DE69637150T3

DE69637150T3 - Für das Beta-A4 (1-42) Peptid spezifischer monoklonaler Antikörper

Info

Publication number: DE69637150T3
Application number: DE69637150T
Authority: DE
Inventors: Gerhard Konig; Paul Graham
Original assignee: Janssen Alzheimer Immunotherapy; Wyeth LLC
Current assignee: Janssen Sciences Ireland UC; Wyeth LLC
Priority date: 1995-02-14
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 2012-03-15
Anticipated expiration: 2016-02-15
Also published as: EP0809656A1; US5693753A; ES2288896T5; DK1160256T4; ES2167548T3; EP1160256B8; DE69637150D1; EP1842859A3; EP1160256A2; PT809656E; EP1842859B1; CA2212887C; US5786180A; CA2212887A1; ATE210681T1; WO1996025435A1; HK1114105A1; DE69617916D1; DK0809656T3; DE69637150T2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Anmeldung betrifft die Alzheimersche Krankheit, insbesondere einen monoklonalen Antikörper, der für das βA4-Peptid spezifisch ist, das von einem Amyloid Vorläuferprotein abgeleitet ist, Verfahren zum Hervorrufen solcher monoklonaler Antikörper und Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit solcher Antikörper im Gewebe.
Hintergrund
Die Alzheimersche Krankheit (engl.: Alzheimer's Disease (AD)) ist eine irreversible, progressive neurodegenerative Gehirnstörung. Über den Verlauf mehrerer Jahre führt die Progression von AD zu Gedächtnisverlust, Demenz und schließlich zum Tod. Derzeit ist sie die vierthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten, die ungefähr 100.000 Todesfälle jährlich bedingt. Typischerweise betrifft AD hauptsächlich ältere Menschen, und es wird deshalb erwartet, dass sie mit der Alterung einer modernen Gesellschaft ein zunehmender gesundheitlicher Belang in der nahen Zukunft sein wird. Bald nach dem Beginn der Krankheit benötigen Patienten Hilfe rund um die Uhr. Dies stellt sowohl ein gewaltiges psychologisches als auch ein finanzielles Problem für unsere Gesellschaft dar. Derzeit sind keine erwiesenen Mittel zur Diagnose, Verhinderung, Behandlung oder Heilung von AD vorhanden.
Neuropathologisch wird AD durch einen massiven neuronalen Zellverlust in bestimmten Gehirnarealen und durch die Ablagerung von proteinartigem Material in den Gehirnen von AD Patienten charakterisiert. Diese Ablagerungen sind das intrazelluläre neurofibrilläre Gewirr (engl.: tangles) und die extrazellulären β-Amyloidplaques. Der bedeutende Proteinbestandteil der β-Amyloidplaque ist das βA4-Peptid. Eine Sequenzanalyse von gereinigtem β-Amyloidplaque Material und eine Massenspektrometrie zeigten, dass die maximale Länge des βA4-Peptids 43 Aminosäuren beträgt. Typischerweise können jedoch Spezies des Peptids auch entweder bei Position 40 oder Position 42 enden (Miller et al., 1993, Arch. Biochem. Biophys. 301: 41–52). Ähnlich kann am N-Terminus eine bestimmte Uneinheitlichkeit beobachtet werden, die zu verschiedenen Formen des Peptids führt, die hauptsächlich bei Position 1, 4 oder 11 beginnen (Miller et al., 1993).
Molekulares Klonieren zeigte, dass das βA4-Peptid von einem viel größeren Vorläuferprotein abgeleitet wird, welches als das ”Amyloid Vorläuferprotein” (engl.: Amyloid Precursor Protein (APP)) bezeichnet wird (Kang et al., 1987, Nature 325: 733–736) (1). 1 zeigt das Amyloid Vorläuferprotein (APP), das ein Transmembran (Tm = Membranbereich) Protein ist, wobei der N-Terminus extrazellulär lokalisiert ist und der C-Terminus intrazellulär (zytoplasmatisch) lokalisiert ist. βA4 ist teilweise in die Membran eingebettet. Mehrere alternativ gespleißte Isoformen sind beschrieben worden, die ausgiebige posttranslationale Modifikationen durchlaufen (Selkoe, 1994, Ann. Rev. Neurosci. 17: 489–517). Die βA4-Sequenz selbst ist teilweise auf der extrazellulären Seite lokalisiert und dehnt sich teilweise in den Transmembran Bereich aus (2). 2 (SEQ ID NR. 3) zeigt die βA4-Sequenz, von der gezeigt ist (eingekreistes Areal), dass sie sich mit ihrem C-terminalen Ende in den Transmembran Bereich (Tm, Areal im Kasten) erstreckt und das N-terminale Ende im extrazellulären Teil lokalisiert ist. Die Sternchen geben den Ort familiengebundener Mutationen im APP Gen an; sie grenzen entweder an die βA4-Sequenz an oder sind im mittleren Anteil der βA4-Sequenz zentriert. Die drei bedeutenden Schnittstellen (α, β und γ) in APP sind angegeben. Für eine Freisetzung von βA4 wurde deshalb vorausgesetzt, dass sie durch die proteolytische Wirkung einer oder mehrerer Proteasen am N-Terminus (β-Abschnitt) und am C-Terminus (γ-Abschnitt) des Peptids auftritt (2) (Selkoe, 1994). Das Hauptereignis während der Sekretion von APP findet am α-Abschnitt statt (Position 16/17 von βA4 ”1–42”). Dieses sezernierte APP Molekül (αAPPs) enthält die ersten 16 Aminosäuren der βA4-Sequenz an seinem Carboxylende. Die übrigen Zell assoziierten APP Fragmente (sogenannte C-terminale Fragmente) (CTFs)) enthalten den C-terminalen Anteil der βA4-Sequenz und erstrecken sich in den zytoplasmatischen Bereich des APP. Deshalb führt dieser proteolytische Abschnitt zu Fragmenten, die nicht in einer solchen Weise verarbeitet werden können, die direkt oder indirekt zu amyloidogenen Fragmenten führt (nicht amyloidogene Verarbeitung) (Selkoe, 1994).
Vor kurzem wurde gezeigt, dass Zelllinien, die große Mengen an APP durch ein stabil transfiziertes APP cDNA Konstrukt exprimieren, hohe pikomolare bis geringe nanomolare Mengen an βA4 erzeugen und es schnell in das Medium freisetzen (Shoji et al., 1992, Science 258: 126–129). Es ist auch festgestellt worden, dass nahezu jede primäre Zellkultur oder Zelllinie βA4 konstitutiv freisetzt (Busciglio et al., 1993, PNAS USA 90: 2092–2096). Zusätzlich ist sowohl durch gesunde Kontrollen als auch Alzheimer Patienten gezeigt worden, dass sie geringe nanomolare Mengen an βA4 in Seren und CSF aufweisen (Seubert et al., 1992, Nature, 359: 325–327). Der Großteil der nachgewiesenen löslichen βA4 Spezies in diesen Körperflüssigkeiten und konditionierten Medien war βA4 ”1–40”, was die gesamte Zusammensetzung nicht genau widerspiegelt, die in β-Amyloidplaque Ablagerungen festgestellt wurde. Die Ansicht, dass die Erzeugung und anschließende Freisetzung von βA4 ausreichend ist und deshalb für den Aufbau von β-Amyloidplaques in den Gehirnen von AD Patienten verantwortlich ist, konnte deshalb nicht länger aufrechterhalten werden; andere Faktoren müssen zu der Ablagerung von β-Amyloidplaques beitragen. Eine ersichtliche Hypothese ist, dass eine akute oder chronische Überproduktion von βA4 die erhöhte Amyloidladung verursacht, die bei AD beobachtet wird.
Das Ergebnis, dass spezifische Punktmutationen in und um den βA4-Bereich des APP Gens mit bestimmten familiengebundenen Alzheimerschen Krankheitsfällen (engl.: familial Alzheimer's disease (FAD)) verknüpft sind, zeigte eindeutig, dass das APP Gen ein ”Krankheitsgen” ist (Goate et al., 1991, Nature 349: 704–706; Murrell et al., 1991, Science 254: 97–99; Levy et al., 1990, Science 248: 1124–1126; Carter et al., 1992, Nature Genetics 2: 225–256). In Familien, in denen AD dominant mit einem spezifischen Alter des Beginns vererbt wird, sind die Punktmutationen im APP Gen notwendig und hinreichend, um AD zu verursachen. Obwohl die große Mehrheit von Alzheimer Krankheitsfällen sporadisch und wahrscheinlich multifaktoriell ist, können uns diese familiengebundenen APP Mutationen eine große Menge über Amyloidgenese lehren, d. h. das Hervorrufen des kleinen βA4-Peptids aus dem größeren Vorläufer und seine anschließende Ablagerung in β-Amyloidplaques.
