DE69636673T2

DE69636673T2 - Verfahren und vorrichtung zur molekülsequenzierung

Info

Publication number: DE69636673T2
Application number: DE69636673T
Authority: DE
Inventors: Francis John HASSARD; Stuart Hassard; Mary Alison MAINWOOD
Original assignee: Deltadot Ltd
Current assignee: Deltadot Ltd
Priority date: 1995-05-10
Filing date: 1996-05-10
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2016-05-11
Also published as: AU5657096A; GB9509410D0; EP0830592A1; EP0830591A1; ATE258682T1; AU5656996A; JP3975247B2; JPH11505613A; JP3928073B2; EP0830592B1; WO1996035946A1; US6103533A; ES2215192T3; DE69631417D1; DE69631417T2; PT830591E; ATE344451T1; WO1996035945A1; JPH11505612A; DK0830591T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sequenzieren eines Biomoleküls und ein molekulares Sequenziersystem.
Derzeitige Verfahren zur Nukleinsäure-Sequenzierung und Kartierung, und Protein- und Gewebe-Bildgebung, basieren auf radioaktiven, bio- und chemilumineszenten Strahlen, photographischen Platten, und einigen elektronischen Techniken. Keine von diesen hat sich in der Praxis als vollkommen zufrieden stellend herauskristallisiert.
Die fluoreszente Bildgebung, Radiomarkierung und bio- und chemilumineszenten Marker, die mit Film und/oder Emulsion verwendet werden, sind teuer, sehr langsam, beschränkt und schwierig mit Computern zu koppeln. Die involvierten Techniken sind schwierig, und erfordern gefährliche Handhabungs- und Entsorgungsprozeduren, die eine beachtliche technische Fachkenntnis erfordern. Die verwendeten Materialien sind häufig schwierig und aufwendig zu erhalten, und besitzen kurze Lebensdauern. Die photographische Bildgebung, welche häufig verwendet wird, beansprucht Tage oder manchmal Wochen oder Monate um fertigestellt zu werden und ist aufgrund ihres schmalen dynamischen Bereichs und relativ schlechter Reaktionslinearität beschränkt.
Von den elektronischen Techniken sind die Phosphor-Bildgebung/proportionale Drahtkammer (MWPC) und die Mikrokanalplate/MWPC-Ansätze bei vielen Molekularbiologen aufgrund ihrer beschränkten Linearität und Kosten unbeliebt.
Es kann als Hintergrund nützlich sein, einige Details des derzeitigen Standes der Technik der Nukleinsäure-Bildgebung darzulegen. Es gibt zwei getrennte Methodologien, welche derzeitig für gewöhnlich verwendet werden, die Details von diesen sind später dargelegt.
Es gibt zuerst jene, die die Verwendung eines photographischen Films einschließen, um chemilumineszente oder radioaktive Markierungen zu visualisieren und zweitens jene, die einen Lichtstrahler, wie Ethidiumbromid, das an Nukleinsäuren chemisch bindet und unter UV-Stimulierung oranges Licht emitiert, verwenden. Die erste Bildgebungstechnologie wird für gewöhnlich bei der Nukleinsäure-Sequenzierung verwendet. Dieser Prozess schließt die chemische Markierung einer Komponente der Sequenzierungsreaktion, üblicherweise den Primer, mit einem Radioisotop oder chemilumineszenten Marker, oder Tag ein. Im Anschluss an die Sequenzierungsreaktion und Elektrophorese wird dieser Tag verwendet, um die Position der Nukleinsäurebanden durch die Aussetzung des getrockneten Elektrophoresegels zu normalem photographischem Film abzubilden. Dies ist ein langwieriger Vorgang, der von 24 bis 72 Stunden dauert, in Abhängigkeit von der verwendeten Sequenzierungstechnik. Viele der bei der Nukleinsäuresequenzierung verwendeten radioaktiven Marker sind sehr gefährlich und führen zusätzliche Komplikationen zu dem Sequenzierungsvorgang ein, deshalb wäre jedes Bildgebungssystem, welches die Notwendigkeit für diese Marker beseitigt, äußerst vorteilhaft.
Die zweite Technologie, die von Lichtstrahlern, wird im Allgemeinen für DNA Restriktionsanalyse und Plasmid-Konstruktionsplannung verwendet. Die Technik beruht auf der Bildgebung von Nukleinsäuren in einfachen Agarosegelen unter Verwendung der karzinogenen Chemikalie Ethidiumbromid, welche oranges Licht nach der UV Stimulation emittiert, um die Größe zu visualisieren und die Konzentration von vorhandenen Nukleinsäuren abzuschätzen. Ethidiumbromid ist eine äußerst ungewünschte Komponente von dieser Technik mit gefährlicher akkumulativer medizinischer Konsequenz. Seine Beseitigung von der Bildgebungstechnik wäre in jeder Anwendung der Agarosegel-Analyse sehr vorteilhaft.
Die Nukleinsäuresequenzierung, im Gegensatz zu der räumlichen Bildgebung, verwendet normalerweise einen ziemlich unterschiedlichen Prozess. Dieser Prozess schließt die chemische Markierung einer Komponente der Sequenzierungsrektion ein, im Allgemeinen den Primer, mit einem Radioisotop oder bio- oder chemilumineszenten Marker, oder Tag. Im Anschluss an die Sequenzierungsreaktion und Elektrophorese wird dieser Tag verwendet, um die Position der Nukleinsäurebanden durch das Aussetzen des photographischen Films zu dem getrockneten Elektrophorese-Gel abzubilden. Dies ist ein langwieriger Vorgang, der von 24 bis 72 Stunden dauert, in Abhängigkeit von der verwendeten Sequenzierungstechnik.
DNA Restriktionsenzymanalyse (DNA Kartierung) und Vektorkonstruktion ist ein fundamentaler Aspekt der Molekularbiologie. Diese Kartierungstechniken beruhen auch auf der photographischen Bildgebung von Nukleinsäurefragmenten in einfachen Agarosegelen unter Verwendung von Ethidiumbromid. Dieser Marker emittiert oranges Licht nach der UV Stimulation, um die Größe zu visualisieren und die Konzentration von vorhandenen Nukleinsäuren abzuschätzen. Ethidiumbromid ist eine äußerst ungewünschte Komponente von dieser Technik mit gefährlicher akkumulativer medizinischer Konsequenz. Seine Beseitigung von der Bildgebungstechnik wäre in jeder Anwendung der Agarosegel-Analyse sehr vorteilhaft.
Die Bildgebung von Peptiden und Proteinen ist häufig das Endziel von vielen genetischen, technischen Prozessen. Es bildet auch einen großen Anteil der allgemeinen biologischen, biochemischen und medizinischen Forschung. Es gibt tatsächlich kaum ein Gebiet der Biowissenschaft, die nicht abhängig ist, zumindest irgendwie, von der Proteinanalyse. Die Analyse basiert wiederum normalerweise auf elektrophoretischen Techniken, die wiederum von der Zugabe eines Markers abhängen. Im Allgemeinen sind diese radioaktiv, obwohl chemilumineszente und spezialisierte chemische Farbstoffe ebenfalls verwendet werden.
Das Gebiet der Gewebebildgebung ist ungeheuer wichtig im Gebiet der Arzneimittelendeckung, und medizinischen und molekularen Diagnostik. Traditionell können β-emittierende Marker verwendet werden, um die Verteilung eines Arzneimittels innerhalb einer Gewebeprobe abzubilden. Dieser Vorgang erfordert typischerweise Wochen oder sogar Monate und erfordert die Verwendung von potenziell gefährlichen Substanzen.
