DE69630990T2

DE69630990T2 - Biovertragliche Klebmasse

Info

Publication number: DE69630990T2
Application number: DE69630990T
Authority: DE
Inventors: Wonza M. Palo Alto Rhee; Prema R. Los Gatos Rao; George H. Cupertino Chu; Frank A. Belmont DeLustro; Carol F.H. Redwood Shores Harner; Naomi San Mateo Sakai; Jacqueline A. Redwood City Schroeder
Original assignee: Cohesion Technologies Inc
Current assignee: Angiodevice International GmbH
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-29
Publication date: 2004-12-30
Anticipated expiration: 2016-05-30
Also published as: EP0747066A2; US5786421A; ES2211923T3; EP0747066B1; JPH0999052A; CA2172906A1; DE69630990D1; US5936035A; EP0747066A3; ATE255918T1; US5744545A; CA2172906C; JP2007296401A; JP4831848B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Zusammensetzungen, die als biologische oder chirurgische Klebstoffe nützlich sind; insbesondere betrifft sie Bioklebstoffzusammensetzungen, welche Kollagen umfassen, das unter Verwendung eines multifunktional aktivierten synthetischen hydrophilen Polymers vernetzt wurde, wie auch die Verwendung derartiger Zusammensetzungen, um eine Adhäsion zwischen einer ersten Oberfläche und einer zweiten Oberfläche zu bewirken, wobei wenigstens eine der ersten und zweiten Oberfläche vorzugsweise eine native Gewebeoberfläche ist, und die Verwendung derartiger Zusammensetzungen, um die Bildung von Adhäsion nach einer Operation zu verhindern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das US-Patent Nr. 5,024,742, das am 18. Juni 1991 für Nesburn et al. erteilt wurde, offenbart ein Verfahren der Vernetzung von aminosäurehaltigen Polymeren mit photoaktivierbaren, heterobifunktionalen Vernetzungsmitteln, wobei die Vernetzungsmittel eine photoaktivierbare Stelle und eine konventionelle Stelle aufweisen, umfassend: i) Auswählen von einem oder mehreren aminosäurehaltigen Polymeren; und ii) Kombinieren der Polymere mit den Vernetzungsmitteln, so dass die konventionelle Stelle auf dem Vernetzungsmittel an das Polymer gebunden wird und die photoaktivierbare Stelle ungebunden bleibt. Bei der Photoaktivierung werden Vernetzungen gebildet, wenn die photoaktive Stelle an ein anderes aminosäurehaltiges Polymer bindet. Die resultierende vernetzte Kollagenzusammensetzung kann als ein Bioklebstoff für nahtlose Schließungen des Auges oder irgendeiner anderen Wunde verwendet werden.
Das US-Patent Nr. 5,156,613, das am 20. Oktober 1992 für Sawyer erteilt wurde, offenbart ein Verfahren der Verbindung oder Rekonstruktion von biologischem Gewebe, umfassend das Anwenden von Energie auf das Gewebe während ein Füllmaterial bereitgestellt wird, und das Denaturieren oder Schmelzen des Materials und des benachbarten biologischen Gewebes mit der Energie, um zu bewirken, dass sich das denaturierte oder geschmolzene Füllmaterial und das Gewebe mischen, wodurch das Gewebe verbunden oder rekonstruiert wird. Ebenfalls beansprucht wird ein Verfahren der Verbindung oder Rekonstruktion von biologischem Gewebe, umfassend das Anwenden optischer oder Radiofrequenzenergie, während auf dem biologischen Gewebe ein Kollagenfüllmaterial bereitgestellt wird; das Denaturieren oder Schmelzen des Kollagens und des benachbarten Gewebes mit der aufgebrachten Energie, um ein Mischen des denaturierten oder geschmolzenen Kollagens und des Gewebes zu bewirken, und das Verbinden oder Rekonstruieren des Gewebes.
Das US-Patent Nr. 5,162,430, das am 10. November 1992 für Rhee et al. erteilt wurde, offenbart Konjugate aus Kollagen – synthetischem Polymer, die hergestellt wurden, indem Kollagen kovalent an synthetische hydrophile Polymere wie z. B. verschiedene Derivate von Polyethylenglycol gebunden wurde.
Das US-Patent Nr. 5,192,316, das am 9. März 1993 für Ting erteilt wurde, offenbart eine Linse zur Implantation unmittelbar an der Bowman-Membran einer lebenden Hornhaut, um die optischen Eigenschaften des Auges zu korrigieren. Die Linse ist aus einem synthetischen Polymer gefertigt, welches für Wasser durchlässig ist und ein Hydrogel bildet. Die Linse umfasst vorzugsweise einen Zusatz, um die Haftung der Linse an der Hornhaut zu erhöhen und/oder das Wachstum der Epithelzellen zu stimulieren. Der Zusatz kann sein: Fibronectin, Kollagen, Zellbefestigungsprotein, Antigelatinfaktor, ein biologisch aktives Peptid, kaltes unlösliches Globulin, Chondronectin, Laminin, epithelialer Wachstumsfaktor (EGF) oder eine Mischung von diesen.
Das US-Patent Nr. 5,209,776, das am 11. Mai 1993 für Bass et al. erteilt wurde, offenbart eine Zusammensetzung zum Zusammenkleben getrennter Gewebe oder zum Beschichten von Geweben oder Prothesematerialien, umfassend: i) wenigstens eine erste Komponente, die ausgewählt ist aus natürlichen oder synthetischen Peptiden, modifizierten, quervernetzten, gespaltenen oder verkürzten Varianten oder Derivaten, und ii) wenigstens eine zweite Komponente, die von der ersten Komponente verschieden ist, welche dazu dient, die erste Komponente dabei zu unterstützen, eine Matrix, ein Sol oder Gel mit der ersten Komponente zu bilden. Die erste Komponente kann beispielsweise Albumin, alpha-Globuline, beta-Globuline, gamma-Globuline, Transthyretin, Fibrinogen, Thrombin, Kollagen, Elastin, Keratin, Fibroin, Fibrin oder Fibronectin sein. Die zweite Komponente kann beispielsweise Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparin, Heparansulfat, Kollagen, Fructose, Dextrane, Agarose, Alginsäure, Pektine, Methylcellulose, Hydroxycellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, CMC, Glycerin, Mannitol, Sorbitol, Polyvinylalkohol oder Polyethylenglycol sein.
Das US-Patent Nr. 5,219,895, das am 15. Juni 1993 für DeVore et al. erteilt wurde, offenbart eine Kollagenzusammensetzung, welche als ein Klebstoff für medizinischen Anwendungen nützlich ist, wobei die Zusammensetzung gebildet wird durch die Polymerisation von derivatisiertem Kollagen, das mit einem Acylierungsmittel und/oder einem Sulfonierungsmittel modifiziert wurde. Die Polymerisation wird durch Explosiv-UV-Bestrahlung, fluoreszierendes Licht und/oder einen Starter durchgeführt. Das Acylierungsmittel kann Glutarsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Laurinsäureanhydrid, Diglycolsäureanhydrid, Methylbernsteinsäureanhydrid, Methylglutarsäureanhydrid, Dimethylglutarsäureanhydrid oder Exo-3,6-epoxy-1,2,3,4-tetrahydrophthalsäureanhydrid sein. Das Kleben von weichem Gewebe umfasst das Aufbringen einer polymerisierbaren Kollagenzusammensetzung auf wenigstens einen Teil einer Oberfläche von wenigstens einem aus einem ersten und zweiten Gewebe; das Aussetzen der Gewebeoberfläche an einen Starter, um das Kollagen zu polymerisieren; und das Inkontaktbringen der zwei Gewebe, um eine Klebung zwischen diesen zu bilden.
Das US-Patent Nr. 5,290,552, das am 1. März 1994 für Brown et al. erteilt wurde, offenbart eine Zusammensetzung eines chirurgischen Klebstoffs, welche Fibrinogen, Faktor XIII, Kollagen, Thrombin und Ca²⁺-Ionen in einem wässrigen Medium umfasst. Das Kollagen ist fibrillär, ist bei pH-Werten von ca. 5 unlöslich, ist fließfähig, hat die native helikale Struktur von Kollagenfibrillen und ist in der Lage, eine Gelierung des Klebstoffs zu bewirken. Das Thrombin und das Ca²⁺ liegen in einer Menge vor, die ausreicht, um die Polymerisation des Fibrinogens zu katalysieren, um ein Gerinnsel zu bilden.
Das US-Patent Nr. 5,328,955, das am 12. Juli 1994 für Rhee et al. erteilt wurde, offenbart verschiedene aktivierte Formen von Polyethylenglycol und verschiedene Verknüpfungen, welche verwendet werden können, um Konjugate aus Kollagen – synthetischem Polymer herzustellen, die eine Reihe von physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweisen.
Die europäische Patentschrift Nr. 341007 der Matrix Pharmaceuticals, Inc., offenbart eine Zusammensetzung eines chirurgischen Klebstoffs, welche in einer wässrigen Zusammensetzung Plasma von dem zu behandelnden Patienten, Kollagen in einer Menge, die ausreicht, um die Zusammensetzung anzudicken (z. B. bei einer Konzentration von ca. 5–30 mg/ml), und Thrombin in einer Menge, die ausreicht, um die Polymerisation von Fibrinogen, das in dem Plasma vorliegt, zu katalysieren, um ein Gerinnsel zu erzeugen (z. B. ca. 1–1000 NIHu Thrombin), umfasst.
Die europäische Patentschrift Nr. 466383 von Bausch & Lomb, Inc., offenbart eine Klebstoffzusammensetzung, die für chirurgische Anwendungen geeignet ist, welche eine wässrige Lösung von natürlichem Kollagen, das eine Schmelzindextemperatur von 35–45°C aufweist, umfasst. Die Zusammensetzung umfasst eine Mischung von dicht vernetztem Kollagen und nicht vernetztem Kollagen. Das dicht vernetzte Kollagen wird durch thermische Vernetzung erhalten. Die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 9213578 von Bausch & Lomb, Inc., offenbart eine Zusammensetzung eines chirurgischen Klebstoffs, welche eine wässrige Kollagen- oder Gelatinelösung mit einer Schmelzindextemperatur (MIT) von 33–60°C umfasst. Die Heilung von Wunden wird gefördert, indem wenigstens eine Oberfläche der Wunde mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird, welche umfasst: a) eine Dispersion kultivierter Epithelzellen in einer wässrigen Kollagenlösung, oder b) eine wässrige Lösung, welche ein gereinigtes natürlich vorkommendes Biopolymer und Wachstumsfaktoren enthält, wobei die Zusammensetzung eine MIT von 33–60°C und eine Viskosität von weniger als 50.000 cP bei 10°C über der MIT aufweist.
Die europäische Patentschrift Nr. 575273 der Flamel Technologies offenbart vernetzbare Kollagenderivate, die in Wasser und/oder polaren aprotischen organischen Lösungsmitteln löslich sind und freie oder substituierte SH-Gruppen an Cystein- oder Cysteinderivatresten enthalten, welche an dem Kollagenmolekül, wenigstens teilweise, durch Abstandhaltergruppen befestigt sind. Ebenfalls offenbart wird unlösliches vernetztes Kollagen, bei welchem die Brücken zwischen den Ketten wenigstens teilweise Disulfidverknüpfungen sind, welche durch Cysteinreste gebildet werden, die an dem Kollagenmolekül, wenigstens teilweise, durch Abstandhaltergruppen befestigt sind. Die beanspruchten Zusammensetzungen sind als biologische oder chirurgische Klebstoffe nützlich.