Die Doppelmutation beim APP Codon 670/671 (die ”Schwedische Variante” am N-Terminus von βA4 im APP) verursacht eine 5- bis 8-fach höhere Freisetzung von βA4 in Zellkulturen, die mit dieser mutierten APP cDNA stabil transfiziert sind (2) (Citron et al., 1992; Cai et al., 1993). Es ist denkbar, dass diese Doppelpunktmutation zu einem erhöhten Umsatz von APP aufgrund erhöhter Proteolyse am β-Abschnitt führt, was wiederum zu einem höheren Spiegel an freigesetztem βA4 führt. Erhöhte Mengen von βA4-Monomeren, wie durch Transfektionsstudien mit der ”Schwedischen Mutation” gezeigt wurde, können die schnelleren Kinetiken einer βA4-Aggregation zu β-Amyloidplaques in diesen Familien erklären.
Eine andere FAD Mutation liegt C-terminal von βA4 bei Position 717 (”London Variante”) und beeinflusst den Spiegel an freigesetztem βA4 in einer Gewebekultur nicht (2). Es wurde vor kurzem gezeigt, dass diese 717 Mutation das ”1–40/1–42” βA4-Verhältnis verändert (Suzuki et al., 1994, Science 264: 1336–1340). Obwohl es momentan nicht klar ist, wie das Hervorrufen des C-Terminus von βA4 auftritt, da dieser Teil in den Transmembran Bereich eingebettet ist, ist es verlockend anzunehmen, dass die ”London Mutation” den proteolytischen Zusammenbruch von APP zu βA4 beeinflusst. Möglicherweise beeinträchtigt diese Punktmutation die Schneidegenauigkeit der verantwortlichen Protease an der γ-Stelle. βA4 1–40 zeigt unter anderem einen dramatischen Unterschied in seiner Löslichkeit in wässrigen Lösungen, wenn es mit βA4 1–42 verglichen wird (Burdick et al., 1992, JBC 267: 546–554). Das letztere ist nahezu unlöslich in Wasser, wobei 1–40 bis zu mehreren mg/ml in vitro wasserlöslich ist. Geringe Mengen der längeren 1–42 Form können eine Präzipitation von 1–40 in vitro dramatisch verstärken. Ein leicht höherer Anteil der längeren 1–42 βA4Spezies würde den frühen Beginn einer Ablagerung von βA4 zu β-Amyloidplaques in Patienten mit dieser ”London Mutation” erklären. Der Anteil der 1–42 Spezies zu der kürzeren löslicheren 1–40 Spezies kann auch einer der entscheidenden Faktoren in den sporadischen AD Fällen sein (d. h. Fälle, in denen keine genetische Prädisposition identifiziert wurde). Monoklonale Antikörper, die spezifisch an die 1–42 Spezies binden, sind deshalb nützlich, um die Erzeugung und Anwesenheit von βA4 Spezies zu untersuchen, die bei der Aminosäureposition 42 enden, und können als ein diagnostischer Indikator abnormer Spezies verwendet werden, die bei AD anwesend sind.
Kürzliche biochemische Analysen mit einem Antikörper, der eine βA4-Endung bei Position 40 erkennt, und einem Antikörper, der βA4 Spezies erkennt, die sich bis zu Position 42 oder weiter ausdehnen, zeigten dass der Beitrag der längeren βA4Speziesen entscheidend für den Beginn der Krankheit sein könnte (Suzuki et al., 1994). Jedoch unterscheiden die monoklonalen Antikörper von Suzuki nicht zwischen βA4 1–42, 1–43 und längeren βA4 Spezies. Dies ist auch der Fall für einen anderen monoklonalen Antikörper 2G9, über den berichtet wurde (Yang et al., 1994, Neuro Report 5: 2117–2120). Um diese Kreuzreaktivität zu vermeiden, würden deshalb Antikörper, die für βA4 Spezies spezifisch sind, die bei Position 42 enden, zum Ausschluss der anderen Formen sehr nützlich sein, um eine Kreuzreaktivität mit Membran assoziierten C-terminalen APP Fragmenten zu vermeiden, die typische zelluläre Produkte sind, die nicht notwendigerweise mit den β-Amyloidplaques assoziiert sind.
Ein monoklonaler Antikörper, der βA4 1–42 erkennt, ist beschrieben worden (Murphy et al., 1994, Am. J. Path., 144: 1082–1088). Jedoch wurde die βA4 1–43-Peptidart in diesen Untersuchungen nicht verwendet, somit ist es nicht bekannt, wie die genaue Spezifität dieses monoklonalen Antikörpers in einer Antwort auf das 1–43 Peptid sein würde. Kompetitionsuntersuchungen wurden mit diesem Antikörper nur mit βA4-Peptiden durchgeführt, die bei Position 40 (”1–40”) und Position 44 (”1–44”) und darüber hinaus enden. Es ist wichtig anzumerken, dass von diesem Antikörper berichtet wurde, dass er diffuses Amyloid, fibrilläres Amyloid, intraneuronales und extraneuronales neurofibrilläres Gewirr, aber kein vaskuläres Amyloid färbt.
Ein in vitro biochemischer diagnostischer Test für die Alzheimersche Krankheit in ihren frühen Stadien sowie ein Mittel zum Screenen nach gefährdeten AD Personen ist nicht verfügbar. Die derzeitige Diagnose von AD benötigt eine detaillierte klinische Evaluierung, die keine klaren Antworten geben kann bis sich signifikante Symptome von Demenz und Gedächtnisverlust manifestiert haben. Im Hinblick auf die Forschung, auf die oben Bezug genommen wird, stellt βA4 1–42 eine präklinische Markierung für AD dar. Somit wird ein Identifizieren des Spiegels von βA4 1–42 oder der Aufbau von βA4 1–42 oder anderen bei Rest 42 endenden Spezies und wie dieser während des Verlaufs der Krankheit fortschreiten kann und wie er im Gehirn verteilt ist, wertvolle Einsichten sowohl in ein Überwachen des Verlaufs von AD als auch für eine spezifische Diagnose und mögliche Behandlung von AD bereitstellen.
Es wäre zum Herstellen diagnostischer Tests, Therapeutika und für Überwachungsassays von AD nützlich, einen monoklonalen Antikörper zu haben, der im Gegensatz zu der Spezifität derzeit verfügbarer Antikörper (kreuzreaktiv mit 1–43; es wird berichtet, dass sie kein vaskuläres Amyloid färben) kein vaskuläres Amyloid färbt und für βA4-Peptid spezifisch ist, das bei Rest 42 endet, und deshalb die diagnostischen Fähigkeiten des Standes der Technik ausdehnt, d. h. einer, der den freien C-Terminus von βA4 1–42 erkennt und diffuses und fibrilläres Amyloid, neurofibrilläres Gewirr und vaskuläres Amyloid färbt. Ein solcher Antikörper ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper bereit, welcher spezifisch an ein βA4(1–42)-Peptid, welches mit diffusem Amyloid, fibrillärem Amyloid, neurofibrillärem Gewirr und vaskulärem Amyloid in Verbindung gebracht wird, und nicht an βA4(1–40)- und βA4(1–43)-Peptid bindet.
Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper bereit, der für das βA4-Peptid, insbesondere den C-Terminus von βA4 ”1–42”, spezifisch ist und diffuses und fibrilläres Amyloid, neurofibrilläres Gewirr und vaskuläres Amyloid färbt. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper bereit, der für alle βA4-Peptide spezifisch ist, bei denen der C-Terminus einen Rest 42 der βA4-Aminosäuresequenz aufweist. Die vorliegende Erfindung umfasst weiter Antikörperfragmente und Konstrukte davon, welche dieselbe Bindungsspeziftät aufweisen. Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann in diagnostischen, Reinigungs- und therapeutischen Verwendungen verwendet werden.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform umfasst einen monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 2, welcher spezifisch an ein βA4(1–42)-Peptid und nicht an βA4(1–40)- und βA4(1–43)-Peptide bindet, erhältlich durch das Immunisieren eines Säugetiers mit dem Peptid Cys-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala (SEQ ID NR. 1), welches an einen geeigneten immunologischen Träger gekoppelt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Protein bereit, das ein immunologisch aktives Fragment des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers ist.
