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Bereich der Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf die allgemeinen Bereiche der Molekularbiologie
und Medizinwissenschaft und speziell auf eine Vorrichtung für die Nukleinsäureextraktion,
wobei spezifische Zielsequenzen amplifiziert werden und die amplifizierten
Nukleinsäuresequenzen
in einer unabhängigen
Vorrichtung nachgewiesen werden. Die Anmeldung beschreibt folglich
eine unabhängige
Vorrichtung, die im Stande ist schnell und genau Zielnukleinsäuresequenzen
nachzuweisen.
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Hintergrund und Stand der
Technik
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Die
Verwendung von Nukleinsäuresondentests,
basierend auf der Hybridisierung, in routinemäßigen klinischen Laborverfahren
wird durch einen Mangel an Sensitivität erschwert. Die Befähigung Nukleinsäuren aus
klinischen Proben zu amplifizieren hat die Nukleinsäuresondentechnologie
stark vorangetrieben, wobei die Sensitivität geboten wird, die in früheren Versionen
von nichtisotop Assays fehlte. Die Sensitivität, die durch die Oligonukleotidsondentests
erreicht wird, wobei die Nukleinsäureamplifikation verwendet
wird, übersteigt nun
die von irgendeinem anderen Verfahren. Die Nukleinsäureamplifikationsverfahren
können
eine einzige Kopie einer spezifischen Nukleinsäuresequenz nachweisen. Der
routinemäßige Nachweis
und Identifikation von spezifischen Gensequenzen haben in einer
Vielzahl von Situationen und Industrien eine extrem breite Anwendung.
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Die
Hauptbarriere für
die Übertragung
einer Technologie in das Feld der Routinetests ist das Fehlen einer ökonomischen
und einfach zu verwendenden Systems oder Apparats. Um in der heutigen
kostenbewussten Umgebung wettbewerbsfähig zu sein muss das genetikbasierte
Testen einen hohen Durchsatz bereitstellen, während adäquate Kontrollen und Schutzmaßnahmen
umfasst sind, um falschpositive Ergebnisse auf Grund einer Probenkontamination
zu verhindern.
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Die
derzeitige Technologie umfasst mehrere Schritte, obwohl neuste Entwicklungen
auf automatisierte Systeme für
den Nachweis der amplifizierten Zielsequenz abzielen. Der erste
Schritt, die Extraktion der Nukleinsäuren, wird auf einer Vielzahl
von Wegen bewerkstelligt, zum Beispiel durch Phenolextraktion, Extraktion durch
chaotrope Reagenzien, chromatographische Reinigung (Qiagen, WO 95/01359,
Reinigung auf Silicamembranen) und Ultrazentrifugation (Maniatis
et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Habour Laboratory, Cold Spring Habour, NY). Phenol ist eine gut
bekannte gesundheitliche Gefahr und bedarf einer speziellen Handhabung
für die
Abfallentfernung. Das Extraktionsverfahren ist auch mühsam und arbeitsintensiv.
Die Ultrazentrifugation benötigt
häufig
die Verwendung von teueren und gefährlichen Chemikalien sowie
die Verwendung einer komplizierten und teueren Ausstattung. Das
Verfahren benötigt
häufig
lange Laufzeiten und umfasst manchmal einen oder mehrere Tage Zentrifugation.
Das einfachste und schnellste Verfahren ist die Trennung unter Verwendung
der chromatogaphischen Reinigung.
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Der
zweite Schritt, die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz,
setzt eine Vielzahl von Enzymen ein, bekannt als Polymerasen und
Ligasen. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist die am häufigsten
verwendete Amplifikationstechnik. Die allgemeinen Prinzipien und
Bedingungen für
die Amplifikation von Nukleinsäuren
unter Verwendung der PCR ist im Stand der Technik gut bekannt; die
Details dafür
werden in zahlreichen Referenzen geliefert, einschließlich in
dem Patent der Vereinigten Staaten Nr. 4,683,195, in dem Patent
der Vereinigten Staaten Nr. 4,683,202 und in dem Patent der Vereinigten
Staaten Nr. 4,965,188, alle von Mullis et al. Folglich sind die
Details für
die PCR-Technologie hier nicht umfasst. Andere Methoden schließen die
Ligasekettenreaktion, Qβ-Replikase,
Strangverdrängungsassay,
Transcriptionsmediated iso CR Cycling-Probe-Technologie und Nucleic
Acid Sequence-based Amplification (NASBA).
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Eine
derzeitige Proteinnachweistechnologie für Antigen-Antikörper-Assays umfasst die
Verwendung von Mikropartikeln. Ferner sind derzeitig eine Vielzahl
von Mikropartikelstrategien für
dip-stick-Nachweis Antigen-Antikörper-Assays
erhältlich,
zum Beispiel der vertriebene Schwangerschaftstest für zu Hause
(Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,141,850 von Cole et al.).
Solche Tests verwenden farbige Partikel, die eine sichtbare Linie
in Folge einer spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion bilden. Die vorliegende
Erfindung wird durch die Hybridisierung eines Amplikons an Fangoligonukleotide
bewerkstelligt, die an Mikropartikel gebunden sind. Das heißt die hierin
offenbarte Erfindung weist Nukleinsäureamplikons nach.
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Der
Nachweis der amplifizierten Nukleinsäure für die klinische Verwendung
beruht im Wesentlichen auf der Hybridisierung des amplifizierten
Produkts und dem Nachweis mit einer Sonde, die mit einer Vielzahl von
Enzymen und lumineszenten Reagenzien markiert ist. Das Patent der
Vereinigten Staaten Nr. 5,374,524 von Miller beschreibt einen Nukleinsäuresondenassay,
der die Nukleinsäureamplifikation
und die Lösungshybridisierung
kombiniert, wobei Fang- und Reportersonden verwendet werden. Diese
Techniken benötigen mehrere
Reagenzien, mehrere Waschschritte und eine spezielle Ausrüstung für den Nachweis
der Zielnukleinsäure.
Darüber
hinaus sind diese Techniken arbeitsintensiv und benötigen technisches
Personal mit einem Fachwissen der Molekularbiologie.
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Die
Verwendung von Sonden, die aus Oligonukleotidsequenzen bestehen,
die an Mikropartikel gebunden sind, ist gut bekannt und im Stand
der Technik dargestellt. Der Mechanismus für die Bindung der Oligonukleotide
an die Mikropartikel in Hybridisierungsassays und für die Reinigung
von Nukleinsäuren
ist auch gut bekannt. Das europäische
Patent Nr. 200133 beschreibt die Bindung von Oligonukleotiden an
wasserlösliche Partikel
mit einem Durchmesser von weniger als 50 Mikrometern, die in Hybridisierungsassays
für die
Fang- und Zieloligonukleotide verwendet werden. Das Patent der Vereinigten
Staaten Nr. 5,387,512 von Wu beschreibt die Verwendung von Oligonukleotidsequenzen,
die kovalent an Mikropartikel gebunden sind, als Sonden, um PCR-amplifizierte
Nukleinsäuren
einzufangen. Das Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,328,825 von Findlay
beschreibt auch ein Oligonukleotid, das mittels eines Proteins oder
Kohlenwasserstoffs mit einem wasserlöslichen Partikel verbunden
ist. Die Olionukleotidsonde wird kovalent an den Mikropartikel oder
ein anderes festes Hilfsmittel gebunden. Die Sensitivität und Spezifität von allen
Patenten, auf die oben Bezug genommen wird, basiert auf der Hybridisierung
der Oligonukleotidsonde an die Zielnukleotidsequenz.
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Die
Verwendung von in den Amplifikationsreaktionen umfassten nichtradioaktiven
Markierungen für den
Nachweis von Nukleinsäuren
ist auch im Stand der Technik gut bekannt. Es wurden auch Nukleinsäuren verwendet,
die mit Biotin (Patent der Vereinigten Staaten Nr. 4,687,732 von
Ward et al.; europäische
Patentnr. 063879), Digoxin (europäische Patentnr. 173251) und
anderen Haptenen modifiziert werden. Zum Beispiel verwendet das
Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,344,757 von Graf eine Nukleinsäuresonde,
die wenigsten ein Hapten als Markierung enthält, für die Hybridisierung mit einer
komplementären
Zielnukleinsäure,
die an eine feste Membran gebunden ist. Die Sensitivität und Spezifität dieser
Assays basiert auf der Aufnahme einer einzigen Markierung in die
Amplifikationsreaktion, welche unter Verwendung eines Antikörpers nachgewiesen werden
kann, der für
die Markierung spezifisch ist. Der gewöhnlich Fall umfasst einen Antikörper, der
an ein Enzym konjugiert ist. Darüber
hinaus erzeugt die Zugabe eines Substrates eine kolorimetrische Änderung
oder eine Fluoreszenzänderung,
die mit einem Instrument nachgewiesen werden kann.
