DE69635482T2 - Säugetieren apoptosis inhibitorprotein genfamilie, primers, probes und verfahren zur nachweis - Google Patents

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Description

  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Die Erfindung betrifft Apoptose.
  • Es gibt zwei allgemeine Weisen, auf die Zellen sterben. Die am einfachsten erkannte Weise ist durch Nekrose, die für gewöhnlich von einer Verletzung verursacht wird, die schwerwiegend genug ist, um die zelluläre Homöostase zu stören. In der Regel wird der osmotische Druck der Zelle gestört und infolgedessen quellt die Zelle auf und rupturiert dann. Wenn der Zellinhalt in den sie umgebenden Geweberaum strömt, folgt oftmals eine Entzündungsreaktion.
  • Die zweite allgemeine Weise, auf die Zellen sterben, wird als Apoptose oder programmierter Zelltod bezeichnet. Apoptose tritt oftmals so schnell auf, dass sie schwer nachzuweisen ist. Dies kann dabei helfen zu erklären, warum die Beteiligung von Apoptose an einem breiten Spektrum von biologischen Prozessen erst vor kurzem erkannt worden ist.
  • Der Apoptoseweg ist über die gesamte Evolution hinweg hoch konserviert worden und spielt bei der Embryonalentwicklung, Viruspathogenese, Krebs, autoimmunen Störungen und neurodegenerativer Erkrankung eine große Rolle. Unangemessene Apoptose kann beispielsweise AIDS, Alzheimer'-Krankheit, Parkinson'-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Retinitis pigmentosa und andere Erkrankungen der Retina, myelodysplastisches Syndrom (z. B. aplastische Anämie), durch Giftstoffe induzierte Lebererkrankung, einschließlich Alkoholismus, und ischämische Verletzung (z. B. Myokardinfarkt, Schlaganfall und Reperfusionsverletzung) verursachen oder dazu beitragen. Umgekehrt ist das Ausbleiben einer apoptotischen Reaktion mit der Entwicklung von Krebs, insbesondere Brill-Symmers-Syndrom, p53-vermittelte Karzinome und hormonabhängige Tumore, mit autoimmunen Störungen, wie Lupus erythematosis und multiple Sklerose, und mit Virusinfektionen, einschließlich der mit Herpesvirus, Pockenvirus und Adenovirus zusammenhängenden, in Verbindung gebracht worden.
  • Bei mit HIV-1 infizierten Patienten reagieren reife CD4+-T-Lymphozyten auf Stimuliation durch Mitogene oder Superantigene, indem sie Apoptose erfahren. Die große Mehrheit dieser Zellen ist jedoch nicht mit dem Virus infiziert. Folglich könnte sich eine unangemessene antigeninduzierte Apoptose für die Zerstörung dieses lebenswichtigen Teils des Immunsystems in den frühen Stadien der HIV-Infektion verantwortlich zeichnen.
  • Bakuloviren kodieren Proteine, die als Inhibitoren von Apoptoseproteine (IAPs) bezeichnet werden, da sie die Apoptose inhibieren, die andernfalls auftreten würde, wenn Insektenzellen mit dem Virus infiziert werden. Von diesen Proteinen wird geglaubt, dass sie in einer von anderen viralen Proteinen unabhängigen Weise arbeiten. Die IAP-Gene vom Bakulovirus enthalten Sequenzen, die ein Ring-Zinkfingerartiges Motiv (RZF), von dem vermutet wird, dass es direkt an der DNA-Bindung beteiligt ist, und zwei N-terminale Domänen kodieren, die aus einem Wiederholungsmotiv aus 70 Aminosäuren bestehen, das als BIR-Domäne (Baculovirus IAP Repeat, Bakulovirus-IAP-Wiederholung) bezeichnet wird.
  • Studien an einer Gruppe von autosomalen rezessiven neurodegenerativen Störungen, die als die spinalen Muskelatrophien (SMAs) bekannt sind, haben zur Identifizierung eines Gens für das neuronale Apoptoseinhibitorprotein (Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein) in Menschen geführt, das zu bakuloviralen Apoptoseinhibitorproteinen (Baculoviral Apoptosis Inhibitor Protein) homolog ist. Es ist angedeutet worden, dass Mutationen in dem NAIP-Lokus zu einem Ausbleiben einer normalerweise eintretenden Inhibition von Apoptose von Motorneuronen führen kann, was im SMA-Phänotyp resultiert oder dazu beiträgt (Roy et al., Cell 80: 167–178, 1995).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem ersten Gesichtspunkt weist die Erfindung ein im Wesentlichen reines Polypeptid auf, das mindestens eine Domäne umfasst, die mindestens 85% Aminosäuresequenzidentität zu einer Domäne aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus:
    • (a) den Aminosäuren 26–93, 163–230 oder 265–330 von XIAP (SEQ ID NO: 4);
    • (b) den Aminosäuren 26–93, 163–230 oder 264–329 von mXIAP (SEQ ID NO: 10);
    • (c) den Aminosäuren 29–96, 169–235 oder 255–322 von HIAP-1 (SEQ ID NO: 6);
    • (d) den Aminosäuren 29–96, 169–235 oder 255–322 von mHIAP-1 (SEQ ID NO: 40);
    • (e) den Aminosäuren 46–113, 184–250, 269–336 von HIAP-2 (SEQ ID NO: 8) und
    • (f) den Aminosäuren 25–92, 156–222 oder 241–308 von mHIAP-2 (SEQ ID NO: 42) ausgewählt ist, wobei das Polypeptid Apoptose inhibiert.
  • Vorzugsweise weist das Polypeptid mindestens 90% Aminosäuresequenzidentität zu der Domäne auf. Mehr bevorzugt weist das Polypeptid mindestens 95% Aminosäuresequenzidentität zu der Domäne auf.
  • In einer Ausführungsform besteht das Polypeptid aus einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus:
    • (a) den Aminosäuren 26–93, 163–230 oder 265–330 von XIAP (SEQ ID NO: 4);
    • (b) den Aminosäuren 26–93, 163–230 oder 264–329 von mXIAP (SEQ ID NO: 10);
    • (c) den Aminosäuren 29–96, 169–235 oder 255–322 von HIAP-1 (SEQ ID NO: 6);
    • (d) den Aminosäuren 29–96, 169–235 oder 255–322 von mHIAP-1 (SEQ ID NO: 40);
    • (e) den Aminosäuren 46–113, 184–250, 269–336 von HIAP-2 (SEQ ID NO: 8) und
    • (f) den Aminosäuren 25–92, 156–222 oder 241–308 von mHIAP-2 (SEQ ID NO: 42) ausgewählt ist, wobei das Polypeptid Apoptose inhibiert.
  • In einer anderen Ausführungsform weist das Polypeptid mindestens 85% Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 42 auf. Vorzugsweise weist das Polypeptid mindestens 90% Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 42 auf. Mehr bevorzugt weist das Polypeptid mindestens 95% Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 42 auf.
  • In einer weiteren Ausführungsform besteht das Polypeptid aus einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 42 ausgewählt ist.
  • In einem zweiten Gesichtspunkt weist die Erfindung ein im Wesentlichen reines Nukleinsäuremolekül auf, das ein wie oben beschriebenes Polypeptid kodiert.
  • In einem dritten Gesichtspunkt weist die Erfindung einen Expressionsvektor auf, der ein wie oben beschriebenes Nukleinsäuremolekül umfasst.
  • In einem vierten Gesichtspunkt weist die Erfindung eine Zelle auf, die einen wie oben beschriebenen Expressionsvektor umfasst.
  • In einem fünften Gesichtspunkt weist die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines wie oben beschriebenen Polypeptids auf, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Bereitstellen einer Zelle, die mit einem Nukleinsäuremolekül der Erfindung transformiert wurde, wobei das Nukleinsäuremolekül zur Expression in der Zelle angeordnet ist; und
    • (b) Kultivieren der transformierten Zelle unter Bedingungen zum Exprimieren des Polypeptids, um das Polypeptid herzustellen.
  • In Fällen, in denen ein Polypeptid der Erfindung eine Ring-Zinkfinger-Domäne enthält, wird die Ring-Zinkfinger-Domäne eine Sequenz aufweisen, die Folgendem entspricht: Glu-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Lys-Xaa3-Cys-Met-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa3-Xaa1-Phe-Xaa1-Pro-Cys-Gly-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Cys-Ala-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Pro-Xaa1-Cys, wobei Xaa1 eine beliebige Aminosäure ist, Xaa2 Glu oder Asp ist und Xaa3 Val oder Ile ist (SEQ ID NO: 1).
  • Vorzugsweise weist die RZF-Domäne eine der in 6 gezeigten IAP-Sequenzen auf. Vorzugsweise befinden sich die BIR-Domänen am aminoterminalen Ende des Proteins bezüglich der RZF-Domäne, die sich an oder in der Nähe des Carboxyterminus des Polypeptids befindet.
  • Mit „IAP-Gen" ist ein Gen gemeint, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert.
  • Mit „IAP-Protein" oder „IAP-Polypeptid" ist ein Polypeptid oder ein Fragment davon gemeint, das von einem wie oben beschriebenen IAP-Gen kodiert wird.
  • Mit „BIR-Domäne" ist eine Domäne gemeint, die die Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 85% Identität zu einer der hierin für XIAP, HIAP-1, HIAP-2 bereitgestellten Sequenzen der BIR-Domäne aufweist.
  • Mit „Ring-Zinkfinger" oder „RZF" ist eine Domäne gemeint, die die Aminosäuresequenz mit der folgenden Konsensussequenz aufweist: Glu-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Lys-Xaa3-Cys-Met-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa3-Xaa1-Phe-Xaa1-Pro-Cys-Gly-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Cys-Ala-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Pro-Xaa1-Cys, wobei Xaa1 eine beliebige Aminosäure ist, Xaa2 Glu oder Asp ist und Xaa3 Val oder Ile ist (SEQ ID NO: 1).
  • Vorzugsweise ist die Sequenz mit den hierin für das humane oder murine XIAP, HIAP-1 oder HIAP-2 bereitgestellten RZF-Domänen im Wesentlichen identisch.
  • Mit „Modulieren von Apoptose" oder „Verändern von Apoptose" ist Erhöhen oder Verringern der Anzahl von Zellen, die andernfalls in einer gegebenen Zellpopulation Apoptose erfahren würden, gemeint. Vorzugsweise ist die Zellpopulation aus einer Gruppe ausgewählt, die T-Zellen, Nervenzellen, Fibroblasten oder eine beliebige andere Zelllinie, von der bekannt ist, dass sie in einer Laborsituation Apoptose erfahren würde (z. B. die mit Bakulovirus infizierten Insektenzellen), beinhaltet. Man wird zu schätzen wissen, dass das Ausmaß der Modulation, das von einem IAP oder einer modulierenden Verbindung bereitgestellt wird, in einem gegebenen Assay variieren wird, ein Fachmann kann jedoch die statistisch signifikante Veränderung des Apoptose-Niveaus ermitteln, die ein IAP oder eine Verbindung, die ein IAP moduliert, identifiziert.
  • Mit „Inhibieren von Apoptose" ist eine beliebige Verringerung der Anzahl von Zellen, die im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle Apoptose erfahren, gemeint. Vorzugsweise macht die Verringerung mindestens 25% aus, mehr bevorzugt macht die Verringerung 50% aus und am meisten bevorzugt ist die Verringerung mindestens einfach.
  • Mit „Polypeptid" ist eine beliebige Kette von mehr als zwei Aminosäuren gemeint, ungeachtet der posttranslationellen Modifizierung, wie Glykosylierung oder Phosphorylierung.
  • Mit „im Wesentlichen identisch" ist ein Polypeptid oder eine Nukleinsäure gemeint, die mindestens 50%, vorzugsweise 85%, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95% Homologie zu einer Referenzaminosäure- oder -nukleinsäuresequenz aufzeigt. Bei Polypeptiden wird die Länge von Vergleichssequenzen im Allgemeinen mindestens 16 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 20 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens 25 Aminosäuren und am meisten bevorzugt 35 Aminosäuren betragen. Bei Nukleinsäuren wird die Länge von Vergleichssequenzen im Allgemeinen mindestens 50 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 60 Nukleotide, mehr bevorzugt mindestens 75 Nukleotide und am meisten bevorzugt 110 Nukleotide betragen.
  • Sequenzidentität wird in der Regel unter Verwendung von Sequenzanalysensoftware mit den darin spezifizierten Standardparametern gemessen (z. B. Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, USA). Dieses Softwareprogramm gleicht ähnliche Sequenzen ab, indem es verschiedenen Substitutionen, Deletionen oder anderen Modifizierungen Homologiegrade zuordnet. Konservative Substitutionen beinhalten in der Regel Substitutionen in den folgenden Gruppen: Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin; Aspartinsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin.
  • Mit „im Wesentlichen reines Polypeptid" ist ein Polypeptid gemeint, das von den Bestandteilen getrennt worden ist, die mit diesem naturgemäß einhergehen. In der Regel ist das Polypeptid im Wesentlichen rein, wenn es zu mindestens 60 Gew.-% von den Proteinen und natürlich vorkommenden organischen Molekülen frei ist, mit denen es naturgemäß assoziiert ist. Vorzugsweise, handelt es sich bei dem Polypeptid um ein IAP-Polypeptid, das zu mindestens 75 Gew.-%, mehr bevorzugt mindestens 90 Gew.-% und am meisten bevorzugt mindestens 99 Gew.-% rein ist. Ein im Wesentlichen reines IAP-Polypeptid kann beispielsweise durch Extraktion aus einer natürlichen Quelle (z. B. einem Fibroblast, einer Nervenzelle oder einem Lymphozyt), durch Expression einer rekombinanten Nukleinsäure, die ein IAP-Polypeptid kodiert, oder durch chemisches Synthetisieren des Proteins gewonnen werden. Die Reinheit kann mittels eines beliebigen geeigneten Verfahrens gemessen werden, z. B. mittels Säulenchromatographie, Polyacrylamid-Gelelektrophorese oder HPLC-Analyse.
