DE69632790T2

DE69632790T2 - Zusammensetzungen unter verwendung von morphogenen proteinen und stimulationsfaktoren

Info

Publication number: DE69632790T2
Application number: DE69632790T
Authority: DE
Inventors: C. John LEE; C. Lee-Chuan YEH
Original assignee: Stryker Corp
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1995-12-12
Filing date: 1996-12-11
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2016-12-12
Also published as: US5948428A; DE69632790D1; US5916870A; EP0871471B1; AU719120B2; AU1333297A; JP4121558B2; JP2000502336A; US5854207A; ATE269713T1; US6048964A; EP0871471A1; CA2238277A1; CA2238277C; WO1997021447A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Osteogene Proteine wurden ursprünglich als eine Aktivität beschrieben, die in Extrakten von Säugerknochen vorhanden ist, die vermutlich während des Wachstums und der natürlichen Knochenheilung aktiv ist und die in der Lage ist, eine Entwicklungskaskade zu induzieren, die zu einer Akkumulation von Knorpel und endochondralem Knochen führt, wenn sie in vivo implantiert werden. Diese Entwicklungskaskade umfaßt die Rekrutierung und Proliferation von mesenchymalen Zellen, die Differenzierung von Vorläuferzellen, die Kalzifizierung von Knorpel, das vaskuläre Einwachsen, die Knochenbildung, die Knochenremodellierung und die Knochenmarkdifferenzierung (Reddi, Collagen Rel. Res., 1, S. 209–26 (1981)).
Die Faktoren in der Knochenmatrix, die die Differenzierung von endochondralem Knochen induzieren, können dissoziiert extrahiert werden und mit inaktiver Kollagenmatrix rekonstituiert werden, um die volle, Knochen induzierende Aktivität wiederherzustellen (Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, S. 7599–7603 (1981)). Dies stellt ein experimentelles Verfahren für die Testung von Proteinextrakten auf ihre Fähigkeit bereit, die endochondrale Knochenbildung in vivo zu induzieren. Unter Verwendung dieses Wiederherstellungstests wurde aus verschiedenen Säugerarten eine Reihe von verwandten osteogenen Proteinen isoliert, die in der Lage sind, die Knochen- und Knorpelbildung in Implantaten in anderen Arten zu induzieren (Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, S. 6591–95 (1983)). Der aktive Faktor oder die aktiven Faktoren, der/die diese Aktivität fördert/fördern, wurde(n) in der Literatur üblicherweise als knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) und als osteogene Proteine (OPs) bezeichnet.
Osteogene und knochenmorphogenetische Proteine stellen eine Familie von strukturell und funktionell verwandten morphogenen Proteinen dar, die zu der Superfamilie der Transformierenden Wachstumsfaktoren-Beta (TGF-β) gehören (vgl. nachstehend). Die TGF-β-Superfamilie wiederum stellt eine große Zahl an evolutionär konservierten Proteinen mit verschiedenen Aktivitäten dar, die in das Wachstum, die Differenzierung und die Gewebemorphogenese und -reparatur involviert sind. BMPs und osteogene Proteine werden als Mitglieder der TGF-β-Superfamilie als Vorläufer von sekretorischen Polypeptiden exprimiert, die gemeinsam eine hoch konservierte bioaktive Cystein-Domäne haben, die in der Nähe der C-Termini liegt. Eine andere Eigenschaft von vielen Proteinen der BMP-Familie ist ihre Neigung zur Bildung von Homo- und Heterodimeren.
Mittlerweile wurden viele morphogene Proteine beschrieben, die zur BMP-Familie gehören. Einige wurden unter Verwendung von Reinigungsverfahren isoliert, die mit Biotests wie dem vorstehend beschriebenen gekoppelt waren. Andere wurden wegen ihrer DNA-Sequenzenhomologien innerhalb von konservierten Regionen, die die BMP-Familie gemeinsam hat, identifiziert und cloniert. Diese Homologen werden als konsekutiv-nummerierte BMPs bezeichnet, ob sie nun eine merkliche osteogene Aktivität aufweisen oder auch nicht. Unter Verwendung eines alternativen Weges wurden synthetische OPs, die osteogene Aktivität haben, unter Verwendung von Aminosäurekonsensussequenzen geplant, die aus Sequenzvergleichen zwischen natürlicherweise vorkommenden OPs und BMPs abgeleitet waren (vgl. nachstehend; Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,324,819).
Während mehrere der frühestens Mitglieder der BMP-Familie osteogene Proteine waren, die aufgrund ihrer Fähigkeit der Induktion von neuem Knorpel und Knochen identifiziert wurden, hat die Suche nach BMP-verwandten Genen und Genprodukten in einer Vielzahl von Arten neue morphogene Proteine offenbart, von denen einige unterschiedliche oder zusätzliche Gewebe induzierende Fähigkeiten haben. Wie berichtet, induzieren BMP-12 und BMP-13 (identifiziert durch DNA-Sequenzenhomologie) in vivo Sehnen-/Bänder-ähnliche Gewebebildung (WO 95/16035). Mehrere BMPs können neuronale Zellproliferation induzieren und die Axon-Regenerierung fördern (WO 95/05846). Und einige BMPs, die ursprünglich auf der Basis ihrer osteogenen Aktivität isoliert wurden, haben auch Nerven induzierende Eigenschaften (Liem et al., Cell, 82, S. 969–79 (1995)). Es scheint daher, daß osteogene Proteine und andere BMPs eine Vielzahl an potentiellen Gewebe induzierenden Fähigkeiten haben, deren endgültige Expression von einem komplexen Satz von Entwicklungs- und Umgebungseinflüssen abhängen kann. Diese osteogenen, BMP- und BMP-verwandten Proteine werden hier kollektiv als morphogene Proteine bezeichnet.
Man erwartet, daß die vorstehend beschriebenen Aktivitäten und andere, bis dato nicht entdeckte Gewebe induzierende Eigenschaften der morphogenen Proteine, die zur BMP-Familie gehören, bei der Förderung der Geweberegeneration bei Patienten mit Traumata von Nutzen sind, die zum Beispiel durch Verletzungen oder degenerative Erkrankungen verursacht werden. Implantierbare osteogene Vorrichtungen, die osteogene Säugerproteine enthalten, für die Förderung der Knochenheilung und -regeneration wurden beschrieben (vgl. z. B. Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557). Einige osteogene Vorrichtungen umfassen osteogenes Protein, das in porösen, biokompatiblen Matrices dispergiert ist. Diese aus natürlichen Quellen abgeleiteten oder synthetischen Matrices erlauben üblicherweise dem osteogenen Protein, aus der Matrix heraus und in die Stelle der Implantation zu diffundieren und erlauben den Eintritt und Austritt von Zellen. Osteogenes Protein induziert die Vorläuferzellen zur Differenzierung und Proliferation. Vorläuferzellen können in die Matrix wandern und differenzierte Zellen können aus der porösen Matrix in die Stelle der Implantation austreten. Osteogene Zellen können die Matrix auch als physisches Gerüst für die Knochenleitung benutzen. Ähnliche Vorrichtungen wurden für die Verabreichung von BMPs für die Sehnen-Bänder-ähnliche und Nervengeweberegeneration beschrieben (vgl. nachstehend). Mit osteogenem Protein beschichtete prothetische Vorrichtungen, die die Bindungsstärke zwischen der Prothese und existierendem Knochen verstärken, wurden auch beschrieben (Rueger et al., US-Patent Nr. 5,344,654). EP 0436469 offenbart eine Zusammensetzung, die eine Kombination von IGF-I und einer für den Knochen antiresorptiven aktiven Verbindung umfaßt. US 5 354 557 offenbart eine osteogene Vorrichtung, die ein osteogenes Protein und einen Wachstumsfaktor wie IGF umfaßt.
Die Verfügbarkeit von großen Mengen an gereinigten und hoch aktiven morphogenen Proteinen würde die orthopädische Medizin revolutionieren, gewisse Arten an plastischer Chirurgie, rekonstruktive dentale und verschiedene periodontale und craniofaciale Verfahren und Verfahren, die im Allgemeinen Knochen-, Knorpel-, Sehnen-, Bänder- und Nervenregeneration umfassen. Viele dieser OP und BMP codierenden Säugergene sind mittlerweile cloniert und können rekombinant als aktive homo- und heterodimere Proteine in einer Vielzahl von Wirtssystemen exprimiert werden, einschließlich Bakterien. Die Möglichkeit der rekombinanten Produktion von aktiven Formen von morphogenen Proteinen wie Ops und BMPs, einschließlich von Varianten und Mutanten mit erhöhten biologischen Aktivitäten (vgl. nachstehend), macht potentielle therapeutische Behandlungen unter Verwendung von morphogenen Proteinen möglich.
Angesichts der großen Zahl an potentiellen therapeutischen Verwendungen von morphogenen Proteinen bei der Behandlung einer Vielzahl von verschiedenen Geweben und Gewebearten besteht ein Bedarf an hoch aktiven Formen an morphogenen Proteinen. Somit wäre es wünschenswert, die Gewebe induzierenden Eigenschaften von morphogenen Proteinen zu erhöhen. Bei erhöhter Gewebe induzierender Aktivität könnte die Behandlung mit einem morphogenem Protein, selbst in großem Maßstab, die Gewebebildung schneller induzieren, oder die Gewebeinduktion könnte unter Verwendung von reduzierten Konzentrationen an morphogenem Protein erreicht werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme durch Bereitstellung von Arzneimitteln, die einen stimulierenden Faktor für morphogenes Protein (MPSF), der IGF-I ist, für die Verbesserung der Gewebe induzierenden Aktivität eines morphogenen Proteins umfassen, insbesondere eines, das zu der Familie der BMP-Proteine gehört, wie ein osteogenes Protein. Diese Erfindung stellt auch implantierbare morphogene Vorrichtungen bereit, die ein morphogenes Protein und einen MPSF umfassen, die in einem Träger bereitgestellt werden und die in der Lage sind, die Gewebebildung in allogenen und xenogenen Implantaten zu induzieren. Diese Erfindung stellt auch eine prothetische Vorrichtung bereit, die eine Prothese umfaßt, die mit einem morphogenen Protein und einem MPSF beschichtet ist, und ein Verfahren Förderung der zur in vivo-Integration einer implantierbaren prothetischen Vorrichtung, um die Bindungsstärke zwischen der Prothese und dem existierenden Zielgewebe an der Verbindungsstelle zu erhöhen. Einige der beschriebenen Beispiele fallen nicht unter den Umfang der Ansprüche, wurden aber nur zu Referenzzwecken eingeschlossen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1. IGF-I ist ein MPSF, der die osteogene Induktion von OP-1 stimuliert. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) (nMol/μg Protein) in FRC-Zellen ist als Funktion steigender Konzentration von IGF-I (ng/ml) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von OP-1 (500 ng/ml) aufgetragen.
2. Der monoclonale anti-IGF-I-Antikörper inhibiert die IGF-I-Stimulierung der osteogen Induktion von OP-1. FRC-Zellen wurden 48 Stunden in der Anwesenheit oder Abwesenheit von OP-1 (500 ng/ml) mit einem monoclonalen Antikörper (Upstate Biotech) gegen IGF-I inkubiert. Das Niveau von alkalischer Phosphatase (nMol/μg Protein) in jeder Kultur wurde gemessen.
3. IGF-I- und OP-1-Dosis-Antwort-Kurven für Knochen induzierende Aktivität. Die relative Aktivität (%) der alkalischen Phosphatase (AP) in FRC-Zellen ist als Funktion steigender Konzentrationen von IGF-I (bei BRL gekauft; 0–100 ng/ml) in der Abwesenheit oder Anwesenheit steigender Konzentration von OP-1 (0–500 ng/ml) aufgetragen.
4. Zeitpunkt der Zugabe von OP-1 und IGF-I. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) (nMol/μg Protein) in FRC-Zellen ist angegeben. FRC-Zellen wurde in serumfreiem Medium gezüchtet, das 500 ng/ml OP-1 enthielt, und IGF-I (25 ng/ml) wurde anschließend zu verschiedenen Zeitpunkten (Stunden) zu der Kultur zugegeben. Kontrollkulturen wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das Lösungsmittelträger enthielt.
5 Östradiol ist im Zusammenwirken mit OP-1 ein MPSF. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) (nMol/μg Protein) in FRC-Zellen ist angegeben. FRC-Zellen wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das OP-1 allein (200 ng/ml) oder steigende Konzentrationen von Östradiol (0,05, 0,5 und 5,0 nm) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 ng/ml OP-1 enthielt. Kontrollkulturen (CON) wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das Lösungsmittelträger enthielt.
6 Wachstumshormon ist im Zusammenwirken mit OP-1 ein MPSF. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) (nMol/μg Protein) in FRC-Zellen ist angegeben. FRC-Zellen wurden in serumfreiem Medium inkubiert, das OP-1 allein (200 ng/ml; "0") oder steigende Konzentrationen von hGH (10–100 ng/ml) in der Anwesenheit von 200 ng/ml OP-1 enthielt. Kontrollkulturen (CON) wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das Lösungsmittelträger enthielt (nicht gezeigt).
7 Hydrocortison ist im Zusammenwirken mit OP-1 ein MPSF. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) (nMol/μg Protein) in FRC-Zellen ist angegeben. FRC-Zellen wurden in serumfreiem Medium inkubiert, das OP-1 allein (200 ng/ml) oder steigende Konzentrationen von Hydrocortison (0,05, 0,5 und 5,0 nM) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 ng/ml OP-1 enthielt. Kontrollkulturen (CON) wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das Lösungsmittelträger enthielt.
8 Insulin ist im Zusammenwirken mit OP-1 ein MPSF. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) (nMol/μg Protein) in FRC-Zellen ist angegeben. FRC-Zellen wurden in serumfreiem Medium inkubiert, das OP-1 allein (200 ng/ml) oder steigende Konzentrationen von Insulin (0,05, 0,5 und 5,0 nM) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 ng/ml OP-1 enthielt. Kontrollkulturen (CON) wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das Lösungsmittelträger enthielt.
9 Parathyroid-Hormon ist im Zusammenwirken mit OP-1 ein MPSF. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) (nMol/μg Protein) in FRC-Zellen ist angegeben. FRC-Zellen wurden mit OP-1 allein (200 ng/ml) und mit steigenden Konzentrationen von Parathyroid-Hormon (PTH; 25, 100 und 200 ng/ml) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 ng/ml OP-1 inkubiert. Kontrollkulturen (CON) wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das Lösungsmittelträger enthielt.
10. Progesteron ist im Zusammenwirken mit OP-1 ein MPSF. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) (nMol/μg Protein) in FRC-Zellen ist angegeben. FRC-Zellen wurden mit OP-1 allein (200 ng/ml) und mit steigenden Konzentrationen von Progesteron (0,05, 0,5 und 5,0 nm) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 200 ng/ml OP-1 inkubiert. Kontrollkulturen (CON) wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das Lösungsmittelträger enthielt.
11. IGF-II stimuliert nicht die von OP-1 induzierte osteogene Induktion. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) (nMol/μg Protein) in FRC-Zellen ist angegeben. FRC-Zellen wurden mit OP-1 allein (500 ng/ml) und mit steigenden Konzentrationen von IGF-II (10–300 ng/ml) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 500 ng/ml OP-1 (gezeigt nur für 100 und 200 ng/ml IGF-II) inkubiert. Kontrollkulturen (CON) wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das Lösungsmittelträger enthielt.
12. TGF-β stimuliert nicht die von OP-1 induzierte osteogene Induktion. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) (nMol/μg Protein) in FRC-Zellen ist angegeben. FRC-Zellen wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das enthielt: OP-1 allein (200 ng/ml), TGF-β allein (0,05–2 ng/ml), oder das steigende Konzentrationen an TGF-β (0,05–50 ng/ml) in der Anwesenheit von OP-1 mit 100 ng/ml, 200 ng/ml oder 500 ng/ml enthielt. Kontrollkulturen (CON) wurden in serumfreiem Medium gezüchtet, das Lösungsmittelträger enthielt.
13. (A) Dosisantwort von OP-1 auf den [³H] Tymidin-Einbau in FRC-Zellen. Konfluente FRC-Zellen in Platten mit 48 Mulden wurden 18 Stunden in serumfreiem α-MEM-Medium inkubiert, das einen Kontrollträger oder verschiedene Konzentrationen an OP-1 (100, 200 oder 500 ng/ml) enthielt. Die Behandlungen (6 Mulden/Behandlung) wurden dann mit [³H] Tymidin (5 μCi/ml) 6 Stunden gepulst und nach insgesamt 24 Stunden Inkubation wurde das Ausmaß des [³H] Tymidin-Einbaus in die DNA bestimmt und als dpm ("disintegration per minute", Zerfall)/Mulde (x-Achse) dargestellt. Die Werte sind Mittelwerte ± SE ("standard error", Standardabweichung) von vier unabhängigen Experimenten von verschiedenen Präparationen von FRC-Zellen. (B) Wirkungen von OP-1 und IGF-I auf den [³H] Tymidin-Einbau in FRC-Zellen. Konfluente FRC-Zellen in Platten mit 48 Mulden wurden mit OP-1 in der Anwesenheit von exogenem IGF-I (10, 25, 50 ng/ml) 18 Stunden inkubiert und wie bei (A) mit [³H]-Tymidin zusätzlich 6 Stunden gepulst. Nach insgesamt 24 Stunden Inkubation wurde das Ausmaß des [³H]-Tymidin-Einbaus in die DNA bestimmt und als dpm/Mulde (x-Achse) dargestellt. Offene Kreise: Kontrolle (kein OP-1): behandelt mit Lösungsmittelträger in serumfreiem Medium; geschlossene Kreise: 100 ng/ml OP-1; geschlossene Quadrate: 200 ng/ml OP-1; geschlossene Rauten: 500 ng/ml OP-1. Die Werte sind Mittelwerte ± SE von vier unabhängigen Experimenten von verschiedenen Präparationen von FRC-Zellen. *p < 0,01 im Vergleich mit der Kontrolle.
14. Wirkungen von OP-1 und IGF-I auf den [³H]-Tymidin-Einbau in menschliche SaOS-2 Osteosarcom-Zellen. Die Höhe der Säulen stellt den relativen [³H]-Tymidin-Einbau der Testproben im Vergleich mit den Kontrollproben dar. Säule 1: Kontrolle (behandelt mit Lösungsmittelträger); Säule 2: IGF-I, 50 ng/ml; Säule 3: IGF-I, 100 ng/ml; Säule 4: OP-1, 500 ng/ml; Säule 5: OP-1 (500 ng/ml) + IGF-I (10 ng/ml); Säule 6: OP-1 (500 ng/ml) + IGF-I (25 ng/ml); Säule 7: OP-1 (500 ng/ml) + IGF-I (50 ng/ml); und Säule 8: OP-1 (500 ng/ml) + IGF-I (100 ng/ml).
15. Wirkungen von OP-1 und IGF-I auf den [³H]-Tymidin-Einbau in menschliche TE85-Osteosarcom-Zellen. Die Höhe der Säulen stellt den relativen [³H]-Tymidin-Einbau der Testproben im Vergleich mit den Kontrollproben dar. Säule 1: Kontrolle (behandelt mit Lösungsmittelträger); Säule 2: IGF-I, 10 ng/ml; Säule 3: IGF-I, 25 ng/ml; Säule 4: OP-1, 200 ng/ml; Säule 5: OP-1 (200 ng/ml) + IGF-I (10 ng/ml); Säule 6: OP-1 (200 ng/ml) + IGF-I (25 ng/ml); Säule 7: OP-1 (200 ng/ml) + IGF-I (50 ng/ml); und Säule 8: OP-1 (200 ng/ml) + IGF-I (100 ng/ml).
16. Wirkungen von OP-1 und des(1-3) IGF-I auf die von OP-1 stimulierte Aktivität der alkalischen Phosphatase in FRC-Zellen. Aktivität der alkalischen Phosphatase in FRC-Zellen, die mit 200 ng/ml OP-1 und steigenden Konzentrationen von IGF-I oder des(1-3) IGF-I (ng/ml) behandelt wurden. Die Resultate sind normalisiert auf die Aktivität in FRC-Zellen, die mit OP-1 allein behandelt wurden, wobei die Aktivität 5- bis 7-fach höher ist als die in Kontrollkulturen, die mit Lösungsmittelträger allein behandelt wurden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Damit die hier beschriebene Erfindung vollständig verstanden werden kann, wird die folgende ausführliche Beschreibung gegeben.
Der Ausdruck "biokompatibel" betrifft ein Material, das keine schädlichen Wirkungen hervorruft, die im Zusammenhang mit den verschiedenen Schutzsystemen des Körpers stehen, wie mit Zellulen und humoral assoziierten Immunantworten, z. B. entzündlichen Reaktionen und fibrotischen Reaktionen auf Fremdkörper. Der Ausdruck biokompatibel umfaßt auch, daß keine spezifischen unerwünschten cytotoxischen oder systemischen Wirkungen durch das Material hervorgerufen werden, wenn es in den Patienten implantiert wird.
Der Ausdruck "knochenmorphogenetisches Protein (BMP)" betrifft ein Protein, das, basierend auf der DNA- und der Aminosäuresequenzhomologie, zu der BMP-Familie der TGF-β-Superfamilie von Proteinen (BMP-Familie) gehört. Gemäß der vorliegenden Erfindung gehört ein Protein zu der BMP-Familie, wenn es mindestens 50% Identität in der Aminosäuresequenz mit mindestens einem bekannten Mitglied der BMP-Familie innerhalb der konservierten C-terminalen Cystein-reichen Domäne hat, welche die BMP-Proteinfamilie charakterisiert. Mitglied der BMP-Familie können insgesamt weniger als 50% Identität in der DNA- oder der Aminosäuresequenz haben.
Der Ausdruck "morphogenes Protein" betrifft ein Protein, das morphogene Aktivität hat (vgl. nachstehend). Vorzugsweise ist ein morphogenes Protein dieser Erfindung mindestens ein Polypeptid, das zur BMP-Proteinfamilie gehört. Morphogene Proteine können in der Lage sein, Vorläuferzellen zur Proliferation zu induzieren und/oder Differenzierungsvorgänge zu initiieren, die zur Bildung von Knorpel, Knochen, Bändern, Ligament, Nerven oder anderen Arten von Gewebe führen, in Abhängigkeit von den Bedingungen der lokalen Umgebung, und somit können sich die morphogenen Proteine in verschiedenen Umgebungen verschieden verhalten. Zum Beispiel kann ein osteogenes Protein an einer Behandlungsstelle Knochengewebe und Nervengewebe an einer anderen Behandlungsstelle induzieren.
Der Ausdruck "osteogenes Protein (OP)" betrifft ein morphogenes Protein, das in der Lage ist, eine Vorläuferzelle zur Bildung von Knorpel und/oder Knochen zu induzieren. Der Knochen kann ein intramembranöser Knochen oder endochondraler Knochen sein. Die meisten osteogenen Proteine sind Mitglieder der BMP-Proteinfamilie und sind somit auch BMPs. Das Umgekehrte kann aber nicht richtig sein. BMPs (identifiziert durch die Sequenzhomologie) müssen in einem funktionellen Biotest eine merkliche osteogene Aktivität haben, um gemäß dieser Erfindung osteogene Proteine zu sein.
Der Ausdruck "morphogenes Protein stimulierender Faktor (MPSF)" betrifft einen Faktor, der in der Lage ist, die Fähigkeit eines morphogenen Proteins zu stimulieren, die Gewebebildung von einer Vorläuferzelle zu induzieren. Der MPSF kann eine direkte oder eine indirekte Wirkung auf die Erhöhung der induzierenden Aktivität von morphogenem Protein haben. Zum Beispiel kann der MPSF die Bioaktivität eines anderen MPSF erhöhen. Mittel, die die Bioaktivität eines MPSF erhöhen, umfassen zum Beispiel diejenigen, die die Synthese, die Halbwertszeit, die Reaktivität mit anderen Biomolekülen wie Bindungsproteinen und Rezeptoren oder die Bioverfügbarkeit des MPFS erhöhen.
Die Ausdrücke "morphogene Aktivität", "induzierende Aktivität" und "Gewebe induzierende Aktivität" betreffen alternativ die Fähigkeit eines Mittels, eine Zielzelle zu einer oder mehreren Zellteilungen zu stimulieren (Proliferation), was gegebenenfalls zur Zelldifferenzierung führen kann. Solche Zielzellen werden hier generisch als Vorläuferzellen bezeichnet. Die Zellproliferation ist typischerweise durch Veränderungen bei der Regulierung des Zellzyklus charakterisiert und kann mit einer Reihe von Verfahren nachgewiesen werden, welche die Messung der Wachstumsraten der DNA-Synthese oder der zellulären Wachstumsraten einschließen. Frühe Stadien der Zelldifferenzierung sind typischerweise durch Veränderungen im Muster der Genexpression relativ zu dem der Vorläuferzelle charakterisiert, was ein Hinweis auf eine Ausrichtung auf ein spezielles Zellschicksal oder einen speziellen Zelltyp sein kann. Spätere Stadien der Zelldifferenzierung können durch Veränderungen im Muster der Genexpression, der Zellphysiologie und -morphologie charakterisiert sein. Jede reproduzierbare Veränderung bei der Genexpression, der Zellphysiologie und -morphologie kann verwendet werden, um den Beginn und das Ausmaß der Zelldifferenzierung zu bewerten, die von einem morphogenen Protein induziert wird.
Der Ausdruck "synergistische Wechselwirkung" betrifft eine Wechselwirkung, bei der die kombinierte Wirkung von zwei Mitteln höher ist als die algebraische Summe ihrer individuellen Wirkungen.
Morphogene Proteine
Die morphogenen Proteine dieser Erfindung sind in der Lage, eine Vorläuferzelle zu stimulieren, Zellteilung und -differenzierung zu durchlaufen, wobei die induzierende Aktivität bei Anwesenheit eines MPSF erhöht werden kann. Viele morphogene Proteine des Säugers wurden beschrieben. Einige fallen in eine Klasse von Produkten, die "Homöodomäne-Proteine" aufgrund ihrer Homologie zu den Homöobox-Genen von Drosophila genannt wurden, die an der phänotypischen Expression und Übereinstimmung von Körpersegmenten während der Embryogenese beteiligt sind. Andere morphogene Proteine werden als peptidische Wachstumsfaktoren klassifiziert, die Wirkungen auf die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung oder beides haben.
Peptidische Wachstumsfaktoren können in eine Anzahl von Superfamilien oder Familien gruppiert werden, primär basierend auf ihrer Sequenzähnlichkeit (Mercola und Stiles, Development, 102, S. 451–460 (1988)). Diese Familien umfassen: Epidermalen Wachstumsfaktor (z. B. EGF, TGF-α, notch und delta); Transfomierender Wachstumsfaktor-Beta (z. B. TGF-β, Inhibin, Activin, MIS, BMP, dpp und Vg-1); Heparin bindender Wachstumsfaktor (z. B. FGF, ECDGF und int-2); von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor; Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF-I, IGF-II); und Nervenwachstumsfaktor.
Die BMP-Familie
Die morphogenen Proteine dieser Erfindung, deren Aktivität in der Anwesenheit eines MPSF erhöht sein kann, gehören vorzugsweise zu der TGF-β-Proteinsuperfamilie. Die Mitglieder der TGF-β-Superfamilie werden auf der Basis ihres Ausmaßes an struktureller oder funktioneller Ähnlichkeit weiter in Familien unterteilt. Die BMP-Familie ist eine solche Familie, die nach ihren repräsentativen knochenmorphogenetischen/osteogenen Proteinfamilienmitgliedern benannt ist. Von den berichteten "BMPs" (BMP-1 bis BMP-13), die primär auf der Basis der Sequenzenhomologie isoliert wurden, bleiben alle bis auf BMP-1 als Mitglieder der BMP-Familie der morphogenen Proteine klassifiziert (Ozkaynak et al., EMBO J., 9, S. 2085–93 (1990)).
Die BMP-Familie umfaßt andere strukturell verwandte Mitglieder, die morphogene Proteine sind, einschließlich des decapentaplegischen Genkomplexprodukts (DPP) von Drosophila, des Vgl-Produkts von Xenopus laevis und seines murinen Homologs, VGR-1 (vgl. z. B. Massagué, J., "The Transforming Growth Factor-β Family", Annu. Rev. Cell Biol., 6, S. 597–641 (1990)).
Ein morphogenes Protein gemäß dieser Erfindung gehört zur BMP-Familie, wenn es ein Polypeptid umfaßt, das mindestens 50% Aminosäuresequenzidentität mit mindestens einem bekannten BMP-Familienmitglied in der konservierten C-terminalen Cystein-reichen Domäne hat, die die BMP-Proteinfamilie charakterisiert. Diese Definition ist zum Teil abgeleitet vom Vergleich der Aminosäuresequenzidentitäten zwischen den C-terminalen Domänen anderer BMP-Familienmitglieder, die eine merkliche morphogene Aktivität haben.
Die Genprodukte von DPP von Drosophila und von Vg-1 von Xenopus laevis sind zueinander zu 50% identisch (und zu 35–40% identisch mit TGF-β). Die Dpp- und Vg-1-Produkte sind morphogene Proteine, die an den Ereignissen der frühen Musterbildung während der Embryogenese ihrer jeweiligen Wirte teilnehmen. Diese Produkte scheinen den knochenmorphogenetischen Proteinen des Säugers BMP-2 und BMP-4 am nächsten verwandt zu sein, deren C-terminalen Domänen zu 75% mit der von Dpp identisch sind.
Die C-terminalen Domänen von BMP-3, BMP-5, BMP-6 und OP-1 (BMP-7) sind zu etwa 60% identisch zu der von BMP-2 und die C-terminalen Domänen von BMP-6 und OP-1 sind zu 87% identisch. BMP-6 ist wahrscheinlich das menschliche Homolog des murinen Vgr-1 (Lyons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, S. 4554–59 (1989)); die beiden Proteine sind auf der Ebene der Aminosäuresequenz insgesamt zu 92% identisch (US-Patent Nr. 5,459,047). BMP-6 ist zu 58% identisch mit dem Xenopus Vg-1-Produkt.
Die DNA- und Aminosäuresequenzen dieser und anderer BMP-Familienmitglieder sind publiziert und können vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein neues Genkandidatenprodukt zur BMP-Familie gehört. Von neuen, mit BMP verwandten Genprodukten ist analog zu erwarten, daß sie mindestens eine morphogene Aktivität besitzen.
