DE69725587T2 - Verwendung von wnt polypeptiden - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Anmeldung betrifft die Verwendung von Wnt-Polypeptiden („Wnts"). Insbesondere betrifft die Erfindung Verwendungen eines Wnt-Polypeptids zur Verbesserung der Proliferation, Differenzierung und/oder Erhaltung von primitiven hämatopoetischen Zellen, z. B. hämatopoetischen Stamm-/Progenitor-Zellen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • A. HÄMATOPOESE
  • Der Vorgang der Blutzellen-Bildung, bei dem rote und weiße Blutzellen durch die Teilung von Zellen ersetzt werden, die sich im Knochenmark befinden, wird als Hämatopoese bezeichnet. Eine Zusammenfassung von Hämatopoese findet sich in Dexter und Spooncer (Ann. Rev. Cell Biol. 3, 423–441 (1987)).
  • Es gibt viele verschiedene Typen von Blutzellen, die zu unterschiedlichen Zelllinien gehören. Entlang jeder Linie gibt es Zellen in unterschiedlichen Reifungsstadien. Reife Blutzellen sind für verschiedene Funktionen spezialisiert. Beispielsweise sind Erythrozyten am O2- und CO2-Transport beteiligt; T- und B-Lymphozyten sind an Zell- bzw. Antikörpervermittelten Immunreaktionen beteiligt; Blutplättchen sind für Blutgerinnung erforderlich; und die Granulozyten und Makrophagen fungieren als allgemeine Abbauzel len und Hilfszellen. Granulozyten können weiters in Basophile, Eosinophile, Neutrophile und Mastzellen unterteilt werden.
  • Jede der verschiedenen Blutzellen-Typen entsteht aus pluripotenten oder totipotenten Stammzellen, die zur Selbsterneuerung fähig sind oder Progenitor-Zellen oder Colony Forming Units (CFU) entstehen lassen können, die eine eingeschränktere Reihe von Zell-Typen ergeben. Wenn Stammzellen allmählich ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung verlieren, werden sie zunehmend Linien-begrenzt. Es ist gezeigt worden, dass sich Stammzellen zu multipotenten Zellen (von Cexter und Spooncer, oben, als „CFC-Mix" bezeichnet) entwickeln können. Einige der CFC-Mix-Zellen können Erneuerung erfahren, während andere zu Linien-beschränkten Progenitoren führen, die sich schlussendlich zu reifen Myeloidzellen (z. B. Neutrophilen, Megakaryozyten, Makrophagen, Basophilen und Erythroidzellen) entwickeln. Auf ähnliche Weise können pluripotente Stammzellen PreB- und PreT-Lympoid-Zelllinien entstehen lassen, die zu reifen B- bzw. T-Lymphozyten differenziert werden. Progenitoren sind durch ihre Nachkommenschaft definiert, z. B. werden Granulozyt-/Makrophagenkolonie-bildende Progenitor-Zellen (GM-CFU) zu Neutrophilen oder Makrophagen differenziert; primitive Erythroid-Burstbildende Einheiten (BFU-E) werden zu Erythroidkolonie-bildenden Einheiten (CFU-E) differenziert, die reife Erythrozyten entstehen lassen. Auf ähnliche Weise können die Meg-CFU-, Eos-CFU- und Bas-CFU-Progenitoren zu Megakaryozyten, Eosinophilen bzw. Basophilen differenziert werden.
  • Die Anzahl an pluripotenten Stammzellen im Knochenmark ist extrem niedrig, und es wird geschätzt, dass sie in der Größenordnung von etwa 1 pro 10.000 bis 1 pro 100.000 Zellen liegt (Boggs et al., J. Clin. Inv. 70, 242 (1982), und Harrison et al., PNAS 85, 822 (1988)). Demgemäß ist die Charakterisierung von Stammzellen schwierig. Daher sind verschiedene Protokolle zur Anreicherung von pluripotenten Stammzellen entwickelt worden. Siehe beispielsweise Matthews et al., Cell 65, 1143–1152 (1991); WO 94/02157; Orlic et al., Blood 82(3), 762–770 (1993); und Visser et al., Stem Cells 11(2), 49–55 (1993).
  • Es ist gezeigt worden, dass verschiedene Linien-spezifische Faktoren das Zellwachstum, die Differenzierung und die Funktion von hämatopoetischen Zellen steuern. Zu diesen Faktoren oder Cytokinen gehören die Interleukine (z. B. IL-3), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulationsfaktor (GM-CSF), Makrophagen-Kolonie-Stimulationsfaktor (M-CSF), Granulozyten-Kolonie-Stimulationsfaktor (M-CSF), Erythropoetin (Epo), Lymphotoxin, Stahlfaktor (SLF), Tumornekrosefaktor (TNF) und γ-Interferon. Diese Wachstumsfaktoren verfügen über ein breites Wirkungsspektrum von allgemeinen bis zu Linienspezifischen Rollen bei der Hämatopoese oder einer Kombination aus beiden. Beispielsweise scheint IL-3 sowohl auf multipotente Stammzellen als auch auf Progenitoren zu wirken, die auf die Granulozyt-/Makrophagen-, Eosinophil-, Megakaryozyten-, Erythroid- oder Mastzellen-Linien beschränkt sind. Andererseits wirkt Epo im Allgemeinen auf ziemlich reife Erythroid-Progenitorzellen.
  • B. HÄMATOPOETISCHE UMGEBUNG UND EMBRYOGENESE
  • Die Fähigkeit der hämatopoetischen Stammzellen, für die lebenslange Produktion aller Blut-Zelllinien zu sorgen, wird durch ein Gleichgewicht zwischen der Plastizität der Stammzelle, d. h. der Produktion spezialisierter Progenitor-Zellen, die spezifische Blut-Zelllinien erzeugen, und der Replikation der Stammzelle im undifferenzierten Stadium (Selbst-Erneuerung) erreicht. Die Mechanismen, die die Plastizität und Selbst-Erneuerung hämatopoetischer Stammzellen in vivo regulieren, lassen sich nur schwer definieren. Die hauptsächlich beitragenden Faktoren stellen jedoch eine Kombination aus der Zelle innewohnenden und Umgebungs-Einflüssen dar (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10302–10306 (1995)). Die Wichtigkeit der hämatopoetischen Umgebung ist durch die Verwendung langfristiger Knochenmarkskultursysteme bestätigt worden, worin auf Stroma kultivierte hämatopoetische Zellen die Erhaltung von HSCs ermöglichen, wenn auch in geringen Frequenzen (Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1968–1972, (1992); Wineman et al., Blood 81, 365–372 (1993)).
  • Die Demonstration der Erhaltung hämatopoetischer Zellen in Kultur hat zu Bemühungen geführt, Kandidaten-"Stammzellen"-Faktoren zu identifizieren. Die Rolle hämatopoetischer Cytokine bei der Stammzellen-Erhaltung ist durch die direkte Zuführung gereinigter Faktoren zu In-vitro-Kulturen von Stammzellenpopulationen, gefolgt von der Transplantation der kultivierten Zellen, untersucht worden (Muench et al., Blood 81, 3463–3473 (1993); Wineman et al., oben (1993); Rebel et al., Blood 83, 128–136 (1994)). Es ist gezeigt worden, dass die meisten der bekannten „früh wirkenden" Cytokine, wie IL-3, IL-6 und KL, die Proliferation stärker spezialisierter Progenitor-Zellen stimulieren, während sie gleichzeitig die Erhaltung, aber nicht die Ausdehnung von Zellen zulassen, die zur langfristigen Mehrlinien-Repopulation fähig sind (Überblick in Williams, Blood 12, 3169–3172 (1993); Müller-Siebergand Deryugina, Stem Cells 13, 477-486 (1995)). Während diese Daten darauf hinweisen, dass die Plastizität und Repopulationsfunktion der Zellen durch Cytokin-Behandlung beibehalten werden kann, bleiben die Moleküle, die die Selbsterneuerung dieser pluripotenten Zellen fördern, unbekannt.
