DE69635968T2 - Therapeutischer Inhibitor von glatten Muskelzellen - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein therapeutische Verfahren, die das chirurgische oder intravenöse Einführen von Bindungspartnern umfassen, die auf bestimmte Ziel- bzw. Ziel-Zellpopulationen gerichtet sind, wie etwa glatte Muskelzellen, Krebszellen, somatische Zellen, die eine Regulierung bzw. Modulation zur Linderung eines Erkrankungszustands erfordern, sowie Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere zur Behandlung von Zuständen, wie etwa Stenose infolge einer Gefäßverletzung oder -erkrankung, Krebs, Erkrankungen, die von Hyperaktivität oder Hyperplasie somatischer Zellen herrühren, sowie Erkrankungen, die durch Immunsystem-Effektorzellen vermittelt werden. Auch beschrieben wird das chirurgische oder intravenöse Einführen von Mitteln, die in der Lage sind, die Proliferation oder Migration oder Konzentration von Proteinen glatter Muskelzellen zu verändern. Die Erfindung betrifft auch die gerichtete oder die gezielte Verabreichung therapeutischer Mittel an Zellen vaskulärer glatter Muskulatur, was zu einer Dilatation bzw. Ausweitung und Fixierung des Gefäßlumens führt (biologischer Stentingeffekt). Die kombinierte Verabreichung eines zytoziden bzw. zellabtötenden Konjugats und einer Retard-Dosierungsform eines Inhibitors vaskulärer glatter Muskelzellen ist ebenfalls offenbart.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Perkutane transluminale Coronarangioplastie (PTCA) wird häufig als primäre Behandlungsmodalität bei vielen Patienten mit einer koronaren Herzerkrankung verwendet. PTCA kann myokardiale Ischämie bei Patienten mit einer Coronararterienerkrankung lindern, indem sie die Lumenobstruktion vermindert und den koronaren Durchfluss verbessert. Die Verwendung dieses chirurgischen Verfahrens ist schnell gestiegen, mit 39.000 Verfahren, die 1983 durchgeführt wurden, nahezu 150.000 in 1987, 200.000 in 1988, 250.000 in 1989 und für 1994 werden über 500.000 PTCAs pro Jahr geschätzt (1, 2, 3). Stenose nach PTCA bleibt ein signifikantes Problem, wobei von 25% bis 35% der Patienten innerhalb 1 bis 3 Monaten eine Restenose entwicken. Restenose führt zu signifikanter Morbidität und Mortalität und erfordert häufig weitere Eingriffe, wie etwa eine wiederholte Angioplastie oder eine Herzkranzbypassoperation. Keine chirurgischer Eingriff und keine postoperative Behandlung hat sich (bis dato) als wirksam erwiesen, Restenose zu verhindern.
  • Die Prozesse, die für die Stenose nach einer PCTA verantwortlich sind, sind nicht vollständig verstanden, könnten jedoch aus einer komplizierten Wechselwirkung zwischen mehreren unterschiedlichen biologischen Mitteln und (Stoffwechsel-) Wegen herrühren. In histologischen Schnitten betrachtet können restenotische Läsionen ein übermäßiges Wachstum glatter Muskelzellen in den intimalen Lagen des Gefäßes aufweisen (3). Mehrere mögliche Mechanismen für die glatte Muskelzellproliferation nach PTCA wurden vorgeschlagen (1, 2, 4, 5).
  • Verbindungen, die Berichten zufolge Proliferation glatter Muskelzellen in vitro unterdrücken (4, 6, 7), haben ungewünschte pharmakologische Nebenwirkungen, wenn man sie in vivo verwendet. Heparin ist ein Beispiel einer solchen Verbindung, die Berichten zufolge die Proliferation glatter Muskelzellen an vitro hemmt, aber, wenn sie in vivo angewandt wird, die potenziell schädliche Nebenwirkung hat, Blutgerinnung zu inhibieren. Während Heparinpeptide eine reduzierte antikoagulante Aktivität aufweisen, besitzen sie die unerwünschte pharmakologische Eigenschaft einer kurzen pharmakologischen Halbwertszeit. Es sind Versuche unternommen worden, solche Probleme zu lösen, indem ein Doppelballonkatheter verwendet wurde, d.h. zur örtlichen Verabreichung des therapeutischen Mittels am Ort der Angioplastie (z.B. 8; U.S.-Patent 4,824,436), und durch Verwenden bioabbaubarer Materialien, die mit einem Medikament imprägniert sind, d.h. um Probleme der kurzen Halbwertzeit zu kompensieren (z.B. 9; U.S. Patent 4,929,602).
  • Verrucarine und Roridine sind Trichothecen-Medikamente, die als sekundäre Metabolite durch den Bodenpilz Myrothecium verrucaria und Myrothecium roridium erzeugt werden. Verrucarin ist ein makrozyklischer Triester. Roridin ist ein makrozyklischer Diester von Verrucarol (10). Als Gruppe sind Trichothecene strukturell sesquiterpenoiden Mycotoxinen verwandt, die von verschiedenen Pilzarten erzeugt werden und durch die 12,13-Epoxytrichothec-9-en-Grundstruktur gekennzeichnet sind. Ihre zytotoxische Aktivität bezogen auf eukaryontische Zellen ist eng mit ihrer Fähigkeit verbunden, an die Zelle zu binden, aufgenommen zu werden und die Protein- und Makromolekülsynthese in der Zelle zu inhibieren.
  • Mindestens fünf Gesichtspunkte würden auf den ersten Blick die Verwendung inhibitorischer Medikamente auszuschließen scheinen, um eine Stenose zu verhindern, die aus übermäßigem Wachstum glatter Muskelzellen resultiert. Erstens können inhibitorische Mittel eine systemische Toxizität aufweisen, die inakzeptables Risikopotential für Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen erzeugen könnte. Zweitens könnten inhibitorischen Mittel die vaskuläre Wundheilung nach der Operation stören, und dies könnte entweder die Heilung verzögern oder die Struktur oder Elastizität der neu verheilten Gefäßwand schwächen. Drittens könnten inhibitorische Mittel, die glatte Muskelzellen töten, umgebendes Endothel und/oder andere mediale glatte Muskelzellen schädigen. Tote und sterbende Zellen schütten auch mitogene Mittel aus, die eine zusätzliche Proliferation glatter Muskelzellen stimulieren und die Stenose verschlimmern könnten. Viertens könnte die Verabreichung therapeutisch wirksamer Mengen eines inhibitorischen Mittels von mehreren Punkten her problematisch sein: nämlich a) die Verabreichung einer großen Anzahl an Molekülen in die Intrazellularräume zwischen den glatten Muskelzellen könnte notwendig sein, d.h. um günstige Bedin gungen zu schaffen, um es einer therapeutisch wirksamen Dosis von Molekülen zu ermöglichen, die Zellmembran zu durchdringen; b) das Steuern eines inhibitorischen Arzneimittels in den richtigen Intrazellulärraum, d.h. dorthin, wo dessen Wirkung ausgeübt wird, könnte schwierig zu kontrollieren sein; und c) die Optimierung der Verbindung des inhibitorischen Arzneimittels mit dessen intrazellulärem Ziel bzw. Target, z.B. einem Ribosom, während eine intrazellulare Umverteilung der Arznei in z.B. benachbarte Zellen minimiert wird, könnte schwierig sein. Da fünftens die Proliferation glatter Muskelzellen über mehrere Wochen stattfindet, scheint es von vornherein notwendig, die inhibitorischen Medikamente über mehrere Wochen hinweg verabreicht werden sollten, vielleicht fortwährend, um eine günstige Wirkung zu erzielen.
  • Wie aus dem Vorhergehenden ersichtlich bleiben bei der Verwendung inhibitorischer Medikamente, einschließlich zytotoxischer Mittel, um Proliferation glatter Muskulatur wirksam zu behandeln, viele Probleme zu lösen. Es wäre sehr vorteilhaft, neue Methoden zu entwickeln, um Stenose aufgrund von Proliferation glatter vaskulärer Muskelzellen nach einer traumatischen Gefäßverletzung zu unterbinden, wie sie etwa während einer Gefäßoperation stattfinden. Zudem wäre die Verabreichung von Verbindungen, die inhibitorische Wirkung mit längerer Dauer bei vaskulären glatten Muskelzellen hervorruft, vorteilhaft. Eine örtliche Verabreichung solcher Retard-Verbindungen wäre auch bei der Behandlung anderer Zustände nützlich, bei denen die Zielzellpopulation für diese Verabreichung zugänglich ist.
  • Ein Aspekt der Erfindung umfasst einen bevorzugt metallischen, Kunststoff- oder bioabbaubaren intravaskulären Stent, der eine Retard-Dosierungsform umfassend eine zytostatische Menge eines therapeutischen Mittels umfasst, wie in Anspruch 1 definiert. Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform der Erfindung ist ein Stent, der ein therapeutisches Mittel umfasst, wie es in Anspruch 8 definiert ist.
  • Die Stents können eine bioabbaubare Beschichtung oder eine poröse oder permeable, nicht-bioabbaubare Beschichtung aufweisen. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Stent, der eine bioabbaubare Beschichtung oder eine poröse/permeable nicht-bioabbaubare Beschichtung aufweist, die das therapeutische Mittel umfasst. Eine weiter bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Stent, der eine bioabbaubare Beschichtung oder eine poröse oder nicht-bioabbaubare Beschichtung umfasst, die eine Retard-Dosierungsform des therapeutischen Mittels umfasst.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann ein Stent, z.B. ein bioabbaubarer Stent, d.h. die Stentmatrix, mit dem therapeutischen Mittel imprägniert sein. Ebenfalls wird die Verwendung eines bioabbaubaren Stents, der mit dem therapeutischen Mittel imprägniert ist, und der ferner mit einer bioabbaubaren Beschichtung oder einer porösen oder permeablen nicht-bioabbaubaren Beschichtung beschichtet ist, welche eine Retard-Dosierungsform eines therapeutischen Mittels umfasst, vorgeschlagen. Diese Ausführungsform der Erfindung kann unterschiedliche Ausschüttungsraten des therapeutischen Mittels bereitstellen, d.h. es gäbe eine schnellere Ausschüttung des therapeutischen Mittels aus der Beschichtung, gefolgt von einer verzögerten Ausschüttung des therapeutischen Mittels, mit dem die Stentmatrix imprägniert ist, auf den Abbau der Stentmatrix hin.
  • Der intravaskuläre Stent stellt ein mechanisches Mittel für eine Erhöhung des Lumeninhalts eines Gefäßes bereit, zusätzlich zur biologischen Stentingwirkung des in Anspruch 1 definierten therapeutischen Mittels.
  • Die erfindungsgemäßen Dosierungsformen sind bevorzugt entweder nicht abbaubare Mikropartikel oder Nanopartikel oder bioabbaubare Mikropartikel oder Nanopartikel. Bevorzugter sind die Mikropartikel oder Nanopartikel aus einem Polymer gebildet, das eine Matrix enthält, die durch zufällige, nicht-enzymatische oder hydrolytische Spaltung biologisch abgebaut wird. Eine besonders bevorzugte Struktur ist aus einem Gemisch thermoplastischer Polyester gebildet (z.B. Polylactid oder Polyglycolid) oder einem Copolymer aus Lactid- und Glycolid- Komponenten. Die Lactid-/Glycolid- Struktur besitzt den zusätzlichen Vorteil, dass deren Abbau Milchsäure und Glycolsäure bildet, beides normale metabolische Produkte von Säugern.
  • Bevorzugte therapeutische Mittel, die innerhalb der Mikropartikel oder Nanopartikel dispergiert sind, sind jene, die eine Inhibierung einer therapeutisch wesentlichen Zielzellaktivität aufweisen, ohne die Zielzelle zu töten, oder ohne Zielzelltötungsaktivität. Für die Behandlung von Restenose vaskulärer glatter Muskelzellen inhibieren nützliche therapeutische Mittel Zielzellaktivität (z.B. Proliferation oder Migration) ohne die Zielzellen zu töten. Bevorzugte therapeutische Gruppierungen für diesen Zweck sind Proteinkinaseinhibitoren (z.B. Staurosporin oder ähnliche), Inhibitoren der Migration und/oder Kontraktion von glatten Muskeln (z.B. Cytochalasine, wie Cytochalasin B, Cytochalasin C, Cytochalasin D oder ähnliche), Suramin, und Stickoxid-freisetzende Verbindungen wie Nitroglycerin, oder deren Analoga oder funktionelle Äquivalente. Bei der Krebstherapie inhibieren nützliche therapeutische Mittel die Proliferation oder sie sind für die Zielzellen zytotoxisch. Bevorzugte therapeutische Gruppierungen für diesen Zweck sind Roridin A und Pseudomonas Exotoxin, oder deren Analoga oder funktionelle Äquivalente. Für die Behandlung von Erkrankungen, die vom Immunsystem beeinflusst werden, wie Arthritis, transportieren nützliche therapeutische Mittel zytostatische, zytozide oder Metabolismus-modulierende therapeutische Mittel zu Zielzellen, die durch lokale Verabreichung der Dosierungsform zugänglich sind. Bevorzugte therapeutische Gruppierungen für diesen Zweck sind Roridin A, Pseudomonas Exotoxin, Suramin und Proteinkinaseinhibitoren (z.B. Staurosporin), Sphingosin, oder deren Analoga und funktionelle Äquivalente. Für die Behandlung von pathologisch-proliferierenden normalen Geweben (z.B. proliferative Vitreoretinopathie, Pannus corneae und ähnlichen) sind antiproliferative Mittel oder Antimigrationsmittel bevorzugt (z.B. Cytochalasine, Taxol, Somatostatin, Somatostatinanaloga, N-Ethylmaleimid, Antisense-Oligonukleotide und ähnli che).
  • Die erfindungsgemäßen Dosierungsformen werden mittels eines Bindungsproteins oder -peptids gezielt auf eine relevante Zielzellpopulation ausgerichtet. Bevorzugte Bindungsproteine/-peptide der vorliegenden Erfindung sind Bindungsprotein für vaskuläre glatte Muskelzellen, Tumorzellbindeprotein und Bindeprotein für Immunsystemeffektorzellen. Bevorzugte Bindungsproteine für vaskuläre glatte Muskelzellen verbinden sich spezifisch mit Chondroitinsulfatproteoglykan (CSPG), welches auf den Membranen von vaskulären glatten Muskelzellen exprimiert wird, und in einer bevorzugten Ausführungsform besitzt dieses CSPG ein Molekulargewicht von ungefähr 250 Kilodalton. In bevorzugten Ausführungsformen bindet das Bindeprotein für vaskuläre glatte Muskelzellen an ein CSPG-Target auf der Zelloberfläche mit einer Bindungskonstante von mindestens 10–4 M. In anderen bevorzugten Ausführungsformen enthält das Bindeprotein für vaskuläre glatte Muskelzellen eine Sequenz von Aminosäuren, die sich in der Fab, Fv oder CDR ("complementarity determining regions") von monoklonalem Antikörper NR-AN-01 oder dessen funktionellen Äquivalenten finden. Andere bevorzugte Bindungspeptide, die in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen jene, die sich im interzellulären Stroma und der Matrix, welche zwischen vaskulären glatten Muskelzellen liegen, befinden. Bevorzugte Bindungspeptide von diesem Typ sind spezifisch mit Kollagen, Retikulumfasern oder anderen interzellulären Matrixverbindungen assoziiert. Bevorzugte Tumorzellbindungsproteine sind mit Oberflächenzellmarkern assoziiert, die von der Ziel-Tumorzell-Population exprimiert werden, oder deren zytoplasmatische Epitope. Bevorzugte Bindungsproteine für vom Immunsystem modulierte Zielzellen sind mit Zelloberflächenmarkern der Zielimmunsystemeffektorzellen oder deren zytoplasmatischen Epitopen assoziiert. Bindungspeptide/-proteine der vorliegenden Erfindung zielen auch auf pathologisch-proliferierende normale Gewebe ab.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Stents bereit, welche die Verabreichung von freiem (d.h. nicht-zielgerichtetem oder nicht an einen Bindungspartner assoziiertem) therapeutischem Mittel an Zielzellen umfasst. Bevorzugt sind die Zielzellen vaskuläre Zellen glatter Muskulatur und das therapeutische Mittel ist ein Inhibitor vaskulärer glatter Muskelzellkontraktion, was es dem normalen hydrostatischen Druck erlaubt, das Gefäßlumen zu dilatieren. Solch eine Kontraktionsinhibition kann durch Actininhibition erreicht werden, welche bevorzugt durch durch einen geringeren Dosisspiegel erreichbar und aufrechtzuerhalten ist, als für die Inhibierung der Proteinsynthese notwendig. Dementsprechend synthetisieren die vaskulären glatten Muskelzellen Protein, welches notwendig ist, um geringe Zelltraumata zu reparieren und interstitielle Matrix zu sezernieren, wobei die Fixierung des Gefäßlumens in einem dilatierten Zustand nahe dem maximalen systolischen Durchmesser erleichtert wird. Dieses Phänomen stellt einen biologischen Stentingeffekt dar, der den unerwünschten Recoil-Mechanismus vermindert oder verhindert, welcher in bis zu 25% der Angioplastieverfahren auftritt, welche basierend auf einem anfänglichen Angiogramm nach dem Eingriff als erfolgreich eingestuft werden. Cytochalasine (welche die Polymerisation von G- zu F-Actin inhibieren, was umgekehrt die Migration und Kontraktion vaskulärer glatter Muskelzellen inhibiert) sind die bevorzugten therapeutischen Mittel zur Verwendung in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Protokolle mit freiem therapeutischem Mittel von diesem Typ bewirken eine Verminderung, eine Verzögerung oder die Beseitigung von Stenose nach Angioplastie oder anderen gefäßchirurgischen Verfahren. Bevorzugt wird freies therapeutisches Mittel direkt oder im Wesentlichen direkt an vaskuläres Gewebe glatter Muskulatur verabreicht. Solch eine Verabreichung wird bevorzugt durch einen Infusionskatheter vorgenommen, um eine 10–3 M bis 10–12 M Konzentration des therapeutischen Mittels am Verabreichungsort in einem Blutgefäß zu erreichen.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 ist eine mikrokopische Fotografie vaskulärer glatter Muskelzellen in einer Arterie eines 24jährigen männlichen Patienten mit Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel, das an Zelloberfläche und Membran gebunden ist. Der Patient erhielt das Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel durch Verabreichungn i.v. 4 Tage bevor das arterielle Gewebe für die Histologie präpariert wurde.
  • 1B ist eine mikrokopische Fotografie von Zellen vaskulärer glatter Muskulatur in einer Arterie eines 24jährigen männlichen Patienten mit einem Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel, das an Zelloberfläche und Membran gebunden ist. Der Schnitt wurde ex vivo mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG zur Reaktion gebracht. Diese Reaktion wurde durch Zugabe von 4-Chlor-1-naphthol sichtbar gemacht. Das Reaktionsprodukt des Substrats bildet ein unlösliches violettes oder dunkelbraunes Präzipitat am Reaktionsort (bei #2 gezeigt). Eine Gegenfärbung wurde vorgenommen, um Zellkerne sichtbar zu machen (bei # 1 gezeigt).
  • 2 zeigt ein erstes Schema für die chemische Kopplung eines therapeutischen Mittels mit einem Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel.
  • 3 zeigt ein zweites Schema für die chemische Kopplung eines therapeutischen Mittels mit einem Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel.
  • 4A zeigt graphisch experimentelle Daten, die schnelle Bindung von Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel an Marker-positive Testzellen in vitro zeigen.
  • 4B zeigt graphisch experimentelle Daten, die schnelle Bindung von Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel an vaskuläre glatte Muskelzellen in vitro zeigen.
  • 5A stellt graphisch experimentelle Daten dar, die die unerwünschte Zytotoxizität schon geringer Spiegel eines therapeutischen Konjugats (d.h. RA-NR-AN-01) sowie des freien RA therapeutischen Mittels zeigen, wenn vaskuläre glatte Muskelzellen für 24 Stunden in vitro behandelt wurden.
  • 5B stellt graphisch experimentelle Daten dar, die die Wirkungen von RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat auf die metabolische Aktivität von Merker-positiven und -negativen Zellen zeigen. Die Daten zeigen die unerwünschte nicht-spezifische Zytotoxizität des Konjugats für all diese Zellen in einer 24-Stunden-Behandlung in vitro. Die Nichtspezifität resultiert aus der extrazellulären Hydrolyse des Kopplungsliganden, welcher die getesteten Zellen freiem Arzneimittel aussetzt.
  • 6A zeigt graphisch experimentelle Daten, die die unerwünschte nichtspezifische Zytotoxizität von PE-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat für Marker-positive und -negative Testzellen nach 24 Stunden Behandlung in vitro zeigen, obwohl den 24 Stunden Behandlung eine Erholungsperiode über Nacht folgte, bevor die metabolische Aktivität getestet wurde.
  • 6B zeigt experimentelle Daten, die die nicht-spezifische Zytotoxizität des freien PE therapeutischen Mittels auf Marker-positive und -negative Testzellen nach 24 Stunden Behandlung an vitro zeigen.
  • 7A stellt graphisch experimentelle Daten dar, die zeigen, dass eine kurze fünfminütige "Puls"-Behandlung, d.h. anstelle von 24 Stunden, gefolgt von Aussetzen gegenüber [3H] Leucin, mit freiem RA therapeutischem Mittel unspezifisch zytotoxisch war, d.h. für HT29-Marker-negative Kontrollzellen, aber im Gegensatz dazu das RA-NR-AN-01 therapeutische Konjugat bei dieser "Puls"-Behandlung nicht zytotoxisch ist.
  • 7B zeigt graphisch experimentelle Daten, die zeigen, dass freies RA therapeutisches Mittel für HT29-Marker-negative Kontrollzellen unspezifisch zyto toxisch ist, auch in einer 5' "Puls"-Behandlung, gefolgt von einer 24-stündigen Erholungsphase vor dem Aussetzen gegenüber [3H]-Leucin, aber im Gegensatz dazu das RA-NR-AN-01 therapeutische Konjugat für Zeilen nicht zytotoxisch ist.
  • 7C zeigt graphisch die Ergebnisse von Experimenten, die zeigen, dass die "Puls"-Behandlung von Zellen in vitro mit RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat die zelluläre Aktivität in Marker-positiven A375-Zellen hemmt, gemessen mittels der Proteinsynthese.
  • 7D zeigt graphisch experimentelle Daten, die zeigen, dass eine "Puls"-Behandlung von Zellen in vitro mit RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat keine langanhaltenden inhibitorischen Wirkungen auf die zelluläre Aktivität in Marker-positiven Zellen ausgeübt, da die Proteinsynthese in A375-Zellen nicht inhibiert wurde, wenn den Zellen eine Erholungsphase über Nacht vor dem Test in vitro erlaubt wurde.
  • 8A zeigt graphisch experimentelle Daten, die zeigen, dass das RA-NR-AN-01 therapeutische Konjugat keine langanhaltenden inhibitorischen Wirkungen auf die zelluläre Aktivität in vaskulären glatten Muskelzellen ausübte, während eine "Puls"-Behandlung von Zellen in vitro mit freien RA therapeutischem Mittel unspezifisch zytotoxisch war, wie sich durch die metabolische Aktivität in BO54 Zellen ergibt, denen 48 Stunden Erholungsphase vor dem Test erlaubt wurden.
  • 8B zeigt graphisch experimentelle Daten ähnlich jenen, die in 8A oben gezeigt sind, jedoch unter Verwendung eines zweiten markerpositiven Zelltyps, nämlich A375, wobei die Daten zeigen, dass eine "Impuls"-Behandlung mit dem RA-RN-AN-01 therapeutischen Konjugat keine langdauernden inhibitorischen Effekte auf die zelluläre Aktivität ausgeübt hat, gemessen durch die metabolische Aktivität in A375-Zellen, denen eine 48-stündige Erho lungsperiode vor dem Testen zugestanden wurde.
  • 8C stellt graphisch Ergebnisse dar ähnlich jenen, die in 8A und 8B oben dargestellt sind, jedoch unter Verwendung einer Markernegativen Kontrollzelltyps, nämlich HT29. Diese Ergebnisse zeigen, dass die "Puls"-Behandlung mit RA-NR-AN-01 therapeutischem Konjugat keine langanhaltenden inhibitorischen Wirkungen auf die zelluläre Aktivität Markernegativer Kontrollzellen ausgeübte, gemessen durch die metabolische Aktivität in HT29-Zellen, denen eine 24stündige Erholungsphase vor dem Test erlaubt wurde.
  • 9A zeigt eine Stenose aufgrund von Proliferation intimaler glatter Muskelzellen in einem histologischen Schnitt einer unbehandelten Arterie 5 Wochen nach Angioplastie in einem Tiermodell.
  • 9B zeigt die Hemmung der Stenose in einem Tiermodell in einem histologischen Schnitt einer Arterie, die mit therapeutischem Konjugat 5 Wochen nach der Angioplastie behandelt wurde.
  • 10A zeigt graphisch experimentelle Daten, die Proteinsynthese- und DNA-Synthese-Inhibitionsfähigkeit von Suramin im Hinblick auf vaskuläre glatte Muskelzellen vergleichen.
  • 10B zeigt graphisch experimentelle Daten, die Proteinsynthese- und DNA-Synthese-Inhibitionsfähigkeit von Staurosporin im Hinblick auf vaskuläre glatte Muskelzellen vergleichen.
  • 10C zeigt graphisch experimentelle Daten, die Proteinsynthese- und DNA-Synthese-Inhibitionsfähigkeit von Nitroglycerin im Hinblick auf vaskuläre glatte Muskelzellen vergleichen.
  • 10D zeigt graphisch experimentelle Daten, die Proteinsynthese- und DNA-Synthese-Inhibitionsfähigkeit von Cytochalasin B im Hinblick auf vaskuläre glatte Muskelzellen vergleichen.
  • 11 zeigt einen tangentialen Schnitt parallel zur inneren Oberfläche einer vaskulären glatten Muskelzelle, die 62500fach vergrößert ist und durch zahlreiche endozytotische Vesikel gekennzeichnet ist, von denen einige antikörperbeschichtete Goldkügelchen enthalten, die sich im Prozess befinden, durch die Zelle in vitro aufgenommen zu werden.
  • 12 zeigt eine glatte Muskelzelle, die 62500fach vergrößert ist und durch eine bemerkenswerte Anhäufung von Goldkügelchen in Lysosomen, 24 Stunden nachdem die Zellen in vitro den Kügelchen ausgesetzt wurde, gekennzeichnet ist.
  • 13 zeigt eine glatte Muskelzelle, die 62500fach vergrößert ist und durch die Anhäufung von Goldkügelchen in Lysosomen in vivo gekennzeichnet ist.
  • 14 zeigt eine in vivo Dosis-Wirkungs-Studie der Wirkungen von Cytochalasin B auf den Lumeninhalt von Oberschenkelarterien von Schweinen.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Wie hierin verwendet besitzen die folgenden Begriffe die unten ausgeführten Bedeutungen:
    "Therapeutisches Konjugat" meint ein Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel oder interstitielle Matrix, das (z.B. wahlweise über einen Linker) mit einem therapeutischen Mittel gekoppelt ist.
  • "Target" bzw. "Ziel" und "Marker" werden bei der Beschreibung der Konjugat-Aspekte der vorliegenden Erfindung austauschbar verwendet und meinen ein Molekül, das auf spezifische Weise durch das Bindungsprotein für Matrix oder vaskuläre glatte Muskulatur erkannt wird, z.B. ein Antigen, ein Polypeptidantigen oder ein Zelloberflächen-Kohlenhydrat (z.B. ein Glykolipid, ein Glykoprotein oder ein Proteoglykan), das auf den Zelloberflächenmembranen einer glatten vaskulären Muskelzelle oder einer Matrixstruktur exprimiert wird.
  • "Epitop" wird in Bezug auf eine spezifische Stelle innerhalb des "Ziel"-Moleküls verwendet, das von dem Bindungsprotein für Matrix oder glatten Muskel gebunden wird, z.B. eine Sequenz von drei oder mehr Aminosäuren oder Sacchariden.
  • "Gekoppelt" wird so verwendet, dass eine kovalente oder nichtkovalente chemischen Assoziierung (d.h. hydrophob durch van der Waals-Kräfte oder Ladungs-Ladungswechselwirkungen) des Bindungsproteins für Matrix oder vaskulären glatten Muskel mit dem therapeutischen Mittel gemeint ist. Aufgrund der Natur der verwendeten therapeutischen Mittel werden die Bindungsproteine normalerweise mittels kovalenter Bindung mit den therapeutischen Mitteln assoziiert bzw. mit diesen verbunden.
  • "Linker" meint ein Mittel, das das Bindungsprotein für Matrix oder glatten Muskel an ein therapeutisches Mittel koppelt, z.B. einen organischen chemischen Koppler.
  • "Migration" glatter Muskelzellen meint die Bewegung dieser Zellen in vivo aus den medialen Schichten eines Gefäßes in die Intima, wie sie auch in vitro durch Verfolgen der Bewegung einer Zelle von einem Ort zu einem anderen studiert werden kann (z.B. mittels Zeitverlauf-Filmaufnahmen oder eines Videorekorders oder manueller Zählung der glatten Muskelzellmigration aus einer definierten Fläche in der Gewebekultur über die Zeit).
  • "Proliferation", d.h. glatter Muskelzellen oder Krebszellen, bedeutet Ansteigen der Zellzahl, d.h. durch Mitose der Zellen.
  • "Exprimiert" meint mRNA-Transkription und -Translation mit der daraus folgenden Synthese, Glykosylierung und/oder Sekretion eines Polypeptids durch eine Zelle, z.B. CSPG, das durch eine glatte Gefäßmuskelzelle oder eine Perizyte synthetisiert wird.