Eine andere Charakteristik der BMP-Proteinfamilienmitglieder ist ihre offensichtliche Fähigkeit zur Dimerisierung. Mehrere, vom Knochen abgeleitete osteogene Proteine (OPs) und BMPs werden in ihren aktiven Formen als Homo- und Heterodimere vorgefunden. Die Fähigkeit von OPs und BMPs zur Bildung von Heterodimeren kann zusätzliche oder veränderte morphogene induktive Fähigkeiten auf morphogene Proteine übertragen. Heterodimere können qualitativ oder quantitativ verschiedene Bindungsaffinitäten als Homodimere für OP- und BMP-Rezeptormoleküle aufweisen. Veränderte Bindungsaffinitäten können wiederum zu einer verschiedenen Aktivierung von Rezeptoren führen, die verschiedene Signalwege anstoßen, was letztlich zu verschiedenen biologischen Aktivitäten oder Ergebnissen führen kann. Veränderte Bindungsaffinitäten könnten sich auch auf eine Gewebe- oder Zelltyp-spezifische Weise manifestieren, wobei nur spezielle Vorläuferzelltypen induziert werden, zu proliferieren und/oder sich zu differenzieren.
Geeignete in vitro-, ex vivo- und in vivo-Biotests, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich der hier beschriebenen, können verwendet werden, um sicherzustellen, ob ein neues, mit BMP verwandtes Genprodukt oder eine neue heteromere Art eine bekannte oder neue morphogene Aktivität hat. Expressions- und Lokalisierungsuntersuchungen, die definieren, wo und wann das Gen und seine) Produkte) exprimiert werden, können auch verwendet werden, um potentielle morphogene Aktivitäten zu identifizieren. Nucleinsäure- und Proteinlokalisierungsverfahren sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannt (vgl. z. B. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Cloning, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1989).
Viele der identifizierten BMPs sind osteogen und können die Bildung von Knochen und Knorpel induzieren, wenn sie in Säuger implantiert werden. Einige aufgrund ihrer Sequenzhomologie mit osteogenen Proteinen identifizierte BMPs besitzen andere morphogene Aktivitäten und die MPSFs gemäß dieser Erfindung können verwendet werden, um diese anderen Aktivitäten zu erhöhen. Zum Beispiel wird berichtet, daß BMP-12 und BMP-13 die ectopische Bildung von Bänder-/Ligament-ähnlichem Gewebe induzieren, wenn sie in Säuger implantiert werden (Celeste et al., WO 95/16035). Unter Verwendung dieses Biotests oder jedes anderen geeigneten Tests, der vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet ausgewählt wird, können ein oder mehrere MPSFs, die in der Lage sind, die Fähigkeit des BMP zur Induktion der Bildung von Bänder-/Ligament-ähnlichem Gewebe zu stimulieren, gemäß den hier beschriebenen Verfahren identifiziert und optimiert werden.
Gewisse BMPs, von denen bekannt ist, daß sie osteogen sind, können auch die neuronale Zelldifferenzierung induzieren. Embryonale Mäusezellen, die mit BMP-2 oder OP-1 (BMP-7) behandelt wurden, differenzieren zu Astrocyten-ähnlichen (glialen) Zellen, und kürzlich wurde die Regeneration von peripherem Nerv unter Verwendung BMP-2 berichtet (Wang et al., WO 95/05846). Zusätzlich werden BMP-4, BMP-5 und OP-1 (BMP-7) in epidermalem Ectoderm exprimiert, das die neuronale Platte flankiert. Ectopische rekombinante BMP-4- und OP-1 (BMP-7)-Proteine sind in der Lage, Zellen der neuronalen Platte zur Initiierung der Differenzierung mit Schicksal zu dorsalen neuralen Zellen zu induzieren (Liem et al., Cell, 82, S. 969–79 (1995)). Auf Ebene des Rückenmarks können OP- 1 und andere BMPs die Differenzierung von neuralen Leistenzellen induzieren. Es wird vorgeschlagen, daß OP-1 und diese BMPs viele oder alle dorsalen neuralen Zelltypen induzieren können, einschließlich Deckplattenzellen, neurale Leistenzellen und Kommissurenneuronen, in Abhängigkeit von lokalisierten Positionsreizen.
Daß mehrere osteogene Proteine, die ursprünglich von Knochenmatrix abgeleitet wurden, im embryonalen Nervensystem lokalisiert zu sein und neurogenische induktive Eigenschaften zu haben scheinen, macht es wahrscheinlich, daß diese und andere Mitglieder der BMP-Proteinfamilie zusätzliche Gewebe induzierende Eigenschaften haben werden, die noch nicht offenbart sind. Es ist vorauszusehen, daß die Fähigkeit, unter Verwendung eines MPSF, wie hier dargestellt, die Gewebe induzierenden Eigenschaften von morphogenen Proteinen zu verstärken, bei der Verstärkung von neuen Gewebe induzierenden Eigenschaften von bekannten morphogenen Proteinen von Nutzen sein wird. Es ist auch vorauszusehen, daß die hier beschriebene Erfindung bei der Stimulierung von Gewebe induzierenden Eigenschaften von neuen morphogenen Proteinen von Nutzen sein wird, die zur BMP-Proteinfamilie gehören, wenn sie in der Zukunft identifiziert werden.
Produktion von morphogenen Proteinen
Die morphogenen Proteine, deren Aktivität gemäß dieser Erfindung in der Anwesenheit eines MPSF erhöht ist, können aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden. Morphogene Proteine können aus natürlichen Quellen isoliert werden, oder sie können durch Expression eines geeigneten rekombinanten DNA-Moleküls in einer Wirtszelle produziert werden. Zusätzlich können die morphogenen Proteine dieser Erfindung synthetisch erhalten werden und synthetische morphogene Proteine können gegebenenfalls durch ein rekombinantes DNA-Molekül in einer Wirtszelle exprimiert werden.
1. Aus natürlichen Quellen abgeleitete morphogene Proteine
In einer Ausführungsform dieser Erfindung werden morphogene Proteine aus natürlichen Quellen isoliert und im Zusammenwirken mit einem MPSF verwendet, um die Gewebebildung zu induzieren. Morphogene Proteine können unter Verwendung von herkömmlichen physikalischen und chemischen Trennverfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wohl bekannt sind, aus Gewebequellen gereinigt werden, vorzugsweise Gewebequellen von Säugern. Wenn ein Reinigungsprotokoll nicht veröffentlich ist, wie zum Beispiel für ein neu identifiziertes morphogenes Protein, können herkömmliche Reinigungsverfahren durchgeführt werden in Kombination mit Tests auf morphogene Aktivität nach jedem Schritt, um die morphogene Aktivität durch eine Reihe von Reinigungsschritten zu verfolgen und somit ein wirksames Reinigungsschema zu etablieren. Wenn verfügbar, können immunologische Reagentien alleine oder in Verbindung mit den vorstehenden Techniken verwendet werden, um morphogene Proteine zu reinigen.
Diese Erfindung stellt auch native Formen von osteogenem Protein bereit, die im Zusammenspiel mit einem MPSF wirken, um die Gewebebildung zu induzieren. Das osteogene Protein kann aus natürlichen Quellen gemäß dargestellten Protokollen gereinigt werden, wie zum Beispiel bei Oppermann et al., US-Patente Nr. 5,324,819 und 5,354,557 (vgl. Beispiel 1).
Das osteogene Proteine OP-1 wurde beschrieben (vgl. z. B. Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557). In seiner native Form ist OP-1 glycosyliert und hat ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 30–35 kD, wie mittels SDS-PAGE bestimmt. Wenn es reduziert ist, ergibt das Protein von 30–35 kD zwei glycosylierte Polypeptidketten, die ein offensichtliches Molekulargewicht haben, das von etwa 15 kD zu etwa 23 kD reichen kann. Im reduzierten Zustand hat das Protein von 30–35 kD keine nachweisliche osteogene Aktivität. Das deglycosylierte Protein, das osteogene Aktivität hat, hat ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 27 kD. Wenn reduziert, ergibt das Protein von 27 kD zwei deglycosilierte Polypeptide, die Molekulargewichte von etwa 14 kD bis 16 kD haben.
Die natürlichen osteogenen Proteine dieser Erfindung, die im Zusammenspiel mit einem MPSF wirken, um die Gewebebildung zu induzieren, können Formen, die verschiedene Glycosylierungsmuster haben, verschiedene N-Temini und aktive verkürzte oder mutierte Formen des nativen Proteins einschließen.
2. Rekombinant exprimierte Morphogene Proteine
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird ein morphogenes Protein durch Expression eines geeigneten rekombinanten DNA-Moleküls in einer Wirtszelle produziert und wird im Zusammenspiel mit einem MPSF verwendet, um die Gewebebildung zu induzieren. Von DNA- und Aminosäuresequenzen von vielen BMPs und OPs wurde berichtet und Verfahren für ihre rekombinante Produktion sind publiziert und dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet anderweitig bekannt. Für eine allgemeine Diskussion der Clonierungs- und rekombinanten DNA-Technik, vgl. Ausubel et al., vorstehend; vgl. auch Watson et al., Recombinant DNA, 2te Ausg. 1992 (W. H. Freeman und Co., New York).
Die DNA-Sequenzen, die Rinder- und menschliches BMP-2 (früher BMP-2A) und BMP-4 (früher BMP-2B) codieren und Verfahren für die rekombinante Produktion der entsprechenden Proteine sind in den US-Patenten Nr. 5,011,691; 5,013,649; 5,166,058 und 5,168,050 beschrieben.
Die DNA- und Aminosäuresequenzen von menschlichem und Rinder-BMP-5 und BMP-6 und Verfahren für ihre rekombinante Produktion sind in dem US-Patent Nr. 5,106,748 bzw. US-Patent Nr. 5,187,076 offenbart; vgl. auch US-Patente Nr. 5,011,691 und 5,344,654. Oppermann et al., US-Patente Nr. 5,011,691 und 5,258,494 offenbaren DNA- und Aminosäuresequenzen, die OP-1 (BMP-7) codieren und Verfahren für die rekombinante Expression von OP-1. Für die Ausrichtung der Aminosäuresequenzen von BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und OP-1 (BMP-7) vgl. WO 96/16034.
Die DNA-Sequenzen, die BMP-8 codieren, sind in WO 91/18098, und die DNA-Sequenzen, die BMP-9 codieren, in WO 93/00432 offenbart. Die DNA- und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen, die BMP-10 und BMP-11 codieren, sind in WO 94/26893 und WO 94/26892 offenbart. Die DNA- und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für BMP-12 und BMP-13 sind in WO 95/16035 offenbart.
Die vorstehenden Patentoffenbarungen, die DNA- und Aminosäuresequenzen und Verfahren für die Produktion von BMPs und OPs beschreiben, die von diesen Sequenzen codiert werden, sind durch Bezugnahme hier eingeschlossen.
Um Gene zu clonieren, die neue BMPs, OPs und andere morphogene Proteine codieren, die mittels Biotests in Extrakten identifiziert wurden, können Verfahren verwendet werden, die die "reverse Genetik" einschließen. Solche Verfahren starten mit einem Protein von bekannter oder unbekannter Funktion, um das Gen zu erhalten, die dieses Protein codiert. Als Anfangsschritt bei der Clonierung des Gens mittels reverser Genetik können Standardproteinreinigungsverfahren verwendet werden. Wenn genügend Protein gereinigt werden kann, um eine partielle Aminosäuresequenz zu erhalten, kann eine degenerierte DNA-Sonde, die in der Lage ist, mit der DNA-Sequenz zu hybridisieren, die die partielle Aminosäuresequenz codiert, geplant, synthetisiert und als Sonde verwendet werden, um Vollängenclone zu isolieren, die dieses oder ein verwandtes morphogenes Protein codieren.
In einer anderen Ausführungsform kann ein partiell gereinigter Extrakt, der das morphogene Mittel enthält, verwendet werden, um unter Verwendung von immunologischen Verfahren, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, Antikörper zu erzeugen, die gegen dieses Mittel gerichtet sind. Für morphogenes Protein spezifische Antikörper können dann als eine Sonde verwendet werden, um Expressionsbibliotheken, die aus cDNAs gemacht wurden, zu durchmustern (vgl. z. B: Broome und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 75, S. 2746–49 (1978); Young und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, S. 31–35 (1983)).
Für die Clonierung und Expression neuer BMPs, OPs und anderer morphogener Proteine, identifiziert auf der Basis von DNA-Sequenzhomologie, können die homologen Sequenzen unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Verfahren cloniert und sequenziert werden. Wenn die DNA-Sequenz verfügbar ist, kann ein DNA-Fragment, das das morphogene Protein codiert, in einen Expressionsvektor inseriert werden, der in Verbindung mit dem gewünschten Expressionssystem des Wirts ausgewählt wurde. Das DNA-Fragment wird so in den Vektor cloniert, daß seine Transkription von einem heterologen Promotor in dem Vektor kontrolliert wird, bevorzugt von einem Promotor, der ggf. reguliert werden kann.
Einige Wirt-Vektor-Systeme, die für die rekombinante Expression von BMPs und OPs geeignet sind, werden in den vorstehend zitierten Referenzen offenbart. Geeignete Wirtszellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Bakterien wie E. coli, Hefen wie Saccharomyces und Picia, Insekten-Baculovirus-Zellsysteme und primäre, transformierte oder immortalisierte eukaryontische Zellen in Kultur. Bevorzugte eukaryontische Wirtszellen umfassen CHO-, COS- und BSC-Zellen (vgl. nachstehend).
Ein geeigneter Vektor wird gemäß dem ausgewählten Wirtssystem ausgewählt. Nützliche Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt, auf Plasmide, Cosmide, Bakteriophagen, Insekten-Vektoren und Vektoren von tierischen Viren, einschließlich Retroviren, und andere einzel- oder doppelsträngige DNA-Viren.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung kann das morphogene Protein, das im Zusammenwirken einem MPSF verwendet wird, von einem rekombinanten DNA-Molekül abgeleitet sein, das in einem prokaryontischen Wirt exprimiert wird (Beispiel 2A). Unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technik wurde verschiedene Fusionsgene konstruiert, um die rekombinante Expression von osteogenen Sequenzen aus natürlichen Quellen in E. coli zu induzieren (vgl. z. B. Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557). Unter Verwendung von analogen Verfahren können DNAs, die verkürzte Formen von morphogenen Sequenzen aus natürlichen Quellen umfassen, als Fusionskonstrukte hergestellt werden, die mittels der säurelabilen Spaltstelle (Asp-Pro) mit einer Leader-Sequenz (wie dem "MLE-Leader") verknüpft sind, die für die Förderung der Expression in E. coli geeignet ist.
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird das morphogene Protein, das im Zusammenwirken mit einem MPSF verwendet wird, unter Verwendung eines Säuger- Wirt/Vektorsystems verwendet (Beispiel 2B). Es kann bevorzugt sein, eine Säugerprotein für therapeutische Verwendungen rekombinant in Säugerzellkultursystemen zu produzieren, um ein Protein zu produzieren, dessen Struktur eher der des natürlichen Materials entspricht. Die rekombinante Proteinproduktion in Säugerzellen erfordert die Etablierung von geeigneten Zellen und Zelllinien, die einfach zu transfizieren sind, in der Lage sind, die fremde DNA mit nicht umgelagerter Sequenz stabil zu behalten, und die die erforderlichen zellulären Komponenten für die effiziente Transkription, Translation, posttranslationale Modifikation und Sekretion des Proteins haben. Außerdem ist ein geeigneter Vektor erforderlich, der das Gen von Interesse trägt.
Die Planung des DNA-Vektors für die Transfektion in Säugerzellen sollte geeignete Sequenzen für die Förderung der Expression des Gens von Interesse umfassen, einschließlich: geeignete Transkriptions-Initiations-, -Terminations- und -Enhancersequenzen; effiziente RNA-Prozessierungssignale wie Spleiß- und Polyadenylierungssignale; Sequenzen, die die cytoplasmische mRNA stabilisieren; Sequenzen, die die Translationseffizienz erhöhen (z. B. Kozak-Consensussequenz); Sequenzen, die die Proteinstabilität erhöhen; und, wenn erwünscht, Sequenzen, die die Proteinsekretion erhöhen.
Bevorzugte DNA-Vektoren umfassen auch ein Markergen und Mittel, um die Zahl der Kopien des Gens von Interesse zu erhöhen. DNA-Vektoren können auch stabilisierende Sequenzen (z. B. ori- und ARS-ähnliche Sequenzen und Telomer-ähnliche Sequenzen) umfassen oder können alternativ so geplant werden, daß sie die gerichtete oder nicht gerichtete Integration in das Wirtszellgenom favorisieren.
Im letzten Jahrzehnt wurde ein wesentlicher Fortschritt bei der Entwicklung von Säugerzellexpressionssystemen erzielt und viele Aspekte des Systems sind gut charakterisiert. Ein detaillierter Überblick über die Produktion von fremden Proteinen in Säugerzellen, einschließlich nützlicher Zellen, die Proteinexpression fördernder Sequenzen, Markergene und Genamplifikationverfahren ist offenbart bei M. M. Bending, Genetic Engineering, 7, S. 91–127 (1988).
Spezielle Details der Transfektion, Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen sind gut dokumentiert und werden vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet verstanden. Weitere Details über die verschiedenen technischen Aspekte bei jedem Schritt, der bei der rekombinanten Produktion von fremden Proteinen in Säugerzellexpressionssystemen verwendet wird, können in einer Vielzahl von Texten und Laborhandbüchern im Stand der Technik gefunden werden. Vgl. z. B. F. M. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989).
In Kürze sind unter den am besten charakterisierten Transkriptionspromotoren, die für die Expression eines fremden Gens in einer speziellen Säugerzelle von Nutzen sind, der frühe SV40-Promotor, späte Hauptpromotor des Adenovirus (AdMLP), der Metallothionein-I-Promotor der Maus (mMT-I), die lange terminale Wiederholung (LTR) des Rous-sarcom-Virus (RSV), die lange terminale Wiederholung des Maus-Brusttumorvirus (MMTV-LTR) und der menschliche mittelfrühe Hauptpromotor des Cytomegalievirus (hCMV). Die DNA-Sequenzen für alle diese Promotoren sind im Stand der Technik bekannt und sind kommerziell verfügbar.
Ein Verfahren für die Genamplifikation in Säugerzellsystemen ist die Verwendung des selektierbaren Dihydrofolatreduktasegens (DHFR) in einer dhfr-Zelllinie. Im Allgemeinen wird das DHFR-Gen auf dem Vektor bereitgestellt, der das Gen von Interesse trägt und die Zugabe von steigenden Konzentrationen des cytotoxischen Wirkstoffs Methotrexat (MTX) führt zur Amplifikation der Anzahl an Kopien des DHFR-Gens wie auch der des physikalisch assoziierten Gens von Interesse. DHFR als selektierbares, amplifizierbares Markergen in tranfizierten Eierstockzelllinien des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) ist im Stand der Technik besonders gut charakterisiert. Andere amplifizierbare Markergene von Nutzen umfassen die Adenosin-Desaminase (ADA)- und die Glutamin-Synthetase (GS)-Gene.
In einem bevorzugten Expressionssytem wird die Genamplifikation durch die Modifizierung von regulatorischen Sequenzen der Markergenexpression (z. B. Enhancer-, Promotor- und Transkriptions- oder Translations-Initiationssequenzen) weiter verstärkt, um die Mengen von produziertem Markerprotein zu reduzieren. Die Erniedrigung des Ausmaßes an DHFR-Transkription erhöht die Kopienzahl an DHFR-Genen (und des physikalisch assoziierten Gens), um den transfizierten Zellen die Adaption ihres Wachstums an sogar niedrige Menge an Methotrexat (z. B. 0,1 μM MTX) zu ermöglichen. Bevorzugte Expressionsvektoren wie pH754 und pH752 (Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557, 19C und D) wurden unter Verwendung von rekombinanter Standard-DNA-Technologie manipuliert, um einen schwachen DHFR-Promotor zu schaffen. Wie der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet weiß, können andere nützliche schwache Promotoren, die von den hier gezeigten und bevorzugten differieren, unter Verwendung von Standard-Vektorkonstruktionsverfahren konstruiert werden. Außerdem können andere regulatorische Sequenzen auch modifiziert werden, um dieselben Effekte zu erzielen.
Ein anderes Genamplifikationsschema beruht auf der Temperatursensitivität (ts) von BSC40-tsA58-Zellen, die mit einem SV40-Vektor transfiziert wurden. Die Reduktion der Temperatur auf 33°C stabilisiert das temperatursensitive SV40 T-Antigen, was zum Ausschneiden und zur Amplifikation der integrierten transfizierten Vektor-DNA führt, wobei das physikalisch assoziierte Gen von Interesse amplifiziert wird.
Die Auswahl der Zellen/Zelllinien ist auch wichtig und hängt vom Bedarf des Durchschnittsfachmann ab. Affennierenzellen (COS) stellen hohe Ausmaße an transienter Genexpression bereit und stellen damit ein nützliches Werkzeug für die rasche Testung einer Vektorkonstruktion und die Expression von cloniertn Genen bereit. COS-Zellen werden mit dem Affenvirus 40 (SV40)-Vektor transfiziert, der das Gen von Interesse trägt. Die transfizierten COS-Zellen sterben nachfolgend ab und verhindern damit die langfristige Produktion des gewünschten Proteinprodukts. Die transiente Expression erfordert jedoch nicht das zeitraubende Verfahren, das für die Entwicklung von stabilen Zelllinien erforderlich ist.
CHO-Zellen sind zur erfolgreichen Expression einer großen Vielzahl von Proteinen von einem weiten Bereich von Zelltypen in der Lage. Während somit das Glycosylierungsmuster auf einem rekombinanten Protein, das in einem Säugerzellexpressionssystem produziert wurde, mag mit dem natürlichen Protein nicht identisch sein, sind die Unterschiede bei den Oligosaccharidseitenketten oft nicht essentiell für die biologische Aktivität des exprimierten Proteins.
Mehrere verschiedene Säugerzellexpressionssysteme können verwendet werden, um rekombinante morphogene Proteine zur Verwendung im Zusammenwirken mit einem MPSF gemäß dieser Erfindung zu exprimieren. Stabile Zelllinien wurden unter Verwendung von CHO-Zellen und einem temperatursensitiven (ts) Stamm von BSC-Zellen (Affennierenzellen, BSC40-tsA58; Biotechnology, 6, S. 1192–96 (1988)) für die langfristige Produktion des osteogenen Proteins OP-1 entwickelt. Unter den etablierten Zelllinien sind die CHO-Zellen bis heute möglicherweise die am besten charakterisierten und sind eine bevorzugte Zelllinie für die Säugerzellexpression von rekombinanten morphogenen Proteinen (Beispiel 2b).
Es wurde gefunden, daß zwei verschiedene Promotoren bei der Transkription von menschlichen osteogenen Proteinsequenzen (hOP1; SEQ ID Nr. 1) am meisten von Nutzen waren: der CMV-Promotor und der MMTV-Promotor, verstärkt durch die Enhancer-Sequenz vom Rous-sarkomvirus-(LTR). Der mMT-Promotor (Maus-Metallothionein-Promotor) und der späte SV40-Promotor wurden auch getestet. Mehrer Selektionsmarkergene wie neo (Neomycin) und DHFR werden verwendet.
Die Restriktionskarten und die Quellen von verschiedenen exemplarischen Expressionsvektoren, die für die Expression von OP-1 in Säugerzellen geplant wurden, sind in Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557 beschrieben (vgl. Beispiel 2B). Jedes dieser Vektorkonstrukte beinhaltet die cDNA-Sequenz voller Länge von menschlichem OP-1, die in den herkömmlichen pUC-Vektor (pUC-18) cloniert ist.
Es wird von dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet erkannt, daß auch DNA-Sequenzen verwendet werden können, die verkürzte Formen von osteogenem Protein codieren, unter der Vorraussetzung, daß der Expressionsvektor oder die Wirtszelle dann die Sequenzen bereitstellt, die erforderlich sind, um die Prozessierung und Sekretion des exprimierten Proteins zu steuern.
Rekombinantes OP-1 wurde in drei verschiedenen Zellexpressionssystemen exprimiert: COS-Zellen für die rasche Durchmusterung der Funktionalität der verschiedenen Expressionsvektorkonstrukte, CHO-Zellen für die Etablierung von stabilen Zelllinien und BSC40-tsA58-Zellen als ein alternatives Mittel zur Produktion von rekombinantem OP-1-Protein. Das hier offenbarte CHO-Zellexpressionssystem wird als die beste, gegenwärtig bekannte Ausführungsform für die langfristige rekombinante OP-1-Produktion in Säugerzellen angesehen (vgl. Beispiel 2B).
Wie vorstehend diskutiert, werden mehrere, vom Knochen abgeleitete osteogene Proteine (OPs) und BMPs als Homo- und Heterodimere vorgefunden, die in ihrer aktiven Form Disulfidbindungen zwischen den Ketten umfassen. Verfahren für die gemeinsame Expression und den Zusammenbau von heteromeren Polypeptiduntereinheiten in einem Wirt wurden beschrieben (vgl. z. B. WO 93/09229). BMP-2, BMP-4. BMP-6 und BMP-7 (OP-1) – ursprünglich aus Knochen isoliert – sind als Homodimere oder als Heterodimere bioaktiv.
Außerdem wurden auch Verfahren für die Erzeugung von Aminosäuresubstitutionsmutationen in BMPs und OPs beschrieben, die die erneute Faltung und/oder den Zusammenbau von Untereinheiten in Formen favorisieren, die eine höhere morphogene Aktivität zeigen (US-Patent Nr. 5,399,677).
Synthetische, nicht native morphogene Proteine
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung kann ein morphogenes Protein synthetisch für die Verwendung im Zusammenwirken mit einem MPSF zur Induktion der Gewebebildung hergestellt werden. Synthetisch hergestellte morphogene Proteine können native oder sie können nicht native Proteine sein, d. h. diejenigen, die ansonsten nicht in der Natur gefunden werden.
Nicht native osteogene Proteine wurden unter Verwendung einer Reihe von Consensus-DNA-Sequenzen (US-Patent Nr. 5,324,819) synthetisiert. Diese Consensus-Sequenzen wurden auf der Basis von partiellen Aminosäuresequenzdaten, die von natürlichen osteogenen Produkten erhalten wurden, und ihre beobachteten Homologien mit anderen in der Literatur berichteten Genen entworfen, die eine vermutete oder gezeigte Entwicklungsfunktion haben.
Mehrere der biosynthetischen Consensus-Sequenzen (osteogene Consensus-Proteine oder "COPs" genannt) wurden als Fusionsproteine in Prokaryonten exprimiert. Gereinigte Fusionsproteine können gespalten, wieder gefaltet, mit mindestens einem MPSF kombiniert (gegebenenfalls in einer Matrix oder Vorrichtung), in einem etablierten Tiermodell implantiert werden und es kann gezeigt werden, daß sie Knochen und/oder Knorpel induzierende Aktivität haben. Die gegenwärtig bevorzugten synthetischen osteogenen Proteine umfassen zwei synthetische Aminosäuresequenzen, die als COP5 (SEQ ID Nr. 2) und COP7 (SEQ ID Nr. 3) bezeichnet werden.
Die Aminosäuresequenzen dieser Proteine sind nachstehend gezeigt, wie bei Oppermann et al., US-Patente Nr. 5,011,691 und 5,324,819 ausgeführt:
Bei diesen Aminosäuresequenzen werden die Striche (–) nur zum Füllen verwendet, um vergleichbare Sequenzen in verwandten Proteinen aneinander auszurichten. Unterschiede zwischen den ausgerichtetn gelegten Aminosäuresequenzen sind hervorgehoben.
Somit ist in einer Ausführungsform dieser Erfindung das morphogene Protein, das im Zusammenwirken mit einem MPSF wirkt, um die Gewebebildung zu induzieren, ein synthetisches osteogenes Protein, welches eine partielle oder die gesamte Aminosäuresequenz von COP5 oder COP7 umfaßt, so daß es in der Lage ist, die Gewebebildung wie die Knorpel- und/oder Knochenbildung in der Anwesenheit eines MPSF zu induzieren, wenn es korrekt gefaltet ist und in einem Säuger implantiert ist.
COP-Proteine können in der Anwesenheit eines MPSF verwendet werden, um die Knochenbildung von Osteoblasten zu induzieren, wenn sie in einer günstigen Umgebung implantiert sind. In einer anderen Ausführungsform können COP-Proteine im Zusammenwirken mit einem MPSF verwendet werden, um Knorpel zu induzieren, wenn sie an einem avaskulären Ort implantiert werden oder wenn ein Inhibitor der Entwicklung zu vollständigem Knochen zusammen mit oder in der Nachbarschaft eines aktiven morphogenen Proteins implantiert wird.
Vorzugsweise umfaßt das synthetische morphogene Protein, das im Zusammenwirken mit einem MPSF der Erfindung wirkt, ein Protein, das eine Sequenz umfaßt, die ein hinreichendes Duplikat der Sequenzen von COP5 oder COP7 ist, so daß es in der Lage zur Gewebebildung ist, wie der Knochen- und/oder Knorpelbildung, wenn es korrekt gefaltet ist und in der Anwesenheit eines MPSF in einem Säuger implantiert ist. Mehr bevorzugt ist das Protein weniger als etwa 200 Aminosäuren lang.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die synthetischen Proteine Arten der generischen Aminosäuresequenzen:
wobei die Buchstaben die Aminosäurereste gemäß des Standard-Einbuchstabencodes angeben und die Xs Aminosäurereste darstellen (Reste 1–102 und 5–102 von SEQ ID Nr. 4). Cysteinreste sind hervorgehoben.
Die bevorzugten Aminosäuresequenzen innerhalb der vorstehenden generischen Sequenzen sind:
wobei jede der Aminosäuren, die vertikal an jeder Position in der Sequenz angeordnet ist, alternativ in verschiedenen Kombinationen verwendet werden kann (Seq. ID Nr. 5). Man beachte, daß diese generischen Sequenzen 6 und vorzugsweise 7 Cysteinreste haben, mit denen sie sich inter- und intramolekulare Disulfidbindungen bilden können, und daß sie andere kritische Aminosäuren enthalten, die die Tertiärstruktur dieser osteogenen Proteine beeinflussen.