Es ist verständlich, dass all der vorliegenden Verfahren, die oben erwähnt sind, die Verwendung von entweder Radioisotopen oder anderen gefährlichen Substanzen erfordern, zusätzlich erfordern zumindest einige der oben aufgelisteten Techniken die Verwendung von teuren und unhandlichen Elektrophoresegeln. Zusammengefasst sind die Hauptprobleme wie Folgt:

1. Schulung: Gesundheits- und Sicherheitsstandards erfordern von allen Mitarbeitern, die in Kontakt mit jeglicher Form von Radioaktivität sind, eine extensive Schulung in der Handhabung, Verwendung und Entsorgung von Radioaktivität.
2. Verwendung: Der Einbau von Radioaktivität in ein System ist häufig ein komplexer und zeitaufwendiger Vorgang. Der Mitarbeiter muss äußerste Vorsichtsmaßnahmen, zum Beispiel, mit dem Isotop ³²P einhalten, welches häufig bei der DNA Sequenzierung verwendet wird, welches von dem Mitarbeiter durch Plexiglas abgeschirmt werden muss, welches ein bereits komplexes Experiment viel aufwändiger macht. Im Anschluss an das anfängliche Experiment wird die weitere Manipulation des bereits fragilen Elektrophoresegels durch die vorhandene Radioaktivität verkompliziert. Die Radioaktivität kann durch chemi- oder biolumineszente Bildgebungsmittel ersetzt werden, jedoch sind diese, und weil diese sicherer sind, nach wie vor kompliziert zu verwenden.
3. Zeit. Alle diese Bildgebungssysteme beruhen auf der Verwendung der Autoradiographie, um die Nukleinsäuren oder Proteine zu visualisieren. Dies wird durch Trocken der Gele auf einem Stück Filterpapier und Aussetzen von diesem zu einem Stück photographischen Film erreicht. Der Film muss eine beliebige Zeit zwischen 24 Stunden bis 3 Monate belichtet werden. Deshalb kann es von Tagen bis Monate dauern, um zu sehen, ob das Experiment funktioniert hat. Dies ist ein Hauptproblem in der Molekularbiologie und erhöht die Länge von Forschungsprojekten signifikant.
4. Aufwand: Die verschiedenen Komponenten von diesen Experimenten sind kostspielig. Radioaktivität hat aufgrund ihres natürlichen Zerfalls, eine beschränkte Lebensdauer und sie ist auch teuer, wobei ³⁵S etwa £250 für 20 Sequenzierungsreaktionen kostet. Der verwendete Film ist ebenfalls sehr teurer, da einige von ihnen 35 × 45 cm messen.
5. Entsorgung. Diese Vorgänge erzeugen große Volumina an festen und flüssigen Abfällen, von denen alle legal und verantwortungsvoll entsorgt werden müssen. Dies ist ebenfalls sehr teuer und mühevoll.

US-A-4539297 offenbart eine Vorrichtung für das Trennen von großen Molekülen, wie DNA Plasmide, unter Verwendung von utravioletter Bildgebung in Zusammenhang mit einer Standardphotographieplatte. Diese Dokument offenbart die folgenden Merkmale: eine molekulare Bildgebungvorrichtung, welche eine UV Lichtquelle aufweist, die so angeordnet ist, um auf eine Probe zu scheinen, die die Biomoleküle enthält; ein Elektrophoresematerial; Mittel zum Anlegen einer Potentialdifferenz entlang des Materials, um die Bewegung der Biomoleküle entlang des Materials zu bewirken; und eine Photographieplatte, die als UV Detektor für das Abbilden der Biomoleküle durch ihre molekulare UV Absorption fungiert.
In elektrophoretischen und anderen Anwendungen innerhalb welcher molekulare Substanzen zu identifizieren sind, ist es sehr wohl bekannt, die Geschwindigkeit einer bestimmten molekularen Bande zu messen und die involvierten molekularen Spezies anhand dieser Geschwindigkeit zu identifizieren. Typischerweise wird dies durch Messen der Zeit, die eine bestimmte Bande braucht, um sich von einem ersten zu einem zweiten fixen Sensor zu bewegen, gemacht. Typische Beispiele von diesen Techniken sind in WO-A-94/01581 und ebenfalls in Beckers, et al., Use of a Double-Detector System for the Measurement of Mobilities in Zone Electrophoresis, Journal of Chromatography, 452(1988) 591–600 offenbart. Es ist bekannt, wie zum Beispiel in den Japanischen Patentzusammenfassungen, volume 6, number 82 (p-116)[190], 11. Juli 1980 offenbart ist, mehrere Detektoren zu benutzen, um die Geschwindigkeit von individuellen Partikeln innerhalb einer sich bewegenden Mischung zu verfolgen.
Die Erfindung ist in den unabhängigen Ansprüchen 1 und 7 dargelegt.
In dem bevorzugten Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Moleküle durch Detektieren ihrer intrinsischen Absorption von UV Licht abgebildet. Bei diesem Aspekt der Erfindung verwenden wir das intrinsische Bild von dem Molekül selbst, ob es ein Nukleinsäurefragment, ein Protein oder tatsächlich eine Polypeptidkette ist. Das Bild stammt von der Absorption dieses Moleküls unter Verwendung molekularer UV Absorptionsspektropmetrie, im Gegensatz zu den bekannten Techniken der optischen Spektrometrie. Der Hauptvorteil ist das Fehlen eines Tags.
Dies hat viele wichtige Konsequenzen. Vielleicht der offensichtlichste ist, dass kein gefährlicher Tag mehr benötigt wird, ob es radioaktiv ist oder ein bekanntes Karzinogen, wie Ethidiumbromid. Eine andere Angelegenheit ist, dass für Sequenzierungsreaktionen das Fehlen eines Tags einer der Hauptbeschränkungen bei einer Reihe von Basen, die sequenziert werden können, entfernt, d.h. die Menge an Radioaktivität, die innerhalb der Probe eingebaut werden können.
Beim Umwandeln in den Geschwindigkeitsraum kann eine Berechnung der Geschwindigkeit durchgeführt werden, die eine Substanz innerhalb einer sich bewegenden Mischung benötigt, um einen gegebenen Detektor I_k zu einem Zeitpunkt zu erreichen, zu welchem das Signal von diesem Detektor aufgezeichnet wurde. Diese nominale Geschwindigkeit kann als Z_k über t berechnet werden, wobei Z_k die Distanz zwischen Ursprung und dem Detektor I_k ist und t die vergangene Zeit ist. Es kann jedoch andere Verfahren geben, um nominale Geschwindigkeiten zu bestimmen, zum Beispiel durch Messen der Zeit, die eine bekannte Substanz benötigt, um von einem Detektor zum nächsten zu wandern. Es wäre auch möglich, die Geschwindigkeit durch Identifizieren einer bestimmten Sequenz von Banden an einem Detektor und Messen wie lange diese Sequenz von Banden benötigen, im Durchschnitt, zum nächsten Detektor zu wandern, zu bestimmen. Auf diese Art kann eine individuelle Bande innerhalb der Sequenz an zwei getrennten Detektoren identifiziert und genau gestoppt werden, wobei de Geschwindigkeit dann aus der Kenntnis der Entfernung zwischen den Detektoren berechnet werden kann.
