DE69724780T2

DE69724780T2 - Polysaccharidschwämme für zellkultur und transplantation

Info

Publication number: DE69724780T2
Application number: DE69724780T
Authority: DE
Inventors: Lilia Shapiro; Rachel Glicklis; Smadar Cohen
Original assignee: Ben Gurion University of the Negev Research and Development Authority Ltd
Current assignee: Ben Gurion University of the Negev Research and Development Authority Ltd
Priority date: 1996-05-22
Filing date: 1997-05-21
Publication date: 2004-07-15
Anticipated expiration: 2017-05-22
Also published as: CA2256327C; DE69724780D1; CA2256327A1; EP0901384A1; IL118376A0; AU2711797A; PT901384E; ATE249251T1; DK0901384T3; WO1997044070A1; AU714647B2; JP2000512666A; US20030078672A1; US6334968B1; EP0901384B1; US6425918B1; ES2206707T3; US6793675B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue bioresorbierbare Polysaccharidschwämme, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und die Verwendungen hiervon zur Kultivierung von Säugerzellen in vitro, wie auch die Verwendung hiervon als Matrizes, Träger oder Formgeber für eine Implantation in einen Patienten, um beschädigtes oder entferntes Gewebe zu ersetzen, wobei das Polysaccharidschwammimplantat als Substrat, Matrix oder Formgeber für das umgebende Wirtsgewebe dient, um in dieses einzudringen, auf ihm zu proliferieren und eventuell einen aktiven Teil des Gewebes oder Organs zu bilden, in dem das Implantat gemacht wurde oder das Implantat dient als anfängliches Substrat für die Vaskulisierung durch umgebendes Wirtsgewebe und nach einer Vaskularisierung können die in vitro angezogenen Zellen der Wahl oder jene, die von einem Wirt erhalten wurden, in das vaskularisierte Implantat injiziert werden, um eine schnelle Akklimatisierung und Proliferation der Zellen zu ermöglichen, die anschließend einen aktiven Ersatz für das Organ oder Gewebe bilden, das zerstört oder entfernt wurde. Der Polysaccharidschwamm kann auch als Substrat, Matrix oder Formgeber für die Transplantation von Zellen in einen Patienten dienen, die anfänglich hierauf in vitro angezogen wurden, um zerstörtes, entferntes oder nicht funktionsfähiges Gewebe zu ersetzen.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Poröse, absorbierbare Matrizes, die aus natürlichen und synthetischen Polymeren hergestellt werden (siehe beispielsweise Yannas 1990, Natsumi et al., 1993, Grande 1989, Vacanti 1990, Mikos et al., 1993a, Mikos et al. 1993b, Mikos et al. 1993c und Langer und Vacanti 1993), sind derzeit in Verwendung oder in Untersuchung als Implantate, um die Regeneration von Gewebe bei Defekten zu erleichtern, die durch Erkrankung, Trauma oder rekonstruktive Operationsverfahren verursacht wurden. Diese Matrizes wurden alleine verwendet oder mit Zellen zum Zweck der Zell- und Gewebetransplantation beimpft (Langer und Vacanti, 1993). Die Zelltransplantation kann eine alternative Behandlung zur Gesamtorgantransplantation für versagende oder schlecht funktionsfähige Organe sein, wie Leber und Pankreas. Da viele isolierte Zellpopulationen in vitro mittels Zellkulturtechniken vermehrt werden können, ist nur eine sehr kleine Anzahl an Donorzellen notwendig, um ein geeignetes Implantat herzustellen. Daher gilt, wenn solche Zellen von einem lebenden Donor entnommen werden, muss der lebende Donor kein gesamtes Organ opfern. Darüberhinaus können für den Zweck der Gentherapie Gentransfervektoren in verschiedene Zelltypen eingeführt werden, wie beispielsweise Hepatocyten, Fibroblasten, Keratinocyten, Endothelzellen und Myoblasten, die dann in den Wirt zur Bildung und lokalen Freisetzung von Proteinen und anderen therapeutischen Arzneimitteln oder Mitteln zurücktransplantiert werden.
Eine weitere Anwendung für poröse Matrizes ist als Formgeber, um das Verhalten von Zellen in einem dreidimensionalen Netzwerk in vitro zu untersuchen (Jain et al., 1990, Doane and Birk, 1991). In einigen Anwendungen werden diese porösen Matrizes entworfen, um als Analoga der extrazellulären Matrix zu dienen, um ein geeignetes Substrat für die Zellhaftung bereitzustellen und bestimmte verankerungsabhängige Prozesse zu ermöglichen, wie Migration, Mitose und Matrixsynthese (Folkman und Moscona, 1978). Unter diesem Aspekt wird berücksichtigt, dass solche Analoga der extrazellulären Matrix zur Modulation des Zellverhaltens auf ähnliche Weise fähig sein können, wie die, die von der nativen extrazellulären Matrix bewirkt wird (siehe Madri und Basson, 1992), wobei angenommen wird, dass die Chemie dieser Analoga, wie auch ihre Porencharakteristiken, wie Prozentsatz an Porosität, Porengröße und Orientierung die Dichte und Verteilung der Zellen innerhalb der Matrix beeinflussen können und hierbei den Regenerationsprozess beeinflussen, wenn diese Analoga in Transplantationen verwendet werden.
Bioresorbierbare Schwämme können auch eine temporäre Formgebung für transplantierte Zellen bereitstellen und hierbei den Zellen erlauben, selbst eine extrazelluläre Matrix zu sekretieren, um langfristig einen vollständigen und natürlichen Gewebeersatz zu ermöglichen. Die makromolekulare Struktur dieser Schwämme ist so ausgewählt, dass sie vollständig abbaubar sind und eliminiert werden, wenn sie ihre Funktion der Bereitstellung der anfänglichen künstlichen Unterstützung für frisch transplantierte Zellen erfüllt haben. Für diese Schwämme gilt, um bei Zelltransplantationen brauchbar zu sein, dass sie hochporös mit großen Oberflächen/Volumenverhältnissen sein müssen, um eine große Anzahl an Zellen zu beherbergen, dass sie biokompatibel sein müssen, das heißt nicht toxisch gegenüber den Zellen, die sie beherbergen und gegenüber dein Wirtsgewebe, in das sie transplantiert werden, dass sie zur Förderung der Zelladhäsion fähig sein müssen und dass sie die Aufrechterhaltung der differenzierten Funktion der haftenden Zellen erlauben.
Jedoch sind die meisten bis heute beschriebenen porösen Matrizes, die erfolgreich hergestellt und bei Implantaten oder Transplantaten verwendet werden, auf die beschränkt, die eine sehr dünne Zellschicht tragen und sind im Prinzip die, welche als Hautsubstitute oder Hautersatz dienen (siehe beispielsweise Yannas, 1990). In Anbetracht dieser limitierten Anwendung sind die entwickelten Matrizes die, worin die Porosität und Porengröße hiervon von dem Typ ist, die fast ausreichend ist, um die Verteilung der dünnen Zellschicht in der Matrix zu erlauben. Wenn jedoch solche Matrizes mit Zellen verwendet werden, wie beispielsweise Hepatocyten, die in Zellaggregaten wachsen und eine Dicke aufweisen, die größer ist als die, welche für diese früheren Matrizes vorgesehen war, tritt ein erstes Problem in Bezug auf die ausreichende Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen zu den inneren Zellen in der Matrix auf, wobei als Ergebnis diese inneren oder unteren Zellschichten gewöhnlich absterben. Daher können diese früheren Matrizes zur Herstellung von Hautäquivalenten brauchbar sein, sind aber viel weniger zur Herstellung von funktionellen Organäquivalenten sowohl in vitro als auch nach einer anschließenden Transplantation in vivo brauchbar, die sich aus mehrlagigen Zellaggregaten zusammensetzen.
Die meisten der bisher entwickelten porösen Matrizes basieren wie oben erwähnt auf natürlichen Polymeren, wie Collagen oder synthetischen Polymeren aus der Milch/Glycolsäurefamilie. Diese auf Collagen basierenden Matrizes haben mehrere Nachteile, wie unter anderem, dass sie sich sehr schnell abbauen, wobei viele schon in den ersten 4 Wochen nach der Implantation verschwinden (siehe Olde Damink et al., 1995, Ben-Yishay et al., 1995). Obwohl die Abbaurate der Collagenmatrix durch Quervernetzung mit Glutaraldehyd reduziert werden kann, zeigen die entstehenden quervernetzten Matrizes jedoch eine Immunogenität, Calzifizierung und fibrotische Narbenbildung, wenn sie für längere Perioden implantiert werden (siehe Timple et al., 1980). Ferner sind Collagenmatrizes auch nicht geeignet für eine längere in vitro Kultivierung von Zellen aufgrund einer signifikanten Kontraktion der Collagenform, die etwa nach einer Woche Inkubation auftritt, was die Kollagenform weniger brauchbar für eine Operationsbehandlung macht, wenn sie als Transplantationsmatrix beabsichtigt ist (Ben-Yishay, 1995).
Andere synthetische bioabbaubare Schäume auf der Grundlage von Poly(D,L-milch-coglycolsäure) wurden als Formgeber für Gewebekonstruktionen verwendet, wie dies oben erwähnt ist, da aber diese Polymere hydrophob sind, bleiben, wenn eine Zellsuspension oder ein Kulturmedium in diese Schäume platziert wird oder in ihr Inneres injiziert wird, die Mehrzahl der Poren leer, was zu einer Minderausnutzung des Volumens dieser Schäume führt. Zusätzlich haben Studien gezeigt, dass der Abbau dieser bioabbaubaren Schäume zu einer signifikanten Akkumulie rung von Säureprodukten mit signifikanten Abnahmen im internen pH innerhalb dieses Schaums auf weniger als pH 3,0 führt (siehe Park, Lu und Crotts, 1995), wobei das saure Umfeld für die wachsenden Zellen sehr schädlich ist.
Alginate wurden auch vorher für die Zwecke der Zelltransplantation verwendet. Alginate sind natürliche Polysaccharidpolymere, wobei sich das Wort "Alginat" auf eine Familie an polyanionischen Polysaccharidcopolymeren bezieht, die von braunen Meeresalgen stammen und sich aus 1,4-gebundenen β-D-Mannuronsäure- (M) und α-L-Guluronsäureresten (G) in verschiedenen Anteilen zusammensetzen. Alginat ist in wässrigen Lösungen bei Raumtemperatur löslich und ist zur Bildung von stabilen Gelen fähig, insbesondere in Gegenwart von bestimmten divalenten Kationen, wie Calcium, Barium und Strontium. Die einzigartigen Eigenschaften von Alginat zusammen mit der Biokompatibilität (siehe Sennerby et al., 1987 und Cohen et al., 1991), der relativ geringen Kosten und der breiten Verfügbarkeit haben Alginate zu einem wichtigen Polymer in medizinischen und pharmazeutischen Anwendungen gemacht. Beispielsweise wurde es in Wundabdeckungen und Zahnabdrucksmaterialien verwendet. Ferner wurde Alginat auch von verschiedenen regulatorischen Behörden zur Verwendung als Wundabdeckung und als Lebensmittelzusatzstoff beim Menschen zugelassen. Darüberhinaus sind Alginate mit pharmazeutischer Reinheit, die allen Qualitäts- und Sicherheitserfordernissen der pharmazeutischen Behörden von Europa und den Vereinigten Staaten von Amerika (LTSA) entsprechen, von mehreren kommerziellen Herstellern erhältlich. Daher waren diese früheren Anstrengungen, obwohl Alginat auch für die Zelltransplantation verwendet wurde, im allgemeinen auf Systeme fokussiert, bei denen eine semipenneable Membran entwickelt wurde, wie sie für den Schutz der Zellen vor dem Immumsystem des Wirts erforderlich war (siehe beispielsweise King et al., 1987 und Sun et al. 1987). Diese semipermeablen Membranen werden durch Tropfen eines Zellgemisches, das in einer Alginatlösung suspendiert ist, in eine zweite Lösung hergestellt, die Calciumchlorid enthält. Dies ergibt Alginatkügelchen oder Mikrokapseln, die die hierin enthaltenen Zellen verkapseln. Die Mikrokapseln werden gewöhnlich auch einem zweiten Schritt unterzogen, bei dem eine semipermeable Membran um die Alginatkügelchen durch die Adsorption eines Polykations, wie Polylysin, auf der Oberfläche der Kügelchen gebildet wird. Diese Beschichtung reduziert jedoch die Mikrokapselpermeabilität gegenüber Nährstoffen, die zum Tod der verkapselten Zelle führt.
In Anbetracht der obigen Nachteile des Stands der Technik ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Polysaccharidpolymerform bereitzustellen, die aus jedem geeigneten Polysaccharidpolymer sein kann, wie beispielsweise Alginate, Gellan, Gellankautschuk, Xanthan, Chitosan, Agar, Carrageenan, (polyanionische Polysaccharidpolymere) oder Chitosan (polykationische Polysaccharidpolymere), die geeignete Stellen für die Anlagerung und das Wachstum einer ausreichenden Zellmasse bereitstellt, um nicht nur in vitro sondern auch in vivo zu überleben und funktionsfähig zu sein und wobei die Polysaccharidpolymerform, das Substrat oder die Matrix nicht nur das Überleben und das Wachstum der Zellen nicht beschränkt, die benachbart zur Matrixoberlfäche liegen, wenn die Zellen zahlenmäßig innerhalb der Matrix zunehmen, sondern auch als Träger von dicken Zelllagen dient, wie Zellaggregaten und zur Aufrechterhaltung der Zellen in einem aktiven Funktionszustand vor und nach einer Implantation/Transplantation in ein Wirtsgewebe fähig ist, wobei die Polysaccharidmatrix auch für eine Vaskularisierung vom umgebenden Gewebe (Angiogenese) zugänglich ist.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung Polysaccharidmatrizes bereitzustellen, die bioabbaubar sind, die aber nur langsam in vivo abgebaut werden und hierbei es den enthaltenen Zellen ermöglichen, sich zu etablieren und ihre eigene Gewebematrix an der Transplantationsstelle bis zu dem Punkt zu entwickeln, bei dem sie keine Polysaccharidmatrix mehr benötigen oder wenn die Matrix alleine als Implantat verwendet wird, muss sie für eine ausreichende Zeit stabil sein, um vom umgebenden Gewebe eingenommen zu werden und hierauf zu proliferieren bis zu dem Punkt, an dem die einwandernden Zellen etabliert sind und ihre eigene Gewebematrix gebildet haben, wobei das ursprünglich fehlerhafte Gewebe ersetzt wird oder wenn die Matrix alleine als erste Stufe eines Implantats verwendet wird, muss sie für eine ausreichende Zeit stabil sein, um ein Vaskularisierung vom umgebenden Gewebe in das Implantat zuzulassen oder die Invasion hiervon durch Blutgefäße und um die zweite Stufe zuzulassen, bei der die Zellen der Wahl in die vaskularisierte Matrix injiziert werden und anschließend hierauf proliferieren, bis zu dem Punkt, an dem sich diese Zellen etabliert haben, ihre eigene Gewebematrix gebildet haben und hierdurch zumindest funktionell das ursprünglich schadhafte oder beschädigte Gewebe ersetzt haben.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, solche Polysaccharidschwämme mit einer hohen Porosität bereitzustellen, die leicht durch Blutgefäße und/oder Zellen eingenommen werden können und die anschließend das Wachstum, die Proliferation und die biologische Funktion von solchen implantierten oder transplantierten Zellen sowohl in vitro als auch nachher in vivo geeignet zu unterstützen, wenn sie als Implantate oder Transplantate verwendet werden wobei solche Polysaccharidschwämme eine Morphologie aufweisen, so dass das innere Volumen optimal genutzt wird und ferner mit der Maßgabe, dass solche Schwämme, die keine externe Beschichtung oder der gleichen für Implantations- oder Transplantationszecke benötigen und daher sind die Schwämme nicht nur Vehikel für die Verkapselung von Zellen, sondern dienen als Matrix oder Formgeber für die Zellen, die sie tragen und erlauben den freien Transport von Sauerstoff und Nährstoffen in die Zellen und sorgen in vivo für eine Vaskularisierung der Zellen, um eine Nährstoffversorgung und eine anschließenden Geweberegeneration aus diesen transplantierten Zellen bereitzustellen. Daher sind die erfindungsgemäßen Polysaccharidschwämme so entworfen, dass sie nicht nur als Verkapselungsvorrichtungen für Zellen dienen, sondern als effektive Matrizes, Träger oder Formgeber für eine optimale Verwendung bei Implantationen und Transplantationen für eine Gewebereparatur, wie dies oben erwähnt ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polysaccharidschwämme bereitzustellen.
Andere Ziele der Erfindung umfassen die Bereitstellung von Polysaccharidschwämmen zur Verwendung bei der in vitro Säugerzellkultur, bei Implantationen und bei Transplantationen zur Reparatur von beschädigtem oder erkranktem Gewebe, wie auch die Verwendung solcher Polysaccharidschwämme zum Zweck der in vitro Zellkultur, Implantationen und Transplantationen.
Andere Ziele und Aspekte der Erfindung sind leicht aus der folgenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich oder werden hieraus deutlich.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf einem neuen Verfahren zur Herstellung von dreidimensionalen, porösen, bioabbaubaren Schwämmen und die hierdurch hergestellten Schwämme, wobei die Schwämme oft aus jedem geeigneten Polysaccharid hergestellt sind, wie beispielsweise polyanionischen Polysaccharidpolymeren, die Alginate, Gellan, Gellankautschuk, Xanthan, Chitosan, Agar und Carrageenan umfassen und polykationischen Polysaccharidpolymeren, die Chitosan umfassen. Die Polysaccharidschwämme der Erfindung haben viele mögliche Anwendungen, insbesondere medizinische Anwendungen, beispielsweise können sie als Zellmatrix, Substrat oder Formgeber verwendet werden, um verschiedene Säugerzellen in vitro unter Bedingungen anzuziehen, die für den Erhalt von solchen Zellen in vitro sorgen, welche in einem aktiven Stadium der Zellproliferation sind oder sogar in Differenzierungsstadien mit einer damit zusammenhängenden biologischen Aktivität der Zellen in diesen Stadien.