  • Ein Protein ist im Wesentlichen von naturgemäß assoziierten Bestandteilen frei, wenn es von diesen Kontaminanten getrennt ist, die mit diesem in seinem natürlichen Zustand einhergehen. Folglich wird ein Protein, das chemisch synthetisiert oder in einem Zellsystem; das sich von der Zelle unterscheidet, aus der es naturgemäß stammt, produziert wird, im wesentlichen von seinen naturgemäß assoziierten Bestandteilen frei sein. Dementsprechend beinhalten im Wesentlichen reine Polypeptide die von eukaryotischen Organismen abgeleiteten, aber in E. coli oder anderen Prokaryoten synthetisierten. Mit „im Wesentlichen reine DNA" ist DNA gemeint, die von den Genen frei ist, die im natürlich vorkommenden Genom des Organismus, aus dem die DNA der Erfindung abgeleitet ist, das Gen flankieren. Der Ausdruck beinhaltet daher beispielsweise eine rekombinante DNA, die in einen Vektor; in ein autonom replizierendes Plasmid oder einen autonom replizierenden Virus oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten eingebaut ist; oder die als ein separates Molekül existiert (z. B. eine cDNA oder eine genomische cDNA oder ein cDNA-Fragment, das mittels PCR oder Restriktionsendonukleaseverdau produziert wurde), unabhängig von anderen Sequenzen. Er beinhaltet auch eine rekombinante DNA, die Teil eines Hybridgens ist, das eine zusätzliche Polypeptidsequenz kodiert.
  • Mit „transformierte Zelle" ist eine Zelle gemeint, in die (oder in einen Vorfahr derer) mittels rekombinanter DNA-Techniken ein DNA-Molekül, das (wie hierin verwendet) ein IAP-Polypeptid kodiert, eingeführt worden ist.
  • Mit „Transgen" ist ein beliebiges Stück DNA gemeint, das durch einen Kunstgriff in eine Zelle insertiert wird und Teil des Genoms des Organismus wird, der sich aus dieser Zelle entwickelt. Ein derartiges Transgen kann ein Gen beinhalten, das zu dem transgenen Organismus teilweise oder vollständig heterolog ist (d. h. diesem fremd ist), oder kann ein Gen repräsentieren, das zu einem endogenen Gen des Organismus homolog ist.
  • Mit „transgen" ist eine beliebige Zelle gemeint, die eine DNA-Sequenz enthält, die durch einen Kunstgriff in eine Zelle insertiert wird und Teil des Genoms des Organismus wird, der sich aus dieser Zelle entwickelt. Wie hierin verwendet, sind transgene Organismen im Allgemeinen transgene Säuger (z. B. Nager, wie Ratten oder Mäuse) und die DNA (das Transgen) wird durch einen Kunstgriff in das Kerngenom insertiert.
  • Mit „Transformation" ist ein beliebiges Verfahren zum Einführen von Fremdmolekülen in eine Zelle gemeint. Lipofektion, Calciumphosphat-Präzipitation, retrovirale Abgabe, Elektroporation und biolistische Transformation sind nur ein paar der Lehren, die verwendet werden können. Bei biolistischer Transformation beispielsweise handelt es sich um ein Verfahren zum Einführen von Fremdmolekülen in eine Zelle unter Verwendung von mittels Geschwindigkeit angetriebenen Mikroprojektilen, wie Wolfram- oder Goldteilchen. Solche mittels Geschwindigkeit angetriebenen Verfahren rühren von Druckschüben her, die mittels Helium angetriebene, mittels Luft angetriebene und mittels Schwarzpulver angetriebene Techniken beinhalten, aber nicht darauf beschränkt sind. Biolistische Transformation kann auf die Transformation oder Transfektion einer großen Vielfalt von Zelltypen und intakten Geweben angewendet werden, einschließlich, ohne Einschränkung, intrazellulären Organellen (z. B. Mitochondrien und Chloroplasten), Bakterien, Hefe, Pilzen, Algen, tierischem Gewebe und kultivierten Zellen.
  • Mit „zur Expression angeordnet" ist gemeint, dass das DNA-Molekül neben einer DNA-Sequenz angeordnet ist, die die Transkription und Translation der Sequenz steuert (d. h. die Produktion z. B. eines IAP-Polypeptids, eines rekombinanten Proteins oder eines RNA-Moleküls erleichtert).
  • Mit „Reportergen" ist ein Gen gemeint, dessen Expression geprüft werden kann; solche Gene beinhalten, ohne Einschränkung, Glucuronidase (GUS), Luciferase, Chloramphenicoltransacetylase (CAT) und β-Galactosidase.
  • Mit „Promotor" ist die zur direkten Transkription ausreichende Mindestsequenz gemeint. Ebenfalls umfasst sind jene Promotorelemente, die dazu ausreichen, promotorabhängige Genexpression für zelltypenspezifische, gewebespezifische oder von externen Signalen oder Agenzien induzierbare steuerbar zu machen; solche Elemente können sich in den 5'- oder 3'-Regionen des nativen Gens befinden.
  • Mit „funktionsfähig verknüpft" ist gemeint, dass ein Gen und eine oder mehrere Regulationssequenzen derart verbunden werden, um eine Genexpression zuzulassen, wenn die entsprechenden Moleküle (z. B. transkriptionelle Aktivatorproteine) an die Regulationssequenzen gebunden werden.
  • Mit „konservierte Region" ist eine beliebige Länge aus sechs oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren gemeint, die mindestens 30%, vorzugsweise 50% und am meisten bevorzugt 70% Aminosäuresequenzidentität zwischen zwei oder mehreren der IAP-Familienmitglieder (z. B. zwischen humanem HIAP-1, HIAP-2 und XIAP) aufzeigt. Beispiele von konservierten Regionen sind in den 5–7 und den Tabellen 1 und 2 gezeigt (als von einem Kästchen umgebene oder gekennzeichnete Sequenzen) und umfassen BIR-Domänen und Ring-Zinkfinger-Domänen.
  • Mit „nachweisbar markiert" ist ein beliebiges Mittel zum Kennzeichnen und Identifizieren des Vorliegens eines Moleküls gemeint, z. B. eine Oligonukleotidsonde oder ein Oligonukleotidprimer, ein Gen oder Fragment davon oder ein cDNA-Molekül. Verfahren zum nachweisbaren Markieren eines Moleküls sind in der Technik wohl bekannt und beinhalten, ohne Einschränkung, radioaktive Markierung (z. B. mit einem Isotop, wie 32P oder 35S) und nichtradioaktive Markierung (z. B. chemilumineszente Markierung, z. B. Fluoreszein-Markierung).
  • Mit „Antisense", wie hierin in Bezug auf Nukleinsäuren verwendet, ist eine Nukleinsäuresequenz gemeint, ungeachtet der Länge, die zum kodierenden Strang eines Gens komplementär ist.
  • Mit „gereinigter Antikörper" ist ein Antikörper gemeint, der zu mindestens 60 Gew.-% frei von Proteinen und natürlich vorkommenden organischen Molekülen ist, mit denen er naturgemäß assoziiert ist. Vorzugsweise ist das Präparat zu mindestens 75 Gew.-%, mehr bevorzugt 90 Gew.-% und am meisten bevorzugt mindestens 99 Gew.-% Antikörper, z. B. ein IAP-spezifischer Antikörper. Ein gereinigter Antikörper kann beispielsweise durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von rekombinant produziertem Protein oder konservierten Motivpeptiden und Standardtechniken gewonnen werden.
  • Mit „bindet spezifisch" ist ein Antikörper gemeint, der ein Protein erkennt und bindet, der jedoch andere Moleküle in einer Probe, z. B. einer biologischen Probe, die naturgemäß Protein enthält, nicht im Wesentlichen erkennt und bindet.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist die humane XIAP-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 3) und die XIAP-Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 4).
  • 2 ist die humane HIAP-1-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 5) und die HIAP-1-Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 6).
  • 3 ist die humane HIAP-2-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 7) und die HIAP-2-Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 8). Die in der HIAP-2-Δ-Variante fehlende Sequenz ist von einem Kästchen umgeben.
  • 4 ist die murine XIAP-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 9) und die kodierte murine XIAP-Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 10).
  • 5 ist die murine HIAP-1-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 39) und die kodierte murine HIAP-1-Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 40).
  • 6 ist die murine HIAP-2-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 41) und die kodierte murine HIAP-2-Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 42).
  • 7 ist eine Darstellung der Ausrichtung der BIR-Domänen von IAP-Proteinen (SEQ ID NO: 11 und 14–31).
  • 8 ist eine Darstellung der Ausrichtung von humanen IAP-Polypeptiden- mit DIAP, Cp-IAP und der IAP-Konsensussequenz (SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 und 13).
  • 9 ist eine Darstellung der Ausrichtung der Ring-Zinkfinger-Domänen von IAP-Proteinen (SEQ ID NO: 32–38).
  • 10 ist eine fotografische Aufnahme eines Northern-Blot, der die Expression von humaner HIAP-1- und HIAP-2-mRNA in humanen Geweben veranschaulicht.
  • 11 ist eine fotografische Aufnahme eines Northern-Blot, der die Expression von humaner HIAP-2-mRNA in humanen Geweben veranschaulicht.
  • 12 ist eine fotografische Aufnahme eines Northern-Blot, der die Expression von humaner XIAP-mRNA in humanen Geweben veranschaulicht.
  • 13A und 13B sind fotografische Aufnahmen von Agarosegelen, die apoptotische DNA-Leitern und RT-PCR-Produkte unter Verwendung von HIAP-1- und HIAP-2-spezifischen Sonden in mit HIV infizierten T-Zellen veranschaulichen.
  • 14A–14D sind Graphen, die die Unterdrückung von Apoptose durch XIAP, HIAP-1, HIAP-2, Bcl-2, SMN und 6-myc bildlich veranschaulichen.
  • 15A–15B sind Balkengraphen, die den Prozentanteil von lebensfähigen CHO-Zellen nach transienter Transfektion mit den gezeigten cDNA-Konstrukten und anschließendem Serumentzug bildlich veranschaulichen.
  • 16A–16B sind Balkengraphen, die den Prozentanteil von lebensfähigen CHO-Zellen nach transienter Transfektion mit den gezeigten cDNA-Konstrukten und anschließendem Aussetzen gegenüber Menadion bildlich veranschaulichen (16A = 10 μM Menadion; 16B = 20 μM Menadion).
  • 17 ist eine fotografische Aufnahme eines Agarosegels, das cDNA-Fragmente, die mit HIAP-1-spezifischen Primern amplifiziert wurden, aus RNA enthält, die aus Raji-, Ramos-, EB-3- und Jiyoye-Zellen und aus normaler Plazenta gewonnen wurde.
  • 18 ist eine fotografische Aufnahme eines Western-Blot, der Protein enthält, das aus Jurkat- und Astrozytomzellen extrahiert wurde, die mit einem Anti-XIAP-Antikörper gefärbt wurden. Die Position und Größe einer Reihe von Markerproteinen sind angegeben.
  • 19 ist eine fotografische Aufnahme eines Western-Blot, der Protein enthält, das nach wie in Beispiel XII beschriebener Behandlung aus Jurkat-Zellen extrahiert wurde. Der Blot wurde mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-XIAP- Antikörper gefärbt. Spur 1: negative Kontrolle; Spur 2: Anti-Fas-Antikörper; Spur 3: Anti-Fas-Antikörper und Cycloheximid; Spur 4: TNF-α; Spur 5: TNF-α und Cycloheximid.
  • 20 ist eine fotografische Aufnahme eines Western-Blot, der Protein enthält, das nach Aussetzen gegenüber Anti-Fas-Antikörpern aus HeLa-Zellen extrahiert wurde. Der Blot wurde mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-XIAP-Antikörper gefärbt. Spur 1: negative Kontrolle; Spur 2: Cycloheximid; Spur 3: Anti-Fas-Antikörper; Spur 4: Anti-Fas-Antikörper und Cycloheximid; Spur 5: TNF-α; Spur 6: TNF-α und Cycloheximid.
  • 21A–21B sind fotografische Aufnahmen von Western-Blots, die mit polyklonalem Kaninchen-Anti-XIAP-Antikörper gefärbt wurden. Protein wurde aus HeLa-Zellen (21A) und Jurkat-Zellen (21B) sofort, 1, 2, 3, 5, 10 und 22 Stunden nach dem Aussetzen gegenüber Anti-Fas-Antikörper extrahiert.
  • 22A und 22B sind fotografische Aufnahmen von Western-Blots, die mit einem Anti-CPP32-Antikörper (22A) oder einem polyklonalen Kaninchen-Anti-XIAP-Antikörper (22B) gefärbt wurden. Protein wurde aus Jurkat-Zellen sofort, 3 Stunden oder 7 Stunden nach dem Aussetzen gegenüber einem Anti-Fas-Antikörper extrahiert. Neben dem Gesamtprotein sind zytoplasmatische und nukleäre Extrakte gezeigt.
  • 23 ist eine fotografische Aufnahme eines Polyacrylamidgels nach Elektrophorese der Produkte eines In-Vitro-XIAP-Spaltungsassays.
  • Ausführliche Beschreibung
  • I. IAP-Gene und Polypeptide
  • Es sind eine neue Klasse von Säugerproteinen, die Apoptose modulieren (IAPs), und die Gene, die diese Proteine kodieren, entdeckt worden. Die IAP-Proteine zeichnen sich durch das Vorliegen von mindestens einer BIR-Domäne mit mindestens 85% Sequenzidentität zu einer in Tabelle 2 aufgeführten BIR-Sequenzdomäne aus. Als Beispiele von neuartigen IAP-Genen und -Proteinen werden die cDNA-Sequenzen und Aminosäuresequenzen für humane IAPs (HIAP-1, HIAP-2 und XIAP) und ein neuer muriner Inhibitor von Apoptose, XIAP, bereitgestellt. Weitere Mitglieder der Familie von Säuger-IAPs (einschließlich Homologe von anderen Spezies und Mutantensequenzen) können unter Anwendung von Standardklonierungstechniken und der hierin bereitgestellten und in der Technik bekannten konservierten Aminosäuresequenzen, Primer und Sonden isoliert werden. IAPs umfassen jene Proteine, denen der Ring-Zinkfinger fehlt, wie im Folgenden weiter beschrieben. TABELLE 1 NUKLEOTIDPOSITION VON KONSERVIERTEN DOMÄNEN*
    Figure 00180001
    Figure 00190001
    • * Die angegebenen Positionen entsprechen den in den 1–4 gezeigten.
    TABELLE 2 AMINOSÄUREPOSITION VON KONSERVIERTEN DOMÄNEN*
    Figure 00190002
    • * Die angegebenen Positionen entsprechen den in den 1–4 gezeigten.
  • Das Erkennen der Familie von Säuger-IAPs hat ein sich entwickelndes Muster der Proteinstruktur bereitgestellt. Das Erkennen dieses Musters ermöglicht, Proteine mit einer bekannten, homologen Sequenz, aber einer unbekannten Funktion als mutmaßliche Inhibitoren von Apoptose zu klassifizieren. Auf diese Weise wurde ein Drosophila-Gen, nun als DIAP bezeichnet, klassifiziert (siehe Genbank-Zugangsnummer M96581 und 6 zwecks Sequenzinformationen). Die Konservierung dieser Proteine über Spezies hinweg zeigt, dass der Signalweg von Apoptose über die gesamte Evolution hinweg konserviert worden ist.