  • Transplantationsuntersuchungen haben gezeigt, dass die Signale, die das Schicksal pluripotenter Stammzellen regulieren, im Embryo- und Erwachsenen-Knochenmark ähnlich sein können. Zellen von der Tag-11-Fötalleber-, Dottersack- oder Aorta/Gonaden/Mesonephros-(AGM-)Region können das Erwachsenen-Knochenmark repopulieren und entsprechend auf äußere Indikatoren reagieren, um die langfristige Multilinien-Hämatopoese aufrecht zu erhalten (Müller et al., Immunity 1, 291–301 (1994)). Obwohl die embryonale Hämatopoese weitgehend der Erythroid-Linie gewidmet ist, trägt die embryonale Mikroumgebung klar zum Erhalten pluripotenter Stammzellen im undifferenzierten Zustand bei. Diese Zellpopulationen erfahren während der Embroygenese einen Zyklus (Zeigler et al., oben (1994); Morrison et al., oben (1995); Rebel et al., Blood 87, 3500-3507 (1996)).
  • Bei Säugetieren entstehen hämatopoetische Vorläufer in der extraembryonalen und ventralen Mesoderm-, Dottersack- oder AGM-Region (Dzierzak und Medvinsky, Trends Genet. 11, 359–366 (1995); Zon, Blood 86, 2876–2891 (1995)). Bei Amphibien-Embryos sind die äquivalenten Regionen das Ventral-Blut-Insel-Mesoderm und das Dorsal-Lateral-Platten-Mesoderm (Zusammenfassung in Kessler und Melton, Science 266, 596–604 (1994); Zon, oben (1995); Tam und Qzinlin, Curr. Biol. 6, 104–106 (1996)). Zu den ausgeschiedenen Faktoren, die potentiell die Zell-Schicksal-Bestimmung von ventralem Mesoderm in Xenopus regulieren, gehören Wnts, FGFs und BMP-4 (Zusammenfassung in Christian und Moon, Bio Essays 15, 135–140 (1993a); Zon, oben (1995)). Die embryonale Expression von Xwnt-8 (Christian und Moon, Genes Dev. 7, 13–28 (1993b)) und Xwnt-11 (Ku und Melton, Development 119, 1161–1173 (1993)) ist lokal auf den Bereich des voraussichtlichen ventralen und lateralen Mesoderms beschränkt, und die XWnt-8-Expression kann durch ventralisierende Faktoren wie FGFs und BMP-4 herbeigeführt werden.
  • C. DIE WNTS-GENFAMILIE
  • Für Wnts kodiert eine große Gen-Familie, deren Mitglieder in Rundwürmern, Insekten, Knorpelfischen und Wirbeltieren zu finden sind (Sidow, 1994). Es wird angenommen, dass Wnts bei einer Vielzahl von Entwicklungsprozessen und physiologischen Prozessen eine Funktion erfüllen, da viele verschiedene Spezies mehrere konservierte Wnt-Gene aufweisen (McMahon, Trends Genet. 8, 236–242 (1992); Nusse und Varmus, Cell 69, 1073–1087 (1992)). Wnt-Gene kodieren für sekretierte Glykoproteine, von denen angenommen wird, dass sie als parakrine oder autokrine Signale fungieren, die bei mehreren primitiven Zell-Typen wirksam sind (McMahon, oben (1992); Nusse und Varmus, oben (1992)). Zur Wnt-Wachstumsfaktor-Familie gehören mehr als 10 Gene, die bei der Maus identifiziert wurden (Wnt-1, -2, -3a, -3b, -4, -5a, -5b, -6, -7a, -7b, -8a, -8b, -10b, -11, -12) (siehe beispielsweise Gavin et al., Genes Dev. 4, 2319–2332 (1990); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2268–2272; Christiansen et al., Mech. Dev. 51, 341–350 (1995)) sowie zumindest 7 Gene, die beim Menschen identifiziert wurden (Wnt-1, -2, -3, -4, -5a, -7a und -7b), und zwar durch cDNA-Klonierung (siehe beispielsweise Vant Veer et al., Mol. Cell. Biol. 4, 2532–2534 (1984)). Das Wnt-I-Proto-Oncogen (int-1) wurde ursprünglich aus Brustdrüsen-Tumoren identifiziert, die aufgrund einer Insertion viraler DNA-Sequenz durch Mäuse-Brustdrüsen-Tumorvirus (MMTV) herbeigeführt wurden (Nusse und Varmus, Cell 31, 99–109 (1982)). Bei erwachsenen Mäusen wird die Expressionsmenge von Wnt-1-mRNA nur während späterer Stadien der Sperma-Entwicklung im Hoden detektiert. Wnt-1-Protein hat etwa 42 KDa und enthält eine Amino-terminale hydrophobe Region, die als Signalsequenz für die Sekretion fungieren kann (Nusse und Varmus, oben). Die Expression von Wnt-2/irp wird in Mäuseföten- und Erwachsenen-Geweben detektiert, und ihre Verteilung überlappt nicht mit dem Expressionsmuster für Wnt-1. Wnt-3 ist mit Mäuse-Milchdrüsen-Tumorgenese verbunden. Die Expression von Wnt-3 bei Mäuseembryos wurde in den Neuralröhren und in den Extremitätenknospen detektiert. Wnt-5a-Transkripte werden in den sich entwickelnden vorderen und hinteren Extremitäten an den Tagen 9,5 bis 14,5 detektiert, und die höchsten Mengen sind im apikalen Ectoderm an der distalen Spitze von Extremitäten konzentriert (Nusse und Varmus, oben (1992)). Vor kurzem ist ein Wnt-Wachstumsfaktor mit der Bezeichnung Wnt-x gemeinsam mit der Detektion von Wnt-x-Expression in Knochengeweben und in von Knochen stammenden Zellen beschrieben worden (PCT/US94/14708; WO95/17416). Ebenfalls beschrieben wurde die Rolle von Wnt-x bei der Erhaltung von reifen Osteoblasten und die Verwendung von Wnt-x-Wachstumsfaktor als Therapiemittel oder bei der Entwicklung anderer Therapiemittel zur Behandlung von Knochenerkrankungen.
  • Wnts können eine Rolle bei der lokalen Zell-Signalisierung spielen. Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass ein Großteil des sekretierten Wnt-Proteins mit der Zelloberfläche oder extrazellulären Matrix assoziiert zu finden und nicht frei im Medium diffundierbar ist (Papkoff und Schrywer, Mol. Cell. Biol. 10, 2723–2730 (1990); Bradley und Brown, EMBO J. 9, 1569–1575 (1990)).
  • Untersuchungen von Mutationen bei Wnt-Genen deuten darauf hin, dass Wnts eine Rolle bei der Wachstumsregulierung und Gewebemusterung spielen. Bei Drosophile kodiert wingless (wg) für ein Wnt-Gen (Rijsewik et al., Cell 50, 649–657 (1987)), und wg-Mutationen verändern das Muster des embryonalen Ectoderms, Neurogenese und Imaginal-Disk-Protuberanz (Morata und Lawerence, Dev. Biol. 56, 227–240 (1977); Baker, Dev. Biol. 125, 96–108 (1988); Klingensmith und Nusse, Dev. Biol. 166, 396–414 (1994)). Bei Caenorhabditis elegans kodiert Iin-44 für ein Wnt, das für asymmetrische Zellteilungen erforderlich ist (Herman und Horvitz, Development 120, 1035–1047 (1994)). Knock-out-Mutationen bei Mäusen haben gezeigt, dass Wnts für die Gehirnentwicklung (McMahon und Bradley, Cell 62, 1073–1085 (1990); Thomas und Cappechi, Nature 346, 847–850 (1990)) und die Protuberanz von embryonalen Primordia für Niere (Stark et al., Nature 372, 679–683 (1994)), Schwanzknospe (Takada et al., Genes Dev. 8, 174–189 (1994)) und Extremitätenknospe (Parr und McMahon, Nature 374, 350–353 (1995)) essentiell sind. Überexpression von Wnts in der Brustdrüse kann zu Brustdrüsen- Hyperplasie (McMahon, oben (1992); Nusse und Varmus, oben (1992)) und vorzeitiger Alveolarentwicklung (Bradbur et al., Dev. Biol. 170, 553–563 (1995)) führen. Es ist noch nicht nahe gelegt oder in Erwägung gezogen worden, dass Wnts bei der Säugetier-Hämatopoese eine Rolle spielen könnten.