Die japanische Patentschrift Nr. 6070972 von Nippon offenbart eine Zusammensetzung zum Kleben biologischer Gewebe, bestehend aus i) einem Klebstoffbestandteil, welcher ein partielles Hydrolysat von Kollagenprotein, Wasser und eine mehrwertige Phenolverbindung umfasst; und ii) einem Härtungsbestandteil, bestehend aus einer wässrigen Lösung, die wenigstens eine Verbindung von Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glycerolaldehyd enthält.
Die EP-A-0656214 offenbart Kollagen-Polymer-Konjugate, die chemisch modifizierte Kollagene umfassen, welche im Wesentlichen bei pH 7 in nicht fibrillärer Form vorliegen, kovalent gebunden an synthetische hydrophile Polymere, um optisch klare Materialien zur Anwendung in ophthalmischen oder anderen medizinischen Anwendungen zu erzeugen.
Wir offenbaren nun eine detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, einschließlich Bioklebstoffzusammensetzungen, welche Kollagen umfassen, das unter Verwendung von multifunktional aktivierten synthetischen hydrophilen Polymeren vernetzt wurde, sowie Verfahren zur Verwendung dieser Zusammensetzungen, um eine Klebung zwischen einer ersten Oberfläche und einer zweiten Oberfläche zu bewirken, wobei wenigstens eine von der ersten und zweiten Oberfläche eine native Gewebeoberfläche ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
So stellt die vorliegende Erfindung einen Bioklebstoff bereit, welcher fibrilläres Kollagen, ein Faserzerlegungsmittel (vorzugsweise einen biokompatiblen Alkohol) und ein multifunktional aktiviertes synthetisches hydrophiles Polymer umfasst, wobei das Faserzerlegungsmittel in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um das Kollagen bei pH 7 im Wesentlichen nicht fibrillär zu machen, und wobei das Kollagen und das synthetische Polymer kovalent binden, um ein Konjugat aus Kollagen – synthetischem Polymer zu bilden.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine derartige Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zum Bewirken einer nicht operativen Befestigung einer ersten Oberfläche an einer zweiten Oberfläche bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:
Mischen des fibrillären Kollagens und des Faserzerlegungsmittels in einer Menge, die ausreicht, um das Kollagen bei pH 7 im Wesentlichen nicht fibrillär zu machen;
Mischen des resultierenden Kollagens und des synthetischen hydrophilen Polymers, um eine Vernetzung zwischen diesen zu initiieren; Anwenden der Mischung von Kollagen und synthetischem Polymer auf eine erste Oberfläche, bevor eine wesentliche Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem synthetischen Polymer aufgetreten ist; und Inkontaktbringen der ersten Oberfläche mit der zweiten Oberfläche, um eine Adhäsion zwischen diesen zu bewirken. Wenigstens eine von der ersten und zweiten Oberfläche ist vorzugsweise eine native Gewebeoberfläche.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine derartige Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zum Verhindern der Bildung von Adhäsionen nach einer Operation bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:
Mischen des fibrillären Kollagens und des Faserzerlegungsmittels in einer Menge, die ausreicht, um das Kollagen bei pH 7 im Wesentlichen nicht fibrillär zu machen;
Mischen des resultierenden Kollagens und des synthetischen hydrophilen Polymers, um eine Vernetzung zwischen diesen zu initiieren; Anwenden der Mischung aus Kollagen und synthetischem Polymer auf ein Gewebe, das die Operationsstelle umfasst, umgibt und/oder benachbart zu dieser ist, bevor eine wesentliche Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem synthetischem Polymer stattgefunden hat; und Fortsetzen lassen der Vernetzung des Kollagens und des synthetischen Polymers in situ, bis eine Gleichgewichtsvernetzung erreicht wurde; und Bewirken des Verschließens der Operationsstelle, ggf. durch herkömmliche Methoden.
Die nicht fibrillären auf Kollagen basierenden Klebstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise optisch klar, was die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Anwendung in ophthalmischen Anwendungen besonders geeignet macht, bei welchen die optische Klarheit ein Erfordernis ist. Weiterhin sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung aus biokompatiblen, nicht immunogenen Komponenten zusammengesetzt, welche keine toxischen, potenziell entzündlichen oder immunogenen Reaktionsprodukte an der Gewebestelle der Verabreichung zurück lassen.
KURZE BESCHREIBUNGEN DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Ergebnisse einer Differentialscanningkalorimetrie (DSC) für nicht vernetztes succinyliertes Kollagen (Probe A) und succinylierte Kollagenformulierungen, die 10, 20, 50 und 91 mg/ml difunktional aktiviertes SG-PEG enthalten (Proben B, C bzw. D).
2 zeigt DSC-Ergebnisse für methylierte Kollagenformulierungen, die 2, 10, 30 und 72 mg/ml difunktional aktiviertes SG-PEG enthalten (Proben E, F, G bzw. H).
3 zeigt DSC-Ergebnisse für nicht vernetztes methyliertes Kollagen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen, die zur Verwendung als biologische oder chirurgische Klebstoffe geeignet sind, hergestellt, indem Kollagen mit einem multifunktional aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer vernetzt wird. Wie hierin ver wendet werden die Begriffe "Bioklebstoff", "biologischer Klebstoff" und "chirurgischer Klebstoff" austauschbar verwendet und beziehen sich auf biokompatible Zusammensetzungen, die in der Lage sind, eine temporäre oder permanente Befestigung zwischen den Oberflächen von zwei nativen Geweben oder zwischen einer nativen Gewebeoberfläche und einer nicht nativen Gewebeoberfläche oder einer Oberfläche eines künstlichen Implantats zu bewirken.
Um die Bioklebstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung herzustellen, ist es zuerst notwendig, Kollagen und ein multifunktional aktiviertes synthetisches hydrophiles Polymer bereit zu stellen. Wie hierin verwendet soll der Begriff "Kollagen" Kollagen jeglichen Typs umfassen, aus jeder Quelle, einschließlich aber nicht beschränkt auf, Kollagen, das aus dem Gewebe extrahiert wurde oder rekombinant erzeugt wurde, Kollagenanalogen, Kollagenderivaten, modifizierten Kollagenen und denaturierten Kollagenen wie beispielsweise Gelatine.
Kollagen ist die Hauptproteinkomponente von Knochen, Knorpel, Haut und Bindegewebe in Tieren. Kollagen ist in seiner nativen Form typischerweise ein starres, stabförmiges Molekül mit ungefähr 300 Nanometern (nm) Länge und 1,5 nm im Durchmesser. Es ist aus drei Kollagenpolypeptiden zusammengesetzt, welche eine enge Tripelhelix bilden. Die Kollagenpolypeptide sind gekennzeichnet durch einen langen Mittelabschnitt mit der sich wiederholenden Sequenz -Gly-X-Y-, wobei X und Y oft Prolin oder Hydroxyprolin sind, welcher an jedem Ende durch die "Telopeptid"-Bereiche gebunden ist, die weniger als ca. 5 Prozent (%) des Moleküls ausmachen. Der Telopeptid-Bereich der Kollagenketten ist typischerweise für die Vernetzung zwischen den Ketten und für die Immunogenität des Proteins verantwortlich.
Im Allgemeinen kann Kollagen aus irgendeiner Quelle verwendet werden, um die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung herzustellen; beispielsweise kann Kollagen aus einer humanen oder anderen Säugetierquelle wie beispielsweise der Lederhaut von Rindern oder Schweinen und menschlicher Plazenta extrahiert und gereinigt werden oder kann rekombinant oder in anderer Weise hergestellt werden. Die Herstellung von gereinigtem, im Wesentlichen nicht antigenem Kollagen in Lösung aus Rinderhaut ist grundsätzlich ein 3-Schritt-Verfahren, welches die Solubilisierung, Enzymbehandlung und Reinigung beinhaltet, wie es in dem US-Patent Nr. 4,140,537, das am 20. Februar 1979 für Luck et al. erteilt wurde, und dem US-Patent Nr. 4,488,911, das am 18. Dezember 1984 für Luck et al. erteilt wurde, beschrieben wird. EP-A-0652731 offenbart Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Kollagen aus menschlicher Plazenta. EP-A-0681431 offenbart Verfahren zum Erzeugen von rekombinantem humanem Kollagen in der Milch transgener Tiere, einschließlich transgener Kühe. Der Begriff "Kollagen" oder "Kollagenmaterial", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf alle Formen von Kollagen, einschließlich jener, die prozessiert oder anderweitig modifiziert wurden.
Kollagen irgendeines, anfangs fibrillären Typs, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Typen I, II, III, IV, oder irgendeine Kombination von diesen, kann verwendet werden, auch wenn der Typ I allgemein bevorzugt ist. Entweder Atelopeptid- oder Telopeptid-haltiges Kollagen kann verwendet werden; wenn jedoch Kollagen aus einer xenogenen Quelle, wie beispielsweise Rinderkollagen, verwendet wird, ist Atelopeptidkollagen aufgrund seiner verringerten Immunogenität im Vergleich zu Telopeptid-haltigem Kollagen allgemein bevorzugt.
Kollagen, das vorab nicht durch Verfahren wie Erwärmung, Bestrahlung oder durch chemische Vernetzungsmittel vernetzt wurde, ist zur Verwendung als das Ausgangsmaterial bei der Praktizierung der vorliegenden Erfindung bevorzugt, auch wenn vorab vernetztes Kollagen verwendet werden kann. Nicht vernetztes fibrilläres Atelopeptidkollagen ist im Handel bei der Collagen Corporation (Palo Alto, CA) mit Kollagenkonzentrationen von 35 mg/ml und 65 mg/ml unter den Handelsmarken Zyderm^®I-Kollagen bzw. Zyderm II-Kollagen erhältlich. Mit Glutaraldehyd vernetztes fibrilläres Atelopeptidkollagen ist im Handel bei der Collagen Corporation mit einer Kollagenkonzentration von 35 mg/ml unter der Handelsmarke Zyplast^®-Kollagen erhältlich.
Kollagene zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung liegen allgemein in wässriger Suspension bei einer Konzentration zwischen ca. 20 mg/ml bis ca. 120 mg/ml, vorzugsweise zwischen ca. 30 mg/ml bis ca. 90 mg/ml vor.
In der vorliegenden Erfindung wird nicht fibrilläres Kollagen erzeugt, da dieses eine klebrige Konsistenz aufweist und im Allgemeinen viskoser ist als fibrilläres Kollagen (bei äquivalenten Kollagenproteinkonzentrationen), was es in Zusammensetzungen, die zur Verwendung als Bioklebstoff gedacht sind, besonders nützlich macht. Der Begriff "nicht fibrilläres Kollagen" bezieht sich auf irgendein modifiziertes oder unmodifiziertes Kollagenmaterial, das bei pH 7 im Wesentlichen in nicht fibrillärer Form vorliegt, wie durch die optische Klarheit einer wässrigen Suspension des Kollagens angezeigt wird.
