DE69636734T2 - Nucleoside mit anti-hepatitis b virus wirksamkeit - Google Patents

Nucleoside mit anti-hepatitis b virus wirksamkeit Download PDF

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Description

  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Diese Erfindung stellt die Verwendung einer wirksamen Menge einer oder mehrerer der hier offenbarten aktiven Verbindungen oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat oder Prodrug einer dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines mit Hepatitis B (auch als „HBV" bezeichnet) infizierten Patienten bereit.
  • Als Ursache für Krebs beim Menschen steht der HBV an zweiter Stelle nach dem Tabak. Der Mechanismus, durch den der HBV Krebs induziert, ist unbekannt, obwohl davon ausgegangen wird, dass er die Tumorentwicklung direkt oder indirekt durch chronische Entzündung, Zirrhose und Zellregeneration, die mit der Infektion verbunden ist, auslöst.
  • Der Hepatitis-B-Virus hat weltweit epidemische Formen angenommen. Nach einer Inkubationszeit von zwei bis sechs Monaten, in der der Wirt nichts von der Infektion weiß, kann die HBV-Infektion zur akuten Hepatitis und Leberschädigung führen, die Abdominalschmerz, Gelbsucht und erhöhte Blutspiegelwerte bestimmter Enzyme verursacht. HBV kann eine fulminante Hepatitis verursachen, eine schnell fortschreitende, häufig tödliche Form der Krankheit, bei der große Abschnitte der Leber zerstört werden. Typischerweise erholen sich Patienten von einer akuten viralen Hepatitis. Bei einigen Patienten bleiben jedoch hohe Level an viralem Antigen im Blut für eine längeren oder unbegrenzten Zeitraum bestehen, die eine chronische Infektion verursachen. Chronische Infektionen können zu einer chronisch persistenten Hepatitis führen. Patienten, die chronisch anhaltend mit dem HBV infiziert sind, sind am häufigsten in Entwicklungsländern zu finden. Mitte des Jahres 1991 gab es ungefähr 225 Millionen chronische Träger des HBV allein in Asien und weltweit fast 300 Millionen Träger. Chronische persistente Hepatitis kann Müdigkeit, Leberzirrhose und Leberzellenkarzinom, einen primären Leberkrebs, verursachen. In westlichen Industrieländern gehören zu den Hochrisikogruppen für eine HBV-Infektion jene, die in Kontakt mit HBV-Trägern oder deren Blutproben kommen. Die Epidemiologie des HBV gleicht tatsächlich derjenigen des erworbenen Immundefizienzsyndroms sehr, was erklärt, warum die HBV-Infektion unter Patienten mit AIDS oder HIV-Infektionen verbreitet ist. Der HBV ist jedoch ansteckender als der HIV.
  • Tägliche Behandlungen mit α-Interferon, einem gentechnisch hergestellten Protein, hat gute Ansätze gezeigt. Es wurde ebenfalls ein vom Humanserum abgeleiteter Impfstoff entwickelt, um Patienten gegen HBV zu immunisieren. Mit Hilfe der Gentechnik wurden Impfstoffe produziert. Zwar stellte sich der Impfstoff als wirksam heraus, die Produktion des Impfstoffs ist jedoch mühsam, da die Versorgung mit Humanserum von chronischen Trägern limitiert ist, und der Reinigungsvorgang lang und teuer ist. Ferner muss jede Impfstoffcharge, die aus einem anderen Serum hergestellt wird, an Schimpansen getestet werden, um die Sicherheit zu gewährleisten. Außerdem hilft der Impfstoff Patienten nicht, die bereits mit dem Virus infiziert sind.
  • Die europäische Patentanmeldung Nr. 92304530.6 offenbart, dass eine Gruppe von 1,2-Oxathilan-Nukleosiden für die Behandlung von Hepatits-B-Infektionen nützlich sind. Es wurde berichtet, dass das 2-Hydroxymethyl-5-(Cytosin-1-yl)-1,3-Oxathiolan eine Anti-Hepatits-B-Aktivität aufweist. Doong, et al., Proc. of Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8495–8499 (1991); Chang, et al., J. of Biological Chem., Vol 267(20), 13938–13942. Die Anti-Hepatitis-B-Aktivität des (–)- und (+)-Enantiomers von 2-Hydroxymethyl-5-(5-Fluorcytosin-1-yl)-1,3-Oxathiolan wurde von Furman et al., in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Dez. 1992, Seiten 2686–2692 veröffentlicht.
  • PCT/US92/03144 (Internationale Veröffentlichungsnr. WO 92/185117), eingereicht von der Yale University, offenbart eine Anzahl von β-L-Nukleosiden zur Behandlung sowohl von HBV als auch HIV. Zu den anderen Arzneimitteln, die zur Behandlung von HBV erforscht wurden, gehören Adenosinarabinosid, Thymosin, Acyclovir, Phosphonoformiat, Zidovudin, (+)-Cyanidanol, Quinacrin und 2'-Fluorarabinosyl-5-Joduracil.
  • Ein wesentlicher Schritt der Wirkungsweise von Purin- und Pyrimidin-Nukleosiden gegen virale Krankheiten, und insbesondere HBV und HIV, ist ihre metabolische Aktivierung durch zelluläre und virale Kinasen, um Mono-, Di- und Triphosphatderivate zu ernten. Die biologisch aktive Spezies vieler Nukleoside ist die Triphosphatform, die die DNA-Polymerase oder Umkehrtranskriptase hemmt oder Kettenabbruch verursacht. Die Nukleosidderivate, die bisher für die Behandlung von HBV und HIV entwickelt wurden, wurden für die Verabreichung an einen Wirt in nicht phosphorilierten Form präsentiert, ungeachtet der Tatsache, dass das Nukleosid in der Zelle phosphoriliert werden muss, bevor es seine antivirale Wirkung zeigt, da die Triphosphatform typischerweise entweder vor dem Erreichen der Zelle dephosphoriliert wurde oder von der Zelle nur schwach absorbiert wird. Nukleotide durchdringen im Allgemeinen Zellmembranen sehr ineffizient und sind normalerweise in vitro nicht sehr potent. Versuche zur Modifikation von Nukleotiden zur Erhöhung der Absorption und Leistungsfähigkeit von Nukleotiden wurden von R. Jones und N. Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995) 1–17 beschrieben. WO 93/00910 beschreibt bestimmte Lipidmodifizierte Nukleosidanaloga zur Behandlung von HBV. Hostetler et al., (Antiviral Rsch., 24: 59–69 (1994)) beschreiben Phospholipid-Prodrugs von β-D-Dideoxycytidin. Perigaud et al., (Bioch. Pharm., 48: 11–14 (1994)) offenbart die Wirksamkeit von Phosphotriestern von β-D-Dideoxycytidin auf HIV.
  • Angesichts der Tatsache, dass der Hepatitis-B-Virus weltweit epidemische Formen angenommen hat, und schwere und tragische Wirkungen für den infizierten Patienten hat, besteht weiterhin ein großer Bedarf, neue wirksame pharmazeutische Mittel bereitzustellen, um Menschen zu behandeln, die mit dem Virus infiziert sind, die eine geringe Toxizität für den Wirt haben.
  • Daher ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur Behandlung menschlicher Patienten oder anderer Wirte bereitzustellen, die mit HBV infiziert sind.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die Verwendung eines Nukleotid-Prodrugs aus β-L-2',3'-Dideoxyadenosin zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung eines mit Hepatitis B infizierten Patienten, wobei:
    • a) Das Nukleotid am 5-Kohlenstoff 5'-mono-, di- oder triphosphoriliert ist;
    • b) ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch einen Rest substituiert sind, der unabhängig aus einem Alkyl, Aryl, Steroid, Kohlenhydrat, 1,2-Diacylglycerol, Alkohol und S-Acyl-2-thioethyl ausgewählt ist, und
    • c) das Nukleotid mindestens zu 95 % frei von seinem entgegengesetzten β-D-Enantiomer ist.
  • In einer bevorzugen Ausführungsform wird das Nukleotid als das angegebene Enantiomer bereitgestellt und im Wesentlichen in Abwesenheit von dessen entsprechendem Enantiomer (d. h., in enantiomerisch angereicherter Form).
