DE69629114T2

DE69629114T2 - Ionisches molekularkonjugat von n-acylierten poly(2-amino-2deoxy-d-glucose) und polypeptide-derivaten

Info

Publication number: DE69629114T2
Application number: DE69629114T
Authority: DE
Inventors: Shalaby W. Shalaby; Steven A. Jackson; Francis Ignatious; Jeaques-Pierre Moreau
Original assignee: Kinerton Ltd
Current assignee: Ipsen Manufacturing Ireland Ltd
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2016-05-25
Also published as: AU717188B2; PT830137E; KR19990022399A; WO1996039160A1; CN1192152A; US5821221A; EP0830137B1; JPH11508289A; PL323735A1; CZ391697A3; CA2222995C; ES2201188T3; US5665702A; SK168397A3; AU5878996A; ATE245031T1; CA2222995A1; DE69629114D1; SI9620090A; BR9609031A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zur kontrollierten Freisetzung pharmazeutischer Polypeptide sind polymere Arzneimittelabgabesysteme entwickelt worden. Beispielsweise sind synthetische Polyester, wie Poly(DL-milchsäure), Poly(glykolsäure), Poly(milch-glykolsäure) und Poly(ε-caprolacton) in Form von Mikrokapseln, Folien oder Stäben verwendet worden, um biologisch aktive Polypeptide freizusetzen, siehe z. B. die US-A-4 767 628 und US-A-4 675 189 und die PCT-Anmeldung Nr. WO 94/00148.
Zusätzlich zu den synthetischen polymeren Ketten sind natürliche Polymere und deren Derivate als Komponenten in ähnlichen Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung verwendet worden, die durch enzymatischen Abbau dissoziieren. Ein Beispiel für derartige natürliche Polymere sind jene auf Basis von Chitin, einem Poly(N-acetylglucosamin). Da Chitin jedoch wasserunlöslich ist, sind von anderen solubilisierbare Derivate untersucht worden, die hauptsächlich auf partiell deacetyliertem Chitin basieren, z. B. Chitosan. Siehe z. B. Herausgeber P. A. Sanford et al., Advances in Chitin & Chitosan (1992). Obwohl sich Chitosan in einigen Pilzen findet, wird die Herstellung von biologisch abbaubarem Chitosan im Allgemeinen synthetisch durchgeführt. Siehe Mima et al., J. Appl. Polym. Sci. 28: 1909 bis 1917 (1983). Synthetische Derivate von Chitosan sind auch hergestellt worden, um die biologischen in vivo-Charakteristika des Polymers zu ändern. Siehe Muzzarelli et al., Carbohydrate Res. 207: 199 bis 214 (1980).
Die Verwendung von Chitin sowie Chitinderivaten ist in einer Reihe von Arzneimittelabgabesystemen vorgeschlagen worden. Siehe z. B. die EP-A-486 959, EP-A-482 649, EP-A1-525 813 und EP-A1-544 000 sowie die US-A-5 271 945.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Copolymer, das ein N-acyliertes Derivat von Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) einschließt, wobei zwischen 1 und 50% der freien Amine der Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) mit einer ersten Acylgruppe acyliert sind, wobei die erste Acylgruppe COE₁ ist, wobei E₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C_3-33-Carboxyalkyl, C_3-33-Carboxyalkenyl, C_7-39-Carboxyarylalkyl und C₉ _-39-Carboxyarylalkenyl, und zwischen 50 und 99% der freien Amine der Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) mit einer zweiten Acylgruppe acyliert sind, wobei die zweite Acylgruppe COE₂ ist, wobei E2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C_1-30-Alkyl, C_2- ₃₀-Alkenyl, C_6- ₃₇-Arylalkyl und C_8- ₃₇-Arylalkenyl, mit der Maßgabe, dass mindestens eines der freien Amine des Derivats mit der ersten Acylgruppe acyliert ist und bis zu 30% der freien Hydroxygruppen des Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) mit der ersten Acylgruppe oder der zweiten Acylgruppe acyliert sind.