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Dennoch
sind die oben beschriebenen Methoden mit vielen Schritten und Waschschritten
arbeitsintensiv; sie benötigen
eine spezielle und teuere Ausrüstung
für den
Nachweis der Zielnukleinsequenz; sie benötigen angelernte Mitarbeiter;
und sie benötigen
mehrere Stunden, um sie abzuschließen. Es sind mehrere Patente
herausgegeben worden, die sich mit der Automatisierung der Prozesse
für die
Amplifikation und den anschließenden
Amplikonnachweis befassen. Diese Patente verwenden eine spezielle
Ausrüstung
und basieren immer noch auf dem Prinzip der Hybridisierung und der
Immunoassaytechnologie. Zum Beispiel beschreibt das europäische Patent
Nr. 320308 ein System, das die Zielnukleotidsequenzen nachweist,
die durch eine Ligasekettenreaktion amplifiziert wurden.
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Die
automatisierten Methoden beseitigen den Bedarf für speziell ausgebildetes Personal,
die Kosten für
die Apparatur sind jedoch sehr hoch und die Möglichkeit einer Kontamination
existiert dennoch, weil viele Proben in derselben Apparatur verarbeitet
werden. Um das Problem der Kontamination zu beheben ist es nötig die
drei oben behandelten Schritte zu integrieren. Die hierin offenbarte
unabhängige
Vorrichtung erreicht dieses Ziel, indem die existierenden Nukleinsäureextraktionstechnologie
und isothermen Amplifikationstechnologien mit einer innovativen
Nachweisstrategie verflochten werden.
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Die
hierin beschrieben Erfindung stellt einen schnellen und genauen
Nachweis von amplifizierten Nukleinsäuresequenzen bereit, wobei
eine unabhängige
Vorrichtung verwendet wird. Die Möglichkeit der Kontamination
wird wegen des hierin beschriebenen „Wegwerf"-Methode behoben. Die Eliminierung einer
Kreuzkontamination öffnet
die Tür
zum Massenscreening, einschließlich
einer Automatisierung. Die hohe Sensitivität der Analyse gewährt den
frühen
Krankheitsnachweis und die Möglichkeit
für eine
frühe Behandlung.
Die vorliegenden Erfindung diagnostiziert die Anwesenheit von Infektionserkrankungen
genetischen, bakteriellen oder viralen Ursprungs. Die Analyse durch
diese Erfindung kann die Wirksamkeit der Behandlung überwachen,
zum Beispiel, um den HI-Virus im Plasma von Patienten zu überwachen,
die eine Therapie durchlaufen. Die Analyse entsprechend der hierin
offenbarten Erfindung ist einfach und bedarf eine geringe Kenntnis
im Fach der Molekularbiologie. Die Kosten sind signifikant weniger
als bei anderen Verfahren, die derzeitig in Verwendung sind, um
amplifizierte Nukleinsäure nachzuweisen.
Der Zeitrahmen für
den Nachweis einer amplifizierten Sequenz wird drastisch verringert.
Es gibt nicht die Gefahr durch potentiell gefährliche Chemikalien. Die Analyse
bedarf keiner speziellen Abfallentsorgungsverfahren. Die Erfordernis
von vielen Waschschritten in einer immunometrischen Methode oder
einer Hybridisierungsmethode wird behoben. Die unabhängige Vorrichtung
benötigt
keine spezielle Ausrüstung,
außer
einem Standardheizblock mit konstanter Temperatur. Die geringe Komplexität der Vorrichtung
bietet sich in „Sachen
sorgfältiger" Tests in Kliniken
und Arztpraxen an. Die Tragbarkeit der Vorrichtung bietet eine Analyse „vor Ort", um Nukleinsäuresequenzen
im Bereich der Forensik, Agrarwirtschaft, Umwelt und Nahrungsmittelindustrie
nachzuweisen.
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Die
Nukleinsäuresondentechnologie
hat sich in den letzen Jahren schnell entwickelt, weil die wissenschaftliche
Gemeinschaft ihren Wert für
den Nachweis von verschiedenen Erkrankungen, Organismen oder genetischen
Abnormalien entdeckt hat. Die Amplifikationstechniken haben die
Sensitivität
bereit gestellt, um quantitativ die Anwesenheit von selbst winzigen
Nukleinsäuremengen
zu bestimmen. Das Manko für
eine weit verbreitete Verwendung dieser Technologie ist die Möglichkeit
von einer Kreuzkontamination der Proben, weil der Test so sensitiv
ist. Die Kosten der nukleinsäurebasierten
Tests sind hoch, weil sie hoch qualifiziertes technisches Personal
und eine komplizierte Ausrüstung
benötigen.
Ein Verfahren die Möglichkeit
der Übertragung von
einer Probe zur einer Anderen zu beseitigen, ist die Verwendung
einer vollständig
abgeschlossenes Einwegvorrichtung.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Diese
Erfindung basiert auf einen neuartigen Konzept für ein Verfahren zum Nachweis
spezifischer DNA- oder RNA-Sequenzen. Die vorliegende Erfindung
ist durch eine unabhängige
Vorrichtung definiert, die die Nukleinsäureextraktions-, Amplifikations-
und Nachweismethodiken zusammenfasst.
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Die
vorliegende Erfindung ist eine unabhängige Vorrichtung, die die
Nukleinsäureextraktion,
die spezifische Zielamplifikation und den Nachweis in einer einzigen
Vorrichtung zusammenfasst, was einen schnellen und genauen Nachweis
der Nukleinsäuresequenz
erlaubt. Die vorliegende Erfindung ist auf alle Nukleinsäuren und
deren Derivate anwendbar. Die vorliegende Erfindung ist für die Identifikation
von spezifischen Nukleinsäuresequenzen
nützlich,
die bestimmten Erkrankungen oder Zuständen entsprechen, sowie für die Überwachung
der Behandlungswirksamkeit von ansteckenden Erkrankungen, sie ist
aber nicht auf diese Anwendungen beschränkt.
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In
der Erfindung umfasst die unabhängige
Vorrichtung einen ersten hohlen gestreckten Zylinder mit einem einzigen
geschlossenen Ende und darin einer Vielzahl von Kammern, einen zweiten
hohlen gestreckten Zylinder, der innen durchgehend angrenzend an
den ersten Zylinder positioniert ist und zu einer relativen Drehung
im Stande ist. Die Probe wird für
die Extraktion in den zweiten Zylinder eingeführt. Die extrahierte Nukleinsäure wird
an eine Festphasenmembran oder Silica gebunden und dadurch durch
die Zugabe des Waschpuffers nicht von der festen Phase eluiert.
Die Amplifikation und die Markierung findet in demselben Zylinder statt.
Schließlich
wird das markierte, amplifizierte Produkt mit Mikropartikeln zur
Reaktion gebracht, die mit rezeptorspezifischen Liganden für den Nachweis
der Zielsequenz konjugiert sind.
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Der
zweite hohle gestreckte Zylinder kann Extraktions- und Amplifikationsmittel
umfassen.
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Die
Probe kann in drei separaten und sequentiellen Kammern extrahiert,
amplifiziert und nachgewiesen werden.
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Andere
Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die
folgende detaillierte Beschreibung, in Verbindung mit den begleitenden
Figuren, die als Beispiel die Prinzipien der vorliegenden Erfindung
darstellen, offensichtlich werden.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf eine unabhängige Vorrichtung,
welche die Nukleinsäureextraktion,
die spezifische Zielamplifikation und den Nachweis zusammenfasst.
