DE69636728T4

DE69636728T4 - Neues protein und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE69636728T4
Application number: DE69636728T
Authority: DE
Inventors: Fusao Kawagoe-shi MAKISHIMA; Hiroyuki Kanagoe-shi TAKAMATSU; Hideo Kawagoe-shi MIKI; Shinji Kawagoe-shi KAWAI; Michio Kawagoe-shi KIMURA; Tomoaki Kawagoe-shi MATSUMOTO; Mieko Kawagoe-shi KATSUURA; Koichi Kawagoe-shi ENOMOTO; Yusuke Kawagoe-shi SATOH
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2016-04-20
Also published as: EP0955313A1; CA2216741C; NO974812L; DK0955313T3; HUP9801697A2; EA000582B1; PT955313E; US20030181378A1; NZ305472A; CA2216741A1; EP0955313B1; US7235527B2; DE69636728T2; US20090325864A1; US7268114B2; UA46767C2; PL322945A1; BR9608019A; NO321153B1; EA199700329A1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Protein mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls, welches von MP52 abgeleitet ist. Die Erfindung betrifft auch ein homodimeres Protein dieses Proteins und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Knorpel- und Knochenerkrankungen, welche das dimere Protein als einen Wirkstoff enthält. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen Proteins in großer Menge und mit hoher Reinheit durch Kultivieren von E. coli, welche mit einem Plasmid transformiert wurden, das eine DNA-Sequenz, die dazu geeignet ist, das oben beschriebene Protein zu exprimieren, enthält. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung von Knorpel- und Knochenerkrankungen, welches die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die als einen Wirkstoff eine effektive Menge des homodimeren Proteins enthält, bei einem Menschen umfasst.
2. Beschreibung des Stands der Technik
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Vitamin D₃, Kalzitonin, Östrogen oder deren Derivate sowie Biophosphonat-Derivate enthalten, sind in der klinischen Praxis zur Vorbeugung und Behandlung von Knochenerkrankungen verwendet worden. Von knochenmorphogenetischen Proteinen (im Folgenden BMP), der TGF-β-Gensuperfamilie, welche BMP-2 bis BMP-9 und verwandte Proteine umfasst, ist vor kurzem berichtet worden, dass sie knochenmorphogenetische Wirksamkeit aufweisen.
Weiterhin ist auch von der knochenmorphogenetischen Wirksamkeit eines dieser Proteine, welches als MP-52 bezeichnet wird, berichtet worden (WO 93/16099 und WO 95/04819). Als reife Region von MP52-Proteinen wird ein Protein angesehen, welches aus 120 Aminosäureresten mit N-terminalem Alanin besteht, und dessen Aminosäuresequenz ist in diesen Veröffentlichungen beschrieben.
Ein mit GDF-5 bezeichnetes Protein, welches eine zu MP52 analoge Aminosäuresequenz aufweist, ist außerdem in Nature, Band 368, S. 639-643 (1994) und WO 94/15949 beschrieben.
Diese Proteine können jedoch nicht auf einfache Weise in gereinigter Form in industriellem Maßstab hergestellt werden.
Säugerzelllinien wie beispielsweise L-Zellen wurden für die gentechnologische Herstellung von MP52 ausprobiert. Man hat jedoch erkannt, dass es nicht einfach ist, MP52 in gereinigter Form und mit hoher Ausbeute mit den Expressionssystemen herzustellen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben versucht, MP52 unter Verwendung von E. coli mittels Gentechnologie in großem Maßstab herzustellen. Die Erfinder haben versucht, MP52 unter Verwendung von E. coli herzustellen, indem ein Kodon, welches Methionin kodiert, an die DNA, welche die reife Region von MP52, die mit Alanin beginnt, kodiert, hinzugefügt wurde. Bei dem resultierenden Produkt handelt es sich nicht nur um MP52, sondern um ein Gemisch aus MP52, einem Protein mit 121 Aminosäureresten mit einem N-terminalen Methionin und einem Protein mit 119 Aminosäureresten, bei welchem das N-terminale Alanin abgespalten ist und welches mit Prolin beginnt. Es war extrem schwierig, reines MP52 mit wenigstens der reifen Region aus dem Gemisch zu isolieren.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass ein Protein von SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls, das mit Prolin am N-Terminus beginnt, auf selektive Weise mit einer extrem hohen Ausbeute hergestellt werden kann, indem ein Plasmid erzeugt wird, in welchem ein Kodon, das Methionin kodiert, an die DNA-Sequenz angebunden wurde, welche die aus 119 Aminosäureresten bestehende Aminosäuresequenz von SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls kodiert, wobei das N- terminale Alanin von MP52 entfernt ist, und indem E. coli, in welche das erhaltene Plasmid eingefügt wurde, für die Expression verwendet wurden. Außerdem wurde bestätigt, dass das Homodimer des in SEQ ID No.: 1 in dem Sequenzprotokoll beschriebenen Proteins eine knorpel- und knochenmorphogenetische Wirksamkeit besitzt und somit wurde die Erfindung abgeschlossen.
