DE69630691T2 - Liposomal p-Ethoxy Oligonucleotides - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft liposomale Zusammensetzungen von bestimmten Antisense-p-Ethoxyoligonukleotiden. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung solcher Zusammensetzungen in der Heiltherapie.
  • Antisense-Oligonukleotide (Oligos), die komplementär zu spezifischen Regionen der Ziel-mRNA sind, hat man zur Hemmung der Expression endogener Gene eingesetzt. Wenn die Antisense-Oligonukleotide an die Ziel-mRNA binden, entsteht ein DNA-RNA-Hybrid. Diese Hybridbildung hemmt die Translation der mRNA und, infolgedessen, die Genexpression des Proteins. Ist das Protein für das Überleben der Zelle essentiell, kann die Hemmung seiner Expression zum Zelltod führen. Daher können Antisense-Oligonukleotide bei Therapien zur Bekämpfung von Krebs und Viren nützliche Werkzeuge sein.
  • Wesentliche Schwierigkeiten, Antisense-Oligonukleotide zur Hemmung der Genexpression zu verwenden, sind ihre zelluläre Instabilität, ihre schlechte Aufnahme in die Zelle und ihre dürftige intrazelluläre Verteilung. Natürliche Phosphodiester sind gegenüber Hydrolyse durch Nukleasen nicht resistent; daher sind hohe Konzentrationen an Antisense-Oligonukleotiden nötig, um einen hemmenden Effekt beobachten zu können. Modifizierte Phosphodiester-Analoge wie Phosphorothioate hat man hergestellt, um das Problem der Hydrolyse durch Nukleasen zu beheben, aber sie bieten keine vollständig zufrieden stellende Lösung des Problems.
  • Die zelluläre Aufnahme von Antisense-Oligonukleotiden ist gering. Zur Lösung dieses Problems hat man physikalische Verfahren wie Kalziumphosphat-Fällung, DEAE-Dextran-vermittelte Aufnahme oder Elektroporation eingesetzt, um die zelluläre Aufnahme der Oligonukleotide zu verbessern. Diese Verfahren sind schwierig zu reproduzieren und in vivo nicht anwendbar.
  • Weitere modifizierte Phosphodiester-(PD)-Analoge, die hergestellt wurden, sind p-Ethoxy-(pE)-Oligos. Die Modifizierungen von pE-Oligos werden in dem Phosphatrückgrat vorgenommen, damit durch die Modifizierung die Bindung dieser Oligos an die Ziel-mRNA nicht beeinträchtigt ist. pE-Oligos werden hergestellt, indem eine Ethylgruppe an das nicht-verbrückte Sauerstoffatom des Phosphatrückgrats gehängt wird, wodurch diese Oligos ungeladen werden. Trotz ihrer Resistenz gegenüber Nukleasen ist die zelluläre Aufnahme und die intrazelluläre Verteilung von pE-Oligos nach wie vor gering, da diese Oligos nach Internalisierung in die Zelle innerhalb der endosomalen/lysosomalen Vakuolen verbleiben und ihr Zugang zur Ziel-mRNA somit unterbunden ist.
  • DE 41 10 085 offenbart Verfahren zur Herstellung von 2'-O-Alkyl-Oligoribonukleotide und deren Verwendung als Antisense-Oligonukleotide.
  • WO 95/03788 offenbart liposomale Methylphosphonatoligonukleotid-Zusammensetzungen, die bei der Behandlung von chronischer myeloider Leukämie nützlich sind.
  • Akhtar et al., Nucleic Acids Research (1991) 19: 5551–5559, beschreibt die Wechselwirkung bestimmter Oligonukleotide, andere als p-Ethoxy-Oligonukleotide, mit Phospholipidmembranen und die Eigenschaften bestimmter Oligonukleotid-Analoge, solche Membranen zu durchdringen.
  • Stein und Cheng, Science (1993) 261: 1004–1012, beschreiben die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden als therapeutische Mittel, im Detail werden Phosphodiester, Phosphorothioat und Methylphosphonat-Oligonukleotide diskutiert.
  • WO 97/04787 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein gegen menschliches raf gerichtetes Oligonukleotid, welches in sterisch stabilisierten Liposomen, bei denen ein Teil des Lipids ein Glykolipid, ein mit einem hydrophilen Polymer derivatisiertes Lipid oder ein Lipidpolymerkonjugat ist, eingeschlossen ist.
  • Es besteht Bedarf an verbesserten Antisense-Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten und Bedarf an Verfahren zur Herstellung solcher verbesserter Zusammensetzungen.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine liposomale Zusammensetzung von Antisense-Oligonukleotiden. Die Zusammensetzung umfasst (a) ein Liposom, das im Wesentlichen aus ungeladenen Phospholipiden besteht und im Wesentlichen frei von Cholesterin ist und (b) ein Antisense-Oligonukleotid, das in dem Liposom eingeschlossen ist und ein p-Ethoxyoligonukleotid ist. Die Phospholipide sind bevorzugt Phosphatidylcholine. Ein besonders bevorzugtes Phospholipid ist Dioleoylphosphatidylcholin. Wenn das Antisense-Oligonukleotid ein p-Ethoxyoligonukleotid ist, liegt das bevorzugte molare Verhältnis von Phospholipid zu Oligo zwischen 5 : 1 und 100 : 1.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer liposomalen Zusammensetzung von Antisense-Oligonukleotiden. Das Verfahren umfasst die Schritte (a) Hydratisieren einer lyophilisierten Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus ungeladenen Phospholipiden besteht und im Wesentlichen frei von Cholesterin ist und ein Antisense-Oligonukleotid, das ein p-Ethoxyoligonukleotid ist, wodurch sich eine wässrige Suspension bildet, die freie Oligonukleotide und Oligonukleotide einschließende Liposomen enthält; und (b) Trennen der freien Oligonukleotide von den Liposomen mittels Dialyse. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die wässrige Suspension vor der Dialyse mit Ultraschall behandelt.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stellen ein verbessertes Transportsystem für Antisense-Oligos, zum Beispiel für solche, die in der Therapie gegen Krebs verwendet werden, dar. Verglichen mit Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik bewirken die liposomalen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung neben einer verringerten Hydrolyse der Oligos durch Nukleasen eine erhöhte zelluläre Aufnahme und einen erhöhten intrazellulären Transport der Antisense-Oligos. Wenn solche Zusammensetzungen zum Transport von Oligos, welche die Expression eines in Krebszellen aber nicht in normalen Zellen vorhandenen Gens hemmen, verwendet werden, sind die therapeutischen Ergebnisse besser. Krebsformen gäbe es zahlreiche, wobei Leukämie ein bedeutendes Beispiel darstellt.