  • "Makrozyklisches Trichothecen" soll irgendeines aus der Gruppe strukturell verwandter sesquiterpenoider makrozyklischer Mycotoxine bedeuten, die durch verschiedene Pilzarten hergestellt werden und die durch die 12,13-Epoxytrichothec-9-en-Grundstruktur gekennzeichnet sind, z.B. Verrucarine und Roridine, welche die Produkte von Sekundärmetabolismus der Bodenpilze Myrothecium verrucaria und Myrothecium roridium sind.
  • "Retard-" bzw. "Depot-" bzw. "Dauerfreisetzung-" meint eine Dosierungsform, die so gestaltet ist, dass ein therapeutisches Mittel aus ihr über eine Zeitspanne ausgeschüttet wird bzw. aus dieser freigesetzt wird, die von ungefähr 3 bis ungefähr 21 Tagen reicht. Die Ausschüttung über eine längere Zeitspanne wird auch als erfindungsgemäße "Retard"-Dosierungsform angesehen.
  • "Dosierungsform" meint eine freie (nicht-gezielte oder nicht mit einem Bindungspartner assoziierte) Formulierung eines therapeutischen Mittels sowie therapeutische Retard-Formulierungen, wie jene, die mikropartikuläres oder nanopartikuläres, bioabbaubares oder nicht-bioabbaubares polymeres Material enthalten, das in der Lage ist, an ein oder mehrere Bindungsproteine oder -peptide zu binden, um eine darin dispergierte therapeutische Gruppierung zu einer Zielzellpopulation zu transportieren.
  • "Staurosporin" umfasst Staurosporin, einen Proteinkinase C-Inhibitor der folgenden Formel
    Figure 00160001
    sowie Diindoloalkaloide mit einer der folgenden allgemeinen Strukturen:
    Figure 00160002
  • Genauer umfasst der Begriff "Staurosporin" K-252 (siehe z.B. japanische Patentanmeldung 62,164,626), BMY 41950 (US-Patent 5,015,578), UCN-01 (US-Patent 4,935,415), TAN-999 (japanische Patentanmeldung 01,149,791), TAN-1030A (japanische Patentanmeldung 01,246,288), RK-286C (japanische Patentanmeldung 02,258,724) und deren funktionelle Äquivalente und Derivate. Derivate von Staurosporin umfassen jene, die in den japanischen Patentanmeldungen 03,72,485; 01,143,877; 02,09,819 und 03,220,194 besprochen sind, sowie jene in den internationalen PCT-Anmeldungen WO8907105 und WO9109034, und den europäischen Patentanmeldungen EP410,389 und EP296,110 . Derivate von K-252, einem natürlichen Produkt, sind bekannt. Siehe z.B. japanische Patentanmeldungen 63,295,988; 62,240,689; 61,268,687; 62,155,284; 62,155,285; 62,120,388 und 63,295,589, sowie die internationale PCT-Anmeldung WO8807045 und die europäische Patentanmeldung EP 323,171 .
  • "Cytochalasin" umfasst Pilzstoffwechselprodukte, die eine inhibitorische Wirkung auf den Zielzellmetabolismus zeigen, einschließlich Verhinderung der Kontraktion oder Migration glatter vasculärer Muskelzellen. Bevorzugt inhibieren Cytochalasine die Polymerisation von monomerem Actin (G-Actin) zur polymeren Form (F-Actin), um hierdurch die Zellfunktionen zu inhibieren, die zytoplasmatische Mikrofilamente erfordern. Cytochalasine sind typischerweise von Phenylalanin (Cytochalasine), Tryptophan (Chaetoglobosine) oder Leuzin (Aspochalasine) abgeleitet, was zu einer Benzyl-, Indo-3-ylmethyl- oder Isobutylgruppe führt, und zwar jeweils an der Position C-3 einer substituierten Perhydroisoindol-1-on-Gruppierung (Formel V oder VI).
  • Figure 00180001
  • Die Perhydroisoindolgruppierung umfasst umgekehrt einen 11, 13 oder 14 Atome umfassenden carbozyklischen oder sauerstoffenthaltenden Ring, der an Positionen C-8 und C-9 kondensiert ist. Alle natürlich auftretenden Cytochalasine enthalten eine Methylgruppe bei C-5; eine Methyl- oder Methylengruppe bei C-12; und eine Methylgruppe bei C-14 oder C-16. Beispielhafte Moleküle umfassen Cytochalasin A, Cytochalasin B, Cytochalasin D, Cytochalasin E, Cytochalasin F, Cytochalasin G, Cytochalasin H, Cytochalasin J, Cytochalasin K, Cytochalasin L, Cytochalasin M, Cytochalasin N, Cytochalasin O, Cytochalasin P, Cytochalasin Q, Cytochalasin R, Cytochalasin S, Chaetoglobosin A, Chaetoglobosin B, Chaetoglobosin C, Chaetoglobosin D, Chaetoglobosin E, Chaetoglobosin F, Chaetoglobosin G, Chaetoglobosin J, Chaetoglobosin K, Deoxaphomin, Proxiphomin, Protophomin, Zygosporin D, Zygosporin E, Zygosporin F, Zygosporin G, Aspochalasin B, Aspochalasin C, Aspochalasin D und ähnliche, sowie deren funktionelle Äquivalente und Derivate. Bestimmte Cytochalasin-Derivate sind in den japanischen Patenten 72 01,925; 72 14,219; 72 08,533; 72 23,394; 72 01924; und 72 04,164 ausgeführt. Cytochalasin B wird in dieser Beschreibung als Prototyp für ein Cytochalasin verwendet.
  • Glatte Muskelzellen und Pericyten, umfassen, wenn hierin auf sie Bezug genommen wird, jene Zellen, die aus den medialen Schichten der Gefäße und der Adventitiengefäße abgeleitet sind, welche in intimalen hyperplastischen vaskulären Stellen infolge einer Verletzung proliferieren, wie jene, die während einer PTCA verursacht werden.
  • Die Eigenschaften glatter Muskelzellen umfassen die histologische Morphhologie (bei lichtmikroskopischer Untersuchung) einer Spindelform mit einem verlängerten Kern, der zentral in der Zelle liegt, mit vorhandenen Nucleoli und Myofibrillen im Sarcoplasma. Bei elektronenmikroskopischer Untersuchung weisen glatte Muskelzellen lange schlanke Mitochondrien in dem juxtanuklearen Sarcoplasma auf, einige wenige tubuläre Elemente des granulären endoplasmatischen Retikulums und zahlreiche Gruppen freier Ribosomen. Ein kleiner Golgi-Komplex kann sich in der Nähe eines Pols des Kerns befinden. Der Großteil des Sarcoplasma wird von dünnen parallelen Myofilamenten eingenommen, die zum größten Teil in der Längsachse der Muskelzelle orientiert sein können. Diese Actin-haltigen Myofibrillen können in Bündeln angeordnet sein, mit eingestreuten Mitochondrien. Verteilt durch die kontraktive Substanz der Zelle können auch ovale dichte Bereiche vorhanden sein, mit ähnlich dichten Bereichen, die in Intervallen längs den Innenaspekten des Plasmalemma verteilt sind.
  • Eigenschaften von Perizyten umfassen die histologische Morphologie (bei lichtmikroskopischer Untersuchung), die durch eine unregelmäßige Zellform gekennzeichnet ist. Perizyten findet man innerhalb der Basalmembran, die vaskuläre endotheliale Zellen umgibt, und ihre Identität kann durch eine positive Immunfärbung mit Antikörpern, die für Alpha-Actin glatter Muskelzellen (bspw. Anti-Alpha-sm1, Biomakor, Rehovot, Israel), HMW-MAA und Perizyten-Gangliosid-Antigene wie MAb 3G5 (11) spezifisch sind bestätigt werden; und durch negative Immunfärbung mit Antikörpern gegen Cytokeratine (d.h. epitheliale und Fibroblasten-Marker) und van Willebrandt-Faktor (d.h. einen endothelialen Marker). Sowohl vaskuläre glatte Muskelzellen als auch Perizyten sind in der Immunfärbung mit dem monoklonalen NE-AN-01-Antikörper positiv.
  • Die erfindungsgemäßen Stents sind nützlich bei der Inhibierung der Aktivität von vaskulären glatten Muskelzellen, z.B. bei der Verminderung, Verzögerung oder Beseitigung einer Stenose nach Angioplastie. Wie hierin verwendet meint der Begriff "Verminderung" die Verringerung der intimalen Verdickung, die aus der Stimulation der glatten Muskelzellproliferation nach Angioplastie folgt, entweder in einem Tiermodell oder bei einem Menschen. "Verzögern" meint die Verzögerung der Zeit bis zum Einsetzen einer sichtbaren intimalen Hyperplasie (z.B. histologisch beobachtet oder durch angiographische Untersuchung) nach Angioplastie, und kann auch von einer "verminderten" Restenose begleitet sein. "Beseitigung" oder "Eliminieren" oder „Ausmerzen" der Restenose nach Angioplastie bedeutet das vollständige "Vermindern" und/oder vollständige "Verzögern" der Intimahyperplasie in einem Patienten in einem Ausmaß, das es nicht länger notwendig macht, chirurgisch zu intervenieren, d.h. einen geeigneten Blutfluss durch das Gefäß durch wiederholte Angioplastie, Atherectomie oder Coronararterien-Bypassoperation wiederherzustellen. Die Wirkungen des Vermindern, Verzögern oder Beseitigen einer Stenose können durch Verfahren bestimmt werden, die für den Fachmann Routine sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Angiographie, Ultraschalluntersuchung, fluoroskopische Bilddarstellung, endoskopische Faseroptikuntersuchung oder Biopsie und Histologie. Die erfindungsgemäßen therapeutischen Konjugate erzielen diese vorteilhaften Wirkungen, indem sie spezifisch an die Zellmembranen glatter Muskelzellen und Pericyten binden.
  • Therapeutische Konjugate der Erfindung erhält man durch Kopplung eines Bindungsproteins für vaskuläre glatte Muskeln an ein therapeutisches Mittel. In dem therapeutischen Konjugat führt das Bindungsprotein für vaskuläre glatte Muskulatur die Funktion der Zielführung (bzw. des Targetings) des therapeutischen Konjugats zu den vaskulären glatten Muskelzellen oder Pericyten aus, und das therapeutische Mittel führt die Funktion aus, die Zellaktivität der glatten Muskelzelle oder des Pericyts zu inhibieren.
  • Erfindungsgemäße therapeutische Dosierungsformen (vom Retardtyp) besitzen die Fähigkeit, den therapeutischen Mittel über eine langgezogene Zeitspanne an Zielzellen abzugeben. Therapeutische Dosierungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung können in irgendeiner Konfiguration vorliegen, die für diesen Zweck geeignet ist. Bevorzugte therapeutische Retarddosierungsformen zeigen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften:
    • – eine mikropartikuläre (z.B. von ungefähr 0,5 Mikrometer bis ungefähr 100 Mikrometer Durchmesser, wobei von ungefähr 0,5 bis ungefähr 2 Mikrometer bevorzugt ist) oder nanopartikuläre (z.B. von ungefähr 1,0 Nanometer bis ungefähr 1000 Nanometer Durchmesser, wobei von ungefähr 50 bis ungefähr 250 Nanometer bevorzugt ist) freifließende Pulverstruktur;
    • – bioabbaubare Struktur, die so gestaltet ist, dass sie über eine Zeitspanne zwischen ungefähr 3 bis ungefähr 180 Tagen biologisch abgebaut wird, wobei von ungefähr 10 bis ungefähr 20 Tagen bevorzugt ist, oder nicht-bioabbaubare Struktur, um eine Diffusion eines therapeutischen Mittels über eine Zeitspanne zwischen ungefähr 3 und ungefähr 180 Tagen zu ermöglichen, wobei von ungefähr 10 bis ungefähr 21 Tagen bevorzugt ist;
    • – biokompatibel mit Zielgewebe und der lokalen physiologischen Umgebung, in welche die Dosierungsform verabreicht wird, einschließlich biokompatiblen Bioabbauprodukten;
    • – Erleichterung einer stabilen und reproduzierbaren Verteilung eines therapeutischen Mittels, bevorzugt unter Bildung einer therapeutisches Mittel-Polymer-Matrix, wobei die Freisetzung des therapeutischen Mittels auf einer oder beiden der folgenden Routen stattfindet: (1) Diffusion des therapeutischen Mittels durch die Dosierungsform (wenn das therapeutische Mittel in dem Polymer oder Polymergemisch löslich ist, das die Dosierungsform bildet); oder (2) Freisetzung des therapeutischen Mittels als die biologische Abbauprodukte der Dosierungsform; und
    • – Fähigkeit, an ein oder mehrere zelluläre und/oder interstitielle Matrixepitope zu binden, wobei von ungefähr 1 bis ungefähr 10.000 Bindungsprotein/-peptid-Dosierungsform-Bindungen bevorzugt ist, und wobei ein Maximum von ungefähr einer Bindungspeptid-Dosierungsform pro 150 Quadratångström der Partikeloberfläche mehr bevorzugt ist. Die gesamte Bindungszahl ist von der eingesetzten Partikelgröße abhängig. Die Bindungsproteine oder -peptide sind in der Lage, die partikuläre therapeutische Dosierungsform durch kovalente Ligandensandwichstrukturen oder nichtkovalente Modalitäten zu koppeln, wie hierin ausgeführt.
  • Nanopartikuläre therapeutische Retarddosierungsformen der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind bioabbaubar und binden an die vaskulären glatten Muskelzellen und dringen in diese Zellen primär durch Endozytose ein. Der biologische Abbau dieser Nanopartikel erfolgt über die Zeit (z.B. 10 bis 21 Tagen) in prälysosomischen Vesikeln und Lysosomen. Die bevorzugten größeren therapeutischen mikropartikulären Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung binden an die Zielzelloberfläche oder die interstitielle Matrix in Abhängigkeit des gewählten Bindungsproteins oder -peptids und gegeben die therapeutischen Mittel zur anschließenden Aufnahme durch die Zielzelle frei, wobei nur wenige der kleineren Mikropartikel durch Phagozytose in die Zelle eindringen. Ein Fachmann wird anerkennen, dass der präzise Mechanismus, über den eine Zielzelle eine Dosierungsform der vorliegenden Erfindung aufnimmt und metabolisiert, von der Morphologie, Physiologie und den metabolischen Prozessen dieser Zellen abhängig ist.
  • Die Größe der zielgerichteten therapeutischen partikulären Retarddosierungsformen ist auch im Hinblick auf die Art der zellulären Aufnahme wichtig. Bei spielsweise können die kleineren Nanopartikel mit der interstitiellen Flüssigkeit zwischen die Zellen fließen und in das infundierte Gewebe eindringen, bis sie an das normale oder neoplastische Gewebe binden, welches für die Zielausrichtung durch das Bindungsprotein/-peptid ausgewählt wurde. Dieses Merkmal ist z.B. wichtig, weil die Nanopartikel den lymphatischen Drainagekanälen von infundierten primären neoplastischen Foci folgen, was eine Zielausrichtung auf metastatische Zielfoci entlang des lymphatischen Systems bewirkt. Die größeren Nanopartikel tendieren dazu, leichter in dem infundierten Primärgewebe interstitiell festgehalten zu werden.
  • Bevorzugte Retarddosierungsformen der vorliegenden Erfindung sind bioabbaubare Mikropartikel oder Nanopartikel. Bevorzugter sind bioabbaubare Mikropartikel oder Nanopartikel aus einer polymerenthaltenden Matrix geformt, die durch zufällige, nicht-enzymatische, hydrolytische Spaltung biologisch abgebaut wird, und zwar unter Freisetzung des therapeutischen Mittels, wobei Poren innerhalb der Partikelstruktur gebildet werden.
  • Polymere, die aus der Kondensation von Alpha-Hydroxycarbonsäuren und zugeordneten Lactonen abgeleitet sind, sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Eine besonders bevorzugte Gruppierung ist aus einem Gemisch thermoplastischer Polyester (z.B. Polylactiden oder Polyglycoliden) oder einem Copolymer aus Lactiden- und Glycoliden-Komponenten geformt, wie ewta Poly(lactid-co-glycolid). Eine beispielhafte Struktur, ein zufälliges Poly-(DL-lactid-co-glycolid), ist unten gezeigt, wobei die Werte von x und y vom Fachmann eingestellt werden können, um wünschenswerte Mikropatikel- und Nanopartikel-Eigenschaften zu erreichen.
  • Figure 00230001
  • Andere Mittel, die für die Bildung von Partikel-Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Polyorthoester und Polyacetale (Polymer Letters, 18: 293, 1980) und Polyorthocarbonate (U.S. Patent 4,093,709) und ähnliche.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Milchsäure-/Glycolsäure-Polymere enthaltende Matrixpartikel werden durch emulsionsbasierte Verfahren hergestellt, die modifizierte Lösungsmittelxtraktionsprozesse darstellen, wie jene beschrieben von Cowsar et al., "Poly(Lactide-Co-Glycolide) Microcapsules for Controlled Release of Steroids", Methods Enzymology, 112: 101-116, 1985 (Steroideinschluss in Mikropartikeln); Eldridge et al., "Biodegradable and Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid which enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies", Infection and Immunity, 59: 2978-2986, 1991 (Toxoid-Einschluss); Cohen et al., "Controlled Delivery Systems for Proteins based on Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres", Pharmaceutical Research, 8(6): 713-720, 1991 (Enzymeinschluss); und Sanders et al., "Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres", J. Pharmaceutical Science, 73(9): 1294-1297, 1984 (Peptideinschluss).
  • Allgemein umfasst das Verfahren zur Bildung von Partikeldosierungsformen der vorliegenden Erfindung das Lösen des Polymers in einem halogenierten Kohlenwasserstofflösungsmittel, Dispergieren einer (bevorzugt wässrigen) Lösung des therapeutischen Mittels in demselben, und Hinzufügen eines zusätzlichen Mittels, das als Lösungsmittel für das halogenierte Kohlenwasserstofflösungsmittel wirkt, jedoch nicht für das Polymer. Das Polymer fällt aus der – halogenierten Kohlenwasserstoff- Polymer -Lösung in Tröpfchen in die therapeutisches Mittel enthaltende Lösung aus und schließt das therapeutische Mittel ein. Bevorzugt wird das therapeutische Mittel im Wesentlichen gleichmäßig in der Retarddosierungsform der vorliegenden Erfindung dispergiert. Nach der Partikelbildung werden sie mit einem organischen Lösungsmittel gewaschen und gehärtet. Es folgen Waschschritte mit Wasser und mit wässrigem nichtionischem oberflächenaktiven Mittel bevor bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet wird.
  • Für Biokompatibilitätszwecke werden Partikeldosierungsformen, gekennzeichnet durch darin in Matrixform dispergiertes therapeutisches Mittel, vor der Verpackung, Lagerung oder Verabreichung sterilisiert. Die Sterilisation kann auf jeder hierfür geeigneten Art und Weise voregnommen werden. Beispielsweise können die Partikel mit Gammastrahlen bestrahlt werden, vorausgesetzt dass das Aussetzen gegenüber dieser Strahlung die Struktur oder Funktion des therapeutischen Mittels, das in der Matrix aus therapeutischem Mittel und Polymer dispergiert ist, oder des daran anhängenden Bindungsproteins/-peptids nicht nachteilig beeinflusst. Wenn das therapeutische Mittel oder das Bindungsprotein/-peptid derart nachteilig beeinflusst werden, können die Partikeldosierungsformen unter sterilen Bedingungen hergestellt werden.
  • Die Freisetzung des therapeutischen Mittels aus den erfindungsgemäßen Partikeldosierungsformen kann als Ergebnis von sowohl Diffusion als auch Erosion der Partikelmatrix geschehen. Die Bioabbaurate beeinflusst direkt die Freisetzungskinetik des therapeutischen Mittels. Die biologische Abbaurate ist regelbar durch Veränderung der Zusammensetzung und der Struktur der Retarddosierungsform. Beispielsweise kann eine Veränderung des Lactid/Glycolid-Verhältnisses in bevorzugten Dosierungsformen der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden, wie beschrieben bei Tice et al., "Biodegradable Controlled-Release Parenteral Systems", Pharmaceutical Technology, S. 26-35, 1984; durch Einschluss von Polymerhydrolyse-modifizierenden Mitteln, wie etwa Zitronensäure und Natriumcarbonat, wie beschrieben bei Kent et al., "Microencapsulation of Water Soluble Active Polypeptides", U.S. Patent 4,675,189; durch Verändern der Beladung des therapeutischen Mittels im Lactid/Glycolidpolymer, wobei die Abbaurate umgekehrt proportional zur Menge des darin enthaltenen therapeutischen Mittels ist, sowie durch sorgfältige Auswahl eines geeigneten Analogons einer gemeinsamen Familie therapeutischer Mittel, die unterschiedliche Wirksamkeiten aufweisen, um die Kernbeladungen zu verändern; und durch Verändern der Partikelgröße, wie beschrieben in Beck et al., "Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide)/Norethisterone Microcapsules: An Injectable Biodegradable Contraceptive", Biol. Reprod., 28: 186-195, 1983, oder ähnliches. Alle oben genannten Verfahren zur Regulation der Bioabbaurate beeinflussen die intrinsische Viskosität der Polymer-enthaltenden Matrix, wobei deren Hydrierungsrate verändert wird.
  • Die bevorzugte Lactid/Glycolid-Struktur ist mit der physiologischen Umgebung eines Säugers biokompatibel. Zudem haben die bevorzugten Retarddosierungsformen den Vorteil, dass deren Bioabbau Milchsäure und Glycolsäure erzeugt, beide normale Stoffwechselprodukte von Säuger.
  • Funktionelle Gruppen, die erforderlich sind, damit um Bindungen von Bindungsprotein/-peptid-Partikeldosierungsform an die Partikel zu knüpfen, sind wahlweise von der Partikelstruktur umfasst, zusammen mit den nicht-abbaubaren oder bioabbaubaren Polymereinheiten. Funktionelle Gruppen, die zu diesem Zweck nützlich sind, umfassen jene, die mit Peptiden reagieren können, wie Carboxylgruppen, Amingruppen, Sulfhydrylgruppen und ähnliche. Bevorzugte bindungsverstärkende Gruppierungen umfassen die terminalen Carboxylgruppen der bevorzugten (Lactid-Glycolid)-Polymer-enthaltenden Matrix oder ähnliche.
  • Ein nützliches Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel ist eine Polypeptid-, peptidische oder mimetische Verbindung (wie unten beschrieben), die in der Lage ist, an ein Ziel oder einen Marker auf einer Oberflächenkomponente einer intakten oder zerstörten vaskulären glatten Muskelzelle auf eine Weise zu binden, die entweder die Freisetzung des therapeutischen Mittels extrazellulär untmittelbar in die interstitielle Matrix mit anschließender Diffusion des therapeutischen Mittels in die verbleibenden intakten vaskulären glatten Muskelzellen und/oder die Aufnahme durch die Zelle in ein intrazelluläres Kompartiment der gesamten zielgerichteten bioabbaubaren Komponente erlaubt, was die Zuführung des therapeutischen Mittels gestattet. Repräsentative Beispiele nützlicher Bindungsproteine für vaskulären glatten Muskel umfassen Antikörper (z.B. monoklonale oder polyklonale affinitätsgereinigte Antikörper), F(ab')2-, Fab'-, Fab- und Fv-Fragmente und/oder Komplementaritätsbestimmende Bereiche (CDRs) von Antikörpern oder funktionelle Äquivalenten von diesen (z.B. Bindungspeptide und ähnliche); Wachstumsfaktoren, Zytokine und Polypeptidhormone und ähnliche; und Makromoleküle, die extrazelluläre Matrixrezeptoren erkennen (z.B. Integrin- und Fibronectin-Rezeptoren und ähnliche).
  • Andere bevorzugte Bindungspeptide, die für die Zielausrichtung der Dosierungsformausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen jene, die im intrazellulären Stoma und der Matrix lokalisiert sind, die sich zwischen und unter den vaskulären glatten Muskelzellen befinden. Diese Bindungspeptide transportieren das therapeutische Mittel zu dem interstitiellen Raum zwischen den Zielzellen. Das therapeutische Mittel wird in solche interstitiellen Räume zur anschließenden Aufnahme durch die vaskulären glatten Muskelzellen freigesetzt. Bevorzugte Bindungspeptide dieses Typs sind Epitopen auf Kollagen, extrazellulären Glykoproteinen, wie etwa Tenascin, Reticulum und elastischen Fasern und anderem interzellulären Matrixmaterial zugeordnet.
  • Bevorzugte Tumorzell-bindende Peptide sind Epitopen von myc-, ras-, bcr/Ab1-, erbB und ähnlichen Genprodukten, sowie Mucinen, Cytokinrezeptoren wie IL-6, EGF, TGF und ähnlichen, zugeordnet, wobei die Bindungspeptide an bestimmten Lymphomen (myc), Karzinomen wie Kolonkrebs (ras), Karzinomen (erbB), Adenokarzinomen (Mucine), Brustkrebs und Hepatomen (IL-6-Rezeptor), bzw. Brustkrebs (EGF und TGF) lokalisiert sind. Bevorzugte an Immunsystem- Effektorzellen bindende Peptide sind anti-TAC, IL-2 und ähnliche, welche an aktivierten T-Zellen bzw. Makrophagen lokalisiert werden. Andere bevorzugte Bindungsproteine/-petide, die in der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Gruppierungen, die in der Lage sind, sich an pathologisch proliferierenden normalen Geweben zu platzieren, wie Perizyten des intraokularen Gefäßnetzes, das in degenerative Augenerkrankungen verwickelt ist.
  • Erfindungsgemäße therapeutische Mittel werden dazu ausgewählt, die zelluläre Aktivität einer vaskulären glatten Muskelzelle zu inhibieren, z.B. Proliferation, Migration, Zunahme im Zellvolumen, Zunahme in der Synthese extrazellulärer Matrix (z.B. Kollagene, Proteoglycane und ähnliche) oder Sezernieren extrazellulärer Matrixmaterialien durch die Zelle. Das therapeutische Mittel wirkt als "zytostatisches Mittel', um die Zellteilung in proliferierenden Zellen zu verhindern oder zu verzögern, indem die DNA-Replikation inhibiert wird (z.B. durch ein Medikament, wie Adriamycin, Staurosporin oder ähnliche) oder durch Inhibieren der Spindelfaserbildung (z.B. ein Arzneimittel, wie Colchicin) und ähnliche.
  • Repräsentative Beispiele "zytostatischer Mittel" umfassen z.B. modifizierte Toxine, Methotrexat, Adriamycin, Radionuklide (z.B. etwa jene, die offenbart sind in Fritzberg et al., U.S. Patent 4,897,255), Proteinkinaseinhibitoren (z.B. Staurosporin), Inhibitoren spezifischer Enzyme (z.B. wie die Kernenzyme DNA-Topoisomerase II und DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Adenylguanylcyclase), Superoxiddismutaseinhibitoren, terminale Desoxynucleotidyltransferase, reverse Transkriptase, Antisense-Oligonukleotide, welche die Proliferation vaskulärer glatter Muskelzellen und ähnliches unterdrücken, die, wenn sie in ein Zellkompartiment mit geeigneter Dosierung eingebracht werden, die Wirkung haben, die Proliferation einer vaskulären glatten Muskelzelle oder eines Pericyten zu beeinträchtigen, ohne die Zelle zu töten. Andere Beispiele für "zytostatische Mittel" umfassen peptidische oder mimetische Inhibitoren (d.h. Antagonisten, Agonisten oder kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren) zellu lärer Faktoren, die (z.B. in Gegenwart extrazellulärer Matrix) die Proliferation vasculärer glatter Muskelzellen oder Pericyten auslösen können; z.B. Cytokine (z.B. Interleukine, wie IL-1), Wachstumsfaktoren (z.B. PDGF, TGF-alpha oder -beta, Tumornekrosefaktor, von glatten Muskeln und Endothel abgeleitete Wachstumsfaktoren, z.B. Endothelin, FGF), Homingrezeptoren (z.B. für Blutplättchen oder Leukozyten) und extrazelluläre Matrixrezeptoren (z.B. Integrine). Repräsentative Beispiele nützlicher therapeutischer Mittel in dieser Kategorie zytostatischer Mittel für die glatte Muskelproliferation umfassen: Unterfragmente von Heparin, Triazolpyrimidin (Trapidil; ein PDGF-Antagonist), Lovastatin und Prostaglandine E1 oder I2.
  • Für die erfindungsgemäßten Ausführungsformen von Retarddosierungsformen sind therapeutische Mittel bevorzugt jene, die die Aktivität vaskulärer glatter Muskelzellen inhibieren, ohne die Zellen zu töten (d.h. zytostatische therapeutische Mittel). Bevorzugte therapeutische Mittel für diesen Zweck zeigen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: Inhibieren der DNA-Synthese vor der Inhibierung der Proteinsynthese, oder Inhibierung der Migration der vaskulären glatten Muskelzellen in die Intima. Diese therapeutischen Mittel inhibieren die Proteinsynthese nicht signifikant (d.h. sie töten die Zielzellen nicht), und erleichtern daher die zelluläre Reparatur und Matrixproduktion, um die Gefäßwandläsion zu stabilisieren, die durch Angioplastie hervorgerufen wird, um hierdurch die glatte Muskelzellproliferation zu vermindern.
