DE69636813T2

DE69636813T2 - Heparine-proteine kovalente Konjugate, die eine Alpha-Carbonyl-Amin enthalten und Verfahren für deren Produktion

Info

Publication number: DE69636813T2
Application number: DE69636813T
Authority: DE
Inventors: Leslie Burlington BERRY; Maureen Oakville ANDREW
Original assignee: McMaster University
Current assignee: McMaster University
Priority date: 1995-11-30
Filing date: 1996-11-29
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2016-11-30
Also published as: JP4166275B2; CA2237159C; WO1997019701A2; AU7688396A; US20030100487A1; EP0863768B1; CA2237159A1; ATE350066T1; JP2000501082A; US6562781B1; EP0863768A2; WO1997019701A3; DE69636813D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue chemische Verbindungen, die kovalente Konjugate von Glycosaminoglycanen, insbesondere von Heparinen, umfassen, und Verfahren zu deren Herstellung, deren pharmazeutische Zusammensetzungen und die therapeutischen Verwendungen davon.
2. Beschreibung der Hintergrundtechnik
Heparin ist ein sulfatiertes Polysaccharid, welches zu einem großen Teil aus einer alternierenden Sequenz von Hexuronsäure und 2-Amino-2-desoxy-D-glucose besteht. Heparin und eine verwandte Verbindung, das Dermatansulfat, sind von großer Bedeutung als Antikoagulantien für die klinische Verwendung bei der Vorbeugung von Thrombose und verwandten Erkrankungen. Sie sind Mitglieder der Familie der Glycosaminoglycane (GAGs), welche lineare Ketten von sulfatierten, sich wiederholenden Disaccharideinheiten, welche ein Hexosamin und eine Uronsäure enthalten, sind. Die Antikoagulation unter Verwendung von GAGs (wie z. B. Heparin und Dermatansulfat) verläuft über deren Katalyse der Hemmung der Koagulationsenzyme (von denen Thrombin das wesentliche ist) durch Serinproteaseinhibitoren (Serpine), wie z. B. Antithrombin III (ATIII) und Heparin-Cofaktor II (HCII). Die Bindung der Serpine durch die Katalysatoren ist wesentlich für deren Wirkung und tritt über spezifische Sequenzen entlang der linearen Kohlenhydratkette des Glycosaminoglycans (GAGs) auf. Heparin wirkt durch Bindung an ATIII über eine Pentasaccharidsequenz, wodurch die Hemmung einer Vielzahl von Koagulationsenzymen potenziert wird (im Falle von Thrombin muß Heparin auch an das Enzym binden). Heparin kann auch die Hemmung von Thrombin potenzieren, indem es an das Serpin HCII bindet. Dermatansulfat wirkt, indem es spezifisch an HCII über eine Hexasaccharidsequenz bindet, wodurch lediglich die Hemmung von Thrombin potenziert wird. Da Glycosaminoglycane (insbesondere Heparin) in vivo an andere Moleküle binden können oder von der Wirkungsstelle aufgrund einer Reihe von Mechanismen verlorengehen können, wäre es vorteilhaft, GAG über eine kovalente Bindung dauerhaft in Assoziation mit dem Serpin zu halten.
Kovalente Komplexe zwischen ATIII und Heparin wurden schon zuvor hergestellt, siehe z. B. Bjork et al., (1982) FEBS Letters 143(1):96–100, und von Collen et al., US-Patent Nr. 4,623,718. Diese Konjugate erfordern kovalente Modifikationen des Heparins, bevor es konjugiert wird. Das Produkt von Bjork et al. (hergestellt durch Reduktion der Schiff-Base zwischen dem Aldehyd eines 2,5-D-Anhydromannoseterminus von Heparin, hergestellt durch partiale Depolymerisierung von Heparin zu Heparinfragmenten mit salpetriger Säure, und einer Lysyl-Aminogruppe von ATIII) wies keine nachweisbare Antithrombin-Aktivität auf. Das Produkt von Collen et al. (hergestellt durch Konjugation von Carboxylgruppen innerhalb der Kette des Heparinmoleküls und von Lysyl-Aminogruppen von ATIII über Aminohexyltolyl-Spacer-Arme) wies eine zufällige Verknüpfung der Uronsäuren des Heparinrests mit den Carboxylgruppen auf, was die ATIII-Bindesequenz beeinträchtigen könnte, und tatsächlich war die spezifische Anti-Xa-(eine Koagulationsprotease, die Prothrombin zu Thrombin aktiviert) Aktivität ungefähr 65% des nicht-kovalent verknüpften nicht-modifizierten Ausgangsheparins (J. Biol. Chem. 257:3401–3408 (1982)). Die spezifische Antithrombinaktivität wäre daher ebenfalls 65% oder weniger, da sowohl Xa als auch Thrombin es erfordern, daß Heparin an ATIII bindet. Die Geschwindigkeitskonstante der bimolekularen Reaktion des Produkts von Collen et al. für die Hemmung von Thrombin sollte vergleichbar zu derjenigen des nicht-kovalenten Gemisches von mit ATIII gesättigtem Heparin sein (J. Biol. Chem. 259:5670–5677 (1984)). Allerdings wurde ein großer molarer Überschuß von Heparin oder von kovalentem Komplex gegenüber Thrombin (>10:1) verwendet, um die Kinetik zu vereinfachen, was den Effekt jeder Subpopulation von Molekülen mit geringer Aktivität maskieren würde. Die spezifischen Antithrombinaktivitäten wurden nicht angegeben.
Außerdem wurde Heparin auch mit anderen Proteinen kovalent konjugiert (wie z. B. mit dem Gewebeplasminogenaktivator und mit Erythropoietin) von Halluin (US-Patent Nr. 5,308,617), unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens zu dem von Bjork et al. Diese Konjugate litten unter den gleichen Problemen, die mit dem Verlust an Heparinaktivität assoziiert waren, wie bei den Bjork-Konjugaten. Die Kopplung von Heparin zu Affinitätsträgern über eine Hydrazinverknüpfung wird in der WO 95/05400 berichtet. Allerdings ist die Hydrazongruppe im allgemeinen nicht bei Proteinen und anderen Makromolekülen zu finden, und dessen Inkorporation führt häufig zu einer Abnahme der biologischen Aktivität. Das US-Patent Nr. 4,213,962 beschreibt Heparin und Antithrombin III, welche auf mit Cyanbromid aktivierter Agarose co-immobilisiert sind. Die US-Patente mit den Nummern 5,280,016 und 4,990,502 beschreiben die Oxidation von Heparin mit Periodat und die Reduktion des auf diese Weise erzeugten Aldehyds.
Es wäre daher wünschenswert, kovalente Konjugate von Heparin und verwandten Glycosaminoglycanen bereitzustellen, die die maximale biologische Aktivität (z. B. Antikoagulationsaktivität) behalten und verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen sowie einfache Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung erfüllt diese und andere Bedürfnisse.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt ein kovalentes Konjugat bereit, welches ein Glycosaminoglycan umfaßt, welches mit einem Protein über eine kovalente Verknüpfung verknüpft ist, wobei das Protein wenigstens eine primäre Aminogruppe aufweist, wobei das Protein über dessen Aminogruppe mit einem terminalen Aldoserest des Glycosaminoglycans unmittelbar kovalent verknüpft ist.
Die kovalente Verknüpfung umfaßt ein α-Carbonylamin, das durch anschließende Amadori-Umlagerung eines Imins (>C=N-), welches zwischen der Aminogruppe der ersten Spezies und dem C1 der terminalen Aldose ausgebildet wird, gebildet wird. Das Glycosaminoglycan ist vorzugsweise Heparin. Die Amin-enthaltende Spezies ist ein Protein, wie z. B. Antithrombin III oder Heparin-Cofaktor II.
Die Erfindung stellt weiterhin neuartige und milde Verfahren zur Herstellung der obigen kovalenten Konjugate bereit, die zu Konjugaten mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften und verbesserter biologischer Aktivität führen. Die Verfahren umfassen das Inkubieren der Glycosaminoglycane mit dem Amin-enthaltenden Protein unter Bedingungen, die eine Iminbildung zwischen dem terminalen Aldoserest des Glycosaminoglycans und dem Amin ermöglichen. Das Imin läßt man unter milden Bedingungen (Amadori-Umlagerung) sich in ein α-Carbonylamin umlagern. Die Erfindung stellt weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die diese Konjugate umfassen, sowie therapeutische Verwendungen davon.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Verringerung der Thrombenbildungsneigung eines Materials, wie z. B. eines synthetischen Polymers, bereit, indem das Material mit den kovalenten Konjugaten der Erfindung beschichtet wird, insbesondere mit dem Heparin-Antithrombin-III-Konjugat. Die nach diesem Verfahren behandelten Materialien sind geeignet als medizinische oder prothetische Vorrichtungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 vergleicht die Hemmung der Thrombinaktivität von Antithrombin III, nicht-kovalenten Antithrombin-III-Heparin-Komplexen und verschiedenen Konzentrationen der kovalenten Antithrombin-III-Heparin-(ADH)-Konjugate der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt die Hemmung der Fähigkeit des Thrombins, humanes Fibrinogen zu koagulieren, durch die kovalenten Antithrombin-III-Heparin-Konjugate (ATH1) der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt die Wirkung von zugegebenem Heparin auf die Rate der Hemmung von Thrombin durch die Antithrombin-III-Heparin-Konjugate der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt die Rate der Hemmung der Thrombinaktivität gegenüber dem Farbreagenz S-2238 durch die Antithrombin-III-Heparin-Konjugate der vorliegenden Erfindung.
5 zeigt die Hemmung der Antithrombin-Wirkung der kovalenten ATH-Konjugate der vorliegenden Erfindung durch FPR-Thrombin.
6 zeigt die Plasma-Clearance der kovalenten ATH-Konjugate der vorliegenden Erfindung und von Heparin in Kaninchen nach intravenöser Injektion.
7 zeigt die Plasmakonzentrationen der kovalenten ATH-Konjugate der vorliegenden Erfindung in Kaninchen nach subkutaner Injektion.
8 zeigt die Plasmakonzentrationen der kovalenten ATH-Konjugate der vorliegenden Erfindung und von Heparin in Kaninchen nach subkutaner Injektion.
9 zeigt die AT-Bindung an 100nM SH oder ATH.
10 zeigt die Aktivität von ATH und AT + SH bei der Hemmung von Thrombin.
11 zeigt die nicht-katalytischen [☐----☐] und katalytischen [O----O] Aktivitäten in ATH nach der Chromatographie über Sephadex G200.
12 zeigt die Pharmakokinetik von ATH nach intravenöser Injektion, gemessen anhand der Anti-Faktor-Xa-Aktivität.
13 zeigt die Pharmakokinetik von ATH nach intravenöser Injektion gemessen durch ELISA von Plasma-AT.
14 zeigt die Pharmakokinetik von ATH nach subkutaner Injektion.
15 zeigt die Anti-Faktor-Xa-Aktivitäten von BAL nach intratrachealer Instillation von ATH.
16 zeigt den kumulativen Blutverlust nach Behandlung in einem Blutendes-Ohr-Modell am Kaninchen.
17 zeigt den kumulativen Blutverlust nach Behandlung in einem Blutendes-Ohr-Modell am Kaninchen (wobei die abweichenden Werte entfernt wurden).
18 zeigt die Plasma-Anti-Faktor-Xa-Aktivität in einem Blutendes-Ohr-Modell am Kaninchen.
19 zeigt die Veränderung des Gerinnselgewichts für verschiedene Behandlungsgruppen in einem Venöse-Thrombose-Modell am Kaninchen.
20 zeigt die Plasma-Anti-Faktor-Xa-Aktivität in einem Venöse-Thrombose-Modell am Kaninchen.
21 zeigt die Gerinnselgewichte, wenn ATH-aufpolymerisierte, Hirudin-aufpolymerisierte und unbehandelte Polyurethan-Leitungen in einem Kaninchen-Perfusionsmodell verwendet werden.
22 zeigt die Gerinnselgewichte, wenn ATH-aufpolymerisierte, AT-aufpolymerisierte und unbehandelte Polyurethan-Leitungen in einem Kaninchen-Perfusions-Modell verwendet werden.
23 zeigt die luminale Oberfläche von mit ATH behandelten und von unbehandelten Leitungen, nachdem diese für 3 Stunden in Kaninchen dem Blut ausgesetzt waren.
24 zeigt Protein-Fluroeszenz-Scans von AT, AT + SH und ATH.
25 zeigt die SH-Bindung an 100 nM AT oder ATH.
26 zeigt die AT-Bindung an 100nM SH oder ATH.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Diese Erfindung stellt neuartige kovalente Konjugate von Glycosaminoglycanen bereit, die an deren terminalem Aldoserest mit Molekülen, die primäres Amin enthalten, markiert sind. Insbesondere stellt die Erfindung neuartige kovalente Konjugate von Heparin (Merck Index, 1980) und Fragementen davon mit therapeutisch signifikanten Serinproteaseinhibitoren, wie z. B. Antithrombin III und Heparin-Cofaktor-II, bereit, sowie therapeutische Verwendungen davon und Verfahren zu deren Herstellung. Die neuartigen Heparinkonjugate dieser Erfindung werden unter milden Bedingungen hergestellt, sie behalten eine maximale Antikoagulationsaktivität im Vergleich zu intaktem Heparin und sie haben verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften.
Bevor die Erfindung etwas ausführlicher beschrieben wird, werden die folgenden Definitionen angegeben, um die Bedeutung und den Umfang der Begriffe, die verwendet werden, um die Erfindung hierin zu beschreiben, beispielhaft zu erläutern und zu definieren.
Der Begriff "Hexose" bezeichnet einen Kohlenwasserstoff (C₆H₁₂O₆) mit sechs Kohlenstoffatomen. Hexosen können Aldohexosen sein, wie z. B. Glucose, Mannose, Galactose, Idose, Gulo se, Talose, Allose und Altrose, deren offene Kettenform eine Aldehydgruppe enthält. Alternativ können die Hexosen Ketosen sein, wie z. B. Fruktose, Sorbose, Allulose und Tagatose, deren offene Kettenform eine Ketongruppe enthält.
Der Begriff "Uronsäure" bezeichnet die Karbonsäure, die durch Oxidation der primären Hydroxylgruppe eines Kohlenwasserstoffs gebildet wird, und diese werden typischerweise nach dem Kohlenwasserstoff, von dem sie abgeleitet sind, benannt. Demnach gibt die Oxidation der Hydroxylgruppe am C6 von Glucose Glucuronsäure, die Oxidation der Hydroxylgruppe am C6 von Galactose ergibt Galacturonsäure und die Oxidation der Hydroxylgruppe am C6 von Idose ergibt Iduronsäure.
Der Begriff "Hexosamine" bezeichnet ein Hexosederivat, bei dem wenigstens eine Hydroxygruppe, typischerweise die C2-Hydroxygruppe, durch ein Amin ersetzt worden ist. Das Amin kann wahlweise alkyliert, acyliert (z. B. mit Muraminsäure), typischerweise durch eine Acetylgruppe, sulfoniert (O- oder N-sulfatiert), sulfonyliert, phosphoryliert, phosphonyliert und dergleichen sein. Die repräsentativen Beispiele von Hexosaminen umfassen Glucosamin, Galactosamin, Tagatosamin, Fructosamin, deren modifizierte Analoga und dergleichen.
Der Begriff "Glycosaminoglycan" bezeichnet die linearen Ketten von zu einem großen Teil sich wiederholenden Disaccharideinheiten, die ein Hexosamin und eine Uronsäure enthalten. Die exakte Identität des Hexosamins und der Uronsäure kann breit variieren, und die repräsentativen Beispiele sind jeweils in den Definitionen oben bereitgestellt. Die Disaccharide können wahlweise modifiziert sein durch Alkylierung, Acylierung, Sulfonierung (O- oder N-sulfatiert), Sulfonylierung, Phosphorylierung, Phosphonylierung und dergleichen. Der Grad einer solchen Modifikation kann variieren und kann an einer Hydroxygruppe oder an einer Aminogruppe erfolgen. Am üblichsten werden die Hydroxylgruppe am C6 und die Amingruppe am C2 sulfatiert. Die Länge der Kette kann variieren und das Glycosaminoglycan kann ein Molekulargewicht von größer als 200.000 Dalton, typischerweise bis zu 100.000 Dalton und noch typischer weniger als 50.000 Dalton, aufweisen. Die Glycosaminoglycane werden typischerweise als Mucopolysaccharide gefunden. Die repräsentativen Beispiele umfassen Heparin, Dermatansulfat, Heparansulfat, Chondroitin-6-Sulfat, Chondroitin-4-Sulfat, Keratansulfat, Chondroitin, Hyaluronsäure, Polymere, die N-Acetyl-Monosaccharide enthalten (wie z. B. N-Acetylneuraminsäure, N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin und N-Acetylmuraminsäure) und dergleichen und Gummi, wie z. B. Gummi arabicum, Gummi tragacanthum, und dergleichen. Siehe Heinegard, D. und Sommarin Y. (1987) Methods in Enzymology 144:319–373.
Der Begriff "unmittelbar kovalent verknüpft" bezeichnet eine kovalente Verknüpfung zwischen zwei Spezies, die ohne die Verwendung eines intermediären Spacers oder von Verknüpfungseinheiten erreicht wird. Wenn demnach von einem ersten Molekül gesagt wird, daß es direkt kovalent mit einem terminalen Aldoserest eines Glycosaminoglycans über eine Aminogruppe an dem ersten Molekül verknüpft ist, bedeutet dies, daß das Stickstoffatom des ersten Moleküls unmittelbar an ein Atom des terminalen Aldoserests gebunden ist. Diese Bindung wird eine kovalente Bindung sein und kann eine Einzel-, Doppel- oder Dreifachbindung sein. Der Fachmann wird daher verstehen, daß Heparinkonjugate, die mit einem anderen Molekül durch die initiale Anheftung von Spacer-Gruppen, wie z. B. Polymethylen-Diamino-Linker, an das Heparinmolekül verknüpft sind, von dieser Erfindung nicht umfaßt sind.
Der Begriff "Protein" umfaßt ohne Beschränkung hierauf Albumine, Globuline (z. B. Immunoglobuline), Histone, Lectine, Protamine, Prolamine, Gluteline, Phospholipasen, antibiotische Proteine und Scleroproteine sowie konjugierte Proteine, wie z. B. Phosphoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Glycoproteine, Nucleoproteine.
Der Begriff "Serpin" bezeichnet einen Serinproteaseinhibitor, und als Beispiel hierfür dient eine Spezies wie z. B. Antithrombin III und Heparin-Cofaktor-II.
Der Begriff "Amin" bezeichnet sowohl primäre Amine, RNH₂, als auch sekundäre Amine RNH(R').
Der Begriff "Amino" bezeichnet die Gruppe >NH oder -NH₂.
Der Begriff "Imin" bezeichnet die Gruppe >C=N- und Salze davon.
Die Begriffe "Behandlung" oder "behandeln" eines Zustands und/oder einer Erkrankung in einem Säugetier werden hier so verwendet, daß sie bedeuten:

(i) Vorbeugung des Zustands oder der Erkrankung, d.h. Vermeidung jedes klinischen Symptoms der Erkrankung,
(ii) Hemmung des Zustands oder der Erkrankung, d.h. Aufhalten der Entwicklung oder des Fortschreitens der klinischen Symptome, und/oder
(iii) Lindern des Zustands oder der Erkrankung, d.h. Bewirkung des Rückgangs der klinischen Symptome.

Der Begriff "im wesentlichen rein" bedeutet in seiner Verwendung hierin, daß eine betrachtete Spezies die überwiegende Spezies ist, die vorliegt (d.h. auf einer molaren Basis ist diese häufiger als jede andere individuelle Spezies in der Zusammensetzung), und vorzugsweise ist eine im wesentlichen aufgereinigte Fraktion eine Zusammensetzung, bei der die betrachtete Spezies wenigstens etwa 50% (auf einer molaren Basis) aller vorliegenden makromolekularen Spezies umfaßt. Im allgemeinen wird eine im wesentlichen reine Zusammensetzung mehr als etwa 80 bis 90% aller makromolekularen Spezies, die in der Zusammensetzung vorliegen, umfassen. Noch bevorzugter ist die betrachtete Spezies bis im wesentlichen zur Homogenität aufgereinigt (kontaminierende Spezies können in der Zusammensetzung mit herkömmlichen Detektionsverfahren nicht festgestellt werden), wobei die Zusammensetzung im wesentlichen aus einer einzigen makromolekularen Spezies besteht.
Die Zustände und Erkrankungen, die bei der vorliegenden Erfindung behandelt werden, umfassen den Myokardinfarkt und einen breiten Bereich an thrombotischen Zuständen. Diese umfassen die Fibrinabscheidung, die zu finden ist bei dem Atemnotsyndrom von Neugeborenen, dem Atemnotsyndrom von Erwachsenen, dem Primärkarzinom der Lunge, dem non-Hodgkins-Lymphom, der fibrosierenden Alveolitis und bei Lungentransplantaten. Die vorliegende Erfindung kann außerdem entweder erworbene AT-III-Mangelzustände, wie z. B. das Atemnotsyndrom von Neugeborenen, die L-Asparaginase-induzierte Defizienz, die Herz-Lungen-Umgehungs-induzierte Defizienz und die Sepsis behandeln oder angeborene AT-III-Mangelzustände. Im Falle der angeborenen AT- III-Defizienz können lebensbedrohliche thrombotische Komplikationen mit AT-III-Niveaus von weniger als 0,25 Einheiten/ml bei Heterozygoten die ATIII plus Heparin benötigen, bei bis zu 1 oder 2 Kindern pro Jahr in den USA auftreten, wobei aus der Literatur nicht klar hervorgeht, ob jemals ein homozygot defizientes Kind den Zeitpunkt der Geburt überlebt hat.
Die weiteren Verwendungen der Erfindung umfassen die kovalente Beschichtung von GAGs auf Amin-enthaltende Oberflächen, wie z. B. zentralvenöse Leitungen, Herzkatheter, Herz-Lungen-Umgehungskreisläufe, Dialysekreisläufe oder andere mit externem Blut in Kontakt tretende Instrumente, sowie mechanische Ventile, Stents oder eine beliebige in-vivo-Prothese.
Die neuartigen Verbindungen dieser Erfindung werden hergestellt durch einen einfachen einstufigen Prozeß, der die direkte kovalente Verknüpfung der Amingruppe einer Amin-enthaltenden Einheit (wie z. B. ohne Beschränkung hierauf Amin-enthaltende Oligo-(Poly-)Saccharide, Amin-enthaltende Lipide, Proteine, Nukleinsäuren und jedes beliebige Xenobiotikum) mit einem terminalen Aldoserest eines Glycosaminoglycans bereitstellt. Vorzugsweise ist die Amin-enthaltende Einheit ein Protein, das die gewünschte biologische Aktivität aufweist. Das milde, nicht destruktive Verfahren, das hier bereitgestellt wird, erlaubt die maximale Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität des Proteins und ermöglicht die direkte Verknüpfung des Proteins ohne daß ein Bedürfnis nach intermediären Spacer-Gruppen besteht, wie aus dem folgenden hervorgeht:
Das Glycosaminoglycan, das konjugiert werden soll, wird mit der Amin-enthaltende Spezies bei einem pH-Wert inkubiert, der für die Iminbildung zwischen dem Amin und dem terminalen Aldose- oder Ketoserest des Glycosaminoglycans geeignet ist. Die terminalen Aldose- und Ketosereste stehen im allgemeinen im Gleichgewicht zwischen der zyklischen Hemiacetal- oder Hemiketalform mit geschlossenem Ring und den korrespondierenden Aldehyd- oder Ketonäquivalenten mit offenem Ring. Im allgemeinen sind die Amine in der Lage, mit der Form mit geöffnetem Ring zu reagieren, um so ein Imin (Schiff-Base) zu erzeugen. Typischerweise sind die Aldosen etwas reaktiver, da die korrespondierenden Aldehyde in der Form mit offenem Ring gegenüber den Aminen etwas reaktiver sind. Demnach stellt die kovalente Konjugatausbildung zwischen Aminen und terminalen Aldoseresten von Glycosaminoglycanen ein bevorzugtes Verfahren dar zur Anknüpfung einer Spezies, die eine Aminogruppe enthält, an ein Glycosaminoglycan.
Die Reaktion wird typischerweise bei einem pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 9, vorzugsweise bei etwa 5 bis etwa 8 und noch bevorzugter bei etwa 7 bis etwa 8, durchgeführt. Die Reaktion wird im allgemeinen in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Allerdings können auch organische Medien, insbesondere polare hydrophile organische Lösungsmittel, wie z. B. Alkohole, Ether und Formamide und dergleichen in Anteilen von bis zu etwa 40% eingesetzt werden, um die Löslichkeit der Reaktanten falls erforderlich zu erhöhen. Es können auch nicht-nukleophile Puffer, wie z. B. Phosphat, Acetat, Bicarbonat und dergleichen eingesetzt werden.
Das Imin wird über einen ausreichenden Zeitraum inkubiert, typischerweise über etwa 1 Tag bis 1 Monat, noch typischer etwa 3 Tage bis 2 Wochen, um die Amadori-Umlagerung des intermediären Imins zu ermöglichen. Die terminalen Aldosereste des Glycosaminoglycans, die nach den durch diese Verbindung bereitgestellten Verfahren konjugiert sind, besitzen häufig C2- Hydroxylgruppen an dem terminalen Aldoserest, d.h. eine 2-Hydroxycarbonyleinheit, die durch Kondensation mit dem Amin der Spezies, die mit dem Glycosaminoglycan konjugiert wird, in ein 2-Hydroxyimin umgewandelt wird. Bei der Amadori-Umlagerung, die insbesondere bei Kohlenwasserstoffen üblich ist, kann sich das α-Hydroxyimin (Imin am C1, Hydroxy am C2), welches sich durch die initiale Kondensation ausbildet, unter Ausbildung eines α-Ketoamins durch Enolisierung und Reprotonierung (Keto am C2, Amin am C1) umlagern. Das hieraus hervorgehende α-Carbonylamin ist thermodynamisch gegenüber dem Präcursor α-Hydroxyimin bevorzugt, wodurch ein stabiles Addukt mit minimaler Störung der Glycosaminoglycankette bereitgestellt wird. Demnach stellt die Erfindung bei dieser Ausführungsform ein Glycosaminoglycan bereit, das an dem C1 des terminalen Aldoserests des Glycosaminoglycans kovalent mit einer Amin-enthaltenden Spezies über eine Aminverknüpfung konjugiert ist. Falls gewünscht, kann das resultierende Konjugat reduziert werden oder markiert werden durch Reduktion der C2-Carbonylgruppe mit einem Markierungsreagens, wie z. B. einer Radiomarkierung (z. B. NaB₃H₄), siehe M.W.C. Hatton, L.R. Berry et al. (1980) Analytical Biochemistry 106:417–426, oder kann mit einer zweiten Amin-enthaltenden Spezies, wie z. B. einer Fluoreszenzmarkierung, konjugiert werden.
Eine Reihe von verschiedenen Proteinen (Antikörper, Enzyme, Rezeptoren, Wachstumsfaktoren und dergleichen) kann mit den Glycosaminoglycanen nach den hierin offenbarten Verfahren konjugiert werden. Demnach stellt die Erfindung kovalente Konjugate von Glycosaminoglycanen mit einer Reihe von Proteinen bereit. Wenn Proteine mit Glycosaminoglycanen konjugiert werden, wird im allgemeinen die Verknüpfung zwischen den ε-Aminogruppen der Lysinreste erfolgen. Alternativ kann die Verknüpfung auch über die N-terminale Aminogruppe unter Anwendung eines pH-Wertes, bei dem die ε-Aminogruppen protoniert sind, erreicht werden. Zusätzlich sind dem Fachmann viele Verfahren bekannt, um eine Amin-Funktionalität in ein Makromolekül einzuführen, siehe z. B. "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking" von S. Wong (CRC Press, 1991) und "The Organic Chemistry of Biological Compounds" von Robert Barker (Prentice-Hall, 1971).
Insbesondere kann die vorliegende Erfindung auf eine Reihe von anderen therapeutisch nützlichen Proteinen angewendet werden, bei denen eine längere Halbwertzeit und die Blutgerinnung als wesentliche Faktoren zu berücksichtigen sind. Diese umfassen Blutenzyme, Antikörper, Hormone und dergleichen sowie verwandte Plasminogenaktivatoren, wie z. B. Streptokinase und Derivate davon. Insbesondere stellt die Erfindung Konjugate von Heparin oder Dermatansulfat mit Antithrombin, Heparin-Cofaktor II oder Analoga von Heparin-Cofaktor II bereit, wie beschrieben in dem US-Patent Nr. 5,118,793.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen Glycosaminoglycankonjugate mit maximaler Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität bereit. Insbesondere werden Konjugate von Heparin oder Dermatansulfat mit entweder ATIII oder HCII bereitgestellt, die >60%, typischerweise >90%, noch typischer >95% und besonders typisch ≥ 98%, der Antithrombinaktivität von intaktem nicht-konjugiertem Heparin aufweisen. Diese Konjugate haben eine Geschwindigkeitskonstante der bimolekularen Reaktion für die Thrombinhemmung, die 5- bis 100-fach größer, im allgemeinen 8- bis 20- fach größer und typischerweise nahezu 10-fach größer als die der kovalenten Konjugate ist, die von Collen berichtet wurden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt intakte Heparinmoleküle bereit, die mit Antithrombin III oder Heparin-Cofaktor II konjugiert sind. Demnach wird der Verlust an biologischer Aktivität, der mit der Fragmentierung oder einer anderen Modifikation von Heparin vor dessen Konjugation einhergeht, vermieden. Es ist für den Fachmann klar, daß die Heparinkonjugate dieser Erfindung ihre Antikoagulationsaktivität behalten, da sie aus intaktem Heparin hergestellt werden.
Wie oben beschrieben, zieht die vorliegende Erfindung einen Vorteil aus der Tatsache, daß ursprüngliches (aus der Darmschleimhaut isoliertes) Heparin, genauso wie Dermatansulfat, bereits Moleküle mit Aldosetermini enthält, die in einem Gleichgewicht zwischen Hemiacetal- und Aldehydformen vorliegen, eine Tatsache, die offenbar auf dem Gebiet nicht erkannt und nicht entdeckt worden war. Daher haben wir Heparin oder Dermatansulfat mit Antithrombinserpinen durch Reduktion der einzigen Schiff-Base, die spontan zwischen dem Aldoseterminus Aldehyd am Heparin oder Dermatansulfat und einer Lysyl-Aminogruppe an dem Serpin ausgebildet wird, konjugiert. Das Heparin oder Dermatansulfat wird vor dessen Konjugation nicht modifiziert (keine Verringerung von dessen Aktivitäten) und wird an einer spezifischen Stelle an einem Ende des Moleküls verknüpft, ohne eine entblockte Aktivierungsgruppe oder Quervernetzung des Serpins. Heparin wurde kovalent mit ATIII oder HCII verknüpft, und Dermatansulfat wurde kovalent mit HCII verknüpft. Die Konjugation von anderen GAGs (wie z. B. Heparansulfat) mit Serpinen oder anderen Proteinen (wie z. B. Albumin) ist nach diesem Verfahren möglich. Zum Beispiel wurde Dermatansulfat mit Albumin unter Anwendung der hierein offenbarten Verfahren konjugiert.
Gemäß einem anderen Aspekt dieser Erfindung haben wir auch kovalente Komplexe hergestellt, indem wir einfach Heparin und ATIII in Puffer gemischt haben und es zugelassen haben, daß sich ein Keto-Amin spontan durch eine Amadori-Umlagerung zwischen dem Heparin-Aldose-Terminus und einer ATIII-Lysyl-Aminogruppe ausbildet. Demnach stellt diese Erfindung Verfahren zur Anwendung der Amadori-Umlagerung zum Herstellen von Konjugaten von Glycosaminoglycanen mit Proteinen bereit. Dieses ist ein besonders mildes und einfaches Verfahren der Konjugation, welches bisher auf dem Gebiet der Konjugation solcher Moleküle nicht bekannt war, und welches die Modifikation des Glycosaminoglycans minimiert, wodurch die Aufrechterhaltung von dessen biologischer Aktivität maximiert wird.
Ein anderer Aspekt dieser Erfindung stellt kovalente Konjugate von Glycosaminoglycanen, insbesondere von Heparin, bereit, die am Ende mit einem Amin-enthaltenden Protein an dem terminalen Aldose-Rest des Glycosaminoglycans markiert sind. Zum Beispiel werden Heparin und ATIII unmittelbar miteinander verknüpft, so daß die aktive Pentasaccharidsequenz für ATIII auf dem Heparin in unmittelbarer Nähe für die Bindung vorliegt. Dies ist einer der grundlegenden Gründe für die Herstellung eines kovalenten Heparin-ATIII-Komplexes, da Heparin die Hemmung durch ATIII nur dann beschleunigt, wenn ATIII die aktive Sequenz binden kann. Es ist bemerkenswert, daß ATH die einzigartige Eigenschaft aufweist, daß das H in dem Konjugat das endogene AT stöchiometrisch aktiviert, während es exogenes AT katalytisch aktiviert. Typischerweise wird ein Amin-enthaltendes Protein an jedes Glycosaminoglycan angeheftet. Es ist allerdings klar, daß das Verhältnis von Amin-enthaltender Spezies zu Glycosaminoglycan auf unter 1 verringert werden kann, indem man die molaren Verhältnisse der Reaktanten oder die Reaktionszeit entsprechend einstellt. Glycosaminoglycane sind in einer Reihe von Formen und mit einer Reihe von Molekulargewichten erhältlich. Zum Beispiel ist Heparin ein Mukopolysaccharid, das aus Schweinedarm oder Rinderlunge isoliert wird, und es ist im Hinblick auf die Molekülgröße und die chemische Struktur heterogen. Es besteht primär aus (1-4)verknüpftem 2-Amino-2-desoxy-α-D-glucopyranosyl und α-L-Idopyranosyluronsäureresten mit einem relativ kleinen Anteil an β-D-Glucopyranosyluronsäureresten. Es enthält Material mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 6.000 bis etwa 30.000. Die Hydroxyl- und Aminogruppen werden durch Sulfatierung und Acetylierung in verschiedenen Graden derivatisiert.
Die Heparinmoleküle können auch auf der Grundlage ihres Pentasaccharidgehaltes klassifiziert werden. Etwa ein Drittel des Heparins enthält Ketten mit einer Kopie des einzigartigen Pentasaccharids (siehe Choay, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 11:81–85 (1985), was durch Querverweis darauf hierin eingeschlossen ist) mit hoher Affinität für AT, wohingegen ein viel kleinerer Anteil (geschätzt etwa 1% des Gesamtheparins) aus Ketten besteht, die mehr als eine Kopie des Hoch-Affinitäts-Pentasaccharids enthalten (siehe Rosenberg et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 86:1319–1324 (1979), was durch Querverweis hierin eingeschlossen ist). Der Rest (etwa 66%) des Heparins enthält nicht das Pentasaccharid. Demnach besteht das sogenannte "Standardheparin" aus einem Gemisch der drei Spezies, Heparin mit "hoher Affinität" ist angereichert im Hinblick auf Spezies, die wenigstens eine Kopie des Pentasaccharids enthalten, und Heparin mit "sehr hoher Affinität" bezeichnet die ungefähr 1% der Moleküle, die mehr als eine Kopie des Pentasaccharids enthalten. Diese drei Spezies können voneinander getrennt werden, indem man chromatographische Routineverfahren anwendet, wie z. B. die Chromatographie über eine Antithrombin-Affinitätssäule (z. B. Sepharose-AT; siehe z. B. Lam et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 69:570–577 (1976) und Horner Biochem. J. 262:953–958 (1989).