Ein Ziel der Erfindung ist es, ein Protein mit der in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz bereitzustellen. Das Protein besteht aus 119 Aminosäureresten und entspricht einem Protein, in welchem das N-terminale Alanin von humanem MP52, das als reife Region, die aus 120 Aminosäureresten besteht angesehen wird, entfernt ist. Das erfindungsgemäße Protein ist in Wasser löslich. Ferner ist das Protein selbst wenig toxisch, da es von humanem Protein abgeleitet ist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Knorpel- und/oder Knochenerkrankungen bereitzustellen, welche als einen Wirkstoff ein Homodimer des Proteins mit der in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz umfasst. Genauer betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Vorbeugung und Behandlung von Osteoporose, Osteoarthritis wie beispielsweise Gonarthritis deformans und Malum coxae deformans oder Arthroosteitis, Knorpelläsion wie beispielsweise artikuläre Meniskusläsion, Rekonstruktion in den beschädigten Teilen von Knochen und Knorpel, hervorgerufen durch Verletzung und Onkoektomie, Beschädigung von Knochen und Knorpel, Knochenbruch, kongenitale Knorpel- und Knochenerkrankungen wie beispielsweise Chondrodysplasie, Chondrohypoplasie, Achondrogenesis, Palatoschisis und Osteodysplasie und außerdem radikuläre und alveolare Defekte, da das erfindungsgemäße homodimere Protein Knorpel- und knochenmorphogenetische Wirksamkeit aufweist. Außerdem kann das homodimere Protein für eine Knochentransplantationsbehandlung in der kosmetischen Chirurgie eingesetzt werden. Diese Behandlungen beinhalten auch solche im Bereich der Veterinärchirurgie.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches aus 119 Aminosäureresten besteht und von humanem MP52, welches in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, abgeleitet ist, unter Verwendung von E. coli bereitzustellen.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Erzeugung eines Plasmids, das eine DNA-Sequenz beinhaltet, die die Aminosäuresequenz, welche aus 119 Aminosäureresten besteht und in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, kodiert, mit einem zusätzlichen Methionin am N-Terminus. Nur die reife Region von humaner MP52-cDNA wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR-Verfahren) amplifiziert, indem als eine Matritzen-DNA ein Plasmidvektor, der die in WO 93/16099 beschriebene cDNA enthält, verwendet wurde. Das PCR-Verfahren, auf welches hierin Bezug genommen wird, bedeutet im Allgemeinen eine Vervielfältigung einer sehr kleinen Menge an DNA-Fragmenten oder RNA-Fragmenten, nach dem in dem US-Patent 4,683,195 beschriebenen Verfahren.
Für die Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins ist es notwendig, geeignete Expressionsvektoren, welche DNA, die das Protein kodiert, beinhalten zu erzeugen, und anschließend durch Gentechnologie in gewünschte E. coli-Wirtsstämme einzufügen. Die beiden folgenden verbesserten Verfahren wurden für eine Herstellung des Proteins in großem Maßstab eingesetzt;

1) ein Verfahren zur Erhöhung der Produktivität von Zielproteinen durch Erhöhen der Translationseffizienz, wie von M. Nobuhara et al. (Agric. Biol. Chem., 52 (6), 1331-1338, 1988) beschrieben, nämlich das Verfahren zur Erhöhung des AT-Gehalts in der Umgebung des ATG-Startkodons und
2) ein Verfahren zur Erhöhung einer durchschnittlichen Kopienanzahl an Plasmiden pro Zelle, nämlich das Verfahren, in dem die Ori-Region für den Replikationsursprung des PBR-Vektors durch denjenigen des pUC-Vektors ersetzt wird.

Weiterhin wurde der erfindungsgemäße Expressionsvektor (pKOT245) erzeugt, indem die Promotorregion direkt mit der DNA-Sequenz verbunden wurde, welche die Aminosäuresequenz in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls mit einem zusätzlichen Methionin an dessen N-Terminus kodiert. Die E. coli, welche diesen Vektor enthielten, wurden am 14. April 1995 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, welches sich in 1-3, Higashi 1-chome, Yatake-cho, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan befindet, hinterlegt (Accession-Nr. BIKOKEN-KI P-14895) und am 10. April 1996 gemäß dem Budapester Abkommen über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt (Accession-Nr. BIKOKEN-KI BP-5499).
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monomerer Proteine umfassend die Schritte:
Erzeugen eines Plasmids, das DNA enthält, welche die Aminosäuresequenz in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls mit einem Methionin am N-Terminus kodiert,
Einbringen des Plasmids in E. coli für eine Transformation, Kultivieren der E. coli, um Einschlusskörper zu erhalten, Solubilisieren und Reinigen der Einschlusskörper, um monomere Proteine zu erhalten, und
ein Verfahren zur Herstellung homodimerer Proteine des Proteins von SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls durch Rückfalten und Reinigen der oben erhaltenen monomeren Proteine. Die Proteine der Erfindung wurden hergestellt durch Solubilisieren der E. coli-Einschlusskörper und anschließendes Auftragen auf eine SP-Sepharose FF-Säule und Sephacryl S-200-Säule, um gereinigte, sulfonierte MP52-Monomere zu erhalten, die einer Rückfaltung und isoelektrischer Präzipitation unterzogen wurden, anschließend erfolgte Auftragen auf eine RESOURCE RPC-Säule einer Reversphasen-HPLC, um die gereinigten dimeren Fraktionen der Proteine zu erhalten. Die physikochemischen Eigenschaften der Proteine wurden auf Grundlage der N-terminalen Aminosäuresequenz und der Aminosäurezusammensetzung und durch Elektrophorese analysiert.
Diese Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Kultivierung von E. coli, in welche die Expressionsvektoren der Erfindung eingebracht wurden, unter den Bedingungen eines Kulturmediums bei 28–34 °C, pH 6–8 und einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 20–50 %.
Diese Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung von Knorpel- und Knochenerkrankungen, welches die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche als einen Wirkstoff eine wirksame Menge des homodimeren Proteins enthält, bei einem Menschen umfasst.