  • Beispiele für solche bevorzugten therapeutischen Mittel sind Proteinkinaseinhibitoren, wie Staurosporin (Staurosporin ist erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), Cytochalasine, wie Cytochalasin B (Sigma Chemical Co.) und Suramin (FBA Pharmaceuticals, West Haven, Connecticut), sowie Nitroglycerin (DuPont Pharmaceuticals, Inc. Manuti, Puerto Rico) oder deren Analoga oder funktionelle Äquivalente. Diese Verbindungen sind zytostatisch und es wurde von ihnen gezeigt, dass sie eine minimale Inhibierung der Proteinsynthese und Zytotoxizität bei Konzentrationen ausüben, bei denen eine signifikante DNA-Synthesehemmung stattfindet (siehe Beispiel 8 und 10A – 10D). Ein nützliches Protokoll für die Identifikation therapeutischer Mittel, die in den Retarddosierungsformausführungsformen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, ist z.B. in Beispiel 8 ausgeführt. Ein Fachmann ist in der Lage, im Wesentlichen entsprechende experimentelle Protokolle zu gestalten, um eine solche Identifizierung unterschiedlicher Zielzellpopulationen herbeizuführen, wie etwa adhärente einschichtige Zielzelltypen. Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Mittel, die für Krebszellen zytotoxisch sind. Bevorzugte Mittel für diese Ausführungsformen sind Roridin A, Pseudomonas Exotoxin und ähnliche oder deren Analoga oder funktionelle Äquivalente. Eine Vielzahl dieser therapeutischen Mittel, einschließlich Radioisotope und ähnliche, ist identifiziert worden und ist im Stand der Technik bekannt. Zusätzlich sind Protokolle für die Identifikation zytotoxischer Gruppen bekannt und werden in der Technik routinemäßig verwendet.
  • Die Modulierung von Immunsystem-vermittelten Krankheitseffektorzellen kann ebenfalls unter Verwendung der erfindungsgemäßen Retarddosierungsformen erreicht werden. Solch eine Modulation wird bevorzugt im Hinblick auf Krankheiten vorgenommen, die eine Effektorzellpopulation aufweisen, die über eine lokale Verabreichung durch eine Retarddosierungsform zugänglich sind. Therapeutische Gruppierungen mit der entsprechenden Modulationsaktivität, z.B. zytozide, zytostatische, Metabolismus-modulierende oder ähnliche Aktivität bei lymphorektikularen Zellen bei der Behandlung von Arthritis (intraarticuläre Verabreichung), Sprue (Orale Verabreichung), Uveitis und Endophatalmitis (Intraoculare Verabreichung) und Keratitis (Subkonjungtivale Verabreichung), sind unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, identifizierbar. Diese Mittel können auch verwendet werden, um die Hyperaktivität von epithelialen Drüsen und endokrinen Organen, die zu vielen Erkrankungen führt, zu vermindern. Bevorzugte Mittel für diese Ausführungsformen umfassen Roridin A, Pseudomonas Exotoxin, Suramin, Proteinkinaseinhibitoren (z.B. Staurosporin) und ähnliche, oder deren Analoga oder funktionelle Äquivalente.
  • Andere bevorzugte therapeutische Mittel bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung umfassen Gruppierungen, die in der Lage sind, pathologische Proliferation, Migration oder Hyperaktivität normaler Gewebe zu vermindern oder auszuschalten. Beispielhaft für solche therapeutischen Mittel sind jene, die in der Lage sind, Hyperaktivität von Hornhautepithel und Stroma, pathologische Proliferation oder verlängerte Kontraktion von glatten Muskelzellen oder Perizyten des intraocularen Gefäßsystems, das in degenerative Augenerkrankung als Ergebnis von Hyperplasie oder vermindertem Gefäßlumeninhalt verwickelt sind, zu reduzieren oder auszuschalten. Bevorzugte Mittel für diesen Zweck sind Staurosporin und Cytochalasin B.
  • Erfindungsgemäße Bindungsproteine für vaskulären glatten Muskel binden an Targets auf der Oberfläche vaskulärer glatter Muskelzellen. Es wird anerkannt werden, dass spezifische Targets, z.B. Polypeptide oder Kohlenhydrate, Proteoglycane und ähnliche, die mit den Zellmembranen vaskulärer glatter Muskelzellen verbunden sind, zur Auswahl (z.B. durch Klonieren) oder Konstruktion (z.B. durch gentechnische Verfahren oder chemische Synthese) geeigneter spezifischer Bindungsproteine für vaskulären glatten Muskel nützlich sind. Besonders nützliche "Targets" werden durch die glatten Muskelzellen aufgenommen, z.B. wenn der Antigenumsatz von Membranbestandteilen bei der Erneuerung stattfindet. Die Aufnahme durch Zellen kann auch durch Mechanismen erfolgen, die Phagolysosomen, Clathrin-beschichtete Pits, Rezeptor-vermittelte Umverteilung oder Endozytose und ähnliche umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird solch ein "Target" hier beispielhaft durch Chondroitinsulfatproteoglycane (CSPGs) vertreten, synthetisiert durch die vaskulären glatten Muskelzellen und Pericyten, und ein einzelner Teil (hier Epitop) des CSPG-Moleküls mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 250 kD ist besonders bevorzugt. Dieses 250 kD-Target ist ein N-gekoppeltes Glycoprotein, das eine Komponente eines größeren 400 kD-Proteoglycankomplexes ist (14). In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel durch einen monoklonalen NR-AN-01-Antikörper (eine Subkultur von NR-ML-05) breitgestellt, der an ein Epitop in einem CSPG-Zielmolekül von vaskulärem glatten Muskel bindet. Berichten zufolge bindet der NR-ML-05 genannte Antikörper an ein 250 kD CSPG, das durch Melanomzellen synthetisiert wird (Morgan et al., U.S. Patent 4,897,255). Glatte Muskelzellen und Pericyten synthetisieren Berichten zufolge ebenfalls ein 250 kD CSPG und ebenso andere CSPGs (11). NR-ML-05-Bindung an glatte Muskelzellen wurde ebenfalls offenbart (Fritzberg et al., U.S. Patent 4,879,225). Monoklonaler Antikörper NR-ML-05 und Unterkultur NR-ML-05 85-41-41-A2, Gefriercharge # A2106, wurden beide bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt und haben die Hinterlegungsnummern HB-5350 bzw. HB-9350 zugewiesen bekommen. NR-ML-05 ist der Verwandte von Subklon NR-AN-01, der hierin offenbart ist, und dieser ist strukturell und funktionell zu jenem äquivalent. Es wird anerkannt werden, dass NR-AN-01 nur ein Beispiel für ein Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel ist, das spezifisch an das 400 kD-CSPG-Target bindet, und dass auch andere Bindungsproteine, die an dieses Target und andere Epitope in diesem Target binden (14), auch für die therapeutischen Konjugate und Verfahren der Erfindung nützlich sind. Im vorliegenden Fall wurden auch sechs andere monoklonale Maus-Antikörper und zwei humane chimäre monoklonale Antikörper ausgewähl, wie hierin beschrieben, die spezifisch auf das 250 kD-CSPG vaskulärer glatter Muskelzellen abzielen. Die Antikörper scheinen auch durch glatte Muskelzellen nach der Bindung an die Zellmembran aufgenommen zu werden. Immunreaktivitätsstudien haben auch die Bindung des murinen MAbs an das 250 kD Antigen in 45 humanen normalen Geweben und 30 verschiedenen Neoplasmen gezeigt, und einige dieser Ergebnisse wurden bereits offenbart (U.S. Patent 4,879,225). In dieser Offenbarung und anderen humanen klinischen Studien platzierten sich MAbs, die gegen CSPG-250 kD-Antigen gerichtet waren, in vivo an vaskulären glatten Muskelzellen. Ferner wird anerkannt werden, dass die Aminosäurereste, die in der kinetischen Mehrpunktassoziation der monoklonalen NR-AN-01-Antikörper mit einem CSPG-Markerantigenepitop beteiligt sind (d.h. die Aminosäuren, aus denen sich die Komplementaritäts-bestimmenden Regionen zusammensetzen), durch computergestützte molekulare Modellierung bestimmt werden und durch die Verwendung von Mutanten, die eine geänderte Antikörperbindungsaffinität besitzen. Diese Aminosäuren der Bindungsstelle und das dreidimensionale Modell des NR-AN-01 Antigenbindungsorts dienen als molekulares Modell zur Konstruktion funktioneller Äquivalente, z.B. kurzer Polypeptide ("Minimalpolypeptide"), die eine Bindungsaffinität für CSPG haben, das durch vaskuläre glatte Muskelzellen und Pericyten synthetisiert wird.
  • In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform zur Behandlung von Stenose nach gefäßchirurgischen Verfahren, z.B. PTCA, besitzen ausgewählte Bindungsproteine, z.B. Antikörper oder Fragmente, zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung eine Bindungsaffinität von > 104 Liter/Mol für das 250 kD CSPG von vaskulärem glatten Muskel, und auch die Fähigkeit, an glatte Muskelzellen oder Pericyten zu binden und von diesen aufgenommen zu werden.
  • Die dreidimensionale Modellierung ist auch nützlich, um andere funktionelle Äquivalente zu konstruieren, die die Bindung von NR-AN-01 an sein antigenes Epitop nachahmen, z.B. "mimetische" chemische Verbindungen, die die dreidimensionalen Aspekte von NR-AN-01-Bindung an sein Epitop in einem CSPG Zielantigen nachahmen. Wie hier verwendet bezieht sich "Minimalpolypeptid" auf eine Aminosäuresequenz von mindestens sechs Aminosäuren Länge. Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff "mimetisch" auf ein organisches chemisches Polymer, das so konstruiert ist, dass es den geeigneten Zwischenraum für die Bindung an die Aminosäuren von z.B. NR-AN-01-CSPG-Target erreicht, das durch vaskuläre glatte Muskelzellen oder Pericyten synthetisiert wurde.
  • Es wird anerkannt werden, dass die Erfinder auch den Nutzen humaner monoklonaler Antikörper oder "humanisierter" Mausantikörper als Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel in therapeutischen Konjugaten ihrer Erfindung vorschlagen. Zum Beispiel kann ein monoklonaler Mausantikörper "chimärisiert" werden, indem die Nukleotidsequenz, welche die murine Fv-Region (d.h. die die Antigenbindungsstellen enthält) mit einer Nukleotidsequenz, die für eine humane konstante Domänenregion und eine Fc-Region codiert, genetisch rekombiniert wird, z.B. auf ähnliche Weise wie in der europäischen Patentanmeldung EP 0,411,893 A2 offenbart. Es ist erkennbar, dass humanisierte Bindungspartner für vaskuläre glatte Muskelzellen den Vorteil besitzen, die Immunoreaktivität des Antikörpers oder Polypeptids im Wirtsempfänger zu senken, was nützlich sein kann, um dabei in vivo die Halbwertszeit zu erhöhen und die Möglichkeit schädlicher Immunreaktionen zu senken.
  • Ebenfalls werden als nützliche Bindungspeptide für Retarddosierungsformen für Restenosebehandlung der vorliegenden Erfindung jene vorgeschlagen, die im interzellulären Stroma oder der Matrix lokalisiert sind, die sich zwischen und unter den vaskulären glatten Muskelzellen befinden. Solche Bindungspeptide transportieren das therapeutische Mittel zu dem Interstitium zwischen den Zielzellen. Das therapeutische Mittel wird in die interstitiellen Räume zur anschließenden Aufnahme durch die vaskulären glatten Muskelzellen freigesetzt. Bevorzugte Bindungspeptide dieses Typs binden an Epitope auf Kollagen, extrazellulären Glycoproteinen wie Tenascin, Reticulum und elastischen Fasern, Cytokeratin und anderen intrazellulären Matrixkomponenten. Minimalpeptide, mimetische organische chemische Verbindungen, humane oder humanisierte monoklonale Antikörper und ähnliche, die zum intrazellularen Stroma und der Matrix transportiert werden, sind auch als Bindungspeptide in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich. Diese Bindungspeptide können gemäß bekannter Techniken identifiziert und konstruiert oder isoliert werden. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bindet das interstitielle Matrixbindungsprotein an ein Zielepitop mit einer Bindungskon stante von mindestens 10–4 M.
  • Nützliche Bindungspeptide für erfindugnsgemäße Ausführungsformen der Krebsbehandlung umfassen jene, die an Zellmembran- und zytoplasmatische Epitope von Krebszellen binden und ähnliche. Diese Bindungpeptide werden zur Oberflächenmembran von intakten Zellen bzw. internen Epitopen von zerstörten Zellen transportiert, und sie transportieren das therapeutische Mittel für die Aufnahme in die Zielzellen. Minimalpeptide, mimetische organische Verbindungen und humane oder humanisierte Antikörper, die zu den entsprechenden Tumorzelltypen transportiert werden, sind ebenfalls als erfindungsgemäße Bindungspeptide nützlich. Solche Bindungspeptide können entsprechend bekannter Techniken identifiziert und konstruiert oder isoliert werden. Bevorzugte Bindungsproteine dieser Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung binden an ein Zielepitop mit einer Bindungskonstante von mindestens ungefähr 10–6 M.
  • Bindungspeptide für Membran- und zytoplasmatische Epitope und ähnliche, die zu Immunsystem-vermittelten Krankheitseffektorzellen, z.B. Zellen des lymphoretikularen Systems, transportiert werden, sind ebenfalls nützlich, um Retarddosierungsformen der vorliegenden Erfindung zu verabreichen. Das therapeutische Mittel wird zu Zielzellen für dessen Aufnahme in diese mittels solcher Retarddosierungsformen transportiert. Minimalpeptide, mimetische organische Verbindungen und humane oder humanisierte Antikörper, welche zu den entsprechenden Effektorzelltypen transportiert werden, sind ebenfalls nützlich als Bindungspeptide der vorliegenden Erfindung. Solche Bindungspeptide können entsprechend bekannter Techniken identifiziert und kontruiert oder isoliert werden. Bevorzugte Bindungspeptide dieser Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung binden an ein Zielepitop mit einer Bindungskonstante von mindestens 10–6 M.
  • Andere bevorzugte Bindungsproteine oder -peptide, die in der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, enthalten Gruppierungen, die in der Lage sind, zu pathologisch proliferierenden normalen Geweben transportiert zu werden, wie etwa Pericyten der intraokularen Gefäße, die an regenerativer Augenerkrankung beteiligt sind. Das therapeutische Mittel wird in Zielzellen zu dessen Aufnahme in diese mittels solcher Retarddosierungsformen verabreicht. Minimalpeptide, mimetische organische Verbindungen und humane oder humanisierte Antikörper, die an die entsprechenden pathologisch proliferierenden normalen Zelltypen transportiert werden, sind auch als Bindungspeptide der vorliegenden Erfindung nützlich. Diese Bindungspeptide können gemäß bekannten Techniken identifiziert und konstruiert oder isoliert werden. Bevorzugte Bindungspeptide dieser Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung binden an ein Zielepitop mit einer Bindungskonstante von mindestens ungefähr 10–6 M.
  • Repräsentative "Kopplungs"-Verfahren zum Verknüpfen des therapeutischen Mittels durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen mit dem Bindungsprotein für vaskuläre glatte Muskulatur umfassen chemische Verknüpfungen und heterobifunktionelle Verknüpfungs- („Crosslinking")-verbindungen (d.h. "Linker"), die unter Bildung einer Bindung zwischen reaktiven Gruppen (wie etwa Hydroxyl-, Amino-, Amido- oder Sulfhydrylgruppen) in einem therapeutischen Mittel und anderen reaktiven Gruppen (ähnlicher Natur) im Bindungsprotein für vaskuläre glatte Muskulatur reagieren. Diese Bindung kann z.B. eine Peptidbindung, eine Disulfidbindung, eine Thioesterbindung, eine Amidbindung, eine Thioetherbindung und ähnliches sein. In einem veranschaulichenden Beispiel sind Konjugate monoklonaler Antikörper mit Arzneimitteln von Morgan und Foon zusammengefasst (Monoclonal Antibody Therapy to Cancer: Preclinical Models and Investigations, Basic and Clinical Tumor Immunology, Ausg. 2, Kluwer Academic Publishers, Hingham, MA) und von Uhr, J. of Immunol. 133: i-vii, 1984). Ein anderes veranschaulichendes Beispiel, bei dem das Konjugat ein radionukleides zytostatisches Mittel enthält, U.S. Patent 4,897,255, Fritzberg et al., auf das hierin expressis verbis Bezug genommen wird, ist instruktiv im Hinblick auf Kopplungsverfahren, die nützlich sein könnten. In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform enthält das therapeutische Konjugat ein Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel, das kovalent an ein Trichothecen-Arzneimittel gebunden ist. In diesem Fall kann die kovalente Bindung der Kopplung zwischen einer oder mehreren Amino-, Sulfhydryl- oder Carboxylgruppen des Bindungsproteins und a) dem Trichothecen selbst; b) einer Trichothecen-Hemisuccinatcarbonsäure; c) einem Trichothecen-Hemisuccinat (HS)-N-hydroxysuccinimidatester; oder d) Trichothecenkomplexen mit Poly-L-lysin oder irgend einem polymeren Träger gebildet sein. Repräsentative Beispiele für Kopplungsverfahren zur Herstellung therapeutischer Konjugate, welche ein therapeutisches Trichothecenmittel enthalten, sind in den U.S. Patenten 4,906,452 und 4,744,981 beschrieben. Andere Beispiele, die ein Hydrazid zur Bildung einer Schiff'schen Basenkopplung zwischen Bindungsproteinen und Trichothecenen verwenden, sind in der anhängigen U.S. Patentanmeldung 07/415,154 offenbart.
  • Die Auswahl des Kopplungsverfahrens wird durch die Auswahl des Bindungsproteins oder -peptids für vaskulären glatten Muskel, des Bindungsproteins oder -peptids für intestitielle Matrix und des therapeutischen Mittels beeinflusst, und auch durch solche physikalischen Eigenschaften wie z.B. Lagerstabilität und/oder solche biologischen Eigenschaften wie z.B. Halbwertszeit in Zellen und Blut, interzellulärer Kompartimentierungsweg und ähnliches. Zum Beispiel haben in einem derzeit bevorzugten therapeutischen Konjugat Hemisuccinatkonjugate des therapeutischen Roridin A-Mittels eine längere Serumhalbwertszeit als jene von Verrucarin A, und diese erhöhte Stabilität führt zu einer signifikant erhöhten biologischen Aktivität.
  • Die Retard-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein thera peutisches Mittel, das in einer biologisch nicht-abbaubaren oder bioabbaubaren Polymerstruktur dispergiert ist. Solche eine Dispersion wird gemäß des Verfahrens, das von Cowsar et al., "Poly(Lactide-Co-Glycolide) Mirocapsules for Controlled Release of Steroids", Methods Enzymology, 112: 101-116, 1985; Eldridge et al., "Biodegradable and Biocompatible Poly(DL-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres as an Adjuvant for Staphylococcal Enterotoxin B Toxoid Which Enhances the Level of Toxin-Neutralizing Antibodies", Infection and Immunity, 59: 2978-2986, 1991; Cohen et al., "Controlled Delivery Systems for Proteins Based an Poly(Lactic/Glycolic Acid) Microspheres", Pharmaceutical Research, 8(6): 7113-720, 1991; und Sanders et al., "Controlled Release of a Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Analogue from Poly(D,L-Lactide-Co-Glycolide) Microspheres", J. Pharmaceutical Science, 73(9): 1294-1297, 1984, beschrieben wurde, durchgeführt.
  • Der physikalische und chemische Charakter der Retarddosierungsform der vorliegenden Erfindung ist verschiedenen alternativen Anbringungsarten an Bindungsproteinen oder -peptiden zugänglich. Dosierungsformen (Retardtyp) der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, an Bindungsproteine/-peptide z.B. durch kovalente Bindungen, intermediäre Ligandensandwichanlagerung oder nicht-kovalente Adsorption oder partiellen Einschluss zu binden. Wenn die bevorzugten Polylaktid-/glycolid-Partikel mit dem darin dispergierten therapeutischen Mittel gebildet werden, ist das ungeladene Polymer-Rückgrat sowohl einwärts orientiert (mit dem darin enthaltenen quasilipophilen therapeutischen Mittel) als auch auswärts entlang einem Großteil der terminalen Carboxylgruppen. Diese Oberflächencarboxylgruppen können als kovalente Bindungsstellen (z.B. durch ein Carbodiimid aktiviert) für nukleophile Gruppen des Bindungsproteins/-peptids dienen. Solche nukleophilen Gruppen enthalten Lysin-epsilonaminogruppen (Amidbindung), Serinhydroxylgruppen (Esterbindung) oder Cysteinmercaptangruppen (Thioesterbindung). Reaktionen mit bestimmten Gruppen sind vom pH-Wert und dem Reduktionszustand der Reaktionsbedingungen abhängig.
  • Zum Beispiel werden Polymilchsäure-/Glycolsäurepartikel, die terminate Carbonsäuregruppen aufweisen, mit N-Hydroxybenztriazol in Gegenwart von wasserlöslichem Carbodiimid der Formel R-N=C=N-R' zur Reaktion gebracht (wobei R eine 3-Dimethylaminopropylgruppe oder ähnliches ist und R' eine Ethylgruppe oder ähnliches ist). Die Benztriazol-derivatisierten Partikel (d.h. aktivierte Imidat-tragende Gruppierungen) werden dann mit einer nukleophilen Protein-/Peptidgruppe zur Reaktion gebracht, wie etwa einer verfügbaren Epsilon-Aminokomponente. Alternativ dazu sind p-Nitrophenol, Tetrafluorphenol, N-Hydroxysuccinimid oder ähnliche Moleküle nützlich, um einen aktiven Ester mit den terminalen Carboxylgruppen der Polymilchsäure-/Glycolsäurepartikel in Gegenwart von Carbodiimid zu bilden. Andere nukleophile Bindungsprotein-/peptidgruppen umfassen Hydroxylgruppen von Serin, endogene freie Thiole von Cystein, Thiolgruppen aus der Reduktion von Bindungsprotein-/-peptiddisulfidbrücken unter Verwendung von Reduktionsmitteln, die zu diesem Zweck allgemein verwendet werden (z.B. Cystein, Dithiotreitol, Mercaptoethanol und ähnliche) und ähnliche. Zusätzlich sind die terminalen Carboxygruppen der Polymilchsäure-/-glycolsäurepartikel aktivierbar durch Reaktion mit Thionylchlorid, unter Bildung einer Acrylchlorid-derivatisierten Gruppe. Die derivatisierten Partikel werden dann mit nukleophilen Bindungspeptid-/-proteingruppen zur Reaktion gebracht, unter Bildung von erfindungsgemäßen zielgerichteten Dosierungsformen.
  • Die direkte Konjugation bzw. Verbindung von Retarddosierungsform und Bindungsprotein oder -peptid kann die Erkennung zwischen Bindungsprotein/-peptid und Zielzellen zerstören. Ligandensandwich-Anheftungstechniken sind nützliche Alternativen, um eine Retarddosierungsform-Bindungsprotein/-peptid-Anheftung zu erreichen. Solche Techniken umfassen die Bildung einer primären Peptid- oder Proteinhülle unter Verwendung eines Proteins, das an die Zielzellpopulation nicht bindet. Das Bindungsprotein/-peptid wird dann an die primäre Peptid- oder Proteinhülle gebunden, um den daraus hervorgehenden Partikel mit funktionellem Bindungsprotein/-peptid bereitzustellen. Ein beispielhafter Ligandensandwichansatz umfasst das kovalente Binden von Avidin oder Streptavidin an die Partikel durch funktionelle Gruppen, wie sie oben in Bezug auf den "direkten" Bindungsansatz beschrieben sind. Das Bindungsprotein oder Peptid wird derivatisiert, bevorzugt minimal, mit funktionalisiertem Biotin (z.B. durch aktiven Ester, Hydrazid, Iodacetal, Maleimidyl oder ähnliche funktionelle Gruppen). Liganden (d.h. Bindungspeptid oder -proteinfunktionalisiertes Biotin)-Bindung an den verfügbaren Biotinbindungsstellen der primären Avidin/Streptavidin-Proteinhülle erfolgt durch die Verwendung einer gesättigten Menge von biotinyliertem Protein/Peptid.
  • Beispielsweise werden Polymilchsäure-/-glycolsäurepartikel, die terminale Carbonsäuregruppen aufweisen, mit Carbodiimid aktiviert und anschließend mit Avidin oder Streptavidin zur Reaktion gebracht. Das Bindungsprotein oder -peptid wird mit Biotinamidcaproat-N-hydroxysuccinimidester bei einem 1-3 molaren Anbieten einer biotinhaltigen Verbindung zu dem Bindungsprotein/-peptid zur Reaktion gebracht, um ein biotinyliertes Bindungsprotein/-peptid zu bilden. Ein molarer Überschuss des biotinylierten Bindungsprotein/-peptids wird mit den Avidin-derivatisierten Partikeln inkubiert, um eine zielgerichtete Dosierungsform der vorliegenden Erfindung zu bilden.
  • Alternativ werden die Partikel- Carboxygruppen biotinyliert (z.B. durch Carbodiimidaktivierung der Carboxygruppe und anschließende Reaktion mit Aminoalkylbiotinamid). Die biotinylierten Partikel werden dann mit einer gesättigten Konzentration (d.h. molarem Überschuss) an Avidin oder Streptavidin inkubiert, um proteinbeschichtete Partikel zu bilden, die freie Biotinbindungsstellen auf weisen. Diese beschichteten Partikel sind dann zu einer Reaktion mit einem molaren Überschuss eines biotinylierten Bindungsproteins in der Lage, das wie oben beschrieben gebildet ist. Eine andere Option umfasst ein Avidin- oder Streptavidin-gebundenes Bindungsprotein oder eine Proteinbindung mit biotinylierten Partikeln.
  • Zusätzlich kann die Bindungsprotein/-peptid-Partielanheftung durch Adsorption des Bindungspeptids an dem Partikel erreicht werden, was aus dem nichtionischen Charakter des teilweise freiliegenden Polymerrückgrats des Partikels folgt. Unter Bedingungen hoher Ionenstärke (z.B. 1,0 molares NaCl) sind Wasserstoff und hydrophobe partikelbindende Protein/Peptidbindung bevorzugt.
  • Außerdem kann das Bindungsprotein/-peptid teilweise in der Partikelpolymermatrix nach deren Bildung eingeschlossen werden. Unter diesen Umständen sorgt das so eingeschlossene Bindungsprotein/-peptid für den selektiven Restbindungscharakter an dem Partikel. Milde Partikelbildungsbedingungen, wie jene, die von Cohen et al., Pharmaceutical Research, 8: 713-720 (1991) verwendet werden, sind für diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Dieses eingeschlossene Bindungsprotein ist auch in der Neuanheftung eines teilweise abgebauten Partikels nützlich, das eine Exozytose durchgemacht hat. Andere polymere Partikeldosierungsformen (z.B. nicht-bioabbaubare Dosierungsformen), die unterschiedliche freiliegende funktionelle Gruppen aufweisen, können an Bindungsproteine oder -peptide gemäß den oben diskutierten Prinzipien gebunden werden.
  • Beispielhafte nicht-bioabbaubare Polymere, die in der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind Polystyrole, Polypropylene, Styrolacrylcopolymere und ähnliche. Solche nicht-bioabbaubaren Polymere umfassen funktionelle Gruppen zum Anhängen von Bindungsprotein/-peptid, einschließlich Carbonsäuregruppen, aliphatische primäre Aminogruppen, aromatische Aminogruppen und Hydroxylgruppen, oder sie können so derivatisiert werden, dass sie diese umfassen.
  • Funktionelle Carbonsäuregruppen werden mit dem Bindungsprotein oder peptid gekoppelt, zum Beispiel unter Verwendung der Reaktionsmechanismen, wie sie oben für bioabbaubare Polymilchsäure/-glycolsäure-Polymerpartikel- Dosierungsformen ausgeführt sind. Zusätzlich können primäre Aminogruppen mit Cyanogenbromid aktiviert werden und mit primären Aminogruppen des Bindungsproteins/-peptids Guanidinbindungen bilden. Aromatische funktionelle Aminogruppen werden zum Beispiel mit salpetriger Säure diazotiert, unter Bildung von Diazoniumgruppierungen, die mit Bindungsprotein/-peptidtyrosinen reagieren, unter Bildung einer Diazobindung zwischen dem nicht-bioabbaubaren Partikel und dem Bindungsprotein/-peptid. Funktionelle Hydroxylgruppen werden mit den primären Aminogruppen des Bindungsproteins/-peptids z.B. dadurch gekoppelt, dass die Hydroxylkomponente in eine terminale funktionelle Carbonsäuregruppe umgewandelt wird. Eine solche Umwandlung kann z.B. durch Reaktion mit Chloressigsäure erreicht werden, gefolgt durch Reaktion mit Carbodiimid. Sandwich-, Adsorptions- und Einschlusstechniken, wie sie oben in Bezug auf bioabbaubare Partikel diskutiert sind, sind auf analoge Weise auf nicht-bioabbaubare Partikel-Bindungsprotein/-peptidfixierung anwendbar.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielausrichtung für potenziell proliferierende Zellen spezifisch, die in vergrößertem glatten Muskel in der Intimaregion einer verletzten Gefäßstelle entstehen, z.B. infolge Angioplastie, z.B. Pericyten und vaskuläre glatte Muskelzellen. Aspekte der Erfindung beziehen sich auf therapeutische Modalitäten, bei denen das therapeutische Konjugat der Erfindung verwendet wird, um Proliferation glatter Muskelzellen nach Angioplastie, z.B. PTCA, Atherektomie und perkutaner transluminaler Coronarrotationatheroblation zu verzögern, zu reduzieren oder zu beseitigen.
  • Retarddosierungsformen einer Ausführungsform der Erfindung müssen nur in einer antiproliferativen therapeutischen Dosierung verabreicht werden, die ausreicht, um die proximalen (6 bis 9) Zelllagen der glatten Tunica media Muskelzellen, die das Lumen begleiten, der Dosierungsform auszusetzen. Die Dosierung ist empirisch bestimmbar, z.B. durch a) Infundieren von Gefäßen aus geeigneten Tiermodellsystemen unter Verwendung immunohistochemischer fluoreszenter oder elektronenmikroskopischer Verfahren zum Erfassen der Dosierungsform und von deren Wirkungen; und b) Durchführen geeigneter in vitro Studien.
