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Die vorliegende Erfindung betrifft
Hydrogele, die ein gut kontrolliertes Freisetzungsverhalten aufweisen,
und Verfahren zur Herstellung derartiger Hydrogele.
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Die schnellen Entwicklungen auf dem
Gebiet der Molekularbiologie und der Biotechnologie haben es ermöglicht,
eine große
Anzahl pharmazeutisch interessanter Erzeugnisse in großen Mengen
herzustellen. Beispielsweise können
pharmazeutisch aktive Peptide und Proteine geeignet als Arzneimittel
bzw. Wirkstoffe bei der Behandlung lebensbedrohlicher Erkrankungen,
z. B. Krebs, und verschiedener Arten viraler, bakterieller und parasitischer
Erkrankungen; bei der Behandlung von z. B. Diabetes; in Impfstoffen,
z. B. für
prophylaktische Zwecke, und für
empfängnisverhütende Zwecke
eingesetzt werden. Insbesondere die spezialisierten biologischen
Aktivitäten
dieser Arten von Wirkstoffen schaffen enorme Vorteile gegenüber anderen
Arten von Arzneimitteln.
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Um die schnellen Entwicklungen zu
erläutern,
wurde berichtet (siehe z. B. Soeterboek und Verheggen, Pharm. Weekblad
130 (1995) 670–675),
dass sich in den Vereinigten Staaten von Amerika ungefähr 275 biotechnologische
Erzeugnisse in Untersuchungen der Phase IV befinden, während sich
mehr als 500 Produkte in der Erforschung befinden.
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Beispiele für (rekombinante) Proteine,
die in pharmazeutischer Hinsicht als sehr interessant gelten, sind
Cytokine, wie z. B. Interleukine, Interferone, Tumornekrosefaktor
(TNF), Insulin, Proteine für
eine Verwendung in Impfstoffen und Wachstumshormonen.
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Aufgrund ihrer Beschaffenheit können Proteine
und proteinhaltige bzw. proteinartige Erzeugnisse, einschließlich Peptide,
wobei diese Erzeugnisgruppe hier nachstehend als Proteinwirkstoffe
bezeichnet wird, nicht oral verabreicht werden. Diese Erzeugnisse
neigen dazu, sich im Gastrointestinaltrakt schnell abzubauen, insbesondere
aufgrund der dortigen sauren Umgebung und Gegenwart proteolytischer
Enzyme.
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Darüber hinaus können die
meisten Proteinwirkstoffe Endothel- und Epithelbarrieren aufgrund
ihrer Größe und ihrer
im Allgemeinen polaren Eigenschaften nicht passieren.
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Aus diesen Gründen müssen Proteinwirkstoffe parenteral
in das System gebracht werden, z. B. durch Injektion. Das pharmakokinetische
Profil dieser Erzeugnisse ist jedoch so, dass eine Injektion des
Erzeugnisses als solches eine häufige
Verabreichung erfordert. Denn es ist eine bekannte Tatsache, dass
proteinhaltiges Material innerhalb von Minuten aus dem Blutkreislauf
entfernt wird.
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Da, anders ausgedrückt, Proteinwirkstoffe
chemisch und/oder physikalisch unstabil sind und im Allgemeinen
eine kurze Halbwertzeit im menschlichen oder tierischen Körper haben,
sind zahlreiche tägliche
Injektionen oder kontinuierliche Infusionen erforderlich, damit
der Proteinwirkstoff eine gewünschte
therapeutische Wirkung ausübt.
Es ist offensichtlich, dass dies für Patienten unangenehm ist,
die diese Proteinwirkstoffe benötigen.
Darüber
hinaus erfordert diese Art der Verabreichung oft einen Krankenhausaufenthalt
und hat logistische Nachteile.
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Zudem scheint es, dass zumindest
für bestimmte
Klassen pharmazeutischer Proteine, wie Cytokine, die derzeit z.
B. bei Krebsbehandlungen verwendet werden, die therapeutische Wirksamkeit
stark von einer wirk samen Abgabe, z. B. intra- oder peritumoral,
abhängt.
In solchen Fällen
sollten die Proteinwirkstoffe an die Stellen geleitet werden, wo
ihre Aktivität
während
eines längeren
Zeitraums benötigt
wird.
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Daher besteht ein Bedarf für Abgabesysteme,
welche die Fähigkeit
zur kontrollierten Freisetzung haben. Im Fachgebiet wurden Abgabesysteme
vorgeschlagen, die aus polymeren Netzwerken bestehen, die mit den
Proteinen beladen sind und aus denen diese allmählich freigesetzt werden.
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Im Einzelnen können derzeit zwei Hauptarten
polymerer Abgabesysteme unterschieden werden: biologisch abbaubare
Polymere und biologisch nicht abbaubare Hydrogele.
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Biologisch abbaubare Polymere, z.
B. Polymilchsäure
(PLA) und Copolymere von PLA mit Glycolsäure (PLGA), werden häufig als
Abgabesysteme für
Proteine verwendet.
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Proteine können in pharmazeutische Abgabesysteme,
z. B. Mikrokügelchen,
durch eine Reihe von Verfahren eingefügt werden. In vivo und in vitro
wird üblicherweise
ein zweiphasiges Freisetzungsprofil beobachtet: ein anfänglicher
Ausbruch gefolgt von einer mehr allmählichen Freisetzung. Der Ausbruch
wird durch proteinartiges Material verursacht, das an oder nahe
der Oberfläche
der Mikrokügelchen
vorliegt, und durch proteinartiges Material, das in den Poren vorliegt.
Die allmähliche
Freisetzung wird einer Kombination aus Diffusion des proteinartigen
Materials durch die Matrix und Abbau der Matrix zugeschrieben. Insbesondere
für größere Proteine
ist eine Diffusion in diesen Matrizes vernachlässigbar, sodass die Freisetzung
von dem Abbau des Polymers abhängt.