Das Copolymer hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 3000 bis 90000 Dalton, bestimmt mittels Gelpermeationschromatographie oder irgendeinem analogen Verfahren. Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen sind über 90% der freien Amine der Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) mit entweder der ersten Acylgruppe oder der zweiten Acylgruppe acyliert. Vorzugsweise sind zwischen 10 und 30% des freien Amins der Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) mit der ersten Acylgruppe acyliert. Einige der freien Hydroxygruppen (z. B. zwischen 1 und 30%) des Derivats können mit entweder der ersten Acylgruppe oder der zweiten Acylgruppe acyliert sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform hat das Copolymer die Formel:
in der
R₁ für jede individuelle sich wiederholende Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H;
R₂ für jede individuelle sich wiederholende Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H;
R₃ für jede individuelle sich wiederholende Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H;
R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H;
R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H;
R₆ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H;
R₇ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus COH und CH₂OR₈;
R₈ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H;
n zwischen 2 und 200 liegt; und
für zwischen 1 und 50% der sich wiederholenden Einheiten R₁ die erste Acylgruppe ist, und für zwischen 50 und 99% der sich wiederholenden Einheiten R₁ die zweite Acylgruppe ist, mit der Maßgabe, dass für mindestens eine der sich wiederholenden Einheiten R₁ die erste Acylgruppe ist.
Die Begriffe COE₁ und COE₂ stehen für -C=O·E₁ beziehungsweise -C=O·E₂. Die Carboxyalkyl-, Carboxyalkenyl-, Carboxyarylalkyl- und Carboxyarylalkenylsubstituenten können 1 bis 4 Carbonsäurefunktionalitäten enthalten. Beispiele für die erste Acylgruppe schließen Succinyl, 2-(C₁- bis C₃₀-Alkyl)succinyl, 2-(C₂- bis C₃₀-Alkenyl)succinyl, Maleyl, Phthalyl, Glutaryl und Itaconyl ein. Beispiele für die zweite Acylgruppe schließen Acetyl, Benzoyl, Propionyl und Phenylacetyl ein, sind jedoch nicht auf diese begrenzt.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch eine Zusammensetzung, die das obige Copolymer und Polypeptid einschließt, wobei das Polypeptid mindestens ein effektives ionogenes Amin umfasst, wobei mindestens 50 Gew.% des in der Zusammensetzung vorhandenen Polypeptids ionisch an das Polymer gebunden sind. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise zwischen 5 und 50 Gew.% des Polypeptids.
Beispiele für geeignete Polypeptide schließen Wachstumshormon freisetzendes Peptid (GHRP), luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH), Somatostatin, Bombesin, Gastrin freisetzendes Peptid (GRP), Calcitonin, Bradykinin, Galanin, Melanocyt stimulierendes Hormon (MSH), Wachstumshormon freisetzenden Faktor (GRF), Wachstumshormon (GH), Amylin, Tachykinine, Sekretin, Parathyroidhormon (PTH), Enkephalin, Endothelin, Calcitonin-Gen freisetzendes Peptid (CGRP), Neuromedine, mit Parathyroidhormon verwandtes Protein (PTHrP), Glukagon, Neurotensin, adrenocorticothropes Hormon (ACTH), Peptid YY (PYY), Glukagon freisetzendes Peptid (GLP), vasoaktives Intestinalpeptid (VIP), hypophysäre Adenylatcyclase aktivierendes Peptid (PACAP), Motilin, Substanz P, Neuropeptid Y (NPY), TSH und biologisch aktive Analoga davon ein. Der Begriff "biologisch aktive Analoga" wird hier verwendet, um natürlich vorkommende, rekombinante und synthetische Peptide, Polypeptide und Proteine mit physiologischer oder therapeutischer Wirkung abzudecken. Im Allgemeinen deckt der Begriff alle Fragmente und Derivate eines Peptids, Proteins oder eines Polypeptids ab, das eine qualitativ ähnliche Agonist- oder Antagonistwirkung zu derjenigen des nicht modifizierten oder natürlich vorkommenden Peptids, Proteins oder Polypeptids zeigt, z. B. jene, in denen einer oder mehrere der Aminosäurereste, die in den natürlichen Verbindungen vorkommen, substituiert oder entfernt worden sind, oder bei denen die N- oder C-terminalen Reste in der Struktur modifiziert worden sind. Der Begriff effektives ionogenes Amin bezieht sich auf ein freies Amin, das auf dem Polypeptid vorhanden und in der Lage ist, eine ionische Bindung mit den freien Carboxylgruppen an dem Copolymer zu binden.