  • In einem repräsentativen Beispiel wird diese therapeutisch wirksame Dosis erreicht, indem in einer Gewebekultur glatter Muskelzellen die perizelluluäre Mitteldosis bestimmt wird, was bei kontinuierlicher Exposition zu einer therapeutischen Wirkung zwischen toxischen und minimal wirksamen Dosierungen führt. Dieser therapeutische Spiegel wird an vivo erreicht, indem die Größe, Anzahl und die Konzentration und Freisetzungsrate des therapeutischen Mittels bestimmt wird, die für Partikel erforderlich ist, die zwischen die glatten Muskelzellen der Arterienwand infundiert wird, um diese perizelluluäre therapeutische Dosis aufrecht zu erhalten. Die Dosierungsform sollte das therapeutische Mittel mit einer Rate freisetzen, die ungefähr der perizellulären Dosis der folgenden beispielhaften therapeutischen Mittel entspricht: von ungefähr 0,01 bis ungefähr 100 Mikrogramm/ml Nitroglycerin, von ungefähr 1,0 bis ungefähr 1000 Mikrogramm/ml Suramin, von ungefähr 0,001 bis ungefähr 100 Mikrogramn/ml Cytochalasin, und von ungefähr 0,1 bis ungefähr 105 Nanogramm/ml Staurosporin.
  • Es wird vom Fachmann anerkannt werden, dass die erwünschten therapeutisch wirksamen Dosierungen der erfindungsgemäßen Retarddosierungsformen von verschiedenen Faktoren abhängig sind, einschließlich z.B.: a) Bindungsaffinität des Bindungsproteins, das der Dosierungsform zugeordnet ist; b) Atmosphärendruck und Dauer der Infusion; c) Zeit, über die die verabreichte Dosierungs form an dem Zielort verbleibt; d) Rate der Freisetzung des therapeutischen Mittels aus der Partikeldosierungsform; e) Natur des verwendeten therapeutischen Mittels; f) Natur der Verletzung und/oder der gewünschten Therapie; und/oder g) interzellulären und/oder intrazellulären Lokalisierung der Partikeldosierungsform. Ein Fachmann, die bezüglich der Verabreichung von Medikamenten mit therapeutisch wirksamen Dosierungen ausgebildet ist (z.B. durch Überwachung der Spiegel therapeutischer Mittel und Beobachten der klinischen Wirkungen bei Patienten) sind in der Lage, die optimale Dosierung für einen einzelnen Patienten auf der Basis von Erfahrung und professioneller Beurteilung zu bestimmen.
  • Es wird auch anerkannt werden, dass die Auswahl eines therapeutischen Mittels, das seine Wirkungen intrazellulär entfaltet, z.B. auf Ribosomen- oder DNA-Stoffwechsel, die Dosierung und die Zeit beeinflusst, die erforderlich sind, um eine therapeutisch wirksame Dosis zu erreichen, und dass dieser Prozess in vitro und in Tierstudien im Modell nachgestellt werden kann, wie etwa jenen, die in den unten bereitgestellten Beispielen beschrieben sind, um den Konzentrationsbereich herauszufinden, über den das therapeutische Konjugat oder die Dosierungsform verabreicht werden sollte, um ihre Wirkungen zu entfalten, eine Restenose nach Angioplastie zu verzögern, zu vermindern oder zu verhindern. Zum Beispiel sind therapeutische Konjugate, die mit alpha-, beta- oder gamma-Strahlern bekannter spezifischer Aktivitäten radioaktiv markiert sind (z.B. Millicurie pro Millimol oder Milligramm Protein) nützlich, um die therapeutisch wirksame Dosierung zu bestimmen, und zwar indem diese in Tierstudien und in Humanversuchen verwendet werden, mit quantitativer Bildauswertung oder Autoradiographie histologischer Gewebeschnitte, um die Konzentration des therapeutischen Konjugats zu bestimmen, die für das therapeutische Protokoll erforderlich ist. Eine therapeutisch wirksame Dosis des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform wird erreicht, wenn zumindest drei Bedingungen erfüllt sind: nämlich (1) das therapeutische Konjugat oder die Dosie rungsform wird an die intimalen Schichten des traumatisch verletzten Gefäßes geliefert; (2) das therapeutische Konjugat oder die Dosierungsform wird innerhalb des gewünschten intrazellulären Kompartiments der glatten Muskelzellen verteilt; d.h. im Kompartiment, das zur Wirkung des therapeutischen Mittels erforderlich ist, oder das therapeutische Mittel, das extrazellulär von der Dosierungsform freigesetzt wird, wird innerhalb des relevanten intrazellulären Kompartiments verteilt; und (3) das therapeutische Mittel hemmt die gewünschte zelluläre Aktivität der vaskulären glatten Muskelzelle, z.B. Proliferation, Migration, vergrößertes Zellvolumen, Matrixsynthese, Zellkonzentration und ähnliche, wie oben beschrieben.
  • Zusätzlich kann ein zweites irrelevantes Bindungsprotein für vaskulären glatten Muskel einem Patienten verabreicht werden, bevor ihm ein Stent verabreicht wird, um die unspezifische Bindung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform an Gewebe zu vermindern. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das irrelevante Bindungsprotein ein Antikörper sein, welcher nicht über antigenspezifische Bindung an Stellen im Patienten bindet, sondern stattdessen auf unspezifische Weise bindet, z.B. durch Fc-Rezeptor-bindende reticuloendotheliale Zellen, Asialorezeptorbindung, und durch Bindung an Ubiquitinexprimierende Zellen. Der irrelevante "Blocker" vermindert die unspezifische Bindung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform und vermindert daher Nebenwirkungen, z.B. Gewebetoxzität, die mit der Verwendung des therapeutischen Konjugats oderder Dosierungsform einhergehen. Der irrelevante "Blocker" wird vorteilhafterweise 5 Minuten bis 48 Stunden, insbesondere bevorzugt 15 Minuten bis eine Stunde vor Verabreichung des therapeutischen Konjugats oder der Dosierungsform verabreicht, obwohl die Zeitspanne in Abhängigkeit von dem therapeutischen Konjugat und dem Weg oder der Methode der Injektion unterschiedlich sein kann. Repräsentative Beispiele irrelevanter "Blocker" umfassen Antikörper, die mit Humangewebe und Rezeptoren nicht reagieren, oder zelluläre und Serum-Proteine, die aus tierischen Quellen präpariert sind, so dass bei Tests herausgefunden wird, dass sie nicht in spezifischer Weise (z.B. mit Ka < 103 M–1) an humane Zellmembranziele binden.
  • Es wird anerkannt werden, dass die erfindungsgemäßen Stents nicht auf die Verwendung für die Therapie nach Angioplastie beschränkt sind; vielmehr wird die Nützlichkeit der therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen durch ihre Fähigkeit bestimmt, zelluläre Aktivitäten glatter Muskelzellen und Pericyten in der Gefäßwand zu inhibieren. Somit umfassen andere Aspekte der Erfindung therapeutische Konjugate und Dosierungsformen und Protokolle, die bei einem frühen therapeutischen Eingriff für die Verminderung, Verzögerung oder Ausmerzung (oder sogar Umkehrung) atherosklerotisches Plaques und Bereiche von Gefäßwandhypertrophie nützlich sind. Therapeutische Konjugate und Dosierungsformen der Erfindung finden auch eine Anwendung bei einem frühen Eingriff bei präatherosklerotischen Bedingungen, z.B. sind sie bei Patienten nützlich, die ein hohes Risiko für die Entwicklung von Atherosklerose und/oder Vorzeichen von Hypertension aufweisen, als Ergebnis von atherosklerotischen Veränderungen in Gefäßen oder Gefäßstenose aufgrund einer Hypertrophie der Gefäßwand.
  • Zum Beispiel können in einer anderen Ausführungsform der Erfindung die Stents in Situationen verwendet werden, in denen Angioplastie nicht ausreicht, um eine verstopfte Arterie zu öffnen, wie in jenen Situationen, die das Einsetzen eines intravaskulären Stents erfordern. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein metallischer, Kunststoff- oder bioabbaubarer intravaskulärer Stent verwendet, der ein therapeutisches Mittel umfasst, wie in Anspruch 1 definiert.
  • Der Stent umfasst bevorzugt eine bioabbaubare Beschichtung oder eine poröse oder permeable nicht-bioabbaubare Beschichtung, die das therapeutischen Mittel umfasst. Eine bevorzugtere Ausführungsform der Erfindung ist ein beschichteter Stent, wobei die Beschichtung eine Retarddosierungsform des therapeutischen Mittels aufweist. In einer alternativen Ausführungsform kann der biologisch abbaubbare Stent auch mit dem therapeutischen Mittel imprägniert sein, d.h. die Stentmatrix.
  • Ein bioabbaubarer Stent mit dem darin imprägnierten therapeutischen Mittel, der außerdem mit einer bioabbaubaren Beschichtung oder mit einer porösen nicht-bioabbaubaren Beschichtung beschichtet ist, in der die Retarddosierungsform des therapeutischen Mittels dispergiert ist, ist auch eine Ausführungsform der Erfindung. Dieser Stent kann eine differentielle Freisetzungsrate des therapeutischen Mittels bereitstellen, d.h. es kann eine schnellere Freisetzung des therapeutischen Mittels von der Beschichtung vorliegen, gefolgt durch eine verzögerte Freisetzung des therapeutischen Mittels, das in die Stentmatrix imprägniert ist, bei der Zersetzung der Stentmatrix. Bevorzugt ist in dieser Ausführungsform der Erfindung das therapeutische Mittel in der Beschichtung ein Cytochalasin oder Taxol und insbesondere bevorzugt Cytochalasin B oder Taxol oder deren Analoga, die funktionell äquivalent sind. Der intravaskuläre Stent stellt somit ein mechanisches Mittel bereit, um für einen vergrößerten Lumeninhalt eines Gefäßes zu sorgen, zusätzlich zu dem, was über die biologische Stentingwirkung des zytoskelettalen Inhibitors erreicht wird, wie Cytochalasin B oder Taxol, das freisetzbar darein eingebettet ist.
  • Weiterhin kann das Einsetzen intravaskulärer Stents, die ein therapeutisches Mittel umfassen, das ein Inhibitor der Proliferation glatter Muskelzellen ist, eine erhöhte Wirksamkeit bieten, indem die intimale Proliferation vermindert oder verhindert wird. Daher ist auch ein Stent, der außerdem ein Cytochalasin aufweist, um die Proliferation und Migration von Pericyten zu inhibieren, die sich in glatte Muskelzellen umwandeln und zur Intimaverdickung beitragen können, eine Ausführungsform der Erfindung. Diese Inhibierung der intimalen glatten Muskelzellen und des Stromas, das durch den glatten Muskel und die Pericyten produziert wird, kann eine schnellere und eine vollständigere Reendothelialisierung nach der Platzierung des vaskulären Stents im Gefäß ermöglichen. Die erhöhte Rate der Reendothelisierung und Stabilisierung der Gefäßwand nach dem Einsetzen des Stents kann den Verlust an Lumeninhalt und den verminderten Blutdurchfluss reduzieren, welcher die primäre Ursache für Fehler bzw. Fehlfunktionen bei vaskulären Stents ist.
  • Bevorzugt sind in der Durchführung dieser Ausführungsform der Erfindung die bioabbaubaren Mikropartikel, die das therapeutische Mittel enthalten, ungefähr 1 bis 50 Mikron groß. Es ist zudem bevorzugt, dass die Mikropartikel über eine Dauer von 30 bis 120 Tagen biologisch abgebaut werden, wobei in die Tunica media und intima eine dauerhafte zelluläre Konzentration von ungefähr 0,05 μg/ml bis ungefähr 0,25 μg/ml Cytochalasin B in das Zytosol freigesetzt wird, wodurch eine Diffusion therapeutischer Spiegel von Cytochalasin B ermöglicht wird, ohne Toxizität für die Zellen, die der Stent-/Gefäßwandfläche benachbart sind.
  • Die therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen der Erfindung können auch in therapeutischen Modalitäten für die Verstärkung des Neuwachstums von endothelialen Zellen in verletzten vaskulären Geweben und bei vielen Arten von Wunden einschließlich epithelialen Wunden verwendet werden. Bei diesen therapeutischen Modalitäten finden die erfindungsgemäßen therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen eine Anwendung bei der Inhibition der Migration und/oder Proliferation glatter Muskelzellen oder Perizyten. Glatte Muskelzellen und Perizyten wurden in vitro mit der Produktion von Faktoren in Verbindung gebracht, die endotheliale Zellproliferatin inhibieren, und deren Proliferation kann auch zu einer physikalischen Barriere führen, um ein kontinuierliches Endothel zu bilden. Daher finden die erfindungsgemäßen therapeutischen Konjugate und Dosierungsformen eine Anwendung bei der Förderung von Neoangiogenese und erhöhter Reendothelialisierung, z.B. während Wundheilung, Gefäßtransplantaten und Gefäßchirurgie. Die Dosierungsformen können auch therapeutische Modalitäten ausschütten, die Reendothelialisierung der zerstörten Gefäßwand stimulieren oder beschleunigen. Ein beispielhaftes therapeutisches Mittel für diesen Zweck ist vaskulärer Permeabilitätsfaktor.
  • Noch weitere Aspekte der Erfindung beziehen sich auf therapeutische Modalitäten für die Verstärkung der Wundheilung an einem vaskulären Ort und für die Verbesserung der strukturellen und elastischen Eigenschaften von geheilten Gefäßgeweben. Bei diesen therapeutischen Modalitäten werden unter Verwendung des erfindungsgemäßen Konjugats oder der Dosierungsformen die Stärke und Qualität der Heilung der Gefäßwand verbessert, d.h. unter Inhibieren der Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen oder Perizyten in einer Gefäßwand. Glatte Muskelzellen an der vaskulären Wundstelle tragen zum normalen Prozeß Kontraktion der Wundstelle bei, was die Wundheilung fördert. Man glaubt derzeit, dass die Migration und Proliferation glatter Muskelzellen und die Matrixsekretion durch transformierte glatte Muskelzellen von diesem normalen Prozeß abweichen können und die strukturellen und elastischen Langzeiteigenschaften des geheilten Gefäßes stören können. Daher stellen andere Aspekte der Erfindung therapeutische Konjugate und Dosierungsformen bereit, die Proliferation und Migration von glatten Muskelzellen und Perizyten sowie die morphologische Transformation inhibieren, und die Qualität des geheilten Gefäßsystems verbessern.
  • Es ist dem normalen Fachmann bekannt, dass periphere Gefäße, die für Gefäßimplantate an anderen peripheren Stellen oder in Coronararterien-Bypassimplantaten verwendet werden, häufig aufgrund postchirurgischer Stenose Fehlfunktionen aufweisen. Da eine Cytochalasin B-Infusion den Gefäßlumeninhalt in chirurgisch traumatisierten Gefäßen aufgrund der biologischen Stentingaktivität aufrechterhalten kann, wird die Verabreichung in diesem Verfahren die Kontraktionsfähigkeit des Gefäßes verzögern, was zu einem größeren Lumeninhalt führt. Weiterhin ist es ein Vorteil dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass die Verabreichung von Cytochalasin B auf diese Weise die Konstruktion oder einen Spasmus verhindert, der häufig auftritt, nachdem Gefäßimplantate an ihren beiden proximalen und distalen Steilen anastomisiert wurden, was zu einer beeinträchtigten Funktion, wenn nicht dem totalen Aus fall, der Gefäßimplantate führen kann. Somit sollte das durch Cytochalasin B hervorgerufene Stenting des Gefäßes das Auftreten von Spasmen vermindern, welche innerhalb von einigen wenigen Tagen bis zu mehreren Monaten nach dem Implantationsverfahren auftreten können.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine kombinationstherapeutisches Verfahren bereit, das ein zytozides therapeutisches Konjugat und ein zytostatisches therapeutisches Mittel umfasst. Das zytozide Konjugat umfasst einen Bindungspartner (wie ein Protein oder ein Peptid), der in der Lage ist, sich spezifisch zu vaskulären glatten Muskelzellen zu lokalisieren, sowie ein aktives Mittel, das in der Lage ist, diese Zellen abzutöten. Das zytozide Konjugat wird, bevorzugt intravenös oder durch irgend einen anderen passenden Weg, verabreicht, begibt sich zu den glatten Ziel-Muskelzellen und zerstört proliferierende Zellen, die in stenotische oder restenotische Ereignisse verwickelt sind. Diese zelluläre Zerstörung verursacht die Freisetzung von mitogenen und anderen metabolischen Ereignissen, wobei wiederum diese Ereignisse im Allgemeinen zur Proliferation vaskulärer glatter Muskulatur führen. Die antiproliferativen oder antikontraktilen Retarddosierungsformen der vorliegenden Erfindung werden dann verabreicht, bevorzugt durch einen Infusionskatheter oder irgend eine passende Dosierungsform. Die Retarddosierungsform verzögert die Proliferation und/oder Migration und Kontraktion vaskulärer glatter Muskulatur, um hierdurch den Lumendurchmesser aufrecht zu erhalten. Diese Behandlungsmethode stellt eine biologische Arteromyoectomie dar, die in Stenotischen Gefäßen nützlich ist, die aus Hyperplasie vaskulärer glatter Muskelzellen und ähnlichem resultiert.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf therapeutische Modalitäten für die Aufrechterhaltung eines erweiterten Lumenvolumens nach Angioplastie oder anderen Gefäßtraumata. Eine Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung umfasst die Verabreichung eines therapeutischen Mittels, das in der Lage ist, die Kontraktionsfähigkeit vaskulärer glatter Muskelzellen zu inhibieren. Beispielhafte Mittel, die in der Praxis dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind jene, die in der Lage sind, zu bewirken, dass eine traumatisierte Arterie ihren Gefäßtonus verliert, so dass der normale vaskuläre hydrostatische Druck (d.h. Blutdruck) das schlaffe Gefäß bis auf seinen oder bis in die Nähe seines maximalen physiologischen Durchmesser erweitert. Der Verlust des Gefäßtonus kann durch Mittel hervorgerufen werden, die die Bildung oder Funktion kontraktiler Proteine stören (z.B. Actin, Myosin, Tropomyosin, Caldesmon, Calponin oder ähnliche). Diese Störung kann direkt oder indirekt auftreten, zum Beispiel durch Hemmung der Calciummodulation, Phosphorylierung oder anderer metabolischer Stoffwechselwege, die in die Kontraktion vaskulärer glatter Muskelzellen verwickelt sind.
  • Die Inhibierung der zellulären Kontraktion (d.h. Verlust des Gefäßtonus') kann über zwei Mechanismen wirken, um den Grad der vaskulären Stenose zu vermindern. Zum ersten begrenzt die Hemmung der zellulären Kontraktion über eine verlängerte Zeitspanne die Anzahl glatter Muskelzellen, die von der Tunica media in die Intima wandern, deren Verdickung in luminaler Gefäßstenose resultiert. Zweitens bewirkt die Hemmung der zellulären Kontraktion, dass sich die glatte Muskelzellwand unter dem normalen hydrostatischen Gefäßdruck (d.h. Blutdruck) entspannt und erweitert. Therapeutische Mittel, wie etwa Cytochalasine, inhibieren die glatte Muskelzellkontraktion, ohne die Proteinsynthese aufzuheben, die für traumatisierte, postangioplastische oder andere chirurgisch oder erkrankungsbedingt beschädigte glatte Muskelzellen notwendig sind, um sich selbst zu reparieren. Die Proteinsynthese ist für die glatten Muskelzellen auch notwendig, um die Matrix abzuscheiden, die das Lumen in einem Zustand nahe seinem maximalen systolischen Durchmesser fixiert oder beibehält, wenn sich die Gefäßläsion stabilisiert (d.h. ein biologisch induzierter Stentingeffekt).
  • Dieser biologische Stentingeffekt führt nicht nur zu einem erweiterten Gefäßlumeninhalt und einer erhöhten Blutdurchflussrate durch das Gefäß, sondern reduziert auch signifikant das elastische Zurückfedern nach einer Angioplastie. Das elastische Zurückfedern ist ein akuter Verschluss des Gefäßes, der mit einem Vasospasmus oder einer frühen Relaxation der Muskelwand einhergeht, und zwar aufgrund eines traumatischen Schocks, der aus dem Überstrecken des Gefäßes durch einen Ballonkatheter während der Angioplastie folgt. Dieser Spasmus der Tunica media, der zur Verringerung des Lumenquerschnitts führt, kann innerhalb von Stunden, Tagen oder Wochen nach der Ballondilatatation auftreten, wenn die Wiederherstellung des Gefäßmuskelwandtonus geschieht. Jüngere Beobachtungen während der mikroskopischen Untersuchung von Atherectomieproben deuten darauf hin, dass das elastische Zurückfedern in bis zu 25% der angioplastischen Verfahren auftreten kann, die, auf der Basis des anfänglichen Angiogramms nach der Behandlung als erfolgreich klassifiziert wurden. Weil das biologische Stentingverfahren die Arterienwand nach der Ballonangioplastie entspannt, kann der Arzt ein zu starkes Aufpumpen und einen daraus herrührenden traumatischen Schock als Mittel eliminieren, um den Gefäßspasmus oder das elastische Zurückfedern zu vermindern oder zu verzögern. Das Vermindern oder Eliminieren des zu starken Aufpumpens senkt die Verletzung der Muskelwand des Gefäßes, um hierdurch die Determinanten der Glatten-Muskelzellproliferation in der Intima zu reduzieren und dadurch das Auftreten oder die Ernsthaftigkeit der Restenose zu reduzieren.
  • Das biologische Stenting setzt auch das Auftreten von Thrombusbildung herab. Bei Oberschenkelarterien von Schweinen, die mit Cytochalasin B behandelt wurden, wurde zum Beispiel das Auftreten muraler Mikrothrombi im Vergleich zu Ballon-traumatisierten Arterien, die nicht mit dem therapeutischen Mittel behandelt wurden, herabgesetzt. Dieses Phänomen scheint ein Sekundärnutzen zu sein, der aus dem verstärkten Blutfluss durch das traumatisierte Gefäß resultieren könnte, wobei der Nutzen durch die Durchführung der vorliegenden Erfindung erreicht wird.
  • Cytochalasine sind beispielhafte therapeutische Mittel, die in der Lage sind, einen biologischen Stentingeffekt bei vaskulären glatten Muskelzellen zu erzeugen. Man glaubt, dass Cytochalasine sowohl die Migration als auch Kontraktion der vaskulären glatten Muskelzellen durch Wechselwirkung mit Actin inhibieren. Die Cytochalasine interagieren mit den Enden des filamentösen Actins, um die Längung der Aktinfilamente zu inhibieren. Niedrige Dosen von Cytochalasinen (z.B. Cytochalasin B) unterbrechen auch die Mikrofilamentnetzwerke von Actin. In vitro Daten zeigen auch, dass, nachdem die vaskulären glatten Muskelzellen frei von Cytochalasin B geworden sind, Zellen ausreichend polymerisiertes Actin regenerieren, um die Migration innerhalb 24 Stunden wieder aufzunehmen. In vivo Untersuchungen zeigen, dass vaskuläre glatte Muskelzellen den Gefäßtonus innerhalb vom 2 bis 4 Tagen wiedergewinnen. Es ist während dieser Erholungsperiode, in die Wirkung der Festsetzung des Lumendurchmessers und der biologische Stentingeffekt auftreten.
  • Das therapeutische Mittel kann zielgerichtet werden, wird aber bevorzugt nach der Angioplastie oder dem anderen traumatischen Ereignis direkt an das traumatisierte Gefäß verabreicht. Der biologische Stentingeffekt, z.B. von Cytochalasin B, ist erreichbar unter Verwendung einer einzigen Infusion des therapeutischen Mittels in den traumatisierten Bereich der Gefäßwand mit einer Dosierungskonzentration im Bereich von 0,1 Mikrogramm/ml bis etwa 1,0 Mikrogramm/ml.
  • Die Hemmung der Glatten-Gefäßmuskelzell-Migration (von der Tunica media zur Intima) ist in dem gleichen Dosierungsbereich gezeigt worden (Beispiel 11); doch ist ein dauerhaftes Aussetzen des therapeutischen Mittels auf das Gefäß bevorzugt, um diese antimigratorischen Wirkungen zu maximieren. Wenn die vaskulären glatten Muskelzellen nicht in die Intima wandern können, können sie dort nicht proliferieren. Sollten vaskuläre glatte Muskelzellen in die Intima wandern, hemmt eine anschließend verabreichte post-proliferative Retarddosierungs form die Intimaproliferation. Im Ergebnis kann die erfindungsgemäße Retarddosierungsform, die ein Cytochalasin oder ein anderes proliferatives therapeutisches Mittel enthält, in Kombination mit einem cytochalasinfreien therapeutischen Mittel verabreicht werden. Auf diese Weise kann der biologische Stentingeffekt und ein antiproliferativer oder antimigratorischer Effekt in einem einzigen Verabreichungsprotokoll erreicht werden.
  • Mittel, die in den Protokollen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise gemäß den folgenden Verfahren identifizierbar. Ein mögliches Mittel für eine Verabreichung als freies Mittel (d.h. nicht zielgerichtet bzw. ungezielt) zeigt ein oder mehrere der folgenden Eigenschaften:
    • (i) es behält ein erweitertes Lumenvolumen nach Angioplastie (z.B. PTCA, perkutane transluminale Angioplastie (PTA) oder ähnliche) oder einem anderen Trauma, einschließlich Atherektomie (z.B. Rotoblater, Laser und ähnliche); Coronararterien-Bypassbbehandlungen oder ähnlichem; oder resultierend von einer Gefäßerkrankung (z.B. Atherosklerose, sekundäre Augenerkrankungen auf Gefäßstenose oder Atropie, stenotische cerebrate Gefäßerkrankungen oder ähnliche);
    • (ii) die anfängliche Zunahme des Gefäßquerschnitts, durch das Mittel erleichtert, führt nicht zu einer oder einer betonten chronischen Stenose des Lumens;
    • (iii) inhibiert die Zielzellkonzentration oder Migration; und
    • (iv) ist zytostatisch.
  • Bevorzugt hat ein hierin verwendetes therapeutisches Mittel alle vier Eigenschaften; jedoch sind für die Durchführung der vorliegenden Erfindung die erste und die dritte wichtiger als die zweite und die vierte. Beispielsweise wurde Cytochalasin B untersucht, um die Eignung für die Verwendung in therapeutischen mittelfreien Protokollen zu bestimmen. Der biologische Stentingeffekt von Cytochalasin B ist erreichbar unter Verwendung einer einzigen Infusion des therapeutischen Mittels in den traumatisierten Bereich der Gefäßwand mit einer Dosiskonzentration im Bereich von etwa 0,1 Mikrogramm/ml bis etwa 1,0 Mikrogramm/ml. Ein Mittel, der für die Retard-Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich ist, zeigt ein oder mehrere der folgenden Eigenschaften:
    • (i) es hält ein erweitertes Lumenvolumen nach Angioplastie (z.B. PTCA, perkutaner transluminaler Angioplastie (PTA) oder ähnliche) oder einem anderen Trauma, einschließlich Atherectomie (z.B. Rotoblater, Laser und ähnliche); Coronararterien-Bypassbehandlungen oder ähnlichem; oder einer Gefäßerkrankung resultierend (z.B. Atherosklerose, sekundäre Augenerkrankungen auf Gefäßstenose oder Atropie, stenotische cerebrale Gefäßerkrankungen oder ähnliche);
    • (ii) hemmt die Targetzellproliferation (z.B. 5 Minuten und 24 Stunden nach der Aussetzen gegenüber dem Mittels, glatte Gefäßmuskelgewebekulturen demonstrieren in vitro einen Hemmspiegel von 3H-Thymidinaufnahme und zeigen bevorzugt eine relativ geringe Hemmung der 3H-Leucinaufnahme);
    • (iii) produziert bei einer Dosis, die zur Hemmung der DNA-Synthese ausreicht, nur milde bis mäßige (z.B. Grad 2 oder 3 in den unten beschriebenen Assays) morphologische zytotoxische Effekte;
    • (iv) hemmt die Zielzellkonzentration; und
    • (v) ist zytostatisch.
  • Bei der Identifizierung eines therapeutischen Mittels, das ein oder mehrere der vorstehenden Eigenschaften zeigt, wird das Mittel einem zweiten Testprotokoll unterzogen, welches es umfasst, vaskuläre glatte Muskelzellen dem therapeutischen Mittel länger auszusetzen.
  • Ein Mittel, das in den Dauerfreisetzungsausführungsformen der vorliegenden Erfindung nützlich ist, zeigt die folgenden Eigenschaften:
    • (i) bei langdauerndem (z.B. 5 Tage) Aussetzen erzeugt das Mittel in vitro den gleichen oder ähnlichen Effekt auf DNA-Synthese und Proteinsynthese der Glatten-Gefäßmuskel-Gewebekultur, wie sie oben für Aussetzen über 5 Minuten und 24 Stunden beschrieben wurde; und
    • (ii) bei einer effektiven Dosis in dem langdauerenden in vitro-Assay für DNA-Synthesehemmung zeigt das Mittel milde bis mäßige morphologische zytotoxische Effekte über eine längere Dauer (z.B. 10 Tage).