  • Verglichen mit liposomalen Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik verstärken die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch den Einbau von Oligos in die Liposomen.
  • 1A und 1B sind Photographien, welche die Aufnahme von (A) freien und (B) lioposomalen pE-Oligos durch ALL-1-Zellen zeigen.
  • 2A zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von ALL-1- und HL60-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos, die gegen den B1/A2-Bruchpunkt der Bcr-Abl mRNA gerichtet sind.
  • 2B zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von ALL-1-Zellen mit liposomalen B1/A2 pE-Antisense-Oligos und liposomalen B2/A2 pE-Kontrolloligos.
  • 3A zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von BV173- und HL60-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos, die gegen den B2/A2-Bruchpunkt der Bcr-Abl mRNA gerichtet sind.
  • 3B zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von BV173-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos, die gegen den B2/A2-Bruchpunkt und mit Kontrolloligos, die gegen den B1/A2-Bruchpunkt gerichtet sind.
  • 4A zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von K562- und HL60-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos, die gegen den B3/A2-Bruchpunkt der Bcr-Abl mRNA gerichtet sind.
  • 4B zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von K562-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos, die gegen den B3/A2-Bruchpunkt und mit Kontrolloligos, die gegen den B1/A2-Bruchpunkt gerichtet sind.
  • 5 zeigt das Maß an Wachstumshemmung, wenn BV173-Zellen mit Tween 20-enthaltenden liposomalen pE-Oligos inkubiert wurden.
  • „Liposomen" bedeutet innerhalb des vorliegenden Patents Lipid-enthaltende Vesikel mit einer Lipid-Doppelschicht, sowie andere Lipid-Transportpartikel, welche Antisense-Oligonukleotide einschließen können. Die Liposomen können sich aus einem oder mehreren Phospholipiden zusammensetzen, sofern das Lipid-Material im Wesentlichen ungeladen ist. Es ist wichtig, dass die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von anionischen und kationischen Phospholipiden und Cholesterol ist. Geeignete Phospholipide schließen Phosphatidylcholine und andere, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, ein. Die Liposomen können beispielsweise unilamellar, multilamellar oder mit einer undefinierten Lamellenstruktur versehen sein. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend die Liposomen enthält üblicherweise einen sterilen, pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder Lösungsmittel, wie zum Beispiel Wasser oder eine Salzlösung.
  • „Einschließen," „Einkapseln," und „Einbauen" bedeuten innerhalb des vorliegenden Patents, dass das Oligo innerhalb mindestens eines Teils des inneren wässrigen Raums (einschließlich der interlamellaren Regionen der Doppelschicht) des Liposoms eingeschlossen ist.
  • Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung eignet sich bevorzugt zur parenteralen Verabreichung, zum Beispiel durch intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, intralymphatische, intraperitoneale, subkutane, intrapleurale oder intrathekale Injektion oder kann ex vivo für Knochenmarksspülungen verwendet werden. Bevorzugte Dosierungen zwischen 5–25 mg/kg können erwogen werden. Die Verabreichung würde bevorzugt innerhalb eines Zeitplans bis zum Verschwinden oder Rückgang des Tumors wiederholt werden und kann in Verbindung mit anderen Therapieformen erfolgen. Die Herstellung und die Verwendung der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beispiele näher verdeutlicht.
  • BEISPIEL 1 (vergleichendes Beispiel)
  • Materialien
  • Phosphodiester und Phosphorothioat-Oligonukleotide wurden von Genta Incorporated bezogen. Phospholipide wurden von Avanti Polar Lipids bezogen.
  • Oligonukleotid-Markierung
  • Phosphodiester wurden bei 37°C für 8 Stunden mit [32Pγ]ATP am 5'-Ende mittels T4-Kinase markiert. Das markierte Oligonukleotid wurde mit Ethanol bei –20°C über Nacht gefällt. Nach dreimaligem Waschen mit 70% Ethanol wurden die Phosphodiester-Oligonukleotide zweimal durch einen Microcon-3-Filter gefiltert, um die markierten Oligonukleotide von freiem [32Pγ]ATP zu trennen.
  • Mit 35S markierte Phosphorothioate wurden von Genta Incorporated bezogen.
  • Herstellung liposomaler Phosphodiester
  • In destilliertem Wasser gelöste Phosphodiester-Oligonukleotide wurden mit Phospholipiden in Anwesenheit von überschüssigem t-Butanol gemischt, so dass das Endvolumen an t-Butanol in der Mischung zwischen 80 und 90% betrug. Geringe Mengen an [3H]-Cholestanyl-Ether und [32P]-Phosphodiester wurden zu der Mischung als Lipid- bzw. Oligonukleotid-Marker hinzugefügt. Die Mischung wurde mittels Vortex gemischt und anschließend in einem Aceton-/Trockeneisbad eingefroren. Die gefrorene Mischung wurde lyophilisiert und mit HEPES-gepufferter Salzlösung (1 mM HEPES und 10 mM NaCl) über Nacht hydriert. Die Liposomen wurden zweimal für 10 min. in einem Bad-Ultraschallgerät mit Ultraschall behandelt.
  • Herstellung liposomaler Phosphorothioate
  • Liposomale Phosphorothioate wurden in ähnlicher Weise hergestellt wie liposomale Phosphodiester, mit der Ausnahme, dass Phosphorothioate, anstatt Phosphodiester verwendet wurden. Außerdem wurden [35S] Phosphorothioate anstatt [32P] Phosphodiester als Oligonukleotidmarker verwendet.
  • Trennung freier von in Liposomen eingebauten Oligonukleotiden
  • Die Abtrennung freier von in Liposomen eingebauten Phosphodiester oder Phosphorothioat-Oligonukleotiden erfolgte durch Dialysieren der Mischung gegen ein überschüssiges 2500-faches Volumen an RPMI-Medium bei Raumtemperatur über Nacht. Vor und nach der Dialyse wurden Aliquots der Präparation zur flüssigen Szintillationszählung entnommen, um den Einbau von Phosphodiester- oder Phosphorothioat-Oligonukleotide in die Liposomen zu bestimmen.