Ein solches zelluläres Wachstum, eine Aktivierung und/oder Differenzierung und/oder Proliferation hängt vollkommen von der Art des Substrats, der Matrix oder des Formgebers ab auf dem oder in dem sie angezogen werden und in diesem Zusammenhang haben die neuen Alginatschwämme der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass sie für das Wachstum von Säugerzellen, wie beispielsweise Fibroblasten und Hepatocyten besonders vorteilhaft sind. Darüberhinaus können Säugerzellen, die auf oder innerhalb der Polysaccharidschwämme gemäß der vorliegenden Erfindung angezogen werden, in Auto- und Allotransplantaten beispielsweise zum Zweck des Ersatzes von beschädigten Organen oder Geweben verwendet werden, wie beispielsweise Haut, Leber und viele andere. Ähnlich sind die Polysaccharidschwämme der Erfindung auch besonders als Implantate geeignet, die in einem Patienten als Ersatz des Gewebes eingebracht werden, das zerstört oder entfernt wurde und erlauben dem umgebenden Gewebe das Implantat einzunehmen und letztlich das Implantat mit dem zellulären Material aufzufüllen, um die ursprünglich zerstörten oder entfernten Gewebe wiederherzustellen. Solche Implantate können auch in einem Zweistufenverfahren verwendet werden, worin in einem ersten Schritt das Implantat in einen Patienten eingebracht wird, um Gewebe oder ein Organ zu ersetzen, das vollständig oder teilweise entfernt wurde. Das Implantat wird dann durch Blutgefäße aus dem umgebenden Gewebe eingenommen, um eine Vaskularisierung des Implantats bereitzustellen, wobei dies kurz nach der Implantierung beginnt. Wenn das Implantat vaskularisiert wurde, wird die zweite Stufe durch die Injektion von Zellen der Wahl in das Implantat ausgeführt, die das ursprüngliche Gewebe/Organ ersetzen sollen. Diese Zellen wurden vorher in vitro kultiviert oder wurden frisch aus dem Patienten oder einem geeigneten Spender erhalten. Wenn die Zellen injiziert sind, sind sie zur schnellen Akklimatisierung aufgrund des vorgeformten vaskulären Netzwerks in der Implantatform der ersten Stufe fähig. Als Ergebnis können die injizierten Zellen schnell proliferieren und das Implantat auffüllen, um anschließend in verschiedene Stadien zu differenzieren und letztlich für einen aktiven Ersatz für das ursprünglich beschädigte oder entfernte Gewebe/Organ sorgen. Die Art der Polysaccharidschwämme der Erfindung ist insbesondere für die vorher erwähnten Transplantations- oder Implantationsanwendungen brauchbar, da die Polysaccharide der Wahl die mit einer sehr geringen Immunogenität sind, eine Stabilität für relativ lange Zeitspannen aufweisen und da die Schwämme bioabbaubar sind, werden sie nach einer relativ langen Zeitspanne im Körper ohne schädliche Nebenwirkungen abgebaut.
Die Porosität und Schwammmorphologie der erfindungsgemäßen Polysaccharidschwämme hängt von verschiedenen Formulierungs- und Prozessierungsparametern ab, die im erfindungsgemäßen Verfahren variiert werden können und daher ist es möglich, eine große Vielzall an makroporösen Schwämmen herzustellen, die für die Zellkultur und Vaskularisierung geeignet sind. Die verschiedenen Schwämme haben gute mechanische Eigenschaften und sind daher wie oben erwähnt geeignet, das Wachstum und die Proliferation einer großen Vielzahl an Säugerzellen zu unterstützen, wie beispielsweise Fibroblasten und Hepatocyten und daher können die mit Zellen beimpften Schwämme der Erfindung zumindest eine temporäre Unterstützung für solche Zellen bereitstellen, wenn sie als Ersatz für beispielsweise Hautgewebe (Dermisfibroblasten) oder Lebergewebe (Hepatocyten) transplantiert werden. Diese temporäre Unterstützung hält für die Zeitspanne, bis der mit den Zellen transplantierte Schwamm innerhalb des Patienten bioabgebaut ist, wobei dann erwartet wird, dass das Transplantat das ursprünglich beschädigte oder erkrankte Gewebe zur eigenständigen Reparatur fähig ist.
Das neue Verfahren der Erfindung basiert auf einem Dreistufenverfahren, das einen Gelierungsschritt umfasst, worin eine Polysaccharidlösung in Gegenwart eines Quervernetzungsmittels geliert wird, gefolgt von einem Gefrierschritt und schließlich einem Trocknungsschritt durch Lyophilisierung, um einen porösen Schwamm zu bilden. Durch die Veränderung der Zustände an jeder Stufe, insbesondere der Konzentration des Polysaccharids, der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Quervernetzungsmittels und der Konzentration hiervon, der Form des Gefäßes, in dem der Gelierschritt stattfindet und der Geschwindigkeit des Gefrierschritts ist es somit möglich, ein sehr breites Spektrum an Polysaccharidschwämmen mit verschiedener Form zu erhalten, die verschiedene Porengrößen und Porenverteilungen aufweisen und somit auch in den mechanischen Eigenschaften variieren.
Die folgenden Bedeutungen von verschiedenen Ausdrücken werden hierin verwendet:
Porengröße – Die Porengröße einer Pore innerhalb eines Polysaccharidschwämms wird durch die Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt d = √l × h,worin 1 und h jeweils die mittlere Länge und Breite der Poren sind, wie dies durch mikroskopische Analyse der verschiedenen Schwämme bestimmt wurde (siehe Beispiel 2) Porenwanddicke – Dieser Parameter charakterisiert den Abstand zwischen den Poren innerhalb eines Schwamms und ist so für die Mikrostruktur der Schwämme mitbestimmend und wird auch durch Messung der verschiedenen Schwämme auf mikroskopischer Ebene bestimmt (siehe Beispiel 2).
E-Modul der Elastizität – Dies ist ein Maßstab für die relative Steifigkeit der Polysaccharidschwämme und wird in kPa Einheiten bestimmt, wenn man Schwämme einer Kompression unterzieht und die Geschwindigkeit ihrer Deformierung verfolgt. Je höher das E-Modul der Elastizität ist, desto höher ist die relative Steifigkeit des Schwämms.
Polysaccharidlösungen – Dies soll zwei Arten von Lösungen bezeichnen, wobei die erste die ursprüngliche Lösung des Polysaccharids in Wasser ist, die durch Lösen einer im Handel erhältlichen Form des Polysaccharids in Wasser unter den Homogenisierungsbedingungen hergestellt wird, die gewöhnlich eine Lösung des Salzes des Polysaccharids ergibt, beispielsweise eine Natriumalginatlösung. Diese anfangliche Lösung wird dann einer Gelierung als erster Schritt des erfindungsgemäßen Schwammherstellungsprozesses unterzogen. Die einer Gelierung unterzogene Lösung wird fertige Polysaccharidlösung genannt und in vielen Fällen ist es eine weiter verdünnte Form der anfänglichen Polysaccharidlösung. Wenn daher die Konzentrationen des Polysaccharids hierin angegeben sind, beziehen sie sich gewöhnlich auf die Konzentration des Polysaccharids in der fertigen Lösung, die dem Gelierschritt im ersten Teil des Verfahren unterzogen wird, aus der der Polysaccharidschwamm erhalten wird. In den späteren Beispielen ist eine Vielzahl an Schwämmen beispielhaft dargestellt, die von einem der Polysaccharide der Wahl hergestellt wurden, nämlich verschiedenen Alginaten. Daher wird gemäß dem oben Erwähnten "ursprüngliche Alinatlösung" oder "anfängliche Alginatlösung" verwendet, um die wässrige Alginatlösung der ersten Form durch die Auflösung eines Alginatpulvers in Wasser zu bezeichnen und "fertige Alginatlösung", um die gelöste Alginatlösung zu bezeichnen, die einer Gelierung und einer anschließenden Gefrierung und Trocknung unterzogen wird.
Implantation – Dieser Ausdruck soll gewöhnlich die Einbringung eines erfindungsgemäßen Polysaccharidschwamms in einen Patienten bezeichnen, wobei das Implantat dem vollständigen oder teilweisen Ersatz des Gewebes, das beschädigt oder entfernt wurde, durch das Implantat dient, welches als Matrix, Substrat oder Formgeber dient, wo nach umgebendes Gewebe in das Implantat einwachsen kann und so wachsen kann, dass letztlich nach einem ausreichenden Wachstum eines solchen Gewebes innerhalb des Schwamms und dem biologischen Abbau des Schwamms über die Zeit das verletzte oder entfernte Gewebe effektiv ersetzt wird. Implantation meint in diesem Sinn auch das oben erwähnte zweistufige Verfahren, worin in der ersten Stufe das Implantat in den Patienten gesetzt wird und durch die Invasion der Blutgefäße vom umgebenden Gewebe vaskularisiert wird, ein Prozess, der gewöhnlich schnell nach der Implantierung erfolgt. Nach der Vaskularisierung ist das Implantat dann für die zweite Stufe zugänglich, die die Injektion von Zellen der Wahl ist, welche vorher entweder in vitro angezogen wurden oder aus dem Patienten oder einem geeigneten Donor erhalten wurden. Solche Zellen sind aufgrund des vorgeformten Netzwerks innerhalb des Implantats zu einer schnellen Akklimatisierung fähig und sind daher auch zur schnellen Proliferation und anschließenden funktionellen Differenzierung unter Bildung eines Ersatzes für das beschädigte oder entfernte Gewebe fähig. Falls es erforderlich ist, ein Gewebe/Organ vollständig zu ersetzen, beispielsweise die Haut oder Lebersegmente oder Portionen, die entfernt wurden, besteht ein Bedarf, das obige Zweistufenverfahren anzuwenden. Auf diese Weise werden funktionsfähige Zellen, wie beispielsweise Fibroblasten oder Hepatocyten in das Implantat injiziert, das bereits vaskularisiert ist. Ein weiterer Aspekt der Implantierung soll auch die Verwendung eines Polysaccharidschwamms als Vehikel bezeichnen, um therapeutische Arzneimittel an eine bestimmte Stelle im Patienten zu transportieren, gewöhnlich durch Zellen, die vom Polysaccharidschwamm getragen werden, die zur Sekretion eines gewünschten therapeutischen Proteins, Hormons oder dergleichen fähig sind oder die verschiedene regulatorische Proteine sekretieren, die wiederum die Expression von solchen erforderlichen therapeutischen Arzneimitteln endogen im Gewebe zu steuern, in das das Implantat eingesetzt wurde. In diesem Aspekt ist auch die Einführung von verkapselten therapeutischen Mitteln in den Polysaccharidschwamm enthalten, beispielsweise Wachstumsfaktoren, angiogenen Faktoren und dergleichen, die vorteilhaft sind, um ein schnelleres Wachstum der Zellen im Implantat oder eine schnellere Vaskularisierung des Implantats zu fördern. Solche Faktoren sind gewöhnlich zu klein, um effektiv im Schwamm zurückgehalten zu werden und werden daher in Form von langsam freisetzenden oder kontrolliert freisetzenden Mikrokapseln in den Schwamm eingeführt, um ihre Wirksamkeit sicherzustellen.
Transplantation – Die Transplantation kann auf zwei Arten passieren, das heißt Allo- oder Autotransplantation und in beiden Fällen werden die zu transplantierenden Zellen zuerst in vitro auf oder innerhalb des Alginatschwamms angezogen, bis sie einen gewünschten Zustand der Zellaktivierung, Proliferation oder Differenzierung erreichen, wie dies gewünscht ist, wonach der mit solchen Zellen beimpfte Alginatschwamm in einen Patienten an der gewünschten Stelle zum Zweck der Organ- oder Gewebereparatur oder dem Ersatz hiervon eingesetzt wird. Wie oben erwähnt, kann die Transplantation neben den Zellen auch Mikrokapseln enthalten, die therapeutische Mittel für die Zellen, die Vaskularisierung oder für den Wirt enthalten.
Demnach liefert die vorliegende Erfindung einen Polysaccharidschwamm, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er folgendes aufweist: (i) eine mittlere Porengröße im Bereich von 10 μm bis 300 μm, (ii) einen mittleren Abstand zwischen den Poren von 5 μm bis 270 μm, der auch die Wanddicke der Poren ist und (iii) ein Elastizitäts-E-Modul als Maß der Steifigkeit für den Schwamm im Bereich von 50 kPa bis 500 kPa.
Eine Ausführungsform eines Schwamms der Erfindung ist ein Schwamm, der ein Polysaccharid enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus den polyanionischen Polysacchariden Alginate, Gellan, Gellankautschuk, Xanthan, Chitosan, Agar, Carragenan und dem polykationischen Polysaccharid Chitosan besteht.
Eine weitere Ausführungsform des Polysaccharidschwamms der Erfindung ist ein Schwamm, der ein Alginat enthält, ausgewählt aus der Gruppe an Alginaten, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie folgendes aufweisen: (i) einen Gehalt an Mnnuronsäureresten (M) im Bereich zwischen 25% und 65% der gesamten Reste, (ii) einen Gehalt an Guluronsäureresten (G) im Bereich zwischen 35% und 75% der gesamten Reste, (iii) ein M/G Verhältnis zwischen 1/3 und 1,86/l und (iv) eine Viskosität der fertigen Alginatlösung mit 1% G/V Alginat, aus der der Schwamm erhalten wird, im Bereich von 50 cP bis 800 cP.
Bevorzugte Polysaccharidschwämme der Erfindung umfassen Schwämme, die ein Alginat enthalten, das von braunen Meeresalgen stammt, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Alginat Protanal^® LF 120 (LF 120), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® LF LF 20/60 (LF 20/60), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat MVG^® (MVG), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® HF 120 (HF 120), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® SF 120 (SF 120), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® SF 120 AB (SF 120 RB), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® LF 200 RB (LF 200 RB), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Manuguel^® DMB (DMB), das von Laminaria hyperborea stammt, Keltone^® HVCR (HVCR), das von Macrocystis pyrifera stammt und Keltone^® LV (LV), das von Macrocystis pyrifera stammt.
Die obigen Alginatschwämme der Erfindung werden vorzugsweise formuliert, wobei das Alginat in Form einer Natriumalginatlösung verwendet wird, die eine Alginatkonzentration zwischen 1% bis 3% G/V aufweist, um eine Alginatkonzentration zwischen 0,1% bis 2% G/V in der fertigen Lösung bereitzustellen, aus der der Schwamm erhalten wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung können die Polysaccharidschwämme auch ein quervernetzendes Mittel enthalten, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus den Salzen von Calcium, Kupfer, Aluminium, Magnesium, Strontium, Barium, Zinn, Zink, Chrom, organischen Kationen, Polyaminosäuren, Polyethylenimin, Polyvinylamin, Polyallylamin und Polysacchariden.
Die am meisten bevorzugten quervernetzenden Mittel zur Verwendung bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Schwämme werden aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus Calciumchlorid (CaCl₂), Strontiumchlorid (SrCl₂) und Calciumgluconat (Ca-Gl).
Vorzugsweise liegt der verwendete Quervernetzer in Form einer Quervernetzungslösung mit einer Konzentration des Quervernetzers vor, die zur Bereitstellung einer Quervernetzerkonzentration zwischen 0,1% bis 0,3% G/V in der fertigen Lösung ausreicht, woraus der Schwamm erhalten wird.
Die bevorzugten Polysaccharidschwämme der Erfindung sind die, welche aus einer Polysaccharidlösung mit oder ohne der Zugabe eines Quervernetzers hergestellt werden. Ausführungsformen dieser bevorzugten Schwämme der Erfindung umfassen einen Alginatschwamm, der aus einer Alginatlösung mit oder ohne der Zugabe eines Quervernetzers hergestellt wird und worin die fertige Alginatlösung mit oder ohne Quervernetzer, aus der der Schwamm erhalten wird, aus der Gruppe an fertigen Lösungen ausgewählt wird, die Konzentrationen an Alginat oder Alginat und Quervernetzer aufweisen, welche besteht aus (i) LF 120 Alginat rnit 1% G/V ohne Quervernetzer, (ii) LF 120 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,1% G/V, (iii) LF 120 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V, (iv) LF 120 Alginat mit 1% G/V und SrCl₂ mit 0,15% G/V, (v) LF 120 Alginat mit 1% G/V und CaCl₂ mit 0,1% G/V, (vi) LF 120 Alginat mit 0,5% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V (vii) LF 20/60 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V, (viii) HVCR Alginat mit 0,5% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V und (ix) HVCR Alginat mit 1 % G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V.
Andere Ausführungsformen umfassen Schwämme, die aus einer fertigen Lösung aus LF 120 Alginat mit 1 % G/V und Ca-Gl Quervernetzer mit 0,2% G/V erhalten werden und einen Schwamm, der aus einer fertigen Lösung aus HVCR Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl Quervernetzer mit 0,2% G/V erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharidschwamms der Erfindung, das gekennzeichnet ist durch:

