DE69636775T2

DE69636775T2 - Kombinationstest für den aktuellen glukosespiegel und die mittel- oder langfristige blutzuckerkontrolle

Info

Publication number: DE69636775T2
Application number: DE69636775T
Authority: DE
Inventors: Robert S. Sandusky GALEN; F. John San Diego BURD; Talei San Diego HOBLITZELL; Gebhard Los Angeles NEYER
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1996-04-05
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2016-04-06
Also published as: JPH11503025A; US20040265941A1; EP0819180B1; DK0819180T3; CA2215914A1; US5695949A; ES2277342T3; EP0819180A1; US6958129B2; DE69636775D1; WO1996031619A1; EP0819180A4; US6670192B1; US6027692A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Assay-System und insbesondere die Bestimmung des integrierten glykämischen Zustands eines Diabetikers durch Messung der Konzentrationsspiegel von Glucose und proteingebundener Glucose.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Personen, die unter Diabetes mellitus leiden, haben im allgemeinen einen anormal hohen Blutzuckerspiegel, weil die Bauchspeicheldrüse keine ausreichenden Mengen des aktiven Hormons Insulin in den Blutstrom ausscheidet, um den Kohlenhydratstoffwechsel zu regulieren. Wenn ein anormal hoher Blutzuckerspiegel, der auch als hyperglykämischer Zustand bekannt ist, über längere Zeiträume andauern kann, wird das Individuum unter den chronischen Komplikationen der Diabetes leiden, einschließlich Retinopathie, Nephropathie, und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Untersuchungen zeigen, daß bei diabetischen Patienten, die in der Lage sind, eine normale glykämische Kontrolle einzuhalten, die Wahrscheinlichkeit für diese schwerwiegenden Komplikationen stark verringert ist. Daher sind mehrere Tests entwickelt worden, um den glykämischen Zustand zu messen und zu kontrollieren.
Ein üblicher medizinischer Test zur Kontrolle des glykämischen Zustands durch Diabetiker ist die direkte Messung des Blut-Glucosespiegels. Da sich die Blut-Glucosespiegel innerhalb eines Tages verändern, was durch die Ernährung, Aktivität und die Behandlung beeinflußt wird, und abhängig von der Natur und dem Schweregrad des individuellen Falls ist, messen einige Patienten ihren Blut-Glucosespiegel bis zu siebenmal täglich.
Ausgehend von dem beobachteten Muster in den gemessenen Glucosespiegeln nehmen Patient und Arzt gemeinsam Anpassungen in Bezug auf die Ernährung, die sportliche Betätigung und die Insulinaufnahme vor, um die Erkrankung besser zu steuern. Diese Information sollten selbstverständlich für den Patienten sofort verfügbar sein.
Jedoch sind wegen der häufigen Schwankungen der Glucosespiegel an einem Tag auch Tests entwickelt worden, die unabhängig von der Ernährung des Patienten, seiner Aktivität und/oder der Behandlung sind, und die längerfristige Hinweise auf die Blut-Glucosespiegel liefern. Diese Tests messen die Konzentration von glykierten Proteinen oder "proteingebundener Glucose" (protein bound glucose; PBG). Proteine, wie diejenigen, die im Vollblut, Serum oder anderen biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind, reagieren unter nicht-enzymatischen Bedingungen mit Glucose, wobei glykierte Proteine gebildet werden. Das Ausmaß dieser Reaktion ist direkt abhängig von der Glucosekonzentration im Blut.
Einer der ersten entwickelten Tests für glykierte Proteine mißt glykiertes Hämoglobin, nämlich Hämoglobin A_1c (HbA_1c), welches die glykämische Kontrolle über einen Zeitraum von ca. 2 bis 3 Monaten widerspiegelt. Andere dieser Tests messen Serumproteine, wie zum Beispiel das gesamte glykierte Serumprotein oder ein spezifisches glykiertes Serumprotein, nämlich glykiertes Albumin. Glykiertes Albumin spiegelt eine mittelfristige glykämische Kontrolle über einen Zeitraum von etwa 2 bis 3 Wochen wider.
Eine weitere Möglichkeit zur indirekten Abschätzung der Blutzuckerkonzentration ist die Analyse der Fruktosaminkonzentration. Glykierte Proteine sind auch als Fruktosamine oder Ketoamine bekannt. Die Blutproteine werden in vivo durch eine nicht-enzymatische Reaktion zwischen Glucose und verfügbaren Aminogruppen von Blutproteinen (hauptsächlich die ε-Aminogruppe von Lysinresten und die α-Aminogruppe der terminalen Aminosäure des Proteins) glykiert. Die Glucose bindet an eine Aminogruppe des Proteins, wobei eine Schiff'sche Base gebildet wird, d.h. ein Glykosylamin oder Aldimin, welches durch eine molekulare Umlagerung ein stabiles Ketoamin bildet. Diese Reaktionsabfolge ist in 1a dargestellt. Im Stand der Technik sind solche Ketoamine generisch als "Fruktosamine" bekannt. Das Ausmaß der Proteinglykierung und der Fruktosaminbildung ist direkt proportional zur Glucosekonzentration im Blut. Die Messung der Fruktosaminspiegel in Serum oder Plasma ist für die Überwachung der diabetische Kontrolle nützlich, weil die Fruktosaminkonzentrationen im Serum oder Plasma den mittleren Blut-Glucosespiegel über einen Zeitraum von etwa einem halben Monat widerspiegeln.
Während diese individuellen Tests zur direkten und indirekten Messung von Glucose entwickelt worden sind, gibt es kein praktisches Testsystem, das es dem Diabetiker oder einem Arzt erlaubt, sowohl den akuten Glucosespiegel als auch den mittelfristigen oder langfristigen glykämischen Zustand zu bestimmen. Gegenwärtig wird der Glucosetest routinemäßig vom Arzt oder dem Patienten durchgeführt. Der Test auf glykiertes Protein wird jedoch üblicherweise in einem klinischen Labor durchgeführt, wobei komplizierte Verfahren und teure Geräte eingesetzt werden. Die Ergebnisse dieser klinischen Labortests sind für Arzt und Patient über mehrere Tage nicht verfügbar. Diese Verzögerung bei der Übertragung von Informationen vermindert den Wert des Testergebnisses. Der Arzt kann es sogar unterlassen, dem Patienten das Testergebnis mitzuteilen, und bis zum nächsten Besuch warten, was mehrere Monate dauern kann. Skandinavische Forscher konnten kürzlich zeigen, daß Ärzte und Patienten, die auf die Testergebnisse der glykierten Proteine aufmerksam gemacht wurden, eine bessere glykämische Kontrolle hatten, als diejenige, denen diese Ergebnisse nicht bewußt waren. Man nimmt nunmehr auch an, daß glykierte Proteine die auslösenden Agenzien für Komplikationen bei der Erkrankung sein können. Daher gibt es einen Bedarf für die praktische und schnelle Messung von glykiertem Proteine allein oder in Kombination mit Glucose, um den integrierten glykämischen Zustand eines Subjekts zu bestimmen.
Gegenwärtig gibt es kein Testsystem, das den integrierten glykämischen Zustand eines Subjekts bestimmt, um dem Subjekt ein vollständiges Bild von seinem oder ihrem glykämischen Status zu liefern, um so die bestmögliche Überwachung und Behandlung zu erlauben. Besonders nützlich wäre ein einziges Instrument zur Bestimmung des integrierten glykämischen Zustands eines Subjekts, das in der Praxis des Arztes benutzt werden könnte, oder sogar noch besser, beim diabetischen Patienten zu Hause. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Anforderungen und stellt weitere damit zusammenhängende Vorteile bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein einziges Testsystem sowie ein Verfahren zur Bestimmung des integrierten glykämischen Zustands eines Subjekts durch Messung der Glukosekonzentration und des Spiegels an proteingebundener Glucose in einer Körperflüssigkeit eines Subjekts, wie zum Beispiel Vollblut. Die Glucosekonzentration zeigt den akute glykämischen Zustand des Subjekts an, während die Konzentration an proteingebundener Glucose entweder den mittelfristigen oder den langfristigen glykämischen Zustand anzeigt. Wahlweise können auch andere Analyte gemessen werden, die mit dem glykämischen Zustand zusammenhängen, wie zum Beispiel Ketonkörper oder Fettsäurederivate. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Diagnose von Diabetes.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Analyse der Fruktosaminkonzentration in weniger als fünf Minuten oder in fünf Minuten bereit, sogar in Abwesenheit eines Reaktionsbeschleunigers.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1a zeigt die Reaktionsabfolge für die Bildung von Fruktosamin in vivo.
1b zeigt, daß unter alkalischen Bedingungen das Fruktosamin ein Enaminol bildet, ein reduzierendes Agens, daß beispielsweise kolorimetrisch gemessen werden kann.
2 stellt eine Ausführungsform für eine mehrschichtige Testvorrichtung dar, die zur Messung der Fruktosaminkonzentration in einer Körperflüssigkeitsprobe verwendet werden kann.
3a veranschaulicht eine Ausführungsform für eine Testvorrichtung, die ein Reagenzkissen enthält, auf das die zu analysierende Körperflüssigkeit aufgebracht wird.
3b ist ein schematisches Blockdiagramm eines Geräts, das bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Die 4a und 4b zeigen, wie eine Körperflüssigkeitsprobe jeweils auf eine Testvorrichtung für Fruktosamin (F) beziehungsweise Glucose (G) aufgebracht wird. Die 4a und 4b zeigen ferner eine Ausführungsform des Geräts, bei der es möglich ist, die Konzentrationsspiegel von Fruktosamin und Glucose in der auf die jeweilige Testvorrichtung aufgebrachten Körperflüssigkeitsprobe zu bestimmen.
5 zeigt eine Ausführungsform einer Testvorrichtung, die zwei Teststreifen aufweist, welche benutzt werden können, um glykiertes Hämoglobin in einer Körperflüssigkeitsprobe zu messen.
6 veranschaulicht ein Beispiel für eine Testvorrichtung, die zwei Teststreifen aufweist und in der Lage ist, glykiertes Albumin in einer Körperflüssigkeitsprobe zu messen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Verfahren und das einzelne Testsystem der vorliegenden Erfindung stellen einen kombinierten Assay bereit, der es einem diabetischen Patienten oder einem Arzt erlaubt, den akuten Glucosespiegel des Subjekts sowie auch den mittel- oder langfristigen glykämischen Zustand des Subjekts zu beurteilen. Ein derartiges System ist für diabetische Patienten und ihre Ärzte, die versuchen die glykämische Kontrolle der Patienten zu normalisieren nützlich, wodurch die Möglichkeit von schweren Komplikationen der Erkrankung vermindert wird. Vor der Einführung dieser Erfindung, konnte der glykämischen Zustand eines Patienten nur aus getrennten Tests abgeleitet werden, und häufig mußte der Test auf glykierte Proteine in einem klinischen Labor durchgeführt werden. Das vorliegende Testsystem erlaubt es dem Arzt, einen kombinierten Test auf Glucose und proteingebundene Glucose in seiner Praxis durchzuführen; was sogar noch besser ist: es ermöglicht die Durchführung der Untersuchung durch den diabetischen Patienten zu Hause, wodurch ein schnelles, exaktes und vollständiges Bild vom glykämischen Zustand des Patienten bereitgestellt wird. Die vorliegende Erfindung stellt ein einzelnes Testsystem und ein Verfahren zur Bestimmung des integrierten glykämischen Zustands eines Subjekts bereit, indem sowohl Glucose als auch proteingebundene Glucose untersucht werden. Die durch den gemeinsamen Test auf Glucose und proteingebundene Glucose bereitgestellten Informationen sind besonders nützlich, weil Glucosekonzentrationen in diabetischen Patienten stark schwanken können, und diese Schwankungen würden in Standardmethoden der Untersuchung von Glucose übersehen werden.