Ein geeigneter monoklonaler Antikörper ist als 369.2B identifiziert und wird durch die Zelllinie erzeugt, die in der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Zugangsnummer HB 11829 abgelegt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Hervorrufen des erfindungsgemäßen Antikörpers bereit, welches das Immunisieren eines nicht-menschlichen Säugetiers mit dem Peptid Cys-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala (SEQ ID NR. 1) umfasst, welches an einen geeigneten immunologischen Träger gekoppelt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines βA4-Peptids, welches bei Position 42 Ala endet, in Gewebe bereit, umfassend das Inkontaktbringen einer Gewebeprobe mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder dem erfindungsgemäßen Protein durch das Nachweisen der Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers oder des Proteins in einer selektiven Weise. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum selektiven Aufreinigen eines βA4-Peptids bereit, welches bei Position 42 Ala endet, umfassend das Inkontaktbringen einer zu reinigenden Probe mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder dem erfindungsgemäßen Protein, das Trennen des βA4-Peptids, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, von der zu reinigenden Probe und das Isolieren des βA4-Peptids, welches bei Aminosäure 42 Ala endet. in einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen eines βA4-Peptids bereit, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, welches mit der Alzheimerschen Krankheit in Verbindung gebracht wird, umfassend das Inkontaktbringen der zu testenden Probe mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder dem erfindungsgemäßen Protein und das Nachweisen der Anwesenheit des βA4-Peptids, welches bei Aminosäure 42 Ala endet.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zum Verhindern der Aggregation von βA4-Peptid, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, in vitro bereit, umfassend das Verabreichen des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers oder des erfindungsgemäßen Proteins. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der monoklonale Antikörper mit 369.2B identisch, oder er ist ein immunologisch aktives Fragment mit einer äquivalenten Bindungsspezifität davon.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit eines βA4-Peptids bereit, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, umfassend ein immunologisch reaktives Fragment des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers. Ebenso wie Mittel zum Verhindern der Aggregation von βA4-Peptid, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, umfassend ein immunologisch reaktives Fragment des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers, stellt die vorlegende Offenbarung ein Mittel zum Nachweisen und Überwachen des Spiegels von βA4-Peptid, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, in Gewebe oder Flüssigkeitsproben bereit (z. B. in Blut, anderen Körperflüssigkeiten, Gewebeteilen, Biopsiegeweben, etc.).
Die vorliegende Erfindung stellt auch den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder das erfindungsgemäße Protein zur Verwendung für das Nachweisen der Anwesenheit des βA4-Peptids bereit, welches bei Aminosäure 42 Ala endet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder das erfindungsgemäße Protein zur Verwendung für das Verhindern der Aggregation des βA4-Peptids bereit, welches bei Aminosäure 42 Ala endet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Kit zum Nachweisen der Anwesenheit von βA4-Peptid bereit, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, umfassend den erfindungsgemäßen Antikörper oder das erfindungsgemäße Protein und ein Mittel zum Nachweisen des Antikörpers oder des Proteins.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Formulierung bereit, umfassend den erfindungsgemäßen Antikörper oder das erfindungsgemäße Protein.
Die vorliegende Erfindung steht auch den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder das erfindungsgemäße Protein zur Verwendung in der Verhinderung oder in der Behandlung der Alzheimerschen Krankheit bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Antikörpers oder des erfindungsgemäßen Proteins in der Herstellung eines Kits zur Diagnose der Alzheimerschen Krankheit bereit.
Besondere, bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen werden durch die folgende detailliertere Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und der Ansprüche klarer.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird durch eine Betrachtung der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen vollständiger verstanden, in denen:
1 eine schematische Darstellung ist, das den βA4-Anteil des Amyloid Vorläuferproteins (APP), seine Lage relativ zur Zelimembran und die α, β und γ Schnittstellen zeigt;
2 den βA4-Anteil von APP, seine Position relativ zum Transmembran Bereich einer Zelle und die drei Hauptschnittstellen (α, β und γ) im APP zeigt;
3 ein Diagramm des Klons pGK003 darstellt, der zum Hervorrufen des βA4 1– 42-Peptids verwendet wurde;
4A ein SDS-PAGE auf einem 16% Tris/Tricin Gel von in vitro translatiertem, radioaktiv markiertem βA4 in einem Weizenkeim System zeigt;
4B ein SDS-PAGE auf einem 16% Tris/Tricin Gel von in vitro translatiertem, radioaktiv markiertem βA4 von einem Weizenkeimsystem zeigt, das mit MAb 286.8A immunpräzipitiert wurde;
5 eine Graphik darstellt, die eine Immunpräzipitation von in vitro translatiertem βA4 (IVT βA4) mit 286.8A zeigt;
6 ein Diagramm des Peptids darstellt, das verwendet wurde, um die Immunantwort hervorzurufen (Immunogen) und die Seren von Mäusen zu screenen;
7 eine Graphik darstellt, die eine Immunpräzipitation von in vitro translatiertem βA4 vs. eine Antikörperkonzentration zeigt; -O- 286.8A, -Δ- 369.2B, -☐- 369.6;
8 eine Graphik darstellt, welche die % verschiedener βA4-Sequenzen zeigt, die durch MAb 369.2 immunpräzipitiert wurden;
9 eine Graphik darstellt, die eine Epitopkartierung von MAb 369.2 durch einen kompetitiven Assay zeigt, wobei
35-42(OVA) (Ovalbumin gekoppeltes 35–42 βA4-Peptid) darstellt, -☐- 1–42 βA4-Peptid darstellt und -♦- 1–40 βA4-Peptid darstellt;
10 eine Aufnahme darstellt, welche die Bindung von MAb 369.2B an vaskuläres Amyloid und andere Plaques mit verschiedenen Morphologien zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die β-Amyloidablagerungen in Gehirnen mit Alzheimerscher Krankheit sind hauptsächlich aus βA4-Peptiden aufgebaut, die sowohl eine N- als auch eine C-terminale Heterogenität zeigen. Die wichtigsten C-terminalen Spezies, die durch ein Peptidsequenzieren von β-Amyloid identifiziert wurden, das aus post mortem Gehirnmaterial gereinigt wurden, enden entweder bei Position 40 oder 42 des βA4-Peptids, das meistens 43 Reste lang ist. In vitro Experimente mit synthetischen βA4-Peptiden, die entweder bei Position 40 oder 42 enden, zeigen beachtliche physiko-chemische Unterschiede an. Vorher konnte weder die Verteilung dieser zwei βA4 Spezies in post mortem Gewebe noch ihr Hervorrufen in vitro aufgrund des Fehlens spezifischer Antikörper gegen das Carboxylende angegangen werden, die in der Lage sind zwischen Unterspezies von βA4-Peptid zu unterscheiden.
Ein kürzlicher Hinweis schlägt vor, dass eine Freisetzung von βA4 ein normales Ereignis in nahezu jeder Zellkultur ist. Typischerweise können hohe pikomolare bis geringe nanomolare Konzentrationen von βA4 in Serum und zerebrospinaler Flüssigkeit gemessen werden (Seubert et al., 1993). Dieses Ergebnis war überraschend, da angenommen worden ist, dass die Erzeugung von βA4 ein pathologisches Ereignis ist, da βA4 als β-Amyloidplaques in den kortikalen und hippokampalen Gehirnbereichen von Patienten mit Alzheimerscher Krankheit massiv abgelagert wird. Eine detaillierte Sequenzanalyse des freigesetzten βA4 aus Zellkulturen zeigte, dass die bedeutenden Spezies bei Position 40 enden (Selkoe, 1994). Amyloidplaques, die aus post mortem Gehirn gereinigt werden, zeigen ein leicht unterschiedliches Bild: Amyloidablagerungen der kongophilen Amyloid Angiopathie (engt.: congophilic amyloid angiopathy (CAA)) sind βA4-Aggregate, die Blutgefäße umgeben und vorherrschend βA4 1–40 sind, wobei im Gegensatz dazu Amyloidplaque Kerne (engl.: amyloid plaques cores (APC)), die im Gehirnparenchym anwesend sind und nicht mit Blutgefäßen in Verbindung gebracht werden, eine N-terminale Uneinheitlichkeit zeigen (die am häufigsten bei den Resten 1, 4 und 11 beginnt) und hauptsächlich entweder bei Position 40 oder 42 enden (Glenner und Wong, 1984, Biochem. Biophy. Res. Comm. 120: 885–890; Masters et al., 1985, PNAS USA 82: 4245–4249; Miller et al., 1993). Gelegentlich sind längere Spezies beschrieben worden, die bei 43 enden oder sich sogar weiter ausdehnen (Miller et al., 1993). Da die Länge des hydrophoben C-Terminus für die Fähigkeit des Peptids entscheidend ist, sich in vitro selbst zu aktivieren (Burdick et al., 1992; Jarrett et al., 1993, Biochem. 32: 4693–4697), ist es gänzlich möglich, dass die beiden verschiedenen bzw. ausgeprägten pathologischen Aggregate, APC und CAA, und andere vaskuläre β-Amyloidplaques durch die unterschiedlichen Eigenschaften der beiden Spezies 1–40 und 1–42 erklärt werden können. Dies könnte auch für die so genannten ”diffusen Plaques” der Fall sein (Selkoe, 1994), die häufig in Gehirnen von alten Menschen beobachtet werden und nicht mit AD in Verbindung gebracht werden, jedoch ist vorgeschlagen worden, dass sie Vorläufer fibrillärer β-Amyloidablagerungen sind. Eine nicht fibrilläre Aggregation von βA4 ist für diese Strukturen vorgeschlagen worden. Es ist deshalb von grundlegender Wichtigkeit, die Gewebe spezifische Erzeugung dieser langen βA4 Spezies (d. h. jene, die bei Position 42 enden) und deren pathologisches Auftreten in Gehirnen von AD Patienten zu bestimmen. Kürzlich sind drei Berichte veröffentlicht worden, in denen Antikörper beschrieben worden sind, die 1–42 und 1–40 Spezies von βA4 unterscheiden (Suzuki et al., 1994; Murphy et al., 1994; Yang et al., 1994). Im Unterschied zu den erfindungsgemäßen Antikörpern kreuzreagieren die Antikörper, von denen durch Suzuki et al. und Yang et al. berichtet wurde, in einem signifikanten Ausmaß sowohl mit der 1–43 als auch der 1–42 Spezies des βA4-Peptids. Der Antikörper von Murphy et al., der für eine Bindung mit der 1–43 Spezies des βA4-Peptids nicht getestet wurde, zeigt ein anderes Gewebebindungsmuster als der erfindungsgemäße Antikörper und muss somit ein anderes oder modifiziertes Epitop erkennen als jenes, das durch den erfindungsgemäßen Antikörper erkannt wird.