  • Entwicklung von liposomalen Phosphodiestern
  • Dioleoylphosphatidylcholin-(DOPC)-Lipide wurden für den Phosphodiester-(PD)-Einbau ausgewählt, weil diese Lipide neutral sind, während PD negativ geladen ist. Die Verwendung dieses Lipids reduziert möglicherweise elektrostatische Abstoßung (welche den Einbau mindern kann). Positiv geladene Lipide wurden nicht verwendet, da sie nichtspezifische, zelluläre Toxizität hervorrufen. Der Einbau von PD-Oligonukleotiden in Liposomen erfolgte zunächst durch die Einfrier-/Auftau-Methode und die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode.
  • (A) Einfrier-/Auftau- (EA) Methode.
  • Zur Bildung eines Lipidfilms wurde das organische Lösungsmittel von den [3H]-markierten DOPC-Lipiden unter Stickstoffgas verdunstet. Nach Vakuumtrocknung wurde der Lipidfilm mit HEPES-gepufferter Salzlösung (1 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0) hydriert und in einem Bad-Ultraschallgerät mit Ultraschall behandelt. Diese vorgeformten Liposomen wurden anschließend mit [32P]-markierten PD-Oligonukleotiden in einem molaren Verhältnis von 100 oder 1000 zu 1 gemischt. Die ganze Mischung wurde in einem Aceton/Trockeneisbad für 5–10 min. eingefroren und bei Raumtemperatur für 25–30 min. aufgetaut. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, bevor die Probe auf eine Biogel A 0,5 M-Säule zur Trennung freier von liposomalen PD-Oligonukleotiden geladen wurde. Vor und nach der Einfrier-/Auftauprozedur wurden Aliquots entnommen und zur flüssigen Szintillationszählung gebracht, um den Einbau der Phosphodiester in Liposomen zu bestimmen.
  • Der Einbau wurde bestimmt durch
  • Figure 00070001
  • Ein Einbau fand nicht statt (Tabelle 1).
  • (B) Dehydrierungs-Rehydrierungs- (DR)-Methode
  • Zur Bildung eines Lipidfilms wurde das organische Lösungsmittel von den [3H]-markierten DOPC-Lipiden unter Stickstoffgas verdunstet. Nach Vakuumtrocknung wurde der Lipidfilm mit HEPES-gepufferter Salzlösung hydriert und in einem Bad-Ultraschallgerät mit Ultraschall behandelt. Diese vorgeformten Liposomen wurden anschließend in einem Aceton/Trockeneisbad eingefroren und lyophilisiert. Die getrockneten Lipide wurden anschließend mit destilliertem Wasser, das [32P]-Phosphodiesteroligonukleotide enthielt, rehydriert. Das molare Verhältnis zwischen DOPC zu PD betrug entweder 100/1 oder 1000/1. Zur Trennung freier PD-Oligonukleotide von liposomalen PD wurde die Mischung auf eine BioGel A 0,5 M-Säule geladen. Vor und nach Säulenbeladung wurden Aliquots entnommen und zur flüssigen Szintillationszählung gebracht. Der Einbau lag bei < 5% (Tabelle 1).
  • Tabelle 1 Vergleich zwischen Einfrier-Auftau (EA)- und Dehydrierungs-Rehydrierungs (DR)-Methoden hinsichtlich Einbau von PD in DOPC-Liposomen
    Figure 00070002
  • Figure 00080001
  • Mit molaren Verhältnissen von DOPC zu PD von 500/1 und 5000/1 wurde ein Einbau von 0 bzw. 5,2% erzielt.
  • Es wurde gefunden, dass durch die Zugabe von t-Butanol zur Mischung vor dem Einfrieren und Lyophilisieren der Einbau auf 11,9% gesteigert werden konnte. Darüber hinaus wurde durch Reduzierung des Volumens an destilliertem Wasser während des Rehydrierungsprozesses von 200 auf 50 μl 11,9% gegenüber 1,8% Einbau bei einem molaren Verhältnis von 1000/1 erzielt. Mit diesen verbesserten Bedingungen wurde der Effekt des molaren Verhältnisses auf den Einbau erneut gemessen (Tabelle 2).
  • Tabelle 2 Effekt des molaren Verhältnisses von Lipid zu Oligonukleotiden auf den Einbau von PD in Liposomen
    Figure 00080002
  • Vor dem Einfrieren in einem Aceton/Trockeneisbad und dem Lyophilisieren wurde in destilliertem Wasser gelöstes PD mit DOPC in Anwesenheit von überschüssigem t-Butanol gemischt, so dass das Endvolumen an t-Butanol in der Mischung 80–90% betrug. Damit konnte der Schritt der Herstellung vorgeformter Liposomen weggelassen werden. Mit diesem Verfahren wurde ein ähnliches Maß an Einbau (16,2%) bei einem molaren Verhältnis von 2000/1 erzielt.
  • Die Methode zur Trennung von freiem PD von liposomalem PD wurde geändert, weil die Ausbeute von Lipiden und PD < 50% betrug. Zwei andere Trennungsmethoden wurden verwendet: Microcon-10-Filter und Dialyse (Tabelle 3).
  • Tabelle 3 Vergleich verschiedener Methoden zur Trennung von freiem PD von in Liposomen eingebautem PD a)
    Figure 00090001
  • Wenn die liposomale Mischung vor dem Trennungsverfahren mittels Dialyse für 10 min. mit Ultraschall behandelt wurde, wurde ein ähnliches Maß an Einbau erzielt. Für den PD-Einbau wurde ein weiteres Lipid, Dimyristoylphosphatidylcholin, eingesetzt. Der Einbau betrug > 85%.
  • Entwicklung liposomaler Phosphorothioate
  • Ein ähnliches Einbauprotokoll wurde mit Phosphorothioaten (PT) angewendet, da PT und PD Strukturanaloga sind. Verschiedene molare Verhältnisse von DOPC zu PT wurden eingesetzt (Tabelle 4). Der Effekt der Ultraschallbehandlung auf die liposomale Mischung (vor der Dialyse) wurde ebenfalls untersucht.
  • Tabelle 4 Effekt der molaren Verhältnisse von Lipid zu Oligonukleotid auf den Einbau von PT in Liposomen
    Figure 00090002
  • BEISPIEL 2
  • Einbau von p-Ethoxyoligos in Liposomen
  • pE-Oligos wurden von Oligos Therapeutics (Willsonville, OR) bezogen. Phospholipide wurden von Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) bezogen.