Synthetische, nicht native osteogene Proteine können chemisch synthetisiert werden oder sie können unter Verwendung von Verfahren, die vorstehend für die rekombinante Expression von nativen DNA-Sequenzen beschrieben wurden, durch Einbringung der synthetischen DNA-Sequenzen in einem Expressionsvektor in eine Wirtszelle rekombinant exprimiert werden. Man nimmt an, daß diese biosynthetischen COP-Sequenzen während der erneuten Faltung dimerisieren und sie scheinen nicht aktiv zu sein, wenn sie reduziert sind. Es können Homodimere oder Heterodimere zusammengebaut werden.
Diese und andere synthetische, nicht native osteogene Proteine können im Zusammenwirken mit einem MPSF verwendet werden und gemäß hier beschreibener Verfahren unter Verwendung von in vitro-, ex-vivo- oder in vivo-Biotests auf die Induktion von Vorläuferzellen und Geweberegeneration getestet werden. Es wird in Betracht gezogen, daß nicht natives osteogenes Protein/MPSF-Kombinationen in der Lage sein werden, die Differenzierung von gewissen neuralen Linien zu induzieren, die von nativen osteogenen Proteinen induziert werden können.
Es wird auch in Betracht gezogen, daß nicht native osteogene Proteine im Zusammenwirken mit einem MPSF in der Lage sein werden, andere Arten von Vorläuferzellen zur Differenzierung und Proliferation zu induzieren. Somit können nicht natives osteogenes Protein und MPSF bei der Reparatur und Regeneration nicht nur von Knochen- und Knorpelgewebe von Nutzen sein, sondern auch von Bändern, Ligament, neuralem und potentiell anderen Arten von Gewebe und somit allgemein bei Verfahren der Gewebereparatur und -regeneration.
Homologe Proteine, die morphogene Aktivität haben
Die morphogenen Proteine, die gemäß dieser Erfindung im Zusammenwirken mit einem MPSF wirken, um die Gewebebildung zu induzieren, können durch die rekombinante Expression von DNA-Sequenzen produziert werden, die auf der Basis der Homologie mit den vorstehend beschriebenen osteogenen COP-Consensussequenzen isoliert wurden. Synthetische COP-Sequenzen, wie die vorstehend beschriebenen, können als Sonden zum Auffinden von verwandten DNA-Sequenzen aus einer Vielzahl von Arten verwendet werden (vgl. z. B. Oppermann et al., US-Patente Nr. 5,011,591 und 5,258,494. COP-Sequenzen haben zu genomischen DNAs geführt, von denen anschließend gezeigt wurde, daß sie, wenn sie korrekt zusammengesetzt wurden, Proteine codieren, die eine echte osteogene Aktivität haben, d. h. die, wenn sie ordnungsgemäß in einen Säuger implantiert waren, die vollständige Kaskade von Ereignissen induzieren, die zur Knochenbildung führen. Es wurden zum Beispiel unter Verwendung dieses Verfahrens die genomischen DNAs isoliert, die BMP-2 und OP-1 (BMP-7) codieren. Morphogene Proteine, die von einem Gen codiert werden, das mit einer COP-Sequenzsonde hybridisiert, sind vorzugsweise über Disulfidbindungen zu einem Paar von Untereinheiten zusammengebaut, um eine dimere Spezies zu bilden, die in der Lage ist, Gewebebildung zu induzieren, wenn sie in der Gegenwart eines MPSF in einen Säuger implantiert wird. Die dimere Spezies kann Homo- oder Heterodimere des mit COP verwandten Polypeptids umfassen, die mit einem heterologen Polypeptid zusammengebaut sind. Von rekombinanten Formen von BMP-2 und BMP-4 ist gezeigt worden, daß sie als mit OP-1 (BMP-7)-Untereinheiten zusammengebaute Homodimere und Heterodimere über die Artgrenzen hinaus eine osteogene Aktivität haben.
Morphogenes Protein codierende Gene, die mit synthetischen COP-Sequenzsonden hybridisieren, umfassen Gene, die Vgl, Inhibin, DPP, OP-1 (BMP-7), BMP-2 und BMP-4 codieren. Vgl ist ein bekanntes morphogenes Protein von Xenopus laevis, das in die frühe embryonale Musterbildung involviert ist. Inhibin ist ein anderes Entwicklungsgen, das ein Mitglied der BMP-Familie von Proteinen von Xenopus laevis ist. DPP ist eine Aminosäuresequenz, die von einem Drosophila-Gen codiert wird, das für die Entwicklung des dorso-ventralen Musters verantwortlich ist. OP-1 (auch als BMP-7 bezeichnet), BMP-2 und BMP-4 sind osteogene Proteine, die die Bildung von Knorpel, Knochen und neuralem Gewebe induzieren können (vgl. nachstehend). Verschiedene Kombinationen dieser Polypeptide, d. h. Heterodimere und Homodimere, haben morphogene Aktivität.
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung kann ein morphogenes Protein, das im Zusammenwirken mit einem MPSF wirkt, ein Polypeptid umfassen, das von einer Nucleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer "OPS"-Nucleinsäuresonde (Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557) hybridisieren kann. "OPS" – steht für OP-1 "short" – betrifft den Teil des menschlichen OP-1-Proteins, der das konservierte Skelett von 6 Cysteinen in der C-terminal aktiven Region definiert (97 Aminosäuren; Seq. ID Nr. 1, Reste 335–431).
Ein Beispiel für eine stringente Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung in 4 × SSC bei 65°C (oder 10°C höher als die berechnete Schmelztemperatur für ein Hybrid zwischen der Sonde und einer Nucleinsäuresequenz, die keine fehlgepaarten Basenpaare enthält), gefolgt von Waschen in 0,1 × SSC bei der Hybridisierungstemperatur. Eine andere stringente Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung in 50%-igem Formamid, 4 × SSC bei 42°C (vgl. z. B. T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, S. 387–89 (1982)).
Angesichts dieser Offenbarung kann somit der Durchschnittsfachmann Gene planen und synthetisieren, oder er kann Gene aus cDNA- oder genomischen Bibliotheken isolieren, die Aminosäuresequenzen codieren, die mit morphogener Aktivität assoziiert sind. Diese Gene können in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden, um große Mengen an aktiven osteogenen oder sonst morphogenen Proteinen zu produzieren. Rekombinant exprimierte Proteine können in ihrer nativen Form, verkürzte Analoga, Muteine, Fusionsproteine und andere konstruierte Formen sein, die in der Lage sind, die Bildung von Knochen, Knorpel oder von anderen Arten von Gewebe zu induzieren, gezeigt durch in vitro- und ex vivo-Biotests und durch in vivo-Implantation in Säugern, einschließlich des Menschen.
Wenn der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet einmal einen Biotest hat, der eine oder mehr morphogene Proteinaktivitäten nachweisen kann, kann ein stimulierender Faktor für ein morphogenes Protein (MPSF), der in der Lage ist, diese Aktivität zu stimulieren, unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren identifiziert werden.
Bevorzugte morphogene Proteine
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt das morphogene Protein, dessen Aktivität durch die Anwesenheit eines MPSF stimuliert werden kann, ein Paar von Disulfidverknüpften Untereinheiten, um eine dimere Spezies zu ergeben, wobei mindestens eine der Untereinheiten ein rekombinantes Polypeptid umfaßt, das zur BMP-Proteinfamilie gehört. Die dimere Spezies kann ein Homodimer oder ein Heterodimer sein und ist in der Lage, die Zellproliferation und/oder Gewebebildung zu induzieren, wenn sie Zugang zu einer Vorläuferzelle in dem Säuger hat. Die Vorläuferzelle kann induziert werden, um eine oder mehr Gewebearten zu bilden, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus endochondralem oder intramembranösen Knochen, Knorpel, Bänder-/Ligament-ähnlichem Gewebe, neuralem Gewebe und anderen Organgewebearten, einschließlich Nierengewebe.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das morphogene Protein ein osteogenes Protein, das in der Lage ist, die Vorläuferzelle zur Bildung von einer oder mehreren Gewebearten zu induzieren, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus endochondralem oder intramembranösen Knochen und Knorpel.
Bevorzugte morphogene und osteogene Proteine dieser Erfindung umfassen mindestens ein Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, OP-1 (BMP-7), BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, COP-5 und COP-7. Vorzugsweise umfaßt das morphogene Protein mindestens ein Polypeptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus OP-1 (BMP-7), BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-6; mehr bevorzugt OP-1 (BMP-7) und BMP-2; und am meisten bevorzugt OP-1 (BMP-7).
Wie der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wissen wird, wird das bevorzugte morphogene Protein dieser Erfindung, dessen Aktivität in der Gegenwart eines MPFS verstärkt wird, zum Teil von der zu generierenden Gewebeart und von den gewählten Implantationsstellen oder Behandlungsstellen abhängen. Diese Variablen können empirisch getestet werden.
Stimulatorische Faktoren für morphogenes Protein (MPSF)
Ein stimulatorischer Faktor für morphogenes Protein (MPSF) gemäß dieser Erfindung ist ein Faktor, der in der Lage ist, die Fähigkeit eines morphogenen Proteins zur Induktion der Gewebebildung aus einer Vorläuferzelle zu stimulieren. Der MPSF hat eine synergistische Wirkung auf die Gewebeinduktion durch das morphogene Protein.
Die Vorläuferzelle, die durch das morphogene Protein dieser Erfindung zur Proliferation und/oder Differenzierung induziert wird, ist vorzugsweise eine Säugerzelle. Bevorzugte Vorläuferzellen umfassen Chondroblasten, Osteoblasten und Neuroblasten des Säugers, alle frühere Entwicklungsvorläufer davon, und alle Zellen, die sich daraus entwickeln (d. h. Chondroblasten, prä-Chondroblasten und Chondrocyten). Die morphogenen Proteine sind jedoch in der Evolution hoch konserviert und es ist wahrscheinlich, daß nicht vom Säuger stammende Vorläuferzellen von denselben oder artfremden Kombinationen von morphogenen Proteinen und MPFS stimuliert werden. Es kann somit vorausgesehen werden, daß, wenn Schemata für die Implantation von xenogenen Zellen in den Menschen ohne Verursachung von schädlichen immunologischen Reaktionen zur Verfügung stehen, nicht vom Säuger stammende Vorläuferzellen, die gemäß den hier beschriebenen Verfahren durch morphogenes Protein und MPSF stimuliert wurden, für die Geweberegeneration und -reparatur im Menschen von Nutzen sein werden.
Die spezielle Wahl der relativen Konzentrationen, mit denen der MPSF kombiniert wird, können unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren systematisch variiert werden, um den an einer ausgewählten Behandlungsstelle induzierten Gewebetyp zu optimieren.
Der stimulatorischer Faktor für morphogenes Protein (MPSF) dieser Erfindung für die Induktion der Bildung von Knochen und/oder Knorpel im Zusammenwirken mit einem osteogenen Protein ist Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I (IGF-I). Wenn die Vorläuferzelle ein Osteoblast ist, der stimuliert wird, um Knochen zu bilden, schließen bevorzugte Kombinationen von osteogenen Protein/MPSF BMP-2- oder BMP-3-Homodimere aus, die im Zusammenwirken mit Vitamin D oder PTH verwendet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt der MPSF eine Verbindung oder ein Mittel, die/das in der Lage ist, die Bioaktivität eines anderen MPSF zu erhöhen. Mittel, die die MPSF-Bioaktivität erhöhen, umfassen zum Beispiel diejenigen, die die Synthese, die Halbwertszeit, die Reaktivität mit anderen Biomolekülen wie Bindungsproteinen, und Rezeptoren oder die Bioverfügbarkeit des MPSF erhöhen. Diese Mittel können Hormone, Wachstumsfaktoren, Peptide, Cytokine, Trägermoleküle wie Proteine oder Lipide oder andere Faktoren umfassen, die die Expression oder die Stabilität des MPSF erhöhen.
Wenn zum Beispiel der ausgewählte MPSF IGF-I ist, umfassen die Mittel, die seine Bioaktivität erhöhen, GH, PTH, Vitamin D und cAMP-Induktoren. Außerdem ist fast das gesamte IGF-I im Kreislauf und dem extrazellulären Raum an eine Gruppe von Bindungsproteinen mit hoher Affinität gebunden, die IGFBPs genannt werden und die die Bioaktivität von IGF-I erhöhen oder inhibieren können (vgl. z. B. Jones und Clemmons, Endocrine Reviews, 16, S. 3–34 (1995)).
Diese Mittel, die die Bioaktivität von IGF-I erhöhen, können als zusätzliche MPFSs in Kombination mit IGF-I verwendet werden, um die Gewebe induzierende Aktivität von morphogenem Protein zu stimulieren. Eine solche bevorzugte Kombination, die mindestens zwei MPSFs für die Knorpel- und Knochenbildung umfaßt, ist das osteogene Protein OP-1, IGF-I und PTH (vgl. nachstehend).
Vorzugsweise ist der MPSF in einer Menge anwesend, die in der Lage ist, die Gewebe induzierende Aktivität des morphogenen Proteins in einem Säuger synergistisch zu stimulieren. Die relativen Konzentrationen an morphogenem Protein und MPSF, die bei Verabreichung an einen Säuger die Gewebebildung optimal induzieren, können durch den Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren empirisch bestimmt werden.
Testen von mutmaßlichen stimulatorischen Faktoren für morphogenes Protein
Um einen MPSF zu identifizieren, der in der Lage ist, die Gewebe induzierende Aktivität eines ausgewählten morphogenen Proteins zu stimulieren, muß ein geeigneter Test ausgewählt werden. Zu Beginn ist es vorzuziehen, in vitro-Tests durchzuführen, um einen MPSF zu identifizieren, der in der Lage ist, die Gewebe induzierende Aktivität eines morphogenen Proteins zu stimulieren. Ein nützlicher in vitro-Test ist einer, der einen Nucleinsäure- oder Proteinmarker verfolgt, von dessen Expression bekannt ist, daß sie mit dem assoziierten Zelldifferenzierungsweg korreliert.
Die Beispiele 3 und 4 beschreiben Experimente unter Verwendung des osteogenen Proteins OP-1, um eine wirksame Konzentration an MPSF zu identifizieren und zu optimieren. Wie vorstehend beschrieben ist von OP-1 bekannt, daß es osteogene und neurogene Aktivität hat. Somit kann ein in vitro-Test, der die Expression eines mit der Osteogenese oder Neurogenese assoziierten Markers in geeigneten entsprechenden Vorläuferzellen beobachtet, verwendet werden, um einen oder mehrere MPSFs zu identifizieren, die im Zusammenwirken mit OP-1 funktionieren.
Testen von mutmaßlichen MPSFs unter Verwendung von morphogenen Tests
Ein bevorzugter Test für das Testen von potentiellen MPSFs mit OP-1 auf osteogene Aktivität ist der enzymatische Test auf alkalische Phosphatase (AP). AP ist ein Osteoblasten-Differenzierungsmarker in primären osteoblastischen FRC-Zellen (fötalen Rattenschädelzellen). Die durch OP-1 stimulierte AP-Aktivität ist das Resultat von erhöhten stabilen AP-mRNA-Niveaus, gemessen mittels Northern-Analyse. Das Verfahren ist generell wie folgt.
Zunächst wird ein MPSF durch Auswahl von einer oder mehreren Konzentrationen eines MPSF und durch ihr Testen allein oder in der Anwesenheit eines morphogenen Proteins identifiziert (Beispiele 3 und 4). Zum zweiten wird die Menge an MPSF, die im Zusammenwirken mit dem morphogenen Protein zum Erreichen von optimaler, vorzugsweise synergistischer Gewebeinduktion erforderlich ist, durch Erzeugen eines Dosis-Wirkungskurve bestimmt (Beispiel 3).
Gegebenenfalls können ein oder mehrere zusätzliche MPSFs, die die morphogene Aktivität, die von einem morphogenen Protein und einem ersten MPSF induziert wird, stimulieren oder anders ändern, identifiziert werden und eine neue multifaktorielle Dosis-Wirkungskurve erzeugt werden (Beispiel 5).
Die Mengen für zusätzliche biochemische Marker für die Knochenzelldifferenzierung können gemessen werden, um auf synergistische Wirkungen von OP-1 und anderen Proteinen, die zur BMP-Familie gehören, mit IGF-I und anderen IGF-I aktivierenden Mitteln, zu testen. Andere Knochenzelldifferenzierungsmarker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Typ I-Kollagen, Osteocalcin, Osteopontin, Knochen-Sialoprotein und PTH-abhängige cAMP-Mengen.
1 zeigt, daß IGF-I als ein MPSF wirken kann, der die osteogene Aktivität von OP-1 stimuliert. Exogenes IGF-I ruft eine stimulatorische Wirkung auf die Fähigkeit von OP-1 zur Induktion der FRC-Zelldifferenzierung hervor, gemessen über die Niveaus der Aktivität der zellulären alkalischen Phosphatase (AP). Exogenes IGF-I allein (bis zu 300 ng/ml) stimulierte die AP-Aktivität in FRC-Zellen nicht. IGF-I erhöhte jedoch die von OP-1 stimulierte AP-Aktivität 3–4-fach. Somit ist die stimulatorische Wirkung von IGF-I synergistisch.
Um zu zeigen, daß die MPSF-Aktivität von IGF-I nicht auf einem verunreinigenden Faktor beruhte, der in den IGF-I-Herstellungen anwesend war, die in dem vorstehenden Experiment verwendet wurden, wurde ein ähnliches Experiment in der Anwesenheit oder Abwesenheit eines IGF-I-spezifischen Antikörpers durchgeführt, der die Wirkung von IGF-I blockiert. Wie in 2 gezeigt, blockierte der anti-IGF-I-Antikörper, zumindest partiell, die von OP-1 stimulierte Aktivität der alkalischen Phosphatase. Während OP-1 (500 ng/ml) die AP-Aktivität 1,6-fach über die mit Träger behandelte Kontrollkultur stimulierte, reduzierte die gemeinsame Inkubation mit dem anti-IGF-I-Antikörper die Höhe der von OP-1 induzierten Stimulierung zu etwa 50%. Die Erhöhung der Menge an Antikörper reduzierte die Höhe nicht, was nahelegt, daß die Menge an Antikörper kein limitierender Faktor war. Diese Resultate zeigen, daß die von OP-1 induzierte Differenzierung von osteoblastischen Zellen durch die Erhöhung der IGF-I-Mengen stimuliert werden kann.
Nachdem ein morphogenes Protein/MPSF-Paar identifiziert wurde, ist es wünschenswert, die relativen Mengen von jeder Komponente zu identifizieren, die erforderlich sind, um optimale Niveaus an Gewebe induzierender Aktivität zu bewirken, wenn die beiden Komponenten zusammen arbeiten. Dies wird durch Testen der Gewebe induzierenden Aktivität getan, die produziert wird, wenn die Konzentration von jeder Komponente unabhängig von der anderen systematisch variiert wird. Das Resultat einer solchen Studie ist eine Dosis-Wirkungskurve für ein vorgegebenes morphogenes Protein/MPSF-Paar.
3 zeigt die Wirkung von variierenden IGF-I-Konzentrationen (1–100 ng/ml) als Funktion der OP-1-Konzentration (0–500 ng/ml) auf die synergistische Erhöhung der Knochen induzierenden Aktivität. Bei Abwesenheit von OP-1 stimulierte IGF-I nicht die AP-Aktivität in FRC-Zellen. Bei einer OP-1-Konzentration von 100 ng/ml jedoch verstärkte IGF-I selbst bei niedriger Konzentration (10 ng/ml) die von OP-1 stimulierte AP-Aktivität 1,5- bis 2-fach. Eine maximale Verstärkung (etwa 2,5-fach) wurde bei 25 ng/ml IGF-I bei einer OP-1-Konzentration von 200 ng/ml beobachtet. IGF-I bei höheren Konzentrationen verstärkte nicht mehr die von OP-1 stimulierte AP-Aktivität. Bei diesen höheren IGF-I-Konzentrationen wird die von OP-1 stimulierte Erhöhung der AP-Aktivität nicht inhibiert.
Das Ausmaß, mit dem OP-1 die Expression des Osteoblasten-Phänotyps in der Anwesenheit von IGF-I moduliert, wurde weiterhin durch Messen der von PTH stimulierten cAMP-Mengen bewertet, einem anderen Marker der osteoblastischen Differenzierung (TABELLE 1). 48 Stunden Behandlung von konfluenten FRC-Zellen mit 10 oder 200 ng/ml OP-1 allein erhöhte die von PTH stimulierten cAMP-Mengen 3- bis 4-fach im Vergleich mit den mit Lösungsmittel behandelten Kontrollzellen. IGF-I allein erhöhte die von PTH stimulierten cAMP-Mengen nicht. 48 Stunden Inkubation von FRC-Zellen mit OP-1 (100 oder 200 ng/ml) und IGF-I (10–50 ng/ml) resultierte in einer dosisabhängigen Stimulation mit einer maximalen Erhöhung der cAMP-Mengen von etwa 1,7-fach.
TABELLE 1
TABELLE 1: Mit PTH stimulierte cAMP-Anhäufung in mit OP-1 und OP-1 + IGF-I behandelten FRC-Zellen. Konfluente FRC-Zellen in Platten mit 48 Mulden wurden mit Lösungsmittelträger, OP-1 (100 oder 200 μg/ml) allein, IGF-I (10, 25 oder 50 μg/ml) allein, oder OP-1 (100 oder 200 μg/ml) + IGF-I (10, 25 oder 50 μg/ml) in serumfreiem Medium behandelt und, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden cAMP-Tests durchgeführt. Die cAMP-Mengen wurden bestimmt und das Verhältnis der cAMP-Mengen in den Kulturen, die mit PTH behandelt worden waren, zu den in Kulturen ohne PTH wurde berechnet. Das Vielfache der Stimulation unter allen experimentellen Bedingungen wurde berechnet und als Verhältnis zur Kontrolle (wo kein OP-1 als 1 definiert war) ausgedrückt. Die Werte stellen dreifache Bestimmungen in zwei unabhängigen Experimenten dar.
Andere, noch zu identifizierende Faktoren können ebenfalls die induktive Aktivität von OP-1 beeinflussen, und ähnliche Tests können unter Verwendung von OP-1 und IGF-I durchgeführt werden, um einen oder mehrere zusätzliche MPSFs zu identifizieren, die die osteoinduktive Aktivität von OP-1 in der Gegenwart von IGF-I stimulieren können (Beispiel 5).
Um die Wirkung einer Vorbehandlung von FRC-Zellen mit OP-1 auf die synergistische Wirkung von IGF-I zu bewerten, wurden die Zellen zunächst in einer konstanten Konzentration von OP-1 inkubiert (500 ng/ml). IGF-I (25 ng/ml) wurde anschließend zu verschiedenen Zeitpunkten zu der Kultur zugegeben und das AP-Niveau wurde am Ende von 48 Std. Inkubation bestimmt. 4 zeigt, daß die maximale synergistische Wirkung beobachtet wurde, wenn die FRC-Zellen gleichzeitig mit OP-1 und IGF-I behandelt wurden. Die Wirkung war signifikant reduziert, wenn IGF-I 6 Std. oder später nach der Behandlung mit OP-1 zugegeben wurde. 24 Std. Vorinkubation von FRC-Zellen mit IGF-I (25 ng/ml), gefolgt von der Behandlung mit OP-1 (500 ng/ml), hebt die synergistische Wirkung auf. Wenn somit das morphogene Protein OP-1 ist und der MPSF IGF-I ist, ist es bevorzugt, daß sie zum gleichen oder etwa zum gleichen Zeitpunkt verabreicht werden, damit der MPSF seine maximale Wirkung hat.
Es mag nicht für jede Kombination aus morphogenem Protein/MPSF zutreffen, daß die gemeinsame Verabreichung für die Induktion der morphogenen Aktivität optimal ist. Wenn zum Beispiel der MPSF (MPSF-1) ein Mittel ist, das die Expression eines anderen MPSF (MPSF-2) induziert, kann gefunden werden, daß die vorherige Verabreichung von MPSF-1 bevorzugt ist, so daß hohe Mengen an MPSF-2 anwesend sind, wenn das ausgewählte morphogene Protein verabreicht wird. Die hier beschriebenen Verfahren können vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet verwendet werden, um ein Verabreichungsprotokoll für eine vorgegebene Kombination aus morphogenen Protein/MPSF zu optimieren, um einen ausgewählten Gewebetyp an einer ausgewählten Behandlungsstelle zu induzieren.
Das vorstehend für OP-1 und IGF-I beschriebene Verfahren kann generell mit jedem ausgewählten morphogenen Protein verwendet werden, um mutmaßliche MPSF-Verbindungen zu testen (Beispiel 4). Zunächst wird das morphogene Protein oder die morphogene Verbindung verwendet, um die Bedingungen für einen Test zu identifizieren und dann zu optimieren, der genau die Induktion eines speziellen Typs eines Zelldifferenzierungswegs darstellt, der mit Gewebebildung assoziiert ist. Wie vorstehend beschrieben, wird in diesem Stadium ein in vitro-Test bevorzugt, der repräsentativ für die Induktion des gewünschten Gewebetyps ist. Der Test kann die mRNA- oder Protein-Mengen als Funktion der Zeit oder zu einem festgesetzten Zeitpunkt nach der Verabreichung des morphogenen Proteins an Zellen oder einen Gewebeexplantat feststellen.
Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden wachsende Konzentrationen der folgenden Verbindungen als MPSFs in Kombination mit einer einzigen Konzentration (200 ng/ml) an osteogenem Protein OP-1 getestet: a) Östradiol (5); b) Wachstumshormon (hGH; 6); c) Hydrocortison (HC; 7); d) Insulin (8); e) Parathyroidhormon (PTH; 9); und f) Progesteron (PG; 10). Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß jede der vorstehenden Verbindungen in einem speziellen Konzentrationsbereich in Kombination mit OP-1 als ein MPSF funktioniert.
Generell wird mindestens etwa 1 ng/ml an morphogenem Protein mit mindestens etwa 0,01 ng/ml an MPSF kombiniert, um ein Anwachsen bei der morphogenen Aktivität zu beobachten. Bevorzugte Konzentrationsbereiche für Kombinationen von osteogenem Protein OP-1 und MPSF bei der Induktion der Bildung von Knochen und Knorpel, bestimmt durch Experimente wie denjenigen, die in den 3 und 5–10 gezeigt sind, sind in der TABELLE 2 gezeigt. Es wird vorausgesehen, daß einige der MPSFs, insbesondere die Hormone, wirkungsvoller sein können, wenn sie den Zellen vor der Verabreichung der OP-1/MPSF-Zusammensetzung verabreicht werden.
TABELLE 2 Bevorzugte Konzentrationsbereiche für OP-1/MPSF
Bevorzugte Konzentrationsbereiche für Kombinationen von osteogenem Protein OP-1 und MPSF bei der Induktion der Bildung von Knochen und Knorpel sind in der TABELLE 3 gezeigt.
TABELLE 3 Mehr Bevorzugte Konzentrationen für OP-1/MPSF
Es wird vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet verstanden werden, daß der bevorzugte Konzentrationsbereich von MPSF in einem speziellen Test in Abhängigkeit von der Konzentration des ausgewählten morphogenen Proteins variieren kann. Die systematische Variation der relativen Konzentrationen des morphogenen Proteins und des MPSF sollte durchgeführt werden, um die Konzentrationsverhältnisse der zwei Faktoren zu optimieren. Das kann, im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben und in 3 für OP-1 und IGF-I gezeigt, durchgeführt werden.
Um zu bestimmen, ob andere Mitglieder der IGF-Wachstumsfaktorfamilie mit OP-1 auch eine synergistische Wirkung zeigen, ähnlich der, die für IGF-I beobachtet wird, wurden FRC-Zellen mit OP-1 (500 ng/ml) und variierenden Konzentrationen an IGF-II gemeinsam inkubiert. Wie in 11 gezeigt, erhöhte oder inhibierte IGF-II (10–300 ng/ml) nicht die von OP-1 stimulierte Erhöhung bei der AP-Aktivität. Außerdem war das Niveau der AP-Aktivität in FRC-Kulturen, die mit IGF-I (25 ng/ml) + OP-1 (500 ng/ml) behandelt worden waren, ähnlich zu dem in Kulturen, die mit IGF-II (25 ng/ml) + IGF-I (25 ng/ml) + OP-1 (500 ng/ml) behandelt worden waren. Somit verstärkt IGF II (925 ng/ml) die synergistische Wirkung, die IGF-I auf die von OP-1 induzierte Gewebebildung hat, nicht weiter.
Die in 12 zusammengestellten Daten zeigen, daß TGF-β kein MPSF in Kombination mit OP-1 bei dem AP-Aktivitätstest in FRC-Zellen ist. TGF-β allein stimulierte die AP-Aktivität nicht. TGF-β (0,05–3,0 ng/ml) zeigte keine synergistische Wirkung mit OP-1 auf die AP-Aktivität.
Das Testen von mutmaßlichen MPSFs unter Verwendung von Zellproliferationstests
Ein morphogenes Protein kann in der Lage sein, eine spezielle Vorläuferzelle zur Proliferation zu stimulieren (d. h. eine oder mehrere Runden an Mitose und Zellteilung zu initiieren). Ein stimulierender Faktor für ein morphogenes Protein kann auf der Basis seiner Fähigkeit zur Stimulierung der Zellproliferation in der Anwesenheit des ausgewählten morphogenen Proteins identifiziert werden. Somit ist ein anderer bevorzugter Test für das Testen von potentiellen MPSFs – wie hier gezeigt für die von OP-1 induzierte osteogene Aktivität – der Thymidineinbautest, der die Fähigkeit von einer oder mehreren Substanzen testet, die Zellteilung zu stimulieren, gemessen mittels erhöhter DNA-Synthese.
1. Fötale Rattenschädeldachzellen (FRC)
13A zeigt, daß 24 Stunden Behandlung von FRC-Zellen mit OP-1 in einer dosisabhängigen Stimulation des Einbaus von [³H] Thymidin in DNA resultierte. Bei 500 ng/ml OP-1 wurde eine maximale 1,8-fache Stimulation beobachtet (p < 0,001 im Vergleich mit der Kontrolle). Die halbmaximale und maximale Stimulation des Einbaus von [³H] Thymidin geschah bei OP-1-Konzentrationen von etwa 150 und 500 ng/ml. Die Wirkung von IGF-I auf die von OP-1 induzierte Zellproliferation wurde dann untersucht.