Der Abbau kann durch die (Co)polymerzusammensetzung beeinflusst
werden. Eine be kannte Strategie zur Erhöhung der Abbaurate von PLA
ist eine Copolymerisation mit Glycolsäure.
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Obgleich Abgabesysteme auf Basis
biologisch abbaubarer Polymere interessant sind, ist es sehr schwierig,
die Freisetzung des eingebauten Proteins zu kontrollieren. Dies
beeinträchtigt
die Anwendbarkeit dieser Systeme insbesondere für Proteine mit einem engen
therapeutischen Fenster, wie Cytokine und Hormone. Darüber hinaus
müssen
organische Lösemittel
für die
Verkapselung des Proteins in diesen polymeren Systemen verwendet
werden. Der Kontakt von Proteinen mit organischen Lösemitteln
führt im
Allgemeinen zur Denaturierung, welche die biologische Aktivität des Proteins
beeinträchtigt.
Darüber
hinaus können
die sehr strengen Anforderungen der Zulassungsbehörden in
Bezug auf mögliche
Spuren schädlicher
Substanzen die Verwendung solcher Formulierungen therapeutischer
Wirkstoffe bei menschlichen Patienten verbieten.
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Auch Hydrogele werden häufig als
Abgabesysteme für
Proteine und Peptide verwendet. Hydrogele können durch Vernetzen eines
wasserlöslichen
Polymers erhalten werden, wodurch sich ein dreidimensionales Netzwerk
ergibt, das große
Mengen Wasser enthalten kann. Proteine können in das Gel geladen werden, indem
das Protein dem Polymer zugegeben wird, bevor die Vernetzungsreaktion
durchgeführt
wird, oder indem ein vorgeformtes Hydrogel in einer Proteinlösung durchtränkt wird.
So müssen
keine (aggressivenj organischen Lösemittel zum Beladen der Hydrogele
mit Proteinmolekülen
verwendet werden.
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Im Gegensatz zu den biologisch abbaubaren
Polymeren kann die Freisetzung von Proteinen aus Hydrogelen leicht
kontrolliert und manipuliert werden, indem die Hydrogeleigenschaften,
wie z. B. der Wassergehalt und die Vernetzungsdichte des Gels variiert
werden. Jedoch besteht ein Hauptnachteil der derzeit verwendeten
Hydrogel-Abgabesysteme darin, dass sie nicht biologisch abbaubar
sind. Daher ist eine operative Entfernung des Gels aus dem Patienten
nach der Freisetzung des Proteins erforderlich, um Komplikationen
aufgrund des Einschlusses des leeren Hydrogelmaterials (häufig wird
Wundgewebe gebildet) zu vermeiden.
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Biologisch abbaubare Hydrogele wurden
bei der Herstellung von Abgabesystemen für Proteinwirkstoffe verwendet.
Eines dieser Systeme umfasst vernetzte Dextrane, die durch Koppeln
von Glycidylmethacrylat (GMA) an Dextran und anschließend radikalischer
Polymerisation einer wässrigen
Lösung
von GMA-derivatisiertem Dextran (dex-GMA) erhalten werden. In dieser
Hinsicht wird auf Van Dijk-Wolthuis et al. in Macromolecules 28,
(1995), 6317–6322
und De Smedt et al. in Macromolecules 28, (1995), 5082–5088 Bezug
genommen.
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Proteine können in den Hydrogelen verkapselt
werden, indem sie einer Lösung
von GMA-derivatisiertem Dextran vor der Vernetzungsreaktion zugegeben
werden. Es scheint, dass die Freisetzung der Proteine aus diesen
Hydrogelen von dem Vernetzungsgrad und dem Wassergehalt des Gels
abhängt
und dadurch kontrolliert werden kann (Hennink et al., J. Contr.
Rel. 39, (1996), 47–57).
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Obwohl erwartet wurde, dass die beschriebenen
vernetzten Dextran-Hydrogele
biologisch abbaubar sind, sind diese Hydrogele unter physiologischen
Bedingungen ziemlich stabil. Dies wird in Beispiel 5 weiter ausgeführt. Unter
anderem wird gezeigt, dass die Auflösezeit von Dextran-Hydrogelen, die durch
Polymerisation von mit Glycidylmethacrylat derivatisiertem Dextran
(DS = 4) erhalten werden, ungefähr
100 Tage beträgt. Dextran-Hydrogele,
in denen die Dextrane einen höheren
Substitutions grad aufwiesen, zeigten sogar bei extremen Bedingungen
während
70 Tagen keine Anzeichen eines Abbaus.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
besteht darin, ein Abgabesystem mit langsamer oder kontrollierter
Freisetzung zu schaffen, das die vorstehend genannten Nachteile
nicht besitzt und insbesondere keine Verwendung organischer Lösemittel
erfordert, keine unerwünschten
und unkontrollierbaren Ausbrucheffekte zeigt und kein schlecht kontrollierbares
Freisetzungsverhalten besitzt. Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab,
die Vorteile beider Arten bekannter Abgabesysteme zu kombinieren,
nämlich
ein System, das unter physiologischen Bedingungen (biologisch) abbaubar
ist – entweder
chemisch und/oder enzymatisch – mit
kontrollierter Freisetzung eines Proteinwirkstoffs.
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Die vorliegende Erfindung schafft
sichere und einfach kontrollierbare Abgabesysteme auf Basis bestimmter
biologisch abbaubarer Hydrogele, welche die Anwendbarkeit von Proteinwirkstoffen
für die
Behandlung vieler Erkrankungen erhöhen. Die mit diesen Wirkstoffen
verbundenen Risiken, wie Ausbrüche
im Freisetzungsprofil und die Unannehmlichkeiten für den Patienten
sind reduziert, während
die therapeutische Wirksamkeit von Wirkstoffbehandlungen unter Verwendung
der Hydrogele gemäß der vorliegenden
Erfindung erhöht
ist.