Beim Transformieren in den Geschwindigkeitsraum und Integrieren über die Zeit können die individuellen Substanzen (zum Beispiel Biomoleküle) schnell als individuelle Spitzen oder Peaks in dem Geschwindigkeitsraum identifiziert werden. Die Größe und/oder Breite von jedem Peak kann verwendet werden, um einen Messwert für die Menge von jeder individuellen Substanz zu erhalten.
Vorzugsweise werden die Moleküle von Interesse direkt durch Detektieren ihrer Absorption durch Abbilden der Nukleinsäure, Protein oder Gewebekarte auf einen Diamantdetektor abgebildet. Dies kann durch Illuminieren des abzubildenden Objektes, zum Beispiel Nukleinsäuren, mit UV Licht konstanter Helligkeit von entweder einer Vorrichtung mit breitem Spektrum, wie Heliumentladungsröhren, oder einem monochromatischen Laser, wie einem Excimer Laser bei 196 nm, erreicht werden. Wir beobachten die unterschiedlichen Mengen an Licht, das einen Detektor erreicht, der hinter dem abzubildenden Objekt platziert ist. Im Falle der zweidimensionalen Bildgebung wird der Schatten gleichzeitig abgebildet, und das Objekt dadurch identifiziert. Dies erfordert einen zwei-dimensionalen Detektor, wie eine Pixel-Vorrichtung oder eine pixelisierte Rippenvorrichtung.
In dem besseren Fall des direktionalen Lasers können wir das zu identifizierende Objekt auf einem eindimensionalen Detektor, entweder planar (mit Streifenelektroden) oder gerippt gescannt werden, und zu einem zweidimensionalen Bild aufgebaut werden.
Wenn die Erfindung auf Nukleinsäure-Manipulation und Quantifizierung angewendet wird, ermöglicht die Technologie eine quantitative Differenzierung zwischen gesendeter und absorbierter Energie. Die Quantifizierung von DNA unter diesen Bedingungen hat wichtige Anwendungen in der Konstruktion von Expressionsvektoren, die verwendet werden, um spezialisierte Proteine zu erzeugen, die in Therapeutika verwendet werden.
Wenn die vorliegende Erfindung auf das Abbilden von Peptiden und Proteinen angewendet wird, kann die gleiche Ausrüstung verwendet werden, wie verwendet wird, um DNA Restriktionsenzym-Karten abzubilden. Die Geschwindigkeit der Bildgebung, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, bietet signifikante Vorteile gegenüber existierenden Techniken, von denen einige bis zu drei Monate in Anspruch nehmen können.
Diese Idee basiert auf der Absorption von UV Licht bei < 230 nm durch Proteine, was ebenfalls ein optimaler Bereich für Nukleinsäuren darstellt. Somit könnte derselbe Detektor beide Molekülarten abbilden. Ein zusätzlicher Vorteil des Merkmales ist, dass Lipide, Kohlenhydrate und andere kleine Makromoleküle UV schlecht, wenn überhaupt, in diesem Bereich absorbieren, was ein intrinsisches Filtern von biologischem Rauschen auf dem Bild ermöglicht.
Diese spektrale Reaktion ist ideal zu jener von Diamant abgestimmt, welcher sich bei 224 nm einschaltet und gegenüber Licht mit größeren Wellenlängen oder niederer Energie äußerst unempfindlich ist. Dies ist ein sehr leistungsstarkes Kennzeichen für einen Detektor, das er aufweisen sollte. Ein typischer Wellenlängenbereich für einen Diamantdetektor ist etwa 180–224 nm, da aber die untere Grenze mehr durch die Materialen und/oder Quelle als dem Detektormedium eingeführt wird, können geringere Wellenlängen nicht in allen Umständen ausgeschlossen werden. Für bestimmte Anwendungen könnten Silikondetektoren verwendet werden (Detektionsbereich 190–300 nm). Photovervielfacher könnten ebenfalls verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich die Erfindung auf eine Elektrophorese-Vorrichtung, zum Beispiel, einem DNA Sequenzierer. Die Vorrichtung überwacht vorzugsweise qualitativ die Signaländerungen von einer Quelle, wie die Banden von Nukleinsäuren zwischen der Quelle und dem Detektor auf einem Elektrophoresegel vorbeiwandern. Wie die Banden den Detektor passieren, können sie direkt in eine Datenbank digitalisiert werden.
Die Vorrichtung kann weiters das Konzept der Verwendung einer inerten wieder verwendbaren Festphase für die Elektrophorese aufweisen. Für einen DNA Sequenzierer kann die Festphase auf ein Quarzsubstrat (zum Beispiel eine Röhre) beschichtet werden oder anderweitig unterstützt werden, wobei es vorzugsweise vier getrennte Röhren für die vier Basen gibt.
Zusammengefasst, die Folgenden sind die Hauptvorteile der vorliegenden Erfindung oder untergeordnete Aspekte der vorliegenden Erfindung:

1. Schulung. Die Beseitigung von Radioaktivität von dem System umgeht den Bedarf an Gesundheits- & Sicherheitstraining.
2. Gebrauch. Die Entfernung von Radioaktivität oder jeder anderen extrinischen Bildgebungskomponente aus dem experimentellen Vorgang erhöht dramatisch die Wirksamkeit und Geschwindigkeit von diesen Reaktionen. Der Markierungsschritt (bei welchem der radioaktive Marker der Reaktion hinzugefügt wird) ist häufig kompliziert, und sein Versagen kann nicht bemerkt werden, bis das Experiment abgeschlossen ist.
3. Zeit. Es wird erwartet, dass die Fähigkeit die Ergebnisse, zum Beispiel, eines Sequenzierungsgels eher in Minuten als in Stunden abzubilden, zu einer dramatischen Erhöhung der Wirksamkeit von Sequenzierungsoperationen im großen Maßstab, wie das humane Genomprojekt, führt. Es würde ebenfalls die schnellere Entdeckung von Problemen innerhalb der Reaktion ermöglichen – viel Zeit wird in der Molekularbiologie aufgrund der Zeit, die es dauern kann, um festzustellen, dass ein Experiment schief gelaufen ist, vergeudet.
4. Aufwand. Die Anwendung von Hardware, basierend auf dieser Technologie, würde zu einer massiven Freisetzung von Geldmitteln von dem Verbrauchsartikel-Budget von jeder Forschungsgruppe führen. Im Anschluss an die anfänglichen Ausrüstungskosten, könnten viele Molekularbiologie-Gruppe erwarten, dass ihre Radioaktivität und Filmanforderungen wesentlich fallen.
5. Entsorgung. In Bezug auf Umwelt sind die Vorteile der Technologie riesig. Die gesamte Entfernung von Radioaktivität von dem System eliminiert natürlich den Bedarf an seiner Entsorgung.

Die Erfindung können in der Praxis in einer Reihe von Arten ausgeführt werden und mehrere spezifische Ausführungsformen werden nun beispielhaft beschrieben, unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, wobei:
1 einen Detektor des Standes der Technik zeigt;
2 ein Querschnitt eines Detektors ist, der für die Verwendung mit dem Verfahren und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung geeignet ist;
3 eine Perspektivansicht des Detektors der 2 ist;
4a eine andere Ausführungsform zeigt, bei der die Elektroden in einer bipolaren Spannungskonfiguration verbunden sind;
4b eine andere Ausführungsform zeigt, bei der die Elektroden in einer Widerstandskettenkonfiguration verbunden sind;
5 eine noch weitere Ausführungsform eines Detektors zeigt, der für die Verwendung mit dem Verfahren und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung geeignet ist;
6 eine molekulare Bildgebungsvorrichtung zeigt, die eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufweist;
7 eine Seitenansicht der Bildgebungsvorrichtung der 6 zeigt;
8 schematisch einen automatisierten DNA Sequenzierer zeigt, der eine andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung aufweist;
9 einen schematischen Querschnitt durch den in 9 gezeigten Sequenzierer ist;
10 schematisch eine bevorzugte Ausführungsform zum Isolieren von Biomolekülen zeigt; und
11 die Ergebnisse einer bevorzugten Analyse als ein Diagramm in dem Geschwindigkeitsraum zeigt.