13B zeigt, daß IGF-I allein die Zellproliferation leicht (1,3-fach), aber signifikant (p < 0,04) in dosisabhängiger Weise stimulierte, in Übereinstimmung mit publizierten Ergebnissen, daß IGF-I bei FRC-Zellen eine schwache mitogene Wirkung hat (Centrella und Canalis, Endocrinol. Rev., 6, S. 544–551 (1985)). Bei Anwesenheit von 100 ng/ml OP-1 erhöhten steigende Konzentrationen von IGF-I den Thymidineinbau um das etwa 1,2-fache im Vergleich mit OP-1 allein (p < 0,03). Eine maximale Verstärkung wurde mit 25 ng/ml IGF-I bei Anwesenheit von 200 ng/ml OP-1 beobachtet, mit einer etwa 1,5-fachen Erhöhung beim Thymidineinbau im Vergleich mit dem mit OP-1 allein nachgewiesenen (p < 0,005) Eine 1,3-fache Erhöhung beim Thymidineinbau wurde auch mit 50 ng/ml IGF-I bei Anwesenheit von 500 ng/ml OP-1 beobachtet, im Vergleich mit OP-1 allein (p < 0,01). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, daß die kombinierte Behandlung von FRC-Zellen mit OP-1 und IGF-I eine signifikante stimulierende Wirkung auf die Zellproliferation über die von OP-1 oder IGF-I allein hinaus hatte.
2. Menschliche Osteosarkomzellen
Wie vorstehend gezeigt, resultierte die simultane Behandlung von fötalen Rattenschädeldachzellen (FRC) mit OP-1 und IGF-I in einer synergistischen Wirkung auf die Induktion der Differenzierung und Mitogenese dieser Zellen, wenn die Aktivität der alkalischen Phosphatase als Differenzierungsmarker und der [³H] Thymidineinbau als Marker für die Mitogenese verwendet wurde. Als nächstes fragten wir uns, ob OP-1 und IGF-I eine ähnliche Synergie zeigten, wenn sie Osteoblastenzellen anderen Ursprungs verabreicht werden. Bei dieser Studie wurde die Wirkung der Behandlung von menschlichen Osteosarkomzellen mit OP-1 und IGF-I gemäß der in Beispiel 14 beschriebenen Verfahren untersucht.
14 zeigt die Wirkungen von OP-1 und IGF-I auf den [³H] Thymidineinbau bei menschlichen osteogenen SaOS-2-Sarkomzellen und 15 zeigt die Wirkungen von OP-1 und IGF-I auf den [³H]-Thymidineinbau bei menschlichen TE85-Osteosarkomzellen. Die Behandlung mit OP-1 allein schien die Aktivität der alkalischen Phosphatase weder bei den SaOS-2- noch bei den TE85-Zellen zu stimulieren. Die Inkubation von mit OP-1 behandelten Zellen mit steigenden Konzentrationen an exogenem IGF-I (10–100 ng/ml) stimulierte auch nicht die Aktivität der alkalischen Phosphatase. Eine Interpretation dieser Beobachtungen ist, daß beide Zelllinien festgelegte differenzierende osteoblastische Zellen sind, bei denen OP-1 nicht in der Lage war, eine weitere Differenzierung zu induzieren.
Im Gegensatz dazu stimulierte die Behandlung dieser menschlichen Osteosarkomzellen mit OP-1 und IGF-I die Zellproliferation, wie mit dem [³H] Thymidineinbautest (Beispiel 3) festgestellt wurde. Wie in den 14 und 15 gezeigt, stimulierte OP-1 allein den [³H]-Thymidineinbau leicht in den TE85-Zellen, aber nicht in den SaOS-2-Zellen (Spalten 4). Exogenes IGF-I allein stimulierte den [³H] Thymidineinbau in beiden Zelllinien (Spalten 2 und 3) in Übereinstimmung mit publizierten Ergebnissen, daß IGF-I für viele verschiedene Zelltypen mitogen ist, einschließlich Osteoblasten (vgl. vorstehend). Die Behandlung mit OP-1 und IGF-I in Kombination stimulierte den [³H] Thymidineinbau in dosisabhängiger und synergistischer Weise (Spalten 5–8).
Demnach ist die in osteoblastischen Zellen der Ratte beobachtet Synergie bei der Wirkung von OP-1 und IGF-I in ähnlicher Weise auf zwei verschiedene menschliche osteoblastische Zelllinien zutreffend.
Modifizierte Formen von IGF-I funktionieren als ein MPSF
IGF-I ist ein einzelkettiges Polypeptid von 70 Aminosäureresten. Eine natürlicherweise vorkommende Variante von IGF-I, "Des(1-3)-IGF-I", ist eine wirksame, am Aminoende verkürzte Form des Moleküls, das erhöhte mitogene und Gen induzierende Aktivitäten im Vergleich mit IGF-I voller Länge hat (vgl. z. B. Adashi et al.,J. Clin. Investig., 90, S. 1593–99 (1992); W. Ruan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, S. 10872–876 (1992); Clark et al., Clinical Science, 86, S. 709–14 (1994); und Russo und Werther, Growth Factors, 11, S. 301–11 (1994)). Es wurde postuliert, daß die Erhöhung bei der mitogenen Aktivität das Ergebnis einer Verminderung der Affinität von Des(1-3)-IGF-I zu den IGF-Bindungsproteinen (IGFBPs) ohne größere Verminderung seiner Affinität zu den IGF-I-Rezeptoren ist (vgl. z. B. G. L. Francis et al., J. Mol. Endocrinology, 8, S. 213–223 (1992)). Die Konsequenz ist, daß man glaubt, daß eine höhere effektive Konzentration von ungebundenem Wachstumsfaktor für die Wechselwirkung mit den IGF-I-Rezeptoren zur Verfügung steht.
Die vorliegende Studie wurde geplant, um zu bestimmen, ob diese spezielle verkürzte Form von IGF-I, wie das IGF-I-Molekül voller Länge, bei der Stimulation der morphogenen Aktivität in fötalen Rattenschädeldachzellen (FRC) eine synergistische Wirkung mit OP-1 zeigen würde. Die Wirksamkeit der verkürzten IGF-I-Variante bei der Synergie wurde ebenfalls untersucht.
16 zeigt die Wirkungen von OP-1 und IGF-I oder Des(1-3)-IGF-I auf die durch OP-1 stimulierte Aktivität der alkalischen Phosphatase in FRC-Zellen. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde in FRC-Zellen gemessen, die mit 200 ng/ml OP-1 und mit steigenden Konzentrationen von IGF-I oder Des(1-3)-IGF-I behandelt waren, wie in Beispiel 15 beschrieben. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen stimulierte OP-1 allein die Aktivität der alkalischen Phosphatase 5- bis 7-fach über die Kontrolle. IGF-I und OP-1 stimulierten die Aktivität der alkalischen Phosphatase synergistisch und in einer IGF-I dosisabhängigen Weise (16). (Das Niveau an Synergie ist auch bei OP-1 dosisabhängig, wie in 3 gezeigt). Bei niedrigen Konzentrationen war Des(1-3)-IGF-I etwa 1,5-fach wirksamer als IGF-I. Diese Beobachtung ist in Übereinstimmung mit dem Postulat, daß eine Verminderung bei der Affinität von Des(1-3)-IGF-I zu den IGFBPs zu einer höheren Konzentration von ungebundenem Wachstumsfaktor, der für die Wechselwirkung mit den IGF-I-Rezeptoren zur Verfügung steht, führt. Die Daten implizieren weiterhin, daß die bei einem IGF-I-Molekül voller Länge beobachtete OP-1/IGF-I-Synergie mindestens partiell das Resultat eines vom IGF-I-Rezeptor vermittelten Ereignisses ist.
Die Ausmaße an Stimulation durch beide Formen an IGF-I waren bei höheren Konzentrationen ähnlich. Der leichte Abfall bei der relativen Aktivität der alkalischen Phosphatase bei 50 ng/ml an Des(1-3)-IGF-I war statistisch nicht signifikant. Vermutlich waren bei diesen hohen Konzentrationen an Des(1-3)-IGF-I und IGF-I die IGF-I-Rezeptoren gesättigt und die Rolle der IGFBPs bei der Regulierung der Bioverfügbarkeit von IGF-I wurde minimiert.
Somit kann eine variante Form von IGF-I, die, verglichen mit IGF-I voller Länge, wegen ihrer erhöhten Stabilität und/oder ihrer Fähigkeit zur Wechselwirkung mit den Rezeptoren bei niedrigeren Konzentrationen in vitro und/oder in vivo eine größere Aktivität hat, gemäß dieser Erfindung als ein MPSF verwendet werden, um die Aktivität eines morphogenen Proteins zu stimulieren. Mehrere variante Formen von IGF-I wurden beschrieben (vgl. z. B. G. L. Francis et al., vorstehend). In ähnlicher Weise kann man voraussehen, daß andere variante Formen von IGF-I (z. B. Mutanten, Fusionen, Hybride, Verkürzungen und dergleichen), die eine erhöhte in vivo-Stabilität, eine verminderte Affinität für Bindungsproteine und/oder eine verminderte Affinität für die Rezeptorbindung haben, als MPSFs gemäß dieser Erfindung von Nutzen sein werden.
Zum Beispiel kann man voraussehen, daß immobilisierte Formen von IGF-I, die eine längere effektive Halbwertszeit haben, wenn sie in vivo implantiert werden, und die ihre biologische Aktivität behalten, als MPSFs von Nutzen sein können, die in einer örtlich beschränkten Weise wirken. IGF-I kann zum Beispiel unter Verwendung von Routineverfahren mittels chemischer Verknüpfung an andere Proteine oder an Affinitätsmatrices gekoppelt sein. Vgl. z. B. M. Brinkley, "A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and crosslinking reagents" in Perspectives in Bioconjugate Chemistry (C. F. Mears, Hrsg.), S. 59–70, American Chemical Society, Wash. D. C. (1993); Nilsson, K. und Mosbach, K., "Immobilization of enzymes and affinity ligands to various hydroxyl groups carrying supports using highly reactive sulfonyl chlorides," Biochem. Biophys. Res. Commun., 102, S. 449–457 (1981); und G. T. Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, California, Academic Press (1992).
Es wird weiterhin vorausgesehen, daß andere MPSFs, die gemäß der Verfahren hier identifiziert werden können, durch Produktion von varianten Formen dieses MPSF auch bezüglich ihrer Aktivität optimiert werden können, wobei diese Formen veränderte Fähigkeiten zur Wechselwirkung mit anderen zellulären Proteinen wie Ziel- und/oder kompetitiven Rezeptoren, inhibitorischen und/oder stimularorischen Bindungsproteinen und dergleichen, veränderte Stabilitäten oder veränderte Lokalisationscharakteristika haben. Verfahren zur Produktion von varianten Formen von Proteinen durch chemische Modifikationen, Mutagenese und rekombinante DNA-Technologie sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt. Die varianten Formen eines MPSF können dann gemäß der hier beschriebenen Verfahren bezüglich ihrer Fähigkeit zur Stimulation der Zellproliferation und/oder Zelldifferenzierung in der Anwesenheit eines morphogenen Proteins getestet werden und mit dem ursprünglichen MPSF verglichen werden. Auf diese Weise können Kombinationen aus morphogenen Protein/MPSF optimiert werden, um auf eine gewünschte Weise in dem speziellen therapeutischen Kontext, für den sie letzendlich gedacht sind, zu funktionieren.
Basierend auf Dosis-Wirkungskurven von morphogenem Protein/MPSF in morphogenen und/oder mitogenen Tests wie den vorstehend diskutierten können Zusammensetzungen, die ein morphogenes Protein und einen MPSF umfassen, mit verschiedenen Konzentrationsverhältnissen formuliert werden und sie können in einem Biotest getestet werden, der ausgewählt wurde, um die Gewebe induzierende Aktivität zu repräsentieren, die letztlich bei der Gewebebehandlung verwendet werden wird. Der bevorzugte Test ist letztlich ein ex vivo- oder in vivo-Gewebeinduktionsbiotest wie diejenigen, die in den Beispielen 7–13 beschrieben sind.
Arzneimittel
Die Arzneimittel, die durch diese Erfindung bereitgestellt werden, umfassen mindestens eine und gegebenenfalls mehr als eine Kombination aus morphogenem Protein/MPSF, die in der Lage sind, die Gewebebildung zu induzieren, wenn sie einem Patienten verabreicht oder implantiert werden. Die Zusammensetzungen dieser Erfindung werden mit einer wirksamen Dosis verabreicht, um den speziellen Gewebetyp an der Behandlungsstelle zu induzieren, ausgewählt gemäß dem speziell zu behandelnden klinischen Syndrom. Die Bestimmung der bevorzugten pharmazeutischen Formulierung und ein therapeutisch wirksames Dosisschema für eine gegebene Anwendung gehört zum Stand der Technik unter Berücksichtigung von zum Beispiel der Verabreichungsart, dem Zustand und Gewicht des Patienten, dem Ausmaß der gewünschten Behandlung und der Verträglichkeit der Behandlung für den Patienten.
Dosen, von denen man erwartet, daß sie geeignete Startpunkte für die Optimierung des Behandlungsschemas sind, basieren auf den Ergebnissen von in vitro-Tests (z. B. Beispiele 3-5), und ex vivo- oder in vivo-Tests (z. B. Beispiele 7–13). Auf der Basis der Ergebnisse solcher Tests kann ein Bereich von geeigneten Konzentrationsverhältnissen an morphogenem Protein und MPSF ausgewählt werden, um eine Behandlungsstelle in Tieren und dann in Menschen zu testen.
Die Verabreichung der morphogenen Proteine und von MPSF dieser Erfindung, einschließlich isolierter und gereinigter Formen von Komplexen mit morphogenem Protein, ihrer Salze oder ihrer pharmazeutisch verträglichen Derivate kann unter Verwendung jeder herkömmlich akzeptierten Verabreichungsart von Mitteln erreicht werden, die immunsuppressive Aktivität zeigen.
Die Arzneimittel, die ein morphogenes Protein und einen MPSF dieser Erfindung umfassen, können in einer Vielzahl von Formen sein. Diese umfassen zum Beispiel feste, halbfeste und flüssige Dosisformen wie Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Zäpfchen und injizierbare und infundierbare Lösungen. Die bevorzugte Form hängt von der beabsichtigten Verabreichungsart und der therapeutischen Anwendung ab und kann vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet ausgewählt werden. Die Verabreichungsarten können die orale, parenterale, subkutane, intravenöse, intraläsionale oder topische Verabreichung umfassen. In den meisten Fällen werden die Arzneimittel dieser Erfindung in der Nähe der Behandlungsstelle verabreicht, die einer Geweberegeneration oder -reparatur bedarf.
Die Arzneimittel, die ein morphogenes Protein und einen MPSF dieser Erfindung umfassen, können zum Beispiel in sterilen, isotonischen Formulierungen mit oder ohne Cofaktoren plaziert werden, die die Aufnahme oder Stabilität stimulieren. Die Formulierung ist vorzugsweise flüssig, oder sie kann ein lyophilisiertes Pulver sein. Zum Beispiel können das morphogene Protein und der MPSF dieser Erfindung mit einem Formulierungspuffer verdünnt sein, der 5,0 mg/ml Citronensäuremonohydrat, 2,7 mg/ml Trinatriumcitrat, 41 mg/ml Mannit, 1 mg/ml Glycin und 1 mg/ml Polysorbat 20 umfaßt. Diese Lösung kann lyophilisiert, unter Kühlen gelagert und vor der Anwendung mit sterilem Wasser-für-die-Injektion (USP) rekonstituiert werden.
Die Zusammensetzungen werden bevorzugt herkömmliche pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen, die im Stand der Technik bekannt sind (vgl. zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, 16te Ausgabe, 1980, Mac Publishing Company). Solche pharmazeutisch akzeptablen Träger können andere medizinische Mittel, Träger, genetische Träger, Adjuvantien, Excipienten usw. umfassen, wie menschliches Serumalbumin oder Plasmaherstellungen. Die Zusammensetzungen sind vorzugsweise in der Form einer Einheitsdosis und werden üblicherweise mit einem Dosisschema verabreicht, das von der speziellen Gewebebehandlung abhängt.
Die Arzneimittel dieser Erfindung können auch in Verbindung mit einer morphogenen Vorrichtung unter Verwendung von zum Beispiel Mikrokügelchen, Liposomen, anderen mikropartikulären Verabreichungssystemen oder Formulierungen mit andauernder Freisetzung verabreicht werden, wobei die Vorrichtung in der Nähe oder auf andere Weise in Kommunikation mit dem betroffenen Geweben oder dem Blutstrom, der diese Gewebe durchströmt, plaziert wird (vgl. nachstehend morphogene Vorrichtungen).
Liposomen, die ein morphogenes Protein und einen MPSF dieser Erfindung enthalten, können mittels wohl bekannter Verfahren hergestellt werden (vgl. z. B. DE 32 18 121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, S. 3688–92 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, S. 4030–34 (1980); US-Patente Nr. 4,485,045 und 4,544,545). Üblicherweise sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200–800 Angstrom) unilamellären Typ, bei denen der Lipidgehalt mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist. Der Anteil an Cholesterin wird so ausgewählt, um das optimale Maß an Freisetzung von morphogenem Protein und MPSF zu kontrollieren.
Die morphogenen Proteine und MPSFs dieser Erfindung können auch an Liposomen gebunden sein, die andere biologisch aktive Moleküle wie immunsuppressive Mittel, Cytokine usw. enthalten, um das Ausmaß und die Charakteristika der Gewebeinduktion zu modulieren. Die Bindung von morphogenen Proteinen und MPSFs an Liposomen kann mittels jedes bekannten Verknüpfungsmittels erreicht werden, wie heterobifunktionellen Verknüpfungsmitteln, die eine breite Anwendung bei der Kopplung von Toxinen oder chemotherapeutischen Mitteln an Antikörper für die zielgerichtete Verabreichung gefunden haben. Die Konjugation an Liposomen kann auch unter Verwendung des auf Kohlenwasserstoffe gerichteten Verknüpfungsmittels 4-(4-Maleimidophenyl)buttersäurehydrazid (MPBH) erreicht werden (Duzgunes et al.,J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).
Morphogene Vorrichtungen
Die morphogenen Vorrichtungen dieser Erfindung umfassen ein morphogenes Protein und mindestens einen MPSF, der in einem implantierbaren, biokompatiblen Trägermaterial dispergiert ist, das als geeignetes Verabreichungs- oder Trägersystem für diese Verbindungen fungiert. Geeignete Beispiele für Träger mit andauernder Freisetzung umfassen semipermeable Polymermatrices in der Form von geformten Artikeln wie Zäpfchen oder Kapseln. Implantierbare oder mikrokapsuläre Matrices mit andauernder Freisetzung umfassen Polylactide (US-Patent Nr. 3,773,319; EP 58,481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22, S. 547–56 (1985); Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Ethylenvinylacetat (Langer et al.,J. Biomed. Mater. Res., 15, S. 167–277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12, S. 98–105 (1982).
In einer Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt der Träger für die morphogene Vorrichtung eine biokompatible Matrix, die aus Partikeln von porösem Material aufgebaut ist. Die Poren sind vorzugsweise von einer Dimension, die einer Vorläuferzelle die Wanderung und anschließende Differenzierung und Proliferation erlaubt. Es können verschiedene Matrices, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden (vgl. z. B. US-Patente Nr. 4,975,526; 5,162,114; 5,171,574 und WO 91/18558).
Die Partikelgröße sollte im Bereich von 70 μm–850 μm sein, vorzugsweise 70 μm–420 μm und am meisten bevorzugt 150 μm–420 μm. Die Matrix kann durch dichtes Packen von partikulärem Material in eine Form hergestellt werden, die den speziellen, zu behandelnden Gewebedefekt überspannt. In einer anderen Ausführungsform kann ein Material, das biokompatibel und vorzugsweise in vivo biologisch abbaubar ist, strukturiert werden, um als temporäre Stütze und Substrat für die Rekrutierung von wandernden Vorläuferzellen und als Basis für ihre anschließende Verankerung und Proliferation zu dienen.
Nützliche Matrixmaterialien umfassen zum Beispiel Kollagen; Homopolymere oder Copolymere von Glycolsäure, Milchsäure und Buttersäure, einschließlich ihrer Derivate; und keramische Materialien wie Hydroxyapatit, Tricalciumphosphate und andere Calciumphosphate. Es können auch verschiedene Kombinationen dieser und anderer geeigneter Matrixmaterialien von Nutzen sein, bestimmt mittels der hier dargelegten Tests.
Gegenwärtig bevorzugte Träger umfassen partikulären, demineralisierten, mit Guanidin extrahierten, speziesspezifischen (allogenen) Knochen, und speziell behandelten partikulären, mit Protein extrahierten, demineralisierten xenogenen Knochen (Beispiel 6). Gegebenfalls können solche xenogenen Knochenpulvermatrices auch mit Proteasen wie Trypsin behandelt werden. Vorzugsweise werden die xenogenen Matrices mit einem oder mehreren die Fibrillen modifizierenden Mitteln behandelt, um das intrapartikuläre Intrusionsvolumen (die Porosität) und die Oberfläche zu vergrößern. Nützliche modifizierende Mittel umfassen Lösungsmittel wie Dichlormethan, Trichloressigsäure, Acetonitril und Säuren wie Trifluoressigsäure und Fluorwasserstoffsäure. Das gegenwärtig bevorzugte Fibrillen modifizierende Mittel, das bei der Formulierung der Matrices dieser Erfindung nützlich ist, ist ein erhitztes wäßriges Medium, vorzugsweise ein saures wäßriges Medium, das einen pH-Wert von weniger als etwa 4,5 hat, am meisten bevorzugt hat es einen pH-Wert im Bereich von etwa pH 2–pH 4. Ein gegenwärtig bevorzugtes erhitztes saures wäßriges. Medium ist 0,1%-ige Essigsäure, die einen pH-Wert von etwa 3 hat. Erhitzen von demineralisiertem, von Lipiden befreitem, mit Guanidin extrahiertem Knochenkollagen in einem wäßrigen Medium bei erhöhten Temperaturen (d. h. im Bereich von etwa 37°C–60°C, vorzugsweise im Bereich von etwa 45°C–60°C) für etwa eine Stunde ist im Allgemeinen ausreichend, um die gewünschte Oberflächenmorphologie zu erreichen. Obwohl der Mechanismus nicht klar ist, wird die Hypothese aufgestellt, daß die Hitzebehandlung die Kollagenfibrillen ändert, was in einem Anwachsen der Partikeloberfläche resultiert.
Demineralisierter, mit Guanidin extrahierter, xenogener Rinderknochen umfaßt ein Gemisch von zusätzlichen Materialien, die unter Verwendung von biomolekularen Standardreinigungsverfahren weiter fraktioniert werden können. Zum Beispiel kann eine chromatographische Trennung von Extraktkomponenten, gefolgt von der Zugabe der verschiedenen Extraktfraktionen, entsprechend den Peaks im Chromatogramm, zurück zu der aktiven Matrix, verwendet werden, um die Eigenschaften der Matrix durch Wegfraktionieren von Inhibitoren der Knochen oder Gewebe induzierenden Aktivität zu verbessern.
Es können in der Matrix auch wesentlich die restlichen Schwermetalle vermindert werden. Wenn behandelt, wie hier offenbart, können die einzelnen Schwermetallkonzentrationen in der Matrix auf weniger als etwa 1 ppm reduziert werden.
Der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet kann eine biokompatible Matrix seiner Wahl, die eine gewünschte Porosität oder Oberflächenmikrotextur hat und die bei der Produktion von morphogenen Vorrichtungen von Nutzen ist, um die Induktion von Knochen oder anderem Gewebe zu fördern, oder als biologisch abbaubares Implantat mit andauernder Freisetzung schaffen. Zusätzlich können synthetisch formulierte Matrices, hergestellt, wie hier offenbart, verwendet werden.
Allgemeine Betrachtung der Matrixeigenschaften
Das gegenwärtig bevorzugte Trägermaterial ist eine xenogene, von Knochen abgeleitete partikuläre Matrix, die, wie hier beschrieben, behandelt wird. Dieser Träger kann entweder durch ein biologisch abbaubares synthetisches oder ein synthetisches anorganisches Material ersetzt werden (z. B. Hydroxyapatit (HAP), Kollagen, Carboxymethylcellulose, Tricalciumphosphat oder Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polybuttersäure und ihre verschiedenen Copolymere).
Die Matrixgeometrie, die Partikelgröße, die Anwesenheit von Oberflächenladung und das Maß der intra- und interpartikulären Porosität sind alle wichtig für eine erfolgreiche Matrixleistung. Untersuchungen haben gezeigt, daß die Oberflächenladung, die Partikelgröße, die Anwesenheit von Mineralien und die Methodik für die Kombination der Matrix und des morphogenen Proteins alle beim Erreichen einer erfolgreichen Gewebeinduktion eine Rolle spielen.
Zum Beispiel kann bei der Knochenbildung unter Verwendung des osteogenen Proteins OP-1 und eines MPSF eine Störung der Matrixladung durch chemische Modifikation die Knochen induzierenden Reaktionen vernichten. Die Partikelgröße beeinflußt die quantitative Reaktion von neuem Knochen; Partikel zwischen 70 μm und 420 μm rufen die maximale Reaktion hervor. Die Verunreinigung der Matrix mit Knochenmineral wird die Knochenbildung inhibieren. Am wichtigsten ist, daß die Verfahren, die zur Formulierung des osteogenen Proteins und des MPSF auf die Matrix verwendet werden, extrem sensitiv gegenüber dem physikalischen chemischen Zustand der Proteine und der Matrix sind.
Die aufeinanderfolgenden zellulären Reaktionen an der Berührungsfläche von Knochenmatrix/Implantate mit osteogenem Protein sind komplex. Die mehrstufige Kaskade umfaßt: Bindung von Fibrin und Fibronectin an die implantierte Matrix, Wanderung und Proliferation von mesenchymalen Zellen, Differenzierung der Vorläuferzellen zu Chondroblasten, Knorpelbildung und Calcifizierung von Knorpel, vaskuläres Einwachsen, Knochenbildung, Knochenremodellierung und Knochenmarkdifferenzierung.
Ein erfolgreicher Träger für morphogenes Protein und MPSF sollte mehrere wichtige Funktionen erfüllen. Er sollte als Verabreichungssytem mit langsamer Freisetzung von morphogenem Protein und MPSF wirken, das morphogene Protein und den MPSF vor unspezifischer Proteolyse schützen und sollte jeden Schritt der zellulären Reaktionen erleichtern, der in die Induktion der Vorläuferzelle während der Gewebeentwicklung involviert sind.
Zusätzlich müssen ausgewählte Materialien in vivo biokompatibel sein und vorzugsweise biologisch abbaubar; der Träger wirkt vorzugsweise als temporäres Gerüst, bis er vollständig durch neuen Knochen oder neues Gewebe ersetzt ist. Polymilchsäure (PLA), Polyglycolsäure (PGA) und verschiedene Kombinationen haben in vivo verschiedene Auflösungsraten. In Knochen können die Auflösungsraten variieren, je nachdem, ob sie in corticalen oder trabekulären Knochen plaziert sind.
Das bevorzugte Matrixmaterial für eine osteogene Vorrichtung, hergestellt aus xenogenem Knochen und behandelt, wie hier offenbart, produziert ein implantierbares Material, das in einer Vielzahl von klinischen Vorgaben von Nutzen ist. Zusätzlich zu ihrer Verwendung als Matrix bei der Knochenbildung bei verschiedenen orthopädischen, peridontalen und rekonstruktiven Verfahren kann die Matrix auch als Träger mit andauernder Freisetzung oder als Kollagenbeschichtung für orthopädische oder allgemeine prothetische Implantate verwendet werden.
Die Matrix kann im Vorgriff der Operation wie gewünscht geformt werden oder vom Arzt oder Techniker während der Operation geformt werden. Es wird bevorzugt, die Matrix so zu formen, daß sie einen Gewebedefekt überspannt und daß sie die gewünschte Form des neuen Gewebes annimmt. Im Falle der Knochenreparatur eines Pseudoarthrosedefekts ist es wünschenswert, Ausmaße zu verwenden, um den Pseudoarthrosedefekt zu überspannen. Untersuchungen an Ratten haben gezeigt, daß der neue Knochen so gebildet wird, daß er die Ausmaße der implantierten Vorrichtung hat. Somit kann das Material für topische, subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Implantate verwendet werden. Bei dem Knochenbildungsverfahren wird das Material langsam vom Körper absorbiert und wird von Knochen in der Form oder fast in der Form des Implantats ersetzt.
Die Matrix kann einen formstabilen Feststoff umfassen, der aus locker gebundenem, partikulärem Material besteht, z. B. Kollagen. Sie kann auch einen geformten, porösen Feststoff oder einfach ein Aggregat von dicht gepackten Partikeln umfassen, die vom umgebenden Gewebe an der Stelle gehalten werden. Es kann auch Mastix-Muskel oder anderes Gewebe verwendet werden. Große allogene Knochenimplantate können als Träger für die Matrix dienen, wenn ihre Knochenmarkhohlräume gesäubert sind und mit Partikeln gepackt sind, die dispergiertes osteogenes Protein und MPSF umfassen. Die Matrix kann auch die Form einer Paste oder eines Hydrogels einnehmen.
Wenn das Trägermaterial eine Hydrogelmatrix umfaßt, betrifft dies ein dreidimensionales Netzwerk von verknüpften hydrophilen Polymeren in der Form eines Gels, das im Wesentlichen aus Wasser aufgebaut ist, vorzugsweise Gele mit mehr als 90% Wasser, aber nicht beschränkt darauf. Hydrogelmatrices können eine positive oder negative Nettoladung tragen, oder sie können neutral sein. Eine typische Matrix mit negativer Nettoladung ist Alginat. Hydrogele, die eine positive Nettoladung tragen, können mittels extrazellulärer Matrixkomponenten wie Kollagen oder Laminin typisiert werden. Beispiele für kommerziell erhältliche extrazelluläre Matrixkomponenten umfassen Matrigel^TM und Vitrogen^TM. Ein Beispiel für ein neutrales Hydrogel ist hoch verknüpftes Polyethylenoxid oder Polyvinylalkohol.
Zahlreiche Wachstumsfaktoren, Cytokine, Hormone, trophische Mittel und therapeutische Zusammensetzungen einschließlich Antibiotika und chemotherapeutische Mittel, Enzyme, Enzyminhibitoren und andere bioaktive Mittel können auch an dem Trägermaterial, das das morphogene Protein und MPSF umfaßt, absorbiert oder darin dispergiert sein und werden auch im Lauf der Zeit an der Stelle des Implantats freigesetzt, wenn das Matrixmaterial langsam absorbiert wird.