Die Positionen 29 bis 42 des βA4-Peptids liegen vollständig innerhalb des mutmaßlichen Transmembran Bereichs des Amyloid Vorläuferproteins und sind von hydrophober Art (Miller et al., 1993). Synthetische Peptide zu den C-terminalen Sequenzen in diesem Bereich müssen die Fähigkeit der 34–42 Sequenz überwinden, eine ungewöhnlich stabile β-Struktur zu bilden, die in Wasser nahezu unlöslich ist und stark denaturiert (Halverson et al., 1990, Biochem. 29: 2639–2644), falls sie dazu verwendet werden sollen, eine gute Immunantwort gegen lösliches βA4 auszulösen. Wir gestalteten einen hydrophilen Abstandshalter bzw. Spacer, der fünf Reste lang ist, der diese Unlöslichkeitsprobleme überwinden würde und auch das angenommene Epitop von der Nähe des Trägers weg erstreckt. Um die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzreaktivität mit der kürzeren, aber bedeutenden βA4 Spezies, 1–40, zu verringern, wählten wir ein minimales Peptidylepitop aus acht Resten aus, das den Positionen 35–42 der βA4-Sequenz entspricht. Die vollständige synthetische Sequenz, die auf diese Weise gestaltet wurde, wurde durch eine freie Sulfhydrylgruppe an einem N-terminalen Cysteinrest an KLH (Hämocyanin der Schlüssellochschnecke, engl.: keyhole limpet hemocyanin) gekoppelt.
Eine erfolgreiche Verwendung von Abstandshaltern und hydrophilen Resten in der Erzeugung von Antipeptid Antikörpern ist gut belegt, wie in der Verwendung hydrophiler Strukturen, um unlösliche Haptene für eine Konjugation in Lösung zu bringen (McMillan et al., 1983, Cell 35: 859–863; Makela und Seppala, 1986, in Handbook of Experimental Immunology, Band 1: Immunochemistry, Wier, D. M., Herausgeber, Blackwell Scientific Publications, Oxford, S. 3.1–3.13). Der Erfolg dieses Verfahrens im Erzeugen spezifischer Antikörper kann zumindest teilweise auf die Anwesenheit eines freien, geladenen Carboxylterminus zurückgeführt werden, insbesondere im Zusammenhang mit hydrophoben Sequenzen, da terminale Reste auf Peptidantigenen signifikante Anteile von Antipeptid Antikörpern zur Folge haben (Gras-Masse et al., 1985, in Synthetic Peptides in Biology and Medicine, Alitalo, K. et al., Herausgeber, Elsevier, Amsterdam, S. 105). Dies zusammen mit der selektiven und neuen Verwendung einer minimalen βA4-Sequenz, die als ein Immunogen verwendet wird, maximierte die Wahrscheinlichkeit eines Erzeugens eines Antikörpers, der zwischen βA4 Spezies unterscheiden könnte, die bei den Positionen 42 enden, und denen die dies nicht tun. Obwohl Peptid Kompetitionsuntersuchungen die antigene Determinante nicht fein kartierten, waren βA4-Sequenzen mit Ausnahme von 1–42 im Hemmen einer Bindung nicht wirksam. Die Tatsache, dass 1–42 nicht völlig mit ³⁵S-Methionin markiertem, in vitro translatiertem βA4 konkurriert, kann entweder auf die besonderen Eigenschaften des Moleküls selbst oder auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass das 35–42 Peptidimmunogen im Zusammenhang mit einem spezifischen Abstandshalter und/oder Träger dargestellt wurde oder dass ein 200- bis 1000-facher Überschuss an unmarkiertem Peptid nicht genug ist, um das Signal zu quenschen. Unspezifische Wirkungen von N-terminalen Resten auf eine antigene Aktivität sind auch gut belegt (Benjamini et al., 1968, Biochem. 7: 1261–1264)
Das verblüffende Ergebnis, dass 25–35 tatsächlich die Fähigkeit von 369.2B und anderen Antikörpern verstärkt, an βA4 zu binden, kann auf eine auffällige Interaktion zwischen dem abstrahierten Peptid und der βA4-Sequenz selbst in voller Länge zurückgeführt werden. Von den Resten 26–33 wird angenommen, dass sie als eine zufällige Wicklung in wässriger Lösung vorkommen (Halverson et al., 1990) und in der Lage sein können, mit löslichem βA4 in einer solchen Weise zu interagieren, die den C-Terminus für die Bindungsstellen auf Antikörpern zugänglicher macht.
Der erfindungsgemäße hoch spezifische Antikörper, für den 369.2B ein besonderes Beispiel ist, wurde gegen ein synthetisches βA4-Peptid mit Resten 35–42 angezogen und erkennt die kürzere βA4 Spezies 1–40 in Lösung oder auf einer festen Phase nicht. Darüber hinaus waren sowohl 1–40 als auch 1–43 nicht in der Lage, den Antikörper herauszuabsorbieren, wenn sie immunhistochemisch verwendet wurden. Ein zweites Screening Verfahren mit einem Mediumkapazitätsdurchsatz für das Screenen von Hybridomüberständen wurde unter Verwendung von radioaktiv markiertem, in vitro translatiertem βA4 angewendet, so dass Antikörper, die vom primären Screenen entnommen wurden, nach ihrer Fähigkeit weiter ausgewählt werden konnten, lösliches βA4 zu immunpräzipitieren. Dieses Verfahren kann leicht an andere interessierende Proteine/Antikörper angepasst werden. Der sich ergebende MAb 369.2B stellt ein ausgezeichnetes Hilfsmittel, um die Rolle von βA4-Peptiden, die bei Position 42 enden, in situ, in post mortem Gewebe, in transgenen Tieren zu untersuchen und um das in vitro Hervorrufen von βA4-Peptiden in etablierten zellulären βA4-Erzeugungsmodellen zu untersuchen, für diagnostische Verwendungen und für Therapeutika dar.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper stellt ein wichtiges Hilfsmittel dar, das benötigt wird, um ein diagnostisches Testkit zu etablieren. Er ermöglicht es, die Menge an βA4 1–42 oder Derivaten davon (z. B. 4–42 Spezies und anderen verkürzten Formen mit dem ”42” Carboxylende) in humanen Körperflüssigkeiten (CSF, Serum, Urin, etc.) oder Geweben zu messen/zu quantifizieren. Er kann auch dazu verwendet werden, das Verteilungsmuster von 1–42 oder βA4 Spezies, die bei Rest 42 enden, in AD Gehirnen im Vergleich zu gesunden Kontrollen zu untersuchen. Seine außergewöhnlich hohe Affinität macht ihn zu einem ausgezeichneten und neuen Hilfsmittel für ein solches Testen. Der hier offenbarte monoklonale Antikörper kann auch in biologischen Modellsystemen verwendet werden, wie transduzierten Zellkulturen oder Tiermodellen (transgenen Mäusen), die dazu gestaltet sind, die Anwesenheit und/oder Erzeugung von βA4 Spezies zu messen und/oder zu beeinflussen, die bei Aminosäure 42 enden. Diese Modellsysteme stellen ein Mittel dar, um selektive Modulatoren der Erzeugung von βA4, das bei der Aminosäureposition 42 des βA4 endet, in biologischen Systemen zu untersuchen. Die erfindungsgemäßen Antikörper stellen Verfahren zum Verhindern einer Aggregation von βA4-Peptid bereit, da die Spezifität des Antikörpers die spezifische Beeinflussung des freien C-terminalen Rest ermöglichen wird, wodurch die Aggregation, die in AD pathogen sein kann, beeinflusst und unterbrochen wird.