Wie vorliegend verwendet bedeutet der Ausdruck "integrierter glykämischer Zustand" die akute Glucosekonzentration in Kombination mit der mittleren Glucosekonzentration über einen Zeitraum. "Akut" (immediate) bedeutet den gegenwärtigen Glucosespiegel in der Körperflüssigkeit eines Subjekts zur Zeit der Messung. Die Glucosekonzentration über einen Zeitraum zeigt entweder den mittel- oder langfristigen glykämischen Zustand an, und kann durch Messung der Konzentration an proteingebundener Glucose bestimmt werden. Der mittelfristige glykämische Zustand bezieht sich im allgemeinen auf einen Bereich von Tagen bis zu etwa einem Monat, wie zum Beispiel durch die Messung von Fruktosamin, das eine mittlere Glucosekonzentration in der Körperflüssigkeit über den Zeitraum von etwa einem halben Monat widerspiegelt, gezeigt wird. Der langfristige glykämische Zustand spiegelt den glykämischen Zustand weit über einen Monat hinaus wider, im allgemeinen über einen Zeitraum von 2 bis 3 Monaten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Reihenfolge bei der Messung von Glucose, proteingebundener Glucose und beliebiger zusätzlicher Analyte, die den glykämischen Zustand anzeigen, irrelevant. Zum Beispiel können Fruktosaminkonzentrationen zuerst und Glucosespiegel als zweites gemessen werden. Unabhängig von der Reihenfolge, stellt die Erfindung immer den integrierten glykämischen Zustand eines Subjekts bereit.
Zusätzlich zur Verwendung der vorliegenden Erfindung für die Überwachung des glykämischen Zustands eines Subjekts, das bekanntermaßen Diabetes hat, kann die vorliegende Erfindung auch zur Diagnose von Diabetes eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung kann zur Diagnose oder zum Screening von Individuen verwendet werden, für die ein Verdacht auf Diabetes besteht, oder die anfällig für Diabetes sein können. Zum Beispiel könnte eine schwangere Frau eine Person mit einer Anfälligkeit für Diabetes sein, für die ein Screening notwendig ist. Andere Personen, für die eine Diagnose besonders nützlich sein kann, sind Verwandte von diagnostizierten Diabetikern.
Das Verfahren zur Diagnose von Diabetes in einem Subjekt unter Verwendung des einzelnen Testsystems der vorliegenden Erfindung umfasst zunächst das Erhalten mindestens einer Körperflüssigkeitsprobe von einem Subjekt, und anschließend die Messung der Glucosekonzentration in einer Körperflüssigkeitsprobe des Subjekts und die Messung der Konzentration an proteingebundener Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe des Subjekts. Die Reihenfolge bei der Messung von Glucose und proteingebundener Glucose ist irrelevant. Schließlich werden die gemessenen Konzentrationen von Glucose und proteingebundener Glucose mit den Glucosekonzentrationen und den Konzentrationen von proteingebundener Glucose eines normalen Subjekts verglichen.
Die Verbindung von hohen Glucosespiegeln und einer hohen Konzentration an proteingebundener Glucose, oder Spiegel von proteingebundener Glucose, die einen hohen Glucosespiegel über einen Zeitraum anzeigen, wenn diese mit denen aus einem normalen Subjekt verglichen werden, sind diagnostisch oder indikativ für Diabetes. Zum Beispiel hat ein normales Subjekt Nüchternglucosespiegel im Bereich von 70-120 mg/dl. Glucosewerte oberhalb von 120 mg/dl können auf Diabetes hinweisen. Glucosewerte oberhalb von 150 mg/dl sind ein starker Hinweis auf Diabetes, und oberhalb von 200 mg/dl ein nahezu unbestreitbares Anzeichen für einen diabetischen Zustand. Ein normales Subjekt hat PBG-Konzentrationsspiegel im Bereich von 2 bis 3 millimo lar (mM), während Werte für PBG oberhalb von 3 mM in Kombination mit hohen Glucosespiegeln diagnostisch für Diabetes sein können.
Der Vorteil des kombinierten Assays der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß bis vor kurzem Serumglucose der einzige verfügbare Screening-Test auf eine mögliche Diabetes war. Ein anormal hoher Wert für Serumglucose ist nicht eindeutig, er könnte durch Diabetes verursacht sein, aber er könnte auch auf einen nicht nüchternen Zustand, Stress oder auf die Einnahme bestimmter Wirkstoffe hinweisen. Im Hinblick auf die Beschränkungen der alleinigen Untersuchung auf Glucose haben Rosen, et al., Hospital Practice, 27: 59-61 (1992) mehrere Serumproben von Patienten als Maßnahme zum Screening nach Diabetes sowohl auf Glucose als auch auf proteingebundene Glucose getestet. Die vorliegende Erfindung hat jedoch den zusätzlichen Vorteil, in der Lage zu sein, eine unbehandelte Körperflüssigkeitsprobe zu testen, oder Proben, die keine Trennung oder dergleichen vor dem Test erfordern. Zum Beispiel können Tropfen vom Vollblut eines Patienten mit den Verfahren und dem Testsystem der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ohne Serum oder Plasma vor der Durchführung des Tests abzutrennen. Die einfache und praktische Handhabung der vorliegenden Erfindung erlaubt es somit Ärzten und Patienten, den integrierten glykämischen Zustand des Patienten innerhalb von Minuten zu erfahren, entweder in der Praxis des Arztes oder zu Hause.
Wie vorliegend verwendet umfasst der Ausdruck "proteingebundene Glucose" oder "PGB" jedes glykierte Protein oder eine Kombination derselben. PGB-Konzentrationen korrelieren über die Zeit mit den Glucosekonzentrationen. Der PGB-Test, oder Non-Glucose-Test auf den glykämischen Zustand kann Tests für die gesamten oder für einzelne glykierte Proteine umfassen, die in Körperflüssigkeiten gefunden werden. Zum Beispiel kann man das "gesamte glykierte Hämoglobin" messen, was alle Spezies von glykiertem Hämoglobin einschließt, oder man kann ein spezifisches Hämoglobin messen, wie zum Beispiel Hämoglobin A_1c (HbA_1c). In ähnlicher Weise kann man alle glykierten Serumproteine messen, oder das "gesamte glykierte Serumprotein", oder ein bestimmtes glykiertes Serumprotein, wie zum Beispiel glykiertes Albumin. Darüber hinaus umfasst "proteingebundene Glucose" auch Fruktosamine. Mehr als ein PGB-Wert kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung gemessen werden. Zum Beispiel können Fruktosamine als ein Anzeichen für den mittelfristigen, und HbA_1c als Anzeichen für den langfristigen glykämischen Zustand gemessen werden.
Die hauptsächlichen, normalen Hämoglobin-Spezies sind A₀(α₂β₂), A₂(α₂δ₂), und F(α₂γ₂). Es gibt noch eine Reihe unbedeutender, aber normalerweise auftretender Hämoglobine, die im allgemeinen als HbA₁ oder "schnelle" Hämoglobine bezeichnet werden, da sie in einem elektrophoretischen Gel vor A₀ wandern. Die Familie von HbA₁ umfasst A_1a1, A_1a2, A_1b1, A_1b2, A_1b3, A_1c, A_1d und _1e, wobei alle glykierte Hämoglobine sind. Alle Fraktionen sind typischerweise im diabetischen Zustand im Vergleich mit den Konzentrationen in der nichtdiabetischen Population erhöht. HbA_1c ist die dominierende Subfraktion, aber alle diese Fraktionen schwanken im allgemeinen mit der mittleren Konzentration an Blutglucose und spiegeln den Status der glykämischen Kontrolle wider. Die meisten Hämoglobine werden glykiert, im allgemeinen durch eine Reaktion zwischen Glucose und der ε-Aminogruppe von Lysinresten im Hämoglobin. HbA_1c dagegen bindet über seinen aminoterminalen Valinrest an Glucose. Die Halbwertszeit von Hämoglobin beträgt etwa 60 Tage; daher ist die Messung des gesamten glykierten Hämoglobins oder HbA_1c indikativ für den langfristigen glykämischen Zustand, wobei im allgemeinen ein Zeitraum von 2 bis 3 Monaten widergespiegelt wird.
Die Glykierung ist nicht auf Hämoglobin beschränkt, sondern kann auch bei Serumproteinen auftreten. Da Aminogruppen mit Glucose reagieren, werden die meisten in Körperflüssigkeiten vorhandenen Proteine glykiert, einschließlich von Enzymen, Immunoglobulinen und der meisten anderen Proteinklassen sowie auch einzelnen Proteinen. Die Gesamtheit aller glykierten Serumproteine oder das "gesamte glykierte Serumprotein" kann analysiert werden, oder es kann ein spezifisches glykiertes Serumprotein, wie zum Beispiel glykiertes Albumin, gemessen werden. Die Messungen von glykierten Serumproteinen, entweder als gesamtes glykiertes Serumprotein oder als einzelnes glykiertes Serumprotein, sind indikativ für den mittelfristigen glykämischen Zustand. Glykiertes Albumin hat eine Halbwertszeit von etwa zwei bis drei Wochen, während die von anderen Serumproteine von zweieinhalb Tagen bis dreiundzwanzig Tagen reichen kann. Die Messung des gesamten glykierten Serumproteins oder des glykierten Albumins sind somit indikativ für den mittelfristigen glykämischen Zustand, was die Glucosekonzentrationen über einen Zeitraum von einigen Tagen bis zu etwa einem Monat widerspiegelt.
Fruktosamine werden durch glykierte Proteine gebildet. Glucose bindet an eine Aminogruppe des Proteins, wobei eine Schiff'sche Base gebildet wird, d.h. ein Glykosylamin oder Aldimin, das durch eine molekulare Umlagerung ein stabiles Ketoamin bildet. Diese Reaktionsabfolge ist in 1a illustriert. Im Stand der Technik sind solche Ketoamine im allgemeinen als "Fruktosamine" bekannt. Da die Fruktosaminbildung direkt von der Glucosekonzentration abhängt, haben diabetische Individuen höhere Fruktosaminkonzentrationen im Blut als nicht-diabetische Individuen. Unter alkalischen Bedingungen werden die im Blut gebildeten Fruktosamine wie in 1b gezeigt, zu Enaminolen umgewandelt. Die Enaminolform der Fruktosamine ist eine chemisch aktive, reduzierende Substanz, welche mit einem geeigneten Indikator reagiert, der in der Lage ist, durch Fruktosamine reduziert zu werden. Zum Beispiel kann der Farbumschlag eines chromogenen Farbstoffs oder die Fluoreszenz eines fluoreszenten Reagenz aus dieser Reaktion gemessen werden und mit einem Standard verglichen werden, um einen Hinweis auf die mittlere Glucosekonzentration in Blutproben über den Zeitraum des vergangenen halben Monats zu liefern. Im allgemeinen spiegelt die Fruktosaminkonzentration in einer Körperflüssigkeit, wie zum Beispiel im Blutserum, eine mittlere Glucosekonzentration über einen Zeitraum von etwa einem halben Monat wider.