Andere gewebespezifische Matrices
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen, aus natürlichen Quellen abgeleiteten Knochenmatrices können nützliche Matrices auch synthetisch durch Zusammengeben von Reagentien formuliert werden, die angemessen modifiziert wurden. Ein Beispiel für eine solche Matrix ist die poröse, biokompatible, in vivo biologisch abbaubare synthetische Matrix, die in der WO91/18558 offenbart wurde.
Kurz gesagt umfaßt die Matrix ein poröses, verknüpftes, strukturelles Polymer von biokompatiblem, biologisch abbaubarem Kollagen, am meisten bevorzugt gewebespezifisches Kollagen, und geeigneten gewebespezifischen Glycosaminoglycanen als gewebespezifischen Zellanheftungsfaktoren. Knochengewebe-spezifisches Kollagen (d. h. Typ I Kollagen), das aus einer Anzahl von Quellen abgeleitet wurde, kann für die Verwendung in diesen synthetischen Matrices geeignet sein, einschließlich lösliches Kollagen, säurelösliches Kollagen, Kollagen, das in neutralen oder basischen wäßrigen Lösungen löslich ist, ebenso wie die Kollagene, die kommerziell erhältlich sind. Außerdem kann Typ II-Kollagen, wie es in Knorpel gefunden wird, in Kombination mit Typ I-Kollagen verwendet werden.
Glycosaminoglycane (GAGs) oder Mucopolysaccharide sind Polysaccharide, die aus Resten von Hexoaminen aufgebaut sind, die glycosidisch gebunden sind und in einer mehr oder weniger regelmäßigen Weise Hexouronsäure- oder Hexosereste abwechselnd eingebaut haben. GAGs sind tierischen Ursprungs und haben eine gewebespezifische Verteilung (vgl. z. B. Dodgons et al., in Carbohydrate Metabolism and its Disorders, Dickens et al., Hrsg., Bd. 1, Academic Press (1968)). Die Reaktion mit den GAGs stellt auch ein Kollagen mit einer anderen wertvollen Eigenschaft bereit, d. h. die Unfähigkeit des Hervorrufens einer Immunreaktion (Fremdkörperreaktion) bei einem tierischen Wirt.
Nützliche GAGs umfassen diejenigen, die Sulfatgruppen enthalten, wie Hyaluronsäure, Heparin, Heparinsulfat, Chondroitin-6-sulfat, Chondroitin-4-sulfat, Dermatansulfat und Keratinsulfat. Für osteogene Vorrichtungen wird gegenwärtig Chondroitin-6-sulfat bevorzugt. Andere GAGs können auch zur Bildung der hier beschriebenen Matrix geeignet sein, und der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet wird unter Verwendung von lediglich Routineexperimenten entweder andere geeignete GAGs kennen oder sich ihrer versichern können. Für eine detailliertere Beschreibung der Mucopolysaccharide vgl. Aspinall, Polysaccharides, Pergamon Press, Oxford (1970).
Kollagen kann mit einem GAG in wäßriger saurer Lösung zur Reaktion gebracht werden, vorzugsweise in verdünnter Essigsäurelösung. Durch tropfenweise Zugabe von GAG zu der wäßrigen Kollagensuspension entstehen Copräzipitate von verknäulten Kollagenfibrillen, die mit GAG beschichtet sind. Diese verknäulte Masse von Fasern kann dann homogenisiert werden, um eine homogene Dispersion von feinen Fasern zu bilden, und kann dann filtriert und getrocknet werden.
Die Unlöslichkeit der Kollagen-GAG-Produkte kann durch kovalente Verknüpfung dieser Materialien bis zum erwünschten Maß erhöht werden, was auch dazu dient, um die Resistenz gegenüber der Resorption dieser Materialien zu erhöhen. Im Allgemeinen ist jedes G60 Verknüpfungsverfahren, das zur Verknüpfung von Kollagen geeignet ist, auch für die Verknüpfung dieser zusammengesetzten Materialien geeignet, obwohl die Verknüpfung durch ein dehydrothermales Verfahren bevorzugt wird.
Wenn trocken, sind die verknüpften Partikel im Wesentlichen sphärisch mit Durchmessern von etwa 500 μm. Rasterelektronenmikroskopie zeigt Poren von etwa 20 μm auf der Oberfläche und 40 μm im Innern. Das Innere ist aus fibrösen und blattähnlichen Strukturen aufgebaut und stellt somit Oberflächen für die Zellanheftung zur Verfügung. Die Hohlräume sind verbunden, so daß die Zellen durch das Innere der Partikel einen Zutritt haben. Das Material scheint zu etwa 99,5% Leervolumen zu sein, was das Material bezüglich der potentiellen Zellmasse, die pro Gramm Mikroträger wachsen kann, sehr wirkungsvoll macht.
Eine andere nützliche synthetische Matrix ist eine, die aus biokompatiblen, in vivo biologisch abbaubaren synthetischen Polymeren formulieret wurde, so wie diejenigen, die aus Glycolsäure, Milchsäure und/oder Buttersäure aufgebaut sind, einschließlich Copolymeren und Derivaten davon. Diese Polymere sind im Stand der Technik gut beschrieben und kommerziell verfügbar. Zum Beispiel können Polymere, die aus Polymilchsäure (d. h. MG 100 ka), 80% Polylaktid/20% Glycosid oder Poly-3-Hydroxybuttersäure (d. h. MG 30 ka), aufgebaut sind, alle bei PolySciences, Inc. gekauft werden. Die Polymerzusammensetzungen werden im Allgemeinen in partikulärer Form erhalten und die morphogenen Vorrichtungen werden vorzugsweise unter wasserfreien Bedingungen (z. B. in einer Ethanol-Trifluoressigsäure-Lösung, EtOH/TFA) hergestellt, um die Hydrolyse der Polymere zu vermeiden. Außerdem kann man unter Verwendung einer Anzahl von speziellen Lösungsmittelbehandlungen, die im Stand der Technik bekannt sind, die Morphologie der partikulären Polymerzusammensetzung ändern, zum Beispiel um die Porosität zu erhöhen.
Herstellung der morphogenen Vorrichtung
Die aus natürlichen Quellen stammenden, synthetischen und rekombinanten morphogenen Proteine und MPSFs, wie vorstehend beschrieben, ebenso wie andere Konstrukte können kombiniert und unter Verwendung eines der beschriebenen Verfahren in einer geeigneten Matrixherstellung dispergiert werden. Im Allgemeinen werden etwa 500–1000 ng an aktivem morphogenem Protein und etwa 10–200 ng eines aktiven MPSF mit 25 mg der inaktiven Trägermatrix für Biotests in der Ratte kombiniert. Bei größeren Tieren werden etwa 0,8–1 mg an aktivem morphogenem Protein pro Gramm Träger mit 100 ng oder mehr aktivem MPSF kombiniert. Die optimalen Verhältnisse an morphogenem Protein zu MPSF für eine spezifische Kombination und einen spezifischen Gewebetyp können durch den Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet gemäß der hier beschriebenen Verfahren empirisch bestimmt werden. Für große Implantate können größere Mengen verwendet werden.
Prothetische Vorrichtungen
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird eine implantierbare prothetische Vorrichtung bereitgestellt, die ein osteogenes Protein und einen MPSF umfaßt. Jedes prothetische Implantat, das für eine spezielle Behandlung vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet ausgewählt wurde, kann in Kombination mit einer Zusammensetzung verwendet werden, die gemäß dieser Erfindung mindestens ein osteogenes Protein und mindestens einen MPSF umfaßt. Die Prothese kann aus einem Material hergestellt sein, das Metall oder Keramik umfaßt. Bevorzugte prothetische Vorrichtungen werden ausgewählt aus der Gruppe, die aus einer Hüftvorrichtung, einer Schraube, einem Stab und einem Titankäfig für operative Wirbelsäulenversteifung besteht.
Die osteogene Vorrichtung wird auf dem prothetischen Implantat auf einer Oberflächenregion aufgebracht, die in der Nähe eines Zielgewebes in einem Säuger implantiert werden kann. Vorzugsweise ist der Säuger ein menschlicher Patient. Die Zusammensetzung wird auf der Oberfläche des Implantats in einer Menge aufgebracht, die ausreicht, um verstärktes Gewebewachstum in die Oberfläche zu fördern. Die Menge an Zusammensetzung, die ausreicht, um verstärktes Gewebewachstum zu fördern, kann unter Verwendung von Biotests wie denjenigen, die hier und in Rueger et al., US-Patent Nr. 5,344,654 beschrieben sind, empirisch vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bestimmt werden. Vorzugsweise werden zur Optimierung der Konzentration der Zusammensetzungskomponenten Tierstudien durchgeführt, bevor eine ähnliche prothetische Vorrichtung in einem menschlichen Patienten verwendet wird. Solche prothetischen Vorrichtungen werden für die Reparatur von orthopädischen Defekten, Verletzungen oder Anomalien in dem behandelten Säuger von Nutzen sein.
Somit stellt dieser Erfindung auch ein Verfahren zur Förderung der Integration in vivo einer implantiertbaren prothetischen Vorrichtung in ein Zielgewebe eines Säugers bereit, welches die Schritte der Bereitstellung einer Zusammensetzung auf der Oberfläche der prothetischen Vorrichtung, die mindestens ein osteogenes Protein und mindestens einen MPSF umfaßt, und die Implantation der Vorrichtung an einem Ort in einem Säuger umfaßt, wo das Zielgewebe und die Oberfläche der prothetischen Vorrichtung mindestens partiell für einen Zeitraum in Kontakt gehalten werden, der ausreicht, um verstärktes Gewebewachstum zwischen dem Zielgewebe und der Vorrichtung zu erlauben.
Biotests
Die verschiedenen morphogenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen dieser Erfindung werden vorzugsweise in ex vivo- oder in vivo-Biotests bewertet. Untersuchungen in Ratten zeigen, daß die osteogene Wirkung in einer geeigneten Matrix abhängig ist von der Dosis des morphogenen Proteins, das in der Matrix dispergiert ist. Es wird keine Aktivität beobachtet, wenn die Matrix allein implantiert wird. In vivo-Biotests, die im Rattenmodell durchgeführt wurden, haben auch gezeigt, daß demineralisierte, mit Guanidin extrahierte, xenogene Knochenmatrixmaterialien des in der Literatur beschriebenen Typs im Allgemeinen als Träger unwirksam sind, bei der Induktion von Knochen versagen können und eine Entzündungs- oder immunologische Reaktion produzieren können, wenn sie implantiert werden, außer sie werden, wie vorstehend offenbart, behandelt. Bei gewissen Arten (z. B. Affen) sind anscheinend auch allogene Matrixmaterialien als Träger unwirksam (Aspenberg et al., J. Bone Joint Surgery, 70, S. 625–627 (1988)). Die Beispiele 6–13 stellen unter Verwendung von in vivo-Biotests in Säugern verschiedene Verfahren für die Herstellung von morphogenen Vorrichtungen und für die Bewertung ihres morphogenen Nutzens dar.
Ein Rattenbiotest für die Knocheninduktion – basierend auf dem Biotest für die Induktion der Knochendifferenzierungsaktivität, wie beschrieben von Sampath und Reddi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, S. 6591–95 (1983)) – kann verwendet werden, um die osteogene Aktivität von osteogenen Proteinen im Zusammenwirken mit einem oder mehreren MPSFs zu messen (Beispiel 7). Rattenbiotests werden als erster Schritt beim Wechseln von in vitro-Testresultaten zu in vivo-Implantationsuntersuchungen bevorzugt.
Die Katze und das Kaninchen als etablierte Modelle für die Wirksamkeit in großen Tieren für die Testung von osteogenen Vorrichtungen wurden im Detail beschrieben (Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557; Beispiel 8 und Beispiel 9). Das Oberschenkelmodell der Katze, das Ellenmodell des Kaninchens, das Ellenmodell des Hundes (Beispiel 10) oder das Affenmodell (Beispiel 11) sind alles nützliche Tests, um zu bewerten, ob die Zusammensetzungen und Vorrichtungen dieser Erfindung, die ein oder mehrere osteogene Proteine in Kombination mit einem oder mehreren MPSFs umfassen, die Knochenregeneration in vivo erhöhen können, und für die Bestimmung der optimalen Dosierung von Kombinationen aus morphogenem Protein/MPSF.
Vorzugsweise werden die Ergebnisse von dem Rattenbiotest (Beispiel 7) als Ausgangspunkt für Optimierungsuntersuchungen in einem dieser Modelle mit größeren Tieren verwendet. Am meisten bevorzugt wird die Untersuchung mit größeren Tieren im Hund oder im Affen durchgeführt. Während die Untersuchungen an der Katze und dem Kaninchen als Trägermaterial für die osteogene Vorrichtung allogene Matrices verwenden, nimmt man an, daß eine geeignete Behandlung, wie sie hier beschrieben wird, von einem vom Knochen abgeleiteten oder synthetischen Material die Matrix geeignet für xenogene Implantate macht. Die Ergebnisse im Kaninchen tendieren jedoch dazu, daß sie weniger voraussagbar sind, wenn osteogene Proteine (mit oder ohne MPSF) in einer vom Rind abgeleiteten Kollagenmatrix dispergiert sind.
Rekombinantes BMP-2 ist wirkungsvoll bei der Reparatur von großen Knochendefekten in einer Vielzahl von anderen Biotests in Säugern. Implantierte osteogene Vorrichtungen, die BMP-2 umfassen, heilen erfolgreich segmentale Defekte im Oberschenkel der Ratte (Yasko et al., J. Bone Joint Surg., 74A, S. 659–70 (1992), des Schafs (Gerhart et al., Clin. Orthop., 293, S. 317–26 (1993), im Unterkiefer des Hundes (Toriumi et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 117, S 1101–12 (1991) und bei Schädeldefekten bei Ratten und Hunden.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um die Fähigkeit von einem oder mehreren MPSFs zur Erhöhung der osteogenen Aktivität von einem oder mehreren osteogenen Proteinen bei der Knochen- und/oder Knorpelegeneration und – reparatur in vivo zu bewerten. Diese Verfahren können auch verwendet werden, um die Bedingungen zur Erhöhung der osteogenen Aktivität unter Verwendung von einem oder mehreren MPSFs zu optimieren. Es wird angenommen, daß die Wirksamkeit von jeder Kombination aus osteogenen Protein/MPSF unter Verwendung dieser Tests charakterisiert werden kann. Verschiedene Kombinationen aus osteogenem Protein/MPSF, Dosis-Wirkungs-Kurven, verschiedene Matrices aus natürlichen Quellen oder synthetisch und jede andere erwünschte Variation bei den Komponenten der osteogenen Vorrichtung können unter Verwendung der Verfahren, wie sie im Wesentlichen beschrieben werden, getestet werden.
Biotest für die Bildung von Sehnen-/Bänder-ähnlichem Gewebe
Eine modifizierte Version des ectopischen Implantationstests der Ratte von Sampath und Reddi (vgl. vorstehend) wurde von Celeste et al., WO 95/16035 berichtet. Der modifizierte Test verfolgt die Bildung von Sehnen- und Bänder-ähnlichem Gewebe, die von morphogenen Proteinen induziert wird (wie BMP 12, BMP 13 und menschliches MP52). Dieser Test bei Sehnen-/Bänder-ähnlichem Gewebe kann verwendet werden, um MPSFs zu identifizieren, die die Bildung von Sehnen- und Bänder-ähnlichem Gewebe durch BMP 12, BMP 13 oder andere morphogene Proteine an einer speziellen Behandlungsstelle stimulieren (Beispiel 12). Der Test kann auch verwendet werden, um die Konzentrationen und Behandlungszeitpläne für therapeutische Gewebereparaturanwendung zu optimieren.
Es sollte verstanden werden, daß die vorstehenden experimentellen Verfahren innerhalb des Stands der Technik in einer Reihe von Weisen modifiziert werden können, um bei der Bestimmung von Nutzen zu sein, ob eine morphogene Vorrichtung in der Lage ist, die Bildung von Sehnen- und Bänder-ähnlichem Gewebe in vivo zu induzieren. Sie können verwendet werden, um verschiedene Kombinationen aus morphogenen Protein/MPSF zu testen und um eine in vivo-Dosis-Wirkungskurve zu produzieren, die bei der Bestimmung der effektiven relativen Konzentrationen von morphogenen Proteinen und MPSFs von Nutzen sind. Sie können auch zur Identifikation von Konzentrationsbereichen verwendet werden, in denen ein spezieller MPSF additiv oder synergistisch die induzierende Aktivität eines speziellen morphogenen Proteins verstärken kann.
Die osteogenen Proteine BMP-4 und BMP-7 (OP-1) können Explantate der ventralen neuralen Platte induzieren, die Differenzierung mit dem Schicksal dorsale neuralen Zellen zu durchlaufen (Liem et al., Cell, 82, S. 969–79 (1995)). Molekulare Marker der Differenzierung zu dorsalen Zellen sind bei Liem et al. beschrieben. Diese Marker umfassen PAX3 und MSX, deren Expression ein frühes Stadium der Differenzierung von Zellen der neuralen Platte begleiten; DSL-1 (ein BMP-ähnliches Molekül), das die Differenzierung der Zellen der dorsalen neuralen Platte in einem Stadium nach dem Schließen des neuralen Rohres begleitet; und das SLUG-Protein, dessen Expression nach dem Schließen des neuralen Rohres prämigratorische neurale Leistenzellen definiert. Die Expression dieser dorsalen Marker kann in Explantaten der ventralen neuralen Platte durch ectopisches BMP-4 und BMP-7 (OP-1) induziert werden.
Ein Test für die Regeneration von peripheren Nerven unter Verwendung des morphogenen Proteins BMP-2 ist beschrieben worden (Wang et al., WO 95/05846). Dieser Test umfaßt die Implantation von neurogenen Vorrichtungen in der Nachbarschaft von verstärkten Ischiasnerven in Ratten. Diese Verfahren kann verwendet werden, um die Fähigkeit eines mutmaßlichen MPSF zu beurteilen, die neuronal induzierende Aktivität von Homo- und Heterodimeren von morphogenen Proteinen, die neurogene Aktivität haben, zu stimulieren, wie BMP-2, BMP-4, BMP-6 und OP-1 (BMP-7) oder jede andere Kombination aus ausgewähltem neurogenem Protein/MPSF (Beispiel 13).
Verwendung von morphogenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen
Die morphogenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen, die ein hier offenbartes morphogenes Protein und einen hier offenbarten MPSF umfassen, werden es dem Arzt erlauben, eine Vielzahl von Gewebeverletzungen, Zustände der Gewebedegeneration und – erkrankung und Störungen, die mittels lokalisierter stimulierter Geweberegeneration oder – reparatur gelindert oder geheilt werden können, zu behandeln.
Die morphogenen Vorrichtungen dieser Erfindung können verwendet werden, um die lokale Gewebebildung von einer Vorläuferzelle in einem Säuger zu induzieren, indem man die Vorrichtung an einer Stelle implantiert, die mindestens einer Vorläuferzelle des Säugers zugänglich ist. Die morphogenen Vorrichtungen dieser Erfindung können allein oder in Kombination mit anderen Therapien für die Gewebereparatur und -regeneration verwendet werden.
Die morphogenen Vorrichtungen dieser Erfindung können zur Verwendung bei der Reparatur von Knorpel und weichem Gewebe auch in oder in der Umgebung eines Gelenks oder in der Umgebung von mit dem Nervensystem assoziiertem Gewebe zur Verwendung bei der neuralen Regeneration und Reparatur implantiert werden. Die Gewebespezifität des speziellen morphogenen Proteins – oder der Kombination von morphogenen Proteinen mit anderen biologischen Faktoren – werden die Zelltypen oder Gewebe bestimmen, die für solche Behandlungen zugänglich sind, und können vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet ausgewählt werden. Man nimmt daher an, daß die Fähigkeit der Verstärkung der von morphogenem Protein induzierten Geweberegeneration durch gleichzeitige Verabreichung eines MPSF gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf einen speziellen Zelltyp oder ein spezielles Gewebe beschränkt ist. Es ist vorauszusehen, daß die Erfindung, wie sie hier offenbart wird, ausgeführt werden kann, um die Aktivität von neuen morphogenen Proteinen zu verstärken und neue Gewebe induzierende Funktionen zu verstärken, die in der Zukunft gefunden werden.
Die osteogenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen, die ein osteogenes Protein und einen MPSF umfassen, werden es dem Arzt erlauben, eine vorhersehbare Knochen- und/oder Knorpelbildung unter Verwendung von weniger osteogenem Protein zu erhalten, um mindestens etwa dasselbe Ausmaß an Knochen- oder Knorpelbildung zu erhalten. Die osteogenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen dieser Erfindung können verwendet werden, um alle Verletzungen, Anomalien und Störungen effizienter und/oder wirkungsvoller zu behandeln, die im Stand der Technik über osteogene Vorrichtungen beschrieben wurden. Diese umfassen zum Beispiel die Bildung von lokalem Knochen bei Frakturen, Pseudoarthrosefrakturen, Fusionen und Knochenlücken so wie denjenigen, die bei einer Tumorresektion erzeugt werden oder diejenigen, die von einer Zyste resultieren; die Behandlung von erworbenen oder angeborenen cranofacialen und anderen skelettalen oder dentalen Anomalien (vgl. z. B. Glowacki et al., Lancet, 1, S. 959–63 (1981)); die Durchführung von dentalen und periodontalen Rekonstruktionen, wo der Ersatz von verloren gegangenem Knochen oder eine Knochenvermehrung erforderlich ist, wie Kieferknochen; und der Ersatz von alveolarem Knochenverlust, der von einer periodontalen Erkrankung resultiert, um den Verlust von Zähnen zu verzögern oder zu vermeiden (vgl. z. B. Sigurdsson et al., J. Periodontol., 66, S. 511–21 (1995)).
Eine osteogene Vorrichtung dieser Erfindung, die eine Matrix umfaßt, die allogenen Knochen umfaßt, kann auch an einer Stelle implantiert werden, die des Knochenersatzes bedarf, um die Allotransplantatreparatur und die Inkorporation in einem Säuger zu beschleunigen.
Eine andere potentielle klinische Anwendung der verbesserten osteogenen Vorrichtungen dieser Erfindung ist bei der Knorpelreparatur, zum Beispiel nach einer Gelenkverletzung oder bei der Behandlung von Osteoarthritis. Die Fähigkeit der Verstärkung der Knorpel induzierenden Aktivität von morphogenen Proteinen durch gleichzeitige Verabreichung eines MPSF kann die schnellere oder umfangreichere Gewebereparatur und den schnelleren oder umfangreicheren Geweberersatz unter Verwendung derselben oder von niedrigeren Mengen an morphogenen Proteinen erlauben.
Die morphogenen Zusammensetzung und Vorrichtungen dieser Erfindung werden bei der Behandlung von gewissen angeborenen Krankheiten und Entwicklungsanomalien bei Knorpel, Knochen und anderen Geweben von Nutzen sein. Zum Beispiel sterben homozygote OP-1 (BMP-7)-defiziente Mäuse innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt wegen Nierenversagen (Luo et al., J. Bone Min. Res., 10, (Erg. 1) S. 5163 (1995)). Das Nierenversagen bei diesen Mäusen ist assoziiert mit dem Versagen der Bildung von Nierenglomeruli wegen des Fehlens von mesenchymaler Gewebekondensation. OP-1-defiziente Mäuse können auch verschiedene Anomalien des Skeletts haben, die mit ihren hinteren Gliedmaßen, dem Brustkorb und dem Schädel assoziiert sind, sie sind polydactyl und zeigen eine abweichende Entwicklung der Retina. Diese Ergebnisse, in Kombination mit den vorstehend diskutierten, betreffend die Fähigkeit von OP-1 zur Induktion der Differenzierung in dorsale neurale Zellschicksale, zeigen, daß OP-1 während der Entwicklung eine wichtige Rolle bei epithelialen-mesenchymalen Wechselwirkungen spielt. Es wird angenommen, daß die Zusammensetzungen, Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung in der Zukunft bei der Linderung dieser und anderer Entwicklungsanomalien von Nutzen sein werden.
Entwicklungsanomalien des Knochens können isolierte oder viele Regionen des Skeletts oder eines speziellen stützenden oder Bindegewebetyps betreffen. Diese Anomalien erfordern oft komplizierte Knochentransplantationsverfahren und orthopädische Vorrichtungen. Die Gewebereparatur und -regeneration, die nach solchen Verfahren erforderlich ist. kann unter Verwendung der morphogenen Proteine, die gemäß dieser Erfindung in Kombination mit MPSFs verwendet werden, schneller und vollständiger erfolgen. Beispiele für vererbbare Zustände, einschließlich angeborener Knochenkrankheiten, für die die Verwendung von morphogenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen dieser Erfindung von Nutzen sein wird, umfassen Osteogenesis imperfekta, das Hurler und Marfan-Syndrom und mehrere Störungen von epiphysealen und metaphysealen Wachstumszentren, wie sie in der Hypophosphatasia dargeboten werden, einer Defizienz bei der enzymatischen Aktivität der alkalischen Phosphatase.
Entzündliche Gelenkerkrankungen können auch von den verbesserten morphogenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen dieser Erfindung profitieren. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, infektiöse, nicht infektiöse, rheumatoide und Psoriasis-Arthritis, Bursitis, ulcerative Colitis, regionale Enteritis, Whipple Krankheit und ankylosierende Spondylitis (auch Marie Strümpell oder Bechterew Krankheit); die sogenannten "Kollagen-Krankheiten" wie der sytemische Lupus erythematodes (SLE), die progressive sytemische Sclerosis (Scleroderma), die Polymyositis (Dermatomyositis), die nekrotisierende Vasculitides, das Sjögren Syndrom (Sicca Syndrom), das rheumatische Fieber, die Amyloodosis, die thrombotische thrombocytopenische Purpura und die rezidivierende Polychondritis. Vererbbare Störungen von Bindegewebe umfassen das Marfan Syndrom, die Homocystinuria, das Ehlers-Danlos Syndrom, die Osteogenesis imperfecta, die Alkaptonuria, das Pseudoxanthoma elasticum, Cutis laxa, das Hurler's Syndrom und die Myositis ossificans progressiva.
Das folgende sind Beispiele, die die morphogenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen dieser Erfindung und die zu ihrer Charakterisierung verwendeten Verfahren illustrieren. Diese Beispiele sollten nicht als einschränkend angesehen werden: die Beispiele sind zum Zwecke der Illustration eingeschlossen und die vorliegende Erfindung wird nur durch die Ansprüche eingeschränkt.
Beispiel 1: Gewinnung von OP-1 aus natürlichen Quellen
Für eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens für die Reinigung von OP-1 aus Rinderknochen vgl. Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,324,819.
Gewinnung von demineralisiertem Knochen
Demineralisierte Rinderknochenmatrix wird unter Verwendung von zuvor publizierten Verfahren gewonnen (Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, S. 6591–95 (1983)). Frische diaphyseale Rinderknochen (Alter 1–10 Tage) werden von Muskeln und Fett befreit, von Periosteum gereinigt, durch Druck mit kaltem Wasser entmarkt, in kaltes absolutes Ethanol getaucht und bei –20°C gelagert. Sie werden dann getrocknet und unter Verwendung von flüssigem Stickstoff zur Vermeidung von Erhitzen in einer großen Mühle durch Zertrümmern und Pulverisieren fragmentiert. Der pulverisierte Knochen wird zu einer Partikelgröße von zwischen 70–420 mm gemahlen und wird durch zweimal Waschen von etwa zwei Stunden Dauer mit drei Volumina Chloroform und Metanol (3 : 1) entfettet. Der zu Partikeln zerkleinerte Knochen wird dann mit einem Volumen absolutem Ethanol gewaschen und über einem Volumen wasserfreiem Ether getrocknet. Alternativ kann Corticales Rinderknochenpulver (75–425 mm) bei American Biomaterials gekauft werden.
Das entfettete Knochenpulver wird bei 4°C 40 Min. mit 10 Volumina 0,5 N HCl viermal demineralisiert. Letztlich wird das demineralisierte Knochenpulver mit einem großen Volumen Wasser neutralisierend gewaschen.
Das demineralisierte Knochenpulver wird dann als Ausgangsmaterial für die Durchführung der folgenden Reinigungsschritte verwendet, die im Detail bei Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,324,819 erklärt sind:

1. Dissoziative Extraktion und Ethanolfällung;
2. Heparin-Sepharose-Chromatographie I;
3. Hydroxyapatit-Ultrogel-Chromatographie;
4. Sephacryl S-300-Gelausschlußchromatographie;
5. Heparin-Sepharose-Chromatographie II;
6. Umkehrphasen-HPLC

Es kann auch eine SDS-Gelelektrophorese durchgeführt werden, um die Arten, die mittels HPLC getrennt wurden, sichtbar zu machen und weiter zu charakterisieren; die von dem Gel eluierten Arten können filtriert, konzentriert und für die Sequenzierung und andere gewünschte Charakterisierungen weiter bearbeitet werden. Die Ausbeute ist typischerweise 0,5 bis 1 μg im Wesentlichen reines osteogenes Protein pro kg Knochen.
Für zusätzliche Details zu diesen Verfahren und die chemische Charakterisierung dieser aus natürlichen Quellen abgeleiteten osteogenen Proteine vgl. auch Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,258,494.
Beispiel 2: Herstellung von rekombinantem osteogenem Protein
A. Expression in E. coli
Unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken können verschiedene Fusionsgene konstruiert werden, um die rekombinante Expression von osteogenen Sequenzen aus natürlichen Quellen in einem prokaryontischen Wirt wie E. coli zu induzieren. Volllängen- oder verkürzte Formen der morphogenen Gene, die OP-1 oder BMP-2 codieren, wurden in einen bakteriellen Expressionsvektor stromabwärts von einer säurelabilen Asp-Pro-Spaltstelle unter der Kontrolle eines synthetischen trp-Promotor-Operators cloniert. Die Vektoren wurden durch Transformation in einen geeigneten E. coli-Stamm eingebracht und die Bakterien wachsen gelassen, um unlösliche Einschlußkörper zu bilden.