Biologische Aktivitäten des homodimeren Proteins wurden durch Radiographie- Analyse mit weichen Röntgenstrahlen, Analyse durch Gewebeanfärben und Analyse des Zeitverlaufs ektopischer Knorpel-/Knochenbildung bestimmt. Weiter bestätigte sich aus den Ergebnissen der Wirkung auf die intramembrane Verknöcherung, der Wirkung auf die Regenerierung von Gelenkknorpel und der Wirkung auf die Heilung von Knochenbruch und -defekten, dass das homodimere Protein der Erfindung sich vorteilhaft auf Behandlungen der Knorpel- und/oder Knochenregeneration auswirkt.
Das homodimere Protein der Erfindung kann systemisch verabreicht werden durch intravenöse, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion. Im Fall von intravenöser Verabreichung kann zusätzlich zu herkömmlichen intravenösen Injektionen auch eine intravenöse Tropfinfusion verwendet werden.
Injizierbare Präparationen können beispielsweise in Form injizierbarer Pulver formuliert werden. In diesem Fall können die Pulver durch Hinzufügen eines oder mehrerer geeigneter wasserlöslicher Hilfsstoffe, wie beispielsweise Mannitol, Saccharose, Laktose, Maltose, Glukose, Fruktose und dergleichen, zu einem Wirkstoff, Auflösen des Gemischs in Wasser, Aufteilen in Phiolen oder Ampullen und anschließendes Lyophilisieren und hermetisches Verschließen hergestellt werden.
Im Fall einer lokalen Verabreichung kann das homodimere Protein auf die Oberfläche von Knorpel, Knochen oder Zahn, welche behandelt werden sollen, mit Kollagenpaste, Fibrinkleber oder anderen Haftmaterialien aufgetragen werden. Im Fall einer Knochentransplantation kann sowohl natürlicher Knochen als auch herkömmlicher künstlicher Knochen verwendet werden. Künstlicher Knochen bedeutet Knochen der aus Metall, Keramik, Glas und anderen natürlichen oder künstlichen anorganischen Substanzen hergestellt ist. Als bevorzugte künstliche Substanz ist Hydroxyapatit zu nennen. Beispielsweise kann künstlicher Knochen durch Stahl als dichtes Material im inneren Bereich und Hydroxyapatit als poröses Material im äußeren Bereich aufgebaut werden. Außerdem ist es nützlich, das homodimere Protein auf den Teil des Knochens, von welchem Krebsgewebe entfernt wurde, aufzutragen, um die Rekonstruktion von Knochen zu beschleunigen. Es kann auch für die Knorpeltransplantation eingesetzt werden.
Die Dosis kann abhängig von verschiedenen Faktoren, welche die Wirksamkeit des Proteins beeinflussen, wie beispielsweise dem Gewicht von Knochen und Knorpel, welche rekonstruiert werden sollen, der verletzten Stelle von Knochen und Knorpel und der Symptome, dem Alter und dem Geschlecht der Patienten, der Schwere der Infektion, den Verabreichungsintervallen und anderen klinischen Faktoren variiert werden. Die Dosis kann auch abhängig von der Art der Träger, die für die Rekonstruktion mit dem dimeren Protein verwendet werden sollen, variiert werden. Im Allgemeinen liegt die Dosis im Bereich von etwa 10–10⁶ ng an homodimerem Protein pro Nassgewicht an gewünschtem Knochen und Knorpel, wenn sie als Zusammensetzung, welche einen Träger enthält, verabreicht wird. Bei lokaler und systemischer Verabreichung durch Injektion ist es bevorzugt, 0,1–10⁴ μg mit einer Frequenz von einmal wöchentlich bis einmal täglich zu verabreichen.
Durch die gleichzeitige Verabreichung des homodimeren Proteins mit bekannten Wachstumsfaktoren wie beispielsweise insulinartigem Wachstumsfaktor-I ist ein synergistischer Effekt für die Regeneration von Knochen und Knorpel zu erwarten.
Es ist noch nie von einem Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins in industriellem Maßstab und in gereinigter Form wie oben beschrieben berichtet worden und das homodimere Protein ist als medizinische Zusammensetzung zur Behandlung von Knorpel- und Knochenerkrankungen nützlich, da es knorpel- und knochenmorphogenetische Aktivität besitzt. Ferner kann das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins für die Herstellung anderer Proteine der oben beschriebenen Mitglieder der TGF-β-Superfamilie angewendet werden, die bislang alle nur unter Verwendung von Säugerzelllinien erfolgreich hergestellt werden konnten.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht. Die Erfindung soll jedoch nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie auf diese speziellen Beispiele begrenzt ist.
Beispiele
Beispiel 1 Konstruktion eines Expressionsvektors
(1) Isolierung einer reifen Region von MP52
Eine reife Region von humaner MP52-cDNA wurde mittels PCR amplifiziert, wobei der Plasmidvektor (pSK52s) verwendet wurde, welcher in WO 93/16099 beschriebene cDNA als Matritzen-DNA enthält.
Gemäß dem Verfahren zur Erhöhung der Produktivität der Zielproteine, welches von M. Nobuhara, et al. (Agric. Biol. Chem., 52 (6), 1331-1338, 1988) beschreiben wurde, wurde ein Teil der DNA der reifen Region des MP52-Gens ausgetauscht, um den AT-Gehalt in der Nähe des ATG-Startkodons zu erhöhen.