  • Wnt-5a und Wnt-5b werden im posterioren und lateralen Mesoderm und dem extraembryonalen Mesoderm des Tag-7-8-Mäuseembryos exprimiert (Gavin et al., oben (1990)). Diese embryonalen Domänen tragen zur AGM-Region und Dottersack-Geweben bei, von denen multipotente hämatopoetische Vorläufer und HSCs abgeleitet sind (Dzierzak und Medvinsky, oben (1995); Zon, oben (1995); Kanatsu und Nishikawa, Development 122, 823–830 (1996)). Wnt-5a, Wnt-10b und andere Wnts sind in Extremitätenknospen nachgewiesen worden, was auf mögliche Rollen bei der Entwicklung und Musterung der frühen Knochen-Mikroumgebung hinweist, wie für Wnt-7b gezeigt (Gavin et al., oben (1990); Christiansen et al., Mech. Devel. 51, 341–350 (1995); Parr und McMahon, oben (1995)).
  • D. HÄMATOPOETISCHE ERKRANKUNGEN UND STÖRUNGEN
  • Chemo- und Strahlentherapien verursachen dramatische Reduktionen von Blutzellen-Populationen bei Krebspatienten. Jährlich unterziehen sich in den USA und Europa zumindest 500.000 Krebspatienten einer Chemotherapie und Strahlentherapie, und dazu kommen weitere 200.000 in Japan. Knochenmarkstransplantationstherapie, die bei aplastischer Anämie, primärer Immundefizienz und akuter Leukämie (nach Gesamtkörperbestrahlung) wertvoll ist, kommt in der Medizin in immer größerem Umfang zur Anwendung. Jedes Jahr erhalten zumindest 15.000 Amerikaner Knochenmarkstransplantate. Andere Erkrankungen können eine Reduktion der gesamten oder bestimmter Blutzelllinien verursachen. Beispiele für diese Zustände sind Anämie (einschließlich makrozytischer und aplastischer Anämie); Thrombozytopenie; Hypoplasie; Immun-(Autoimmun-) thrombozytopenische Purpura (ITP); und HIV-induzierte ITP.
  • Es sind pharmazeutische Produkte erforderlich, die die Wiederherstellung von Blutzellen-Populationen dieser Patienten verbessern können.
  • Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung der Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung von primitiven hämatopoetischen Zellen bereitzustellen. Ein derartiges Verfahren kann nützlich sein, um die Repopulation von hämatopoetischen Stammzellen und somit reifen Blutzelllinien zu verbessern. Das ist wünschenswert, wenn ein Säugetier als Folge von Krankheit, Strahlen- oder Chemotherapie eine Verringerung von hämatopoetischen oder reifen Blutzellen erlitten hat. Dieses Verfahren ist auch nützlich, um aus derartigen hämatopoetischen Zellen ex vivo erweiterte Populationen solcher Stammzellen und reifer Blutzelllinien zu erzeugen.
  • Diese und andere Ziele werden Fachleuten angesichts der gesamten Beschreibung klar sein.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die erfindungsgemäße Entdeckung, dass Wnt-Polypeptide („Wnts"), wie Wnt-5a, eine Rolle bei de Hämatopoesie spielen. Gemäß einem anderen Aspekt basiert die vorliegende Erfindung auf der Beobachtung, dass derartige Wnts als hämatopoetische regulierende Faktoren fungieren und fähig sind, die Proliferation hämatopoetischer Stammzellen direkt zu stimulieren, die Bildung multizellularer Aggregate oder „ Foci" primitiver Blastzellen auszulösen und die Gesamtzahl an multipotentialen Kolonie-bildenden Zellen über Rezeptor-Signalisierung zu erhöhen. Wnts schienen direkt auf der Ebene des frühen hämatopoetischen Vorläufers (d. h. hämatopoetischer Stamm-/Progenitor-Zellen) zu wirken. Eine solche erweiterte Stammzellenpopulation kann als Quelle von Zellen für Myelopoesie, Erythropoesie (z. B. Milz-Erythropoese) und Lymphopoesie dienen. Demgemäß können Wnts verwendet werden, um die Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung von hämatopoetischen Stamm-/Progenitor-Zellen in vitro oder in vivo zu stimulieren (um beispielsweise hämatopoetische Erkrankungen oder Störungen zu behandeln).
  • Somit stellt die Erfindung ein In-vitro-Verfahren zur Verbesserung der Proliferation, Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung einer Zelle mit einem Wnt-Polypeptid bereit, umfassend den Schritt des Kontaktierens der Zelle mit einer Menge an Wnt-Polypeptid, die die Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung (z. B. das Überleben) der Zelle wirksam stimuliert. Gemäß bevorzugter Ausführungsformen ist die Zelle, auf die das Wnt-Polypeptid einwirkt, ein hämatopoetischer Vorläufer, z. B. eine hämatopoetische Stamm-/Progenitor-Zelle. Beispielsweise kann das Wnt-Polypeptid Wnt-1, Wnt-5a oder Wnt-10b sein. Zur Verwendung in vivo kann das gewählte Wnt-Polypeptid ein Derivat mit langer Halbwertszeit sein, beispielsweise von einem Wnt-5a-Polypeptid wie Wnt-5a-Immunglobulin-Chimäre und/oder Wnt-5a-Polypeptid sein, das mit einem nicht-proteinartigen Polymer, wie Polyethylenglykol (PEG), modifiziert ist. Das hierin erörterte Verfahren kann zu einer Zunahme der Proliferation und/oder Differenzierung von Lymphoid-, Myeloid- und/oder Erythroid-Blutzelllinien aus der erhaltenen oder erweiterten hämatopoetischen Stamm/Progenitor-Zellpopulation führen. Zur Verwendung in vitro kann die durch Wnts stimulierte Zelle in Zellkultur vorliegen. Die Erfindung sieht auch die Verwendung eines Human-Wnt-Polypeptids bei der Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Proliferation, Differenzierung oder Aufrechterhaltung einer hämatopoetischen Stamm/Progenitor-Zelle bei einem Menschen vor. Die Zelle kann bei einem Säugetier vorliegen, insbesondere einem Menschen (z. B. einem Patienten, der an verringerten Blutmengen leidet und der von einer Zunahme verschiedener Blutzellen profitieren könnte). Potentielle Patienten sind jene, die Chemo- oder Strahlentherapie oder Knochenmarkstransplantationstherapie erhalten haben. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Repopulation von Blutzellen (z. B. Erythroid-, Myeloid- und/oder Lymphoid-Blutzellen) bei einem Säugetier bereit, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an Wnt-Polypeptid an das Säugetier umfasst.
  • Säugetiere, die von einer Verbesserung der Lymphopoesie profitieren können, sind jene, die eine Neigung zu einer oder mehreren der folgenden exemplarischen Zustände haben oder daran leiden: Lymphocytopenie; Lymphorrhea; Lymphostase; Immundefizienz (z. B. HIV und AIDS); Infektionen (darunter beispielsweise opportunistische Infektionen und Tuberkolose (TB)); Lupus; und andere Störungen, die durch Lymphozyten-Mangel charakterisiert sind. Eine wirksame Menge des Wnt-Polypeptids kann bei einem Verfahren zur Immunpotenzierung oder zur Verbesserung der Immunfunktion bei einem Säugetier verwendet werden.