Die Erfindung beruht auf den Prinzipien der chromatographischen
Nukleinsäureextraktion
aus der Probe, der Amplifikation der spezifischen Zielnukleotidsequenzen,
was zu einem doppelt markierten Amplifikationsprodukt führt, der
Liganden-Rezeptor-Bindung
und der Mikropartikeltechnologie für den Nachweis der amplifizierten
Nukleinsäure. Darüber hinaus
kann die vorliegende Erfindung auf der Nukleinsäurehybridisierung beruhen.
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Das
Verfahren ist für
die Bestimmung aller Nukleinsäurezielsequenzen
geeignet. Die Sensitivität
und Genauigkeit dieses Verfahrens sind im Vergleich zu den derzeitig
verwendeten Verfahren, die von Fachleuten auf dem Gebiet verwendet
werden, verbessert. Die Erfindung bietet die Möglichkeit für eine kontaminationsfreie,
schnelle und verlässliche
Bestimmung der Anwesenheit von spezifischen amplifizierten Zielnukleinsäuren.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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1 ist
eine perspektivische Ansicht der unabhängigen Vorrichtung, welche
die Nukleinsäureextraktion,
-amplifikation und -nachweis zusammenfasst.
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2 ist ein Schema des bevorzugten Verschlussmechanismus,
welches jede der drei Rotationspositionen der Vorrichtung darstellt:
A) geschlossen; B) offen; und C) eluieren.
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3 ist eine Querschnittsansicht der oberen
und unteren Körpers
der Vorrichtung, welche die klappbare Abdeckung in der offenen Position
zeigt.
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4 ist eine perspektivische Ansicht der
klappbaren Abdeckung und der Reaktionskügelchen, die innerhalb einer
Reaktionskügelchenkammer
enthalten sind, die einer integrierte Messerkante hat.
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5 ist eine Querschnittsansicht des Öffnungsteils
der zweiten hohlen gestreckten Zylinders.
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6 stellt die relative Position des Absorptionsmittelkissens
und Streifens dar, welche die Mikropartikel und Fangzonen haben.
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7 stellt eine sequentielle perspektivische
Ansicht dar, die den Arbeitsablauf der unabhängigen Vorrichtung illustriert.
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8 stellt die Reagenzien und ihre entsprechenden
Interaktion (entsprechende Interaktion?) in der Ampliflkationskammer
der Vorrichtung in einer SDA-Strategie dar.
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9 stellt die Reagenzien und ihre entsprechenden
Interaktionen in einer alternierenden SDA-Strategie dar.
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10 stellt die Reagenzien und ihre entsprechenden
Interaktionen in einem Cycling-Probe-Assay dar.
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11 stellt die Nachweiseergebnisse der
isothermen Amplifikation und den Nachweis mit bifunktional markierten
amplifizierten Zielsequenzen unter Verwendung eines Strangverdrängungsassays
dar.
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12 zeigt
die Nachweisergebnisse eines Lateralflussassays.
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13 zeigt
die Nachweisergebnisse eines anderen Lateralflusses.
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14 stellt eine NASBA-Strategie dar.
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15 zeigt die Ergebnisse des Nachweises
mittels Amplifikation mit einem einzigen markierten Primer, gefolgt
von der Hybridisierung mit einer Sonde, die eine einzige Markierung
enthält.
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- 1
- Erster
hohler gestreckter Zylinder
- 2
- Zweiter
hohler gestreckter Zylinder
- 3
- klappbare
Abdeckung
- 6
- Indizierungsstift
- 7
- Indizierungskerben
- 9
- Absorptionsmittelkissen
- 10
- Streifen
- 11
- Reaktionskügelchen
- 12
- Reaktionskügelchenkammer
- 13
- Öffnung
- 14
- Living-Hinge
- 15
- Dichtungsrand
- 16
- Reservoir
- 17
- feste
Oberfläche
- 18
- Messerkante
- 19
- Folie-
oder Folie/Polymer-Membran
- 20
- Nachweiskammer
- 21
- Transparentes
Sichtfenster
- 22
- Poröse Membran
- 23
- Silicaschlamm
- 24
- farbige
Mikropartikel
- 25
- Fangzone
für Zielsequenz
- 26
- Fangzone
für Kontrollsequenz
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Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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Es
ist selbstverständlich,
dass sowohl die vorhergehende allgemeine Beschreibung als auch die
folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft sind und nur der
Erklärung
dienen und für
die Erfindung, wie sie beansprucht wird, nicht einschränkend sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung für den Nachweis einer amplifizierten
Zielnukleinsäuresequenz
bereit, die in einer Probe vorhanden ist. Es wird von Fachleuten
auf dem Gebiet erkannt werden, dass Assays für ein breites Spektrum an Zielnukleinsäuresequenzen,
die in einer Probe vorhanden sind, in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung durchgeführt
werden können.
Die Proben können
biologische Proben umfassen, die aus landwirtschaftlichen Quellen,
bakteriellen und viralen Quellen oder aus humanen oder anderen tierischen
Quellen stammen, sowie andere Proben wie Abfall oder Trinkwasser,
landwirtschaftliche Produkte, Nährmittel,
Luft, ect. Beispiele schließen
Blut, Stuhl, Sputum, Schleim, Serum, Urin, Speichel, Tränen oder
eine Biopsieprobe, eine histologische Gewebeprobe, ein Gewebekulturprodukt,
ein landwirtschaftliches Produkt, Abfall oder Trinkwasser, Nährmittel,
Luft, ect. ein. Die vorliegende Erfindung ist für den Nachweis von Nukleinsäuresequenzen
nützlich,
die für
genetische Defekte oder ansteckende Krankheiten bezeichnend sind.
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Die
folgenden Definitionen werden für
das Verständnis
der Beschreibung und der Ansprüche
hilfreich sein. Die hierin bereitgestellten Definitionen sollten
berücksichtigt
werden, wenn diese Begriffe in den folgenden Beispielen und durchwegs
in der vorliegenden Anmeldung verwendet werden.
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So
wie er hierin verwendet wird bezieht sich der Begriff „Ziel"-Nukleinsäuremolekül auf das Nukleinsäuremolekül, das durch
die vorliegenden Methoden amplifiziert wird. Das „Ziel"-Molekül kann gereinigt,
teilweise gereinigt oder in einem ungereinigten Zustand in der Probe
vorhanden sein.
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So
wie in dieser Erfindung verwendet bezieht sich der Begriff „Amplifikation" auf einen „Template-abhängigen Prozess", der zu einer Konzentrationszunahme
von einer Nukleinsäuresequenz
relativ zu ihrer Anfangskonzentration führt. Ein „Template-abhängiger Prozess" ist als ein Prozess
definiert, der die „Template-abhängige Extension" eines „Primer"-Moleküls umfasst. Ein „Primer"-Molekül bezieht
sich auf eine Sequenz einer Nukleinsäure, die zu einem Teil der
Ziel- oder Kontrollsequenz komplementär ist und kann oder kann nicht
mit einem Hapten markiert sein. Eine „Template-abhängige
Extension" bezieht
sich auf die Nukleinsäuresynthese
von RNA oder DNA, worin die Sequenz des neu synthetisierten Nukleinsäurestrangs
durch die Regeln der komplementären
Basenpaarung von der Zielnukleinsäure und den Oligonukleotiden
bestimmt wird.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Extraktion und Amplifikation
von Nukleinsäuren
in einer Kammer einer unabhängigen
Vorrichtung, gefolgt von dem Nachweis in einer weiteren Kammer und
der Sammlung des Abfalls in noch einer weiteren Kammer. Die Reaktionskammern
sind funktionell verschieden, sequentiell und kompakt. Die besagten
Kammern liefern genaue Volumina, geben Reagenzien ab und sammeln
den Abfall ein. All dies geschieht in einer vollständig unabhängigen Vorrichtung
mit einfachen, narrensicheren Gebrauchsanweisungen, wie es unten
beschrieben ist.
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Wie
in 1 dargestellt besteht eine Extraktions-, Amplifikations-
und Nachweisvorrichtung aus einem ersten hohlen gestreckten Zylinder 1,
der ein geschlossenes Ende und eine aufgepresste Abdeckung 3 hat, die
an dem entgegengesetzten, offenen Ende hängt, und einem zweiten hohlen
gestreckten Zylinder 2 besteht, der innen angrenzend an
den ersten Zylinder 1 positioniert ist und der zu einer
relativen Rotation in der Lage ist. Die bevorzugte Ausführungsform
des zweiten Zylinders 2 ist ein konischer Zylinder, der
mit einer Öffnung 13 endet,
die einen Dichtungsrand 15 hat. De erste Zylinder 1 besteht
ferner aus 2 Kammern: einer Reservoirkammer 16 und einer
Nachweiskammer 20, wobei die besagte Nachweiskammer ferner
aus einem Kissen 9 und einem Streifen 10 besteht.