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Im Einzelnen betrifft die vorliegende
Erfindung ein biologisch abbaubares Hydrogel, das Bindungen aufweist,
die unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbar sind. Die Hydrogele
gemäß der vorliegenden Erfindung
enthalten hydrolytisch labile Spacer, die im menschlichen oder tierischen
Körper
gelöst
bzw. gespalten werden. Wie vorstehend grob dargestellt wurde, ist
ein Hydrogel definiert als ein mit Wasser gequollenes dreidimensionales
Netzwerk vernetzter hydrophiler Makromoleküle. Detaillierter gesagt, bestehen
die erfindungsgemäßen Hydrogele
aus zwei sich durchdringenden Netzwerken, die miteinander durch
hydrolysierbare Spacer verbunden sind. Hydrogele enthalten im Allgemeinen
20 bis über
99 Gew.% Wasser.
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Darüber hinaus betrifft die Erfindung
ein Verfahren zur Herstellung eines Hydrogels, bei dem Makromoleküle, z. B.
Polymere, die unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbare
Bindungen enthalten, in einer wässrigen
Lösung
vernetzt werden.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
können
alle Arten biologisch abbaubarer Hydrogele verwendet werden, sofern
hydrolytisch labile Spacer in diese Strukturen eingeführt werden
können.
Wenn die Hydrogelstruktur in das System eines menschlichen oder
tierischen Körpers
gebracht wird, wird sie mehr oder weniger allmählich gespalten. Die Abbauprodukte
müssen
nach der Therapie nicht entfernt werden. Sie können einfach von dem Körper metabolisiert
und/oder ausgeschieden werden.
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Vorzugsweise basieren die Hydrogele
auf wasserlöslichen
Polymeren, die mindestens eine Anzahl von Seitengruppen mit der
Fähigkeit
aufweisen, Verbindungen zu anderen Polymeren zu bilden, z. B. Dextran oder
derivatisierte Dextrane, wobei Stärke und Stärkederivate, Cellulosederivate,
wie z. B. Hydroxyethyl- und Hydroxypropylcellulose, Polyvinylpyrrolidon,
Proteine, Polyaminosäuren,
Polyvinylalkohol, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polyethylenglycole,
die eine Anzahl von Monomereinheiten aufweisen, die Seitenketten
bilden können,
usw., sowie deren Copolymere ebenfalls verwendet werden können.
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Die erfindungsgemäßen Hydrogele basieren geeigneterweise
auf einem Polymer, das mit Methacrylateinheiten vernetzt ist. Andere
Vernetzungs einheiten sind Acrylateinheiten, Vinylether und Vinylester sowie
andere Einheiten, die dem Fachmann auf dem Gebiet für diesen
Zweck bekannt sind.
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Im Allgemeinen werden die in der
vorliegenden Erfindung verwendeten, mit Wasser quellbaren Hydrogele
hydrolysierbar gemacht, indem mindestens eine hydrolytisch labile
Einheit in den Spacern zwischen den Hauptketten der wasserlöslichen
Polymere und der zweiten Polymerkette eingeführt wird, die durch die vernetzbaren
Einheiten, wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben ist, gebildet
wird. Es ist auch möglich, Polymerketten
zu verwenden, die hydrolytisch labile Monomereinheiten in der Hauptkette
aufweisen. Jedoch liegen Hydrogele, die nur Polymerketten enthalten,
die nur durch hydrolysierbare Spacergruppen miteinander Kopf-Schwanz-verbunden
sind, nicht im Bereich der vorliegenden Erfindung. Im Gegensatz
zu erfindungsgemäßen Hydrogelen
korreliert der Vernetzungsgrad bei Hydrogelen auf Basis von quellbaren
Polymeren, die nur mit labilen Spacern Kopf-Schwanz-substituiert
sind, direkt mit dem Wassergehalt des Gels. Das Polymersystem des
erfindungsgemäßen Hydrogels
macht es möglich,
die Freisetzung einer Komponente durch Einstellen des Wassergehalts
und/oder des Vernetzungsgrades unabhängig zu kontrollieren.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform
weisen die Hydrogele gemäß der vorliegenden
Erfindung als hydrolytisch labile Einheiten hydrolysierbare Lactat-
und/oder Carbonatesterbindungen auf. Diese Bindungen können in
das Hydrogel gebracht werden, indem z. B. (Poly)glycolsäure- und/oder
(Poly)milchsäure-Reste
zwischen der Hauptkette des Polymers und den vernetzbaren Gruppen
des Polymers eingeführt
werden. Mit dem Begriff (Poly)glycolsäure sind sowohl Glycolsäure als
auch ihre Di- und Oligomere gemeint. Mit dem Begriff (Poly)milchsäure sind
sowohl Milchsäure
als auch ihre Di- und Oligomere gemeint. Andere Möglichkeiten
für hydrolytisch
labile Einheiten basieren auf Einheiten, die Carbonsäureester,
Urethane, Anhydride, (Halb)acetale, Amide und Peptidbindungen einführen.
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Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden (Poly)glycolsäure- und/oder (Poly)milchsäure-Spacer
zwischen polymerisierbare Methacrylatgruppen und Dextran eingeführt. Wird
ein aus diesem Material geformtes Hydrogel in eine physiologische
Umgebung eingeführt,
wird das Hydrogel biologisch abbaubar, wobei Dextran, Polyhydroxyethylmethacrylat
(PHEMA), Milchsäure
und/oder Glycolsäure
als Abbauprodukte resultieren. Diese Abbauprodukte sind alle bioverträglich. Es
wird angemerkt, dass Milchsäure
und Glycolsäure
endogene Verbindungen sind. Dextran ist ein ungiftiges Polymer,
das seit vielen Jahren als Plasmaexpander eingesetzt wird und in
Abhängigkeit
von seinem Molekulargewicht von den Nieren ausgeschieden wird. PHEMA
ist ein bekanntes bioverträgliches
Polymer, das wahrscheinlich ebenfalls über die Nieren ausgeschieden
wird.