(a) Bereitstellung einer Polysaccharidlösung, die 1% bis 3% G/V Polysaccharid in Wasser enthält,
(b) Erforderlichenfalls Verdünnung dieser Polysaccharidlösung mit zusätzlichem Wasser, um eine fertige Lösung mit 0,5% bis 2% G/V Polysaccharid zu erhalten und Unterziehung dieser Lösung von (a) einer Gelierung unter Bildung eines Polysaccharidgels,
(c) Gefrierung des Gels von (b) und
(d) Trocknung des gefrorenen Gels von (c) unter Bildung eines Polysaccharidschwamms.

Eine Ausführungsform des obigen Verfahrens der Erfindung ist ein Verfahren, das ferner die Zugabe eines Quervernetzers zur Polysaccharidlösung von (a) während des Gelierschritts (b) umfasst, wobei der Quervernetzer in einer Menge zugegeben wird, um in der fertigen Lösung, die einer Gelierung unterzogen wird, eine Konzentration des Quervernetzers zwischen 0,1% bis 0,3% G/V bereitzustellen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Gelierschritts (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Gelierschritt durch intensives Rühren der Polysaccharidlösung in einem Homogenisiergerät bei etwa 31 800 Upm für etwa 3 Minuten ausgeführt und wenn ein Quervernetzer zur Lösung gegeben wird, dieser Quervernetzer sehr langsam während diesem intensiven Rühren der Alginatlösung zugegeben wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, worin das Polysaccharid ein Alginat ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Alginat besteht, das von braunen Meeresalgen stammt, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Alginat Protanal^® LF 120 (LF 120), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® LF 20/60 (LF 20/60), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat MVG^® (MVG), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® HF 120 (HF 120), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® SF 120 (SF 120), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® SF 120 RB (SF 120 RB), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® LF 200 RB (LF 200 RB), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Manugel^® DMB (DMB), das von Laminaria hyperborea stammt, Keltone^® HVCR (HVCR), das von Macrocystis pyrifera stammt und Keltone^® LV (LV), das von Macrocystis pyrifera stammt.
In der oben bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung sind, wenn das Polsaccharid Alginat ist, die bevorzugten fertigen Lösungen, die Alginate mit oder ohne Quervernetzer enthalten und einem Gelierschritt (b) unterzogen werden, die folgenden: (i) LF 120 Alginat mit 1% G/V ohne Quervernetzer, (ü) LF 120 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,1% G/V, (iii) LF 120 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V, (iv) LF 120 Alginat mit 1% G/V und SrCl₂ mit 0,15% G/V, (v) LF 120 Alginat mit 1% G/V und CaCl₂ mit 0,1% G/V, (vi) LF 120 Alginat mit 0,5% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V (vii) LF 20/60 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V, (viii) HVCR Alginat mit 0,5% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V und (ix) HVCR Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V.
Der Gefrierschritt (c) des Verfahrens der Erfindung kann durch schnelles Einfrieren in einem flüssigen Stickstoffbad bei etwa –180°C für etwa 15 Minuten oder durch langsames Einfrieren in einem Gefrierschrank bei etwa –18°C für etwa 8 bis 24 Stunden ausgeführt werden. Das am meisten bevorzugte Gefrierverfahren erfolgt durch schnelles Einfrieren in einem flüssigen Stickstoffbad, wie dies oben erwähnt ist.
Der Trocknungsschritt (d) erfolgt vorzugsweise durch Lyophilisierung unter Bedingungen von etwa 0,007 mm Hg Druck und etwa –60°C.
Zum Zweck der Herstellung der Polysaccharidschwamme der Erfindung mit verschiedenen Formen und Größen, beispielsweise Nasenform, Würfelform und zylindrischen Formen und dergleichen (siehe 2) ist es bevorzugt, das erfindungsgemäße Verfahren durch Gießen der anfänglichen Polysaccharidlösung in ein geeignetes Gefäß mit der gewünschten Form auszuführen und die Gelierung und die anschließenden Schritte des Verfahrens in diesem geformten Gefäß durchzuführen.
Die vorliegende Erfindung liefert auch einen Polysaccharidschwamm der Erfindung, insbesondere Alginatschwämme, wie dies oben erwähnt ist, zur Verwendung als Matrix, Substrat oder Formgeber zur Anzucht von Säugerzellen in vitro. Eine weitere bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen Polysaccharidschwämme ist ihre Verwendung als Matrix, Substrat oder Formgeber für die Implantierung in einen Patienten, um Gewebe zu ersetzen oder zu reparieren, das entfernt oder beschädigt wurde, worin der implantierte Schwamm ein Substrat, eine Matrix oder ein Formgeber für das umgebende Gewebe ist, um hierin einzudringen und hierauf zu proliferieren und das beschädigte oder entfernte Gewebe zu ersetzen oder worin das Implantat ein anfängliches Substrat für die Vaskularisierung durch das umgebende Gewebe ist und das vaskularisierte Implantat dann als Substrat dient, um injizierte Zellen der Wahl aus dein Wirt oder in vitro angezogene zu erhalten, wobei die injizierten Zellen zur schnellen Akklimatisierung und Proliferation auf dem vaskularisierten Schwamm fähig sind, um schnell das beschädigte oder entfernte Gewebe zu ersetzen.
Eine weitere bevorzugte Verwendung der Polysaccharidschwamme der Erfindung ist die Verwendung als implantierter Träger für die therapeutische Arzneimittelabgabe an ein gewünschtes Gewebe, wobei die Arzneimittelabgabe durch die Wirkung von genetisch veränderten Zellen oder natürlichen Zellen erfolgen kann, die im Schwamm enthalten sind und diese therapeutischen Arzneimittel exprimieren, wobei die Zellen das Arzneimittel exprimieren oder regulatorische Proteine exprimieren, um die Bildung des Arzneimittels endogen in diesem Gewebe zu steuern. In der bevorzugten Verwendung ist das therapeutische Arzneimittel, das von dein auf dein Schwamm oder im Schwamm enthaltenen Zellen exprimiert wird, ein therapeutisches Protein, wobei die Zellen das Protein exprimieren oder regulatorische Proteine exprimieren, um die Bildung dieses Proteins endogen im Gewebe zu steuern, in das der Schwamm implantiert wurde.
Andere bevorzugte Ausführungsformen zur Verwendung der Polysaccharidschwämme gemäß der Erfindung umfassen: Die Verwendung der Schwämme als Matrix, Substrat oder Formgeber für die in vitro Kultivierung von Pflanzenzellen und Algen, die Verwendung als Matrix, Substrat oder Formgeber für die Abgabe von genetisch veränderten viralen Vektoren, nicht-viralen Vektoren, polymeren Mikrosphären und Liposomen an ein Gewebe oder Organ, die alle für ein therapeutisches Mittel für dieses Gewebe oder Organ kodieren oder dieses enthalten, die Verwendung als Matrix, Substrat oder Formgeber für die in vitro Fertilisation von Säugeroozyten, zur Verwendung als Matrix, Substrat oder Formgeber zur Lagerung von befruchteten Säugeroozyten oder anderen in vitro kultivierten Säugerzellen zur Verwendung als Matrix, Substrat oder Formgeber zur Lagerung von Pflanzenzellen und Algen, die in vitro kultiviert werden und die Verwendung als Matrix, Substrat oder Formgeber für die Transplantation von Zellen, die auf oder im Schwamm wachsen in vitro in ein Gewebe eines Patienten, der in Folge einer Gewebeschädigung, Gewebeentfernung oder Gewebedysfunktion die Zellen benötigt.
Bevorzugte Verwendungen des Polysaccharidschwamms der Erfindung, wie er oben erwähnt ist, umfassen die Verwendung hiervon zur Anzucht von Fibroblastenzellen in vitro und zur Anzucht von Hepatocyten in vitro. Gemäß diesen bevorzugten Verwendungen können die Polysaccharidschwämme der Erfindung als Transplatationsvorrichtungen zur Transplantation von Fibroblastenzellen verwendet werden, um zerstörtes oder entferntes Hautgewebe zu transplantieren oder zur Transplantation von Hepatocyten, um zerstörtes oder entferntes Gewebe zu ersetzen.
Die vorliegende Erfindung liefert daher künstliche Organäquivalente, die zur Bereitstellung der essentiellen Funktion des Organs dienen, das sie vollständig oder teilweise ersetzen oder dessen Funktion sie verbessern sollen. Die künstlichen Organäquivalente der Erfindung umfassen daher einen Polysaccharidschwamm der Erfindung, wie er vorher erwähnt ist, und repräsentative Zellen des Organs, wobei die Zellen auf oder im Schwamm in vitro bis zu dein Stadium angezogen werden, indem sie voll aktiv sind und zu den aktiven Zellen des Organs äquivalent sind und daher ist das künstliche Organ zur Transplantation oder Implantation auf allen verschiedenen Arten, wie sie vorher beschrieben sind, in einen Patienten geeignet, der nach einer Organzerstörung, -entfernung oder -dysfunktion dessen bedarf. Bevorzugte Ausführungsformen der künstlichen Organäquivalente der Erfindung sind künstliche Haut, die einen Polysaccharidschwamm der Erfindung und Hautfibroblastenzellen umfasst, wie auch ein künstliches Leberäquivalent, das einen Polysaccharidschwamm der Erfindung und Hepatocyten umfasst.
Kurze Beschreibung der Figuren und Figurlegenden
Die 1 zeigt eine schematische Darstellung des allgemeinen Verfahrens zur Herstellung von Alginatschwämmen gemäß der Erfindung, wie dies in Beispiel 1 im Detail beschrieben ist. Die Nummern in der Figur stehen für folgendes: 1: Quervernetzerlösung, 2: Mischer, 3: Alginatlösung, 4: Gelierung, 5: Gefrierung, 6: Lyophilisierung, 7: Alginatschwamm.
Die 2 ist eine Kopie einer Photographie, die die verschedenen Formen und Größen von Alginatschwämmen zeigt, die gemäß der Erfindung hergestellt werden können, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist. Die 3(a)–(k) zeigen Reproduktionen von Scanningelektronenmikroskopie (SEM) Aufnahmen, die die Morphologie von verschiedenen Arten an Alginatschwämmen zeigen, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist. LF 120 und HVCR sind Alginate, wie in Tabelle 3, G/V steht für Gewicht pro Volumen, Ca-Gl steht für Calciumgluconat und SrCl₂ steht für Strontiumchlorid. Die Bedingungen werden für folgendes verwendet (falls nichts anderes angegeben ist, werden die Gele durch flüssigen Stickstoff eingefroren):

a) LF 120, 1% (G/V) (ohne Quervernetzer),
b) LF 120, 1% (G/V) + 0,1% (G/V) Ca-Gl,
c) LF 120, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl,
d) LF 120, 1% (G/V) + 0,15% (G/V) SrCl₂,
e) LF 120, 1% (G/V) + 0,1% (G/V) CaCl₂,
f) LF 20/60, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl,
g) LF 120, 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl,
h) HVCR, 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl,
i) HVCR, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl,
j) LF 120, 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, Gefrierschrank,
k) LF 120, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, Gefrierschrank.

Die 4(a)–(d) zeigen graphisch durch Säulengraphik die Ergebnisse, die die Auswirkungen der Veränderung der verschiedenen Parameter des Prozesses zur Herstellung der Alginatschwämme auf die Parameter der Mikrostruktur der entstehenden Alginatschwämme der Erfindung darstellen, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist. Weiße Säulen stehen für die Porengrößenmessungen, schattierte Säulen stehen für die Wanddickemessungen. Die Werte auf der Ordinate sind in Mikrometer [μ] angegeben. CaCl₂ steht für Calciumchlorid, Ca-Gl für Calciumgluconat, SrCl₂ für Strontiumchlorid. Falls nichts anderes angegeben ist, werden die Gele in flüssigem Stickstoff eingefroren.

4a) 1, LF 120, 1% (G/V) (kein Quervernetzer) 2, LF 120, 1% (G/V) + 0,1% (G/V) Ca-Gl 3, LF 120, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl
4b) 1, LF 120, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl 2, LF 120, 1% (G/V) + 0,1% (G/V) CaCl₂ 3, LF 120, 1% (G/V) + 0,15% (G/V) SrCl₂ 4, LF 20/60, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl
4c) 1, LF 120, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl (Gefrierschrank) 2, LF 120, 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl (Gefrierschrank) 3, LF 120, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl 4, LF 120, 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl
4d) 1, LF 120, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl 2, LF 120, 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl 3, HVCR, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl 4, HVCR, 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl

Die 5 ist eine schematische Darstellung des Geräts, das zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften verwendet wird, insbesondere die auf den Schwamm angewendete Last gegen die Kompression des Schwamms und liefert hierbei ein Mittel zur Steifigkeit des Schwamms, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Zahlen in der Figur stehen für folgendes: 1: Beladungszelle, 2: Deformationszelle, 3: Stempel, 4: Probe, 5: Übertragungstisch.
Die 6 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse, die die Veränderung der Konzentration an Quervernetzer Calciumgluconat (Ca-Gl) auf die Komprimierbarkeit der Alginatschwämme zeigt, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Ordinate (I): Belastung [kPa], Abszisse (II): Verformung. Der Buchstabe N zeigt das Gefrieren der Gele durch flüssigen Stickstoff an.

a) (Dreiecke): LF 120 1% (G/V), kein Quervernetzer, N
b) (Quadrate, gepunktete Linie): LF 120 1% (G/V) + 0,1% (G/V) Ca-Gl, N
c) (Quadrate, durchgezogene Linie): LF 120 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N

Die 7 zeigt graphisch die Ergebnisse, die die Auswirkung der relativen Menge an Guluronsäureresten (G) in den Alginaten und die Viskosität der Alginatlösung auf die Komprimierbarkeit der hieraus hergestellten Alginatschwämme darstellen, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Ordinate (I): Belastung [kPa], Abszisse (II): Verformung. Hierin steht der Buchstabe N für das Gefrieren der Gele durch flüssigen Stickstoff

a) (Dreiecke): LF 120, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N
b) (Quadrate, gepunktete Linie): LF 20/60, 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N
c) (Quadrate, durchgezogene Linie): HVCR 1% + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N

Die 8 zeigt graphisch die Ergebnisse, die die Wirkung von unterschiedlichen Quervernetzern, die in der Herstellung der Alginatschwämme verwendet werden, auf die Komprimierbarkeit der hermit hergestellten Alginatschwämme darstellen, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Ordinate (I): Belastung [kPa], Abszisse (II): Verformung.

a) (Dreiecke) : LF 120, 1% (G/V) + 0,01 M Ca-Gl, N
b) (Quadrate, gepunktete Linie): LF 120, 1% (G/V) + 0,01 M CaCl₂, N
c) (Quadrate, durchgezogene Linie): LF 120, 1% (G/V) + 0,01 M SrCl₂, N

Die 9 zeigt graphisch die Ergebnisse der Alginatkonzentration auf die Komprimierbarkeit von Alginatschwämmen, die hiermit hergestellt wurden, wie dies in Beispiel 3 detailliert beschrieben ist. Ordinate (I): Belastung [kPa], Abszisse (II): Verformung.

a) (Quadrate, durchgezogene Line): LF 120 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N
b) (Quadrate, gepunktete Linie): LF 120 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N
c) (Dreiecke, durchgezogene Linie): HVCR 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N
d) (Dreiecke, gepunktete Linie), HVCR 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N

Die 10 zeigt graphisch die Ergebnisse, die die Wirkung der Gefriergeschwindigkeit während der Herstellung der Alginatschwämme auf die Kompriinierbarkeit der so hergestellten Alginatschwämme zeigen, wie dies in Beispiel 3 detailliert beschrieben ist. Ordinate (I): Belastung [kPa], Abszisse (II): Verformung. Die Buchstaben F und N zeigen an, dass die Gele jeweils in einem Gefrierschrank und flüssigem Stickstoff eingefroren werden:

a) (Quadrate, durchgezogene Linie): LF 120 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N
b) (Quadrate, gepunktete Linie): LF 120 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, F
c) (Dreiecke, durchgezogene Linie): LF 120 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N
d) (Dreiecke, gepunktete Linie): LF 120 0,5% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, F

Die 11 zeigt graphisch die Ergebnisse, die die Wirkung der Gassterilisierung der Alginatschwämme auf die Komprimierbarkeit der so sterilisierten Schwämme zeigt, wie dies in Beispiel 3 detailliert beschrieben ist. Ordinate (I): Belastung [kPa], Abszisse (II): Verformung. "Gas" steht in b) für die Sterilisation des Alginatprodukts durch Gas.

a) (Quadrate, durchgezogene Linie): LF 120 1% (G/V) + 0,2% Ca-Gl, N
b) (Quadrate, gepunktete Linie): LF 120 1% (G/V) + 0,2% (G/V) Ca-Gl, N, Gas

