DE69631014T2

DE69631014T2 - Fibrin-/fibrinogen-abbau und gerinsel-auflösung durch eine fibrinolytische matrix-metallproteinase

Info

Publication number: DE69631014T2
Application number: DE69631014T
Authority: DE
Inventors: Alessandra Bini
Original assignee: New York Blood Center Inc
Current assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 1995-05-17
Filing date: 1996-05-17
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2016-05-18
Also published as: US5922322A; US5830468A; EP0771146A1; CA2194692A1; WO1996036227A1; JPH10506925A; DE69631014D1; ES2212802T3; EP0771146B1; EP0771146A4; AU6145396A; ATE255904T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren von Enzym-vermitteltem Zerfall von Fibrinogen und Fibrin. Spezieller bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Abbauen von Fibrinogen und Herbeiführen einer Lyse von Fibringerinnseln unter Vermittlung einer fibrinolytischen Matrix-Metallproteinase. Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung von fibrinolytischer Metallproteinase als ein antithrombotisches Mittel, um verengte Gefäße wieder herzustellen und Fibrinablagerungen zu entfernen.
Das Gerinnen von Blut ist Teil der natürlichen Antwort des Körpers auf Verletzung oder Trauma. Die Blutgerinnselbildung leitet sich aus einer Reihe von Ereignissen ab, die Koagulations-Kaskade genannt wird, bei der die letzten Schritte die Bildung des Enzyms Thrombin mit sich bringt. Thrombin wandelt das zirkulierende Fibrinogen in Fibrin, eine netzartige Struktur, die das unlösliche Netzwerk der Blutgerinnsel bildet, um. Als Teil der Hämostase ist die Gerinnselbildung bei der Antwort auf Traumata oft ein lebensrettender Prozeß und dient dazu, den Blutfluss aus dem verletzten Gefäßsystem zum Stillstand zu bringen.
Der lebensrettende Prozess der Gerinnselbildung als Antwort auf eine Verletzung kann lebensbedrohlich werden, wenn er an ungeeigneten Stellen im Körper auftritt. Beispielsweise kann ein Gerinnsel ein Blutgefäß blockieren und die Blutzufuhr zu einem Organ oder anderen Körperteil anhalten. Die Ablagerung von Fibrin trägt zusätzlich zur teilweisen oder vollständigen Verengung von Blutgefäßen bei, was zu einer chronischen Verringerung des Blutflusses führt. Ebenso lebensbedrohlich sind Gerinnsel, die sich von ihren ursprünglichen Orten ablösen und durch das Kreislaufsystem fließen, wobei sie an entfernten Stellen Blockaden verursachen. Solche Gerinnsel sind als Embolien bekannt. Tatsächlich wurde geschätzt, dass Blutkoagulisations-Pathologien, wie zum Beispiel Herzanfälle, Gehirnschläge oder dergleichen, ungefähr 50% aller Todesfälle in Kliniken ausmachen.
Die Bildung von Fibrin während einer Entzündung, Gewebe-Reparatur oder Hämostase spielt nur eine temporäre Rolle und muss entfernt werden, wenn die normale Gewebestruktur und Funktion wieder hergestellt ist. Ein Fibringerinnsel, das sich schnell bildet, um eine Blutung in einem verletzten Blutgefäß zu stoppen, wird somit umgebaut und dann entfernt, um den normalen Blutfluss wieder herzustellen, während das Verheilen stattfindet. Das System, das für den Fibrinzerfall und die Gerinnselentfernung verantwortlich ist, ist das fibrinolytische System. Die Arbeitsweise des fibrinolytischen Systems ist eng durch die Wechselwirkung mit Aktivatoren, Zymogenen, Enzymen, wie auch durch Inhibitoren von jeden diesen Komponenten aufeinander abgestimmt, um eine zielgerichtete lokale Aktivierung an den Orten einer Fibrinablagerung bereitzustellen (Francis et al. 1994; Collen 1980; Collen et al. 1991).
Der Hauptvermittler der Fibrinolyse ist Plasmin, eine Trypsin-artige Endopeptidase, die Fibrin spaltet, um Gerinnsel aufzulösen und um den verletzten Geweben zu ermöglichen, sich zu regenerieren. Von Plasmin wurde auch gezeigt, dass es eine Rolle beim Abbauen von Proteinen, die bei Zell-Zell- und Zell-Matrix Wechselwirkungen beteiligt sind, spielt als auch beim Aktivieren von anderen Gewebe-wiederherstellenden Enzymen, wie zum Beispiel Matrix-Metallproteinasen (Murphy et al. 1992). Die Kontrolle der Plasminaktivität als auch von diesen anderen extrazellulären Ereignissen wird wiederum hauptsächlich durch Plasminogen-Aktivatoren, die das inaktive Zymogen Plasminogen in das aktive Enzym Plasmin konvertieren, vermittelt.
Im klinischen Rahmen ist es im Allgemeinen wünschenswert, das fibrinolytische System zu aktivieren oder zu verstärken. Dies ist insbesondere in Fällen von Herzinfarkten, bei denen Koronararterien verschlossen werden und eine Rekanalisation erforderlich ist, nötig. Die Katheterisierung hat sich bei einer solchen Rekanalisation als relativ wirksam erwiesen, aber pharmakologische Mittel sind erwünscht, um solche invasive Verfahren, um den Wiederversschluss zu hemmen, zu ergänzen oder zu ersetzen. Das Studium des komplizierten Systems der Thrombolyse und Fibrinolyse ist ein schnell wachsendes Gebiet, was zur Entwicklung einer neuen Generation von thrombolytischen Mitteln geführt hat.
Frühere therapeutische Behandlungen zum Auflösen von lebensbedrohlichen Gerinnseln umfassten das Injizieren von verschiedenen Enzymen, von denen bekannt ist, dass sie Fibrin zerfallen lassen, in das Blutsystem (Collen 1996). Die Probleme bei diesen Behandlungen waren, dass die Enzyme nicht ortsspezifisch waren und deshalb mehr als nur die Auflösung des Gerinnsels bewirkt haben. Diese Enzyme beeinflussen und zerstören zusätzlich viele lebenswichtige Protein-Wechselwirkungen, die dazu dienen, den Körper vor übermäßigem Bluten aufgrund der vielen kleinen Verletzungen, die er täglich erhält, zu bewahren. Die Zerstörung dieser Schutzmechanismen durch solche Enzyme kann zu einer schweren Hämorrhagie und anderen möglicherweise tödlichen Komplikationen führen.
Die zur Zeit best-bekannten therapeutischen Mittel zum Hervorrufen oder Steigern der Thrombolyse sind Verbindungen, die die Aktivierung von Plasminogen, die sogenannten „Plasminogenaktivatoren", bewirken (Brakman et al. 1992). Diese Verbindungen verursachen die Hydrolyse der Arg560-Val561-Peptidbindung im Plasminogen. Diese Hydrolyse ergibt die aktive zweikettige Serinprotease, das Plasmin. Eine Anzahl solcher Plasminogenaktivatoren sind bekannt, welche Serinproteasen, wie zum Beispiel dem Urokinaseplasminogenaktivator (u-PA), dem gewebetypischen Plasminogenaktivator (t-PA), Streptokinase (ein nicht-enzymatisches Protein) und Staphylokinase, umfassen. Von diesen ist Streptokinase das am meisten verwendete therapeutische thrombolytische Mittel. Obwohl jedoch die Streptokinase und die anderen Plasminogenaktivatoren sich als hilfreich bei der Rekanalisierung von Koronararterien erwiesen haben, ist ihre Fähigkeit zur Verbesserung der Sterblichkeit nicht ohne Nebenwirkungen und ihre Verwendung erfordert noch harte Kontrollbedingungen, um einen Erfolg in einem hohen Prozentsatz an Fällen zu erreichen (Martin et al. 1994). Die Verwendung von solchen Verbindungen kann zusätzlich Blutungskomplikationen bei anfälligen Individuen hervorrufen. Einer der Nachteile bei der Verwendung von t-PA in klinischen Versuchen war andererseits die frühe Wiederbildung des Gerinnsels, nachdem es aufgelöst worden war, was bei manchen Patienten zu einem thrombotischen Wiederverschluss geführt hat.
Zahlreiche Studien haben die Fähigkeit des t-PA, thrombolytische Phänomene auszulösen oder zu verstärken, belegt (Sobel et al. 1987). Als Folge wird t-PA, speziell dessen rekombinante Form rt-PA, als thrombolytisches Pharmazeutikum beliebter. rt-PA hat dennoch unter ernsten Beschränkungen, welche extrem hohe Dosierungskosten und veränderliche Wirksamkeit umfassen, zu leiden. Spezifische, schnell-wirkende Inhibitoren von t-PA wurden zu sätzlich in menschlichem Plasma und anderen Flüssigkeiten identifiziert (Collen et al. 1987). Ein weiterer Zugang zu t-PA beinhaltet die mögliche Anwendung von Gentransfer von und Expression von rekombinantem t-PA in Endothelzellen (Lee et al. 1993). Dieses Verfahren ist außergewöhnlich komplex und es ist nicht wahrscheinlich, dass es als thrombolytische Behandlung in naher Zukunft anwendbar ist.
Es sind auch andere Enzyme als Plasmin, die Fibrin bzw. Fibrinogen in verschiedenem Ausmaß abbauen können, bekannt. Die endogenen Leukozyten-Proteasen (Bilezikian et al. 1977; Plow et al. 1975) beispielsweise, später als Elastase und Cathepsin-G identifiziert (Gramse et al. 1978; Plow 1980; Plow et al. 1982), können teilweise Fibrin bzw. Fibrinogen abbauen. Exogene Enzyme, die Fibrin abbauen, sind auch bekannt. Solche Enzyme umfassen hämolytische Enzyme, die aus dem Gift von gewissen Schlangen, zum Beispiel der Familien der Klapperschlangen und Vipern (Purves et al. 1987; Retzios et al. 1992; Sanchez et al. 1991), entnommen werden. Aus Schlangen isolierte fibrinolytische Enzyme können in zwei verschiedene Klassen eingeteilt werden (Guan et al. 1991). Jene Enzyme, die vorzugsweise die Aα-Kette des Fibrinogens und auch die α- und β-Ketten des Fibrins abbauen, sind Zink-Metallproteasen (Guan et al. 1991) und können alle durch EDTA gehemmt werden. Die Enzyme der zweiten Klasse sind Serinproteasen und zeigen Spezifizität für die β-Kette des Fibrins (Guan et al. 1991). Eine Endopeptidase aus dem Gift der Puffotter (Bitis arietans) kann an der Vernetzungsstelle der γ-Kette spalten und dadurch das D-Dimer-Fragment in ein D-artiges Monomer spalten (Purves et al. 1987). Fibrinolytische Enzyme wurden auch aus Blutegeln erhalten (Zavalova et al. 1993; Budzynski 1991) sowie auch aus dem Wachstumsmedium eines Bakteriums (Aeromonas hydrophila), das aus dem Darmtrakt des Blutegels gewonnen wurde (Loewy et al. 1993).
Die endogenen Matrix-Metallproteinasen (MMPs) oder „Matrixine" umfassen drei Klassen von Enzymen: Collagenasen, Gelatinasen und Stromelysine. Von MMPs ist bekannt, dass sie die Fähigkeit besitzen, eine Anzahl von Proteinen und Proteoglykanen, die mit der extrazellulären Matrix (ECM) des Bindegewebes assoziiert sind, abzubauen. Von ihnen wurde gezeigt, dass sie eine Anzahl von Proteinen, welche Collagen (Typen I–IV, VII und X), Laminin, Fibronectin, Elastin und Proteoglykane umfassen, zerfallen lassen. MMPs wurden auch in Leukozyten identifiziert (Welgus et al. 1990). Es wurde gezeigt, dass MMP-2 und MMP-9 Elastaseaktivität (Senior et al. 1991), der ein Teil der komplexen proteolytischen Aktivität, die ursprünglich in Granulozyten beobachtet wurde, zugeordnet werden kann (Sterrenberg et al. 1983), besitzen. MMPs nehmen beim Umbau von Geweben in physiologischen Prozessen, wie zum Beispiel der Morphogenese und embryonischen Entwicklung, sowie auch bei der Pathophysiologie der Wundheilung, Tumorinvasion und Arthritis (Matrisian 1992; Nagase et al. 1991; Woessner 1991; Werb et al. 1992) teil.
Die Expression von MMPs und deren Inhibitoren ist unter weitreichender und verschiedenartiger molekularer und zellulärer Kontrolle (Kleiner et al. 1993; Matrisian 1992; Woessner 1991). Bekannte regulierende Faktoren umfassen Hormone, Cytokine, Protoonkogene, Steroide und Wachstumsfaktoren. MMPs werden durch spezifische Inhibitoren, die „Gewebeinhibitoren der Metallproteinasen" (TIMPs, engl.: tissue inhibitors of metalloproteinases) genannt werden, welche die Aktivität von jedem Mitglied der Familie hemmen kann, gehemmt. Ein Enzym-Inhibitor-Komplex wird gebildet und es findet keine Umwandlung von Bindegewebe statt, wenn die MMPs im Überschuss vorliegen. Das Hauptaugenmerk der Forschung über ECM war, den ECM-Abbau durch MMPs zu beschränken, um das Fortschreiten von krankhaften Zuständen zu unterbre chen oder zu stören. Mehrere Forschergruppen synthetisieren kleine Moleküle, die die Proteinasen hemmen könnten, um ihre zerstörende Aktivität bei Arthritis zu ändern, und als antiangiogene Faktoren, um die Tumorverbreitung zu hemmen.