Überraschenderweise unterscheidet sich der Antikörper der vorliegenden Erfindung von dem des Standes der Technik darin, dass er diffuses und fibrilläres Amyloid, neurofibrilläres Gewirr und vaskuläres Amyloid färbt, während er für das βA4-Peptid mit einem freien C-terminalen Rest 42 spezifisch ist. Dieses einzigartige Bindungsmuster zeigt, dass der erfindungsgemäße Antikörper ein zum Stand der Technik unterschiedliches Epitop erkennt und dass die Gewebeverteilung oder Zugänglichkeit des βA4-Peptids, das durch den erfindungsgemäßen Antikörper erkannt wird, auch unterschiedlich ist. Weiter stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper bereit, der das βA4-Peptid aus einer Lösung präzipitieren kann, was durch die Antikörpern des Standes der Technik nicht gezeigt wurde. Somit stellt die vorliegende Erfindung einzigartige monoklonale Antikörper, die eine Untermenge von βA4 Spezies erkennen, die eine verschiedene bzw. ausgeprägte Gewebeverteilung aufweist, die höchstwahrscheinlich ein besserer diagnostischer Indikator ist, als jene, die vorher verfügbar waren, und ein einzigartiges Ziel für eine therapeutische Untersuchung bereit.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Antikörper, Antikörperfragmente und Konstrukte davon bereit, die für die βA4 Spezies eines Peptids spezifisch sind, bei denen der G-Terminus bei Rest 42 endet. Solche Antikörper, Bindungsfragmente und Konstrukte davon können in diagnostischen, analytischen, therapeutischen und biochemischen Reinigungsverfahren verwendet werden, welche die Bindungsspezifität des vorliegenden monoklonalen Antikörpers und dessen Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen einsetzen.
Die folgenden Beispiele erklären die vorliegende Erfindung weiter und sind zur Darstellung und nicht zur Beschränkung gezeigt. Die folgenden Beispiele zeigen bestimmte Aspekte der oben identifizierten Verfahren und Zusammensetzungen sowie vorteilhafte Ergebnisse.
Beispiel 1: βA4-Peptid Expressionssystem
Herstellung von Plasmid pGK002
Im Allgemeinen werden Klonierungs- und molekularbiologische Verfahren zum Beispiel in Sambrook, Fritsch und Maniatis, 1989, Molecular Cloning, 2. Auflage, Gold Spring Harbor, Lab Press gefunden. Das Plasmid pMTI-26, welches ein Bluescript KS Klon ist, der 2,415 kb (Kilobasenpaare) der APP Sequenz mit einem TAG Stoppcodon enthält, gefolgt von einer BamHI Stelle, die im Leseraster durch eine ortsspezifischen Mutagenese nach dem 42. Aminosäurecodon des βA4-Bereichs angebracht wurde, wurde durch Ausschneiden eines 1,8 kb XbaI/BglII Fragments und Re-Ligieren des Plasmids nach einem Auffüllen an den Enden modifiziert. Das sich ergebende Konstrukt, das als pGK002 bezeichnet wird, ordnet das Konsensus enthaltende Initiierungscodon der βA4-Sequenz dem Bluescript T7 Promotor unmittelbar nachgeschaltet an.
Herstellung von Plasmid pGK003
Das Plasmid pGK003 (3), das in allen Weizenkeim in vitro Translationen von βA4 verwendet wurde, die unten beschrieben werden, wurde durch Subklonieren eines 590 bp (Basenpaar) NotI/XhoI Fragments aus pGK002, das die vollständige humane βA4-Sequenz enthält, mit dem mutagenisierten Stopp/BamHI in einen pSP64 polyA Vektor (Promega Corp.) hergestellt. Beim Herstellen dieses Plasmids wurde pGK002 mit NotI und XhoI gespalten, und das sich ergebende 590 bp Fragment wurde mit Klenow aufgefüllt, isoliert und mit pSP64 polyA ligiert, das mit SmaI linearisiert wurde. 3 ist ein Diagramm des Klons pGK003. Das offene Leseraster von βA4 1–42 wird in vitro. von dem bakteriellen SP6 Promotor exprimiert. Der 3'-untranslatierte (3'-UT) Bereich von APP ist in schwarz gezeigt.
Beispiel 2: In vitro Transkription und Translation von pGK003
Das Plasmid pGK003 wurde mit EcoRV linearisiert, und eine vollständige Spaltung wurde durch eine Agarose Gelelektrophorese bestätigt. Die Probe wurde zweifach mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefolgt von zwei Chloroformextraktionen und einer Ethanolpräzipitation. Das sich ergebende Pellet wurde einmal in 70% Ethanol gewaschen, teilweise unter Vakuum getrocknet und in TE mit einer Konzentration von 1 μg/μl resuspendiert.
In vitro Transkripte wurden unter Verwendung linearisierter Matrizen mit 30 μg/ml in 80 mM HEPES-KOH (pH 7,5) Puffer hergestellt, der 16 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin, 40 mM DTT, 3 mM ATP/CTP/GTP/UTP, 800 Einheiten/ml RNAsin Ribonuklease Inhibitor (Promega Corp.), 5 Einheiten/ml anorganische Hefe Pyrophosphatase (Sigma Corp.) und 1800 Einheiten/ml SP6 RNA Polymerase (Promega Corp.) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C für 4 Std. gehalten. Das sich ergebene Transkript wurde durch eine Elektrophorese durch ein 1,2% Agarose/TBE/EtBr Gel mit denaturierten Proben (65°C × 10 min) verifiziert.
Die Transkripte wurden unter Verwendung von Weizenkeimextrakt (Sigma Corp.) translatiert. Kurz gesagt wurden die Transkripte erwärmt (65°C × 10 min), mit dem Weizenkeimextrakt gemischt, der KAc, RNAsin und eine Methionin-minus Aminosäuremischung enthielt, und bei 25°C für 1 Std. in der Anwesenheit von ³⁵S-markiertem Methionin (Amersham) translatiert. Eine Translation eines 4 kD (Kilodalton) βA4-Proteins wurde durch ein SDS-PAGE unter Verwendung von 16% Tris/Tricin Gel (Novex) verifiziert. Die Gele wurden fixiert, und die Proteine wurden fluorographisch unter Verwendung eines kommerziellen Systems, ”Amplify” (Amersham), visualisiert.
Der Einbau der Markierung in in vitro translatiertes βA4, das einen Methioninrest pro Molekül enthielt, wurde durch Schneiden des Gels bestimmt. Die 2 mm Schnitte wurden in 1 ml 30% Wasserstoffperoxid, 0,75 M NH₄OH über Nacht bei 37°C gelöst. Als nächstes wurde ein 10 ml Volumen eines ”Ready Value” Szintillationscocktails (Beckman) zugegeben und, DPMs (Abfall pro Minute (engl.: Decay per minute)) wurden unter Verwendung eines Beckman LS6000IC Szintillationszählers im Auto DMP Modus bestimmt. Typische Reaktionen erzeugen ~250 ng βA4/mT, oder ~56 nM.
Eine in vitro Transkription, der eine Translation des βA4-Klons, pGK003, in einem Weizenkeimsystem folgte, führte zu einem einzigen 4 kD Proteinprodukt, wenn es durch Fluorographie auf einem 16% Tris-Tricin SDS Polyacrylamidgel visualisiert wurde (4A). 4A zeigt die Ergebnisse einer SDS-PAGE auf einem 16% Tris/Tricin Gel. Spur 1: Markierungen mit hohem Molekulargewicht. Spur 2: Markierungen mit geringem Molekulargewicht. Spur 3: In vitro translatiertes βA4 in einem Weizenkeimsystem. Die Identität dieses 4 kD Produkts wurde durch eine Immunpräzipitation mit βA4 spezifischen Antikörpern bestätigt (4B). 4B zeigt Ergebnisse eines SDS-PAGE auf einem 16% Tris/Tricin Gel. Spur 1: Markierungen mit hohem Molekulargewicht. Spur 2: Markierungen mit geringem Molekulargewicht. Spur 3: in vitro translatiertes βA4 aus einem Weizenkeimsystem, das mit MAb 286.8A immunpräzipitiert wurde. Eine Transkription und Translation sowohl von diesem als auch von anderen βA4-Klonen in einem kombinierten Retikulozyten Lysatsystem (TnT) führte nicht zu derselben Ausbeute oder Reinheit von radioaktiv markiertem βA4 (Daten nicht gezeigt). Dies könnte auf das kurze Transkript oder die eigentümliche Art des βA4-Peptidds selbst zurückzuführen sein.
Der monoklonale Antikörper 286.8A, der gegen ein rohes Peptid 1–42 angezogen wurde und sich auf den Bereich 3–8 des βA4 abbildet, war in der Lage, dieses Protein in einer konzentrationsabhängigen Weise zu präzipitieren (5). 5 stellt diese Immunpräzipitation von in vitro translatiertem βA4 (IVT βA4) graphisch dar. Erhöhte Mengen von IVT βA4 wurden mit einer festgelegten Menge 286.8A (7,4 μg) in 100 μl in RIPA Puffer immunpräzipitiert.