Die Mutagenese wurde durch ein PCR-Verfahren unter Verwendung des konzipierten Stromaufwärts-PCR-Primers, der die Mutation von SEQ ID No.: 2 des Sequenzprotokolls einschließt, eingefügt. Für die DNA-Sequenz der PCR-Primer wurde die DNA von SEQ ID No.: 2 als Stromaufwärts-Primer und die DNA von SEQ ID No.: 3 des Sequenzprotokolls als Stromabwärts-Primer verwendet.
Die PCR wurde durchgeführt, indem die Matritzen-DNA (10 ng), 50 pmol jedes der PCR-Primer in Ablaufrichtung und in umgekehrter Richtung, dNTP (0,2 mmol) und MgCl₂ (1,5 mmol) zusammen mit Taq-DNA-Polymerase (5 U) in dasselbe Testgefäß gegeben wurde.
Dreißig PCR-Zyklen wurden durchgeführt; die Bedingungen jedes Zyklus waren 94 °C für eine Minute zur Denaturierung, 55 °C für eine Minute zum Primerannealing und 72 °C für 2 Minuten zur Primerverlängerung.
Die bei der PCR erhaltenen Produkte wurden durch Elektrophorese in 1,5 %-iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (bezogen von FMC) isoliert und die Fragmente mit etwa 360 bp wurden isoliert (Fragment 1).
(2) Konstruktion eines E. coli-Expressionsvektors für das erfindungsgemäße Protein
Um die Kopienanzahl des Plasmids pro Bakterium zu erhöhen, wurde die Ori-Region für den Replikationsursprung von derjenigen des pBR gegen diejenige des pUC-Vektors ausgetauscht. Der E. coli-Expressionsvektor pKK223-3 ist kommerziell erhältlich (bezogen von Pharmacia Biotech) und wurde verwendet, um die Tac-Promotor-Region durch Verdau mit den Restriktionsendonukleasen SspI und EcoRI zu isolieren und außerdem um unter Verwendung von SalI und SspI die rrnBt₁t₂-Terminatorregion zu isolieren. Ein DNA-Fragment der Tac-Promotorregion, welches mit Mungobohnennuklease (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt wurde, wurde durch T4-DNA-Ligase mit dem oben erhaltenen Fragment 1 ligiert. Das resultierende DNA-Fragment wurde durch SalI verdaut und mit der rrnBt₁t₂-Region religiert. Das DNA-Fragment wurde in die SmaI-Stelle des pUC18-Vektors ligiert, um den Expressionsvektor (pKOT245 (Accession-Nr. BIKOKEN-KI P-14895)) (1) für die Herstellung des Proteins zu erzeugen. Die Länge der pKOT245-DNA beträgt 3,7 kb. Die Nukleotidsequenz des für das Protein erzeugten Expressionsvektors wurde durch einen Pharmacia ALF-DNA-Sequenzierer analysiert.
(3) Transformation
Die Transformation wurde gemäß dem Rubidiumchlorid-Transformationsverfahren von Kushner et al. (Genetic Engineering, S. 17, Elsevier, 1978) durchgeführt. PKOT245 wurde verwendet, um den Wirtsstamm E. coli W3110M gemäß dem oben beschriebenen Verfahren zu transformieren, um E. coli-Transformanten für die Herstellung des Proteins zu erzeugen.
Beispiel 2 Kultivierung
(1) Kultivierung
Die E. coli, welche das erfindungsgemäße Protein exprimieren, wurden in dem modifizierten SOC-Medium (Bacto Trypton 20 g/l, Bacto Hefeextrakt 5 g/l, NaCl 0,5 g/l, MgCl₂·6H₂O 2,03 g/l, Glukose 3,6 g/l) vorkultiviert. 100 ml der Bakteriensuspension wurde verwendet, um 5 l des Produktionsmediums (Bacto Trypton 5 g/l, Zitronensäure 4,3 g/l, K₂HPO₄ 4,675 g/l, KH₂PO₄ 1,275 g/l, NaCl 0,865 g/l, FeSO₄·7H₂O 100 mg/l, CuSO₄·5H₂O 1 mg/l, MnSO₄·nH₂O 0,5 mg/l, CaCl₂·2H₂O 2 mg/l, Na₂B₄O₇·10H₂O 0,225 mg/l, (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0,1 mg/l, ZnSO₄·7H₂O 2,25 mg/l, CoCl₂·6H₂O 6 mg/l, MgSO₄·7H₂O 2,2 g/l, Thiamin HCl 5,0 mg/l, Glukose 3 g/l), zu beimpfen, welches in einem 10-Liter-Fermentierer unter Durchlüftungsrühren kultiviert wurde und dann wurde bei Erreichen des frühen Stadiums der logarithmischen Wachstumsphase (OD550 = 5,0) Isopropyl-β-D-thio-galaktopyranosid zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt und die Kultivierung wurde fortgesetzt, bis OD550 = 150 erreicht war. Während der Kultivierung wurde die Temperatur bei 32 °C gehalten und der pH-Wert wurde durch Hinzufügen von Ammoniak bei 7,15 gehalten. Um eine Verringerung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff zu verhindern, wurde das Rühren beschleunigt, so dass die Konzentration an gelöstem Sauerstoff bei einer Luftsättigung von 50 % gehalten wurde. Bei Anzeichen eines plötzlichen Anstiegs der Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde die Kultivierung fortgesetzt, indem 50 %-ige Glukoselösung bei einem Wert von 0,2 % hinzugefügt wurde, um eine hohe Zelldichte zu erhalten.
(2) Herstellung von E. coli-Einschlusskörpern
Die durch das oben beschriebene Verfahren erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um die Zellne zu ernten, welche dann in 25 mM Tris-HCl Puffer, der 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (pH 7,3) enthielt, suspendiert wurde. Die Zellen wurden zerstört, indem sie durch einen Homogenisierer geleitet wurden (hergestellt von APV Gaulin Inc.) und sie wurden erneut zentrifugiert, um das Präzipitat, welches die Einschlusskörper enthielt, zu ernten.