Die Einschlußkörper wurden nach der Lyse in 8 M Harnstoff solubilisiert, gegen 1%-ige Essigsäure dialysiert und durch differentielle Solubilisierung partiell gereinigt. Die Konstrukte, die die Asp-Pro-Stelle enthielten, wurden mit Säure gespalten. Die resultierenden Produkte wurden durch eine Sephacryl-200HR- oder SP·Trisacyl-Säule gegeben, um die Proteine weiter zu reinigen, und dann auf semi-präparativen C-18-Säule der HPLC unterzogen, um die Leader-Proteine und andere kleinere Verunreinigungen von den morphogenen Proteinkonstrukten zu trennen.
Die morphogenen Proteine OP-1 und BMP-2 wurden mittels Chromatographie auf Heparin-Sepharose gereinigt. Der Ausfluß der HPLC-Säule wurde bei einem pH-Wert von 2 lyophilisiert, so daß er reduziert blieb.
Die Bedingungen für die Rückfaltung waren ein pH-Wert von 8,0 unter Verwendung von Tris-Puffer und 6 M Guanidin-HCl bei einer Proteinkonzentration von mehreren mg/ml. Diese Lösungen wurden mit Wasser verdünnt, um 2 M oder 3 M Guanidinkonzentrationen zu ergeben, und 18 Stunden bei 4°C belassen. Im Puffer gelöste oder eingebrachte Luft gewährleistete unter diesen Umständen die Oxidation des Proteins.
Proben der verschiedenen gereinigten Konstrukte und verschiedene Gemische von Paaren der Konstrukte, die sich rückgefaltet zusammenlagerten, wurden auf SDS-Polyacrylamidgele aufgetragen, durch Elektrophorese getrennt, in Scheiben geschnitten, in eine Matrix eingebaut, wie nachstehend offenbart, und auf osteogene Aktivität getestet.
Diese Untersuchungen zeigten, daß jedes der Konstrukte (Version voller Länge oder verkürzt) eine echte osteogene Aktivität hatte. Außerdem waren auch gemischte Arten einschließlich Heterodimere auch osteogen aktiv und können Heterodimere umfassen. Für spezielle getestete Kombinationen vgl. Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557. Letztlich induzieren einzelne und gemischte Arten der Analoga der aktiven Region, d. h. COP 5 und COP7, offenbart in dem US-Patent Nr. 5,011,691, Osteogenese, bestimmt mittels histologischer Untersuchung.
Nach der N-terminalen Sequenzierung der verschiedenen Konstrukte zur Bestätigung ihrer Identität wurden polyclonale Antiseren gegen die rekombinanten Proteine, mutmaßlich in ihrer reifen Form, produziert. Die menschlichen OP-1-Antiseren reagierten mit den glycosylierten und nicht glycosylierten Untereinheiten mit höherem Molekulargewicht von Rindermaterial aus natürlichen Quellen. Antiseren gegen rekombinantes, reifes, menschliches BMP-2 reagierten mit den glycosylierten und nicht glycosylierten Untereinheiten mit niedrigerem Molekulargewicht von Rindermaterial aus natürlichen Quellen. Daß es eine gewisse Kreuzreaktivität gab, war wegen der signifikanten Homologie zwischen BMP-2 und OP-1 (etwa 60% Identität) und der Wahrscheinlichkeit, daß abgebautes OP-1, das während der Reinigung erzeugt worden war, die Untereinheiten mit niedrigerem Molekulargewicht verunreinigt, zu erwarten. Beide Antiseren reagieren mit dem dimeren bOP von 30 kD aus natürlichen Quellen.
Außerdem können synthetische osteogene Sequenzen, die durch Zusammenbau von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden (vgl. vorstehend) produziert wurden, in geeigneten prokaryontischen Wirten exprimiert werden. Vgl. Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,324,819 für ein exemplarisches Plasmid und Protokoll. Ein Expressionsvektor, der auf pBR322 basiert und einen synthetischen trp-Promotor, einen Operator und den modifizierten trp LE-Leader enthält, kann an den EcoRI- und PstI-Restriktionsstellen geöffnet werden und ein FB-FB COP-Genfragment kann zwischen diesen Stellen inseriert werden, wobei FB ein Fragment B vom Protein A von Staphylococcus ist. Das exprimierte Fusionsprotein resultiert aus der Anheftung des COP-Gens an ein Fragment, das FB codiert. Das COP-Protein wird über eine Gelenk-Region, die die Sequenz Asp-Pro-Asn-Gly hat, mit dem Leaderprotein verknüpft.
Diese Gelenk-Region erlaubt die chemische Spaltung des Fusionsproteins an der Asp-Pro-Stelle mit verdünnter Säure oder die Spaltung an Asn-Gly mit Hydroxylamin. Die Spaltung an der Gelenk-Region setzt das COP-Protein frei.
B. Zellexpression im Säugersystem
Die rekombinante Produktion von Säugerproteinen für therapeutische Anwendungen kann in Säugerzellkultursystemen durchgeführt werden, um ein Protein zu produzieren, dessen Struktur weitgehend die des natürlichen Materials ist. Die rekombinante Proteinproduktion in Säugerzellen erfordert die Etablierung von geeigneten Zellen und Zelllinien, die leicht zu transfizieren sind, die in der Lage sind, die fremde DNA mit nicht umgelagerter Sequenz stabil zu erhalten, und die die erforderlichen zellulären Komponenten für die effiziente Transkription, Translation, post-translationale Modifikation und Sekretion des Proteins haben. Außerdem ist ein geeigneter Vektor notwendig, der das Gen von Interesse trägt.
Die Planung eines DNA-Vektors für die Transfektion in Säugerzellen sollte geeignete Sequenzen für die Förderung der Expression des Gens von Interesse umfassen, einschließlich geeignete Transkriptionsinitiations-, -terminations- und Enhancersequenzen, ebenso wie Sequenzen, die die Translationseffizienz erhöhen, wie die Kozak-Consensussequenz. Bevorzugte DNA-Vektoren umfassen auch ein Markergen und Mittel zur Amplifikation der Kopienzahl des Gens von Interesse.
Im letzten Jahrzehnt wurde ein beträchtlicher Fortschritt bei der Entwicklung von Säugerzellexpressionssystemen erzielt und viele Aspekte der Systeme sind gut charakterisiert. Ein ausführlicher Überblick zum Stand der Technik bei der Produktion von fremden Proteinen in Säugerzellen, einschließlich von Zellen von Nutzen, die Proteinexpression fördernder Sequenzen, Markergenen und Genamplifikationsverfahren ist bei Bendig, Mary M., Genetic Engineering, 7, S. 91–127 (1988) offenbart.
Kurz gesagt sind unter den am besten charakterisierten Transkriptionspromotoren, die bei der Expression eines fremden Gens in einer speziellen Säugerzelle von Nutzen sind, der frühe SV40-Promotor, der Adenoviruspromotor (AdMLP), der Metallothionein-I-Promotor der Maus (mMT-I), die lange terminale Wiederholung (LTR) des Roussarkom-Virus (RSV), die lange terminale Wiederholung (LTR) des Maus-Brusttumorvirus (MMTV-LTR) und der mittelfrühe Hauptpromotor des menschlichen Cytomegalievirus (hCMV). Die DNA-Sequenzen für alle diese Promotoren sind im Stand der Technik bekannt und sind kommerziell verfügbar.
Eines der besser charakterisierten Verfahren für die Genamplifikation in Säugerzellsystemen ist die Verwendung des selektierbaren Dihydrofolatreduktasegens (DHFR) in einer dhfr-Zelllinie. Im Allgemeinen wird das DHFR-Gen auf dem Vektor bereitgestellt, der das Gen von Interesse trägt, und die Zugabe von steigenden Konzentrationen des cytotoxischen Wirkstoffs Methotrexat führt zur Amplifikation der Anzahl an Kopien des DHFR-Gens wie auch der des assoziierten Gens von Interesse. DHFR als selektierbares, amplifizierbares Markergen in transfizierten Eierstockzelllinien des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) ist im Stand der Technik besonders gut charakterisiert. Andere amplifizierbare Markergene von Nutzen umfassen die Adenosin-Desaminase (ADA)- und die Glutamin-Synthetase (GS)-Gene.
Im gegenwärtig bevorzugten Expressionssytem wird die Genamplifikation durch die Modifizierung von regulatorischen Sequenzen der Markergenexpression (z. B. Enhancer-, Promotor- und Transkriptions- oder Translations-Initiationssequenzen) weiter verstärkt, um die Mengen von produziertem Markerprotein zu reduzieren. Die Erniedrigung des Ausmaßes der DHFR-Transkription hat den Effekt der Erhöhung der Kopienzahl an DHFR-Genen (und des assoziierten OP-1-Gens), um den transfizierten Zellen die Adaption ihres Wachstums an sogar niedrigen Mengen an Methotrexat (MTX) (z. B. 0,1 μM MTX) zu ermöglichen. Bevorzugte Expressionsvektoren (pH754 und pH752) wurden unter Verwendung von rekombinanter Standard-DNA-Technologie manipuliert, um einen schwachen DHFR-Promotor zu schaffen. Wie der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet weiß, können andere nützliche schwache Promotoren, die von den hier gezeigten und bevorzugten differieren, unter Verwendung von Standard-Vektorkonstruktionsverfahren konstruiert werden. Außerdem können andere, unterschiedliche regulatorische Sequenzen auch modifiziert werden, um denselben Effekt zu erzielen.
Die Auswahl der Zellen/Zelllinien ist auch wichtig und hängt von den Ansprüchen des Experimentators ab. Affennierenzellen (COS) stellen ein hohes Ausmaß an transienter Genexpression bereit und stellen damit ein nützliches Werkzeug für die rasche Testung einer Vektorkonstruktion und die Expression von clonierten Genen bereit. COS-Zellen werden mit einem Affenvirus 40 (SV40)-Vektor transfiziert, der das Gen von Interesse trägt. Die transfizierten COS-Zellen sterben nachfolgend ab und verhindern damit die langfristige Produktion des gewünschten Proteinprodukts. Die transiente Expression erfordert jedoch nicht das zeitraubende Verfahren, das für die Entwicklung einer stabilen Zelllinie erforderlich ist.
Unter den etablierten Zelllinien sind wahrscheinlich die CHO-Zellen heute die am besten charakterisierten und sind die gegenwärtig bevorzugte Zelllinie für die Zellexpression von rekombinantem osteogenem Protein im Säugersystem. CHO-Zellen sind zur Expression von Proteinen von einem weiten Bereich von Zelltypen in der Lage. Die allgemeine Anwendbarkeit von CHO-Zellen und ihre erfolgreiche Produktion einer großen Vielzahl verschiedener menschlicher Proteine in nicht verwandten Zelltypen betont die grundlegende Ähnlichkeit aller Säugerzellen. Während somit das Glycosylierungsmuster auf einem rekombinanten Protein, das in einem Säugerzellexpressionssystem produziert wurde, nicht identisch sein mag mit dem natürlichen Protein, sind die Unterschiede bei den Oligosaccharidseitenketten oft nicht essentiell für die biologische Aktivität des exprimierten Proteins.
Die hier offenbarte Methodik umfaßt die Verwendung von COS-Zellen für die rasche Bewertung der Vektorkonstruktion und Genexpression, und die Verwendung von etablierten Zelllinien für die langfristige Proteinproduktion. Von den offenbarten Zelllinien ist die Expression von OP-1 durch CHO-Zelllinien gegenwärtig am meisten bevorzugt.
Mehrere verschiedene Säugerzellexpressionssysteme wurden verwendet, um rekombinante OP-1-Proteine zu exprimieren, die im Zusammenwirken mit einem MPSF gemäß dieser Erfindung verwendet werden können. Insbesondere werden COS-Zellen für die rasche Bewertung der Vektorkonstruktion und Genexpression verwendet, unter Verwendung eines SV40-Vektors für die Transfektion der DNA-Sequenz in COS-Zellen. Stabile Zelllinien wurden unter Verwendung von CHO-Zellen (Eierstockzellen des chinesischen Hamsters) und einem temperatursensitiven Stamm von BSC-Zellen (Affennierenzellen, BSC40-tsA58; Biotechnology, 6, S. 1192–96 (1988)) für die langfristige Produktion von OP-1 entwickelt.
Es wurde gefunden, daß zwei verschiedene Promotoren bei der Transkription von hOP1 (SEQ ID Nr. 1) am meisten von Nutzen sind: der CMV-Promotor und der MMTV-Promotor, verstärkt durch die Enhancer-Sequenz von der LTR des Roussarkomvirus. Der mMT-Promotor (Maus-Metallothionein-Promotor) und der späte SV40-Promotor wurden auch getestet. Mehrere Selektionsmarkergene werden auch verwendet, nämlich neo (Neomycin) und DHFR.
Das DHFR-Gen kann auch als ein Teil eines Genamplifikationsschemas für CHO-Zellen verwendet werden. Ein anderes Genamplifikationsschema beruht auf der Temperatursensitivität (ts) von BSC40-tsA58-Zellen, die mit einem SV40-Vektor transfiziert wurden. Die Reduktion der Temperatur auf 33°C stabilisiert das ts SV40 T-Antigen, was zum Ausschneiden und zur Amplifikation der integrierten transfizierten Vektor-DNA führt, wobei auch das assoziierte Gen von Interesse amplifiziert wird.
Es wurden stabile Zelllinien für CHO-Zellen ebenso wie für BSC40-tsA58-Zellen (hier weiterhin als "BSC-Zellen" bezeichnet) etabliert. Die verschiedenen Zellen, Zelllinien und DNA-Sequenzen, die für die Säugerzellexpression der OP-1-Proteine dieser Erfindung ausgewählt wurden, sind im Stand der Technik gut charakterisiert und leicht verfügbar. Andere Promotoren, Selektionsmarker, Genamplifikationsverfahren und Zellen können auch verwendet werden, um die OP-1-Proteine dieser Erfindung zu exprimieren, ebenso wie andere osteogene Proteine. Spezielle Details der Transfektion, Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen sind im Stand der Technik gut dokumentiert und werden vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet verstanden. Weitere Details der verschiedenen technischen Aspekte von jedem der Schritte, die bei der rekombinanten Produktion von fremden Genen in Säugerzellexpressionssystemen verwendet werden, können in einer Reihe von Texten und Laborhandbüchern im Stand der Technik gefunden werden. Vgl. z. B. F. M. Ausubel et al., Hrsg. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989).
a) Exemplarische Expressionsvektoren
Die Restriktionskarten und Quellen von verschiedenen exemplarischen Expressionsvektoren, die für die Expression von OP-1 in Säugerzellen entworfen wurden, wurden beschrieben (Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557; vgl. 19(A–F) und den Begleittext). Jeder dieser Vektorkonstrukte verwendet eine cDNA-Sequenz voller Länge ("hOP1"; Seq. ID NR. 1), die ursprünglich aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek (Plazenta) isoliert wurde und anschließend unter Verwendung von pUC-Polylinker-Sequenzen an den Insertionsstellen in einen herkömmlichen pUC-Vektor (pUC-18) cloniert wurde.
Es wird von dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet erkannt, daß auch DNA-Sequenzen in diesen Vektoren verwendet werden können, die verkürzte Formen von osteogenem Protein codieren, unter der Vorraussetzung, daß der Expressionsvektor oder die Wirtszelle dann die Sequenzen bereitstellt, die erforderlich sind, um die Prozessierung und Sekretion des exprimierten Proteins zu steuern.
Jeder Vektor beinhaltet einen SV40-Replikationsursprung (ori), der für die Vermittlung der Plasmidreplikation in Primatenzellen (d. h. COS- und BSC-Zellen) von Nutzen ist. Außerdem wird der frühe SV40-Promotor verwendet, um die Transkription der Markergene auf dem Vektor anzustoßen (d. h. neo und DHFR).
Der pH717-Expressionsvektor (19A) enthält das Neomycin (neo)-Gen als einen Selektionsmarker. Diese Markergen ist im Stand der Technik gut bekannt und kommerziell verfügbar. Alternativ können andere Selektionsmarker verwendet werden. Der spezielle Vektor, der verwendet wird, um das DNA-Fragment des neo-Gens für pH717 bereitzustellen, kann von Clontech, Inc., Palo Alto, Calif. (pMAM-neo-blue) erhalten werden. Dieser Vektor kann auch als das Rückgrat verwendet werden. In pH717 wird die hOP1-Transkription vom CMV-Promotor angetrieben mit Enhancer-Sequenzen von der RSV-LTR (lange terminale Wiederholung des Roussarkomvirus) und MMTV-LTR (lange terminale Wiederholung des Maus-Brusttumorvirus). Diese Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt und kommerziell erhältlich. Zum Beispiel können Vektoren, die die CMV-Promotorsequenz enthalten (z. B. pCDM8), bei Invitrogen Inc., San Diego, Calif., erhalten werden.
Der Expressionsvektor pH731 (19B) verwendet den späten Promotor von SV40, um die hOP1-Transkription anzutreiben. Wie vorstehend angedeutet, sind auch die Sequenz und die Charakteristika dieses Promotors im Stand der Technik gut bekannt. Zum Beispiel kann pH731 durch Insertion des SmaI-BamHI-Fragments von hOP1 in pEUK-C1 (Clontech, Inc., Palo Alto, Calif.) erzeugt werden.
Die pH752- und pH754-Expressionsvektoren enthalten das DHFR-Gen unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors sowohl als Selektionsmarker und auch als induzierbarer Genamplifikator. Die DNA-Sequenz für DHFR ist im Stand der Technik gut charakterisiert und kommerziell erhältlich. Zum Beispiel kann pH754 von pMAM-neo (Clontech, Inc., Palo Alto, Calif.) durch Ersatz des neo-Gens (BamHI-Verdau) mit einem SphI-BamHI- oder einem PvuII-BamHI-Fragment von pSV5-DHFR (ATCC #37148) erzeugt werden, welches das DHFR-Gen unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors enthält. Unter Verwendung von Standardtechniken (z. B. durch Linkerinsertion oder stellengerichtete Mutagenese) kann eine BamHI-Stelle an der SphI- oder PvuII-Stelle geschaffen werden, um die Insertion des Fragments in das Vektorrückgrat zuzulassen. hOP1-DNA kann in die Polylinkerstelle stromabwärts von der MMTV-LTR-Sequenz inseriert werden, was pH752 ergibt (19D). Die CMV-Promotorsequenzen können dann in pH752 inseriert werden (z. B. von pCDM8, Invitrogen, Inc.), was pH754 ergibt (19C).
Der frühe SV40-Promotor, der die DHFR-Expression antreibt, ist in diesen Vektoren modifiziert, um das Niveau an produzierter DHFR-mRNA zu reduzieren. Genau gesagt wurden die Enhancersequenzen und ein Teil der Promotorsequenz deletiert, wodurch nur etwa 200 Basen der Promotorsequenz stromaufwärts des DHFR-Gens übrig blieben. Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transfiziert sind, sind an das Wachstum in 0,1 μM MTX adaptiert und können die OP-1-Produktion signifikant erhöhen (vgl. z. B. Tabelle 8, Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557).
Der pW24-Vektor (19E) ist bei der Sequenz im Wesentlichen identisch mit p754, außer daß anstelle von DHFR neo als Markergen (vgl. pH717) verwendet wird. In ähnlicher Weise enthält pH783 (19F) den amplifizierbaren Marker DHFR, hier ist OP-1 aber unter der Kontrolle von mMT (Metallothionein-Promotor der Maus). Der mMT-Promotor ist im Stand der Technik gut charakterisiert und kommerziell verfügbar.
Alle getesteten Vektoren sind in den verschiedenen, für die Expression von OP-1 verwendeten Zellen stabil und stellen eine Reihe von Expressionsniveaus von OP-1 bereit.
b) Exemplarische Säugerzellen
Rekombinantes OP-1 wurde in drei verschiedenen Zellexpressionssytemen exprimiert: COS-Zellen für die rasche Durchmusterung der Funktionalität der verschiedenen Expressionsvektorkonstrukte, CHO-Zellen für die Etablierung von stabilen Zelllinien und BSC40-tsA58-Zellen als alternativen Weg zur Produktion von OP-1-Protein. Das CHO-Zellexpressionssystem, das hier offenbart wird, wird als die gegenwärtig beste, bekannte Weise für die langfristige rekombinate Produktion von OP-1 in Säugerzellen angesehen.
(1) COS-Zellen
COS-Zellen (Affennierenzellen) werden für die rasche Durchmusterung von Vektorkonstrukten und für die unmittelbare Produktion in kleinem Maßstab von OP-1-Protein verwendet. COS-Zellen sind im Stand der Technik gut bekannt und kommerziell verfügbar. Die hier speziell beschriebene Zellinie kann von der American Type Culture Collection (ATCC #COS-1, CRL-1650) erhalten werden.
Die OP-1-Expressionsniveaus dieser verschiedenen Expressionsvektoren, analysiert mittels Northern- und Western-Blot-Tests werden bei Oppermann et al., verglichen (vgl. Tabelle 7, Oppermann et al.).
Die Gewinnung von OP-1 von transfizierten COS-Zellen in großem Maßstab kann unter Verwendung der herkömmlichen Rollerflaschentechnologie erfolgen. Kurz gesagt werden 14 × 10⁶ Zellen verwendet, um jede Flasche zu besähen. Nach 24 Std. Wachstum werden die Zellen mit 10 μg Vektor-DNA (z. B. pH717) pro 10⁶ Zellen unter Verwendung des DEAE-Dextran-Verfahrens transfiziert. Die Zellen werden dann 120 Std. in serumfreiem Medium konditioniert, bevor das Medium für die Proteinanalyse geerntet wird. Wenn man dieses Protokoll befolgt, ist die Ausbeute an OP-1 etwa 2–6 ng/ml.
(2) BSC-Zellen
Die BSC40-tsA58-Zelllinie ("BSC-Zellen") ist ein temperatursensitiver (ts) Stamm von Affennierenzellen (Biotechnology, 6, S. 1192–96 (1988)), der einige der Probleme überwindet, die mit COS-Zellen assoziiert sind. Diese BSC-Zellen haben den Vorteil, daß sie in der Lage sind, bei Temperaturerniedrigung Gensequenzen rasch in großem Maßstab zu amplifizieren, ohne die Zugabe von exogenen, potentiell giftigen Wirkstoffen zu erfordern. Außerdem können die Zellen nach der Induktion und Stimulation der OP-1-Expression in neues Wachstumsmedium übertragen werden, bei 39,5°C bis zur Konfluenz gezüchtet werden und durch Temperaturerniedrigung auf 33°C ein zweites mal induziert werden. BSC-Zellen können zur raschen Etablierung von stabilen Zelllinien für die Proteinproduktion verwendet werden.
Die OP-1-Expression in transfizierten BSC-Zellen kann durch Erniedrigung der Temperatur auf 33°C in Medien induziert werden, die 10% FCS enthalten, mit Ernte des konditionierten Mediums nach 96 Std. Inkubation. Es werden vergleichbare Mengen an OP-1-mRNA und -Protein erhalten, im Vergleich mit CHO-Zellen (d. h. 100–150 ng OP-1/ml konditioniertes Medium von BSC-Clonen, die mit pH717 transfiziert waren, vgl. Oppermann et al.).
(3) CHO-Zellen
CHO-Zellen (Eierstockzellen des chinesischen Hamsters) können für die langfristige Produktion von OP-1 verwendet werden und sind die gegenwärtig bevorzugte Zelllinie für die Säugerzellexpression von OP-1. CHO-Zelllinien sind für die Produktion eines fremden Gens in kleinem und großem Maßstab gut charakterisiert und sind kommerziell erhältlich. Vgl. Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557 für eine detaillierte Beschreibung von: Etablierung einer stabilen transfizierten Zelllinie mit hohen hOP-1-Expressionsniveaus, Subclonierung von transfizierten Zellen, um Subclone mit hoher Expression zu erhalten, Charakterisierung der Kopienzahl der DNA-Insertion im Subclon und Durchmusterung der Subclone auf die Expressionsniveaus von OP-1-mRNA und -Protein. Oppermann et al. stellen auch eine detaillierte Beschreibung eines schnellen Reinigungsverfahrens für die Gewinnung von rekombinant produziertem OP-1 von etwa 90% Reinheit und weitere Ergebnisse bereit, die die physikalischen Charakteristika (Molekulargewicht und Glycosylierungsprofile) und die osteogenen Aktivitäten einer Vielzahl an rekombinanten Formen von OP-1, das in den vorstehend beschriebenen Zelllinien exprimiert wurde, zeigen.
Es wird daher erwartet, daß aktive, reife OP-1-Sequenzen, einschließlich des Proteins voller Länge, der verkürzten und durch Mutation veränderten aktiven Formen des Proteins, durch verschiedene andere prokaryontische und eukaryontische Zellexpressionssysteme unter Verwendung von Verfahren, wie sie im Wesentlichen hier beschrieben werden, exprimiert werden können. Die produzierten Proteine können variierende N-Termini haben und die in eukaryontischen Zellen exprimierten können verschiedene Glycosylierungsmuster haben. Letztlich wird auch anerkannt werden, daß diese Variationen bei dem produzierten rekombinanten osteogenen Protein eher charakteristisch für das verwendete Wirtszellexpressionssystem sein werden als für das Protein selbst.
Beispiel 3: Synergistischer Effekt von exogenem IGF-I auf die von OP-1 induzierte Mitogenese und Differenzierung von fötalen Schädeldachzellen der Ratte (FRC)
A. Differenzierung: Primäre Osteoblastenzellkulturen wurden unter Verwendung von publizierten Verfahren aus fötalem Rattenschädeldach gewonnen (M. A. Aronow et al., J. Cell Physiol., 143, S. 213–221 (1990); T. K. McCarthy et al., J. Bone Miner. Res., 3, S. 401–8 (1988)). In Kürze wurde Zellen durch sequentiellen Verdau des Schädeldachs mit Kollagenase geerntet und die Zellen von Verdau III bis V wurden vereint. Die fötalen Schädeldachzellen der Ratte (FRC) wurden in komplettem Medium (MEM, alpha; GIBCO/BRL, Grand Island, NY) ausplattiert, das 10% fötales Kälberserum, Vitamin C (100 μg/ml) und Antibiotika (100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin) enthielt. Die Kulturen wurden bei 37°C mit 95% Luft/5% CO₂ mehrere Tage inkubiert, um zur Konfluenz zu kommen. Die Zellen wurden dann für die Experimente subkultiviert.
Die FRC-Zellen wurden in Platten mit 48 Mulden (COSTAR, Cambridge, MA) in komplettem MEM-Medium mit 10% fötalem Kälberserum in etwa 4 Tagen bis zur Konfluenz subkultiviert.
Die konfluenten Zellen wurden mit balancierter Hank-Salzlösung (HBSS) gespült und mit serumfreiem α-MEM-Medium (mit 0,1% BSA, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin), das die entsprechenden Lösungsmittelträger enthielt (50% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure für die Behandlung mit OP-1 oder 0,1 N Essigsäure für die Behandlung mit IGF-I), oder rekombinanten menschlichen OP-1 oder IGF-I mit den angegebenen Konzentrationen behandelt. Die Konzentration an Lösungsmittelträger in dem Kulturmedium überschritt nie 0,1%. Am Ende der Behandlung wurden die Zellen lysiert und die gesamte zelluläre Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde gemessen (typischerweise nach 48 Stunden Behandlung).
Die konfluenten FRC-Zellen (6–8 × 10⁶ Zellen/T-150-Kolben) wurden einmal mit HBSS gespült, um das komplette Medium zu entfernen und dann in serumfreiem α-MEM-Medium (mit 0,1% BSA, 100 U/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von OP-1 für verschiedene Zeiträume inkubiert. OP-1 war in 50% Acetonitril und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) gelöst. Am Ende der Behandlungen wurden die Zellen in den T-150-Kolben mit eiskalter PBS-Lösung gespült, um das serumfreie Medium zu entfernen, und für die anschließende RNA-Isolierung verwendet.
Akfivitätstest für alkalische Phosphatase
Die gesamte Aktivität der zellulären alkalischen Phosphatase wurde unter Verwendung eines eines kommerziellen Testkits bestimmt (Sigma, St. Louis, MO). Die Zelllysate wurden durch Absaugen des Mediums von den Platten mit 48 Mulden, Spülen der Zellen mit eiskaltem PBS und Lyse der Zellen mit 0,05%-igem Triton X-100 und 60 sec. Ultraschallbestrahlung hergestellt. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase in den Lysaten wurde in 2-Amino-2-methyl-1-propanol-Puffer (pH 10,3) mit p-Nitrophenylphosphat als Substrat bei 37°C gemessen. Die Reaktionen wurden 1–2 h in Platten mit 96 Mulden durchgeführt. Nach der Farbentwicklung wurden die Reaktionen mit 0,5 N NaOH beendet. Die Absorption der Reaktion wurde bei 405 nm unter Verwendung eines automatischen Plattenlesers von Hewlett Packard Genenchem gemessen. Die Gesamtproteinmengen in den Lysaten wurden gemäß Bradford (M. Bradford, Anal. Biochem., 72, S. 248–54 (1976)) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde in nMol freigesetztem p-Nitrophenol pro Mikrogramm zellulärem Gesamtprotein angegeben.
RNA-Isolierung
Die gesamte RNA wurde mit kaltem Ultraspec (Biotecx Lab., Houston, TX) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. Die RNA wurde durch Ausfällen gewonnen und in DEPC-H₂O gelöst. Die Menge an gewonnener RNA wurde durch den A₂₆₀-Wert geschätzt. Die Integrität der RNA-Herstellung wurde mittels Gelelektrophorese in 1%-iger Agarose überprüft. Die RNA wurde durch Anfärben mit EtBr nachgewiesen. Nur RNA-Herstellungen, die intakte RNA zeigten, wurden für die anschließenden Analysen verwendet.
Northern-Blot-Analyse
Gesamt-RNAs (20 μg) wurden bei 65°C 15 min. mit Formaldehyd und Formamid denaturiert und auf einem 1%-igen GTG-Agarosegel analysiert, das 2,2 M Formaldehyd enthielt. Es wurden RNA-Standards (0,24–9,5 kb) von GIBCO/BRL (Grand Island, NY) als Größenmarker verwendet. Die fraktionierte RNA wurde unter Verwendung einer Turboblοt-Apparatur (Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH) auf eine "Nytran plus"-Membran übertragen. Die Spur, die die Standards enthielt, wurde aus dem Blot ausgeschnitten und mit Methylenblau angefärbt. Die RNA wurde unter Verwendung eines UV Crosslinkers (Stratagene, La Jolla, CA) kovalent an die Membran gebunden. Die Membranen wurden übernacht bei 42°C mit den Osteocalcin- oder Typ I-Kollagen-DNA-Sonden hybridisiert, jeweils zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur für 20 min, jeweils zweimal mit 2 × SSC/1% SDS bei 60°C für 1 Stunde und letztlich jeweils zweimal mit 0,1 × SSC bei Raumtemperatur für 30 min gewaschen. Die Blots wurden einem PhosphorImage-Schirm ausgesetzt und, wie vorstehend beschrieben, analysiert. Vier Blots mit verschiedenen RNA-Herstellungen wurden für jede Sonde wiederholt.