Beispiel 3: Immunogen und Screeningpeptid Herstellung
Die Peptide wurden durch Standard Fmoc Festphasenverfahren hergestellt. (Siehe als Beispiel Gras-Masse et al., 1985).
Das Peptid #959, ein synthetisches Peptid mit 14 Resten und einem N-terminalen Cystein, das an einen hydrophilen DGDGD Abstandshalter geheftet ist, und Resten 35–42 von humanem βA4 (die sich ergebende vollständige Sequenz: CDGDGDMVGGVVIA (SEQ ID NR. 1)) wurde an einen Maleimid aktivierten KLH (Schlüsselloch Napfschnecken Hämocyanin) Träger unter Verwendung des kommerziell erhältlichen ”Imject” aktivierten Immunogen Konjugationskits (Pierce) gekoppelt. Kurz gesagt wurden 2 mg Peptid in 200 μl Konjugationspuffer gelöst und bei Raumtemperatur für 2 Std. mit 2 mg wieder hergestelltem, Maleimid aktiviertem KLH umgesetzt. Das Konjugat wurde durch Gelfiltration gereinigt und als ein Immunogen für eine monoklonale Antikörperherstellung unter Verwendung von Standardprotokollen verwendet, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Das Peptid #958, ein synthetisches Peptid mit 14 Resten und mit einem N-terminalen Cystein, das an einen GGGGG Abstandshalter geheftet ist, und Resten 35–42 des humanen βA4 (die sich ergebende vollständige Sequenz: CGGGGGMVGGVVIA (SEQ ID NR. 2)) wurde an Ovalbumin durch Lösen von 2 mg Peptid in 200 μl 6 M Guanidin, 0,01 M Phosphat, pH 7,0, gekoppelt und wie oben an 2 mg wieder hergestelltes, Maleimid aktiviertes Ovalbumin konjugiert. Das gereinigte Konjugat wurde in einem ELISA Screenen monoklonaler Fusionsprodukte verwendet. Antikörper, die auf diese Weise gescreent wurden, sind eher für die ”35–42” Determiante als für den Abstandshalter, die Cysteinbrücke oder Trägeranteile des Immunogens spezifisch.
6: Zeigt das Peptid, das verwendet wurde, um die Immunantwort hervorzurufen (das Immunogen), und das Peptid, das verwendet wurde, um sowohl die Seren von Mäusen als auch Fusionen in der Enzym Immunassayplatte (EIA) zu screenen. Die βA4-Sequenz 35–42 wurde zusammen mit einem Abstandshalter und einem C-terminalen Cystein synthetisiert, das anschließend verwendet wurde, um es kovalent über eine Maleimidbrücke an ein großes Trägermolekül zu koppeln. Sowohl der Abstandshalter als auch das Trägermolekül im Immunogen und Screeningpeptid sind unterschiedlich, um βA4-Sequenz spezifische Antikörper auszuwählen.
ELISA (Enzym gekoppelter Immunabsorptionsassay)
Biotinylierung von MAb
Der N-Hydroxysuccinimidester von Biotin wird verwendet, um den monoklonalen Antikörper 286.8A zu biotinylieren. Die Intaktheit des Reagens wird zuerst durch Beobachten seiner spontanen Hydrolyse in der Abwesenheit von primären Aminen verifiziert: Eine 0,2 mg/ml Lösung aus NHS-LC-Biotin (Vector Labs, Burlingame, CA) in PBS wird bei 260 nm über einen Zeitverlauf überwacht. Eine OD260 von 1,0 nach ungefähr 2 Std. (ansteigend von und anfänglich OD260 ~0,55) zeigt die erwartete Hydrolyse an.
In der Biotinylierungsreaktion ist für ein 66:1 molares Verhältnis von Biotin zu monoklonalem 286.8A bei einem neutralen pH-Wert festgestellt worden, dass es optimale Ergebnisse ergibt, wenn der biotinylierte 286.8A in einem ELISA Format getestet wurde. 0,6 mg NHS-LC-Biotin in Wasser in einer Konzentration von 0,1 mg/ml werden zu 1 ml (2 mg) 286.8A in PBS (innerhalb von 5 min des Lösens) zugegeben. Ein nukleophiler Angriff des NHS Esters tritt bei 25°C für 4 Std. auf, nach welchen 10 mg Glycin in 50 μl H₂O zugegeben werden, um die Reaktion zu stoppen. Die Reaktion wird anschließend auf eine 10 ml vernetzte Dextran Entsalzungssäule gegeben, die auf PBS äquilibriert ist, und 0,5 ml Aliquote werden gesammelt. Der erste Höchstwert, der den IgG Höchstwert darstellt, wird vereinigt und bei 4°C gelagert, bis er verwendet wird.
ELISA Verfahren
Corning 25801 ELISA Platten mit 96 Vertiefungen werden über Nacht bei 4°C mit 100 μl monoklonalem 4G8 oder einem anderen Einfang Antikörper mit 5 μg/ml typischerweise in Wasser oder Puffer beschichtet Die Platte wird anschließend mit PBS gewaschen, das 1% Triton X-100 in einem Dynatech Ultrawasch plus enthält. Die Vertiefungen werden anschließend für 90 min mit 300 μl PBS blokkiert, das 1% Triton X-100 und 1% ELISA BSA mit Reinheitsgrad (Blockierungspuffer) enthält. Nach dem Waschen wird ein Antigen oder ein unbekannter Stoff, das/der in Blockierungspuffer verdünnt ist, dreifach zu den Vertiefungen zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 Std. inkubiert. Die Platte wird 2-mal gewaschen, und 400 ng biotinylierter 286.8A oder ein anderer nachweisender Antikörper werden zugegeben. Nach 30 min wird die Platte ausgiebiger gewaschen (2-maliges Waschen, 2 min Einweichen, 2-maliges Waschen), und 100 μl vorgebildete Avidin-Biotin Alkaliphosphatase Komplexe (Vector Labs) werden zugegeben. Die Platte wird gewaschen (2-maliges Waschen, 2 min Einweichen, 2-maliges Waschen, 5 min Einweichen, 4 Waschschritte), und MUP Substrat wird mit 0,06 mg/ml in 1 × Diethanolamin Puffer zugegeben. Die Platten werden in einem Millipore Cytoflour nach 15 min unter Verwendung eines 360 nm Anregungsfilters und eines 460 nm Emissionsfilters ausgelesen.
Beispiel 4: Hervorrufen eines monoklonalen Antikörpers
Balb/c Mäuse wurden mit mehreren I. P. Impfungen aus KLH konjugiertem Peptid #959 immunisiert. Splenozyten von immunisierten Tieren wurden mit dem Mausmyelom AG8 unter Verwendung von Standardprotokollen fusioniert (Wunderlich et al., 1992, J. Immunol. Methods 147: 1–11). Die Überstände von sich ergebenden Hybridomen wurden auf eine Immunreaktivität gegen Ovalbumin gekoppeltes Peptid #958 unter Verwendung von Standard ELISA Protokollen gescreent, wie oben beschrieben. Hybridome, die für die Expression von immunreaktiven MAbs positiv waren, wurden mindestens zweifach durch eine einschränkende Verdünnung kloniert, und eine MAb Isotypenanalyse wurde durchgeführt. Gereinigtes MAb IgG wurde aus Aszitesflüssigkeit unter Verwendung einer Protein A Affinität schromatographie hergestellt.
Nach einer Fusion zeigte ein Screenen, dass eine Immunisierung von Mäusen mit Peptid #959, das an KLH konjugiert war und in einem Festphasen ELISA Format mit an Ovalbumin gekoppeltem Peptid #958 gescreent wurde, zu sechs positiven Vorläufersignalen führte (identifiziert als 369.1 bis 369.6). Beide Peptide weisen die Aminosäuren 35–42 des βA4-Bereichs, verschiedene N-terminale Abstandshalter und ein Cystein für ein kovalentes Koppeln an Trägerproteine auf (6). Der freie C-Terminus mit der geladenen Carboxylgruppe und eine beschränkte Länge von nur 8 Aminosäuren begünstigt das Hervorrufen von Antikörpern, die insbesondere gegen längere Formen von βA4-Peptiden gerichtet sind; kürzere βA4-Peptide, die vor der Aminosäure 42 enden, würden somit nicht erkannt werden.
6 stellt die Struktur des Immunogens (Trägerpeptid) und des Screening Peptids (Trägerscreening Peptid), die verwendet werden, in Diagrammen dar.