  • Erkrankungen oder Störungen, bei denen eine Steigerung der Erythropoesie vorteilhaft sein kann, sind, ohne darauf beschränkt zu sein: Erythrocytopenie; erythrodegenerative Störungen; Erythroblastopenie; Leukoerythroblastosie; Erythroklasie; Thalassemi; und Anämie (z. B. hämolytische Anämie, wie erworbene, Autoimmun- oder mikroangiopathische hämolytische Anämie; aplastische Anämie; kongenitale Anämie, wie z. B. kongenitale dyserythropoetische Anämie, kongenitale hämolytische Anämie oder kongenitale hypoplastische Anämie; dyshämopoetische Anämie; Faconi-Anämie; genetische Anämie; hämorrhagische Anämie; hyperchrome oder hypochrome Anämie; ernährungsbedingte, hypoferrische oder Eisenmangel-Anämie; hypoplatische Anämie; infektiöse Anämie; Blei-Anämie; lokale Anämie; makrozytische oder mikrozytische Anämie; maligne oder perniziöse Anämie; megaloblastische Anämie; molekulare Anämie; normozytische Anämie; physiologische Anämie; traumatische oder posthämorrhagische Anämie; refraktäre Anämie; Strahlen-Anämie; Sichelzellen-Anämie; Milz-Anämie; sowie toxische Anämie).
  • Eine Steigerung der Myelopoesie kann bei jeder der oben genannten Erkrankungen oder Störungen sowie bei den folgenden exemplarischen Leiden vorteilhaft sein: Myelofibrose; Thrombocytopenie; Hypoplasie; Verbrauchskoagulopathie (DIC); Immun- (Autoimmun-) thrombocytopenische Purpura (ITP); HIV-induzierte ITP; Myelodysplasie; thrombozytotische Erkrankungen und Thrombozytose.
  • Das Verfahren kann weiters das Einwirkenlassen eines oder mehrerer anderer Cytokine (z. B. Linien-spezifischer Cytokine) auf hämatopoetische Zellen umfassen (gleichgültig, ob diese in Zellkultur oder in einem Säugetier vorliegen), und das kann zu einer synergistischen Verbesserung der Proliferation und/oder Differenzierung der Zellen führen. Beispiele für Cytokine sind Thrombopoietin (TPO; Erythropoietin (EPO); Makrophagen-Kolonie-Stimulationsfaktor (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); Granulozyten-CSF (G-CSF); Interleukin-1 (IL-1); IL-1a; IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9; IL-11; IL-10; IL-12; Leukämie-Hemmfaktor (LIF) oder Kit-Ligand (KL). Bei dieser Ausführungsform kann das Einwirkenlassen des Cytokins dem Einwirkenlassen des Wnt-Polypeptids vorangehen, gleichzeitig damit stattfinden oder ihm folgen. Vorzugsweise werden das Wnt-Polypeptid und ein oder mehrere weitere Cytokine dem Patienten gleichzeitig verabreicht (wenn es sich um ein In-vivo-Verfahren handelt), und gegebenenfalls werden sie kombiniert, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden.
  • Zur Verwendung bei den obigen Verfahren stellt die Erfindung auch eine Fertigware bereit, die Folgendes umfasst: einen Behälter, ein Etikett auf dem Behälter und eine Zusammensetzung, die einen im Behälter enthaltenen Wirkstoff umfasst, worin die Zusammensetzung wirksam die Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung von hämatopoetischen Stamm-/Progenitor-Zellen in einem Säugetier verbessert, das Etikett anzeigt, dass die Zusammensetzung zur Verbesserung der Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung dieser Zellen verwendet werden kann und der Wirkstoff in der Zusammensetzung ein Wnt-Polypeptid ist. Gegebenenfalls umfasst die Fertigware einen oder mehrere weitere Behälter, die ein oder mehrere weitere Cytokine) in einer abgepackten Kombination mit dem das Wnt-Polypeptid beinhaltenden Behälter beinhalten.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann eine wirksame Menge des Wnt-Polypeptids verwendet werden, um das Transplantieren bei Knochenmarkstransplantation zu verbessern oder die Mobilisierung und/oder Ausdehnung von hämatopoetischen Stamm zellen bei einem Säugetier vor dem Ernten hämatopoetischer Progenitoren aus ihrem peripheren Blut zu stimulieren.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Graph, der Wnts-Förderung von Zell-Proliferation in Suspensionskulturen von flASK-Zellen zeigt. Die Vervielfachung der Zellanzahl nach Kultur für 7 Tage wird gezeigt. Kulturen wurden mit flASK-Zellen (5.000/Napf), 25 ng/ml KL und konditionierten Medien (CM) aus 293 mit Kontrollplasmid, Wnt-1, Wnt-5a (gDWnt5aHis6) oder Wnt-10b transfizierten Zellen initiiert. Die Tests wurden doppelt durchgeführt und in zwei unabhängigen Versuchen wiederholt.
  • 2A, B und C sind Graphen, die die Wnts-Förderung von erhöhter Vervielfachung und Kolonie-Bildung aus flASK-Zellen zeigen. 2A zeigt das/die verbesserte Überleben/Proliferation von flASK-Zellen nach Transduktion mit dem Wnt5a/LNL6-Retrovirus. Transduktionen wurden mit 100.000 Zellen/ml in IL-3, IL-6 und KL initiiert. Die Vervielfachung für LNL6- oder Wnt5a/LNL6-behandelten Zellen wurde aufgrund von Zellzählungen am Ende des Transduktionszeitraums (48 h) bestimmt und viermal wiederholt. 2B zeigt, dass Suspensionskultur von Wnt5a/LNL6-transduzierten Zellen für 7 Tage im Vergleich zu LNL6-behandelten Kulturen zu umfassender Ausdehnung führte. 2C zeigt die Kolonie-Bildung aus flASK-Zellen nach eine 48-stündigen Transduktion mit LNL6 oder Wnt5a/LNL6. Die Zellen wurden vierfach in Myeloid-Methylcellulose plattiert, das Wachstum wurde nach Tag 12 der Kultur beurteilt, und es wurde in vier unabhängigen Versuchen wiederholt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Eine Suche zur Findung neuer Selbsterneuerungsfaktoren durch Untersuchungen an der embryonalen und fötalen hämatopoetischen Mikroumgebung hat zu der Entdeckung geführt, dass Wnt-Polypeptide eine neue Klasse von Stammzellen-Regulatoren umfassen und die umfassende Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung von kultivierten hämatopoetischen Stamm-/Progenitor-Zellen direkt stimulieren. Wnt-Polypeptide sind somit in vivo oder ex vivo nützlich, um die Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung von hämatopoetischen Stamm-/Progenitor-Zellen zu verbessern, die Population dieser Zellen auszudehnen und die Repopulation derartiger Zellen und von Blutzellen von Mehrfach-Linien bei einem Säugetier zu erhöhen.
  • I. Definitionen
  • Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe eingesetzt, und sie sind wie nachstehend angeführt zu definieren.
  • Die Begriffe „Wnts" oder „Wnt-Genprodukt" oder „Wnt-Polypeptid", wie sie in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, umfassen Wnt-Polypeptide nativer Sequenz, Wnt-Polypeptidvarianten, Wnt-Polypeptidfragmente und chimäre Wnt-Polypeptide. Gegebenenfalls ist das Wnt-Polypeptid nicht mit nativer Glykosylierung verbunden. „Native Glykosylierung" bezieht sich auf die Kohlenhydrat-Gruppierungen, die kovalent an Wnt-Polypeptid gebunden sind, wenn es in der Säugetierzelle erzeugt wird, aus der es in der Natur stammt. Demgemäß ist ein Human-Wnt-Polypeptid, das in einer nichthumanen Zelle erzeugt wird, ein Beispiel für ein Wnts, das „nicht mit nativer Glykosylierung verbunden" ist. Manchmal ist das Wnt-Polypeptid unglykosyliert (z. B. als Ergebnis dessen, dass es in einem Prokaryoten rekombinant erzeugt wird).