  • (a) Oligo-Markierung
  • pE-Oligos wurden bei 37°C für 24 Stunden mit [32Pγ]ATP am 5'-Ende mittels T4-Polynukleotidkinase markiert und anschließend mit Ethanol bei –20°C über Nacht präzipitiert. Anschließend wurden sie mit 70% Ethanol dreimal gewaschen, um die markierten Oligos von freiem [32Pγ]ATP zu trennen.
  • (b) Herstellung von Liposomen
  • In destilliertem H2O gelöste pE-Oligos wurden mit Phospholipiden zu verschiedenen molaren Verhältnissen in Anwesenheit von überschüssigem t-Butanol gemischt, so dass das Endvolumen an t-Butanol in der Mischung mindestens 95% betrug. Geringe Mengen an [3H]Cholestanylether und [32P]pE wurden ebenfalls als Lipid- bzw. Oligomarker zu der Mischung hinzugefügt. Die Mischung wurde mittels Vortex gemischt, in Aceton/Trockeneisbad gefroren und anschließend lyophilisiert. Der lyophilisierte Ansatz wurde mit HEPES-gepufferter Salzlösung (1 mM HEPES und 10 mM NaCl) auf eine Endkonzentration des Oligos von 10–100 μM hydriert. Die liposomalen p-Ethoxyoligos wurden für 10–20 min. in einem Bad-Ultraschallgerät mit Ultraschall behandelt.
  • (c) Trennung freier von in Liposomen eingebauten pE-Oligos
  • Die Trennung freier von in Liposomen eingebauten pE-Oligos erfolgte durch Dialyse (Molekulargewichtausschluss = 12–14000) gegen einen 1000-fachen Überschuss an HEPES-gepufferter Salzlösung bei Raumtemperatur über Nacht. Vor und nach der Dialyse wurden Aliquots der liposomalen pE-Oligos entnommen, um den Einbau an pE-Oligos in die Liposomen im Szintillationszähler zu bestimmen.
  • (d) Einbaueffizienz
  • Das Lipid Phosphatidylcholin (PC) wurde für den Einbau von pE-Oligos gewählt, da sowohl PC als auch pE-Oligos neutrale Moleküle sind, so dass sie miteinander kompatibel sein sollten. Aus den verschiedenen PCs wurde Dioleoyl-PC (DOPC) ausgewählt, weil seine kettenschmelzende Phasenübergangstemperatur zwischen –15 bis –20°C liegt.
  • Infolgedessen liegt DOPC bei Raumtemperatur in der flüssig-kristallinen Phase vor, welche ideal zum Herstellen von Liposomen ist.
  • Zum Einbau von pE-Oligos in Liposomen wurden verschiedene Verhältnisse von pE-Oligos in Anwesenheit von überschüssigem t-Butanol mit DOPC gemischt. Geringe Mengen an radioaktiv markierten pE-Oligos und DOPC wurden zu der Mischung hinzugefügt. Die DOPC/pE-Oligo-Mischungen wurden in einem Trockeneis/Acetonbad vor dem Lyophilisieren eingefroren. Das lyophilisierte DOPC/pE-Oligo-Pulver wurde anschließend mit einer HEPES-gepufferten Salzlösung hydriert, so dass die Endkonzentration an Oligo 10 μM betrug. Die pE-Oligos waren erfolgreich in DOPC-Liposomen mit einer Effizienz zwischen 28 und 83% eingebaut (Tabelle 5). Die Einbaueffizienz war von den molaren Verhältnissen zwischen DOPC und den pE-Oligos abhängig: 10 > 100 > 5 > 1000 : 1.
  • Tabelle 5 Effekt des molaren Verhältnisses von DOPC zu pE-Oligos auf den Einbau von pE-Oligos
    Figure 00110001
  • Transport der pE-Oligos zu leukämischen Zellen
  • Nachdem eine hohe Einbaueffizienz (> 80%) der pE-Oligos in Liposomen erzielt werden konnte, testeten wir weiterhin, ob diese liposomalen pE-Oligos das Cytoplasma, in welchem sich die mRNA befindet, erreichen konnten. Wir bezogen ein 16-mer pE-Oligo, das am 5'-Ende mit Rhodamin markiert war, so dass wir die Lokalisierung der pE-Oligos mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar machen konnten.
  • (a) Inkubation von pE-Oligos mit leukämischen Zellen
  • Es wurden ALL-1-Zellen, welche menschliche akute lymphozytische Leukämiezellen darstellen, verwendet. Fünfzigtausend ALL-1-Zellen pro Vertiefung wurden in eine 24- well-Platte in 0,3 mL Medium ausplattiert. 2 Stunden nach Ausplattieren wurden Endkonzentrationen von 16 μM von liposomalen oder freien pE-Oligos, die mit Rhodamin konjugiert waren, zu den ALL-1-Zellen hinzugefügt. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen vor Betrachtung unter einem konfokalen Laser-Rastermikroskop dreimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen. Siehe 1 (Aufnahme von (A) freiem oder (B) liposomalen pE-Oligos durch ALL-1-Zellen).
  • Unsere Ergebnisse zeigen, dass größere Mengen an pE-Oligos von ALL-1-Zellen aufgenommen worden waren, wenn diese in Liposomen eingebaut waren. Die Liposomen waren in der Lage, die pE-Oligos zum Cytoplasma zu transportieren.
  • Wachstumshemmung von liposomalen pE-Oligos auf leukämische Zellen
  • Wir testeten anschließend weiterhin, ob liposomale pE-Oligos spezifisch das Wachstum leukämischer Zellen hemmen können. Wir haben drei verschiedene Arten menschlicher leukämischer Zelllinien verwendet: ALL-1 (akute lymphocytische Leukämie), BV173 und K562 (beide sind chronische myelogene Leukämiezellen). Alle drei Zelllinien enthalten das rearrangierte Philadelphia-(Ph)-Chromosom, welches durch eine reziproke Translokation der Chromosomen 9 und 22 entsteht. Die Translokation resultiert in der Relokation des c-Abl-Protoonkogens vom Chromosom 9 auf das 3'-Ende der sogenannten „Bruchpunkt Cluster Region" (Bcr) des Chromosoms 22, wodurch ein hybrides Bcr-Abl-Gen entsteht. Die Bruchpunkte, an denen die Bcr- und die Abl-Gene fusionieren, sind in allen drei Zelllinien unterschiedlich. In ALL-1-Zellen ist der Bruchpunkt Bcr exon 1/Abl exon 2. In BV173-Zellen ist der Bruchpunkt Bcr exon 2/Abl exon 2. In K562-Zellen ist der Bruchpunkt Bcr exon 3/Abl exon 2. Alle diese Hybridgene produzieren ein neuartiges Bcr-Abl-Fusionsprotein, welches eine erhöhte Tyrosinkinase-Aktivität aufweist, die mit der Pathogenese von Leukämien in Verbindung gebracht wird. Infolgedessen könnte die Hemmung der Produktion des Bcr-Abl-Proteins zur Hemmung des Wachstums leukämischer Zellen oder sogar zum Zelltod führen. Um die Produktion des Bcr-Abl-Proteins spezifisch zu hemmen, haben wir uns entschlossen, die Antisense-Sequenzen gegen die Bruchpunkte der Bcr-Abl-mRNA zu richten, welche nur in Ph-Chromosompositiven Leukämiezellen aber nicht in nomalen Zellen vorhanden ist. Wir hoffen, auf diesem Weg nur minimale nicht-spezifische toxische Nebeneffekte hervorzurufen, da nur das Wachstum leukämischer, aber nicht normaler Zellen betroffen ist.