Ein Vorteil der Bildung eines Konjugats zwischen Heparin und einer Spezies, die wenigstens eine primäre Aminogruppe enthält (z. B. ATIII) unter Verwendung des langsamen Glykierungsverfahrens, das hier offenbart wird, ist die apparente Selektion im Hinblick auf Heparinketten, die zwei Pentasaccharide aufweisen. Demnach scheint z. B. ATH, das nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, im Hinblick auf Heparinspezies, die zwei Pentasaccharide enthalten, angereichert zu sein. Wenn Standardheparin (enthaltend ungefähr 1% Heparin mit zwei Pentasacchariden) als ein Ausgangsmaterial verwendet wird, umfassen üblicherweise mehr als 10% des resultierenden ATH Heparin mit zwei Pentasacchariden, etwas häufiger enthalten mehr als etwa 20%, noch häufiger mehr als 35% und noch häufiger etwa 50% des ATH Heparin mit zwei Pentasacchariden.
Ohne durch einen bestimmten Mechanismus gebunden sein zu wollen, könnte eine Erklärung für die apparente Auswahl von Heparin mit sehr hoher Affinität darin bestehen, daß das Inkubationsgemisch einen 200-fachen molaren Überschuß an Heparin enthält. Während des Inkubationsprozesses binden nur Heparinketten, die Pentasaccharide mit hoher Affinität in der Nähe einer terminalen Aldose enthalten, an das AT über einen ausreichend langen Zeitraum, um das Auftreten einer kovalenten Anheftung zu ermöglichen. Demnach gibt es eine selektive Wechselwirkung zwischen AT und den Heparinketten mit sehr hoher Affinität.
Diese Anreicherung kann für mehrere nützliche Eigenschaften von AT verantwortlich sein. Das ATH der Erfindung aktiviert das AT, mit welchem es konjugiert ist, in einer stöchiometrischen Weise, aktiviert exogenes AT jedoch in einer katalytischen Weise. Demnach wirkt das Heparin in dem ATH-Komplex katalytisch, sowohl wenn ATH als systemisches Antikoagulans verabreicht wird als auch wenn ATH verwendet wird, um Oberflächen zu beschichten, um diese nicht-thrombogen zu machen. Das Verfahren der Erfindung erzeugt einen ATH-Komplex mit sehr hoher spezifischer Anti-Faktor-IIa-Aktivität. Zusätzlich kann die zweite Pentasaccharidkette in dem ATH-Komplex mit exogenen AT-Molekülen reagieren, wodurch es möglich wird, daß das konjugierte Heparin eine katalytische Aktivität aufweist. Darüber hinaus kann das Heparin in dem ATH-Komplex in einer solchen Weise angeordnet sein, daß das Pentasaccharid verfügbar ist, um zirkulierende AT-Moleküle zu binden und zu aktivieren, wenn der ATH-Komplex an die prothetische Oberfläche gebunden ist.
Es wird davon ausgegangen, daß das interessierende Heparinkonjugat (z. B. ATH) auch hergestellt werden kann durch Inkubieren eines Spezies, die wenigstens eine primäre Aminogruppe enthält (z. B. ATIII) mit aufgereinigtem Heparin mit hoher Affinität (d.h. 2 Pentasaccharid-Gruppen enthaltend) oder mit einer Fraktion, die im Hinblick auf Heparin mit sehr hoher Affinität angereichert ist.
Obwohl diese Erfindung primär im Hinblick auf Heparin beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß alle Glycosaminoglycane, ungeachtet deren Molekulargewicht und Derivatisierung, nach den hierin offenbarten Verfahren konjugiert werden können, vorausgesetzt, daß sie einen terminalen Aldoserest enthalten. Die Konjugate von all diesen Glycosaminoglycanen und deren Herstellung nach den hier offenbarten Verfahren liegen im Schutzumfang dieser Erfindung. Zum Beispiel sind Konjugate von Heparinen, die mit Phosphaten, Sulfonaten und dergleichen derivatisiert sind, sowie Glycosaminoglycane mit Molekulargewichten von weniger als 6.000 oder mehr als 30.000 im Schutzumfang dieser Erfindung.
In der klinischen Praxis können die neuartigen Heparinkonjugate der vorliegenden Erfindung im allgemeinen in der gleichen Weise und in der gleichen Form der pharmazeutischen Zubereitung verwendet werden, wie im Handel erhältliches Heparin für die klinische Verwendung. Demnach können die neuartigen Heparinkonjugate, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, in wäßrigen Lösungen für die Injektion (intravenös, subkutan und dergleichen) eingeschlossen sein oder in wäßrigen Lösungen für die intravenöse Infusion oder in Salbenzubereitungen für die Verabreichung über die Haut und die Schleimhautmembranen. Der Fachmann wird erkennen, daß alle Therapieformen, sowohl die prophylaktischen als auch die kurativen, die entweder gegenwärtig bekannt sind oder in der Zukunft verfügbar werden, bei denen die Heparintherapie indiziert ist, mit den neuartigen Heparinkonjugaten, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, praktiziert werden können.
Die Heparinkonjugate dieser Erfindung finden insbesondere Verwendung bei der Behandlung des Atemnotsyndroms (RDS) von Neugeborenen und Erwachsenen. Im Gegensatz zu der Verwendung von nicht-kovalenten Heparin-ATIII-Komplexen beugt die Verwendung der kovalenten Heparinkonjugate der vorliegenden Erfindung dem Verlust von Heparin in dem Lungenraum durch Dissoziation von ATIII vor. In diesem Fall könnte eine Lösung von Kovalentkomplex in einem physiologischen Puffer als ein atomisiertes Spray den Atemweg hinunter in die Lunge über einen Katheter oder einen Puffer verabreicht werden. Aufgrund seiner großen Größe wird ATH in den Alveolen für einen längeren Zeitraum verbleiben. ATH ist auch geeignet für die Behandlung von selbständig auftretender Lungenfibrose (mehr als 2 Tage).
Die Langzeitanwendung im Kreislauf könnte durchgeführt werden durch entweder intravenöse oder subkutane, vorzugsweise intravenöse, Injektion des Komplexes in einem physiologischen Puffer. Die kovalenten Konjugate dieser Erfindung können auch verwendet werden bei der Behandlung von erworbenen ATIII-Mangelzuständen, die gekennzeichnet sind durch thrombotische Komplikationen, wie z. B. Herz-Lungen-Umgehungs-Kreislauf, extrakorporale Anreicherung mit molekularem Sauerstoff, etc., da eine längere Halbwertszeit des Kovalentkomplexes weniger Behandlungen und weniger Beobachtung bedeuten würde. Zusätzlich stellt diese Erfindung Konjugate für die prophylaktische Behandlung von erwachsenen Patienten mit dem Risiko einer Thrombose in den tiefen Venen bereit.
Das ATH-Konjugat dieser Erfindung hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber nicht-komplexiertem AT und SH. Da AT mit SH kovalent verknüpft ist, wird es weniger unspezifisches Binden von ATH an Plasmaproteinen als bei SH geben, was zu einer geringeren interindividuellen Variation des Wirkungsbereichs von ATH führt, als dies bei SH der Fall ist. Die längere Halbwertszeit von ATH nach intravenöser Injektion im Menschen bedeutet, daß ein dauerhafter Antikoagulationseffekt erhalten wird, indem man ATH weniger häufig verabreicht, als es erforderlich ist bei nicht-komplexiertem AT und SH. ATH ist ein viel effektiverer Inaktivator von Thrombin und Faktor-Xa als AT, und es wird erwartet, daß es wirksam ist, wenn es in viel geringeren Konzentrationen als AT bei Patienten mit einer AT-Defizienz verwendet wird. Außerdem hat ATH Zugang zu an Fibrin gebundenem Thrombin und kann dieses hemmen. Letztlich wurde für ATH gezeigt, daß, wenn es mit prothetischen Oberflächen (z. B. endovaskulären Transplantaten) verknüpft (z. B. kovalent verknüpft) ist, eine viel größere antithrombotische Aktivität in vivo aufweist, als kovalent verknüpftes AT oder kovalent verknüpftes Hirudin.
Bei frühgeborenen Kindern gibt es eine hohe Inzidenz des Atemnotsyndroms (RDS), eine schwere Lungenkrankheit, die die Behandlung mit assistierter Atmung erfordert. Die assistierte Atmung über einen langen Zeitraum führt zu dem Ausbruch von bronchopulmonaler Dysplasie als eine Folge der Lungenverletzung, die es den Koagulationsproteinen aus dem Plasma ermöglicht, sich in den Alveolarraum zu bewegen. Dies führt zu der Erzeugung von Thrombin und nachfolgend von Fibrin. Die verbreitete Gegenwart von Fibrin in dem Lungengewebe und im Luftraum ist durchgängig bei Kindern, die an RDS sterben, zu beobachten. Das Fibringel im Luftraum beeinträchtigt den Fluidtransport aus dem Luftraum der Lunge, was zu einem dauerhaften und schlimmer werdenden Lungenödem führt. Diese Erfindung stellt Konjugate bereit, die für neuartige Therapien zur Behandlung solcher Fibrin-vermittelten Krankheiten im Lungengewebe nützlich sind, indem der intra-alveolaren Fibrinbildung vorgebeugt wird, indem eine "anti-thrombotische Umgebung" aufrecht erhalten wird und/oder die Fibrinolyse im Lungengewebe verstärkt wird, wodurch die Fibrinlast im Luftraum der Lunge verringert wird.
Die Heparinkonjugate werden unmittelbar zu dem Luftraum der Lunge über den Atemweg prophylaktisch (bevor das Baby seinen ersten Atemzug nimmt) verabreicht. Dies stellt sicher, daß das antithrombotische Mittel unmittelbar an der Stelle der potentiellen Fibrinabscheidung verfügbar ist, und daß das Blutungsrisiko, das mit systemischen antithrombotischen Therapien einhergeht, vermieden wird. Zusätzlich wird das antithrombotische Mittel in der Lunge bereits vor dem Beginn der Atmungsunterstützung, die verbunden ist mit der initialen Verletzung, vorliegen, d.h. anders als bei der systemischen Antithrombin-Verabreichung, bei der der Übergang des verabreichten Arzneistoffs in den Luftraum der Lunge nicht auftritt bis nach der Verletzung der Lunge. Da Heparin kovalent mit ATIII verknüpft ist, wird es in dem Luftraum der Lunge verbleiben. Es kann auch eine unterstützende Therapie zu den oberflächenaktiven Mitteln, die gegenwärtig verabreicht werden, um RDS und BPD vorzubeugen, darstellen. Mit "oberflächenaktives Mittel der Lunge" ist die seifenähnliche Substanz gemeint, die normalerweise im Luftraum der Lunge vorliegt, und deren Hauptaufgabe es ist, das Kollabieren des Luftraums zu verhindern. Die Konjugate können auch wiederholt über einen endotrachealen Tubus oder als ein inhaliertes Aerosol verabreicht werden. Die unterstützende Therapie kann auch praktiziert werden mit Asthmamedikationen über einen Inhalator (z. B. antiinflammatorische Steroide, wie z. B. Beclomethasondipropionat) oder mit anderen Antiasthmatika, wie z. B. Cromolynnatrium (Dinatriumsalz von 1,3-Bis-(2-carboxychromon-5-yloxy)-2-hydroxypropan, INTAL^®) und mit bronchienerweiternden Mitteln, wie z. B. Albuterolsulfat.
Eine Reihe von anderen Erkrankungen, die mit erhöhter Thrombinaktivität und/oder Fibrinabscheidung einhergeht, können durch Verabreichung der Konjugate dieser Erfindung behandelt werden. Die inflammatorischen Prozesse, die mit dem Atemnotsyndrom von Erwachsenen verbunden sind, sind im wesentlichen ähnlich zu denen des RDS von Neugeborenen und können durch die beschriebene antithrombotische Therapie behandelt werden. Auch für die spontane Lungenfibrose ist gezeigt worden, daß sie zu einer Aktivierung der Koagulations-/Fibrinolysekaskaden in dem Luftraum der Lunge führt. Die fibrotische Erkrankung der Lunge ist häufig eine Nebenwirkung, die mit der Chemotherapie von Krebs einhergeht, und die antithrombotische Applikation der kovalenten Heparinkonjugate dieser Erfindung gegen RDS kann vor der Chemotherapie gegen Krebs prophylaktisch verabreicht werden, um der Lungenfibrose vorzubeugen. Die Verabreichung wird nach der Chemotherapie wiederholt, um sicherzustellen, daß keine Fibrinbildung erfolgt. Eine Abnahme der Antithrombin-III-Aktivität und eine Erhöhung der Thrombinaktivität bei Sepsis ist ebenfalls gut dokumentiert. Sepsis ist der häufigste Risikofaktor für die Entwicklung von adultem RDS. Daher können die Heparinkonjugate dieser Erfindung verwendet werden, um die Mortalität, die mit septischem Schock verbunden ist, zu reduzieren.
Die Konjugate dieser Erfindung werden in einer therapeutisch wirksamen Dosis verabreicht, d.h. in einer Menge, welche, wenn sie an ein Säugetier, das einen Bedarf danach hat, verabreicht wird, ausreichend ist, um eine Behandlung zu bewirken, wie es oben beschrieben wurde (z. B., um Thrombose in dem Säugetier zu verringern oder in anderer Weise zu behandeln oder um in einem Gerinnsel gebundenes Thrombin zu inaktivieren oder um die Thrombenaggregation zu hemmen). Die Verabreichung der wirksamen Verbindungen und Salze, die hierin beschrieben wird, kann durch jede annehmbare Verabreichungsweise für Mittel, die vergleichbaren Zwecken dienen, erfolgen.
Die Menge des Arzneistoffs in einer Formulierung kann innerhalb des gesamten, vom Fachmann eingesetzten Bereichs variieren, z. B. von etwa 0,01 Gew.-% (%w) bis etwa 99,99 Gew.-% des Arzneistoffs bezogen auf die Gesamtformulierung und mit etwa 0,01 Gew.-% bis 99,99 Gew.-% Trägerstoff. Vorzugsweise ist der Arzneistoff mit einem Gehalt an etwa 10 Gew.-% bis etwa 70 Gew.-% vorhanden.
Im allgemeinen ist eine annehmbare tägliche Dosis von etwa 0,001 bis 50 mg pro kg Körpergewicht des Empfängers pro Tag, vorzugsweise etwa 0,05 bis 25 mg pro kg Körpergewicht pro Tag und besonders bevorzugt etwa 0,01 bis 10 mg pro kg Körpergewicht pro Tag. Demnach wäre der Dosierungsbereich für die Verabreichung an eine Person mit 70 kg von etwa 0,07 mg bis 3,5 g pro Tag, vorzugsweise von etwa 3,5 mg bis 1,7 g pro Tag und besonders bevorzugt von etwa 0,7 mg bis 0,7 g pro Tag in Abhängigkeit von den zu behandelnden Individuen und dem zu behandelnden Erkrankungszustand. Eine solche Optimierung der Verwendung liegt eindeutig im Zuständigkeitsbereich des Fachmanns. Im Falle von ATH erlaubt die lange Halbwertszeit, daß die Verbindung weniger häufig als SH verabreicht wird (z. B. einmal oder zweimal wöchentlich).