  • Ein Prodrug, wie hier verwendet, bezieht sich auf ein pharmazeutisch verträgliches Derivat des spezifisch offenbarten Nukleosids, das bei der Verabreichung in vivo in das Nukleosid umgewandelt wird, oder das an sich eine Aktivität aufweist. Nicht beschränkende Beispiele sind 5'- und N6-Purin-acylierte oder -alkylierte Derivate der aktiven Verbindung.
  • Das Nukleosid wird als ein Monophosphat-, Diphosphat- oder Triphosphatderivat bereitgestellt, (d. h. ein Nukleotid-Prodrug), zum Beispiel ein Ester, das das Prodrug in vivo stabilisiert.
  • Die offenbarten Nukleoside oder ihre pharmazeutisch verträglichen Prodrugs oder Salze von β-L-2',3'-Dideoxyadenosin oder pharmazeutisch verträgliche Formulierungen, die diese Verbindungen enthalten, sind für die Vorbeugung und Behandlung von HBV-Infektionen und anderen verwandten Erkrankungen, wie etwa Anti-HBV-Antikörper-positive und HBV-positive Erkrankungen, chronische Leberentzündung, die von HBV verursacht ist, Zirrhose, akute Hepatitis, fulminante Hepatitis, chronische persistente Hepatitis und Müdigkeit, nützlich. Diese Verbindungen oder Formulierungen können auch prophylaktisch verwendet werden, um dem Fortschreiten des klinischen Leidens bei Individuen vorzubeugen oder zu sie verzögern, die Anti-HBV-Antikörper- oder HBV-Antigen-positiv sind oder die HBV ausgesetzt waren.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung werden eine oder mehrere aktive Verbindungen im Wechsel oder in Kombination mit einem oder mehreren Anti-HBV-Mitteln verabreicht, um eine wirksame Anti-HBV-Behandlung bereitzustellen. Beispiele für Anti-HBV-Mittel, die in Alternanz- oder Kombinationstherapie verwendet werden können, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf 2-Hydroxymethyl-5-(5-Fluorcytosin-1-yl)-1,3-Oxathiolan („FTC", vgl. WO 92/14743), dessen physiologisch verträgliches Derivat, oder physiologisch verträgliches Salz; 2-Hydroxymethyl-5-(Cytosin-1-yl)-1,3-Oxathiolan (einschließlich der razemischen BCH-189-Form, oder 3TC (BCH-189, angereichert mit dem (–)-Enantiomer)), dessen physiologisch verträglichem Derivat, oder physiologisch verträglichem Salz; 2'-Fluoro-5-Ethyl-Arabinosyluracil (FEAU); Carbovir oder Interferon.
  • Es kann jedes Alternanzverfahren verwendet werden, das eine Behandlung des Patienten bereitstellt. Zu den nicht beschränkenden Beispielen für Alternanzmuster gehören 1 bis 6 Wochen Verabreichung einer wirksamen Menge eines Mittels, gefolgt von 1 bis 6 Wochen der Verabreichung einer wirksamen Menge eines zweiten Anti-HBV-Mittels. Zum Alternanzplan können auch behandlungsfreie Zeiträume gehören. Zur Kombinationstherapie gehört normalerweise die gleichzeitige Verabreichung eines wirksamen Dosierungsverhältnisses von zwei oder mehreren Anti-HBV-Mitteln.
  • Angesichts der Tatsache, dass HBV häufig bei Patienten zu finden ist, die ebenfalls Anti-HIV-Antikörper- oder HIV-Antigen-positiv sind, oder die HIV ausgesetzt waren, können die aktiven Anti-HBV-Verbindungen, die hier offenbart sind, oder ihre Derivate oder Prodrugs unter geeigneten Umständen in Kombination oder Alternanz mit Anti-HIV-Medikationen verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, 3'-Azido-3'-Deoxythymidin (AZT), 2',3'-Dideoxyinosin (DDI), 2',3'-Dideoxycytidin (ddC), 2',3'-Dideoxy-2',3'-Didehydrothymidin (D4T), 2-Hydroxymethyl-5-(5-Fluorcytosin-1-yl)-1,3-Oxathiolan (FTC) oder 2-Hydroxymethyl-5-(Cytosin-1-yl)-1,3-Oxathiolan (razemisches BCH-189 oder BCH-189, angereichert mit dem (–)-Enantiomer, 3TC). Nicht-Nukleosid-RT-Hemmer, wie etwa die Tibo-Klasse der Verbindungen, Nevirapin oder Pyrimidinon können ebenfalls in Kombination mit den beanspruchten Verbindungen verabreicht werden.
  • Die aktiven Anti-HBV-Mittel können ebenfalls in Kombination mit Antibiotika, anderen antiviralen Verbindungen, antifungalen Mitteln oder anderen pharmazeutischen Mitteln verabreicht werden, die zur Behandlung sekundärer Infektionen verabreicht werden.
  • In einer Ausführungsform wird das Nukleosid als ein Phosphatderivat bereitgestellt, das stabilisiert wird, um die Dephosphorilierung vor der Aufnahme in die infizierte Zelle zu verringern oder zu eliminieren. Eine Anzahl stabilisierter Phosphatderivatgruppen in der 5'-Position des Nukleosids sind bekannt und wurden in der Literatur veröffentlicht. In einer Ausführungsform wird das Nukleosid als SATE-Derivat verabreicht, wie nachfolgend genauer offenbart. Es kann jedes alternative stabilisierte Phosphatderivat in der 5'-Position des Nukleosids angeordnet werden, das sich materiell nicht nachteilig auf die Aktivität der Verbindung auswirkt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist eine Illustration der chemischen Strukturen von β-L-2',3'-Dideoxycytidin (β-L-FddC), β-D-2',3'-Dideoxycytidin (β-D-ddC, β-L-2',3'-Dideoxy-5-Fluorcytidin (β-L-FddC), (–)-β-L-2-Hydroxymethyl-5-(5-Fluorcytosin-1-yl)-1,3-Oxathiolan ((–)-β-L-FTC), (+)-β-D-2-Hydroxymethyl-5-(5-Fluorcytosin-1-yl)-1,3-Dioxolan ((+)-β-D-FDOC) und β-L-2-Amino-6-(R4)-9-[(4-Hydroxymethyl)-Tetrahydrofuran-1-yl)-Purin.
  • 2 ist eine Illustration des Nummerierungsschemas, das in der chemischen Nomenklatur für Nukleoside in diesem Text verwendet wird.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „enantiomerisch pur" auf eine Nukleosidzusammensetzung zu der mindestens ungefähr 95 %, und bevorzugt ungefähr 97 %, 98 %, 99 % oder 100 % eines einzigen Enantiomers dieses Nukleosids gehören.
  • Der Begriff Alkyl, wie hier verwendet, bezieht sich, wenn nicht anders spezifiziert, auf einen gesättigten, geraden, verzweigten oder zyklischen, primären, sekundären oder tertiären C1-C10-Kohlenwasserstoff, und beinhaltet spezifisch Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, Cyclopentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Isohexyl, Cyclohexyl, Cyclohexylmethyl, 3-Methylpentyl, 2,2-Dimethylbutyl und 2,3-Dimethylbutyl. Die Alkylgruppe kann optional mit einem oder mehreren Resten substituiert werden, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Hydroxyl, Amino, Alkylamino, Arylamino, Alkoxy, Aryloxy, Nitro, Cyano, Sulfonsäure, Sulfat, Phosphonsäure, Phosphat oder Phosphonat, entweder ungeschützt oder, wenn notwendig, geschützt, wie dem Fachmann bekannt, zum Beispiel, wie in Greene et al., „Protective Groups in Organic Synthesis, „John Wiley and Sons, Second Edition, 1991 gelehrt. Der Begriff niedriges Alkyl, wie hier verwendet, und wenn nicht anders spezifiziert, bezieht sich auf eine C1-C4-Alkyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Isopropyl-, Isobutyl-, sec-Butyl- oder t-Butylgruppe.
  • Wie hier verwendet, beinhaltet der Begriff Acyl spezifisch, aber nicht beschränkt auf, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Pentanoyl, 3-Methylbutyryl, Wasserstoffsuccinat, 3-Chlorbenzoat, Benzoyl, Acetyl, Pivaloyl, Mesylat, Valeryl, Caproic, Caprylic, Capric, Lauric, Myristic, Palmitic, Stearic und Oleic.
