Gruppe besteht; und – jede Y Gruppe (Y¹ . . . Y^m) ein Atom oder eine chemische Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H oder aus irgendeiner anderen Gruppe besteht, einschließlich eines Säureradikales; wobei der besagte Initiator eine positive netto Ladung bei dem pH des besagten kapillaren Puffers trägt.
Verfahren gemäss Anspruch 5, wobei jedes der besagten Monomere in dem besagten Initiator dasselbe ist, und wobei das besagte Monomer mindestens ein Stickstoffatom enthält.
Verfahren gemäss Anspruch 5, wobei der besagte Initiator ein Polypeptid oder ein Protein ist.
Verfahren gemäss Anspruch 5, wobei das besagte Polyanion aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Derivaten von Polysacchariden, Derivaten von synthetischen Polymeren, mehrsäurigen Aminosäuren, Polynukleotiden, Polyphosphorsäuren und aus einer Mischung aus irgendwelchen der vorgenannten Substanzen besteht.
Verfahren gemäss Anspruch 8, wobei das besagte Polyanion die folgende Struktur aufweist:
wobei: – m × n > 12; – A aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, OH, NH2, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe und einer heterocyclischen Gruppe besteht; – B aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, OH, NH2, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe und einer heterocyclischen Gruppe besteht; – R¹ ... R^m Monomere in einem Polymer darstellen, wobei das besagte Polymer ein Homopolymer ist, wenn jedes der Monomere, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, dasselbe ist, und wobei das besagte Polymer ein Heteropolymer ist, wenn mindestens eines der besagten Monomere, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, verschieden von den anderen Monomeren ist, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, wobei jedes der Monomere aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer P (Phosphor) Gruppe, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe und einer heterocyclischen Gruppe besteht, und wobei jedes dieser Monomere mit einer entsprechenden Y Gruppe und mit einer entsprechenden W Gruppe substituiert wird; – jede W Gruppe (W¹ . . . W^m) ein Atom oder eine chemische Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus OH, O, einem Säureradikal, einer Alkylgruppe, die ein Säureradikal trägt, einer Arylgruppe, die ein Säureradikal trägt, einer Alkylarylgruppe, die ein Säureradikal trägt, und einer heterocyclischen Gruppe, die ein Säureradikal trägt, besteht; und – jede Y Gruppe (Y¹ . . . Y^m) ein Atom oder eine chemische Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, OH, einem Säureradikal, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe, einer heterocyclischen Gruppe und aus Derivaten derselben, einem primären Amin, einem sekundären Amin, einem tertiären Amin, einem quaternären Amin, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus und aus einer Mischung aus irgendwelchen der vorgenannten Substanzen besteht; wobei das besagte Polyanion eine negative netto Ladung bei dem pH des besagten kapillaren Puffers trägt.
Verfahren gemäss Anspruch 9, wobei das besagte Säureradikal aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfatgruppe, einer Sulfonatgruppe und einer Phosphatgruppe besteht.
Verfahren gemäss Anspruch 9, wobei das besagte Polyanion H_n+2 P_n O_3n+1 ist und die folgende Struktur aufweist
wobei: – n > 12, – A H, OH ist – B H, OH ist.
Verfahren gemäss irgendeinem der Ansprüche 6, 9 oder 11, wobei das besagte Polyanion und der besagte Initiator in der besagten Kapillare in einer Menge vorhanden sind, die zwischen 10^–12% und 10% mit Bezug auf das Volumen der besagten Kapillare, liegt.
Einheit zur Detektion und/oder Analyse von Proben mit Hilfe der Kapillarelektrophorese, welche einen Initiator, einen kapillaren Puffer und/oder einen kathodischen Puffer enthält, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte kapillare Puffer und der besagte kathodische Puffer ein Polyanion oder eine Mischung von Polyanionen enthalten, wobei das Polyanion oder die Mischung von Polyanionen in mindestens einem kapillaren Puffer oder in dem kathodischen Puffer eingeschlossen ist, und dass der Initiator ein Molekül oder eine Mischung von Molekülen mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton enthält und eine positive Ladung bei dem pH des kapillaren Puffers trägt, wobei aus dem Initiator ein Polykation wird, wenn er nur positive Ladungen trägt, und ein Polyelektrolyt wird, wenn er positive und negative Ladungen trägt.