  • Ein Polypeptid „nativer Sequenz" ist eines, das die gleiche Aminosäuresequenz aufweist wie ein Polypeptid (z. B. Wnt-Polypeptid), das aus der Natur stammt. Derartige Polypeptide nativer Sequenz können aus der Natur isoliert werden oder können durch rekombinante oder synthetische Mittel erzeugt werden. Somit kann ein Polypeptid nativer Sequenz die Aminosäuresequenz von natürlich vorkommendem Human-Polypeptid, Mäuse-Polypeptid oder Polypeptid von einer anderen Säugetier-Spezies aufweisen.
  • Der Begriff „Wnt-Polypeptid nativer Sequenz" umfasst jene Wnt-Polypeptide von einer Tierspezies (z. B. Mensch, Maus, Kaninchen, Katze, Kuh, Schaf, Huhn, Schwein, Pferd usw.) wie sie in der Natur vorkommen. Die Definition umfasst spezifisch Human-Wnt-Polypeptide, Wnt-1, -2, -3, -4, -5a, -7a und -7b, sowie Mäuse-Wnt-Polypeptide, Wnt-1, -2, -3a, -3b, -4, -5a, -5b, -6, -7a, -7b, -8a, -8b, -10b, -11 und -12. Der Begriff „Wnt-Protein nativer Sequenz" umfasst die nativen Proteine mit oder ohne das N-terminale Anfangs-Methionin (Met) und mit oder ohne der nativen Signalsequenz. Die Humanund Mäuse-Wnt-Polypeptide nativer Sequenz, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, weisen in ihrer unbearbeiteten Form eine Länge von etwa 348 bis etwa 389 Aminosäuren auf, was Variabilität widerspiegelt (insbesondere am schlecht konservierten Amino-Terminus und mehreren inneren Stellen), enthalten 21 konservierte Cysteine und weisen die Merkmale eines sekretierten Proteins auf (siehe beispielsweise Wnt-Polypeptide wie in Gavin et al., oben; Lee et al., oben; Christiansen et al., oben; PCT/US94/140708 (WO 95/17416)). Das Molekulargewicht eines Wnt-Polypeptids beträgt in einer monomeren Form etwa 38 bis 42 kD.
  • Mit einem „Varianten-" Polypeptid ist ein biologisch aktives Polypeptid wie nachstehend definiert gemeint, das weniger als 100% Sequenzidentität mit einem Polypeptid nativer Sequenz aufweist. Derartige Varianten sind Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurerest(e) am N- oder C-Terminus oder innerhalb der nativen Sequenz hinzugefügt sind; von etwa 1 bis 40 Aminosäurereste deletiert und gegebenenfalls durch einen oder mehrere Aminosäurereste substituiert sind; sowie Derivate der obigen Polypeptide, worin ein Aminosäurerest kovalent modifiziert worden ist, so dass das resultierende Produkt eine nicht natürlich vorkommende Aminosäure aufweist. Üblicherweise weist eine biologisch wirksame Wnt-Variante eine Aminosäuresequenz auf, die zumindest etwa 90 Aminosäuresequenzidentität mit einem Wnt-Polypeptid nativer Sequenz aufweist, vorzugsweise zumindest etwa 95%, und mehr bevorzugt zumindest etwa 99%.
  • Ein „chimäres" Wnt-Polypeptid ist ein Polypeptid, bei dem ein Wnt-Polypeptid oder ein Abschnitt (z. B. eine oder mehrere Domänen) davon an heterologes Polypeptid fusioniert oder gebunden ist. Das chimäre Wnt-Polypeptid hat im Allgemeinen zumindest eine biologische Eigenschaft mit einem Wnt-Polypeptid nativer Sequenz, wie Wnt-5a, gemeinsam. Beispiele für chimäre Polypeptide sind Immunoadhäsine und Epitop-markierte Polypeptide.
  • Der Begriff „Wnt-Immunoadhäsin" wird austauschbar mit dem Ausdruck „Wnt-Polypeptid-Immunglublin-Chimäre" verwendet und bezeichnet ein chimäres Molekül, das einen Abschnitt des Wnt-Polypeptids mit einer Immunglobulinsequenz kombiniert. Die Immunglobulinsequenz ist vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, eine konstante Immunglobulin-Domäne. Die Immunglobulin-Gruppierung in den Chimären gemäß vorliegender Erfindung kann von IgG1-, IgG2-, IgG3- oder IgG4-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM, aber vorzugsweise IgG1 oder IgG3, erhalten werden.
  • Der Begriff „ Epitop-markiert", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein chimäres Polypeptid, bei dem ein Wnt-Polypeptid oder ein Abschnitt davon an ein „Markierungspolypeptid" fusioniert ist. Das Markierungspolypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper dagegen hergestellt werden kann, ist jedoch kurz genug, damit es die biologische Wirkung des Wnt-Polypeptids nicht stört. Das Markierungspolypeptid ist vorzugsweise ebenfalls ziemlich einzigartig, so dass der Antikörper dagegen im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Markierungs-Polypeptide weisen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa 6 und 60 Aminosäurereste auf.
  • „Isoliertes" Wnt-Polypeptid bedeutet, dass es aus einer Wnts-Quelle gereinigt worden ist oder durch rekombinante oder synthetische Verfahren hergestellt worden ist und ausreichend frei von anderen Peptiden oder Proteinen ist, um (1) zumindest 15 und vorzugsweise 20 Aminosäurereste der N-terminalen oder einer internen Aminosäuresequenz zu erhalten, indem ein Spinning-Cup-Sequenator oder der beste im Handel erhältliche Aminosäure-Sequenator auf dem Markt verwendet oder wie durch zum Anmeldedatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlichte Verfahren modifiziert wird, oder (2) bis zur Homogenität durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Einsatz von Coomassie-Blue oder, vorzugsweise Silberfarbe. Homogenität bedeutet hier weniger als etwa 5% Verunreinigung mit anderen Quellen-Proteinen.
  • Mit „im Wesentlichen reines" Protein ist eine Zusammensetzung gemeint, die zumindest etwa 90 Gew.-% des Proteins umfasst, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise zumindest etwa 95 Gew.-%. Mit „im Wesentlichen homogenes" Protein ist eine Zusammensetzung gemeint, die zumindest etwa 99 Gew.-% Protein, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, umfasst.
  • „Biologische Eigenschaft" bedeutet bei Verwendung in Zusammenhang mit „Wnt-Polypeptid" oder „ isoliertes Wnt-Polypeptid", dass es eine Effektor-Funktion aufweist, die direkt oder indirekt durch Wnt-Polypeptid nativer Sequenz, wie Wnt-5a, verursacht oder erfüllt wird. Zur Effektor-Funktion von Wnt-Polypeptiden nativer Sequenz gehören die Verbesserung der Differenzierung und/oder Proliferation und/oder Aufrechterhaltung von hämatopoetischen/Progenitor-Zellen (z. B. wie in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Tests bestimmt). Ein „biologisch wirksames Wnt-Polypeptid" ist eines, das eine biologische Eigenschaft von Wnt-Polypeptid nativer Sequenz aufweist.