  • Der Begriff Aryl, wie hier verwendet, und wenn nicht anders spezifiziert, bezieht sich auf Phenyl, Biphenyl oder Naphthyl und bevorzugt auf Phenyl. Die Arylgruppe kann optional substituiert werden mit einem oder mehreren Resten, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl, Amino, Alkylamino, Arylamino, Alkoxy, Aryloxy, Nitro, Cyano, Sulfonsäure, Sulfat, Phosphonsäure, Phosphat oder Phosphonat, entweder ungeschützt oder, wenn notwendig, geschützt, wie dem Fachmann bekannt, zum Beispiel, wie in Greene et al., „Protective Groups in Organic Synthesis, „John Wiley and Sons, Second Edition, 1991 gelehrt.
  • Der Begriff Purin- oder Pyrimidinbase beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf, Adenin, N6-Alkylpurine, N6-Acylpurine (worin Acyl C(O)(Alkyl, Aryl, Alkylaryl oder Arylalkyl ist), N6-Benzylpurin, N6-Halopurin, N6-Vinylpurin, N6-Acetylenpurin, N6-Acylpurin, N6-Hydroxyalkylpurin, N6-Thioalkylpurin, N2-Alkylpurine, N2-Alkyl-6-Thiopurine, Thymin, Cytosin, 6-Azapyrimidin, 2- und/oder 4-Mercaptopyrimidin, Uracil, C5-Alkylpyrimidine, C5-Benzylpyrimidine, C5-Halopyrimidine, C5-Vinylpyrimidin, C4-Acetylpyrimidin, C5-Acylpyrimidin, C5-Hydroxalkylpurin, C5-Amidopyrimidin, C5-Cyanopyrimidin, C5-Nitropyrimidin, C5-Aminopyrimidin, 5-Azacytidinyl, 5-Azauracilyl, Triazolopyridinyl, Imidazolopyridinyl, Pyrrolopyrimidinyl, Pyrazolopyrimidinyl. Funktionelle Sauerstoff- oder Stickstoffgruppen auf der Base können, wenn notwendig oder erwünscht, geschützt werden. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann gut bekannt und beinhalten Trimethylsilyl, Dimethylhexylsilyl, t-Butyldimethylsilyl und t-Butyldiphenylsilyl, Trityl, Alkylgruppen, wie etwa Acetyl and Propionyl, Methylsulfonyl und p-Toluylsulfonyl.
  • Wie hier verwendet, beinhaltet der Begriff natürliche Aminosäure, ist aber nicht beschränkt auf, Alanyl, Valinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Prolinyl, Phenylalaninyl, Tryptophanyl, Methioninyl, Glycinyl, Serinyl, Threoninyl, Cysteinyl, Tyrosinyl, Asparaginyl, Glutaminyl, Aspartoyl, Glutaoyl, Lysinyl, Argininyl und Histidinyl.
  • Die hier offenbarte Erfindung ist wie in Anspruch 1 beschrieben.
  • I. Struktur und Präparation von aktiven Nukleosiden Stereochemie
  • Die verwendeten Verbindungen sind Enantiomere von 2',3'-Dideoxycytidin, 2',3'-Dideoxy-5(Halo- oder Methyl)-Cytidin, 2-Hydroxymethyl-5-(5-Fluorcytosin-1-yl)-1,3-Dioxolan oder 2-Amino-6-(OH, Cl, NH2, oder H)-9-[(4-Hydroxymethyl)-Tetrahydrofuran-1-yl]-Purin.
  • Da die 1'- und 4'-Kohlenstoffe des Zuckers (nachfolgend generell als Zuckerrest bezeichnet) der Nukleoside chiral sind, können ihre Nichtwasserstoff-Substituenten (CH2OR und die Pyrimidin- bzw. Purinbase) entweder cis (auf der gleichen Seite) oder trans (auf der gegenüberliegenden Seite) sein, bezogen auf das Zuckerringsystem. Die vier optischen Isomere werden daher durch die folgenden Konfigurationen repräsentiert (wenn der Zuckerrest in einer horizontalen Ebene orientiert wird, so dass der „primäre" Sauerstoff (der zwischen den C1- und C4'-Atomen; vgl. 2) hinten liegt): cis (mit beiden Gruppen „nach oben", was der Konfiguration natürlich vorkommender Nukleoside entspricht, cis (mit beiden Gruppen „nach unten", was eine nicht natürlich vorkommende Konfiguration ist), trans (mit dem C2-Substituenten „nach oben" und dem C5-Substituent „nach unten"), und trans (mit dem C2-Substituenten „nach unten" und dem C5-Substituenten „nach oben"). Wie schematisch in 1 angegeben, sind die „D-Nukleoside" cis-Nukleoside in einer natürlichen Konfiguration und die „L-Nukleoside" sind cis-Nukleoside in der natürlich nicht vorkommenden Konfiguration.
  • Die Nukleoside, die für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer HBV-Infektion nützlich sind, sind β-L- Enantiomere, mit Ausnahme von FDOC, das in seiner β-D-enantiomeren Form verwendet wird, da entdeckt wurde, dass das β-D-Enantiomer von FDOC überraschenderweise weniger toxisch ist das β-L-Enantiomer von FDOC.
  • Prodrug-Formulierungen
  • Die hier offenbarten β-L-2',3'-Dideoxyadenosin-Nukleoside können als jedes Derivat verabreicht werden, das bei der Verabreichung an den Rezipienten in der Lage ist, direkt oder indirekt die aktive Ausgangsverbindung bereitzustellen, oder die an sich Aktivität zeigt. In einer Ausführungsform wird der Wasserstoff der 5'-OH-Gruppe durch ein C1-C20-Alkyl ersetzt, einschließlich C1- bis C5-Alkyl; Acyl, worin der Nicht-Carbonyl-Rest der Estergruppe ausgewählt ist aus geradem, verzweigtem oder cyclischem C1-C20-Alkyl, einschließlich C1- bis C5-Alkyl, Phenyl oder Benzyl; einer natürlich vorkommenden oder nicht natürlich vorkommenden Aminosäure; Alkoxyalkyl, einschließlich Methoxymethyl; Aralkyl, einschließlich Benzyl; Aryloxyalkyl, wie etwa Phenoxymethyl; Aryl, einschließlich Phenyl, das optional mit Halogen substituiert ist, C1- bis C4-Alkyl oder C1- bis C4-Alkoxy; einer Dicarbonsäure, wie etwa Bernsteinsäure; Sulfonatestern, wie etwa Alkyl- oder Aralkylsulphonyl, einschließlich Methansulfonyl; oder einem Mono-, Di- oder Triphosphatester.
  • Einer oder beide Wasserstoffe der Aminogruppen auf der Purinbase können durch ein C1-C20-Alkyl ersetzt werden, einschließlich C1- bis C5-Alkyl; Acyl, worin der Nicht-Carbonylrest der Estergruppe ausgewählt ist aus geradem, verzweigtem oder cyclischem C1-C20-Alkyl, einschließlich C1- bis C5-Alkyl, Phenyl oder Benzyl; Alkoxyalkyl, einschließlich Methoxymethyl; Aralkyl, einschließlich Benzyl; Aryloxyalkyl, wie etwa Phenoxymethyl; Aryl, einschließlich Phenyl, das optional mit Halogen substituiert ist, C1- bis C4-Alkyl oder C1- bis C4-Alkoxy.
  • Das aktive Nukleosid kann auch als 5'-Etherlipid bereitgestellt werden, wie in den folgenden Bezugsdokumenten offenbart: Kucera, L. S., N. Iyer, E. Leake, A. Raben, Modest E. J., D. L. W., and C. Piantadosi. 1990. Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation. AIDS Res Hum Retroviruses. 6: 491–501; Piantadosi, C., J. Marasco C. J., S. L. Morris-Natschke, K. L. Meyer, F. Gumus, J. R. Surles, K. S. Ishaq, L. S. Kucera, N. Iyer, C. A. Wallen, S. Piantadosi, and E. J. Modest. 1991. Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity. J Med Chem. 34: 1408.1414; Hostetler, K. Y., D. D. Richman, D. A. Carson, L. M. Stuhmiller, G. M. T. van Wijk, and H. van den Bosch. 1992. Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cells by 3' deoxythymidine diphosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 3,-deoxythymidine. Antimicrob Agents Chemother. 36: 2025.2029; Hostetler, K. Y., L. M. Stuhmiller, H. B. Lenting, H. van den Bosch, and D. D. Richman, 1990. Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides. J. Biol Chem. 265: 6112.7.