Die Freisetzung des Polypeptids aus der Zusammensetzung kann durch Veränderung der chemischen Struktur der Zusammensetzung modifiziert werden. Das Erhöhen des Molekulargewichts des Polymers verringert die Rate des von dem Konjugat freigesetzten Peptids. Das Erhöhen der Anzahl der Carbonsäuregruppen an dem Polymer erhöht die Menge an Polypeptid, die ionisch an die Zusammensetzung gebunden ist, und erhöht demzufolge die Freisetzungsmenge des Peptids aus dem Konjugat.
Die Freisetzung des Polypeptids kann ferner durch (a) Behandeln der Zusammensetzung mit löslichen Salzen zweiwertiger oder mehrwertiger Metallionen von schwachen Säuren (z. B. Calcium, Eisen, Magnesium oder Zink); (b) Beschichten der Teilchen mit einer dünnen absorbierbaren Schicht, die aus Glykolidcopolymer oder Silikonöl gefertigt ist, in kugeliger, zylindrischer oder planarer Anordnung, oder (c) Mikroverkapseln der Zusammensetzung in einem absorbierbaren Glykolidcopolymer moduliert werden. Gemäß einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung zwischen 0,01 und 20 Gew.% mehrwertiges Metall.
In Abhängigkeit von der Auswahl des Polypeptids können die Zusammensetzungen verwendet werden, um eine beliebige Zahl von Befindlichkeitsstörungen zu behandeln. Es ist beispielsweise gezeigt worden, dass Somatostatin, Bombesin, GRP, LHRH und Analoga davon verschiedene Formen von Krebs behandeln. Es ist gezeigt worden, dass Wachstumsfaktoren wie GH, GRF und GHRP und Analoga davon das Wachstum sowohl bei Erwachsenen als auch älteren Individuen stimulieren. Es ist gezeigt worden, dass Calcitonin, Amylin, PTH und PTHrP und Analoga davon Osteoporose und andere Knochenerkrankungen behandeln.
Die Zusammensetzungen sind zur parenteralen Verabreichung vorgesehen, z. B. zur intramuskulären, subkutanen, intraduralen oder intraperitonealen Injektion. Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise intramuskulär verabreicht.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in Form von Pulver oder einem Mikroteilchen zur Verabreichung als Suspension mit pharmazeutisch annehmbaren Vehikel (z. B. Wasser mit oder ohne Trägersubstanz wie Mannitol oder Polysorbat) vorliegen. Die Zusammensetzungen können auch in Form eines Stabs zur parenteralen Implantierung unter Verwendung eines Trokars kompoundiert sein, z. B. intramuskuläre Implantation.
Die Dosis der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Behandlung der oben genannten Erkrankungen oder Befindlichkeitsstörungen variiert in Abhängigkeit von der Verabreichungsweise, dem Alter und dem Körpergewicht des Individuums und dem Zustand des zu behandelnden Individuums und wird letztendlich durch den behandelnden Arzt oder Tierarzt festgelegt. Eine derartige durch den behandelnden Arzt oder Tierarzt festgelegte Menge der Zusammensetzung wird hier als "therapeutisch wirksame Menge" bezeichnet.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren eines Copolymers, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, in denen Chitosan mit einer schwachen Säure umgesetzt wird, um Polysaccharid mit niedrigerem Molekulargewicht zu erzeugen; zwischen 1 und 50% der freien Amine des Polysaccharids mit niedrigerem Molekulargewicht mit erstem Acylierungsmittel umgesetzt werden, wobei das erste Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C₄- bis C₃₄-Polycarboxyalkan, C₄- bis C₃₄-Polycarboxyalken, C₈- bis C₄₀-Polycarboxyarylalkan, C₁₀- bis