Kollagene zur Verwendung in den Bioklebstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung liegen anfangs in fibrillärer Form vor, und werden dann durch die Zugabe von einem oder mehreren Faserzerlegungsmitteln nicht fibrillär gemacht. Die Faserzerlegungsmittel müssen in einer Menge vorliegen, die ausreicht, um das Kollagen bei pH 7 im Wesentlichen nicht fibrillär zu machen, wie oben beschrieben wird. Faserzerlegungsmittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen, ohne Beschränkung, verschiedene biokompatible Alkohole, Aminosäuren, anorganische Salze und Kohlenhydrate, wobei biokompatible Alkohole besonders bevorzugt sind. Bevorzugte biokompatible Alkohole umfassen Glycerol und Propylenglycol. Nicht biokompatible Alkohole wie z. B. Ethanol, Methanol und Isopropanol, sind zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung aufgrund ihrer potenziell nachteiligen Wirkungen auf den Körper des Patienten, welcher diese erhält, nicht bevorzugt. Bevorzugte Aminosäuren umfassen Arginin. Bevorzugte anorganische Salze umfassen Natriumchlorid und Kaliumchlorid. Auch wenn Kohlenhydrate, wie beispielsweise verschiedene Zucker, einschließlich Sucrose, bei der Praktizierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind sie nicht so bevorzugt wie andere Typen von Faserzerlegungsmitteln, da diese in vivo zytotoxische Wirkungen aufweisen können.
Kollagen, das bereits in nicht fibrillärer Form vorliegt, kann zusammen mit dem fibrillären Kollagen verwendet werden, um die Zusammensetzungen der Erfindung herzustellen. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "nicht fibrilläres Kollagen" Kollagentypen umfassen, die in nativer Form nicht fibrillär sind, wie auch Kollagene, die chemisch modifiziert wurden, so dass sie bei oder um neutralen pH herum in nicht fibrillärer Form vorliegen. Kollagentypen, die in nativer Form nicht fibrillär (oder mikrofibrillär) sind, umfassen die Typen IV, VI und VII.
Chemisch modifizierte Kollagene, die bei neutralem pH in nicht fibrillärer Form vorliegen, umfassen succinyliertes Kollagen und methyliertes Kollagen, welche beide gemäß den Verfahren hergestellt werden können, die in dem US-Patent Nr. 4,164,559, das am 14. August 1979 für Miyata et al. erteilt wurde, beschrieben werden. Unsere Experimente haben gezeigt, dass aufgrund seiner inhärenten Klebrigkeit methyliertes Kollagen zur Verwendung in Bioklebstoffzusammensetzungen besonders bevorzugt ist (siehe Beispiele 3–5 unten).
Fibrilläres Kollagen ist trüb und weniger klebrig als nicht fibrilläres Kollagen. Jedoch existieren Mischungen von nicht fibrillärem und fibrillärem Kollagen bei den hergerichteten Zusammensetzungen, und diese können zur Verwendung in Klebstoffzusammensetzungen bevorzugt sein, die für eine Langzeitanwendung in vivo gedacht sind, wenn die optische Klarheit kein Erfordernis ist. Wir haben gefunden, dass Mischungen von methyliertem (nicht fibrillä rem) Kollagen und fibrillärem Kollagen, das mit synthetischen hydrophilen Polymeren vernetzt wurde, als Bioklebstoff nützlich sind (siehe Beispiel 5 unten).
Eine Zusammensetzung, welche eine Mischung aus partikulärem vernetztem fibrillärem Kollagen und nicht vernetztem fibrillärem Kollagen umfasst, welche in der EP-A-0713707 offenbart wird, kann ebenfalls bei der Praktizierung der Erfindung verwendet werden. Das partikuläre vernetzte fibrilläre Kollagen ist vorzugsweise Glutaraldehyd-vernetztes fibrilläres Kollagen und umfasst vorzugsweise zwischen ca. 25 bis ca. 95 Prozent, insbesondere zwischen ca. 60 bis ca. 80 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung. Das nicht vernetzte fibrilläre Kollagen umfasst vorzugsweise zwischen ca. 5 bis ca. 75, noch bevorzugter zwischen ca. 20 bis ca. 40 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung. Das partikuläre vernetzte fibrilläre Kollagen und das nicht vernetzte fibrilläre Kollagen werden zuerst kombiniert, dann zusammen unter Verwendung eines synthetischen hydrophilen Polymers vernetzt.
Es wurde ebenfalls gefunden, dass denaturiertes Kollagen, welches üblicherweise als Gelatine bekannt ist, in den Verfahren der Erfindung nützlich ist.
Die auf Kollagen basierenden Bioklebstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls so formuliert werden, dass sie biologisch aktive Mittel enthalten, um die Adhäsion der Gewebe oder das Heilen der geklebten Gewebe zu erleichtern. Der Begriff "biologisch aktives Mittel" oder "aktives Mittel", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf organische Moleküle, welche in vivo biologische Wirkungen ausüben. Beispiele für die aktiven Mittel umfassen, ohne Beschränkung, Enzyme, Rezeptorantagonisten oder -agonisten, Hormone, Wachstumsfaktoren, autogenes Knochenmark, Antibiotika, antimikrobielle Mittel und Antikörper. Der Begriff "aktives Mittel" soll ebenfalls eine Vielzahl verschiedener Zelltypen umfassen, welche in die Zusammensetzungen der Erfindung eingearbeitet werden können. Der Begriff "aktives Mittel" soll ebenfalls Kombinationen oder Mischungen aus zwei oder mehreren aktiven Mitteln, wie sie oben definiert sind, umfassen.
Bevorzugte aktive Mittel zur Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen Wachstumsfaktoren wie beispielsweise transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs), von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktoren (PDGFs), epidermale Wachstumsfaktoren (EGFs), aktivierte Bindegewebspeptide (CTAPs), osteogene Faktoren und biologisch aktive Analoge, Fragmente und Derivate solcher Wachstumsfaktoren. Mitglieder der Supergenfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF), welches multifunktionale regulatorische Proteine sind, sind besonders bevorzugt. Mitglieder der TGF-Supergenfamilie umfassen die transformierenden beta-Wachstumsfaktoren (zum Beispiel TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3); Knochenmorphogeneseproteine (zum Beispiel BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); heparinbindende Wachstumsfaktoren (zum Beispiel Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF)); Inhibine (zum Beispiel Inhibin A, Inhibin B); wachstumsdifferenzierende Faktoren (zum Beispiel GDF-1); und Activine (zum Beispiel Activin A, Activin B, Activin AB).
Wachstumsfaktoren können aus nativen oder natürlichen Quellen isoliert werden, wie beispielsweise aus Säugetierzellen, oder können synthetisch hergestellt werden, wie beispielsweise durch rekombinante DNA-Techniken oder durch verschieden chemische Prozesse. Zusätzlich können Analoge, Fragmente oder Derivate dieser Faktoren verwendet werden, vorausgesetzt, dass diese wenigstens einen Teil der biologischen Aktivität des nativen Moleküls zeigen. Beispielsweise können Analoge durch Expression von Genen hergestellt werden, die durch gezielte Mutagenese oder durch andere gentechnologische Techniken verändert wurden.
Biologisch aktive Mittel können in das Kollagen durch Beimischung eingearbeitet werden. Alternativ können die Mittel kovalent mit dem Kollagen verknüpft werden, indem ein Vernetzungsmittel wie beispielsweise ein funktional aktivierter Polyethylenglycol verwendet wird, oder an das Kollagen affinitätsgebunden werden, indem ein Bindungsligand verwendet wird. Prozesse zum kovalenten Binden biologisch aktiver Mittel wie beispielsweise Wachstumsfaktoren an Kollagen, wobei ein synthetisches hydrophiles Polymer, wie beispielsweise ein funktional aktivierter Polyethylenglycol verwendet wird, werden in dem US-Patent Nr. 5,162,430 beschrieben, dass am 10. November 1992 für Rhee et al. erteilt wurde. Verfahren zur Affinitätsbindung biologisch aktiver Mittel an Kollagen über Bindungsliganden wie zum Beispiel Heparin sind offenbart in der EP-Anmeldung Nr. 96 102 340.5 (veröffentlicht als EP 732 105 ).
Das biologisch aktive Mittel wird im Allgemeinen in das Kollagen eingearbeitet, nachdem das Kollagen mit einem Faserzerlegungsmittel gemischt wurde. Der Typ und die Menge des verwendeten aktiven Mittels werden, neben anderen Faktoren, von der besonderen Stelle und dem Zustand, der behandelt werden soll, und der biologischen Aktivität und den pharmakokinetischen Eigenschaften des ausgewählten aktiven Mittels abhängen.
Wenn biologisch aktive Mittel in die Zusammensetzungen der Erfindung eingearbeitet werden, sind biokompatible Alkohole (und insbesondere Glycerol) die bevorzugten Faserzerlegungsmittel, da von gewissen Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise dem transformierenden Wachstumsfaktor Beta gezeigt wurde, dass diese ihre Aktivität in Zusammensetzungen, die Glycerol enthalten, beibehalten.
Um die auf Kollagen basierenden Bioklebstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird Kollagen unter Verwendung eines multifunktional aktivierten synthetischen hydrophilen Polymers vernetzt. Der Begriff "multifunktional aktiviert" bezieht sich auf synthetische hydrophile Polymere, welche zwei oder mehr funktionale Gruppen, die an verschiedenen Stellen entlang der Polymerkette angeordnet sind, die in der Lage sind, mit nukleophilen Gruppen wie beispielsweise primären Amino (-NH₂)-Gruppen oder Thiol (-SH)-Gruppen auf anderen Molekülen wie beispielsweise Kollagen zu reagieren, aufweisen oder chemisch so modifiziert wurden, dass sie diese aufweisen. Jede funktionale Gruppe auf einem multifunktional aktivierten synthetischen hydrophilen Polymermolekül ist in der Lage, kovalent an ein Kollagenmolekül zu binden, wodurch eine Vernetzung zwischen den Kollagenmolekülen bewirkt wird. Typen von multifunktional aktivierten hydrophilen synthetischen Polymeren umfassen difunktional aktivierte, tetrafunktional aktivierte und sternförmig verzweigte Polymere.
Multifunktional aktivierte Polyethylenglycole und insbesondere gewisse difunktional aktivierte Polyethylenglycole sind die bevorzugten synthetischen hydrophilen Polymere zur Verwendung bei der Herstellung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Der Begriff "difunktional aktiviert" bezieht sich auf synthetische hydrophile Polymermoleküle, welche zwei funktionale Gruppen, die in der Lage sind, mit nukleophilen Gruppen auf anderen Molekülen wie beispielsweise Kollagen zu reagieren, aufweisen oder chemisch so modifiziert wurden, so dass sie diese aufweisen. Die zwei funktionalen Gruppen auf einem difunktional aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer sind im Allgemeinen an entgegengesetzten Enden der Polymerkette lokalisiert. Jede funktional aktivierte Gruppe auf einem difunktional aktivierten synthetischen hydrophilen Polymermolekül ist in der Lage, kovalent an ein Kollagenmolekül zu binden, wodurch eine Vernetzung zwischen den Kollagenmolekülen bewirkt wird.