Die Verabreichung kann über jeden annehmbaren systemischen oder örtlichen Weg erfolgen, z. B. über parenterale, intravenöse, nasale, bronchial-inhalatorische (d.h. Aerosolformulierung), transdermale oder topische Wege, in der Form einer festen, halbfesten oder flüssigen Dosierungsform, wie z. B. Tabletten, Suppositorien, Pillen, Kapseln, Pulver, Lösungen, Suspensionen, Aerosole, Emulsionen oder dergleichen, vorzugsweise in einer Einheitsdosierungsform, die für die einfache Verabreichung von exakten Dosierungen geeignet ist. Die Verabreichung über eine intravenöse oder subkutane Infusion ist üblicherweise bevorzugt. Am üblichsten wird eine wäßrige Formulierung verwendet werden. Das Konjugat ist in ein nicht-toxisches, inertes, pharmazeutisch annehmbares Trägermedium formuliert, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 3–8, besonders bevorzugt bei einem pH-Wert von etwa 6–8. Im allgemeinen wird die wäßrige Formulierung mit dem Kultur- oder Perfusionsmedium vereinbar sein. Die Zusammensetzungen werden einen herkömmlichen pharmazeutischen Träger oder Hilfsstoff umfassen und ein Konjugat des Glycosaminoglycans und können zusätzlich andere medizinische Mittel, pharmazeutische Mittel, Träger, Hilfsstoffe etc. umfassen. Die Träger können ausgewählt sein unter verschiedenen Ölen, einschließlich denjenigen, die aus Petroleum, Tieren, Pflanzen oder die synthetisch gewonnen werden, z. B. Erdnußöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen. Wasser, Salzlösung, wäßrige Dextrose oder Mannitol und Glykole sind bevorzugte flüssige Träger, insbesondere für injizierbare Lösungen. Die geeigneten pharmazeutischen Träger umfassen Stärke, Cellulose, Talkum, Glucose, Laktose, Sucrose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Kieselgel, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerolmonostearat, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glycerol, Propylenglykol, Wasser, Ethanol und dergleichen. Andere geeignete pharmazeutische Träger und deren Formulierungen sind beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin (1985).
Falls gewünscht, kann die pharmazeutische Zusammensetzung, die zu verabreichen ist, auch kleine Anteile von nicht-toxischen Hilfssubstanzen, wie z. B. Benetzungs- oder Emulgatormittel, pH-puffernde Mittel und dergleichen, wie z. B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaureat, Triethanolaminoleat, etc. enthalten.
Die Verbindungen dieser Erfindung werden im allgemeinen als eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die einen pharmazeutischen Hilfsstoff in Verbindung mit einem Konjugat des Glycosaminoglycans umfaßt. Der Anteil des Konjugats in einer Formulierung kann innerhalb des gesamten vom Fachmann angewendeten Bereichs variieren, z. B. von etwa 0,1 Gew.-% (%w) bis etwa 99,99 Gew.-% des Arzneistoffs bezogen auf die Gesamtformulierung und etwa 0,01 Gew.-% bis 99,99 Gew.-% Hilfsstoffe. Vorzugsweise wird die Formulierung zu etwa 3,5 bis 60 Gew.-% aus der pharmazeutisch aktiven Verbindung bestehen, wobei der Rest ein geeigneter pharmazeutischer Hilfsstoff ist.
Die Verbindungen der Erfindung, insbesondere ATH, können verwendet werden, um die Thrombenbildungsneigung von innerlichen und extrakorporalen Vorrichtungen, die mit Blut in Kontakt treten, zu verringern, und finden insbesondere Anwendung zur Beschichtung von thrombenbildenden prothetischen Oberflächen und medizinischen Vorrichtungen. Der Begriff "prothetische Vorrichtungen" und "medizinische Vorrichtungen" bezeichnet hier jedes beliebige natürliche oder synthetische Material, das in einen Patienten implantiert ist oder in anderer Weise mit Blut in Kontakt tritt und für welches es wünschenswert ist, daß die Blutgerinnung reduziert wird. Demnach umfassen diese Begriffe endovaskuläre Schläuche, arterielle und zentralvenöse Leitungen, Herzkatheter, Herz-Lungen-Umgehungskreisläufe, Dialysekreisläufe oder andere externe, mit Blut in Kontakt tretende Instrumente, wie z. B. Schrittmacherableitungen, arterielle und venöse Katheter für die Punktion von großen Gefäßen, Thrombektomiekatheter, Suturen, Blutfilter, intravenöse Leitungen, mechanische Ventile, Stents, künstliche Nieren, Lungen, Herzen und Lebern oder jede beliebige andere in-vivo-Prothese, insbesondere diejenigen die aus einem natürlichen oder synthetischen Polymer oder natürlichen oder synthetischen Polymeren hergestellt sind.
Die Materialien, die in prothetischen Vorrichtungen verwendet werden, umfassen Ioplex-Materialien und anderen Hydrogele, wie z. B. diejenigen, die basieren auf 2-Hydroxyethylmethacrylat oder Acrylamid und Polyetherpolyurethanharnstoffe (PEUU), einschließlich Biomer (Ethicon Corp.) und Avcothan (Avco-Everrett Laboratories). Die Materialien, die am häufigsten für röhrenförmige Anwendungen verwendet werden, sind Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluorethylen (Gore-Tex), Poly(vinylchlorid), Polydimethylsiloxan, ein Ethylen-Acrylsäure-Copolymer, verknüpftes oder gewobenes Dacron, Polyester-Polyurethan, Polyurethan, Polycarbonat-Polyurethan (Corethane^TM), Polyamid (Nylon) und Polystyren. Zusätzliche Verbindungen, die in prothetischen und biomedizinischen Vorrichtungen verwendet werden, und die mit Blut in Kontakt kommen, sind beschrieben in Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Auflage 1982 (Band 19, Seiten 275–313, und Band 18, Seiten 219–2220) und van der Giessen et al., Circulation, 94:1690–1997 (1996).
Im allgemeinen wird die Zusammensetzung der Erfindung, z. B. ATH, mit dem Polymer der Vorrichtung kovalent verknüpft sein. Die Verfahren zur kovalenten Verknüpfung sind gut bekannt und werden je nach Natur des Polymermaterials variieren. Im allgemeinen siehe Hermanson, Mallia und Smith, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press (1992). Es wird davon ausgegangen, daß andere Polymere und Materialien, möglicherweise auch solche umfassend, die bisher nicht entdeckt sind, für die Verknüpfung mit ATH oder anderen Konjugaten der Erfindung geeignet sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Polyurethan-Polycarbonatmaterial mit ATH beschichtet. Die Beschichtung wird in drei Stufen durchgeführt. Zunächst wird das Polymer aktiviert. Die Aktivierung kann erreicht werden durch Behandlung mit einem Oxidationsmittel (z. B. Natriumhypochlorit, NaOCl) oder einem Reduktionsmittel (z. B. Lithiumaluminiumhydrid). Als zweites wird ein Monomer (Allylglycidylether) auf die Oberfläche aufpolymerisiert durch Umsetzung der aktivierten Leitung mit einem Initiator (Na₂S₂O₄) und einem Monomer (z. B. Allylglycidylether, Acrolein oder ein anderes Monomer mit einer funktionellen Gruppe, die mit einem Alken verbunden ist), das mit den Verbindungen der Erfindung, z. B. ATH, weiter reagieren kann. Als Drittes wird die zu verknüpfende Verbindung (z. B. ATH oder ein anderes Antikoagulationsmittel, welches Gruppen aufweist, wie z. B. eine Aminogruppe, die mit der funktionellen Gruppe des Monomers reagieren kann) mit dem Monomer verknüpft. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß es keine Manipulation von ATH einschließt und daß es dessen Antikoagulationsaktivität nicht verändert.
Die Konjugate der Erfindung sind auch als Molekulargewichtsstandards für die Analyse von unbekannten Proben geeignet.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um es dem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung noch besser zu verstehen und diese auszuführen.
Materialien
Im folgenden Methodenteil bezeichnet "Standardheparin" Heparin aus kommerziellen Quellen, es sei denn, es ist etwas anderes angegeben. Heparin mit hoher Affinität ist eine Heparinfraktion, in der alle Moleküle an ATIII binden.
Das Heparin stammte aus der Darmschleimhaut vom Schwein (Sigma Chem Co. USA). Das Dermatansulfat stammte aus der Darmschleimhaut vom Schwein (Mediolanum farmaceutici S.p.A., Italien). Das ATIII stammte aus humanem Plasma (Bayer Inc.). Das HCII stammte aus humanem Plasma (Affinity Biologicals).
BEISPIEL I
Herstellung von kovalenten Konjugaten zwischen GAGs und Serpinen
Die Reaktionen zur Ausbildung von kovalenten Komplexen zwischen dem Glycosaminoglycan (GAG) und dem Serpin, z. B. ATIII oder HCII, umfaßten die Inkubation von GAG (5 mg–70 mg) mit dem Serpin (0,5 mg–3 mg) in 1 ml steril filtriertem Puffer (0,3 M Phosphat, 1 M NaCl, pH 8,0 oder 0,02 M Phosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,3), enthaltend 0,05 M Natriumcyanborhydrid bei 35°C bis 45°C, vorzugsweise 40°C, in einem versiegelten Kunststoffröhrchen (Polycarbonat, Polypropylen, etc.). Das Weglassen des Natriumcyanborhydrids erlaubte die Ausbildung von kovalenten Komplexen über die Amadori-Umlagerung, welche radioaktiv markiert werden konnten, durch späteren Zusatz von mit Tritium markiertem Natriumborhydrid. Die Inkubationszeiten lagen in dem Bereich von 3 Tagen bis 2 Wochen. Die Aufreinigung des kovalenten Produkts wurde erreicht durch eine Reihe von Verfahren. Die Aufreinigungsverfahren sind beschrieben in dem US-Patent Nr. 5,308,6 7, US-Patent Nr. 4,623,718 und FEBS Letters 143(1):96–100, 1982, die alle durch Querverweis eingeschlossen sind. Die Gelfiltrierung über Sephadex G-200 unter Verwendung von 2 M NaCl ergab eine Fraktion mit hoher molarer Masse, die einen kovalenten Komplex enthielt, der im wesentlichen frei von freiem Serpin war. Diese Fraktion wurde weiter aufgereinigt durch Elektrophorese auf einem 7,5% Polyacrylamidgel bei pH 8,8 unter Anwendung von nicht-denaturierenden Bedingungen (kein Natriumdodecylsulfat), durch Herausschneiden des Abschnitts des Gels, welcher lediglich Komplex enthielt und durch Elution des Produkts aus dem herausgeschnittenen Abschnitt des Gels durch Inkubation in einem Puffer (3,0 g/l Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 14,4 g/l Glycin, pH-Wert 8,8) bei 23°C.
Alternativ wurde das Antithrombin-Heparin-Konjugat (ATH) auch in einer Stufe aus dem Reaktionsgemisch aufgereinigt durch hydrophobe Chromatographie auf Butyl-Agarose (Sigma Chemical Company, Milwaukee, WI). In 2,5 M Ammoniumsulfat wurden ATH und ATIII an Butyl-Agarosekügelchen gebunden, während Heparin dies nicht tat. Die Einstellung der Ammoniumsulfatkonzentration auf von 2,5 M bis 1,8 M ermöglichte, daß reines ATH von den Kügelchen eluiert wurde, während ATIII gebunden blieb.
An Butyl-Agarose gebundenes ATH und ATIII konnten auch gemeinsam eluiert werden, indem die Ammoniumsulfatkonzentration auf weniger als 1,5 M eingestellt wurde, gefolgt von der Trennung von ATH von ATIII auf DEAE-Sepharose-Fast-Flow-Kügelchen (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Von Butyl-Agarose eluiertes ATH und ATIII wurden gegen 0,01 M Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 dialysiert, bevor sie an die DEAE-Kügelchen gebunden wurden, und das gebundene ATIII wurde mit 0,2 M NaCl in Puffer eluiert, während ATH durch NaCl-Konzentrationen von 0,4 M bis 2,0 M eluiert wurde. Auf diese Weise konnten verschiedene Molekulargewichte und Chargen in Abhängigkeit von der verwendeten NaCl-Konzentration isoliert werden. Die Konzentration von aufgereinigtem ATH wurde bei 4°C durch Dialyse in Schläuchen durchgeführt mit einem cutoff von 12.000–14.000 molare Masse unter Stickstoffdruck (1 Atmosphäre).
ATH, welches erzeugt wurde in 0,02 M Phosphat, 0,015 M NaCl, 0,05 M Natriumcyanborhydrid, pH 7,3, und das aufgereinigt wurde unter Verwendung der Elution des Komplexes aus einem herausgeschnittenen Abschnitt eines Gels im Anschluß an eine nicht-denaturierende Elektrophorese, ergab ein Material, bei dem das molare Verhältnis von ATIII:H in dem Komplex 1:1,1 betrug und >99% waren aktiv.
BEISPIEL II
Charakterisierung von GAG-Serpin-Konjugaten
1. Biologische Aktivität
Die Anti-Xa-Aktivität, die von Collen et al. und von Bjork et al. für deren jeweilige ATH-Zubereitungen gemessen wurde, wurde ermittelt durch (Prä)Inkubation von ATH mit Xa gefolgt von der Bestimmung der verbleibenden Aktivität auf Xa mit S-2222 (N-Benzoyl-isoleucyl-glutamylglycyl-arginyl-paranitroanilid (von Chromogenix, Schweden)). Der Prozentsatz der ATH-Moleküle mit Aktivität (bestimmt anhand der Menge des gehemmten Xa) wird in Tabelle I berichtet. Die Anti-IIa-Aktivität wurde gemessen für unser ATH durch Titrierung mit verschiedenen Mengen an IIa (Thrombin). Die Menge an IIa, die durch eine gegebene Massenkonzentration von ATH (Masse bestimmt durch Analyse unter Verwendung von nicht-modifiziertem Ausgangsheparin) gehemmt wird, wird bestimmt durch die Messung der verbleibenden Aktivität gegen S-2238 (D-Phenylalanyl-pipecolylarginyl-paranitroanilid (von Chromogenix, Schweden)).
Hemmung der Thiombinaktivität
Die Hemmung der Reaktion von Rinderthrombin mit dem Farbsubstrat S-2238 wurde untersucht. Alle Arbeitsschritte wurden bei 23°C durchgeführt. Thrombin wurde unter Rühren zugegeben zu einer Lösung, die das zu untersuchende Material und S-2238 enthält, gelöst in Puffer mit 0,036 M Natriumacetat, 0,036 M Natriumbarbital, 0,145 M NaCl, pH-Wert 7,4, in einem Eppendorf-Röhrchen (die finale Thrombinkonzentration betrug 0,045 IU/ml, und die finale S-2238-Konzentration betrug 28,3 μg/ml). Die resultierende Lösung wurde in eine Quarzküvette übertragen und die Absorption wurde bei 405 nm aufgenommen über die Zeit (die Nullzeit lag bei 30 Sekunden nach der Zugabe des Thrombins) ausgelesen. Die Reaktionskonzentration des ATIII in entweder den ATH-, ATIII- oder ATIII + H(Heparin)-Reaktionen betrug 8,8 nM. Die [ATIII] in den 0,3 × ATH- und 3 × AT + H-Reaktionen betrug jeweils 2,7 nm und 27 nm. Bei den Reaktionen, bei denen Heparin verwendet wurde, lag es in äquimolarer Konzentration zu dem ATIII in dem Experiment vor. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt und zeigen, daß die ATH-Konjugate der vorliegenden Erfindung wirksamer sind als freies ATIII und Heparin.
Das Thrombin stammte von Parke-Davis. Das S-2238 stammte von Chromogenix (Schweden). Es wurde Standardheparin (Leo Laboratories) verwendet.
Reaktion mit Fibrinogen und Thrombin
Die Fähigkeit von Rinderthrombin, humanes Fibrinogen zu gerinnen, wurde durch verschiedene ATIII-enthaltende Gemische wie folgt gehemmt. Eine ATIII-enthaltende Probe wurde mit Fibrinogen in 0,15 M NaCl in einem Kunststoffröhrchen bei 37°C vermischt. Nach 1 Minute wurde Thrombin zugegeben (die finale Fibrinogenkonzentration betrug 0,2 mg/ml, und die finale Thrombinkonzentration betrug 1 IU/ml), und es wurde eine Uhr gestartet. Die Zeit wurde aufgezeichnet für das erste Auftreten eines Gerinnsels an dem Ende einer Drahtschlaufe aus Nichrome, welche für das Umrühren verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt und zeigen, daß die ATH- Konjugate wirksamer bei der Vorbeugung der Gerinnselbildung sind. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet.