Die 12 ist eine Kopie einer Lichtmikroskopie, die Schwämme zeigt, welche mit Fibroblasten beimpft und über einen längeren Zeitraum bei 37°C (einen Monat) kultiviert wurden, was die Stabilität der Schwämme für längere Zeiträume in Kultur zeigt, wie dies in Bespiel 4 beschrieben ist.
Die 13 zeigt zwei Kopien von Lichtmikroskopaufnahmen mit einer Vergrößerung von 100 fach der Aufsicht auf die Schwammoberfläche (obere mikroskopische Aufnahme) und des Querschnitts innerhalb des Schwamms (untere mikroskopische Aufnahme) fünf Tage nach der Inkubation des Schwamms mit den Zellen, wie dies in Beispiel 5 beschrieben ist.
Die 14 zeigt eine graphische Derstellung der Ergebnisse, die die Proliferation von Hepatocyten zeigt, die in Alginatschwämmen über einen längeren Zeitraum in Kultur beimpft wurden (3 Wochen), wie dies in Beispiel 5 detailliert beschrieben ist. Ordinate (I): Zellkonzentration [10⁶ Zellen/ml], Abszisse (II): Zeit [Tage].
Die 15 zeigt graphisch die vergleichenden Ergebnisse, die die Geschwindigkeit der Albuminsekretion aus Hepatocyten zeigen, die in Alginatschwämmen angeimpft wurden gegen Heptocyten, die auf Collagenase I Gelen in vitro angezogen werden über einen Zeitraum von 10 Tagen, wie dies in Beispiel 5 beschrieben ist. Ordinate (I): μg Antikörper/(Tag × 10⁶ Zellen), Abszisse (II): Zeit [Tage]. Die Kreise stellen die auf Collagen I erhaltenen Ergebnisse dar, die Dreiecke stellen die in Schwämmen erhaltenen Ergebnisse dar.
Die 16 zeigt Kopien von mikroskopischen SEM Aufnahmen mit höherer (obere Aufnahme) und geringeren (untere Aufnahme) Vergrößerungen, worin die Fibroblasten als wachsend innerhalb der mit Fibroblasten beimpften Schwämme fünf Tage nach einer Kultur in vitro beobachtet werden, wie dies in Beispiel 6 detailliert beschrieben ist.
Die 17 zeigt Kopien von mikroskopischen SEM Aufnahmen mit höheren (untere Aufname) und geringeren (obere Aufnahme) Vergrößerungen, die als Protein-enthaltende Mikrosphären innerhalb der Poren eines Alginatschwamms beobachtbar sind, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie vorher und später beschrieben betrifft die vorliegende Erfindung neue Polysaccharidschwämme, die primär durch ihre Morphologie und mechanischen Eigenschaften, wie auch ihre Stabilität in längerer Kultur gekennzeichnet sind, wie auch ein neues Verfahren zur Herstellung dieser Polysaccharidschwämme. Die Polysaccharidschwämme der vorliegenden Erfindung sind besonders zur Anzucht von verschiedenen Säugerzellen in vitro und zur Verwendung bei Implantationen und Transplantationen auf eine Vielzahl an verschiedenen Arten, wie dies oben beschrieben ist, in Patienten brauchbar, die dessen nach einer Gewebeschädigung, -entfernung oder -dysfunktion bedürfen. Beispielsweise wurde von den erfindungsgemäßen Alginatschwämmen gezeigt, dass sie zur Unterstützung des Wachstums, der Proliferation und der biologischen Funktion von Hepatocyten fähig sind und daher können Schwämme, die mit solchen Hepatocyten angeimpft sind, für Leberzelltransplantate brauchbar sein und ähnlich können die Schwämme auch zur Unterstützung des Wachstums, der Proliferation und der biologischen Funktion von Fibroblasten fähig sein und so auch für Hauttransplantate (Dermis) verwendet werden.
Wie oben erwähnt haben die vorher bekannten porösen absorbierbaren Matrizes, die aus verschiedenen natürlichen und synthetischen Polymeren hergestellt werden und als Träger oder Matrizes für Implantate vorgesehen sind, um die Regeneration von Gewebe zu erleichtern, wenn dies nach einer Erkrankung, einem Trauma oder einem rekonstitutiven Operationsverfahren erforderlich ist, mehrere Nachteile, die ihre Verwendung im großen Maßstab für die obigen medizinischen Anwendungen verhindert haben. Diese Nachteile umfassen die folgenden: Viele der früheren polymeren Matrizes sorgen nur für das Wachstum von dünnen Zellschichten und sind daher auf Anwendungen beschränkt, wie beispielsweise die Anzucht von dünnen Schichten an Fibroblastenzellen als Hautzellen, wobei die Matrizes nicht geeignet sind, um das Wachstum von dickeren Zelllagen oder Zellaggregaten, beispiels weise das Wachstum von Hepatocyten zu unterstützen und können daher nicht effektiv für eine Transplantation von solchen Zelltypen verwendet werden. Ferner wurden viele der vorher entwickelten porösen Matrizes, die zur Verwendung als Implantate oder Substrate für Transplantate entwickelt wurden, demnach so entwickelt, dass sie bioabbaubar sind, aber es wurde jedoch beobachtet, dass beispielsweise die auf Collagen basierenden Matrizes ziemlich schnell mit einer relativ hohen Geschwindigkeit abgebaut werden und sie daher, wenn sie als Träger für transplantierte Zellen verwendet werden, zu schnell abgebaut werden, bevor die Zellen die erforderliche Zeit hatten, um sich in vivo zu etablieren und die gewünschte neue Gewebematrix zu bilden. Sogar im Fall von länger haltbaren Matrizes wurde festgestellt, dass viele von ihnen zu unerwünschten in vivo Nebenwirkungen führen, beispielsweise sind viele immunogen, viele kontrahieren sich und werden starr, was sie weniger für eine operative Handhabung geeignet macht, viele führen zu unerwünschten Abbauprodukten, wenn sie bioabbaubar sind und sehr oft ist die Morphologie der Matrizes so, dass die Zellen, die in der Matrix enthalten sind, nicht ausreichend mit den erforderlichen Nährstoffen versorgt werden, um ihr Langzeitwachstum zu unterstützen, da die poröse Art dieser Matrizes so ist, dass der freie Fluss der Nährstoffe in und aus der Matrix limitiert oder beschränkt ist oder die Vaskularisierung in die Matrix aus dem umgebenden Gewebe nicht unterstützt wird, in das die Matrix implantiert wurde.
Die Polysaccharidschwämme der vorliegenden Erfindung zielen alle auf die oben erwähnten Nachteile der vorher bekannten porösen Matrizes ab und überwinden diese. Wie oben erwähnt, können die Polysaccharidschwämme der vorliegenden Erfindung viele verschiedene Arten an Polysacchariden aufweisen, wie beispielsweise die polyanionischen Polysaccharide, wie Alginate, Gellan, Gellankautschuk, Xanthan, Chitosan, Agar, Carrageenan und die polykationischen Polysaccharide, wie Chitosan. Von diesen Polysacchariden sind die bevorzugten die oben erwähnten Alginate, die in verschedenen Formen vorkommen. Daher setzen sich die bevorzugten Schwämme der vorliegenden Erfindung aus Alginat zusammen, das eine Famihe an polyanionischen Co-Polymeren repräsentiert, die von braunen Meeresalgen stammen und aus 1,4-gebundenen β-D-Mannuronsäure- (M) und α-L-Guluronsäureresten (G) in verschiedenen Anteilen bestehen. Alginat ist in wässrigen Lösungen bei Raumtemperatur löslich und bildet stabile Gele in Gegenwart von bestimmten divalenten Kationen, wie Calcium, Barium und Strontium, wie auch in Abwesenheit solcher Kationen unter bestimmten Bedingungen, wie beispielsweise verringertem pH oder speziellen Verarbeitungsbedingungen, wie dies hierin beschrieben ist. Ferner haben die einzigartigen Eigenschaften von Alginat in Kombination mit dessen Biokompatibilität (siehe Sennerby et al., 1987 und Cohen et al. 1991) und die relativ geringen Kosten Alginat zu einem wichtigen Polymer in medizinischen und pharmazeutischen Anwendungen gemacht (beispielsweise Wundabdeckungen und Zahnabdruckmaterial). Darüberhinaus wurde Alginat schon von einer großen Anzahl an regulatorischen Behörden als annehmbare Wundbedeckung und als Nahrungsmittelzusatz zugelassen.
Darüberhinaus sind Alginate von mehreren Herstellern (siehe Tabelle 1) erhältlich, die die Alginate gemäß strengen pharmazeutischen Anforderungen herstellen, die durch die Europäische und US Pharmakopöe festgelegt sind (pharmazeutische Zulassungsbehörden).
Die Verwendung von verschiedenen Typen von Alginaten gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung der verschiedenen Schwämme der Erfindung liefert eine Vielfalt an Schwämmen, wobei jeder eine hoch poröse Matrix darstellt, die das Wachstum, die Proliferation und die biologische Funktion von einer großen Vielzahl an Zellen unterstützt, einschließlich Zellen, wie Hepatocyten, die in Aggregaten oder dicken Lagen wachsen. Diese porösen Schwämme sind auch zur Sicherstellung einer angemessenen Versorgung der Nährstoffe an diese Zellen fähig, die hierin wachsen und sind für eine Invasion der Blutgefäße zugänglich, das heißt, dass sie nach einer Im plantation oder Transplantation in vivo für eine Vaskularisierung zugänglich sind. Ferner werden in Anbetracht der Tatsache, dass das Alginat ein hydrophiles Polymer ist, die Alginatschwämme der vorliegenden Erfindung leicht benetzt, was eine effizientere Penetration von Zellen in die Matrix während dein Animpfen erlaubt. Es sollte erwähnt werden, dass bei früheren Bemühungen, Alginate für Zelltransplantationen zu verwenden, primär die Entwicklung einer semipermeablen Membran, die aus dein Alginat hergestellt wurde, zum Schutz der Zellen, die von dieser Membran umschlossen wurden, vor dein Immunsystem des Wirts gesucht wurde (siehe beispielsweise King et al., 1987 und Sun et al., 1987). Dieser Ansatz liefert im wesentlichen Alginatkügelchen, die mit einer semipermeablen Membran beschichtet wurden, beispielsweise durch die Absorption eines Polykations, wie Polylysin an die Alginatkügelchen, was jedoch zu einer starken Reduktion der Permeabilität der Kügelchen oder Mikrokapseln für Nährstoffe führt, die anschließend zum Zelltod der Zellen führen, die in diesen Alginatkügelchen oder Mikrokapseln verkapselt sind.
Im Gegensatz dazu sind die erfindungsgemäßen Alginatschwämme, wie oben erwähnt, für den Fluss an Nährstoffen in die Schwammmatrix voll zugänglich und auch für eine Vaskularisierung in vivo zugänglich.
Wie es später in den Beispielen beschrieben wird, hängen die Porosität und Schwämmmorphologie (Porengröße und Porenverteilung) des Polysaccharids, beispielsweise der Alginatschwämme der Erfindung, von den verschiedenen Formulierungs- und Prozessierungsparametern ab, die leicht in dem erfindungsgemäßen Verfahren kontrolliert werden können und erlauben es, eine große Vielzall an makroporösen Schwämmen zu erhalten, die für die Zellkultur, Implantierung und Transplantation geeignet sind.
Alle diese Schwämme haben gute mechanische Eigenschaften und sind zur Unterstützung des Wachstums und der Proliferation von verschiedenen Säugerzellen geeignet, wie beispielsweise Fibroblasten und Hepatocyten und sind daher zur Bereitstellung von mindestes einer vorrübergehenden Unterstützung für diese Zellen anwendbar, wenn sie beispielsweise für Transplantationen verwendet werden, um Haut- oder Lebergewebe zu ersetzen.
Wie oben erwähnt, haben die Schwämme der vorliegenden Erfindung einen großen Anwendungsbereich, beispielsweise können sie auch verwendet werden zur in vitro Kultivierung von Pflanzenzellen und Algenzellen, insbesondere Mikroalgen, zur in vitro Unterstützung von Säugeroocyten für die Zwecke einer in vitro Fertilisation dieser Oocyten und daher auch zur Lagerung dieser Pflanzenzellen, Algen und befruchteten Oocyten in Anbetracht der Tatsache, dass die Polysaccharidschwämme der Erfindung, insbesondere die Alginatschwämme, mit großer Effizienz bis etwa –180°C (flüssiger Stickstoff) eingefroren werden können und nach einem Auftauen liefern die Schwämme eine sehr geeignete Matrix zum Schutz und zur erneuten Proliferation von solchen gelagerten Zellen. Darüberhinaus können die erfindungsgemäßen Schwämme, wie oben erwähnt, auch als Arzneimittelabgabevehikel verwendet werden, indem sie entweder genetisch veränderte oder natürliche Zellen tragen, die das gewünschte Produkt oder Arzneimittel bilden, das in diesen Zellen gebildet und an den Wirt an der Stelle abgegeben wird, an der der Schwamm implantiert wurde, oder die Zellen sind zur Bildung und Freisetzung von einem oder mehreren regulatorischen Proteinen an das umgebende Gewebe fähig, die die Bildung des gewünschten Zellprodukts in den Zellen des das Implantat umgebenden Gewebes steuern. Ähnlich können Schwämme der Erfindung auch zur Abgabe von verschiedenen viralen Vektoren, nicht-viralen Vektoren, polymeren Mikrosphären (siehe Beispiel 7) und Liposomen verwendet werden, die entweder die therapeutischen Produkte oder Arzneimittel der Wahl kodieren oder enthalten, die an das Wirtsgewebe oder Wirtsorgan abgegeben werden sollen, in das das Implantat gesetzt wurde. Alle diese viralen Vektoren, nicht-viralen Vektoren, polymeren Mikrosphären und Liposomen können Hergestellt werden, wie dies in der Technik gut bekannt ist, um eine große Vielzahl an therapeutischen Mitteln zu kodieren oder zu enthal ten, beispielsweise verschiedene Enzyme, Hormone und dergleichen und können zum Zeitpunkt der Herstellung des Schwamms oder nach der Herstellung des Schwamms in den Schwamm eingebracht werden. Beispielsweise ist es möglich, wie es in Beispiel 7 beschrieben ist, Protein-enthaltende Mikrosphären innerhalb von Alginatschwämmen durch die Zugabe von solchen Mikrosphären in Alginatschwämme zu verkapseln, indem man die Mikrosphären zur Alginatlösung zum Zeitpunkt der Zugabe des Quervernetzers bei der Gelierung der Alginatlösung gemäß dem Verfahren der Erfindung zugibt. Die entstehenden Alginatgele, die solche Mikrosphären enthalten, werden dann durch Gefrier- und Lyophilisierschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zu Schwämmen verarbeitet, die diese enthalten. Daher sind die erfindungsgemäßen Schwämme auch zur Abgabe von Mitteln brauchbar, die gewöhnlich nicht für so poröse Materiahen geeignet sind, indem man die Mittel in einer Form einführt, beispielsweise Mikrosphären, die innerhalb des Schwamms zurückgehalten werden und für eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des therapeutischen Mittels innerhalb der Mikrosphären sorgen.
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter in den folgenden nicht beschränkenden Beispielen und den begleitenden Figuren beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung von Alginatschwämmen
Wie oben erwähnt, gehören die Alginate zu einer Familie an polyanionischen Co-Polymeren, die von braunen Meeresalgen stammen und 1,4-gebundene β-Δ-Mannuronsäure- (M) und α-L-Guluronsäurereste (G) in verschiedenen Anteilen aufweisen. Alginate sind in wässrigen Lösungen bei Raumtemperatur löslich und bilden stabile Gele in Gegenwart von bestimmten divalenten Kationen, wie beispielsweise Calcium, Barium und Strontium.
Alginate mit unterschiedlichem Co-Monomerverhältnis, das heißt variierendem Gehalt an Mannuronsäure (M) und Guluronsäure (G) und einer variierenden Viskosität werden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Alginatschwämme verwendet. Die wichtigsten Eigenschaften dieser Alginate werden in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Eigenschaften von Alginaten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden
Es sollte erwähnt werden, dass die in den folgenden Beispielen und begleitenden Figuren nur Bezug zu den ersten drei Alginattypen für die Alginatschwämme, die hieraus hergestellt werden und ihre verschiedenen Eigenschaften genommen wird. Alle verbleibenden in Tabelle I aufgeführten Alginattypen wurden, obwohl sie nicht beispielhaft dargestellt werden, bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Alginatschwämmen verwendet und liefern alle Schwämme der gewünschten Charakteristiken und Eigenschaften (Ergebnisse nicht gezeigt).
Zur Herstellung der verschiedenen Alginatschwämme der Erfindung werden verschiedene quervernetzende Mittel (Quervernetzer) in verschedenen Konzentrationen der Quervernetzerlösung verwendet. Diese sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2: Die unterschiedlichen Quervernetzer und Quervernetzerlösungskonzentrationen, die gemäß der folgenden Erfindung verwendet werden:
Es sollte erwähnt werden, dass viele andere quervernetzende Mittel auch zur Herstellung der Alginatschwämme geeignet sind, aus denen die drei oben in Tabelle 2 angegebenen nur ein Beispiel sind. Es wurde festgestellt, dass eine Vielzahl an Quervernetzungsmitteln, wie die Salze von Calcium, Kupfer, Aluminium, Magnesium, Strontium, Barium, Zinn, Zink, Chrom, organischen Kationen, Polyaminosäuren, Polyethylenimin, Polyvinylamin, Polyallylamin und Polysaccharide zur Herstellung der Schwämme der vorliegenden Erfindung geeignet sind. So wurden die anderen oben erwähnten Quervernetzungsmittel ebenfalls erfolgreich verwendet (Daten nicht gezeigt), obwohl in den folgenden Beispielen und den begleitenden Figuren nur Schwämme beispielhaft angegeben sind, die mit den oben angegebenen Quervernetzern der Tabelle 2 hergestellt wurden.
Staminlösungen aus Natriumalginat mit Konzentrationen von 1 bis 3% (G/V) werden durch Lösen des Polymerpulvers in zweifach destilliertem Wasser und Mischen mittels eines Homogenisiergeräts mit der Dispenservorrichtung 10G (Heidolph Elektro Kehlheim, Deutschland) mit 25 000 U/min für 30 Minuten bei Raumtemperatur hergestellt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren zur Schwammherstellung entwickelt, das auf 3 Schritten basiert: (i) Gelierung einer Alginatlösung unter Bildung eines quervernetzten Hydrogels, (ii) Gefrierung und (iii) Trocknung durch Lyophilisierung. Das Schema der Schwammherstellung wird in 1 dargestellt, eine schematische Darstellung des allgemeinen Verfahrens für die Alginatschwammherstellung. Kurz gesagt werden 0,5– 1 cm³ Alginatstammlösung mit 2% G/V in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen (Vertiefungsgröße: 16 mm Durchmesser, 20 mm Höhe) gegeben, auf die gewünschte Endkonzentration mit zweifach destilliertem Wasser verdünnt und dann unter Bildung eines Gels durch eine sehr langsame Zugabe der Quervernetzerlösung quervernetzt, wobei intensiv mit dem Homogenisiergerät für 3 Minuten gerührt wird (Dispenservorrrichtung 6G mit einer Geschwindigkeit von 31 800 U/min).
Die obigen Alginatgele werden dann eingefroren. Es werden zwei Sätze an Bedingungen verwendet, um die Wirkung der Geschwindigkeit des Einfrierens der Schwammmorphologie und die mechanischen Eigenschaften zu untersuchen: 1) Durch Plazierung der Platten auf einem Regal in einem Gefrierschrank zwischen –18°C und –20°C über Nacht und 2) in einem flüssigen Stickstoffbad für 15 Minuten. Die gefrorenen Gele werden bei 0,007 mm Hg und einer Gefriertrocknungstemperatur von –60°C lyophilisiert (Freeze Dry Systems LABCONCO Co., Kansas City)
Für die Gewebekultur werden die Schwämme durch Ethylenoxidgasbehandlung mittels eines Standardethylenoxidsterilisiergeräts sterilisiert. Kurz gesagt werden die Proben einer 100% Ethylenoxidatmosphäre bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 70% für 3,5 Stunden bei 55°C ausgesetzt. Die Proben werden dann mit einem warmen Luftstrom bei atmosphärischem Druck für mindestens 48 Stunden zur Entfernung des restlichen Ethylenoxids aus dem Alginatschwamm begast und die so sterilisierten Schwämme werden in laminierten Taschen bei Raumtemperatur bis zu ihrer Verwendung gelagert.
Die obige Technologie der Alginatschwammherstellung, die drei unterschiedliche Schritte umfasst, hat die Eigenschaft, dass jeder dieser Schritte die Morphologie, Mikrostruktur und mechanischen Eigenschaften der entstehenden Matrix beeinflussen kann. Daher wird, wie dies in den folgenden Beispielen beschrieben ist, die Auswirkung der Variation dieser Schritte mit dem Ziel untersucht, einen Alginatschwamm zu erhalten, der für die Zell- und Gewebetransplantation am geeignetsten ist. Daher ist die oben beschriebene Methodik die allgemeine für die Alginatschwammherstellung, während spezifischere später im Detail beschrieben sind.
Beispiel 2: Morphologie der Alginatschwämme
Die Morphologie der Alginatschwämme wird durch eine Scanningelektronenmikroskopie (SEM, JEOL JSM-35CF) untersucht. Die Proben der verschiedenen Alginatschwämme werden auf Aluminiumstäben befestigt und rnit einer unltradünnen (100 A) Goldschicht in einem Polaron E 5100 Beschichtungsgerät beschichtet. Die Parameter der Schwammmikrostruktur werden durch geometrische Messungen auf den SEM Aufnahmen untersucht. Die Porenlänge, Porenbreite und Wanddicke (das heißt der mittlere Abstand zwischen benachbarten Poren) werden durch ein Stereomikroskop (Bausch & Lomb) gemessen, das mit einem optischen Mikrometer ausgestattet ist. Die tatsächliche Größe der Poren wird mittels der folgenden Gleichung berechnet: d = √l·h worin 1 und h jeweils für die mittlere Länge und Breite der Poren stehen. Die Wanddickemessungen werden ausgeführt, da dieser Parameter den Abstand zwischen den Poren charakterisiert und daher die Mikrostruktur der Schwämme.