  • Die IAP-Proteine können zum Inhibieren der Apoptose verwendet werden, die als Teil von zahlreichen Krankheitsverläufen oder Störungen auftritt. IAP-Polypeptide oder Nukleinsäure, die IAP-Polypeptide kodiert, beispielsweise können zur Behandlung oder Prävention von Apoptose verabreicht werden, die als Teil von AIDS, neurodegenerativen Erkrankungen, ischämischer Verletzung, durch Giftstoffe induzierter Lebererkrankung und myelodysplastischem Syndrom auftritt. Nukleinsäure, die das IAP-Polypeptid kodiert, kann ebenfalls zum Inhibieren von Apoptose vorgesehen werden.
  • II. Klonieren von IAP-Genen
  • A. XIAP
  • Die Suche nach humanen Genen, die an Apoptose beteiligt sind, resultierte in der Identifizierung einer X-gekoppelten Sequence Tagged Site (STS) in der GenBank-Datenbank, die starke Homologie zu der konservierten RZF-Domäne von Cp-IAP und Op-IAP aufzeigte, den zwei Bakulovirusgenen, von denen bekannt ist, dass sie Apoptose inhibieren (Clem et al., Mol. Cell Biol. 14: 5212–5222, 1994; Birnbaum et al., J. Virol. 68: 2521–2528, 1994). Das Screenen einer humanen fötalen Gehirn-ZapII-cDNA-Bibliothek (Stratagene, LaJolla, CA, USA) mit dieser STS resultierte in der Identifizierung und Klonierung von XIAP (steht für X-gekoppeltes IAP-Gen (IAP = Inhibitor von Apoptoseproteinen)). Das humane Gen weist eine 1,5 kb lange kodierende Sequenz auf, die drei BIR-Domänen (Crook et al., J. Virol. 67: 2168–2174, 1993; Clem et al., Science 254: 1388–1390, 1991; Birnbaum et al., J. Virol., 68: 2521–2528, 1994) und einen Zinkfinger enthält. Eine Northern-Blot-Analyse mit XIAP offenbarte eine Message, die größer als 7 kb war und in verschiedenen Geweben exprimiert wird, insbesondere Leber und Niere (12). Die beträchtliche Größe des Transkripts spiegelt große untranslatierte 5'- und 3'-Regionen wider.
  • B. Humanes HIAP-1 und HIAP-2
  • Die HIAP-1- und HIAP-2-Gene wurden mittels Screenen einer humanen Leber-Bibliothek (Stratagene Inc., LaJolla, CA, USA) mit einer Sonde, die die gesamte XIAP-kodierende Region enthielt, mit geringer Stringenz kloniert (der letzte Waschvorgang wurde bei 40°C mit 2 × SSC, 10% SDS durchgeführt; 2 und 3). Die HIAP-1- und HIAP-2-Gene wurden außerdem unabhängig voneinander mit einer Sonde nachgewiesen, die von einem exprimierten Sequenz-Tag (EST; GenBank-Zugangsnr. T96284) abgeleitet wurde, der einen Teil einer BIR-Domäne enthielt. Die EST-Sequenz wurde ursprünglich mittels der Polymerase-Kettenreaktion isoliert; eine cDNA-Bibliothek wurde als eine Matrize verwendet und mit EST-spezifischen Primern amplifiziert. Die von DNA abgeleitete Sonde wurde dann zum Screenen der humanen Leber-cDNA-Bibliothek auf vollständige HIAP-kodierende Sequenzen verwendet. Es wurde anschließend eine dritte DNA nachgewiesen, die die HIAP-2-Sequenz enthielt, bei der es jedoch den Anschein hat, dass ihr ein Exon fehlt, wahrscheinlich aufgrund alternativen mRNA-Spleißens (siehe die von Kästchen umgebene Region in 3). Die wie mittels Northern-Blot-Analyse untersuchte Expression von HIAP-1 und HIAP-2 in humanen Geweben ist in den 8 und 9 gezeigt.
  • C. mXIAP
  • Vierzehn cDNA- und zwei genomische Klone wurden mittels Screenen einer Mausembryo-λgt11-cDNA-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA, USA) bzw. einer genomischen Maus-FIX-II-Bibliothek mit einer XIAP-cDNA-Sonde identifiziert. Ein cDNA-Contig, das 8,0 kb umspannte, wurde unter Verwendung von 12 überlappenden Mausklonen konstruiert. Die Sequenzanalyse offenbarte eine kodierende Sequenz von ungefähr 1,5 kb. Das Mausgen, mXIAP, kodiert ein Polypeptid mit beachtlicher Homologie zu humanem XIAP am und rund um das Initiations-Methionin, das Stoppcodon, die drei BIR-Domänen und die RZF-Domäne. Wie beim humanen Gen enthält das Maus-Homologon große 5'- und 3'-UTRs, was ein bis zu 7–8 kb großes Transkript produzieren könnte.
  • Eine Analyse der Sequenz- und Restriktionskarte von mXIAP grenzt die Struktur und den genomischen Aufbau von mXIAP weiter ab. Southern-Blot-Analyse und inverse PCR-Techniken (Groden et al., Cell 66: 589–600, 1991) können zum Kartieren von Exons und Definieren von Exon/Intron-Grenzen eingesetzt werden.
  • Es können Antiseren gegen ein mXIAP-Fusionsprotein erzeugt werden, das unter Verwendung eines bakteriellen Expressionssystems aus beispielsweise E. coli gewonnen wurde. Die resultierenden Antiseren können zusammen mit Northern-Blot- Analyse verwendet- werden, um die räumliche und zeitliche Expression von mXIAP in der Maus zu analysieren.
  • D. mHIAP-1 und mHIAP-2
  • Die murinen Homologe von HIAP-1 und HIAP-2 wurden auf dieselbe Art und Weise wie mXIAP unter Verwendung der humanen HIAP-1- und HIAP-2-Sequenzen als Sonden kloniert und sequenziert. Das Klonieren von mHIAP-1 und mHIAP-2 beweist weiter, dass Homologe von unterschiedlichen Spezies unter Anwendung der hierin bereitgestellten und den in der molekularen Biologie bewanderten Fachmännern im Allgemeinen bekannten Techniken isoliert werden können.
  • III. Identifizierung weiterer IAP-Gene
  • Standardtechniken, wie die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) und DNA-Hybridisierung, können zum Klonieren weiterer humaner IAP-Gene und ihrer Homologe in anderen Spezies verwendet werden. Southern-Blots von humaner genomischer DNA, die mit geringer Stringenz mit für XIAP, HIAP-1 und HIAP-2 spezifischen Sonden hybridisiert wurde, offenbaren Banden, die anderen bekannten humanen IAP-Sequenzen entsprechen, und Banden, die nicht bekannten IAP-Sequenzen entsprechen. Folglich können weitere IAP-Sequenzen unter Verwendung von Hybridisierung mit geringer Stringenz einfach identifiziert werden. Beispiele von murinen und humanen XIAP-, HIAP-1- und HIAP-2-spezifischen Primern, die zum Klonieren weiterer Gene mittels RT-PCR verwendet werden können, sind in Tabelle 5 gezeigt.
  • IV. Charakterisierung der IAP-Aktivität und Studien der intrazellulären Lokalisierung
  • Die Fähigkeit von putativen IAPs, Apoptose zu modulieren, kann in In-vitro-Systemen definiert werden, in denen Veränderungen der Apoptose nachgewiesen werden können. Expressionskonstrukte eines Säugers, die IAP-cDNAs tragen, die entweder vollständig oder verkürzt sind, können in Zelllinien, wie CHO-, NIH 3T3-, HL60-, Rat-1- oder Jurkat-Zellen, eingeführt werden. Darüber hinaus können SF21-Insektenzellen verwendet werden, wobei in diesem Fall das IAP-Gen vorzugsweise mit einem Hitzeschockpromotor eines Insekts exprimiert wird. Nach der Transfektion kann die Apoptose mit Standardverfahren induziert werden, die Serumentzug oder die Anwendung von Staurosporin, Menadion (das Apoptose durch die Bildung von freien Radikalen induziert) oder Anti-Fas-Antikörpern umfassen. Als eine Kontrolle werden Zellen unter denselben Bedingungen wie die zum Erfahren von Apoptose induzierten kultiviert, aber entweder nicht transfiziert oder mit einem Vektor transfiziert, dem ein IAP-Insert fehlt. Die Fähigkeit jedes IAP-Konstrukts, Apoptose bei Expression zu inhibieren, kann durch Berechnen des Überlebensindex der Zellen, d. h. des Verhältnisses von überlebenden transfizierten Zellen zu überlebenden Kontrollzellen, quantifiziert werden. Diese Versuche können das Vorliegen von apoptoseinhibierender Aktivität bestätigen und können, wie unten erörtert, gleichfalls zum Bestimmen der funktionellen Region bzw. Regionen eines IAP verwendet werden. Diese Assays können auch in Kombination mit der Anwendung von zusätzlichen Verbindungen durchgeführt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die Apoptose durch IAP-Expression modulieren.
  • A. Zellüberleben nach Transfektion mit vollständigen IAP-Konstrukten und Induktion von Apoptose
  • Spezifische Beispiele der durch Ausführen verschiedener Apoptoseunterdrückungsassays erhaltenen Ergebnisse sind in den 14A bis 14D gezeigt. Das Überleben von CHO-Zellen nach Transfektion mit einem von sechs Konstrukten und anschließendem Serumentzug beispielsweise ist in 14A gezeigt. Die Zellen wurden unter Verwendung von LipofectaceTM mit 2 μg eines der folgenden rekombinanten Plasmide transfiziert: pcDNA3-6-myc-XIAP (xiap), pcDNA3-6-myc-HIAP-1 (hiap-1), pcDNA3-6-myc-HIAP-2 (hiap-2), pcDNA3-Bcl-2 (bcl-2), pcDNA3-HA-SMN (smn) und pcDNA3-6-myc (6-myc). Es wurden Oligonukleotid-Primer synthetisiert, um PCR-Amplifikation und Klonierung der XIAP-, HIAP-1- und HIAP-2-ORFs in pcDNA3 (Invitrogen) zu ermöglichen. Jedes Konstrukt wurde modifiziert, um ein synthetisches myc-Tag einzubauen, das sechs Wiederholungen der Peptidsequenz MEQKLISEEDL (SEQ ID NO: 43) kodiert, wodurch der Nachweis von myc-IAP-Fusionsproteinen mittels monoklonalem Anti-myc-Antiserum ermöglicht wird (Egan et al., Nature 363: 45–51, 1993). Proben von Zelllinien in dreifacher Ausfertigung in 24-Well-Schalen wurden 5 Mal mit serumfreiem Medium gewaschen und im Verlauf des Versuchs unter serumfreien Bedingungen gehalten. Zellen, die Trypanblau ausschlossen und somit lebensfähig waren, wurden mit einem Hämozytometer sofort, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Serumentzug gezählt. Das Überleben wurde als ein Prozentanteil der anfänglichen Anzahl von lebensfähigen Zellen berechnet. In diesem Versuch und den in den 14B und 14D dargestellten stellt der gezeigte Prozentanteil der lebensfähigen Zellen den Durchschnitt von drei separaten Versuchen, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden, +/– der durchschnittlichen Abweichung dar.
  • Das Überleben von CHO-Zellen nach Transfektion (mit jeweils einem der oben beschriebenen sechs Konstrukte) und Aussetzen gegenüber Menadion ist in 14B gezeigt. Die Zellen wurden in 24-Well-Schalen plattiert, über Nacht wachsengelassen und dann 1,5 Stunden lang 20 μM Menadion (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) ausgesetzt. Proben in dreifacher Ausfertigung wurden zum Zeitpunkt des Aussetzens gegenüber Menadion und 24 Stunden danach geerntet und das Überleben wurde mittels Trypanblauausschluss bewertet.
  • Das Überleben von Rat-1-Zellen nach Transfektion (mit jeweils einem der oben beschriebenen sechs Konstrukte) und Aussetzen gegenüber Staurosporin ist in 14C gezeigt. Rat-1-Zellen wurden transfiziert und dann zwei Wochen lang in Medium selektioniert, das 800 μg/ml G418 enthielt. Die Zelllinie wurde auf Resistenz gegenüber mittels Staurosporin induzierter Apoptose (1 μM) für 5 Stunden bewertet. Lebensfähige Zellen wurden 24 Stunden nach dem Aussetzen gegenüber Staurosporin mittels Trypanblauausschluss gezählt. Der gezeigte Prozentanteil der lebensfähigen Zellen stellt den Durchschnitt von zwei Versuchen +/– der durchschnittlichen Abweichung dar.
  • Die Rat-1-Zelllinie wurde ebenfalls zum Prüfen der Resistenz dieser Zellen gegenüber Menadion (14D) nach Transfektion mit jedem der oben beschriebenen sechs Konstrukte verwendet. Die Zellen wurden 1,5 Stunden lang 10 μM Menadion ausgesetzt und die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde 18 Stunden später gezählt.
  • B. Vergleich des Zellüberlebens nach Transfektion mit vollständigen IAP-Konstrukten gegenüber partiellen IAP-Konstrukten
  • Um den Mechanismus zu untersuchen, über den humane IAPs, einschließlich XIAP, HIAP-1 und HIAP-2, Schutz gegen Zelltod bieten, wurden Expressionsvektoren konstruiert, die entweder (1) vollständige IAP-cDNA (wie oben beschrieben), (2) einen Teil eines IAP-Gens, der die BIR-Domänen, jedoch nicht den RZF kodiert, oder (3) einen Teil eines IAP-Gens, der den RZF, jedoch nicht die BIR-Domänen kodiert, enthielt. Humane und murine XIAP- oder mXIAP-cDNAs wurden durch transiente oder stabile Expression in HeLa-, Jurkat- und CHO-Zelllinien geprüft. Nach der Transfektion wurde Apoptose durch Serumentzug, Anwendung von Menadion oder Anwendung eines Anti-Fas-Antikörpers induziert. Dann wurde der Zelltod wie oben beschrieben durch Trypanblauausschluss bewertet. Als eine Kontrolle auf Transfektionseffizienz wurden die Zellen mit einem β-gaI-Expressionskonstrukt kontransfiziert. In der Regel wurden ungefähr 20% der Zellen erfolgreich transfiziert.