C₄₀-Polycarboxyarylalken oder einem acylierenden Derivat derselben; und zwischen 50 und 100 des freien Amins des Polysaccharids mit niedrigerem Molekulargewicht mit zweitem Acylierungsmittel umgesetzt werden, wobei das zweite Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C₂- bis C₃₁-Monocarboxyalkan, C₃- bis C₃₁-Monocarboxyalkan, C₇- bis C₃₈-Monocarboxyarylalkan, C₉- bis C₃₅-Monocarboxyarylalken oder einem acylierenden Derivat derselben. Die Reaktion des Polysaccharids mit niedrigerem Molekulargewicht mit sowohl dem ersten Acylierungsmittel als auch dem zweiten Acylierungsmittel kann mit einem Aminnachweismittel (z. B. Fluorescamin) gemessen werden, um zu gewährleisten, dass zwischen 1 und 50% der freien Amine des Polysaccharids mit niedrigerem Molekulargewicht mit dem ersten Acylierungsmittel acyliert sind und zwischen 50 und 99% der freien Amine des Polysaccharids mit dem niedrigeren Molekulargewicht mit dem zweiten Acylierungsmittel acyliert sind. Siehe z. B. P. D. Bailey, An Introduction to Peptide Chemistry (Wiley, NY, USA) (1990); H. Oppenheimer et al., Archives Biochem. Biophys. 120: 108–118 (1967); S. Stein, Arch. Biochem. Biophys. 155: 203 bis 212 (1973).
Die Umsetzung von Chitosan mit der schwachen Säure (z. B. Salpetrigsäure) spaltet das Polymer, wodurch dessen Molekulargewicht verringert wird (z. B. 2500 bis 80000 Dalton). Gemäß bevorzugten Ausführungsformen werden die erste acylierende Gruppe und das zweite Acylierungsmittel nacheinander mit dem Polysaccharid mit niedrigerem Molekulargewicht umgesetzt, z. B. wird entweder das erste Acylierungsmittel umgesetzt, bevor das zweite Acylierungsmittel umgesetzt wird, oder das zweite Acylierungsmittel wird vor dem ersten Acylierungsmittel umgesetzt, oder gleichzeitig. Als Ergebnis der Acylierung der freien Amine können einige der freien Hydroxygruppen des Polysaccharids mit niedrigerem Molekulargewicht acyliert werden. Das Ausmaß der Acylierung der freien Hydroxygruppen kann geändert werden, indem der pH-Wert oder die Lösungsmittel oder die Mittel, die während der Acylierungsreaktionen verwendet werden, oder die verwendeten Acylierungsmittel verändert werden.
Beispiele für Acylierungsderivate schließen Anhydride und N-acylierte Heterocyclen (z. B. Imidazole und Pyrazole) ein, sind jedoch nicht auf diese begrenzt. Siehe z. B. Bodansky et al., The Practice of Peptide Synthesis, 87 bis 150 (Springer Verlag, 1984). Die Polycarboxyalkan-, Polycarboxyalken-, Polycarboxyarylalkan- und Polycarboxyarylalkenmittel oder acylierende Derivate davon enthalten oder entstammen Reaktanten, die 2 bis 5 Carbonsäurefunktionalitäten enthalten. Die Monocarboxyalkan-, Monocarboxyalken-, Monocarboxyarylalkan- und Monocarboxyarylalkensubstituenten enthalten oder entstammen Reaktanten, die nur eine einzige Carbonsäuregruppe enthalten. Beispiele für erste Acylierungsmittel schließen Bernsteinsäureanhydrid, 2-(C₁- bis C₃₀-Alkyl)bernsteinsäureanhydrid, 2- (C₂- bis C₃₀-Alkenyl)bernsteinsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid, Glutarsäureanhydrid, Itaconsäureanhydrid und Phthalsäureanhydrid ein, sind jedoch nicht auf diese begrenzt. Beispiele für zweite Acylierungsmittel schließen Acetanhydrid, Benzoesäureanhydrid, N,N'-Diacetyl-3,5-dimethylpyrazol, N,N'-Diacetyl-imidazol, Phenylessigsäureanhydrid, Propionsäureanhydrid und Buttersäureanhydrid ein, sind jedoch nicht auf diese