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden Moleküle von Polyethylenglycol (PEG) chemisch modifiziert, um funktionale Gruppen an zwei oder mehr Stellen entlang der Länge des PEG-Moleküls bereit zu stellen, so dass eine kovalente Bindung zwischen dem PEG und reaktiven Gruppen auf dem Kollagen stattfinden kann. Einige spezifische aktivierte Formen von PEG sind nachstehend strukturell gezeigt, wie auch verallgemeinerte Reaktionsprodukte, die durch ein Umsetzen von difunktional aktivierten Formen von PEG mit Kollagen erhalten wurden. In den Formeln 1–8 steht der Begriff COL für Kollagen; der Begriff PEG steht für Polymere mit der sich wiederholenden Struktur (OCH₂CH₂)_n.
Das erste aktivierte PEG ist difunktional aktiviertes PEG-Succinimidylglutarat, welches hierin als (SG-PEG) bezeichnet wird. Die Strukturformel dieses Moleküls und das Reaktionsprodukt, das erhalten wird, indem es mit Kollagen umgesetzt wird, sind in Formel 1 gezeigt.
SG-PEG: Difunktional Aktiviertes PEG-Succinimidylglutarat
FORMEL 1
Eine andere difunktional aktivierte Form von PEG wird als PEG-Succinmidyl (S-PEG) bezeichnet. Die Strukturformel für diese Verbindung und das Reaktionsprodukt, das erhalten wird, indem diese mit Kollagen umgesetzt wird, sind in Formel 2 gezeigt. In einer allgemeinen Strukturformel für die Verbindung ist der Index 3 durch ein "n" ersetzt. In der Ausführungsform, die in Formel 1 gezeigt ist, ist n = 3, so dass drei sich wiederholende CH₂-Gruppen auf jeder Seite des PEG vorliegen.
Die Struktur in Formel 2 führt zu einem Konjugat, welches eine "Ether"-Verknüpfung aufweist, die weniger hydrolyseanfällig ist. Dieses ist verschieden von dem Konjugat, das in Formel 1 gezeigt ist, in welchem eine Ester-Verknüpfung vorkommt. Die Ester-Verknüpfung ist unter physiologischen Bedingungen hydrolyseanfällig.
SE-PEG, n = 3: Difunktional Aktiviertes PEG-Succinimidyl (Ether-Verknüpfung)
FORMEL 2
Noch eine andere difunktional aktivierte Form von Polyethylenglycol, worin n = 2 ist, ist in Formel 3 gezeigt, wie auch das Konjugat, das durch Umsetzen des aktivierten PEG mit Kollagen gebildet wird.
SE-PEG, n = 2: Difunktional Aktiviertes PEG-Succinimidyl (Ether-Verknüpfung)
FORMEL 3
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, die ähnlich ist zu den Verbindungen der Formeln 2 und 3, wird bereitgestellt, wenn n = 1 ist. Die Strukturformel und das resultierende Konjugat aus Kollagen-synthetischem Polymer sind in Formel 4 gezeigt. Es wird angemerkt, dass dieses Konjugat sowohl eine Ether- als auch eine Peptid-Verknüpfung umfasst. Diese Verknüpfungen sind unter physiologischen Bedingungen stabil.
SE-PEG, n = 1: Difunktional Aktiviertes PEG-Succinimidyl (Ether-Verknüpfung)
FORMEL 4
Eine andere difunktional aktivierte Form von PEG wird als PEG-Succinimidylsuccinamid (SSA-PEG) bezeichnet. Die Strukturformel für diese Verbindung und das Reaktionsprodukt, das erhalten wird, indem diese mit Kollagen umgesetzt wird, sind in Formel 5 gezeigt. In der Struktur, die in Formel 1 gezeigt ist, ist n = 2; jedoch können verwandte Verbindungen, in welchen n = 1 oder n = 3–10 ist, ebenfalls bei der Praktizierung der Erfindung verwendet werden.
Die Struktur in Formel 5 führt zu einem Konjugat, welches eine "Amid"-Verknüpfung umfasst, welche wie die vorher beschriebene Ether-Verknüpfung weniger hydrolyseanfällig ist und daher stabiler als eine Ester-Verknüpfung ist.
SSA-PEG, n = 2: Difunktional Aktiviertes PEG-Succinimidylsuccinamid
FORMEL 5
Noch eine andere difunktional aktivierte Form von PEG wird bereitgestellt, wenn n = 0 ist. Diese Verbindung wird als PEG-Succinimidylcarbonat (SC-PEG) bezeichnet. Die Strukturformel dieser Verbindung und das Konjugat, das gebildet wird, indem SC-PEG mit Kollagen umgesetzt wird, sind in Formel 6 gezeigt.
SC-PEG, n = 0: Difunktional Aktiviertes PEG-Succinimidylcarbonat
FORMEL 6
All die aktivierten Polyethylenglycolderivate, die in den Formeln 1–6 dargestellt sind, beinhalten den Einschluss der Succinimidylgruppe. Es können jedoch andere aktivierende Gruppen an Stellen entlang der Länge des PEG-Moleküls befestigt werden. Beispielsweise kann PEG derivatisiert werden, um difunktional aktivierten PEG-Propionaldehyd (A-PEG) zu bilden, welcher in Formel 7 gezeigt ist, wie auch das Konjugat, das durch die Reaktion von A-PEG mit Kollagen gebildet wird. Die Verknüpfung, welche in Formel 6 gezeigt ist, wird als eine -(CH₂)_n-NH-Verknüpfung bezeichnet, wobei n = 1–10 ist.
A-PEG: Difunktional Aktivierter PEG-Propionaldehyd
FORMEL 7
Noch eine andere Form von aktiviertem Polyethylenglycol ist difunktional aktivierter PEG-Glycidylether (E-PEG), welcher in Formel 8 gezeigt ist, wie auch das Konjugat, das durch Umsetzen von diesen mit Kollagen gebildet wird.
E-PEG: Difunktional Aktivierter PEG-Glycidylether
FORMEL 8
Viele der aktivierten Formen von Polyethylenglycol, die oben beschrieben wurden, sind nun im Handel von der Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama, und der Union Carbide, South Charleston, West Virginia, erhältlich. Die verschiedenen aktivierten Formen von Polyethylenglycol und verschiedene Verknüpfungen, welche verwendet werden können, um Konjugate aus Kollagen-synthetischem Polymer zu erzeugen, die eine Reihe von physikalischen und chemischen Eigenschaften aufweisen, werden detaillierter in dem US-Patent Nr. 5,328,955 beschrieben, das am 12. Juli 1994 für Rhee et al. erteilt wurde.
Die Konzentration des multifunktional aktivierten synthetischen hydrophilen Polymers, das verwendet wurde, um die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird abhängig von einer Anzahl von Faktoren variieren, einschließlich des Typs und Molekulargewichts des verwendeten synthetischen Polymers und der Kollagenproteinkonzentration der Kollagensuspension. Im Allgemeinen haben wir gefunden, dass Konzentrationen des synthetischen Polymers in dem Bereich von ca. 0,1 bis ca. 10 Gewichtsprozent der Endzusammensetzung zur Verwendung in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind. Beispielsweise würde eine Endzusammensetzung mit einem Gesamtgewicht von 1 Gramm (1000 Milligramm) zwischen ca. 1 und ca. 100 Milligramm des multifunktional aktivierten synthetischen Polymers enthalten.
Bevorzugte multifunktional aktivierte Polyethylenglycole zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind difunktional aktiviertes SG-PEG (wie in Formel 1 dargestellt) und difunktional aktiviertes SE-PEG (in den Formeln 2–4 gezeigt).
In einem allgemeinen Verfahren zur Herstellung der bevorzugten Bioklebstoffzusammensetzungen der Erfindung wird eine wässrige Suspension von fibrillärem Kollagen mit einem Faserzerlegungsmittel in einer Menge gemischt, die ausreicht, um das Kollagen bei pH 7 im Wesentlichen nicht fibrillär zu machen. Das resultierende nicht fibrilläre Kollagen wird dann mit einem multifunktional aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer gemischt, um eine Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem synthetischen Polymer zu initiieren.
VERWENDUNG UND VERABREICHUNG
In einem allgemeinen Verfahren zum Bewirken der Befestigung einer ersten Oberfläche an einer zweiten Oberfläche werden: 1) Kollagen und ein multifunktional aktiviertes synthetisches hydrophiles Polymer bereit gestellt; 2) das Kollagen und das synthetische Polymer werden zusammengemischt, um eine Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem synthetischen Polymer zu initiieren; 3) die Mischung aus Kollagen-synthetischem Polymer wird auf eine erste Oberfläche aufgetragen, bevor eine wesentliche Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem synthetischen Polymer stattgefunden hat; und 4) die erste Oberfläche wird mit einer zweiten Oberfläche in Kontakt gebracht, um eine Adhäsion zwischen der ersten Ober fläche und der zweiten Oberfläche zu bewirken. Wenigstens eine von der ersten und der zweiten Oberfläche ist vorzugsweise eine native Gewebeoberfläche.
Beispielsweise werden das Kollagen und das multifunktional aktivierte synthetische hydrophile Polymer im Allgemeinen in getrennten Spritzen bereitgestellt, deren Inhalt dann unter Verwendung einer Mischtechnik von Spritze zu Spritze kurz vor der Abgabe an eine erste Oberfläche zusammengemischt wird. Das synthetische Polymer wird im Allgemeinen in einer sterilen, trockenen Form verwendet (wie in der EP-A-0 697 218 beschrieben wird), um den Verlust des Vernetzungsvermögens aufgrund von Hydrolyse zu verhindern, welche typischerweise bei Aussetzen der hydrophilen Polymere an wässrige Medien stattfindet.
Das Kollagen und das synthetische Polymer werden vorzugsweise für ein Minimum von 20 (insbesondere wenigstens 30) Durchgängen gemischt, um eine ausreichende Mischung des trockenen Polymers mit dem Kollagen sicherzustellen. Da ein Vernetzen zwischen dem Kollagen und dem synthetischem Polymer allgemein durch den Mischprozess initiiert wird, ist es wichtig, die Reaktionsmischung aus Kollagen-synthetischem Polymer so schnell wie möglich nach dem Mischen auf die erste Oberfläche aufzutragen.
Die Reaktionsmischung aus Kollagen-synthetischem Polymer kann aus der Öffnung einer Spritze oder einer anderen geeigneten Extrusionsvorrichtung auf die erste Oberfläche extrudiert werden. Nach der Auftragung kann die extrudierte Reaktionsmischung aus Kollagensynthetischem Polymer wenn nötig unter Verwendung eines Spatels auf der ersten Oberfläche verteilt werden. Alternativ können das synthetische Polymer und das Kollagen, das aus der Mischung von fibrillärem Kollagen und dem Faserzerlegungsmittel resultiert, in einer geeigneten Mischschale oder einem Gefäß zusammengemischt werden, dann unter Verwendung eines Spatels auf die erste Oberfläche aufgetragen werden.
In einem alternativen Verfahren zur Herstellung der Reaktionsmischung sind das Kollagen und das synthetische Polymer in getrennten Kammern einer Sprühdose oder Flasche mit einer Düse oder einer anderen geeigneten Sprühvorrichtung enthalten. Bei diesem Szenario mischen sich das Kollagen und das synthetische Polymer praktisch nicht, bis sie zusammen aus der Düse der Sprühvorrichtung ausgestoßen werden.