  • (a) Sequenzen der pE-Antisense-Oligos (geschrieben vom 5'- zum 3'-Ende)
  • Antisense gegen Bcr exon 1/Abl exon 2 (B1/A2), vorhanden in ALL-1-Zellen
    GAAGGGCTTCTGCGTC
  • Antisense gegen Bcr exon 2/Abl exon 2 (B2/A2), vorhanden in BV173-Zellen
    CTGAAGGGCTTCTTCC
  • Antisense gegen Bcr exon 3/Abl exon 2 (B3/A2), vorhanden in K562-Zellen
    GGGCTTTTGAACTCTGCT
  • (b) Transport liposomaler pE-Oligos zu leukämischen Zellen
  • Zehntausend ALL-1- oder BV173-Zellen oder fünftausend K562-Zellen wurden in einer 96-well-Platte pro Vertiefung in 100 μL RPMI-Medium mit 10% fötalem Kälberserum ausplattiert. Zwei Stunden nach Ausplattieren wurden Endkonzentrationen von 0–10 μM liposomaler pE-Oligos zu den leukämischen Zellen hinzugefügt. Die Zellen wurden mit den liposomalen pE-Oligos für 5 Tage inkubiert. HL60-Zellen, eine menschliche promyelocytische Zelllinie, die das Philadelphia-Chromosom nicht besitzt, wurden als Kontrollzellen verwendet. Sie wurden unter den gleichen Bedingungen mit einer Konzentration von zehntausend Zellen pro Vertiefung ausplattiert.
  • (c) Bestimmung der Lebensfähigkeit leukämischer Zellen
  • Am Ende der Inkubation wurden 100 μL Medium zu jeder Vertiefung auf ein Endvolumen von 200 μL hinzugefügt. Anschließend wurden 50 μL Zellen aliquotiert und zu den 96-well-Platten, welche 130 μL Medium und 20 μL alamarBlue-Farbstoff enthielten, hinzugefügt. Die Zellen werden für weitere 4–8 Stunden bei 37°C inkubiert, bevor sie direkt in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (Molecular Devices, Menlo Park, CA) bei 570 und 595 nm gemessen werden. Der alamarBlue-Farbstoff inkorporiert einen Oxidations-Reduktions-Indikator, der bei chemischer Reduktion des Wachstumsmediums aufgrund Zellwachstum seine Farbe ändert. Der Absorptionsunterschied zwischen 570 und 595 nm wird als allgemeiner Absorptionswert der leukämischen Zellen herangezogen. Die Lebensfähigkeit leukämischer Zellen, die mit liposomalen pE-Oligos behandelt worden waren, wird mit der Lebensfähigkeit unbehandelter Kontrollzellen verglichen.
  • Nach Inkubation der ALL-1- und der HL60-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos gegen den B1/A2-Bruchpunkt der Bcr-Abl-mRNA wurde eine dosisabhängige Wachstumshemmung der ALL-1-, aber nicht der HL60-Zellen beobachtet (2A). Eine ähnliche Wachstumshemmung wurde bei BV173- und K562-Zellen beobachtet, wenn diese mit liposomalen pE-Antisense-Oligos gegen B2/A2- bzw. B3/A2-Bruchpunkte der Bcr-Abl-mRNA inkubiert worden waren (3A, 4A). HL60-Zellen waren bei identischen Bedingungen nicht im Wachstum gehemmt.
  • Um sicherzustellen, dass die wachstumshemmenden Effekte sequenzabhängig waren, wurden die Ph-Chromosom-positiven Zelllinien mit liposomalen Antisense- und Kontroll-pE-Oligos inkubiert. Die Inkubation von ALL-1-Zellen mit liposomalen B1/A2 pE-Antisense-Oligos und liposomalen B2/A2 pE-Kontroll-Oligos induzierte Wachstumshemmung (2B). Jedoch induzierten die B1/A2-Antisense-Oligos einen bedeutend höheren hemmenden Effekt. In ähnlicher Weise wurden höhere hemmende Effekte auf BV173- und K562-Zellen mit den entsprechenden liposomalen pE-Antisense-Oligos als mit den Kontrolloligos beobachtet (3B, 4B).
  • Außerdem stellten wir fest, dass durch die Zugabe des Detergens Tween 20 zu der liposomalen pE-Oligomischung die Wirkung der hemmenden Effekte der liposomalen pE-Oligos erhöht war. Wir gaben Tween 20 zu 5% (Gew.-% der pE-Oligos) zu der liposomalen pE-Oligomischung dazu. Die Mischung wurde mittels Vortex gemischt, und vor dem Lyophilisieren in einem Aceton/Trockeneisbad eingefroren. Die getrocknete Mischung wurde anschließend hydriert und wie vorher angegeben mit Ultraschall behandelt. Wenn Tween 20-enthaltende liposomale pE-Oligos zu BV173-Zellen zugefügt wurden, konnte eine 100%-ige Wachstumshemmung bei 5 μM (5) beobachtet werden, wohingegen unter den gleichen Bedingungen eine 100%ige Wachstumshemmung mit normalen liposomalen pE-Oligos (ohne Tween 20) stattdessen bei 10 μM beobachtet wurde.