Anfänglich wird die Form der Schwämme durch die Umgebung bestimmt, in der die Herstellung des Schwamms ausgeführt wird. So können Schwämme mit verschiedenen Formen, beispielsweise nasenförmig, rohrförmig oder zylinderförmig wie auch viele andere leicht durch die einfache Auswahl des geeigneten Gefäßes konstruiert werden, worin die Schwämme hergestellt und verarbeitet werden. Beispiele für verschiedene Schwämme verschiedener Formen sind in 2 gezeigt, die eine Kopie einer Photographie ist, die nasenförmige, röhrenförmige und zylinderförmige Schwämme zeigt. In 2 ist auch ein Linear gezeigt, um einen Anhaltspunkt für die Größen (Längen, Breiten) der verschiedenen Schwämme in Zentimeter/Inch bereitzustellen. Wie in 2 gezeigt, sind die verschiedenen bevorzugten Schwämme der Erfindung die mit runden Ecken, wobei dies die bevorzugte Geometrie ist, wenn sie mit vorher bekannten Implantatmatrizes verglichen werden, die scharfe Winkel oder Kanten hatten, welche unerwünscht sind, da es gezeigt wurde, dass solche schufen Implantate die größte Entzündungsreaktion auslösen können (siehe beispielsweise Matlaga et al., 1976).
Unter Verwendung der oben erwähnten Methodik zur Herstellung der erfindungsgemäßen Alginatschwämme wurden sehr poröse, gut untereinander verbundene Schwämme mit einer typischen Organisation des polymeren Materials erhalten. Die Morphologie der Alginatschwamme in Bezug auf die Porengröße, der Porenanzahl und Porenverteilung wie auch der Abstand zwischen den Poren, das heißt der Wanddicke, hängt gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung stark von der Konzentration und dein Typ des Quervernetzers und der anfänglichen Alginatkonzentration ab, die bei der Herstellung der Schwämme verwendet werden. Die dichteste Struktur mit der kleinsten Anzahl an Poren Kubikzentimeter (cm³) und der größten Wanddicke wird bei Schwammen erhalten, die durch das Gefriertrocknungsverfahren erhalten werden, ohne dass ein Quervernetzer während der Verarbeitung zugegeben wird. Die Oberflächenmorphologie gemäß SEM von verschiedenen Schwämmen, die mittels verschiedener Arten von Alginaten bei verschiedenen Konzentrationen mit und ohne verschiedenen Quervernetzern und unter verschiedenen Gefrierbedingungen hergestellt wurden, sind in den 3(a)–(k) gezeigt. Jede der 3(a) –(k) ist eine Kopie einer SEM Aufnahme, unter der der jeweils verwendete Alginattyp (siehe Tabelle 1), dessen Endkonzentration in der Schwammlösung (Prozent G/V), die verwendete Menge und der Quervernetzertyp, wie auch die Art der verwendeten Gefrierung angegeben ist, das heißt wenn "Gefrierschrank" angegeben ist, wird ein langsamer Gefrierprozess verwendet (–20°C für 24 Stunden) oder falls nichts angegeben ist, wird eine schnelle Einfrierung verwendet, das heißt die Gefrierung in flüssigem Stickstoff (siehe 3(a)–3(i)). Wie oben erwähnt ist es durch die obige Gleichung möglich, die tatsächlichen Werte für die Porengröße und Wanddicke aus den SEM Aufnahmen zu berechnen und dies erfolgt durch die auf jeder Aufnahme gedruckten Balken, wobei jeder Balken 100 um darstellt, um ein genaues Mittel zur Messung der Werte der Porengröße und Wanddicke bereitzustellen. Diese tatsächlichen Werte sind graphisch in den 4(a)–(d) dargestellt, die die Porengröße (offene Balken) und die Wanddicke (gefüllte Balken) von den verschiedenen Alginattypen mit und ohne Quervernetzer und mit und ohne "Einfrieren" zeigen, wie sie bei der Herstellung der verschiedenen Schwämme verwendet werden, wie dies oben erwähnt ist.
So ist die Oberflächenmorphologie gemäß SEM eines repräsentativen Schwamms ohne Quervernetzung und mit einem schnellen Gefriertrocknungsverfahren in 3(a) gezeigt und die tatsächlichen Werte der Porengröße und Wanddicke eines solchen Schwamms sind durch die zwei Ballten auf der linken Seite (LF1) der 4(a) gezeigt. Von diesem Schwamm wurde auch gezeigt, dass er das höchste Maß an Schrumpfung aufweist, wahrscheinlich aufgrund des fehlenden quernernetzenden Netzwerks.
Wenn jedoch die Schwämme mit einem quervernetzenden Mittel hergestellt werden, das heißt aus einem quervernetzten Hydrogel, ist der Schwamm hochporös, wobei das Maß an Porosität und die Porengröße vom Typ und der Konzentration des ionischen Quervernetzers abhängen. Die Verwendung von Calciumgluconat (Ca-Gl) als Quervernetzer führt zur Bildung von Schwämmen mit einer homogenen Mikrostruktur sowohl in Bezug auf die Porenverteilung als auch Porengröße, wie dies in den 3(b) und 3(c) gezeigt ist. Die mittlere Porengröße und Wanddicke betragen in diesem Fall jeweils 100 und 50 μm, wenn 0,1% (G/V) Ca-Gl verwendet wird, wie dies in den 3(b) und 4(a) gezeigt ist (siehe Mittelbalken der 4(a)), wobei die mittlere Porengröße und Wand dicke abnimmt, wenn die Konzentration von Ca-Gl erhöht wird (siehe 3(c) und 4(a) (die Balken auf der rechten Seite)). Schwämme, die mit Calciumchlorid oder Strontiumchlorid als Quernetzer hergestellt wurden, haben im Mittel größere Poren (vergleiche 3(c), 3(d) und 3(e), wobei die Schwämme in 3(c) mit Ca-Gl hergestellt wurden, während die Schwämme der 3(d) mit SrCl₂ und die der 3(e) mit CaCl₂ hergestellt wurden). In dem Fall, in dem CaCl₂ oder SrCl₂ als Quervernetzer verwendet wurden, beträgt der mittlere Duchmesser der Poren jeweils 150 und 200 um, wenn ähnliche Konzentrationen (auf molarar Basis) des ionischen Quervernetzers verwendet werden; wie dies in 4(b) gezeigt ist.
Die Viskosität der Alginatlösung und des Alginattyps, das heißt das Comonomerverhältnis an Guloronsäure- (G) zu Mannuronsäureresten (M) haben auch einen signifikanten Effekt auf die Schwammmikrostruktur. Die Verwendung von LF 20/60 Polymer, das ein ähnliches G zu M Verhältnis aufweist, wie LF 120, aber eine weniger viskose Lösung bei einer Polymerlösung mit 1% /G/V) aufweist (siehe Tabelle 1), führt zur Bildung eines Schwamms mit einer weniger homogenen Mikrostruktur (das heißt eine weniger homogene Porenverteilung, wie dies gezeigt wird, wenn man die 3(f) bis 3(c) vergleicht, wobei in beiden Fällen die gezeigten Schwämme auf die gleiche Weise mit demselben Quervernetzer (Ca-Gl) hergestellt wurden, sich aber der verwendete Alginattyp unterscheidet, das heißt LF 120 gegen LF 20/60. Ferner ist die Porengröße etwas kleiner in den aus LF 20/60 Alginat hergestellten Schwämmen als die, die aus den LF 120 Alginatschwämmen erhalten wird und die Wanddicke für die LF 20/60 Alginatschwämme ist größer, als die für die LF 120 Alginatschwämme, wie dies in 4(b) gezeigt ist (Vergleich des Balkens auf der linken Seite mit dein Balken auf der rechten Seite in der Figur).
Für einen gegebenen Alginattyp beeinflusst die anfängliche Konzentration der Alginatlösung signifikant die Schwammmikrostruktur, so dass die abnehmende Polymerkonzentration zur Bildung von Schwämmen mit einer erhöhten Porengröße und abnehmenden Wanddicke führt (siehe 3(g) gegenüber 3(c) und 4(c), worin der einzige Unterschied zwischen den in 3(c) und denen in 3(g) gezeigten Schwämmen in der Menge der verwendeten Alginatlösung liegt, wobei die der 3(g) aus einer Alginatlösung hergestellt wurden, aber mit der halben Konzentation G/V, wie der, die zur Herstellung der in 3(c) verwendeten Schwämme verwendet wurde.
Das Alginat vom Typ HVCR, das eine Lösung mit einer ähnlichen Viskosität zu der von LF 120 liefert, aber einen niedrigeren Guluronsäuregehalt aufweist (siehe Tabelle 1) führt zur Bildung von Schwämmen mit einer kleineren Porengröße als die des LF 120 Alginats (siehe 3(h) und 3(i) gegenüber 3(g) und 3(c), worin für die 3(h) und 3(i) die Schwämme aus HVCR Alginat mit demselben Quervernetzer und derselben Konzentration der Alginatlösung und derselben Quervernetzerlösung hergestellt wurden, wie die, die aus LF 120 Alginat hergestellt wurden, die jeweils in den 3(g) und (c) gezeigt sind). Die aktuellen Werte der Porengrößen und Wanddikken der mit HVCR hergestellten Schwämme gegenüber denen aus LF 120 Alginat hergestellten sind in 4(d) angegeben, das heißt man muss die zwei Sätze der Balken auf der linken Seite mit den zwei Sätzen an Balken auf der rechten Seite in dieser Figur vergleichen. Das Ergebnis stimmt mit der Theorie der Alginatgelierung durch ionische Quervernetzung überein, die die gelbildenden Eigenschaften und die Porengröße im Gel mit dem Poly-G-Gehalt des Polymers korreliert. Gemäß dem Eierschachtelmodell von Grant et al (1973) verbrücken die bivalenten Kationen die negativ geladenen Guluronsäurereste am Alginat und die Mannuronsäurereste spielen nur eine untergeordnete Rolle in diesem Gelnetzwerk. Daher führt die Erhöhung des G Gehalts im allgemeinen zu einer erhöhten Porengröße (siehe Martinsen et al., 1989).
Die Wirkung des Gefrierprozesses, das heißt die Art und Dauer hiervon auf die Schwammmikrostruktur wird untersucht und es wird festgestellt, dass das schnelle Einfrierverfahren mittels flüssigem Stickstoff Schwämme mit einer kleineren Porengröße und besseren mechanischen Eigenschaften (siehe später) liefert, als die, die mit langsamen Einfrierverfahren erhalten werden, das heißt in einem Gefrierschrank bei –20°C für 24 Stunden. Diese Unterschiede werden deutlich im Vergleich zwischen den 3(c) und 3(g) mit den 3(j) und 3(k) gezeigt, worin bei den ersteren der Einfrierschritt mit flüssigem Stickstoff verwendet wird, während im letzteren das langsame Einfrierverfahren verwendet wird. Der Rest der Schwammbestandteile und präparativen Verfahren ist in allen Fällen derselbe, das heißt in allen Fällen wird das LF 120 Alginat in zwei Konzentrationen verwendet und als Quervernetzer wird Ca-Gl verwendet.
Ein Vergleich der tatsächlichen Werte der Porengröße und Wanddicke, die für die oben durch schnelles Einfrieren oder durch langsames Einfrieren hergestellten Schwämme erhalten wurden, ist in 4(c) gezeigt, worin die zwei Sätze an Balken auf der linken Seite Schwämme darstellen, die durch langsames Einfrieren hergestellt wurden, während die zwei Sätze an Balken auf der rechten Seite die durch schnelles Einfrieren hergestellten Schwämme darstellen. Es wird vorgeschlagen, dass die Unterschiede zwischen den Porengrößen der durch die verschiedenen Einfrierverfahren hergestellten Schwämme die Unterschiede in den Wärmeleitgeschwindigkeiten während des Einfrierverfahrens wiederspiegeln. Wenn die Temperatur verringert wird, wird Wasser, das immer noch in flüssiger Form vorliegt, auf eine Temperatur unterkühlt, die ein Stück unterhalb des Gefrierpunkts liegt. An diesem Punkt beginnen sich Eiskristalle zu bilden und die Kristallisationswärme wird freigesetzt, die die Temperatur des Wassers bis zum Schmelzpunkt erhöht, was zu einem Gemisch aus Eis und Wasser führt. Als Ergebnis werden größere Poren mit dickeren Wänden während einem langsamen Einfrierverfahren hergestellt. Jedoch wird eine ausreichend schnelle Kühlgeschwindigkeit, das heißt das schnelle Einfrieren in flüssigem Stickstoff so betrachtet, dass es für die Ableitung der Hitze aus der Kristallisation sorgt, die die Bildung von großen Eiskristallen verhindert. Ferner wird nach dem Einfrieren des Schwammmaterials das gefrorene Material bei einer geringen Temperatur unter Vakuum getrocknet, was für die Sublimierung der Eiskristalle sorgt. Daher wird die Porosität der Schwämme durch die Größe der während des Einfrierprozesses gebildeten Kristalle kontrolliert, das heißt bei einer geringen Einfriergeschwindigkeit, beispielsweise dein Einfrieren in einem Gefrierschrank bei –18°C bis –20°C für 24 Stunden werden große Eiskristalle gebildet, was zur Bildung eines Schwamms mit einer krümeligen Mikrostruktur und beschädigten Zellwänden nach dem Vakuumtrocknungsschritt führt, das heißt der Gefriertrocknung. Im Gegensatz dazu führt ein schneller Kühlschritt mittels flüssigem Stickstoff zur Bildung einer großen Anzahl an kleinen Eiskristallen, die eine bevorzugte Orientierung haben, wobei für die Bildung eines Schwamms mit einer homogenen Mikrostruktur und verbesserten mechanischen Eigenschaften gesorgt wird (siehe später).
Die hierin vorher beschriebene Mikrostruktur des erfindungsgemäßen Alginatschwamms unterscheidet sich auch signifikant von der, die durch bekannte Verfahren zur Herstellung von Alginathydrogelen erhalten wird. In diesen bekannten Verfahren (siehe Martinsen et al., 1980) werden Alginathydrogele ohne Einfrieren und Lyophilisieren hergestellt, die ein Netzwerk an Poren mit einer Porengröße aufweisen, die zwischen 50–1500 Å liegt. Die Porengröße des Alginathydrogels wird wahrscheinlich primär durch die Dichte der Matrixquervernetzung kontrolliert. Die Grundmikrostruktur wird einer wesentlichen Deformation unterzogen, die durch den Einfrierprozess während der Herstellung des Alginatschwamms verursacht wird. Während dieses Einfrierprozesses können die schnell wachsenden Eiskristalle die Quervernetzungen aufbrechen, was zu neuen Mikrostrukturen führt. Die gefrorene Gelstruktur ist daher ein Ergebnis der Bildung und Zerstörung von inneren Bindungen. Daher haben die Zusammenset zung des Gels (beispielsweise der Alginattyp und das Vorkommen oder Fehlen von Quevernetzern und ihre relativen Konzentrationen) wie auch die während des Schwammherstellverfahrens verwendete Einfriergeschwindigkeit den größten Einfluss auf die Größe und die Struktur der im fertigen Schwammprodukt gebildeten Poren, wobei sich dies von Parametern unterscheidet, die normalerweise die Mikrostruktur des vorher hergestellten Alginathydrogels beeinflussen, die ohne Einfrieren und/oder Lyophilisierung hergestellt werden.
Die oben erwähnten Ergebnisse, die die Morphologie der erfindungsgemäßen Schwämme betreffen, zeigen deutlich, dass die Alginatschwammikrostruktur insbesondere die Porengröße und Verteilung leicht durch Variieren der Alginatzusammensetzung und Alginatkonzentration, dem Typ und der Konzentration des ionischen Quervernetzers und dein Einfrierverfahren und der Einfriergeschwindigkeit kontrolliert werden. Die Fähigkeit gemäß der vorliegenden Erfindung einen relativ großen Bereich an verschiedenen Typen an Alginatschwämmen mit variablen Mikrostrukturen zu bilden, ist für die Entwicklung von geeigneten Iinplantationssubstraten für Zelltransplantationen äußerst wichtig und erlaubt die Optimierung von solchen Implantaten, beispielsweise können Schwämme mit variierender Morphologie, einschließlich Mikrostruktur, für unterschiedliche Typen an Implantationen und Transplantationen in Abhängigkeit des Gewebetyps verwendet werden, in das die Implantate gesetzt werden oder den Zelltypen, die transplantiert werden sollen.
Die Porenstruktur eines Alginatschwamms diktiert die Wechselwirkung des Schwamms und der hierin enthaltenen transplantierten Zellen mit dein Wirtsgewebe, in das ein solcher Schwamm eingesetzt werden soll. Die Porenstruktur wird durch die Größe, Größenverteilung und Kontinuität der einzelnen Poren innerhalb des Schwamms bestimmt. Poröse Materialien werden typischerweise als mikroporös (Porendurchmesser < 2 nm), mesoporös (2 nm < d < 50 nm) oder mikroporös (d > 50 nm) definiert. Nur kleine Moleküle, beispielsweise verschiedene Gase sind zur Penetration von mikroporösen Materialien fähig. Mesoporöse Materialien erlauben den freien Transport von großen Molekülen und wenn die Poren groß genug sind (d > 10⁴ nm), dann sind die Zellen zur Migration durch die Poren eines solchen Materials fähig. Daher ist es durch den sorgfältigen Entwurf eines Schwamms möglich, einen Schwamm herzustellen, der gewünschte extrazelluläre Signale erlauben kann, beispielsweise eine Zunahme der Serumzuckerkonzentrationen, die durch die Poren in die im Schwamm festgehaltenen transplantierten Zellen weitergegeben wird, während zur selben Zeit größere extrazelluläre molekulare oder zelluläre Signale, beispielsweise Immunglobulimnoleküle ausgeschlossen werden, die zu einer Abstoßung der transplantierten Zellen führen können.
Die erfindungsgemäßen Schwämme gehören zu den makroporösen Materialien und können daher eine Vaskularisierung der Matrix erlauben, die für die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und Funktion der transplantierten Zellen sehr wichtig ist, die innerlalb der Matrix zurückgehalten werden (siehe beispielsweise Mikos et al., 1993). Durch das obige Verfahren zur Herstellung der Schwämme gemäß der Erfindung ist es auch möglich, Alginatschwämme herzustellen, die eine unimodale Porengrößenverteilung oder eine kontinuierliche Porenstruktur aufweisen. Solche Schwämme erlauben es Molekülen oder Zellen, durch die Schwammmatrix ohne Beschränkung ("Flaschenhälse") in der Porenstruktur transportiert zu werden. Schließlich liefert die Erfindung, wie dies aus der obigen detaillierten Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Schwämme ersichtlich ist, ein Verfahren zur Alginatschwammherstellung, das einfach durchzuführen, äußerst reproduzierbar und für eine kommerzielle Produktion solcher Schwämme leicht im Maßstab vergrößerbar ist.
Beispiel 3
Mechanische Eigenschaften und die Porenkomprimierbarkeit der Alginatschwämme
Die mechnischen Eigenschaften der Alginatschwämme werden bei 22°C (Raumtemperatur) durch Pressen der Probenschwämme bei einer konstanten Deformationsrate von 2 mm/min mittels eines Standardtestgeräts bestimmt. Dieses Gerät wird schematisch in 5 gezeigt und umfasst eine Beladungszelle, eine Deformationszelle, einem Stempel und einen Tisch. Der Probenschwamm wird zwischen dein Stempel und dein Tisch platziert und wird einer Belastung unterzogen, die durch das Messgerät gemessen wird, an das der Tisch an seinem anderen Ende verbunden ist ("Übertragung"). Mit einem solchen Gerät werden die Belastung und die Deformation mit hoher Genauigkeit bis zu Beladungen von 1 g und bei Deformierungen von weniger als 0,05 mm verfolgt. In diesem Gerät ist der Durchmesser des Stempels (7 mm) gewöhnlich kleiner als der der Probe (die Probenschwämme sind etwa 15 mm groß) oder größer, wenn sie einer Kompression unterzogen werden und daher wird der Einfluss der Probendurchmesservariationen auf die Testergebnisse minimiert.
Diese Tests der mechanischen Eigenschaften und der Porenkomprimierbarkeit der erfindungsgemäßen Alginatschwämme sind in Anbetracht der Tatsache sehr wichtig, dass die für Transplantationen oder Implantationen verwendeten Schwämme ausgezeichnete mechanische Eigenschaften aufweisen müssen und ihre Form während des Stadiums der in vitro Kultivierung mit häufigem Medienwechsel und schließlich während des operativen Verfahren bei der Transplantierung aufrechterhalten müssen. Die Ergebnisse der Analyse der mechanischen Eigenschaften, insbesondere die Komprimierbarkeit der gemäß der Erfindung hergestellten Alginatschwämme, sind in den 6– 11 gezeigt, die graphische Darstellungen der Belastung (kPa) gegen die Verformung der verschiedenen Schwämme sind, welche mittels unterschiedlicher Alginattypen, unterschedliche Quervernetzer, wie auch unterschiedliche Konzentrationen an Alginat und Quervernetzer und unterschiedlichen Einfrierbedingungen hergestellt wurden. Die 6-11 zeigen daher einen Satz an Deformtionskurven auf die Belastungs-Verformungs-Koordinatenebene für die verschiedenen Typen an Alginatschwämmen, die gemäß der Endung hergestellt werden. Jede in den 6-11 gezeigte Kurve stellt das mittlere Ergebnis aus 7–12 Tests dar. In den Tests beträgt der Variationskoeffizient 23 bis 41% unter minimalen Deformationsbedingungen und 7% bis 12% unter maximalen Deformationsbedingungen. Die Gesamtergebnisse aus den in den 6–11 gezeigten Kurven sind auch in der Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3: Mechanische Eigenschaften und Porosität von Alginatschwämmen als Funktion von unterschiedlichen Formulierungs- und Prozessierungsparametern