Unter Bezugnahme zuerst auf die 6 und 7 ist eine molekulare Bildgebungsvorrichtung gezeigt, die eine bevorzugte Ausführungsform einer Form der vorliegenden Erfindung aufweist. Die in den 6 und 7 gezeigte Vorrichtung ist hauptsächlich ein Nukleinsäure/Protein-Bildgeber, und weist in seiner einfachsten Form einen im Wesentlichen flachen Grundplattenabschnitt 710, einen Körperabschnitt 715, der entlang einer Kante des Grundplattenabschnittes befestigt ist, und einen Deckel 720 auf, der drehbar an den Körperanteil 715 mittels eines langgestreckten Scharniers befestigt ist. Zwischen dem Deckel und der Grundplatte ist eine elektrophoretische Gel-Befestigung 740. Der Grundplattenabschnitt 710 enthält eine Scanning UV-Detektoranordnung, die vorzugsweise, obwohl nicht notwendigerweise, einen Detektor der Form, die später unter Bezugnahme auf die 1 bis 5 beschrieben ist, besitzt.
Um den Bildgeber zu verwenden, wird der Deckel 720 zuerst angehoben, und eine abzubildende Probe (nicht gezeigt) wird in der Befestigung 740 platziert. Die Probe kann ein Elektrophoresegel enthalten, welches molekulare Proben (Fragmente) enthält, die auf herkömmliche Art und Weise unter Verwendung eines elektrischen Feldes getrennt wurden. Sobald die Probe in Position gebracht wurde, wird der Deckel 720 geschlossen, und einen ultraviolette Lichtbox 722, die an der Unterseite des Deckels angebracht ist, wird eingeschaltet. Dies badet die Proben in ultraviolettem Licht, wobei die Menge an UV Absorption durch die Detektoranordnung mit dem Grundplattenabschnitt detektiert, wie der Detektor quer über die Probe scannt. Das detektierte Absorptionsmuster über die Oberfläche der Probe wird digitalisiert, und wird über einen Datenport 750 an einen externen Computer (nicht gezeigt), auf welchem ein geeignetes Graphikprogramm läuft, übermittelt.
Die Lichtbox 722 kann jede geeignete ultraviolette Quelle enthalten, wie eine Deuteriumlampe. Ein Schalter 723 bietet dem Benutzer die Fähigkeit, zwischen UV-Wellenlängen umzuschalten, so dass sowohl Nukleinsäuren als auch Proteine leicht abgebildet werden können.
Bei einer alternativen Anordnung könnte die UV-Quelle an eine querlaufende Scanninganordnung (nicht gezeigt) befestigt sein, die an den Deckel 720 befestigt ist. Bei dieser Anordnung würde die UV-Quelle quer über die Probe scannen, während der Detektor innerhalb des Grundplattenabschnittes 710 stationär bleiben würde. Es wäre auch möglich, sowohl die UV-Quelle als auch den Detektor an die Scanning-Anordnungen zu befestigen, wobei beide Anordnungen über das Gel mit derselben Geschwindigkeit scannen. In entweder der bevorzugten oder in der alternativen Anordnung kann ein einstellbarer Laser als die Lichtquelle verwendet werden.
Der Vorteil der Verwendung des bevorzugten Diamantdetektors, der später unter Bezugnahme auf die 1 bis 5 beschrieben wird, ist, dass der Detektor von Haus aus gegenüber der Absorption, die in biologischen Strukturen, die von keinem speziellen Interesse sind, wie Lipide und Kohlenhydrate, auftritt, unempfindlich ist. Die geeignete Auflösung kann durch ein einfaches Experiment bestimmt werden, gemäß der bestimmten Anwendung. Es wird erwartet, dass für die Detektion von Nukleinsäuren und Proteine bei angemessener Auflösung eine Rippengröße (Breite) von zwischen etwa 5 und 200 μm verwendet werden würde.
Unter Bezugnahme auf 8 und 9, die schematisch einen automatisierten DNA Sequenzierer gemäß einer Ausführungsform einer weiteren Form der vorliegenden Erfindung zeigen.
8 und 9 zeigen eine Untereinheit der vorgeschlagenen Sequenziermaschine. Die Maschine als ganzes weist vier oder fünf solche Untereinheiten auf. Jede Untereinheit weist ein Toppufferreservoir 810 auf, welches Pufferlösung 820 enthält; ein unteres Reservoir, das eine Pufferlösung 840 enthält; eine UV Quelle 870 oder eine Vielzahl von solchen Quellen; einen UV Detektor 860, der mit einer Standardanzeige 865 verbunden ist; eine Kathode 822, die mit der Pufferlösung 820 verbunden ist; und eine Anode, die mit der Pufferlösung 840 verbunden ist. Die Vorrichtung enthält auch vier Festphasen-Matrixröhren, 850, welche sich zwischen den oberen und unteren Reservoirs erstrecken.
Sowohl die oberen als auch unteren Reservoirs 810, 830 können aus einem durchsichtigen Plastikmaterial gebildet sein, und einfache Pufferlösungen 820, 840 enthalten, um die überschüssige Anhäufung von Säure in dem System zu verhindern. Die Festphasen Matrixröhren 850 kontaktieren die Pufferlösung 820 an dem oberen Ende und die Pufferlösung 840 ab dem unteren Ende.
Die Lichtquelle 870 weist eine UV-Lampe oder ein Deuterium oder Entladungslampe auf. Alternativ könnte sie einen Laser, der in der Lage ist, im Bereich zwischen 220 nm und 180 nm zu arbeiten, oder sogar eine Diode aufweisen.
Der Detektor 860 weist jeden geeigneten optischen Detektor auf, der mit der Wellenlänge der Lichtquelle 870 übereinstimmt. Der Detektor weist vorzugsweise einen Diamant-Rippendetektor auf, wie detaillierter später unter Bezugnahme auf die 1 bis 5 beschrieben ist. Die Breiten der Rippen können zwischen 5 und 200 μm in Abhängigkeit der zu detektierenden Wellenlängen und der gewünschten Auflösung liegen. Die Enge der Rippen und die Tatsache, dass eine im Wesentlichen planare Illumination verwendet wird, ermöglicht ein hohe Präzision und Auflösung.
Der Detektor 860 ist mit einer geeigneten Elektronik verbunden, welche ein digitales Auslesen an einem Ausgang 865 bereitstellt. Eine Standardauslesung, wie Labview (^TM), geben die Daten direkt in einen geeigneten Datenbankvorläufer, wie MacVektor (^TM) oder MacDNAsys (^TM), ein.