  • Eine weitere Untersuchung potenzieller antiproliferativer Mittel innerhalb der vorliegenden Erfindung erfolgt in einem in vivo Ballon-traumatisierten Schweine-Oberschenkelarterien-Modell. Bevorzugt demonstrieren diese Mittel eine 50%ige oder stärkere Hemmung der Zellproliferation in die Tunica media von vaskulären glatten Muskelzellen, gemäß Indikation durch eine 1-stündige "BRDU-Blitzmarkierung" vor dem Sammeln des Gewebes und der histologischen Auswertung. Wenn ein Mittel für eine Zeitspanne wirksam ist, die ausreicht, um eine intimale glatte Gefäßmuskelproliferation von 50% oder größer bei einer einzigen Einwirkung zu inhibieren, ist es ein Mittel innerhalb der vorliegenden Erfindung, der keine Verabreichung in einer Retarddosierungsform erfordert. Mittel mit einer kürzeren Aktivitätsdauer werden für die Dauerfreisetzung ausgewertet, wenn die systemische Toxizität und der potenzielle therapeutische Index scheinbar eine intravenöse Verabreichung gestatten, um die 50%ige Hemmung zu erreichen, oder wenn der Mittel für die lokale Verabreichung zu den vaskulären glatten Muskelzellen mit Dauerfreisetzung bei einer effektiven antiproliferativen Dosis geeignet ist. Retardmittel werden in einer Retarddosierungsform für Dosisoptimierungs- und -wirksamkeitsstudien ausgewertet. Bevorzugt senken antiproliferative Mittel, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung nützlich sind, die Gefäßstenose um etwa 50% in Ballon-traumatisierten Schweine-Oberschenkelarterien und, noch bevorzugter, senken die Gefäßstenose auf ein ähnliches Ausmaß in Schweine-Coronararterien. Diese Mittel sind dann in klinischen Versuchen am Menschen auszuwerten.
  • Die Zellproliferations- (d.h. DNA-Synthese)- Hemmung ist die primäre Eigenschaft für die Dauerfreisetzung von Mitteln. Beispielsweise hemmt Staurosporin eine Differenz zwischen 3H-Leucin und 3H-Thymidin-Aufnahme so, dass es bei verabreichten Dosierungen zytostatisch ist. Längerfristige Toxizitätsstudien deuteten nicht darauf hin, dass ein verlängertes Aussetzen gegenüber dem therapeutischen Mittel die Zielzellen nachteilig beeinflussen würde. Zusätzlich zeigte BRDU-Pulsmarkierung an, dass Staurosporin die Zielzellproliferation hemmt. Jedoch kann alternativ dazu jede geeignete Methode verwendet werden, um die Fähigkeit zu untersuchen, die Zellproliferation zu inhibieren. Demzufolge ist Staurosporin wirksam dabei, ein expandiertes Lumenvolumen zu erhalten.
  • Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele besser verstanden werden.
  • BEISPIEL 1
  • Bindung an vaskuläre glatte Muskelzellen in der Blutgefäßwand in vivo
  • 1 stellt die Bindung von NR-AN-01 (einem muriner IgG2b mAb) an vaskuläre glatte Muskelzellen in der Gefäßwand einer Arterie in einem 24 Jahre alten männlichen Patienten, 4 Tage nach der i.v. Verabreichung von NR-AN-01. 1 ist eine Mikrokopische Fotografie eines histologischen Schnitts durch den medialen Bereich einer Arterienwand des Patienten nach NR-AN-01 Verabreichung, wobei der Schnitt ex vivo mit HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG reagiert wurde. Die Reaktion des HRP-Konjugats mit NR-AN-01 MAb wurde sichtbar gemacht durch Zugabe von 4-Chlor-1-naphthol oder 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid als Peroxidasesubstrat (Chromogen). Das Reaktionsprodukt des Substrats bildet ein unlösliches violettes oder dunkelbraunes Präzipitat am Reaktionsort (bei #2 gezeigt, 1). Es wurde eine Gegenfärbung verwendet, um kollagenöses extrazelluläres Matrixmaterial (bei #2 gezeigt, 1) oder Zellkerne (#1, 1) sichtbar zu machen. Glatte Muskelzellen werden unter mikroskopischer Untersuchung als violett gefärbte Zellen sichtbar gemacht. Diese Mikrokopische Fotografie zeigt die Fähigkeit von mAb, in vivo spezifisch an humanen glatten Gefäßmuskel zu binden, und wird durch die Zellen aufgenommen und verbleibt für längere Zeit in den Zellen.
  • BEISPIEL 2
  • Therapeutische Konjugate, die therapeutische Trichothecen-Mittel enthalten Konjugate von NR-AN-01 und Roridin A wurden durch chemische Kupplung eines Hemisuccinatderivats des Trichothecenzytotoxins (wie unten beschrieben) an einen monoklonalen Antikörper namens NR-AN-01 gebaut. Es wurden zwei Konjugate hergestellt, wobei einer an die Roridin A 2'-Position gekoppelt wurde und einer an die 13'-Position. In dieser Synthese wurden zwei Schemata verwendet, wie in 2 und 3 dargestellt. Das Konjugat wurde dann von unreagiertem Roridin A durch PD-1 0 SEPHAROSE® Säulenchromatographie (Pharmacia; Piscataway, NJ) gereinigt, durch Größenausschluss-Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert, und die Säulenfraktionen wurden durch SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung (IEF) charakterisiert, wie unten beschrieben
  • 2 zeigt schematisch das erste Reaktionsschema für die Synthese von Roridin A-Hemisuccinylsuccinimidat (RA-HS-NHS) durch einen zweistufigen Prozess mit den Reagenzien: Succinanhydrid, Triethylamin (NEW und Dimethylaminopyridin (DMAP) vorliegend in Dichlormethan (CH2ClZ) bei Raumtemperatur (RT); und N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) Reagenzien, ebenfalls in CH2ClZ bei RT.
  • 3 zeigt schematisch das zweite Reaktionsschema für die Synthese von Roridin A-Hemisuccinylsuccinimidat (RA-HS-NHS) durch einen fünfstufigen Prozess mit den Reagenzien: t-Butyldimethylsilylchlorid (TBMS-C1) und Imidazol in Dimethylformamid (DMF) bei Raumtemperatur (RT); Acetanhydrid, Triethylamin (TEA) und Diethylaminopyridin in Dichlormethan (CH2ClZ) bei RT; Succinanhydrid, Triethylamin (TEA) und Dimethylaminopyridin (DMAP) in (CH2ClZ) bei RT; und N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) Mittel.
  • Synthese von 2'-Roridin-A-Hemisuccinsäure (2):
  • Zu 0,5 g (0,94 mmol) Roridin A wurde 15 ml Dichlormethan hinzugefügt. Zu dieser Lösung wurde unter Rühren 0,104 g (1,04 mmol) Succinanhydrid hinzugefügt. Zu diesem Reaktionsgemisch wurde 0,2 ml Triethylamin in 5 ml Dichlormethan hinzugefügt. Zu dem homogenen Reaktionsgemisch wurde eine katalytische Menge von Dimethylaminopyridin hinzugefügt und bei Raumtemperatur über 15 Stunden gerührt. Dem Abschluss der Reaktion folgte eine Dünnschichtchromatographie (CH2ClZ : CH3OH = 9,7 : 0,3 mit wenigen Tropfen Essigsäure). Am Ende der Reaktion wurden 0,3 ml Eisessigsäure hinzugefügt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der getrocknete rohe Rest wurde zwischen Wasser und Methylchlorid aufgeteilt. Die kombinierten Methylenchloridextrakte (3 × 50 ml) wurden überwasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, wobei das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt wurde, und getrocknet, zum Erhalt von 0,575 g (96%) eines Rohgemisches dreier Verbindungen. Die präparative Cl 8 HPLC-Separation des Rohgemisches in 50%igem Acrylonitrilwasser mit 2%iger Essigsäure ergab 0,36 g (60%) von 2 als weißem Feststoff.
  • Synthese von Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat (3):
  • Zu 0,3 g (0,476 mmol) 2'-Roridin A-Hemisuccinsäure in 30 ml Dichlormethan wurden 0,055 g (0,478 mmol) N-Hydroxysuccinimid hinzugefügt. Zu dem klaren Reaktionsgemisch wurden 0,108 g (0,524 mmol) Dicyclohexylcarbodümied hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 6 Stunden gerührt. Dem Abschluss der Reaktion folgte TLC (CH2ClZ : CH3OH = 9,7 : 0,3 mit wenigen Tropfen Essigsäure) als Entwicklungs-Lösungsmittel. Einige wenige Tropfen von Eisessigsäure wurden zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Zu dem getrockneten Rest wurde Dichlormethan hinzugefügt, und das präzipitierte DCU wurde gefiltert. Lösungsmittel von dem Filtrat wurde unter reduziertem Druck beseitigt, um einen weißen Feststoff zu erhalten. Aus dem Rohprodukt wurde 0,208 g (60%) von 3 durch präparative HPLC in 50%igem Acetonitril mit 2% Essigsäure als mobiler Phase gereinigt.
  • Synthese von 13'-t-Butyldimethylsilyl-Roridin A (4):
  • Zu 72,3 mg (0,136 mmol) Roridin A in 0,5 ml Dimethylformamidlösung wurden 0,055 g (0,367 mmol) t-Butyldimethylsilylchlorid und 0,025 g (0,368 mmol) Imidazol hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 Stunden gerührt. Dem Abschluss der Reaktion folgte eine Silikageldünnschichtchromatographie mittels 1 %iger McOH-CHCl3 als Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch wurde in Vakuum entfernt und getrocknet. Das Rohprodukt wurde zwischen Wasser und Methylchlorid aufgeteilt. Lösungsmittel aus den kombinierten Methylenchloridextrakten wurde unter reduziertem Druck entfernt und getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie mittels EtOAc : Hexan (1 : 3) als Eluierungslösungsmittel gereinigt. Lösungsmittel aus den Eluanten wurde unter reduziertem Druck beseitigt, um 0,66 g (75%) von 4 als Feststoff zu gewinnen.
  • Synthese von 13'-t-Butyldimethylsilyl-2'-Acetyl-Roridin A (5):
  • Zu 0,1 g (0,155 mmol) von 13'-t-Butyldimethylsilyl-Roridin A in 10 ml Dichlormethan wurden 0,3 ml Acetanhydrid, 0,2 ml Triethylamin und einige Kristalle Dimethylaminopyridin hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden aufbewahrt. Dem Abschluss der Reaktion folgte TLC in 1%gem Methanolmethylenchlorid als Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und durch eine Silikagelsäule mittels 1 % Methanolchloroform als Eluierungslösungsmittel gereinigt. Das Lösungsmittel von den Eluanten wurde unter Vakuum beseitigt, um 0,085 g (80 %) 5 als Feststoff zu gewinnen
  • Synthese von 2'-Acetyl-Roridin A (6):
  • Zu 0,05 g (0,073 mmol) 2'-Acetyl-13'-t-Butyldimethylsilyl-Roridin A in 5 ml Tetrahydrofuran wurden 0,3 ml von 1 M Tetrabutylammoniumfluoridlösung in THF hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Dem Abschluss der Reaktion folgte eine Silikagel-Dünnschichtchromatographie mittels 1 %igem McOH-CHCl3 als dem Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck entfernt und getrocknet. Das Rohprodukt wurde auf einer Silikagelsäule mittels 1%igem CH3OH-CHCl3 als Eluierungslösungsmittel gereinigt. Lösungsmittel aus den kombinierten Eluanten wurde unter Vakuum beseitigt, um 0,020 g (48%) von 6 als Feststoff zu gewinnen.
  • Synthese von 2'-Acetyl-13-Hemisuccinyl-Roridin A (7):
  • Zu 0,05 g (0,087 mmol) von 2'-Acetyl-Roridin A in 1 ml Dichlormethan wurden 0,025 g (0,25 mmol) Succinanhydrid und 35 ml von Triethylamin hinzugefügt. Einige wenige Kristalle von Dimethylaminopyridin wurden als Katalysator hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Dem Abschluss der Reaktion folgte eine Dünnschichtchromatographie mittels 5%igem McOH-CHZClZ als Entwicklungs-Lösungsmittel. Am Ende der Reaktion wurden 30 ml Eisessigsäure hinzugefügt. Lösungsmittel von dem Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck entfernt und getrocknet. Das Rohprodukt wurde zwischen Wasser und Ethylacetat aufgeteilt. Lösungsmittel von den kombinierten Ethylacetatfraktionen wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde gereinigt, indem es durch eine Silikagelsäule geschickt wurde, um 0,039 g (66%) von 7 als weißem Feststoff zu gewinnen.
  • Synthese von Succi nimidyl-2'-Acetyl-13'-Roridin A-Hemisuccinat (8):
  • Zu 0,036 g (0,0050 mmol) von 2'-Acetyl-13'-Roridin A-Hemisuccinsäure in 2 ml Dichlormethan wurden 0,009 g (0,09 mmol) N-Hydroxysuccinimid hinzugefügt. Zu einer gerührten Lösung wurde 0,012 g (0,059 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 8 Stunden gerührt. Dem Abschluss der Reaktion folgte eine Silikageldünnschichtchromatographie mittels 5%igem MeOH-CH2Cl2 als Entwicklungs-Lösungsmittel. Einige wenige Tropfen von Eisessigsäure wurden zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt. Lösungsmittel von dem Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck entfernt und getrocknet. Das Rohprodukt wurde auf einer Silikagelsäule mittels 5% McOH-CHZClZ als Eluierungslösungsmittel gereinigt. Das Lösungsmittel von den kombinierten Eluanten wurde unter Vakuum beseitigt, um 0,025 g (61 %) von 8 als weißem Feststoff zu gewinnen.
  • Konjugation von Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat (3) und Succinimidyl-2'-acetyl-13'-Roridin A-Hemi succinat (8) mit NR-AN-01 Gesamt-Antikörper (MAb):
  • Konjugationsreaktionen wurden bei pH 8,0 in Boratpuffer in der Gegenwart von 25% Dimethylsulfoxid (DMSO)-Lösungsmittel bei Raumtemperatur bei leichtem Mischen für 45 Minuten vor der Reinigung durch Gelpermeationschromatographie durchgeführt. Die molaren Trichothecen-Medikamentenprecursor zu Antikörperangebote betrugen 25 : 1 und 40 : 1 für die 2'- bzw. 13'-Roridin A-Analoge (3 und 8). Die Antikörperkonzentration war 0,9 bis 1,0 mg/ml während der Konjugationsreaktion.
  • Eine typische 2'-Analogen (3)-Reaktion mit 25 mg Antikörper war wie folgt: Zu 4,7 ml von 5,3 mg Ab/ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung (d.h. PBS; 150 mM NaCl; 6,7 mM Phosphat; pH 7,3) wurden 10 ml PBS und 5 ml Boratpuffer (0,5 M, pH 8,0) hinzugefügt. Unter leichtem Rühren wurden dem Reaktionsgemisch 6,3 ml DMSO, das 1,37 mg Succinimidyl-2'-Roridin A-Hemisuccinat (3) enthielt, dann tropfenweise über eine 15 Sekundendauer hinzugefügt.
  • Reinigung:
  • Zur Reinigung wurden 1 ml Reaktionsaliquots auf Pharmacia PC-10 Sepharose® Säulen gegeben, äquilibriert in PBS. Das eluierte Konjugat wurde in 2,4 bis 4,8 ml Fraktionen gesammelt. Die PD-10 gereinigten Konjugataliquots wurden dann gepoolt und auf einem Amicon PM-1 ODiAflo® Konzentrator auf 1,5 bis 2,0 mg Ab/ml konzentriert; steril durch eine 0,2 p Gelman Acarodisc® gefiltert und in sterile Glasfläschchen in 5 ml Volumen abgefüllt.
  • Das 2'-Konjugat wurde in flüssigem Stickstoff schnellgefroren und dann bis zum Gebrauch bei –70°C aufbewahrt. Das 13'-Rorodin A NR-AN-01-Konjugat wurde geforen oder gekühlt aufbewahrt (d.h. bei 5 bis 10°C).
  • Charakterisierung der Konjugate
  • Die Proteinkonzentration wurde durch BCA-Assay mittels der Kupferreakti onsmethode bestimmt (Pierce Chemical Corp.).
  • Die Abschätzung des Grads der Antikörperderivatisierung wurde durchgeführt durch zuerst Hydrolysieren eines Aliquots des Konjugats in 0,2 M Carbonat, pH 10,3 für 4 Stunden (bei Raumtemperatur für 2'-Konjugat oder bei 37°C für das 13'-Konjugat), gefolgt durch Filtration durch eine PM-30 Membran. Das Filtrat wurde dann für Roridin A auf C-1 8 reverse Phase HPLC untersucht, mittels einer mobilen Phase eines 50 : 48 : 2 Verhältnisses von CH3CN : H2O: HOAC. Es wurde ein Korrekturfaktor von 1,32 verwendet, um eine parallele makrozyklische Ringzersetzung zu korrigieren, die während der Hydrolyse des 13'-Konjugats polare Produkte ergibt.
  • Es wurde auch eine Größenausschluss-Chromatographie auf DuPont Zorbax® HPLC und isoelektrischer Fokussierung mittels Serva® Gelplatten (pH 3 bis 10) durchgeführt. Durch HPLC wurde keine Indikation einer Aggregation beobachtet.
  • Immunoassay von Roridin A-Antikörperkonjugaten erfolgt durch entweder kompetitive ELISA mittels biotinyliertem Ab mit Streptavidin/Peroxidase-Detektion oder durch kompetitiven Zellbindungsassay mittels 125l-arkiertem Antikörper. Altenrativ wurde die Immunoreaktivität unter Bedingungen der Antigensättigung in einem Zellbindungsassay gemessen, wobei der Antikörper zuerst mit 1-125 durch die Chloramin-T-Methode spurenmarkiert wurde und dann anschließend mit 2'- und 13'-Roridin A-Precursorn derivatisiert wurde.
  • Die Strukturformel des Trichothecens ist unten gezeigt:
    Figure 00650001
  • BEISPIEL 3
  • Bindungskinetiken an Matte Muskelzellen
  • Zur Verabreichung durch einen i.v. Katheter ist es erwünscht, dass die therapeutischen Konjugate der Erfindung in weniger als 3 bis 5 Minuten verabreicht werden, sodass der Blutfluss in dem Patienten wieder hergestellt werden kann. Daher wurden Studien durchgeführt, um die Bindungskinetiken des Glatten-Muskel-Bindungsproteins mit einem Ka von > 109 Liter/mol zu bestimmen. Weil menschliche vaskuläre glatte Muskelzellen in der Kultur langsam wachsen und sich herausstellte, dass glatte Muskelzellen des Pavians den humanen CSPG-Zelloberflächenmarker exprimieren, wurden glatte Arterienmuskelzellen vom Pavian und menschliche A375 M/M (Melanom: ATCC #CRL 1619) Zellen, die den CSPG-Oberflächenmarker trugen, in vielen der Studien verwendet, die in den Beispielen unten beschrieben sind.
  • Für die Bindungskinetikstudien wurden A375 M/M- und B054-Zellen in sterilen 96 Well-Mikrotiterplatten mit 2500 Zellen/Weil angesetzt. Die Platten wurden in Aluminiumfolie eingewickelt und bei 37°C über Nacht in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO2/95% Luft inkubiert. Nach angenähert 18 Stunden wurden die Inkubationsplatten entfernt, und die Zellen wurden mit 0,05% Glutaraldehyd für 5 Minuten fixiert, um einen Membranturnover zu verhindern. Nach dem Fixieren wurden die Platten im Überschuss mit PBS, das 0,5% Tween-20® enthielt, gewaschen. Serielle Zweifachverdünnungen eines NR-AN-01 the rapeutischen Konjugats, das Roridin A enthielt, wurden mit Proteinkonzentrationen von 10 mg/ml bis 20 ng/ml hergestellt, und jede Lösung wurde in zwei Wells aliquotisiert. Die Platten wurden bei 4°C mit dem NR-AN-01 für 5, 15, 30 und 60 Minuten inkubiert, wonach das ungebundene Protein durch Absaugen entfernt wurde, und es wurde zu jedem Well 100 ml CS-Puffer hinzugefügt (55% Hühnerserum/0,5% Tween-20® in PBS). CS-Puffer wurde beseitigt, und das NR-AN-01 therapeutische Konjugat, gebunden an die Zellen, wurde sichtbar gemacht durch Hinzufügen von 100 ml HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zu jedem Well; Inkubieren bei 4°C für eine Stunde; Waschen mit PBS/0,055% Tween®, um ungebundenes Ziegen-IgG zu beseitigen; und Hinzufügen von 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzthiazol-6-sulfonsäure (ABTS) chromogenes Substrat (d.h. für HRP). Nach Inkubation für 30 Minuten wurde die an die Zelle gebundene Menge von NR-AN-01 quantifiziert, durch Messung der Absorption bei 415 nm und 490 nm mittels ELISA Plattenlesegeräts, ausgestattet für die Datenerfassung mit einem Compaq Computer.
  • 4A zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, wobei A375 M/M marker-positive Zellen bei 4°C (d.h. um Membranturnover zu verhindern) für 5 Minuten (offene Quadrate, 4A), 15 Minuten (geschlossene Rauten, 4A), 30 Minuten (geschlossene Quadrate, 4A) oder 60 Minuten (offene Rauten, 4A) mit unterschiedlichen Konzentrationen von NR-AN-01 (NRAND01 pg/ml) gehalten wurden. Die Bindung des NR-AN-01 MAb an die A375-Zellen wurde quantifiziert durch Waschen, um ungebundenen Antikörper zu beseitigen, Hinzufügen von HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG zur Reaktion mit dem zeltgebundenen MAb, Waschen, um ungebundenen sekundären Ziegen-Antikörper zu beseitigen, und Hinzufügen von 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) Substrat für Peroxidase. Die Farbentwicklung wurde nach 30 Minuten sowohl bei 415 nm als auch 490 nm überwacht (ABS415.490).
  • 4B zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die in ähnlicher Weise durchgeführt wurden, wie oben in Bezug auf 4A beschrieben wurde, jedoch mittels 8054 marker-positiven glatten Muskelzellen, d.h. anstatt der A375 m/m Zellen.
  • Die in 4A und 4B dargestellten Ergebnisse zeigen eine signifikante Bindung von NR-AN-01 an A375 und B054 Zellen innerhalb 5 Minuten bei 4°C auch bei der geringsten Dosis von 20 nm/ml.
  • BEISPIEL 4
  • Wirkungen von Roridin A und RA-NR-AN-01 Konjugaten
  • Die Wirkungen von Roridin A (RA) und RA-NR-AN-01 Konjugaten auf die zelluläre Proteinsynthese (d.h. durch 3H-Leucinaufnahme) und die metabolische Aktivität (d.h. durch mitochondrialen MTT-Assay) wurden in den Experimenten geprüft, die unten in BEISPIEL 5 und BEISPIEL 6 im Detail angegeben sind. Die Studien in BEISPIEL 4 enthalten Experimente zur Bestimmung der Wirkungen der langdauernden (d.h. 24-stündigen) Behandlung mit den Mitteln. Die Studien in BEISPIEL 5 enthalten Experimente zur Bestimmung der Effekte einer "Puls" (d.h. 5-minütigen) Behandlung der Zellen. In beiden Studien wurde die zelluläre Spezifität der Wirkung durch Aufnahme von "Ziel"-Zellen (d.h. Zellen, die den CSPG "Marker" tragen) und Nicht-Targetzellen ausgewertet. Zu Vergleichszwecken wurde auch freies RA (d.h. angekoppeltes) in den Studien eingebunden. Die Effekte auf die zelluläre Proteinsynthese oder metabolische Aktivität wurde entweder unmittelbar nach der Behandlung ausgewertet, oder es wurde eine "Erholungsdauer" zugelassen (d.h. einschließlich der Inkubation der Zellen über Nacht bei 37°C), um die langfristigen Effekte der Mittel auf die Zeltpopulationen zu bestimmen.
  • Metabolische Effekte nach 24-stündiger Exposition:
  • Während es bekannt ist, dass monoklonale Antikörper-Medikamentenkonjugate einen Spezifitätsgrad für Zellen haben können, die Markerantigene tragen, wenn in vivo verwendet, hat es sich herausgestellt, dass es in vielen Systemen schwieriger ist, die in vitro Spezifität der Wirkung zu demonstrieren, insbesondere mit Verbindungen, die lipophil sind. Daher wurden die vorliegenden Experimente durchgeführt, wobei die inhibitorischen Effekte des NR-AN-01 Roridin A-Konjugats auf Target- und Nichttargetzellen über 24 Stunden getestet wurden. Die Ergebnisse mit RA-NR-AN-01 wurden mit dem Effekt von freiem Roridin A über die gleiche 24-Stundendauer verglichen. Ein modifiziertes Methyltetrazoliumblau (MTT)-Assay wurde mit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (Sigma) genutzt, um die zelluläre metabolische Aktivität zu bestimmen. Dieser Assay ist dazu gedacht, die zelluläre mitochondriale Dehydrogenaseaktivität zu messen. Für einige dieser Studien wurden M14 (Melanom) und B054 (glatter Muskel)-Zelllinien als marker-positive Zielzellen verwendet, und es wurden HT29-Zellen (Colonkarzinom; ATCC#HTB38) als Nichttargetspezifitätskontolle verwendet. In anderen Studien wurde A375 als marker-positive Zelle verwendet. Die HT29- und M14-Zellen wurden in 96-Weil Mikrotiterplatten mit einer Konzentration von 5,0 × 103 Zellen/Weil angesetzt, und die B054-Zellen wurden mit 2,5 × 103 Zellen/Weil angesetzt. Serielle Zweifachverdünnungen von freiem Roridin A und 2'RA-HS-NR-AN-01 (d.h. Roridin A, gekopelt durch Hemisuccinat (HS)-Kopplungsmittel and er 2'-Position an NR-AN-01) wurden in DMEM über einen Bereich von Proteinkonzentrationen von 20 mg/ml bis 40 pg/ml hergestellt. Es wurden Testmittel (doppelt) zu Mikrotiterwells (100 ml/Wlell) hinzufügt, und die Platten wurden in Aluminiumfolie eingewickelt und bei 37°C in angefeuchteter Atmosphäre, bestehend auf 5% CO2/95% Luft, für 24 Stunden inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt (durch Absaugen), wurde frisches DMEM hinzugefügt (100 ml/Well), und die Zellen wurden umgedreht, um für eine zusätzliche über Nacht (d.h. 16-18 Stunden) "Erholungsdauer" zu inkubieren. Am Ende der "Erholungsdauer" wurde die zelluläre metabolische Aktivität bestimmt, indem zu jedem Well 20 ml einer 5 mg/ml MTT-Lösung hinzugegeben wurde. Die Platten wurden abgedeckt und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert, und dann wurde die Reaktion entwickelt, indem 100 ml/Welt 10%iger SDS/0,1 N Hcl hinzugefügt wurde. Das dunkelblaue, in Lösung gebrachte Formazanreaktionsprodukt wurde bei Raumtemperatur nach 16-18 Stunden entwickelt und mittels eines ELISA Mikrotiterplattenlesegeräts bei einer Absorption von 570 nm quantifiziert.
  • 5A zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, wobei B054 markerpositve glatte Muskelzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von RA-NR-AN-01 (NRAN01-RA; offene Quadrate, 5A) oder freiem Roridin A (freies RA; geschlossene Rauten; 5A) für eine Dauer von 24 Stunden inkubiert wurden, gewaschen wurden und dann zur Kultur für eine zusätzliche 16-18-stündige Übernacht (o/n) Erholungsdauer zurückgebracht wurden, bevor die metabolische Aktivität in einem MTT-Assay getestet wurde. Die Konzentrationen von freiem RA und RA-NR-AN-01 werden ausgedrückt als die berechnete Konzentration von Roridin A (in mg/ml aufgetragen auf einer logarithmischen Skala) in dem Assay (d.h. anstatt dem totalen mg/ml von NR-AN-01 Protein in dem Assay), sodass direkte Vergleiche möglich sein können. Die metabolische Aktivität der Zellen in dem MTT-Assay wird dargestellt als Prozentsatz der metabolischen Aktivität, gemessen in einer unbehandelten Kontrollkultur von Zellen, d.h. % Kontrolle).
  • 5B zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die in ähnlicher Weise ausgeführt wurden wie jene, die oben in Bezug auf 5A beschrieben wurden, jedoch unter Vergleich der Effekte von nur RA-NR-AN-01 (NRAN01-RA) an drei unterschiedlichen Zelltypen: nämlich B054 markerpositiven glatten Muskelzellen (B054-NRAN01-RA; offene Quadrate, 5B); HT 29 marker-negativen Kontrollzellen (HT29-NRAN01-RA; geschlossene Rauten, 5B); und M14 marker-positiven Zellen (M14-NRAN01-RA; geschlossene Quadrate, 5B). Wie oben in Bezug auf 5A beschrieben, werden die Konzentrationen in dem vorliegenden Experiment als pg/ml Roridin A ausgedrückt. Die metabolische Aktivität der Zellen wird in ähnlicher Weise wie in 5A ausgedrückt, d.h. als Prozentsatz der Aktivität, gemessen in einer unbehandelten Kontrollkultur von Zellen (% Kontrolle).
  • Die in 5A und 58 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die in dem MTT-Assay gemessene metabolische Aktivitäten in allen Populationen von Testzellen signifikant abnahmen, sogar 16-18 Stunden nach einer 24-stündigen Inkubation in entweder freiem Roridin A oder den 2'- oder 13'-RA-NR-AN-01 Konjugaten. Die Effekte der RA-NR-AN-01 Konjugate schienen nicht spezifisch inhibitorisch für sowohl Ziel (8054 und M14)- als auch Nichtziel (HT29)-Zellen (5A und 5B) zu sein. Die inhibitorischen Effekte wurden bei einer freien Roridin A- oder RA-Konjugatkonzentration von > 10 ng/ml beobachtet.
  • Zu Vergleichszwecken wurde eine zweite Studie durchgeführt, wobei die Effekte von Pseudomonas exotoxin (PE)-Konjugaten auf Zellen in einem ähnlichen Protokoll ausgewertet wurden. Für diese Studie wurden Ziel- und Nichtzielzellen mit PE oder PE-NR-AN-01 für 24 Stunden behandelt, und erhielten dann eine "Erholungsperiode" (wie oben), bevor die metabolische Aktivität in einem MTT-Assay getestet wurde.