Claims (9)

  1. Liposomale Zusammensetzung von Antisense-Oligonukleotiden, umfassend (a) ein Liposom, das sich aus einem oder mehreren im Wesentlichen ungeladenen Phospholipiden zusammensetzt und im Wesentlichen frei von Cholesterin ist und (b) ein Antisense-Oligonukleotid, das in dem Liposom eingeschlossen ist und ein p-Ethoxyoligonukleotid ist; wobei das molare Verhältnis von Phospholipid zu Oligo zwischen ungefähr 5 : 1 und ungefähr 100 : 1 beträgt.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Phospholipide Phosphatidylcholine sind.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Phospholipide Dioleoylphosphatidylcholine sind.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid ein p-Ethoxyoligonukleotid ist, das im Wesentlichen aus einem Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz GAAGGGCTTCTGCGTC besteht.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid ein p-Ethoxyoligonukleotid ist, das im Wesentlichen aus einem Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz CTGAAGGGCTTCTTCC besteht.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid ein p-Ethoxyoligonukleotid ist, das im Wesentlichen aus einem Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz GGGCTTTTGAACTCTGCT besteht.
  7. In vitro-Verfahren zum Hemmen des Wachstums von Tumorzellen, einschließend die Verabreichung einer zur Hemmung des Tumorzellwachstums wirksamen Menge einer Zusammensetzung, einschließend (a) ein Liposom, welches sich aus einem oder mehreren im Wesentlichen ungeladenen Phospholipiden zusammensetzt und im Wesentlichen frei von Cholesterin ist und (b) ein Antisense-Oligonukleotid, das in dem Liposom eingeschlossen ist und ein p-Ethoxyoligonukleotid ist.
  8. Verfahren zur Herstellung einer liposomalen Zusammensetzung von Antisense-Oligonukleotiden gemäß Anspruch 1, das die Schritte einschließt: (a) Hydratisieren einer lyophilisierten Zusammensetzung, die sich aus einem oder mehreren im Wesentlichen ungeladenen Phospholipiden zusammensetzt und die im Wesentlichen frei von Cholesterin ist und ein Antisense-Oligonukleotid, das ein p-Ethoxyoligonukleotid ist; wodurch sich eine wässerige Suspension bildet, die freie Oligonukleotide und Oligonukleotide einschließende Liposomen enthält; und (b) Trennen der freien Oligonukleotide von den Liposomen mittels Dialyse.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die wässerige Suspension vor der Dialyse mit Ultraschall behandelt wird.
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Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5855911A (en) * 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
US6977244B2 (en) * 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6894031B1 (en) * 1996-11-21 2005-05-17 Cedars-Sinai Medical Center Pituitary tumor transforming gene (PTTG) carboxy-terminal peptides and methods of use thereof to inhibit neoplastic cellular proliferation and/or transformation
US6565889B2 (en) * 1996-12-02 2003-05-20 The Regents Of The University Of California Bilayer structure which encapsulates multiple containment units and uses thereof
US6126965A (en) * 1997-03-21 2000-10-03 Georgetown University School Of Medicine Liposomes containing oligonucleotides
US7262173B2 (en) 1997-03-21 2007-08-28 Georgetown University Chemosensitizing with liposomes containing oligonucleotides
US6287591B1 (en) * 1997-05-14 2001-09-11 Inex Pharmaceuticals Corp. Charged therapeutic agents encapsulated in lipid particles containing four lipid components
US6835395B1 (en) 1997-05-14 2004-12-28 The University Of British Columbia Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles
JP2002508765A (ja) * 1997-06-23 2002-03-19 アルザ コーポレイション リポソーム被包ポリヌクレオチド組成物および方法
EP1012331B1 (de) * 1997-07-01 2006-03-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
DE19740092A1 (de) * 1997-09-12 1999-03-18 Ulrich Dr Med Hengge Liposomen und Verfahren zur Transfektion von Zellen
US7704962B1 (en) * 1997-10-03 2010-04-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Small oligonucleotides with anti-tumor activity
US7285288B1 (en) * 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
HU227190B1 (en) 1999-02-26 2010-10-28 Univ British Columbia Trpm-2 antisense therapy
US7112337B2 (en) 1999-04-23 2006-09-26 Alza Corporation Liposome composition for delivery of nucleic acid
AU7868400A (en) 1999-10-08 2001-04-23 Alza Corporation Neutral-cationic lipid for nucleic acid and drug delivery
FR2802422B1 (fr) * 1999-12-21 2002-08-09 Capsulis Structures mixtes resultant de l'incorporation d'une macromolecule biologique, en particulier d'adn, dans une phase structuree d'amphiphiles et vesicules obtenues a partir de ces structures
US7569551B2 (en) 2000-02-25 2009-08-04 The University Of British Columbia Chemo- and radiation-sensitization of cancer by antisense TRPM-2 oligodeoxynucleotides
AU2001290920B2 (en) 2000-09-14 2006-11-23 The University Of British Columbia Antisense insulin-like growth factor binding protein (IGFBP)-2-oligodeoxynucleotides for prostate and other endocrine tumor therapy
CA2471967A1 (en) * 2002-01-03 2003-07-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Wt1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer
DK1465995T3 (da) 2002-01-17 2008-10-20 Univ British Columbia Bispespecifikke antisense-olignukleotider der inhiberer IGFBP-2 og IGFBP og fremgangsmåder til anvendelse deraf
ATE478142T1 (de) 2002-08-21 2010-09-15 Univ British Columbia Behandlung von melanomen durch reduktion der clusterin menge
AU2003278028B2 (en) 2002-10-02 2008-12-18 The University Of British Columbia Compositions for treatment of prostate and other cancers
AU2004227847A1 (en) 2003-03-31 2004-10-21 Alza Corporation Lipid particles having asymmetric lipid coating and method of preparing same
US8047981B2 (en) * 2003-08-14 2011-11-01 Boston Scientific Scimed, Inc. Medical slings
CA2539727C (en) * 2003-10-01 2016-11-01 The University Of British Columbia Bispecific oligonucleotide for the treatment of cns malignancies
JP2007513072A (ja) 2003-11-05 2007-05-24 パリンゲン インコーポレーテッド Ｃｄｉｍ結合抗体における増強されたｂ細胞細胞傷害性
JP2007512355A (ja) 2003-11-21 2007-05-17 アルザ コーポレイション 開裂性のｐｅｇで表面修飾されたリポソーム−ｄｎａ複合体で媒介される遺伝子送達
US8710020B2 (en) * 2004-04-02 2014-04-29 The University Of British Columbia Clusterin antisense therapy for treatment of cancer
EP2543341B1 (de) * 2004-06-14 2016-07-20 Boston Scientific Limited Anker für Weichgewebe
US8377435B2 (en) 2004-11-05 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Antibody induced cell membrane wounding
US20080014198A1 (en) * 2004-11-23 2008-01-17 The University Of British Columbia Treatment of Cancer With a Combination of an Agent that Perturbs the EGF Signaling Pathway and an Oligonucleotide that Reduces Clusterin Levels
EP1871281B1 (de) * 2005-04-06 2014-01-08 Boston Scientific Limited Anordnung zur suburethralen unterstützung
CA2605068A1 (en) 2005-04-15 2006-10-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Delivery of sirna by neutral lipid compositions
WO2007008209A1 (en) 2005-07-13 2007-01-18 Boston Scientific Scimed Inc. Snap fit sling anchor system and related methods
US7981023B2 (en) * 2005-07-25 2011-07-19 Boston Scientific Scimed, Inc. Elastic sling system and related methods
EP3533416A1 (de) 2005-07-25 2019-09-04 Boston Scientific Limited Beckenbodenreparatursystem
US8273429B2 (en) * 2006-01-19 2012-09-25 Federal-Mogul World Wide, Inc. Fabric for end fray resistance and protective sleeves formed therewith and methods of construction
FR2900576B1 (fr) 2006-05-03 2008-09-19 Centre Nat Rech Scient Procede de concentration extemporanee et reversible de liposomes.