Beispiel 3 Reinigung
(1) Solubilisierung von E. coli-Einschlusskörpern
Nach dreimaligem Waschen mit 1 % Triton X-100 wurden die E. coli-Einschlusskörper bei 3 000 × g für 30 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und anschließend wurde das resultierende Präzipitat durch Sonikation in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, 8 M Harnstoff, 10 mM DTT und 1 mM EDTA solubilisiert.
(2) Herstellung von Monomeren
Die solubilisierte Lösung wurde bei 20 000 × g für 30 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde gesammelt. Der erhaltene Überstand wurde SP-Sepharose FF (Pharmacia AB), eingestellt mit 20 mM Tris-HCl-Puffer pH 8,3, 6 M Harnstoff und 1 mM EDTA, unterzogen und anschließend wurde er nach Waschen mit derselben Lösung mit derselben Lösung, welche 0,5 M NaCl enthält, eluiert. Das Protein in dem Eluat wurde sulfoniert durch Hinzufügen von Na₂SO₃ und Na₂SO₄O₆ bis zu einer Endkonzentration von 111 mM bzw. 13 mM und es wurde für 15 Stunden bei 4 °C inkubiert. Die sulfonierte Lösung wurde gelfiltriert an Sephacryl S-200 HR (Pharmacia AB), welche mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, 6 M Harnstoff, 0,2 M NaCl und 1 mM EDTA eingestellt war, um gereinigte sulfonierte Monomere der erfindungsgemäßen Proteine zu erhalten.
(3) Rückfalten
Die Lösung der sulfonierten Monomere wurde unter Rühren in ein neunfaches Volumen an 50 mM Na-Glyzin-Puffer, pH 9,8, 0,2 M NaCl, 16 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 2 mM GSH (Glutathion im reduzierten Zustand) und 1 mM GSSG (Glutathion im oxidierten Zustand) hinzugefügt und anschließend für 24 Stunden bei 4 °C inkubiert, um das erfindungsgemäße Protein zu oxidieren und rückzufalten.
(4) Herstellung von Homodimeren
Die Rückfaltungslösung wurde mit demselben Volumen an gereinigtem Wasser verdünnt und anschließend wurde der pH-Wert durch Hinzufügen von 6 N NaCl auf etwa 7,4 eingestellt, und die Lösung wurde einer isoelektrischen Präzipitation unterzogen. Die durch 20-minütige Zentrifugation bei 3 000 × g gesammelten Präzipitate wurden in einer Lösung mit 30 % Acetonitril, welche 0,1 % TFA enthielt, solubilisiert. Die Lösung wurde mit demselben Volumen an gereinigtem Wasser verdünnt und auf eine RESOURCE RPC-Säule (Pharmacia AB) einer Reversphasen-HPLC, die mit 25 % Acetonitril, welches 0,05 % TFA enthielt, voreingestellt war, aufgetragen und dann mit einem linearen Gradienten von 25–45 % Acetonitril, welches 0,05 % TFA enthielt, eluiert. Das Eluat wurde bei einer Absorption von 280 nm beobachtet. Die gereinigten homodimeren Proteinfraktionen wurden gesammelt und mittels SpeedVac-Konzentrierer (Servant Co.) lyophilisiert.
(5) Bestimmung der physikochemischen Eigenschaften des gereinigten erfindungsgemäßen Proteins
a) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz
Die Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz für die gereinigten Proteine wurde unter Verwendung eines Aminosäuresequenzierers Modell 476A (Applied Biosystems Inc.) durchgeführt, um die Aminosäuresequenz von dem N-Terminus zu der 30. Aminosäure wie in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls gezeigt, zu bestätigen.
b) Analyse der Aminosäurezusammensetzung
Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung der oben erhaltenen gereinigten Proteine wurde mit einem Aminosäuresequenzierer (PICO TAG Systems, Waters) durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt. Die in Tabelle 1 beschriebene Zahl gibt die Anzahl an Aminosäureresten pro monomerem Protein an. Tabelle 1

-: nicht detektierbar

c) Analyse durch Elektrophorese
Es wurde mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen bestätigt, dass das Molekulargewicht der oben erhaltenen gereinigten Proteine etwa 28 KDa beträgt.
Aus den oben unter a), b) und c) gezeigten Ergebnissen ergibt sich, dass das Protein der Erfindung ausgehend von dem N-terminalen Pro ausschließlich 119 Aminosäurereste umfasst.
Beispiel 4 Bestimmung der biologischen Aktivitäten
(1) Aktivität bei ektopischer Knochenbildung in Mäusen.
Etwa 500 μg an in Beispiel 3 erhaltenem homodimerem Protein wurden gelöst und in 50 μl 10 mM Chlorwasserstoffsäure verdünnt und es wurden Konzentrationen von 1 μg/10 μl, 10 μg/10 μl und 100 μg/10 μl der Lösung hergestellt. 10 μl jeder Lösung wurden mit 150 μl Porzintendon Typ-I Kollagenlösung (Koken, 0,5 %, pH 3, I-AC) gemischt, neutralisiert, lyophilisiert und die resultierende Mischung wurde in Taschen implantiert, die in den Oberschenkelmuskeln von 8 Wochen alten männlichen ICR-Mäusen erzeugt worden waren. Am Tag 21 nach der Implantation wurden die Tiere getötet und die Oberschenkel wurden herausgeschnitten. Nach dem Abtrennen der Haut wurde das Auftreten von kalzifizierten Geweben durch weiche Röntgenstrahlenradiographie bewertet. Wie in Tabelle 2 gezeigt, rief die Implantation von 1 μg/Stelle oder mehr des dimeren Proteins in einem Teil der Gruppe von Mäusen kalzifiziertes Gewebe hervor und 10 und mehr Dosen riefen in allen verwendeten Mäusen kalzifiziertes Gewebe hervor.