  • Nukleotid-Prodrugs
  • Das hier beschriebene β-L-2',3'-Dideoxyadenosin-Nukleosid wird verabreicht, oder jedes andere Nukleosid, das eine Anti-Hepatits-B-Aktivität aufweist, kann als Nukleotid-Prodrug verabreicht werden, um die Aktivität, Bioverfügbarkeit, Stabilität zu erhöhen oder die Eigenschaften des Nukleosids anderweitig zu verändern. Eine Anzahl von Nukleotid-Prodrugliganden sind bekannt. Ein Nukleotid-Prodrug, wie hier beschrieben, bezieht sich auf ein Nukleosid, das ein Phosphatderivat auf der 5'-Position aufweist, das in vivo stabiler ist als das Ausgangsphosphat, und das sich materiell nicht nachteilig auf die Anti-Hepatitis-B-Aktivität des Nukleosids auswirkt. Phosponate sind in den Phosphatderivaten beinhaltet. Im Allgemeinen wird die Alkylierung, Acylierung oder eine andere lipophile Modifikation des Mono-, Di- oder Triphosphoats des Nukleosids die Stabilität des Nukleotids erhöhen. Beispiele für Substituentengruppen, die einen oder mehrere Wasserstoffe auf dem Phosphatrest ersetzen können, sind Alkyl, Aryl, Steroide, Kohlenhydrate, einschließlich Zucker, 1,2-Diacylglycerol und Alkohole. Viele sind in R. Jones and N. Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995) 1–17 beschrieben. Jedes davon kann in Kombination mit dem offenbarten β-L-2',3'-Dideoxyadenosin-Nukleosid verwendet werden, um die erwünschte Wirkung zu erreichen. Beispiele für Nukleotid-Prodrugs werden in den folgenden Bezugsdokumenten beschrieben.
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  • Präparation der aktiven Verbindungen
  • Die zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HBV-Infektionen in einem Wirtsorganismus verwendeten Nukleoside können gemäß den bekannten Verfahren hergestellt werden. β-L-Nukleoside können aus Verfahren hergestellt werden, die offenbart sind in, oder Standardmodifikationen von Verfahren, die zum Beispiel in den folgenden Veröffentlichungen offenbart sind: Jeong, et. al., J. of Med. Chem., 36, 182–195, 1993; European Patent Application Publication No. 0285 8844; Génu-Dellac, C., G. Gosselin, A.-M. Aubertin, G. Obert, A. Kim, and J.-L. Imbach, 3-Substituted thymine α-L-nucleoside derivatives as potential antiviral agents; synthesis and biological evaluation, Antiviral Chem. Chemother. 2: 83–92 (1991); Johansson, K. N. G., B. G. Lindborg, and R. Noreen, European Patent Application 352 248; Mansuri, M. M., V. Farina, J. E. Starrett, D. A. Benigni, V. Brankovan, and J. C. Martin, Preparation of the geometric isomers of ddC, ddA, D4C and D4T as potential anti-HIV agents, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1: 65–68 (1991); Fujimori, S., N. Iwanami, Y. Hashimoto, and K. Shudo, A convenient and stereoselective synthesis of 2'-deoxy-β-L-ribonucleosides, Nucleosides & Nucleotides 11: 341–349 (1992); Génu-Dellac, C., G. Gosselin, A.-M. Aubertin, G. Obert, A. Kirn, and J.-L. Imbach, 3-Substituted thymine α-L-nucleoside derivatives as potential antiviral agents; synthesis and biological evaluation, Antiviral Chem. Chemother. 2: 83–92 (1991); Holy, A, Synthesis of 2'-deoxy-L-uridine, Tetrahedron Lett. 2: 189–192 (1992); Holy, A., Nucleic acid components and their analogs. CLIII. Preparation of 2'-deoxy-L-ribonucleosides of the pyrimidine series. Collect Czech Chem Commun. 37: 4072–4087 (1992); Holy, A, 2'-deoxy-L-uridine: Total synthesis of a uracil 2'-deoxynucleoside from a sugar 2-aminooxazoline through a 2.2'-anhydronucleoside intermediate. In: Townsend LB, Tipson RS, ed. Nucleic Acid Chem. New York: Wiley, 1992: 347–353. vol 1) (1992); Okabe, M., R.-C. Sun, S. Tan, L. Todaro, and D. L. Coffen, Synthesis of the dideoxynucleosides ddC and CNT from glutamic acid, ribonolactone, and pyrimidine bases. J Org Chem. 53: 4780–4786 (1988); Robins, M. J., T. A. Khwja, and R. K. Robins. Purine nucleosides. XXIX. Synthesis of 21-deoxy-L-adenosine and 21-deoxy-L-guanosine and their alpha anomers. J Org Chem. 35: 363–639 (1992); Génu-Dellac, C., Gosselin G., Aubertin A-M, Obert G., Kirn A., and Imbach J-L, 3'-Substituted thymine α-L-nucleoside derivatives as potential antiviral agents; synthesis and biological evaluation. Antiviral Chem. Chemother. 2(2): 83–92 (1991); Génu-Dellac, C., Gosselin G., Imbach J-L; Synthesis of new 2'-deoxy-3'-substituted-α-L-threo-pentofuranonucleosides of thymine as a potential antiviral agents. Tet Lett 32(1): 79–82 (1991); Génu-Dellac, C., Gosselin G., Imbach J-L. Preparation of new acylated derivatives of L-arabinofuranose and 2-deoxy-1-erythro-pentofuranose as precursors for the synthesis of 1-pentofuranosyl nucleosides. 216: 240–255 (1991); and Génu-Dellac, C., Gosselin G., Puech F, et al. Systematic synthesis and antiviral evaluation of -L-arabinofuranosyl and 2'-deoxy-α-L-erythro-pentofuranosyl nucleosides of the five naturally occurring nuclei acid bases. 10(b): 1345–1376 (1991).
  • 2',3'-Dideoxycytidin (ddC) ist eine bekannte Verbindung. Das D-Enantiomer von DDC wird gegenwärtig von Hoffman-LaRoche unter dem Namen Zalcitabine für die Verwendung zur Behandlung von Personen vertrieben, die mit HIV infiziert sind. Vgl. die US-Patenschriften mit den Nr. 4,879,277 und 4,900,828.
  • Enantiomerisch reine β-D-Dioxolan-Nukleoside, wie etwa β-D-FDOC, können hergestellt werden wie in PCT/US91/09124 ausführlich offenbart. Der Prozess erfordert zuerst die Präparation von (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes-Oxymethyl)-Dioxotan aus 1,6-Anhydromannose, einem Zucker, der die gesamte notwendige Stereochemie für das enantiomerisch reine Endprodukt enthält, einschließlich der korrekten diastereomeren Konfiguration über die 1-Position des Zuckers (der die 4'-Position in dem später gebildeten Nukleosid wird). Das (2R, 4R)- und (2R, 4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes-Oxymethyl)-Dioxolan wird mit einer erwünschten heterocyclischen Base in Gegenwart von SnCl4, einer anderen Lewis-Säurel oder Trimethylsilyltriflate in einem organischen Lösemittel, wie etwa Dichloroethan, Acetonitril oder Methylenchlorid kondensiert, um das stereochemisch reine Dioxolan-Nukleosid bereitzustellen.
  • Enzymatische Verfahren zur Trennung der D- und L-Enantiomere der cis-Nukleoside sind zum Beispiel offenbart in Nucleosides and Nucleotides, 12(2), 225–236 (1993); Europäische Patentanmeldungen Nr. 92304551.2 und 92304552.0, eingereicht von Biochem Pharma, Inc.; und PCT Veröffentlichungsnummern. WO 91/11186, WO 92/14729 und WO 92/14743, eingereicht von der Emory University.
  • Die Trennung der acylierten oder alkylierten razemischen Mischung der D- und L-Enantiomere der cis-Nukleoside kann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit chiralen stationären Phasen erreicht werden, wie in PCT Veröffentlichungsnr. WO 92/14729, offenbart.