Adenosin 3',5'-cyclisches Monophosphat (cAMP)-Test
Test für cAMP-Mengen wurden im Wesentlichen wie bei Kitten et al., Am. J. Physiol., 269, (Endocrinol. Metab. 32), E918–E926 (durch Bezugnahme hier eingeschlossen) durchgeführt. Konfluente FRC-Zellen wurde in Platten mit 48 Mulden gezüchtet, die mit verschiedenen Konzentrationen an OP-1 mit oder ohne IGF-I in serumfreiem α-MEM behandelt wurden. Das Medium wurde nach 24 Stunden entfernt, es wurde frisches Medium, das die ausgewählten Testkomponenten enthielt, zugegegen und die Zellen noch einmal 24 Stunden inkubiert. Das Medium wurde entfernt, die Zellen mit Balancierter Hank-Salzlösung gespült und 15 Minuten in frischem serumfreiem Medium inkubiert, das 3-Isobutyl-1-methylxanthin (1 mM) enthielt. Die Zellen wurden 10 min, mit 0,01 Essigsäure (Hac)/0,1% BSA oder 100 nM PTH behandelt. Die Menge an cAMP in den Zelllysaten wurde unter Verwendung eines BIOTRAK-cAMP-Enzymimmuntests (Amersham, Arlington Heights, IL) gemäß den Vorschriften des Herstellers bestimmt. Die Menge an cAMP wurde bestimmt und das Verhältnis der Menge an cAMP in den Kulturen, die mit PTH behandelt worden waren, zu dem in den Kulturen ohne PTH wurde berechnet. Das x-fache an Stimulation unter jeder experimentellen Bedingung wurde berechnet und als Verhältnis zur Kontrolle (kein OP-1 ist als 1 definiert) dargestellt.
Statistische Analysen
Es wurden mehrfache Mittel mit der Einweganalyse der Varianz verglichen, gefolgt vom Student-t-Test für den gepaarten Vergleich mit der Kontrolle, unter Verwendung der ANOVA- und T-Test-Programme in PSIPlot (Poly Software International, Salt Lake City, UT) für Personalcomputer.
B. Mitogenese: Primäre Osteoblastenzellkulturen wurden aus fötalem Rattenschädeldach präpariert und, wie vorstehend beschrieben, subkultiviert. In Platten mit 48 Mulden gezüchtete konfluente FRC-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen an OP-1 mit oder ohne IGF-I in serumfreiem α-MEM-Medium 18 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit [³H] Thymidin (5 μCi/ml) zusätzliche 6 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden mit 1 × PBS gespült und das Ausmaß des Einbaus von [³H]-Thymidin in die DNA wurde, wie bei Kitten et al., Am. J. Physiol., 269, (Endocrinol. Metab. 32), E918–E926 (durch Bezugnahme hier eingechlossen) beschrieben, bestimmt.
Beispiel 4: Identifizierung eines ersten MPSF, der die Gewebeinduktion durch ein morphogenes Protein stimuliert
Ein alkalischer Phosphatase (AP)-Test an FRC-Zellen wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt, um steigende Konzentrationen an mutmaßlichen MPSFs in Kombination mit einer einzigen Konzentration (200 ng/ml) des osteogenen Proteins OP-1 zu testen.
Mindestens vier experimentelle Gruppen wurden getestet: Kontrollzellen, die nicht mit OP-1 oder MPSF behandelt worden waren; Zellen der Gruppe I, die mit steigenden Konzentrationen an MPSF allein behandelt worden waren; Zellen der Gruppe II, die mit 200 ng/ml OP-1 allein behandelt worden waren; und Zellen der Gruppe III, die mit 200 ng/ml OP-1 in der Anwesenheit von steigenden Konzentrationen an MPSF behandelt worden waren.
5 zeigt die Effekte von Östradiol (0,05–5,0 nM; gekauft bei Sigma, St. Louis, MO) und 200 ng/ml OP-1 auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase von FRC-Zellen 48 Stunden nach der Behandlung. Östradiol allein schien die AP-Aktivität nicht zu stimulieren. In der Gegenwart von 0,5 nM Östradiol und 200 ng/ml OP-1 war das Niveau der AP-Aktivität fast elf-fach höher als die Kontrolle und etwa dreifach höher als bei Zellen, die nur mit OP-1 behandelt worden waren.
6 zeigt die Effekte von Wachstumshormon (hGH; 10–1000 ng/ml; gekauft bei Sigma, St. Louis, MO) und 200 ng/ml OP-1 auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase von FRC-Zellen 48 Stunden nach der Behandlung. Alle in der Gegenwart von 200 ng/ml OP-1 getesteten Konzentrationen an hGH stimulierten die Induktion der AP-Aktivität über diejenigen hinaus, die für OP-1 allein beobachtet wurde ("0"). Höhere Konzentrationen an hGH schienen mehr stimulatorische Wirkung zu haben als niedrigere Konzentrationen.
7 zeigt die Effekte von Hydrocortison (HC; 0,05–5 nM; gekauft bei Sigma, St. Louis, MO) und 200 ng/ml OP-1 auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase von FRC-Zellen nach 48 Stunden. HC allein stimulierte die AP-Aktivität in FRC-Zellen nicht. In der Gegenwart von 0,5 nM HC und 200 ng/ml OP-1 ist das Niveau der AP-Aktivität etwa dreifach höher als das in Kontrollzellen und etwa zweifach höher als bei Zellen, die nur mit OP-1 behandelt worden waren.
8 zeigt die Effekte von Insulin (0,05–5 nM; gekauft bei Sigma, St. Louis, MO) und 200 ng/ml OP-1 auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase von FRC-Zellen nach 48 Stunden. Insulin allein stimulierte die AP-Aktivität in FRC-Zellen nicht. In der Gegenwart von 0,05 nM Insulin oder 0,5 nM Insulin und 200 ng/ml OP-1 ist das Niveau der AP-Aktivität etwa vierfach höher als das in Kontrollzellen und etwa zweifach höher als bei Zellen, die nur mit OP-1 behandelt worden waren.
9 zeigt die Effekte von Parathyroidhormon (PTH; 25–200 nM; gekauft bei Sigma, St. Louis, MO) und 200 ng/ml OP-1 auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase von FRC-Zellen nach 48 Stunden. PTH allein stimulierte die AP-Aktivität in FRC-Zellen nicht. Niedrige Konzentrationen an PTH (25 und 100 nM) und 200 ng/ml OP-1 scheinen keine Wirkung auf die von OP-1 induzierte Stimulierung der AP-Aktivität zu haben. In der Gegenwart von 200 nM PTH und 200 ng/ml OP-1 ist das Niveau der AP-Aktivität etwa fünffach höher als das in Kontrollzellen und etwa zweifach höher als bei Zellen, die nur mit OP-1 behandelt worden waren.
Letztlich zeigt 10 die Effekte von Progesteron (PG; 0,05–5 nM; gekauft bei Sigma, St. Louis, MO) und 200 ng/ml OP-1 auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase von FRC-Zellen nach 48 Stunden. PG allein (5 nM) scheint die AP-Aktivität etwa dreifach über diejenige der Kontrollzellen zu stimulieren. PG (5 nM) in der Gegenwart von 200 ng/ml OP-1 scheint das Niveau der AP-Aktivität etwa vierfach zu erhöhen, als in den Kontrollzellen und etwa zweifach höher als bei Zellen, die nur mit OP-1 behandelt worden waren.
Beispiel 5: Identifizierung von zusätzlichen MPSFs, die die Gewebeinduktion durch eine Kombination aus Protein/MPSF stimulieren
Nachdem eine wirksame Kombination aus morphogenem Protein/MPSF identifiziert wurde, können eine oder mehrere zusätzliche MPSFs, die die Stimulation der Gewebeinduktion durch diese Kombination aus morphogenem Protein/MPSF weiter erhöhen, identifiziert werden. Es wurde ein Test im Wesentlichen gemäß den in Beispielen 3 und 4 dargelegten Verfahren durchgeführt, außer daß die FRC-Zellen mit einer Kombination von 200 ng/ml OP-1 und 25 ng/ml IGF-I in der Anwesenheit oder Abwesenheit von steigenden Konzentrationen von PTH (25-200 nM) inkubiert wurden.
Die Abwesenheit von PTH (bei Konzentrationen von mindestens etwa 50 nM) erhöhte signifikant die von der Kombination aus OP-1/IGF-I induzierte AP-Aktivität.
Beispiel 6: Herstellung von von Knochen abgeleiteten Matrices zur Verwendung in morphogenen Vorrichtungen
Demineralisierte Knochenmatrix, vorzugsweise Rinderknochenmatrix, wurde unter Verwendung von zuvor veröffentlichten Verfahren (Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, S. 6591–95 (1983)), wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
Demineralisierte Knochenmatrix wird mit 5 Volumina 4 M Guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,0 16 Std. bei 4°C extrahiert. Die Suspension wird filtriert. Das unlösliche Material wird gesammelt und zur Herstellung der Matrix verwendet. Das Material besteht von seiner Natur her zumeist aus Kollagen und ihm fehlt osteogene oder chondrogene Aktivität.
Der Hauptbestandteil aller Knochenmatrices ist Typ-I-Kollagen. Zusätzlich zu Kollagen umfassen demineralisierte Knochenextrakte nicht-Kollagen-Proteine, die etwa 5% seiner Masse ausmachen können. In einer xenogenen Matrix können diese nicht-Kollagen-Komponenten sich selbst als potente Antigene präsentieren, und sie können immunogene und/oder inhibitorische Komponenten darstellen. Diese Komponenten können auch die Osteogenese in allogenen Implantaten inhibieren, indem sie mit der Entwicklungskaskade der Knochendifferenzierung interferieren.
Die Behandlung der Matrixpartikel mit einem die Kollagenfibrillen modifizierenden Mittel extrahiert potentiell unerwünschte Komponenten aus der Matrix und ändert die Oberflächenstruktur des Matrixmaterials. Nützliche Mittel umfassen Säuren, organische Lösungsmittel oder erhitzte wäßrige Medien. Verschiedene Behandlungen sind nachstehend beschrieben. Eine detaillierte physikalische Analyse der Wirkung dieser Fibrillen modifizierenden Mittel auf demineralisierte, mit Guanidin extrahierte Knochenkollagenpartikel ist offenbart im US-Patent Nr. 5,171,574.
Nach dem Kontakt mit dem Fibrillen modifizierenden Mittel wird die behandelte Matrix gewaschen, um alle extrahierten Komponenten zu entfernen, gemäß einer Form der Prozedur, die nachstehend dargestellt ist:

1. Suspension von 1 g/200 ml in TBS (Tris gepufferte Salzlösung) und 2 Std. Rühren bei 4°C; oder in 6 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,0 (UTBS) oder Wasser und 30 Minuten Rühren bei Raumtemperatur (RT) (ausreichend Zeit zur Neutralisation des pH-Werts);
2. Zentrifugation und Wiederholung des Waschschritts; und
3. Zentrifugation; Verwerfen des Überstands; Waschen des Rückstands mit Wasser; und Lyophilisierung.

Säurebehandlungen
1. TRIFLUORESSIGSÄURE
Trifluoressigsäure ist eine starke nicht oxidierende Säure, die ein bekanntes Quellmittel für Proteine ist und Kollagenfibrillen modifiziert.
Rinderknochenrückstand, der, wie vorstehend beschrieben, präpariert wurde, wird gesiebt und Partikel geeigneter Größe werden gesammelt. Diese Partikel werden mit verschiedenen prozentualen Gehalten (1,0% bis 100%) an Trifluoressigsäure und Wasser (Vol./Vol.) bei 0°C oder bei Raumtemperatur unter konstantem Rühren 1–2 Stunden extrahiert. Die behandelte Matrix wird filtriert, lyophilisiert oder mit Wasser/Salz gewaschen und dann lyophilisiert.
2. FLUORWASSERSTOFF
Wie Trifluoressigsäure ist Fluorwasserstoff (HF) eine starke Säure und ein Quellmittel und ist auch in der Lage, die intrapartikuläre Oberflächenstruktur zu verändern. Fluorwasserstoff ist auch als deglycosylierendes Mittel bekannt. Als solches kann HF als Verstärker der osteogenen Aktivität dieser Matrices durch Entfernung des antigenen Kohlenhydratgehalts aller Glycoproteine fungieren, die nach der Guanidinextraktion noch mit der Matrix assoziiert sind.
Rinderknochenrückstand, der, wie vorstehend beschrieben, präpariert wurde, wird gesiebt und Partikel geeigneter Größe werden gesammelt. Die Probe wird im Vakuum über P₂O₅ getrocknet, in das Reaktionsgefäß übertragen und durch Destillation bei –70°C auf die Probe wasserfreiem Fluorwasserstoff (10–20 ml/g Matrix) ausgesetzt. Das Gefäß kann sich auf 0°C erwärmen und das Reaktionsgemisch wird bei dieser Temperatur zwei Stunden gerührt. Nach dem Verdampfen des Fluorwasserstoffs im Vakuum wird der Rückstand über KOH-Pellets im Vakuum sorgfältig getrocknet, um alle verbliebenen Spuren der Säure zu entfernen. Das Ausmaß der Deglycosylierung kann mittels einer Kohlenhydratanalyse von Matrixproben, die vor und nach der Behandlung mit Fluorwasserstoff entnommen wurden, nach ausreichendem Waschen der Proben, um nicht kovalent gebundene Kohlenhydrate zu entfernen, bestimmt werden. SDS extrahierte Proteine von mit HF behandeltem Material ist negativ in Bezug auf Kohlenhydrat, wie bestimmt mittels Con A-Blotting.
Die deglycosylierte Knochenmatrix wird als nächstes zweimal mit TBS (Tris gepufferte Salzlösung) oder UTBS gewaschen, mit Wasser gewaschen und dann lyophilisiert. Es werden andere Säurebehandlungen zusätzlich zu HF und TFA in Betracht gezogen.
Gegenwärtig ist TFA wegen seiner Flüchtigkeit das bevorzugte Mittel zur Säurebehandlung bei diesen Behandlungen. Es wird jedoch verstanden, daß andere, eventuell weniger kaustische Säuren verwendet werden können, wie Essigsäure oder Ameisensäure.
Lösungsmittelbehandlungen
1. DICHLORMETHAN
Dichlormethan (DCM) ist ein organisches Lösungsmittel, das in der Lage ist, Proteine ohne Beeinflussung ihrer Primärstruktur zu denaturieren. Dieses Quellmittel ist ein geläufiges Reagens bei der automatischen Peptidsynthese und wird bei Waschschritten verwendet, um Komponenten zu entfernen. Rinderknochenrückstand, der, wie vorstehend beschrieben, präpariert wurde, wird gesiebt und Partikel geeigneter Größe werden in 100% DCM inkubiert, oder vorzugsweise in 99,9% DCM/0,1% TFA. Die Matrix wird mit dem Quellmittel für eine bis zwei Stunden bei 0°C oder bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ wird die Matrix ohne Inkubation mit dem Mittel mindestens dreimal mit kurzen Waschschritten (jeweils 20 Minuten) behandelt.
2. ACETONITRIL
Acetonitril (ACN) ist ein organisches Lösungsmittel, das in der Lage ist, Proteine ohne Beeinflussung ihrer Primärstruktur zu denaturieren. Es ist ein geläufiges Reagens, das bei der Hochleistungs-Flüssigchromatographie verwendet wird, und es wird verwendet, um Proteine aus Säulen auf Silica-Basis durch Störung der hydrophoben Wechselwirkungen zu eluieren.
Partikel von Rinderknochenrückstand mit der geeigneten Größe, wie vorstehend beschrieben, hergestellt, werden mit 100% ACN (1,0 g/30 ml) oder vorzugsweise 99,9% ACN/0,1% TFA 1–2 Stunden unter konstantem Rühren bei Raumtemperatur behandelt. Die behandelte Matrix wird dann mit Wasser gewaschen oder mit Harnstoffpuffer oder mit 4 M NaCl gewaschen und lyophilisiert. Alternativ kann die mit ACN oder ACN/TFA behandelte Matrix ohne Waschen lyophilisiert werden.
3. ISOPROPANOL
Isopropanol ist auch ein organisches Lösungsmittel, das in der Lage ist, Proteine ohne Beeinflussung ihrer Primärstruktur zu denaturieren. Es ist ein geläufiges Reagens, das verwendet wird, um Proteine aus Silica-HPLC-Säulen zu eluieren. Partikel von Rinderknochenrückstand mit der geeigneten Größe, wie vorstehend beschrieben, hergestellt, werden mit 100% Isopropanol (1,0 g/30 ml) oder vorzugsweise in der Gegenwart von 1% TFA 1–2 Stunden unter konstantem Rühren bei Raumtemperatur behandelt. Die Matrix wird dann mit Wasser gewaschen oder mit Harnstoffpuffer oder mit 4 M NaCl, bevor sie lyophilisiert wird.
4. CHLOROFORM
Chloroform kann auch verwendet werden, um die Oberfläche von Knochenmatrix, wie die vorstehend dargestellten Reagentien zu erhöhen, entweder allein oder angesäuert. Die Behandlung, wie vorstehend beschrieben, ist wirksam, um sicherzustellen, daß das Material vor der Implantation frei von Pathogenen ist.
Hitzebehandlung
Das gegenwärtig am meisten bevorzugte Mittel ist ein erhitztes, wäßriges, Fibrillen modifizierendes Medium wie Wasser, um die Oberfläche und die Porosität der Matrixpartikel zu erhöhen. Das gegenwärtig am meisten bevorzugte wäßrige Medium ist ein saures wäßriges Medium, das einen pH-Wert von weniger als 4,5 hat, d. h. im Bereich von etwa pH 2–pH 4, der helfen kann, das Kollagen vor dem Erhitzen "aufzuquellen". Essigsäure (0,1%), die einen pH-Wert von etwa 3 hat, ist gegenwärtig am meisten bevorzugt. 0,1 M Essigsäure kann auch verwendet werden.
Verschiedene Mengen an von Lipiden befreitem, demineralisiertem, mit Guanidin extrahiertem Knochenkollagen werden in dem wäßrigen Medium (1 g Matrix/30 ml wäßriges Medium) unter konstantem Rühren in einem Glaskolben mit Wassermantel erhitzt und für einen vorher bestimmten Zeitraum bei einer vorgegebenen Temperatur gehalten. Bevorzugte Behandlungszeiten sind etwa eine Stunde, obwohl Behandlungszeiten von etwa zwischen 0,5 bis zwei Stunden akzeptabel erscheinen. Die angewandte Temperatur wird bei einer Temperatur im Bereich von etwa 37°C bis 65°C konstant gehalten. Die gegenwärtig bevorzugte Hitzebehandlungstemperatur ist im Bereich von etwa 45°C bis 60°C.
Nach der Hitzebehandlung wird die Matrix filtriert, gewaschen, lyophilisiert und für die Implantation verwendet. Wenn ein saures wäßriges Medium verwendet wird, wird die Matrix auch vorzugsweise vor dem Waschen und Lyophilisieren neutralisiert. Ein gegenwärtig bevorzugter Neutralisationspuffer ist ein 200 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0. Um die Matrix zu neutralisieren, wird die Matrix nach der thermischen Behandlung vorzugsweise zunächst abkühlen lassen, das saure wäßrige Medium (z. B. 0,1% Essigsäure) wird dann entfernt und durch den Neutralisationspuffer ersetzt und die Matrix für etwa 30 Minuten geschüttelt. Der Neutralisationspuffer kann dann entfernt werden und die Matrix gewaschen und lyophilisiert werden (vgl. vorstehend).
Die Wirkungen der Hitzebehandlung auf die Morphologie des Matrixmaterials ist beschrieben bei Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557. Die heiße wäßrige Behandlung kann das Ausmaß von Mikrogrübchen auf der Partikeloberfläche erhöhen (d. h. etwa 10-fach) ebenso wie auch substantiell die Partikelporosität erhöhen. Diese Veränderung der Morphologie der Matrixpartikel erhöht wesentlich die Partikeloberfläche. Die sorgfältige Messung der Größe der Poren und Mikrogrübchen offenbart, daß die Behandlung der Matrixpartikel mit heißem wäßrigem Medium Durchmesser im Bereich von 1 μm bis 100 μm bei den Partikelporen und Mikrogrübchen ergibt.
Oppermann et al., zeigen auch, daß ein vollständiger Lösungsmittelextrakt von der mit heißem Wasser behandelten Matrix die von OP-1 induzierte Bildung von neuem Knochen in dosisabhängiger Weise inhibiert. Somit kann eine solche Behandlung auch eine Komponente/Komponenten entfernen, deren Assoziation mit der Matrix mit der Bildung von neuem Knochen in vivo interferiert.
Die Matrix kann auch behandelt werden, um verunreinigende Schwermetalle zu entfernen, wie durch das Einwirken von Metallionenchelatoren auf die Matrix. Zum Beispiel kann nach der thermischen Behandlung mit 0,1%-iger Essigsäure die Matrix in einem Neutralisationspuffer neutralisiert, werden, der Natrium-EDTA enthält, z. B. 200 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA, pH 7,0. Die Verwendung von 5 mM EDTA stellt einen etwa 100-fachen molaren Überschuß an Chelator für die restlichen Schwermetalle bereit, die in den bis jetzt getesteten, am meisten verunreinigten Matrices anwesend waren. Das anschließende Waschen der Matrix nach der Neutralisation scheint die Hauptmenge an EDTA zu entfernen. Die Behandlung der Matrixpartikel mit EDTA reduziert den restlichen Schwermetallgehalt aller getesteten Metalle (Sb, As, Be, Cd, Cr, Cu, Co, Pb, Hg, Ni, Se, Ag, Zn, Tl) auf weniger als etwa 1 ppm. Biotests mit mit EDTA behandelten Matrices zeigen, daß die Behandlung mit dem Metallionenchelator die Knochen induzierende Aktivität nicht inhibiert.
Die Kollagenmatrixmaterialien nehmen vorzugsweise die Form eines feinen Pulvers an, unlöslich in Wasser, nicht adhärierende Partikel umfassend. Es kann einfach durch Einpacken in den Rauminhalt verwendet werden, in dem das Wachstum von neuem Knochen oder eine andauernde Freisetzung gewünscht wird, vom umgebenden Gewebe an der Stelle gehalten.
In einer anderen Ausführungsform kann das Pulver verkapselt sein in z. B. eine Ummantelung aus Gelatine oder Polymilchsäure, die leicht vom Körper absorbiert wird. Das Pulver kann zu einem Volumen vorgegebener Dimensionen geformt werden und es kann unter Verwendung von zum Beispiel löslichem, Spezies-biokompatiblem Kollagen durch Interadhärenz der Partikel in dieser Form gehalten werden. Das Material kann auch in der Form von Blättern, Stäben, Kügelchen oder anderen makroskopischen Formen produziert werden.
Demineralisierte Rattenknochenmatrix, die als allogene Matrix verwendet wird, kann aus mehreren dehydratisierten diaphysealen Schäften von Rattenoberschenkelknochen und -Schienbein hergestellt werden (wie beschrieben bei Oppermann et al., US 5,354,557 ), um eine Knochenpartikelgröße zu produzieren, die durch ein Sieb von 420 μm paßt. Die Knochenpartikel werden einer dissoziativen Extraktion mit 4 M Guanidin-HCl unterworfen. Eine solche Behandlung resultiert in einem kompletten Verlust der inhärenten Fähigkeit der Knochenmatrix zur Induktion der endochondralen Knochendifferenzierung. Das verbleibende unlösliche Material wird zur Fabrikation der Matrix verwendet. Das Material besteht von seiner Natur her zumeist aus Kollagen und induziert bei Implantation nicht die Bildung von Knorpel oder Knochen. Alle neuen Herstellungen werden vor der Verwendung auf ihren Mineralgehalt und ihre osteogene Aktivität getestet. Der totale Verlust an biologischer Aktivität der Knochenmatrix wird geheilt, wenn eine aktive Fraktion an morphogenem Protein oder eine im Wesentlichen reine Herstellung von morphogenem Protein mit der biologisch inaktiven, unlöslichen Kollagenmatrix zusammengebracht wird.
Lyophilisierung mit Ethanol-Trifluoressigsäure
Bei diesem Verfahren wird das morphogene Protein in einer Lösung von Ethanol-Trifluoressigsäure (47,5% EtOH/0,01% TFA) gelöst und zu dem Trägermaterial mit dem MPSF zugegegeben. Die Proben werden mit einem Vortex-Gerät behandelt und dann lyophilisiert. Dieses Verfahren wird gegenwärtig bevorzugt.
Lyophilisierung mit Acetonitril-Trifluoressigsäure
Dies ist eine Variante des vorstehenden Verfahrens unter Verwendung einer Lösung von Acetonitril-Trifluoressigsäure (ACN/TFA), um das morphogene Protein zu solubilisieren, das dann zu dem MPSF und dem Trägermaterial zugegegeben wird. Die Proben werden vielfach heftig mit einem Vortex-Gerät behandelt und dann lyophilisiert.
Ethanolfällung
Die Matrix wird zu morphogenem Protein und MPSF zugegeben, die in Guanidin-HCl gelöst sind. Die Proben werden mit einem Vortex-Gerät behandelt und bei niedriger Temperatur inkubiert (d. h. 4°C). Die Proben werden dann weiter mit einem Vortex-Gerät behandelt. Es wird kaltes absolutes Ethanol zu dem Gemisch zugegeben (5 Volumina), welches dann gerührt und inkubiert wird, vorzugsweise 30 Minuten bei –20°C. Nach der Zentrifugation (Mikrofuge, hohe Geschwindigkeit) wird der Überstand verworfen. Die rekonstituierte Matrix wird zweimal mit kaltem, konzentriertem Ethanol in Wasser (85% EtOH) gewaschen und dann lyophilisiert.
Harnstoff-Lyophilisierung
Für diejenigen morphogenen Proteine, die in Harnstoffpuffer hergestellt werden, wird das Protein mit dem MPSF und dem Matrixmaterial gemischt, vorsichtig mit einem Vortex-Gerät behandelt und dann lyophilisiert. Das lyophilisierte Material kann, „wie es ist", für Implantate verwendet werden.
Lyophilisierung aus gepufferter Salzlösung
Herstellungen von morphogenem Protein in physiologischer Salzlösung können auch mit dem MPSF und dem Matrixmaterial mit einem Vortex-Gerät behandelt und lyophilisiert werden, um eine morphogen aktives Material zu produzieren.
Diese Verfahren können auch verwendet werden, um andere aktive therapeutische Wirkstoffe, Hormone und verschiedene bioaktive Mittel zum Zwecke der andauernden Freisetzung an die Matrix zu adsorbieren.
Beispiel 7: Rattenmodell-Biotest für die Knocheninduktion
Dieser Test besteht in der Implantierung von allogenen oder xenogenen Testproben an subkutanen Stellen in Empfängerratten unter Etheranästhesie. Männliche Long-Evans-Ratten, 28–32 Tage alt, können verwendet werden. Unter sterilen Bedingungen wird ein vertikaler Einschnitt in der Haut im Bereich des Thorax gemacht und durch stumpfe Sektion eine Tasche geformt. Etwa 25 mg Testprobe wird tief in die Tasche implantiert und der Einschnitt wird mit einem metallischen Hautclip geschlossen. Der Tag der Implantation wird als der Tag eins des Experiments bezeichnet. Die Implantate werden am Tag 12 entfernt. Die heterotrophe Stelle erlaubt die Untersuchung der Knocheninduktion ohne mögliche Zweideutigkeiten, die bei der Verwendung von orthotropen Stellen resultieren.
Die Knochen induzierende Aktivität wird biochemisch durch die spezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase und den Calciumgehalt der Implantate am Tag 12 bestimmt. Eine Erhöhung bei der spezifischen Aktivität der alkalischen Phosphatase zeigt den Beginn der Knochenbildung. Der Calciumgehalt ist andererseits proportional zu der Menge an Knochen, die sich in dem Implantat gebildet hat. Die Knochenbildung wird daher durch die Bestimmung des Calciumgehalts des Implantats am Tag 12 in Ratten berechnet und als "knochenbildende Einheiten" ausgedrückt, wobei eine knochenbildende Einheit die Menge an Protein darstellt, die für die halbmaximale knochenbildende Aktivität des Implantats am Tag 12 erforderlich ist. Die Knocheninduktion, die durch intakte, demineralisierte Rattenknochenmatrix gezeigt wird, wird für Vergleichszwecke in diesem Test als die maximale Knochendifferenzierungsaktivität angesehen.
Zelluläre Ereignisse während der Bildung von endochondralem Knochen
Erfolgreiche Implantate zeigen eine kontrollierte Entwicklung durch die Stadien der von Protein induzierten endochondralen Knochenentwicklung, einschließlich: (1) transiente Infiltration durch polymorphonukleäre Leukocyten am Tag eins; (2) Wanderung und Proliferation von mesenchymalen Zellen an den Tagen zwei und drei; (3) Chondrocyten erscheinen an den Tagen fünf und sechs; (4) Bildung von Knorpelmatrix am Tag sieben; (5) Knorpelcalcifizierung am Tag acht; (6) vaskuläres Einwachsen, Erscheinen von Osteoblasten und Bildung von neuem Knochen an den Tagen neun und zehn; (7) Erscheinen von Osteoclasten, Remodellierung von Knochen und Auflösung der implantierten Matrix an den Tagen zwölf bis 18; und (8) hämatopoetische Knochenmarksdifferenzierung in den Knöchelchen am Tag 21. Dieser Zeitverlauf in Ratten kann durch Erhöhung der zugegebenen Mengen an OP-1 beschleunigt werden. Es ist möglich, daß steigende Mengen an einem oder mehreren MPSFs diesen Zeitverlauf ebenfalls beschleunigen können. Die Form des neuen Knochens stimmt mit der Form der implantierten Matrix überein.