Die Matrix-Metallproteinase-3 (MMP-3) gehört zu der Stromelysin-Klasse der Matrix-Metallproteinasen. MMP-3 wird in reifen Makrophagen exprimiert (Campbell et al. 1991), aber auch in Endothelzellen, glatten Muskelzellen und in Fibroplasten. Von MMP-3 wurde kürzlich gezeigt, dass sie in Makrophagenabgeleiteten Schaumzellen von experimentellen Atheromen (Galis et al. 1995) exprimiert wird. Das inaktive Zymogen, proMMP-3, wird durch die neutrophile Elastase, Plasma-Kallikrein, Plasmin, Chymotrypsin, Trypsin, Cathepsin G und Mastzellentryptase sowie durch Quecksilber-Verbindungen, wie zum Beispiel 4-Aminophenylquecksilberacetat (APMA) (Nagase et al. 1992; Kleiner et al. 1993; Nagase et al. 1990; Nagase 1991) aktiviert. Erhöhte Pegel von MMP-3 wurden in den Gelenken von Patienten, die an Osteoarthritis und rheumatischer Arthritis leiden, gefunden. In arteriosklerotischen Plaques gibt es eine große Menge von Fibrin- bzw. Fibrinogen-abgeleitetem Antigen (FRA), das aus verschiedenen molekularen Formen besteht (Bini et al. 1987; Bini et al. 1989; Smith et al. 1990; Valenzuela et al. 1992). Zwei sehr neue Studien haben das Vorhandensein von Matrix-Metallproteinase-3 in arteriosklerotischen Plaques gezeigt (Henney et al. 1991; Galis et al. 1994), aber ihre Funktion in diesem Zusammenhang blieb unaufgeklärt. Tatsächlich wurde MMP-3 in diesen Studien als ein möglicher negativer Faktor angesehen.
Die bekannten Substrate von MMP-3 umfassen Proteoglykane, Collagen Typ IV, Fibronektin und Laminin. Solche Substrate sind im Allgemeinen typisch für Matrix-Metallproteinasen (Doolittle 1987). Es gab jedoch kein Anzeichen, dass irgendeine endogene Metallproteinase beim Abbau von Fibrinogen oder Fibrin beteiligt sein könnte. Auch gab es keinen Hinweis, dass Metallproteinasen zur Fibrinolyse oder Thrombolyse verwendet werden könnten.
Aus der vorstehenden Diskussion wird klar, dass deutliche Lücken im Verständnis der Vorgänge, die bei der Thrombusbildung und dem Thrombusabbau beteiligt sind, vorhanden sind. Während bestimmte Ansätze erkannt wurden, die ein gewisses Maß an Kontrolle über diese Vorgänge ermöglichen, leiden diese Ansätze bezüglich Kosten, Effizienz oder Sicherheit unter schwerwiegenden Defiziten. Die Diagnose und Behandlung von krankhaften Zuständen, die mit physiologischen Vorgängen unter Beteiligung von Fibrinogen und Fibrin assoziiert sind, wurden auch als mangelhaft befunden.
Als Folge besteht ein Bedarf an wirksamen Zusammensetzungen zur Verwendung beim Beschränken der Thrombusentwicklung und Hervorrufen der Thrombolyse.
Es besteht ein Bedarf an Verfahren zum Aufbrechen von Blutgerinnsel und arteriosklerotischen Plaques, sowohl in vitro, beispielsweise für diagnostische Zwecke, als auch in vivo, beispielsweise zur therapeutischen Behandlung von Embolien, Arteriosklerose und anderen klinisch-bedeutsamen Leiden.
Zusätzlich besteht ein Bedarf an diagnostischen und experimentellen Materialien und Verfahren zum Erlangen von mehr Information bezüglich der physikalischen und chemischen Vorgänge, die bei der Thrombusbildung und dem Thrombusabbau beteiligt sind.
Darüber hinaus besteht ein Bedarf zur wirksamen Behandlung, um einer beschädigten Gefäßwand wenigstens ein Teil an Integrität zurückzugeben, um den Rückgang der arteriosklerotischen Plaques zu fördern und um bei einer Angioplastie und Bypasschirurgie zu helfen, den Wiederverschluss zu verhindern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Abbauen von Fibrin, Fibrinogen und abgeleiteten Substanzen (d. h. „Fibrin(ogen)") mittels einer fibrinolytischen Metallproteinase (FMP) bereit. Die fibrinolytische Metallproteinase ist ein Stromelysin, vorzugsweise endogenes Stromelysin. Am meisten bevorzugtumfasst die fibrinolytische Metallproteinase die Matrix-Metallproteinase-3 (MMP-3). Die fibrinolytische Metallproteinase spaltet oder baut vorzugsweise Fibrinogen) bei der Peptidbindung, die als γGly404-Ala405 bezeichnet wird, ab.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in vitro durchgeführt werden. In vitro umfasst das Verfahren das Kontaktieren einer Gewebeprobe, beispielsweise Blut oder Plasma, mit wenigstens einer fibrinolytischen Matrix-Metallproteinase. Bei diesem Verfahren kann Fibrin als Bestandteil von Gerinnseln und/oder arteriosklerotischen Plaques zu Zwecken der Untersuchung der Struktur solcher Materialien sowie zur weiteren Untersuchung der Mechanismen der Fibrinolyse oder Thrombolyse abgebaut werden. Fibrinogen kann für experimentelle oder diagnostische Zwecke, die mit der Fibrinbildung in Zusammenhang stehen oder um das mögliche Wachstum eines Fibrinogen-Fibrin-Netzes zu verhindern, abgebaut werden.
Bei einem bevorzugten diagnostischen Verfahren umfasst das Verfahren das Kontaktieren einer Probe, die Fibrinogen) enthält, mit wenigstens einer endogenen fibrinolytischen Metallproteinase, um Abbauprodukte bereitzustellen. Das Verfahren umfasst vorzugsweise das Analysieren der Abbauprodukte, um Fibrinogen) zu charakterisieren. Eine solche Analyse umfasst typischerweise ein differenzielles Abtrennen der verschiedenen Abbauprodukte. Die Abbauprodukte können mit verschiedenen Mitteln identifiziert oder gemessen werden. Beispielsweise können die Fragmente durch Antikörper, die an einen speziellen Bereich bzw. spezielle Bereiche von Fibrinogen) spezifisch binden oder damit assoziieren, nachgewiesen werden oder aufgrund von durch enzymatischem Abbau induzierten Epitopverlust nicht mit ihnen assoziieren. Solche Antikörper sind vorzugsweise monospezifisch, mehr bevorzugt monoklonal. Synthetische und/oder chimäre Antikörper können verwendet werden, ebenso können Antigen-bindende Bereiche, beispielsweise wie Fab und F(ab')₂ verwendet werden. Die Messung von spezifischer Assoziation zwischen solchen Antikörpern und Abbaufragmenten kann qualitative oder quantitative Information über die Fibrin(ogen)probe, die analysiert wird, liefern. Solche Antikörper können detektierbar markiert werden, um bei der Messung der Arten und Mengen der Abbauprodukte zu helfen. Alternativ können Antikörper, die an ein Substrat fixiert sind, verwendet werden, um bei der Trennung oder Reinigung von Abbaufragmenten, die durch eine fibrinolytische Metallproteinase hergestellt wurden, zu helfen.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Stromelysins zur Herstellung eines Medikaments zum Durchführen von thrombolytischer, embolytischer oder arteriolytischer Therapie in einem Wirbeltier, vorzugsweise einem Primaten, mehr bevorzugt in einem Menschen, bereit. Typischerweise muss fibrinolytische Metallproteinase in einer therapeutischen Zusammensetzung, die die Metallproteinase und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittelumfasst, verabreicht werden. Wahlweise kann die verabreichte Zusammensetzung ferner ein oder mehrere andere aktive Bestandteile als Beigabe zu der fibrinolytischen Aktivität der Metallproteinase umfassen. Geeignete Beigabeverbindungen schließen Verbindungen, die thrombolytische oder fibrinolytische Aktivität aufweisen, ein. Beispielsweise können solche Beigabeverbindungen ein Plasminogenaktivator, Hirudin, ein Enzyminhibitor, ein Gerinnungshemmer, ein Antikörper oder synthetisches Peptid, das für den Blutplättchen-GPIIb/IIIa-Rezeptor spezifisch ist, oder eine Mischung davon, sein.
Das Stromelysin kann verwendet werden, um Komplikationen, die mit Arteriosklerose in Zusammenhang stehen, zu verhindern oder zu verbessern (d. h. Fibrinogen und Fibrin in Plaques abzubauen, bevor der Verschluss eintritt), sowie einen Wiederverschluss nach einer thrombolytischen Therapie zu verhindern, zum Beispiel mit t-PA nach einem Herzinfarkt. Tatsächlich ist t-PA schnell-agierend, während eine bevorzugte Metallproteinase MMP-3 eine langsamere und schrittweise Arbeitsweise aufweist. Somit können die Verbindungen vorteilhaft in Kombination, die eine aufeinanderfolgende oder gleichzeitige Verwendung umfasst, verwendet werden. Das Stromelysin kann auch als prophylaktisches Mittel verwendet werden, um eine Wiederverengung nach einem chirurgischen Eingriff, wie z. B. einer Bypasschirugie oder Angioplastie, zu hemmen. Alternativ kann das Stromelysin bei der arteriolytischen Therapie verwendet werden, um die anfängliche Bildung von arteriosklerotischen Plaques zu hemmen oder den Rückgang von arteriosklerotischen Plaques zu fördern.
Die Erfindung stellt zusätzlich diagnostische und therapeutische Kits, die eine fibrinolytische Matrix-Metallproteinase einschließen, bereit. Die fibrinolytische Metallproteinase ist vorzugsweise endogen. Die Metallproteinase schließt Stromelysin, mehr bevorzugt MMP-3, ein. Es ist auch bevorzugt, dass die Metallproteinase Fibrinogen) bei der γGly404-Ala405-Peptidbindung spaltet oder hydrolysiert. Solche Kits können einen oder mehrere Behälter sowie ein zusätzliches Reagenz oder zusätzliche Reagenzien und/oder einen aktiven und/oder inerten Bestandteil bzw. aktive und/oder inerte Bestandteile zum Durchführen jedweder Variationen des erfindungsgemäßen Verfahrens einschließen. Beispielhafte Reagenzien umfassen ohne Beschränkung synthetische Substrate, um die enzymatische Aktivität zu testen, und Antikörper (vorzugsweise monospezifisch, zum Beispiel monoklonal), um den Anstieg oder Abfall des Antigen-Pegels zu messen. Bevorzugte Kits umfassen wenigstens eine therapeutischwirksame Dosiseinheit einer fibrinolytischen Metallproteinase. Ebenso bevorzugt sind Kits, die Mittel zum Verabreichen, vorzugsweise parenteral, mehr bevorzugt intravenös, einer Zusammensetzung, die eine fibrinolytische Metallproteinase enthalten, umfassen. Die Kits können ein oder mehrere andere aktive Bestandteile als Beigaben, beispielsweise Plasminogen-Aktivatoren, Hirudin oder Gerinnungshemmer, wie zum Beispiel Heparin oder Aspirin, einschließen. Diese anderen Bestandteile können in getrennten Zusammensetzungen in getrennten Reagenzbehältern eingeschlossen werden oder können miteinander und/oder mit der fibrinolytischen Metallproteinase in einen einzelnen Reagenzbehälter eingeschlossen werden. Die Kits können auch Anweisungen zum Mischen oder Kombinieren von Bestandteilen und/oder Verwendung des Kits gemäß der Erfindung umfassen.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Kontrollieren der Thrombusbildung, die durch ein Gerät mit medizinischem Bezug hervorgerufen wurde, bereit. Bei dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kontaktieren eines Geräts mit medizinischem Bezug mit einer Zusammensetzung, die eine fibrinolytische Matrix-Metallproteinase, vorzugsweise MMP-3, enthält. Die Me tallproteinase haftet oder bindet wünschenswerterweise an einer Oberfläche des Geräts. Das Verfahren kann verwendet werden, um Oberflächen von implantierbaren prosthetischen Vorrichtungen, die mit Blut in Kontakt sind, wie zum Beispiel Kanülen, Katheter, Implantate, Stents, Filter, Spiralen, Ventile oder dergleichen zu verändern, um Oberflächen, die die Bildung von Gerinnseln oder Plaques hemmen, bereitzustellen. Alternativ befähigt das Verfahren die fibrinolytische Modifikation eines Gerätes, wie zum Beispiel Nadeln, Blutsammelröhrchen, Kulturflaschen, Testplatten, Pipetten, Reagenzbehälter, Schläuche, Membranen oder dergleichen, um die Fibrinolyse zu fördern und die Polymerisation von Fibrinogen und die Thrombusbildung, die sonst in die experimentellen Protokolle störend eingreifen könnte, zu hemmen. Genauso stellt die Erfindung ein Gerät mit medizinischem Bezug, beispielsweise implantierbare Geräte, Laborgeräte oder andere Vorrichtungen für in vivo- und in vitro-Verwendungen, wobei das Gerät verändert wurde, um anhaftende fibrinolytische Metallproteinase zu umfassen, bereit.
Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die genaue Beschreibung und die Beispiele, die hier dargelegt sind, gewürdigt. Die genaue Beschreibung und die Beispiele untermauern das Verständnis der Erfindung, beabsichtigen aber nicht, den Umfang der Erfindung zu beschränken.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Bevorzugte Ausführungsformen gemäß der Erfindung wurden zu Zwecken der Veranschaulichung und der Beschreibung ausgewählt, beabsichtigen aber nicht, in irgendeiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken. Die bevorzugten Ausführungsformen bestimmter Aspekte der Erfindung sind in den beigefügten Abbildungen gezeigt:
1 zeigt eine elektrophoretische Analyse von Fibrinogen, das mit MMP-2 oder MMP-3 behandelt wurde, wobei der differenzielle Abbau von Fibrinogen durch jedes der Enzyme gezeigt ist.
2A ist ein Schaubild, das die relative Fibringerinnsel-Lyse durch MMPs und Plasmin, wie durch den Prozentsatz an Radioaktivität in Probenüberständen gemessen, veranschaulicht.
2B zeigt ein Schaubild, das die relative Fibringerinnsel-Lyse durch MMPs und Plasmin, wie durch den Prozentsatz an Radioaktivität in den Gerinnselrückständen gemessen, veranschaulicht.