US9381209B2 (en) * 2007-03-05 2016-07-05 The University Of British Columbia Treatment of squamous cell carcinoma with HSP27 antisense oligonucleotides and radiotherapy
WO2009149418A2 (en) * 2008-06-06 2009-12-10 Asuragen, Inc. Novel compositions for the in vivo delivery of rnai agents
ES2710109T3 (es) 2010-12-17 2019-04-23 Inst Nat Sante Rech Med Acidos nucleicos que se dirigen a TCTP para su uso en el tratamiento de cánceres quimiorresistentes u hormonorresistentes
CA2864394C (en) 2011-03-02 2021-10-19 Jack Roth A method of predicting a response to a tusc2 therapy
US9113991B2 (en) 2011-05-12 2015-08-25 Boston Scientific Scimed, Inc. Anchors for bodily implants and methods for anchoring bodily implants into a patient's body
US9636201B2 (en) 2011-05-12 2017-05-02 Boston Scientific Scimed, Inc. Delivery members for delivering an implant into a body of a patient
MX363819B (es) 2012-02-08 2019-04-03 Igm Biosciences Inc Uniones a cdim y sus usos.
CN110464709A (zh) 2012-08-10 2019-11-19 德克萨斯州大学系统董事会 用于治疗中风的神经保护性脂质体组合物和方法
WO2014195754A1 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Hydrophobically modified antisense oligonucleotides comprising a triple alkyl chain
WO2014195755A1 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Hydrophobically modified antisense oligonucleotides comprising a ketal group
KR20180091816A (ko) 2015-10-14 2018-08-16 바이오-패쓰 홀딩스 인크. 리포좀 제제를 위한 p-에톡시 핵산
US10736880B2 (en) 2015-12-18 2020-08-11 The Board Of Regents Of The University Of Texas Systems Therapeutics for preterm labor management
EP3512503A4 (de) * 2016-09-14 2020-05-06 Nanyang Technological University Liposomale formulierungen
US10927379B2 (en) 2016-09-16 2021-02-23 Bio-Path Holdings, Inc. Combination therapy with liposomal antisense oligonucleotides
CN116672456A (zh) 2016-10-12 2023-09-01 得克萨斯州大学系统董事会 用于tusc2免疫治疗的方法和组合物
CA3058018A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Bio-Path Holdings, Inc. P-ethoxy nucleic acids for stat3 inhibition
WO2018195281A1 (en) * 2017-04-19 2018-10-25 Bio-Path Holdings, Inc. P-ethoxy nucleic acids for igf-1r inhibition
WO2018195250A1 (en) * 2017-04-19 2018-10-25 Bio-Path Holdings, Inc. P-ethoxy nucleic acids for igf-1r inhibition
CA3175301A1 (en) 2020-04-20 2021-10-28 Hugh D.C. Smyth Biologically active dry powder compositions and method of their manufacture and use
US20230302154A1 (en) 2020-08-19 2023-09-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Nanodrugs for targeted drug delivery and use thereof

Family Cites Families (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH621479A5 (de) * 1977-08-05 1981-02-13 Battelle Memorial Institute
US4394448A (en) * 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4469863A (en) * 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4480041A (en) * 1982-07-09 1984-10-30 Collaborative Research, Inc. Use of phosphotriester intermediates for preparation of functionalized liposomes
FR2540122B1 (fr) * 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4721612A (en) * 1984-04-12 1988-01-26 The Liposome Company, Inc. Steroidal liposomes
US5202429A (en) * 1986-07-09 1993-04-13 The Wistar Institute DNA molecules having human BCL-2 gene sequences
US5049388A (en) * 1986-11-06 1991-09-17 Research Development Foundation Small particle aerosol liposome and liposome-drug combinations for medical use
US5094785A (en) * 1986-12-10 1992-03-10 Ciba Corning Diagnostics Corp. Process for stabilizing liposomes
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4837028A (en) * 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5030442A (en) * 1987-03-30 1991-07-09 Liposome Technology, Inc. Non-crystalline minoxidil composition
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5178875A (en) * 1991-01-14 1993-01-12 The Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal-polyene preliposomal powder and method for its preparation
US4950432A (en) * 1987-10-16 1990-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyene microlide pre-liposomal powders
US4924624A (en) * 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) * 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
EP0397774A1 (de) * 1988-02-04 1990-11-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Formulierung und anwendung von retinoiden für behandlung von krebs und anderen krankheiten
US5098890A (en) * 1988-11-07 1992-03-24 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antisence oligonucleotides to c-myb proto-oncogene and uses thereof
US5734033A (en) * 1988-12-22 1998-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antisense oligonucleotides inhibiting human bcl-2 gene expression
US5831066A (en) * 1988-12-22 1998-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of bcl-2 gene expression
US5087617A (en) * 1989-02-15 1992-02-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
US5248671A (en) * 1989-02-15 1993-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
FR2644080A1 (fr) * 1989-03-13 1990-09-14 Trizac Jacques Dispositif de filtration et d'evacuation de petites particules, dechets et detritus, de natures diverses
WO1990012595A1 (en) * 1989-04-18 1990-11-01 Vestar, Inc. Liposomal targeting of ischemic tissue
US5112962A (en) * 1989-04-19 1992-05-12 Northwestern University Labile anchors for solid phase polynucleotide synthesis
US5227170A (en) * 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US5100662A (en) * 1989-08-23 1992-03-31 The Liposome Company, Inc. Steroidal liposomes exhibiting enhanced stability
US5469854A (en) * 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5542935A (en) 1989-12-22 1996-08-06 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic delivery systems related applications
WO1993007883A1 (en) * 1991-10-24 1993-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
CA2033725C (en) * 1990-01-24 2001-05-29 Folker Pittrof Pharmaceutical and cosmetic compositions containing a salt of cholanic acid