  • Ein „funktionelles Derivat" eines Wnt-Polypeptids nativer Sequenz ist eine Verbindung, die eine qualitative biologische Eigenschaft mit einem Wnt-Polypeptid nativer Sequenz gemeinsam hat. „ Funktionelle Derivate" umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fragmente einer nativen Sequenz und Derivate eines Wnt-Polypeptids nativer Sequenz und seiner Fragmente, mit der Maßgabe, dass sie mit einem entsprechenden Wnt-Polypeptid nativer Sequenz eine biologische Wirkung gemeinsam haben. Der Begriff „ Derivat" umfasst sowohl Aminosäuresequenzvarianten von Wnt-Polypeptid als auch kovalente Modifikationen davon.
  • Der Ausdruck „lange Halbwertszeit", wie in Verbindung mit Wnt-Polypeptiden verwendet, betrifft Wnt-Derivate mit einer längeren Halbwertszeit im Plasma und/oder einer langsameren Clearance als ein entsprechendes Wnt-Polypeptid nativer Sequenz. Die Derivate mit langer Halbwertszeit weisen vorzugsweise eine Halbwertszeit auf, die zumindest etwa 1,5 Mal länger als die eines nativen Wnt-Polypeptids ist; mehr bevorzugt zumindest etwa zwei Mal länger als die eines nativen Wnt-Polypeptids, mehr bevorzugt zumindest etwa drei Mal länger als die eines nativen Wnt-Polypeptids.
  • „Prozentuelle Aminosäuresequenzidentitität" ist hierin als der Prozentsatz an Aminosäureresten in der Kandidaten-Sequenz definiert, die mit den Resten in der nativen Sequenz identisch sind, nachdem die Sequenz ausgerichtet und, falls erforderlich, Zwischenräume eingeführt worden sind, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erreichen, und ohne Berücksichtigung irgendwelcher konservativen Substitutionen als Teil der Sequenz-Identität. Keine der N-terminalen, C-terminalen oder internen Extensionen, Deletionen oder Insertionen in die Kandidaten-Sequenz sind als Sequenzidentität oder Homologie beinträchtigend anzusehen.
  • Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezeichnet DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen Kodierungssequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Zu den Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, gehören beispielsweise ein Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosom-Bindungsstelle und möglicherweise andere bisher noch kaum erforschte Sequenzen. Es ist bekannt, dass eukaryotische Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer einsetzen.
  • Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht ist. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine Kodierungssequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine Kodierungssequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an zweckmäßigen Restriktionsstellen erreicht. Wenn derartige Stellen nicht vorliegen, werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
  • Im Zusammenhang mit der Erfindung werden die Ausdrücke „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" austauschbar verwendet, wobei alle Bezeichnungen auch die Nachkommenschaft umfassen. So umfassen die Ausdrücke „Transformanten" und „transformierte Zellen" oder „Tranfektanden" und „transfizierte Zellen" die primäre gegenständliche Zelle und davon abgeleitete Kulturen unabhängig von der Anzahl an Transfers. Man beachte auch, dass die gesamte Nachkommenschaft hinsichtlich des DNA-Gehalts aufgrund absichtlicher oder unbeabsichtigter Mutationen möglicherweise nicht genau identisch ist. Mutanten der Nachkommenschaft, welche die gleiche Funktion oder biologische Wirkung aufweisen, bezüglich der in den ursprünglich transformierten Zellen gescreent wird, sind ebenfalls umfasst. Wo bestimmte Bezeichnungen erwünscht sind, geht das aus dem Kontext hervor.
  • Der Begriff „Antikörper" wird im allgemeinsten Sinn verwendet und umfasst spezifisch monoklonale Antikörper, Antikörper-Zusammensetzungen mit polyepitopische Spezifität, bispezifische Antikörper, Diakörper und Einzelketten-Moleküle sowie Antikörper-Fragmente (z. B. Fab, F(ab)2 und Fv), solange sie die erwünschte biologische Wirkung aufweisen.
  • Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population im Wesentlichen homogener Antikörper erhalten wird, d. h. dass die einzelnen die Population umfassenden Antikörper bis auf mögliche natürlich vor kommende Mutationen identisch sind, die in geringem Ausmaß auftreten können. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch und gegen eine einzelne Antigen-Stelle gerichtet. Außerdem ist im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise unterschiedliche, gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtete Antikörper enthalten, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet. Neben ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper insofern vorteilhaft, als sie durch die Hybridom-Kultur synthetisiert werden, nicht verunreinigt durch andere Immunglobuline. Das Adjektiv „monoklonal" gibt an, dass der Antikörper das Merkmal aufweist, von einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten worden zu sein, und ist nicht so zu verstehen, dass die Produktion des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren erforderlich ist. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung durch das Hybridom-Verfahren hergestellt werden, das erstmals von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben worden ist, oder sie können durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.816.567 (Cabilly et al.)). Die „monoklonalen Antikörper" können auch von Phagenantikörperbibliotheken isoliert sein, wobei beispielsweise die Techniken in Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), verwendet werden.
  • Die monoklonalen Antikörper umfassen gemäß vorliegender Erfindung spezifisch „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Abschnitt der Schwer- und/oder Leichtkette mit entsprechenden Sequenzen in Antikörpern identisch oder dazu homolog ist, die von einer bestimmten Spezies stammen oder zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern gehören oder dazu homolog sind, die von einer anderen Spezies stammen oder zu einer anderen Antikörper-Klasse oder -Unterklasse gehören, sowie Fragmente derartiger Antikörper, so lange sie die erwünschte biologische Wirkung aufweisen (Cabilly et al., oben; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)).
  • „Humanisierte" Formen nichtmenschlicher (z. B. Mäuse-) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder andere Antigen-Bindungs-Subsequenzen von Antikörpern), die einen minimalen Anteil an Sequenzen aus nichtmenschlichem Immunglobulin enthalten. Zumeist sind humanisierte Antikörper Human-Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste von einer Komplementärbestimmungsreaktion (CDR) des Rezipienten durch Reste aus einer CDR einer nicht menschlichen Spezies (Donor-Antikörper), wie z. B. einer Maus, einer Ratte oder eines Kaninchens mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität, ersetzt sind. In einigen Fällen sind Fv-Rahmenregion-(FR-)Reste des Human-Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Außerdem können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipienten-Antikörper noch in den importierten CDR- oder Rahmensequenzen zu finden sind. Diese Modifizierungen werden vorgenommen, um die Antikörperleistungsfähigkeit weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alles von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen aus einer nichtmenschlichen Immunglobulinsequenz entsprechen. Der humanisierte Antikörper umfasst im Optimalfall auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jene eines Human-Immunglobulins. Weitere Details sind Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992) zu entnehmen. Der humanisierte Antikörper umfasst einen Primatized®-Antikörper, worin die Antigen-Bindungsregion des Antikörpers von einem Antikörper stammt, der durch das Immunisieren von Makakenaffen mit dem Antigen von Interesse erzeugt worden ist.
  • „Bei einem Menschen nicht immunogen" bedeutet, dass beim Kontaktieren des Polypeptids von Interesse in einem physiologisch annehmbaren Träger und in einer therapeutisch wirksamen Menge mit dem entsprechenden Gewebe eines Menschen bei der zweiten Verabreichung des Polypeptids von Interesse nach einem angemessenen La tenzzeit (z. B. 8 bis 14 Tage) kein Zustand der Empfindlichkeit auf das oder Resistenz zum Polypeptid von Interesse auftritt.
  • Die Formulierung „Verbesserung der Proliferation einer Zelle" umfasst den Schritt des Erhöhens des Ausmaßes an Wachstum und/oder Reproduktion der Zelle in Bezug auf eine unbehandelte Zelle in vitro oder in vivo. Eine Zunahme der Zell-Proliferation in Zellkultur kann ermittelt werden, indem die Anzahl an Zellen vor und nach dem Einwirkenlassen eines Moleküls von Interesse gezählt wird. Das Ausmaß der Proliferation kann durch mikroskopische Untersuchung des Konfluenzgrades quantifiziert werden. Zell-Proliferation kann auch unter Verwendung eines Thymidin-Aufnahme-Tests quantifiziert werden.