flüssiger N₂: unmittelbares Einfrieren; Gefrierschrank –20°C, Verarbeitungszeit

Aus den oben erwähnten Ergebnissen, die in den 6–11 gezeigt sind und in Tabelle 3 zusammengefasst sind, wird deutlich, dass das Belastungs-Verformungsverhalten von Alginatschwämmen für das Verhalten von porösen Materialien charakteristisch ist, worin das Elastizitätsmodul mit der Verformung zunimmt. In 6 ist ein Vergleich der Deformationskurven von Schwämmen gezeigt, die aus 1% (G/V) Alginat 120 Lösung mit und ohne Quervernetzung mittels unterschiedlicher Konzentrationen der Calciumgluconatlösung hergestellt wurden. Ohne Quervernetzung (die Kurve, die mit den vollen Dreiecken gezeigt ist) und mit Quervernetzung aber mit einer kleinen Menge an Calciumgluconat (CaGl) von bis zu 0,1 Gewichtsprozent (gepunktete Linie mit vollen Quadraten) zeigen die Schwämme die geringste Steifigkeit, das heißt sie deformieren bei relativ geringen Belastungen. Bei einer Erhöhung der Quervernetzerkonzentration auf 0,2 Gewichtsprozent (die durchgezogene Kurve mit den vollen Quadraten) wird eine steile Zunahme der Schwammsteifigkeit beobachtet. Im Gegensatz dazu hat der Guluronsäuregehalt (G) des Alginats im Schwam keinen signifikanten Effekt auf die mechanischen Eigenschaften des Schwamms, wie dies aus den Kurven in 7 ersichtlich ist. Das Elastizitätsmodul der aus 1% (G/V) Lösungen von LF 120 Alginat (Kurve mit den vollen Dreiecken in 7) und HVCR Alginat (die durchgezogene Kurve mit den vollen Quadraten in 7) hergestellten Alginatschwämme, die ähnliche Viskositätswerte (150 cP) aufweisen, aber sich in ihrem G Gehalt unterscheiden (LF 120 hat 65–75% G, während HVCR 39% G aufweist, siehe Tabelle 1), sind sehr ähnlich, wie dies auch in Tabelle 3 zusammengefasst ist. Es sollte erwähnt werden, dass dieses Verhalten sich von dem für die vorher bekannten Alginathydrogele unterscheidet, bei denen die mechanischen Eigenschaften stark vom Gehalt an G Resten abhängen, wobei eine Zunahme des G Gehalts zur Bildung von Hydrogelen führt, die stärker sind (siehe Smidsrod und Haug, 1972). Daher heben die obigen Ergebnisse die Struktur- wie auch die Verhaltensunterschiede zwischen den Schwämmen der vorliegenden Erfindung und den vorher bekannten Hydrogelformen von Alginaten hervor.
In 7 wird auch gezeigt, dass die Lösungsviskosität die Schwammsteifigkeit für ein gegebenes Alginat mit einem gegebenen G Gehalt stark beeinflusst. Dies ist aus dein LF 20/60 Alginatschwamm ersichtlich (gepunktete Kurve mit ausgefüllten Quadraten in 7), das Schwämme mit einer geringen Steifigkeit bildet als jene, die aus der LF 120 Alginatlösung gebildet werden (Kurve mit den ausgefüllten Dreiecken in 7), wobei der Unterschied in der Viskosität zwischen LF 20/60 und LF 120 Alginat dadurch signifikant ist, dass LF 20/60 eine weniger viskose Lösung mit einem Viskositätswert von 100 cP gegenüber 150 cP für LF 120 aufweist. Daher ist es ersichtlich, dass die Lösungsviskosität einen Haupteinfluss auf die Schwammsteifigkeit hat.
Andere Parameter, die die mechanischen Eigenschaften der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Schwämme haben, umfassen die Art des verwendeten Quervernetzers. Wie in 8 gezeigt, haben Schwämme, die mit Calciumchlorid und Strontiumchlorid hergestellt wurden, eine ähnliche Steifigkeit (siehe jeweils gepunktete Kurve mit ausgefüllten Quadraten und durchgezogene Kurve mit ausgefüllten Dreiecken in 8), wobei die Steifigkeit trotzdem signifikant niedriger ist als die, welclie erhalten wird, wenn Calciumgluconat als Quervernetzer verwendet wird (siehe Kurve mit ausgefüllten Dreiecken in 8). Wie oben erwähnt haben in Bezug auf die Morphologie der Schwämme die Schwämme, die mit Calciumgluconat als Quervernetzer hergestellt wurden, kleinere Poren, was ihre erhöhte Steifigkeit erklären kann.
Die Konzentration des bei der Herstellung der Schwämme verwendeten Alginats hat auch einen signifikanten Einfluss auf die Steifigkeit der Schwämme. Wie dies in 9 gezeigt und in Tabelle 3 zusammengefasst wird, führt eine Erhöhung der Alginatkonzentration von 0,5 auf 1% (G/V) für Alginate mit sowohl geringem G Gehalt (HVCR) als auch hohem G Gehalt (LF 120) zur Herstellung von Schwämmen, die eine erhöhte Steifigkeit aufwei sen (Vergleich der durchgezogenen Kurven mit ausgefüllten Dreiecken und ausgefüllten Quadraten mit den gepunkteten Kurven mit ausgefüllten Dreiecken und ausgefüllten Quadraten in 9, worin die durchgezogenen Kurven die Alginate mit höheren Konzentrationen bezeichnen, während die gepunkteten Kurven für die Alginate mit geringeren Konzentrationen verwendet werden). Daher gilt, je höher die Alginatkonzentration ist, desto höher ist die erforderliche Belastung zur Deformation der hieraus hergestellten Schwämme. Ferner deuten, wie dies oben in Bezug auf die Morphologie der Schwämme erwähnt wird, die mit verschiedenen Alginatkonzentrationen hergestellt wurden, die in 9 gezeigten Ergebnisse auch an, dass die Schwämme mit der größten Steifigkeit die sind, die die kleinste Porengröße aufweisen.
Ein weiterer Parameter, der einen deutlichen Einfluss auf die Steifigkeit der Schwämme hat, ist der der die Art betrifft, auf der die Schwämme hergestellt und verarbeitet werden, insbesondere die Einfriergeschwindigkeit der Alginatlösungen während des Schwammherstellverfahrens. In Hinblick darauf wurde beobachtet, dass ein schnelles Einfrieren mittels flüssigem Stickstoff zu Schwämmen mit besseren mechanischen Eigenschaften führt, insbesondere einer größeren Steifigkeit, mit dem Ergebnis, dass so hergestellte Schwämme höheren Belastungen unterzogen werden müssen, um eine Deformation des Schwamms herbeizuführen. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt, die Schwämme vergleicht, die durch schnelles Einfrieren in flüssigem Stickstoff hergestellt werden, mit denen, die durch langsames Einfrieren in einem Gefrierschrank hergestellt werden, wie dies oben erwähnt ist. Daher ist für Schwämme, die aus LF 120 Alginat bei der höheren Konzentration von 1% G/V und mit 0,2 Gewichtsprozent CaGl als Quervernetzer hergestellt wurden, klar ersichtlich, dass die Schwämme, die in flüssigem Stickstoff eingefroren wurden (durchgezogene Kurve mit ausgefüllten Quadraten in 10) die Schwämme ergibt die signifikant steifer sind, als die, welche vom selben Alginat und Quervernetzer mit denselben Konzentrationen hiervon aber unter Bedingungen mit langsamen Einfrieren hergestellt wurden (gepunktete Kurve mit ausgefüllten Qudraten in 10). In dieser Analyse ist es auch interessant zu erwähnen, dass für die aus den geringen Konzentrationen an Alginat hergestellten Schwämme, von denen gezeigt wurde, dass sie ohnehin weniger steif sind als die, die aus höheren Alginatkonzentrationen hergestellt wurden (siehe 9) die Auswirkung der unterschiedlichen Einfrierarten während der Herstellung hiervon nicht unterscheidbar ist, das heißt in beiden Fällen werden die Schwämme mit stark verringerter Steifigkeit hergestellt (siehe die zwei Kurven, eine durchgezogene und eine gepunktete, mit ausgefüllten Dreiecken in 10).
Falls ein anderer Parameter auf den Einfluss auf die Steifigkeit der Schwämme untersucht wurde, dann war dieser Parameter die Auswirkung der Sterilisation der Schwämme, die erforderlich ist, bevor die Schwämme für die Zellkultur und anschließende Implantierungs- und Transplantationszwecke verwendet werden, wobei die Ergebnisse dieser Analyse anzeigen, dass die Sterilisation der Schwämme die mechanischen Eigenschaften nicht ändert, wie dies in 11 gezeigt ist. Es wird beobachtet, dass Schwämme, die aus den höheren Konzentration von LF 120 Alginat und CaGl aus Quervernetzer hergestellt wurden und einer schnellen Gefrierung in flüssigem Stickstoff unterzogen werden, keine signifikante Veränderung in ihrer Steifigkeit aufweisen, wenn sie einer Gassterilisation unterzogen werden (Vergleich der durchgezogenen Kurve mit den ausgefüllten Quadraten, die Kontrollschwämme zeigt, die nicht gassterilisiert wurden, mit der gepunkteten Kurve mit den ausgefüllten Quadraten, die dieselben Schwämme zeigen, welche aber einer Gassterilisation unterzogen wurden, in 11). Diese Feststellung, das heißt dass die Gassterilisation der Schwämme die mechanischen Eigenschaften auf keine beobachtbare Weise beeinflusst, ist von wesentlicher Bedeutung für die Schwärme der vorliegenden Erfindung in Anbetracht ihrer beabsichtigten medizinischen Anwendungen. Darüberhinaus differenziert diese Beobachtung die erfindungsgemäßen Schwämme gegenüber denen, die aus anderen Materialien hergestellt werden, wobei die anderen Schwämme bekanntermaßen signifikant beeinflusst werden, wenn sie einer Sterilisation unterzogen werden.
Zusammengefasst wird aus den oben erwähnten Ergebnissen, die die Morphologie und die mechanischen Eigenschaften der verschiedenen Schwämme betreffen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, deutlich, dass die am meisten bevorzugten Alginatschwämme, die sind, welche aus LF 120 mit einer anfänglichen Alginatkonzentration von 1% G/V hergestellt und mit Calciumgluconat mit 0,2% G/V quervernetzt werden und einer schnellen Einfrierung in flüssigem Stickstoff unterzogen werden, wonach eine Lyophilisierung während des Herstellverfahrens erfolgt. Die verschiedenen anderen Schwämme die mit einer oder mehreren Variationen der obigen Bestandteile und Herstellweisen gemäß der Erfindung hergestellt werden, sind auch perfekt für die beabsichtigten Zwecke der Schwämme brauchbar, das heißt für die Zellkultur und die Implantations- und Transplantationsanwendungen. Daher ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, eine große Vielzahl an Schwämmen mit unterschiedlichen morphologischen und mechanischen Eigenschaften herzustellen, die alle brauchbar sind und die am besten brauchbaren sind die oben erwähnten, die die höchste Steifigkeit zusammen mit einer homogeneren Porenverteilung aufweisen.
Beispiel 4
Abbau von Alginatschwämmen in vitro
Um den Abbau der Alginatschwämme der vorliegenden Erfindung über einen Zeitraum zu bestimmen, werden die Schwämme in einem vollständigen Kulturmedium inkubiert und es werden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben gezogen, um die Konzentration eines löslichen Alginats durch einen colorimetrischen Test zu bestimmen. Dieser Test basiert auf der metachromatischen Veränderung, die durch Alginat verursacht wird, das an den Farbstoff 1,9-Dimethylmethylenblau (DMMB) bindet (siehe Halle et al., 1993).
In diesem Test werden die Alginatschwämme in einem Standardkulturinedium kultiviert, wobei das Standardvollmedium gewöhnlich zur Kultivierung von Zellen bei 37°C verwendet wird, wie Fibroblasten und Hepatocyten. Die kultivierten Schwämme liegen in zwei Arten vor, wobei die eine Art mit Zellen beimpft wurde und die andere ohne Zellen vorliegt. Die Ergebnisse dieses Tests zeigen, dass Alginatschwämme mit und ohne angeimpften Zellen, die in einem Kulturmedium bei 37°C kultiviert werden, ihre physikalische Stabilität für lange Zeiträume aufrechterhalten. Die Messung von löslichem Alginat im Medium, die den Abbau des Alginatschwämms anzeigt, zeigt nach einer Inkubationsdauer von 1 Monat mit oder ohne Zellen, eine nicht-signifikante Konzentration an löslichem Alginat im Kulturmedium (weniger als 1% G/V). Ein repräsentatives Ergebnis dieser Analyse ist in 12 gezeigt, die eine Kopie einer Lichtmikroskopieaufnahme von Schwämmen ist, die mit Fibroblastenzellen angeimpft wurden und 1 Monat in Kulturmedium bei 37°C photographiert und getestet wurden. In diesem Fall wurde der Schwamm aus LF 120 Alginat mit 1% (G/V) anfänglicher Alginatlösung und 0,2% G/V Calciumgluconat als Quervernetzer hergestellt, wobei die Herstellung, wie oben erwähnt, den schnellen Einfrierschritt in flüssigem Stickstoff umfasst. Aus dein obigen repräsentativen Ergebnis, das in 12 gezeigt ist, wird deutlich, dass die Alginatschwämme ihre physikahsche Stabilität für ausgedehnte Inkubationszeiträume aufrechterhalten, was ferner die Brauchbarkeit von solchen Schwämmen für eine längere Zellkultur und für Implantations- und Transplantationsanwendungen anzeigt.
Beispiel 5
Hepatocytenkultur mit Alginatschwämmen
Die Hepatocyten werden aus 200–250 g schweren männlichen Sprague Dawley Ratten mittels einer Modifikation des Dreistufenverfahrens von Berry und Fried (1969) isoliert. Die Leber wird in der retrograden Richtung zuerst mit Calcium-freiem Perfusionspuffer (143 mM NaCl, 150 mM KCl, 154 mM NaHCO₃, pH 7,4, worin 9% G/V Glucose enthalten sind) für 5 Minuten gefolgt von 100 cm³ an 5 mM EGTA und schließlich mit demselben Perfusionspuffer, der aber 5 mM CaCl₂ und 60 Einheiten/cm³ Typ IV Collagenase enthält, für 20 Minuten perfundiert. Die zerfallende Leber wird in chemisch definiertem, serumfreien Kulturmedium dispergiert (Williams E mit 10 ng/cm³ EGF, 20 mE/cm³ Insulin, 5 nM Dexamethason, 20 mM Pyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 E/cm³ Penicillin /Streptomycin und 0,2 mM Gentamycin). Dieses Medium wird hierin als "Vollmedium" bezeichnet. Die Zellenlebensfähigkeit der Hepatocyten nach der Dispersion beträgt 80–90%, wie dies durch den Trypanblauausschlusstest bestimmt wird. Tote Zellen und Debris werden durch Zentrifugation durch eine isodichte Percolllösung entfernt (siehe Kreamer et al., 1986) und das entstehende Zellpellet wird dann dreimal mit einem Vollmedium gewaschen. Die Lebensfähigkeit bei der Plattierung der so hergestellten Zellen beträgt 88–89%.
Für die Routinekultur werden die Zellen in einem Vollmedium bei einer Konzentration von 3 × 10⁴ lebende Zellen/cm² Kulturoberfläche oder 6 × 10⁵ Zellen/Kulturschale für die 50 mm Kontrollschalen plattiert. Die Kontrollschalen werden mit Collagen Typ I (Collagenbedeckung mit einer Konzentration von 1 μg/cm²) behandelt, um das Hepatocytenwachstum zu unterstützen.