Die Festphasen-Matrixröhren 850 weisen vier Quarzröhren auf, die ein geeignetes Festphasenmaterial enthalten. Zu geeigneten Materialien zählen Silikon-basierende vorher vorhandene Gelmatrizen, wie die Sephadex(^TM)-Gruppe. Die Festphase ist relativ UV-durchlässig, und ist ebenfalls wieder verwendbar. Die Länge der Röhren ist von der exakten Natur der ausgewählten Festphase abhängig, wird jedoch typischerweise nicht länger als 15 bis 20 cm sein.
Im Betrieb wird eine Spannung zwischen der Anode und der Kathode angelegt, um eine Potentialdifferenz entlang der Länge der Festphasen-Matrixröhren 850 zu erzeugen. Die vier unterschiedlichen Reaktionen, die zu detektieren sind, werden geladen, jede auf ihre getrennte Säule, und zu der Anode elektrophoretisiert. Wie die Banden zwischen der Quelle 870 und dem Detektor durchwandern, wird ein einfaches qualitatives Bild von jeder Bande zu einer Datenbank digitalisiert. Die resultierende digitale Information kann entweder in Echtzeit ausgelesen werden, oder es kann innerhalb der Detektionssystemelektronik gespeichert werden, bis die Elektrophorese abgeschlossen ist. Die gesamte Information kann dann auf einmal ausgelesen werden.
Nach dem die Sequenzierungsmischung durch die Säule gelaufen ist, können als DNA Spuren durch kontinuierliche Exposition zu einem elektrischen Feld und einer Pufferlösung entfernt werden. Nach gründlichem Waschen kann die Festphase wieder verwendet werden.
Es sollte erwähnt werden, das die Einfachheit des Betriebes der vorliegenden Vorrichtung und die Wiederverwendbarkeit der Festphase, folgt zumindest teilweise der Tatsache, dass radioaktives Markieren nicht länger benötigt wird.
Es ist natürliche erkennbar, dass die Erfindung in ihrer allgemeinsten Form nicht auf die oben beschriebenen spezifischen Merkmale beschränkt ist. Geeignete äquivalente Vorrichtungen können leicht durch einen Fachmann konstruiert werden, wobei die genauen Details jener Strukturen von dem spezifischen Gebiet von Interesse abhängen. Spezifische Bereiche, in welchen die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung Anwendung finden können, beinhalten Gewebe-Bildgebung, zum Beispiel Arnzeimittel-Targeting, Ausführung und zelluläre Diagnostik; Nukleinsäure-Abfrage und Kartierung, einschließlich Sequenzierung, Restriktionsenzym-Kartierung, Quantifizierung, Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Oligonukleotidreinigung; und Proteinbildgebung, einschließlich Peptidanalyse und Überwachen von Nukleinsäure-Manipulation und medizinischer Diagnostik.
Für geeignete Anwendungen kann ein UV Sensor, wie später unter Bezugnahme auf die 1 bis 5 beschrieben ist, verwendet werden. Solche Anwendungen sind wahrscheinlich jene, in welchen die Bildgebung in dem ungefähren Bereich von 220 bis 190 nm erreicht werden kann. Es ist jedoch nicht notwendig, eine gerippte Topologie zu verwenden, wie spezifisch beschrieben ist und für bestimmte Anwendungen wären planare Diamantdetektoren gleichermaßen angemessen. Der Vorteil eines Diamantdetektors ist, dass er beinahe kein Rauschen aufweist, seine exzellente Quantumwirksamkeit, und seine Linearität.
In Bereichen, die für die Verwendung mit Diamantdetektoren nicht geeignet sind, wie zum Beispiel die Region von 220 bis 290 (wo DNA absorbiert) können Nicht-Diamant-Halbleiter verwendet werden. Geeignete Detektoren würden UV-verstärkte Silikondetektoren und Photovervielfacher beinhalten.
Die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwenden entweder die intrinsische Absorptionseigenschaften von Molekülen, wenn sie Licht ausgesetzt sind, oder verwenden alternativ die Absorptionseigenschaften von Tags, die an die interessierenden Moleküle angeheftet sind. Spezialisierte molekulare Absorber mit unterschiedlicher molekularer Anheftung können verwendet werden, um die Sensitivität zu verbessern. Solche Absorber sollen nicht-toxisch sein.
Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung können Stereo-UV-Laser verwendet werden, um ein drei-dimensionales Bild der komplexen Strukturen in dem zu scannenden Objekt zu erzeugen, durch einfache Schattierungssoftware-Techniken. Wiederum könnte dies entweder unter Verwendung der intrinsischen Absorptionseigenschaften des zu untersuchenden Moleküls oder durch Verwenden von spezialisierten molekularen Absorbertags erreicht werden.
Ein typischer Detektor des Standes der Technik von geladenen Partikeln ist in 1 gezeigt. Der Detektor weist ein flaches Blatt 10 an isolierendem Material, wie Diamant, mit dünnen Goldelektroden-Filmen 12, 14 an seinen oberen und unteren Oberflächen auf. Der obere Elektroden-Film 12 weist eine Vielzahl von parallelen Auslese-Streifen auf, die in einer Richtung senkrecht zu der Ebene des Papiers in der Figur ausgerichtet sind, und der untere Elektroden-Film 14 weist eine weitere Vielzahl von Auslese-Streifen auf, die in einer mit der Ebene des Papiers parallelen Richtung ausgerichtet sind. Eine große Potentialdifferenz V wird zwischen den Elektrodenfilmen aufrechterhalten. Entweder die obere oder die untere Elektrode kann kontinuierlich sein, und die Streifen können abwechselnde Polarität aufweisen.
Ein geladendes Partikel, welches einem Weg 16 durch den Diamant folgt, erzeugt Elektronenloch-Paare 18, 20, welche sich unter dem Einfluss des elektrischen Feldes trennen und eine Ladung auf die Auslese-Streifen induzieren. Die Energie der Partikel kann durch die Menge an Ladung, welche gesammelt wird, und seiner Position durch die Kreuzung der oberen und unteren Streifen, die die größte induzierte Ladungen empfangen, bestimmt werden.
Ein bevorzugter Detektor, der für die Verwendung mit dem Verfahren und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird nun unter besonderer Bezugnahme auf die 2 und 3 detailliert beschrieben. Es ist ein Diamantdetektor und besitzt ein Diamantsubstrat 30 mit, auf einer Oberfläche, einer Vielzahl von parallelen geätzten Diamantrippen 40. Auf einer Seite jeder Rippe gibt es ein positive Auslese-Elektrode 50, und auf der anderen Seite eine negative Elektrode 60. Diese sind vorzugsweise Leiter, könnten anstelle jedoch auch aus einem hoch-leitenden gedopten Halbleitermaterial sein.
Im Betrieb wird der Detektor so positioniert, dass das Substrat im Wesentlichen normal zu einem Partikel oder Strahlungsstrahl 70, der zu detektieren ist, positioniert ist. Ein individuelles Partikel, welches in eine der Rippen übergeht, erzeugt ionisierte Träger, die aufgrund der großen Potentialdifferenz, die zwischen den Elektroden aufrechterhalten wird, schnell zu den Elektroden 50, 60 wandern. Dadurch wird eine Ladung auf die Elektroden induziert, und diese Ladung wird durch die Auslese-Vorrichtung (nicht gezeigt) an den Enden der Rippen ausgelesen.