Wahlweise können andere Analyte, die auf den glykämischen Zustand hinweisen, wie zum Beispiel Ketonkörper oder Fettsäurederivate, gemessen werden. Während einer Insulindefizienz, wie sie zwischen therapeutischen Insulininjektionen als Folge des Insulinmetabolismus auftreten kann, kann die Energie zur Aufrechterhaltung der zellulären Funktionen nicht ausreichend aus Glucose, der Hauptenergiequelle für Zellen, gewonnen werden. In dieser Situation werden die Fettsäureoxidationswege herangezogen, um eine alternative Energiequelle bereitzustellen. Nebenprodukte dieses metabolischen Prozesses, einschließlich Ketonkörper, wie zum Beispiel Aceton, β-Hydroxybutyrat und Acetoacetat, Fettsäuremetabolite und dergleichen, können im Blut und anderen Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden, wenn die Fettsäuren-metabolisierenden Stoffwechselwege aktiviert sind. Da diese Analyte nicht sofort aus dem Blut entfernt werden, wenn der Blut-Glucosespiegel wieder einen normalen Wert erreicht hat, liefern sie einen kurzfristigen Hinweis auf den Status des Glucosemetabolismus im Patienten. Solche Analyte sind in den Körperflüssigkeiten als Reaktion auf Veränderungen im Glucosemetabolismus eines Diabetikers innerhalb von etwa fünf Minuten (5) bis etwa zwölf (12) Stunden nach einer derartigen Veränderung vorhanden. Diese optionalen Messungen von zusätzlichen Analyten, die auch für den glykämischen Zustand indikativ sind, können in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung mit Verfahren durchgeführt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Zum Beispiel können Testreagenzstreifen zur Messung von Ketonkörpern, wie sie zum Beispiel im US Patent 4,397,956 von Maggio beschrieben werden, in Verbindung mit dem Testsystem der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Ein alternativer Analyt, der wahlweise gemessen werden kann und ebenfalls für den glykämischen Zustand indikativ ist, ist Mikroalbumin. Mikroalbumin ist im allgemeinen nur dann im Urin vorhanden, wenn der glykämischen Zustand eines Patienten so schwerwiegend ist, daß er zu Komplikationen in der Nierenfunktion führt.
Die Körperflüssigkeitsprobe des Subjekts, die auf Glucose und PBG, oder auf andere Analyte, die ebenfalls mit dem glykämischen Zustand zusammenhängen, untersucht wird, kann jede unbehandelte biologische Flüssigkeit sein, die diese Analyte enthält, einschließlich z.B. Vollblut, Urin, Speichel, interstitielle Flüssigkeit und Tränen. Die Körperflüssigkeit ist "unbehandelt", was bedeutet, daß die Körperflüssigkeit vor der Testdurchführung nicht bearbeitet werden muß, wie zum Beispiel mit Trennungsverfahren und dergleichen. Die Körperflüssigkeit kann direkt auf die Testvorrichtung aufgebracht werden, ohne zum Beispiel die Abtrennung von Plasma oder Serum aus dem Vollblut. Falls erforderlich kann die Körperflüssigkeit innerhalb der Testvorrichtung selbst aufgetrennt oder anderweitig behandelt werden, wie zum Beispiel durch eine Schicht zur Abtrennung von roten Blutzellen.
Die zur Messung der Glucosekonzentration verwendete Körperflüssigkeitsprobe kann (muß aber nicht) von der gleichen Art Körperflüssigkeitsprobe sein wie diejenige, die zur Messung der Konzentration von PBG verwendet wird. Zum Beispiel kann Vollblut sowohl für den Glucoseanteil als auch für den PBG-Aspekt der Erfindung verwendet werden. Alternativ dazu können die Körperflüssigkeitsprobe oder die Körperflüssigkeitsproben unterschiedliche Arten von Körperflüssigkeitsproben sein, wie zum Beispiel Urin zur Bestimmung der Glucosekonzentration und eine Vollblutprobe für den Test auf Fruktosamin. Weil die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise in häuslicher Umgebung vom Patienten selbst angewendet werden kann, ist Vollblut die bevorzugte Körperflüssigkeit sowohl für die Glucose- als auch für die PBG-Analyse, vorzugsweise Vollblut aus einer Punktur eines Fingers oder des Ohrläppchens. Obwohl Fingerstäbchen bevorzugt sind, können auch Pipetten, Tropfer oder dergleichen benutzt werden, abhängig davon, wo eine Probe entnommen wird.
Bei der Körperflüssigkeitsprobe oder den Körperflüssigkeitsproben, in denen Glucose und PBG gemessen werden, kann es sich um die gleiche oder um verschiedene Proben handeln, abhängig davon, wie die Probe vom Subjekt entnommen wird. Mit "verschiedenen Proben" sind einzelne Körperflüssigkeitsproben gemeint, wie zum Beispiel zwei oder mehr Proben, bei denen es sich um die selbe Art von Körperflüssigkeit handeln kann aber nicht muß, wie es oben beschrieben ist. Wenn zum Beispiel jede der Körperflüssigkeitsproben ein Blutstropfen ist, wie zum Beispiel von einzelnen Punkturen des Fingers des Subjekts, sind sie "getrennte" oder verschiedene "Proben". Alternativ dazu kann die Körperflüssigkeit vom Subjekt entnommen werden, wie zum Beispiel durch Entnahme einer Blutprobe, wobei dann die Körperflüssigkeitsprobe zur Analyse von Glucose und PBG aus der gesammelten Probe entnommen und als dieselbe Probe betrachtet würde. Zusätzliche Körperflüssigkeitsproben können Verwendet werden, wie zum Beispiel eine dritte Körperflüssigkeitsprobe oder mehr, wenn zum Beispiel mehr als eine PBG analysiert wird, oder zur Messung von optionalen Analyten, wie zum Beispiel Ketonkörper.
Die vorliegenden Erfindung ermöglicht die Messung von Glucose und PBG in einem einzelnen Testsystem. Das System stellt eine Testvorrichtung bereit, die ein signalerzeugendes System umfasst, das in der Lage ist, die in einer Körperflüssigkeitsprobe vorhandene Glucosekonzentration anzuzeigen. Das signalerzeugende System wird von einem Gerät ausgelesen, das ein automatisches Mittel zur Bestimmung der Glucosekonzentration aufweist, welches auf das Signal anspricht, das durch die Glucose-Testvorrichtung erzeugt wird. Das Testsystem der vorliegenden Erfindung umfasst auch eine Testvorrichtung, die in der Lage ist, die Konzentration eines PBG zu messen. Die Nicht-Glucose-Testvorrichtung enthält ein signalerzeugendes System, das in der Lage ist, die in einer Körperflüssigkeitsprobe vorhandene Konzentration einer PBG anzuzeigen. Das signalerzeugendes System wird von einem Gerät ausgelesen, das ein automatisches Mittel zur Bestimmung der Konzentration der PBG hat, welches auf das Signal anspricht, das durch die PBG-Testvorrichtung erzeugt wird. Ein geeigneter Apparat, der in dem einzelnen Testsystem verwendet wird, kann sowohl die Ergebnisse des Glucosetests als auch die Ergebnisse des PBG-Tests auslesen. Wenn optionale Analyte, die für den glykämischen Zustand ebenfalls indikativ sind, auch gemessen werden, können entsprechende Testvorrichtungen mit der vorliegenden Erfindung benutzt werden.
Testvorrichtungen, die signalerzeugende Systeme enthalten, welche in der Lage sind, die Konzentration von Glucose anzuzeigen, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Im Stand der Technik umfasst das signalerzeugende System im Allgemeinen Reagenzien, die eine Glucose-Oxidase-Enzymreaktion erzeugen. Glucose und das Enzym Glucose-Oxidase reagieren, wobei Wasserstoffperoxid gebildet wird. Eine Peroxidase, wie zum Beispiel Meerrettichperoxidase, und ein Redoxindikator, wie zum Beispiel o-Toluidin, o-Dianisidin, 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin (TMB), 4-Aminotipyrin, und andere im Stand der Technik wohlbekannte Redoxindikatoren sind in der Lage, in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid oxidiert zu werden, wobei ein gefärbtes Produkt gebildet wird. Ein Teststreifen, der diese oder andere Reagenzien des signalerzeugenden Systems enthält, welches zur Analyse der Glucosekonzentration benutzt wird, kann mit im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren hergestellt werden, wie sie zum Beispiel in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 0 388 782 von Chen und im U.S. Patent 5,304,468 von Phillips et al., beschrieben werden, wobei beide vorliegend durch Verweis eingeschlossen sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie sie in 3a gezeigt ist, hat die Glucose-Testvorrichtung 15 ein Reagenzkissen 18, welches das Reagenz bzw. die Reagenzien des signalerzeugenden Systems enthält. Das Reagenzkissen 18 wird mittels eines Klebmittels 17 an einem Ende eines Kunststoffträgerelements 16 positioniert, das eine Kerbe 19 aufweist. Eine ausführlichere Beschreibung der Materialien für das Reagenzkissen (oder die Reagenzkissen), das Trägerelement (oder die Trägerelemente) und das Klebmittel wird nachfolgend im Rahmen der Erläuterung der Fruktosamin-Testvorrichtung bereitgestellt und ist in gleicher Weise auf die Glucose-Testvorrichtung anwendbar. Falls erforderlich, kann die Glucose-Testvorrichtung zusätzlich eine Bluttrennungsschicht umfassen, wie zum Beispiel die unten beschriebene, oder andere im Stand der Technik wohlbekannte. Darüber hinaus können wahlweise weitere Schichten hinzugefügt werden, wie zum Beispiel eine Schicht zur Interferenzentfernung, eine Strahlungsschicht, oder andere Schichten, die im folgenden beschrieben werden oder im Stand der Technik bekannt sind.
Wie oben beschrieben enthält das Testsystem der vorliegenden Erfindung auch eine Testvorrichtung, die in der Lage ist, die Konzentration eines PBG zu messen. Die Nicht-Glucose- Testvorrichtung enthält ein signalerzeugendes System, welches in der Lage ist, die Konzentration des in einer Körperflüssigkeitsprobe vorhandenen PBG anzuzeigen. Das signalerzeugende System wird von einem Gerät gelesen, das ein automatisches Mittel zur Bestimmung der PBG-Konzentration aufweist, welches auf das Signal anspricht, das durch die PBG-Testvorrichtung erzeugt wird. Das signalerzeugende System und die Reagenzien, die verwendet werden, um das Signal in Reaktion auf PBG zu erzeugen, werden davon abhängen, welcher PBG-Analyt gemessen werden soll.
In einer Ausführungsform umfasst die PBG-Testvorrichtung zwei Teststreifen, die in der Lage sind die Konzentration von glykiertem Hämoglobin in einer Körperflüssigkeitsprobe zu messen, insbesondere im Blut. Diese Ausführungsform ist in 5 erläutert. Mit Bezug auf 5 weisen beide Teststreifen, 31 und 32, eine Schicht auf, die Hämolysereagenzien 33 enthält, die in der Lage ist, rote Blutkörperchen zu lysieren, wodurch Hämoglobin freigesetzt wird. In Teststreifen 31 wandert das Hämolysat dann in eine Schicht 34, die glykiertes Hämoglobin bindet. Jedes glykierte Hämoglobin, oder "Glykohämoglobin", das im Hämolysat vorhanden ist, wird in der Schicht 34 gebunden, während alle nicht glykierten Hämoglobine zur Auslesezone 35 weiterwandern. Im Teststreifen 32 gibt es keine Schicht zur Bindung von glykiertem Hämoglobin, und das Hämolysat einschließlich glykiertem und nicht glykiertem Hämoglobin (im folgenden "Gesamt-Hämoglobin" genannt) wandert direkt zur Auslesezone.
In dieser Ausführungsform der Testvorrichtung kann die Menge an glykiertem Hämoglobin mit einem geeigneten Apparat berechnet werden, der in der Lage ist, die Teststreifen 31 und 32 auszulesen, und den Unterschied zwischen beiden zu bestimmen. Die Menge an glykiertem Hämoglobin kann berechnet werden, indem die Ergebnisse, die mit dem Teststreifen 31 (gesamtes Hä moglobin minus glykiertem Hämoglobin) erhalten wurden, von den Ergebnissen von Teststreifen 32 (gesamtes Hämoglobin) subtrahiert werden.
Bei dem Hämolysereagenz, das in der Schicht 33 verwendet wird, kann es sich um Hämolysine oder chemische Reagenzien handeln, die im Stand der Technik für die Hämolyse wohlbekannt sind, vorausgesetzt, sie reagieren mit roten Blutzellen, wenn sie in einer Schicht eines Teststreifens enthalten sind. Beispiele für hämolytische Reagenzien umfassen zum Beispiel Saponine, oder eine Vielzahl von Detergenzien, und insbesondere nicht ionische Detergenzien, wie zum Beispiel Triton-X-100^®.