Der Großteil
der Vorrichtung ist aus einem Material zusammengesetzt, das nicht
die Bindung von Nukleinsäuren
und Proteinen ermöglicht.
Das bevorzugte Material ist ein hitze- und kältebeständiges Material, das leicht,
starr und stabil ist. Die bevorzugte Größe ist kompakt genug, um in
Heizblöcke
mit konventioneller Größe zu passen,
die Größe kann
jedoch entsprechend herauf- oder herabgesetzt werden. Die bevorzugte
Ausführungsform
setzt die Vorrichtung in einer Umgebung mit konstanter Temperatur ein,
wie einen Heizblock, was gestattet die Reaktionen bei den bevorzugten
Bedingungen mit einer konstanten Temperatur auszuführen.
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Wenn
die Probe in die Vorrichtung eingebracht wird, findet die Nukleinsäureextraktion
und -amplifikation in dem zweiten Zylinder 2 statt, wobei
der besagte erste hohle gestreckte Zylinder 2, der die
Nachweiskammer 20 enthält,
ein Mittel für
den Nachweis hat. Das Reservoir 16 sammelt den in dem Extraktionsprozess und
den anschließenden
Waschschritten verwendeten Lysepuffer.
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Der
zweite Zylinder 2 rotiert relativ zu dem ersten Zylinder 1 und
rastet in der Position A, Position B oder Position C ein. An dem
verjüngtem
Ende des zweiten Zylinders 2 gestattet eine Öffnung 13,
die einen Dichtungsrand 15 hat, dem zweiten Zylinder 2 entweder
mit der Nachweiskammer 20 oder dem Reservoir 16 einzurasten.
Der erste Zylinder 1 enthält zwei Kammern, das Reservoir 16 und
die Nachweiskammer 20. Das Reservoir 16 wird durch
die an den ersten Zylinder 1 angrenzenden Seiten, die Nachweiskammer 20 und
eine poröse
Membran 22 definiert. Die poröse Membran 22 hat
Poren mit einer Größe, die
der Abfallflüssigkeit
gestatten zu passieren. Die klappbare Abdeckung 3 hat einen
Indizierungsstift 6, der für die Arretierung des zweiten
Zylinders 2 in den Positionen A, B oder C verwendet wird.
Der zweite Zylinder 2 ist in der Position A, der geschlossenen
Position, zu dem Reservoir hin geschlossen. In der B-, oder offenen,
Position gestattet der zweite Zylinder 2 den Fluss zu dem
Reservoir 16. In der C-, oder Elutions-, Position sind
das amplifizierte Nukleinsäureziel
und die amplifizierte Nukleinsäurekontrolle
im Stande in die Nachweiskammer 20 zu gelangen. Die klappbare
Abdeckung 3 enthält
auch ein Reaktionskügelchen 11 innerhalb
einer Reaktionskügelchenkammer 12.
Dieses Kügelchen 11 enthält die Reaktionsenzyme
und weitere Reagenzien, die für
den Amplifikationsschritt benötigt
werden. Der zweite Zylinder 2 enthält drei Indizierungskerben 7 für die Einreihung
mit dem Indizierungsstift 6 und die Arretierung der relativen
Rotation der Zylinder 1 und 2.
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In
der Position A ist der zweite Zylinder abgedichtet, was dem Extraktionsschritt
und dem Amplifikationsschritt ermöglicht statt zu finden. In
der Position B ist der zweite Zylinder 2 auf eine Weise
offen, dass die Öffnung
in dem zweiten Zylinder 2 nicht abgedichtet und über dem
Reservoir 16 ist. In der Position C ist der zweite Zylinder 2 auf
eine Weise rotiert, dass der zweite Zylinder 2 nicht verschlossen
ist und die Öffnung über einem
Absorptionsmittelkissen 9 in der Nachweiskammer 20 angeordnet
ist. Das Absorptionsmittelkissen 9 sammelt das amplifizierte
Produkt und leitet das Produkt auf einen Streifen 10 aus
Nylon, Nitrocellulose oder aus einem anderen geeigneten Material.
Der Streifen 10 enthält
farbige Mikropartikel 24 und Fangzonen für die Zielsequenzen 25 und
Kontrollsequenzen 26. Die Nachweiskammer 20 enthält ein transparentes
Sichtfenster 21, um die Reaktionsergebnisse zu beobachten.
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2 stellt die bevorzugte Ausführungsform
des Dichtungsmechanismus der hierin offenbarten Vorrichtung dar.
In der offenen Position A ist der zweite Zylinder 2 durch
einen Dichtungsrand 15 verschlossen. Der Dichtungsrand 15 besteht
aus einem flexiblen Material, dass komprimiert werden kann, wenn
es mit einer festen Oberfläche 17 am
oberen Ende des ersten Zylinders 1 in Kontakt ist. In der
geschlossenen Position B erlaubt die Rotation des zweiten Zylinders 2 relativ
zu dem ersten Zylinder 1 den Inhalten des zweiten Zylinders 2 durch
eine poröse
Membran 22 im Boden des zweiten Zylinders 2 in
das Reservoir 16 zu fließen. In dieser Position erstreckt
sich der Dichtungsrand 15 über die Kompressionsebene hinaus
und gestattet der Flüssigkeit in
das Reservoir 16 zu fließen. Der zweite Zylinder 2 kann
relativ zu dem ersten Zylinder 1 in der Elutionsposition
C gedreht werden. In dieser Position erstreckt sich der Dichtungsrand 15 wieder über die
Kompressionsebene hinaus über
eine Öffnung,
die ein Absorptionsmittelkissen 9 und einen Streifen 10 aus
Membran enthält, die
für den
Nachweisschritt verwendet wird.
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Ein
Querschnitt des oberen 1 und unteren 2 Körpers der Vorrichtung und der
klappbaren Abdeckung 3 in der offenen Position ist in der 3 dargestellt. Der Indizierungsstift 6 ist
auf der klappbaren Abdeckung 3 lokalisiert. Die drei Indizierungskerben 7 sind
auf dem zweiten Zylinder 2 lokalisiert. Das Reaktionskügelchen 11 enthält lyophilisierte
Enzyme und Reagenzien für
die Amplifikationsreaktion. Die klappbare Abdeckung 3 enthält eine
Messerkante 18, die, wenn genügend Druck angewendet wird,
eine Folienmembran 19 durchbricht und das Reaktionskügelchen 11 wird
in den zweiten Zylinder 2 freigesetzt, wie in 4 gezeigt ist.
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Ein
Querschnitt des Bodens von dem zweiten Zylinder 2 ist in
der 5 dargestellt. Der Dichtungsrand 15 enthält eine
poröse
Membran 22, welche die extrahierten Nukleinsäuren bindet,
oder eine poröse
Membran 22, die einen Silicaschlamm 23 in dem
zweiten Zylinder 2 hält.
In 6 ist ein Streifen 10 dargestellt,
der eine Region mit immobilisierten farbigen Mikropartikeln 24 und
zwei Fangzonen 25, 26 enthält. Die Mikropartikel 24 sind
mit einem Rezeptor beschichtet, der für die Ziel- und Kontrollsequenz
spezifisch ist. Die Zielsequenzfangzone 25 enthält Rezeptoren,
die spezifisch für
Haptene auf der Zielsequenz sind, und die Kontrollsequenzfangzone 26 enthält Rezeptoren,
die spezifisch für
Haptene auf der Kontrollsequenz sind.
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Die
folgenden Beispiele dienen dazu die vorliegenden Erfindung zu erklären und
darzustellen. Die besagten Beispiele sind nicht dahin auszulegen
die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken. Es verschiedene Modifikationen
innerhalb des Bereichs der Erfindung möglich.