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Erfindungsgemäße Hydrogele können geeigneterweise
hergestellt werden, indem zunächst
Spacer synthetisiert werden, die mindestens eine vernetzbare Gruppe
und mindestens eine hydrolytisch labile Gruppe enthalten; solche
Spacer mit einem wasserlöslichen
Polymer gekoppelt werden und die erhaltenen Polymere vorzugsweise
in der Gegenwart der freizusetzenden Komponente vernetzt werden.
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Bevorzugte Spacer gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen eine Hydroxyethylmethacrylat-(HEMA)-Gruppe, die
mit einer oder mehreren Lactid- und/oder Glycolid-Einheiten gekoppelt
ist, wie in den Schritten a und b von Schema 1 beispielhaft dargestellt
ist. Detaillierter gesagt, kön nen
Polymilchsäure-Vorpolymere mit
HEMA-Enden durch Lösungspolymerisation
von Lactid in Toluol unter Verwendung von HEMA als Initiator und
Aluminiumalkoxid als Katalysator oder durch eine Massepolymerisation
von Lactid unter Verwendung von HEMA als Initiator und Zinn(II)-octoat als Katalysator
synthetisiert werden. In Abhängigkeit
von dem Verhältnis HEMA/Milchsäure können Vorpolymere
synthetisiert werden, die sich im Molekulargewicht des Milchsäureblocks
unterscheiden. Copolymere von Glycolsäure und Glycolsäure-co-Milchsäure mit
endständigem
HEMA können
analog synthetisiert werden. Die Prepolymere können durch bekannte Techniken
charakterisiert werden, z. B. NMR- und IR-Spektroskopie, Differentialscanningkalorimetrie
(DSC) und Gelpermeationschromatographie (GPC). Um die Polymichsäure- und/oder
Polyglycolsäure-Prepolymere
mit endständigem
HEMA an Dextran zu koppeln, muss die endständige Hydroxylgruppe aktiviert
werden. Vorzugsweise wird die Bindung von HEMA an Dextran durch
Carbonyldiimidazol (CDI) als Kopplungsmittel bewirkt. Jedoch können auch
andere Aktivierungsverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise die
Reaktion der Hydroxylfunktion des HEMA-Milchsäure-Prepolymers mit Bernsteinsäureanhydrid
und anschließende
Aktivierung der gebildeten Carboxylgruppe unter Verwendung eingeführter Verfahren
(z. B. Aktivierung mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)). Das letztere
Verfahren ergibt Dextranderivate, in denen nur hydrolytisch unstabile
Esterbindungen vorliegen, die unterschiedliche Abbaueigenschaften
im Vergleich zu den mit dem CDI-Verfahren synthetisierten Dextranderivaten
schaffen, bei denen sowohl Esterbindungen als auch Carbonatbindungen
vorliegen.
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Die aktivierten Polymilchsäure- und/oder
Polyglycolsäure-Prepolymere
mit endständigem
HEMA werden anschließend
in einem geeigneten aprotischen Lösemittel (wie z. B. DMSO) in
der Gegenwart eines Katalysators, z. B. N,N-Dimethylaminopyridin
(DMAP), an Dextran gekoppelt. Der Sub stitutionsgrad (d. h. die Anzahl
von Molen des Methacrylatgruppen enthaltenden Prepolymers pro 100
Mol Dextran-Glucoseeinheiten), kann durch das Verhältnis von
HEMA enthaltenem Prepolymer zu Dextran in dem Reaktionsgemisch maßgeschneidert
werden.
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Aus diesen substituierten Polymeren
werden Hydrogele z. B. durch eine radikalische Polymerisation einer
wässrigen
Lösung
von mit HEMA-Prepolymer
funktionalisiertem Dextran unter Verwendung eines bekannten Initiatorsystems
aus einem tertiären
Amin und einem Persulfat hergestellt (siehe z. B. die vorstehend zitierten
Artikel von Van Dijk-Wolthuis et al. in Macromolecules 28 und Hennink
et al. in J. Contr. Rel. 39). Es ist auch möglich, eine Polymerisation
mit Gamma-Bestrahlung einzusetzen mit dem Vorteil, das keine Initiator- und/oder
Katalysatorrückstände aus
dem Hydrogel extrahiert werden müssen.
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Das Hydrogelsystem gemäß der vorliegenden
Erfindung kann einfach unter Berücksichtigung
der Freisetzungskinetiken von Proteinwirkstoffen maßgeschneidert
werden, wodurch die Anwendbarkeit von Proteinwirkstoffen enorm erweitert
wird. Insbesondere im Falle von Modifikatoren einer biologischen
Antwort mit einem engen therapeutischen Fenster, die bei der Behandlung
verschiedener Erkrankungen unter Beteiligung des Immunsystems nützlich sind,
ist dies sehr wichtig.
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Ein steigender Substitutionsgrad
(DS; Menge an hydrolysierbarem Spacer, der vernetzbare Zweige aufweist,
pro 100 Einheiten des wasserlöslichen
Hauptpolymers; bestimmbar durch 1H-NMR)
ergibt ein stärker vernetztes
Netzwerk. Dies führt
zu einer langsameren Quellrate und einer verlängerten Auflösezeit des
Gels.
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Die Hydrogele gemäß der vorliegenden Erfindung
können
so hergestellt werden, dass Auflösezeiten von
weniger als 1 Tag bis zu ungefähr
3 Monaten und länger
erhalten werden können.
Dies kann beispielsweise durch Variieren des anfänglichen Wassergehalts der
zu vernetzenden wässrigen
Polymerlösung
und des DS bewirkt werden. Gele mit einem hohen anfänglichen
Wassergehalt, wie z. B. Wassergehalte von über 85 Gew.-%, enthalten überwiegend
intramolekulare Vernetzungen, während
niedrigere anfängliche
Wassergehalte mehr intermolekulare Vernetzungen ergeben. Gele mit
weniger intermolekularen Vernetzungen lösen sich bei gleichem DS schneller
auf.