begrenzt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren einer Zusammensetzung, das die Stufen umfasst, in denen Chitosan mit einer schwachen Säure umgesetzt wird, um Polysaccharid mit niedrigerem Molekulargewicht zu erzeugen; zwischen 1 und 50% der freien Amine des Polysaccharids mit niedrigerem Molekulargewicht mit erstem Acylierungsmittel umgesetzt werden, wobei das erste Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C₄- bis C₃₄-Polycarboxyalkan, C₄- bis C₃₄-Polycarboxyalken, C₈- bis C₄₀-Polycarboxyarylalkan, C₁₀- bis C₄₀-Polycarboxyarylalken oder acylierendem Derivat davon; zwischen 50 und 100% des freien Amins des Polysaccharids mit niedrigerem Molekulargewicht mit zweitem Acylierungsmittel umgesetzt werden, wobei das zweite Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C₂- bis C₃₁-Monocarboxyalkan, C₃- bis C₃₁-Monocarboxyalkan, C₇- bis C₃₈-Monocarboxyarylalkan, C₉- bis C₃₅-Monocarboxyarylalken oder acylierendem Derivat davon; das acylierte Polysaccharid mit niedrigerem Molekulargewicht mit Base neutralisiert wird und das neutralisierte acylierte Polysaccharid mit niedrigerem Molekulargewicht mit Polypeptidsalz gemischt wird, wobei das Polypeptidsalz mindestens ein ionogenes Amin umfasst, um ein ionisches Polypeptid-Copolymer-Konjugat zu bilden.
Die Neutralisierungsstufe macht das Polysaccharid mit niedrigerem Molekulargewicht vorzugsweise in Wasser emulgierbar oder löslich. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Base eine anorganische Base (z. B. Natriumhydroxid). Das Polypeptidsalz ist vorzugsweise ein Salz einer schwachen Säure (z. B. Acetat, Laktat oder Citrat). Das ionische Konjugat kann durch Filtrieren oder Zentrifugieren der resultierenden Mischung isoliert werden.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können leicht zu injizierbaren Mikrokugeln oder Mikroteilchen sowie implantierbaren Folien oder Stäben verarbeitet werden, ohne dass Verarbeitung verwendet werden muss, die Mehrphasenemulsionen erfordern. Die Mikrokugeln werden vorzugsweise hergestellt, indem (a) die Zusammensetzung in aprotischem, wassermischbarem, organischem Lösungsmittel aufgelöst wird; (b) das organische Lösungsmittel in Wasser gemischt wird; und (c) die Mikroteilchen aus dem Wasser isoliert werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist das organische Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe aus Aceton, Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und Dimethylethylenglykol.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen hervor.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Synthese und Verwendung des erfindungsgemäßen Copolymers und der erfindungsgemäßen ionischen Copolymer-Polypeptid-Konjugate gehören zu dem Können von Durchschnittsfachleuten. wenn nicht anderweitig definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, die der Durchschnittsfachmann üblicherweise darunter versteht, an den sich diese Erfindung richtet. Alle hier genannten Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und anderen Druckschriften werden hier zitiert zum Zweck der Bezugnahme.
Es wird angenommen, dass ein Durchschnittsfachmann basierend auf der hier gegebenen Beschreibung die vorliegende Erfindung in vollem Maße nutzen kann. Die folgenden spezifischen Ausführungsformen sollen daher lediglich als veranschaulichend und nicht als den Rest der Offenbarung in irgendeiner Weise einschränkend angesehen werden.