Die Schicht zur Bindung von glykiertem Hämoglobin kann zum Beispiel aus Antikörpern gegen Glykohämoglobin bestehen, wie zum Beispiel diejenigen, die in den U.S. Patenten 4,478,744 von Mezei, 4,806,468 von Wagner et al., 5,193,739 von Cohen und 5,206,144 von Zeuthen et al., beschrieben sind, von denen jedes vorliegend durch Verweis eingeschlossen. Alternativ kann die Schicht zur Bindung von glykiertem Hämoglobin Materialien enthalten, die zur Bindung von Glykohämoglobin wohlbekannt sind und üblicherweise in der Affinitätschromatographie eingesetzt werden, wie zum Beispiel Phenylborsäuren, einschließlich z.B. m-Aminophenylborsäure und andere, die zum Beispiel in den U.S. Patenten 4,269,605 von Dean und 5,284,777 von Rosenthal et al. beschrieben sind, von denen jedes vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist. Phenylborsäure bindet an die cis-Diolgruppen in Glucose-modifiziertem Hämoglobin, wobei ein reversibler, ringförmiger Komplex aus fünf Elementen gebildet wird. Die Phenylborsäure kann mit der Schicht des Teststreifens durch eine Agarosematrix oder eine Cellulosematrix gekoppelt werden, oder mittels anderer Verfahren und Materialien, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie zum Beispiel diejenigen, die in den oben aufgeführten Patenten beschrieben sind.
Das Hämoglobin kann in der Auslesezone durch einfaches Auslesen der Farbe des Hämoglobins bei 416, 542 oder 576 nm verfolgt werden. Deshalb umfasst das signalerzeugende System, das in der Lage ist, die Konzentration einer PBG, wie zum Beispiel von Hämoglobin anzuzeigen, die direkte Messung der PBG. Diese Verfahren umfassen eine Reaktion mit Kaliumferricyanid und Thiocyanat, die das Hämoglobin zu Methämoglobin oxidieren und es komplexieren, wobei das gefärbte Thiocyan-Methämoglobin gebildet wird, das bei 531 nm gemessen werden kann. Ein anderes bekanntes Verfahren ist die Reaktion von Hämoglobin mit Cumolhydroperoxid und Tetramethylbezidin. Das Hämoglobin wirkt wie eine Peroxidase und katalysiert die Reaktion, bei der ein gefärbtes Produkt erzeugt wird, das entweder bei 660 nm oder im nahen Infrarotbereich bei 890 nm gemessen werden kann.
In einer anderen Ausführungsform besteht die PBG-Testvorrichtung aus Teststreifen, welche die Spiegel an glykiertem Albumin messen. Diese Ausführungsform kann Techniken benutzen, die denjenigen ähnlich sind, welche zur Messung des glykierten Hämoglobins in der obigen Ausführungsform eingesetzt wurden. Hier wird das gesamte Albumin, das sowohl glykiertes als auch nicht glykiertes Albumin umfasst, auf einem Teststreifen gemessen, und auf dem anderen Teststreifen wird das gesamte Albumin minus dem glykierten Albumin bestimmt. Wiederum ergibt die Differenz zwischen den beiden Teststreifen die Menge des glykierten Proteins von Interesse.
Für eine ausführlichere Beschreibung der Testvorrichtung zur Messung von glykiertem Albumin wird nunmehr auf 6 verwiesen. Wie in 6 gezeigt, ist die erste Schicht in beiden Teststreifen, 36 und 37, eine Bluttrennungsschicht 38, die Plasma oder Serum abtrennt. Die Trennungsschicht kann derjenigen Trennungsschicht, die in den folgenden Beispielen beschrieben ist, oder anderen im Stand der Technik wohlbekannten Trennungsschichten ähneln. Zum Beispiel wandert dann das abgetrennte Blutplasma in die nächste Schicht 39, die in beiden Teststreifen vorhanden ist, und die mobiles, markiertes Anti-Albumin enthält. Die markierten Antikörper aus dieser Schicht binden sowohl an das glykierte als auch an das nicht-glykierte Albumin, das in der Probe vorhanden ist, und diffundiert dann als Konjugat in die nächste Schicht, die immobilisierte Albuminschicht 40. Freier, mobiler, markierter Antikörper aus der Schicht 39, der nicht an Albumin gebunden hat, diffundiert in Schicht 40 und wird durch das dort vorhandene Albumin immobilisiert. Im Teststreifen 36 wandert das Konjugat aus Albumin und markiertem Anti-Albumin dann in eine Schicht 41, die glykiertes Albumin bindet, in der nur solche Konjugate gebunden werden, die glykiertes Albumin enthalten. Das Konjugat aus markiertem Anti-Albumin und nicht-glykiertem Albumin im Teststreifen 36 diffundiert zur Auslesezone 42, wo eine Messung erfolgt, die für Gesamt-Albumin minus glykiertem Albumin indikativ ist. Teststreifen 37 der Testvorrichtung enthält keine Schicht, die glykiertes Albumin bindet, und die Auslesezone 42 auf Teststreifen 37 ist deshalb für das Gesamt-Albumin indikativ. Die Menge an glykiertem Albumin kann berechnet werden, indem die Ergebnisse, die mit dem Teststreifen 36 (gesamtes Albumin minus glykiertem Albumin) erhalten wurden, von den Ergebnissen des Teststreifens 37 (gesamtes Albumin) subtrahiert werden.
Die oben beschriebene Ausführungsform zur Messung von glykiertem Albumin, ebenso wie die Ausführungsform für Glykohämoglobin, können von den Methoden und Prinzipien profitieren, die jenen ähnlich sind, die von Liotta in U.S. Patent 4,446,232 gelehrt wird, welches vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist, insbesondere die Verwendung von mobilem, markiertem Antikörper und von immobilisiertem Liganden. Das mobile, markierte Anti-Albumin der vorliegenden Erfindung kann (wie es zum Beispiel von Liotta gezeigt wird) mit einem Enzym markiert sein, einschließlich Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase und beta-Galaktosidase, sowie mit anderen Enzymen, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, und welche zur Erzeugung einer Farbe oder anderer Signale geeignet sind. Alternativ dazu können andere Markierungen, wie beispielsweise kolloidale Partikel, zum Beispiel kolloidales Gold oder Latex, oder andere Markierungen verwendet werden, die in der Lage sind, ein Signal zu erzeugen, und die im Stand der Technik wohlbekannt sind.
Die Schicht, die glykiertes Albumin bindet, kann zum Beispiel aus Antikörpern bestehen, die spezifisch für die Konjugate aus glykiertem Albumin und daran gebundenem Anti-Albumin sind. Alternativ dazu kann die Schicht, die glykiertes Albumin bindet, Materialien umfassen, von denen bekannt ist, das sie glykierte Proteine binden, wie beispielsweise Phenylborsäuren, wie sie oben beschrieben und in den U.S. Patenten 4,269,605 von Dean und 5,284,777 von Rosenthal et al. beschrieben sind, von denen jede vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist. Wie oben erwähnt bindet Phenylborsäure an die cis-Diolgruppen in einem Glucose-modifizierten Protein, wobei ein reversibler, ringförmiger Komplex aus fünf Elementen gebildet wird. Die Borsäure kann mit der Schicht des Teststreifens über eine Agarosematrix oder eine Cellulosematrix gekoppelt werden oder mittels anderer Verfahren und Materialien, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie zum Beispiel diejenigen, die in den oben aufgeführten Patenten beschrieben werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist die PBG-Testvorrichtung eine mehrschichtige Testvorrichtung zur Analyse der Fruktosamin-Konzentration. Die mehrschichtige Testvorrichtung enthält ein signalerzeugendes System, das ein Indikator ist, der in der Lage ist, durch Fruktosamine reduziert zu werden, wie zum Beispiel bestimmte Farbstoffe, einschließlich chromogene Farbstoffe oder fluoreszente Reagenzien. Die mehrschichtige Test vorrichtung ist im folgenden sowie in der U.S. Patentanmeldung Seriennummer 08/269,351, die vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist, ausführlicher beschrieben.
Mehrschichtige Fruktosamin-Testvorrichtung
Schichtenanordnung:
Die Schichten der mehrschichtigen Testvorrichtung sind benachbart zueinander angeordnet, so daß sie für einen Fluidaustausch sorgen. Der Fluidübergang zwischen den benachbarten Schichten kann entweder vertikal oder lateral erfolgen. Dementsprechend können die Schichten der mehrschichtigen Testvorrichtung übereinander oder nebeneinander angeordnet sein. Die einzelnen Schichten der Testvorrichtung enthalten die relevanten Testreagenzien, wie zum Beispiel einen Puffer oder einen Indikator. Das relevante Reagenz kann in die Schicht imprägniert werden, oder in oder auf die Schicht aufgezogen werden, oder kovalent mit der Schicht verbunden werden.
Das Material für die verschiedenen, hier beschriebenen Schichten, einschließlich der Pufferschicht, der Indikatorschicht und beliebigen anderen Schichten, umfasst eine poröse Matrix, die in der Lage ist, das relevante Testreagenz aufzunehmen, die aber permeabel für den Fruktosamin-Analyten und andere wichtigen Testreagenzien und Flüssigkeiten ist. Die Permeabilität entsteht im allgemeinen durch Porosität, Quellfähigkeit oder eine beliebige andere Eigenschaft. Die Schichten der Testvorrichtung können verschiedene poröse, fasrige Materialien enthalten, wie zum Beispiel Cellulose, Papier, Vlies, Filz, Gewebe und dergleichen (vgl. zum Beispiel U.S. Patente 3,802,842; 3,809,605; und 3,897,214, wobei jedes davon vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist). Alternativ dazu können die Schichten der Testvorrichtung diverse poröse, nicht- faserartige Materialien umfassen, wie zum Beispiel mikroporöse Polymere (vgl. zum Beispiel U.S. Patent 3,552,929, das vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist). Spezifische Beispiele für geeignete Materialien, die für die Schichten benutzt werden können, umfassen Filterpapier, wie zum Beispiel 3mm-Filterpapier (Whatman, Maidenstone, England), Rayon, Cytosep^®-Membran (Ahlstrom Filtration, Inc., Mt. Holly Spring, PA), Glasfiber und Biodyne A^® Nylonmembran (Pall Corp., East Hills, NY).
Die diversen Schichten, welche die Assayreagenzien (wie Puffer oder Indikator) enthalten, können gleichzeitig oder nacheinander zusammengesetzt werden. Das poröse Material für eine bestimmte Schicht wird zuerst in eine Lösung aus Assayreagenz gelegt, wie zum Beispiel eine Pufferlösung oder eine Indikatorlösung. Nach dem Trocknen kann die Schicht in einem Exsikkator gelagert werden, bis sie in der mehrschichtigen Testvorrichtung eingesetzt wird.
Die Schichten liegen im allgemeinen in der Form von Reagenzkissen (reagent pads) vor, die auf ein Trägerelement aufgebracht oder zwischen zwei oder mehr Trägerelementen positioniert werden, wie im folgenden näher diskutiert ist. Die mehrschichtigen Kissen können eine beliebige geometrische Dimension haben (wie zum Beispiel kreisförmig oder rechteckig), und sie haben im allgemeinen einen Umfang von 0,5 bis 20 mm, vorzugsweise 1 bis 10 mm, und sind entweder aufeinander oder nebeneinander angeordnet.
Unabhängig von der Anordnung der Schichten umfasst die Testvorrichtung, die erfindungsgemäß zur Analyse von Fruktosamin verwendet werden kann, die Grundelemente einer Pufferschicht und einer Indikatorschicht, und sie kann wie im folgenden beschrieben zusätzliche Schichten umfassen.
Pufferschicht:
Die Pufferschicht 13 enthält einen Puffer mit einem pH-Wert von mindestens 9. Verschiedene bekannte Puffertypen können in der Pufferschicht enthalten sein, solange der Puffer einen ausreichend hohen pH gewährleistet, sodaß die Fruktosamine in ihre Enaminolform umgewandelt werden. Um dies zu erreichen, sollte der pH des Puffers bei einem pH-Wert zwischen etwa 9 und etwa 13 liegen, und für optimale Ergebnisse ist der pH bei einem pH-Wert zwischen 10 und 12. Beispiele für solche Puffer umfassen Kaliumhydrogenphosphat, Natriumhydrogenphosphat, Natriumhydroxid, Guanidiniumsalze, bestimmte Aminosäuren und andere geeignete Puffer oder Kombinationen derselben sind im Stand der Technik wohlbekannt. Wenn die Pufferschicht oberhalb der Indikatorschicht liegt, ist sie im allgemeinen aus einem nicht-opaken flüssigkeitsdurchlässigen Material.