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Beispiel 1 Probenfluss durch die bevorzugte
Ausführungsform
einer unabhängigen
Vorrichtung
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Die
bevorzugte Ausführungsform
der hierin offenbarten Vorrichtung wird durch zwei hohle gestreckte Zylinder
definiert, einen ersten Zylinder, der ein geschlossenes Ende hat,
wie in 1 dargestellt, für die Extraktion, Amplifikation
und den Nachweis der Nukleinsäuresequenzen.
In der geschlossenen Position A wird die Probe in den zweiten Zylinder 2 eingebracht. Der
zweite Zylinder 2 enthält
trockenen Lysereagenzien für die
Extraktion der Nukleinsäuren.
Die Probe stellt die Flüssigkeit
bereit, die die Lysereagenzien resuspendiert. Nach einer kurzen
Inkubationszeit mit der geschlossenen Abdeckung 3 wird
der zweite Zylinder 2 in der offene Position B gedreht.
Die extrahierte Nukleinsäure
verbleibt in der oberen Kammer an die poröse Membran 22 oder
den Silicaschlamm 23 gebunden, während die Flüssigkeit
in das Reservoir 16 fließt. In dieser Position folgen
mehrere Waschschritte mit Puffer oder Wasser. Als nächstes wird
der zweite Zylinder 2 in die geschlossene Position A gedreht,
sodass der zweite Zylinder 2 abgedichtet ist, es wird Wasser
zugegeben und die Abdeckung verschlossen. Wenn ein ausreichender
Druck auf die klappbare Abdeckung 3 angewendet wird, wird das
Reaktionskügelchen 11 aus
der Reaktionskügelchenkammer 12 freigesetzt
und zu dem zweiten Zylinder 2 durch das Aufbrechen der
Folienmembran 19 mit der Messerkante 18 zugegeben.
Das Reaktionskügelchen 11 trägt die Enzyme,
die für
die Amplifkation notwendig sind, welche in dem Wasser resuspendiert
werden, und die Amplifikation findet auf der Membran 22 oder
dem Silicaschlamm 23 statt, welche die extrahierten Nukleinsäuren enthalten.
Nach einer angemessenen Inkubationszeit wird der zweite Zylinder 2 relativ
zu dem ersten Zylinder 1 in die Elutionsposition C gedreht.
Die Amplifkationsreationsmischung ist in der Lage die Nachweiskammer 20 einzudringen
indem sie auf dem Absorptionsmittelkissen 9 absorbiert
wird. Wenn das Kissen 9 eine ausreichende Flüssigkeitsmenge
absorbiert, wird die Reaktionsmischung auf den Streifen 10 geleitet.
Auf dem Streifen binden die farbigen Mirkopartikel 24 an
die Haptene, die sich aus der Amplifikationsreaktion ergeben, und
wandern zu der Fangzone auf der Membran, wo sie eine sichtbare Nachweislinie
für die
Zielsequenz, wenn sie vorhanden ist, und die Kontrollsequenz bilden.
Die Nachweislinie wird durch das transparente Sichtfenster 21 betrachtet.
Siehe 7.
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Der
zweite Zylinder 2 hat eine Kapazität von 0,001 bis 25 ml. Die
Probe ist Gesamtblut, Sputum, Serum, Plasma, Urin, Fäkalmaterial,
ein Gewebe, Teil eines Organs oder irgendeine andere Quelle, die
Zielnukleinsäuresequenzen
enthalten kann. Die Probe ist von Menschen, Pflanzen oder Tieren
oder kann eine Umweltprobe sein.
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Das
hierin offenbarte Verfahren und der hierin offenbarte Apparat stellen
einen extrem schnellen, ökonomischen
Nukleinsäurenachweis
bereit. Ferner vermindert diese unabhängige Vorrichtung signifikant
das Risiko einer Kreuzkontamination, da weder die Amplifikationsreagenzien
noch die Amplikons manipuliert werden. Die minimale zusätzliche
benötigte
Ausstattung, ein Standradheizblock, und die Einfachheit des Protokolls
gestatten es den Test einfach, irgendwo und mit einer minimalen
Menge an technischer Erfahrung durchzuführen.
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Beispiel 2 Mikropartikelauswahl
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Die
bevorzugten Mikropartikel, die in dieser Erfindung verwendet werden,
sind aus polymeren Materialien zusammengesetzt, wie Latex, Polyethylen,
Polypropylen, Polymethylmethacrylat oder Polystyrol. Es können jedoch
auch eine Vielzahl von anderen synthetischen oder natürlichen
Materialien bei der Herstellung der Mikropartikel verwendet werden,
zum Beispiel Silikate, paramagnetische Partikel und kolloidales
Gold. Die gewöhnliche
Form der Mikropartikel besitzt Oberflächensulfatladungsgruppen, die
durch die Einführung
von funktionellen Gruppen wie Hydroxyl-, Carboxyl-, Amin- und Carboxylatgruppen
modifiziert werden können.
Die funktionellen Gruppen werden verwendet, um eine große Vielfalt
von Liganden und Rezeptoren an die Mikropartikel zu binden. Diese
Gruppen werden auf der Basis ihrer Fähigkeit ausgewählt die
Bindung mit dem ausgewählten
Mitglied des Ligand-Rezeptor-Paar zu unterstützen, entweder durch kovalente
Bindung oder durch Adsorption. Das bevorzugte Verfahren zur Befestigung
des Rezeptors an den Mikropartikel ist die kovalente Bindung.
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Die
Größe der Mikropartikel,
die in dieser Erfindung verwendet werden, wird ausgewählt, um
die Bindung und den Nachweis der markierten Amplikons zu optimieren.
Die Mikropartikel sind in einem Größenbereich von 0,01-10,0 μm im Durchmesser
erhältlich.
Der bevorzugte Durchmesser für
diese Ausführung
der Erfindung ist ein Bereich von 0,01-1,0 μm, wobei spezifisch die Verwendung
von entweder größeren oder
kleineren Mikropartikeln nicht ausgeschlossen wird, soweit erforderlich
bestimmt. Die Mikropartikel werden für die Bindung an den Zielligand
mit einem geeigneten Rezeptor aktiviert. Der bevorzugte Mikropartikel
in der vorliegenden Erfindung ist aus Latex zusammengesetzt, das
einen farbigen Farbstoff enthält.
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In
der vorliegenden Erfindung sind die mikropartikelgebundenen Rezeptoren
spezifisch für
diskrete Haptene, die an den Enden der amplifizierten Nukleinsäuresequenzen
lokalisiert sind. Die Rezeptoren müssen im Stande sein an ihre
spezifischen Bindungspartner (Hapten) zu binden und ferner erfordert
die Veränderung der
derivatisierten Haptene von dem bevorzugten Biotin und Digoxigenin
eine Veränderung
in den Rezeptoren. Die Konjugation der Rezeptoren an den Mikropartikel
wird durch kovalente Bindung oder in entsprechenden Fällen durch
die Adsorption des Rezeptors auf der Oberfläche des Mikropartikels bewerkstelligt.
Die Techniken für
die Adsorption oder die kovalente Bindung der Rezeptoren auf die
Mikropartikel sind im Stand der Technik gut bekannt und bedürfen keiner
weiteren Erklärung.
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Um
die anti-Digoxigenin-beschichteten Mikropartikel herzustellen werden
0,25-1,0 mg/ml anti-Digoxigenin Fab mit einer Suspension inkubiert,
die eine Endkonzentration von 1,0% Mikropartikel/ml enthält. Den Mikropartikeln
und dem Digoxigenin Fab wird ermöglicht
vor der Behandlung mit dem Aktivierungsmittel für die kovalente Bindung für 15 Minuten
zu reagieren. Die Mirkopartikel werden mit EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiamid)
mit einer Endkonzentration von 0-2,5 mM behandelt. Das Fab und die
Mikropartikel werden gemischt und für eine Stunde bei Raumtemperatur
inkubiert. Das ungebundene Fab wird durch aufeinanderfolgende Waschschritte
entfernt und die beschichteten Mikropartikel werden in Aufbewahrungspuffer resuspendiert.
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Die
Lateralflussassays werden auf Nylon- oder Nitrocellulosemembranen
durchgeführt,
die mit Fangzonen aus 1,0 μl
Streptavidin mit Konzentrationen zwischen 0,0 und 1,0 mg/ml ausfindig
gemacht werden.