3 zeigt eine elektrophoretische Analyse von Fibrin, das mit MMP-2, MMP-3 und Plasmin behandelt wurde, wobei der differenzielle Abbau von Fibrinogen durch jedes der Enzyme gezeigt ist.
4A zeigt einen Immunoblot der Abbauprodukte des Fibrinverdaus durch MMP-3 und Plasmin, wie mit MoAb/4-5(γ392-406) gemessen.
4B zeigt einen Immunoblot der Abbauprodukte des Fibrinverdaus durch MMP-3 und Plasmin, wie mit MoAb/45(γ397-411) gemessen.
5 zeigt einen Immunoblot der Abbauprodukte des Fibrinverdaus durch MMP-3, wie mit MoAb/T2G1 (Bβ15-42) und MoAb/1D4 (Aα349-406) gemessen.
6A zeigt eine elektrophoretische Analyse (nicht-reduzierende Bedingungen) von D-Dimer, das mit MMP-3 behandelt wurde, wobei der Zeit- und Konzentrations-abhängige Abbau des D-Dimers durch MMP-3 gezeigt ist.
6B zeigt eine elektrophoretische Analyse (reduzierende Bedingungen) von D-Dimer, das mit MMP-3 behandelt wurde, wobei der Zeit- und Konzentrations-abhängige Abbau des D-Dimers durch MMP-3 gezeigt ist.
7 ist ein schematisches Diagramm, das den Vernetzungsbereich im vernetzten Fibrin veranschaulicht, wobei die Spaltungsstellen von MMP-3 und CNBr gezeigt sind.
8 zeigt eine elektrophoretische Analyse der Abbauprodukte von Fibrinogen und vernetztem Fibrin durch MMP-3.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Wie oben erwähnt, haben zwei sehr neue Studien das Vorhandensein von MMP-3 in arteriosklerotischen Plaques identifiziert (Henney et al. 1991; Galis et al. 1994). Diese Studien haben das Vorhandensein von MMPs in den Plaques als einen negativen Faktor, der das Zerreissen der Plaques begünstigen könnte, angesehen. Die vorliegende Erfindung steht jedoch mit einem gänzlich anderen Verständnis der Funktion der MMP-3 im Einklang. Die Erfindung bezieht sich auf die unerwartete Rolle, die entdeckt wurde, dass MMP-3 sie beim Abbau von Fibrinogen und Fibrin spielt.
Für ein klareres und deutlicheres Beschreiben der vorliegenden Erfindung wurden in der folgenden Diskussion bestimmte terminologische Konventionen angenommen. Diese Konventionen beabsichtigen ein praktisches Mittel zur verbesserten Beschreibung der Erfindung bereitzustellen, sie sind aber nicht beabsichtigt, beschränkend zu sein und der Fachmann wird anerkennen, dass auf andere und zusätzliche, aber nicht widersprüchliche, Interpretationen geschlossen werden kann.
Beispielsweise betrifft die Erfindung die Verwendung einer Matrix-Metallproteinase, um Fibrin und Fibrinogen abzubauen. Die Matrix-Metallproteinasen, die gemäß der Erfindung verwendbar sind, müssen einige enzymatische Aktivität gegenüber Fibrin, Fibrinogen und/oder verwandten Proteinen, Polypeptiden oder Oligopeptiden aufweisen. Matrix-Metallproteinasen, die diese Aktivität aufweisen, werden „fibrinolytische Matrix-Metallproteinasen" oder „fibrinolytische MMPs" genannt.
Die fibrinolytische Matrix-Metallproteinase kann exogen oder endogen sein. Es ist bevorzugt, dass die fibrinolytische Metallproteinase endogen ist. Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung „endogen", dass die fibrinolytische Metallproteinase eine Herkunft aus den Spezies, in denen die Erfindung durchzuführen ist, hat. Die Spezies können jedes Wirbeltier, vorzugsweise ein Säugetier, und mehr bevorzugt ein Primat, am meisten bevorzugt ein Mensch, sein. Demgemäß, wenn die Erfindung in einem Menschen durchgeführt wird, ist es bevorzugt, dass die aktive Metallproteinase zu Menschen endogen, d. h. von menschlicher Herkunft, ist, sowohl wenn sie als eine pharmazeutische Zusammensetzung angewendet wird als auch resultierend aus einer Therapie, die entwickelt wurde, um die interne Kontrolle des fibrinolytischen Systems des Subjekts zu verbessern. Für in vitro-Verfahren ist die Herkunft der fibrinolyti schen Metallproteinase weniger kritisch, es ist aber bevorzugt, dass die Metallproteinase eine Herkunft, die so nahe als möglich an der Herkunft der Spezies der biologischen Probe, die untersucht werden soll, ist, aufweist. Bei solchen Verfahren ist die Metallproteinase zu der Probe endogen, wenn sie aus der Spezies hergeleitet ist zu der die Testprobe gehört.
Endogene fibrinolytische Metallproteinasen umfassen jede der Stromelysin-Klasse von Metallproteinasen. Bevorzugte Stromelysine umfassen MMP-3 (Stromelysin-1), MMP-10 (Stromelysin-2), und MMP-11 (Stromelysin-3). Eine besonders bevorzugte endogene fibrinolytische MMP ist MMP-3. Wir haben herausgefunden, dass MMP-3 Fibrinogen) an der γGly404-Ala405-Peptidbindung im Vernetzungsbereich der γ-Kette hydrolysiert.
Es ist bekannt, dass aufgrund der Fluidität und Komplexität der Physiologie der Fibrinbildung und des Fibrinabbaus viele Formen von Fibrin und Fibrinogen im zirkulierenden Blut wie auch in thrombotischen arteriosklerotischen Verletzungen vorliegen. Die vielen Formen dieser Moleküle resultieren aus dem fortwährenden Angriff von proteolytischen Enzymen, die die Moleküle unterschiedlich spalten. Das Verfahren gemäß der Erfindung wird mittels einer fibrinolytischen MMP, die Aktivität gegen wenigstens eine Fibrinogen- oder Fibrinverwandte Verbindung hat, durchgeführt. Wenn ein Fibrinogen-abgeleitetes Molekül vorher gespalten oder verändert wurde, um alle MMP-Spaltungsstellen zu entfernen, dann ist dieses Molekül nicht mehr länger in der Lage, als Substrat für eine fibrinolytische MMP zu wirken. Es wurde nun unerwarteterweise herausgefunden, dass Substrate für MMP-3 unter anderen natives Fibrinogen und Fibrin umfassen, und man würde auch erwarten, dass sie modifizierte, synthetische und halbsynthetische Formen dieser Verbindungen sowie eine große Anzahl von Spaltungsprodukten dieser Verbindungen umfassen. Die Klasse der Substanzen, die von Fibrinogen und/oder Fibrin abgeleitet sind oder in Bezug zu Fibrinogen und/oder Fibrin stehen, kann als „Fibrin(ogen)" bezeichnet werden. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann deshalb durch Verwendung jeder MMP, die so arbeitet, dass sie einen Fibrinogen)-Rest abbaut, durchgeführt werden. Während solche Enzyme im Allgemeinen als „fibrinolytisch" bezeichnet werden, können sie auch genauer als „fibrin(ogen)olytische" MMPs bezeichnet werden.
Fibrinogen (hier auch als „Fg" abgekürzt) ist als ein homodimeres Protein, in dem jedes Monomer drei im Wesentlichen homologe Polypeptidketten, die als die α(Alpha), β(Beta), und γ(Gamma)-Ketten identifiziert sind, umfasst, bekannt. Ein Überblick ist in Doolittle (1987) gegeben. Fibrinogen hat demnach die Struktur (αβγ)₂. Alle drei Fibrinogen-Untereinheiten haben „coiled"- (wörtlich: aufgewickelte) Domänen, die es ermöglichen, dass die Untereinheiten sich untereinander so organisieren, dass sie einen „coiled coil"-Bereich (wörtlich: aufgewickelte Wicklung) in dem Fibrinogenmonomer bilden. Zusätzlich haben die Beta- und Gamma-Ketten haben jeweils eine globuläre Domäne, während die Alpha-Kette in zwei Formen vorliegt; eine vorherrschende Form, die keine entsprechende globuläre Domäne (α) aufweist, und eine weniger vorherrschende Form, in der eine globuläre Domäne vorliegt (α_E) (Fu et al. 1994). Dementsprechend, da Fibrinogen homodimer ist und weil zwei Formen der Alpha-Untereinheit identifiziert wurden, sind zwei Hauptformen des Fibrinogens bekannt: (αβγ)₂ und (α_Eβγ)₂. Beide Formen von Fibrinogen werden als Substrate der fibrinolytischen MMPs gemäß der Erfindung angesehen. Künstliche Heterodimere von Fibrinogen sowie rekombinante Formen gehören auch zu der Klasse der fibrinolytischen MMP-Substrate.
Wie erwähnt wird Fibrin (hier auch als „Fb" abgekürzt) durch eine induzierte und kontrollierte Polymerisation von Fibrinogen erzeugt (Fu et al. 1994). Aufgrund der Tatsache, dass verschiedene Formen von Fibrinogen im zirkulierenden Blut bekannt sind, ist es bekannt, dass verschiedene Polymerisationsstrukturen von Fibrin auftreten. Fibrinstrukturen können die Abläufe der Fibrinolyse beeinflussen (Gabriel et al. 1992). Von einer fibrinolytische Metallproteinase wurde nun gefunden, dass sie Fibrin wirksam lysiert. Es scheint daher, dass fibrinolytische Metallproteinasen, ohne wesentlich durch die Besonderheiten der Fibrinvernetzung beschränkt zu sein, gegen Fibrin aktiv sind. Dementsprechend wird Fibrin als ein MMP-Substrat gemäß der Erfindung angesehen. Somit ist Fibrin, das natürlicherweise in einem Subjekt vorkommt, sowie auch Fibrin, das in vitro induziert wird, gemäß der Erfindung zum Abbau geeignet. Somit können Gerinnsel, die im Blut ex vivo, zum Beispiel in einer Blutprobe induziert wurden, gemäß der Erfindung abgebaut werden. Bei solchen in vitro-Anwendungen kann eine fibrinolytische Metallproteinase als Beschichtung auf einen Behälter, beispielsweise einem Blutsammelröhrchen verwendet werden. Auch können künstliches Fibrin, das aus natürlichem, synthetischem, halbsynthetischem, rekombinantem und/oder anderen Arten von Fibrinogen gebildet wurde, durch das Verfahren, das hier beschrieben wird, abgebaut werden.
Unter physiologischen Bedingungen ist Plasmin das zentrale Enzym, das beim Fibrinabbau wirkt. Die Wirkungsweise des Plasmin ist durch Plasma-Kontrollmechanismen, die eine Proteolyse der zirkulierenden Proteine verhindern, auf den Ort der Fibrinablagerung beschränkt. Jedoch ist bekannt, dass Plasmin unter pathologischen Bedingungen Plasmaproteine, speziell Fibrinogen, abbaut.
Abgebautes Fibrinogen kann durch Ionenaustauschchromatographie in fünf Fraktionen (A, B, C, D und E) getrennt werden, wobei die Fragmente D und E die Hauptendprodukte des ursprünglichen Moleküls sind. Die Identifikation und Charakterisierung der kurzlebigen Zwischenfragmente X und Y lieferten das Verständnis für die Entwicklung eines asymmetrischen Schemas des Fibrinogen-Abbaus (Francis et al. 1994).
Klassischerweise ist die Fibrinogenstruktur zweiseitig symmetrisch, wobei sie eine zentrale globuläre Domäne E, die ein „Knoten" ist, der aus den N-terminalen Bereichen von allen sechs Ketten des Fibrinogenmoleküls gebildet ist, umfasst. Von E aus erstrecken sich zwei „coiled coils", wobei jedes Anteile aus einer Gruppe von α, β und γ-Ketten enthält. An den anderen Enden der „coiled coils" sind globuläre Domänen D. Von den D-Domänen erstrecken sich die Aα-Ketten-Verlängerungen, die nur in der α_E-Untereinheit in einer anderen globulären Domäne enden.
Beim proteolytischen Angriff durch Plasmin setzen die anfänglichen Spaltungen das carboxyterminale Ende, den polaren Anhang der Aα-Kette und ein Peptid von dem N-terminalen Anteil der Bβ-Kette (Bβ1-42) frei. Das übrig gebliebene Hauptfragment ist Fragment X. Spaltungen von allen drei Polypeptidketten entlang eines „coiled coil", das den zentralen N-terminalen Knoten (E) und eine terminale Domäne (D) des Fragments X verbindet, teilen es asymmetrisch. Das Ergebnis ist ein D-Molekül-Fragment, das aus den carboxyterminalen Anteilen von drei Ketten besteht, und ein Y-Rest-Fragment, das aus zentralen und terminalen-Domänen, die noch durch ein „coiled coil" verbunden sind, besteht. Nachfolgendes Spalten des „coiled coil" des Fragments Y erzeugt ein zweites Fragment D und ein E-Rest-Fragment. Das Fragment X ist durch Thrombin langsam gerinnbar, aber die Fragmente Y und D haben starke anti polymerisierende Effekte, hauptsächlich aufgrund der Unterbrechung der richtigen Ausrichtung und Fortsetzung des Aufbaus der Protofibrillen von Fibrin.
Die Kenntnis der üblichen Fragmentierung von Fibrinogen hilft bei dem Bereitstellen eines konzeptionellen Rahmens, gegenüber dem die Aktivität von anderen möglichen fibrinolytischen Enzymen verglichen wird. Außerdem wurden Antikörper entwickelt, die nur mit einigen der Fragmente spezifisch reagieren oder an diese spezifisch binden und dabei die molekulare Identifikation von Fragmenten mit hoher Genauigkeit und Präzision ermöglichen (Kudryk et al. 1989a). Unter Verwendung dieses Wissens wurde die fibrinolytische Aktivität einer endogenen Metallproteinase unerwarteterweise identifiziert, wobei dadurch die Entwicklung des Verfahrens gemäß der Erfindung ermöglicht wurde.