Nach der Auftragung der Reaktionsmischung aus Kollagen-synthetischem Polymer wird die erste Oberfläche mit einer zweiten Oberfläche in Kontakt gebracht. Wenn die zwei Oberflächen in Kontakt gebracht werden, bevor eine wesentliche Vernetzung zwischen dem Kolla gen und dem synthetischen Polymer stattgefunden hat, werden die Moleküle des synthetischem Polymers ebenfalls kovalent mit Lysinresten auf den Kollagenmolekülen binden, welche auf einer oder beiden Oberflächen vorliegen, was zu einer verbesserten Adhäsion führt.
Die zwei Oberflächen können manuell oder unter Verwendung anderer geeigneter Mittel zusammengehalten werden, während die Vernetzungsreaktion bis zum Abschluss fortschreitet. Ein Vernetzen zwischen dem Kollagen und dem synthetischem Polymer ist typischerweise innerhalb von 20 bis 60 Minuten nach dem Mischen des Kollagens mit dem synthetischen Polymer abgeschlossen.
Wenigstens eine von der ersten und der zweiten Oberfläche ist vorzugsweise eine native Gewebeoberfläche. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "natives Gewebe" auf biologische Gewebe, die in dem Körper des speziellen Patienten, der behandelt wird, natürlich vorkommen. Wie hierin verwendet soll der Begriff "natives Gewebe" biologische Gewebe umfassen, die von einem Teil des Körpers eines Patienten zur Implantation in einen anderen Teil des Körpers desselben Patienten (wie beispielsweise Knochenautotransplantate, Hautlappenautotransplantate usw.) abgehoben oder entfernt wurden. Beispielsweise können die Zusammensetzungen der Erfindung verwendet werden, um ein Stück Haut von einem Teil des Körpers eines Patienten an einem anderen Teil des Körpers zu befestigen, wie dieses bei Brandopfern der Fall ist.
Die andere Oberfläche kann eine native Gewebeoberfläche, eine nicht native Gewebeoberfläche oder eine Oberfläche eines künstlichen Implantats sein. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "nicht natives Gewebe" auf biologische Gewebe, die von dem Körper eines Spenderpatienten (der zur selben Spezies oder zu einer anderen Spezies als der Empfängerpatient gehören kann) zur Implantation in den Körper eines Empfängerpatienten (zum Beispiel Gewebe- und Organtransplantate) entfernt wurden. Beispielsweise können die vernetzten Polymerzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine Spenderhornhaut an dem Auge eines Empfängerpatienten zu befestigen.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "künstliches Implantat" auf jegliches biokompatibles Material, das zur Implantation in den Körper eines Patienten gedacht ist, welches durch die obigen Definitionen für natives Gewebe und nicht natives Gewebe nicht umfasst ist. Künstliche Implantate umfassen beispielsweise künstliche Blutgefäße, Herzklappen, künstliche Organe, Knochenprothesen, implantierbare Linsenprothesen usw.
Aufgrund ihrer optischen Klarheit sind nicht fibrilläre auf Kollagen basierende Bioklebstoffzusammensetzungen, die aus der vorliegenden Erfindung resultieren, besonders gut zur Verwendung in ophthalmischen Anwendungen geeignet. Beispielsweise kann eine künstliche Linsenprothese zur Sichtkorrektur an der Bowman-Schicht der Hornhaut des Auges eines Patienten unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung befestigt werden. Wie in der EP-A-0 656 214 offenbart, kann ein chemisch modifiziertes Kollagen (wie beispielsweise succinyliertes oder methyliertes Kollagen), welches bei pH 7 im Wesentlichen in nicht fibrillärer Form vorliegt, unter Verwendung eines synthetischen hydrophilen Polymers vernetzt werden, dann zu einer gewünschten Linsenprothesenform geformt werden und vollständig vernetzen gelassen werden. Die resultierende vernetzte Kollagenlinsenprothese kann dann an der Bowman-Schicht einer Hornhaut, von der das Epithel entfernt wurde, des Auges eines Patienten unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung befestigt werden. Durch Aufbringen der Reaktionsmischung aus nicht fibrillärem Kollagen-synthetischem Polymer auf der vorderen Oberfläche der Hornhaut, dann Inkontaktbringen der vorderen Oberfläche der Hornhaut mit der hinteren Oberfläche der Linsenprothese, bevor eine wesentliche Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem synthetischen Polymer stattgefunden hat, wird das synthetische Polymer ebenfalls Kollagenmoleküle sowohl in dem Hornhautgewebe als auch der Linsenprothese kovalent binden, so dass die Linsenprothese an der Stelle fest verankert wird. (Alternativ kann die Reaktionsmischung zuerst auf die hintere Oberfläche der Linsenprothese aufgetragen werden, welche dann mit der vorderen Oberfläche der Hornhaut in Kontakt gebracht wird.)
In einem alternativen Verfahren zur Bewirkung einer Adhäsion zwischen zwei Oberflächen, welche beide nukleophile Gruppen (wie beispielsweise primäre Amino (-NH₂)-Gruppen oder Thiol (-SH)-Gruppen) enthalten, wird ein multifunktional aktiviertes synthetisches hydrophiles Polymer auf die erste Oberfläche aufgetragen, dann wird die zweite Oberfläche mit der ersten Oberfläche in Kontakt gebracht. Das multifunktional aktivierte synthetische hydrophile Polymer wird kovalent an nukleophile Gruppen auf sowohl der ersten als auch der zweiten Oberfläche binden, was eine Adhäsion zwischen den zwei Oberflächen bewirkt.
Das synthetische Polymer kann in einer wässrigen Lösung wie beispielsweise Wasser oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder in einer nicht wässrigen Lösung wie beispielsweise einem biokompatiblen Öl vorliegen. Die Konzentration des synthetischen Polymers in der Lösung liegt vorzugsweise innerhalb des Bereiches von ca. 10 bis ca. 400 Milligramm des synthetischen Polymers pro Milliliter Lösung. Wenn eine wässrige Lösung verwendet wird, wird das synthetische Polymer vorzugsweise unmittelbar vor der Auftragung auf die Oberflä che, die geklebt werden soll, mit dem wässrigen Lösungsmittel gemischt, um einen Verlust des Haftvermögens aufgrund der Hydrolyse des synthetischen Polymers zu verhindern.
Alternativ kann das multifunktional aktivierte synthetische Polymer in trockener Form verwendet werden. Beispielsweise kann das trockene synthetische Polymer zu einem dünnen Blatt oder einer Membran kompressionsgeformt werden, welche dann unter Verwendung von Gamma- oder vorzugsweise Elektronenstrahlbestrahlung sterilisiert werden kann. Die resultierende trockene Membran oder das Blatt kann zu der gewünschten Größe geschnitten werden und dann zur Verwendung in dem oben beschriebenen Verfahren auf eine erste Oberfläche aufgebracht werden, um eine Adhäsion zwischen zwei Oberflächen zu bewirken.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um Gewebe zu beschichten, um die Bildung von Adhäsionen nach einer Operation oder Verletzung von inneren Geweben oder Organen zu verhindern. Bei einem allgemeinen Verfahren zur Beschichtung von Geweben, um die Bildung von Adhäsionen nach einer Operation zu verhindern, werden das Kollagen und ein multifunktional aktiviertes synthetisches hydrophiles Polymer gemischt, dann wird eine dünne Schicht der Reaktionsmischung auf die Gewebe aufgetragen, welche die Operationsstelle umfassen, umgeben und/oder benachbart zu dieser sind, bevor eine wesentliche Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem multifunktional aktivierten synthetischen hydrophilen Polymer stattgefunden hat. Die Auftragung der Reaktionsmischung auf die Gewebestelle kann durch Extrusion, Bürsten, Sprühen (wie oben beschrieben) oder durch irgendein anderes geeignetes Mittel erfolgen.
Nach der Auftragung der Reaktionsmischung auf die Operationsstelle, wird die Vernetzung sich in situ fortsetzen gelassen, bevor der chirurgische Einschnitt geschlossen wird. Wenn eine "Gleichgewichts"- (oder vollständige) Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem multifunktional aktivierten synthetischen Polymer stattgefunden hat, werden Gewebe, die mit Geweben in Kontakt gebracht wurden, die mit den Zusammensetzungen der Erfindung beschichtet wurden, nicht an den beschichteten Geweben haften. An diesem Zeitpunkt kann die Operationsstelle unter Verwendung herkömmlicher Mittel (Nahtmaterialien usw.) verschlossen werden.
Der Punkt, an welchem eine Gleichgewichtsvernetzung erreicht wurde, wird hierin als der Punkt definiert, bei welchem sich die Zusammensetzung bei Berühren nicht länger klebrig oder klebend anfühlt. Im Allgemeinen sind Zusammensetzungen, die eine vollständige Vernetzung innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums erreichen (d. h. 5–15 Minuten nach Mischen des Kollagens und des synthetischen Polymers) zur Verwendung bei der Verhinderung chirurgischer Adhäsionen bevorzugt, so dass die Operationsstelle relativ bald nach Abschluss des Operationsvorgangs verschossen werden kann.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um verschiedene Lumen und Hohlräume im Körper eines Säugetierpatienten zu blockieren oder zu füllen. Die Zusammensetzungen können ebenfalls als biologische Dichtmittel verwendet werden, um Fissuren oder Risse innerhalb eines Gewebes oder einer Struktur (wie beispielsweise ein Gefäß) oder Verbindungsstellen zwischen benachbarten Geweben oder Strukturen abzudichten, um das Entweichen von Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten zu verhindern.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um den Durchschnittsfachleuten eine vollständige Offenbarung und Beschreibung zu bieten, wie die bevorzugten Ausführungsformen der Konjugate, Zusammensetzungen und Vorrichtungen herzustellen sind, und sind nicht gedacht, um den Umfang von dem, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen, zu beschränken. Anstrengungen wurden unternommen, um die Genauigkeit in Bezug auf die verwendeten Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur, Molekulargewicht usw.) sicherzustellen, aber man sollte mit gewissen experimentellen Fehlern und einer gewissen Abweichung rechnen. Wenn nichts anderes angegeben ist, sind Teile Gewichtsteile, ist Molekulargewicht das massegemittelte Molekulargewicht, wird die Temperatur in Grad Celsius angegeben und ist der Druck der Atmosphärendruck oder liegt nahe bei diesem.
Beispiel 1
Herstellung von PEG-vernetztem succinyliertem Kollagen
Sechs (6) Liter Kollagen in Lösung (CIS) (3 mg/ml Kollagen in HCL mit pH 2) wurden unter Verwendung von 0,1 M NaOH bei Raumtemperatur auf pH 9 eingestellt, um fibrilläres Kollagen zu erzeugen. 1,35 Gramm Bernsteinsäureanhydridpulver wurden zu dem fibrillären Kollagen zugegeben, und der pH wurde zwischen 8,5 und 9 gehalten, was zu der Bildung von succinyliertem Kollagen führte. Der pH des succinylierten Kollagens wurde auf 7,2 eingestellt, dann unter Verwendung von 0,1 M HCl auf 4,2, um das succinylierte Kollagen auszufällen. Das succinylierte Kollagen wurde dann zentrifugiert und der Überstand verworfen. Der pH des Pellets wurde unter Verwendung von 0,1 M NaOH auf 7,2 eingestellt. Das Pellet aus succinyliertem Kollagen wurde in Wasser verdünnt, und die Kollagenkonzentration der resultierenden succinylierte Kollagenlösung wurde auf 20 mg/ml bestimmt.