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Beispiel 3 Amplifikation
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Die
vorliegende Erfindung setzt eine Vielzahl verschiedener Enzyme ein,
um die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz zu bewerkstelligen,
zum Beispiel Polymersasen und Ligasen. Die Polymerasen sind durch
ihre Funktion Nukleosidtriphosphate einzubauen definiert, um einen
3'-Hydroxylterminus
eines „Primermoleküls" zu verlängern. Wie
hierin verwendet ist ein „Primer" ein Oligonukleotid,
dass, wenn es an ein Zielnukleinsäuremolekül hybridisiert wird, einen
3'-Hydroxylterminus,
der durch eine Polymerase verlängert
werden kann, und eine Haptenmarkierung am oder nahe des 5'-Terminus besitzt.
Für die
allgemeine Diskussion betreffend Polymerasen siehe Watson, J.D.
et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, 4. Auflage, W.A. Benjamin,
Inc., Menlo Park, CA. Beispiele für Polymerasen, die in Übereinstimmung
mit den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden können, schließen die
E. coli DNA-Polymerase
I, das große
proteolytische Fragment der E. coli Polymerase I, allgemein bekannt
als „Klenow"-Polymrase, Taq-Polymerase,
T7-Polymerase, T4-Polymerase, T5-Polymerase und die reverse Transkriptase
ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die allgemeinen Prinzipien
und Bedingungen für
die Amplifikation von Nukleinsäuren
unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion wie oben diskutiert
sind im Stand der Technik gut bekannt.
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Beispiel 4 Isothermer Amplifikationsansatz
für den
Nachweis mit markierten amplifizierten Zielsequenzen unter Verwendung
von NASBA
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Die
bevorzugte Ausführungsform
für die
Amplifikation, wobei diese Erfindung verwendet wird, ist eine isotherme
Reaktion wie NASBA (Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,130,238)
oder ein Strangverdrängungsassay
(SDA) (Walker et al. (1992) PNAS 89:392). Das Primärprodukt
der NASBA-Reaktion eine einzelsträngige RNA. Die NASBA-Reaktion
verwendet einen Primer, der einen T7-Polymeraserpromotor enthält. In Folge der
T7-Transkription werden bis zu 100 Kopien der Ziel-RNA hergestellt.
Diese Kopien haben dieselbe Sequenz wie die ursprüngliche
Ziel-RNA. Sie dienen als Templates, die folglich den Zyklus wieder
starten und zu einer millionenfachen Amplifikation des ursprünglichen
Templates führen.
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Um
die NASBA in die hierin offenbarte Vorrichtung zu umfassen wurden
Sonden designed, die die Bildung von einem bifunktional haptenisierten
Amplifikationsprodukt gestatten. Für die NASBA gibt es zwei mögliche Strategien:
1) das Design von Amplifikationsprimer, die haptenisiert sind; und
2) die Verwendung von zwei haptenisierten Fangoligonukleotiden,
die an die Produkt-RNA binden. Siehe zum Beispiel 8 und 9. Das gewählte Modellsystem ist für das HIV
POL-Gen.
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In
der vorliegenden NASBA-Haptenisierungstrategie bindet der T7NASFAM-Haptenisierungsprimer, der
einen T7-Transkriptasepromotor und ein angehängtes Fluoreszein enthält, an die
Ziel-RNA. Ein reverse Transkriptase transkribiert eine DNA-Kopie
der RNA, wie es in Beispiel B der 14 dargestellt
ist. Der ursprüngliche
RNA-Strang wird durch die RNase H verdaut. Es bindet ein reverser
Haptenisierungprimer, P2NASBIO mit einem angehängten Biotin, an die antisense-DNA
und wird durch die DNA-Polymeraseaktivität der reversen Transkriptase
verlängert.
Die Haptenisierungsprimer sind wie folgt.
T7NASFAM (T7-PROMOTORPRIMER):
5'-FLUORESZEIN-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT-3' SEQ ID NR: 1
P2NASBIO
(REVERSPRIMER):
5'-BIOTIN-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA-3' SEQ ID NR: 2
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Das
resultierende doppelsträngige
bihaptenisierte DNA-Intermediat ist in dem Beispiel D der 14 dargestellt. Dieser Komplex ergibt
ein Signal in einer Lateralfluss- oder Slide-Agglutination. Die
T7-RNA-Polymerase bindet an die Promotorregion, um viele Kopien
einer minus-sense-RNA herzustelln, wie in dem Beispiel F der 14 gezeigt ist. Diese RNA trägt zu der
Herstellung des DNA-Intermediats auf eine ähnliche Weise bei. Die zwei
Fangoligonukleotide, wobei jedes ein Hapten aus entweder Fluoreszein
oder Biotin hat, binden an die (-)sense-RNAs, was bifunktionale
haptenisierte Komplexe ergibt. Diese Komplexe ergeben ein Signal in
einer Lateralfluss- oder Slide-Agglutination. Die haptenisierten
Fangoligonukleotide, die designed sind, um an das minus-sense-RNA-Produkt zu binden,
sind:
5C(-)NASBA:
5'-FLUORESZEIN-TGGCCTGGTGCAATAGGCCC-3' SEQ ID NR: 3
3C(-)NASBA:
5'-CCCATTCTGCAGCTTCCTCA-BIOTIN-3' SEQ ID NR: 4
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Beispiel 5 Isothermer Amplifikationsansatz
für den
Nachweis mit einer bifunktional markierten amplifizierten Zielsequenz
unter Verwendung eines Stranverdrängungsassays
-
Der
vorliegende Strangverdrängungsassay
(SDA) ist ein Beispiel für
eine isotherme Amplifikation, die unter Verwendung von Mikropartikeln
und einem bifunktional markierten Produkt nachgewiesen werden kann. Die
SDA-Technologie
ist in dem Patent der Vereinigten Staaten Nr. 5,455,166 der Becton Dickinson
and Company beschrieben. Der SDA ist eine isotherme Amplifikation,
der auf der Fähigkeit
eines Restriktionsenzyms basiert in den unmodifizierten Strang einer
Hämiphosphorthioatform
seiner Erkennungsstelle einen Einzelstrangbruch einzufügen und
der Fähigkeit
der DNA-Polymerase die Replikation an dem Einzelstrangbruch zu iniziieren
und den downstream gelegenen Nichttemplatestrang zu verdrängen. Die
Primer, welche die Erkennungsstellen für die Einzelstrangbruch einfügenden Restriktionsenzyme
enthalten, binden an die entgegengesetzten Stränge der Ziel-DNA an die Positionen,
welche die zu amplifizierende Sequenz flankieren. Das Zielfragment
wird exponentiell amplifiziert, indem die Sense- und Antisensereaktionen
gekoppelt werden, in welchen die Stränge, die von der Sensereaktion
verdrängt
wurden, als Ziel für
die Antisensereaktion und anders herum dienen.
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Diese
Reihe von Experimenten wird mit Compositextensionsprimern durchgeführt, die
mit Biotin, FAM oder Digoxigenin markiert sind. Die Bumperprimer
haben dieselbe Sequenz wie sie von Becton Dickinson and Company
bereit gestellt werden (Franklin Lakes, New Jersey). Die Sequenzen
des Ziels, der Bumperprimer und der Compositextensionsprimer sind
wie folgt:
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Bumperprimer:
-
- B1: 5'-CGATCGAGCAAGCCA
SEQ ID NR: 5
- B2: 5'-CGAGCCGCTCGCTGA
SEQ ID NR: 6
-
Compositextensionsprimer:
-
- S1: 5'-fam/dig-ACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGTAAGGCGTACTCGACC
SEQ ID NR: 7
- S2: 5'-biotin-CGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGTGTACTGAGATCCCCT
SEQ ID NR: 8
-
Zielsequenz:
-
- 5'-TGGACCCGCCAACAAGAAGGCGTACTCGACCTGAAAGACGTTATCCACCATACGGATAGGGGATCTCAGTACACATCGATCCGGTTCAGCG
SEQ ID NR: 9
-
Die
Reaktion wird für
das thermophile Strangverdrängungs-Amplifikations (tSDA)-Protokoll
aufgesetzt, das von Becton Dickinson and Co. entwickelt wurde. Der
Zielorganismus ist Mycobacterium tubercolosis. Für die Teststudien wurde ein
künstliches
Zieltemplate verwendet, bestehend aus einer 91nt Sequenz des M. tuberculosis-Genoms,
die durch die äußeren (Bumper)-Primer von Becton
Dickinson definiert ist. Die verwendeten Amplifikationsbedingungen
sind identisch mit jenen, die von Becton Dickinson für den tSDA
verwendet wurden.