Für die Zellkultur innerhalb der Alginatschwämme werden erfindungsgemäße Schwämme mit den folgenden Größen verwendet: 15 × 10 mm (Durchmesser × Höhe) und ein Volumen von 1,7 cm³, die aus LF 120 hergestellt wurden (die anfängliche Konzentration der Alginatlösung und des Calciumgluconats betragen jeweils 1 und 0,2% G/V. Der Schwamm wird in eine Vertiefung der Polystyrolplatten mit 24 Vertiefungen gegeben. Die Hepatocyten werden mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen cm³ folgendermaßen angeimpft: 2 × 10⁵ Zellen, die mit 200 μl Vollmedium suspendiert sind, werden auf die trockenen Schwämme gegeben. Aufgrund ihrer hydrophilen Art werden die Schwämme sofort durch Medium benetzt (die Luft in den Schwammporen wird durch die Flüssigkeit ersetzt), wobei die Zellen durch Kapillarkräfte in die Schwammporen gezogen werden. Dies führt zu einer homogeneren Verteilung der Zellen innerhalb des Schwamms. Die beimpften Schwämme werden mit und ohne zusätzliches Medium in einem 5% CO₂ Inkubator bei 37°C mit 99% Luftfeuchtigkeit für 1 Stunde inkubiert und dann wird 1 cm³ des Vollmediums zugegeben. Nach einer Anlagerungsperiode von 3–5 h (maximale Anhaftung an alle Alginatgele passiert innerhalb von 3 Stunden), wird das Medium gewechselt, um nicht haftende Zellen zu entfernen und dann werden die Zellen in Vollmedium mit täglichem Mediumwechsel gehalten.
Zu unterschiedlichen Zeiten der Zellkultur wird die Zahl der Zellen in der Kontrolle (Collagen-beschichtet) und den Experimentalschalen (Alginatschwämmen) durch die direkte Zählung oder durch biochemische Tests gemessen, wie dies unten detailliert beschrieben ist, wonach die Zelllage oder der Schwamm zweimal mit PBS gewaschen wurde. Für jede Messung werden drei Schalen oder Schwämme verwendet.
Es werden die folgende Direktzählung und die biochemischen Tests ausgeführt:
(a) Direktzählung: Für die direkte Zählung werden die Zellen aus den Kontrollschalen mittels 0,05% Trypsin/ EDTA entfernt, wobei die Zellen aus den Alginatschwämmen nach dem Lösen der Shwämme in 1 cm³ Citratpuffer 4% (G/V) pH 7,4 entfernt werden. Die Zahl der Zellen wird durch direkte Zählung auf einem Hämacytometer gezählt.
(b) Durch LDH Test: Die Aktivität der Lactatdehydrogenase (LDH) wird mittels Sigma Kit (LDH/LD Nr. DG 1340-UV) bestimmt. Die Zellzahl wird durch Messen der Enzymaktivität nach der Zellyse durch 3 Zyklen aus Einfrieren-Auftauen (–20°C und 37°C) bestimmt. Eine Standardkalibrierungskurve wird mittels unterschiedlicher Verdünnungen der Stammzellkultur erstellt. Eine lineare Beziehung zwischen der LDH Aktivität und der Zellzahl wird bis zu Zellkonzentrationen von 3 × 10⁶ Zellen cm³ beobachtet.
(c) Durch MTT: Der MTT Test basiert auf der Fähigkeit der mitochondrialen Dehydrogenaseenzyme von lebenden Zellen, das lösliche MTT Salz (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) in das unlösliche purpurfarbene Formazansalz umzuwandeln. MTT (Sigma) wird als 5 mg/cm³ Stammlösung in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) hergestellt. Die ungelösten Rückstände werden durch Sterilfiltration entfernt. Die Stammlösung wird im Dunklen bei 4°C gelagert und innerhalb von 3 Wochen nach der Herstellung verwendet. Die MTT Stammlösung in 60 μl wird zu den Vertiefungen der Polystyrolplatte mit 24 Vertiefungen gegeben, die den Schwamm in 1 cm³ Kulturmedium enthalten. Nach einer Inkubationsperiode von 5 Stunden bei 37°C wird die MTT Umwandlung nach der Entfernung des MTT enthaltenden Mediums aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugung entfernt. Das entstehende unlösliche Formazanprodukt wird in 100 cm³ an Isopropanol – 0,04 N HCl Lösung (Volumenverhältnis 250 : 1) gelöst und die Absorption der Lösung wird bei 560 nm gegen eine Kontrolle aus Isopropanol-HCl gemessen.
(d) Durch DNA: Der gesamte DNA Gehalt wird gemäß des Verfahrens von Brunk et al (1979) bestimmt. Dieses Verfahren kann die DNA Konzentration eines rohen, zellulären Homogenats im Nanogrammbereich genau mit der Fluoreszenzerhöhung von 4',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) detektierten, das mit DNA komplexiert ist. Kurz gesagt werden mit Zellen beimpfte Schwämme mit Citratpuffer behandelt, um die Schwämme aufzulösen und die Zellen freizusetzen. Die Zellen werden durch die Durchführung von 2 Zyklen aus Einfrieren-Auftauen (–20°C und 37°C) lysiert, wonach eine Dispersion in 25 cm³ an 1 M NaOH und ein Aufkochen des Gemisches für 30 Minuten erfolgt. Nach der Neutralisation mit HCl und einem Abkühlen auf Raumtemperatur wird der Fluoreszenzfarbstoff DAPI mit 100 ng/100 cm³ Trispuffer mit pH 7,0 zugegeben. Die Fluoreszenzemission der Proben bei 540 nm wird nach einer Probenanregung bei 286 nm bestimmt. Die Zahl der Zellen wird aus einer Kalibrierkurve mittels einer bekannten Konzentration der Zellen abgeschätzt.
(e) Bestimmung der Albuminsekretion:
Die Albuminsekretion in das Kulturmedium wird durch einen Enzym-gebundenen Immunosorbentsandwichtest (Schwerer et al., 1987) mittels Antikörpern bestimmt, die für Rattenalbumin spezifisch sind. Kurz gesagt werden Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc Immunoplatte) mit 100 μl Schaf-anti-Rattenalbumin mit 2 μg/cm³ in Beschichtungscarbonatpuffer pH 9,0 über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach dem Waschen der Platten mit PBS, worin 0,5% V/V Tween 20 (PBS-Tween) enthalten sind, werden sie durch die Zugabe von 100 μl an 1 (G/V) Gelatine zur Verringerung der unspezifischen Bindung blockiert. Nach der Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur werden die Platten dreimal mit PBS-Tween gewaschen und 100 μl der entsprechend verdünnten Proben des Mediums werden zu den Vertiefungen gegeben. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur werden die Zellen wie oben beschrieben gewaschen, wonach eine Zugabe von 100 μl Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-anti-Rattenalbumin in PBS (1 : 4000 Verdünnung aus der Stammlösung) bei Raumtemperatur erfolgt. Nach 2 Stunden Inkubation werden die Vertiefungen mit PBS-Tween gewaschen und 100 μl des Substrats 2,2'-Azino-di-(3- ethylbenzthiazolinsulfonat)(ABTS)(1 mg/cm³ in 77 mM Na-Phosphat / 61 mM Citratpuffer pH 4,0, worin 0,01% (V/V) H₂O₂) enthalten ist, wird zu jeder Vertiefung gegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die enzymatische Reaktion wird durch die Zugabe von 0,32% (G/V) Natriumfluorid gestoppt und die Farbveränderung wird spektrophotometrisch bei 405 nm gegen eine Referenz bei 490 nm mittels eines ELISA Geräts verfolgt (Denley, WSO50 WellScan). Reines Rattenalbumin (Cappel) wird zur Erstellung einer Standardkurve verwendet.
Die Ergebnisse der obigen Analyse der innerhalb der Alginatschwämme kultivierten Hepatocyten sind folgende:
Anfänglich werden die kultivierten Hepatocyten unter einer Lichtmikroskopie beobachtet, um die gesamte Morphologie und Art der Zellen zu untersuchen, die in den Alginatschwämmen kultiviert werden. Eine repäsentative Abbildung einer Lichtmikroskopie, die zu verschiedenen Inkubationszeiten aufgenommen wurde, ist in 13 gezeigt, worin die obere mikroskopische Abbildung Zellen zum Zeitpunkt der Beimpfung (Tag 1 der Inkubation) und die untere mikroskopische Aufnahme die Zellen nach 10 Tagen in Kultur zeigt, wobei die Vergrößerung in beiden mikroskopischen Aufnahmen dieselbe ist.
Aus den in 13 gezeigten lichtimkroskopischen Aufnahmen kann man mehrere einzigartige Merkmale im Vergleich mit herkömmlicher Kultur auf Collagen-behandelten Schalen beobachten: (1) Die Hepatocyten werden hauptsächlich innerhalb der Pore des Alginatschwamms immobilisiert, (2) die Morphologie der Hepatocyten ist in der Kultur rund statt flach, wobei die ausgestreckte Form gewöhnlich in einer Monolagenkultur gefunden wird und die runde Morphologie ist näher an der, die in vivo beobachtet wird und (3) an einigen Teilen des Schwamms können Spheroide von Hepatocyten beobachtet werden (siehe vor allem obere mikroskopische Aufnahme in 13). Ferner wird aus den beiden mikroskopischen Aufnahmen in 13 deutlich, dass in den 10 Tagen der Kultur (Vergleich der oberen und unteren mikroskopischen Aufnahme) eine starke Zellproliferation auftritt.
Um die Anzahl an Hepatocyten innerhalb des Alginatschwamms zu analysieren, werden die Hepatocyten aus der Matrix durch deren Auflösung mit Citratpuffer freigesetzt. Die Anzahl an Zellen zu verschiedenen Inkubationszeiten wird durch LDH und DNA Gehalt getestet, wie dies oben erwähnt ist. Die Ergebnisse sind in 14 gezeigt, einer graphischen Darstellung der Anzahl an Zellen als Funktion der Zeit (Inkubationstage). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zellen innerhalb der Schwämme sich vernehert haben (wie dies primär in der Zunahme der DNA Synthese beobachtet wird). Das Muster der differenzierten Funktion durch Zellen, die eine DNA Synthese innerhalb des Alginatschwamms ausführen, ist ähnlich zu dem berichteten Verhalten von Hepatocyten in regenerierter Leber (Friedman, 1984).
Um zu untersuchen, wie die Hepatocyten in den Alginatschwämmen funktionieren, wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Sekretion von Albumin untersucht. Die in 15 gezeigten Ergebnisse sind eine graphische Darstellung der Menge an durch die Zellen sekretierten Albumins (μg/Tag/10⁶ Zellen) als Funktion der Zeit (Inkubationstage). Die Ergebnisse zeigen, dass die Sekretion von Albumin aus Hepatocyten, die innerhalb der Alginatschwämme angezogen werden, über 10 Tage in Kultur stabil ist (siehe Ergebnisse, die mit ausgefüllten Dreiecken in 15 gezeigt sind). Im Gegensatz dazu nimmt die Sekretion von Albumin mit der Kulturzeit in der herkömmlichen Kultur (Collagen-beschichtete Schalen) ab und geht nach 5 Tagen in Kultur fast verloren.
Beispiel 6
Fibroblastenkultur innerhalb der Schwämme
Schwämme mit einer mittleren Größe von 15 × 10 mm (Durchmesser × Höhe) und einem ungefähren Volumen von 1,7 cm³ in einer Vertiefung von Polystyrolplatten mit 24 Vertiefungen werden mit 2 × 10⁵ normalen Hautfibroblasten beimpft, die man von humaner Vorhaut erhält, welche in (200 μl) DMEM Medium suspendiert sind, das mit 10% fetalem Kälberserum (DMEM-FCS) supplementiert ist. Die beimpften Schwämme werden ohne zusätzliches Medium in einem Inkubator mit 5% CO₂ bei 37°C mit 99% Luftfeuchtigkeit für 1 Stunde angezogen und dann wird 1 cm³ DMEM-FCS zugegeben. Das Medium wird alle drei Tage ersetzt.
Die in die Alginatschwämme geimpften Fibroblasten werden dann durch eine Scanningelektronenmikroskopie (SEM) analysiert. Zu diesem Zweck werden Proben aus den beimpften Schwämmen in der Inkubation entnommen und für eine Scanningelektronenmikroskopie (SEM) fixiert. Kurz gesagt werden die Schwämme mit PBS gewaschen und dann in PBS Puffer, worin 2% Glutaraldehyd (pH 7,4) enthalten sind, für 1 Stunde bei Raumtemperatur und danach für 24 Stunden bei 4°C fixiert. Nach dem zweimaligen Waschen mit PBS werden die Schwämme durch eine abgestufte Ethanolreihe (10–99,8% in 10% Schritten) für jeweils 10 Minuten dehydriert. Die Proben werden am kritischen Punkt getrocknet und mit einer ultradünnen Goldschicht (100 Å) wie oben beschrieben beschichtet.
Gewöhnlich wird der obige Test durch SEM nach 5 Kulturtagen der mit Fibroblasten beimpften Alginatschwämme ausgeführt.
Wie im Fall der Hepatocyten (siehe oben) bevorzugen die Fibroblasten die Poren des Alginatschwamms (16). Dies ist leicht in SEM Aufnahmen sichtbar, die in 16 gezeigt sind, die aber repräsentativ für eine große Anzahl an ähnlichen Aufnahmen sind, die von mehreren solchen mit Fibroblasten beimpften Schwammproben hergestellt wurden: Die in 16 gezeigten mikroskopischen Aufnahmen zeigen zwei Vergrößerungen: Eine starke (obere mikroskopische Aufnahme) und eine geringe (untere mikroskopische Aufnahme), aus denen ersichtlich ist, dass die Fibroblasten in den Poren des Schwamms wachsen. Es sollte bei 16 erwähnt werden, dass beide mikroskopischen Aufnahmen auch einen gedruckten Balken aufweisen, der eine Skala zur Bestimmung der tatsächlichen Größen der Zellen, Poren, Porenwanddicken usw. liefert. Der Balken in der oberen mikroskopischen Aufnahme steht für 10 μm und der Balken in der unteren mikroskopischen Aufnahme steht für 100 μm. Ferner hat die Adhäsion der Zellen und ihre Proliferation mit der Kultivierungszeit keinen signifikanten Einfluss auf die Schwämme, die ihre ursprünglichen Formen aufrechterhalten (Ergebnisse nicht gezeigt). Dies zeigt einen weiteren Vorteil des Alginatschwammmaterials gegenüber den Collagenschwämmen. Frühere Studien haben gezeigt, dass in Collagenkontakt angezogene Fibroblasten die neu synthetisierte Collagenschicht auf der sie wachsen, kontrahieren, was zu einem "aufrollen" der Zellmonolage führt (siehe Rivard et al., 1995). Auf ähnliche Weise werden auch die beimpften Collagenschäume auf 40% ihres anfänglichen Volumens nach 5 Wochen in Kultur kontrahiert (Rivard et al., 1995), was sie für eine Transplantation von großen Zellmengen ungeeignet macht.
Beispiel 7
Verkapselung von Protein-enthaltenden Mikrosphären innerhalb der Alginatschwämme
Um die Vaskularisierung der für das Zellwachstum in vivo vorgesehenen Schwämme zu fördern, können Angiogenesefaktoren in die Schwämme eingebracht werden. Jedoch sind Alginat oder andere Polysaccharidschwämme zu porös für die wirksame Verkapselung von Proteinen oder Peptiden und diese Moleküle entweichen schnell aus der Matrix. Um ihre Abgabe aus dem Schwamm zu verlängern, können diese Faktoren zuerst in kleinen, bioabbaubaren, kontrolliert freisetzenden Mikrosphären verkapselt werden, wie Poly(milch/glycolsäure), die dann innerhalb des Schwamms festgehalten werden.
Daher werden Poly(milch/glycolsäure)mikrosphären, die Fibroblastenwachstumsfaktoren oder jeden anderen Angiogenesefaktor enthalten, zuerst durch Lösemittelverdampfungsverfahren hergestellt, das auf einer doppelten Emulsion basiert (Cohen et al., 1991). Die entstehenden Mikrosphären mit einem Durchmesser im Bereich von 5– 20 μm werden unmittelbar nach der Zugabe der Quervernetzerlösung während eines intensiven Rührens mittels des Verfahrens der Erfindung zur Alginatlösung gegeben (für Details siehe Beispiel 1). Die Alginatgele werden dann eingefroren und wie in Beispiel 1 unter Bildung eines Schwamms lysophilisiert, der Mikrosphären enthält, die wiederum die obigen Faktoren enthalten.
Die 17 ist eine Abbildung einer SEM des entstehenden Schwamms. Die obere mikroskopische Aufnahme ist eine geringe Vergrößerung und die untere mikroskopische Aufnahme ist eine größere Vergrößerung und sie zeigen, dass die Mikrosphären in den Poren des Schwamms enthalten sind. Die Balken in beiden mikroskopischen Aufnahmen stellen einen Maßstab zur Bestimmung der tatsächlichen Größenparameter der Porengröße und der Porenwanddicke des Schwamms und der Größe der Mikrosphären innerlalb des Schwamms dar.
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Claims