  • Wenn CHO-Zellen transient transfiziert wurden, verliehen Konstrukte, die vollständige XIAP- oder mXIAP-cDNAs enthielten, geringen Schutz gegen Zelltod (15A). Im Gegensatz dazu war das Überleben von CHO-Zellen, die mit Konstrukten transfiziert worden waren, die nur die BIR-Domänen kodieren (d. h. denen die RZF-Domäne fehlte; siehe 15A), 72 Stunden nach Serumdeprivation merklich gesteigert. Darüber hinaus war ein großer Prozentanteil der Zellen, die die BIR-Domänen exprimieren, nach 96 Stunden noch immer lebensfähig, wobei zu diesem Zeitpunkt keine lebensfähigen Zellen in den Kontrollzellkulturen, d. h. nicht transfizierten Zellkulturen, verblieben (siehe „CHO" in 15A) und weniger als 5% der Zellen, die nur mit dem Vektor transfiziert worden waren, d. h. denen ein cDNA-Insert fehlte, lebensfähig blieben (siehe „pcDNA3" in 15A). Die Deletion einer beliebigen der BIR-Domänen resultierte in der vollständigen Einbuße der Unterdrückung von Apoptose, was von einer Verringerung des Prozentanteils der überlebenden CHO-Zellen gegenüber Kontrollniveaus innerhalb von 72 Stunden nach Serumentzug widergespiegelt wird (15B; siehe „xiapΔ1" (das die Aminosäuren 89–497 von XIAP (SEQ ID NO: 4) kodiert), „xiapΔ2" (das die Aminosäuren 246–497 von XIAP (SEQ ID NO: 4) kodiert) und „xiapΔ3" (das die Aminosäuren 342–497 von XIAP (SEQ ID NO: 4) kodiert) zu 72 Stunden).
  • Stabile Pools von transfizierten CHO-Zellen, die mehrere Monate unter G418-Selektion. gehalten wurden, wurden mittels Aussetzen gegenüber 10 μM Menadion für 2 Stunden zum Erfahren von Apoptose induziert. Zu den geprüften CHO-Zellen zählen jene, die mit dem Folgenden stabil transfiziert wurden: (1) vollständige mXIAP-cDNA (miap), (2) vollständige XIAP-cDNA (xiap), (3) vollständige Bcl-2-cDNA (Bcl-2), (4) cDNA, die die drei BIR-Domänen (jedoch nicht den RZF) von mXIAP kodierte (BIR), und (4) cDNA, die den RZF (jedoch nicht BIR-Domänen) von mXIAP kodierte (RZF). Zellen, die nicht transfiziert waren (CHO) oder nur mit dem Vektor transfiziert waren (pcDNA3), dienten bei diesem Versuch als Kontrollen. Nach dem Aussetzen gegenüber 10 μM Menadion wurden die transfizierten Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (phosphate-buffered saline, PBS) gewaschen und weitere 24 Stunden lang in menadionfreiem Medium kultiviert. Der Zelltod wurde wie oben beschrieben durch Trypanblauausschluss bewertet. Weniger als 10% der nicht transfizierten oder nur mit Vektor transfizierten Zellen blieben zum Ende des 24 Stunden währenden Überlebenszeitraums lebensfähig. Zellen, die den RZF exprimierten, schnitten nicht wesentlich besser ab. Die Expression von vollständigem mXIAP, XIAP oder Bcl-2 und die Expression der BIR-Domänen steigerte jedoch das Zellüberleben (16A). Wenn die Konzentration von Menadion von 10 μM auf 20 μM erhöht wurde (wobei alle anderen Bedingungen des Versuchs mit denen bei Anwendung von 10 μM Menadion identisch waren), war der Prozentanteil lebensfähiger CHO-Zellen, die das BIR-Domänen-cDNA-Konstrukt exprimierten, höher als der Prozentanteil lebensfähiger Zellen, die entweder vollständiges mXIAP oder Bcl-2 exprimierten (16B).
  • C. Analyse der subzellulären Lokation von exprimierten RZF- und BIR-Domänen
  • Die oben beschriebenen Zelltodassays deuten an, dass der RZF als ein negativer Regulator der antiapoptotischen Funktion von IAPs agieren kann. Eine Weise, auf die der RZF und möglicherweise andere IAP-Domänen ihren Regulationseinfluss ausüben könnten, ist durch Modifizieren der Expression von Genen, deren Produkte in dem apoptotischen Weg wirken.
  • Um zu bestimmen, ob die subzellulären Lokationen von exprimierten RZF- und BIR-Domänen mit Rollen als nukleären Regulationsfaktoren im Einklang stehen, wurden COS-Zellen mit den folgenden vier Konstrukten transient transfiziert und das exprimierte Polypeptid wurde mittels Immunofluoreszenzmikroskopie lokalisiert: (1) pcDNA3-6-myc-XIAP, das alle 497 Aminosäuren von SEQ ID NO: 4 kodiert, (2) pcDNA3-6-myc-mXIAP, das alle 497 Aminosäuren von Maus-XIAP (SEQ ID NO: 10) kodiert, (3) pcDNA3-6-myc-mXIAP-BIR, das die Aminosäuren 1 bis 341 von mXIAP (SEQ ID NO: 10) kodiert, und (4) pcDNA3-6-myc-mXIAP-RZF, das die Aminosäuren 342–497 von mXIAP (SEQ ID NO: 10) kodiert. Die Zellen wurden 12 Stunden lang auf Multiwell-Gewebekultur-Objektträgern gewachsen und dann fixiert und mit Methanol permeabilisiert. Die (hier und in den Zelltodassays) verwendeten Konstrukte wurden am N-Terminus mit einem humanen myc-Epitop-Tag markiert. Folglich könnten ein monoklonaler Anti-myc-Antikörper und ein sekundärer Ziege-Anti-Maus-Antikörper, der mit FITC konjugiert wurde, zum Lokalisieren der exprimierten Produkte in transient transfizierten COS-Zellen verwendet werden. Vollständiges XIAP und mXIAP wurden im Zytoplasma lokalisiert, mit hervorgehobener Expression in der perinukleären Zone. Das gleiche Lokalisierungsmuster wurde beobachtet, wenn die Zellen ein Konstrukt exprimierten, das die RZF-Domäne (jedoch nicht die BIR-Domänen) kodierte. Zellen, die die BIR-Domänen (ohne den RZF) exprimierten, zeigten jedoch vor allem eine Färbung des Zellkerns auf. Das von dem BIR-Domänen-Konstrukt exprimierte Protein schien sich in verschiedenen Stadien der Übertragung an den Zellkern zu befinden.
  • Diese Beobachtungen waren mit der Tatsache konsistent, dass XIAP, wie im Folgenden. beschrieben, in T-Zellen gespalten wird, die mit Anti-Fas-Antikörpern (bei denen es sich um potente Induktoren von Apoptose handelt) behandelt werden, und seine N-terminale Domäne zum Zellkern translokalisiert wird.
  • D. Beispiele weiterer Apoptoseassays
  • Spezifische Beispiele von Apoptoseassays werden ebenfalls in den folgenden Referenzen bereitgestellt. Assays für Apoptose in Lymphozyten werden offenbart von: Li et al., „Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein", Science 268: 429–431, 1995; Gibellini et al., „Tat-expressing Jurkat cells show an increased resistance to different apoptotic stimuli, including acute human immunodeficiency virus-type 1 (HIV-1) infection", Br. J. Haematol. 89: 24–33, 1995; Martin et al., „HIV-1 infection of human CD4+ T cells in vitro. Differential induction of apoptosis in these cells.", J. Immunol. 152: 330–342, 1994; Terai et al., „Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T lymphoblasts acutely infected with HIV-1", J. Clin. Invest. 87: 1710–1715, 1991; Dhein et al., „Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1/(Fas/CD95)11", Nature 373: 438–441, 1995; Katsikis et al., „Fas antigen stimulation induces marked apoptosis of T lymphocytes in human immunodeficiency virusinfected individuals", J. Exp. Med. 1815: 2029–2036, 1995; Westendorp et al., „Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gpl2O", Nature 375: 497, 1995; DeRossi et al., Virology 198: 234–244, 1994.
  • Assays für Apoptose in Fibroblasten werden offenbart von: Vossbeck et al., „Direct transforming activity of TGF-beta on rat fibroblasts", Int. J. Cancer 61: 92–97, 1995; Goruppi et al., „Dissection of c-myc domains involved in S phase induction of NIH3T3 fibroblasts", Oncogene 9: 1537–1544, 1994; Fernandez et al., „Differential sensitivity of normal and Haras transformed C3H mouse embryo fibroblasts to tumor necrosis factor: induction of bcl-2, c-myc, and manganese superoxide dismutase in resistant cells", Oncogene 9: 2009–2017, 1994; Harrington et al., „c-Myc induced apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines", EMBO J., 13: 3286–3295, 1994; Itoh et al., „A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen", J. Biol. Chem. 268: 10932–10937, 1993.
  • Assays für Apoptose in Nervenzellen werden offenbart von: Melino et al., „Tissue transglutaminase and apoptosis: sense and antisense transfection studies with human neuroblastoma cells", Mol. Cell Biol. 14: 6584–6596, 1994; Rosenbaum et al., „Evidence for hypoxia-induced, programmed cell death of cultured neurons", Ann. Neurol. 36: 864–870, 1994; Sato et al., „Neuronal differentiation of PC12 cells as a result of prevention of cell death by bcl-2", J. Neurobiol. 25: 1227–1234, 1994; Ferrari et al., „N-acetylcysteine D- and L- stereoisomers prevents apoptotic death of neuronal cells", J. Neurosci. 1516: 2857–2866, 1995; Talley et al., „Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Apoptosis in Human Neuronal Cells: Protection by the Antioxidant N-Acetylcysteine and the Genes bcl-2 and crma", Mol. Cell. Biol. 15: 2359–2366, 1995; Walkinshaw et al., „Induction of apoptosis in catecholaminergic PC12 cells by L-DOPA. Implications for the treatment of Parkinson's disease", J. Clin. Invest. 95: 2458–2464, 1995.
  • Assays für Apoptose in Insektenzellen werden offenbart von: Clem et al., „Prevention of apoptosis by a baculovirus gene during infection of insect cells", Science 254: 1388–1390, 1991; Crook et al., „An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif", J. Virol. 67: 2168–2174, 1993; Rabizadeh et al., „Expression of the baculovirus p35 gene inhibits mammalian neural cell death", J. Neurochem. 61: 2318–2321, 1993; Birnbaum et al., „An apoptosis inhibiting gene from a nuclear polyhedrosis virus encoding a polypeptide with Cys/His sequence motifs", J. Virol. 68: 2521–2528, 1994; Clem et al., "Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and IAP", Mol. Cell. Biol. 14: 5212–5222, 1994.
  • V. Konstruktion eines transgenen Tiers
  • Die Charakterisierung von IAP-Genen liefert Informationen, die für ein IAP-Knock-out-Tiermodell, das mittels homologer Rekombination entwickelt werden soll, erforderlich sind. Das Modell kann ein Säugetier sein, insbesondere eine Maus. Analog dazu kann ein Tiermodell von IAP-Überproduktion durch Integrieren einer oder mehrerer IAP-Sequenzen in das Genom gemäß transgener Standardtechniken erstellt werden.
  • Ein Ersatztyp-Targetingvektor, der zum Erstellen eines Knock-out-Modells verwendet werden würde, kann unter Verwendung eines isogenen genomischen Klons, beispielsweise von einem Mausstamm, wie 129/Sv (Stratagene Inc., LaJolla, CA, USA), konstruiert werden. Der Targetingvektor wird mittels Elektroporation in eine entsprechend abgeleitete Linie von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) eingeführt, um ES-Zelllinien zu erzeugen, die eine hochgradig verkürzte Form eines IAP tragen. Um chimäre Foundermäuse zu erzeugen, werden die Target-Zelllinien in einen Mausembryo im Blastulastadium injiziert. Heterozygote Nachkommen werden zur Homozygosität gekreuzt. Knock-out-Mäuse würden in vivo die Mittel bereitstellen, um auf therapeutische Verbindungen zu screenen, die Apoptose über einen von IAP abhängigen Stoffwechselweg modulieren.
  • VI. IAP-Proteinexpression
  • IAP-Gene können in sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen Zelltypen exprimiert werden. Wenn ein IAP Apoptose moduliert, indem es diese exazerbiert, kann es wünschenswert sein, dieses Protein unter Steuerung eines induzierbaren Promotors zu exprimieren.
  • Im Allgemeinen können erfindungsgemäße IAPs produziert werden, indem eine geeignete Wirtszelle mit dem gesamten oder einem Teil eines IAP-kodierenden cDNA-Fragments transformiert wird, das in einem geeigneten Expressionsvektor angeordnet wurde.
  • Fachmänner der Molekularbiologie werden verstehen, dass eine große Vielfalt von Expressionssystemen zum Produzieren des rekombinanten Proteins verwendet werden kann. Die exakte verwendete Wirtszelle ist für die Erfindung nicht kritisch. Das IAP-Protein kann in einem prokaryotischen Wirt (z. B. E. coli) oder in einem eukaryotischen Wirt (z. B. S. cerevisiae, Insektenzellen, wie Sf21-Zellen, oder Säugerzellen, wie COS-1-, NIH 3T3- oder HeLa-Zellen) produziert werden. Diese Zellen sind öffentlich zugänglich, beispielsweise von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA; siehe auch Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, USA, 1994. Das Transduktionsverfahren und die Wahl des Expressionsvehikels werden vom gewählten Wirtssystem abhängen. Transformations- und Transfektionsverfahren werden z. B. in Ausubel et al. (oben) beschrieben und Expressionsvehikel können aus den bereitgestellten, z. B. in Cloning Vectors: A Laboratory Manual (P. H. Pouwels et al., 1985, Anh. 1987), ausgewählt werden.
  • Ein bevorzugtes Expressionssystem ist das Bakulovirussystem, unter Verwendung beispielsweise des Vektors pBacPAK9, der von Clontech (Palo Alto, CA, USA) erhältlich ist. Falls gewünscht kann dieses System in Verbindung mit anderen Proteinexpressionstechniken verwendet werden, beispielsweise dem myc-Tag-Ansatz, der von Evan et al. (Mol. Cell Biol. 5: 3610–3616, 1985) beschrieben wird.