US5279833A (en) * 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
EP0527818A4 (en) * 1990-04-30 1993-09-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of arachidonic acid metabolism
US5665710A (en) * 1990-04-30 1997-09-09 Georgetown University Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions
ATE151076T1 (de) * 1990-07-02 1997-04-15 Hoechst Ag Oligonucleotid-analoge mit terminalen 3'-3'-bzw. 5'-5'-internucleotidverknüpfungen
US5135917A (en) * 1990-07-12 1992-08-04 Nova Pharmaceutical Corporation Interleukin receptor expression inhibiting antisense oligonucleotides
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
EP0556231A4 (en) * 1990-09-17 1994-08-17 Univ California Method and composition for controlling proliferation of cells
US5271941A (en) * 1990-11-02 1993-12-21 Cho Chung Yoon S Antisense oligonucleotides of human regulatory subunit RI.sub.α of cAMP-dependent protein kinases
DE4110085A1 (de) * 1991-03-27 1992-10-01 Boehringer Ingelheim Int 2'-o-alkyl-oligoribonukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als antisense-oligonukleotide
FR2677272B1 (fr) * 1991-06-05 1995-03-03 Biovecteurs As Vecteur particulaire a tropisme selectif, procede de preparation et composition pharmaceutique.
CA2103377A1 (en) * 1991-06-18 1992-12-19 Bruno Calabretta Selective inhibition of leukemic cell proliferation by bcr-abl antisense oligonucleotides
US5525719A (en) * 1991-08-30 1996-06-11 Chemgenes Corporation N-protected-2'-O-methyl-and N-protected-3'-O-methyl-ribonucleosides and their phosphoramidite derivatives
DE69233118T2 (de) * 1991-12-04 2004-04-15 E.I. Du Pont De Nemours And Co., Wilmington Fettsäure-desaturase gene aus pflanzen
US5279957A (en) * 1992-04-30 1994-01-18 Washington University cDNA encoding human phospholipase A2 polypeptide
CA2134773A1 (en) * 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
US5320962A (en) * 1992-07-22 1994-06-14 Duke University DNA encoding the human A1 adenosine receptor
NL9201440A (nl) * 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
AU5092893A (en) * 1992-09-02 1994-03-29 Georgetown University Method of encapsulating anthracycline glycosides in liposomes
US6001992A (en) 1999-01-07 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of novel anti-apoptotic bcl-2-related proteins
AU5005093A (en) 1992-10-21 1994-05-09 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Combination of antineoplastic agent and antisense oligonucleotides for treatment of cancer
US6015886A (en) * 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US5417978A (en) * 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
FR2710074B1 (fr) * 1993-09-15 1995-12-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Gène GRB3-3, ses variants et leurs utilisations.
AU683957B2 (en) * 1993-11-05 1997-11-27 Amgen, Inc. Liposome preparation and material encapsulation method
US5651981A (en) * 1994-03-29 1997-07-29 Northwestern University Cationic phospholipids for transfection
US5696248A (en) * 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US5908635A (en) * 1994-08-05 1999-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for the liposomal delivery of nucleic acids
IT1275862B1 (it) * 1995-03-03 1997-10-24 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento
PT739898E (pt) * 1995-03-13 2002-03-28 Aventis Pharma Gmbh Mono-esteres de acidos fosfonucleicos processo para a sua preparacao e sua utilizacao
ATE332710T1 (de) * 1995-06-01 2006-08-15 Kishimoto Tadamitsu Wachstumsinhibitor gegen leukämische zellen, der antisense-oligonukleotidderivate gegen das wilms- tumorgen enthält
US6326487B1 (en) * 1995-06-05 2001-12-04 Aventis Pharma Deutschland Gmbh 3 modified oligonucleotide derivatives
US5756122A (en) * 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
US5705385A (en) * 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
AU723163B2 (en) * 1995-06-07 2000-08-17 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
AU705644B2 (en) * 1995-08-01 1999-05-27 Novartis Ag Liposomal oligonucleotide compositions
US5855911A (en) * 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
DE19532553A1 (de) * 1995-09-04 1997-03-06 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung substituierter N-Ethyl-Glycinderivate
US6120794A (en) * 1995-09-26 2000-09-19 University Of Pittsburgh Emulsion and micellar formulations for the delivery of biologically active substances to cells
US6977244B2 (en) * 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US5874224A (en) * 1997-03-11 1999-02-23 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Growth factor receptor binding protein
US6126965A (en) * 1997-03-21 2000-10-03 Georgetown University School Of Medicine Liposomes containing oligonucleotides
GB9711919D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Ciba Geigy Ag Oligonucleotide derivatives
JP2002508765A (ja) * 1997-06-23 2002-03-19 アルザ コーポレイション リポソーム被包ポリヌクレオチド組成物および方法
AU8280798A (en) * 1997-07-03 1999-01-25 Thomas Jefferson University An improved method for design and selection of efficacious antisense oligonucleotides
US7285288B1 (en) * 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6136965A (en) * 1998-07-02 2000-10-24 The Regents Of The University Of California Deoxynucleic alkyl and alkoxy thiourea compounds
US6211349B1 (en) * 1998-12-30 2001-04-03 Oligos Etc., Inc. Protonated/acidified nucleic acids and methods of use
US6211162B1 (en) * 1998-12-30 2001-04-03 Oligos Etc. Inc. Pulmonary delivery of protonated/acidified nucleic acids
US7795232B1 (en) 2000-08-25 2010-09-14 Genta Incorporated Methods of treatment of a bcl-2 disorder using bcl-2 antisense oligomers

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US7754872B2 (en) 2010-07-13
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US20070202157A1 (en) 2007-08-30
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