BEISPIEL 1: DEPOLYMERISATION VON CHITOSAN
Chitosan (Protan, Inc., Portsmouth, NH, USA) wurde in wässriger Essigsäure gelöst, indem einen Tag mit einem mechanischen Rührer gerührt wurde. Stickstoffgas wurde durch die Lösung geblasen, während eine wässrige Lösung von Natriumnitrit zugefügt wurde. Nach einer halben Stunde wurde die Lösung unter vermindertem Druck durch einen gesinterten Glastrichter filtriert, um unlösliche Teilchen zu entfernen, die in der anfänglichen Chitosanlösung vorhanden waren. Zu der filtrierten Lösung wurde eine wässrige Lösung von NaOH gegeben, und die Lösung wurde in Methanol kräftig gerührt, um das Polymer auszufällen. Der resultierende Niederschlag wurde dann filtriert und alternierend fünf Mal mit Wasser und Methanol gewaschen. Der Niederschlag wurde dann zwei Tage lang bei 60°C in einem Vakuumofen getrocknet. Das depolymerisierte Chitosan umfasst eine Aldehydgruppe an einem Ende der Kette. Die Aldehydendgruppe kann durch Umsetzung mit NaBH₄ zu einer primären Hydroxylgruppe reduziert werden. Das depolymerisierte Produkt kann durch Gelpermeationschromatographie (GPC) analysiert werden, um sowohl sein Molekulargewicht als auch seine Molekulargewichtsverteilung (MD) im Vergleich zu Pullulan-Referenzstandards zu ermitteln. NMR- (Kernresonanz)- und IR- (Infrarot)Untersuchungen können verwendet werden, um die Menge an N-Acetylierung an dem depolymerisierten Produkt zu ermitteln.
BEISPIEL 2: PARTIELLE SUCCINYLIERUNG VON DEPOLYMERISIERTEM CHITOSAN
Das depolymerisierte Chitosan aus Beispiel 1 wurde in 0,1 M wässriger Essigsäure gelöst. Zu dieser Lösung wurde Methanol gegeben, gefolgt von Zugabe einer Lösung von Bernsteinsäureanhydrid in Aceton. Die resultierende Lösung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Succinylierung wurde die Lösung dann in wässrigem Aceton ausgefällt. Der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugieren aufgefangen und fünf Mal mit Methanol gewaschen. Der Niederschlag wurde dann in 0,5 M KOH gelöst und gegen Wasser auf einen pH-Wert von 7 dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde dann unter reduziertem Druck konzentriert, in wässrigem Aceton ausgefällt und in einem Vakuumofen bei 60°C getrocknet.
Um unterschiedliche Succinylierungsniveaus zu erhalten, kann das Ausmaß der Umsetzung überwacht werden, wenn die Acylierung voranschreitet, indem auf Anzahl der nicht-acylierten Amingruppen analysiert wird. Die Anzahl der nicht-acylierten Amingruppen kann bestimmt werden, indem eine gezogene Probe der Reaktionsmischung mit einem Aminnachweismittel (z. B. Fluorescamin) gequencht wird. Die vorhandene Aminmenge kann spektrophotometrisch unter Verwendung einer Standardkurve für das Copolymer gemessen werden. Außerdem kann somit Bernsteinsäurechlorid nachfolgend zugegeben werden, bis der gewünschte Acylierungsprozentsatz erreicht ist. Der genaue Succinylierungsgrad des gereinigten Produkts kann unter Verwendung von ¹H-NMR-Spektroskopie und konduktometrischer Titration ermittelt werden.
BEISPIEL 3: ACETYLIERUNG DES N-SUCCINYLIERTEN CHITOSANS
Die partiell succinylierte Probe aus Beispiel 2 wurde in 0,1 M wässriger Essigsäure gelöst. Zu dieser Lösung wurden dann Methanol und Essigsäureanhydrid gegeben, und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur einen Tag lang gerührt. Diese Lösung wurde dann in wässrigem Aceton ausgefällt. Der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugieren aufgefangen und fünf Mal mit Methanol gewaschen. Der Niederschlag wurde dann in 0,1 N KOH gelöst und gegen Wasser auf einen pH-Wert von 7 dialysiert. Die fertige Lösung wurde lyophilisiert, um das Endprodukt zu erhalten. Das Acylierungsverfahren kann spektrophotometrisch wie in Beispiel 2 erörtert gemessen werden, und der genaue Acylierungsgrad des gereinigten Produkts kann unter Verwendung von ¹H-NMR-Spektroskopie und konduktometrischer Titration ermittelt werden.
BEISPIEL 4: HERSTELLUNG VON IONISCHEM POLY(N-ACYL-D-GLUCOSAMIN)PEPTID-KONJUGAT
Das N-succinylierte Chitosan-Kaliumsalz von Beispiel 3 wurde in Wasser gelöst. Eine wässrige Lösung des Acetatsalzes des Somatostatin-Polypeptids, das analog zu SOMATULINE^TM (D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH₂; Kinerton, Dublin, Irland) war, wurde der gerührten Polymerlösung zugefügt. Es bildete sich ein Niederschlag, der abfiltriert und im Vakuumofen bei 40°C getrocknet wurde.