Indikatorschicht:
Die Indikatorschicht 14 enthält einen beliebigen Indikator, der in der Lage ist, durch Fruktosamine reduziert zu werden, wie zum Beispiel bestimmte Farbstoffe, einschließlich chromogene Farbstoffe oder fluoreszente Reagenzien. Beispiele für geeignete chromogene Farbstoffe, die ihre Farbe abhängig von der Menge an Fruktosamin verändern, das in einer flüssigen Probe vorliegt, umfassen Tetrazoliumfarbstoffe, wie zum Beispiel Neotetrazoliumchlorid (NT), Tetranitroblautetrazoliumchlorid (TNBT), Blaues Tetrazoliumchlorid (BT), Jodnitrotetrazoliumchlorid, Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT), Nitroblau-Monotetrazoliumchlorid, Thiazolylblautetrazoliumchlorid (MTT), Tetrazoliumviolett, 2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazoliumchlorid Thiocarbamylnitroblautetrazoliumchlorid (TCNBT), Tetrazolium XTT (XTT), 2,2'-Benzothiazolyl-5-styryl-3-(4'-phthalylhydrazidyl)-tetrazoliumchlorid (BSPT), Distyrylnitroblautetrazoliumchlorid (DSNBT). Ein Beispiel für ein geeigne tes fluoreszentes Reagenz ist 5-Cyano-2,3-ditolyl-Tetrazoliumchlorid (CTC).
Andere Schichten:
Andere Schichten, zusätzlich zur Pufferschicht und Indikatorschicht, können in der Fruktosamin-Testvorrichtung verwendet werden. Zum Beispiel kann die mehrschichtige Testvorrichtung eine Schicht zur Abtrennung roter Blutzellen (RBC) umfassen, oder Schichten vor dem Pufferschichtkissen, zum Zweck der Abtrennung von RBC-Bestandteilen, wie es zum Beispiel in 2 in den Punkten 8 und 9 gezeigt ist, und wie es in den Beispielen beschrieben ist. Andere nützliche Schichten umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) diejenigen, die in den U.S. Patenten 4,050,898 und 4,042,335 beschrieben sind (jedes davon ist vorliegend durch Verweis eingeschlossen), einschließlich strahlungsblockierender Schichten, Schichten zur Interferenzentfernung, die Detergenzien, Chelatoren, Anti-Oxidantien oder andere Substanzen enthalten können, die mit exakten Ergebnissen interferieren können, Schichten zur Kontaminationsverhinderung, Dialyseschichten, Filterschichten, Trägerschichten und dergleichen.
Träger der mehrschichtigen Anordnung:
Das Trägerelement oder die Trägerelemente, welche die mehreren Schichten tragen, können opak, reflektierend oder durchlässig für Licht oder eine andere Energie sein. Das Trägerelement oder die Trägerelemente werden mit den beabsichtigten Analyseverfahren und dem benutzten Indikator (wie zum Beispiel chromogene oder fluoreszente Indikatoren) kompatibel sein. Materialien, die als Trägerelemente eingesetzt werden können, umfassen eine Vielzahl von Kunstoffmaterialien und Polymeren, wie zum Beispiel Celluloseacetat, Polyester, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polyethylen und Polystyrol. wenn solche Mate rialien benutzt werden, ist das Trägerelement im allgemeinen planar. Die Schichten können auch in einem Kunstoffbehälter eingefasst sein, der die Schichten in ihrer richtigen Orientierung hält, oder sie können in anderen Trägern untergebracht werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie zum Beispiel die ICON-Testvorrichtung (Hybritech, Inc., San Diego, CA).
Die mehrschichtige Testvorrichtung hat mindestens ein Trägerelement, das wahlweise eine Detektionsöffnung aufweist. Wie vorliegend verwendet bedeutet die Formulierung "wahlweise eine Detektionsöffnung aufweisen", daß wenn das betreffende Trägerelement transparent ist, es keine Notwendigkeit für eine Detektionsöffnung gibt, während bei einem nicht-transparenten Träger eine Detektionsöffnung benötigt wird und anwesend ist. Die Detektionsöffnung ist ein Loch zur Beobachtung der Farbveränderung oder der Fluoreszenz auf der Indikatorschicht. Die Größe der Detektionsöffnung ist im allgemeinen kleiner als die Größe der mehrschichtigen Anordnung, und die Größe ist abhängig von der Größe der Schicht oder der Schichtkissen. Die Größe der Detektionsöffnung wird im allgemeinen zwischen 0,5 und 20 mm sein, vorzugsweise zwischen 1 und 10 mm. Die Position der Detektionsöffnung auf dem unteren Trägerelement hängt davon ab, ob die mehreren Schichten übereinander oder nebeneinander angeordnet sind. Wenn die mehreren Schichten übereinander liegen, ist die Detektionsöffnung unterhalb von allen Schichten angeordnet. Wenn die mehreren Schichten nebeneinander liegen, ist die Detektionsöffnung direkt unterhalb der Indikatorschicht oder einer anderen letzten Schicht angeordnet.
Wenn nur ein Träger benutzt wird, kann die flüssige Probe direkt auf die erste Schicht aufgebracht werden. Die flüssige Probe kann frei eindringen, diffundiert in die Pufferschicht und fließt durch diese und jede andere vorhandene Schicht, und sie wandert zur Indikatorschicht, so daß die Konzentration an Fruktosamin bestimmt werden kann.
Obwohl wie oben beschrieben nur ein Träger erforderlich sein kann, können zusätzliche Träger benutzt werden. Wenn zwei oder mehr Träger benutzt werden, wird die mehrschichtige Anordnung zwischen einem ersten Trägerelement mit einer Probenöffnung und einem zweiten Trägerelement mit wahlweise einer Detektionsöffnung positioniert. Wie bei der Detektionsöffnung ist die Größe der Probenöffnung im allgemeinen kleiner als die Größe der verschiedenen Schichten, und ihre Größe ist weitgehend abhängig von der Größe der Schicht oder des Schichtkissens. Die Größe der Öffnung wird im allgemeinen zwischen 0,5 und 20 mm sein, vorzugsweise zwischen 1 und 10 mm.
Die zwei oder mehr Trägerelemente können durch eine Haltemittel zusammengehalten werden, wie zum Beispiel einem Klebmittel. Beispiele für geeignete Klebmittel umfassen Gelatine, Gummi, Silikon und Klebstoff auf Acrylat basierender Kleber. Zusätzlich kann der Kunststoffbehälter durch Ultraschall geschweißt sein, oder durch Einrasten verbunden sein, wie es im Stand der Technik üblich ist.
Eine Ausführungsform der mehrschichtigen Testvorrichtung, die zur Bestimmung der Konzentration von Fruktosamin verwendet wird, ist in 2 gezeigt. Mit Bezug auf 2 hat die Ausführungsform ein äußeres im wesentlichen planares Kunststoffträgerelement 1 mit einer Probenöffnung 6 und ein zweites äußeres im wesentlichen planares Kunststoffträgerelement 5, das eine Detektionsöffnung 11 und eine Einbuchtung 12 aufweist. Die Ausführungsform umfasst die zusätzlichen Trägerelemente 2, 3 und 4, die ein Loch 7 für den Fluidaustausch aufweisen. In den zusätzlichen Trägerelementen sind Vollblut-Trennungsschichten 8, 9 und 10 untergebracht, wie in den folgenden Beispielen eingehender beschrieben ist. Unterstützt vom zweiten äußeren Trägerelement 5 ist ein nicht-opakes, flüssigkeitsdurchlässiges Pufferschichtkissen 13, das einen Puffer mit einem pH-Wert zwischen etwa 10 und etwa 12 enthält, und das auf einem Indikatorschichtkissen 14 liegt, das einen Nitroblautetrazolium-Farbstoff enthält.
Eine Körperflüssigkeitsprobe, die den zu messenden Analyten enthält, wird auf die geeignete Testvorrichtung aufgebracht, welche ein Reagenz enthält, das so beschaffen ist, daß es mit dem Analyten in spezifischer weise interagiert, sodaß wie oben beschrieben ein messbares Signal erzeugt wird. Nachdem die Körperflüssigkeitsprobe auf die geeignete Testvorrichtung aufgebracht wurde, kann die Konzentration von Glucose oder PBG in der Körperflüssigkeitsprobe mit einem Apparat bestimmt werden, wie er in 4 veranschaulicht und im folgenden eingehender beschrieben ist. Der Apparat hat automatische Mittel zur Bestimmung der Konzentrationen von Glucose und PBG, die auf das Signal ansprechen, das durch die Reaktionen von Glucose und PBG mit dem signalerzeugenden System der jeweiligen Testvorrichtung entsteht. Der Apparat hat ferner ein Anzeigemittel, das mit den automatischen Mitteln zur Bestimmung gekoppelt ist, sowie eine Aufnahmeöffnung, die mit den automatischen Mitteln zur Bestimmung verbunden ist. Da die vorliegende Erfindung vorteilhafterweise in der häuslichen Umgebung eingesetzt wird, sollten Apparat und Test tragbar sein. Zum Beispiel kann der im Testsystem verwendete Apparat batteriebetrieben sein.
Ein geeigneter, für das einzelne Testsystem benutzter Apparat kann sowohl die Ergebnisse des Glucose-Tests als auch die für PBG auslesen, und er wird deshalb als "glykämischer Messapparat" bezeichnet. Solche Apparate werden entsprechend den Spezifikationen konstruiert werden, die vom signalerzeugenden System des Tests und von den automatischen Mitteln, die auf das erzeugte Signal ansprechen, abhängen. Wenn zum Beispiel das automatische Mittel zur Bestimmung der Konzentration oder das Auslesen eine Farberzeugung ist, kann der Apparat ein Bestimmungsmittel enthalten, das ein Spektrometer ist. Andere Spektrophotometer, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, messen zum Beispiel Fluoreszenz, Absorption oder Transmission. Wenn das Auslesen elektrochemisch erfolgt, kann ein miniaturisiertes Elektrodensystem eingesetzt werden. Es ist im Stand der Technik zum Beispiel wohlbekannt, wie man Glucose elektrochemisch messen kann; dies wird zum Beispiel von Higgins et al. in U.S. Patent No. 4,545,382, Parks et al. in U.S. Patent No. 4,999,582 und von White in U.S. Patent No. 5,243,516 gelehrt, von denen jedes vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist. Es kann mehr als ein automatisches Mittel zur Bestimmung in dem Apparat vorhanden sein. Zum Beispiel kann eine Elektrode vorhanden sein, um die Glucosekonzentration zu messen, und es kann ferner ein Reflektionsspektrometer im Apparat vorhanden sein, um die Fruktosamin-Konzentration zu messen. Eine ausführliche Beschreibung eines Reflektionsspektrometers zur Messung von Glucose und Fruktosamin ist im folgenden dargestellt. Es können jedoch auch andere Apparate konstruiert werden, die sowohl Glucose als auch glykierte Proteine messen können.
In dem glykämischen Messapparat kann ein geeignetes automatisches Mittel zur Bestimmung der Konzentrationen von Glucose und PGB, wie zum Beispiel ein Reflektionsspektrophotometer mit geeigneter Software, so eingestellt werden, dass es automatisch die Reflektion an gewissen Zeitpunkten ausliest, die Rate der Reflektionsänderung berechnet, und unter Verwendung von Kalbrierungsfaktoren die Menge des Analyten in der Blutprobe angeben. Ein solches Gerät ist in 3b schematisch gezeigt, wobei Testvorrichtungen der vorliegenden Erfindung gemessen werden können. Die Lichtquelle 21, zum Beispiel eine Leuchtdiode (LED) mit hoher Intensität, projiziert einen Lichtstrahl auf die Ausleseregion der Testvorrichtung 15. Ein Teil dieses Lichts wird von der Ausleseregion diffus reflektiert und wird durch einen Lichtdetektor 22 detektiert, zum Beispiel einen Licht-zu-Frequenz-Wandler, der eine Ausgangsfrequenz erzeugt, die proportional zum empfangenen Licht ist.