  • 6A zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die in ähnlicher Weise durchgeführt wurden, die oben in Bezug auf 5A beschrieben wurden, jedoch so ausgestaltet, um die metabolischen Effekte auff PE-NR-AN-01 (NRAN01-PE) auf Zellen zu untersuchen, d.h. anstatt RA-NR-AN-01. Drei unterschiedliche Zelltypen wurden verwendet: nämlich B054 marker-positive glatte Muskelzellen (B054; offene Quadrate, 6A); HT29 markernegative Kontrollzellen (HT29; geschlossene Rauten, 6A); und M14 marker-positive Zellen (MT14; geschlossene Quadrate, 6A). In dieser Studie ist die Kon zentration des Konjugats in pg/ml NR-AN-01 Protein ausgedrückt (aufgetragen auf einer log-Skala), und die metabolische Aktivität wird ausgedrückt als Prozentsatz der MTT-Aktivität, gemessen in einer unbehandelten Kontrollkultur (% Kontrolle).
  • 6B zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die in ähnlicher Weise ausgeführt wurden wie jene, die oben in Bezug auf 6A diskutiert wurden, jedoch ausgeführt, um die mit freiem PPE (PE) erhaltenen Effekte mit den oben erhaltenen zu vergleichen, d.h. in 6A, mit PE-NR-AN-01. Die Zellen, die Kulturbedingungen, die Berechnungen und die Präsentation der Ergebnisse sind die gleichen wie in 6A oben.
  • Die in 6A und 6B dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine 24-stündige Exposition von PE-NR-AN-01 oder freiem PE nicht spezifisch inhibitorisch für Zellen der Konzentration von > 100 ng/ml war.
  • Während dieser Typ nicht-spezifischer Hemmung als ein potenzieller Wert für die biologische Atherectomie gewertet wurde, wurde er nicht als wünschenswert für die Behandlung von Restenose nach Angioplastie angesehen, wo tote und sterbende Zellen Faktoren freigeben können, die die Glatte-Muskelproliferation stimulieren.
  • BEISPIEL 5
  • Effekte der Pulsbehandlung auf zelluläre Aktivität
  • Es wurden zusätzliche Studien durchgeführt, um die Effekte davon auszuwerten, Zellen kurzfristig, d.h. 5 Minuten, einem Roridin A-haltigen therapeutischen Konjugat auszusetzen. In diesen Studien wurde sowohl die metabolische Aktivität (gemessen in MTT-Assays) als auch die zelluläre Proteinsynthese (gemessen durch 3H-Leucinaufnahme) ausgewertet.
  • Effekte nach 5 Minuten der Exposition: Proteinsynthese
  • Die Effekte einer 5-minütigen Exposition für freies Roridin A (RA) oder ein therapeutisches Konjugat wurden ausgewertet. Verwendet wurde Roridin A-NR-AN-01, gekoppelt durch Hemisuccinyl (HS) an entweder der 2'-Position (2'RA-HS-NR-AN-01) oder der 13'-Position (13'RA-HS-NR-AN-01). (Im Falle von 13'RA-HS-NR-AN-01 wurde die 2'-Position von Roridin A auch acetyliert.) Die RA-, 2'- oder 13'RA-NR-AN-01 Konjugate wurden in sterilem DMEM über einen Konzentrationsbereich von 400 ng/ml bis 780 pg/ml Roridin A zweifach verdünnt. (Die Testproben wurden alle auf Roridin A normalisiert, sodass direkte Vergleiche der Effekte bei vergleichbaren Dosierungen durchgeführt werden konnten.) Proben wurden (doppelt) in doppelte Mikrotiterplatten mit 100 ml/Well zum Aliquot gebracht und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert.
  • Sowohl kurzfristige als auch langfristige Effekte der Testproben auf markerpositive A375- als auch marker-negative H729-Zellen wurden bestimmt. Zur Untersuchung der kurzfristigen Effekte wurde 100 ml/Well [3H]-Leucin (0,5 mCi/ml) unmittelbar nach der 5-minütigen Behandlung mit Konjugat (oder RA) hinzugefügt, und die Proteinsynthese wurde über eine 5-stündige Dauer ausgewertet. Zur Bestimmung der langfristigen Effekte wurden die Zellen für 5 Minuten behandelt, gewaschen und dann zur Kultur für eine 24-stündige "Erholungs"-Periode im DMEM-Medium zurückgebracht, das entweder 5% NBS/5% Serum Plus®, d.h. für A375oder NT29-Zellen) oder 10% FBS (d.h. für B054-Zellen) enthielt. Am Ende der "Erholungs"-Periode wurde das Inkubationsmedium entfernt (d.h. durch Absaugen), und es wurde 3H-Leucin hinzugefügt (wie oben). In beiden Fällen (d.h. ob kurzfristig oder langfristig) wurde die Proteinsynthese der Zellen ausgewertet durch Inkubieren der Zellen mit 3H-Leucin für 4 Stunden bei 37°C in einer feuchten Kammer (wie oben) und alle Ergebnisse wurden durch Vergleich mit nicht behandelten Zellen (d.h. 100% Kontrolle) berech net. Nach 4 Stunden wurde das 3H-Leucin entfernt, wurden die Zellen von dem Substrat durch Trypsinbehandlung entfernt, abgesaugt (mittels eines PHDTM Zellerntegeräts (Cambridge Technology, Inc., Cambridge, MA)) und durch Filtration auf Glasfaserfiltern gesammelt. Die Glasfaserfilter wurden getrocknet und durch Flüssigszintillationsspektroskopie in einem Beckman Flüssigszintillationszähler radioaktiv quantifiziert.
  • 7A zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die durchgeführt wurden, um die Effekte zu untersuchen, Kontroll HT29 marker-negative Zellen über 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von Roridin A (freies RA; offene Quadrate, 7A) oder 2'-RAN-NR-AN-01 (2'RA-NRAN01; geschlossene Quadrate, 7A) oder 13'RA-NR-AN-01 (13'RA-NRAN01; geschlossene Dreiecke, 7A) Konjugaten auszusetzen. Die Konzentrationen von freiem RA, 2'RA-NR-AN-01 oder 13'NR-AN-01 werden ausgedrückt als die berechnete Konzentration von Roridin A in dem Assay (in pg/ml, aufgetragen auf einer log-Skala), d.h. anstatt dem gesamten pg/ml von NR-AN-01 Protein, sodass direkte Vergleiche der Ergebnisse durchgeführt werden können. Für diese Studien wurden die Zellen für 5 Minuten behandelt, gewaschen und dann zur Kultur für 4 Stunden zurückgebracht, wobei während dieser Zeit die zelluläre Proteinsynthese ausgewertet wurde, indem 0,5 mCi/ml von 3H-Leucin dem Kulturmedium hinzugefügt wurde. Am Ende der 4-stündigen Dauer wurden die zellulären Proteine gesammelt, und die Radioaktivität wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als der Prozentsatz der Radioaktivität, die in einer Kontroll (nicht behandelten) NT29-Zellkultur aufgezeichnet wurde (d.h. % Kontrolle).
  • 7B zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die die Effekte davon untersuchen, Kontroll H29 marker-negative Zellen 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von freiem RA (offene Quadrate, 7B), 2'RA-NRAN01 (geschlossene Quadrate, 7B) oder 13'RA-NRAN01 (geschlossene Dreiecke, 7B) auszusetzen, wie oben in Bezug auf 7A beschrieben, wobei jedoch in den vorliegenden Experimenten die Zellen für eine 16-18-ständige Erho lungsperiode (d.h. über Nacht; o/n) inkubiert wurden, bevor die Proteinsynthese in einem 4-stündigen 3H-Leucinproteinsyntheseassay getestet wurde. Die Ergebnisse sind in ähnlicher Weise dargeboten wie oben in 7A.
  • Die in 7A und 7B dargestellten Ergebnisse zeigen die kurzfristigen bzw. langfristigen Effekte von RA, 2'RA-HS-NR-AN-01 und 13'RA-HS-NR-AN-01 auf die Proteinsynthese durch HT29-Kontrollzellen. Die Ergebnisse zeigen eine Dosis-Antworthemmung der zellulären Proteinsynthese durch freies Roridin A, jedoch nicht durch RA-NR-AN-01 in HT29-Zellen. Die Hemmung, die durch RA während den 5 Minuten Inkubation ausgelöst wurde, war nach den 16-18 Stunden Erholungsdauer (7B) noch immer vorhanden. im Gegensatz hierzu führte die Behandlung von Nichtziel HT29-Zellen mit 2'RA-HS-NR-AN-01 oder 13'RA-HS-NR-AN-01 zu einer detektierbaren Hemmung der Proteinsynthese. Somit legen diese Ergebnisse (im Gegensatz zu jenen, die über 24 Stunden hinweg erhalten wurden) einen überraschenden Grad an Spezifität in der in vitro Wirkung der NR-AN-01-Konjugate nahe, wenn die Behandlung in einem 5-minütigen "Puls" verabreicht wurde. Jedoch war es auch möglich, dass das NR-AN-01-Konjugat inaktiv war, sodass zusätzliche Experimente durchgeführt wurden, um den Effekt der Konjugate auf die Zielzellen auszuwerten.
  • 7C zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die die Effekte darauf untersuchen, A375 m/m marker-positive Zellen 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von freiem RA (offene Quadrate, 7C), 2'RA-NR-AN-01 (geschlossene Quadrate, 7C) oder 13'RA-NR-AN-01 (geschlossene Dreiecke, 7C) auszusetzen, wie oben in Bezug auf 7A beschrieben. In den vorliegenden Studien wurden die A375-Zellen für 5 Minuten in einem Testmittel inkubiert, gewaschen und auf Proteinsynthese über die nächsten 4 Stunden getestet, indem 0,5 mCi/ml 3H-Leucin zu dem Kulturmedium hinzugefügt wurde. Die Ergebnisse der Experimente sind in ähnlicher Weise aufgetragen, wie sie oben in Bezug auf 7A beschrieben sind.
  • 7D zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, welche die Effekte darauf untersuchen, A375 m/ml marker-positive Zellen 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von freiem RA (offene Quadrate, 7D), 2'RA-NRAN01 (geschlossene Quadrate, 7D), 13'RA-NRAN01 (geschlossene Dreiecke, 7D) auszusetzen, wie oben in Bezug auf 7B beschrieben. In den vorliegenden Studien wurden die A375-Zellen für 5 Minuten in diem Testmittel inkubiert, gewaschen und dann zu der Kultur für eine 16-18-stündige Erholungsdauer (d.h. über Nacht; o/n) Erholung zurückgebracht, wobei nach dieser Zeit die Proteinsynthese während eines 4-stündigen 3H-Leucinproteinsyntheseassays ausgewertet wurde. Die Ergebnisse der Experimente sind in ähnlicher Weise aufgetragen, wie sie oben in Bezug auf 7A beschrieben sind.
  • Die in den 7C und 7D dargestellten Ergebnisse zeigen die kurzfristigen und langfristigen Effekte jeweils ovn RA, 2'RA-HS-NR-AN-01 und 13'-RA-HS-NR-AN-01 auf die Proteinsynthese durch A375-Zielzellen. Die Behandlung von Zielzellen mit entweder dem 2'- oder 13'RA-NR-AN-01 therapeutischen Konjugat führte zu einer kurzfristigen Hemmung der Proteinsynthese, d.h. beobachtet unmittelbar nach der 5-minütigen Pulsbehandlung (7C). Diese Feststellungen, in Kombination mit den Feststellungen in 7A und 7B, oben, legen nahe, dass die RA-NR-AN-01-Konjugate aktiv waren und dass sie spezifisch inhibitorisch für Zielzelten waren, jedoch nicht für Nichtzielzellen. Interessanterweise wurden, wenn "Puls"-behandelte Zielzellen zur Kultur zurückgebracht werden, keine langfristigen inhibitorischen Effekte beobachtet (7D). Die in den 7C und 7D dargestellten Ergebnisse zeigen wiederum, dass Roridin A für Testzellen nicht spezifisch inhibitorisch ist (d.h. in ähnlicher Weise wie in 7A und 7B, oben) und dass deren Effekt auf die Zellen auch nach einer 16-18-stündigen Erholungsdauer vorhanden ist. Somit scheinen die spezifischen Effekte von RA-NR-AN-01-Konjugaten auf die Zielzellen während einer "Puls"-Behandlung eine Eigenschaft des NR-AN-01-Bindungsproteins zu sein.
  • Die Ergebnisse, die mit B054 arteriellen glatten Muskelzellen erhalten wurden, waren ähnlich wie jene, die mit den obigen A375-Zellen erhalten wurden, d.h. freies Roridin A zeigte eine Dosis-Antworthemmung der Proteinsynthese im Kurzzeitversuch von gleich 60%, 66% und 90% Kontrolle bei 200 ng/ml, 100 ng/ml und 50 ng/ml; und im langfristigen Versuch waren die Effekte auf die Proteinsynthese gleich 27%, 46% und 98% der Kontrolle bei den gleichen Dosierungen. Im Gegensatz hierzu zeigte das 2'- oder 13'RA-NR-ANA-01 nur eine 10-20%ige Hemmung für die kurz- odere langfristigen Effekte auf die Proteinsynthese (d.h. > 80% der Kontrolle).
  • Somit zeigen die Ergebnisse einen kurzfristigen spezifischen umkehrbaren Effekt des Roridin A-konjugierten NR-AN-01 auf Zielzellen, wenn sie als "Puls"-Behandlung verabreicht werden. Da jedoch nur die Proteinsynthese in diesen Experimenten ausgewertet wurde, war es möglich, dass die zelluluäre metabolische Aktivität in den Zellen als Ergebnis der "Puls"-Behandlung beeinträchtigt werden könnte. Daher wurden zusätzliche Studien durchgeführt, wobei die zelluläre metabolische Aktivität nach einer "Puls"-Behandlung ausgewertet wurde.
  • Effekte nach 5 Minuten der Exposition: metabolische Aktivität
  • MTT-Assays wurden 48 Stunden ausgeführt, nachdem Ziel- und Nichtzielzellen für 5 Minuten RA oder RA-NR-AN-01-Konjugaten ausgesetzt wurden. Die Zielzellen in diesen Studien enthielten B054- und A375- und die Nichtzielzellen enthielten HT29-Zellen. Sterile 96 Well-Mikrotiterplatten wurden mit 2500 Zellen/Weil angesetzt, in Aluminiumfolie eingewickelt und in einer feuchten Kammer, die 5% CO2/95% Luft für 16-18 Stunden inkubiert. Serielle zweifache Verdünnungen von Roridin A (RA), 2'RA-HS-NR-AN-01 und 13'RA-HS-NR-AN-01 wurden aus 400 ng/ml bis 780 pg/ml hergestellt, und 100 ml Aliquots der Verdünnungen wurden in doppelte Wells eingegeben. Nachdem die Testpro ben 5 Minuten ausgesetzt waren, wurden die Zellen gewaschen, um die Testproben zu beseitigen, und es wurde frisches Medium hinzugefügt. Die Zellen durften sich 48 Stunden vor dem Test erholen: D.h. die Platten wurden für 48 Stunden inkubiert, und dann wurde die zelluläre metabolische Aktivität bestimmt, indem 20 ml/Well einer 5 mg/ml M7T-Lösung hinzugefügt wurde. Die Platten wurden abgedeckt und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert, und dann wurde die Reaktion, wie oben beschrieben entwickelt (siehe BEISPIEL 4, oben). Das dunkelblau gelöste Formazanreaktionsprodukt wurde bei Raumtemperatur nach 16-18 Stunden Inkubation entwickelt. Die Proben wurden mittels eines ELISA Mikrotiterplattenlesegeräts bei einer Absorptions von 570 nm quantifiziert.
  • 8A zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, welche die Effekte darauf untersuchen, B054 marker-positive glatte Muskelzellen 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von Roridin A (offene Quadrate, 8A), 2'RANR-AN-01 (NRAN01-2'RA; geschlossene Rauten, 8A) oder 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene Quadrate, 8A) auszusetzen. Die Ergebnisse wurden in ähnlicher Weise ausgeführt wie oben in Bezug auf 7B beschrieben, wobei aber die metabolische Aktivität durch einen MTT-Assay geprüft wurde, d.h. anstatt der Proteinsynthese wie in 7B, und den Zellen wurden auch 48 Stunden Erholung gegeben (anstatt 24 Stunden wie in 7B). Die Ergebnisse der Experimente sind in ähnlicher Weise aufgetragen wie jene, die (oben) in Bezug auf 7A beschrieben sind.
  • 8B zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die die Effekte darauf untersuchen, A375 m/m marker-positive Zellen für 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von Roridin A (offene Quadrate, 8B), 2'RA-NR-AN-01 (NRAN01-2'RA; geschlossene Rauten, 8B), 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene Quadrate, 8B) auszusetzen. Die Experi mente wurden in ähnlicher Weise durchgeführt (und die Ergebnisse aufgetragen) wie jene, die oben in Bezug auf 8A beschrieben sind.
  • 8C zeigt graphisch die Ergebnisse von in vitro Studien, die die Effekte darauf untersuchen, HT29 marker-negative Zellen für 5 Minuten unterschiedlichen Konzentrationen von Roridin A (offene Quadrate, 80), 2'RA-NR-AN-01(NRAN01-2'RA; geschlossene Rauten, 80), 13'RA-NR-AN-01 (NRAN01-13'RA; geschlossene Quadrate, 8C) auszusetzen. Die Experimente wurden in ähnlicher Weise ausgeführt (und die Ergebnisse aufgetragen) wie jene, die oben in Bezug auf 8A beschrieben sind.
  • Die in den 8A bis 8C dargestellten Ergebnisse zeigen leichte Unterschiede zwischen den unterchiedlichen RA-NR-AN-01-Konjugaten bei den höchsten Dosen, wobei aber bei den geringeren Dosierungen das 2'- und 13'RA-NR-AN-01 die metabolischen Aktivität der Targeszellen (d.h. B054 und A375) oder Nichtzielzellen (d.h. HT29) über die längere Frist (d.h. 48 Stunden) nicht signifikant hemmte. Somit legen die Ergebnisse nahe, dass die kurzfristige Hemmung der Zielzellproteinsynthese (7C bis 7D, oben) nicht zu langfristigen metabolischen Effekten auf die Zellen führt, wie messbar in MTT-Assays. Dass diese Assays in der Lage waren, metabolische Veränderungen in den Zellen infolge einer 5-minütigen Exposition zu detektieren, ergibt sich aus den Resultaten, die mit freiem Roridin erhalten wurden. In diesem Fall war freies Roridin A für Ziel- und Nichtzielzelltypen nicht spezifisch inhibierend, auch wenn die Zellen dem Mittel für nur 5 Minuten ausgesetzt wurden und dann zur Kultur für die 48-stündige Erholungsdauer zurückgebracht wurden (8A bis 8C).
  • Somit legen die Feststellungen mit freiem Roridin A nahe, dass MTT-Assay in der Lage war, metabolische Veränderungen zu erfassen, die während einer 5-minütigen Einwirkung induziert wurden. Zusammengenommen legen diese Feststellungen nahe, dass die RA-NR-AN-01-Konjugate die Targezellaktivität spezifisch inhibieren können (d.h. die Proteinsynthese), wenn sie in einer "Puls"-Behandlung verabreicht werden, und dass diese Effekte reversibel waren, ohne signifikante langfristige Effekte auf entweder die Proteinsynthese oder die zelluläre metabolische Aktivität (gemessen in einem MTT-Assay). Diese in vitro Eigenschaften von RA-NR-AN-01-Konjugaten wurden als hochnützlich für die Hemmung der Glatten-Muskelzellaktivität in vivo bewertet.
  • Daher wurden als Nächstes Tiermodellstudien durchgeführt, um die Effekte dieser therapeutischen Konjugate in vivo auszuwerten.
  • BEISPIEL 6
  • Bestimmung der Infusionsbedingungen in einem Tiermodell
  • Die therapeutischen Konjugate der Erfindung sind nützlich, um eine Stenose nach einem Gefäßtrauma oder einer Gefäßerkrankung zu inhibieren. In einem illustrativen Beispiel wird ein Gefäßtrauma, das während Angioplastie induziert wird, während der chirurgischen Prozedur behandelt, indem der Katheter entfernt wird, der zur Durchführung der Angioplastie verwendet wird, und indem ein Balloninfusionskatheter in das Gefäß eingeführt wird. Der Infusionskatheter wird mit der Eintröpfelöffnung (oder alternativ einem permeablen Membranbereich) in dem traumatisierten Bereich des Gefäßes positioniert und dann wird Druck angelegt, um das therapeutische Konjugat einzuführen. Z. B. kann ein Infusionskatheter mit zwei Ballonen verwendet werden, und wenn ein Ballon jederseits des Verletzungsorts aufgepumpt wird, entsteht ein Fluidraum, der mit einem geeigneten Infusionsfluid gefüllt werden kann, das das therapeutische Konjugat enthält. Es ist früher berichtet worden, dass die Infusion von Meerrettichperoxidase (HRP) Markerenzym bei einem Druck von 300 mmHg über 45 Sekunden in Hund- oder Menschen-Coronararterien dazu führte, dass das HRP in die Gefäßwand eindringt (6). Jedoch ist HRP ein kleineres Molekül als NR-AN-01, und Menschen- und Hunde-Coronararterien sind auch beträchtlich kleiner als die Carotis- oder Oberschenkelarterien in dem vorliegenden Hausschwein-Modellsystem. Es wurden daher Experimente ausgeführt, um in einem Hausschwein-Modellsystem die Infusionsbedingungen zu bestimmen, die zum Verabreichen eines therapeutischen Konjugats zu den vaskulären glatten Muskelzellen in Carotis- und Oberschenkelarterien geeignet sind. Die Verabreichungsbedingungen wurden überwacht, indem das Eindringen des therapeutischen Konjugats in die Gefäßwand sowie die spezifische Bindung des therapeutischen Konjugats an die vaskulären glatten Muskelzellen in der Gefäßwand ausgewertet wurden.
  • Unter Verwendung eines Infusionskatheters wurden die Coronar- und Oberschenkelarterien von Hausschweinen oder nicht-menschlichen Primaten mit NR-AN-01 für 45 Sekunden bis 3 Minuten bei mehreren Drücken im Bereich von etwa 0,4 Atmosphären (300 mmHg) bis 3 Atmosphären infundiert. Nach der Infusion wurden die Gefäße mit steriler Salzlösung gespült und immunohistochemisch präpariert, unter Verwendung von HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG, um das NR-AN-01-Maus-IgG in der Gefäßwand zu detektieren. Es wurde bestimmt, dass eine volle Durchdringung von NR-AN-01 in die Gefäßwände bei einem Druck von 3 Atmosphären nach 3 Minuten erreicht wurden.
  • Es wurd auch Immunohistologie verwendet, um zu bestimmen, welche Tiermodellsysteme das Zielantigen für NR-AN-01 exprimiert hatten. Gefäßgewebeschnitte von leicht verfügbaren Versuchstierarten wurden NR-AN-01 ausgesetzt, gewaschen und mit HRP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG in Reaktion gebracht. Es stellte sich heraus, dass nur nicht-menschliche Primaten und Schweine sich 250 kD NR-AN-01 Zielantigen mit dem Menschen teilen.
  • Um zu bestimmen, ob NR-AN-01 in spezifischer Weise an sein Zielantigen in vivo binden könnte, wurden die Coronar- und Oberschenkelarterien von Hausschweinen mit therapeutischen Konjugaten mittels eines Infusionskatheters infundiert, wurden die Infusionsstellen mit steriler Salzlösung gespült und dann wurden die Operationsstellen geschlossen, und die Tiere wurden für zusätzliche 3-5 Tage gehalten. Am Ende dieser Zeit wurden die Gefäßinfusionsstellen herausgenommen und zur Immunohistologie präpariert, wiederum unter Verwendung von Ziegen-anti-Maus-IgG, um NR-AN-01 zu identifizieren. NR-AN-01 wurde in der Gefäßwand von Schweinecoronar- und -oberschenkelarterien 3-5 Tage nach der Operation identifiziert, und es erschien, dass NR-AN-01 nur vaskulären glatten Muskelzellen assoziiert war. Diese Feststellungen legen nahe, dass NR-AN-01 in der Lage ist, spezifisch an sein Zielantigen in vivo zu binden.
  • BEISPIEL 7
  • Hemmung vaskulärer glatter Muskelzellen in vivo
  • Die intimale glatte Muskelproliferation, die einem Ballonkatheter-induzierten Trauma folgt, ist ein gutes Modell, um die therapeutische Wirksamkeit von Konjugaten zur Hemmung der Glatten-Muskelzellaktivität in vivo in Antwort auf ein Gefäßtrauma, einschließlich Restenose nach Angioplastie, auszuwerten. Hausschweine wurden verwendet, um die Effekte von NR-AN-01 zu untersuchen (d.h. in diesen Studien als Glattes-Gefäßmuskelbindungsprotein oder einfach VSMBP bezeichnet; und die therapeutischen Konjugate mit Roridin A sind mit VSMBP-RA bezeichnet). Die Ereignisse, die normalerweise einer Ballonangioplastik in der Schweinearterie folgen, sind zuvor beschrieben worden (12). In diesen Studien führte die Dilatation der Caortisarterie mittels eines übergroßen Ballons (Ballon : Arterienverhältnis angenähert 1,5 : 1) in einer kompletten endothelialen Denudation über einen Bereich von 1,5-2 cm Länge. Obwohl diese Länge der traumatischen Verletzung im Versuch ausgewählt wurde, eine Thrombose zu minimieren, gab es noch immer eine merkliche Plättchenablagerung und Thrombusbildung. Die Prozdur resultierte auch in einer Dissektion durch die interne elastische Schicht in die artielle Media und Necrose der medialen glatten Muskelzellen. Eine Intimaverdickung aufgrund der glatten Muskelproliferation erschien 7 Tage nach der Verletzung und erreichte eine mittlere maximale Dicke von 85 mm nach 14 Tagen. Das histologische Bild dieser Neointima ist sehr ähnlich dem proliferativen neointimalen Gewebe einer humanen Restenose (13).
  • Es wurde ein Einzeldosis-Testprotokoll in Hausschweinen mit NR-AN-01-Roridin A-Konjugaten durchgeführt. Eine lokalisierte Verabreichung der Testkonjugate, d.h. durch einen Katheter in einen Bereich eines traumatisierten Gefäßes, das durch temporäre Schlupfligaturen begrenzt wurde, war ausgestaltet, um die systemische Toxizität zu reduzieren, während für einen hohen Pegel dafür gesorgt wurde, die glatten Zielmuskelzellen auszusetzen. Dieser intraarterielle Verabreichungsweg in Tiermodellstudien simuliert die vorgeschlagene Route in humanen Coronararterien. Das Testprotokoll war ausgestaltet als initiales in vivo Screening von intraarteriolaren, ortsspezifischen, katheterverabreichten, glatten Gefäßmuskelbindungsprotein (VSMBP)-Konjugaten.
  • Die Toxizität des freien Medikaments wurde auch ausgewertet, d.h. für pathobiologische Effekte auf arteriolare glatte Muskelzellen. Die therapeutisch wirksame Dosis von Roridin A-NR-AN-01-Konjugat wurde durch in vitro Studien bestimmt, und der richtige intraarteriolare Verabreichungsdruck wurde bestimmt, indem freie MAb- und MAb-Konjugate Tieren verabreicht wurde, wie oben in BEISPIEL 7 beschrieben.
  • Sechs Mischlings-Hausschweine (Duroc X), entwöhnte Ferkel von angenähert 30 Pfund Körpergewicht, wurden in dem Experiment verwendet. Die Tiere wurden nach Zufall dem folgenden Behandlungsregime zugeordnet, wobei jedes Schwein vier unterschiedliche Behandlungen hatte, aufgeteilt zwischen den rechten und linken Caortis- und Oberschenkelarterien, deren eine eine PBS-Kontrolle war (Tabellen 1-3, unten). Tabelle 1
    Figure 00830001
  • Chirurgisches Verfahren:
  • Testkonjugate und Kontrollverbindungen wurden als einzel-intraarterielle Infusion am Ort der endothelialen Denudierung und des Traumas, induziert durch einen Ballonkatheter, verabreicht. Beide carotiden und Oberschenkelarterien wurden über 1 cm bis 2 cm Endothel durch intraluminale Passage eines 23 cm, Größe 3 (Oberschenkel) und Größe 4 (carotid) Uresil Vascu-Flo® Silikonverschlussballonkatheters (Uresil Technology Center, Skokie, IL) abgeschliffen, ausreichend mit Salzlösung gedehnt, um einen leichten Widerstand zu erzeugen. Diese Technik erzeugte eine leichte Dehnung der Arterie. Nach dieser Behandlung wurden proximate und distale Schlupfligaturen, 3-0 Seide, nahe den Enden des abgeschliffenen Bereichs platziert, und ein Größe 8 French Infant Feeding Katheter (Cutter-Resiflex, Berkeley, CA), der an einer Inflation Pro® (USCI, C. R. Bard, Inc., Billerica, MA) Druckspritze angebracht war, wurde verwendet, um die Testkonjugate und die Kontrollverbindungen direkt zu dem denudierten Segment bei einem Druck von 3 Atmosphären für 3 Minuten zu verabreichen. Die Schlupfligaturen wurden nach der 3-minütigen Aussetzdauer und der Wiederherstellung der arteriellen Bluflusses entfernt. In diesen Studien wurden Zweige der Oberschenkel- oder Carotisarterien mit einer 00 Seidennaht ligiert, um eine Druckinfusion in dem behandelten Bereich zu erreichen. Der größte distale Zweig der Oberschenkelarterie (der Saphena-Arterie) wurde eingeschnitten und als Eintrittsort für die Katheter verwendet, die dann in die Hauptoberschenkelarterie eingeführt wurden. Nach dieser Katheterisierungsprozedur in der Hauptoberschenkelarterie wurde der sekundäre Zweig ligiert. In diesen Fällen wurde Ligation oder Inzision verwendet, um den Eintritt der Katheter zu erlauben, und die Öffnung wurde dann mit 3 bis 4 Nähten aus 5-0 Monosilamen-Polybutester (Novafil, D & G Monofil Inc., Monati, PR) verschlossen.