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Wirkstoffe können entweder durch Gleichgewichtseinstellung
in einer wirkstoffhaltigen Lösung
(siehe z. B. Kim et al. in Phar. Res. 9 (3) (1992) 283–290) oder
durch Einfügen
des Wirkstoffs während
der Hydrogelherstellung (siehe z. B. Heller et al. in Biomaterials
4, (1983) 262–266)
in Hydrogele geladen werden.
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Das Beladen durch Gleichgewichtseinstellung
führt jedoch
normalerweise zu einem ziemlich geringen Wirkstoffgehalt in dem
Abgabesystem. Dies ist insbesondere der Fall, wenn der Wirkstoff
eine makromolekulare Substanz ist. Sofern die Porengröße des Hydrogels
nicht ziemlich groß ist,
haften die Makromoleküle
nur an der äußeren Oberfläche, was
zu einer Ausbruch-Freisetzung
führen
kann.
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Daher wird der Wirkstoff vorzugsweise
während
der Polymerisation oder des Vernetzens geladen.
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Da Suspensionen von Mikrokügelchen
einfach herzustellen und einfach für eine Injektion zu verwenden
sind, werden die Hydrogele im Allgemeinen als Mikrokügelchen
verschiedener Größen angewandt.
Mikrokügel chen
können
durch Lösen
von mit HEMA derivatisiertem Dextran in Wasser hergestellt werden,
wonach diese Lösung
einer Ölphase
(z. B. Silikonöl)
zugegeben wird, sodass sich eine Wasser-in-Öl-Emulsion ergibt. Nach Zugabe
eines geeigneten Initiatorsystems polymerisieren die Methacrylatgruppen,
sodass sich stabile Mikrokügelchen
ergeben.
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Die Wirkstoffe werden aus dem biologisch
abbaubaren Hydrogelen gemäß der vorliegenden
Erfindung während
der Hydrolyse des Hydrogels freigesetzt, obgleich zumindest in gewissem
Ausmaß eine
Diffusion von Proteinen aus dem Hydrogel stattfindet. Tatsächlich kann
das Hydrolyseverhalten des Hydrogels und die Zeit, während der
in dem Hydrogelsystem vorliegende Komponenten freigesetzt werden,
so aufeinender eingestellt werden, dass die Freisetzung bei einem
beliebigen Niveau zwischen Freisetzung erster Ordnung (kein Abbau des
Hydrogels) und nullter Ordnung (vollständig vom Abbau kontolliert)
stattfinden kann (siehe in dieser Hinsicht nachstehend Beispiel
6). Dies schafft einen offensichtlichen Vorteil gegenüber Hydrogelsystemen,
die unter physiologischen Bedingungen nicht hydrolysierbar sind,
aber ziemlich stabil sind, wie das bekannte Dextran-GMA-Hydrogelsystem,
oder gegenüber
Systemen, in denen die Polymere in dem Hydrogel nur in einer Dimension
verlängert
sind.
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Proteinwirkstoffe werden aus den
ziemlich stabilen Hydrogelen gemäß Kinetiken
erster Ordnung freigesetzt – die
Proteinfreisetzung ist proportional zur Quadratwurzel der Zeit -,
die für
monolithische Abgabesysteme üblich
sind. Die Hydrogele gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigen jedoch eher ein Freisetzungsverhalten nullter Ordnung – die Proteinfreisetzung
ist proportional zur Zeit. Wenn sich das Hydrogel während des Freisetzungsvorgangs
abbaut, steigt der Diffusionskoeffizient des in dem Hydrogel vorliegenden
Proteinwirkstoffs. Dies führt
zu einer konstanteren Freisetzung über die Zeit.
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Das Hydrogelsystem der vorliegenden
Erfindung bietet, wie gesagt, die Möglichkeit, die Freisetzungsprofile
verkapselter Proteinwirkstoffe maßzuschneidern. Im Einzelnen
kann die Abbaurate des Hydrogels durch Variieren des Wassergehalts
des Hydrogels, des Substitutionsgrades, der Anzahl und Länge hydrolysierbarer
Gruppen in den Spacern und der Wahl der hydrolysierbaren Spacer
eingestellt werden.
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Es wurde ermittelt, dass Spacer auf
Glycolsäurebasis
eine höhere
Hydrolyseempfindlichkeit aufweisen als Spacer auf Milchsäurebasis.
Liegen Spacer auf Glycolsäurebasis
vor, wird eine beschleunigte Abbaurate des Hydrogels im Vergleich
zu Spacern auf Milchsäurebasis
beobachtet.
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Die Wirkung des Wassergehalts des
Hydrogels und des Substitutionsgrades der Hydrogelpolymere wird
in den nachstehend folgenden Beispielen ausgeführt.
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Darüber hinaus hängt die
Freisetzungsrate von der Größe der Hydrogelpartikel
ab. Diese Größe kann durch
Variieren der Rührgeschwindigkeit,
der Viskosität
der äußeren Phase
usw. während
der Herstellung von Mikrokügelchen
eingestellt werden.
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Die Freisetzungsrate hängt nicht
von der Länge
der wasserlöslichen
Polymere ab, zumindest nicht in einem hohen Ausmaß. Dies
steht im Gegensatz zu Hydrogelsystemen, in denen die hydrolysierbaren
Gruppen nur in der Hauptkette des Polymers vorliegen (eindimensional
verlängerte
Polymere).
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Wie vorstehend dargelegt wurde, kann
die freisetzbare Komponente ein Proteinwirkstoff sein. Jedoch ist
es auch möglich,
Pharmaka, die Nanopar tikel enthalten, z. B. Liposome, ISCOMs, Polymilchsäurepartikel, Polycaprolactonpartikel
und Genabgabesysteme, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind,
zu verkapseln. Die Verkapselung dieser Nanopartikel hat den Vorteil,
dass das Auftreten einer zu schnellen Freisetzung der verkapselten
Komponente verhindert wird oder, in anderen Worten, Ausbruch-Effekte
auf sicherere Weise vermieden werden können.