Lösungen von difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) in PBS wurden bei verschiedenen Konzentrationen wie folgt hergestellt: 10 mg SG-PEG in 0,1 ml PBS, 20 mg SG-PEG in 0,1 ml PBS, 50 mg SG-PEG in 0,1 ml PBS und 100 mg SG-PEG in 0,2 ml PBS. Jede der vier Vernetzerlösungen wurde mit 0,9 ml des succinylierten Kollagens mit 20 mg/ml gemischt, wobei ein Mischen von Spritze zu Spritze eingesetzt wurde. Die vier Zusammensetzungen von succinyliertem Kollagen-SG-PEG wiesen endgültige SG-PEG-Konzentrationen von 10, 20, 50 bzw. 91 mg/ml auf. Die endgültige Kollagenkonzentration der Proben betrug ungefähr 18 mg/ml.
Die vier Formulierungen wurden 5 Minuten und 2 Stunden nach dem Mischen mit dem Auge auf Anzeichen einer Vernetzung hin untersucht. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, zeigten die succinylierten Kollagenformulierungen, die 50 und 91 mg/ml SG-PEG enthielten, 5 Minuten nach dem Mischen Anzeichen einer Vernetzung. Alle vier Formulierungen zeigten eine signifikante Vernetzung 2 Stunden nach dem Mischen, wobei optisch klare Gele gebildet wurden.
Tabelle 1. PEG-Vernetzung von Succinyliertem Kollagen
Die Schmelztemperaturen der succinylierten Kollagenformulierungen, die 10, 20, 50 und 91 mg/ml SG-PEG enthielten (Proben B, C bzw. D), wurden unter Verwendung der Differentialscanningkalorimetrie (DSC) gemessen und mit der von nicht vernetztem succinyliertem Kollagen (Probe A) verglichen. Die DSC ist ein Maß für das Ausmaß der Vernetzung, welches üblicherweise verwendet wird, um die Gelstabilität zu beurteilen.
Die DSC-Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Die Schmelztemperaturen für die vernetzten Formulierungen (B, C und D) waren signifikant höher als die für das nicht vernetzte succinylierte Kollagen (A).
Beispiel 2
Herstellung von PEG-vernetztem methyliertem Kollagen
Neunzig (90) Milliliter Zyderm^®II-Kollagen ohne Lidocain (Collagen Corporation, Palo Alto, CA), die auf eine Kollagenkonzentration von 20 mg/ml eingestellt waren, wurden lyophilisiert, um gefriergetrocknetes Kollagen zu bilden. Das gefriergetrocknete Kollagen wurde dann in kleine Stücke zerteilt.
8,3 Milliliter konzentrierte Salzsäure und 30 Gramm Natriumsulfat wurden zu Methanol zugegeben, um wasserfreies saures Methanol herzustellen. Das Natriumsulfat wurde dann aus dem wasserfreien sauren Methanol abfiltriert. Ungefähr 1 Liter des angesäuerten wasserfreien Methanols wurde anschließend mit dem zerkleinerten gefriergetrockneten Kollagen gemischt.
Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 7 Tage wurde methyliertes Kollagen gebildet. Das überschüssige Methanol wurde verdampft. Das resultierende Material wurde anschließend lyophilisiert und dialysiert, und die Kollagenkonzentration wurde durch die Zugabe von 0,02 M Na₂HPO₄/0,13 M NaCl, pH 7,3, auf 20 mg/ml eingestellt.
Lösungen von difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) in PBS wurden bei unterschiedlichen Konzentrationen wie folgt hergestellt: 3 mg SG-PEG in 0,15 ml PBS, 9 mg SG-PEG in 0,15 ml PBS, 15 mg SG-PEG in 0,15 ml PBS, 30 mg SG-PEG in 0,15 ml PBS, 45 mg SG-PEG in 0,15 ml PBS, 75 mg SG-PEG in 0,15 ml PBS, 111 mg SG-PEG in 0,2 ml PBS und 165 mg SG-PEG in 0,2 ml PBS. Jede der Vernetzerlösungen wurde mit 1,35 ml des methylierten Kollagens mit 20 mg/ml gemischt, indem ein Mischen von Spritze zu Spritze eingesetzt wurde. Die Zusammensetzungen aus methyliertem Kollagen-SG-PEG wiesen endgültige SG-PEG-Konzentrationen von 2, 6, 10, 20, 30, 50, 72 bzw. 106 mg/ml auf. Die endgültige Kollagenkonzentration der Proben betrug ungefähr 18 mg/ml.
Die resultierenden Formulierungen wurden im Hinblick auf die Elastizität und Gelfestigkeit qualitativ ausgewertet. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, zeigten die Formulierungen, die 30 und 50 mg/ml SG-PEG enthielten, unmittelbar beim Mischen Anzeichen einer Vernetzung. Die Zusammensetzungen die 2, 6, 10 und 20 mg/ml SG-PEG enthielten, benötigten ungefähr 5 bis 10 Minuten zum Vernetzen. Die Zusammensetzungen, die 72 und 106 mg/ml SG-PEG enthielten, benötigten mehr als 10 Minuten zur Gelbildung, wobei sie schwache, unelastische Gele bildeten. Die Zusammensetzungen, die zwischen 2–20 mg/ml SG-PEG enthielten, führten zu den stärksten, elastischsten Gelen. Die Zusammensetzung, die 30 mg/ml SG-PEG enthielt, bildete ein Gel mit einer guten Festigkeit, aber einer geringen Elastizität, welches für Anwendungen nützlich sein könnte, wo die Elastizität keine gewünschte Eigenschaft ist.
Zusammensetzungen von methyliertem Kollagen, die mehr als 30 mg/ml SG-PEG enthielten, zeigten eine schwache Elastizität und Gelfestigkeit. Alle Gele waren optisch klar.
Die Schmelztemperaturen der methylierten Kollagenformulierungen, die 2, 10, 30 und 72 mg/ml SG-PEG enthielten (Proben E, F, G bzw. H), wurden unter Verwendung der Differentialscanningkalorimetrie (DSC) gemessen und mit der von nicht vernetztem methyliertem Kollagen verglichen. Die DSC-Ergebnisse für die nicht vernetzten und die vernetzten Proben sind in den 2 bzw. 3 gezeigt. Die Schmelzkurvenprofile geben an, dass die vernetzten Formulierungen eine heterogene Population von Molekülen enthalten, von denen die meisten bei einer höheren Temperatur schmelzen als das nicht vernetzte Kollagen.
Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, waren die Schmelztemperaturen für die vernetzten Formulierungen signifikant höher als die für das nicht vernetzte methylierte Kollagen.
Tabelle 2. PEG-Vernetzung von Methyliertem Kollagen mit 20 mg/ml
Beispiel 3
In vitro-Abgabe und Befestigung einer in situ polymerisierbaren Linsenprothese an einer Rinderhornhaut
Methyliertes Kollagen mit einer Kollagenkonzentration von 30 mg/ml wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Die Epithelschicht der Hornhaut eines entnommenen Rinderauges wurde unter Verwendung eines stumpfen Metallspatels entfernt. Nach der Entfernung des Epithels wurde die Hornhaut mit PBS gewaschen und gründlich unter Verwendung eines Schwamms getrocknet.
Eine Lösung von 10 mg difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) in 0,1 ml PBS wurde hergestellt. Die Vernetzerlösung wurde mit 0,9 ml des methylierten Kollagens mit 30 mg/ml gemischt, wobei ein Mischen von Spritze zu Spritze eingesetzt wurde. Unmittelbar nach dem Mischen wurden ungefähr 0,2 ml des Materials aus methyliertem Kollagen-SG-PEG aus der Öffnung der 1,0 cm³-Spritze auf die Oberfläche der Rinderhornhaut, von welcher das Epithel entfernt worden war, extrudiert.
Das Material aus methyliertem Kollagen-SG-PEG wurde an Ort und Stelle auf der Hornhaut geformt, indem eine Polymethylmethacrylat (PMMA)- oder Polysulfonform verwendet wurde. Eine Vernetzung und Gelbildung des Kollagenpolymers fand innerhalb von ungefähr drei Minuten statt, so dass eine Linsenprothese in situ auf der Rinderhornhaut gebildet wurde.
Nach der Gelbildung wurde die Form von dem Kollagen-Polymermaterial entfernt. Die Oberfläche der in situ gebildeten Linsenprothese wurde mit PBS befeuchtet. Die Linsenprothese war fixiert und wurde durch die Befeuchtung nicht verschoben. Ein leichtes Anstoßen der Linsenprothese mit einem Spatel zeigte, dass dieses gut an der Hornhaut befestigt war. Die Linsenprothese konnte durch "Abbröckeln" mit einem Spatel entfernt werden.
Eine histologische Untersuchung (bei 100-facher Vergrößerung) wurde mit der Rinderhornhaut vor und nach der Entfernung der Linsenprothese aus methyliertem Kollagen-SG-PEG durchgeführt. Eine histologische Untersuchung vor der Entfernung der Linsenprothese zeigte eine innige Grenzfläche zwischen der Linsenprothese und der Hornhaut. Nach der Entfernung der Linsenprothese zeigte die Oberfläche der Hornhaut keine offensichtliche Schädigung oder Abweichungen.
Das obige Experiment wurde wiederholt, indem ein Material verwendet wurde, das aus succinyliertem Kollagen mit einem Grad der Succinylierung von 36% und einer Kollagenkonzentration von 30 mg/ml hergestellt wurde. Zwanzig (20) Milligramm von difunktional aktiviertem SG-PEG wurden in 0,1 ml PBS gelöst. Die Vernetzerlösung wurde anschließend mit 0,9 mg des succinylierten Kollagens mit 30 mg/ml gemischt, wobei ein Mischen von Spritze zu Spritze eingesetzt wurde, dann auf eine Rinderhornhaut abgegeben, von der das Epithel entfernt worden war. Eine Gelbildung fand innerhalb von ungefähr 10 Minuten nach der Abgabe des Kollagenpolymermaterials auf die Hornhaut statt. Ein qualitativer Vergleich zeigte, dass das Material aus methyliertem Kollagen-SG-PEG zu einer besseren Befestigung an der Hornhaut führte als das Material aus succinyliertem Kollagen – SG-PEG.
Beispiel 4
Verwendung von PEG-vernetztem methyliertem Kollagen als Bioklebstoff
Die folgenden Formulierungen wurden hergestellt, indem methyliertes Kollagen (bei verschiedenen Kollagenkonzentrationen) und verschiedene Konzentrationen an difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) verwendet wurden. Die Formulierungen wurden qualitativ im Hinblick auf eine Adhäsion an blutigen Wundstellen bei einem Kaninchen, das zuvor geopfert wurde, getestet.