  • Mono-, Di- und Triphosphatderivate der aktiven Nukleoside können wie gemäß veröffentlichen Verfahren beschrieben, hergestellt werden. Das Monophosphat kann gemäß der Verfahrensweise von Imai et al., J. Org. Chem., 34(6), 1547–1550 (June 1969), hergestellt werden. Das Diphosphat kann gemäß der Verfahrensweise von Davisson et al., J. Org. Chem., 52(9), 1794–1801 (1987), hergestellt werden. Das Triphosphat kann gemäß der Verfahrensweise von Hoard et al., J. Am. Chem. Soc., 87(8), 1785–1788 (1965), hergestellt werden.
  • Allgemeine Verfahrensweisen zur Präparation von Bis(S-Acyl-2-thioethyl)phosphoester von β-L-Dideoxynucleosiden [Bis(SATE)-L ddx MP]
    Figure 00230001
    Bis(SATE)-L-ddxMP Y1, Y2, Y3 und Y4 sind unabhängig H, OH, N3, NR1R2, NO2, NOR3, -O-Alkyl,
    -O-Aryl, Halo (einschließlich F, Cl, Br oder I), -CN, -C(O)NH2, SH, -S-Alkyl oder -S-Aryl, und wobei typischerweise drei von Y1, Y2, Y3 und Y4 entweder H oder OH sind. Der -OH-Substituent, wenn vorhanden, ist typischerweise eine Y1- oder Y3-Gruppe. Wie in der Struktur illustriert, sind Y2 und Y4 in der Arabino(Erythro)-Konfiguration und Y1 und Y3 sind in der Threo(Ribose)-Konfiguration. Die Base ist ein Purin oder Pyrimidin. Alternativ ist der Pseudo-Zuckerrest ein 1,3-Oxathiolan (wie in FTC und BCH-189 oder 3TC, oder ist ein 1,3-Dioxolanderivat). (i) ICH2CH2OH, DBU/C6H5CH3; (ii) Cl2PN(iPr)2, NEt3/THF; (iii) β-L-Dideoxynucleosid, 1H-Tetrazol/THF, dann ClC6H4CO3H/CH2Cl21H-Tetrazol (0,21 g, 3,0 mmol) wurden einer gerührten Lösung aus β-L-Dideoxynucleosid (1,0 mmol) und dem geeigneten Phosphoramidit C (1,2 mmol) in Tetrahydrofuran (2 ml) bei Raumtemperatur zugefügt. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung auf –40 °C abgekühlt und eine Lösung aus 3-Chlorperoxybenzoesäure (0,23 g, 1,3 mmol) in Dichloromethan (2,5 ml) zugefügt; die Mischung konnte sich dann im Laufe 1 Std. auf Raumtemperatur erwärmen. Natriumsulfit (10 %-Lösung, 1,3 ml) wurde der Mischung zugefügt, um den Überschuss an 3-Chlorperoxybenzoesäure zu zerstören, wonach die organische Schicht getrennt wurde und die wässrige Schicht mit Dichlormethan (2 × 10 ml) gewaschen wurde. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigtem wässrigem Natriumhydrogencarbonat (5 ml), dann mit Wasser (3 × 5 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und unter Vakuum zur Trocknung eingedampft. Säulenchromatographie des Rückstands auf Silicagel erbrachte den Titel Bis(SATE)-L-ddxmP.
  • BEISPIEL = β-L-2',3'-Dideoxyadenosin-5'-yl bis(2-Pivaloylthioethyl)phosphat [Bis(SATE)β-L-ddAMP].
    Figure 00240001
    Bis(SATE)β-L-ddAMP
  • Der obigen allgemeine Verfahrensweise folgend, wurde reines Bis(SATE)-L-ddAMP als farbloses Oel in eine Ausbeute von 72 % nach Silicagel-Säulenchromatographie erhalten [Elutionsmittel: Stufengradient aus Methanol (0–3 %) in Dichloromethan]; 1NMR (DMSO-d6) δppm: 8,26 und 8,13 (2s, 2H jeweils, H-2 und H-8), 7,20 (br s, 2H, NH2), 6,24 (t, 1H, H-1'; J = 6,0 Hz), 4,35–4,25 (m, 1H, H-4'), 4,25–4,00 (m, 2H, H-5', 5''), 3,96 (m, 4H, 2 SCH2CH2O), 3,04 (t, 4H, 2 SCH2CH2O; J = 6,3 Hz), 2,5–2,4 (m, 2H, H-2', 2'') 2,2–2,0 (m, 2H, H-3', 3''), 1,15 [s, 18H, 2(CH3)3C]; 31P-NMR (DMSO-d6) δppm = –0,76 (s); UV (EtOH), λmax = 259 nm (ε 15.400); Massenspektrum (durchgeführt in: Glycerol, Thioglycerol, 1:1, ν/ν), FAB > O 604 (M+H)+, 136(BH2)+. Allgemeines Schema für die sterospezifische Synthese von 3'-substitierten β-L-Dideoxynukleosiden
    Figure 00260001
    X = Austrittsgruppe [CH3 SO2, CH3 C6L4 SO2, CF3 SO2]
    Y, Y' = F, N3, NR1R2 [R1, R2 = H, Alkyl, Aryl],
    NO2, NOR [R = H, Alkyl, Acyl], O-Alkyl, O-Aryl usw. Allgemeines Schema für die sterospezifische Synthese von 2'-substitierten β-L-Dideoxynukleosiden
    Figure 00270001
    V = Acyl [CH3-C C6H5-C]
    X = Austrittsgruppe [CH3 SO2, CH3 C6H4SO2H, CF3 SO2]
    Y, Y' = F, N3, NR1R2 [R1, R2 = H, Alkyl, Aryl],
    NO2, NOR [R = H, Alkyl, Acyl], O-Alkyl, O-Aryl usw.
  • Figure 00290001
    Schema 1: Basen = Purine oder Pyrimidine, eventuell entsprechend geschützt; R = Benzoyl (Bz) Acetyl (Ac), Monomethosytrityl (mMTr) oder tert-Butyldiphenylsilyl (TBDPSI)
  • II. Anti-HBV-Aktivität von Nukleosiden
  • Die Fähigkeit der aktiven Verbindungen, HBV zu hemmen, kann durch verschiedene Versuchstechniken gemessen werden. Der hier verwendete Test zur Bewertung der Fähigkeit der offenbarten Verbindungen, die Replikation von HBV zu hemmen, wird in Korba and Gerin, Antiviral Res. 19: 55–70 (1992) ausführlich beschrieben. Ausschließlich zu Illustrationszwecken werden nachfolgend die Ergebnisse der Bewertung der Toxizität und der Anti-HBV-Aktivität für β-L-2',3'-Dideoxycytidin (β-L-FddC), β-L-2',3'-Dideoxy-5-Fluorcytidin (β-L-ddC) und (+)-β-D-2-Hydroxymethyl-5-(5-Fluorcytosin-1-yl)-1,3-Dioxolan ((+)-β-D-FDOC) bereitgestellt. Die Toxizität und die Anti-HBV-Aktivität von (–)-ß-L-2-Hydroxymethyl-5-(5-Fluorcytosin-1-yl)-1,3-Oxathiolan ((–)-ß-L-FTC) und β-D-2',3'-Dideoxycytidin (β-D-ddC) werden als Kontrollen beigefügt. Die anderen hier offenbarten Verbindungen können ähnlich bewertet werden.
  • Die in den Anti-HBV-Assays verwendeten Proben von β-L-ddC und β-L-5-FddC wurden wie folgt charakterisiert.