Tabelle 2
2 zeigt typische Beispiele von weichen Röntgenstrahlenradiographien von kalzifiziertem Gewebe, welches durch unterschiedliche Dosierungen an MP52-Protein hervorgerufen wurde. Die 2A, 2B und 2C zeigen Beispiele von weichen Röntgenstrahlenradiographien von 1 μg des homodimeren Proteins pro Stelle, 10 μg pro Stelle und 100 μg pro Stelle, die jeweils in Mäuseoberschenkel implantiert wurden. Diese Radiographien zeigen, dass das homodimere Protein in dem Mäuseoberschenkel kalzifiziertes Gewebe hervorrief und dieses auf eine dosisabhängige Art und Weise vermehrte. Um zu bestätigen, ob es sich bei den gebildeten kalzifizierten Geweben um Knorpel oder Knochen handelte, wurden die Sektionen der fixierten Mäuseoberschenkel, in welche 10 μg/Stelle des homodimeren Proteins implantiert wurden, mit von Kossa Alcian blue oder Hematoxylin-Eosin angefärbt.
3 zeigt lichtmikroskopische Aufnahmen der mit den jeweiligen Anfärbeverfahren angefärbten Abschnitte. In 3A (von Kossa-Anfärben) zeigen die mit ct und cc bezeichneten Bereiche kalzifiziertes Gewebe bzw. kalzifizierte Chondrozyten. In 3B (Alcian blue-Anfärben) zeigt ein mit rc bezeichneter Bereich verbleibendes Knorpelgewebe. In 3C (Anfärben mit Hematoxylin-Eosin) handelt es sich bei den mit ad, bm, lb, ob und wb bezeichneten Elementen jeweils um Adipozyt, Knochenmarkszellen, Lamellenknochen, Osteoblasten und Geflechtknochen. Somit ist es offensichtlich, dass die Implantation des homodimeren Proteins mit Typ-I Kollagen in Mäuseoberschenkel an den Stellen kalzifizierte Chondrozyten, Osteoblasten und Knochenmarkszellen induzierte.
Somit wurde gezeigt, dass das homodimere Protein eine Aktivität bei der ektopischen Knorpel- und Knochenbildung besitzt.
(2) Analyse des Zeitverlaufs der ektopischen Knochenbildung in Mäusen
Das in Beispiel 3 erhaltene dimere Protein (3 μg) wurde mit einer Typ-I- Kollagenlösung gemischt und wie in Beispiel 4 (1) beschrieben neutralisiert und die lyophilisierten Materialien wurden in die männlichen ICR-Mäuseoberschenkel implantiert. An den Tagen 3, 7, 10, 14, 21 und 28 nach der Implantation wurden die Oberschenkel herausgeschnitten und in 10 % Formalin fixiert und anschließend wurden Sektionen mit Hematoxylin-Eosin oder von Kossa angefärbt. 4 zeigt die lichtmikroskopischen Aufnahmen der angefärbten Sektionen.
Am Tag 3 (4A, Hematoxylin-Eosin-Anfärben) traten nicht-differenzierte Mesenchymalzellen (mc) einschließlich morphologischer fasriger Bindezellen in dem Raum zwischen implantierten Kollagenfasern (co) und Muskelzellen (m) auf. Zwischen den Tagen 7 und 10 (4B bzw. 4C, Anfärben mit Hematoxylin-Eosin) war der Raum mit nicht-differenzierten Mesenchymalzellen (mc) gefüllt und diese Zellen wurden hypertrophiert und differenziert zu Vorknorpelgewebe. Am Tag 14 (4D, Anfärben mit Hematoxylin-Eosin und 4E, Anfärben mit von Kossa) wurde kalzifiziertes Knorpelgewebe (cc) und Knochengewebe (b) beobachtet. Am Tag 21 (4D, Anfärben mit Hematoxylin-Eosin und 4E, Anfärben mit von Kossa) wurde keinerlei kalzifiziertes Knorpelgewebe beobachtet und das am Tag 14 beobachtete Gewebe schien durch Knochen (b) mit Knochenmark (bm) ersetzt worden zu sein. Am Tag 28 (4H, Anfärben mit Hematoxylin-Eosin) lag eine große Menge an Knochenmarkszellen vor und gebildeter Knochen schien sich in einem Resorptionsvorgang zu befinden.
Es ist somit offensichtlich, dass das homodimere Protein eine endochondrale Verknöcherung durch Knorpelbildung an ektopischen Stellen induziert, wie es bei der Verwendung anderer BMPs berichtet wurde.