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Die
für dieses
Verfahren verwendete Membran ist Nitrocellulose, bezogen von der
Millipore Corporation, Bedford, MA. Ein Streifen aus Streptavidin
mit einer Konzentration von 1 mg/ml wird mit einer Menge von 1 μl/cm mittels
eines linearen Reagenzstripers (IVEK Corporation, No. Springfield,
VT) 1 cm vom unteren Rand der Membran aufgetragen. Nach dem Auftragen
des Streptavidins wird die Membran getrocknet und dann gegen eine
nichtspezifische Bindung mittels 0,5% Casein in 100 mM Tris, pH
7,4, blockiert. Die Membranen werden zweimal mit Wasser (ddH2O) gewaschen und getrocknet. Als Nächstes werden
3 μl anti-S1
(komplementär zu
S1 ohne die Biotinmarkierung) und/oder S2-Pimer (komplementär zu S2
ohne die DIG- oder FAM-Markierung) auf eine zweite Membran gepunktet.
Diese Membran wird sandwichartig auf die erste Membran gestapelt,
um die freien Primer abzufangen, die mit dem Produkt um die Mikropartikel
oder die Streptavidinfangzone konkurrieren. Die Mikropartikel werden
wie oben in Beispiel 2 zusammengefasst mit entweder anti-Digoxigenin Fab
oder anti-FAM monoklonalem IgG hergestellt. Die Mikropartikel werden
1:2 mit einer 35% Saccharoselösung
verdünnt
und 3 μl
direkt auf die Membran aufgetragen und getrocknet.
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Das
Reaktionsprodukt (10 μl)
wird zu 45 μl
SDA-Puffer zugegeben und dann (50 μl) auf die zuvor bestreifte
Membran angewendet. Das Auftragen der Proben benötigt das bifunktional markierte
Produkt und die konkurrierenden Primer, um die anti-Primer beschichtete
Membran und die getrockneten Mikropartikel zu passieren. Wenn das
Ziel vorhanden ist gibt es eine sichtbare Linie auf der Membran.
Wenn das Ziel nicht vorhanden ist, fehlt die sichtbare Linie. Die
Ergebnisse eines solchen Experiments sind in der 11 gezeigt.
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Beispiel 6 Inhibierungsassay: Verlust
des sichtbaren Signals auf der Lateralflussmembran
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Die
Cycling-Probe-Technologie bezieht eine Nukleinsäuresonde ein, die DNA-RNA-DNA-Sequenzen umfasst,
die designed sind, um mit den Zielsequenzen zu hybridisieren. Siehe
zum Beispiel 10. Die Sonden sind bifunktional
mit Biotin und FAM markiert. Wenn die Sonden mit dem Ziel hybridisieren,
wobei doppelsträngige
Nukleinsäure
gebildet wird, schneidet die RNase H in dem Reaktionspuffer die
Sonden. Diese Spaltung führt
zu einem Signalverlust, wenn auf eine Membran aufgetragen, die eine
Fangzone aus Straptavidin- und anti-FAM-beschichteten, farbigen
Mikropartikeln enthält.
Wenn das Ziel nicht vorhanden ist, gibt es keine sichtbare Linie
auf der Membran.
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Die
spezifische Sonde und das Ziel, die in dem vorliegenden Beispiel
eingesetzt werden, sind von ID Biomedical Corporation für die Verwendung
beim Nachweis von Mycobacterium tuberulosis designed worden. Die
Sonde ist ein chimäres
Konstrukt, das sowohl DNA- als auch RNA-Sequenzen mit Markierungen
an den 5' (FAM)-
und den 3' (Biotin)-Enden
des DNA-Teils der Sonde enthält.
Die Bindung der Sonde an einen Einzelstrang des Ziels bildet eine
doppelsträngige
Nukleinsäure,
welche mit der RNase H geschnitten wird, was folglich die Bifunktionalität der Sonde
beseitigt. Die Sequenz der Sonde ist unten beschrieben:
FARK2S3B-Sonde:
5'-fam AAA GAT GT agag
GGT ACA GA-3'biotin
SEQ ID NR: 10
(Kleinbuchstaben zeigen Desoxyribonukleosidbasen
an)
-
Die
Sequenz des Ziels ist unten beschrieben:
ARK2-T synthetisches
Ziel:
5'-AAT
CTG TAC CCT CTA CAT CTT TAA-3' SEQ
ID NR: 11
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Die
Reaktion wird unter Berücksichtigung
des Protokolls, bereitgestellt von der ID Biomedical Corporation,
vervollständigt.
Die für
dieses Verfahren verwendete Membran ist Nitrocellulose, bezogen
von der Millipore Corporation, Bedford, MA. Ein Streifen aus Streptavidin
mit einer Konzentration von 1 mg/ml wird mit einer Menge von 1 μl/cm mittels
eines linearen Reagenzstripers (IVEK Corporation, No. Springfield,
VT) 1 cm vom unteren Rand der Membran aufgetragen. Nach dem Auftragen
des Streptavidins wird die Membran getrocknet und dann gegen eine
nichtspezifische Bindung mittels 0,5% Casein in 100 mM Tris, pH
7,4, blockiert. Die Membranen werden zweimal mit Wasser (ddH2O) gewaschen und getrocknet. Die Mikropartikel
werden wie oben in Beispiel 2 umrissen hergestellt, wobei der anti-Digoxigenin
Fab durch anti-FAM monoklonalem IgG ersetzt wird.
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Das
Reaktionsprodukt (10 μl)
wird zu 5 μl
0,1% anti-FAM-beschichteten Mikropartikeln (0,1%) und 35 μl Wasser
zugegeben, und dann auf die vorher bestreifte Membran aufgetragen.
Die Bindung der Sonde an das Ziel gefolgt von der Spaltung der Sonde
durch die RNase H führt
zu einem Bifunktionalitätsverlust
der Sonde. Wenn das Ziel vorhanden ist, fehlt eine sichtbare Linie
auf der Membran. Wenn das Ziel nicht vorhanden ist, ist die bifunktional
markierte Sonde im Stande die anti-FAM-beschichteten Mikropartikel
und das an die Membran gebundene Straptavidin zu binden, was zu
einer sichtbaren Linie führt.
Die Ergebnisse einem solchen Experiments sind in der 12 gezeigt.
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Mit
der Amplifikation wirken bestimmte Proben hemmend auf die Amplifikation,
was falschnegative Ergebnisse liefert. Um dieses Problem zu vermeiden
wird eine Positivkontrolle – eine
Kontrollnukleinsäure
mit Primererkennungsstellen, die an eine vollkommen irrelevante
Nukleinsäuresequenz
angehängt
sind – umfasst. Dieser
Positivkontrollenprimer ist ein Bestandteil der Nukleinsäureextraktionsreagenzien
in dem zweiten Zylinder der Vorrichtung, was folglich die Probenextraktion
und -zulieferung kontrolliert sowie das Versagen der Amplifikation
nachweist. Die bevorzugte Ausführungsform
der Positivkontrolle ist eine Lambda-DNA-Sequenz. Die Kontrollnukleinsäure wird
extrahiert und zusammen mit der Zielnukleinsäure amplifiziert und durch
eine Linie aus immobilen Digoxigeninkügelchen auf der festen Nachweisphase
nachgewiesen.
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Der
Zieloligonukleotidprimer und der Kontrolloligonukleotidprimer, die
in dieser Erfindung verwendet werden, enthalten wenigstens ein Hapten
als Markierung, das an der Primingreaktion nicht beteiligt ist.
Das Hapten ist wenigstens an eine Position des Nukleinsäureprimers
gebunden. Für
die Derivatisierung der Nukleinsäureprimer
können
verschiedene Verfahren eingesetzt werden. Siehe Maniatis, oben.
Die Einführung
des Haptens kann enzymatisch, chemisch oder photochemisch erfolgen.