Die Erfindung stellt unter anderem ein Verfahren zum Abbau von Fibrinogen) bereit. Im Allgemeinen erfordert das Verfahren die Verwendung einer endogenen Matrix-Metallproteinase, die enzymatische Aktivität gegen Fibrin und/oder Fibrinogen besitzt, d. h. diese hydrolysieren kann. Das Verfahren umfasst das Kontaktieren von Fibrin oder Fibrinogen mit einer wirksamen Menge einer fibrinolytischen Matrix-Metallproteinase, vorzugsweise MW-3.
Das Verfahren umfasst typischerweise das Kontaktieren von Fibrinogen oder Fibrin mit einer Matrix-Metallproteinase. Zusammensetzungen, die eine fibrinolytische Metallproteinase umfassen, können auch andere aktive und/oder inerte Bestandteile umfassen. Andere aktive Bestandteile können beispielsweise Bestandteile wie Inhibitoren von MMPs, Plasminogenaktivatoren, andere fibrinolytische Enzyme, Gerinnungshemmer etc. umfassen. Sollen andere aktive Bestandteile angewendet werden, ist es bevorzugt, in die Zusammensetzung einen Plasminogenaktivator einzuschließen. Man hat herausgefunden, dass speziell Matrix-Metallproteinase-3 nicht wesentlich mit t-PA oder Plasmin konkurriert oder nicht wesentlich inhibiert. Dementsprechend kann das Verfahren gemäß der Erfindung Plasminogenaktivatoren wie beispielsweise u-PA, t-PA, Staphylokinase, Streptokinase oder rekombinante, synthetische oder halbsynthetische Formen davon umfassen.
Die Erfindung ermöglicht nun auch die Untersuchung der Wechselwirkung von MMP-3 mit Plasminogenaktivatoren, Plasminogenaktivator-Inhibitoren (zum Beispiel PAI-1) und nativem Plasminogen. Während beispielsweise bekannt ist, dass Plasmin MMP-3 aktivieren kann, ist es nicht bekannt, ob MMP-3 t-PA oder u-PA aktiviert oder ob sie stattdessen durch diese aktiviert wird. Es ist auch nicht bekannt, ob MMP-3 natives Plasminogen aktivieren könnte.
Es ist auch wünschenswert, einen Gerinnungshemmer wie zum Beispiel Heparin einzuschließen, um die Wiedergerinnung zu hemmen oder zu verhindern. Solche Maßnahmen wären bei in vitro-Anwendungen weniger kritisch, könnten aber bei in vivo-Anwendungen deutlich hilfreich sein. Die Kombination von t-PA mit Heparin, um eine thrombolytische Zusammensetzung mit Doppelfunktion zu definieren, ist in der US-Patentschrift Nr. 5,130,143 erläutert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die Erfindung die fibrinolytische Therapie eines Säugetiers, vorzugsweise eines Menschen. Bei dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Matrix-Metallproteinase, die Fibrinogen) abbaut, an ein Subjekt. Die Metallproteinase umfasst vorzugsweise endogenes Stromelysin, und am meisten bevorzugt MMP-3. Die therapeutische Verwendung kann zur Thrombolyse oder zur Verhinderung eines Fortschreitens und zur Erleichterung eines Rückgangs von arteriosklerotischen Plaques angewen det werden. Das Verfahren kann somit zur Akut- oder Notfall-Therapie oder zur verlängerten oder chronischen Nachsorgetherapie zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit oder zur Hemmung der Entwicklung von abnormalen Thromben, Embolien oder arteriosklerotischen Plaques verwendet werden.
Die Arten der Verabreichung einer solchen Zusammensetzung sind dem Fachmann bekannt und sind mit diesen Verfahren, die bei der Verabreichung von herkömmlichen thrombolytischen Mitteln angewendet werden, verwandt. Solche Verfahren umfassen ohne Beschränkung parenterale Verfahren, vorzugsweise intravaskuläre Verfahren, wie zum Beispiel intravenöse Injektion, intraarterielle Injektion und Verabreichung durch Katheter.
Die Bestimmung der wirksamen Menge einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung liegt im Ermessen eines ausgebildeten Mediziners. Bestimmte prophylaktische oder therapeutische Dosierungen und die zeitliche Koordinierung der Verabreichung können abhängig von den vorherrschenden Bedingungen ausgewählt werden, um eine akzeptable medizinische Behandlung zu erlangen. Der ausgebildete Mediziner wird solche Faktoren wie Alter, Geschlecht, Gewicht, Zustand des Patienten sowie den Verabreichungsweg in Betracht ziehen. Der ausgebildete Mediziner wird auch erkennen, dass die fibrinolytische Aktivität von MMPs durch Parallel-Verabreichung (zum Beispiel gleichzeitige Verabreichung oder hintereinander folgende Verabreichung) von anderen aktiven und/oder inerten Substanzen verstärkt werden kann. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, Zusatzstoffe mit thrombolytischer Aktivität zu verabreichen. Diese Mittel können eine direkte fibrinolytische Aktivität haben oder können im System, in dem sie angewendet werden, Regulatoren oder Modulatoren der Fibrinolyse sein. Beispielsweise umfassen Mittel mit thrombolytischer Aktivität Plasminogenaktivatoren, Hirudin, Enzyme (zum Beispiel Proteasen; die aus Schlangengift abgeleitet wurden), Enzyminhibitoren, Gerinnungshemmer (zum Beispiel Heparin, Aspirin), Antikörper (vorzugsweise monoklonale Antikörper) oder synthetische Peptide, die für den Blutplättchen-GPIIb-IIIa-Rezeptor spezifisch sind oder eine Mischung davon. Verschiedene solcher thrombolytischen Mittel sind in Collen (1996) beschrieben. Diese Mittel können zusammen mit oder zusätzlich zu der Anwendung einer MMP-enthaltenden Zusammensetzung verabreicht werden. Somit kann solch ein anderes Mittel oder können solche andere Mittel in die Metallproteinase-enthaltende Zusammensetzung eingeschlossen werden, oder kann oder können als Teil einer anderen Zusammensetzung verabreicht werden.
Bei einer anderen Ausführungsform umfasst die Erfindung zielgerichtete fibrinolytische Metallproteinasen, d. h. Metallproteinasen, die an Reste mit Spezifizität für ein biologisches Ziel-Molekül gebunden sind. Eine Metallproteinase kann beispielsweise an einen Antikörper, mit durch dem Fachmann bekannte Verfahren zum Anhängen von Proteinen an Antikörper, gebunden werden. Auf diese Weise kann eine Metallproteinase vorzugsweise an ein Fibrin(ogen)-Substrat zum Verbessern der fibrin(ogen)olytischen Wirksamkeit gelenkt werden. Somit kann eine fibrinolytische Metallproteinase, wie zum Beispiel MMP-3, mit Antikörpern, die Spezifizität für Fibrin oder ein Abbauprodukt davon aufweisen, mit Blutplättchen, speziell mit P-Selektin, mit oxidierten Lipoproteinen etc. verknüpft werden.
Die Erfindung stellt auch ein diagnostisches Verfahren zur Charakterisierung von Fibrinogen bereit. Bei diesem Verfahren wird Fibrinogen) mit einer endogenen Matrix-Metallproteinase, vorzugsweise MMP-3, kontaktiert, um Abbauprodukte zu erzeugen. Die Abbauprodukte werden dann analysiert, um die Arten und die Mengen der Spaltprodukte, die durch die Aktivität der MMP erzeugt wurden, zu bestimmen.
Typischerweise umfasst das Verfahren das differenzielle Abtrennen der Abbauprodukte, beispielsweise die Abtrennung der Produkte durch Gelelektrophorese. Die Produkte werden dann beispielsweise durch nichtspezifisches Färben gemessen, um die Mengen der Produkte verschiedener Größen zu erkennen. Die Produkte können alternativ durch Kontaktieren der Produkte mit Antikörpern, die spezifisch reaktiv sind mit oder spezifisch an eine Domäne oder mehrere Domänen des Fibrin(ogen)s binden, identifiziert werden (Kudryk et al. 1989a). Vorzugsweise sind solche Antikörper spezifisch gegenüber einem einzigen Abbauprodukt reaktiv, wodurch die Charakterisierung des Produkts im Verhältnis zu anderen Produkten ermöglicht wird.
Neue Antikörper, die gemäß dem diagnostischen Verfahren gemäß der Erfindung verwendbar sind, können entwickelt werden und mit jeder detektierbaren Markergruppe detektierbar markiert werden. Geeignete Markergruppen umfassen zum Beispiel Fluoreszenz-Marker, Enzym-Marker und radioaktive Marker. Detektorgruppen, die gemäß der Erfindung verwendbar sind, umfassen zum Beispiel Fluorescein als Fluoreszenz-Marker, Meerrettich-Peroxidase als Enzymmarker und Jod-125 (¹²⁵I) als radioaktiven Marker. Zusätzliche Fluoreszenz-Marker, die bei der Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Rhodamin, Phycoerythrin und zusätzliche Verbindungen, die Fluoreszenzenergie emittieren. Zusätzliche Enzymmarker, die bei dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Glucoseoxidase und alkalische Phosphatase. Zusätzliche radioaktive Marker, die bei dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Jod-131 (¹³¹I) und Indium-111 (¹¹¹In).
Geeignete detektierbare Marker können aus denen, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise radioaktive Marker, Enzyme, Teile eines spezifischen Bindungspaars, kolloidale Färbungssubstanzen, Fluorochrome, reduzierende Substanzen, Latexe, Digoxigenin, Metalle, Feststoffteilchen, Dansyl-Lysin, Antikörper, Protein A, Protein G, elektronendichte Materialien, Chromophoren oder dergleichen ausgewählt werden. Gewissermaßen kann jeder geeignete Marker, ob direkt oder indirekt detektierbar, verwendet werden. Ein Fachmann wird deutlich erkennen, dass diese oben dargelegten Marker lediglich die verschiedenen Marker, die bei dem diagnostischen Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden könnten veranschaulichen.
Die mit der Fibrinogenuntereinheit reaktiven Antikörper können auch durch Konjugation an Biotin derivatisiert werden und nach Zugabe von Avidinspezies, die durch Konjugation mit Fluoreszenzmarkern, Enzymmarkern, radioaktiven Markern, elektronendichten Markern, usw. bei einer Vielzahl von immunochemischen und immunohistologischen Anwendungen detektierbar gemacht sind, verwendet werden.
Alternativ kann das Verfahren gemäß der Erfindung unter Verwendung von Antikörpern, die an Substratmaterialien gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren angehängt oder gebunden wurden, durchgeführt werden. Solche Materialien sind allgemein im Wesentlichen fest und verhältnismäßig unlöslich, verleihen gegenüber physikalischer oder chemischer Zerstörung der Antikörper Stabilität und ermöglichen den Antikörpern, sich in bestimmten räumlichen Verteilungen anzuordnen. Für diese Substrat-Materialien können Materialien nach Wunsch des Fachmanns gewählt werden und umfassen Materialien wie Gele, Hydrogele, Harze, Kügelchen, Nitrocellulose, Nylonfilter, Mikrotiterplatten, Kulturflaschen, polymere Materialien und dergleichen ohne Beschränkung.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann immunologische Tests umfassen, um das Vorhandensein von Zerfallprodukten von Fibrinogen) in Gewebeproben von Menschen oder Tieren zu bestimmen. Biopsieproben und nekrotische Proben von Subjekten als auch Proben aus Gewebebibliotheken oder Blutbanken können auf Vorhandensein von MMP-Zerfallsfragmenten von Fibrinogen) unter Verwendung von Anti-Fibrinogen-Antikörper ausgewertet werden. Außerdem können geeignete Präparate für die in vivo-Verwendung erdacht werden, wie zum Beispiel zur Visualisierung von Fibrinogen oder Fibrinogen-enthaltenden Substanzen und Strukturen in einem lebenden Subjekt. Auf diese Weise kann das Fortschreiten der Fibrinolyse, die durch MMPs induziert wurde, in situ bewertet werden.
Bei einer solchen Ausführungsform ist eine endogene, fibrinolytische MMP, vorzugsweise MMP-3, an ein Substratmaterial, beispielsweise eine Membran, ein Blutsammelröhrchen, eine Mikrotiter-Platte, Kulturflasche oder dergleichen gebunden. Das Verfahren gemäß der Erfindung kann in dieser Weise bei Abwesenheit von löslicher MMP durchgeführt werden, um die Fibrin(ogen)olyse in einer flüssigen Probe zu induzieren. Dieser Ansatz ist alternativ bei Beschichtungsmembranen und prosthetischen Vorrichtungen verwendbar.