Histologische Bewertung
Histologische Schnitte und Anfärben werden bevorzugt, um das Ausmaß der Osteogenese in den Implantaten zu bestimmen. Die Implantate werden in Bouins-Lösung fixiert, in Paraffin eingebettet und in Schnitte von 6–8 μm geschnitten. Die Anfärbung mit Toluidinblau oder Hämotoxylin/Eosin zeigt klar die letztliche Entwicklung von endochondralem Knochen. Implantate von zwölf Tagen sind üblicherweise ausreichend, um zu bestimmen, ob die Implantate neu induzierten Knochen enthalten.
Biologische Marker
Die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP) kann als Marker für die Osteogenese verwendet werden. Die Enzymaktivität kann nach der Homogenisierung des Implantats spektrophotometrisch bestimmt werden. Die Aktivität hat nach 9–10 Tagen in vivo einen Höhepunkt und nimmt danach langsam ab. Implantate, die histologisch keine Knochenentwicklung zeigen, haben unter diesen Testbedingungen eine niedrige oder keine Aktivität der alkalischen Phosphatase. Der Test ist für die rasche Quantifizierung und zur raschen Gewinnung einer Abschätzung der Knochenbildung von Nutzen, nachdem die Implantate aus der Ratte entfernt wurden. Alternativ kann die Menge an Knochenbildung durch Messung des Calciumgehalts des Implantats bestimmt werden.
Die Genexpressionsmuster, die mit der Bildung von endochondralem Knochen oder von anderen Typen von Gewebe korrelieren, können auch durch Quantifizierung der mRNA-Mengen unter Verwendung von Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie der Northern-Blot-Analyse, festgestellt werden. Solche Expressionsmarker für Entwicklungsgene können verwendet werden, um den Fortschritt durch den Gewebedifferenzierungsweg nach Behandlungen mit osteogenem Protein/MPSF zu bestimmen. Diese Marker umfassen mit Osteoblasten verwandte Matrixproteine wie Prokollagen α₁ (I), Prokollagen α₁ (I), Prokollagen α₁ (III), Osteonectin, Osteopontin, Biglycan und alkalische Phosphatase für die Knochenregeneration ( vgl. z. B. Suva et al., J. Bone Miner. Res., 8, S. 379–88 (1993); Benayahu et al., J. Cell. Biochem., 56, S. 62–73 (1994)).
Beispiel 8: Katzenmodell-Biotest für die Knochenreparatur
Ein Osteotomie-Defekt des Oberschenkelknochens wird chirurgisch hergestellt. Ohne weitere Intervention würde der simulierte Bruchdefekt stetig zur Pseudoarthrosebildung fortschreiten. Die Wirkungen von osteogenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen, die in die geschaffenen Knochendefekte implantiert werden, werden mittels des folgenden Untersuchungsprotokolls bewertet.
Die Katzenuntersuchungen mit Defekten des Oberschenkelknochens von 1 cm und 2 cm zeigen, daß eine Vorrichtung, die eine Matrix umfaßt, die zur Verfügung stehendes osteogenes Protein und MPSF enthält, (1) einen Defekt in einem Gewicht tragenden Knochen in einem großen Tier reparieren kann; (2) kurz nach (weniger als zwei Wochen) der Implantation stetig die Knochenbildung induzieren kann; uns (3) durch endochondrale Ossifikation Knochen induzieren kann, mit einer Stärke wie bei normalem Knochen und auf der Basis Volumen für Volumen. Darüber hinaus bleiben alle Tiere während der Studie gesund und zeigen keine Anzeichen einer klinischen oder histologischen Reaktion auf die implantierte Vorrichtung im Labor. In diesem Knochendefektmodell gibt es wenig oder keine Heilung an Stellen von Knochenkontrollimplantation. Die Resultate liefern einen Beweis für die erfolgreiche Verwendung von osteogenen Zusammensetzungen und Vorrichtungen dieser Erfindung bei der Reparatur von großen Pseudoarthrose-Knochendefekten.
Das Verfahren ist in Kürze wie folgt: 16 erwachsene Katzen, die alle weniger als 10 lbs wiegen, erleiden die unilaterale Herstellung eines Knochendefekts von einem cm im rechten Oberschenkelknochen durch einen lateralen chirurgischen Vorgang. In anderen Experimenten kann ein Knochendefekt von 2 cm erzeugt werden. Der Oberschenkelknochen wird sofort durch laterale Plazierung einer Platte mit 8 Löchern intern fixiert, um die exakten Ausmaße des Defekts zu erhalten. Drei verschiedene Arten von Materialien können in die chirurgisch geschaffenen Oberschenkelknochendefekte der Katze implantiert werden: Gruppe I ist eine negative Kontrolle, die dieselbe Plattenfixierung mit Implantaten von mit 4 M Guanidin-HCl behandeltem (inaktiviertem), demineralisiertem Knochenmatrixpulver der Katze erleidet (GuHCl-DBM) (360 mg); Gruppe II ist eine positive Kontrollgruppe, der ein biologisch aktives, demineralisiertes Knochenmatrixpulver implantiert wird (DBM) (360 mg); und die Gruppen III und IV erleiden ein Verfahren, das identisch ist mit den Gruppen I–II, mit dem Zusatz von morphogenem Protein allein (Gruppe III) und morphogenem Protein +MPSF (Gruppe IV) auf jede der GuHCl-DBM-Trägerproben.
Alle Tiere dürfen sich nach der Operation ad libitum innerhalb ihrer Käfige frei bewegen. Allen Katzen wird Tetracyclin (25 mg/kg subkutan (SQ) vier Wochen lang wöchentlich) für die Markierung der Knochen injiziert. Alle außer vier Tiere der Gruppe III und vier Tiere der Gruppe IV werden vier Monate nach der Oberschenkelosteotomie getötet.
Es werden unmittelbar nach der Operation nach 4, 8, 12 und 16 Wochen radiomorphometrische Untersuchungen in vivo durchgeführt, indem eine standardisierte Röntgenaufnahme des leicht anaesthetisierten Tieres in einer gepolsterten Röntgenstrahl-Spannvorrichtung aufgenommen wurde, die so eingerichtet war, eine echte anterio-posterior-Ansicht des Oberschenkelknochens und der Osteotomiestelle zu produzieren. Alle Röntgenaufnahmen werden auf genau die gleiche Weise und in der genau gleichen Position von jedem Tier aufgenommen. Die Knochenreparatur wird als Funktion der Mineralisierung mittels der Zufallspunktanalyse berechnet. Letztlich wird nach der Tötung eine radiographische Untersuchung an Proben des ausgeschnittenen Knochens in zwei Ebenen durchgeführt.
Nach 16 Wochen wird der Prozentsatz der Oberschenkel der Gruppen III und IV, die verschlossen wurden, und der durchschnittliche Prozentsatz an Knochendefektregeneration in den Gruppen I–IV verglichen. Die negativen GuHCl-DMB-Kontroll-Implantate der Gruppe I sollten im Allgemeinen nach vier Wochen kein Knochenwachstum, weniger als 10% nach acht und 12 Wochen, und etwa 16% (+/– 10%) nach 16 Wochen zeigen. Die positiven DMB-Kontroll-Implantate der Gruppe II sollten im Allgemeinen nach vier Wochen etwa 15–20% Reparatur, 35% nach acht Wochen, 50% (+/– 10%) nach 12 Wochen und 70% (+/– 12%) nach 16 Wochen zeigen.
Ausgeschnittene Test- und normale Oberschenkelknochen können unmittelbar mit einem Knochendensitometer untersucht werden, oder sie können in zwei Schichten von mit Salzlösung getränkten Handtüchern eingewickelt werden, in versiegelten Plastikbeuteln plaziert werden und bei –20°C bis zu weiteren Untersuchungen aufbewahrt werden. Die Stärke der Knochenreparatur, die Belastung bis zum Versagen und die Arbeit bis zum Versagen werden durch Belastung auf einer speziell entworfenen 4-Punkt Biege-Spannvorrichtung aus Stahl bis zum Versagen getestet, die an eine Instron-Testmaschine angeschlossen ist, um die Knochenstärke, die Knochensteifheit, die absorbierte Energie und die Deformation bis zum Versagen zu quantifizieren. Die Untersuchung von Testoberschenkelknochen und normalen Oberschenkelknochen ergibt die Knochenstärke (Belastung) in Pfund und die Arbeit bis zum Versagen in Joule. Normale Oberschenkelknochen zeigen eine Stärke von 96 (+/– 12) Pfund.
Die Stärke von Oberschenkelknochen mit implantierter osteogener Vorrichtung sollte entsprechend der Oberfläche an der Stelle des Bruchs korrigiert werden (wegen der "Sanduhr"-Form der Knochendefektreparatur). Mit dieser Korrektur sollte das Resultat eng mit der normalen Knochenstärke korrelieren.
Nach der biomechanischen Testung werden die Knochen an der Defektstelle sofort in zwei longitudinale Schnitte zerschnitten, gewogen, und das Volumen wird gemessen. Eine Hälfte wird für eine histomorphometrische Standardbewertung von calcifiertem Knochen mit Einbau von fluoreszierendem Farbstoff fixiert, und eine Hälfte wird für die histologische Präparation mit decalcifierter Hämotoxylin/Eosinfärbung fixiert.
Ausgewählte Proben von der Knochenreparaturstelle werden in kaltem 0,15 M NaCl, 3 mM NaHCO3, pH 9,0 mit einer Spex-Gefriermühle homogenisiert. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase des Überstands und der gesamte Calciumgehalt der säurelöslichen Fraktion des Sediments werden dann bestimmt.
Beispiel 9: Kaninchenmodell-Biotest für die Knochenreparatur
Dieser Test ist im Detail in Oppermann et al., US-Patent Nr. 5,354,557 beschrieben; vgl. auch Cook et al., J. of Bone and Joint Surgery, 76-A, S. 827–38 (1994). In ausgewachsenen (weniger als 10 engl. Pfd.) New Zealand White-Kaninchen mit epiphysealem Verschluß, wie mittels Röntgenaufnahme gezeigt, wurden Pseudoarthroe-Defekte von 1,5 cm in der Elle erzeugt. Das Experiment kann die Implantation von Vorrichtungen in mindestens acht Kaninchen per Gruppe wie folgt umfassen: Gruppe I ist eine negative Kontrolle mit Implantaten von mit 4 M Guanidin-HCl behandeltem (inaktiviertem), demineralisiertem Knochenmatrixpulver (GuHCl-DBM); Gruppe II ist eine positive Kontrollgruppe, der ein biologisch aktives, demineralisiertes Knochenmatrixpulver (DBM) implantiert wird; Gruppe III mit Implantaten mit osteogenem Protein allein; Gruppe IV mit Implantaten von Kombinationen aus osteogenem Protein/MPSF und Gruppe V-Kontrollen, die kein Implantat erhalten. Die Defekte der Elle werden über den gesamten Verlauf der Untersuchung von acht Wochen in jeder Gruppe von Kaninchen verfolgt.
In einem anderen Experiment wird die Markhöhle des Defekts von 1,5 cm der Elle vollgepackt mit aktiviertem osteogenem Protein in Kaninchenknochenpulver in der Anwesenheit oder Abwesenheit eines MPSF. Die Knochen werden interkalarisch mit Allotransplantat versehen. Die Ellen der negativen Kontrolle sind nach acht Wochen nicht geheilt und zeigen das klassische "Elfenbein"-Aussehen. Deutlich im Gegensatz dazu "verschwinden" die mit osteogenem Protein/MPSF behandelten Implantate radiographisch nach vier Wochen mit einem Beginn der Remineralisierung nach sechs bis acht Wochen. Die Allotransplantate heilen an jedem Ende mit einer sanften proliferativen Knochenbildung nach acht Wochen. Diese Art von Vorrichtung dient dazu, die Allotransplantat-Reparatur zu beschleunigen.
Implantate, die mit einem osteogenen Protein in der Anwesenheit eines MPSF behandelt wurden, zeigen eine beschleunigte Reparatur oder sie können unter Verwendung von niedrigeren Konzentration an osteogenem Protein mit derselben Rate funktionieren. Wie vorstehend beschrieben wurde, kann das Kaninchenmodell auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von Bedingungen zu testen und diese zu optimieren, bei denen eine spezielle Kombination aus osteogenem Protein/MPSF die lokale Knochen- und Knorpelbildung induzieren kann.
Beispiel 10: Hundeellendefekt-Biotest für die Knochenreparatur
Dieser Test wird im Wesentlichen, wie bei Cook et al., Clinical Orthopaedics and Related Research, 301, S. 302–312 (1994) beschrieben, durchgeführt, hier durch Bezugnahme eingeschlossen. In Kürze wird ein segmentales Defektmodell der Elle verwendet, um die Knochenheilung in erwachsenen männlichen Hunden von 35–45 kg zu bewerten. Experimentelle Zusammensetzungen, die 500 mg unlösliches Rinderknochenkollagen umfassen, werden mit 0, 625, 1200 oder 2500 μg OP-1 (vorzugsweise in CHO-Zellen exprimiertes rekombinantes OP-1; Beispiel 2B) in der Abwesenheit oder Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von einem oder mehreren mutmaßlichen MPSFs rekonstituiert. Anstelle von OP-1 kann in diesem Test jedes osteogene Protein verwendet werden. Die Implantationen an den Defektstellen werden mit einer Trägerkontrolle und mit dern experimentellen Serien von OP-1 und Kombinationen von OP-1/MPSF durchgeführt, die getestet werden. Die mechanische Testung wird an den Ellen von Tieren durchgeführt, die die kombinierten Substanzen 12 Wochen nach der Implantation erhielten. Es werden wöchentlich radiographische Aufnahmen der vorderen Gliedmaßen aufgenommen, bis die Tiere 12 oder 16 Wochen nach der Operation getötet werden. Es werden histologische Schnitte von der Defektstelle und vom benachbarten normalen Knochen analysiert.
Die Anwesenheit von einem oder mehreren MPSFs kann die Rate der Knochenreparatur im Hund erhöhen. Die Anwesenheit von einem oder mehreren MPSFs kann auch die Verwendung von reduzierten Konzentrationen an osteogenem Protein pro kombinierter Substanz erlauben, um ähnliche oder dieselben Resultate zu erreichen.
Beispiel 11 Affenelle- und -schienbeindefekt-Biotest für die Knochenreparatur
Dieser Knochenheilungstest in Afrikanischen grünen Meerkatzen wird, im Wesentlichen wie bei Cook et al., J. Bone and Joint Surgery, 77A, S. 734–50 (1995) beschrieben, durchgeführt. In Kürze wird ein osteoperiostealer Defekt von 2,0 cm in der Mitte des Ellenschafts erzeugt und mit einem Implantat gefüllt, das verschiedene Matrices umfaßt, die 1000 μg OP-1 (vorzugsweise in CHO-Zellen exprimiertes rekombinantes OP-1; Beispiel 2B) in der Abwesenheit oder Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von einem oder mehreren mutmaßlichen MPSFs enthalten. Es wurden experimentelle kombinierte Substanzen verwendet, die verschiedene Matrices, mit 0, 250, 500 oder 100 oder 2000 μg OP-1 in der Abwesenheit oder Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von einem oder mehreren mutmaßlichen MPSFs rekonstruiert, umfaßten, um die osteoperiostealen Defekte zu füllen, die in der Diaphysis des Schienbeins erzeugt worden waren. Anstelle von OP-1 kann in diesem Test jedes osteogene Protein verwendet werden. Die Implantationen an den Defektstellen werden mit einer Trägerkontrolle und mit den experimentellen Serien von OP-1 und Kombinationen von OP-1/MPSF durchgeführt, die getestet werden. Die mechanische Testung wird an den Ellen und Schienbeinen von Tieren durchgeführt, die die kombinierten Substanzen erhielten. Es werden radiographische Aufnahmen und histologische Schnitte von der Defektstelle und vom benachbarten normalen Knochen analysiert, wie in Cook et al. beschrieben.
Die Anwesenheit von einem oder mehreren MPSFs kann die Rate der Knochenreparatur in dem Affen erhöhen. Die Anwesenheit von einem oder mehreren MPSFs kann auch die Verwendung von reduzierten Konzentrationen an osteogenem Protein pro kombinierter Substanz erlauben, um ähnliche oder dieselben Resultate zu erreichen.
Beispiel 12: Rattenmodell-Biotest für die Sehnen/Bänder-ähnliche Gewebebildung
Der ectopische Implantattest der Ratte nach Sampath und Reddi wird so modifiziert, daß der Schritt der Ethanolfällung durch einen Dialyseschritt gegen Wasser, wenn die Zusammensetzung aus morphogenem Protein/MPSF eine Lösung ist, oder einen Diafiltrationsschritt gegen Wasser ersetzt wird, wenn sie eine Suspension ist, gefolgt von Äquilibrierung gegen 0,1%-ige Trifluoressigsäure. Die resultierende Lösung wird mit 20 mg Rattenmatrix gemischt, das Gemisch wird eingefroren, lyophilisiert und in #5 Gelatinekapseln eingeschlossen (oder anderen funktionell äquivalenten Vorrichtungen). Diese Vorrichtungen werden dann subkutan in den abdominalen Brustkorbbereich von Ratten implantiert (21–49 Tage alte Männliche Long Evans-Ratten wurden bei Celeste et al. verwendet).
Die subkutanen Implantate werden nach zehn Tagen entfernt, und unter Verwendung bekannter Verfahren wird ein Schnitt von jedem für die histologische Analyse verarbeitet (vgl. z. B. Ham und Cormack, Histology S. 367–69 (J. B. Lippincott Co. 1979). Glycolmethacrylatschnitte (1 μm) werden mit Von Kossa und saurem Fuschin gefärbt, um die Menge an embryonalem Sehnen/Bänder-ähnlichem Gewebe sichtbar zu machen und zu quantifizieren, die in jedem Implantat induziert worden war. Positive (d. h. BMP-12 enthaltende) und negative (d. h. eine Scheinvorrichtung) Implantatkontrollgruppen werden mit experimentellen Implantaten verglichen, die entweder ein morphogenes Protein allein oder ein morphogenes Protein in Kombination mit einem MPSF umfassen. Das embryonale Sehnen/Bänder-ähnliche Gewebe, charakterisiert durch dicht gepackte Fibroblastenbündel, die in derselben Ebene orientiert sind, können in den positiven Kontrollimplantaten nach zehn Tagen beobachtet werden.
Beispiel 13: Rattenmodell-Biotest für die Nervenregeneration und -reparatur
Es wird ein Matrixträger hergestellt. Wang et al. (WO 95/05846) verwendeten Collastat^®, einen Kollagenschwamm (Vitaphore Wound Healing, Inc.), aber jeder andere erwünschte Träger kann auf seine Anwendbarkeit getestet werden, so wie die hier beschriebenen. Der Kollagenträger wird durch Waschen, Lyophilisierung, Sterilisierung und Entgasen hergestellt und wird dann zum Beispiel beladen mit: keinem morphogenen Protein (negative Kontrollgruppe), mit morphogenem Protein allein (Gruppe I) oder mit einer speziellen Kombination aus morphogenem Protein/MPSF (Gruppe II). Variationen bei der experimentellen Planung erlauben es dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet eine Vielzahl verschiedener Kombinationen aus morphogenem Protein/MPSF unter verschiedenen Bedingungen zu testen.
Alle Handhabungen werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die beladenen Matrices werden in etwa 1,6 × 20 mm langen sterilen, offenen Silicongummi oder biologisch abbaubaren Schläuchen (Stents) plaziert, die beschnitten werden können, um vor der Operation überflüssigen Schlauch zu entfernen. Offene Silicongummi oder biologisch abbaubare Stents, die die Matrices enthalten, werden unter dem Mikroskop angebracht und mit den durchtrennten Nervenenden verbunden, die an jedem Ende für etwa 1 mm in den Stent eingeführt werden, wobei ein "Nervendefekt" mit einer Lücke von etwa 15 mm entsteht. Die Ratten werden auf die Rückkehr der elektrischen Funktion über einen Zeitverlauf von Wochen nach der Implantation getestet. Zusammengesetzte Muskelaktionspotentiale (CMAPs) stellen eine reproduzierbare transkutane Messung zur Bewertung des Ausmaßes der Rückkehr der Funktion dar. Die CMAP-Amplitude und -Latenz sind proportional zur Zahl von reinnervierten Axon-/Motorendplatten und dienen somit als ein nützlicher Index der neuronalen Regeneration.
Die Tiere können zu verschiedenen Zeiten nach der Implantation für die histopathologische Untersuchung getötet werden. Kontrollstents, die in subkutanen Geweben implantiert wurden, dienen als histochemische Kontrollen.
Beispiel 14: Synergistische Wirkung von exogenem IGF-I auf die von OP-1 induzierte Mitogenese von determinierten menschlichen Osteosarkomzellen
Zwei menschliche Zelllinien, die für die Untersuchung ausgewählt wurden, waren die menschlichen Osteosarkomzellen TE85 (ATCC CRL 1543) und SaOS-2 (ATCC HTB 85). Die Zellen wurden bei 37°C in α-MEM mit 10% fötalem Kälberserum bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden dann in serumfreiem Medium wachsen gelassen und 24 Std. mit OP-1 (200 oder 500 ng/ml) in der Abwesenheit oder Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an IGF-I behandelt. Die Kontrollzellen wurden nur mit Lösungsmittelträger behandelt. Das Ausmaß des Einbaus von [³H]-Thymidin durch diese Zellen wurde nach 24 Stunden bestimmt. Die Medien wurden für zusätzliche 24 Stunden durch frische Medien ersetzt, die die entsprechenden Proteinfaktoren enthielten. Die Niveaus der Aktivität der alkalischen Phosphatase in diesen Kulturen wurde unter Verwendung eines spektrophotomerischen Tests bestimmt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Beispiel 15: Synergistische Wirkung von verkürztem exogenem IGF-I auf die von OP-1 induzierte Differenzierung von fötalen Rattenschädeldachzellen (FRC)
Modifizierte Formen von IGF-I, die Charakteristika haben, die die Wechselwirkung mit einem oder mehreren IGF bindenden Proteinen (IGFBPs) ändern, können aus natürlichen Quellen gereinigt werden oder sie können synthetisch oder unter Verwendung von Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Vgl. z. B. G. L. Francis et al., "Novel recombinant fusion protein analogues of insulin-like growth factor (IGF)-I indicate the relative importance of IGF-binding protein and receptor binding for enhanced biological activity," J. Mol. Endocrinol., B. S. 213–223 (1992), hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
FRC-Zellen wurden in α-MEM in der Anwesenheit von 10% fötalem Kälberserum bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden in serumfreiem Medium mit OP-1 (200 ng/ml) in der Abwesenheit oder Anwesenheit von IGF-I oder Des(1-3)-IGF-I behandelt. Die Kontrollen wurden nur mit Lösungsmittelträger behandelt. Die Behandlungen waren für 24 Stunden mit einem Austausch durch frische Medien für zusätzliche 24 Stunden. Die Niveaus der Aktivität der alkalischen Phosphatase in diesen Kulturen wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt.

Claims

Zusammensetzung zur Induzierung von Gewebebildung in einem Säuger, umfassend: (a) ein morphogenes Protein, das in der Lage ist, Gewebebildung zu induzieren, wenn es Zugang zu einer Vorläuferzelle in dem Säuger hat; (b) einen morphogenen proteinstimulierenden Faktor (MPSF), welcher IGF-I ist, wobei der MPSF in einer Konzentration vorliegt, welche wirksam ist, die Fähigkeit des morphogenen Proteins, Gewebebildung aus der Vorläuferzelle zu induzieren, synergistisch zu stimulieren; und (c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das morphogene Protein ein Disulfid-verbrücktes Untereinheitenpaar umfasst, um eine dimere Art herzustellen, und wobei mindestens eine der Untereinheiten ein Polypeptid umfasst, das zu der BMP-Proteinfamilie gehört.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das morphogene Protein ein osteogenes Protein ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei das osteogene Protein in der Lage ist, die Vorläuferzelle zu induzieren, endochondralen oder intramembranösen Knochen zu bilden.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das morphogene Protein in der Lage ist, die Vorläuferzelle zu induzieren, Knorpel, Sehnen/Bänder-ähnliches Gewebe oder nervenähnliches Gewebe zu bilden.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das morphogene Protein ein Polypeptid umfasst, ausgewählt aus: BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (OP-1), BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12 und BMP-13, COP-5, COP-7.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das morphogene Protein ein Polypeptid, ausgewählt aus OP-1, BMP-2, BMP-4 und BMP-6 umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das morphogene Protein ein Polypeptid, ausgewählt aus OP-1, BMP-5 und BMP-6 umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das morphogene Protein OP-1 umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei das Dimer ein Homo- oder ein Heterodimer ist, das mindestens eine BMP-2- oder OP-1 (BMP-7)-Untereinheit umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das morphogene Protein durch Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls in einer Wirtszelle hergestellt wird.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der morphogene proteinstimulierende Faktor ein Mittel umfasst, das die IGF-I-Bioaktivität in dem Säuger erhöht.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei das Mittel, das die IGF-I-Bioaktivität in einem Säuger erhöht, eine abgeänderte Form von IGF-I ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, wobei die abgeänderte Form von IGF-I ein verkürztes IGF-I-Molekül ist, das eine verminderte Affinität gegenüber IGFBPs verglichen zum normalen IGF-I in dem Säuger hat.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei die abgeänderte Form von IGF-I Des(1-3)-IGF-I ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das morphogene Protein in einer Konzentration von mindestens etwa 1 ng/ml vorliegt, und der morphogene proteinstimulierende Faktor in einer Konzentration von mindestens etwa 0,01 ng/ml vorliegt.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das morphogene Protein OP-1 in einer Konzentration von etwa 1 ng/ml bis etwa 500 ng/ml umfasst und der morphogene proteinstimulierende Faktor IGF-I oder Des(1-3)-IGF-I in einer Konzentration von etwa 0,1 ng/ml bis etwa 5 ng/ml umfasst.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 für die Herstellung eines Medikaments, das zur Induzierung von Gewebebildung verwendbar ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 für die Herstellung eines Medikaments, das zur Behandlung eines gewebedegenerativen Zustandes in einem Säuger verwendbar ist.
Morphogene Vorrichtung zur Implantation in einem Säuger, wobei die Vorrichtung umfasst (a) einen implantierbaren biokompatiblen Träger, (b) ein morphogenes Protein, das in dem Träger dispergiert ist, wobei das morphogene Protein in der Lage ist, Gewebebildung zu induzieren, wenn es Zugang zu einer Vorläuferzelle hat, und (c) einen morphogenen proteinstimulierenden Faktor (MPSF), welcher IGF-I ist, der in dem Träger angeordnet ist, wobei der MPSF in einer Konzentration vorliegt, welche wirksam ist, die Fähigkeit des morphogenen Proteins, Gewebebildung aus einer Vorläuferzelle zu induzieren, synergistisch zu stimulieren.
Morphogene Vorrichtung gemäß Anspruch 20, wobei das morphogene Protein wie in einem der Ansprüche 2 bis 11 oder 16 definiert ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 20 oder 21, wobei der Träger ferner eine biokompatible Matrix umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 22, wobei die Matrix einen demineralisierten, proteinextrahierten, teilchenförmigen, allogenen Knochen umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 22, wobei die Matrix mineralfreie, entfettete Typ I unlösliche Knochenkollagenteilchen, die im Wesentlichen frei von nichtkollagenem Protein sind, umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 21, wobei das morphogene Protein mindestens eine Untereinheit umfasst, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche ausreichend duplikativ zu der Aminosäuresequenz von COP-5 oder COP-7 ist, sodass die Art in der Lage ist, Gewebebildung in einem Säuger zu induzieren, wenn es in einem Träger angeordnet und in dem Säuger implantiert ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 20 oder 21, umfassend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15.
Verwendung einer morphogenen Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 26 zur Herstellung eines Medikaments, das zur Induzierung von Gewebebildung an einem ausgewählten Ort verwendbar ist.
Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei der Ort ein Kieferknochen, ein Knochendefekt, der aus einer Fraktur, einer nicht heilenden Fraktur (non-union fracture), einer Fusion und einer Knochenlücke ausgewählt ist, ein Gelenk zur Verwendung in der Wiederherstellung eines Knorpels und weichen Gewebes, oder ein zum Nervensystem gehöriges Gewebe zur Verwendung zur neuralen Regeneration und Wiederherstellung ist.
Verwendung einer Matrix-umfassenden Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24 für die Herstellung eines Medikaments, das zur Beschleunigung der Allotransplantatwiederherstellung und zur Inkorporation in einem Säuger verwendbar ist.
Verwendung einer Matrix-umfassendenden Vorrichtung gemäß Anspruch 22 oder 24, wobei die Matrix der Vorrichtung einen allogenen Knochen umfasst.
Implantierbare prothetische Vorrichtung zur Wiederherstellung orthopädischer Defekte, Verletzungen oder Anomalien in einem Säuger, umfassend: (a) ein prothetisches Implantat, welches einen implantierbaren Oberflächenbereich angrenzend zu einem Zielgewebe in dem Säuger hat; und (b) eine Zusammensetzung, die ein morphogenes Protein und einen morphogenen proteinstimulierenden Faktor (MPSF), welcher IGF-I ist, umfasst, der auf dem Oberflächenbereich in einer Menge angeordnet ist, die ausreicht, um vermehrtes Gewebewachstum an der Oberfläche synergistisch zu fördern.
Prothetische Vorrichtung gemäß Anspruch 31, wobei das osteogene Protein in der Lage ist, die Vorläuferzelle zu induzieren, ein Gewebe zu bilden, welches aus endochondralem Knochen, intramembranösem Knochen, Knorpel, Sehnen/Bänder-ähnlichem Gewebe und neuralem Gewebe ausgewählt ist.
Prothetische Vorrichtung gemäß Anspruch 31, wobei das osteogene Protein wie das morphogene Protein in einem der Ansprüche 6 bis 9 oder 11 definiert ist.
Prothetische Vorrichtung gemäß Anspruch 33, wobei der morphogene proteinstimulierende Faktor ein Mittel umfasst, welches die IGF-I-Bioaktivität in dem Säuger erhöht.
Prothetische Vorrichtung gemäß Anspruch 33, wobei der morphogene proteinstimulierende Faktor in einer Menge vorliegt, welche in der Lage ist, die Fähigkeit des morphogenen Proteins, Gewebebildung in dem Säuger zu induzieren, synergistisch zu stimulieren.
Verwendung einer implantierbaren prothetischen Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 33 bis 35 für die Herstellung eines Medikaments, das zur Gewebewiederherstellung verwendbar ist.