Das Hapten kann direkt an das 5'-Ende des
Primers derivatisiert werden oder eine Brücke von 1 bis 30 Atomen Länge enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Brücke
linear. In einer anderen Ausführungsform
besteht die Brücke
aus einer verzweigten Kette mit einem Haptenmolekül an wenigstens
einem der Kettenenden. Anhand der Anwesenheit von mehreren Haptenmolekülen an den
Enden der verzweigten Kette wird die Nachweissensitivität erhöht. Die
bevorzugten Haptene der vorliegenden Erfindung sind Biotin und Digoxigenin,
es sind jedoch andere Haptene geeignet, die einen Rezeptor als spezifisches
Bindungsreagenz zur Verfügung
haben, zum Beispiel Steroide, Halogene und 2,4-Dinitrophenyl.
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Beispiel 7 Nachweis des bifunktional markierten
amplifizierten Produkts
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Die
für dieses
Verfahren verwendete Membran ist Nitrocellulose, bezogen von der
Millipore Corporation, Bedford, MA. Ein Streifen aus Streptavidin
mit einer Konzentration von 1 mg/ml wird mit einer Menge von 1 μl/cm mittels
eines linearen Reagenzstripers (IVEK Corporation, No. Springfield,
VT) 1 cm vom unteren Rand der Membran aufgetragen. Nach dem Auftragen
des Streptavidins wird die Membran getrocknet und dann gegen eine
nichtspezifische Bindung mittels 0,5% Casein in 100 mM Tris, pH
7,4, blockiert. Die Membranen werden zweimal mit Wasser (ddH2O) gewaschen und getrocknet.
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Das
Amplifikationsprodukt wird zu den Membranen mit farbigen rezeptorbeschichteten
Kügelchen
mit Konzentrationen von 0,001-1,0% Mikropartikeln/ml zugegeben.
Dieser Mischung wird ermöglicht
in die Membran gesaugt zu werden. Positive Reaktionen führen zu
einer farbigen Linie, wo das Fangmaterial aufgetragen ist. Amplifikationsreaktionen,
ohne dass die Zielsequenz zu der Reaktion zugegeben wurde, dienen
als Negativkontrollen. Die Ergebnisse von einem dieser Experimente
sind in der 13 dargestellt.
-
Wenn
die Ziel- und die Kontrollnukleinsäuresequenz vorhanden sind,
interagiert der an die Mikropartikel gebundene Rezeptor mit dem
Hapten(en), um die amplifizierte Nukleinsäure zu fangen. Das Ergebnis
ist eine Linie aus gefärbten
Partikeln, die auf der Membran für
die Ziel- und die Kontrollnukleinsäuren sichtbar ist. Wenn das
Ziel nicht vorhanden ist, werden die gefärbten Partikel nicht gefangen
und sind nicht sichtbar. Wenn das Ergebnis der Analyse negativ ist,
müssen
die Kontrollnukleinsäuresequenzen
sichtbar sein, was anzeigt, dass die Extraktion und die Amplifikation
korrekt durchgeführt
wurden.
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Beispiel 8 Nachweis durch die Amplifikation
mit einem einfach markierten Primer, gefolgt von der Hybridisierung
mit einer Sonde die eine einzige Markierung enthält
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Die
Zielnukleinsäuresequenz
wird mittels PCR amplifiziert, wobei eine 200-1000 mM Primerkonzentration,
der GeneAmp EZ rTth RNA PCR-Kit (Perkin Elmer Corp., Alameda, CA)
und 106 Kopien/ml der ziel-HIV-RNA-Sequenz verwendet
werden. Es wurden 40 PCR-Zyklen ausgeführt, wobei jeder 60°C für 15 Minuten,
95°C für 15 Sekunden
und 55°C
für 60
Sekunden war.
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Die
Sequenzen für
die Primer sind wie folgt:
SK38 Dig Primer:
5'-DIG ATA ATC CAC
CTA TCC CAG TAG GAG AAA T-3' SEQ
ID NR: 12
SK39 Primer:
5'-TT TGG TCC TTG TCT TAT GTC CAG AAT
GC-3' SEQ ID NR:
13
-
Die
spezifischen PCR-Reaktionsbedingungen sind unten beschrieben:
| Reagenz | Endkonzentration |
| 5X
EZ-Puffer | 1x |
| Mn(OAc)2 | 3
mM |
| rTth-Polymerase | 5
U |
| dntp's | jeweils
240 μM |
| SK38 | 1 μM |
| SK39 | 1 μM |
die rTth-DNA-Polymerase ist von Perkin Elmer N808-0097
-
Das
SK38 Dig--SK39-Amplikon (5 μl)
wird mit 5 μl
25 μM (125
pMol) SK39 Biotin bei 95°C
für 1 Minute inkubiert
und dann bei 55°C
für 1 Minute.
Das Amplikon, gebunden an die anti-Digoxigenin-Mikropartikel, wird durch
die Membran zu der Streptavidinlinie gesaugt und durch die Interaktion
von Biotin und Streptavidin gefangen. Das Ergebnis ist eine sichtbare
Linie aus farbigen Mikropartikeln.
-
In
der Negativkontrolle wird das Verfahren wie oben beschrieben durchgeführt, aber
ohne die Zugabe der Zielsequenz. Ohne die Anwesenheit der Zielsequenz
in der Amplifikationsreaktion wird das bifunktional markierte Amplikon
nicht gebildet und die sichtbare Nachweislinie ist nicht vorhanden.
Die Ergebnisse von einem solchen Experiment sind in der 15 gezeigt.
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Beispiel 9 Extraktion der Nukleinsäuren mit
Guanidiumthiocyanat auf Glass (Silicadioxid) und anschließende Amplifikation
ohne die Elution von dem Silicadioxid
-
Es
wurde eine Säure
konstruiert, wobei eine Ansys 0,4 mm Membran als ein Filter verwendet
wurde, um das Silicadioxid zu enthalten, und einen Spritzenapparat,
um den Puffer in etwa 15 Sekunden durch die Säule zu ziehen. Es werden 50 μl Serum,
2 μl SiO2 (0,5 mg/μl)
und 450 μl
GuSCN-Lysepuffer durch Vortexen gemischt und dann bei Raumtemperatur
für 10
Minuten inkubiert. Der spezielle Lysepuffer für die vorliegende Reihe von
Experimenten enthält
14,71 g GuSCN (4 M final), 0,61 ml „Triton X-100", 5,5 ml 0,2 M EDTA
pH 8,0 und wird q.s. auf 31,11 ml mit 0,1 M Tris-HCl, pH 6,4, aufgefüllt. Das
Sicliadioxid wird zweimal mit 500 μl 70% EtOH gewaschen.
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Als
Nächstes
wird der Filter mit dem SiO2 aus der Säule entfernt
und das SiO2 von der Membran unter Verwendung
von 20 μl
Wasser (ddH2O) ausgewaschen. Es werden 5 μl Silicadioxidschlamm
zu der PCR-Reaktion unter Verwendung des Standardprotokolls für das HIV-Modelsystem
zugegeben, wie es oben im Beispiel 8 detailliert beschrieben ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein schnelles, einfaches und genaues
Verfahren zum Nachweis von amplifizierten Zielnukleotidsequenzen
mit einer unabhängigen
Vorrichtung bereit. Die Sensitivität und Spezifität des Nachweises
basieren auf der Markierung des Ziels während dem Amplifikationsprozess,
durch die Einführung
einer Markierung oder durch die anschließende Hybridisierung mit einer
markierten Sonde. Das Verfahren benötigt keine kostenintensive
und komplizierte Ausrüstung
oder speziell angelerntes Personal, noch stellt es irgendeine Gesundheitsgefahr
dar.
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Während die
oben genannte Beschreibung viele Spezifizitäten enthält, sollten diese nicht als
Einschränkungen
für den
Bereich der Erfindung ausgelegt werden, sondern vielmehr als eine
Veranschaulichung der bevorzugten Ausführungsformen davon. Es sind
viele andere Variationen möglich,
wie die Amplifikation mehrerer Zielproben in derselben Reaktionsmischung,
wobei neu entdeckte Polymerasen und Ligasen, ect. verwendet werden.
Folglich sollte der Bereich der Erfindung eher durch die beigefügten Ansprüche bestimmt werden
als durch das gegebene Beispiel. SEQUENZLISTE