  • Mit „Verbesserung der Differenzierung einer Zelle" ist der Vorgang gemeint, dass das Ausmaß des Erwerbs oder des Verfügens über eine oder mehrere Eigenschaften oder Funktionen erhöht wird, die sich von jener der ursprünglichen Zelle unterschieden (d. h. Zell-Spezialisierung). Das kann durch Screenen auf eine Änderung im Phänotyp der Zelle (z. B. Identifizieren morphologischer Veränderungen in der Zelle und/oder Oberflächenmarkern auf der Zelle) ermittelt werden.
  • Mit „Verbesserung des Überlebens oder Erhaltens einer Zelle" ist der Schritt des Erhöhens des Ausmaßes des Verfügens über eine oder mehrere Eigenschaften) oder Funktion(en) gemeint, die gleich zu jenen der ursprünglichen Zelle sind (d. h. Zell-Phänotyp-Erhaltung). Das kann durch Screenen auf den Erhalt des Phänotyps der Zelle (z. B. Blastzellphänotyp wie in Beispiel 2) ermittelt werden.
  • Eine „hämatopoetische Stamm-/Progenitor-Zelle" oder „primitive hämatopoetische Zelle" ist eine, die differenziert werden kann, um einen stärker spezialisierten oder reiferen Blutzellentyp zu bilden.
  • Eine „hämatopoetische Stammzelle" oder „Stammzelle" ist eine, die spezifisch zum langfristigen Transplantieren auf einen letal bestrahlten Wirt fähig ist.
  • „Lympoid-Blutzelllinien" sind jene hämatopoetischen Vorläuferzellen, die zur Differenzierung fähig sind, um Lymphozyten (B-Zellen oder T-Zellen) zu bilden. Gleichermaßen meint „Lymphopoese" die Bildung von Lymphozyten.
  • „Erythroid-Blutzelllinien" sind jene hämatopoetischen Vorläuferzellen, die zur Differenzierung fähig sind, um Erythrozyten (rote Blutzellen) zu bilden, und „Erythropoese" ist die Bildung von Erythrozyten.
  • Die Formulierung „Myeloid-Blutzelllinien" umfasst gemäß vorliegender Erfindung alle hämatopoetischen Vorläuferzellen mit Ausnahme von Lymphoid- und Erythroid-Blutzellen wie oben definiert, und „Myelopoese" umfasst die Bildung von Blutzellen (mit Ausnahme von Lymphozyten und Erythrozyten).
  • Eine „CD34+-Zellpopulation" ist mit hämatopoetischen Stammzellen angereichert. Eine CD34+-Zellpopulation kann beispielsweise aus Nabelschnur-Blut oder Knochenmark erhalten werden. Human-Nabelschnurblut-CD34+-Zellen können unter Einsatz von immunmagnetischen Perlen, die von Miltenyi (Kalifornien, USA) verkauft werden, nach Anleitung des Herstellers selektiert werden.
  • Eine „AA4+-Zellpopulation" ist mit hämatopoetischen Stammzellen angereichert. Eine AA4+-Zellpopulation kann beispielsweise von Fötalleber erhalten werden. AA4+-Zellen können durch immunadhärentes Schwenken, beispielsweise mit einem Antikörper wie AA4.1, erhalten werden.
  • Eine „ LinIoSca+-Zellpopulation" oder „AA4+CSca+-Zellpopulation" ist mit hämatopoetischen Stammzellen angereichert. Derartige Populationen können beispielsweise von Knochenmark und Fötalleber erhalten werden. LinIoSca+-Zellen oder AA4+Sca+-Zellen können durch Zellsortierung nach dem Färben mit einem Antikörper gegen das Sca-1-Antigen (Ly6A/E) ausgewählt werden, beispielsweise dem Ly6A/E-Phycoerythrinkonjugat von Pharmingen (San Diego, CA, USA).
  • Eine „flASK-Zellpopulation" ist in hohem Maße mit hämatopoetischen Stammzellen von Fötalleber angereichert. Eine flASK-Zelle ist eine Fötalleber-, AA4+-, Sca+-, kit+-Zelle. FIASK-Zellen können durch Zellsortierung nach dem Färben ausgewählt werden, beispielsweise mit Antikörpern.
  • „Physiologisch annehmbare" Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind solche, die für die Zelle oder das Säugetier, auf die bzw. das sie einwirken, in den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger sind Puffer, wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Oxidationshemmer, darunter Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (unter etwa 10 Resten); Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Dissacharide und andere Kohlenhydrate, darunter Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie EDTA; Zuckeralkohole, wie Mannit oder Sorbit; Salz-bildende Gegenionen, wie Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
  • Der Begriff „Cytokin" ist ein generischer Ausdruck für von einer Zellpopulation freigesetzte Proteine, die als interzellulare Mediatoren auf eine andere Zelle wirken. Beispiele für derartige Cytokine sind Lymphokine, Monokine, Wachstumsfaktoren und herkömmliche Polypeptidhormone. Zu den Cytokinen gehören Wachstumshormone, wie Human-Wachstumshormon, N-Methionyl-Human-Wachstumshormon und Rinder-Wachstumshormon; Parathormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glycoproteinhormone, wie Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSN), und Luteinisierendes Hormon (LH); hepatischer Wachstumsfaktor; Fibro blast-Wachstumsfaktor; Prolactin, Plazenta-Lactogen; OB-Protein, Tumorfaktorsefaktor-α und -β; Mullerian Inhibiting Factor; Mäuse-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; Inhibin; Activin, Gefäßendothelwachstumsfaktor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nervenwachstumsfaktoren, wie NGF-β; Blutplättchen-Wachstumsfaktor; Transformationswachstumsfaktoren (TGFs), wie TGF-α und TGF-β; Insulin-artiger Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoietin (EPO); osteoinduktive Faktoren; Interferone, wie Interferon-α, -β und -γ; Kolonie-Stimulationsfaktoren (CSFs), wie Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulozyt-Makrophagen-CSF (GM-CSF); und Granulozyt-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs) wie IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; und andere Polypeptidfaktoren, darunter Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und Kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet umfasst der Begriff Cytokin Proteine von natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Äquivalente der Cytokine nativer Sequenz.
  • Ein „Linien-spezifisches Cytokin" ist eines, das auf relativ spezialisierte Zellen in der hämatopoetischen Kaskade wirkt und eine Ausdehnung der Blutzellen einer einzigen Linie veranlasst. Beispiele für derartige Cytokine sind EPO, TPO und G-CSF.
  • „Behandlung" bezeichnet sowohl die therapeutische Behandlung als auch prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Zu denen, die Behandlung benötigen, gehören jene, die bereits an der Krankheit oder Störung leiden, sowie jene, bei denen gegen die Krankheit oder Störung vorgebeugt werden soll.
  • „Säugetier" umfasst für die Zwecke der Behandlung jedes Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- oder Nutztiere, sowie Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Kühe usw. Vorzugsweise ist das Säugetier hier der Mensch.
  • Mit „fester Phase" ist eine nicht-wässrige Matrix gemein, an der ein Reagens von Interesse (z. B. das Wnt-Polypeptid oder ein Antikörper dagegen) haften kann. Beispiele für feste Phasen, die hier enthalten sind, sind jene, die teilweise oder vollständig aus Glas (z. B. Glas mit regulierter Porengröße), Polysacchariden (z. B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikonen gebildet sind. Bei bestimmten Ausführungsformen kann die feste Phase in Abhängigkeit vom Kontext den Napf einer Testplatte umfassen; bei anderen ist es eine Reinigungssäule (z. B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser Begriff umfasst auch eine diskontinuierliche feste Phase aus diskreten Teilchen, wie sie in US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben werden.