Der Polypeptidgehalt des resultierenden ionischen Konjugats kann durch den Unterschied zwischen der Menge an anfangs zugegebenen Peptid und der Menge an freiem Restpeptid, die in dem Filtrat und der Spüllösung vorhanden ist, ermittelt werden. Der Peptidgehalt des resultierenden ionischen Konjugats kann bestimmt werden, indem das Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis des anfänglichen N-succinylierten Chitosans mit demjenigen des resultierenden ionischen Konjugats verglichen wird. GPC-Analyse kann verwendet werden, um Molekulargewicht und MWD zu bestimmen, Differentialscanningkalorimetrie (DSC) kann zur Bestimmung der thermischen Eigenschaften und NMR und IR für die chemische Identität verwendet werden.
ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es sei darauf hingewiesen, dass, obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit ihrer detaillierten Beschreibung beschrieben worden ist, die vorhergehende Beschreibung illustrieren und den Umfang der Erfindung nicht einschränken, soll, der durch den Umfang der angefügten Ansprüche definiert ist. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen sind innerhalb der Ansprüche.

Claims

Copolymer, das ein N-acyliertes Derivat von Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) umfasst, wobei zwischen 1 und 50% der freien Amine der Poly(s-amino-x-deoxy-D-glucose) mit einer ersten Acylgruppe acyliert sind, wobei die erste Acylgruppe COE₁ ist, wobei E₁ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C_3- ₃₃-Carboxyalkyl, C_3- ₃₃-Carboxyalkenyl, C_7-39-Carboxyarylalkyl und C_9- ₃₉-Carboxyarylalkenyl, zwischen 50 und 99 der freien Amine der Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose mit einer zweiten Acylgruppe acyliert sind, wobei die zweite Acylgruppe COE₂ ist, wobei E₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C_1- ₃₀-Alkyl, C_2- ₃₀-Alkenyl, C_6- ₃₇-Arylalkyl und C_8- ₃₇-Arylalkenyl, mit der Maßgabe, dass mindestens eines der freien Amine der Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) mit der ersten Acylgruppe acyliert ist und bis zu 30% der freien Hydroxygruppen der Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) mit der ersten Acylgruppe oder der zweiten Acylgruppe acyliert sind.
Copolymer nach Anspruch 1, bei dem Copolymer ein Molekulargewicht von etwa 3000 bis 90000 Dalton hat, bestimmt mittels Gelpermeationschromatographie.
Copolymer nach Anspruch 1, bei dem über 90% der freien Amine der Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) mit entweder der ersten Acylgruppe oder der zweiten Acylgruppe acyliert sind.
Copolymer nach Anspruch 1, bei dem zwischen 10 und 30% der freien Amine der Poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) mit der ersten Acylgruppe acyliert sind.
Copolymer nach Anspruch 1, bei dem das Copolymer die Formel
hat, wobei R₁ für jede individuelle sich wiederholende Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H; R₂ für jede individuelle sich wiederholende Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H; R₃ für jede individuelle sich wiederholende Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H; R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H; R₅ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H; R₆ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H; R₇ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus COH und CH₂OR₈; R₈ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erster Acylgruppe, zweiter Acylgruppe und H; n zwischen 2 und 200 ist; und für zwischen 1 bis 50% der Einheiten R₁ erste Acylgruppe ist und für zwischen 50 und 99% der sich wiederholenden Einheiten R₁ zweite Acylgruppe ist, mit der Maßgabe, dass für mindestens eine der sich wiederholenden Einheiten R₁ erste Acylgruppe ist.
Copolymer nach Anspruch 1, bei dem die erste Acylgruppe COE₁ ist, wobei E₁ C₃- bis C₃₃-Carboxyalkyl ist.
Copolymer nach Anspruch 6, bei dem die erste Acylgruppe Succinyl ist.
Copolymer nach Anspruch 7, bei dem die zweite Acylgruppe Acetyl ist und R₇ COH oder CH₂OH ist.