  • Nachfolgende Verfahren:
  • Nach der Operation wurden die Schweine während der Quarantäne und Operationserholungsdauern in 3 × 5 Fuß Innenlaufställen mit Zementböden gehalten. Sie wurden dann für den Rest der 5-wöchigen Heilungsdauer vor dem Sammeln der Gewebe zur Histologie zu Innen/Außenlaufställen transferiert. Die Tiere erholten sich von der Operation normal, ohne Evidenz einer Blutung oder Entzündung an den Operationsstellen. Alle sechs Tiere wurden 5 bis 6 Tage nach der Behandlung mit einem Dopplerstethoskop untersucht, und in jedem der Tiere waren alle Arterien durchgängig. Nach der Behandlung hatten alle Tiere einen normalen Appetit, normale Aktivität und normale Gewichtszunahme.
  • Makroskopische pathologische und histologische Auswertung:
  • Fünf Wochen nach der Traumatisierung und Behandlung der Arterien wurden die Tiere mit 0,6 ml Telazol® (Tiletaminhydrochlorid; A. H. Robins Co., Richmond, VA) und 0,5 ml Xylazin (Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA) pro 30 Pfund Körpergewicht durch intramuskulare Injektion sediert, heparinisiert (i.v. 2 ml Natriumheparin, 1000 Einheiten/ml) und durch im. Pentobarbital euthanasiert. Es wurden beide rechten und linken Carotis- und Oberschenkelarterien entfernt, wobei das normale Gefäß sowohl das proximale als auch das distale bis zum behandelten Segment enthielt. Die Arterien wurden gemessen und der Ort der Ligaturen und allgemeine Abnormalitäten wurden notiert. Die Arterien wurden mit 2 mm Abständen durch Schnitte und in der Reihenfolge in Cryoform mit O.C.T (optimaler Schneidtemperatur) Verbindung (Tissue Tek®, Miles Laboratories Inc., Elkhart, IN) angeordnet und in flüssigem Stickstoff gefroren. Die Blöcke wurden auf 5 um geschnitten und mit H/E, Massons Trichrome und Movats Pentachrome für morphologische Untersuchungen gefärbt. Die Schnitte wurden auch für die immunohistologische Färbung von glattem Gefäßmuskel verwendet.
  • Die histologische Untersuchung der Stufenschnitte der Arterien ergab eine merkliche Hemmung der intimalen Glatten-Muskelproliferation in den Bereichen, die traumatisiert und mit RA-NR-AN-01-Konjugaten behandelt waren (Tabelle 2). Diese Hemmung war auch in der submakroskopischen Auswertung der Gefäße evident. Die Hemmung der intimalen Glatten-Gefäßmuskelproliferation wrude mit minimaler oder keiner histologischen Evidenz des Glatten-Muskelzelltodes in der Arterienwand erzeugt. Ein Querschnitt einer solchen traumatisierten Arterie ist in den 9A und 9B angegeben. Tabelle 2 INTIMALE GLATTE GEFAßMUSKELPROLIFERATION IN TRAUMATISIERTEN UND BEHANDELTEN SCHWEINEARTERIEN
    Figure 00860001
    • *Intimale SMC-Hypertrophie: intimale Glatte-Muskelzellhypertrophie, bewertet auf einer Skala von 1+ (minimal) bis 4+ (maximal)
  • Die in 9A dargestellten Ergebnisse zeigen (bei 160-facher Vergrößerung) einen Querschnitt einer unbehandelten Arterie 5 Wochen nach Angioplastie. Dominante histologische Merkmale der Arterie enthalten eine Verlagerung des Endothels (siehe #1 in 9A) von der internen elastischen Schicht weg (sie he #2, 9A), scheinbar aufgrund der intimalen Glatten-Muskelproliferation (siehe #3, 9A).
  • Die in 9B dargestellten Ergebnisse zeigen (bei 160-facher Vergrößerung) einen Querschnitt einer behandelten Arterie 5 Wochen nach Angioplastie und Infusion des therapeutischen RA-NR-AN-01-Konjugats. Das Gefäß in diesem Schnitt wurde größeren mechanischen Belastungen unterzogen als das in 9A gezeigte Gefäß, mit mehreren Stellen, wo die externe elastische Membran riss, und es wurde eine zugeordnete Proliferation glatter Muskelzellen in den äußeren Schichten der Media beobachtet (siehe #4 in 9B). Die Behandlung mit therapeutischem Konjugat hemmte die intimate Hypertrophie, wie sich aus dem Fehlen der Verlagerung des Endothels (siehe #1, 9B) von der internen elastischen Schicht (siehe #2, 9B) ergibt. Überraschenderweise wurde dieser inhibitorische Effekt auf die intimalen glatten Muskelzellen erreicht, ohne die Hypertrophie der medialen glatten Muskelzellen in Bereichen zu inhibieren, wo die externe elastische Membran gerissen war (siehe #4, 9B).
  • Dies ist ein besonders glückliches Ergebnis, weil die Wundheilung in dem behandelten Gefäß fortschreitet, ohne nachteilige Konsequenzen der Intimahyperplasie und Stenose oder Nekrose glatter Muskelzellen in der Media.
  • In diesen histologischen Studien wurden auch Vergleiche der Wirksamkeit sowohl des 2'- als auch 13'-Roridin A-Konjugats durchgeführt, mit der Feststellung, dass das 13'-Konjugat (d.h. 13'RA-HS-NR-AN-01) stärker aktiv bei der Hemmung der intimalen Hyperplasie der glatten Muskelzellen erschien als das 2'-Konjugat (d.h. 2'RA-HS-NR-AN-01). In dieser Studie schien die Niederdruckinfusion des 13'-Konjugats die glatte Muskelzellproliferation effizienter zu inhibieren als der hohe Druck, und auch das 13'-Konjugat schien effizienter zu sein als das 2'-Konjugat.
  • In 9B führte das therapeutische Konjugat, das am Ort nach Angioplastie verabreicht wurde, in einer angenähert 95%igen Hemmung der Glatten-Muskelhypertrophie, die das Lumen des unbehandelten Gefäßes einschränkte (9A). Das therapeutische Konjugat übte signifikant seine Effekte auf die glatten Muskelzellen aus, die von den medialen glatten Muskelschichten in die Intima wandern, ohne das Endothel zu beeinträchtigen noch irgend welche Anzeichen von Nekrose (d.h. Zelltod) in den glatten Muskelzellen in den medialen Schichten der Arterienwand zu erzeugen. Die Studien zeigten auch keinerlei histologische Anzeichen einer mononuklearen Infiltration oder Fibrose, die aus toxischen Effekten auf die Gefäßwand resultieren könnten. Auch wurden sichtbare Anzeichen der Heilung in den intimalen Schichten behandelter Gefäße beobachtet, und mit beobachtetem Nachwachstum des Endothels, d.h. Endothelzellen, die über die dünne Schicht glatter Muskelzellen in der Intima hinweg wachsen, die zwischen dem Endothel und der internen elastischen Schicht liegen (d.h. # 1 und #2 in 9B). Diese kombinierten histologischen Beobachtungen belegen die hocherwünschten Merkmale der Wundheilung, des Neuwachstums von Endothel und einer verbesserten Gefäßstabilität nach einer Behandlung mit einem therapeutischen Konjugat, das Glatte-Muskelhyperplasie in den intimalen Schichten des Gefäßes hemmt.
  • BEISPIEL 8
  • Glatte-Gefäßmuskelzell-in vitro-DNA- und Proteinsynthesehemmung
  • Die Fähigkeit verschiedener therapeutischer Mittel, die DNA-Synthese und Proteinsynthese in vaskulären glatten Muskelzellen zu inhibieren, wurde getestet. 3H-Thymidinaufnahme und Zytotoxizitätsassays wurden gemäß den folgenden Protokollen durchgeführt.
  • 5-Minuten-Exposition: 3H-Leucinaufnahme:
  • Vaskuläre glatte Muskelzellen wurden mit 40.000 Zellen/ml in sterile 24 Wellplatten mit 1 mIM/ell angesetzt. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C, 5% CO2, 95 Luft in einer angefeuchteten Atmosphäre (Sättigung) inkubiert. Logarithmische Verdünnungen des interessierenden therapeutischen Mittels wurden mit vaskulären glatten Muskelzellen für 5 Minuten oder 24 Stunden inkubiert. Proben der therapeutischen Mittel wurden in DMEM F-12 Medium (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) mit 5%igem fötalem Rinderserum (FBS, Gibco BRL, Gaithersbur, MD) und 5% Serum Plus® (JRH Biosciences, Lenexa, KS) verdünnt. Nach der Inkubation mit therapeutischem Mittel wurde die Lösung abgesaugt, und es wurde 1 ml/Well von 0,5 Mikrocurie/ml 3N-Leucin in leucinfreiem DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) mit 5% Serum Plus hinzugefügt. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C, 5% CO2 in angefeuchteter Atmosphäre nachinkubiert. Die Zellen wurden visuell mittels eines Umkehrmikroskops unter Verwendung einer Bewertungsskala eingeteilt, um die Lebensfähigkeit und Zellzahl zu bestimmen. Die 1 bis 3 Einteilung basiert auf dem Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit und der Anzahl im Vergleich zu Kontrollwells, wobei 3 = 100%, 2 = 70% bis 100% und 1 = 0% bis 70%. Eine Aufzeichnung dieser Bewertung unterstützte die Bestimmung des unmittelbaren zytotoxischen Effekts der therapeutischen Mittel. Das Medium wurde dann abgesaugt, und die Zellen wurden zwei Mal mit kaltem 5%igem TCA gewaschen. 400 Mikroliter 0,2 M NaOH wurden pro Well hinzugefügt, und die Platten wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform inkubiert. 200 Mikroliter/Well der Zelllösung wurden in Kunststoffszintillationsfläschchen überführt (Bio-Rad Laboratories), und 4 Milliliter Bio-Safe® II flüssige Szintillationsflüssigkeit (Research Products InterCorp. Mount Prospect, IL) wurden vor dem Umrühren hinzugefügt. Die Fläschchen wurden an einem Beckman LS2800 Flüssigszintillationszählergezählt, Schnittstelle mit Beckman "Data Capture" Software zur Umwandlung in eine Lotus 1-2-3® Datei und Analyse mittels Lotus 1-2-3®.
  • 5-Minuten Exposition: 3H-Thymidinaufnahme: _
  • Vaskuläre glatte Muskelzellen wurden in einem vollständigen Medium mit 5% FBS (Gibco) über Nacht bei 37°C in einer angefeuchteten 5%igen CO2 Umgebung in sterilen 24 Wellplatten inkubiert. Das Medium wurde von den Wells abgesaugt, und serumfreies Medium wurde hinzugefügt, ergänzt mit Wachstumsfaktoren (DMEM : F12 Grundmedium, ergänzt mit einem Wachstumsfaktorcocktail, Katalognummer 11884, welches enthält Insulin (5 Mikrogramm/ml), Transferrin (5 Mikrogramm/ml) und Natriumselenit (5 Nanogramm/ml), erhältlich bei Sigma Chemical, St. Louis; Missouri). Die Zellen wurden in diesem Medium für 24 Stunden inkubiert. Für eine 5-minütige Exposition einem therapeutischen Mittel wurden logarithmische Verdünnungen des therapeutischen Mittels mit den Zellen in komplettem Medium inkubiert. Nach 5 Minuten und Absaugen des Mediums wurden 1 ml/Well von 1,0 Mikrocurie/ml 3H-Thymidin, dispergiert in komplettem Medium, hinzugefügt. Die 24-stündige Exposition involvierte die Inkubation der Zellen mit 1 ml/Well von 1,0 Mikrocurie/ml von 3H-Thymidin, dispergiert in einem kompletten Medium, und es wurden logarithmische Verdünnungen des therapeutischen Mittels getestet. In beiden Expositions-Versuchen wurden die Zellen über Nacht bei 37°C in einer angefeuchteten 5%igen CO2 Umgebung behandelt. Die Zellen wurden auf Lebensfähigkeit und Zellzahl visuell bewertet. Die Zellen wurden gewaschen und präpariert, um sie in Kunststoffszintillationsfläschchen zu überführen, wie für das 3H-Leucinprotokoll beschrieben. Die Fläschchen wurden an einem Beckman LS2800 Flüssigszintillationszähler gezählt, mit Schnittstelle zu Beckman "Data Capture" Software zur Umwandlung in eine Lotus 1-2-3® Datei und Analyse mittels Lotus 1-2-3®.
  • Diese Protokolle sind zur Verwendung mit anderen Zielzellpopulationen geeignet, insbesondere adhärenten einschichtigen Zelltypen.
  • Morphologische Auswertung der Zytotoxizität-Puls-Exposition:
  • Vaskuläre glatte Muskelzellen wurden mit 4,0 × 104 Zellen/ml Medium/Weil auf einem kommerziell vorbereiteten Vierwellobjektträger (Nunc. Inc., Naperville, Illinois) angesetzt. Es wurden ausreichend Objektträger angesetzt, um zwei gepulste Expositionsdauern (5 Minuten und 24 Stunden) sowie eine vorgeschriebene Stufung von Auswertungspunkten (24 Stunden bis 128 Stunden) aufzunehmen. Alle Objektträger wurden doppelt gefahren, um etwaige Assayanomalien zu entdecken. Der therapeutische Mittel wurde in dem gleichen Medium verdünnt, das in den 3H-Leucin- und 3H-Thymidinassays benutzt wurde. Jeder Vierwellobjektträger wurde konzentrationsmäßig gruppiert, zu einer loggrößeren Konzentration (Welt "B"), einer log-niedrigeren Konzentration (Welt "D"), der minimalen wirksamen Konzentration (Weil "C"), bestimmt durch die 3H-Leucin- und 3H-Thymidinassays, wie oben beschrieben. Als Kontrolle für normale Morphologie wurde ein Well (Weil "A") unbehandelt belassen (nur Medium). Die Inkubation erfolgte in einem 37°C, 5 % CO2 befeuchteten Inkubator. Nach jeweils zwei (5 Minuten und 24 Stunden) Expositionspunkten wurde das therapeutische Mittelmedium aus jedem Well abgesaugt, einschließlich dem unbehandelten Well. Dann wurde 1 ml frisches Medium hinzugefügt, um das abgesaugte Medium zu ersetzen. Die Reinkubation erfolgte, bis jeder der gestuften Auswertungspunkte erreicht wurde. An diesen Punkten wurde das Medium abgesaugt und anschließend durch 1 ml 10%igem neutral gepufferten Formalin für 1 Stunde ersetzt, um die richtige Fixierung zu erlauben. Diese fixierten Objektträger wurden in Hematoxylin (nuklear) und Eosin (zytoplasmatisch) zur morphologischen Auswertung und Einteilung gefärbt.
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse des 24-Stunden 3H-Leucin-Proteinhemmassays und des 24-Stunden 3H-Thymidin-DNA-Synthesehemmassays sind in den 10A-10D für Suramin, Staurosporin, Nitroglycerin bzw. Cytochalasin B gezeigt. Alle der getesteten Verbindungen zeigten einen verfügbaren therapeutischen Bereich (die Fläche unter der Kurve des 3H-Leucin-Assays ist größer als jene, die von dem 3H-Thymidin-Assay herrührt), was die Nützlichkeit in der Praxis von Retarddosierungsform Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anzeigt. Insbesondere hemmten die Verbindungen die Fähigkeit vaskulärer glatter Muskelzellen, einer DNA-Synthese zu unterliegen, in der Gegenwart von 5% FPS um ein größeres Ausmaß als sie die Proteinsynthese vaskulärer glatter Muskelzellen hemmten. Die Protein- und DNA-Synthesehemmeffekte von Suramin, Staurosporin, Nitroglycerin und Cytochalasin B während einer 5-minütigen und 24-stündigen gepulsten Exposition sind jeweils in 10A-D gezeigt.
  • BEISPIEL 9
  • Spezifische Bindung und Internalisierung von targetisierten Partikeln durch vaskuläre glatte Muskelzellen
  • Die Fähigkeit vaskulärer glatter Muskelzellen, an mit Bindungsprotein oder – peptid beschichtete Partikel zu binden oder diese zu internalisieren, wurde mit monoklonalem Antikörper (NR-AN-01) beschichteten Goldkügelchen sowol in vitro als auch in vivo demonstriert. Die Glatten-Gefäßmuskelzell-Gewebekulturen (B054), eine antigenpositive Kontrollzelllinie (A375) sowie eine antigennegative Kontrollzelllinie (HT29) wurden mit 10 nm Goldkügelchen inkubiert, mit einer Gruppe, die mit NR-AN-01 beschichtet war, und einer zweiten unbeschichteten Kontrollgruppe. Diese Zellen wurden den Kügelchen als einschichtige und Zellsuspensionskulturen ausgesetzt, und wurden auf Bindung und Internalisierung durch Elektronenmikroskopie zu sechs Zeitpunkten überprüft (d.h. 1 Minute, 5 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 50 Minuten und 24 Stunden).
  • Tabelle 3 zeigt diese Ergebnisse der Experimente, was anzeigt, dass die Bindung an die Zelloberfläche spezifisch ist. Das relative Einteilungssystem, das in Tabelle 3 insgesamt verwendet wurde, repräsentiert eine subjektive Bewertung der Partikelbindung, wobei 0 = keine, 1 = minimal, 2 = mäßig, 3 = moderat und 4 = deutlich. Wenn sich Partikelaggregate auf der einschichtigen Oberfläche sowohl der glatten Muskelzellen als auch der Kontrollzellen ansiedelten, wurden die Partikel durch Makro- und Mikrophagozytose nicht spezifisch internalisiert. Wenn die Zellen in der Zellsuspension verblieben, war die nicht spezifische Internalisierung minimal oder fehlte. Das nicht spezifosche Anhaften der Goldperlen ohne NR-AN-01 auf dem von HT29-Zellen erzeugten Oberflächenmucin wurde beobachtet, was zur mäßigsten nicht spezifischen Internalisierung davon führte. Die Glatte-Gefäßmuskel-Aufnahme von NR-AN-01 targetisierten Goldperlen war in Zellsuspensionskulturen hochspezifisch.
  • Figure 00940001
  • Figure 00950001
  • Figure 00960001
  • 11 zeigt einen tangentialen Schnitt parallel zur Innenoberfläche einer glatten Muskelzelle, gekennzeichnet durch zahlreiche endocytische Vesikel, von denen einige antikörperbeschichtete Goldperlen enthalten, im Prozess der Internalisierung durch die Zelle. Diese endocytischen Vesikel mit an Zelloberflächenantigenen haftenden Partikeln wurden zur Verschmelzung mit Lysosomen angeregt, mit einer höheren als der erwarteten Rate für den normalen Zelloberflächenmembranumsatz. Die resultierende merkliche Ansammlung internalisierter Partikel wurde an dem 24-stündigen Zeitpunkt beobachtet und ist in 12 gezeigt.
  • Die targetisierte Goldperlen-Glatte-Gefäßmuskelzell-Oberflächenbindung, Internalisierung und Lysosomenkonzentration wurde auch in vivo beobachtet. NR-AN-01-beschichtete Goldperlen wurden über einen intravaskulären Katheter infundiert, offenendig mit einem behandelten Bereich, der proximal und distal mit Schlupfligaturen verschlossen war, bei 3 atm Druck angelegt für 3 Minuten in die Wand einer Schweineoberschenkelarterie unmittelbar nach einem Ballontrauma. Die Kügelchenintemalisierungsrate variierte mit dem Grad der Beschädigung, der während des Ballontraumas von der vaskulären glatten Muskelzelle gehalten wurde. Zellen mit minimaler oder keiner Beschädigung internalisierten die Partikel durch Endozytose und Phagozytose schnell, wobei die internalisierten Partikel in Lysosomen konzentriert wurden.
  • Zellen, die durch das Trauma getötet wurden, zeigten eine Oberflächenperlenbinden. Zellen, die durch das Trauma beschädigt wurden, jedoch überlebten, waren durch Perlenoberflächenbindung mit verzögerter Internalisierung und Lysosomenkonzentration gekennzeichnet. 13 zeigt die Partikelkonzentration in Lysosomen in vivo eine Woche nach Verabreichung der Kügelchen.
  • BEISPIEL 10
  • Glatte Gefäßmuskel in vitro DNA- und Proteinsynthesehemmung durch Staurosporin und Cytochalasin Die Fähigkeit von Staurosporin und Cytochalasin, DNA- und Proteinsynthese in vaskulären glatten Muskelzellen in vitro zu inhibieren, wurde getestet. 3H-Leucin- und 3H-Thymidinaufnahme und Zytotoxizitätsassays wurden gemäß den folgenden Protokollen durchgeführt.
  • Kulturzellen:
  • B054-Zellen (vaskuläre glatte Muskelzellen vom Pavian) wurden von Explantaten von Aorta-Glatten-Gefäßmuskelzellen vom Pavian erhalten. Die Zellen wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium): F-12 Medium (Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS, Gibco) und 5% Serum Plus® ("komplettes Medium") ausgebreitet, und eine Ansatzmenge von Zellen wurde im flüssigen Stickstoff zur künftigen Verwendung in Durchlauf sieben gefroren.
  • 5 Minuten-Exposition: Proteinsyntheseassay:
  • Vaskuläre glatte Muskelzellen mit 40.000-50.000 Zellen/ml wurden angesetzt und bearbeitet, wie in BEISPIEL 8 beschrieben, "5 Minuten Exposition; 3H-Leucinaufnahme". Logarithmische Verdünnungen von Staurosporin (200 ng/ml, 20 ng/ml, 2 ng/ml, 0,2 ng/ml und 0,02 ng/ml) wurden im kompletten Medium verteilt. Für Cytochalasin B wurden log-Verdünnungen mit 20 pg/ml, 2,0 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml und 0,002 pg/ml im kompletten Medium verteilt. Das komplette Medium wurde dann zu den Kontrollwells gegeben. Ein ml/Well jeder therapeutischen Mittelverdünnung wurde in Vierfachwells gegeben, und der interessierende Mittel wurde mit den vaskulären glatten Muskelzellen für 5 Minuten bei Raumtemperatur in einer steril gelüfteten Haube inkubiert. Nach der Inkubation des therapeutischen Mittels wurden die Wells anschließend so behandelt, wie in BEISPIEL 8 beschrieben, "5 Minuten Exposition; 3H-Leucinaufnahme".
  • 5 Minuten Exposition: DNA-Syntheseassay:
  • Glatte Gefäßmuskel (B054) Zellen wurden in 24 Wellplatten ausgesetzt und verarbeitet, wie oben beschrieben, unter "5 Minuten Exposition: Proteinsyntheseassay". Nach 5 Minuten Inkubation mit dem therapeutischen Testmittel wurde das Medium abgesaugt, und 1 ml/Welt von 1,0 pCi/ml 3H-Thymidin (anstatt von 3H-Leucin), dispergiert im kompletten Medium, wurde hinzugefügt. Die Zellen wurden dann über Nacht bei 37°C in einer feuchten 5 % CO2 Umgebung inkubiert. Der toxische Effekt des therapeutischen Mittels wurde dann bestimmt, wie oben in dem Proteinsyntheseassay beschrieben.
  • 24 und 120 Stunden Exposition: Proteinsyntheseassay:
  • Glatte Gefäßmuskel (B054) Zellen mit 20.000 Zellen/ml wurden in sterilen 24 Wellplatten angesetzt und im kompletten Medium (1 ml/Well) über Nacht bei 37°C, 5% CO2, 95% Luft in einer feuchten Atmosphäre (Sättigung) inkubiert. Log-Verdünnungen von Staurosporin (100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml und 0,01 ng/ml) wurden sequenziell in den zwei Medien verteilt, wie oben beschrieben. Für Cytochalasin B wurden log-Verdünnungen mit 10 pg/ml, 1,0 pg/ml, 0,1 pg/ml, 0,01 pg/ml und 0,001 pg/ml sequenziell in den zwei Medien verteilt, wie oben beschrieben:
    Medium (1) = komplettes Medium; und
    Medium (2) = DMEM (Leucin-frei) mit 0,5 pCi/ml 3H-Leucin.
    Medium (2) wird für die letzte 24 Stunden Inkubationsdauer des Experiments verwendet.
  • Insbesondere wurde in dem 24 Stunden-Assay jeder therapeutische Mittel in dem Medium (2) verdünnt, wie oben erwähnt. Medium (1) wurde aus den Wells abgesaugt, und Aliquots therapeutischer Mittelverdünnungen in Medium (2) wurden vierfach zu den geeigneten Wells gegeben. Medium (2) wurde dann zu den Kontrollwells gegeben.
  • In dem 120 Stunden-Assay wurde jeder therapeutische Mittel in Medium (1) verdünnt, wie oben erwähnt. Medium (1) wurde von den Wells abgesaugt, und Aliquots der therapeutischen Mittelverdünnungen in Medium (1) wurden vierfach zu den geeigneten Wells gegeben. Medium (1) wurde dann zu den Kontrolwells gegeben. Das Medium wurde alle 24 Stunden gewechselt, und es wurde frischer therapeutischer Mittel zu den Testwells gegeben. Bei 96 Stunden (d.h. dem vierten Tag) wurde jeder therapeutische Mittel in Medium (2) verdünnt, wie oben erwähnt. Medium (1) wurde von den Wells abgesaugt, und Aliquots der therapeutischen Mittelverdünnungen in Medium (2) wurden vierfach zu den geeigneten Wells gegeben. Medium (2) wurde dann zu den Kontrollwells gegeben.
  • Die Testmittel in 3H-Leucin (und Kontrollen) wurden über Nacht bei 37°C, 5% CO2 in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Der toxische Effekt der therapeutischen Mittel wurde dann bestimmt, wie oben beschrieben in 5 Minuten Exposition: Proteinsyntheseassay, oben beschrieben. Zusätzlich wurden Änderungen in den Zellen bei jeder Verdünnung mittels eines Zeiss Mikroskops (Zeiss, Westdeutschland) bei 320X fotografiert. Das Medium wurde dann abgesaugt und die Zellen wurden mit TCA bearbeitet, wie oben beschrieben.
  • 24 und 120 Stunden Exposition: DNA-Syntheseassay:
  • Dieser Assay wurde entsprechend der Prozedur durchgeführt, wie beschrieben für " 24 und 120 Stunden Exposition: Proteinsyntheseassay", außer dass Medium (2) in diesem 24 und 120 Stunden DNA-SYntheseassay ist:
    Medium (2) = komplettes Mediudum mit 1,0 pCi/ml 3H-Thymidin.
  • Medium (2) wird für die letzte 24-stndige Inkubation des Experiments verwendet.
  • Diese Protein- und DNA-Syntheseassays sind zur Verwendung mit anderen Zielzellpopulationen geeignet, insbesondere anhaftende einschichtige Zelltypen.
  • Ergebnisse:
  • Die minimal wirksame Dosis (MED) jedes Mittels wurde als Prozentsatz der Kontrolle bestimmt, die nur mit Medium behandelt wurde; 50% der Kontrollwerte wurden als die zytotoxische Grenzmarke gewählt. Bei 5 Minuten Exposition zeigte Staurosporin ein MED von 100 ng/ml in dem Proteinsyntheseassay und 1 ng/ml in dem DNA-Assay. Die 24 Stunden MED für Staurosporin war 10 ng/ml in dem Proteinsyntheseassay und 1 ng/ml in dem DNA-Syntheseassay. Beide Assays ergaben eine MED von 1 ng/ml für eine 120 Stunden Exposition von Staurosporin.
  • Nach 5 Minuten Exposition zeigte Cytochalasin B eine MED von 10 pg/ml in dem Proteinsyntheseassay sowie auch in dem DNA-Assay. Die 24 Stunden MED für Cytochalasin B war 1,0 pg/ml in dem Proteinsyntheseassay und 0,1 pg/ml in dem DNA-Syntheseassay. Beide Assays ergaben eine MED von angenähert 0,1 pg/ml für eine 120 Stunden Exposition von Staurosporin.
  • Therapeutische Cytochalasin C und Cytochalasin D-Mittel wurden in 24 und 48 Stunden Expositionen unter Verwendung der gleichen Verdünnungen getestet, wie sie oben für Cytochalasin B beschrieben sind. In 24 Stunden zeigte Cyto chalasin C eine MED von 1,0 pg/ml in dem Proteinsyntheseassay und eine MED 0,01 pg/ml in dem DNA-Syntheseassay. In 24 Stunden zeigte Cytochalasin C eine MED von 0,1 pg/ml in dem Proteinsyntheseassay, und 0,01 pg/ml in dem DNA-Syntheseassay. Cytochalasin D zeigte eine MED von 1,0 pg/ml in dem 24 Stunden Proteinsyntheseassay, und eine MED von 0,1 pg/ml in dem 24 Stunden DNA-Syntheseassay. Eine 48 Stunden Exposition für Cytochalasin D ergab eine MED im Bereich zwischen 0,1 und 0,01 pg/ml sowohl in den Proteinsynthese- als auch DNA-Syntheseassays.
  • BEISPIEL 11
  • Migrationshemmung der vaskulären glatten Muskelzellen
  • Es wurden Kratzassays gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt, um das Ausmaß der Migrationshemmung der vaskulären glatten Muskelzellen durch Cytochalasin B zu bestimmen:
    Vaskuläre glatte Muskelzellen (B054) wurden aus Explantaten des glatten Aortenmuskels vom Pavian erhalten, wie in BEISPIEL 10 beschrieben. Die Zellen wurden in flachbödigen 6 Well-Gewebekulturplatten gezüchtet, die etwa 5 ml Medium enthielten. Die vaskulären glatten Muskelzellen wurden mit 200.000 Zellen/Well plattiert und bei 37°C in einem befeuchteten 5% CO2 Inkubator für 18 Stunden platziert. Die Wells wurden dann mit einem sterilen Teil einer einschneidigen Rasierklinge abgekratzt, die mit einer Klemme oder einer Pinzette gehalten wurde, und wurden aseptisch mit einem 90°-Winkel in Kontakt mit dem Boden des Wells gebracht. Die Zellen von der kleinen Fläche entlang dem Kratzer wurden mit einem sterilen Baumwollspitzenapplikator entfernt, während die Klinge in Kontakt mit dem Boden des Wells war. Nach der Inkubation zeigt das Vorhandensein der Zellen in der "abgekratzten" Fläche die Zellmigration über die Kratzlinie hinweg an. Eine Kontrollinkubation zeigte eine signifikante Zellmigration und dient als Standard, gegenüber dem die Migration der Zellen, die dem therapeutischen Mittel ausgesetzt waren, verglichen wird.