(3) Auswirkung auf die intramembrane Verknöcherung
Das in Beispiel 3 erhaltene homodimere Protein wurde in phosphatgepufferter Saline (pH 3,4), welche 0,01 % humanes Serumalbumin enthielt, gelöst und Lösungen mit Konzentrationen von 0,01 μg/20 μl, 0,01 μg/20 μl und 1 μg/20 μl wurden hergestellt. Eine 20 μl-Portion jeder Lösung wurde 12-mal einmal täglich unter Verwendung einer Mikrospritze in die Knochenhaut des Scheitelbeins neugeborener Ratten injiziert, beginnend am Tag 1 nach der Geburt. Dasselbe Volumen des Vehikels wurde auf die Gegenseite des Scheitelknochens jeder Ratte injiziert. Dasselbe Volumen des Vehikels wurde auch auf beiden Seiten des Scheitelknochens von Kontrollratten injiziert. Am Tag 1 nach der letzten Injektion wurden die Ratten getötet und beide Seiten der Scheitelbeine wurden herausgeschnitten und fixiert, und anschließend wurden die mit Hematoxylin-Eosin angefärbten dekalzifizierten Sektionen präpariert, um die Dicke der Scheitelbeine an den Injektionsstellen auf Mikroskopaufnahmen zu messen. Das Verhältnis homodimeres Protein-Injektionsstelle zu Vehikel-Injektionsstelle bezüglich der Dicke des Scheitelbeins jeder Ratte wurde berechnet. Wie in Tabelle 3 gezeigt, erhöhte das homodimere Protein auf eine dosisabhängige Art und Weise die Dicke des Scheitelbeins. Ein typisches Beispiel der mikroskopischen Aufnahmen der Sektion bei einem Verhältnis homodimeres Protein/injizierte Stelle von 0,1 μg/Stelle ist in 5B im Vergleich zu der gegenüberliegenden Vehikelinjektionsstelle gezeigt (5A). Die Injektion des homodimeren Proteins rief die Aktivierung und Proliferation von Periostalzellen (p) hervor und aktivierte Osteoblasten (ob) wurden in und auf dem Scheitelbein (b) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die intramembrane Verknöcherung durch das homodimere Protein stimuliert wurde, wenn es lokal injiziert wurde, und dass das homodimere Protein für die Therapie von Osteoporose, Knochenbruch und alveolärer Krista und peridontalen Defekten nützlich ist.
Tabelle 3
Werte bedeuten Mittelwerte ± SD (n = 4), *p < 0,05, **p < 0,01 im Vergleich zum Verhältnis der Gruppe, in welche Vehikel in beide Stellen injiziert wurce (Williams'-Test).
(4) Auswirkung auf die Regeneration von artikulärem Knorpel
Für diese Studie wurden sechs 12-Wochen-alte männliche Weiße Neuseeland Kaninchen verwendet. Die Haut des rechten Knies und die artikuläre Kapsel wurden geschnitten und in der Patellarinne wurde unter Verwendung eines dentalen Schnittgeräts ein osteochrondraler Defekt mit einer Dicke von 5 × 5 mm erzeugt, um umgebende Sehnen nicht zu beschädigen. Die Defekte wurden entweder mit lyophilisiertem Typ-I Kollagenschwamm oder mit lyophilisiertem Typ-I Kollagenschwamm, welcher 10 μg homodimeres Protein, das wie in Beispiel 4 (1) beschrieben hergestellt wurde, enthielt, aufgefüllt und anschließend wurden die geschnittene artikuläre Kapsel und die Haut genäht. Drei Wochen nach der Operation wurden die Kaninchen getötet und die Oberschenkelköpfe wurden herausgeschnitten und in 10 %-igem Formalin fixiert und anschließend wurden dekalzifizierte Sektionen mit Alcian blue angefärbt. Typische Beispiele mikroskopischer Aufnahmen der Sektionen sind in 6 gezeigt. Die mit dimerem Protein behandelten Defekte (6C und 6D) zeigten die Regeneration von Chondrozyten (ch) mit extrazellulären Matritzen, welche intensiv mit Alcian blue angefärbt waren, im Vergleich zu Kontrolldefekten, in welche Typ-I Kollagenschwamm implantiert worden war (6A und 6B), welche mit fasrigem Gewebe gefüllt waren (f). Das durch das dimere Protein hervorgerufene Knorpelgewebe zeigte eine zonenartige Struktur mit ruhenden Chondrozyten, wachsenden Chondrozyten und hypertrophierten Chondrozyten, wie denjenigen von normalem artikulärem Knorpel. Die Chondroinduktion durch das MP52-Protein wurde in den Defekten aller verwendeten Kaninchen (n = 3) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das dimere Protein zur Reparatur von beschädigtem Knorpelgewebe von Patienten nützlich ist, wie beispielsweise bei Osteoarthritis.