Formulierung A
Neunhundert (900) Mikroliter(μl) methyliertes Kollagen (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) mit einer Kollagenkonzentration von 33 mg/ml wurden mit ungefähr 13,5 mg difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) in 150 μl PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) gemischt (Molverhältnis 40 : 1 von SG-PEG zu Kollagen). Dieses Material wurde auf eine blutige Wundstelle auf der Leber eines zuvor geopferten Kaninchens extrudiert und für 1 Minute gelieren gelassen. Die Haut wurde dann auf das Gel gelegt und für 1 Minute an der Stelle festgehalten. Die Haut wurde entfernt und der Zustand des Gels untersucht. Das Gel aus methyliertem Kollagen-SG-PEG haftete sehr gut an der Leber, nicht so gut an der Haut.
Formulierung B
Neunhundert (900) Mikroliter (μl) methyliertes Kollagen mit einer Kollagenkonzentration von 33 mg/ml wurden mit ungefähr 27 mg difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) in 150 μl PBS gemischt (Molverhältnis 80 : 1 von SG-PEG zu Kollagen). Dieses Material wurde auf eine blutige Wundstelle auf dem Muskel eines zuvor geopferten Kaninchens extrudiert und für 1 Minute gelieren gelassen. Die Haut wurde dann oben auf das Gel gelegt und für 1 Minute an dieser Stelle festgehalten. Die Haut wurde entfernt und der Zustand des Gels untersucht. Das Gel aus methyliertem Kollagen-SG-PEG haftete sehr gut an der Wundstelle, nicht so gut an der Haut.
Formulierung C
4,5 Milliliter (ml) methyliertes Kollagen mit einer Kollagenkonzentration von 64 mg/ml, wurden mit ungefähr 325 mg difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) in 0,5 ml PBS gemischt (Molverhältnis 100 : 1 von SG-PEG zu Kollagen). Dieses Material wurde auf eine blutige Wundstelle eines zuvor geopferten Kaninchens extrudiert und für 1 Minute gelieren gelassen. Die Haut wurde dann oben auf das Gel gelegt und für 1 Minute an dieser Stelle festgehalten. Die Haut wurde entfernt und der Zustand des Gels untersucht. Das Gel aus methyliertem Kollagen-SG-PEG haftete sehr gut an der Wundstelle, nicht so gut an der Haut.
Formulierung D
1,8 Milliliter (ml) methyliertes Kollagen mit einer Kollagenkonzentration von 35 mg/ml wurden mit 71,4 mg difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) in 250 μl PBS gemischt (Molverhältnis 100 : 1 von SG-PEG zu Kollagen). Das Material wurde gemischt, indem ein Mischen von Spritze zu Spritze eingesetzt wurde, wobei für 30 Durchgänge des Materials zwischen den Spritzen gemischt wurde, dann auf eine blutige Wundstelle eines zuvor geopferten Kaninchens extrudiert. Eine Kollagen-SG-PEG-Membran (ungefährer Durchmesser: 4,5 cm), die ein Molverhältnis von 2 : 1 von SG-PEG zu Kollagen enthielt, wurde unmittelbar oben auf das extrudierte SG-PEG-Kollagen-Material gelegt, welches für 1 Minute gelieren gelassen wurde. Die Haut wurde dann oben auf die Membran gelegt und an dieser Stelle für 1 Minute festgehalten. Die Haut wurde entfernt und der Zustand des Gels und der Membran untersucht. Das Gel aus methyliertem Kollagen-SG-PEG haftete sehr gut an der Wundstelle und an der Membran.
Formulierung E
1,8 Milliliter (ml) methyliertes Kollagen mit einer Kollagenkonzentration von 35 mg/ml wurden mit 71,4 mg difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) in 250 μl PBS gemischt (Molverhältnis 100 : 1 von SG-PEG zu Kollagen). Das Material wurde gemischt, indem ein Mischen von Spritze zu Spritze mit 30 Durchgängen des Materials zwischen den Spritzen eingesetzt wurde, dann auf eine blutige Wundstelle eines zuvor geopferten Kaninchens extrudiert, dann 1 Minute gelieren gelassen. Die Haut wurde dann oben auf das Gel gelegt und für 1 Minute an dieser Stelle festgehalten. Die Haut wurde entfernt und der Zustand des Gels untersucht. Das Gel aus methyliertem Kollagen-SG-PEG haftete sehr gut an der Wundstelle, nicht so gut an der Haut.
Beispiel 5
Bioklebstoffformulierungen, welche Mischungen aus methyliertem Kollagen und fibrillärem Kollagen, das mit PEG vernetzt war, umfassten
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Adhäsion von PEG-vernetztem fibrillärem Kollagen an Rinderaugen (die von Ferara Meats, Santa Clara, CA erhalten wurden) festzustellen. Die Experimente wurden weniger als 24 Stunden nach der Entnahme der Augen aus den geopferten Tieren durchgeführt. Die Augen wurden gewaschen und in PBS getränkt.
Von drei Augen wurden die Epithelien entfernt, sie wurden in PBS gewaschen, dann getrocknet. Drei Formulierungen wurden wie folgt ausgewertet:
Fibrilläres Kollagen (68 mg/ml Kollagenkonzentration) wurde mit difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) in einem Molverhältnis von 20 : 1 von SG-PEG zu Kollagen gemischt, dann unmittelbar auf ein Auge aufgetragen, von dem das Epithel entfernt worden war.
Fibrilläres Kollagen (68 mg/ml Kollagenkonzentration) wurde mit difunktional aktiviertem SG-PEG in einem Molverhältnis von 20 : 1 von SG-PEG zu Kollagen gemischt, die Formulierung wurde zentrifugiert, um Luftbläschen zu entfernen, dann ungefähr 2 Minuten nach dem Mischen auf ein Auge aufgetragen, von dem das Epithel entfernt worden war.
Methyliertes Kollagen (37,2 mg/ml Kollagenkonzentration) wurde mit difunktional aktiviertem SG-PEG in einem Molverhältnis von 20 : 1 von SG-PEG zu Kollagen gemischt, dann unmittelbar auf ein Auge aufgetragen, von dem das Epithel entfernt worden war. Fibrilläres Kollagen (68 mg/ml Kollagenkonzentration) wurde mit difunktional aktiviertem SG-PEG in einem Molverhältnis von 20 : 1 von SG-PEG zu Kollagen gemischt, dann unmittelbar oben auf die Formulierung methyliertes Kollagen-SG-PEG aufgetragen.
Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurde die Befestigung der Kollagen-SG-PEG-Formulierungen an den Augen qualitativ festgestellt. Bei den Zusammensetzungen, welche fibrilläres Kollagen und SG-PEG umfassten, wurde gefunden, dass diese keine Befestigung an den Augen, von denen das Epithel entfernt worden war, zeigten. Bei der Zusammensetzung, welche methyliertes Kollagen und SG-PEG umfasste, wurde gefunden, dass diese gut an dem Auge, von welchem das Epithel entfernt worden war, haftete.
Die Formulierungen, die in Tabelle 3 unten angegeben sind, wurden hergestellt, indem fibrilläres Kollagen (37,2 mg/ml Kollagenkonzentration) mit methyliertem Kollagen (37,2 mg/ml Kollagenkonzentration) gemischt wurde, dann unter Verwendung von 0,4% (Gewicht/Volumen) difunktional aktiviertem SG-PEG (3800 MG) vernetzt wurde.
Tabelle 3. Bioklebstoffformulierungen welche Mischungen aus methyliertem Kollagen und fibrillärem Kollagen, die unter Verwendung von difunktional aktiviertem SG-PEG vernetzt worden waren, umfassen
Jede der sechs Formulierungen wurde auf ein Rinderauge, von dem das Epithel entfernt worden war, aufgetragen. Die Formulierungen hafteten alle gut an den Augen, von denen das Epithel entfernt worden war; jedoch wurde gefunden, dass die Befestigungsstärke mit zunehmendem Gehalt an methyliertem Kollagen (d. h. abnehmendem Gehalt an fibrillärem Kollagen) der Formulierung zunahm.
Beispiel 6
In vivo-Adhäsion von verschiedenen auf Kollagen basierenden Formulierungen
Die Blase eines zuvor geopferten Schweins wurde aufgeschnitten, und 0,2 cm³ von jeder der verschiedenen auf Kollagen basierenden Formulierungen, wie sie in Tabelle 4 unten angegeben sind, wurden aus einer 1 cm³-Spritze über eine Nadel mit 27 Gauge in die innere Blasenwand injiziert. Die Schweineblase wurde dann mit einem feuchten Handtuch bedeckt (um das Gewebe feucht zu halten) und bei 37°C für ungefähr eine (1) Stunde inkubiert.
Das Gewebe, welches die obere Oberfläche der Implantate bedeckte, wurde herausgeschnitten, um die Implantate freizulegen. Die Befestigung von jedem der Implantate an dem darunter liegenden Gewebe wurde qualitativ festgestellt, wie in Tabelle 4 unten angegeben ist.
Tabelle 4. Befestigung verschiedener auf Kollagen basierender Formulierungen an der Wand einer Schweineblase
Alle mit PEG vernetzten Formulierungen zeigten eine Befestigung an dem Gewebe, auch wenn die mit PEG vernetzten Zusammensetzungen, die fibrilläres Kollagen umfassten, eine stärkere Befestigung zeigten als es die mit PEG vernetzten nicht fibrillärem (methylierten) Kollagenformulierungen taten, was zeigt, dass die Verhältnisse von DSE-PEG zu methyliertem Kollagen, die in diesem Experiment verwendet wurden, nicht optimal waren.
Beispiel 7
Herstellung von auf Kollagen basierenden Bioklebstoffzusammensetzungen
Ein (1) Milliliter Glycerol (erhalten von Sigma, St. Louis, MO) wurde zur Sterilisation autoklaviert. Eine 3 cm³-Spritze, die 1 ml Zyderm^® II-Kollagen (65 mg/ml Kollagenproteinkonzentration, erhalten von der Collagen Corporation, Palo Alto, CA) enthielt, wurde über einen 3- Wege-Stopfen an der Spritze befestigt, die Glycerol enthielt. Das Glycerol und das Kollagen wurden dann für ungefähr 100 Durchgänge gemischt, wobei ein Mischen von Spritze zu Spritze eingesetzt wurde.
Ein (1) Gramm Sucrose (erhalten von Sigma, St. Louis, MO) wurde in ein Wiegeschiffchen eingewogen. Ein Milliliter des Zyderm II-Kollagens wurde zu der Sucrose in dem Wiegeschiffchen zugegeben. Die Sucrose und das Kollagen wurden gemischt, bis das Kollagen klar wurde. Die Kollagen-Sucrose-Mischung wurde in eine 3 cm³-Spritze gefüllt.
Die Glycerol-Kollagen- und Sucrose-Kollagenmischungen wurden dann mit verschiedenen Mengen an sterilem, trockenem, difunktional aktiviertem SG-PEG (DSG-PEG, 3800 MG) gemischt, das in einer 3 cm³-Spritze enthalten war, wobei ein Mischen von Spritze zu Spritze eingesetzt wurde. Wenn die Kollagenformulierung und das DSG-PEG ausreichend gemischt worden waren, konnte die resultierende Zusammensetzung auf eine Oberfäche extrudiert werden, dann mit einer zweiten Oberfläche in Kontakt gebracht werden, um eine Adhäsion zwischen den zwei Oberflächen zu bewirken.