Falls dies gewünscht ist, können Lichtquelle 21 und/oder Detektor 22 angepaßt werden, um spezifische Wellenlängen des Lichts zu erzeugen oder auf diese anzusprechen. Die Lichtquelle kann polychromatisch sein, und der Lichtdetektor kann in der Lage sein, zwei oder mehr verschiedene Wellenlängen zu messen. Alternativ dazu oder zusätzlich, kann der glykämische Messapparat zwei oder mehr LED-Lichtquellen haben, die in der Lage sind, zwei oder mehr spezifische Wellenlängen des Lichts zu emittieren. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Apparat zum Beispiel zwei LED-Lichtquellen, beide von Stanley Electronic Company (Irvine, CA), spezifiziert als MPG3368S und MVR3368S. Kommerzielle Licht-zu-Frequenz-Wandler umfassen solche, die von Texas Instruments (Houston, TX) hergestellt werden, und als TSL235 und als die bevorzugte Komponente TSL230 spezifiziert sind.
Das Ausgangssignal von Detektor 22 wird von einem Mikroprozessor 24 zur Datenanalyse verarbeitet. Der Mikroprozessor 24 kann den folgenden Funktionen dienen: (1) Zeiteinstellung für das gesamte System; (2) Verarbeitung der Frequenzdaten vom Licht-zu-Frequenz-Wandler; (3) Berechnung der Analyten-Konzentrationen aus den gespeicherten Reflektionsdaten; und (4) Ausgabe der Werte für die Analyten-Konzentration zur Anzeige 23. Eine Vielzahl von Mikroprozessoren kann verwendet werden, wie zum Beispiel das DS5000T von Dallas Semiconductor Company (Dallas, TX). Ein Speicherschaltkreis 25 kann Daten und das Steuerprogramm für den Mikroprozessor speichern. Das Anzeigemittel 23 kann in unterschiedlichen Hardcopy- und Softcopy-Formen vorhanden sein. Üblicherweise ist es eine visuelle Anzeige, wie zum Beispiel eine Flüssigkristall (LCD)- oder ei ne LED-Anzeige, aber es kann auch ein Drucker, ein hörbares Signal oder dergleichen sein. Das Instrument kann ferner einen Ein-Ausschalter umfassen und, sofern dies gewünscht ist, kann es eine hörbare oder sichtbare Zeitausgabe abgeben, um das Auftragen von Proben, das Ablesen, etc. anzuzeigen.
Obwohl andere Verfahren zur Aufnahme von Meßwerten möglich sind, ergab das folgende Verfahren die gewünschten Ergebnisse. Nach dem Beginn der Meßzeit werden Meßwerte nach spezifischen Intervallen verzeichnet. Abhängig von der gemessenen Konzentration können die Intervalle variieren. Zum Beispiel können die PBG-Intervalle 15 Sekunden, und die Glucose-Messwerte können alle 5 Sekunden genommen werden. Die Messungen werden durchgeführt, indem die LED für einen kurzen Zeitraum eingeschaltet wird. Innerhalb dieses Zeitraums wird das reflektierte Licht durch den Licht-zu-Frequenz-Wandler in eine Frequenz umgewandelt. Diese Umwandlung wird vom Mikrocomputer überwacht, indem die vom Licht-zu-Frequenz-Wandler erzeugte Pulsbreite erfaßt wird. Diese Rohmesswerte für die Reflektion werden in Ereignisse für die Ausgangs-Pulsbreite definiert. Diese Ereignisse werden dann für die vom Mikroprozessor vorgenommenen Berechnungen verwendet, um die Konzentration von Glucose oder PBG zu berechnen.
Der glykämische Messapparat kann auch einen Temperatursensor aufweisen, der die Umgebungstemperatur und Temperaturveränderungen mißt. Der Sensor ist besonders nützlich, um temperaturabhängige Veränderungen in der Testreaktivität zu berücksichtigen. Es kann ein digitales Thermometer verwendet werden, das in der Lage ist, die Umgebungstemperatur und Temperaturveränderungen in zufriedenstellender Weise zu überwachen. Der Temperatursensor DS1620 von Dallas Semiconductor hat sich für diese Anwendung als nützlich erwiesen.
Wie oben bezüglich des Temperatursensors erörtert, kann die Analyse für Glucose und PBG mit der gegenwärtigen Erfindung bei Umgebungstemperatur oder Raumtemperatur (etwa 20°C) durchgeführt werden. Überraschenderweise und unerwarteterweise ist die Erfindung in der Lage, selbst bei Raumtemperatur und ohne Reaktionsbeschleuniger die Fruktosamin-Konzentrationsspiegel in weniger als fünf Minuten oder innerhalb von etwa fünf Minuten analysieren; und sogar in so kurzer Zeit wie in vier Minuten oder weniger, und bevorzugt in etwa drei Minuten oder weniger, wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird. Im Stand der Technik wurden entweder Reaktionsbeschleuniger oder erhöhte Temperaturen verwendet. Zum Beispiel benötigt der Trockenphase-Fruktosamintest von Ismail, der in U.S. Patent 4,956,301 beschrieben ist, den Einsatz eines Reaktionsbeschleunigers, um Fruktosamin-Konzentrationen bei Umgebungstemperatur zu analysieren. Wie vorliegend verwendet bedeutet "Reaktionsbeschleuniger" jede Substanz, die nur zum Zweck der Beschleunigung der Reaktion des Fruktosamintests zugegeben wird. Solche Substanzen sind im allgemeinen nicht-ionische Detergenzien und organische Lösungsmittel, welche die Reaktionsrate des Fruktosamintests erhöhen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Analyse von Fruktosamin in etwa fünf Minuten oder weniger schließen die Verwendung derartiger Reaktionsbeschleuniger aus.
Wie oben erwähnt, werden erhöhte Temperaturen auch in Verfahren im Stand der Technik zur Beschleunigung des Fruktosamin-Assays verwendet. Zum Beispiel erfordert das mehrschichtige analytische Element von Sakamoto zur Analyse von Fruktosamin (beschrieben in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 0 473 109) erhöhte Temperaturen im Bereich von 37-40°C, ebenso wie der in U.S. Patent 5,370,990 von Staniford et al. beschriebene Fruktosamin-Assay. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden erhöhte Temperaturen nicht benötigt, um eine vollständige Fruktosaminanalyse in etwa fünf Minuten oder weniger zu erreichen.
Die folgenden Beispielen sollen die Erfindung veranschaulichen, jedoch nicht begrenzen.
BEISPIEL I
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und das Testen von proteingebundener Glucose, Fruktosamin mit einer Vollblutprobe.
Herstellung einer Fruktosamin-Testvorrichtung
Bluttrennungsteil der Fruktosamin-Testvorrichtung
Ein Tetko-Netz #7-280/44 (Tetko, Inc. Rueschlikon, Schweiz) wurde für 1 Minute in eine Detergenzlösung aus 1% Pluronic (Pragmatics, Inc., Elkhart, IN) gelegt. Überschüssiges Detergenz wurde entfernt, und das Netz wurde durch Erhitzen bei 60°C für 10 Minuten getrocknet. Bis zur Benutzung wurde das Netz in getrockneten Plastikbeuteln aufbewahrt. Dann wurden 3/16''-Kreise in der mehrschichtigen Testvorrichtung auf Trägerelement 2 platziert (2).
Eine Cytosep^®-Membran #1661 (Ahlstrom Filtration, Inc., Mt. Holly Spring, PA) wurde für 1 Minute in eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) gelegt, die 300 μg/ml Kartoffellektin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielt. Überschüssige Lösung wurde entfernt, und die Membran wurde durch Erhitzen bei 40°C für 60 Minuten getrocknet. Bis zur Benutzung wurde die Membran in getrockneten Plastikbeuteln aufbewahrt. Bei Benutzung wurden fünf (5) 3/16''-Kreise der Membran in der mehr schichtigen Testvorrichtung zwischen den Trägerelementen 2, 3 und 4 platziert (2).
Eine unbehandelte Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 0,4 μm (Corning Costar, Cambridge, MA) wurde in ein Quadrat von 1 cm geschnitten und an den Boden des Kunststoffträgerelements 4 befestigt, wodurch die 3/16''-Öffnung bedeckt wurde.
Signalerzeugender Teil der Fruktosamin-Testvorrichtung
Pufferschicht-Kissen: Schleicher und Schuell Papier Typ 589 (Keene, N.H.) wurde für 1 Minute in eine 1 molare Lösung Guanidiniumcarbonatpuffer (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mit einem pH von 11,5 gelegt, der 1% Pluronic (Pragmatics, Inc., Elkhart, IN) enthielt. Überschüssige Lösung wurde entfernt, und das Papier wurde durch Erhitzen bei 60°C für 30 Minuten getrocknet. Nach dem Trocknen wurde das Papier für die Pufferschicht in einem Exsikkator aufbewahrt. Bei Benutzung wurde ein 3/16''-Kreis des Pufferpapiers in das Kunstoff-Trägerelement 5 plaziert (2).
Indikatorschicht-Kissen: Ahlstrom A131 Glasfiber (Ahlstrom Filtration, Inc. Mt, Holly Spring, PA) wurde für 1 Minute in eine wässrige Lösung aus 5 mM Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gelegt. Überschüssiges NBT wurde entfernt, und das Glasfiber wurde durch Erhitzen bei 60°C für 30 Minuten getrocknet. Nach dem Trocknen wurde die Glasfiber im Dunkeln aufbewahrt. Bei Benutzung wurde ein 3/16''-Kreis der Glasfiber auf das Kunstoff-Trägerelement 5 plaziert.
Trägerelemente
Fünf weiße, im wesentlichen planare Polystyrolstreifen (LXN Corp., Irvine, CA) wurden benutzt. Der Bodenstreifen 5 hatte eine Öffnung mit einem Durchmesser von 3/16'' mit einem 1 mm × 7 mm großen Spalt, der von einem 0,002 Inch dicken Poylethylenfenster abgedeckt war, welches am Boden des Streifens befestigt war. Die mittleren drei Streifen 2, 3 und 4 hatten Öffnungen mit einem Durchmesser von 3/16 Inch und ein Klebmittel auf der Unterseite jedes Streifens. Der obere Streifen 1 hatte eine Öffnung mit einem Durchmesser von 1/8 Inch und ein Klebmittel auf der Unterseite des Streifens.
Zusammenbau der mehrschichtigen Fruktosamin-Testvorrichtung
Der Bluttrennungsteil der Testvorrichtung und der signalerzeugende Teil der Vorrichtung wurden zusammengebaut, wie es in 2 gezeigt ist. Die Netzschicht wurde innerhalb der drei zusammengeklebten Kunststoffträger auf die fünf mit Lektin imprägnierten Cytosep^®-Schichten gelegt. Der Kunststoffträger mit dem Loch von 1/8 Inch wurde auf die drei zusammengeklebten Kunststoffträger gelegt, welche die Netzschicht und die Cytosep^®-Schichten enthielten. Ein 1 cm-Quadrat aus Polycarbonat wurde an die Unterseite der drei zusammengeklebten Kunststoffträger befestigt.
Ein Pufferschicht-Kissen wurde in der Öffnung des unteren Kunststoffträgerelements auf ein NBT-Indikatorschicht-Kissen gelegt, und es wurde gegen das am Boden dieses Kunststoffträgerelements befestigten Fensters gedrückt. Das Kunststoffträgerelement, das die Pufferschicht und die Indikatorschicht enthielt, wurde an das Bluttrennungschichtteil befestigt, wobei das Kissen der Pufferschicht auf der Polycarbonatmembran lag und mit dem Klebmittel an der Unterseite des Kunststoffträgerelements 4 befestigt war.
Analyse von Fruktosamin in einer Vollblutprobe
Glykiertes humanes Serumalbumin (G-HSA) wurde hergestellt, indem 3 g HSA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 20 ml PBS, das 0,5 molare Glucose enthielt, bei 45°C für 14 Tage inkubiert wurde. Das G-HSA wurde durch Elution über eine Bio-Gel P-10-Säule in PBS von nicht umgesetzter Glucose getrennt.
Vollblutproben von einem einzelnen Patienten wurden mit einem gleichen Volumen von PBS oder einer G-HSA-Probe mit 6 mM Fruktosamin gemischt. Da die Vollblutprobe selbst 2 mM Fruktosamin enthielt, wiesen die drei Proben 1, 2 oder 4 mM Fruktosamin auf. Fünfzehn (15) Mikroliter von jeder Probe wurden mit der oben beschriebenen mehrschichtigen Fruktosamin-Testvorrichtung untersucht. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Testvorrichtung in den oben beschriebenen glykämischen Messapparat eingeführt, und die Reflexion bei 555 nm wurde für 3 Minuten aufgezeichnet. Die Änderung in der Reflexion (ΔK/S) von 2 auf 3 Minuten ergab die folgenden Ergebnisse:
Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, erhöhte sich die Reaktionsrate mit zunehmender Fruktosaminkonzentration in der Blutprobe.
BEISPIEL II
Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und die Untersuchung eines schnellen Glucosetests mit einer Vollblutprobe.
Herstellung von Glucose-Teststreifen
Ein Blatt der 0,8 Micron Supor^® Membran (Gelman Science, Ann Arbor, MI) wurde in eine Lösung mit folgender Zusammensetzung getaucht:

Gelatine-150 Bloom 0,5 g

Glucose-Oxidase 0,285 g

Meerrettichperoxidase 0,133 g

Zitronensäure 0,593 g

Natriumcitrat 2,61 g

Destilliertes Wasser 32 ml
Nach dem Eintauchen wurde das Blatt in einem Ofen bei 56°C für 20 Minuten getrocknet. Das Blatt wurde dann in eine Lösung folgender Zusammensetzung getaucht:

Isopropylalkohol 39,5 ml

3,5,3',5'-Tetramethylbenzidin 0,2 g

ortho-Tolidin 0,2 g

Pluronic L64 (20%) 0,5 ml
Nach dem Eintauchen wurde das Blatt bei 56°C für weitere 20 Minuten getrocknet. 3a zeigt die Konstruktion einer Glucose-Testvorrichtung 19. Die oben beschriebene Glucose-Testmembran 18 wurde in 1 cm Quadrate geschnitten und mit Klebmittel 17 an einen Kunststoffhalter 16 mit einem 5 mm-Loch 20 und einer dreieckige Einkerbung 19 befestigt. Blutproben wurden auf das 5 mm Loch 20 aufgebracht. Die Proben befeuchteten die Membran und reagierten unter Farbbildung, die der Glucose in der Blutprobe entsprach.
Analyse von Glucose in Blutproben
Unterschiedliche Konzentration an Glucose wurden zu einer Blutprobe gegeben. Ein Tropfen jeder Probe wurde auf einen Glucose-Teststreifen aufgebracht, und die Reflexion (ΔK/S) wurde wie oben beschrieben in einem glykämischen Meßapparat nach 45 Sekunden gemessen. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Die Daten zeigen, daß die erzeugte Farbe proportional zur Glucosekonzentration in der Blutprobe war.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf die offenbarten Ausführungsformen beschrieben wurde, wird der Fachmann problemlos erkennen, daß die Erfindung durch die dargestellten, spezifischen Beispiele nur veranschaulicht wird.