(5) Auswirkung auf die Heilung von Knochenbruch und -defekten
30 männliche Sprague-Dawley-Ratten (etwa 15 Wochen alt) wurden für diese Studie verwendet. Unter Verwendung einer seitlichen Annäherung an den Oberschenkelknochen wurde sämtliches Muskel- und Periostelgewebe von der Diaphyse abgestreift. Ein 5 mm-Segment Knochendefekt wurde im mittleren Bereich des rechten Oberschenkelknochenschafts erzeugt, wobei ein dentales Schnittwerkzeug verwendet wurde und anschließend wurde eine speziell hergestellte Polyethylenplatte mit rostfreien Schrauben entlang des Kortex des Oberschenkelknochens fixiert. Typ-I-Kollagenschwämme, welche 0, 1, 10 und 100 μg des homodimeren Proteins enthielten, wurden wie in Beispiel 4 (1) beschrieben hergestellt und in die Segmentknochendefekte implantiert und anschließend wurde die Wunde genäht. Unmittelbar nach der Operation und 12 Wochen nach der Operation wurden die Defekte durch Radiographie mit weichen Röntgenstrahlen bewertet. Wie in 7 gezeigt, regte 10 und 100 μg/Stelle des homodimeren Proteins die Callus (cs)-Bildung in den Defekten und den gebildeten knochenartigen Einheiten an, aber die Wirkung bei 1 μg/Stelle war im Vergleich zu dem Defekt, in welchen Kollagenkontrolle implantiert worden war, bei welchem nur marginale Endostealknochenbildung beobachtet wurde, nicht deutlich. 12 Wochen nach der Operation wurden die Ratten getötet und der Oberschenkelknochen mit einem Defekt wurde herausgeschnitten und der Knochenmineralgehalt (Summe der Mittelwerte dreier Scans pro Defekt) wurde durch Dualenergie-Röntgenstrahlabsorptiometrie (Aloka, Modell DCS-600) in einem Modus mit 1 mm Scanbreite nach Entfernen der Polyethylenplatte gemessen. Beide Enden des Oberschenkelknochens mit dem Harz wurden fixiert, anschließend wurde die maximale Torsionsfestigkeit, um die Einheit der Proben zu brechen, mittels Knochenstrainersystem (Malto, Modell MZ-500D) bei einer Arbeitsgeschwindigkeit von 180 °/Min (Tabelle 4) gemessen. Es zeigte sich, dass das homodimere Protein sowohl den Knochenmineralgehalt als auch die Knochenfestigkeit bei dem Rattenoberschenkelknochendefekt, in welchen das Protein implantiert worden war erhöht und dies spiegelt die Wirksamkeit des vorliegenden Proteins zur Bruchheilung und Knochenrekonstruktion des Defekts wider.
Tabelle 4
Werte bedeuten Mittelwerte ± SE, *p < 0,05 im Vergleich zur Gruppe mit Kollagen allein (Studenten-T-Test).
Aus den Ergebnissen in Beispiel 4 ergibt sich, dass das homodimere Protein der Erfindung Knorpel- und knochenmorphogenetische Wirksamkeit besitzt.
Das Protein, welches aus einem Homodimer des Proteins mit einer Aminosäuresequenz in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls zusammengesetzt ist, besitzt eine Knorpel- und knochenmorphogenetische Wirksamkeit und ist als pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Knorpel und Knochenerkrankungen nützlich. Weiter kann das erfindungsgemäße Protein in industriellem Maßstab und in reiner Form durch ein gentechnologisches Verfahren durch Kultivieren von E. coli, welche mit einem Expressionsvektor für das Protein mit höherer Kopienanzahl transformiert sind, hergestellt werden.
„Sequenzprotokoll"
Kurze Erläuterung der Zeichnungen
1 zeigt eine Plasmidkarte des Expressionsvektors (pKOT245) für das Protein der Erfindung, welches in Beispiel 1 (2) erhalten wurde.
2 zeigt eine weiche Röntgenstrahlenradiographie des kalzifizierten Gewebes, welches in Mäuseoberschenkel in Beispiel 4 (1) induziert wurde.
3 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme des angefärbten kalzifizierten Gewebes in Mäuseoberschenkel in Beispiel 4 (1).
4 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme der zeitlichen Entwicklung des angefärbten kalzifizierten Gewebes in Beispiel 4 (2).
5 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme von angefärbtem Rattenscheitelbein in Beispiel 4 (3).
6 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme von angefärbten artikulären Knorpeldefekten in dem Rattenoberschenkelknochenkopf in Beispiel 4 (4).
7 zeigt eine weiche Röntgenstrahlenradiographie der Knochenbildung in den Knochendefekten der Rattenoberschenkelknochen in Beispiel 4 (5).

Claims

Präparation eines MP52 Proteins mit 119 Aminosäuren, welches aus der in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz besteht, und welches keine Proteine der SEQ ID Nr. 1 mit einem zusätzlichen Alanin oder zusätzlichen Met und Ala am N-Terminus aufweist.
Präparation nach Anspruch 1, wobei das MP52 Protein mit 119 Aminosäuren ein homodimeres Protein ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Knorpel- und Knochenerkrankungen, welche eine therapeutisch wirksame Menge der Präparation nach Anspruch 2 und einen pharmazeutischen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei Knorpel- und Knochenerkrankungen Osteoporose sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei Knorpel- und Knochenerkrankungen Osteoarthritis oder Arthroosteitis sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei Knorpel- und Knochenerkrankungen Knochenbruch und Knochendefekt sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei Knorpel- und Knochenerkrankungen radikuläre und alveolare Defekte sind.
Verfahren zur Herstellung der Präparation nach Anspruch 1, welches Kultivieren von E. coli, die mit einem Plasmid, das eine DNA-Sequenz enthält, transformiert sind, das in der Lage ist, das Protein zu exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Plasmid eine DNA enthält, welche die Aminosäuresequenz in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls mit einem Methionin am N-Terminus codiert.
Verfahren zur Herstellung der Präparation nach Anspruch 2, welches die Schritte umfasst: Erzeugen eines Plasmids, das DNA enthält, welche die Aminosäuresequenz in SEQ ID No.: 1 des Sequenzprotokolls mit einem Methionin am N-Terminus codiert, Einbringen des Plasmids in E. coli zur Transformation, Solubilisieren von Einschlusskörpern die durch Kultivieren der E. coli erhalten werden, Reinigen des monomeren Proteins aus der solubilisierten Lösung, Rückfalten des monomeren Proteins zu einem dimeren Protein und Reinigen des dimeren Proteins.
Verwendung einer Proteinpräparation nach Anspruch 2, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Knorpel- und Knochenerkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Erkrankung Osteoporose ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Erkrankung Osteoarthritis oder Arthroosteitis ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Erkrankung Knochenbruch und Knochendefekt ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Erkrankung radikuläre und alveolare Defekte ist.