  • Alternativ dazu kann ein IAP mittels einer stabil transfi zierten Säugerzelllinie produziert werden. Eine Reihe von Vektoren, die zur stabilen Transfektion von Säugerzellen geeignet sind, sind der Öffentlichkeit zugänglich, z. B. siehe Pouwels et al. (oben), als auch Verfahren zur Konstruktion solcher Zelllinien zugänglich sind (siehe z. B. Ausubel et al. (oben)). In einem Beispiel wird cDNA, die ein IAP kodiert, in einen Expressionsvektor kloniert, der das DHFR-Gen (DHFR = Dihydrofolatreduktase) enthält. Die Integration des Plasmids und somit die Integration des IAP-kodierenden Gens in das Wirtszellenchromosom wird mittels Einbinden von 0,01–300 μM Methotrexat in das Zellkulturmedium selektioniert (wie beschrieben, Ausubel et al., oben). Diese dominante Selektion kann in den meisten Zelltypen erzielt werden. Die rekombinante Proteinexpression kann mittels DHFR-vermittelter Amplifikation des transfizierten Gens gesteigert werden.
  • Verfahren zum Selektionieren von Zelllinien, die Genamplifikationen tragen, werden in Ausubel et al. (oben) beschrieben. Diese Verfahren umfassen im Allgemeinen eine ausgedehnte Kultivierung in Medium, das allmählich ansteigende Methotrexat-Konzentrationen enthält. Die am häufigsten verwendeten DHFR-enthaltenden Expressionsvektoren sind pCVSEII-DHFR und pAdD26SV(A) (beschrieben in Ausubel et al., oben). Die oben beschriebenen Wirtszellen oder vorzugsweise eine DHFR-defiziente CHO-Zelllinie (z. B. CHO-DHFR-Zellen, ATCC-Zugangsnummer CRL 9096) zählen zu den für die DHFR-Selektion einer stabil transfizierten Zelllinie oder DHFR-vermittelten Genamplifikation am meisten bevorzugten.
  • Sobald das rekombinante Protein exprimiert ist, wird es mittels beispielsweise Affinitätschromatographie isoliert. In einem Beispiel kann ein Anti-IAP-Antikörper, der mit den hierin beschriebenen Verfahren produziert werden kann, an eine Säule angefügt werden und zum Isolieren des IAP-Proteins verwendet werden. Vor der Affinitätschromatographie kann mittels Standardverfahren eine Lyse und Fraktionierung von IAP-beherbergenden Zellen durchgeführt werden (siehe z. B. Ausubel et al., oben). Nach dem Isolieren kann das rekombinante Protein, falls gewünscht, mittels z. B. Hochdruckflüssigchromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC; z. B. siehe Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work und Burdon, Hrsg., Elsevier, 1980) weiter gereinigt werden.
  • Polypeptide der Erfindung, insbesondere kurze IAP-Fragmente, können ebenfalls mittels chemischer Synthese produziert werden (z. B. mittels der Verfahren, die in Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausg., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA, beschrieben werden). Diese allgemeinen Techniken der Polypeptidexpression und -reinigung können auch zum Produzieren und Isolieren geeigneter IAP-Fragmente oder -Analoga verwendet werden, wie hierin beschrieben.
  • VII. Anti-IAP-Antikörper
  • Zum Erzeugen IAP-spezifischer Antikörper kann eine IAP-kodierende Sequenz (d. h. die Aminosäuren 180–276) als eine C-terminale Fusion mit Glutathion-S-Transferase (GST; Smith et al., Gene 67: 31–40, 1988) exprimiert werden. Das Fusions protein kann auf Glutathion-Sepharose-Kügelchen gereinigt, mit Glutathion eluiert und mit Thrombin (an der konstruierten Spaltungsstelle) gespalten und bis zum für das erfolgreiche Immunisieren von Kaninchen erforderlichen Grad gereinigt werden. Primäre Immunisierungen können mit dem Freundschen kompletten Adjuvans ausgeführt und anschließende Immunisierungen mit dem Freundschen inkompletten Adjuvans durchgeführt werden. Die Antikörpertiter werden mittels Western-Blot- und Immunpräzipitationsanalysen unter Verwendung des mit Thrombin gespaltenen IAP-Fragments des GST-IAP-Fusionsproteins überwacht. Immunsera wurden mit CNBr-Sepharose-gekoppeltem IAP-Protein affinitätsgereinigt. Die Antiserumspezifität wurde unter Anwendung einer Testreihe nicht verwandter GST-Proteine (einschließlich GSTp53, Rb, HPV-16 E6 und E6-AP) und GST-Trypsin (das mittels PCR unter Verwendung von bekannten Sequenzen erzeugt wurde) ermittelt.
  • Als ein alternierendes oder beigefügtes Immunogen zu GST-Fusionsproteinen können Peptide, die relativ eindeutigen hydrophilen Regionen von IAP entsprechen, erzeugt und mit Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke (keyhole limpet hemocyanin, KLH) mittels eines eingeführten C-terminalen Lysinsgekoppelt werden. Antiserum zu jedem dieser Peptide wird auf ähnliche Weise auf Peptiden, die mit BSA konjugiert wurden, affinitätsgereinigt und die Spezifität wird mittels ELISA und Western-Blotting unter Verwendung von Peptidkonjugaten und mittels Western-Blotting und Immunpräzipitation unter Verwendung von IAP, das als ein GST-Fusionsprotein exprimiert wurde, geprüft.
  • Alternativ dazu können monoklonale Antikörper unter Verwendung der oben beschriebenen IAP-Proteine und Standard-Hybridomtechnologie hergestellt werden (siehe z. B. Kohler et al., Nature 256: 495, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292, 1976; Hammerling et al., in Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, New York, NY, USA, 1981; Ausubel et al., oben). Nach der Produktion werden die monoklonalen Antikörper ebenfalls auf spezifische IAP-Erkennung mittels Western-Blot- oder Immunpräzipitationsanalyse geprüft (mit den in Ausubel et al., oben, beschriebenen Verfahren).
  • Antikörper, die Polypeptide der Erfindung spezifisch erkennen, können beispielsweise in einem Immunoassay zum Überwachen der IAP-Expressionsniveaus oder zum Bestimmen der subzellulären Lokation eines IAP oder IAP-Fragments, das von einem Säuger produziert wurde, verwendet werden. Antikörper, das hierin beschriebene 26-kDa-IAP-Spaltungsprodukt (das mindestens eine BIR-Domäne enthält) inhibieren, können beim Induzieren von Apoptose in Zellen, die eine unerwünschte Proliferation erfahren, nützlich sein.
  • Antikörper können unter Verwendung einer IAP-Sequenz produziert werden, die sich nicht in stark konservierten Regionen befindet und bei der es wahrscheinlich zu sein scheint, dass sie antigen ist, wie mittels Kriterien analysiert wurde, wie den vom Peptidstruktur-Programm bereitgestellten (Genetics Computer Group Sequence Analysis Package, Programmhandbuch für das GCG Package, Version 7, 1991), unter Anwendung des Algorithmus von Jameson und Wolf (CABIOS 4: 181, 1988).
  • Spezifisch handelt es sich bei diesen Regionen, die zwischen BIR1 und BIR2 aller IAPs zu finden sind, um: von Aminosäure 99 bis Aminosäure 170 von HIAP-1, von Aminosäure 123 bis Aminosäure 184 von HIAP-2 und von Aminosäure 116 bis Aminosäure 113 von entweder XIAP oder mXIAP. Diese Fragmente können mittels Standardtechniken erzeugt werden, z. B. durch die PCR, und in den pGEX-Expressionsvektor kloniert werden (Ausubel et al., oben). Die Fusionsproteine werden in E. coli exprimiert und mit einer Glutathion-Agarose-Affinitätsmatrix gereinigt, wie in Ausubel et al. (oben) beschrieben. Zum Verringern des Potentials, Antiserum zu gewinnen, das nichtspezifisch ist oder Bindung an IAP mit geringer Affinität aufzeigt, werden für jedes Protein zwei oder drei Fusionen erzeugt und jede Fusion wird in mindestens zwei Kaninchen injiziert. Antisera werden mittels serienmäßigen Injektionen erzeugt, vorzugsweise einschließlich von mindestens drei Boosterinjektionen.
  • VIII. Identifizierung von Molekülen, die die IAP-Proteinexpression modulieren
  • Die Isolation von IAP-cDNAs vereinfacht auch die Identifizierung von Molekülen, die die IAP-Expression steigern oder vermindern. In einem Ansatz werden Kandidatenmoleküle in unterschiedlichen Konzentrationen zum Kulturmedium von Zellen, die IAP-mRNA exprimieren, gegeben. Die IAP-Expression wird dann beispielsweise mittels Northern-Blot-Analyse (Ausubel et al., oben) unter Verwendung einer IAP-cDNA oder eines cDNA-Fragments als einer Hybridisierungssonde gemessen (siehe auch Tabelle 5). Das Niveau der IAP-Expression bei Vorliegen des Kandidatenmoleküls wird mit dem Niveau der IAP-Expression bei Abwesenheit des Kandidatenmoleküls verglichen, wobei alle anderen Faktoren (z. B. Zelltyp und Kulturbedingungen) identisch sind.
  • Die Wirkung von Kandidatenmolekülen auf IAP-vermittelte Apoptose kann stattdessen auf der Ebene der Translation durch Verwendung des oben beschriebenen allgemeinen Ansatzes mit Standardproteinnachweistechniken gemessen werden, wie Western-Blotting oder Immunpräzipitation mit einem IAP-spezifischen Antikörper (beispielsweise dem hierin beschriebenen IAP-Antikörper).
  • Verbindungen, die das Niveau der IAP-Expression modulieren, können gereinigt oder im Wesentlichen gereinigt werden oder können ein Bestandteil einer Mischung von Verbindungen sein, wie ein Extrakt oder Überstand, der aus Zellen gewonnen wurde (Ausubel et al., oben). In einem Assay einer Mischung von Verbindungen wird die IAP-Expression gegen stufenweise kleinere Teilmengen des Verbindungspools (z. B. mittels Standardreinigungstechniken produziert, wie HPLC oder FPLC), bis von einer einzigen Verbindung oder einer minimalen Anzahl wirksamer Verbindungen bewiesen. wird, dass sie die IAP-Expression moduliert.
  • Verbindungen können ebenfalls auf ihre Fähigkeit zum Modulieren der die IAP-Apoptose inhibierenden Aktivität gescreent werden. In diesem Ansatz wird das Ausmaß der Apoptose bei Vorliegen einer Kandidatenverbindung mit dem Ausmaß der Apoptose bei deren Abwesenheit unter äquivalenten Bedingungen verglichen. Wiederum kann das Screening mit einem Pool von Kandidatenverbindungen beginnen, von denen eine oder mehrere geeignete Modulatorverbindungen schrittweise isoliert werden. Die Apoptose-Aktivität kann mittels eines beliebigen Standardassays, beispielsweise den hierin beschriebenen, gemessen werden.
  • Ein anderes Verfahren zum Nachweisen von Verbindungen, die die Aktivität von IAPs modulieren, besteht darin, auf Verbindungen zu screenen, die physikalisch mit einem gegebenen IAP-Polypeptid interagieren. Diese Verbindungen können durch Anpassen von in der Technik bekannten Interaction-Trap-Expressionssystemen nachgewiesen werden. Diese Systeme weisen Proteininteraktionen unter Verwendung eines transkriptionellen Aktivierungsassays nach und werden von Gyuris et al. (Cell 75: 791–803, 1993) und Field et al. (Nature 340: 245–246, 1989) allgemein beschrieben und sind im Handel von Clontech (Palo Alto, CA, USA) erhältlich. Darüber hinaus beschreibt die PCT-Veröffentlichung WO 95/28497 ein Interaction-Trap-Assay, in dem an der Apoptose beteiligte Proteine aufgrund ihrer Interaktion mit Bcl-2 nachgewiesen werden. Ein ähnliches Verfahren kann zum Identifizieren von Proteinen und anderer Verbindungen, die mit IAPs interagieren, verwendet werden.
  • Verbindungen oder Moleküle, die als Modulatoren von. IAP-vermitteltem Zelltod agieren, können Peptid- und Nicht-Peptid-Moleküle umfassen, wie diejenigen, die in Zellextrakten, Serum eines Säugers oder Wachstumsmedium, in dem Säugerzellen kultiviert worden sind, vorliegen.
  • Ein Molekül, das eine Steigerung der IAP-Expression oder IAP-Aktivität fördert, kann beispielsweise als ein Therapeutikum zum Erhöhen der zellulären IAP-Konzentrationen und dadurch Ausnutzen der Fähigkeit von IAP-Polypeptiden, Apoptose zu inhibieren, verwendet werden.
  • Ein Molekül, das die IAP-Aktivität vermindert (z. B. durch Vermindern der IAP-Genexpression oder Polypeptidaktivität), kann zum Verringern der zellulären Proliferation verwendet werden. Dies wäre. bei der Behandlung von Neoplasmen (siehe Tabelle 3 unten) oder anderen Zellproliferationserkrankungen vorteilhaft. TABELLE 3 NORTHERN-BLOT-IAP-RNA-NIVEAUS IN KREBSZELLEN*
    Figure 00430001
    • * Die Niveaus sind durch ein (+) angezeigt und sind der ungefähre Anstieg der RNA-Niveaus bezüglich von Northern- Blots von RNA aus nichtkanzerösen Kontrollzelllinien. Ein einziges Pluszeichen zeigt einen geschätzten Anstieg von mindestens 1-fach an.
  • Moleküle, von denen mittels der oben beschriebenen Verfahren gefunden wird, dass sie die IAP-Genexpression oder Polypeptidaktivität effektiv modulieren, können in Tiermodellen weiter geprüft werden. Wenn sie in einer In-vivo-Situation weiterhin erfolgreich funktionieren, können sie als Therapeutika verwendet werden, um die Apoptose je nach Bedarf entweder zu inhibieren oder zu fördern.
  • IX. IAP-Therapie
  • Das Niveau der IAP-Genexpression korreliert mit dem Apoptose-Niveau. Somit können IAP-Gene auch in der Anti-Apoptose-Gentherapie Verwendung finden. Insbesondere kann einfunktionelles IAP-Gen zum Aufrechterhalten von Nervenzellen, die im Verlauf einer neurodegenerativen Erkrankung Apoptose erfahren, Lymphozyten (d. h. T-Zellen und B-Zellen) oder Zellen, die durch Ischämie verletzt worden sind, verwendet werden.