    2',3'-Dideoxy-β-L-Cytidin (β-L-DDC). m.p. = 220–220 °C; UV (EtOH 95) max 273 nm, λmin 252 nm; NMR-1H (DMSO-d6) δppm = 7,89 (d. 1H. H-6; J = 7.,4 Hz). 7,15–6,95 (d breit, 2H, NH2), 5,91 (dd. 1H, H-1'; J = 3,0 et 6,5 Hz), 5,66 (d, 1H, H-5; J = 7,4 Hz), 4,99 [t. 1H, OH-5'; J – 5,2 Hz]. 4,05–3,95 (m, 1H, H-4'), 3,60–3,70 (m, 1H, H-5'; nach D2O-Austausch: dd, 3,64 ppm, J = 3,6 et 12,0 Hz). 3,60–3,50 (m. 1H, H-5''; nach D2O-Austausch: dd, 3,50 ppm, J = 4,1 et 12,0 Hz), 2,30–2,15 (m. 1H, H-2'), 1,9–1,65 (m. 3H, H-2'', 3' et 3''); [α] D20 –103,6 (c 0,8 MeOH); Massenspektrum (durchgeführt in: Glycerol-Thioglycerol, 50:50. v/v); FAB > O 423 [2M+H]+, 304 [M+glycerol+H]+. 212 [M+H]+, 112 [BH2]+, 101[s]+; FAB < O 210[M–H]–. Anal. Berechn, für C9H13N3O3 (M = 211,21); C 51,18; H 6,20; N 19,89 festgestellt; C 51,34; H 6,25; N 20,12.
    2'.3'-Dideoxy-β-L-S-fluorcytidin (β-L-S-FddC). m.p. = 158–160 °C; UV (EtOH 95) λmax 281 nm (ε, 8.100) et 237 nm (ε, 8.500); min 260 nm (ε, 5.700) et 225 nm (ε, 7.800); NMR-1H (DMSO-d6) δppm 8,28 (d. 1H, H-6; J – 7,4 Hz), 7,7–7,4 (d breit, 2H, NH2), 5,83 (dd schlecht gelöst, 1H, H-1'), 5,16 (t 1H, OH-5'; J = 5,1 Hz), 4,05–3,95 (m, 1H, H-4'), 3,8–3,70 [m, 1H, H 5'; nach D2O-Austausch: dd, 3,71 ppm. J = 2,7 et 12,3 Hz], 3,60–3,50 [m. 1H, H-5''; nach D2O-Austausch: dd, 3,52 ppm; J = 3,3 et 12,3 Hz], 2,35–2,15 (m, 1H, H-2'). 1,95–1,75 (m, 3H, H-2'', 3' et 3'') [α]D20 –80,0 (–c 1,0, DMSO); Massenspektrum [durchgeführt in: 3-Nitrobenzylalkohol] h 230 [M+H]+ et 101[s]+; FAB < O 228 [M–II]–. Anal. berechnet für C9H12N3FO3 (M = 229,21); C 47,16; II 5,28; N 18,33, F 8,29, festgestellt. C 16,90; H 5,28; N 18,07; F 8,17.
  • Die antiviralen Bewertungen wurden in zwei getrennten Zellpassagen, zwei Kulturen pro Passage (4 Kulturen insgesamt), durchgeführt. Alle Vertiefungen in allen Platten wurden gleichzeitig und mit der gleichen Dichte beimpft.
  • Aufgrund der inhärenten Variationen der Level sowohl intrazellulärer als auch extrazellulärer HBV-DNA, werden nur Depressionen größer als 3,0-fach (für HBV-Virion-DNA) oder 2,5-fach (für HBV-DNA-Replikationszwischenprodukte) der Durchschnittslevel für diese HBV-DNA-Formen in unbehandelten Zellen normalerweise als statistisch signifikant erachtet [P < 0,05] (Korba and Gerin, Antiviral Res. 19: 55–70, 1992). Die Level an integrierter HBV-DNA in jeder zellulären DNA-Präparation (die auf einer Pro-Zellen-Basis in diesen Versuchen konstant bleiben) wurden verwendet, um die Level intrazellulärer HBV-DNA-Formen zu berechnen, wodurch technische Variationen eliminiert werden, die den Blot-Hybridisationsassays inhärent sind.
  • Typische Werte für extrazelluläre HBV-Virion-DNA in unbehandelten Zellen reichen von 50 bis 150 pg/ml Kulturmedium (Durchschnitt von ungefähr 76 pg/ml). Intrazelluläre HBV-DNA-Replikationszwischenprodukte in unbehandelten Zellen reichen von 50 bis 100 pg/ug Zell-DNA (Durchschnitt ungefähr 74 pg/ug Zell-DNA). Im Allgemeinen sind Depressionen in den Leveln von intrazellulärer HBV-DNA aufgrund der Behandlung mit antiviralen Verbindungen weniger ausgeprägt und treten langsamer auf als Depressionen in den Leveln von HBV-Virion-DNA.
  • Die Art, in welcher die Hybridisationsanalysen für diese Experimente durchgeführt wurden, resultiert in eine Äquivalenz von ungefähr 1,0 pg intrazellulärer HBV-DNA/ug zellulärer DNA zu 2 bis 3 genomischen Kopien pro Zelle und 1,0 pg extrazellulärer HBV-DNA/ml Kulturmedium zu 3 × 105 viraler Partikel/ml.
  • Toxizitätsanalysen wurden durchgeführt, um zu bewerten, ob jede der beobachteten antiviralen Wirkungen sich auf eine allgemeinen Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zelle gründeten. Das verwendete Verfahren basierte auf der Aufnahme an neutralem roten Farbstoff, einem Standard und weit verbreiterten Assay für die Lebensfähigkeit von Zellen in einer Vielzahl von Virus-Wirtssystemen, einschließlich HSV (Herpes-simplex-Virus) und HIV.
  • Die Testverbindungen wurden in Form von 40 mM Stammlösungen in DMSO (eingefroren auf Trockeneis) verwendet. Tägliche Aliquots der Testproben wurden gemacht und bei –20 °C eingefroren, so dass jedes individuelle Aliquot einem einzigen Einfrier-Auftau-Zyklus unterzogen würde. Die täglichen Testaliquots wurden aufgetaut, in Kulturmedium bei Raumtemperatur suspendiert und unverzüglich den Zellkulturen zugefügt. Die Verbindungen wurden bei 0,01 bis 10 M auf antivirale Aktivität getestet. Die Verbindungen wurden auf Toxizität bei Konzentrationen zwischen 1 bis 300 μM getestet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 bereitgestellt.
  • Figure 00340001
  • Beispiel 2 Toxizität der Verbindungen
  • Die Fähigkeit der aktiven Verbindungen das Wachstum von Virus in 2.2.15-Zellkulturen (HepG2-Zellen, die mit Hepatitisvirion transformiert sind) zu hemmen, wurde bewertet. Wie in Tabelle 1 illustriert, wurden keine signifikante Toxizität (größer als 50 % Depression der Farbstoffaufnahmelevel, die in unbehandelten Zellen beobachtet wurden) beobachtet für jede der Testverbindungen bei den Konzentrationen von 100 μM. Die Verbindungen waren bei 300 μM moderat toxisch, jedoch zeigten alle drei Verbindungen weniger Toxizität bei dieser Konzentration als β-D-ddC. Es scheint, dass die IC50 von β-L-ddC und β-L-FddC ungefähr zwei Mal die von β-D-ddC ist.
  • Toxizitätsanalysen wurden in Flachboden-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Die Zellen für die Toxizitätsanalysen wurden kultiviert und mit Testverbindungen behandelt mit dem gleichen Plan wie für die antiviralen Bewertungen verwendet. Jede Verbindung wurde bei 4 Konzentrationen getestet, jeweils in dreifachen Kulturen. Die Aufnahme an neutralem rotem Farbstoff wurde verwendet, um das relative Toxizitätslevel zu bestimmen. Die Absorbanz an internalisiertem Farbstoff bei 510 nM (A510) wurde für die quantitative Analyse verwendet. Die Werte werden als ein Prozentsatz der Durchschnittswerte A510 (± Standardabweichungen) in 9 separaten Kulturen an unbehandelten Zellen präsentiert, erhalten auf den gleichen 96-Vertiefungs-Platten wie die Testverbindungen. Der Prozentsatz an Farbstoffaufnahme in den 9 Kontrollkulturen auf Platte 40 betrug 100 ± 3. Bei 150–190 μM β-D-ddC wurde typischerweise eine 2-fache Reduktion an Farbstoffaufnahme (gegenüber den Leveln, die in unbehandelten Kulturen beobachtet wurden) in diesen Assays beobachtet (Korba and Gerin, Antiviral Res. 19: 55–70, 1992).