Das Substrat und die Rippen sind vorzugsweise aus Diamant hergestellt, der entweder natürlich oder künstlich gezüchtet ist. Die Rippen können entweder gezüchtet werden, mit dem Substrat, oder sie können geätzt werden (zum Beispiel mit einem Eximer Laser). Die Elektroden 50, 60 können aus jedem Material oder Kombination von Materialien (zum Beispiel Titan, Vanadium, Chrom, und/oder Gold) sein, die einen ohmschen Kontakt mit der Diamantenoberfläche mit geeigneter Bearbeitung (zum Beispiel Ablation, Ionimplantation oder Anlagerung) bilden. Standardablagerungstechniken können verwendet werden, um das Metall als eine dünne Beschichtung auf die Seiten der Rippen aufzutragen. Typischerwesen kann die Vorrichtung durch Ätzen der Kämme, Auftragen des Materials und dann Polieren der obersten Fläche hergestellt werden.
Es ist aus 2 ersichtlich, dass die Sensitivität der gezeigten Vorrichtung durch Vergrößern des Wertes D (oder die Höhe der Rippen) erhöht werden kann. Je höher die Höhe der Rippen, desto größer ist die Menge an Material, durch welche ein Partikel hindurchwandern muss, dadurch wird die Ionisierung innerhalb der Vorrichtung erhöht. Die Höhe der Rippen wird normalerweise an die erwartete Penetrationstiefe der Partikel oder Photonen, die zu detektieren sind, angepasst. Die Auslese-Geschwindigkeit und Wirksamkeit wird durch die Breite L von jeder dieser Rippen bestimmt. In Abhängigkeit der bestimmten Anwendung kann der Wert von L so gering wie einige Mikrometer, oder ein größerer Wert von bis etwa 200 μ sein, und der Wert von D kann 10 μm oder mehr sein. Das Signal zu Rausch-Verhältnis ist groß, da es ein vernachlässigbares Nebensprechen von Signalen, die von individuellen Rippen ausströmen, gibt. Eine typische Substrattiefe ist etwa 100 μm, die ausreichen dick ist, um die Rippen zu unterstützen und um freistehend zu sein, ohne eine zusätzliche Unterstützungsbasis zu erfordern. Vorzugsweise benutzt die Vorrichtung einen Diamant relativ schlechter Qualität, mit einer Rekombinationslänge von vielleicht 6 μm oder so.
Die Impedanz der Auslese-Vorrichtung (nicht gezeigt) an dem Ende der Rippen stimmt vorzugsweise mit der Impedanz der Elektroden 50, 60 überein, wodurch die Auslese-Geschwindigkeit erhöht wird und die Signalverluste reduziert werden.
Es gibt eine Reihe von Arten, mit welchen eine Potentialdifferenz zwischen den Elektroden 50, 60, die in 2 gezeigt, angelegt werden kann. In der einfachsten Form kann eine Spannungsquelle einfach mit zwei Elektroden verbunden werden. Alternativ können die Elektroden mit einer Widerstandskette (nicht gezeigt) gekoppelt werden, wobei die Potentialdifferenz zwischen den Elektroden durch den Spannungsabfall über den entsprechenden Widerstand definiert wird.
Eine andere Ausführungsform ist in 4 gezeigt, in welcher die Elektroden über die Basis und die Seiten des Raumes zwischen den Diamantrippen 40 gebildet werden. Dies bedeutet effektiv, dass jede Elektrode 50' auf der linken Seite einer Rippe 40 mit einer entsprechenden Elektrode 60' auf der rechten Seite der nächsten Rippe in der Sequenz elektrisch gekoppelt ist, so dass sie zusammen eine einzelne U-förmige Elektrode 61 bilden. In der Ausbildungsform von 4a werden ein erstes abwechselndes Paar von U-förmigen Elektroden 61 über eine erste Spannungsquelle V₁ gekoppelt, und ein zweites abwechselndes Paar wird über ein zweite Spannungsquelle V₂ gekoppelt. Eine solche bipolare Spannungskonfiguration stellt sicher, dass es immer eine konstante Potentialdifferenz V₁ – V₂ über jede der Rippen 40 gibt.
Ein alternatives Verfahren zum Anlegen von Spannungen an die U-förmigen Elektroden 61 wird in 4b gezeigt. Hier wird eine Widerstandskette verwendet, um eine Eingangsspannung V über eine Vielzahl von seriellen Widerständen R abfallen zu lassen. Die Spannung über jede Rippe 40 kann durch Auswählen geeigneter Werte für V und R gewählt werden.
Es ist natürliche verständlich, das eine ähnliche biopolare Spannungskonfiguration oder Widerstandsketten-Spannungskonfiguration in Zusammenhang mit der Ausführungsform der 2 verwendet werden kann.
Eine typische Potentialdifferenz über die Rippe 40 kann im Bereich von 1 Volt pro μm sein. Wesentlich höhere Spannungen könnten verwendet werden, wenn gewünscht (da Diamant ein sehr hohe Durchschlagsspannung hat), aber es gibt im Allgemeinen keinen Bedarf an hohen Potentialdifferenzen, da bei höheren Spannungen die Trägergeschwindigkeit schnell gesättigt ist.
In einer weiteren Ausführungsform (nicht gezeigt) wird ein weiterer paralleler Satz von Rippen, die orthogonal zu dem ersten Satz sind, an der unteren Oberfläche des Substrats 30 bereitgestellt. Diese zwei senkrechten Rippensätze ermöglichen eine genaue X-Y Positionierung von jedem detektierten Partikel.
Die Raume zwischen den Rippen können mit einem Plastikmaterial, oder anderem Absorber, gefüllt werden, wodurch die Fähigkeit des Detektors, neutrale Partikel zu detektieren, verbessert wird.
Eine noch weitere Ausführungsform wird in 5 gezeigt. Hier wurden die Räume zwischen den Rippen sehr eng gemacht, und sie enthalten jeweils eine getrennte Elektrode 62. Eine solche Ausführungsform ist, in vielen Umständen, bevorzugt, da die Enge der Lücken zwischen den Rippen nur einen kleinen Akzeptanzverlust im Vergleich mit den Ausführungsformen der 2, 3 und 4 erzeugt. Die Breite der Lücke und somit die Breite der Elektrode 62, kann hauptsächlich davon abhängen, wie schmal ein Schlitz in eine Diamantstruktur geschnitten werden kann. Die Elektroden 62 können auf jede konventionelle Art und Weise zusammengekoppelt werden, so dass eine geeignete Potentialdifferenz über die Rippen 40 erzeugt wird, zum Beispiel unter Verwendung des Ansatzes der 4a oder der 4b.
Die Detektion von Hochenergie elektromagnetischer Strahlung, wie Gamma-Strahlen, können durch Hinzufügen einer Dusche-hervorrufende-Schicht (nicht gezeigt) auf den Oberteil der Rippen verbessert werden. Ein eintreffendes Photon trifft zuerst auf die eine Dusche-hervorrufende-Schicht und die resultierende Dusche dringt dann in eine der darunter liegenden Rippen ein, was ein Signal bereitstellt, welches detektiert wird.
Der oben beschriebene Ionisierungsstrahlungsdetektor kann eine sehr schnelle Ladungsauslesung bereitstellen, wahrscheinlich innerhalb von 35 ps und sicherlich innerhalb von 50 ps. Diese Auslesegeschwindigkeiten können derzeit für jeden Einzelpuls-Detektor mit vergleichbarer Sensitivität und positioneller Genauigkeit nicht erreicht werden.
Wir wenden uns nur einer Diskussion der Art und Weise zu, in welcher der obige Apparat in der Praxis verwendet werden kann, um individuelle Moleküle innerhalb einer Mischung zu identifizieren.