  • Retrovirale Vektoren, adenovirale Vektoren, adenoassoziierte virale Vektoren oder andere virale Vektoren mit dem entsprechenden Tropismus für Zellen, von denen wahrscheinlich ist, dass sie an der Apoptose beteiligt sind (beispielsweise Epithelzellen), können als ein Gentransferlieferungssystem für ein therapeutisches IAP-Genkonstrukt verwendet werden. Zahlreiche für diesen Zweck geeignete Vektoren sind allgemein bekannt (Miller, Human Gene Therapy 15–14, 1990; Friedman, Science 244: 1275–1281, 1989; Eglitis und Anderson, BioTechniques 6: 608–614, 1988; Tolstoshev und Anderson, Current opinion in Biotechnology 1: 55–61, 1990; Sharp, The Lancet 337: 1277–1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36: 311–322, 1987; Anderson, Science 226: 401–409, 1984; Moen, Blood Cells 17: 407–416, 1991; Miller et al., BioTechniques 7: 980–990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259: 988–990, 1993; und Johnson, Chest 107: 77S–83S, 1995). Retrovirale Vektoren sind besonders gut entwickelt und sind in klinischen Situationen verwendet worden (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323: 270, 1990; Anderson et al., US-Patentschrift Nr. 5,399,346). Nichtvirale Ansätze können ebenfalls zur Einführung von therapeutischer DNA in Zellen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie andernfalls Apoptose erfahren, eingesetzt werden. IAP kann beispielsweise mittels Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413, 1987; Ono et al., Neurosci. Lett 117: 259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298: 278, 1989; Staubinger et al., Meth. Enz. 101: 512, 1983), Asialoorosomucoid-Polylysin-Konjugierung (Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985, 1989) oder weniger bevorzugt Mikroinjektion unter chirurgischen Bedingungen (Wolff et al., Science 247: 1465, 1990) in ein Neuron oder eine T-Zelle eingeführt werden.
  • Bei einem beliebigen der oben beschriebenen Anwendungsverfahren wird das therapeutische IAP-DNA-Konstrukt vorzugsweise auf die Stelle des vorhergesagten Apoptose-Ereignisses angewendet (beispielsweise durch Injektion). Es kann jedoch auch auf Gewebe in der Nähe des vorhergesagten Apoptose- Ereignisses oder auf ein Blutgefäß, das die Zellen versorgt, von denen vorhergesagt wurde, dass sie Apoptose erfahren, angewendet werden.
  • In den beschriebenen Konstrukten kann die IAP-cDNA-Expression von einem beliebigen geeigneten Promotor (z. B. dem humanen Cytomegalievirus-(CMV), Simianvirus 40-(SV40) oder Metallothionein-Promotor) gesteuert und von einem beliebigen geeigneten Regulationselement eines Säugers reguliert werden. Falls gewünscht können beispielsweise Enhancer, von denen bekannt ist, dass sie vorzugsweise die Genexpression in Nervenzellen, T-Zellen oder B-Zellen steuern, zum Steuern der IAP-Expression verwendet werden. Die verwendeten Enhancer könnten jene, die in ihrer Expression als gewebe- oder zellspezifisch gekennzeichnet sind, umfassen, ohne Einschränkung. Alternativ dazu kann, wenn ein genomischer IAP-Klon als ein therapeutisches Konstrukt verwendet wird (beispielsweise nach dessen Isolation mittels Hybridisierung mit der oben beschriebenen IAP-cDNA), die Regulation von den kognaten Regulationssequenzen oder, falls gewünscht, von Regulationssequenzen, die von einer heterologen Quelle abgeleitet sind, einschließlich beliebiger der oben beschriebenen Promotoren oder Regulationselemente, vermittelt werden.
  • Die IAP-Gentherapie kann auch mittels direkter Verabreichung der IAP-mRNA oder Antisense-IAP-mRNA an eine Zelle, von der erwartet wird, dass sie Apoptose erfährt, durchgeführt werden. Die mRNA kann mittels einer beliebigen Standardtechnik produziert und isoliert werden, wird jedoch am einfachsten mittels In-vitro-Transkription unter Verwendung einer IAP- cDNA unter der Steuerung eines Promotors mit hoher Effizienz (z. B. dem T7-Promotor) produziert. Die Verabreichung der IAP-mRNA an mRNA von maligne Zellen kann mittels eines beliebigen der oben beschriebenen Verfahren zur direkten Nukleinsäureverabreichung ausgeführt werden.
  • Idealerweise wird die Produktion von IAP-Protein mittels eines beliebigen Gentherapieansatzes in zellulären IAP-Konzentrationen resultieren, die zur normalen zellulären IAP-Konzentration in einer nicht betroffenen Zelle zumindest äquivalent sind. Die Behandlung mit einem beliebigen IAP-vermittelten Gentherapieansatz kann mit traditionelleren Therapien kombiniert werden.
  • Ein anderer therapeutischer Ansatz umfasst die Verabreichung von rekombinantem IAP-Protein, entweder direkt an die Stelle eines vorhergesagten Apoptose-Ereignisses (beispielsweise durch Injektion) oder systemisch (beispielsweise durch eine beliebige herkömmliche Technik zur Verabreichung von rekombinantem Protein). Die Dosierung von IAP hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Größe und des Wohlbefindens des individuellen Patienten, im Allgemeinen werden jedoch zwischen 0,1 mg und 100 mg inklusive täglich in einer beliebigen pharmazeutisch unbedenklichen Formulierung an einen Erwachsenen verabreicht.
  • X. Verabreichung von IAP-Polypeptiden, IAP-Genen oder Modulatoren von IAP-Synthese oder -Funktion
  • Ein IAP-Protein, -Gen oder -Modulator kann in einem pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel in Einheitsdosisform verabreicht werden. Herkömmliche pharmazeutische Praxis kann eingesetzt werden, um geeignete Formulierungen oder Zusammensetzungen zum Verabreichen von IAP an Patienten bereitzustellen, die an einer Erkrankung leiden, die durch übermäßige Apoptose verursacht wird. Die Verabreichung kann beginnen, bevor der Patient symptomatisch ist. Eine beliebige geeignete Verabreichungsroute kann eingesetzt werden; die Verabreichung kann beispielsweise parenteral, intravenös, intraarteriell, subkutan, intramuskulär, intrakraniell, intraorbital, ophthalmisch, intraventrikulär, intrakapsulär, intraspinös, intrazisternal, intraperitoneal, intranasal, Aerosol- oder orale Verabreichung sein. Therapeutische Formulierungen können in der Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen sein; zur oralen Verabreichung können Formulierungen in der Form von Tabletten oder Kapseln sein und bei intranasalen Formulierungen in der Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen.
  • Verfahren, die in der Technik zum Herstellen von Formulierungen wohl bekannt sind, sind beispielsweise in „Remington's Pharmaceutical Sciences" zu finden. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können beispielsweise Vehikel, steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Polyalkylenglykole, wie Polyethylenglykol, Öle pflanzlichen Ursprungs oder hydrierte Naphthaline enthalten. Biokompatibles, biologisch abbaubares Lactidpolymer, Lactid/Glykolid-Copolymer oder Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Copolymere können zum Steuern der Freisetzung der Verbindungen verwendet werden. Andere potentiell geeignete parenterale Abgabesysteme für IAP- modulatorische Verbindungen umfassen Ethylen/Vinylacetat-Copolymerteilchen, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposome. Formulierungen zur Inhalation können Vehikel, beispielsweise Lactose, enthalten oder können wässrige Lösungen sein, die beispielsweise Polyoxyethylen-9-laurylether, Glykocholat und Desoxycholat enthalten, oder können ölige Lösungen zur Verabreichung in der Form von Nasentropfen oder als ein Gel sein.
  • Falls dies gewünscht wird, kann die Behandlung mit einem IAP-Protein, einem IAP-Gen oder einer IAP-modulatorischen Verbindung mit traditionelleren Therapien für die Erkrankung kombiniert werden, wie chirurgischer Eingriff, Steroidtherapie oder Chemotherapie für Autoimmunkrankheit; antivirale Therapie für AIDS und Gewebeplasminogenaktivator (tissue plasminogen activator, TPA) für ischämische Verletzung.
  • XI. Nachweis von Zuständen, die veränderte Apoptose involvieren
  • IAP-Polypeptide und -Nukleinsäuresequenzen der Erfindung können beim Nachweis oder Überwachen von Zuständen, die aberrierende Apoptose-Niveaus involvieren, diagnostische Anwendung finden. Eine verminderte IAP-Expression kann beispielsweise mit erhöhter Apoptose in Menschen korreliert sein (siehe XII unten). Dementsprechend kann eine Verringerung oder ein Anstieg des Niveaus der IAP-Produktion einen Hinweis auf einen schädlichen Zustand liefern. Niveaus der IAP-Expression können mittels einer beliebigen Standardtechnik untersucht werden. Beispielsweise kann die IAP- Expression in einer biologischen Probe (z. B. einer Biopsie) mittels Standard-Northern-Blot-Analyse überwacht oder kann durch PCR unterstützt werden (siehe z. B. Ausubel et al., oben; PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Ehrlich, Hrsg. Stockton Press, NY, USA; Yap et al., Nucl. Acids Res. 19: 4294, 1991).
  • Alternativ dazu kann eine von einem Patienten erhaltene biologische Probe auf eine oder mehrere Mutationen in den IAP-Sequenzen unter Anwendung eines Fehlpaarungnachweisansatzes analysiert werden. Im Allgemeinen umfassen diese Techniken die PCR-Amplifikation von Nukleinsäure aus der Patientenprobe, gefolgt von der Identifizierung der Mutation (d. h. Fehlpaarung) mittels entweder modifizierter Hybridisierung, aberrierender gelelektrophoretischer Migration, Bindung oder Spaltung, die von Fehlpaarungsbindungsproteinen vermittelt wird, oder direkter Nukleinsäuresequenzierung. Eine beliebige dieser Techniken kann zum Vereinfachen des Nachweises von Mutanten-IAP verwendet werden und jede ist in der Technik wohl bekannt; Beispiele bestimmter Techniken werden in Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766–2770, 1989; Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 232–236, 1989, beschrieben, ohne Einschränkung.
  • In noch einem anderen Ansatz können Immunoassays zum Nachweisen oder Überwachen von IAP-Protein in einer biologischen Probe verwendet werden. IAP-spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper (wie oben beschrieben hergestellt) können in einem beliebigen Immunoassay-Standardformat (z. B. ELISA, Western-Blot oder RIA) zum Messen der IAP-Polypeptid- Konzentrationen verwendet werden. Diese Konzentrationen würden mit Wildtyp-IAP-Konzentrationen verglichen werden, wobei eine Verringerung der IAP-Produktion auf einen Zustand hinweist, der erhöhte Apoptose involviert. Beispiele von Immunoassays werden z. B. in Ausubel et al., oben, beschrieben. Immunhistochemische Techniken können ebenfalls zum IAP-Nachweis eingesetzt werden. Beispielsweise kann eine Gewebeprobe von einem Patienten erhalten, sektioniert und auf das Vorliegen von IAP unter Verwendung eines Anti-IAP-Antikörpers und eines beliebigen Standardnachweissystems (z. B. einem, das einen sekundären Antikörper enthält, der an Meerrettichperoxidase konjugiert ist) gefärbt werden. Allgemeine Anleitungen in Bezug auf solche Techniken können in z. B. Bancroft und Stevens (Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, 1982) und Ausubel et al. (oben) gefunden werden.
  • Es kann ein kombiniertes diagnostisches Verfahren eingesetzt werden, das mit einer Beurteilung der IAP-Proteinproduktion (beispielsweise mittels immunologischen Techniken oder des Protein-Truncation-Tests (Hogerrorst et al., Nature Genetics 10: 208–212, 1995)) beginnt und außerdem eine auf Nukleinsäure basierende Nachweistechnik umfasst, die zum Identifizieren feinerer IAP-Mutationen (beispielsweise Punktmutationen) konzipiert ist. Wie oben beschrieben steht Fachmännern eine Reihe von Fehlpaarungsnachweisassays zur Verfügung und es kann eine beliebige bevorzugte Technik verwendet werden. Es können Mutationen des IAP nachgewiesen werden, die entweder im Rückgang der IAP-Expression oder dem Rückgang der biologischen Aktivität von IAP resultieren. In einer Variation dieses kombinierten diagnostischen Verfahrens wird die biologische Aktivität von IAP als Proteaseaktivität unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Proteaseassaysystems (beispielsweise den hierin beschriebenen) gemessen.
  • Fehlpaarungsnachweisassays bieten außerdem eine Gelegenheit zum Diagnostizieren einer IAP-vermittelten Prädisposition für Erkrankungen, die von unangemessener Apoptose verursacht werden. Ein Patient, der heterozygot für eine IAP-Mutation ist, kann. beispielsweise keine klinischen Symptome zeigen und trotzdem eine höhere Wahrscheinlichkeit als normal zur Entwicklung einer oder mehrerer Arten neurodegenerativer, myelodysplastischer oder ischämischer Erkrankungen besitzen. In Anbetracht dieser Diagnose kann ein Patient Vorkehrungen treffen, seine Aussetzung gegenüber ungünstigen Umweltfaktoren (beispielsweise UV-Lichtaussetzung oder chemische Mutagene) zu minimieren und seine Krankheit sorgfältig zu überwachen (beispielsweise durch häufige physische Untersuchungen). Diese Art von IAP-Diagnoseansatz kann auch zum Nachweisen von IAP-Mutationen in pränatalen Untersuchungen verwendet werden. Die oben beschriebenen IAP-Diagnoseassays können mit einer beliebigen biologischen Probe (beispielsweise einer beliebigen Biopsieprobe oder Körperflüssigkeit oder einem beliebigen Gewebe) ausgeführt werden, in der IAP normalerweise exprimiert wird. Die Identifizierung eines Mutanten-IAP-Gens kann ebenfalls unter Verwendung dieser Quellen für Versuchsproben untersucht werden.
  • Alternativ dazu kann eine IAP-Mutation, insbesondere als Teil einer Diagnose auf Prädisposition für IAP-assoziierte degene rative Erkrankung, unter Verwendung einer DNA-Probe aus einer beliebigen Zelle beispielsweise mittels Fehlpaarungsnachweistechniken geprüft werden. Vorzugsweise wird die DNA-Probe vor der Analyse einer PCR-Amplifikation unterzogen.
  • Um den Nutzen von IAP-Gensequenzen als Diagnostikum und Prognostikum für Krebs zu demonstrieren, wurde ein Human Cancer Cell Line Multiple Tissue Northern Blot (Clontech, Palo Alto, CA, USA; Nr. 7757-1) sondiert. Dieser Northern-Blot enthielt ungefähr 2 μg Poly-A+-RNA pro Spur aus acht verschiedenen humanen Zelllinien: (1) Promyelozytenleukämie HL-60, (2) HeLa-Zelle S3, (3) chronische myelogene Leukämie K-562, (4) Lymphoblastenleukämie MOLT-4, (5) Burkittsches Lymphom Raji, (6) kolorektales Adenokarzinom SW-480, (7) Lungenkarzinom A549 und (8) Melanom G-361. Als eine Kontrolle wurde ein Human Multiple Tissue Northern Blot (Clontech, Palo Alto, CA, USA; Nr. 7759-1) sondiert. Dieser Northern-Blot enthielt ungefähr 2 μg Poly-A+-RNA pro Spur aus acht verschiedenen humanen Geweben: (1) Milz, (2) Thymus, (3) Prostata, (4) Testis, (5) Ovarium, (6) Dünndarm, (7) Kolon und (8) Leukozyten aus dem peripheren Blut.