Zusammensetzung, die das Copolymer gemäß Anspruch 1 und ein Polypeptid, umfasst, wobei das Polypeptid mindestens ein wirksames ionogenes Amin umfasst, wobei mindestens 50 Gew.% des in der Zusammensetzung vorhandenen Polypeptids ionisch an das Polymer gebunden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, die zwischen 5 und 50 Gew.% des Polypeptids umfasst.
Zusammensetzung, die das Copolymer gemäß Anspruch 5 und ein Polypeptid umfasst, wobei das Polypeptid mindestens ein wirksames ionogenes Amin umfasst, wobei mindestens 50 Gew.% des in der Zusammensetzung vorhandenen Polypeptids ionisch an das Polymer gebunden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, die zwischen 5 und 50 Gew.% des Polypeptids umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, bei der das Polypeptid Somatostatin oder ein Somatostatinanaloges ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, bei der die erste Acylgruppe Succinyl ist und die zweite Acylgruppe Acetyl ist.
Verfahren zum Synthetisieren eines Copolymers, das die Stufen umfasst: Umsetzen von Chitosan mit einer schwachen Säure, um ein Polysaccharid mit niederem Molekulargewicht zu produzieren; Umsetzen von zwischen 1 und 50% der freien Amine des Polysaccharids mit niederem Molekulargewicht mit einem ersten Acylierungsmittel, wobei das erste Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C_4- ₃₄-Polycarboxyalkan, C_4- ₃₄-Polycarboxyalken, C_8- ₄₀-Polycarboxyarylalkan, C_10- ₄₀-Polycarboxyarylalken oder einem acylierenden Derivat derselben; und Umsetzen von zwischen 50 und 100% des freien Amins des Polysaccharids mit niederem Molekulargewicht mit einem zweiten Acylierungsmittel, wobei das zweite Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C_2- ₃₁-Monocarboxyalkan, C_3- ₃₁-Monocarboxyalken, C_7-38-Monocarboxyarylalkan, C₉ _-35-Monocarboxyarylalken oder einem acylierenden Derivat derselben.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem der Prozentsatz der freien Amine, die acyliert sind, durch Verwendung eines Nachweismittels für freies Amin ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das erste Acylierungsmittel Bernsteinsäureanhydrid ist, das zweite Acylierungsmittel Essigsäureanhydrid ist und die schwache Säure salpetrige Säure ist.
Verfahren zum Synthetisieren einer Zusammensetzung, das die Stufen umfasst Umsetzen von Chitosan mit einer schwachen Säure, um ein Polysaccharid mit niederem Molekulargewicht zu produzieren; Umsetzen von zwischen 1 und 50% der freien Amine des Polysaccharids mit niederem Molekulargewicht mit einem ersten Acylierungsmittel, wobei das erste Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C_4- ₃₄-Polycarboxyalkan, C_4- ₃₄-Polycarboxyalken, C₈_₄₀-Polycarboxyarylalkan, C_10-40-Polycarboxyarylalken oder einem acylierenden Derivat derselben; und Umsetzen von zwischen 50 und 100% des freien Amins des Polysaccharids mit niederem Molekulargewicht mit einem zweiten Acylierungsmittel, wobei das zweite Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus COOH, C_2- ₃₁-Monocarboxyalkan, C_3- ₃₁-Monocarboxyalken, C_1-38-Mono-carboxyarylalkan, C_9-35-Monocarboxyarylalken oder einem acylierenden Derivat derselben; Neutralisieren des acylierten Polysaccharids mit niederem Molekulargewicht mit einer Base; und Mischen des neutralisierten acylierten Polysaccharids mit niederem Molekulargewicht mit einem Polypeptidsalz, wobei das Polypeptidsalz mindestens ein ionogenes Amin umfasst, um ein ionisches Polypeptid-Copolymer-Konjugat zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem der Prozentsatz der freien Amine, die acyliert sind, unter Verwendung eines Nachweismittels für freies Amin ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das erste Acylierungsmittel Bernsteinsäureanhydrid ist, das zweite Acylierungsmittel Essigsäureanhydrid ist und die schwache Säure salpetrige Säure ist.