ATH1: = Zubereitung #1 von ATIII-Heparin-Konjugat (wie in Beispiel 1 beschrieben
STD Hep: = Standardheparin (LEO Laboratories)
HEP FRAC: = Fraktion mit geringem Molekulargewicht (≈ 7.000 MW, hergestellt durch Gelfiltration) von Standardheparin
CY222: = Heparinfragment mit geringem Molekulargewicht, hergestellt durch salpetrige Säure (Durchschnitt ≈ 2.500 MW, hergestellt von Choay Laboratories)

Das Thrombin stammte von Parke-Davis, das Fibrinogen stammte von Connaught Laboratories. Das ATIII wurde aus humanem Plasma aufgereinigt. In den ATIII + Heparin-Gemischen waren der Protein- und der GAG-Gehalt auf Massenbasis äquivalent (nur 1 von 3 Standardheparinmolekülen bindet ATIII).
Wirkung von zugegebenem Heparin auf die Hemmrate der Thrombinaktivität durch kovalente ATIII-Hegarin-Konjugate (ATH)
Die Fähigkeit von Standardheparin, die Hemmung des humanen Thrombins durch ATH zu beeinflussen, wurde untersucht. Der verwendete Puffer war 0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 1,5 μM Rinderalbumin, pH 7,6. ATH und verschiedene Mengen an Heparin in Puffer wurden in ein Plastikröhrchen mit einem Durchmesser von 8 mm, mit einem flachen Boden, bestehend aus Polycarbonat, ausgestattet mit einem Rührstab, der mit 500–1000 UpM rotiert, eingebracht, und all dies in einem Wasserbad mit 37°C. Humanes Thrombin wurde unmittelbar in dem Moment zugegeben, als eine Uhr gestartet wurde. Nach einer Zeit in dem Bereich von 0,5 bis 5 Sekunden wurde die Thrombinhemmung gestoppt durch Zugabe einer Lösung mit einem Überschuß an Polybren und S-2238. Die verbleibende Thrombinaktivität für S-2238 (A₄₀₅/Min.) wurde in einer Quarzküvette bei 37°C gemessen. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Eine einfach logarithmische grafische Darstellung der verbleibenden Thrombinaktivität (Log (A₄₀₅ × 10⁴/Min.)) gegen die Zeit (Sek.) wurde für jede verwendete Heparinkonzentration erstellt. Die apparente Geschwindigkeitskonstante (k_app (S^–1)) wurde berechnet als In 2, geteilt durch die Zeit, bei der ½ der Ausgangsthrombinaktivität gehemmt wurden. Die k_app für jede Heparinkonzentration wird grafisch dargestellt.
Das Rinderalbumin stammte von Sigma Chemical Company, das humane Thrombin stammte von Enzyme Research Laboratories (USA), das S-2238 stammte von Chromogenix (Schweden), und das Heparin stammte von Leo Laboratories, Kanada. Alle Konzentrationen, die in 3 angegeben sind, sind Reaktionskonzentrationen unmittelbar vor der Zugabe von Polybren-S-2388.
Bestimmung der Raten der Thrombinhemmung durch ATH
Die Versuchsanordnung und die Berechnung der semi-logarithmischen grafischen Auswertung war die gleiche wie für den oben für 3 beschriebenen Versuch, außer daß kein exogenes Heparin zugegeben wurde und daß die Konzentration von ATH wie angegeben variiert wurde. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Hemmung der Thrombin- und der ATH-Reaktion durch FPR-Thrombin
FPR-Thrombin ist Thrombin, welches durch Phenylalanyl-prolyl-arginylpeptid, welches kovalent mit dessen aktivem Serin verbunden ist, gehemmt ist. FPR-Thrombin kann die Reaktion von Thrombin mit ATH kompetitiv hemmen durch Bindung an die Heparinkette, obwohl es nicht mit dem ATIII-Anteil reagieren kann. Die Versuchsanordnung und die Berechnung von k_app waren gleich zu dem Versuch von 3, außer daß verschiedene Mengen an FPR-Thrombin anstelle von Heparin untersucht wurden (es wurde kein exogenes Heparin zugegeben). Die Konstante k₀ war der k_app-Wert, ohne daß FPR-Thrombin zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Geschwindigkeitskonstanten der bimolekularen Reaktion und der Reaktion zweiter Ordnung und Wirkung von zugegebenem Heparin auf die Hemmrate von Thrombin durch ATH
Die Vorgehensweise für die Ergebnisse für zugegebenes Heparin ist gegeben, wie aus den Ergebnissen, die für 3 verwendet werden, bestimmt. Um die Geschwindigkeitskonstanten zu bestimmen, wurde das Verfahren von Hoylaerts et al., in J. Biol. Chem. 259(9):5670–5677 (1984) angewendet. Um die Geschwindigkeitskonstante der bimolekularen Reaktion zu berechnen, wurden k₂ und K_i wie folgt bestimmt. Die kapp-Werte für jede Kurve für jede ATH-Konzentration, die verwendet wurde, wurden bestimmt für 3 separate Versuche, für die 4 ein typisches Beispiel ist. Für jeden Versuch wurde ein Diagramm von 1/k_app gegen 1/[ATH] erstellt. Der Achsenabschnitt der 1[ATH]-Achse entsprach dem Wert von 1/K_i. In jedem Fall wurde die Geschwindigkeitskonstante der bimolekularen Reaktion berechnet als k₂/K_i und der Durchschnitt von 3 Versuchen wird berichtet. Für die Geschwindigkeitskonstante der Reaktion zweiter Ordnung wurden (k_i), k_–I (off-rate) oder IC₅₀ für die FPR-Thrombin-Kompetition ([FPR-Thrombin], bei der k_app/k₀ = 0,5) für jede Kurve für jeden der 3 Versuche bestimmt, wofür 5 ein typisches Beispiel ist. Die Durchschnittswerte für die drei k₂- und K_i-Werte, die gemessen wurden, wurden verwendet, um die Geschwindigkeitskonstante der Reaktion zweiter Ordnung für jeden k_–I-Wert zu berechnen, nimmt man die folgende Formel für gegeben an. Geschwindigkeitskonstante der Reaktion zweiter Ordnung = k_I = (k_–I + k₂)/K_i. Der Durchschnitt wird berichtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Fehlerwerte sind ausgedrückt als ± 2 mal der Standardfehler des Mittels.
TABELLE 2
Pharmakokinetik der kovalenten ATIII-Heparin-Konjugate
1. Plasma-Clearance von ATH und Heparin nach intravenöser Injektion in Kaninchen
Aufgereinigtes ATH und Standardheparin (Sigma) wurden in die Ohrvene von separaten Kaninchen injiziert. Es wurden äquivalente Mengen (bestimmt anhand der Masse des Heparins) injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Blutproben aus der Ohrarterie von jedem Kaninchen in Natriumcitrat (9 Teile Blut auf 1 Teil 3,8% (m/v) Trinatriumcitrat) entnommen. Jede Probe wurde bei 3000 g zentrifugiert, und die resultierenden Plasmaüberstände wurden auf Anti-Xa-Aktivität unter Verwendung eines ACL300-Geräts (Coulter, USA) für Zwecke der Automatisierung analysiert. Bei dem Verfahren wird ein Stachrom Heparinkit (Diagnostica Stage, Frankreich) eingesetzt. Kurz gesagt, wurde jede Probe des Plasmas, die untersucht werden sollte, mit einem Puffer gemischt, der Rinder-ATIII enthielt und mit Rinder-Faktor-X_a bei 37°C für 30 Sekunden inkubiert, gefolgt von einer Inkubation für 30 Sekunden mit dem Farbsubstrat CBS 31.39 (N-(Methylsulfon)-D-leucyl-glycyl-arginyl-paranitroanilid (von Diagnostica Stage, Frankreich)), wonach die Reaktion durch Zugabe von Essigsäure abgestoppt wurde. Die Absorption bei 405 nm wurde dann gemessen. Eine Standardkurve, die unter Verwendung von Standardheparin erzeugt wurde, wurde verwendet, um die Anti-X_a-Aktivität in den Plasmaproben in Form von IU/ml des Heparins zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Die ATH-Halbwertszeit wurde mit 53 Minuten ermittelt, und die Halbwertszeit von freiem Heparin wurde mit 17 Minuten ermittelt.
2. Pharmakokinetik in Plasma nach subkutaner Injektion in Kaninchen
Kaninchen wurden unter die Haut hinter dem Nacken injiziert und es wurden Blutentnahmen für die Plasmaanalyse zu verschiedenen Zeitpunkten, wie oben für 6 beschrieben, vorgenommen. ATH wurde detektiert unter Verwendung eines ELISA-Kits für ATIII von Affinity Biologicals (Hamilton, Kanada). Kurz gesagt, wurde ATH aus den Plasmaproben auf Kunststoffwells, die mit polyklonalen Schaf-anti-humanes-ATIII-Antikörpern beschichtet waren, eingefangen. Durch Peroxidase-konjugierte Affinität aufgereinigte Anti-humanes-ATIII-Antikörper (polyklonal) wurden zu den Wells zugegeben, und nach dem Spülen entwickelte sich mit H₂O₂/O-Phenylendiaminsubstrat für 10 Minuten eine Färbung. Nach Behandlung der Substratreaktion mit H₂SO₄ wurde die Absorption bei 490 nm gemessen. Es wurden Standardkurven von ATH oder humanem ATIII in gepooltem normalem Kaninchenplasma verwendet, um ng von humanem ATIII/ml zu bestimmen. Das ATIII des Kaninchens beeinträchtigte nicht signifikant, da der verwendete Antikörper selektiv für humanes ATIII ist. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. In einem separaten Versuch wurden ATIII und Heparin (nicht-kovalente Konjugate) subkutan injiziert, wobei ATIII (erfaßt durch ELISA) in dem Plasma mit dem gleichen Profil wie ATH auftrat, es wurde jedoch keine Heparinaktivität beobachtet.
2. Charakterisierung der Strutur
A. Allgemeine Struktureigenschaften
Das Verfahren zur Bestimmung des molaren Verhältnisses von Hep:AT in den Heparin-Antithrombin-Konjugaten (ATH) erfolgte durch Densitometrie auf SDS-Gelen (Standardverfahren), die auf entweder Heparin (Alcianblau/Silber) oder ATIII (Coomassieblau) gefärbt wurden, im Vergleich mit den korrespondierenden Standards. Die aktivierenden Gruppen pro GAG-Molekül sind per Definition 1 (ein Aldose-Terminus pro GAG-Kette).
Der Molekulargewichtsbereich wurde bestimmt durch Vergleich von gefärbtem ATH, HCH, HCD mit vorgefärbten Standards auf SDS-Polyacrylamidgelen.
Die Eigenschaften der Antithrombin-Heparin-Konjugate (ATH) und von Heparin-Cofaktor-II-Heparin(HCH)-Konjugaten und von Heparin-Cofaktor-II-Dermatansulfat(HCD)-Konjugaten sind unten in Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE 1 EIGENSCHAFTEN VON KOVALENTEN ATH-PRODUKTEN