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Ein Beispiel für ein beladenes Hydrogelsystem
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist ein Hydrogel, welches das Cytokin Interleukin-2 (IL-2)
enthält.
IL-2 ist ein Proteinwirkstoff, der z. B. bei der Behandlung bestimmter
Arten von Krebs verwendet werden kann.
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Damit IL-2 bei einer Krebsbehandlung
therapeutisch wirksam werden kann, ist eine verlängerte Anwesenheit von IL-2
an der Stelle des Tumorwachstums erforderlich. Dies kann entweder
durch Verabreichen hoher Dosen von IL-2 intravenös durch häufige Bolusinjektionen (siehe
z. B. Rosenberg et al., JAMA 271, (1994) 907–913), durch verlängerte permanente
Infusion (siehe z. B. West et al., N. Engl. J. Med. 316, (1987) 898-905) oder durch häufige Verabreichung
geringer Dosen von IL-2 intra- oder
peritumoral (siehe z. B. Den Otter et al., Anticancer Res. 13, (1993)
2453–2455)
erreicht werden.
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Ein Hauptnachteil des intravenösen Weges
besteht darin, dass zum Erreichen ausreichend hoher IL-2-Spiegel
an der Stelle des Tumorwachstums so hohe IL-2-Dosen intravenös verabreicht
werden müssen, dass
es stark toxisch wird. Im Gegensatz dazu hat sich der intra- oder
peritumorale, von Den Otter et al. entwickelte Ansatz bei verschiedenen
transplantierten und spontanen Tumoren als sehr erfolgreich und
praktisch ungiftig erwiesen.
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Ein ernsthaftes Problem für die Anwendung
dieser Therapieform bei menschlichen Krebspatienten besteht jedoch
darin, dass IL-2 5 bis 10 Mal innerhalb von 1 bis 2 Wochen intra-
oder peritumoral injiziert werden muss. Bei vielen Krebsarten ist
das eine nicht tragbare Belastung für den Patienten, wie in Fällen von
Lungenkrebs, Blasenkrebs und Magenkrebs. Bei ersten Versuchen, die
sehr wirksame lokale, niedrig dosierte Il-2-Behandlung in die menschliche Krebsklinik
zu übertragen,
wurden diese logistischen Probleme der IL-2-Abgabe bereits angetroffen.
Das Abgabesystem mit langsamer Freisetzung gemäß der vorliegenden Erfindung
macht den Einsatz lokaler IL-2-Immuntherapien möglich.
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Für
die in-vivo-Anwendung enthalten Hydrogel-Suspensionen (Mikrokügelchen)
normalerweise bis zu 105 I. E. IL-2 in 0,5
ml, die während
eines Zeitraums von 5 Tagen freigesetzt werden (d. h. pro Tag werden
2 × 104
I. E. IL-2 freigesetzt). Die freigesetzte Proteinmenge kann mit
empfindlichen quantitativen Detektionsverfahren (HPLC, ELISA-Assays)
bestimmt werden. Um zu untersuchen, ob das freigesetzte IL-2 noch
biologisch aktiv ist und in welchem Ausmaß (d. h. was ist die Wirkung
dieser chemischen Verfahren auf die spezifische Aktivität von IL-2),
können
Proliferations-Assays
unter Verwendung der von IL-2 abhängigen CTLL-Zellinie durchgeführt werden.
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Die vorliegende Erfindung wird nun
noch eingehender erklärt,
wobei auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele Bezug genommen
wird.
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Beispiele
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Um ein Dextran-Hydrogel zu erhalten,
wurde zuerst eine polymerisierbare Methacrylatgruppe in Dextran
eingeführt.
Für alle
nachstehend beschrieben Reaktionen wurde Dextran von Fluka (T40,
Mn = 15.000, Mw =
32.500 g/mol) verwendet. Vier verschiedene Dextranderivate wurden
synthetisiert (Beispiele 1–4),
in denen der Methacrylatester über
einen Spacer an Dextran gekoppelt war. Der Spacer enthält verschiedene
hydrolysierbare Bindungen (Carbonat- und/oder Carbonsäureester).
Das Abbauverhalten der aus diesen Derivaten hergestellten Gele wurde
mit Dextrangelen verglichen, die von Glycidylmethacrylat (dex-GMA)
stammen. Bei dieser Bezugsverbindung ist der Methacrylatester direkt
an eine Hydroxylgruppe von Dextran gekoppelt. Dieses Bezugsgel baut
sich äußerst langsam
ab.
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Beispiel 1: Synthese von
dex-HEMA
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Mit Hydroxyethylmethacrylat derivatisiertes
Dextran (dex-HEMA) wurde synthetisiert, indem mit Carbonyldiimidazol
(CDI) aktiviertes HEMA (HEMA-CI) an Dextran gekoppelt wurde.
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CDI (1,62 g; 10 mmol) wurde in ungefähr 10 ml
wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) gelöst. Diese Lösung wurde zu einer Lösung von
HEMA (1,30 g; 10 mmol) in 5 ml wasserfreiem THF gegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdampfen des Lösemittels
wurde eine leicht gelbe Flüssigkeit
erhalten (Ausbeute 2,93 g). Dieses Rohprodukt wurde in Ethylacetat
gelöst,
mit Wasser extrahiert, um Imidazol und nicht umgesetztes HEMA zu
entfernen und über
wasserfreiem MgSO4 getrocknet. Nach Filtration
wurde das Lösemittel
verdampft und fast reines, mit CDI aktiviertes Hydroxyethylmethacrylat (HEMA-Cl)
erhalten. Die Struktur dieses Produkts wurde durch NMR- und IR-Spektroskopie
bestätigt.