Tatsächlich stellt die Erfindung bei einer anderen Ausführungsform ein Verfahren zum Kontrollieren der Gerinnselbildung oder Plaquebildung, die durch ein Gerät mit medizinischem Bezug erzeugt oder induziert wurde, bereit. Bei dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kontaktieren eines Ge räts mit medizinischem Bezug mit einer Zusammensetzung, die eine fibrinolytische Matrix-Metallproteinase, vorzugsweise MMP-3, umfasst. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um eine Metallproteinase zum Binden oder Anhaften an eine Oberfläche zu veranlassen. Man geht davon aus, dass jedes Gerät, das mit Blut in Kontakt kommt, durch dem Fachmann bekannte Verfahren, die die Anlagerung von Proteinen an Substratmaterialien ermöglichen, so verändert werden kann. Beispielsweise kann das Verfahren verwendet werden, um die Blut-kontaktierenden Oberflächen von implantierbaren, prostethischen Vorrichtungen, wie zum Beispiel Kanülen, Katheter, Implantate, Stents, Filter, Spiralen, Ventile zu verändern, um Oberflächen, die die Bildung eines Thrombus hemmen, bereitzustellen. Alternativ ermöglicht das Verfahren die fibrinolytische Veränderung eines Gerätes, wie zum Beispiel Blutsammelröhrchen, Kulturflaschen, Testplatten, Pipetten, Reagenzbehälter, Schläuche, Membranen, um die Fibrinolyse zu fördern und die Bildung eines Thrombus, die andererseits die Experimentierprotokolle störend beeinflussen könnten, zu hemmen. Genauso stellt die Erfindung ein Gerät mit medizinischem Bezug bereit, wie zum Beispiel implantierbare Geräte, Laborgeräte oder andere Vorrichtungen für in vivo- und in vitro-Verwendungen, die die Fähigkeit zum Inhibieren der Thrombusbildung durch Fördern des Abbaus von Fibrinogen) besitzen. Die Metallproteinase kann entweder permanent oder reversibel an ein Gerät, wie z. B. zur Abgabe einer Metallproteinase von einem Gerät in die Lösung, angeheftet werden.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Verstärken der Regulation der Fibrinolyse in einem Subjekt mit Bedarf für eine solche Therapie bereit. Bei dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung das Induzieren einer verstärkten Regulation einer endogenen fibrinolytischen Matrix-Metallproteinase in einem Subjekt. Vorzugsweise umfasst das Verfahren das Erhöhen oder Erniedrigen der Aktivität oder Expression einer endogenen fibri nolytischen Matrix-Metallproteinase durch Behandeln des Subjekts mit einer somatischen Zell-Gentransfertherapie. Jeder Gentherapieansatz kann gemäß dieser Ausführungsform angewendet werden. Somit kann die Hochregulierung der MMP-Expression durch Einführen eines Gens für eine fibrinolytische MMP mit ex vivo- oder in vivo-Genübertragungstechniken durchgeführt werden. Die Hochregulierung einer MMP kann alternativ durch Hemmen der Expression eines MMP-Inhibitors durch „Antisense-Technologie" durchgeführt werden. Die Herunterregulierung der MMP-Aktivität kann durch diese Techniken durchgeführt werden, wobei deren Entwicklung und Durchführung im Können des Fachmanns liegt. Ein kurzer Überblick über verschiedene Gentherapieverfahren ist in Glick et al. (1994) bereitgestellt. Andere therapeutische Ansätze, die pharmazeutische Zusammensetzungen entweder zum Fördern oder Hemmen der Aktivität oder der Expression einer endogenen fibrinolytischen Matrix-Metallproteinase umfassen, können angewendet werden. In Anbetracht der Komplexität des fibrinolytischen Regulationssystems und in Anbetracht der unerwarteten Rolle der MMPs in diesem regulatorischem Schema weiss der Fachmann, dass viele mögliche Verfahrensweisen zum Anpassen des fibrinolytischen Regulationsstatus eines Subjekts vorliegen.
Die folgenden Beispiele beabsichtigen zu einem weiteren Verständnis der Erfindung beizutragen. Die besonderen Materialien und Bedingungen, die angewendet werden, sind dazu gedacht, die Erfindung weiter zu veranschaulichen und sind nicht auf deren annehmbaren Umfang beschränkt.
In den folgenden Beispielen beschreiben wir unsere Experimente, die die Rolle, die MMPs, insbesondere MMP-3, beim Abbau von Fibrinogen (Fg) und vernetztem Fibrin (XL-Fb) spielen, aufgezeigt haben. Wir haben die folgenden Aspekte untersucht: 1) Abbau von Fg; 2) Wirkung des MMPs-Verdaus von Fg auf seine nachfolgende Gerinnungsfähigkeit mit Thrombin; 3) Lyse von XL-Fb und gereinigtem D-Dimer-Fragment (DD); 4) NH₂-terminale-Analysen der Kettenfragmente von ausgewählten Verdau-Ansätzen; 5) Reaktivität der gespaltenen Fragmente mit einer Anzahl von spezifischen monoklonalen Antikörpern. Wir zeigen die Fähigkeit von MMP-3, Fg abzubauen und XL-Fb-Gerinnsel zu lysieren. Basierend auf dieser Arbeit schließen wir, dass sowohl die Matrix-Metallproteinase-1 (MMP-1) als auch die Matrix-Metallproteinase-2 (MMP-2) Fg teilweise abbauen kann, und dass MMP-2 eine beschränkte Kapazität zum Abbau von XL-Fb aufweist. Wir haben auch bestimmt, dass in XL-Fb die αGly404-Ala405-Bindung eine Hauptspaltungsstelle von MMP-3 ist, was zur Bildung eines D-artigen Monomer-Fragments führt. Das lässt einen spezifischen Mechanismus des Fibrinabbaus, der anders als der von Plasmin ist, durch ein endogenes Enzym erkennen.
Die folgenden experimentellen Verfahren sind für die unten erwähnten Beispiele 1 bis 9 von Bedeutung:
Proteine und andere Reagenzien. Plasminogenfreies und fibronektinfreies Fg (Fg ≥ 95% gerinnungsfähig) oder lyophylisiertes menschliches Fg wurden käuflich erworben (American Diagnostica Inc. Greenwich, CT). Plasminogen und Fibronektin wurden durch Affinitätschromatographie mit einer Lysin-Sepharose und Gelatin-Sepharose entfernt, im Wesentlichen wie von anderen beschrieben (Deutsch et al. 1970; Engvall et al. 1977; Procyk et al. 1985). Die Menge von Faktor XIII bei diesen Aufbereitungen beträgt gemäß Herstellerangaben 0,1–0,2 Loewy-Einheiten/mg von Fg. Stammlösungen von Fg (12 mg/ml in TNE-Puffer (0,05 M Tris-HCl (pH 7,4), der 0,1 M NaCl, 0,001 M EDTA und 100 KIU/ml Aprotinin enthält)) wurden bei –70°C bis zur Verwendung aufbewahrt. Die Fg-Konzentration wurde spektrophotometrisch in alkalischem Harn stoff, unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten (1%, 1 cm) = 16,5 bei 282 nm, gemessen. Menschliches Glu-Plasminogen (1 U/0,5 mg) wurde von Imco (Stockholm, Schweden) bezogen. Streptokinase (4.500 u/mg Feststoff), Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V, RIA-Qualität), 4-Aminophenylquecksilberacetat (APMA) und EDTA wurden von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) bezogen. Aprotinin wurde von Mobay Chemical Corp (New York, NY) bezogen. Menschliches α-Thrombin (2.300 U/mg) war eine freundliche Überlassung von Dr. J. Fenton. ¹²⁵I-Fg, das durch das iodogene Verfahren markiert wurde (spezifische Aktivität 1,5 × 10⁶ cpm/μg Protein) war eine freundliche Überlassung von Drs. M. Nag und D. Banerjee, Laboratory of Membrane Biochemistry II, The New York Blood Center. Pro-MMP-1, pro-MMP-2, und pro-MMP-3 wurden, wie vorher von anderen (Okada et al. 1986; Okada et al. 1990; Suzuki et al. 1990) beschrieben, gereinigt. Alle anderen Reagenzien waren von analytischer Reinheit und wurden bei Fisher Scientific (Springfield, NJ) gekauft.
Gelelektrophorese/Immuno-Blotting. Proben von Fg und XL-Fb, die mit Plasmin oder MMPs abgebaut waren, wurden einer SDS-PAGE unter Verwendung von sowohl reduzierenden als auch nicht-reduzierenden Bedingungen unterworfen. Reduzierte Proben wurden in 62,5 mM Tris-Puffer, pH 6,8, der 4 SDS, 8 M Harnstoff, 5% DTT, 10% Glycerin und 1% Bromphenolblau enthielt, hergestellt. Nicht-reduzierte Proben wurden in dem gleichen Puffer ohne DTT hergestellt. Die SDS-PAGE wurde unter Verwendung eines 5–15%-igen Gradienten oder 12,5% Polyacrylamid-Gelen in Tris-Glycerin-Puffer (Laemmli 1970) oder mit 5% und 7,5%-Mini-Gelen in Phospatpufter (McDonagh et al. 1972) nach allgemeinen Verfahren durchgeführt. Die verwendeten, vorgefärbten Molekulargewichtsstandards waren Myosin (200 kDa), Phosphorylase B (97,4 kDa), BSA (68 kDa), Ovalbumin (43 kDa), α-Chymotrypsinogen (25,7 kDa), β-Lactoglobulin (18,4 kDa) und Lysozym (14,3 kDa) (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD). Der Transfer auf Nitrocellulose-Membranen für Immunoblot-Analysen wurde, wie von Towbin et al. (1979) beschrieben, mit einigen Veränderungen (Kudryk et al. 1989b) durchgeführt. Bei einigen Experimenten wurden Membranen mit Kolloidal-Gold vor dem Immunoblotting gefärbt (Colloidal Gold Total Protein Stain, BioRad, Hercules, CA). Die Membranen wurden mit 5% trockener Milch (Carnation, Nestle, Glendale, CA) oder mit 5 BSA geblockt, über Nacht mit ausgewählten Erst-Antikörpern inkubiert (Tabelle I) und dann mit einem Zweit-Antikörper versetzt. Kaninchen-Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase (RAM-HRPO) wurde wie durch Goding (1986) beschrieben unter Verwenden von RAM, das von Dako (Carpinteria, CA) gekauft wurde und HRPO (Typ VI), das von Sigma gekauft wurde, hergestellt. Gebundene Peroxidase-Komplexe wurden unter Verwenden des Chemilumineszenz-Substrates Luminol (ECL Western blotting detection system, Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) detektiert. Das von der Hydrolyse des zugesetzten Luminol-Substrats abgegebene Licht belichtete den bereitgestellten Film (Kodak χ-Omat RP, Eastman Kodak Company, Rochester, NY) in 10 bis 30 Sekunden.
Beispiel 1
Abbau von Fibrinogen. Ein Experiment wurde durchgeführt, um zu bewerten, ob MMPs fibrin(ogen)olytische Aktivität besitzen. Fibrinogen (Fg) (120 μg, 3,5 μM) wurde mit MMP-2 oder MMP-3 (6 μg/ml oder 1 : 20 E : S-Verhältnis) bei 37°C für verschiedene Zeitintervalle inkubiert. ProMMP-2 und proMMP-3 (in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Brij 35, 0,05% NaN₃) wurden mit 1 mM APMA bei 37°C für jeweils 45 Minuten und 24 Stunden vor der Zugabe zu den Fg-Lösungen aktiviert. Alle Reaktionen wurden in der Gegenwart von 10 mM CaCl₂ bei 37°C durchgeführt. Die Verdau-Ansätze wurden durch Zugabe von EDTA (25 mM Endkonzentration) beendet. Die Reaktionsprodukte wurden mit reduzierendem oder nicht-reduzierendem Puffer gemischt und wurden einer SDS-PAGE-Trennung (12,5%) unterworfen. Die Gele wurden auf Proteine mit Coomassie-blau gefärbt.
1 zeigt den zeitabhängigen Verdau von Fibrinogen durch MMP-2 und NEAP-3, im Vergleich zu nicht-verdautem Fibrinogen. Die Enzyme wurden bei E : S = 1 : 20 (Gew./Gew.) verwendet und die Inkubation betrug 1, 2, 4 und 24 Stunden. Die Legende zu 1 lautet folgendermaßen:
Aus 1 ist deutlich, dass unter Verwendung von MMP-2 und MMP-3 in vergleichbaren Mengen (6 μg/120 μg Fg) sowohl die Aα- als auch die Bβ-Ketten von Fg in einer Stunde (Bahnen 2 und 6) umfassend abgebaut wurden. Eine längere Inkubation (24 Stunden) führte zur weiteren Spaltung von beiden Ketten (Bahnen 5 und 9). Der Abbau von Fg-γ-Ketten mit MMP-3 war nach 24 Stunden umfassend (8, Bahn 9) und anders als mit MMP-2 (Bahn 5).
Deutlicher Abbau mit MMP-2 und MMP-3 wurde auch bei geringerer Konzentration an Enzym erhalten (0,2–0,6 μg/120 μg Fg, Daten nicht gezeigt). MMP-1 wurde auch unter Verwendung dieses Protokolls getestet und zeigte bei der höchsten Konzentration (6 μg/120 μg Fg) offensichtlich intakte Bβ- und γ-Ketten und nur teilweisen Abbau der Aα-Ketten (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 2
Gerinnungsfähigkeit von mit MMP-3 abgebautem Fibrinogen. Verdauan sätze (1,5 und 3 Stunden) von Fibrinogen mit MMP-2 und MMP-3 wurden wie oben beschrieben hergestellt. Ein Plasmin-Verdau von Fg (18–20 Stunden) (Gårdlund et al. 1972) wurde als Kontrolle verwendet. Intaktes Fg und Fg-Verdauansätze wurden mit Thrombin wie in Bini et al. (1994) beschrieben zum Gerinnen gebracht. Kurz gesagt, wurden 1,2 mg Fg/ml oder jede der obigen MMP-2- und MMP-3-Verdauansätze von Fibrinogen mit Thrombin (0,4 NIH U/ml) in Gegenwart von 20 mM CaCl₂ zum Gerinnen gebracht. Die Gerinnungszeit wurde als Zunahme an Trübung bestimmt und wurde bei 350 nm (Blombäck et al. 1982) abgelesen. Die Gerinnungsfähigkeit wurde aus einer Auftragung von Trübung gegenüber der Zeit bestimmt. Eine Tangente wurde an der steilsten Stelle der Kurve angelegt; deren Schnittpunkt mit der Zeitachse wurde als Gerinnungszeit (Blombäck et al. 1994) definiert. Die Gele wurden in allen Fällen ohne jede beobachtete Präzipitation hergestellt. Die Gerinnsel-Überstände wurden über eine HPLC (Kudryk et al. 1989b) laufen gelassen, um die Freisetzung von Fibrinopeptiden A (FPA) und B (FPB) zu bestimmen. Diese Ergebnisse wurden in Tabelle I unten tabelliert:
Tabelle I
Fg, das mit MMP-2 (1,5 und 3 Stunden) verdaut wurde, gerann nicht innerhalb von 10 Minuten (willkürlich als maximale Zeit gewählt), war aber noch fähig, ein Fibringel nach einer Inkubation über Nacht mit Thrombin zu bilden, wie durch die Trübungsdaten (Tabelle I) gezeigt. Im Gegensatz dazu waren sowohl die MMP-3- als auch die Plasminverdauansätze bei vergleichbarer Zeit und Konzentration sogar nach einer Übernacht-Inkubation nicht gerinnbar. Die Trübungsdaten ließen erkennen, dass eine Gelbildung nur bei den Reaktionsmischungen von Fg, die mit MMP-2 und bei der niedrigsten Plasmin-Konzentration verdaut wurden, erhalten wurde. Die Trübungswerte der gleichen Ansätze, die am nächsten Tag gemessen wurden, zeigten außerdem, dass die Reaktionsmischungen von Fg und MMP-2 ähnlich der Kontrolle waren, während die Fg-Verdauansätze, die durch MMP-3 oder Plasmin hergestellt wurden, eine niedrige oder keine Trübung aufwiesen (Tabelle I). Die HPLC Profile der Überstände von allen Verdauansätzen zeigten normale Freisetzung von Fibrinopeptiden A und B mit Thrombin (nicht gezeigt).