*AKTIVITÄT VON HEPARIN IM KOMPLEX VERGLICHEN MIT NICHT-MODIFIZIERTEM AUSGANGSHEPARIN

EIGENSCHAFTEN VON KOVALENTEN HCH- UND HCD-PRODUKTEN

* PROZENTSATZ DER GEGEN IIa AKTIVEN MOLEKÜLE

B. Intrinsische Proteinfluoreszenz von ATH
Da Heparin dafür bekannt ist, daß es eine ~ 33%-Verstärkung der intrinsischen Proteinfluoreszenz von AT induziert (Huntington et al (1996) Biochemistry 35, 8495–8503), wurde die instrinsische Fluoreszenz von ATH verglichen zu der von AT und AT + Standardheparin (SH). Die Proteinfluoreszenzemissionsspektren von 100 nM AT, 100 nM AT plus 1277 nM SH oder 100 nM ATH wurden aufgezeichnet (λ_ex 280 nm, λ_em 310–360 nm). Die Fluoreszenz von AT + H war 32% größer als die von AT alleine bei λ_max (341 nm) mit einer Peakverschiebung von weniger als 1 nm (24). Das Spektrum von ATH war virtuell identisch zu demjenigen von AT + SH. Diese Daten suggerieren, daß die Konformation von ATH derjenigen des nicht-kovalenten AT-SH-Komplexes ähnelt.
C. Heparintitration von AT und ATH
Es wurde eine Titration mit SH durchgeführt, um zu bestimmen, ob ATH eine weitere Konformationsveränderung durchlaufen könnte (25). Die Proteinfluoreszenzwerte (bei 341 nm) wurden während einer SH-Titration von 100 nM AT und ATH bestimmt. AT durchlief einen Dosisabhängigen und sättigbaren Anstieg der Fluoreszenzintensität, die einen K_d von 100 nM und ein ΔFI von maximal 32% ergab. Im Gegensatz dazu gab es im Hinblick auf FI bei der SH-Titration von ATH keinen Anstieg, was darauf hinweist, daß es keine weitere Veränderung der Proteinkonformation gab. Demnach liegt ATH in einer vollständig aktivierten Konformation vor, die von exogenem SH unabhängig ist.
D. AT-Titration von ATH
Um zu bestimmen, ob die Heparin-Komponente von ATH in der Lage war, zusätzlich AT zu binden, wurde eine AT-Titration von ATH durchgeführt (26). Diese wurde verglichen mit einer AT-Titration von freiem SH. Die Proteinfluoreszenzwerte (341 nm) von 100 nM ATH wurden bestimmt in der Gegenwart von ansteigenden Mengen an AT. Die Werte wurden korrigiert im Hinblick auf eine innere Filterwirkung, so daß eine Kontroll-AT-Titration linear war. Die ΔFI-Werte wurden umgewandelt in die AT-Konzentration unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten für AT + SH, der bei diesen Untersuchungen bestimmt wurde. Die Bindung von AT an SH und an STH konnte gesättigt werden mit K_d-Werten von jeweils 65 und 175 nM. Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß 28 nM SH an AT in 100 nM SH gebunden sind, was einen Pentasaccharidgehalt in dieser SH-Zubereitung von ~ 28% suggeriert. ATH ist in der Lage, ~ 37 nM AT zu binden, was einen höheren Pentasaccharidgehalt erkennen läßt. Diese Ergebnisse lassen erkennen, daß die Heparinkomponente von ATH in der Lage ist, zusätzlich AT zu binden und daß es daher in der Lage ist, katalytisch zu wirken.
E. Proteinkonformation von ATH im Vergleich zu AT + H
Bei einer Heparintitration ist die Proteinkonformation von ATH in Abwesenheit von SH gemessen durch Tryptophanfluoreszenz sehr ähnlich zu derjenigen von AT mit Sättigungsgehalten von SH (25). Daher scheint es im experimentellen Fehlerbereich, daß ATH dem SH-aktivierten AT ähnelt. Darüber hinaus unterläuft ATH keine weitere Konformationsveränderung, wenn SH zugegeben wird, was suggeriert, daß keine weitere Aktivierung auftritt. Demnach repräsentiert ATH, wie erwartet, eine vollständig aktivierte Form von AT, welche kein exogenes SH benötigt.
F. Bindung von zusätzlichem AT durch das H in ATH
Wenn AT zu ATH zugegeben wird, gibt es einen weiteren Anstieg der Proteinfluoreszenz, die dem intrinsischen H in dem ATH-Komplex zuzuschreiben ist. Die K_d der Bindung läßt erkennen, daß die Affinität von H (innerhalb von ATH) für AT etwas geringer ist als diejenige von freiem SH (26). Dies spiegelt möglicherweise die Konkurrenz zwischen dem kovalent verknüpften und den freien AT-Molekülen wieder. Die Ergebnisse suggerieren, daß etwa 30 nM AT an 100 nM SH binden können, was einen Pentasaccharidgehalt von ~ 30% suggeriert. Obwohl die ATH-vermittelte Bindung an AT eine höhere Bindung erkennen ließ, war der Pentasaccharidgehalt lediglich etwa 1/3 höher (~ 40 nM Bindung an AT aus 100 nM ATH). Dies ist unerwartet, kann jedoch eine Folge der Konkurrenz des AT in ATH mit dem exogenen AT sein, oder es kann sein, daß 1/3 der AT-Moleküle ein zweites Pentasaccharid des AT in ATH mit dem exogenen AT aufweisen oder daß welche von den ATH-Molekülen ein zweites Pentasaccharid aufweisen. Diese Ergebnisse suggerieren, daß das H in ATH katalytisch ist.
G. Selektion nach Heparinmolekülen mit zwei Pentasacchariden bei der Ausbildung von ATH
Wenn eine feststehende Menge Heparin mit AT titriert wird und die Fluoreszenzintensität beobachtet wird, gibt es einen Sättigungsanstieg der Fluoreszenzintensität, die die Heparin-indizierten Konformationsveränderungen in dem reaktiven Zentrum von AT reflektiert. Eine ähnliche Erhöhung der Fluoreszenzintensität wird beobachtet, wenn ATGH mit AT titriert wird (siehe 9).
Die Ergebnisse, die in 9 zusammengefaßt sind, spiegeln eine Veränderung der Fluoreszenzintensität wieder, die auftritt, wenn ATH mit AT titriert wird, welche nahezu identisch zu derjenigen ist, die auftritt, wenn Heparin mit AT titriert wird, wobei die Ergebnisse die Gegenwart eines zweiten Pentasaccharids auf dem AT-konjugierten Heparin suggerieren. Dies kann demonstriert werden, indem man die Ergebnisse in Betracht zieht, die man erwarten würde, wenn Heparin, welches lediglich ein Pentasaccharid aufweist, zu der AT-Einheit von ATH konjugiert würde. In diesem Fall würde das AT, sobald sich das Pentasaccharid von dem AT, mit welchem das Heparin kovalent verbunden ist, von diesem lösen würde, in seine ursprüngliche Konformation zurückkehren, was zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führen würde. Wenn das Pentasaccharid erst einmal abgetrennt ist, könnte es ein exogenes AT binden, was dazu führt, daß dieses eine Konformationsänderung durchlaufen würde. Dies würde einhergehen mit einem reziproken Anstieg der Fluoreszenzintensität zurück zu dem Ausgangswert. Der Netto-Effekt dieses Prozesses wäre keine Veränderung der Fluoreszenzintensität, im Gegensatz zu dem, was bei diesem Versuch beobachtet wird.
BEISPIEL III
Herstellung und Aufreinigung von ATH
Humanes AT (Bayer Inc.) und SH (Sigma Chem. Co., USA) wurden initial dialysiert, um die Reinheit der Reagenzien sicherzustellen. Humanes AT und SH wurden gemeinsam in einem Wasserbad mit 40 °C über 10 bis 14 Tage inkubiert. Diese Inkubation ermöglichte die Konjugation von Heparin mit AT durch eine Schiff-Basen-Bildung zwischen dem Aldose-Terminus Aldehyd am Heparin und einer Lysyl-Aminogruppe an dem AT, gefolgt von einer Amadori-Umlagerung oder einer Reduktion durch Natriumcyanborhydrid (Endkonzentration 0,05 M) für 5 Stunden nach der Initialreaktion. Das Natriumcyanborhydrid wurde zu dem Gemisch nach dem Inkubationszeitraum zugegeben. Dieser Herstellungsprozeß ist einfach und erfordert keine strukturellen Veränderungen von einer der Verbindungen.
AT wurde aufgereinigt unter Anwendung von zwei chromatographischen Stufen.
Die erste Stufe umfaßt die Zugabe des Reaktionsgemisches zu einer hydrophobe Eigenschaften enthaltenden Matrix, Butyl-Agarose in 2,5 M Ammoniumsulfat. Unter diesen Bedingungen binden AT und ATH an Butyl-Agarose-Kügelchen, während Heparin dies nicht tut. Dann werden AT und ATH von den Kügelchen weg eluiert, durch Einstellung der Ammoniumsulfatkonzentration auf weniger als 1,5 M. Das ATH und AT, welches von der Butyl-Agarose-Matrix weg eluiert wird, wird dann dialysiert gegen einen Puffer mit 0,01 M Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,0.
Die zweite Stufe umfaßt das Aufbringen des eulierten ATH und AT auf DEAE-Sepharose-Fast-Flow-Kügelchen in 0,2 M NaCl. Unter diesen Bedingungen bindet freies AT nicht an die DEAE-Sepharose-Kügelchen. ATH wird dann von den DEAE-Kügelchen durch Einstellung der NaCl-Konzentration auf 2 M weg eluiert. Das aufgereinigte ATH wird dann durch Druckdialyse bei 4 °C unter 1 Atmosphäre Stickstoffdruck in einem Schlauch mit einem Cut-off bei 12000–14000 Molmasse konzentriert.
BEISPIEL IV
Stabilität von ATH
ATH wurde bei 4 °C gelagert und Anti-Faktor-Xa-Aktivitätsassays wurden durchgeführt mit der Verbindung auf einer regulären Basis über drei Monate. Es wurden zwei Anti-Faktor-Xa-Aktivitätsassays verwendet. Das erste wies kein zugegebenes exogenes AT auf, während bei dem zweiten exogenes AT zugegeben wurde. Die Tabelle 3 zeigt, daß das ATH seine Aktivität nach etwa drei Monaten verlor.
ATH wurde auch bei –70 °C gelagert ohne Verlust von dessen Aktivität nach sechs Monaten. ATH wurde auch gefriergetrocknet und mit Wasser rekonstituiert. Vor dem Gefriertrocknen wurde ATH gegen 0,1 M Alanin und 0,15 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 dialysiert. Das rekonstituierte ATH war aktiv über wenigstens sechs Monate, wie bestimmt wurde anhand der Anti-Faktor-Xa-Aktivität.
TABELLE 3 Anti-Faktor-Xa-Aktivität von ATH über die Zeit bei Lagerung bei 4 °C
BEISPIEL V
Biologische Aktivitäten und Mechanismen von ATH
1. Direkte nicht-katalytische Aktivität
ATH hat eine direkte nicht-katalytische Antithrombin-Aktivität sowie eine Anti-Faktor-Xa-Aktivität. Bei Verwendung eines Standard-Anti-Faktor-Xa-Assays (Thrombosis Res. 10:399–410 (1977)) mit exogenem AT zugegeben, hat ATH eine spezifische Aktivität von 48 U/mg Heparin.
Die Hemmung von Thrombin wurde untersucht, indem die verbleibende Aktivität von Thrombin gemessen wurde unter Anwendung des Farbsubstrats S2238 (Thrombosis Res. 13:285–288 (1978)), nachdem das Enzym mit ATH umgesetzt worden war. Die Aktivität von ATH wurde mit AT oder mit AT + SH verglichen. Die Mengen an AT und/oder Heparin, die verwendet wurden, waren bezogen auf das Gewicht äquivalent zu den Mengen, die von jedem bei ATH verwendet wurden. 10 zeigt, daß ATH viel aktiver als AT + SH bei der Hemmung von Thrombin, wenn die AT- und Heparin-Komponenten in gleicher Masse vorliegen.
2. Katalytische Aktivität
Die Anti-Faktor-Xa-Aktivität von ATH, ohne daß exogenes AT zu dem Assay-System zugegeben wurde, betrug 48 u/mg. Für eine äquivalente Menge von AT gab es keine meßbare Aktivität. Die Anti-Faktor-Xa-Aktivität von ATH mit exogenem AT, das zu dem Assay-System zugegebenen wurde, betrug 731 u/mg Heparin, was darauf hinweist, daß es in dem ATH eine katalytische Aktivität gibt. Da AT mit H in dem Komplex kovalent verknüpft ist, ist die Beobachtung, daß das H in ATH die AT-vermittelte Inaktivierung von Xa katalysieren könnte, unerwartet. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß der beobachtete katalytische Effekt des ATH eine Folge der Verunreinigung des ATH mit freiem H ist, wurde ATH einer Gelfiltration über eine G-200-Säule unterworfen. Die eluierten Fraktionen wurden dann auf einem Polyacrylamidgel (4 % Stacking und 7,5 % Separating), welches ATH klar von Heparin trennt, analysiert. Das Heparin in dem ATH und in der Fraktion mit freiem Heparin wurde durch Alzianblau-Färbung, gefolgt von Silbernitrat, erfaßt, und die Menge an Heparin in den Banden mit ATH und mit freiem Heparin wurde unter Anwendung der Densitometrie quantifiziert sowie durch Vergleich des Gewichts des Papiers, das aus der Fläche unter den Kurven ausgeschnitten wurde. Die Daten sind in Tabelle 4 und in 11 zusammengefaßt.
Es wurde eine Fraktion gesammelt (Fraktion 22), welche 0,100818 mg H/ml als ATH und 0,498200 μg H/ml als freies Heparin enthielt, und diese wurde untersucht auf ihre Anti-Faktor Xa-Aktivität. Die spezifische Anti-Faktor-Xa-Aktivität dieser Fraktion betrug 83,25 U/ml. Falls dies lediglich der Menge an in der Fraktion vorliegendem ATH zugeschrieben würde, wäre dies äquivalent zu einer spezifischen Aktivität von 825 U/mg. Falls die Anti-Faktor-Xa-Aktivität in der Fraktion lediglich dem freien Heparin in der Fraktion zugeschrieben würde, würde dies erfordern, daß das Heparin eine spezifische Aktivität von 167101 U/mg aufweist. Da die spezifische Anti-Faktor-Xa-Aktivität von SH etwa 160 U/mg beträgt, und da die Menge an freiem Heparin in der Fraktion weniger als 0,5 μg/ml beträgt, zeigen die Ergebnisse dieses Versuchs an, daß nahezu die gesamte der beobachteten Anti-Faktor-Xa-Aktivität dem ATH zugeschrieben werden kann. Die spezifische Anti-Faktor-Xa-Aktivität in dieser Fraktion (Fraktion 22) wurde in Gegenwart und in Abwesenheit von exogenem AT untersucht. Die Aktivität wurde um das 25–30-fache in Gegenwart von exogenem AT erhöht. Aufgrund der sehr niedrigen Konzentration von freiem Heparin (wie oben beschrieben) konnte diese mehrfache Erhöhung nur durch einen katalytischen Effekt des Heparins in dem ATH-Komplex erklärt werden. Um diesen Punkt zu verifizieren wurden Anti-Faktor-Xa-Assays in der Gegenwart von exogenem AT unter Verwendung von Heparin (hohe Affinität) in einer Konzentration von 0,5 (die Menge an freiem Heparin in der Fraktion) und 5 μg/ml durchgeführt. In beiden Fällen gab es keine meßbare Anti-Faktor-Xa-Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die katalytische Aktivität, die in dem ATH beobachtet wurde, keine Folge der Kontamination mit freiem Heparin sein konnte und bestätigen, daß komplexiertes Heparin in ATH eine katalytische Aktivität aufweist. Das Verhältnis der katalytischen zu der nicht-katalytischen Aktivität war signifikant größer bei Fraktionen mit hohem Molekulargewicht im Vergleich zu Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht. Dies suggeriert, daß eine höhere Anzahl von Pentasacchariden (d.h. zwei oder mehr Pentasaccharide pro Molekül) in größeren ATH-Molekülen vorliegt.
Tabelle 4 Anti-Faktor-Xa-Aktivität von gelfiltriertem ATH
Ohne daß es beabsichtigt ist, durch einen bestimmten Mechanismus gebunden zu sein, gibt es zwei wahrscheinliche Erklärungen für die beobachtete katalytische Wirkung von ATH.
Die weniger Wahrscheinliche ist die, daß eine Konformationsveränderung auftritt an der Heparinbindungsstelle von AT, wenn die AT-Komponente des ATH-Komplexes an Thrombin bindet, was zu einer deutlich verringerten Affinität für das Heparin-Pentasaccharid führt. Das Pentasaccharid dissoziiert dann von dem AT (obwohl das Heparinmolekül mit dem AT kovalent verknüpft bleibt) und steht zur Verfügung, um mit exogenem AT zu binden.
Etwas wahrscheinlicher ist die Möglichkeit, daß der Prozeß der kovalenten Verknüpfung von AT mit Heparin die Heparinmoleküle herausselektiert, die zwei Pentasaccharideinheiten enthalten. Daher kann ATH an AT binden und als ein Katalysator über die zweite Pentasaccharidstelle wirken.
Um die für die beobachtete katalytische Aktivität verantwortlichen Mechanismen aufzuklären, können die folgenden Versuche durchgeführt werden:

i) Um zwischen den zwei Mechanismen zu differenzieren, läßt man ATH über eine AT-Säule laufen. Wenn ATH an immobilisiertes AT bindet, so würde dies implizieren, daß der zweite Mechanismus verantwortlich ist. Außerdem würde erwartet werden, daß die Anti-Faktor-Xa-Aktivität von ATH durch Behandlung mit Heparinase abnehmen würde, wenn ein zweites Pentasaccharid für die erhöhte Aktivität verantwortlich ist.
ii) Wenn ATH nicht an das immobilisierte AT bindet, so würde dies dem ersten angenommenen Mechanismus als den Grund für die beobachtete katalytische Wirkung des Heparins, welches kovalent an AT gebunden ist, stützen. Um diesen Mechanismus zu evaluieren, wird ATH mit Thrombin titriert, bevor man es über eine AT-Säule laufen läßt. Das an seiner aktiven Stelle gehemmte Thrombin (FPR-Thrombin) wird als eine Kontrolle verwendet, da dies nicht an das reaktive Zentrum von AT bindet, und es wäre daher nicht zu erwarten, daß es die Affinität von AT zu dem Pentasaccharid verringert.