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Verschiedene Mengen HEMA-Cl (0,73,
1,49 oder 2,19 g; 96% Reinheit) wurden zu einer Lösung von Dextran
(10 g; 62 mmol Glucoseeinheiten) und N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP;
2 g, 16,4 mmol) in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO; 90 ml) gegeben.
Diese Reaktionsgemische wurden 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt, wonach
die Reaktion durch die Zugabe von ungefähr 2 ml konzentrierter HCl
beendet wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Tage gegen Wasser bei
4°C dialysiert.
Dex-HEMA wurde durch Gefriertrocknung isoliert und ergab ein weißes, flaumiges
Material (Ausbeute > 90%).
Der Grad der HEMA-Substitution wurde durch NMR-Spektroskopie ermittelt
und betrug 4, 9 bzw. 13.
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Beispiel 2: Synthese von
dex-SA-HEMA
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Dextran, das mit dem Halbester von
Bernsteinsäure
(SA) und HEMA (dex-SA-HEMA)
derivatisiert ist, wurde wie folgt synthetisiert.
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SA (2,00 g, 20 mmol), HEMA (2,6 g,
20 mmol), Triethylamin (TEA; 0,28 ml, 2 mmol) und Hydrochinon (Hemmstoff, ± 10 mg)
wurden in ungefähr
30 ml wasserfreiem THF gelöst.
Das Reaktionsgemisch wurde 2 Tage bei 45 °C gerührt, wonach das Lösemittel
verdampft wurde. Es wurde eine gelbe Flüssigkeit erhalten (Ausbeute:
4,88 g). Die Struktur von HEMA-SA wurde durch NMR- und IR-Spektroskopie
bestätigt.
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HEMA-SA (0,99 g (94% Reinheit), 4
mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC; 0,83 g, 4 mmol) wurden in
ungefähr
20 ml wasserfreiem DMSO gelöst.
Nach 15 min hatte sich ein Niederschlag gebildet (Dicyclohexylureum;
DCU), und dieses Gemisch wurde zu einer Lösung von Dextran (2,57 g, 16
mmol Glucoseeinheiten) und TEA (0,56 ml, 4 mmol) in wasserfreiem
DMSO (20 ml) gegeben: Das resultierende Gemisch wurde 3 Tage bei
Raumtemperatur gerührt,
wonach 3 Tropfen konzentrierte HCl zugegeben wurden, um die Reaktion zu
beenden. Danach wurde das Reaktionsgemisch filtriert, um DCU zu
entfernen und 3 Tage bei 4 °C
dialysiert. Nach Gefriertrocknung wurde ein weißes, flaumiges Produkt erhalten (Ausbeute
2,78 g). Der Substitutionsgrad wurde durch NMR-Spektroskopie festgestellt und betrug
3.
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Beispiel 3: Synthese von
dex-Lactat-HEMA
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Mit HEMA-Oligolactid derivatisiertes
Dextran wurde wie folgt gemäß der Darstellung
in Schema 1 synthetisiert. Drei Schritte können unterschieden werden.
- a. Koppeln von Lactat an HEMA, sodass sich
HEMA-Lactat ergibt.
- b. Aktivieren von HEMA-Lactat unter Verwendung von CDI, sodass
sich HEMA-Lactat-Cl ergibt.
- c. Koppeln von HEMA-Lactat-Cl an Dextran.
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Ein Gemisch aus L-Lactid (4,32 g;
30 mmol) und HEMA (3,90 g; 30 mmol) wurde auf 110°C erwärmt. Danach
wurde eine katalytische Menge in ungefähr 0,5 ml Toluol gelöstes Zinn(II)-octoat
(SnOct2; 121,5 mg, 0,3 mmol) zugegeben.
Das resultierende Gemisch wurde 1 Stunde gerührt. Nach Abkühlen auf
Raumtemperatur wurde das Gemisch in THF (20 ml) gelöst. Diese
Lösung
wurde in Wasser (180 ml) getropft und der gebildete Niederschlag
wurde durch Zentrifugieren isoliert. Das Pellet wurde in Ethylacetat
(40 ml) aufgenommen, zentrifugiert, um Feststoffmaterial zu entfernen,
getrocknet (MgSO4) und filtriert. Das Lösemittel
wurde verdampft, sodass sich ein viskoses Öl (3,74 g, 45%) ergab. Das
Produkt (HEMA-Lactat) wurde durch NMR- und IR-Spektroskopie charakterisiert.
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HEMA-Lactat (3,74 g, 10,8 mmol) wurde
zu einer Lösung
von CDI (1,76 g, 10,8 mmol) in THF gegeben und 16 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt.
Das Lösemittel
wurde unter reduziertem Druck verdampft, sodass sich ein viskoses Öl ergab.
Das als Hauptkomponenten (NMR-Analyse) HEMA- Lactat-Cl und Imidazol enthaltende Produkt
wurde ohne weitere Aufreinigung verwendet.
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Zu einer Lösung von Dextran (10 g, 62
mmol Glucoseeinheiten) und DMAP (2,0 g, 10,6 mmol) wurden verschiedene
Mengen HEMA-Lactat-Cl (1,61, 3,23 bzw. 4,84 g; 80% Reinheit) gegeben.
Diese Gemische wurden 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt, wonach
die Reaktion durch die Zugabe von ungefähr 2 ml konzentrierter HCl
beendet wurde. Die Lösungen
wurden 2 Tage gegen Wasser dialysiert. Nach Gefriertrocknung wurden
weiße,
flaumige Produkte erhalten (Ausbeute um 85%). Der Substitutionsgrad
(gemäß Bestimmung
durch NMR-Spektroskopie) betrug 3, 6 bzw. 10 für die drei Produkte.
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Unter Verwendung ähnlicher Verfahren kann die
Länge des
Lactat-Spacers durch Ändern des
Molverhältnisses
von HEMA und Lactid in der ersten Reaktion variiert werden.