  • Die Northern-Blots wurden sequentiell mit Folgendem hybridisiert: (1) einer 1,6 kb langen Sonde an die XIAP-kodierende Region (2) eine 375 bp lange HIAP-2-spezifische Sonde, die der untranslatierten 3'-Region entspricht, (3) einer 1,3 kb langen Sonde an die kodierende Region von HIAP-1, die mit HIAP-2 kreuzreagiert, (4) eine 1,0 kb lange Sonde, die von der kodierenden Region von Bcl-2 abgeleitet wurde, und (5) eine Sonde an β-Actin, das vom Hersteller bereitgestellt wurde. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 50°C gemäß der Anregungen des Herstellers durchgeführt. Der Blot wurde zweimal bei Raumtemperatur für 15 Minuten mit 2 × SSC, 0,1% SDS und dann bei 50°C mit 2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen.
  • Alle geprüften Krebslinien zeigten eine erhöhte IAP-Expression im Vergleich zu Proben von nichtkanzerösen Kontrollgeweben (Tabelle 3). Die Expression von XIAP war besonders hoch in HeLa (S-3), chronischer myelogener Leukämie (K-562), kolorektalem Adenokarzinom (SW-480) und Melanom (G-361). Die Expression von HIAP-1 war äußerst hoch in Burkittschem Lymphom und war auch in kolorektalem Adenokarzinom erhöht. Die Expression von HIAP-2 war besonders hoch in chronischer myelogener Leukämie (K-562) und kolorektalem Adenokarzinom (SW-480). Die Expression von Bcl-2 wurde nur in HL-60-Leukämiezellen hochreguliert.
  • Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Hochregulierung der antiapoptotischen IAP-Gene ein weit verbreitetes Phänomen sein kann und möglicherweise viel öfter auftritt als die Hochregulierung von Bcl-2. Darüber hinaus kann die Hochregulierung zur Etablierung oder Aufrechterhaltung des transformierten Zustands von kanzerösen Zellen erforderlich sein.
  • Um der oben beschriebenen Beobachtung nachzugehen, d. h. dass HIAP-1 in der Burkittschen Lymphom-Zelllinie Raji überexprimiert wird, wurde an mehreren Burkittschen Lymphom-Zelllinien eine RT-PCR-Analyse durchgeführt. Gesamt-RNA wurde aus Zellen der Zelllinien Raji, Ramos, EB-3 und Jiyoye und als eine Positivkontrolle aus normalem Plazentagewebe extrahiert. Die RNA wurde revers transkribiert und mittels PCR mit dem folgenden Satz von Oligonukleotid-Primern amplifiziert: 5'-AGTGCGGGTTTTTATTATGTG-3' (SEQ ID NO: 44) und 5'-AGATGACCACAAGGAATAAACACTA-3' (SEQ ID NO: 45), die ein HIRP-1-cDNA-Fragment selektiv amplifizieren. Die RT-PCR wurde mit einem PerkinElmer 480-Thermozykler zum Durchführen von 35 Zyklen des folgenden Programms vorgenommen: 94°C für 1 Minute, 50°C für 1,5 Minuten und 72°C für eine Minute. Das PCR-Reaktionsprodukt wurde auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterworfen und mit Ethidiumbromid gefärbt. Amplifizierte cDNA-Fragmente mit der entsprechenden Größe waren in allen Spuren, die Proben des Burkittschen Lymphoms enthielten, deutlich sichtbar, waren jedoch in den Spuren, die die Probe des normalen Plazentagewebes enthielten, und in Spuren, die Negativkontrollproben enthielten, abwesend, wobei Matrizen-DNA aus der Reaktion weggelassen wurde (17).
  • XII. Akkumulation eines 26-kDa-Spaltungsproteins in Astrozytomzellen
  • A. Identifizierung eines 26-kDa-Spaltungsproteins
  • Ein Gesamtproteinextrakt wurde aus Jurkat- und Astrozytomzellen durch Beschallen dieser (×3 für 15 Sekunden bei 4°C) in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Aprotinin und 5 mM Benzamidin hergestellt. Nach der Beschallung wurden die Proben 5 Minuten lang zentrifugiert (14.000 U/min in einer Mikrofuge). Zwanzig μg Protein wurden pro Well auf ein 10%iges SDS-Polyacrylamidgel geladen, einer Elektrophorese unterworfen und mittels Standardverfahren ein Elektroblotting auf PVDF-Membranen vorgenommen. Eine Western-Blot-Analyse, die wie zuvor beschrieben ausgeführt wurde, offenbarte, dass die Astrozytomzelllinie (CCF-STTG1) trotz des Fehlens eines apoptotischen Auslöserereignisses eine Anti-XIAP-reaktive Bande von ungefähr 26 kDa im Überfluss exprimierte (18). Tatsächlich ist diese Zellinie zuvor als besonders resistent gegenüber Standard-Apoptoseauslösern charakterisiert worden.
  • Unter den folgenden Versuchsbedingungen wurde ebenfalls eine XIAP-reaktive Bande von 26 kDa beobachtet. Jurkat-Zellen (eine transformierte humane T-Zelllinie) wurden durch Aussetzen gegenüber einem Anti-Fas-Antikörper (1 μg/ml) zum Erfahren von Apoptose induziert. Identische Kulturen von Jurkat-Zellen wurden einem der Folgenden ausgesetzt: (1) Anti-Fas-Antikörper und Cycloheximid (20 μg/ml), (2) Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α, zu 1000 U/ml) oder (3) TNF-α und Cycloheximid (20 μg/ml). Alle Zellen wurden 6 Stunden nach Start der Behandlung geerntet. Darüber hinaus wurde Anti-Fas-Antikörper als eine Negativkontrolle zu einem Extrakt gegeben, nachdem die Zellen geerntet wurden. Die Zellen wurden in SDS-Probenpuffer geerntet, auf einem 12,5%igen SDS-Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterworfen und es wurde unter Anwendung von Standardverfahren ein Elektroblotting auf PVDF-Membranen vorgenommen. Die Membrane wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-XIAP-Antikörper zu 1:1000 immungefärbt. Nach vier 15 Minuten währenden Waschvorgängen wurde ein Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, der an Meerrettichperoxidase konjugiert war, für 1 Stunde bei Raumtemperatur angewendet.
  • Nicht gebundener sekundärer Antikörper wurde abgewaschen und es wurde ein Chemilumineszenznachweis von XIAP-Protein durchgeführt. Der Western-Blot offenbarte das Vorliegen des vollständigen 55-kDa-XIAP-Proteins, sowohl in unbehandelten als auch behandelten Zellen. Darüber hinaus wurde außerdem eine neuartige XIAP-reaktive Bande von ungefähr 26 kDa in apoptotischen Zellextrakten, jedoch nicht in der Kontrolle, unbehandelten Zellextrakten, beobachtet (19).
  • Die Spaltung von XIAP tritt in einer Vielfalt von Zelltypen auf, einschließlich anderen Krebszelllinien, wie HeLa. Die Expression des 26-kDa-XIAP-Spaltungsprodukts wurde wie folgt in HeLa-Zellen demonstriert. HeLa-Zellen wurden mit einem der Folgenden behandelt: (1) Cycloheximid (20 μg/ml), (2) Anti-Fas-Antikörper (1 μg/ml), (3) Anti-Fas-Antikörper (1 μg/ml) und Cycloheximid (20 μg/ml), (4) TNF-α (1000 U/ml) oder (5) TNF-α (1000 U/ml) und Cycloheximid (20 μg/ml). Alle Zellen wurden 18 Stunden nach Start der Behandlung geerntet. Wie oben wurde Anti-Fas-Antikörper zu einem Extrakt gegeben, nachdem die Zellen geerntet wurden. Die HeLa-Zellen wurden geerntet und der Western-Blot wurde unter denselben Bedingungen sondiert, wie sie zum Sichtbarmachen von XIAP-reaktiven Banden aus Jurkat-Zellproben verwendet wurden. Erneut war in den apoptotischen Zellpräparaten eine 26-kDa-XIAP-Bande zu sehen (20). Des Weiteren korrelierte das Ausmaß der XIAP-Spaltung positiv mit dem Ausmaß der Apoptose. Die Behandlung von HeLa-Zellen mit lediglich Cycloheximid oder TNF-α bewirkte nur geringe Apoptose und es wurde nur wenig Spaltungsprodukt beobachtet. Wenn die Zellen mit. dem Anti-Fas-Antikörper behandelt wurden, war eine größere Menge an Spaltungsprodukt sichtbar. Diese Daten deuten darauf hin, dass XIAP in mehr als einem Zelltyp und als Reaktion auf mehr als eine Art von Apoptoseauslöser gespalten wird.
  • B. Expressionszeitraum
  • Der Zeitraum, über den sich das 26-kDa-Spaltungsprodukt akkumuliert, wurde durch Behandeln von HeLa- und Jurkat-Zellen mit Anti-Fas-Antikörper (1 μg/ml) und Ernten dieser entweder sofort oder 1, 2, 3, 5, 10 oder 22 Stunden nach der Behandlung geprüft. Es wurden Proteinextrakte hergestellt und wie oben beschrieben Western-Blot-Analysen durchgeführt. Beide Zelltypen akkumulierten zunehmende Mengen des 26-kDa-Spaltungsprodukts über den geprüften Zeitraum (21A und 21B).
  • C. Subzelluläre Lokalisierung des 26-kDa-Spaltungsprodukts
  • Um die subzelluläre Lokation des 26 kDa-Spaltungsprodukts zu bestimmen, wurden Jurkat-Zellen durch Aussetzen gegenüber Anti-Fas-Antikörper (1 μg/ml) zum Erfahren von Apoptose induziert und dann entweder sofort, 3 Stunden oder 7 Stunden später geerntet. Gesamtproteinextrakte wurden wie oben beschrieben aus Zellen hergestellt, die zu jedem Zeitpunkt geerntet worden waren. Zum Herstellen von nukleären und zytoplasmatischen Zellextrakten wurden apoptotische Jurkat-Zellen mit isotonischer Tris-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,0) gewaschen und durch fünfmaliges Einfrieren und Auftauen in Zellextraktionspuffer (50 mM PIPES, 50 mM KCl, 5 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT und 20 μM Cytochalasin B) lysiert. Die Zellkerne wurden mittels Zentrifugation pelletiert und in isotonischem Tris (pH 7,0) resuspendiert und bei –80°C eingefroren. Die zytoplasmatische Fraktion des Extrakts wurde mittels Zentrifugation für 30 Minuten bei 60.000 U/min in einem TA 100.3-Rotor weiter verarbeitet. Überstände wurden entfernt und bei –80°C eingefroren. Proben von sowohl nukleären als auch zytoplasmatischen Fraktionen wurden auf ein 12,5%iges SDS-Polyacrylamidgel geladen und es wurde ein Elektroblotting auf PVDF-Membranen vorgenommen. Dann wurde eine Western-Blot-Analyse mit entweder einem Anti-CPP32-Antikörper (Transduction Laboratories Lexington, KY, USA; 22A) oder dem oben beschriebenen Kaninchen-Anti-XIAP-Antikörper (22B) durchgeführt.
  • Der Anti-CPP32-Antikörper, der die CPP32-Protease (auch als YAMA oder Apopain bekannt) erkennt, teilte sich fast ausschließlich in der zytoplasmatischen Fraktion auf. Das 55-kDa-XIAP-Protein lokalisierte sich in Übereinstimmung mit den oben dargestellten Studien ausschließlich im Zytoplasma von apoptotischen Zellen, wobei von XIAP-Protein in normalen, gesunden COS-Zellen mittels Immunofluoreszenzmikroskopie beobachtet wurde, dass es sich zum Zytoplasma hin lokalisierte. Im Gegensatz dazu lokalisierte sich das 26-kDa-Spaltungsprodukt ausschließlich zur nukleären Fraktion von apoptotischen Jurkat-Zellen hin. Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass der antiapoptotische Bestandteil von XIAP das 26-kDa-Spaltungsprodukt sein könnte, das seinen Einfluss im Zellkern ausübt.
  • D. In-vitro-Spaltung von XIAP-Protein und Charakterisierung des Spaltungsprodukts
  • Für diese Versuchsreihe wurde XIAP-Protein unter Verwendung des Plasmids pcDNA3-6-myc-XIAP, T7-RNA-Polymerase und eines gekoppelten Transkriptions-/Translationskit (Promega) gemäß der Anleitungen des Herstellers mit 35S markiert. Radioaktiv markiertes XIAP-Protein wurde mittels Säulenchromatographie mit Sephadex G-50TM von nicht integriertem Methionin getrennt. Darüber hinaus wurden Extrakte von apoptotischen Jurkat-Zellen nach Behandlung mit Anti-Fas-Antikörper (1 μg/ml) für drei Stunden hergestellt. Zum Herstellen der Extrakte wurden die Zellen in Triton X-100-Puffer. (1% Triton X-100, 25 mM Tris-HCl) auf Eis für zwei Stunden lysiert und dann 5 Minuten lang mikrozentrifugiert. Der lösliche Extrakt wurde zurückbehalten (und wurde mit TX100 gekennzeichnet). Zellen wurden in Zellextraktionspuffer unter Einfrieren/Auftauen lysiert. Die lösliche zytoplasmatische Fraktion wurde beiseite gestellt (und mit CEB gekennzeichnet). Zellkernpellets von der Herstellung der zytoplasmatischen Fraktion CEB wurden mit Triton X-100-Puffer solubilisiert, mikrozentrifugiert und die löslichen Fraktionen, die hauptsächlich Zellkern-DNA enthielten, wurden zurückbehalten (und mit CEB-TX100 gekennzeichnet). Löslicher Zellextrakt wurde durch Lysieren von Zellen mit NP-40-Puffer, gefolgt von Mikrozentrifugation für 5 Minuten hergestellt (und mit NP-40 gekennzeichnet). Die In-vitro-Spaltung wurde mittels Inkubieren von 16 μl jedes Extrakts (CEB, TX100, CEB-TX100 und NP-40) mit 4 μl von in vitro translatiertem XIAP-Protein bei 37°C für 7 Stunden durchgeführt. Negativkontrollen, die nur TX100-Puffer oder CEB-Puffer enthielten, wurden ebenfalls einbezogen. Die Pro teine wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel getrennt, das getrocknet und über Nacht Röntgenfilm ausgesetzt wurde.