3. Inaktivierung von ATH durch Protamin
Die Fähigkeit von Protaminsulfat und von humanem Plättchenfaktor 4 (PF4), die Antikoagulationsaktivität von ATH zu inaktivieren, wurde bestimmt. Etwa 80 % der Anti-Faktor-Xa-Aktivität wird inaktiviert durch entweder Protaminsulfat oder PR4. Demnach kann die ATH-Aktivität, falls gewünscht, während der Verwendung neutralisiert werden.
4. Rate der Hemmung von Thrombin
Die Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zweiter Ordnung von ATH, von AT alleine und von AT + SH wurden verglichen unter Anwendung des Verfahrens von Hoyiaerts et al. (J. Biol. Chem. 259(9):5670–5677). Wie in Tabelle 5 dargestellt, ist ATH etwa 30 Mal schneller als AT + SH bei der Hemmung von Thrombin.
Tabelle 5 Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zweiter Ordnung für ATH
5. Wirkung von Fibrin auf die Thrombininaktivierung durch ATH
An Fibrin gebundenes Thrombin verbleibt katalytisch aktiv, dissoziiert von Fibrin sehr langsam und ist gegenüber der Inaktivierung durch AT und durch AT und SH geschützt. Die Wirkung von ATH auf Thrombin-gebundenes Fibrin wurde evaluiert und die apparente k1 der Geschwindigkeit der Thrombinhemmung durch ATH in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an Fibrinmonomer wurde bestimmt durch Messung des verbleibenden Thrombins zu verschiedenen Zeitpunkten während der Reaktion. Die Hemmung von Thrombin wird zu verschiedenen Zeitpunkten durch die Zugabe von Polybren gestoppt und die Thrombinaktivität, die verbleibt, wird gemessen unter Anwendung von Farbsubstrat S-2238. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Die Geschwindigkeit der Thrombinhemmung durch ATH wurde durch Fibrinmonomer nicht beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu führte Fibrinmonomer zu einer Abnahme der Fähigkeit von Heparin mit hoher Affinität, Thrombin zu hemmen, um etwa das 60-fache. Diese Ergebnisse zeigen an, daß ATH an Fibrin gebundenes Thrombin inaktivieren kann.
Tabelle 6 Vergleich der Wirkung von Fibrin in Monomer auf die Geschwindigkeit der Thrombinhemmung anhand von 100 nM ATH gegenüber 100 nM H plus 200 mM AT

* Heparin mit hoher Affinität. Heparin mit hoher Affinität ist die ATIII-bindende Fraktion von Heparin, welche aus Standard-SH aufgereinigt wurde.

Fibrin-gebundenes Thrombin ist resistent gegenüber der Inaktivierung durch SH, da die Heparin-bindende Stelle (Exosite 2) von Thrombin maskiert ist, wenn das Enzym an Fibrin gebunden ist. Da ATH Fibrin-gebundenes Thrombin inaktivieren kann, wurden Versuche durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Exosite 2 für die Inaktivierung von Thrombin durch ATH wesentlich ist. Diese Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung von R93-Thrombin, einem rekombinanten Thrombin mit einer inaktiven Mutanten-Exosite 2 (J. Biol. Chem. 269:17965–17970 (1994)). Wie in Tabelle 7 dargestellt, inaktiviert ATH R93-Thrombin mit dergleichen apparenten Geschwindigkeit wie Alpha-Thrombin. Im Gegensatz zu ATH ist die k1 von Heparin mit hoher Affinität etwa 400 Mal größer für Alpha-Thrombin als für R93-Thrombin. Diese Ergebnisse suggerieren, daß die Exosite 2 nicht erforderlich ist, dafür, daß ATH an Thrombin bindet.
Tabelle 7 Geschwindigkeit der Thrombin(IIa)-Hemmung durch ATH gegenüber Heparin mit hoher Affinität (HASH)
BEISPIEL VI
Pharmakokinetische Studien von ATH in Kaninchen
Die Pharmakokinetik von ATH wurde in Kaninchen untersucht, wobei Anti-Faktor-Xa-Assays und ELISAs auf humanes AT angewendet wurden. Die Pharmakokinetik von humanen AT + SH, SH alleine und von humanem AT alleine in Kaninchen wurde zum Vergleich mit ATH untersucht.
1. Pharmakokinetik nach intravenöser Verabreichung an Kaninchen
Die Mengen für jede Verbindung, die intravenös an Kaninchen verabreicht wurden, waren die unten beschriebenen. Die Anti-Faktor-Xa-Aktivität wurde nach dem Verfahren, welches in Thrombosis Res. 10:399–410 (1977) beschrieben wird, getestet.
Für jede Gruppe wurden fünf Kaninchen verwendet. Die Verbindungen wurden intravenös an NZW-Kaninchen ohne Befall mit Pathogenen, die bei Bewußtsein waren, verabreicht. Mit Citrat versetzte Blutproben wurden von den Kaninchen zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 24 Stunden entnommen. Es wurden Anti-Faktor-Xa-Tests und ELISAs auf humanes AT mit jeder Probe durchgeführt. Die Halbwertszeiten von ATH, AT + SH und SH anhand der Anti-Faktor-Xa-Aktivitäten betragen jeweils etwa 2,4 Stunden, 0,41 Stunden und 0,32 Stunden. Die Halbwertszeiten von ATH, AT + SH und AT anhand von ELISAs von humanem AT betragen jeweils 2,4 Stunden, 13 Stunden und 13 Stunden. Die Ergebnisse sind in 12 und 13 und in Tabelle 8 zusammengefaßt. Die Halbwertszeiten von SH nach intravenöser Injektion und von AT in Menschen werden jeweils mit etwa 60 Minuten und 66 Stunden berichtet, was ungefähr zweimal die Halbwertszeit von SH und fünfmal die Halbwertszeit von AT in Kaninchen ist. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen wird erwartet, daß die Halbwertszeit von ATH in Menschen 2–5 mal derjenigen in Kaninchen ist, welche etwa 5 Stunden bis 12 Stunden ist. Die lange Halbwertszeit von ATH wird ein distinkter Vorteil für die Anwendung bei der Prophylaxe darstellen, da es selten verabreicht werden kann. Die maximalen Anti-Faktor-Xa-Aktivitäten betrugen für ATH und SH jeweils 8,4 u/ml und 1,17 u/ml.
Tabelle 8 Halbwertszeit von ATH in Kaninchen
2. Pharmakokinetik nach subkutaner Verabreichung bei Kaninchen
Die Mengen der an die Kaninchen subkutan verabreichten Verbindung waren die folgenden:
Es wurden zwei Dosierungen untersucht, und für jede Dosierung wurde ein Tier verwendet. Die Verbindungen wurden subkutan an NZW-Kaninchen, die frei von Pathogenen waren und die bei Bewußtsein waren, verabreicht. Die mit Citrat versetzten Blutproben wurden von den Kaninchen zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 170 Stunden genommen. Es wurden Anti-Faktor-Xa-Tests und ELISAs auf humanes AT mit jeder Probe durchgeführt. Die maximale Antifaktor-Xa-Aktivität für SH betrug 0,29 u/ml bei 1 Stunde, bei den Kaninchen, die AT erhalten hatten, gab es im wesentlichen keine Anti-Faktor-Xa-Aktivität. 14 zeigt die mittlere Konzentration von AT über die Zeit. Diese Ergebnisse suggerieren, daß ATH nicht gut absorbiert wurde bei der Dosierung, die über den subkutanen Weg verabreicht wurde. Dies ist möglicherweise der Größe des Moleküls zuzuschreiben.
3. Pharmakokinetik nach trachealer Instillation in Kaninchen
Eine potentielle Anwendung für ATH ist die Behandlung des Atemnotsyndroms. Daher wurde die Wirkung von ATH nach trachealer Instillation untersucht.
ATH und Salzlösung wurden intratracheal über eine Endotrachealtubus verabreicht an betäubte NZW-Kaninchen, die frei von Pathogenen waren. Die Menge an verabreichtem AT betrug 100 Anti-Faktor-Xa u/kg. Es wurden vier Kaninchen für ATH und zwei Kaninchen für Salzlösung verwendet. Für zwei der Kaninchen, die ATH erhalten hatten und für die Kaninchen, die Salzlösung erhalten hatten, wurde unmittelbar nach der Instillation eine bronchoalveolare Spülung (BAL) durchgeführt, um zu bestimmen, ob es möglich ist, die Verbindung nach Verabreichung zu entfernen. Bei allen Tieren wurde BAL nach 48 Stunden gesammelt. Zu mehreren Zeitpunkten bis zu 48 Stunden wurden mit Citrat versetzte Blutproben entnommen. Es wurden Anti-Faktor-Xa-Tests sowohl mit den BAL- als auch mit den Blutproben durchgeführt. In den Blutproben gab es im wesentlichen keine Anti-Faktor-Xa-Aktivität. Bei den BAL wurde zum Zeitpunkt von 0 Stunden eine signifikante Menge von AT entfernt, wie nachgewiesen wurde anhand der hohen Anti-Faktor-Xa-Aktivität. Bei 48 Stunden gab es in den BAL immer noch verbleibende Anti-Faktor-Xa-Aktivität (15). Diese vorläufigen Ergebnisse zeigten, daß ATH in der Lunge über einen langen Zeitraum verblieb und keine signifikante systemische Antikoagulationswirkung hervorrief.
BEISPIEL VII
Antithrombotische und hämorrhagische Wirkungen von ATH in Versuchsmodellen:
Vergleich mit Heparin
Die Sicherheit und Wirksamkeit von ATH wurde in zwei Tiermodellen untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß (i) ATH dem Wachstum von Thromben vorbeugt und die physio logische Fibrinolyse in einem Tiermodell für die venöse Thrombose beschleunigt, und (ii) das ATH in Dosierungen wirksam ist, die annehmbare hämorrhagische Effekte aufweisen.
1. Vergleich von ATH mit Heparin in Kaninchen-Blutungs-Modell
Wir verglichen die relative Wirkung von ATH, AT + SH, SH alleine AT alleine und Salzlösung auf eine experimentelle Blutung unter Anwendung des Blutendes-Ohr-Modells am Kaninchen. Die fünf Behandlungszweige umfaßten:
Die verabreichten Dosierungen waren äquivalent bezogen auf ihr Gewicht. In jeder Gruppe wurden fünf Kaninchen untersucht.
Bei diesen Versuchen wurden die Kaninchen betäubt, und die Testverbindungen wurden als ein intravenöser Bolus verabreicht. Fünf Minuten nachdem die Verbindungen injiziert worden waren, wurde ein Ohr des Kaninchens mit einem Skalpell mit #11 fünfmal in zufälliger Weise punktiert, wobei Bereiche mit sichtbaren Gefäßen gemieden wurden. Das Ohr wurde dann in ein Wasserbad 37°C (Gesamtvolumen 1 l) gegeben, welches dann kontinuierlich gerührt wurde. 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten und 30 Minuten ab dem Zeitpunkt, zu dem das Ohr punktiert worden war, wurden wäßrige Proben mit 10 ml aus dem Wasserbad entnommen. Zu den gleichen Zeitpunkten wurden mit Citrat versetzte Blutproben genommen. Die Proben wurden unmittelbar bei 1700 g zentrifugiert, es wurde blutplättchenarmes Plasma erhalten und bei –70°C eingefroren, bis die Tests durchgeführt wurden.
Mit den Plasmaproben wurde Anti-Faktor-Xa-Tests durchgeführt. Die Absorption der Wasserproben wurde bei einer Wellenlänge von 540 nm gemessen, und die Ergebnisse wurden mit einer Standardkurve von bekannten Mengen an Blut in Wasser verglichen, und der akkumulative Blutverlust über die Zeit wurde berechnet.
Die 16 zeigt die kumulativen Blutverlust über die Zeit. Die Blutung war in der ATH-Gruppe am größten. Ein Tier in der ATH-Gruppe zeigte eine signifikant stärkere Blutung als der Rest der Tiere in der gleichen Gruppe. 17 zeigt den kumulativen Blutverlust über die Zeit, wenn dieser Ausreißer aus der Analyse herausgenommen wurde. Die Blutung der Tiere in der ATH-Gruppe lag deutlich unter der annehmbaren Menge von 200 pi Blutverlust über 30 Minuten. Darüber hinaus war der kumulative Blutverlust in den ersten fünf Minuten im wesentlichen gleich für alle Be handlungsgruppen, die Antikoagulationsmittel aufwiesen. Der gesteigerte kumulative Blutverlust in der ATH-Gruppe ist wahrscheinlich eine Folge von dessen verlängerter Anti-Faktor-Xa-Aktivität. Die erhöhte Blutung ausgehend von ATH mag auch die Tatsache wiederspiegeln, daß die Anti-Faktor-Xa-Aktivitäten viermal größer als diejenigen in der Gruppe, die AT + SH erhielten, waren. 18 zeigt die Plasma-Anti-Faktor-Xa-Aktivität über die Zeit und demonstriert, daß die Anti-Faktor-Xa-Aktivitäten von ATH im Vergleich zu der Gruppe, die AT + SH erhielt, länger andauern.
2. Vergleich von ATH mit Heparin in einem Venöse-Thrombose-Modell am Kaninchen
Wir evaluierten ATH in einem Venöse-Thrombose-Behandlungsmodell am Kaninchen. Bei diesen Versuchen wurde ATH verglichen mit AT + SH, SH alleine, AT alleine und Salzlösung. Die Dosierungen, die verwendet wurden, waren die gleichen, wie diejenigen, die für das Blutendes-Ohr-Modell am Kaninchen verwendet wurden. Die Anzahl der für jede Gruppe verwendeten Kaninchen betrug n = 5 für ATH, n = 7 für AT + SH, n = 8 für SH, n = 5 für AT und n = 5 für Salzlösung.
Die Kaninchen wurden betäubt. Die Halsvene wurde isoliert, und die Seitenzweige wurden über 2 cm der Halsvene abgeschnürt. Das Halsvenensegment wurde mit zwei Aderpressen isoliert, und in das Venensegment wurde ein Fogarty-Katheter eingebracht. Das Endothel wurde freigelegt, indem man den aufgeblasenen Katheter 15 mal durchführte, und dann wurden 500 u Thrombin in das Segment injiziert. Dann wurden 0,2 ml des Bluts des Kaninchens in das Segment injiziert, um einen Thrombus zu erzeugen. Zum selben Zeitpunkt wurden 0,2 ml des Blutes in jedes der zwei Teströhrchen gegeben, die als eine Kontrolle für das Gewicht des Gerinnsels dienten. 30 Minuten nachdem das Blut in die Vene injiziert worden war, wurden die Aderpressen gelöst und das Blutgerinnsel wurde dem systemischen Kreislauf ausgesetzt. Zehn Minuten vor dem Lösen der Aderpressen wurden die zu untersuchenden Verbindungen in die Tiere injiziert, unmittelbar gefolgt von einer Injektion von humanem 125-l-Fibrinogen. 10, 20, 30, 60, 120 und 180 Minuten nachdem die Aderpressen gelöst worden waren, wurde eine mit Citrat versetzte Blutprobe mit 2 ml und einer Probe geronnenes Blut mit 1 ml entnommen. Die mit Citrat versetzten Blutproben wurden dann zentrifugiert, um ein Blutplättchen-armes Plasma zu erhalten, und dann bei –70°C gelagert. Diese Proben wurden nachfolgend auf Anti-Faktor-Xa-Aktivität untersucht. Nach 180 Minuten wurden die Tiere getötet und es wurden die Thromben gewonnen. Das Gewicht und die Radioaktivität der Thromben wurden mit den Kontrollthromben aus dem gleichen Tier verglichen.
Das Modell ist für den Test der Fähigkeit eines Antikoagulationsmittels, das Wachstum von einem Thrombus zu verhindern, gestaltet. Die in 19 dargestellten Ergebnisse zeigen an, daß ATH, AT + SH und SH bei der Vorbeugung des Wachstums eines Thrombus wirksamer waren als die Salzkontrolle und als eine AT-Kontrolle. Allerdings war ATH die wirksamste Behandlung und ging einher mit einer Verringerung der Thrombengröße um 18%. Die Abnahme der Gerinnselgröße war vergleichbar zu den Ergebnissen, bei denen Mittel verwendet wurden, die eine Aktivität gegenüber an Fibrin gebundenem Thrombin aufweisen. Diese Daten suggerieren, daß ATH gegen Fibrin-gebundenes Thrombin eine Aktivität aufweist. Allerdings zeigt 20, daß Kaninchen, die ATH erhalten hatten, im Vergleich zu anderen Gruppen eine höhere Anti-Faktor-Xa-Aktivität aufwiesen. Demnach bleibt zu untersuchen, ob der wirksamere Effekt von ATH eine Folge einer höheren Anti-Faktor-Xa-Aktivität ist oder einer beschleunigten Aktivität von ATH selbst.
Es ist wahrscheinlich, daß die äquivalenten Anti-Faktor-Xa-Aktivitäten von Heparin und ATH zu weniger Blutung bei ATH führen werden, und daß die verringerte Blutung bei ATH eine Folge der begrenzten Anti-Blutplättchen-Aktivität ist.
BEISPIEL VIII
ATH als ein lokales Antikoagulationsmittel, um eine prothetische Oberfläche zu beschichten
Um dies zu tun, wurde ein endovaskulärer Schlauch aus Polyurethan-Polycarbonat von Corvita mit ATH durch kovalente Verknüpfung der Urethangruppen mit ATH über einen intermediären Monomerlinker beschichtet. Die Thrombenbildungsfähigkeit des beschichteten Schlauchs wurde in einem Halsvenen-Modell am Kaninchen (Kaninchen-Perfusions-Modell) untersucht und mit mit Hirudin beschichtetem Schlauch, mit AT beschichtetem Schlauch und mit unbehandeltem Schlauch verglichen.
1. Verfahren zur Beschichtung von Polyurethan-Polycarbonat mit ATH
Bei der Chemie der Beschichtung von ATH auf Polyurethan-Polycarbonat waren drei Schritte involviert. Zunächst wird das Polymer von Polyurethan-Polycarbonat mit NaOCl aktiviert. NaOCl reagiert mit Urethan, um dieses relativ inerte Material chemisch reaktiv zu machen. Zweitens wird ein Verknüpfungs-Monomer (Allylglycidylether) auf die Oberfläche aufgepfropft, indem man den aktivierten Schlauch mit einem Indikator (Na₂S₂O₄) und einem Monomer, das mit anderen Verbindungen, wie z. B. ATH, weiter reagieren kann, umsetzt. Drittens wird ATH (oder andere Antikoagulationsmittel, die Gruppen aufweisen, wie z. B. eine Aminogruppe, die mit der funktionellen Gruppe des Monomers reagieren können) mit dem Monomer verknüpft.
2. Vergleich von mit ATH beschichtetem Schlauch mit mit Hirudin beschichtetem Schlauch
Hirudin wurde mit dem Polyurethan-Polycarbonat-Schlauch verknüpft, indem man das gleiche Verfahren anwendete, wie dasjenige, welches für die Verknüpfung von ATH verwendet wurde. Bei diesen Versuchen wurden männliche Kaninchen vom Typ New Zealand White betäubt. Die Oberschenkelarterie und Oberschenkelvene wurden mit einer Kanüle punktiert, die für die Fluidverabreichung und die Blutentnahme verwendet wurde. Die äußere Halsvene wurde freigelegt und ein kleines Segment der Gesichtsvene wurde teilweise verschlossen. Ein modifizierter Angiocath mit dem Eichmaß 14 (5 cm lang) wurde in die Halsvene eingeführt. Ein Segment mit 2 cm des endovaskulären Schlauchs wurde gewogen und in einen Angiocath-Katheter mit dem Eichmaß 14 (5 cm lang) eingeführt. Die Modifikation des Angiocath bestand darin, daß die Spitze von dessen Stilett abgeschnitten wurde. Der Katheter wurde über die teilweise verschlossene Gesichtsvene 5 cm in die Halsvene eingeführt, und dann wurde der Schlauch eingesetzt. Danach wurde der Katheter herausgezogen und das Gesichtsvenensegment wurde abgeschnürt. Die Lage des Schlauchs kann durch die Halsvenenwand gesehen werden. Vor der Einführung des Schlauchs und 60, 120, 180 Minuten nach dessen Einsetzen wurde 1 ml Blut in ein Citrat-PPACK sowie in ein Citrat-THAT-M für die Analyse des Thrombin-Antithrombin-Komplexes (TAT) und von Fibrinopeptid A (FPA) gesammelt. Am Ende der 180 Minuten wurde das Segment der äußeren Halsvene, das den Schlauch enthält, entfernt, es wurde mit 10 ml Salzlösung gespült, und es wurde der äußere Durchmesser mit einer Schieblehre gemessen. Danach wurde das Segment der Vene, das den Schlauch enthält, mit einer Schere längsseits geöffnet, und die Vene wurde von dem Schlauch geschält. Der Schlauch wurde längsseits in zwei Hälften geschnitten, auf Gaze leicht aufgestrichen und gewogen. Die Blutproben wurden unmittelbar bei 1700 g zentrifugiert, wodurch Blutplättchen-armes Plasma erhalten wurde, und wurden bei –70°C eingefroren, bis die Tests durchgeführt wurden. Der Schlauch wurde für die Histopathologie in 10% Formalin gelagert.
21 zeigt das Gewicht der Gerinnsel, die sich über drei Stunden in den Schläuchen gebildet hatten, nachdem diese in die Kaninchen eingebracht worden waren. Wie in der grafischen Darstellung dargestellt, war das Gewicht der Gerinnsel, die sich in dem mit ATH beschichteten Schlauch bildeten, statistisch und beachtlich geringer als in dem mit Hirudin beschichteten Schlauch, was demonstriert, daß ein mit ATH beschichteter Schlauch wirksamer ist als ein mit Hirudin beschichteter Schlauch.
3. Vergleich von mit ATH beschichtetem Schlauch mit mit AT beschichtetem Schlauch und mit nicht-behandeltem Schlauch
Die experimentelle Vorgehensweise war die gleiche wie oben. Die 22 zeigt das Gewicht der Gerinnsel, die sich in dem Schlauch nach dem Einbringen in die Kaninchen über drei Stunden bildeten. Der mit ATH beschichtete Schlauch induzierte kleinere Gerinnsel als der mit AT beschichtete Schlauch und als der nicht-behandelte Schlauch. Daher war der mit AT beschichtete Schlauch signifikant thrombogener als der mit ATH beschichtete Schlauch.
23 zeigt die luminale Oberfläche eines mit ATH beschichteten Schlauchs und eines nicht-behandelten Schlauchs, nachdem diese dem Blut in einem Kaninchen über drei Stunden ausgesetzt waren. Der mit ATH beschichtete Schlauch wies eine minimale Menge an Blutgerinnseln auf der Oberfläche auf, der nicht-behandelte Schlauch hatte eindeutig mehr Gerinnsel induziert.