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Beispiel 4: Synthese von
dex-Glycolid-HEMA
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Dex-Glycolid-HEMA wurde nach dem
gleichen Verfahren, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, synthetisiert,
wobei Lactid durch Glycolid ersetzt wurde.
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Bezugsbeispiel 1: Dex-GMA
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Dex-GMA wurde, wie bei Van Dijk-Wolthuis
et al., Macromolecules 28, (1995), 6317–6322 beschrieben, synthetisiert.
Eine neue Untersuchung des erhaltenen Dextranderivats zeigte, dass
die Methacrylestergruppe direkt an eine der Hydroxylgruppen von
Dextran gekoppelt ist, was bedeutet, dass kein Glyceryl-Spacer vorliegt.
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Beispiel 5: Herstellung
von Dextran-Hydrogelen
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Hydrogele wurden durch eine radikalische
Polymerisation wässriger
Lösungen
von methacryliertem Dextran (hergestellt gemäß den Beispielen 1-4 und Bezugsbeispiel
1) erhalten. Methacryliertes Dextran (100 mg) wurde in 760 μl PBS-Puffer
(10 mM Phosphat, 0,9% NaCl, 0,02% NaN3,
pH 7,2) gelöst.
Zu dieser Lösung wurden
90 μl Kaliumperoxydisulfat
(KPS; 50 mg/ml) in dem gleichen Puffer pro Gramm Lösung gegeben
und gut gemischt. Anschließend
wurde N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
(TEMED; 50 μl;
20% (Vol./Vol.) in Wasser, pH-Wert auf 7 eingestellt) zugegeben,
und die resultierende Lösung
wurde schnell in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und
für 1 Stunde
bei Raumtemperatur polymerisiert, sodass sich nach der Polymerisation
ein Hydrogelmaterial mit einem anfänglichen Wassergehalt von 90%
(Gew./Gew.) ergab.
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Die Gele wurden aus den Röhrchen entnommen,
genau gewogen und in PBS bei 37°C
inkubiert. Regelmäßig wurde
das Gewicht der Gele bestimmt und dazu verwendet, den Quellgrad
(= Wt/Wo, wobei Wt das Gewicht
des Gels am Zeitpunkt t und Wo das Anfangsgewicht des Gels ist)
zu berechnen. Die Hydrogelabbau-(Auflöse-)zeit ist definiert als
die Zeit, bei der das Quellverhältnis
= 0 (oder Wt = 0) ist.
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1 zeigt
das Quellverhalten von drei verschiedenen Dextran-Hydrogelen (anfänglicher
Wassergehalt 90%). Das dex-GMA (DS = 4) erreichte eine Gleichgewichtsquellung
nach 3 Tagen. Danach blieb das Gewicht der Gele konstant, was zeigt,
dass keine signifikante Hydrolyse von Methacrylestern auftrat. Dex-HEMA und
dex-Lactat-HEMA zeigten eine mit der Zeit zunehmende Quellung bis
sich diese Gele vollständig
gelöst hatten.
Dies zeigt, dass bei diesen Hydrogelsystemen eine Hydrolyse von
Carbonat estern (dex-(Lactat-)HEMA) und/oder Lactatestern (dex-Lactat-HEMA)
auftrat.
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2 zeigt
das Quellverhalten von dex-Lactat-HEMA-Hydrogelen (anfänglicher
Wassergehalt 92%) mit verschiedenen Substitutionsgraden. Wie zu
sehen ist, führte
ein steigender DS zu einer längeren
Auflösezeit.
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3 zeigt
das Quellverhalten von dex-Lactat-HEMA-Hydrogelen mit einem festen
DS (6) und unterschiedlichem anfänglichen
Wassergehalt. Es scheint, dass sich die Auflösezeit mit einem steigenden
anfänglihen
Wassergehalt verlängert.
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4 zeigt
das Quellverhalten von dex-SA-HEMA-Hydrogel (DS 3) und einem variierenden
anfänglichen
Wassergehalt.
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Die folgenden Tabellen geben einen Überblick über die
Auflösezeiten
verschiedener Dextran-Hydrogele.
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Die Auflösezeiten von Dextran-Hydrogelen
(anfänglicher
Wassergehalt 92%), die durch Polymerisieren von mit GMA derivatisiertem
Dextran (DS 4) erhalten wurden, betrugen ungefähr 100 Tage (pH 7,2, 37°C). Durch
Polymerisieren von mit GMA derivatisiertem Dextran erhaltene Gele
(anfänglicher
Wassergehalt 80%, DS 11) zeigten während 70 Tagen sogar bei extremen
Bedingungen (37°C,
pH 12 und pH 1) keine Anzeichen eines Abbaus (verstärktes Quellen).
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Beispiel 6: Proteinfreisetzung
aus sich abbauenden Dextran-Hydrogelen
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Die Freisetzung aus sich nicht abbauenden
dex-GMA-Hydrogelen wurde ausführlich
untersucht. Es schien, dass wenn der Proteindurchmesser kleiner
als die Mesh-Größe des Hydrogels
war, die Freisetzung des Proteins zutreffend durch die Theorie des
freien Volumens beschrieben werden konnte. In diesem Fall war die
Gesamtmenge an freigesetztem Protein proportional zur Quadratwurzel
der Zeit (W. E. Hennink, Controlled release of proteins from dextran
hydrogels, Journal of Controlled Release 39, (1996) 47–55).
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5 zeigt
die Freisetzung eines Modellproteins (IgG) aus sich abbauenden Dextran-Hydrogelen (dex-Lactat-HEMA,
DS 2,5). Die Freisetzung von IgG aus diesen sich abbauenden Gelen
ist nullter Ordnung (Gesamtfreisetzung proportional zur Zeit). Dies
steht im Gegensatz zu der Freisetzung von Proteinen aus sich nicht
abbauenden Dextran-Hydrogelen, bei denen eine Freisetzung erster
Ordnung beobachtet wurde.