10 illustriert die Anordnung schematisch. Auf der einen Seite des langgestreckten Substrats 910, entlang welcher das Molekül sich bewegen wird, ist eine UV Lampe 920, während es auf der anderen Seite eine Reihe von beabstandeten UV Detektoren I₁, I₂, I₃, ... I_n gibt. Wie zuvor diskutiert wurde, wird die Sequenzierung durch das Detektieren des Durchganges von Banden von Biomolekülen vor den Detektorelementen erreicht. Da die Biomoleküle UV Licht in der interessierenden Region absorbieren, induziert der Durchgang von einer beliebigen Bande vor einem Detektor einen Abfall des nominalen DC(Gleich-)-Stroms, welcher durch die konstante Illumination 930 dieses Detektorelements durch die UV-Lichtquelle 920 hervorgerufen wird. Der Stromabfall wird gemessen und markiert, und als ein individuelles Signal behandelt, welches mit einer gegebenen Biomolekülbande in Zusammenhang gebracht werden kann. Nominal ist in einem elektrophoretischen Gel die Geschwindigkeit einer gegebenen Bande umgekehrt proportional zu der Wurzel der Masse der Nukleinsäuresequenz in der Bande; die Ladung der Sequenz ist von seiner Länge durch friktionale Bremskräfte entkoppelt, welche eine „terminale Geschwindigkeit" auferlegt, die durch diese Kräfte, die zu der Länge proportional sind, verursacht werden.
Um die individuellen Moleküle zu identifizieren, sammelt das System automatisch eine Sequenz von Signalen S_k(t) für die Anordnung von Detektoren S_k zu den Zeitpunkten t = t₁, t₂, t₃, .... Da nun die Position für jedes Detektorelement bekannt ist und die verstrichene Zeit ebenfalls bekannt ist, ist es möglich, die Geschwindigkeit, die ein bestimmtes Molekül benötigt hätte, um einen bestimmten Detektor in der gegebenen, verstrichenen Zeit zu erreichen, zu berechnen. Wenn wir zum Beispiel annehmen, dass die verstrichene Zeit von t_o = 0 gemessen wird und das der Detektor I_k eine Distanz Z_k von dem Ursprung O entfernt ist, können wir die nominale Geschwindigkeit V_k(t) mittels des Ausdruckes Z_k/t berechnen.
Jedes Signal S_k(t) wird dann zu einem geeigneten Kasten in einem gewichteten Histogramm hinzugefügt, welches durch die nominale Geschwindigkeit gruppiert ist. Die individuellen Signale können zu dem entsprechenden Kasten auf einen beliebe angemessene Art hinzugefügt werden, jedoch wird in der bevorzugten Ausführungsform ein Gewicht w zu den Kasten für jedes Signal hinzugefügt, wobei das Gewicht proportional zu der Signalgröße S_k(t) ist. Ein entsprechendes Diagramm oder Histogramm von den in dem Geschwindigkeitsraum graphisch dargestellten Gewichten ist in der 11 gezeigt.
Da jedes unterschiedliche, zu detektierende Biomolekül eine unterschiedliche Länge besitzt, wird es bei einer unterschiedlichen Geschwindigkeit wandern, und wird somit an einem unterschiedlichen Ort in dem Histogramm der 11 erscheinen. Individuelle Moleküle erscheinen als getrennte Spitzen oder Peaks in dem Histogramm; in den gezeigten Beispielen wurden die Moleküle A, B und C detektiert.
Bei einer möglichen Anordnung können die Signale S_k wiederholt für die Zeiten t₁, t₂, t₃ und so weiter gesammelt werden. Sobald alle Daten gesammelt sind, können sie graphisch dargestellt und analysiert werden, wie in 11 gezeigt ist. Bei einer alternativen und bevorzugten Anordnung werden die Daten jedoch gruppiert, während sie gesammelt werden. Der Vorteil einer solchen Anordnung ist, dass ein Diagramm, wie in 11 gezeigt ist, graphisch dargestellt werden kann, zum Beispiel auf einer Computeranzeige, und in Echtzeit aktualisiert werden kann. Wie die Datensammlung fortschreitet, werden die Spitzen, die für die detektierten Moleküle repräsentativ sind, schrittweise deutlicher.
Es ist verständlich, das die Zeitperiode zwischen nachfolgenden Abtastungen der Detektoren in Übereinstimmung mit der Anwendung ausgewählt werden kann. In der bevorzugten Ausführungsform tritt die Abtastung jede einhundert Millisekunden auf, jedoch kann für andere Anwendungen die Periode so kurz wie einige Mikrosekunden oder so groß wie mehrere Minuten oder sogar Stunden sein. Unter Voraussetzung, dass die Ausleseelektroniken den Datenfluss handhaben können, muss kein wirklicher Preis bezahlt werden, um kürzere und kürzere Zeiten zu wählen. Zusätzlich gibt es keine Notwendigkeit für zusammenhängende Zeitperioden, obwohl in der Praxis zusammenhängende Messungsperioden eher bequem sind, insbesondere mit der vorliegenden Anwendung, in welcher die Periode durch die Driftgeschwindigkeit, die Bandengröße und bestimmte andere Faktoren definiert ist.
Es wird erneut darauf hingewiesen, dass das Signal S_k bei jedem Detektor I_k repräsentativ für den Strom-Offset von dem nominalen DC-Niveau ist, welches vorhanden ist, wenn keine Moleküle in dem Strahlenweg 930 sind. Statistische Fluktuationen kann dieses Signal entweder negativ (d.h. über dem durchschnittlichen DC-Niveau) oder positiv (d.h. unterhalb des DC-Niveaus) nehmen. Im Durchschnitt tendieren diese dazu sich aufzuheben, und wie mehr Daten gesammelt werden, wird das Rauschen schrittweise unterdrückt. Indem nicht versucht wurde, individuellen Objekten zu folgen, sondern anstelle die Werte im Geschwindigkeitsraum „blind" aufzusummieren, wurden die Objekte automatisch auf eine Weise gefunden, die natürlich, sehr schnell ist und welche das Rauschen minimiert. Die benötigte Hardware ist sehr einfach, und die Software und die Analyse sogar noch mehr. Die Hardware können zum Beispiel durch Laden eines kapazitiven Elements mit einer Menge, die zu dem Signal S_k proportional ist, bereitgestellt werden.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens ist, dass nicht nur eine automatische Hintergrundsubtraktion ausgeführt wird, sondern das die erhaltene Präzision viel höher ist, als mögliche wäre, wenn einfach nur die Informationen von individuellen Detektorelementen verwendet wird. Die Information von der Anordnung S_k liefert insgesamt viel mehr Information und somit Präzision, als von der individuellen Betrachtung der Detektoren erhalten werden könnte.
Zusätzlich ermöglicht das Verfahren eine Quantifizierung. Durch Betrachten der Höhe und Breite von jeder einzelnen Spitze in 11, kann mit einiger Genauigkeit bestimmt werden, wie viel von jeder detektierten Substanz in der ursprünglichen Mischung enthalten war.