Beispiel 8
Charakterisierung der auf Kollagen basierenden Bioklebstoffzusammensetzungen
Die Formulierungen, die in Tabelle 5 aufgelistet sind, wurden gemäß den Verfahren hergestellt, die in den Beispielen oben beschrieben sind, und qualitativ im Hinblick auf ihre Adhäsionseigenschaften (d. h. Klebrigkeit) und Form (d. h. Handhabungseigenschaften) ausgewertet. Die Formulierungen wurden auf einer Skala von 0 bis 3 bewertet, wobei eine Bewertung von 3 anzeigt, dass die Formulierung sehr klebrig war oder eine sehr gute Form aufwies, und eine Bewertung von 0 anzeigt, dass die Formulierung eine schlechte Klebrigkeit oder Form aufwies. Tabelle 5. Charakterisierung von auf Kollagen basierenden Bioklebstoffzusammensetzungen

DC: Denaturiertes Kollagen (d. h. Gelatine)
MC: Methyliertes Kollagen
SC: Sucrose/Kollagen
GC: Glycerol/Kollagen

Alle Sucrose/Kollagen/DSG-PEG- und Glycerol/Kollagen/DSG-PEG-Formulierungen zeigten ausgezeichnete Adhäsionseigenschaften und Handhabungseigenschaften. Die methyliertes Kollagen/DSG-PEG-Formulierungen zeigten nicht ganz so gute Adhäsions- und Handhabungseigenschaften, was zeigt, dass die Verhältnisse von DSG-PEG zu methyliertem Kollagen, die in diesem Experiment verwendet wurden, nicht optimal waren.
Beispiel 9
In vivo-Auswertung von Lösungen von difunktional aktiviertem SE-PEG als Bioklebstoffen auf Hornhäuten von Kaninchen, von welchen das Epithel entfernt worden war
Vorgeformte Linsenprothesen wurden gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt: Methyliertes Kollagen (53 mg/ml Kollagenkonzentration) wurde mit 40 mg difunktional aktiviertem SG-PEG (DSG-PEG, 3800 MG, das von der Shearwater Polymers, Huntsville, AL erhalten wurde) gemischt und zu einer gekrümmten Folie mit einer Dicke von ungefähr 250 μm geformt. Kreisförmige Linsenprothesen mit einem Durchmesser von 7–8 mm wurden aus der Folie ausgeschnitten. Die Linsenprothesen wurden in Lösungen gegeben, welche 80 mg DSG-PEG in 2 ml PBS oder 2 ml 0,2% Glutaraldehyd enthielten, und über Nacht inkubieren gelassen.
Die Hornhäute mehrerer männlicher weißer Neuseelandkaninchen wurden unter Verwendung eines Gillmessers vom Epithel befreit. Eine Lösung, welche 40 mg difunktional aktiviertes SE-PEG (DSE-PEG, 3800 MG erhalten von Shearwater Polymers, Huntsville, AL) in 200 μl PBS umfasste, wurde auf den konkaven Teil der vorgeformten Kollagenlinsenprothesen, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, aufgetragen. Innerhalb von 2 Minuten wurde die überschüssige DSE-PEG-Lösung unter Verwendung einer Pipettiervorrichtung abgesaugt. Die vorgeformten Kollagenlinsenprothesen wurden dann unmittelbar auf die Oberfläche der Hornhäute, von welchen das Epithel entfernt worden war, aufgebracht.
Es wurde gefunden, dass die vorgeformten Linsenprothesen mit dem DSE-PEG-"Klebstoff" gut an dem Hornhautgewebe, von welchem das Epithel entfernt worden war, hafteten. Die Linsenprothesen konnten durch leichte Manipulation mit einem Gillmesser einfach entfernt werden.
Beispiel 10
In vivo-Auswertung von Lösungen von difunktional aktiviertem SE-PEG als Bioklebstoff auf Hornhäuten von Kaninchen, von welchen das Epithel entfernt worden war
Die Hornhäute von mehreren männlichen weißen Neuseelandkaninchen wurden unter Verwendung eines Gillmessers von dem Epithel befreit. Lösungen, welche 40, 53 oder 66 mg difunktional aktiviertes SE-PEG (DSE-PEG, 3800 MG, erhalten von Shearwater Polymers, Huntsville, AL) in 200 μl PBS umfassten, wurden auf den konkaven Teil der Kaninchenhornhäute, von denen das Epithel entfernt worden war, aufgetragen. Innerhalb von 2 Minuten wurde die überschüssige DSE-PEG-Lösung unter Verwendung einer Pipettiervorrichtung abgesaugt. Vorgeformte Kollagenlinsenprothesen (erhalten von der Imedex, Lyon, Frankreich) wurden dann unmittelbar auf die Oberfläche der Hornhäute, von denen das Epithel entfernt worden war, aufgebracht.
Es wurde gefunden, dass die vorgeformten Linsenprothesen mit dem DSE-PEG-"Klebstoff" gut an dem Hornhautgewebe, von dem das Epithel entfernt worden war, hafteten. Die Linsenprothesen konnten durch leichte Manipulation mit einem Gillmesser einfach entfernt werden.
Nach 7 Tagen wurde die Linsenprothese, die an der Kaninchenhornhaut unter Verwendung der DSE-PEG-Lösung mit 53 mg/ml aufgeklebt worden war, untersucht. Es wurde gefunden, dass der mittlere Teil dieser bestimmten Linsenprothese eine gute Haftung an der Hornhaut aufwies; jedoch hafteten die Ränder der Linsenprothese nicht fest an der Hornhaut. Es wurde beobachtet, dass der mittlere Teil der Hornhaut leicht trüb wurde. Man nimmt an, dass eine Proteinablagerung zwischen der Linsenprothese und der Hornhaut stattgefunden haben könnte und dass das DSE-PEG kovalent an das abgelagerte Protein gebunden hat und dieses auf der Oberfläche der Hornhaut festgehalten hat, was zu der beobachteten Trübung des mittleren Bereichs des Auges führt.
Beispiel 11
In vivo-Auswertung einer Lösung von difunktional aktiviertem SE-PEG als einem Bioklebstoff auf einer Primaten-Hornhaut, von der das Epithel entfernt worden war
Die Hornhaut eines Makakaffen (Macaca cynomologous) wurde unter Verwendung eines Gillmessers vom Epithel befreit. Eine Lösung, welche 40 mg difunktional aktiviertes SE-PEG (DSE-PEG, 3800 MG, erhalten von Shearwater Polymers, Huntsville, AL) in PBS enthielt, wurde auf den konkaven Teil einer vorgeformten Kollagenlinsenprothese (erhalten von der Imedex, Lyon, Frankreich) aufgetragen. Innerhalb von 2 Minuten wurde die überschüssige DSE-PEG-Lösung unter Verwendung einer Pipettiervorrichtung abgesaugt. Die vorgeformte Kollagenlinsenprothese wurde dann unmittelbar auf die Oberfläche des Hornhautgewebes, von der das Epithel entfernt worden war, aufgebracht.
Nach 3 Wochen wurde gefunden, dass die Linsenprothese fest an der Hornhaut des Affen befestigt war. Es wurde keine Trübung der Hornhaut beobachtet. Während der ersten Woche nach dem Vorgang wurde eine minimale Entzündung beobachtet. Die Entzündung war jedoch nach der zweiten Woche abgeklungen.

Claims

Eine Bioklebstoffzusammensetzung, welche fibrilläres Kollagen, ein Faserzerlegungsmittel und ein multifunktional aktiviertes synthetisches hydrophiles Polymer umfasst, wobei das Faserzerlegungsmittel in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um das Kollagen bei pH 7 im wesentlichen nichtfibrillär zu machen, und wobei das Kollagen und das synthetische Polymer kovalent binden, um ein Konjugat aus Kollagen und synthetischem Polymer zu bilden.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Faserzerlegungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem biokompatiblen Alkohol, einer Aminosäure, einem anorganischen Salz und einem Kohlenhydrat.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Faserzerlegungsmittel ein biokompatibler Alkohol ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycerol und Propylenglycol.
Die Zusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das multifunktional aktivierte synthetische hydrophile Polymer ein multifunktional aktivierter Polyethylenglycol ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der multifunktional aktivierte Polyethylenglycol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus difunktional aktiviertem SG-PEG und difunktional aktiviertem SE-PEG.
Eine Zusammensetzung gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch zur Verwendung in einem Verfahren zum Bewirken einer nichtoperativen Befestigung einer ersten Oberfläche an einer zweiten Oberfläche, welches die folgenden Schritte umfasst: Mischen des fibrillären Kollagens und des Faserzerlegungsmittels in einer Menge, die ausreicht, um das Kollagen bei pH 7 im wesentlichen nichtfibrillär zu machen; Mischen des resultierenden Kollagens und des synthetischen Polymers, um eine Vernetzung zwischen diesen zu initiieren; Anwenden der Mischung von Kollagen und synthetischem Polymer auf eine erste Oberfläche, bevor eine wesentliche Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem synthetischen Polymer aufgetreten ist; und Inkontaktbringen der ersten Oberfläche mit der zweiten Oberfläche, um eine Adhäsion zwischen diesen zu bewirken.
Eine Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in einem Verfahren zum Verhindern der Bildung von Adhäsionen nach einer Operation, welches die folgenden Schritte umfasst: Mischen von fibrillärem Kollagen und Faserzerlegungsmittel in einer Menge, die ausreicht, um das Kollagen bei pH 7 im wesentlichen nichtfibrillär zu machen; Mischen des resultierenden Kollagens und eines multifunktional aktivierten hydrophilen Polymers, um eine Vernetzung zwischen diesen zu initiieren; Anwenden der Mischung aus Kollagen und synthetischem Polymer auf ein Gewebe, das eine Operationsstelle, umgebend oder in der Nähe, umfasst, bevor eine wesentliche Vernetzung zwischen dem Kollagen und dem synthetischen Polymer stattgefunden hat; Fortsetzen lassen der Vernetzung des Kollagens und des synthetischen Polymers in situ, bis eine Gleichgewichtsvernetzung erreicht wurde; und Bewirken des Verschließens der Operationsstelle.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, wobei wenigstens eine der ersten und zweiten Oberflächen eine native Gewebeoberfläche ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei eine der ersten und zweiten Oberflächen eine native Gewebeoberfläche ist und die andere der ersten und zweiten Oberflächen eine nicht native Gewebeoberfläche oder eine Oberfläche eines künstlichen Implantats ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei sowohl die erste als auch die zweite Oberfläche native Gewebeoberflächen sind.
Die Zusammensetzung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei das fibrilläre Kollagen als Teil einer Mischung von nichtfibrillärem und fibrillärem Kollagen vorliegt.
Die Zusammensetzung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei das fibrilläre Kollagen eine Mischung von partikulärem vernetztem fibrillärem Kollagen und nicht vernetztem fibrillärem Kollagen umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das partikuläre vernetzte fibrilläre Kollagen mit Glutaraldehyd vernetztes Kollagen umfasst.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das partikuläre vernetzte fibrilläre Kollagen zwischen ca. 25% bis ca. 95% umfasst und das nicht vernetzte fibrilläre Kollagen zwischen ca. 5% bis ca. 75% pro Gewicht der Zusammensetzung umfasst.
Die Zusammensetzung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei das fibrilläre Kollagen denaturiertes Kollagen ist.