Beispiel 3
Abbau von vernetztem Fibrin. Fibringerinnsel wurden aus gereinigtem Fibrinogen gemäß dem Verfahren von Bini et al. (1994) und den darin zitierten Referenzen hergestellt. Radiomarkierte Gerinnsel wurden mit 0,1 ml gereinigtem Fg (1,2 mg/ml in TNE-Puffer), das ¹²⁵I-Fg (20,000 cpm) enthielt, in Gegenwart von 20 mM CaCl₂ hergestellt. Thrombin (1,5 NIH U/ml, Endkonzentration) wurde zugegeben, und die Proben wurden bei 37°C für 18–20 Stunden (Bini et al. 1994) inkubiert. Aktives MMP-1, MMP-2 oder MMP-3 wurde in verschiedenen Mengen (2–60 μg/ml, entsprechend einem 1 : 600–1 : 20 E : S-Verhältnis) in Gegenwart von 10 mM CaCl₂ zugegeben. Plasmin wurde durch Zugeben von Plasminogen (50 μg/ml) und Streptokinase (1080 U/ml) zu den Fibringerinnseln (etwa 0,02–0,5 U/ml Plasmin, Endkonzentration, entsprechend 1 : 1200–1 : 48 E : S) hergestellt. Die Gerinnsel wurden vorsichtig von der Wand des Probenröhrchens mit einem Holzstäbchen entfernt und der Inhalt nach Zugabe von jedem Enzym schwach verwirbelt. Die Inkubationszeiten waren 1–48 Stunden beim 37°C. Die Verdauansätze mit MMPs wurden durch Zugabe von EDTA (25 mM Endkonzentration) beendet, und jene mit Plasmin wurden mit 5000 KIU/ml Aprotinin beendet. Die Gerinnsel wurden von den Überständen durch Zentrifugieren bei 13000 upm für 20 Minuten in einer Sorvall RCL-B (SS-34 Rotor) abgetrennt. Die Fibrinolyse wurde sowohl durch Freisetzen der Radioaktivität in den Überstand (A) als auch durch die rückständige Radioaktivität in jedem Gerinnsel (B) gemessen. Die Proben wurden in einem Packard Auto-γ-5000 Serie Gamma-Zähler gezählt. Kontroll-Fibrin-Gerinnsel, mit und ohne Verdau mit den verschiedenen Enzymen, wurden gleichzeitig hergestellt, um sie für eine SDS-PAGE zu verwenden. Die Daten zeigen Mittelwerte von 2–4 getrennten Experimenten.
Die Ergebnisse dieses Experiments werden in 2A und 2B, die die prozentuale Radioaktivität in den Überständen (2A) und in den Gerinnselrückständen (2B) zeigen, dargestellt. Wie gezeigt, zeigten sowohl die MMP-3-Proben (6 μg/120 μg Fg) als auch die Plasminproben (0,02 IU/ml) nach 24 Stunden Inkubation eine Freisetzung von mehr als 80% der Radioaktivität in die Überstände (Mittelwert von drei Experimenten) (2A). Die Radioaktivitätsrückstand in den Gerinnseln war nach 24 Stunden bei weniger als 10% (2B) und die Gerinnsel wurden sowohl von MMP-3 als auch von Plasmin aufgelöst. Vergleiche 2A und 2B. Die Konzentration von Plasmin, das bei den Lyse-Experimenten verwendet wurde, wurde auf der Basis, eine langsame Lyse zu erhalten (Liu et al. 1986), ausgewählt. In Vorexperimenten wurde in den Überständen unter Verwendung von Plasmin bei 1 : 240 und 1 : 1200 (E : S, Gew./Gew.), welches während der ganzen Untersuchung verwendet wurde, eine ähnliche Freisetzung an Radioaktivität gemessen. Der Abbau mit MMP-2 war bei der höchsten Konzentration bei 24 Stunden ähnlich dem, der mit MMP-3 bei 1 : 200 erhalten wurde. Der Abbau mit MMP-1 war bei der höchsten Konzentration nach 48 Stunden ähnlich dem, der mit MMP-3 bei 1 : 1200 erhalten wurde. Die Kontrollen ohne Zugabe von Enzym sowie ein Plasmin-Verdau von XL-Fb sind auch gezeigt.
Die Inkubation mit einer Mischung von MMP-3 und Plasmin in der gleichen Probe erzeugte Ergebnisse ähnlich denen, die durch jedes Enzym allein produziert worden sind (Daten nicht gezeigt). Dies zeigt, dass sich die beiden Enzyme nicht gegenseitig beeinflussen. Identische Experimente wurden unter Verwendung von Gerinnseln, die aus Plasma hergestellt waren, durchgeführt, und es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 4
Kettenzusammensetzung von durch MMPs und Plasmin abgebauten XL-Fb. Der Verdau von vernetztem Fibrin durch Plasmin, MMP-2 und MMP-3 wurde analysiert. Die Proben des Fibrinabbaus durch jedes der Enzyme wurden reduziert und einer SDS-PAGE (5–15% Gradient) (Laemmli et al. 1973; McDonagh et al. 1972) unterworfen. Nach der Elektrophorese wurden die wieder gewonnenen Proteine auf Nitrocellulose überführt. Das Protein wurde mit Colloidal-Gold auf der Nitrocellulosemembran gefärbt. Die Muster des Dosisabhängigen und Zeit-abhängigen Abbaus von Fibrinogen und Fibrin durch MMP-2, MMP-3 und Plasmin sind in 3 gezeigt.
Die Legende zu 3 lautet folgendermaßen:
3 zeigt den Plasmin-Abbau der vernetzten Fibrin-γ-Dimerkette (94 kDa) zur DD-γ-Dimerkette (76 kDa) bei einem höheren E : S-Verhältnis (Bahnen 1 und 2). Es wurde kein Abbau des vernetzten Fibrin-γ-Dimers mit MMP-2 beim höchsten E : S (1 : 20) (Bahn 4) beobachtet. Ein deutlicher Abbau der γ-Kette wurde mit MMP-3 (E : S = 1 : 20) bei 24 Stunden (Bahn 7) erhalten und ein vollständiger Abbau wurde durch Erhöhen von E : S um das Zweifache (Bahn 8) erhalten. Das Abbaumuster der vernetzten Fibrin-γ-Dimerkette durch MMP-3 ist anders als das, das mit Plasmin erhalten wurde. Tatsächlich erniedrigt Plasmin das Molekulargewicht des γ-Dimers, aber monomerisiert es (Bahnen 1, 2) sogar bei einem höheren E : S-Verhältnis (1 : 240) nicht.
Die XL-Fb-Gerinnsel wurden schrittweise durch MMP-3 abgebaut und führten bei 24 Stunden zu einer nahezu kompletten Lyse. Die Abbaumenge mit MMP-3 (1 : 20) bei 24 Stunden war mit der, die durch Plasmin (1 : 1200) hergestellt wurde, vergleichbar. Daher ist MMP-3 ein langsameres fibrinolytisches Enzym als Plasmin. Die Gerinnsel-Auflösungsraten mit MMP-1 und MMP-2 waren viel langsamer: beim gleichen E : S-Verhältnis (1 : 20) waren nach 24 Stunden nur 34% bzw. 58% gelöst, während mit MMP-3 84% abgebaut waren. Bei Verdauansätzen mit MMP-3 und Plasmin war der Gerinnselradioaktivitätsrückstand ≤ 10%. Diese Ergebnisse zeigten, dass der Verdau von XL-Fb mit MMP-3 weiter fortgeschritten war, möglicherweise mit einem anderen oder mehr spezifischen Mechanismus als der, der entweder mit MMP-1 oder MMP-2 erhalten wurde. Die schwächere Aktivität von MMP-2 könnte jedoch in der schnellen Autolyse des Enzyms nach der Aktivierung mit APMA (Okada et al. 1990) begründet sein.
Beispiel 5
MMP-3 induzierte Spaltung der vernetzten Domäne der γ-Kette. Immunoblots, die mit Standardverfahren hergestellt wurden, wurden mit Plasmin- und Metallproteinase-Verdauansätzen von Fibrin mit einer Gruppe von monoklonalen Antikörpern (MoAbs) (vergleiche Tabelle II) durchgeführt, um zu identifizieren, wie die drei Fibrinketten durch MMP-3 im Vergleich mit Plasmin gespalten werden. Die monoklonalen Antikörper wurden gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren hergestellt.
Tabelle II
Die Proben wurden entweder mit oder ohne Enzym für 24 oder 48 Stunden inkubiert. Die inkubierten Proben wurden dann einer SDS-PAGE (7%-ige Gele) unter reduzierenden Bedingungen unterworfen. Nach der Elektrophorese wurden die Proben auf Nitrocellulosemembranen überführt und die Membranen wurden mit ausgewählten Antikörpern geblottet. Spezifische Antikörperbindende Fibrin(ogen)ketten wurden unter Verwendung von RAM-HRPO und dem chemiluminiszenten Substrat wie oben beschrieben detektiert. Die Ergebnisse sind in den 4–5 gezeigt.
4A zeigt Immunoblots der Abbauprodukte des Fibrinverdaus durch MMP-3 und Plasmin mit MoAb/4-2. Dieser Antikörper ist für ein Epitop in der γ- Kette: γ392-406 spezifisch. Dieser Antikörper reagiert mit Fibrinogen und den D- und D-Dimer-Fragmenten nur nach Denaturierung.
Vernetztes Fibrin und Fibrinogen wurden jeweils ohne Enzym bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Ebenso wurde XL-Fb mit Plasmin (24 Stunden) und mit MMP-3 (24 Stunden und 48 Stunden) inkubiert. Die Verdauansätze wurden unter reduzierenden Bedingungen untersucht. Die Legende zu 4A lautet folgendermaßen:
Wie in 4A gezeigt, reagierte MoAb/4-2 (anti-γ392-406) sowohl mit dem unverdauten XL-Fb-γ-Dimer (94 kDa, Bahn 1) als auch mit der unverdauten Fg-γ-Kette (47 kDa, Bahn 2). Der γ-Kettenmonomerrückstand im vernetzten Fibrinansatz reagierte auch mit MoAb/4-2 (Bahn 1). Im Plasminverdau von XL-Fb reagierten auch das DD-γ-Dimer (76 kDa) und D-γ-Kettenmonomer-Fragment (das bekannterweise aus sowohl dem Fg als auch den XL-Fb-Plasminverdauansätzen herrührt (Siebenlist et al. 1992)) in gleicher Weise mit MoAb/4-2 (Bahn 3). Ein 24-stündiger Verdau von XL-Fb, der mit MMP-3 erzeugt wurde, zeigte verringerte DD-γ-Dimerketten in den Gerinnselrückständen, aber signifikante Mengen von D-Monomer-artigen γ-Ketten-Fragment (36 kDa, Bahn 4). Eine längere Inkubation (48 Stunden) zeigte nur D-Monomer-artiges γ-Ketten-Fragment in dem gesamten Verdau. Verdauansätze mit beiden Enzymen binden MoAb/4-2.
Vernetztes Fibrin wurde auch durch Immunoblotting mit MoAb/4A5, der spezifisch für die γ-Kette bei γ397-411 ist, welches ein Epitop, das dem das mit MoAb/4-2 reaktiv ist, ähnlich ist, untersucht. Als Maßstab wurden XL-Fb-Gerinnsel ohne Enzym bei 37°C für 48 Stunden inkubiert. XL-Fb wurde ebenso mit MMP-3 oder Plasmin für 24 Stunden inkubiert. Die Ergebnisse dieses Immunoblots sind in 4B gezeigt. Die Legende zu 4B lautet folgendermaßen:
Wie in 4B ersichtlich, zeigte MoAb/4A5 (anti-γ397-411) nur mit der γ-Dimer-Bande von sowohl dem intakten als auch dem Plasmin-verdauten XL-Fb (Bahnen 1, 5) und mit dem restlichen DD-γ-Dimer aus den Verdauzusätzen, die mit MMP-3 (Bahnen 2, 4) erzeugt worden sind, Reaktivität. Das D-monomerartige γ-Ketten- Fragment (36 kDa), das mit MoAb/4-2 voll reaktiv ist (4A, Bahnen 4, 5), band nicht an MoAb/4A5 (4B, Bahnen 2, 4). Die Immunoblotanalyse der gleichen Proben unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigte einen ähnlichen Verlust an Immunoreaktivität mit MoAb/4A5 (Daten nicht gezeigt).