  • Kurz gesagt, wurde eine Vorratslösung von Cytochalasin B (Simga Chemical Co.) in Dimethylsulfoxid (DMSO) mit 1 mg/ml hergestellt. Testverdünnungen von Cytochalasin B oder Kontrollmedium wurden hinzugefügt. Jedes Experiment enthielt zwei Sätze von Platten:
    Satz A: Testmittel-Exposition für nur 1, 3, 6, 8 und 10 Tage; und
    Satz B: Testmittel-Exposition für 1, 3, 6, 8 und 10 Tage, gefolgt von einer siebentägigen Erholungszeit mit Kontrollmedium.
  • Am Ende der zeitgesteuerten Expositionen wurden beide Plattensätze fixiert (10% Formalin in PBS) und gefärbt (0,02% Kristallviolett). Die Testkonzentrationen für Cytachalasin B waren 1, 01 und 0,01 pg/ml, und eingeschlossen war eine negative Mediumkontrolle. Frisches Medium und Medikament wurden drei Mal pro Woche zugeführt.
  • Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse dieser Experimente. In dieser Tabelle bezeichnet "M" den Migrationsgrad, wobei – = keine Migration; +1 = minimal; +2 = mäßig; +3 = moderat; und +4 = deutlich (maximale Dichte; Grenze der Zellkontakthemmung) Migration vaskulärer glatter Muskelzellen in den freien Bereich neben dem Kratzer. In dieser Tabelle bezeichnet "T" einen morphologischen Toxizitätsgrad; wobei – = keine Toxizität; +1 = minimal; +2 = mäßig; +3 = moderat; und +4 = deutliche Toxizität. Die Migrationsergebnisse sind ausgedrückt als "Grad in dem freien Bereich des Wells; Grad in einem ungestörten Bereich des Wells). Die Toxizitätswerte repräsentieren einen Grad für alle Zellen in jedem Well.
  • Die Daten zeigen an, dass Cytochalasin B die Migration vaskulärer glatter Muskelzellen in dem freien Bereich benachbart dem Kratzer hemmt (+1 bis +2) bei einer Dosis von 0,1 pg/ml mit nur minimaler (- bis +1) morphologischer Toxizität. Die Daten zeigen auch, dass die behandelten Zellen (0,1 pg/ml) die Migra tionsfähigkeit wiedergewinnen (+3 bis +4) nach der Entfernung des therapeutischen Mittels, auch nach 10 Tagen fortlaufender Exposition dem therapeutischen Mittel. Tabelle 4 KRATZ-MIGRATIONSASSAY: MIGRATIONSHEMMUNG GLATTER GEFASSMUSKELZELLEN DURCH CYTOCHALASIN B
    Figure 01040001
  • BEISPIEL 12
  • Zytotoxische Effekte des therapeutischen Mittels auf vaskuläre glatte Muskelzellen -Puls- und kontinuierliche Exposition
  • Vaskuläre glatte Muskelzellen wurden einem therapeutischen Mittel in einem von zwei Expositionsformaten ausgesetzt:
    Puls-Exposition: Das Puls-Expositionsprotokoll ist oben in BEISPIEL 8 beschrieben (siehe "Morphologische Toxizitätsauswertung – Puls-Exposition").
  • Kontinuierliche Exposition:
  • Es wurde die gleiche Methodik für die morphologische Toxizitätsauswertung der kontinuierlichen Exposition verwendet wie für die Puls-Exposition, mit der Ausnahme, dass die Testwells kontinuierlich dem therapeutischen Mittel in dem Medium während der Expositionsdauer ausgesetzt wurden. Das Medium und der therapeutische Mittel wurden aus jedem Well täglich abgesaugt, einschließlich von dem unbehandelten Kontrollwell, und wurden mit 1 ml frischem Medium und therapeutischem Mittel ersetzt (oder Medium allein für die Kontrollwells). Es folgte eine Reinkubation, bis jeder der stufigen Auswertungspunkte des langfristigen kontinuierlichen Expositionsprotokolls erreicht war. Diese gestuften Auswertungszeitpunkte lagen bei 6, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 216 und 264 Stunden. Zu der bezeichneten Zeitspanne wurden die jeweiligen Zellen fixiert, gefärbt und ausgewertet, wie in dem Puls-Expositionsprotokoll. Die Ergebnisse eines kontinuierlichen Expositionsexperiments sind in Tabelle 5 für Suramin, Staurosporin und Cytochalasin B gezeigt. Die in Tabelle 5 dargebotenen 5 Minuten- und 24 Stundendaten sind Korrelate der Daten, die in den 10A, 10B und 10C enthalten sind. Tabelle 5
    Figure 01060001
  • In einer in vitro-wirksamen Dosierung zeigten Cytochalasin B (1 pg/ml; eine antimigratorische konzentrationswirksame Dosis) und Staurosporin (1 ng/ml; eine antiproliferative wirksame Dosis) einen Toxizitätsgrad von 1 (minimal) bzw. 2 (mäßig). Unabhängige Studien haben aufgezeigt, dass ein Grad von 3 (moderat) oder weniger für einen zytostatischen, antiproliferativen Mittel der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist.
  • BEISPIEL 13
  • In vivo BRDU Assav: Hemmung der Glatten-Gefäßmuskel-Proliferation BRDU Assav:
  • In vivo Glatte-Gefäßmuskel-Proliferation wurde quantifiziert durch Messung der Aufnahme des Basisanalogen 5-Borm-2'-deoxyuridin (BRDU, erhältlich bei Sigma Chemical Co.) in DNA während der zellulären DNA-Synthese und Proliferation. Die BRDU-Aufnahme wurde histochemisch mittels monoklonaler Anti-BRDU-Antikörper aufgezeigt. Diese einstündige Pulsmarkierung gestattet die Auswertung der Zellenanzahl, die während der Pulsperiode einer Teilung unterliegen.
  • Das oben beschriebene BRDU-Pulsmarkierungsprotokoll wird als Standardauswertungstechnik mit in vivo Schweine-Gefäßstudien verwendet. Die folgenden chirurgischen und Behandlungsverfahren (hierin z.B. in den Beispielen 7 und 11 diskutiert) und einer postoperativen Erholungsdauer wurden die Schweine sediert und 1 Stunde vor dem Sammeln des Gewebes mit BRDU gepulst.
  • Kurz gesagt, die Schweine wurden durch intramuskuläre Injektion mit Triletaminhydrochlorid und Xylazin sediert (wie in Beispiel 7, "Allgemeine Pathologie und histologische Auswertung"). Das BRDU wurde dann intravenös über die laterale Ohrvene verabreicht. Jedem 30-40 Pfund Schwein wurden zwei ml BRDU bei einer Konzentration von 50 mg/ml verabreicht. Eine Stunde später wurden die Schweine durch intravenös verabreichtes Pentobarbital getötet. Dann wurden Testarteriensegmente entfernt (ein Segment enthielt ein proximal angeordnetes normales Gefäß, und falls möglich, distal in Bezug auf das behandelte Arteriensegment). Die Arteriensegmente wurden in 2 mm Abständen durchschnitten; der Reihenfolge nach in Cryoformen mit O.C.T. (optimaler Schneidtemperatur) Verbindung (Tissue Tek®, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN) angeordnet; und in flüssigem Sticktstoff gefroren. Die Blöcke wurden auf 5 Mikrometer geschnitten und mittels der folgenden Prozedur immunohistologisch gefärbt, um BRDU zu erfassen:
  • BRDU-markierte Zellerfassung:
  • Nach der BRDU (1 g BRDU, verdünnt in 17 ml sterilem Wasser und 3 ml 1 N NaOH) Pulsmarkierung, Entfernung und Schnitt des Testarteriensegments (wie oben), liefert die immunohistochemische Färbung mit monoklonalem BRDU-Antikörper ein visuelles Mittel zur Bestimmung eines Mitoseindex über eine bestimmte Zeitperiode. Die immunohistochemische Färbemethode wurde wie folgt durchgeführt:
    • 1) 5 pm Schnitte der Testarterie wurden in kaltem Aceton (–20°C) für 10 Minuten dehydriert;
    • 2) die Schnitte wurden auf Glasmikroskopobjektträgern angebracht, und die Objektträger wurden in einem 37°C-Ofen für 10 Minuten getrocknet;
    • 3) die Objektträger wurden in PBS für 10 Minuten rehydriert;
    • 4) die Objektträger wurden einer Feulgensäure-Hydrolyse mittels 1 N HCl unterzogen, wobei vor der Prozedur zwei Aliquots 1 N HCl auf 37°C und 60°C vorgewärmt waren;
    • 5) die Objektträger wurden mit 1 ml 1 N HCl bei 37°C für 1 Minute gespült; 6) die Objektträger wurden auf 60°C 1 N HCl für 15 Minuten überführt;
    • 7) die Objektträger wurden mit 1 ml 1 N HCl bei 37°C für 1 Minute gespült;
    • 8) die Objektträger wurden bei Raumtemperatur PBS gewaschen, mittels 3 Wechseln von PBS in 5 Minutenintervallen;
    • 9) endogene kreuzreaktive Orte an den Sektionen wurden mit normalem Ziegenserum (1 : 25 in PBS) für 20 Minuten blockiert;
    • 10) die Objektträger wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
    • 11) die Schnitte wurden mit Maus-anti-BRDU-Antikörper (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) mit 10 pg/ml für 30 Minuten inkubiert;
    • 12) die Objektträger wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
    • 13) die Schnitte wurden mit Meerrettichperoxidase markiertem (HRPO)-Ziegen-anti-Maus-IgG, (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA; Verdünnung 1 : 20 in PBS) und 4% humanem AB-Serum für 30 Minuten inkubiert;
    • 14) die Objektträger wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
    • 15) die Schnitte wurden mit Farbstoff (3,3'-Diaminobenzidin (DAB; Sigma) mit 5 mg/ml in 200 ml PBS) und 200 pl von 30% H2O2 für 10 Minuten inkubiert;
    • 16) die Objektträger wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8;
    • 17) die Proben wurden mit Gill 1 Hämatoxylin gegengefärbt (Gill 1 Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA; 30 Eintauchungen);
    • 18) die Objektträger wurden mit PBS gewaschen wie in Schritt 8; mit Bläuelösung gespült (1 g Lithiumcarbonat in 500 ml dH2O); mit deionisiertem Wasser gewaschen; und
    • 19) die Testproben wurden dann dehydriert, gereinigt und mit Deckglas versehen.
  • Als Schlussfolgerung dieser Prozedur zeigt eine positive immunohistologische Färbung an der Reaktionsstelle(n) eine braune Farbe.
  • Zytocidale Mittel hemmten die BRDU-Aufnahme relativ zu einer PBS-Kontrolle; jedoch hemmten Cytochalasin B und Staurosporin die BRDU-Aufnahme (d.h. Zellproliferation), ohne die vaskulären glatten Muskelzellen abzutöten. Die Anzahl der mit BRDU markierten vaskulären glatten Muskelzellen wurde bei 400-facher Vergrößerung wie folgt zugeordnet:
    1 = <_1/Hochleistungsfeld (HPF);
    2 = 2 bis 5/HPF;
    3 = > 5 bis <_10/HPF; und
    4 = > 10/HPF.
  • Sowohl Cytochalasin B als auch Staurosporin hemmten die Proliferation für 24 Stunden nach einem Ballontrauma (Grad 1), was einen BRDU-Markierungsgrad ergibt, äquivalent jenem einer vortraumatischen Grundlinie (Grad 1). PBS und monoklonale Antikörperkontrollen zeigten einen Grad von 2,5 bis 4 BRDU-Markierung während dergleichen Zeitspanne. Vier Tage nach dem Trauma zeigten die Arterien, die mit Cytochalasin B oder Staurosporin behandelt wurden, sowie die PBS- und monoklonalen Antikörperkontrollen einen BRDU-Markierungsgrad von 4. Die antiproliferativen, nicht zytocidalen Eigenschaften von Cytochalasin B und Staurosporin legen nahe, dass diese Mittel für die Retarddosierungsformulierungen zur Reduktion von Gefäßstenose geeignet sind.
  • BEISPIEL 14
  • Biologische Stentung von ballontraumatisierten Schweinarterien
  • Verwendung von Cytochalasin B
  • Ballontraumatisierte Schweinearterien, die mit Cytochalasin B behandelt wor den waren, zeigten einen größeren Lumenquerschnitt an den 4 Tage und 3 Wochen Postbehandlungszeitpunkten im Vergleich zu Arterien, die mit anderen Testmitteln behandelt waren, oder Kontrollen. Zehn Oberschenkelarterien (zwei Arterien, erhalten von jedem der 5 Schweine, die gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Einzeldosisprotokoll behandelt worden waren) wurden histologisch ausgewertet. Der maximale Lumenquerschnitt jeder Arterie wurde aus digitalisierten mikroskopischen Bildern mit einem BQ System IV computierisierten morphometrischen Analysesystem (R & M Biometrics, Inc., Nashville, TN) gemessen und berechnet. Dieses Experiment wurde mit 5 zusätzlichen Schweinen (zwei Arterien pro Schwein; Cytochalasin B-Dosis = 0,1 pg/ml, Einwirkung für 3 Minuten bei 1 atm Druck; gleiche Zeitpunkte) wiederholt. Die aus den zwei Experimenten erhaltenen Daten wurden zusammengefasst. Es wurde eine Vergrößerung des Lumenquerschnitts an dem 3 Wochen nach Cytochalasin B-Behandlungszeitpunkt beobachtet.
  • Der Lumenquerschnitt der traumatisierten und Cytochalasin B-behandelten Arteriensegmente wurden auch mit dem Lumenquerschnitt des normalen unbehandelten Bereichs der Oberschenkelarterie proximal des Testbereichs verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der Lumenquerschnitt in dem Testbereich angenähert zwei Mal so groß war wie der Bereich des normalen Kontrollsegments derselben Arterie. Die negativen Kontrollmittel, PBS und monoklonaler Antikörper NR-AN-01, zeigten keine Vergrößerung oder eine leichte Verringerung des Lumenquerschnitts im Vergleich zu dem normalen Kontrollsegment derselben Arterie.
  • Eine Cytochalasin B-Dosis-Antwortstudie wurde dann an 10 Schweinen, nach dem in Beispiel 7 beschriebenen Experimentalprotokoll, durchgeführt. Kurz gesagt, beide Arterien in jedem von zwei Schweinen wurden mit einer der folgenden Dosen Cytochalasin B behandelt: 0,0 pg/ml (d.h. eine PBS-Negativkontrolle); 0,01 pg/ml; 0,10 pg/ml; 1,0 pg/ml; und 10,0 pg/ml. Der Mittel wurde durch einen intraluminalen Katheter bei 1 atm Druck für 3 Minuten verab reicht, und die Arterien wurden 3 Wochen später durch das oben beschriebene morphometrische Analysesystem ausgewertet. Das Verhäfltnis des behandelten Arterienlumenquerschnitts zu dem proximalen normalen Arterienlumenquerschnitt wurde als prozentuale Änderung in der behandelten gegenüber der normalen Fläche bestimmt. Ein signifikanter Schwelleneffekt wurde bei Dosierungen von 0,1 pg/ml (= 140%ige Zunahme) zu 1,0 pg/ml beobachtet (14). Die 10 pg/ml Dosis schien für die vaskulären glatten Muskelzellen toxisch zu sein (Daten nicht gezeigt). Die Subschwellenwertdosis (0,01 pg/ml) und negative Kontrolle (PBS) zeigten eine a ± = 20%ige Änderung im Lumenquerschnitt. Diese Daten legen nahe, dass Cytochalasin B als "biologischer Stent" wirkt, wenn es traumatisierten Arterien verabreicht wird.
  • BEISPIEL 15
  • Direkte Konjugation von NR-AN-01-Antikörper zu funktionellen carboxylischen Gruppen eines Latexpartikels
  • Antikörper-beschichtete Latexpartikel (ein Modell einer Antikörperbeschichteten Retarddosierungsform) kann mittels der folgenden aseptischen Technik erhalten werden:
  • Konjugation:
  • Zu 4 ml 0,05 M Natriumborat, pH 8,5, enthaltend 0,01% Tween-200 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Sigma) wird 0,5 ml PBS, enthaltend 5 mg NR-AN-01 monoklonaler Antikörper, hinzugefügt. Zu dieser Lösung bei Raumtemperatur werden, unter Mischen, 2,5 ml einer wässrigen Suspension, enthaltend 50 pg carboxylierter Latexpartikel mit 1 pm Durchmesser, hinzugefügt. Unmittelbar danach wird 0,50 ml Wasser, enthaltend 100 mg frisch gelösten 1(3-Dimethylaminopropyl)3-ethylcarbodiimid HCl unter Vermischen hinzugefügt.
  • Die Lösung wird dann unter Schütteln für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird dann mit 50 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,6 verdünnt, enthaltend 0,2% Gelatinstabilisator (Phosphat/Gelatinpufter). Dieses Gemisch wird mit 40.000 × g für 2 Stunden bei 4-10°C zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und der Pellet wird in 50 ml Phosphat/Gelatinpufter mittels leistungsschwacher Beschallung für 10 Sekunden resuspendiert. Die Zentrifugation wird wiederholt, und der Pellet wird zwei Mal resuspendiert, gefolgt durch Resuspension in dem Phosphat/Gelatinpuffer. Die konjugierten Partikel werden dann mittels Standardprotokollen und Sorbitolexzipienten lyophilisiert.
  • Charakterisierung:
    • (a) Größeneinteilung: Die Partikelgrößenhomogenität wird durch Laseranisotropie oder, für Partikel größer als 1 pm, durch mikroskopische Untersuchung bewertet.
    • (b) Spezifische Bindungsbewertung: Die spezifische Bindung an glatte Muskelzellen wird durch histologische Untersuchung des Gewebes oder von Zellpellet-Mikrotomscheibchen nach der Inkubation von Protein/Peptidkonjugaten mit konjugierten Partikeln bestimmt, mit oder ohne Blockerprotein/peptid, das in dem Inkubationsgemisch enthalten ist. Bevorzugte Detektionstechniken umfassen zweite Antikörperassays (d.h. Anti-Maus-IgG) oder Kompetitionsassays (d.h. radioszintigraphische Detektion in Verbindung mit radioisotopisch markierten Protein/Peptidkonjugaten).
    • (c) Bewertung des Ausmaßes der Protein/Peptidderivatisierung: Diese Bestimmung erfolgt durch Beschichtung der Latexpartikel mit einem radioisotopisch markierten Antikörper, gefolgt durch Detektion der Radioaktivität, die den beschichteten Partikeln zugeordnet ist.
  • Die Charakterisierung der Antikörper-beschichteten Partikel ist in Tabelle 6 beschrieben. Tabelle 6 Charakterisierung von NR-AN-01-beschichteten Latexparikeln
    Figure 01140001
  • Der Partikelaggregationseffekt des pH während der Antikörperkonjugation ist in Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 pH-Effekt während Antikörper-Konjugation-Partkelaggregation
    Figure 01150001
  • Verwendung von 50 mM MES (pH 5,5); Phosphat (pH 7,0); oder Borat (pH 8,5) Puffer, wie beschrieben. Ausgewertet durch mikroskopische Untersuchung auf einer Skala von 0-100%.
  • Diese Daten legen nahe, dass Proteine oder Peptide direkt mit Retarddosierungsformen der vorliegenden Erfindung konjugiert werden können. Insbesondere werden Polymilch-glycolsäurepartikel, die terminate Carbonsäuregruppen aufweisen, gemäß der hierin beschriebenen Prozedur oder alternativen Verfahren, die in der Beschreibung hiervon beschrieben sind, konjugiert.
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  • Während die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dargestellt und beschrieben wurde, versteht es sich, dass darin verschiedene Änderungen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
  • ASPEKTE DER ERFINDUNG
    • 1. Intravaskulärer Stent, umfassend eine Menge an Cytoskelett-Inhibitor, die wirksam ist, nach Einsetzen des Stents Stenose zu inhibieren oder Restenose zu vermindern.
    • 2. Intravaskulärer Stent, umfassend eine Menge an Inhibitor der Proliferation glatter Muskelzellen, die wirksam ist, nach Einsetzen des Stents Stenose zu inhibieren oder Restenose zu vermindern.
    • 3. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 1, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 4. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 1, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 5. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 1, welcher zudem einen Inhibitor der Proliferation glatter Muskelzellen umfasst.
    • 6. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 2, wobei der Stent zudem einen Cytoskelett-Inhibitor umfasst.
    • 7. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 6, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 8. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 6, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 9. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 1 oder 6, welcher den Cytoskelett-Inhibitor in einer Retard-Form umfasst.
    • 10. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 9, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 11. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 9, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 12. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 9, wobei die Retard-Form des Cytoskelett-Inhibitors ein Bindungspeptid oder -protein umfasst, das in der Lage ist, spezifisch an glatte Muskelzellen, Stromazellen oder interstitielle Matrix, welcheglatte Muskelzellen umgibt, zu binden.
    • 13. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 1 oder 6, wobei der Stent eine bioabbaubare Beschichtung oder eine poröse oder permeable nicht-bioabbaubare Beschichtung umfassend den Cytoskelett-Inhibitor umfasst.
    • 14. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 13, wobei die Beschichtung bioabbaubar ist.
    • 15. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 13, wobei die Beschichtung porös ist.
    • 16. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 13, wobei die Beschichtung eine Retard-Dosierungsform des Cytoskelett-Inhibitors umfasst.
    • 17. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 16, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 18. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 16, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 19. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 1 oder 2, welcher Metall oder einen Kunststoff umfasst.
    • 20. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 1 oder 2, welcher ein bioabbaubares Material umfasst.
    • 21. Der intravaskuläre Stent nach Anspruch 20, welcher im Wesentlichen aus einem bioabbaubaren Material besteht.
    • 22. Verfahren zur Herstellung eines intravaskulären Stents, der bei der Aufrechterhaltung des Gefäßlumeninhalts bei einem Säuger wirksam ist, umfassend das Beschichten eines intravaskulären Stents mit einer Beschichtung, die eine Retarddosierungsform umfasst, welche eine Menge an Cytoskelett-Inhibitor umfasst, die wirksam ist, um Stenose oder Restenose in dem Gefäß zu verhindern oder zu vermindern.
    • 23. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei der Stent ein bioabbaubares Material umfasst.
    • 24. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei der Stent Kunststoff oder Metall umfasst.
    • 25. Das Verfahren nach Anspruch 40 oder 41, wobei der Stent zudem ein therapeutisches Mittel umfasst, das ein Inhibitor der Proliferation glatter Muskelzellen ist.
    • 26. Das Verfahren nach Anspruch 40 oder 41, wobei der Stent zudem ein therapeutisches Mittel umfasst, das ein Cytoskelett-Inhibitor ist.
    • 27. Das Verfahren nach Anspruch 43, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 28. Das Verfahren nach Anspruch 43, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 29. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Beschichtung bioabbaubar ist.
    • 30. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei die Beschichtung porös oder permeabel ist.
    • 31. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 32. Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 33. Verfahren zur Herstellung eines intravaskulären Stents, der bei der Aufrechterhaltung des Gefäßlumeninhalts bei einem Säuger wirksam ist, umfassend das Einführen einer Menge an Cytoskelett-Inhibitor, die wirksam ist, um Stenose oder Restenose in dem Gefäß zu verhindern oder zu vermindern, in die Matrix eines intravaskulären Stents.
    • 34. Das Verfahren nach Anspruch 50, wobei der Stent zudem eine Beschichtung umfasst, die eine Retarddosierungsform umfasst, welche einen Cytoskelett-Inhibitor umfasst.
    • 35. Das Verfahren nach Anspruch 51, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 36. Das Verfahren nach Anspruch 51 wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 37. Das Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Beschichtung bioabbaubar ist.
    • 38. Das Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Beschichtung porös oder permeabel ist.
    • 39. Das Verfahren nach Anspruch 50, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 40. Das Verfahren nach Anspruch 50 wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 41. Verfahren zur Herstellung eines intravaskulären Stents, der bei der Aufrechterhaltung des Gefäßlumeninhalts bei einem Säuger wirksam ist, umfassend das Einführen einer Menge eines therapeutischen Mittels, welches ein Inhibitor der Proliferation glatter Muskelzellen ist, die wirksam ist, um Stenose oder Restenose in dem Gefäß zu verhindern oder zu vermindern, in die Matrix eines intravaskulären Stents.
    • 42. Das Verfahren nach Anspruch 58, wobei der Stent zudem eine Beschichtung umfasst, die eine Retarddosierungsform umfasst, welche einen Cytoskelett-Inhibitor umfasst.
    • 43. Das Verfahren nach Anspruch 59, wobei der Cytoskelett-Inhibitor Cytochalasin B oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 44. Das Verfahren nach Anspruch 59 wobei der Cytoskelett-Inhibitor Taxol oder ein Analogon von diesem umfasst.
    • 45. Das Verfahren nach Anspruch 59, wobei die Beschichtung bioabbaubar ist.
    • 46. Das Verfahren nach Anspruch 59, wobei die Beschichtung porös oder permeabel ist.
    • 47. Das Verfahren nach Anspruch 29, 50 oder 58, wobei der Stent Kunstoff oder Metall umfasst.
    • 48. Das Verfahren nach Anspruch 29, 50 oder 58, wobei der Stent ein bioabbaubares Material umfasst.
    • 49. Das Verfahren nach Anspruch 65, wobei der Stent im Wesentlichen aus einem bioabbaubaren Material besteht.

Claims (13)

  1. Intravaskulärer Stent, welcher eine Dauerfreigabe-Dosierungsform umfasst, welche eine zytostatische Menge eines therapeutischen Wirkstoffes umfasst, welche die Zellaktivität der vaskulären glatten Muskulatur inhibiert ohne die Zielzellen der vaskulären glatten Muskulatur abzutöten.
  2. Intravaskulärer Stent nach Anspruch 1, wobei besagte Zellaktivität Proliferation, Kontraktion, Migration oder Hyperaktivität ist.
  3. Intravaskulärer Stent nach Anspruch 1, der weiter eine Matrix umfasst, wobei besagte Matrix den therapeutischen Wirkstoff umfasst.
  4. Intravaskulärer Stent nach Anspruch 1, der weiter eine bioabbaubare oder eine poröse oder eine durchlässige nicht-bioabbaubare Beschichtung umfasst, wobei besagte Beschichtung den therapeutischen Wirkstoff umfasst.
  5. Intravaskulärer Stent nach Anspruch 3, wobei besagter Stent bioabbaubar ist und weiter eine bioabbaubare oder eine poröse oder eine durchlässige nicht-bioabbaubare Beschichtung umfasst, wobei besagte Beschichtung auch den therapeutischen Wirkstoff umfasst.
  6. Intravaskulärer Stent nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die zytostatische Menge des therapeutischen Wirkstoffs die Proteinsynthese der Zellen der vaskulären glatten Muskulatur nicht inhibiert.
  7. Intravaskulärer Stent nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die zytostatische Menge des therapeutischen Wirkstoffs die zelluläre Reparatur und die Matrixerzeugung ermöglicht.
  8. Intravaskulärer Stent nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der therapeutische Wirkstoff ausgewählt wird aus modifizierten Toxinen, Methotrexat, Adriamycin, Radionukliden, peptidischen oder mimetischen Inhibitoren, Proteinkinase-Inhibitoren, Staurosporin, Subfragmenten des Heparin, Triazolopyrimidinen, Lovastatin, Prostaglandin E1 oder I2, Cytoskelettinhibitoren, Colchizin, Vinblastin, Cytochalasinen, Taxol, Triochothezenen, modifizierten Diphtherie- und Rizintoxinen, oder Pseudomonas exotoxin, Suramin, Verbindungen, welche Stickoxide freisetzen, Nitroglyzerin, Roridin A, Sphingosin, Somatostatin und/oder N-Ethylmaleinemid.
  9. Intravaskuläerer Stent nach einem der Ansprüche 1 bis 8, der weiter ein bindendes Protein oder Peptid umfasst, welches sich an eine Zielzelle bindet, wobei besagtes bindendes Protein oder Peptid an den therapeutischen Wirkstoff gekoppelt ist.
  10. Intravaskuläerer Stent nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei besagte Dauerfreigabe-Dosierungsform dazu geeignet ist, den therapeutischen Wirkstoff über eine Zeitspanne freizusetzen.
  11. Intravaskulärer Stent nach Anspruch 10, wobei besagte Dauerfreigabe-Dosierungsform dazu geeignet ist, den therapeutischen Wirkstoff über ungefähr 3 bis ungefähr 180 Tage freizusetzen.
  12. Intravaskulärer Stent nach Anspruch 10, wobei besagte Dauerfreigabe-Dosierungsform dazu geeignet ist, den therapeutischen Wirkstoff über ungefähr 10 bis ungefähr 21 Tage freizusetzen.
  13. Intravaskulärer Stent nach einem der Ansprüche 1 bis 12, welcher so eingepasst ist, dass er in einer Person im Anschluss an ein Gefäßtrauma eine vergrößerte luminale Fläche aufrecht erhält, wobei besagte Person besagte Aufrechterhaltung der vergrößerten luminalen Fläche nötig hat.
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