Claims

Testsystem zur Bestimmung des integrierten glykämischen Zustands eines Subjekts, umfassend: (a) eine erste Testvorrichtung (32, 37), die ein erstes signalerzeugendes System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von Glucose, welche in einer Körperflüssigkeitsprobe des Subjekts vorhanden ist, mitzuteilen; (b) eine zweite Testvorrichtung (31, 36), die ein zweites signalerzeugendes System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von proteingebundener Glucose, welche in einer Körperflüssigkeitsprobe des Subjekts vorhanden ist, mitzuteilen; und (c) einen Apparat (21, 22, 23, 24, 25) mit einem automatischen Mittel zur Bestimmung der Konzentration von Glucose, das auf ein Signal anspricht, welches von der ersten Testvorrichtung erzeugt wird, welche die Konzentration von Glucose mitteilt, die in einer Körperflüssigkeitsprobe vorhanden ist, und mit einem automatischen Mittel zur Bestimmung der Konzentration von proteingebundener Glucose, das auf ein Signal anspricht, welches von der zweiten Testvorrichtung erzeugt wird, welche die Konzentration von proteingebundener Glucose mitteilt, die in einer Körperflüssigkeitsprobe vorhanden ist.
Testsystem nach Anspruch 1, bei dem der Apparat eine Aufnahmeöffnung aufweist, die in der Lage ist, die erste Testvorrichtung aufzunehmen, und bei dem das automatische Mittel zur Bestimmung der Konzentration von Glucose mit der Aufnahmeöffnung gekoppelt ist, und bei dem der Apparat ferner ein Anzeigemittel aufweist, das mit dem automatischen Mittel zur Bestimmung gekoppelt ist.
Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das erste signalerzeugende System, das in der Lage ist, die Konzentration von Glucose in einer Körperflüssigkeitsprobe mitzuteilen, Reagenzien zur Erzeugung einer Glucoseoxidase-Enzymreaktion umfasst.
Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 3, bei dem das automatische Mittel zur Bestimmung der Konzentration von Glucose, das auf das Signal anspricht, welches von der ersten Testvorrichtung erzeugt wird, ein elektrochemischer Sensor ist.
Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 4, bei dem der Apparat eine Aufnahmeöffnung aufweist, die in der Lage ist, die zweite Testvorrichtung aufzunehmen, und bei dem das automatische Mittel zur Bestimmung der Konzentration von proteingebundener Glucose mit der Aufnahmeöffnung gekoppelt ist, und bei dem der Apparat ferner ein Anzeigemittel aufweist, das mit dem automatischen Mittel zur Bestimmung gekoppelt ist.
Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 5, bei dem das automatische Mittel zur Bestimmung ein Spektrophotometer ist.
Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 6, bei dem das Spektrophotometer in der Lage ist, eines der nachfolgenden Dinge zu messen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Reflexion, Fluoreszenz, Absorption und Transmission.
Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 7, bei dem die proteingebundene Glucose Fructosamin ist, und bei dem die zweite Testvorrichtung, welche das zweite signalerzeugende System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von Fructosamin mitzuteilen, folgendes umfasst: (a) eine flüssigkeitspermeable Pufferschicht, die einen Puffer mit einem pH-Wert von mindestens 9 aufweist; (b) eine Indikatorschicht, die einen Indikator umfasst, der in der Lage ist, von Fructosamin reduziert zu werden; und (c) ein Trägerelement, das wahlweise eine Detektionsöffnung aufweist, wobei die Pufferschicht an die Indikatorschicht grenzt, und wobei die Pufferschicht und die Indikatorschicht durch das Trägerelement gestützt sind.
Testsystem nach Anspruch 8, bei dem die zweite Testvorrichtung, die das zweite signalerzeugende System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von Fructosamin mitzuteilen, ferner eine oder mehrere zusätzliche Schichten in Fluidkontakt mit der Pufferschicht umfasst.
Testsystem nach Anspruch 9, bei dem die zusätzlichen Schichten ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einer Blutzellentrennschicht, einer Strahlungsblockierungsschicht, einer Interferenzentfernungsschicht, einer die Kontamination verhindernden Schicht, einer Dialyseschicht, einer filtrierenden Schicht und einer Trägerschicht.
Testsystem nach Anspruch 10, bei dem die zusätzliche Schicht ein zusätzliches Trägerelement mit einer Probenöffnung ist, und bei dem die Pufferschicht und die Indikatorschicht zwischen den Trägerelementen angeordnet sind.
Testsystem nach Anspruch 11, bei dem die Pufferschicht über der Farbstoffschicht angeordnet ist.
Testsystem nach Anspruch 8, bei dem die Pufferschicht und die Farbstoffschicht aneinandergrenzen.
Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 7, bei dem die proteingebundene Glucose Fructosamin ist, und bei dem die zweite Testvorrichtung, die das signalerzeugende System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von Fructosamin mitzuteilen, folgendes umfasst: (a) ein erstes im wesentlichen planares Trägerelement aus Kunststoff mit einer Probenöffnung; (b) ein zweites im wesentliches planares Trägerelement aus Kunststoff mit einer Detektionsöffnung; (c) eine Vollblut-Trennschicht; (d) eine flüssigkeitspermeable Pufferschicht, die einen Puffer mit einem pH-Wert von zwischen etwa 10 und etwa 12 umfasst; und (e) eine Indikatorschicht, die einen Nitroblautetrazolium-Farbstoff aufweist, wobei die Trennschicht über der Pufferschicht angeordnet ist, und die Pufferschicht über der Indikatorschicht angeordnet ist, und wobei die Abtrennschicht, die Pufferschicht und die Indikatorschicht zwischen dem ersten Träger element und dem zweiten Trägerelement angeordnet sind, wobei alle in Fluidkontakt mit der angrenzenden Schicht stehen.
Verfahren zur Bestimmung des integrierten glykämischen Zustands in einer Körperflüssigkeitsprobe eines Subjekts durch Verwendung eines Testsystems nach den Ansprüchen 1 bis 14, Schritte umfassend, bei denen man: (a) eine Körperflüssigkeitsprobe auf die erste Testvorrichtung aufträgt, die das erste signalerzeugende System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von Glucose in der Körperflüssigkeitsprobe mitzuteilen; (b) eine Körperflüssigkeitsprobe auf die zweite Testvorrichtung aufträgt, die das zweite signalerzeugende System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von proteingebundener Glucose mitzuteilen, welche in der Körperflüssigkeitsprobe vorhanden ist; (c) in beliebiger Reihenfolge die Konzentration von Glucose und die Konzentration von proteingebundener Glucose in der Körperflüssigkeitsprobe bestimmt; wobei die Konzentration von Glucose indikativ für den unmittelbaren glykämischen Zustand ist, und die Konzentration der proteingebundenen Glucose indikativ für den mittelfristigen oder langfristigen glykämischen Zustand ist.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Körperflüssigkeitsprobe eine unbearbeitete Körperflüssigkeitsprobe ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 15 oder 16, bei dem die proteingebundene Glucose Fructosamin ist, das auf den mittelfristigen glykämischen Zustand hinweist.
Verfahren nach den Ansprüchen 15 oder 16, bei dem die proteingebundene Glucose ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem gesamten glykierten Hämoglobin und Hämoglobin A_IC (HbA_IC), von denen jedes auf den langfristigen glykämischen Zustand hinweist.
Verfahren nach den Ansprüchen 15 oder 16, bei dem die proteingebundene Glucose ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem gesamten glykierten Serumprotein und glykiertem Albumin, von denen jedes auf den mittelfristigen glykämischen Zustand hinweist.
Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 19, bei dem mehr als eine proteingebundene Glucose gemessen wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 16 bis 20, bei dem die unbearbeitete Körperflüssigkeitsprobe, die auf die erste Testvorrichtung aufgebracht wird, welche das erste signalerzeugende System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von Glucose mitzuteilen, und die unbearbeitete Körperflüssigkeitsprobe, die auf die zweite Testvorrichtung aufgebracht wird, welche das zweite signalerzeugende System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von proteingebundener Glucose mitzuteilen, Vollblut sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 16 bis 20, bei dem die unbearbeitete Körperflüssigkeitsprobe, die auf die erste Testvorrichtung aufgebracht wird, welche das erste signalerzeugende System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von Glucose mitzuteilen, und die unbearbeitete Körperflüssigkeitsprobe, die auf das zweite Testvorrichtung aufgetragen wird, welche das zweite signalerzeugende System umfasst, das in der Lage ist, die Konzentration von proteingebundener Glucose mitzuteilen, getrennte Körperflüssigkeitsproben sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 22, bei dem ein weiterer Analyt gemessen wird, der für den glykämischen Zustand indikativ ist, wobei dieser Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Ketonkörper, einem Fettsäurederivat und Mikroalbumin.
Verfahren nach Anspruch 23, bei dem der Ketonkörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Azeton, β-Hydroxybutyrat, Acetoacetat.
Verfahren zur Diagnose von Diabetes in einem Subjekt unter Verwendung des Testsystems nach den Ansprüchen 1 bis 14, das aus Schritten besteht, bei denen man: (a) die Konzentration der Glucose und der proteingebundenen Glucose in einer Körperflüssigkeit mittels eines Verfahrens nach den Ansprüchen 15-24 mißt; (b) die gemessene Konzentration von Glucose und die gemessene Konzentration von proteingebundener Glucose mit dem Konzentrationsspiegel von Glucose und dem Konzentrationsspiegel von proteingebundener Glucose eines normalen Subjekts vergleicht, wobei erhöhte Konzentrationen von Glucose und proteingebundener Glucose oberhalb der Spiegel eines normalen Subjekts diagnostisch für Diabetes sind.