  • Beispiel 3 Anti-Hepatitis-B-Virus-Aktivität
  • Die positive Behandlungskontrolle β-D-2',3'-Dideoxycytosin [β-D-ddC] induzierte signifikante Depressionen an HBV-DNA-Replikation bei der verwendeten Konzentration. Vorherige Studien haben zweigen an, dass bei 9 bis 12 μM von β-D-ddC eine 90 % Depression von HBV RI (relativ zu den Durchschnittsleveln in unbehandelten Zellen) typischerweise in diesem Assaysystem beobachtet wird (Korba and Gerin, Antiviral Res. 19: 55–70, 1992). Dies ist konsistent mit den Daten, die in Tabelle 1 präsentiert wurden.
  • Die in Tabelle 1 präsentierten Daten zeigen an, dass alle drei Testverbindungen ((β-L-FddC), (β-L-ddC) und β-D-FDOC)) potente Inhibitoren von HBV-Replikation sind, welche Depression von HBV-Virion-DNA und HBV-RI zu einem Grad verursachen, vergleichbar mit, oder größer als, nach der Behandlung mit β-D-ddC beobachtet.
  • Beispiel 4
  • Die Wirkung von ausgewählten β-L-Derivaten gegen Hepatitis-B-Virusreplikation in transfizierten HepG-2-Zellen wird in Tabelle 4 beschrieben.
  • Figure 00370001
  • Beispiel 5
  • Die komparative inhibitorische Wirkung von ausgewählten Triphosphaten auf Waldmurmeltier-Hepatitis-Virus-DNA-Polymerase wird in Tabelle 5 dargelegt.
  • Tabelle 5: Komparative inhibitorische Aktivitäten von L-Nukleosid-Triphosphaten auf Waldmurmeltier-Hepatitis-Virus-DNA-Polymerase und menschliche DNA-Polymerase α und β.
    Figure 00380001
  • III. Präparation pharmazeutischer Zusammensetzungen
  • Die hier offenbarten Verbindungen oder ihre pharmazeutisch verträglichen Salze und Derivate sind zur Vorbeugung und Behandlung von HBV-Infektionen und anderen verwandten Erkrankungen, wie etwa Anti-HBV-Antikörper-positive und HBV-positive Erkrankungen, chronische Leberentzündung, die von HBV verursacht ist, Zirrhose, akute Hepatitis, fulminante Hepatitis, chronische persistente Hepatitis und Müdigkeit, nützlich. Diese Verbindungen oder Formulierungen können auch prophylaktisch verwendet werden, um dem Fortschreiten der klinischen Erkrankung bei Individuen vorzubeugen oder zu sie verzögern, die Anti-HBV-Antikörper- oder HBV-Antigen-positiv sind, oder die HBV ausgesetzt waren.
  • Menschen, die an irgend einer dieser Erkrankungen leiden, können behandelt werden, indem dem Patienten eine wirksame HBV-Behandlungsmenge einer oder eine Mischung der hier beschriebenen aktiven Verbindungen oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat oder Salz davon verabreicht wird, optional in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel. Die aktiven Materialien können auf jedem geeigneten Weg, zum Beispiel oral, parenteral, intravenös, intradermal, subkutan oder topisch, in flüssiger oder fester Form, verabreicht werden.
  • Die aktive Verbindung ist in dem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel in einer Menge enthalten, die ausreicht, um einem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge zu liefern, ohne bedenkliche toxische Wirkungen bei dem behandelten Patienten hervorzurufen.
  • Eine bevorzugte Dosis der aktiven Verbindung für alle der oben erwähnten Bedingungen wird im Bereich zwischen etwa 1 bis 60 mg/kg, bevorzugt 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht pro Tag, allgemeiner zwischen 0,1 und etwa 100 mg je Kilogramm Körpergewicht des Rezipienten pro Tag liegen. Der wirksame Dosierungsbereich der pharmazeutisch verträglichen Derivate kann auf der Basis des zu verabreichenden Ausgangsnukleosids errechnet werden. Wenn das Derivat an sich Aktivität zeigt, kann die wirksame Dosierung als über unter Verwendung des Gewichts des Derivats geschätzt werden, oder durch andere Mittel, die dem Fachmann bekannt sind. In einer Ausführungsform wird die aktive Verbindung wie in dem Produktinsert oder in der Physician's Desk Reference für 3'-Azido-3'-deoxythymidin (AZT), 2',3'-Dideoxyinosin (DDI), 2',3'-Dideoxycytidin (ddC) oder 2',3'-Dideoxy-2',3'-Didehydrothymidin (D4T) für die HIV-Indikation beschrieben, verabreicht.
  • Die Verbindung wird bequem in jeder passenden Einheitsdosierungsform, einschließlich verabreicht, aber nicht beschränkt auf eine, die 7 bis 3.000 mg, bevorzugt 70 bis 1.400 mg, des aktiven Inhaltsstoffs pro Einheitsdosierungsform enthält. Eine orale Dosierung von 50 bis 1.000 mg ist üblicherweise günstig.
  • Idealerweise sollte der aktive Inhaltsstoff verabreicht werden, um Spitzenplasmakonzentrationen der aktiven Verbindung von etwa 0,2 bis 70 μM, bevorzugt etwa 1,0 bis 10 μM, zu erreichen. Dies kann zum Beispiel durch intravenöse Injektion einer 0,1- bis 5 %-Lösung des aktiven Inhaltsstoffs, optional in Kochsalzlösung, erreicht werden, oder als Bolus des aktiven Inhaltsstoffs verabreicht werden.
  • Die aktive Verbindung kann in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes bereitgestellt werden. Wie hier verwendet betrifft der Begriff pharmazeutisch verträgliche Salze oder Komplexe Salze oder Komplexe der Nukleoside, die die gewünschte biologische Aktivität der Stammverbindung halten und minimale, wenn überhaupt, unerwünschte toxikologische Wirkungen zeigen. Nicht beschränkende Beispiele für solche Salze sind (a) Säureadditionssalze, gebildet mit anorganischen Säuren (zum Beispiel Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure und ähnliche), und Salze; die mit organischen Säuren gebildet werden, wie etwa Essigsäure, Oxllsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Gerbsäure, Pamoic Acid, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalensulfonsäuren, Naphthalendisulfonsäuren und Polygalacturonsäure; (b) Basen-Additionssälze, gebildet mit Kationen, wie Natrium, Kali, Zink, Calcium, Wismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Cobalt, Nickel, Cadmium, Natrium, Kalium und ähnliche, oder mit einem organischen Kation, gebildet aus N,N-Dibenrylethylen-diamin, Ammonium, oder Ethylendiamin; oder (c) Kombinationen von (a) und (b); z. B., ein Zinktannatsalz oder ähnliche.
  • Modifikationen der aktiven Verbindung, spezifisch an den N6 oder N4- und 5'-O-Positionen, können die Bioverfügbarkeit und Stoffwechselrate der aktiven Spezies beeinflussen, und somit Kontrolle über die Freisetzung der aktiven Spezies bereitstellen.
  • Die Konzentration der aktiven Verbindung in der Arzneimittelzusammensetzung wird von den Absorptions-, Inaktivierungs- und Ausscheidungsraten des Arzneimittels sowie anderen Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind, abhängen. Es ist zu beachten, dass die Dosierungswerte auch mit der Schwere der Erkrankung, die gelindert werden soll, variieren werden. Es versteht sich ferner, dass für jedes besondere Subjekt, spezifische Dosierungsregimes über die Zeit angepasst werden sollten, gemäß dem individuellen Bedarf und der professionellen Beurteilung der Person, die die Zusammensetzungen verabreicht oder deren Verabreichung überwacht, und dass die Konzentrationsbereiche, die hier bekannt gemacht werden, nur exemplarisch sind, und nicht dazu gedacht sind, den Umfang oder die Praxis der beanspruchten Zusammensetzung zu beschränken. Der aktive Inhaltsstoff kann auf einmal verabreicht werden oder kann in eine Anzahl kleinerer Dosen aufgeteilt werden, die in variierenden Zeitintervallen zu verabreichen sind.
  • Eine bevorzugte Verabreichungsart der aktiven Verbindung ist oral. Orale Zusammensetzungen werden normalerweise ein inertes Verdünnungsmittel oder einen essbarer Träger beinhalten. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen sein oder in Tabletten gepresst werden. Zum Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung in Transportsubstanzen eingebaut sein und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Pharmazeutisch kompatible Bindemittel und/oder Adjuvansmaterialien können als Teil der Zusammensetzung enthalten sein.
  • Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und ähnliches können jede der folgenden Inhaltsstoffe oder Verbindungen ähnlicher Natur enthalten: Eine Bindemittel, wie etwa mikrokristalline Zellulose, Tragantgummi oder Gelatine; eine Transportsubstanz, wie etwa Stärke oder Lactose, ein Zersetzungsmittel, wie etwa Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Schmiermittel, wie etwa Magnesiumstearat oder Sterote; ein Gleitmittel, wie etwa kolloidales Siliciumdioxid; ein Süßungsmittel, wie etwa Saccharose oder Saccharin; oder einen Geschmacksstoff, wie etwa Pfefferminz, Salicylsäuremethylester oder Orangengeschmacksstoff. Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann sie, zusätzlich zu Material obigen Typs einen flüssigen Träger, wie ein Fettöl, enthalten. Zusätzlich können die Dosierungseinheitsformen verschiedene andere Materialien enthalten, die die physikalische Form der Dosierungseinheit modifizieren, zum Beispiel Beschichtungen aus Zucker, Schellack oder anderen Schutzmitteln.
  • Die aktive Verbindung oder das pharmazeutisch verträgliche Salz oder Derivat davon kann als Komponente eines Elixiers, einer Suspension, eines Sirups, einer Oblate, eines Kaugummis oder ähnlichem verabreicht werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Saccharose als Süßungsmittel und bestimmte Konservierungsmittel, Farbstoffe und Färbemittel und Geschmackstoffe enthalten.
  • Die aktive Verbindung oder das pharmazeutisch verträgliche Derivat oder Salz davon kann auch mit anderen aktiven Materialien gemischt werden, die die erwünschte Wirkungsweise nicht beeinträchtigen, oder mit Materialien, die die erwünschte Wirkungsweise ergänzen, wie etwa Antibiotika, Antifungine, Entzündungshemmer oder andere Antiviral-, einschließlich Anti-HBV-, Anti-Zytomegalovirus- oder Anti-HIV-Mittel.
  • Lösungen oder Suspensionen, die für parenterale, intradermale, subkutane oder topische Applikation verwendet werden, können die folgenden Komponenten beinhalten: Ein steriles Verdünnungsmittel, wie etwa Wasser zur Injektion, Kochsalzlösung, fette öle, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere synthetische Lösemittel; antibakterielle Mittel, wie etwa Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien, wie etwa Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner, wie etwa Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie etwa Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zur Anpassung der Tonizität, wie etwa Natriumchlorid oder Dextrose. Die parentale Präparation kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfachdosisfläschchen, die aus Glas oder Plastik gemacht sind, eingeschlossen sein.
  • Wenn intravenös verabreicht, sind bevorzugte Träger physiologische Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). In einer bevorzugten Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, die die Verbindung gegen schnelle Elimination aus dem Körper schützen werden, wie etwa eine Formulierung zur kontrollierten Freigabe, einschließlich Implantate und mikroverkapselte Freisetzungssysteme. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere können verwendet werden, wie etwa Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Präparation solcher Formulierungen werden für den Fachmann offensichtlich sein. Die Materialien sind im Handel auch von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc erhältlich.
  • Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposomen, die auf infizierte Zellen gerichtet sind mit monoklonalen Antikörpern zu viralen Antigenen) sind auch als pharmazeutisch verträgliche Träger bevorzugt. Diese können gemäß Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, zum Beispiel, wie in der US-Patentschrift Nr. 4,522,811 beschrieben. Zum Beispiel können liposome Formulierungen hergestellt werden, indem geeignete Lipid(e) (wie etwa Stearoylphosphatidylethanolamin, Stearoylphosphatidylcholin, Arachadoylphosphatidylcholin, und Cholesterol) in einem anorganischen Lösemittel gelöst werden, das dann eingedampft wird, und einen dünnen Film des getrockneten Lipids auf der Oberfläche des Behälters hinterlässt. Eine wässrige Lösung der aktiven Verbindung oder deren Monophosphat-, Diphosphat- und/oder Triphosphatderivate werden dann in den Behälter eingeführt. Der Behälter wird dann von Hand geschwenkt, um das Lipidmaterial von den Seiten des Behälters abzulösen und um die Lipidaggregate zu dispergieren, wodurch die liposomale Suspension geformt wird.
  • Diese Erfindung wurde mit Bezug auf deren bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Variationen und Modifikationen der Erfindung sind für den Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung der Erfindung offensichtlich.

Claims (23)

  1. Verwendung eines Nukleotid-Prodrugs aus β-L-2',3'-Dideoxyadenosin zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung eines mit Hepatitis B infizierten Patienten, wobei: a) Das Nukleotid am 5'-Kohlenstoff 5'-mono-, di- oder triphosphoriliert ist; b) ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch einen Rest substituiert sind, der unabhängig aus einem Alkyl, Aryl, Steroid, Kohlenhydrat, 1,2-Diacylglycerol, Alkohol und S-Acyl-2-thioethyl ausgewählt ist und c) das Nukleotid mindestens zu 95 % frei von seinem entgegengesetzten β-D-Enantiomer ist.
  2. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleotid ein Monophosphat ist.
  3. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleotid ein Diphosphat ist.
  4. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleotid ein Triphosphat ist.
  5. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe des Phosphatrestes durch Alkyl substituiert sind.
  6. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch Aryl substituiert sind.
  7. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch ein Steroid substituiert sind.
  8. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch ein Kohlenhydrat substituiert sind.
  9. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch ein 1,2-Diacylglycerol substituiert sind.
  10. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch einen Alkohol substituiert sind.
  11. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nukleotid monophosphoriliert und einer der Wasserstoffe am Phosphatrest durch eine S-Acyl-2-Thioethyl-Gruppe mit der Formel CH2-CH2-S-C(O)-C(CH3)3 substituiert ist.
  12. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei sie weiterhin die Verwendung einer wirksamen Menge einer zweiten Verbindung, die aus dem (–)-Enantiomer oder der razemischen Mischung von 2-Hydroxymethyl-5-(5-Fluorcytosin1-yl)-1,3-Oxathiolan oder seinem physiologisch verträglichen Salz ausgewählt ist; einem Enantiomer oder einer razemischen Mischung von 2'-Fluoro-5-Ethyl-Arabinosyluracil (FEAU) oder seinem physiologisch verträglichen Salz; Carbovir oder Interferon zur Behandlung umfasst.
  13. Ein Nukleotid-Prodrug aus β-L-2',3'-Dideoxyadenosin, wobei: a) Das Nukleotid am 5'-Kohlenstoff 5'-mono-, di- oder triphosphoriliert ist; b) ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch einen Rest substituiert sind, der unabhängig aus einem Alkyl, Aryl, Steroid, Kohlenhydrat, 1,2-Diacylglycerol und Alkohol ausgewählt ist; und c) das Nukleotid mindestens zu 95 % frei von seinem entgegengesetzten β-D-Enantiomer ist.
  14. Das Nukleotid-Prodrug nach Anspruch 13, wobei das Nukleotid ein Monophosphat ist.
  15. Das Nukleotid-Prodrug nach Anspruch 13, wobei das Nukleotid ein Diphosphat ist.
  16. Das Nukleotid-Prodrug nach Anspruch 13, wobei das Nukleotid ein Triphosphat ist.
  17. Das Nukleotid-Prodrug nach Anspruch 13, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch ein Alkyl substituiert sind.
  18. Das Nukleotid-Prodrug nach Anspruch 13, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch ein Aryl substituiert sind.
  19. Das Nukleotid-Prodrug nach Anspruch 13, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch ein Steroid substituiert sind.
  20. Das Nukleotid-Prodrug nach Anspruch 13, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch ein Kohlenhydrat substituiert sind.
  21. Das Nukleotid-Prodrug nach Anspruch 13, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch ein 1,2-Diacylglycerol substituiert sind.
  22. Das Nukleotid-Prodrug nach Anspruch 13, wobei ein oder mehrere Wasserstoffe am Phosphatrest durch ein Alkohol substituiert sind.
  23. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Nukleotid-Prodrug nach Anspruch 13 aufweist.
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