Einheit gemäss Anspruch 13, wobei der besagte Initiator ein Polymerderivat mit der folgenden Struktur ist:
wobei: – m × n > 12; – A aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, OH, NH₂, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe und einer heterocyclischen Gruppe besteht; – B aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, OH, NH₂, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe und einer heterocyclischen Gruppe besteht; – R¹ ... R^m Monomere in einem Polymer darstellen, wobei das besagte Polymer ein Homopolymer ist, wenn jedes der Monomere, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, dasselbe ist, und wobei das besagte Polymer ein Heteropolymer ist, wenn mindestens eines der besagten Monomere, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, verschieden von den anderen Monomeren ist, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, wobei jedes der Monomere aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Aminoalkylgruppe, einer Aminoarylgruppe, einer Aminoalkylarylgruppe oder aus einem aminoheterocyclischen Gerüst oder einer solchen Gruppe und aus deren Derivaten, aus einer Basisaminosäure oder Peptidgruppe (welche mindestens eine Basisaminosäure enthält) oder aus einem Alkyl-, Aryl-, Alkylarylgerüst oder einer solchen Gruppe oder aus einem stickstoffhaltigen heterocyclischen Gerüst oder einer solchen Gruppe besteht, und wobei jedes dieser Monomere mit einer entsprechenden Y Gruppe und mit einer entsprechenden W Gruppe substituiert wird; – jede W Gruppe (W¹ . . . W^m) ein Atom oder eine chemische Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, einem Imin, einem primären Amin, einem sekundären Amin, einem tertiären Amin, einem quaternären Amin, einer Guanidingruppe und aus einer Hydrazingruppe oder aus irgendeiner anderen Gruppe besteht; und – jede Y Gruppe (Y¹ ... Y^m) ein Atom oder meine chemische Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H oder aus irgendeiner anderen Gruppe, die ein Säureradikal mit einschließt, besteht; wobei der besagte Initiator eine positive netto Ladung bei dem pH des kapillaren Puffers trägt.
Einheit gemäss Anspruch 14, wobei jedes der besagten Monomere, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, in dem besagten Initiator dasselbe ist, und wobei das besagte Monomer mindestens ein Stickstoffatom enthält.
Einheit gemäss Anspruch 15, wobei der besagte Initiator ein Polypeptid oder ein Protein ist.
Einheit gemäss Anspruch 14, wobei das besagte Polyanion aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Derivaten der Polysacchariden, Derivaten der synthetischen Polymere, mehrsäurigen Aminosäuren, Polynukleotiden, Polyphosphorsäuren und aus einer Mischung aus irgendwelchen der vorgenannten Substanzen besteht.
Einheit gemäss Anspruch 17, wobei das besagte Polyanion die folgende Struktur aufweist:
wobei: – m × n > 12; – A aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, OH, NH₂, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe und einer heterocyclischen Gruppe besteht; – B aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, OH, NH₂, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe und einer heterocyclischen Gruppe besteht; – R¹ ... R^m Monomere in einem Polymer darstellen, wobei das besagte Polymer ein Homopolymer ist, wenn jedes der besagten Monomere, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, dasselbe ist, und wobei das besagte Polymer ein Heteropolymer ist, wenn mindestens eines der besagten Monomere, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, von den anderen Monomeren verschieden ist, die durch R¹ ... R^m dargestellt werden, wobei jedes der besagten Monomere aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer P (Phosphor) Gruppe, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe und aus einer heterocyclischen Gruppe besteht, und wobei jedes der besagten Monomere mit einer entsprechenden Y Gruppe und mit einer entsprechenden W Gruppe substituiert wird; – jede W Gruppe (W¹ . . . W^m) ein Atom oder eine chemische Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus OH, O, einem Säureradikal, einer Alkylgruppe, die ein Säureradikal trägt, Einer Arylgruppe, die ein Säureradikal trägt, einer Alkylarylgruppe, die ein Säureradikal trägt, und aus einer heterocyclischen Gruppe, die ein Säureradikal trägt, besteht; und – jede Y Gruppe (Y¹ . . . Y^m) ein Atom oder eine chemische Gruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus H, OH, einem Säureradikal, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe, einer Alkylarylgruppe, einer heterocyclischen Gruppe und Derivaten derselben, einem primären Amin, einem sekundären Amin, einem tertiären Amin, einem quaternären Amin, einem stickstoffhaltigen Heterocyclus und aus einer Mischung aus irgendwelchen der vorgenannten Substanzen, besteht; wobei das besagte Polyanion eine negative netto Ladung bei dem pH des besagten kapillaren Puffers trägt.
Einheit gemäss Anspruch 18, wobei das Säureradikal aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Carboxylgruppe, einer Sulfatgruppe, einer Sulfonatgruppe und einer Phosphatgruppe besteht.
Einheit gemäss Anspruch 19, wobei das Polyanion H_n+2 P_n O_3n+1 ist und die folgende Struktur aufweist:
wobei: – n > 12, – A H, OH ist – B H, OH ist.