Die Verwendung eines im Wesentlichen planaren Lichtstrahles 930 und direktionalen Detektoren, stellt sicher, dass die Moleküle sehr präzise lokalisiert werden können, während sie den Detektor passieren. Während es natürlich möglich wäre, das beschriebene Verfahren mit Molekülen zu verwenden, die ein zu detektierendes Signal emittieren, wie Radioaktivität oder UV-Licht, ist es wahrscheinlich, dass die Präzision aufgrund zusätzlicher Streuung und der Tatsache, dass die Mokekülkonzentrationen größer sein müssten, um das gleiche Signal zu erzeugen (da der Großteil des emittierten Lichts oder Radioaktivität vergeudet wird, da es in alle Richtungen emittiert wird), geringer sein wird. Durch Verwenden der UV Absorption, um das Signal zu erzeugen, können viel kleinere Moleküle verwendet werden, so dass sie sich schneller bewegen und sich schneller trennen. Dies ermöglicht, dass die Lesezeiten dramatisch verkürzt werden, und zwar eher vielleicht auf Minuten als die herkömmlichen Stunden.

Claims

Verfahren zum Sequenzieren eines Biomoleküls, welches aufweist: Anwenden einer Sequenzierungreaktion auf eine Probe, die ein zu sequenzierendes Biomolekül enthält, um eine reagierte Probe zu erzeugen: Aufbringen der reagierten Probe auf ein Elektrophorese-Material; Anlegen einer Potentialdifferenz entlang des Materials, wodurch die Probe veranlasst wird, an einer Vielzahl von beabstandeten Detektoren vorbei zu wandern, wobei jeder Detektor I_k so eingerichtet ist, um ein Signal S_k zu erzeugen, welches für eine molekulare UV Absorption der Probe repräsentativ ist, wie sie den Detektor I_k passiert; Mehrmaliges Messen des Signals S_k(t) an jedem Detektor I_k zu einer Vielzahl von Zeiten t = t₁, t₂, t₃, ...; Gruppieren der Signale S_k(t) durch die Nominalgeschwindigkeit V_k(t), der Geschwindigkeit, die eine molekulare Substanz innerhalb der Wanderungsmischung benötigt, um den Detektor I_k zu der Zeit t zu erreichen; und Bestimmen der Sequenz des Biomoleküls gemäß den Peaks innerhalb der Sammlung an gruppierten Signalen.
Verfahren zum Sequenzieren von Biomolekülen nach Anspruch 1, in welchem die die Sequenzierungsreaktion UV-absorbierende Marker-Moleküle (Tag-Moleküle) enthält.
Verfahren zum Sequenzieren eines Biomoleküls nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem das Biomolekül eine Nukleinsäure enthält.
Verfahren zum Sequenzieren eines Biomoleküls nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem das Biomolekül ein Peptid enthält.
Verfahren zum Sequenzieren eines Biomoleküls nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem das Biomolekül ein Protein enthält.
Verfahren zum Sequenzieren eines Biomoleküls nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in welchem das Biomolekül einen Virus enthält.
Molekulares Sequenzierungssystem, welches eine UV-Lichtquelle (722, 870), welche so angeordnet ist, dass sie auf die Probe scheint, die die Produkte der Sequenzierungsreaktion eines zu sequenzierenden Biomoleküls enthält; ein Elektrophorese-Material (740, 850) und Mittel zum Anlegen einer Potentialdifferenz entlang des Materials, um zu bewirken, dass die Probe entlang des Materials wandert, aufweist; wobei das System weist weiters aufweist: eine Vielzahl von voneinander beabstandeten Detektoren, wobei jeder Detektor I_k so eingerichtet ist, um ein Signal S_k zu erzeugen, welches für eine molekulare UV Absorption der Probe repräsentativ ist, während sie den Detektor I_k passiert; Mittel für das wiederholte Messen des Signals S_k(t) an jedem Detektor I_k bei einer Vielzahl von Zeiten t = t₁, t₂, t₃, ...; Mittel zum Gruppieren der Signale S_k(t) durch die Nominalgeschwindigkeit V_k(t), der Geschwindigkeit, die eine molekulare Substanz innerhalb der Wanderungsmischung benötigt wird, um den Detektor I_k zu der Zeit t zu erreichen; und Mittel zum Bestimmen der Sequenz des Biomoleküls gemäß den Peaks innerhalb der Sammlung an gruppierten Signalen.
Molekulares Sequenzierungssystem nach Anspruch 7, in welchem die Vielzahl von Detektoren in Bezug auf die Probe stationär und eingerichtet ist, um die Fragmente, während sie vorbeiwandern oder innerhalb der Probe nach den Detektoren zu ermitteln.
Molekulares Sequenzierungssystem nach Anspruch 8, in welchem die UV-Quelle (870) gegenüber den Detektoren (860) angeordnet sind.
Molekulares Sequenzierungssystem nach einem der Ansprüche 7 bis 9, in welchem die Detektoren Diamant-Detektoren sind.
Molekulares Sequenzierungssystem nach einem der Ansprüche 7 bis 9, in welchem die Detektoren aus UV-verstärktem Silizium sind.
Molekulares Sequenzierungssystem nach einem der Ansprüche 7 bis 11, in welchem der Detektor eine einzelne Detektor-Materialscheibe (30) aufweist, wobei die Scheibe eine Vielzahl von parallel-verlaufenden Rinnen in der Oberfläche davon aufweist, wodurch zwischen den Rinnen eine Vielzahl von parallel-verlaufenden Detektorelementen (40) definiert sind, wobei die gegenüberliegenden Seiten jedes Elements entgegengesetzte Ableseelektroden (50, 60) und Mittel (V₁, V₂) für das Anlegen einer Potentialdifferenz zwischen den gegenüberliegenden Elektroden jedes Elements trägt, um ein elektrisches Feld über das Element hinüber zu erzeugen.
Molekulares Sequenzierungssystem nach einem der Ansprüche 7 bis 12, in welchem die Lichtquelle ein UV-Laser ist.
Molekulares Sequenzierungssystem nach einem der Ansprüche 7 bis 12, in welchem die Lichtquelle eine Deuterium-Lampe ist.
Molekulares Sequenzierungssystem nach einem der Ansprüche 7 bis 12, in welchem die Lichtquelle eine Helium-Entladungsröhre ist.
Molekulares Sequenzierungssystem nach einem der Ansprüche 7 bis 15, in dem das System eingerichtet ist, um festzustellen, dass ein Fragment dem Detektor benachbart ist, wenn der Detektor aufgrund der molekularen Lichtabsorption des Fragments einen reduzierten Lichteingang registriert.
Molekulares Sequenzierungssystem nach einem der Ansprüche 7 bis 16, in welchem das Elektrophorese-Material eine Festphase ist.
Molekulares Sequenzierungssystem nach Anspruch 17, in welchem das Elektrophorese-Material auf einem Quartzträgermaterial montiert ist.
Molekulares Sequenzierungssystem nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, in welchem das Elektrophorese-Material wiederverwendbar ist.
Molekulares Sequenzierungssystem nach einem der Ansprüche 7 bis 9, in welchem der Detektor ein Photovervielfacher ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem die Signale S_k(t) gruppiert werden, wie sie gesammelt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem die Nominalgeschwindigkeit V_k(t) aus der Kenntnis der gewanderten Distanz von einem Ausgangspunkt zu dem Detektor I_k und der verstrichenen Zeit, bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem die Nominalgeschwindigkeit als Z_k/t berechnet wird, wobei Z_k die Distanz zwischen dem Ursprung und dem Detektor I_k ist und t die verstrichene Zeit ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem die Signale S_k(t) gruppiert werden, indem die Werte innerhalb einer Vielzahl von Nominalgeschwindigkeit bins summiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem die Signale S_k für die Abnahme des durch die Detektoren als Folge der Lichtabsorption durch die zu identifizierenden molekularen Substanzen empfangenen Lichts repräsentativ sind.