Diese Experimente zeigen, dass das Muster des XL-Fb-Abbaus mit MMP-3 unterschiedlich zu dem ist, das mit Plasmin erhalten wurde. Bei Verdauansätzen mit MMP-3 (1 : 20) blieben nur sehr kleine Mengen des γ-Dimers zurück. Bei höheren Pegeln desgleichen Enzyms können keine Dimere detektiert werden. MMP-2 scheint den Abbau des γ-Dimers im Wesentlichen nicht zu beeinflussen. Zwei monoklonale Antikörper, MoAb/4-2 und MoAb/4A5, die mit verschiedenen Epitopen bei der Sequenz γ392-411 reaktiv sind, wurden verwendet, um die Spaltungsbereiche von XL-Fb durch MMP-3 im Vergleich zu Plasmin zu definieren. Dieses Segment der Kette enthält die Reste (γGln398 und γLys406), die beim kovalenten Vernetzen (Bilden der ε-(γ-Glu)-Lys-Isopeptidbindungen) zu Nachbarmolekülen teilnehmen, was zur Stabilisierung von Fibrin unter Mitwirkung von Faktor XIIIa (Chen et al. 1971) führt. MoAb/4A5 erkennt ein Epitop im COOH-terminalen Bereich dieses Peptids (γ397-411), während MoAb/4-2 mit seinem NH₂-terminalen Ende reagiert (γ392-406). Beide Antikörper binden an Mikrotiterplatten, die mit den Plasmin-abgeleiteten Verdauprodukten Fragmente-D und Fragmente-DD beschichtet sind. Nur Mo-Ab/4A5 konkurriert mit solchen Fragmenten, wenn jedes in Lösung ist (Kudryk et al. 1991). Bei einem 24-stündigen MMP-3-Verdau von XL-Fb waren sowohl die restliche DD-γ-Dimerkette als auch das D-monomerartige γ-Ketten- Fragment mit MoAb/4-2 reaktiv. Ein längerer Verdau (48 Stunden) führte nur zu dem D-monomer-artigen γ-Ketten-Fragment, das immer noch mit MoAb/4-2 reaktiv war. Analyse von diesen gleichen Verdauansätzen mit MoAb/4A5 (Anti-γ397-411) zeigte, dass nur die DD-γ-Dmer-Bande reaktiv ist. Das D-monomerartige γ-Ketten- Fragment band nicht an MoAb/4A5. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Hauptspaltungsstelle von MMP-3 innerhalb der γ-Kette-vernetzenden Domäne liegt, was zum Abbau des γ-Dimers führt. Gereinigtes Fragment-DD wurde auch mit MMP-3 zu einem D-monomerartigen Fragment gespalten.
Der Immunoblot der Abbauprodukte des Fibrinverdaus durch MMP-3 und Plasmin wurde auch unter Verwenden von MoAb/T2G1 und MoAb/1D4 unter reduzierenden Bedingungen, wie in 5 gezeigt, durchgeführt. Das experimentelle Protokoll war wie oben für die anderen Antikörper beschrieben. Die Legende zu 5 lautet folgendermaßen:
Wie in 5 gezeigt, wurden die Bahnen 1–3 mit MoAb/T2G1 geblottet, während die Bahnen 4–7 mit MoAb/1D4 geblottet wurden.
MoAb/T2G1 ist für Bβ15-42 spezifisch, aber nur für Fibrin II, nicht für Fibrinogen/Fibrin I. MoAb/1D4 ist für Aα349-406 in Fibrinogen und Fibrin sowie in dessen Plasminverdauansätzen spezifisch. Wie in 5 gezeigt, ging die Immunoreaktivität von MoAb/T2G1 in den Verdauansätzen von Fibrin durch MMP-3 sowohl bei niedrigerer Konzentration (1 : 200) als auch bei höherer Konzentration (1 : 20) (Bahnen 4, 5) verloren, während sie im intakten Fibrin (Bahn 6) vorhanden ist. Die Immunoreaktivität von MoAb/1D4 ist noch teilweise in dem Fibrinverdau bei niedrigerer Konzentration von MMP-3 (Bahn 1) erhalten, aber sie ist vollkommen in den Verdauansätzen bei höherer Konzentration von MMP-3 sowohl bei 24 Stunden (Bahn 2) als auch bei 48 Stunden (nicht gezeigt) vollkommen verloren, während sie in der Kontrollprobe (Bahn 3) deutlich vorliegt.
Die MMP-3-Abbauprodukte von XL-Fb wurden jeweils mit MoAbs, T2G1 (anti-Bβ15-42) und 1D4 (anti-Aα349-406) untersucht. Beide Epitope sind in XL-Fb vorhanden. Bei den Plasminverdauansätzen von XL-Fb reagieren viele verschiedene Größenbanden (≥ 20 kDa) mit MoAb/1D4, während die gesamte MoAb/T2G1 Reaktivität verloren ging. Sogar verhältnismäßig niedrige Konzentrationen von MMP-3 (1 : 200) führten zu Verdauansätzen, die mit diesen Antikörpern beim Immunoblotting nicht reagierten. Dieses Ergebnis bedeutet, dass Aα349-406 durch MMP-3 vom Fibrin abgespalten wurde. Es konnte keine Immunoreaktivität mit MoAb/1D4 in MMP-3-Verdauansätzen von XL-Fb durch „Konkurrenz-ELISA" entdeckt werden. Dieser Antikörper reagiert identisch mit Aα349-406 und Hi2-DSK (Aα349-406) vor und nach dem vollständigen Verdau mit Trypsin.
Beispiel 6
Verdau des Fragment-D-Dimers (DD) durch MMP-3. Die Experimente wurden durchgeführt, um zu sehen, ob MMP-3 das gereinigte D-Dimer (DD) in D-Monomer spaltet. Das gereinigte Fragment-D und D-Dimer wurden bei 37°C für 4 und 24 Stunden mit niedriger (1 : 20) und hoher (1 : 200) Konzentration von MMP-3 inkubiert. Die Reaktionen wurden mit 25 mM EDTA beendet. Die Ver dauansätze wurden auf einer PAGE (7% Phosphat) aufgetrennt. Die Proben wurden auf Nitrocellulose-Membranen überführt und mit Coomassie-blau gefärbt. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Die Proben ließ man unter nicht-reduzierenden (6A) und reduzierenden (6B) Bedingungen laufen. Die Legende zu 6A und 6B lautet folgendermaßen:
Wie in 6A und 6B gezeigt, findet fortschreitender (Zeitabhängiger) Abbau von D-Dimer (186 kDa) in D-Monomer-artiges Fragment (Bahnen 4, 5) statt. Die Größe des entstandenen Monomers war etwas größer als das Fragment-D (93 kDa), das durch den Plasminabbau von Fg (Bahn 1) erhalten wurde. Da dieses Gel zwei Monate nach der Herstellung dieser Proben gemacht wurde, zeigt dies, dass die Reaktion wirksam gestoppt wurde und nicht weiter fortgeschritten ist. Die Ergebnisse zeigen, dass die Monomerisierung sogar nach 4 Stunden mit der niedrigeren Menge an Enzym (1 : 200) (Bahn 3) auftritt. Ein Erhöhen der Enzymmenge um das 10-fache erhöht die Monomerisierung nach 4 Stunden (Bahn 4) und konvertiert fast vollständig das Substrat nach 24 Stunden (Bahn 5). Dies wird in 6B, die die Konversion des γ-Dimers (78 kDa) zu der γ-Monomer-artigen Kette (38 kDa) zeigt, untermauert.
Beispiel 7
Analyse der MMP-Verdau-Produkte durch ELISA. ELISA-Bindungstests wurden unter Verwenden allgemein anerkannter Verfahren durchgeführt. Die Polyvinylmikrotiterplatten wurden mit geeigneten Verdünnungen von verschiedenen Verdauansätzen beschichtet und wurden auf Antikörper-Bindung getestet (Kudryk et al. 1984). Gemäß den Ergebnissen, die in 4 gezeigt sind, banden die Verdauansätze mit zunehmenden Konzentrationen von MMP-3 MoAb/4A5 (Anti-γ397-411) nicht. Das bedeutet, dass die Fibrinogenspaltungsstelle von MMP-3 im Bereich dieses Epitops ist (die Fibrinvernetzungen treten in der Region γGly397-Lys406 auf). Diese Spaltungsart tritt nicht bei Plasmin auf. Die Verdauansätze sind jedoch mit MoAb/4-2 (γ349-406) reaktiv. Es konnte keine Immunoreaktivität mit MoAb/1D4 in MMP-3-Verdauansätzen von XL-Fb durch Konkurrenz-ELISA detektiert werden, was nahelegt, dass das 1D4-reaktive Epitop in solchen Verdauansätzen zerstört wurde. MoAb/1D4 bindet in der gleichen Weise an die Plasmin-Verdauansätzen von Fg und XL-Fb.
Somit zeigte der ELISA (direktes Binden), der mit Verdauansätzen von Fg und XL-Fb mit MMP-3 durchgeführt worden ist, dass das lineare Sequenz-Epitop γ392-406 (MoAb/4-2 reaktiv), aber nicht γ397-411 (MoAb/4A5 reaktiv) mit diesem Verfahren detektiert werden konnte. Dies bestätigte die Ergebnisse, die mit Immunoblotting erhalten wurden und legte ferner nahe, dass MMP-3 innerhalb der Sequenz γ397-411 spaltet. Die NH₂-terminale Sequenzanalyse des Dipeptids (isoliert mit CNBr-Abbau von XL-Fibrin, das mit MMP-3 verdaut wurde) zeigte, dass γAla405 der erste Rest der zweiten Sequenz ist (siehe Beispiele 8–9 unten). Wir vermerken, dass MoAb/4-2 auch ein synthetisches Pep tid, dessen Sequenz der von γ392-400 entspricht, bindet. MoAb/4A5 reagiert mit synthetischen Peptiden, die γ392-411 und γ397-411 entsprechen, was verloren geht, wenn eines der Peptide mit Trypsin bei γLys406-Gln407 gespalten wird. Dieses Merkmal stimmt mit dem beobachteten Fehlen an Reaktivität von MoAb/4A5 mit dem Dipeptid überein.
Beispiel 8
Größen- und Sequenzanalyse der Ketten von MMP-3-verdautem Fg und XL-Fb. Fg und XL-Fb, die mit MMP-3 verdaut waren, wurden unter reduzierenden Bedingungen auf einer 12,5%-igen SDS-PAGE (Laemmli 1970) getrennt und auf eine Polyvinyliden-Difluorid-Membran (PVDF) „elektrogeblottet" (Matsudaira 1987). Der Anteil der Membran, die das γ-Kettenfragment enthielt, wurde abgetrennt und einem automatischen Sequenzieren auf einem 477A Applied Biosystems Inc., das mit einem Flüssigphasensequenzer mit einem Modell 120A „on-line" Phenylthiohydantoin (PTH)-Aminosäurenbestimmer gepulst wird, unterworfen.
Die Verdauansätze von sowohl Fg als auch XL-Fb brachten eine γ-Kettensequenz Leu-Lys-Ser-Arg-Lys (SEQ ID NO: 1) hervor, was zeigt, dass MMP-3 sowohl Fg als auch XL-Fb an der γThr83-Leu84-Bindung spaltet. Die gleiche Bande aus dem XL-Fb Verdau ergab jedoch eine zweite γ-Ketten-Sequenz Ala-X-Gln-Ala-Gly-Asp (SEQ ID NO: 2), was MMP-3-induzierte Hydrolyse bei der γGly404-Ala405-Bindung in der γ-Ketten-Vernetzungsregion anzeigt.
Beispiel 9
Charakterisierung eines CNBr-abgeleiteten γ-Ketten-Fragments aus den MMP-3-Verdauansäfzen von XL-Fb. Um die Ergebnisse abzusichern, die vom Sequenzieren der γ-Kette von XL-Fb, das mit MMP-3 abgebaut worden ist, erhalten wurden, wurde der gleiche Verdau mit CNBr (Blomback et al. 1968) behandelt und das Fragment, das mit MoAb/4-2 (anti-γ392-406) reaktiv ist, wie folgt isoliert. Die von MMP-3 gespaltenen Fragmente wurden durch HPLC mit umgekehrten Phasen unter Verwenden einer Vydac C-4-Säule (1,0 × 25 cm, The Sep/a/ra/tions Group, Hesperia, CA) gereinigt. Die Säule wurde bei Raumtemperatur unter Verwenden des folgenden Gradienten, der mit 0,05 Trifluoressigsäure (TFA, Lösungsmittel A) und 50% Acetonitril in A (Lösungsmittel B) aufgebaut war, entwickelt: bei 5% B/0,5 Minuten; 5 bis 50% B/bei 50 Minuten; 50 bis 100% B/bei 70 Minuten; 100% B/bei 75 Minuten. Die Flussrate der Säule betrug 1,0 ml/min und die Fraktionen (1 ml) wurden auf Reaktivität mit MoAb/4-2 (anti-γ392-406) überprüft. Die Antikörper-reaktive Fraktion wurde weiter durch FPLC unter Verwenden der Superdex Peptid HR 10/30-Säule (1,0 × 30–31 cm, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) gereinigt. Die Säule wurde bei Raumtemperatur unter Verwenden von 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,2), der zusätzlich 0,25 M NaCl enthielt, entwickelt. Die Fraktion, die mit MoAb/4-2 reagierte, wurde zusammengeführt, über eine Sep-Pak^® (Millipore Corp., Milford, MA) entsalzt und einer Sequenzanalyse unterzogen.
Das sequenzierte Fragment entsprach einem vernetzten Dipeptid mit zwei verschiedenen NH₂-Enden: γLys385, hervorgegangen aus einer CNBr-Spaltung, und γAla405 (7). Die beiden Sequenzen wurden in vergleichbaren molaren Mengen gewonnen. Im Zyklus 3 zeigten die NH₂-terminale Analysen keine PTH-Reste (aufgrund eines Gerätefehlers), aber der Beweis für Gln und Ile in Zyklus 3 wurde im Zyklus 4 als Rückstand gesehen. Diese Daten unterstützen unsere Schlussfolgerung, dass MMP-3 bei γGly404-Ala405 innerhalb des vernetzten Bereichs der γ-Kette des Fibrins spaltet.
Tabelle III zeigt die partielle Sequenz des vernetzten Dipeptids, das aus XL-Fb, welches mit MMP-3 verdaut wurde, nach dem CNBr-Abbau isoliert wurde. Die γ-vernetzte Domäne mit den Stellen des MMP-3-Verdaus und CNBr-Spaltung ist schematisch in 7 gezeigt. Das entstandene Dipeptid enthält eine einzelne ε-(γ-Glu)-Lys-Bindung mit einem NH₂-Terminus, γLys385, der aus der CNBr-Spaltung bei γMet384-Lys385 hervorgeht. Das Vorhandensein des zweiten NH₂-Terminus, γAla405, unterstützte unsere Schlussfolgerung, dass MMP-3 bei γGly404-Ala405 im vernetzten Bereich der γ-Kette spaltet.