Zwei der sechs Vorläufersignale waren letztendlich nicht klonierbar. Von den restlichen vier ergaben zwei Immunpräzipitations-/Szintillationssignale, die nur wenige Prozent über normalen Nicht-Immunkontrollen lagen; die anderen beiden (identifiziert als 369.6 und 369.2) zeigten Signale von jeweils 18% bzw. 19%. Ein Erzeugen von monoklonalen Antikörpern aus Aszitesflüssigkeit und eine anschließende Immunreinigung dieser Klone wurden durchgeführt. Tabelle 1 vergleicht die Daten, die mit dem IPSA für Hybridom Überstände und gereinigte Antikörper erhalten wurden. Tabelle 1

Zelllinie Isotyp IPSA (Überstand) IPSA (gereinigt)

369.1 IgG1/IgG2b 3% N. D.

369.2 IgG1 19% 25% (mit 5 μg)

369.3 IgG1 2% N. D.

369.6 IgG2b 18% 7% (mit 10 μg)
Tabelle I. Vergleich von Antikörperaktivitäten in Hybridom Zelllinien. Die IPSA Daten stellen die Prozent von in vitro translatiertem βA4 dar, das entweder durch Hybridom Überstände oder gereinigte Antikörper immunpräzipitiert werden konnte.
Beispiel 5: Immunpräzipitations-/Szintillationsassay für ein Hybridom Screenen
Um monoklonale Antikörper zu entwickeln und nach monoklonalen Antikörpern zu screenen, die das βA4-Peptid in Lösung eher erkennen als wenn es an eine feste Phase angeheftet ist, wurde ein Assay entwickelt, in dem eine Immunpräzipitation eines ³⁵S-Methionin markierten, in vitro translatierten βA4 (IVT βA4) gemessen wird. Eine Standardmenge an in vitro translatiertem βA4 bildet Antikörper/Antigen Komplexe in einer Lösung, die auf ionische Stärke, pH-Wert und Detergens Zusammensetzung optimiert werden können. Nachdem die Immunkomplexe mit Protein G (Omnisorb Zellen) präzipitiert und ausgiebig gewaschen sind, wird die gebundene Reaktivität in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gezählt, der Hintergrund wird subtrahiert und die Wirksamkeit der Präzipitation wird berechnet. Dieser Immunpräzipitations-/Szintillationsassay (IPSA) ermöglicht sowohl die schnelle. Identifikation als auch die Charakterisierung von Antikörpern und ist verwendet worden, um eine Vielfalt von βA4-Antikörpern zu testen. Der Assay kann im Allgemeinen sowohl auf monoklonale Hybridom Überstände als auch auf polyklonale Seren angewendet werden, um Antikörper zu identifizieren, die für Immunpräzipitationen verwendet werden können. Typischerweise können 18 IPSAs an einem Tag durchgeführt werden. Dies stellt deshalb ein schnelles und informatives zusätzliches Hybridom Screeningverfahren dar.
Kurz gesagt wurden ungefähr 1,5 × 10⁵ DPMs an ³⁵S-Methionin markiertem, in vitro translatierten βA4 (IVT βA4) zu 10 μl eines 10 × Immunpräzipitationspuffers (150 mM NaCl, 10% NP-40, 5% Desoxycholinsäure, 1% SDS, 500 mM Tris, pH-Wert 8) zugegeben. Dazu wurden 90 μl monoklonaler Zellüberstand von der interessierenden monoklonalen Fusion (unsere Bezeichnung # 369) zugegeben und für 2 Std. bei 4°C umgesetzt. Der Hintergrund wurde unter Verwendung von 90 μl Überstand eines nicht reaktiven Klons bestimmt; die positive Kontrolle war 90 μl eines Überstands, der monoklonalen Antikörper 286.8A enthielt, der zuvor gegen eine rohe, synthetische βA4(1–42)-Präparation hergestellt wurde. Nach 2 Std. wurden 40 μl einer 10% Lösung aus Omnisorb Zellen (Calbiochem) zugegeben, die in 1 × Immunpräzipitationspuffer (RIPA Puffer, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Desoxycholinsäure, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH-Wert 8) equilibriert wurden, und für zusätzliche 2 Std. bei 4°C unter Schütteln umgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 5 min bei 4500 g und 4°C pelletiert und mit 800 μl kaltem 1 × Immunpräzipitationspuffer 3 × gewaschen. Die Pellets wurden quantitativ auf Szintillationsgefäße übertragen und in einem Beckman LS6000 Szintillationszähler im Auto DPM Modus gezählt. Der Prozentsatz an Immunpräzipitiertem βA4 wurde berechnet.
Die Immunpräzipitations-/Szintillationsassays wurden mit 1 μg gereinigtem monoklonalen Antikörper 369.2B in einem Gesamtvolumen von 100 μl 1 × Immunpräzipitationspuffer durchgeführt, zu dem 5 μg Kompetitionspeptid zugegeben wurde. Inkubationen und Präzipitationen erfolgten wie oben beschrieben.
7 stellt den Prozentsatz an immunpräzipitiertem IVT βA4 als eine Funktion der Antikörperkonzentration für MAbs 369.2, 369.6 und MAb 286.8A dar. Unter den Bedingungen dieses Assays ist 369.2 (und weiter Subklon 369.2B) ungefähr viermal besser als 369.6 im Immunpräzipitieren von löslichem IVT βA4, aber es präzipitiert ein bisschen weniger als halb so viel wie 286.8A. 7 zeigt die Ergebnisse einer Immunpräzipitation von in vitro translatiertem βA4 vs. der Antikörperkonzentration (μg Antikörper/100 μl RIPA Puffer) wobei;
Die Prozente bei einer angegebenen MAb Konzentration variierten nur wenige Prozentsatzpunkte zwischen und innerhalb von Experimenten.
IPSA für eine monoklonale Charakterisierung
Ungefähr 1,5 × 10⁵ DPMs ³⁵S-Methionin markiertes, in vitro translatiertes βA4 wurden zu verschiedenen Mengen gereinigtem monoklonalen Antikörper, entweder 369.2B, 369.6 oder 286.8A, in einem Gesamtvolumen von 100 μl 1 × Immunpräzipitationspuffer gegeben und wie oben beschrieben umgesetzt. Die Immunkomplexe wurden mit Omnisorb präzipitiert, gewaschen und wie oben beschrieben gezählt.
Beispiel 6: Charakterisierung von MAb 369.2B
Um die beste Zelllinie, 369.2B, weiter zu charakterisieren wurde ein Kompetition Immunpräzipitations-/Szintillationsassay (Kompetition IPSA) durchgeführt. In dieser Variation wurde 369.2B zu einem ungefähr 200-fachen molaren Überschuss an unmarkiertem Kompetitionspeptid zu derselben Zeit wie markiertes, in vitro translatiertes βA4 1–42 zugegeben. Wie erwartet, konkurrieren Peptide gegen den humanen βA4-Bereich 1–40, 1–11, 1–28, 12–28 als auch das umgekehrte Peptid 40-1 nicht mit dem ³⁵S-Methionin markierten, in vitro translatierten βA4 um eine Immunpräzipitation im Gegensatz zu vollständigem 1–42 Peptid (8).
Diese Ergebnisse wurden in einem Festphasen ELISA Format bestätigt: Sowohl das absorbierte Ovalbumin gekoppelte Screening Peptid, das den βA4-Bereich 35–42 enthält, als auch das 1–42 Peptid konkurrieren im Gegensatz zu 1–40 (9). Die verringerte Kompetitionsfähigkeit des 1–42 Peptids im Vergleich zu dem Ovalbumin gekoppelten 35–42 kann auf Konformations- und/oder Löslichkeitsfaktoren, welche die antigene Determinante einschließen, oder vielleicht einfacher auf die besondere Stöchiometrie der Konjugation zurückgeführt werden. (Ovalbumin ist ein Träger mit einem Molekulargewicht von 45 kD im Vergleich zu 4 kD für das 1–42 Peptid und weist ungefähr zwischen 5–15 konjugierbare Maleimidgruppen pro Mol Träger auf).
8 zeigt einen Immunpräzipitationspeptid Kompetitions-/Szintillationsassay für eine Epitopbestimmung von MAb 369.2. Ein Peptidkompetitor (5 μg) wurde mit in vitro translatiertem βA4 (–1,5 × 10⁵ DPMs oder –200 μg) gemischt, anschließend mit 2 μg 369.2 immunpräzipitiert, wobei;
Die Prozente bei einer angegebenen MAb Konzentration variierten typischerweise nur wenige Prozentsatzpunkte zwischen und innerhalb von Experimenten.
9 zeigt ein Epitopkartierung von MAb 369.2 durch einen Kompetitionsassay. C369.2 (50 ng IgG/100 μl) wurde mit oder ohne synthetische Kompetitionspeptide vorinkubiert (22°C, 1 Std.), anschließend einem ELISA gegen Ovalbumin gekoppeltes 35–42 (200 ng/Vertiefung) unterzogen, das an Platten gebunden war, Die Kompetition in Prozent wurde relativ zu einer MAb Bindung in der Abwesenheit eines Kompetitoren berechnet, d. h. wobei;
Das gefüllte Rechteck ist 35–42 (OVA) Peptidkonjugat; das offene Rechteck ist 1–42 Peptid; und die offene Raute ist 1–40 Peptid.