Claims

Kovalentes Konjugat umfassend ein Glycosaminoglycan, das über eine kovalente Verknüpfung mit einem Protein verknüpft ist, wobei das Protein wenigstens eine primäre Aminogruppe umfaßt, wobei das Protein über diese Aminogruppe mit einem terminalen Aldoserest des Glycosaminoglycans unmittelbar kovalent verknüpft ist, wobei die kovalente Verknüpfung ein α-Carbonylamin umfaßt, das ausgebildet wird durch anschließende Amadori-Umlagerung über einen ausreichenden Zeitraum eines Imins, das hervorgeht aus der Reaktion zwischen der Aminogruppe und dem terminalen Aldoserest des Glycosaminoglycans, und pharmazeutisch verträgliche Salze davon, wobei das Glycosaminoglycan Heparin ist.
Konjugat nach Anspruch 1, wobei die kovalente Verknüpfung eine -CO-CH₂-NH-Gruppe umfaßt, die ausgebildet wird durch Amadori-Umlagerung einer -HCOH-HC=N-Gruppe, die hervorgeht aus der Reaktion zwischen der Aminogruppe und der C1-Carbonylgruppe des terminalen Aldoserests.
Konjugat nach Anspruch 2, wobei in der -CO-CH₂-NH-Gruppe der -CO-CH₂-Anteil von dem Glycosaminoglycan abgeleitet wird und der -NH-Anteil von der Aminogruppe des Proteins abgeleitet wird.
Konjugat, welches die Formel: Glycosaminoglycan-CO-CH₂-NH-Protein aufweist, wobei das Glycosaminoglycan Heparin ist und das Protein Antithrombin III (AT) ist.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das molare Verhältnis des Proteins zu dem Glycosaminoglycan weniger als 1 beträgt.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das molare Verhältnis des Proteins zu dem Glycosaminoglycan 1:1 beträgt.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Protein ein Serinproteaseinhibitor ist.
Konjugat nach Anspruch 7, wobei der Proteaseinhibitor ausgewählt ist unter Antithrombin III und Heparin-Cofaktor II.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Glycosaminoglycan Heparin ist und das Protein Antithrombin III ist.
Konjugat nach Anspruch 9, welches bei der Hemmung von Thrombin wirksamer ist als freies Antithrombin III und Heparin.
Konjugat nach Anspruch 9, welches ein Molekulargewicht von 69kD–100kD aufweist.
Konjugat nach Anspruch 9, 10 oder 11, welches mehr als 60%, 90%, 95% oder 98% der Antithrombin-Aktivität von intaktem, nicht konjugiertem Heparin aufweist.
Konjugat nach Anspruch 9, welches eine längere Halbwertzeit als Heparin in vivo aufweist.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Glycosaminoglycan Heparin ist und das Heparin ein einzelnes Pentasaccharid umfaßt.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Glycosaminoglycan Heparin ist und das Heparin zwei Pentasaccharide umfaßt.
Konjugat nach Anspruch 15, das mehr als 10% Heparinketten aufweist, die zwei Pentasaccharide aufweisen.
Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches für die Injektion in einen Menschen pharmazeutisch geeignet ist.
Einstufiges Verfahren zur Konjugierung eines Proteins, welches wenigstens eine primäre Aminogruppe umfaßt, mit einem Glycosaminoglycan, wobei man bei dem Verfahren das Glycosaminoglycan mit dem Protein unter Bedingungen, die die Bildung eines Imins zwischen der Aminogruppe und einem terminalen Aldoserest des Glycosaminoglycans ermöglichen, inkubiert, wobei das Glycosaminoglycan Heparin ist, und wobei das Imin in ein α-Carbonylamin umgeändert wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das α-Carbonylamin durch Amadori-Umlagerung des Imins ausgebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem man das Glycosaminoglycan mit dem Protein bei einem pH-Wert inkubiert, der für die Iminausbildung zwischen der Aminogruppe und dem terminalen Aldoserest des Glycosaminoglycans geeignet ist, und über einen Zeitraum, der ausreichend ist, um die Amadori-Umlagerung des Imins in ein α-Carbonylamin zu ermöglichen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Glycosaminoglycan Heparin ist und das Protein Antithrombin IIII (ATIII) ist.
Verfahren zur Herstellung eines kovalenten Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 mit den Stufen der Konjugierung eines Proteins, welches wenigstens eine primäre Aminogruppe umfaßt, mit einem Glycosaminoglycan durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21.
Verfahren nach Anspruch 24, welches auch die Stufe der Isolierung des kovalenten Konjugats umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer Konjugatzusammensetzung von Proteinen, die wenigstens eine durch kovalente Bindungen mit Glycosaminoglycanen verbundene primäre Aminogruppe umfassen, wobei man bei dem Verfahren: (a) die Glycosaminoglycane mit den Proteinen bei einem pH-Wert und über einen Zeitraum, der für die Ausbildung eines Imins zwischen der Aminogruppe und einem terminalen Aldoserest der Glycosaminoglycane ausreichend ist, inkubiert, und über eine Zeit und bei einer Temperatur, die dafür ausreicht, daß die Imine eine anschließende Amadori-Umlagerung über einen ausreichenden Zeitraum in ein α-Carbonylamin unter Ausbildung der kovalenten Bindungen durchlaufen, und (b) die Konjugatzusammensetzung oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon isoliert, wobei die Glycosaminoglycane Heparin (H) sind und die Amino-enthaltenden Moleküle Antithrombin III (ATIII) sind.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 24, wobei das Inkubieren für etwa 3 Tage bis 2 Wochen bei einer Temperatur von 35°C bis 45°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Inkubieren für etwa 2 Wochen durchgeführt wird.
Pharmazeutisches Präparat, welches ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 als aktiven Bestandteil in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 27 in der Form einer wäßrigen Lösung zur Injektion oder in der Form einer Salbe oder in der Form eines Aerosols.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Arzneimittels für die prophylaktische und therapeutische Behandlung des Atemnotsyndroms von Neugeborenen, des Atemnotsyndroms von Erwachsenen, des Primärkarzinoms der Lunge, des non-Hodgkins-Lymphoms, der fibrosierenden Alveolitis, von Lungentransplantaten, der L-Asparaginase-induzierten Defizienz, der Herz-Lungen-Umgehungs-induzierten Defizienz, von Sepsis oder vererbbaren AT-III-Mangelzuständen.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung und Behandlung von Thrombose.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung des Atemnotsyndroms eines Kindes oder Erwachsenen.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei das Konjugat nach Anspruch 9 unmittelbar den Atemwegen der Lunge zugeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei gleichzeitig ein Lungenoberflächenfaktor, ein antiinflammatorisches Steroid, ein anti-Asthma-Arzneimittel oder ein bronchienerweiterndes Mittel verabreicht wird.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung der Fibrinabscheidung in den Lungenalveolen.
Material zur Verwendung in einer medizinischen oder prothetischen Vorrichtung, wobei das Material ein Polymer umfaßt, welches Kontakt mit einem kovalenten Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 17 hat.
Material nach Anspruch 36, wobei das Glycosaminoglycan Heparin ist und die Spezies Antithrombin III ist.
Material nach Anspruch 36 oder 37, wobei das Konjugat an das Polymer kovalent angeheftet ist.
Material zur Verwendung in einer medizinischen oder prothetischen Vorrichtung, wobei das Material ein Polymer umfaßt, das mit einer kovalenten Konjugatzusammensetzung Kontakt hat, wobei die kovalente Konjugatzusammensetzung Glycosaminoglycane umfaßt, die über kovalente Verknüpfungen mit einem Protein verknüpft sind, wobei das Protein wenigstens eine primäre Aminogruppe umfaßt, wobei die Glycosaminoglycane Heparine sind, das Protein Antithrombin III ist und die kovalente Konjugatzusammensetzung Antithrombin-III-Heparin (ATH) umfaßt, wobei das ATH kovalent an das Polymer angeheftet ist, und wobei das Protein über die Aminogruppe mit einem terminalen Aldoserest des Glycosaminoglycans mittels einer α-Carbonylaminverknüpfung unmittelbar kovalent verknüpft ist.
Material nach einem der Ansprüche 36 bis 39, wobei das Polymer ein synthetisches Polymer ist, das ausgewählt ist unter Poly-2-hydroxyethylmethoacrylat, Polyacrylamid, Polyether-Polyurethanharnstoff (PEUU), Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluorethylen, Poly-(vinylchlorid), Polydimethylsiloxan, einem Ethylen-Acrylsäure-Copolymer, Dacron, Polyester-Polyurethan, Polyurethan, Polycarbonat-Polyurethan, Polyamid (Nylon) und Polystyren.
Material nach Anspruch 40, wobei das Polymer Polyurethan-Polycarbonat ist.
Prothetische oder medizinische Vorrichtung, welche ein Material nach einem der Ansprüche 36 bis 41 umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 42, die ausgewählt ist unter endovaskulären Schläuchen, einer arteriellen oder zentralvenösen Leitung, einem Herzkatheter, einem Herz-Lungen-Umgehungskreislauf, einem Dialysekreislauf oder einem anderen mit externem Blut in Kontakt tretenden Instrument, einer Schrittmacherableitung, einem arteriellen oder venösen Katheter, einem Thrombektomiekatheter, einer Sutur, einem Blutfilter, einer intravenösen Leitung, einem mechanischen Ventil, einem Stent, einer/m künstlichen Niere, Lunge, Herzen oder Leber und einer in-vivo-Prothese.
Vorrichtung nach Anspruch 43, wobei die Vorrichtung ein endovaskulärer Schlauch ist.
Verfahren zur Verringerung der Thrombenbildungsfähigkeit eines Materials, bei dem man das Material mit einem Konjugat nach einem der Ansprüche 9 bis 13 beschichtet.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei das Konjugat kovalent mit dem Material verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 45 oder 46, wobei das Material für die Verwendung in einer prothetischen oder medizinischen Vorrichtung nach Anspruch 43 geeignet ist.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Verringerung der Thrombenbildungsfähigkeit von inneren oder äußeren Vorrichtungen, die mit Blut in Kontakt treten.