Tabelle III
Die Daten, die aus der Sequenzanalyse der MMP-3-Verdauansätze von Fg und XL-Fb erhalten wurden, zeigten Nähe zu den Spaltungsstellen mit Plasmin mit den gleichen Substraten. Plasmin spaltet bei γLys62-Ala63 und langsamer bei γLys85-Ser86 (Collen et al. 1975). Das Fibrinogen, das durch Plasmin verdaut wurde, führt somit zu zwei D-Spezies- Fragmenten, d. h. γAla63-Val411 und γSer86-Val411. Im Gegensatz dazu, spaltet MMP-3 sowohl Fg als auch XL-Fb bei γThr83-Leu84. Außerdem, da MMP-3 die γGly404-Ala405-Peptidbindung hydrolysiert, hat die y-Kette ein Molekulargewicht, das im Wesentlichen dem des D-γ-Ketten- Fragments, das mit Plasmin hergestellt wurde, ähnlich ist. Bei den Verdauansätzen von XL-Fb mit MMP-3 ist jedoch dieses Produkt nicht ein echtes Monomer, da die γ405-411-Domäne mit der benachbarten γ-Kette, die die Sequenz γLeu84-Gly404 hat, vernetzt ist. Es muss vermerkt werden, dass die Gewinnung von ähnlichen Mengen der beiden Sequenzen aus den γ-Ketten der Dipeptide, die mit CNBr hergestellt wurden, zeigt, dass, obwohl langsam, der Abbau von XL-Fb mit MMP-3 nahezu komplett war, was zur Bildung des D-Monomer-artigen Fragments führte.
Beispiel 10
Charakterisierung von anderen Spaltungsprodukten von Fg und XL-Fb durch MMP-3.MMP-3 erzeugt auch andere Spaltprodukte von Fg und XL-Fb, da es nicht nur die γ-Kette spezifisch schneidet, sondern auch die α- und β-Ketten. Fg und XL-Fb wurden unter Verwenden von MMP-3 (E : S = 1 : 20) für 24 Stunden verdaut, getrennt und unter Verwenden der oben in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren sequenziert. Wie in 8 gezeigt, werden sowohl Fg (Bahn 1) als auch XL-Fb (Bahn 2) spezifisch gespalten. Die Bande 1 in 8 umfasst zwei Fragmente: ein γ-Kettenfragment mit einer NH₂-terminalen Sequenz Leu-Lys-Ser-Arg-Lys (SEQ ID NO: 1), wiederum entsprechend der Spal tung γ84; und ein β-Kettenfragment (β1) mit einer NH₂-terminalen Sequenz Lys-Arg-Gln-Lys-Gln (SEQ ID NO: 3), entsprechend der Spaltung bei β127. Es zeigte sich, dass Bande 2 ein weiteres β-Kettenfragment (β2), mit einer NH₂-terminalen Sequenz Tyr-Ser-Ser-Glu-Leu (SEQ ID NO: 4), entsprechend der Spaltung bei β142, enthielt. Bande 3 ist das Enzym MMP-3, das in dem Verdauansatz übrig geblieben war. Es zeigte sich, dass Bande 4 ein α-Kettenfragment mit einer NH₂-terminalen Sequenz Asn-Arg-Asp-Asn-Thr (SEQ ID NO: 5), entsprechend der Spaltung bei α103, enthielt. (Es zeigt sich auch, dass Bande 4 die Fragmente, die bei γ1 and α414 sowohl in Fibrinogen als auch in den Fibrinverdauansätzen gespalten wurden, enthielt). Bande 5 enthielt Fragmente, die bei β51 und β52 sowohl in Fibrin als auch in den Fibrinogen-Verdauansätzen mit MMP-3 gespalten wurden.
Die Tatsache, die in den Beispielen 1–10 oben gezeigt wurde, legt entsprechend fest, dass Fibrinogen nicht mehr mit Thrombin gerinnbar ist, wenn es mit Matrixmetallproteinase-3 (MMP-3, Stromelysin 1) behandelt wurde, aber nicht, wenn es mit Matrixmetallproteinase-2 (MMP-2, Gelatinase A) behandelt wurde. Eine Inkubation von XL-Fb-Gerinnseln (mit ¹²⁵I-Fg hergestellt) mit MMP-3 führten zur vollständigen Lyse nach 24 Stunden. Ein D-Monomer-artiges Fragment wird durch MMP-3-Abbau von Fibrinogen, XL-Fb und Fragment-DD erzeugt. Die Immunoreaktivität mit dem monoklonalen Antikörper MoAb/4-2 (anti-γ392-406), aber nicht mit MoAb/4A5 (anti-γ397-411) legte nahe, dass eine Hauptspaltungsstelle innerhalb der Sequenz, die an der Vernetzung von zwei γ-Ketten teilnimmt, lag. Die NH₂-terminale Sequenz der γ-Kette des D-Monomerartigen Fragments und eines Dipeptids, das von dem MMP-3-Verdau von XL-Fibrin isoliert wurde, identifizierte die Hydrolyse der γGly404-Ala405-Peptidbindung. Diese Daten zeigen, dass der Abbau von Fg und XL-Fb durch MMP-3 spezifisch ist und anders ist als mit Plasmin. Dieser Mechanismus der Fibrinolyse ist von Wichtigkeit bei der Wundheilung, Entzündung, Atherosklerose, Malignität, Nierenkrankheiten und andere pathosphysiologischen Prozessen.
Insofern als MMP-3 nahe der Stelle spaltet an der die Fibrinvernetzung stattfindet, ist ein starkes teleologisches Argument gemacht, dass MMP-3 eine einzigartige Rolle bei der Fibrinolyse spielt. Eine koordinierte Regulation der Metallproteinasen und der Plasminogenaktivatoren könnte daher zu synergistischen Wirkungen führen, und der komplette Abbau von sowohl der extrazellulären Matrix als auch des Fibrinnetzwerks würde zur Heilung von Wunden, Entzündungen, Thrombosen, Krebs, Nierenkrankheiten und anderen pathosphysiologischen Prozessen führen. Somit wird entsprechend festgestellt, dass die gleichzeitige Gabe von MMP-3 mit anderen thrombolytischen Wirkstoffen, wie z. B. t-PA eine zusätzliche therapeutische Wirkung erzielen würde, bei der sich jeweils die Bestandteile ergänzen oder potenzieren würden.
Während somit hier beschrieben wurde, was im Moment als die bevorzugten Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung erachtet werden, wird der Fachmann realisieren, dass andere und weitere Ausführungsformen gemacht werden können, ohne den Geist der Erfindung zu verlassen, und es ist beabsichtigt, alle diese weiteren Modifikationen und Veränderungen einzuschließen wie sie im wahren Umfang der Ansprüche, wie hier dargelegt, liegen.
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Claims

Verwendung einer fibrinolytischen Metallproteinase für die Herstellung eines Medikaments für den Einsatz bei einem Verfahren einer fibrinolytischen Therapie, wobei besagte fibrinolytische Metallproteinase ein Stromelysin ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Stromelysin ein endogenes Stromelysin ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Stromelysin MMP-3 ist.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Stromelysin Fibrinogen) bei der γGly404-Ala405 Peptidbindung spaltet.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Verfahren der fibrinolytischen Therapie das Verabreichen von Stromelysin zusammen mit einer Zusatzverbindung mit thrombolytischer Aktivität beinhaltet.
Verwendung nach Anspruch 5, bei welcher die Zusatzverbindung mit thrombolytischer Aktivität aus der Gruppe bestehend aus einem Plasminogen Aktivator, Hirudin, einem Enzym Inhibitor, einem Enzym, einem Antikoagulans, einem Antikörper oder synthetischen Peptid speziell für ein Blutplättchen gpIIb/IIIa Rezeptor oder einer Kombination daraus ausgewählt wird.
Verwendung nach Anspruch 6, bei welcher der Plasminogen Aktivator aus der Gruppe bestehend aus u-PA, t-PA, Streptokinase, Staphylokinase und Kombinationen davon ausgewählt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Verfahren der fibrinolytischen Therapie durchzuführen ist im Anschluss an eine thrombolytische Therapie, um einen vaskulären Wiederverschluss zu verhindern.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Verfahren der fibrinolytischen Therapie durchzuführen ist im Anschluss an einen medizinischen Eingriff, um eine Wiedereinengung zu verhindern.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Verfahren derfibrinolytischen Therapie durchzuführen ist, um eine Initialbildung von atherosklerotischer Plaque zu verhindern oder deren Rückbildung zu fördern.
Eine Zusammensetzung für eine thrombolytische Therapie, umfassend eine fibrinolytische Metallproteinase, die ein Stromelysin ist, eine Zusatzverbindung mit thrombolytischer Aktivität und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, bei welcher das Stromelysin ein endogenes Stromelysin ist.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, bei welcher das Stromelysin MMP-3 ist.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, bei welcher das Stromelysin Fibrinogen) bei der γGly404-Ala405 Peptidbindung spaltet.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, bei welcher die Zusatzverbindung mit thrombolytischer Aktivität aus der Gruppe bestehend aus einem Plasminogen Aktivator, Hirudin, einem Enzym Inhibitor, einem Enzym, einem Antikoagulans, einem Antikörper oder synthetischen Peptid speziell für ein Blutplättchen gpIIb/IIIa Rezeptor oder einer Kombination daraus ausgewählt ist.
Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, bei welcher der Plasminogen Aktivator aus der Gruppe bestehend u-PA, t-PA, Streptokinase, Staphylokinase und Kombinationen daraus ausgewählt ist.
Eine Ausrüstung zum Durchführen einer thrombolytischen Therapie mit einer Zusammensetzung umfassend eine fibrinolytische Metallproteinase, die ein Stromelysin ist, eine Zusatzverbindung mir thrombolytischer Aktivität und einen Behälter.
Eine Ausrüstung gemäß Anspruch 17, bei welcher das Stromelysin ein MMP-3 ist.
Eine Ausrüstung gemäß Anspruch 17, bei welcher die Zusatzverbindung mit thrombolytischer Aktivität aus der Gruppe bestehend aus einem Plasminogen Aktivator, Hirudin, einem Enzym Inhibitor, einem Enzym, einem Antikoagulans, einem Antikörper oder einem synthetischen Peptid speziell für ein Blutplättchen gpIIb/IIIa Rezeptor oder einer Kombination daraus ausgewählt ist.
Eine Ausrüstung gemäß Anspruch 17, ferner umfassend Mittel zum verabreichen einer therapeutisch effektiven Menge dieser Zusammensetzung.
Eine Ausrüstung gemäß Anspruch 20, bei welcher das Verabreichungsmittel Mittel zum parenteralen Verabreichen der Zusammensetzung umfasst.
Ein Verfahren zum Herabsetzen von Fibrin(ogen), umfassend ein Kontaktieren von Fibrinogen) im Reagenzglas mit einer zum Spalten des Fibrin(ogen)s wirksamen Menge fibrinolytischer Metallproteinase, wobei die fibrinolytische Metallproteinase ein Stromelysin ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 22, bei welchem das Stromelysin ein MMP-3 ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 22, bei welchem das Stromelysin das Fibrinogen) bei der γGly404-Ala405 Peptidbindung spaltet.
Ein Diagnoseverfahren zum Kennzeichnen von Fibrin(ogen), umfassend ein Kontaktieren von Fibrinogen) im Reagenzglas mit einer fibrinolytischen Metallproteinase, um charakteristische Abbauprodukte des Fibrin(ogen)s bereitzustellen, wobei die fibrinolytische Metallproteinase ein Stromelysin ist.
Ein Diagnoseverfahren gemäß Anspruch 25, bei welchem das Stromelysin ein MMP-3 ist.
Ein Diagnoseverfahren gemäß Anspruch 25, bei welchem das Verfahren ferner ein Kontaktieren der Abbauprodukte mit wenigstens einem Antikörper, das besonders mit einem Bereich von Fibrin(ogen) zusammengeht, und ein Messen einer spezifischen Vereinigung des Antikörpers mit den separierten Abbauprodukten umfasst.
Ein Diagnoseverfahren gemäß Anspruch 27, bei welchem der Antikörper mit einer detektierbaren Markerhälfte detektierbar gekennzeichnet wird.
Ein Diagnoseverfahren gemäß Anspruch 27, bei welchem der Antikörper ein monospezifischer Antikörper ist.
Ein Verfahren zum Verhindern von Thrombusbildung durch einen medizintechnisch-betreffenden Apparat, umfassend ein Kontaktieren eines medizintechnisch-betreffenden Apparates mit einer Zusammensetzung umfassend eine fibrinolytische Metallproteinase, um eine Thrombusverhindernde Oberfläche auf dem medizintechnisch-betreffenden Apparat bereitzustellen, wobei die fibrinolytische Metallproteinase ein Stromelysin ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 3, bei welchem der medizintechnisch-betreffende Apparat aus der Gruppe bestehend aus Blutspenderöhrchen, Kulturflaschen, Testplatten, Pinzetten, Reagenzbehälter, Röhrchen, Membranen, Nadeln, Kanülen, Katheter, Transplantaten, Stents, Filtern, Spiralen, Ventilen und ähnlichem ausgewählt wird.
Ein medizintechnisch-betreffender Apparat mit Thrombus verhindernden Eigenschaften, umfassend eine medizintechnisch-betreffende Einrichtung mit einer hierzu bereitgestellten Thrombus-verhindernden Menge einer Zusammensetzung, umfassend eine fibrinolytische Metallproteinase, wobei die fibrinolytische Metallproteinase ein Stromelysin ist.
Ein medizintechnisch-betreffender Apparat gemäß Anspruch 32, bei welchem der medizintechnisch-betreffende Apparat aus der Gruppe bestehend aus Blutspenderöhrchen, Kulturflaschen, Testplatten, Pinzetten, Reagenzbehälter, Röhrchen, Membranen, Nadeln, Kanülen, Katheter, Transplantaten, Stents, Filtern, Spiralen, Ventilen und ähnlichem ausgewählt ist.