Aus diesen Daten schließen wir, dass monoklonaler 369.2B für das C-terminale Ende des (1–42) βA4-Peptids in voller Länge spezifisch ist. Obwohl die genaue antigene Determinante noch nicht fein kartiert worden ist, schließt sie klar Reste nach Position 40 ein, und da der Antikörper gegen ein kurzes, synthetisches Peptid hergestellt wurde, ist es unwahrscheinlich, dass die Determinante andere Reste Von βA4 einschließt, die konformativ nebeneinander liegen können. Insbesondere 369.2B ist ein sehr wichtiges Hilfsmittel im Erkennen von βA4 Spezies, die bei Position 42 enden.
Eine zusätzliche und interessante Beobachtung aus dem Peptid Kompetitionsassay ist die verstärkte Immunpräzipitationsfähigkeit von in vitro translatiertem βA4 durch das Dekapeptid 25–35. Dieses Phänomen ist auch in Assays unter Verwendung sowohl eines anderen monoklonalen Antikörpers (d. h. 286.8A) als auch eines Kaninchen polyklonalen Antiserums gesehen worden (Daten nicht gezeigt). Wir wissen auch aus anderen Experimenten unter Verwendung verschiedener Mengen an Detergens, insbesondere SDS, in IPSA Assays mit MAb 286.8A, dass mehr βA4 mit zunehmenden Mengen an Detergens immunpräzipitiert werden kann (Daten nicht gezeigt). Für SDS ist interessanterweise gezeigt worden, dass es im Lösen von βA4-Aggregaten unwirksam ist, wie es zumindest durch SDS-PAGE gezeigt wurde (Burdick et al., 1992). Jedoch ist es nicht unmittelbar klar, warum SDS die Immunpräzipitationsfähigkeit von βA4 verstärken sollte.
Beispiel 7: Immunhistochemische Studien
Wir haben immunhistochemische Studien mit 369.2B durchgeführt. Das Färbemuster von 369.2B (1/10.000 Verdünnung einer 22 mg/ml aus Aszites gereinigten Antikörperlösung) zeigte interessante Unterschiede, wenn es mit dem monoklonalen Antikörper 286.8A verglichen wurde, für den wir gezeigt haben, dass er das Epitop 3–8 von βA4 erkennt und human spezifisch ist (Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse, die aus der Immunhistochemie erhalten wurden, zeigten, dass 369.2B ein hervorragender Antikörper ist (bei einer 1/10.000 Verdünnung), um Amyloidplaque Kerne, diffuse sowie fibrilläre Amyloidablagerungen und vaskuläre Amyloidablagerungen spezifisch zu markieren (10).
10 zeigt eine Mikroaufnahme, die β-Amyloidplaques, Blutgefäße und perivaskuläre Ablagerungen von βA4 in einem Paraffin eingebetteten, 10 μm dicken Schnitt des Gehirns einer 76 Jahre alten, weiblichen Patientin mit der Alzheimerschen Krankheit zeigt. Die Gewebeschnitte wurden mit 88% Ameisensäure (30 min) vorbehandelt, anschließend unter Verwendung eines Avidin-Biotin-Peroxidase Kits (Vector Laboratories, Burlington, CA) mit Nickeldiaminobenzidin als dem Chromogen markiert. Der monoklonale Antikörper 369.2B markiert Plaques mit einer Vielfalt von Morphologien, die Kern-, perivaskuläre und diffuse (nicht amyloide) Plaques einschließen. Er markiert auch eine Untermenge an amyloiden Blutgefäßen.

Weitere Studien zeigten auch, dass das βA4 1–43-Peptid nicht in der Lage war, um ein Färben zu konkurrieren (mehr als ein 1000-facher Überschuss Peptid), wobei βA4 1–42 das Signal vollständig beseitigte (Tabelle 2). Wie erwartet konkurrierten 1–40 oder 40–1 wieder nicht um ein Färben. Aus diesen Untersuchungen können wir schon schließen, dass dieser Antikörper ein hervorragendes Hilfsmittel für die Immunhistochemie ist. Wie durch in vitro Untersuchungen vorgeschlagen, die physiko-chemische Unterschiede zwischen 1–40 und 1–42 zeigen, ist es möglich, dass diese zwei βA4 Spezies unterschiedliche Muster in Alzheimer Gehirnen zeigen. Mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind wir nun in der Lage, diese Frage anzugehen. Somit sind der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper und die erfindungsgemäßen Verfahren für diagnostische und therapeutische Verwendungen in allen immunologischen und verwandten Methodiken, die zum Nachweis, zum Überwachen, zur Extraktion, zur Hemmung und zur Modifikation von einzigartigen βA4 Spezies angewendet werden können, in der Diagnose und Behandlung von AD nützlich, wie in den Ansprüchen definiert. Tabelle 2 Monoklonaler Antikörper, der für ein Färben verwendet wird

Kompetitionspeptid	N-terminaler MAb 286.8A	C-terminaler MAb 369.2B
Keines/Puffer	+++	+++
Keines/DMSO	+++	+++
Humanes ”40–1”	+++	+++
Humanes ”1–16”		+++
Maus ”1–16”	+++	+++
Humanes ”1–40”	–	+++
Humanes ”1–42”	–	–
Humanes ”1–43”	–	+++
Humanes ”35–42” mit	+++	–
Abstandshalter

Tabelle 2. Ergebnisse aus Kompetitionsbindungsexperimenten und einem Hemmen einer Färbung, ein +++ gibt ein starkes Färben an, – gibt ein nicht nachweisbares Färben an.
Es sollte verstanden werden, dass die vorangegangene Offenbarung bestimmte besondere Ausführungsformen der Erfindung hervorhebt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Monoklonaler Antikörper, welcher spezifisch an ein βA4(1–42)-Peptid, welches mit diffusem Amyloid, fibrillärem Amyloid, neurofibrillärem Gewirr und vaskulärem Amyloid in Verbindung gebracht wird, und nicht an βA4(1–40)- und βA4(1–43)-Peptide bindet.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1, welcher spezifisch an ein βA4(1–42)-Peptid und nicht an βA4(1–40)- und BA4(1–43)-Peptide bindet, erhältlich durch das Immunisieren eines Säugetiers mit dem Peptid Cys-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala (SEQ ID Nr. 1), welches an einen geeigneten immunologischen Träger gekoppelt ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, der ein IgG-Klasse Antikörper ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3, der ein IgG1- oder IgG2b-Unterklasse Antikörper ist.
Protein, welches ein immunologisch aktives Fragment des monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ist.
Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines βA4-Peptids, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, in Gewebe, umfassend das Inkontaktbringen einer Gewebeprobe mit dem monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Protein nach Anspruch 5 und das Nachweisen der Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers oder des Proteins.
Verfahren zum selektiven Aufreinigen eines βA4-Peptids, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, umfassend das Inkontaktbringen einer zu reinigenden Probe mit dem monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Protein nach Anspruch 5, das Trennen des βA4-Peptids, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, von der zu reinigenden Probe und das Isolieren des βA4-Peptids, welches bei Aminosäure 42 Ala endet.
Verfahren zum Nachweisen eines βA4-Peptids, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, welches mit der Alzheimerschen Krankheit in Verbindung gebracht wird, umfassend das Inkontaktbringen der zu testenden Probe mit dem monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Protein nach Anspruch 5 und das Nachweisen der Anwesenheit des βA4-Peptids, welches bei Aminosäure 42 Ala endet.
Verfahren zum Verhindern der Aggregation von βA4-Peptid, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, in vitro, umfassend das Verabreichen des monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des Proteins nach Anspruch 5.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das Protein nach Anspruch 5 zur Verwendung für das Nachweisen der Anwesenheit des βA4-Peptids, welches mit Aminosäure 42 Ala endet.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das Protein nach Anspruch 5 zur Verwendung für das Verhindern der Aggregation des βA4-Peptids, welches bei Aminosäure 42 Ala endet.
Kit zum Nachweisen der Anwesenheit von βA4-Peptid, welches bei Aminosäure 42 Ala endet, umfassend den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das Protein nach Anspruch 5 und ein Mittel zum Nachweisen des Antikörpers oder des Proteins.
Verfahren zum Erzeugen des Antikörpers nach Anspruch 1, umfassend das Immunisieren eines nicht-menschlichen Säugetiers mit dem Peptid Cys-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala (SEQ ID Nr. 1), welches an einen geeigneten immunologischen Träger gekoppelt ist.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das Protein nach Anspruch 5.
Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des Proteins nach Anspruch 5 in der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder zur Behandlung der Alzheimerschen Krankheit.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder des Proteins nach Anspruch 5 in der Herstellung eines Kits für die Diagnose der Alzheimerschen Krankheit.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das Protein nach Anspruch 5 zur Verwendung in der Verhinderung oder in der Behandlung der Alzheimerschen Krankheit.