Polysaccharidschwamm, dadurch gekennzeichnet, daß er folgendes aufweist: (i) eine mittlere Porengröße im Bereich von 10 μm bis 300 μm, (ii) einen mittleren Abstand zwischen den Poren von 5 μm bis 270 μm, der auch die Wanddicke der Poren ist und (iii) ein Elastizitäts-E-Modul als Maß der Steifigkeit für den Schwamm im Bereich von 50 kPa bis 500 kPa.
Polysaccharidschwamm nach Anspruch 1, worin der Schwamm ein Polysaccharid umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, die aus den polyanionischen Polysacchariden Alginate, Gellan, Gellankautschuk, Xanthan, Agar, Carragenan und dem polykationischen Polysaccharid Chitosan besteht.
Polysaccharidschwamm nach Anspruch 1 oder 2, worin der Schwamm ein Alginat enthält, ausgewählt aus der Gruppe an Alginaten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie folgendes aufweisen: (i) einen Gehalt an Mannuronsäureresten (M) im Bereich zwischen 25% und 65% der gesamten Reste, (ii) einen Gehalt an Guluronsäureresten (G) im Bereich zwischen 35% und 75% der gesamten Reste, (iii) ein M/G Verhältnis zwischen 1/3 und 1,86/1 und (iv) eine Viskosität der fertigen Alginatlösung mit 1% G/V Alginat, aus der der Schwamm erhalten wird, im Bereich von 50 cP bis 800 cP.
Polysaccharidschwamm nach Anspruch 3, worin der Schwamm ein Alginat umfaßt, das von der braunen Meeresalge stammt, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Alginat Protanal^® LF 120 (LF 120), das von Laminatria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® LF 20/60 (LF 20/60), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat MVG^® (MVG), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® HF 120 (HF 120), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® SF 120 (SF 120), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® SF 120 RB (SF 120 RB), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Protanal^® LF 200 RB (LF 200 RB), das von Laminaria hyperborea stammt, Alginat Manugel^® DMB (DMB), das von Laminaria hyperborea stammt, Keltone^® HVCR (HVCR), das von Macrocystis pyrifera stammt und Keltone^® LV (LV), das von Macrocystis pyrifera stammt.
Polysaccharidschwamm nach Anspruch 4, worin der Schwamm ein Alginat enthält, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus LF 120, LF 20/60 und HVCR.
Polysaccharidschwamm nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin das Alginat in Form einer Natriumalginatlösung verwendet wird, die eine Alginatkonzentration zwischen 1% bis 3% G/V aufweist, um eine Alginatkonzentration zwischen 0,1% bis 2% G/V in der fertigen Lösung bereitzustellen, aus der der Schwamm erhalten wird.
Polysaccharidschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Schwamm ferner ein quervernetzendes Mittel enthält, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus den Salzen von Calcium, Kupfer, Aluminium, Magnesium, Strontium, Barium, Zinn, Zink, Chrom, organischen Kationen, Polyaminosäuren, Polyethylenimin, Polyvinylamin, Polyallylamin und Polysacchariden.
Polysaccharidschwamm nach Anspruch 7, worin der Schwamm ferner ein quervernetzendes Mittel enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Calciumchlorid (CaCl₂), Strontiumchlorid (SrCl₂) und Calciumgluconat (Ca-Gl).
Polysaccharidschwamm nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin der Quervernetzer in Form einer Quervernetzungslösung mit einer Konzentration des Quervernetzers verwendet wird, die zur Bereitstellung einer Quervernetzerkonzentration zwischen 0,1% bis 0,3% G/V in der fertigen Lösung ausreicht, woraus der Schwamm erhalten wird.
Polysaccharidschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin der Schwamm aus einer Polysaccharidlösung mit oder ohne der Zugabe eines Quervernetzers erhalten wird.
Polysaccharidschwamm nach Anspruch 10, worin der Schwamm ein Alginatschwamm ist, der aus einer Alginatlösung mit oder ohne der Zugabe eines Quervernetzers hergestellt wird und worin die fertige Alginatlösung mit oder ohne Quervernetzer, aus der der Schwamm erhalten wird, aus der Gruppe an fertigen Lösungen ausgewählt wird, die Konzentrationen an Alginat oder Alginat und Quervernetzer aufweisen, welche besteht aus (i) LF 120 Alginat mit 1 % G/V ohne Quervernetzer, (ii) LF 120 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,1% G/V, (iii) LF 120 Alginat mit 1 % G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V, (iv) LF 120 Alginat mit 1% G/V und SrCl₂ mit 0,15% G/V, (v) LF 120 Alginat mit 1% G/V und CaCl₂ mit 0,1% G/V, (vi) LF 120 Alginat mit 0,5% G/V und Ca-Gl rnit 0,2% G/V (vii) LF 20/60 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V, (viii) HVCR Alginat mit 0,5% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V und (ix) HVCR Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V.
Polysaccharidschwamm nach Anspruch 11, worin der Schwamm aus einer fertigen Lösung aus LF 120 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl Quervernetzer mit 0,2% G/V erhalten wird.
Polysaccharidschwamm nach Anspruch 11, worin der Schwamm aus einer fertigen Lösung aus HVCR Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl Quervernetzer mit 0,2% G/V erhalten wird.
Polysaccharidschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Verwendung in medizinischen Anwendungen.
Verwendung eines Polysaccharidschwamms nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung einer Matrix, eines Substrats oder eines Gerüsts zur Implantierung in einen Patienten, um Gewebe zu ersetzen oder zu reparieren, das entfernt oder beschädigt wurde, worin der implantierte Schwamm ein Substrat, eine Matrix oder ein Gerüst für umgebendes Gewebe ist, um hierin einzudringen, hierauf zu proliferieren und das beschädigte oder entfernte Gewebe zu ersetzen oder worin das Implantat ein anfängliches Substrat zur Vaskularisierung durch das umgebende Gewebe ist und das vaskularisierte Implantat dann als Substrat dient, um injizierte Zellen der Wahl vom Wirt oder die in vitro angezogen wurden zu erhalten, wobei die injizierten Zellen zur schnellen Akklimatisierung und Proliferation auf dem vaskularisierten Schwamm fähig sind, um das beschädigte oder entfernte Gewebe zu ersetzen.
Verwendung eines Polysaccharidschwamms nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines implantierten Trägers zur therapeutischen Arzneimittelabgabe in ein gewünschtes Gewebe, wobei die Arzneimittelabgabe durch die Wirkung von genetisch veränderten Zellen oder natürlichen Zellen erfolgt, die von diesem Schwamm getragen werden und diese therapeutischen Arzneimittel exprimieren, wobei die Zellen das Arzneimittel exprimieren oder regulatorische Proteine exprimieren, um die endogene Bildung des Arzneimittels in diesem Gewebe zu steuern.
Verwendung nach Anspruch 16, worin das therapeutische Arzneimittel, das von den Zellen exprimiert wird, die von dem Schwamm getragen werden, ein therapeutisches Protein ist, worin die Zellen das Protein exprimieren, oder regulatorische Proteine exprimieren, die die Bildung dieses Proteins endogen im Gewebe steuern, in das der Schwamm implantiert wurde.
Verwendung eines Polysaccharidschwamms nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung einer Matrix, eines Substrats oder eines Gerüsts für die in vivo Abgabe von genetisch veränderten viralen Vektoren, nicht-viralen Vektoren, polymeren Mikrosphären und Liposomen an ein Gewebe oder Organ, die alle für ein therapeutisches Mittel für dieses Gewebe oder Organ kodieren oder dieses enthalten.
Verwendung eines Polysaccharidschwamms nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung einer Matrix, eines Substrats oder eines Gerüsts zur Transplantation von Zellen die auf oder in diesem Schwamm in vitro angezogen wurden in ein Gewebe eines Patienten, der diese Zellen als Folge einer Schädigung, Entfernung oder Fehlfunktion des Gewebes benötigt.
Verfahren zur Herstellung eines Polysaccaridschwamms nach einem der Ansprüche 1–19, gekennzeichnet durch: (a) Bereitstellung einer Polysaccharidlösung, die 1% bis 3% G/V Polysaccharid in Wasser enthält, (b) Erforderlichenfalls Verdünnung dieser Polysaccharidlösung mit zusätzlichem Wasser, um eine fertige Lösung mit 0,5% bis 2% G/V Polysaccharid zu erhalten und Unterziehung dieser Lösung von (a) einer Gelierung unter Bildung eines Polysaccharidgels, (c) Gefrierung des Gels von (b) und (d) Trocknung des gefrorenen Gels von (c) unter Bildung eines Polysaccharidschwamms.
Verfahren nach Anspruch 20, das ferner die Zugabe eines Quervernetzers zur Polysaccharidlösung von (a) während des Gelierschritts (b) umfaßt, wobei der Quervernetzer in einer Menge zugegeben wird, um in der fertigen Lösung, die einer Gelierung unterzogen wird, eine Konzentration des Quersenetzers zwischen 0,1% bis 0,3% G/V bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, worin die Polysaccharidlösung von (a) durch Lösen des Polysaccharids in pulverisierter Form im zweifach destilliertem Wasser in Mengen hergestellt wird, um eine Konzentration zwischen 1% bis 3% G/V Polysaccharid in dieser Lösung zu erhalten, wobei die Polysaccharidlösung in einem Homogenisiergerät bei etwa 25 000 Upm für etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20–22, worin der Gelierschritt (b) durch intensives Rühren der Polysaccharidlösung in einem Homogenisiergerät bei etwa 31 800 Upm für etwa 3 Minuten ausgeführt wird und worin, wenn ein Quervernetzer zur Lösung gegeben wird, dieser Quervernetzer sehr langsam während diesem intensiven Rühren der Polysaccharidlösung zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, worin das Polysaccharid ein Alginat nach Anspruch 4 ist.
Verfahren nach Anspruch 24, worin in diesem Verfahren die fertigen Lösungen, die dem Gelierschritt (b) unterzogen werden, aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus: (i) LF 120 Alginat mit 1% G/V ohne Quervernetzer, (ii) LF 120 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,1% G/V, (iii) LF 120 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V, (iv) LF 120 Alginat mit 1% G/V und SrCl₂ mit 0,15% G/V, (v) LF 120 Alginat mit 1% G/V und CaCl₂ mit 0,1% G/V, (vi) LF 120 Alginat mit 0,5% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V (vii) LF 20/60 Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V, (viii) HVCR Alginat mit 0,5% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V und (ix) HVCR Alginat mit 1% G/V und Ca-Gl mit 0,2% G/V.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20–25, worin der Gefrierschritt (c) durch schnelles Einfrieren in einem flüssigem Stickstoffbad für etwa 15 Minuten ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20–25, worin der Gefrierschritt (c) durch langsames Einfrieren in einem Gefrierschrank bei etwa –18°C für 8–24 Stunden ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20–27, worin der Trocknungsschritt (d) durch Lyophilisierung unter Bedingungen von etwa 0,007 mm Hg Druck und etwa –60°C ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20–28, worin die fertige Polysaccharidlösung mit oder ohne Quervernetzer in ein Gefäß der gewünschten Form gegossen wird, bevor das intensive Rühren des Gelierschritts (b) begonnen wird, wobei das Gefäß eine Form hat, die für die Form des Polysaccharidschwamms gewünscht wird.
Verwendung eines Polysaccharidschwamins nach einem der Ansprüche 1–13 als Matrix, Substrat oder Gerüst zur in vitro Anzucht von Säugerzellen, Pflanzenzellen, Algen oder zur in vitro Fertilisation von Säugeroozyten.
Verwendung eines Polysaccharidschwamms nach Anspruch 30 für das in vitro Wachstum von Fibroblastenzellen.
Verwendung eines Polysaccharidschwamms nach Anspruch 30 zur in vitro Anzucht von Hepatozyten.
Künstliche Haut, die einen Polysaccharidschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und Hautfibroblastenzellen umfaßt, die auf diesem Schwamm in vitro bis zu dem Stadium angezogen wurden, worin die Zellen in einem aktiv proliferierenden Stadium sind, das zur Transplantation an einen Patienten geeignet ist, der einer künstlichen Haut bedarf.
Künstliches Organäquivalent, das einen Polysaccharidschwamm nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und repräsentative Zellen des Organs umfaßt, wobei die Zellen auf dem Schwamm in vitro bis zu dem Stadium angezogen wurden, in dem die Zellen voll aktiv sind und zu den aktiven Zellen des Organs äquivalent sind, wobei das künstliche Organ zur Transplantation oder Implantierung in einen Patienten geeignet ist, der dies aufgrumd einer Schädigung, Entfernung oder Fehlfunktion des Organs benötigt.
Künstliches Organäquivalent nach Anspruch 34, das ein künstliches Leberäquivalent ist, worin die in diesem Schwamm angezogenen Zellen Hepatozyten in einem Stadium sind, in dein die Hepatozyten auf ähnliche Weise zu Hepatozyten in vivo aktiv sind und funktionieren und zur Transplantation oder Implantierung in einen Patienten geeignet sind, der an einer Fehlfunktion, Schädigung oder zumindest teilweisen Entfernung der Leber leidet.