  • Die In-vitro-Spaltung von XIAP war im CEB-Extrakt sichtbar. Das beobachtete Molekulargewicht des Spaltungsprodukts betrug ungefähr 36 kDa (23). Die Größenverschiebung des Spaltungsprodukts von 10 kDa deutet darauf hin, dass das beobachtete Produkt vom Amino-Terminus des rekombinanten Proteins abgeleitet ist, der sechs Kopien des myc-Epitops (10 kDa) enthält. Es hat folglich den Anschein, dass das Spaltungsprodukt mindestens zwei der BIR-Domänen besitzt und dass es zum Zellkern hin lokalisiert ist.
  • XIII. Behandlung von mit HIV infizierten Personen
  • Die Expression von HIAP-1 und HIAP-2 ist in mit HIV infizierten humanen Zellen erheblich vermindert. Des Weiteren geht diese Verringerung Apoptose voraus. Folglich kann eine Verabreichung von HIAP-1, HIAP-2, Genen, die diese Proteine kodieren, oder Verbindungen, die diese Gene hochregulieren, zum Verhindern des T-Zellen-Schwunds in mit HIV infizierten Patienten verwendet werden. Das folgende Assay kann auch zum Screenen auf Verbindungen verwendet werden, die die Expression von HIAP-1 und HIAP-2 modifizieren und die außerdem Apoptose verhindern.
  • Kultivierte reife CD4+-Lymphozytzelllinien (H9, in den 13A und 13B mit „a" gekennzeichnet; CEM/CM-3; mit „b" gekennzeichnet; 6T-CEM, mit „c" gekennzeichnet; und Jurkat, mit „d" gekennzeichnet) wurden nach Aussetzen gegenüber Mitogenen oder Infektion mit HIV auf Anzeichen von Apoptose (13A) und HIAP-Genexpression (13B) untersucht. Apoptose wurde durch das Auftreten von DNA-„Laddering" bei Gelelektrophorese aufgezeigt und die Genexpression wurde mittels PCR beurteilt. Die mit normalen (nicht infizierten, nicht mit Mitogenen stimulierten) Zellen erhaltenen Resultate sind in den 13A und 13B in jeder Spur als mit „1" gekennzeichnet gezeigt. Die 24 Stunden nach Stimulation mit PHA/PMA (Phytohämagglutinin/Phorbolester) erhaltenen Resultate sind in jeder Spur als mit „2" gekennzeichnet gezeigt. Die 24 Stunden nach Infektion mit dem HIV-Stamm IIIB erhaltenen Resultate sind in jeder Spur. als mit „3" gekennzeichnet gezeigt. Das „M" bezieht sich auf Standard-DNA-Marker (die 123 bp lange Leiter in 13B und die Lambda-HindIII-Leiter in 13A (beide von Gibco-BRL)). DNA-Leitern (Prigent et al., J. Immunol. Methods, 160: 139–140, 1993), die Apoptose indizieren, sind offenkundig, wenn DNA aus den oben beschriebenen Proben auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen werden (13A). Die Sensibilität und das Ausmaß der Apoptose der vier geprüften T-Zelllinien variieren nach Stimulation mit Mitogenen und Infektion mit HIV.
  • Zum Untersuchen der HIAP-Genexpression wurde aus den kultivierten Zellen Gesamt-RNA hergestellt und unter Anwendung von Oligo-dT-Priming revers transkribiert. Die RT-cDNA-Produkte wurden mittels PCR mit spezifischen Primern (wie in Tabelle 5 gezeigt) zum Nachweis von HIAP-2a, HIAP-2b und HIAP-1 amplifiziert. Die PCR wurde mit einem PerkinElmer 480-Thermozykler mit 35 Zyklen des folgenden Programms durchgeführt: 94°C für eine Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 1,5 Minuten. Die RT-PCR-Reaktionsprodukte wurden auf einem 1%igen Agarosegel, das mit Ethidiumbromid gefärbt worden war, einer Elektrophorese unterworfen. Die Abwesenheit von HIAP-2-Transkripten wird in allen vier Zelllinien 24 Stunden nach der Infektion mit HIV beobachtet. In drei von vier Zelllinien (alle mit Ausnahme von H9) wird das HIAP-1-Gen außerdem nach der Infektion mit HIV drastisch herunterreguliert. Die Stimulation mit PHA/PMA-Mitogenen scheint ebenfalls die HIAP-Genexpression zu vermindern; insbesondere die von HIAP-2 und zu einem geringeren Ausmaß die von HIAP-1. Die Daten dieser Versuche sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Die Expression von β-Actin war in allen geprüften Zelllinien konsistent, was darauf hindeutet, dass kein Fehler im RT-PCR-Assay vorliegt, der zur Verminderung der HIAP-Genexpression beitragen könnte. TABELLE 4 OLIGONUKLEOTID-PRIMER FÜR DIE SPEZIFISCHE RT-PCR-AMPLIFIKATION VON EINZIGARTIGEN IAP-GENEN
    Figure 00630001
    • * Nukleotidposition wie aus den 1–4 für jedes IAP-Gen bestimmt
    • a PCR-Produktgröße von HIAP-2a
    • b PCR-Produktgröße von HIAP-2b
  • TABELLE 5 APOPTOSE UND HIAP-GENEXPRESSION IN KULTIVIERTEN T-ZELLEN NACH STIMULATION MIT MITOGENEN ODER INFEKTION MIT HIV
    Figure 00640001
  • XIV. Zuordnung von XIAP, HIAP-1 und HIAP-2 zu den Chromosomen Xq25 und 11q22–23 mittels In-situ-Fluoreszenzhybridisierung (FISH)
  • In-situ-Fluoreszenzhybridisierung (fluorescence in situ hybridization, FISH) wurde zum Identifizieren der chromosomalen Lokation von XIAP, HIAP-1 und HIAP-2 eingesetzt. Die verwendeten Sonden waren in Plasmidvektoren klonierte cDNAs: der 2,4 kb lange XIAP-Klon enthielt eine 1493 bp lange kodierende Sequenz, eine 34 bp lange 5'-UTR (untranslatierte Region) und eine 913 bp lange 3'-UTR; die HIAP-1-cDNA war 3,1 kb lang und enthielt eine 1812 bp lange kodierende Region und eine 1300 bp lange 3'-UTR und der HIAP-2-Klon bestand aus einer 1856 bp langen kodierenden Region und einer 1200 bp langen 5'-UTR. Insgesamt 1 μg der Sonden-DNA wurde mittels Nicktranslation (BRL) mit Biotin markiert. Aus einer Kultur von normalem peripheren Blut hergestellte Chromosomen-Spreads wurden 2 Minuten lang bei 70°C in 50%igem Formamid/2 × SSC denaturiert und anschließend mit der mit Biotin markierten DNA-Sonde 18 Stunden lang bei 37°C in einer Lösung hybridisiert, die aus 2 × SSC/70%igem Formamid/10%igem Dextransulfat bestand. Nach der Hybridisierung wurden die Spreads in 2 × SSC/50%igem Formamid gewaschen, worauf ein Waschvorgang in 2 × SSC bei 42°C folgte. Die mit Biotin markierte DNA wurde mittels mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) konjugierten Avidin-Antikörpern und Anti-Avidin-Antikörpern (ONCOR-Nachweiskit) gemäß der Anleitungen des Herstellers nachgewiesen. Chromosome wurden mit Propidiumiodid gegengefärbt und mit einem Olympus BX60-Epifluoreszenzmikroskop untersucht. Zur Chromosomidentifizierung wurden die Objektträger mit aufgezeichneten markierten Metaphase-Spreads entfärbt, dehydriert, getrocknet, 30 Sekunden lang mit Trypsin verdaut und 2 Minuten lang mit 4%iger Giemsa-Färbung gefärbt. Die Chromosom-Spreads wurden erneut lokalisiert und die Bilder wurden verglichen.
  • Insgesamt 101 Metaphase-Spreads wurden wie oben beschrieben mit der XIAP-Sonde untersucht. In 74% der analysierten Zellen wurden symmetrische Fluoreszenzsignale an entweder einem oder beiden Homologen des Chromosoms Xq24 beobachtet. Nach der Färbung mit HIAP-1- und HIAP-2-Sonden wurden 56 Zellen analysiert und in 83% der untersuchten Zellen wurden Duplettsignale in der Region 11q22–23 beobachtet. Das XIAP-Gen wurde auf Xq25 kartiert, wohingegen das HIAP-1- und das HIAP-2-Gen am Rand der Banden 11q22 und 11q23 kartiert wurden.
  • Diese Versuche bestätigten die Lokation des XIAP-Gens am Chromosom Xq25. Bisher wurde von keinen hochkonsistenten chromosomalen Anomalien, an denen die Bande Xq25 beteiligt war, in beliebigen Malignitäten berichtet. Deletionen in dieser Region hängen jedoch mit einer Reihe von Immunsystemdefekten zusammen, einschließlich X-gekoppelte Erkrankungen des lymphoretikulären Systems (Wu et al., Genomics 17: 163–170, 1993).
  • Zytogene Anomalien der Bande. 11q23 wurden ungeachtet des Phänotyps in mehr als 50% der Leukämien im Kindesalter identifiziert (Martinez-Climet et al., Leukaemia 9: 1299–1304, 1995). Neuanordnungen des MLL-Gens (Mixed-Lineage-Leukämie oder myeloische lymphatische Leukämie; Ziemin Van der Poel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10735–10739, 1991) sind in 80% der Fälle mit 11q23-Translokation entdeckt worden; es wurde jedoch ebenfalls von Patienten berichtet, bei denen die Neuanordnungen deutlich andere Regionen als das MLL-Gen involvierten (Kobayashi et al., Blood 82: 547–551, 1993). Folglich können die IAP-Gene dem Paradigma von Bcl-2 folgen und würden somit eine wichtige Rolle in der Transformation von Krebs spielen.
  • XV. Vorbeugende antiapoptotische Therapie
  • Bei einem Patienten, der als für eine IAP-Mutation heterozygot oder als für IAP-Mutationen empfänglich (selbst wenn diese Mutationen noch nicht in einer Veränderung oder einem Rückgang der biologischen Aktivität von IAP resultieren) diagnostiziert wurde, oder einem Patienten, der als HIV-positiv diagnostiziert wurde, kann eine beliebige der obigen Therapien vor dem Auftreten des Krankheitsphänotyps verabreicht werden. Die Therapien können beispielsweise einem Patienten verordnet werden, der HIV-positiv ist, aber noch nicht eine verminderte T-Zellenzahl oder andere offenkundige Anzeichen von AIDS aufzeigt. Insbesondere Verbindungen, von denen gezeigt wurde, dass sie die IAP-Expression oder die biologische Aktivität von IAP steigern, können mittels einer beliebigen Standarddosierung und -verabreichungsroute (siehe oben) verabreicht werden. Alternativ dazu kann eine Gentherapie, die ein IAP-Expressionskonstrukt verwendet, vorgenommen werden, um den Zelldefekt vor der Entwicklung der degenerativen Erkrankung umzukehren oder zu verhindern.
  • Die obigen Verfahren können zum Mindern oder Diagnostizieren der hierin beschriebenen Störungen in einem beliebigen Säuger, beispielsweise Menschen, Haustieren oder Nutztieren, verwendet werden. Wenn ein nichtmenschlicher Säuger behandelt oder diagnostiziert wird, kann das eingesetzte IAP-Polypeptid, die eingesetzte IAP-Nukleinsäure oder der eingesetzte IAP-Antikörper für diese Spezies spezifisch sein.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (12)

  1. Im Wesentlichen reines Polypeptid, das mindestens eine Domäne umfasst, die mindestens 85% Aminosäuresequenzidentität zu einer Domäne aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus: (a) den Aminosäuren 26–93, 163–230 oder 265–330 von XIAP (SEQ ID NO: 4); (b) den Aminosäuren 26–93, 163–230 oder 264–329 von mXIAP (SEQ ID NO: 10); (c) den Aminosäuren 29–96, 1,69–235 oder 255–322 von HIAP-1 (SEQ ID NO: 6); (d) den Aminosäuren 29–96, 169–235 oder 255–322 von mHIAP-1 (SEQ ID NO: 40); (e) den Aminosäuren 46–113, 184–250, 269–336 von HIAP-2 (SEQ ID NO: 8) und (f) den Aminosäuren 25–92, 156–222 oder 241–308 von mHIAP-2 (SEQ ID NO: 42) ausgewählt ist, wobei das Polypeptid Apoptose inhibiert.
  2. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid mindestens 90% Aminosäuresequenzidentität zu der Domäne aufweist.
  3. Polypeptid nach Anspruch 2, wobei das Polypeptid mindestens 95% Aminosäuresequenzidentität zu der Domäne aufweist.
  4. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid aus einer Aminosäuresequenz besteht, die aus der Gruppe bestehend aus (a) den Aminosäuren 26–93, 163–230 oder 265–330 von XIAP (SEQ ID NO: 4); (b) den Aminosäuren 26–93, 163–230 oder 264–329 von mXIAP (SEQ ID NO: 10); (c) den Aminosäuren 29–96, 169–235 oder 255–322 von HIAP-1 (SEQ ID NO: 6): (d) den Aminosäuren 29–96, 169–235 oder 255–322 von mHIAP-1 (SEQ ID NO: 40); (e) den Aminosäuren 46–113, 184–250, 269–336 von HIAP-2 (SEQ ID NO: 8) und (f) den Aminosäuren 25–92, 156–222 oder 241–308 von mHIAP-2 (SEQ ID NO: 42) ausgewählt ist, wobei das Polypeptid Apoptose inhibiert.
  5. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid mindestens 85% Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 42 aufweist.
  6. Polypeptid nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid mindestens 90% Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 42 aufweist.
  7. Polypeptid nach Anspruch 6, wobei das Polypeptid mindestens 95% Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 42 aufweist.
  8. Polypeptid nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid aus einer Aminosäuresequenz besteht, die aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 42 ausgewählt ist.
  9. Im Wesentlichen reines Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–8 kodiert.
  10. Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9 umfasst.
  11. Zelle, die den Expressionsvektor nach Anspruch 10 umfasst.
  12. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1–8, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Zelle, die mit einem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9 transformiert wurde, wobei das Nukleinsäuremolekül zur Expression in der Zelle angeordnet ist; und (b) Kultivieren der transformierten Zelle unter Bedingungen zum Exprimieren des Polypeptids, um das Polypeptid herzustellen.
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