  • II. Arten der Durchführung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung des Einsatzes von Wnt-Polypeptiden zur Verbesserung der Hämatopoese. Die hierin beschriebenen Versuche zeigen, dass Wnts als hämatopoetische Regulierungsfaktoren fungieren, die eine Rolle bei der Verbesserung der Proliferation, Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung von hämatopoetischen Zellen zu spielen scheinen. Insbesondere ist festgestellt worden, dass Wnts in angereicherten Human-Stammzellenpopulationen vorhanden sind, und Wnts können verwendet werden, um die Proliferation von hämatopoetischen Stammzellen/Progenitorzellen zu stimulieren. Andere Verwendungen für diese Polypeptide gehen aus der nachfolgenden Diskussion hervor. Nachstehend wird beschrieben, wie Wnt-Gene und -Polypeptide hergestellt werden können.
  • A. Herstellung von Wnt-Genen und -Genprodukten
  • Der Großteil der nachstehenden Diskussion betrifft die rekombinante Produktion von Wnt-Genen und -Genprodukten durch Kultivierung von Zellen, die mit einem Vektor transformiert sind, der für Wnt-Polypeptid kodierende Nucleinsäure enthält, und Gewinnung des Polypeptids aus der Zellkultur.
  • 1. Isolation von DNA, die für Wnt-Polypeptid kodiert
  • Die für Wnt-Polypeptid kodierende DNA kann von jeder cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt ist, von dem angenommen wird, dass des die Wnt-Polypeptid-mRNA aufweist und diese in einer nachweisbaren Menge exprimiert. Demgemäß kann Wnt-Polypeptid-DNA zweckmäßig von einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Säugetier-Fötalleber oder -Fötalgehirn hergestellt wurde. das für Wnt-Polypeptid kodierende Gen kann aus einer genomischen Bibliothek oder durch Oligonucleotidsynthese erhalten werden.
  • Bibliotheken werden mit Sonden (wie Antikörpern gegen das Wnt-Polypeptid oder Oligonucleotiden mit etwa 20 bis 80 Basen) gescreent, die dazu bestimmt sind, das Gen von Interesse oder das Protein zu identifizieren, für das es kodiert. Screenen der cDNAoder genomischen Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Einsatz von Standardverfahren durchgeführt werden, wie in Kapitel 10–12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben. Ein alternatives Mittel zum Isolieren des für Wnt-Polypeptid kodierenden Gens besteht darin, PCR-Methodik einzusetzen, wie in Abschnitt 14 von Sambrook et al., oben, beschrieben.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung besteht darin, sorgfältig gewählte Oligonucleotidsequenzen zum Screenen von cDNA-Bibliotheken von verschiedenen menschlichen Geweben, vorzugsweise Human-Fötalleber, zu verwenden. Die als Sonden gewählten Oligonucleotidsequenzen sollten ausreichend lange und ausreichend eindeutig sein, damit falsche Positivergebnisse minimiert werden.
  • Das Oligonucleotid muss so markiert sein, dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek detektiert werden kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren besteht darin, 32P-markiertes ATP mit Polynucleotid-Kinase zu verwenden, wie nach dem Stand der Technik allgemein bekannt ist, um das Oligonucleotid radioaktiv zu markieren. Es können jedoch auch andere Verfahren eingesetzt werden, um das Oligonucleo tid zu markieren, darunter, ohne darauf beschränkt zu sein, Biotynylierung oder Enzymmarkierung.
  • Aminosäuresequenzvarianten von Wnt-Polypeptid werden hergestellt, indem geeignete Nucleotidänderungen in die Wnt-Polypeptid-DNA eingeführt werden, oder durch Synthese des erwünschten Wnt-Polypeptids. Derartige Varianten stellen Insertionen, Substitutionen und/oder spezifizierte Deletionen von Resten innerhalb oder an einem oder beiden Enden der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Human-Wnt-Polypeptids dar. Vorzugsweise stellen diese Varianten Insertionen und/oder Substitutionen innerhalb oder an einem oder beiden Enden der reifen Sequenz und/oder Insertionen, Substitutionen und/oder spezifizierte Deletionen innerhalb oder an einem oder beiden Enden der Signalsequenz des Wnt-Polypeptids dar. Es wird jede beliebige Kombination aus Insertion, Substitution und/oder spezifizierter Deletion durchgeführt, um das fertige Konstrukt zu erhalten, mit der Maßgabe, dass das fertige Konstrukt die erwünschte biologische Wirkung wie hierin definiert aufweist. Die Aminosäure-Änderungen können auch die post-translationalen Verfahren des Wnt-Polypeptids verändern, wie eine Veränderung der Anzahl oder Position der Glycosylierungsstellen, die Änderung der Membran-Verankerungseigenschaften und/oder die Änderung der intrazellulären Position des Wnt-Polypeptids durch Insertion, Deletion oder andere Beeinflussung der Leadersequenz des Wnt-Polypeptids.
  • Variationen in der nativen Sequenz wie oben beschrieben können vorgenommen werden, indem eine der Techniken und Richtlinien für konservative und nicht konservative Mutationen eingesetzt wird, die in US-Patent Nr. 5.364.934 dargelegt sind. Dazu gehören Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. Eine Anleitung zur Selektion von Aminosäuren zum Ändern, Hinzufügen oder Löschen ist beispielsweise auch Tabelle I und der diese Tabelle betreffenden Diskussion zu entnehmen.
  • 2. Insertion von Nucleinsäure in replizierbaren Vektor
  • Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), die für das Wnt-Polypeptid kodiert, wird zur weiteren Klonierung (Amplifizierung der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert. Es stehen viele Vektoren zur Verfügung. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Marker-Gene, ein Verstärkerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • a. Signalsequenzkomponente
  • Das bei Hämatopoese gemäß vorliegender Erfindung nützliche Wnt-Polypeptid kann nicht nur direkt, sondern auch als Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid erzeugt werden, das vorzugsweise eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids ist, rekombinant hergestellt werden. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der Wnt-Polypeptid-DNA sein, der in den Vektor insertiert ist. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz ist vorzugsweise eine, die von der Wirtszelle erkannt und verarbeitet (d. h. durch eine Signal-Peptidase gespalten) wird. Für prokaryotische Wirtszellen, die die native Wnt-Polypeptid-Signalsequenz nicht erkennen und verarbeiten, wird die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz substituiert, die beispielsweise aus der aus basischer Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Für die Hefe-Sekretion kann die native Signalsequenz beispielsweise durch den Hefe-Invertase-Leader, α-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomycesund Kluyveromyces-α-Faktor-Lader, wobei letzterer in dem am 23. April 1991 ausgegebenen US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder saurem Phosphatase-Leader, C. albicans-Gluciamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990), oder dem in der am 15. November 1990 veröffentlichten WO 90/13646 beschriebenen Signal substituiert werden. Bei Säugetier-Zellexpression ist die native Signalsequenz (z. B. die Wnt-Polypeptid-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion von Wnt-Polypeptid aus Human-Zellen in vivo lenkt) zufriedenstellend, es können aber auch andere Säugetier-Signalsequenzen geeignet sein, wie Signalsequenzen von anderem Tier-Wnt-Polypeptid sowie Signalsequenzen von sekretierten Polypeptiden der gleichen oder einer verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader, beispielsweise das Herpes-SimplexgD-Signal.
  • Die DNA für eine solche Vorläuferregion ist in Leserahmen an DNA ligiert, die für das reife Wnt-Polypeptid kodiert.
  • b. Replikationsursprung-Komponente
  • Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren eine, die es dem Vektor ermöglicht, unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und sie umfasst Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Derartige Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren wohlbekannt. Der Replikationsursprung vom Plasmid pBR322 eignet sich für die meisten Gram-negativen Bakterien, der 2-μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen nützlich. Im Allgemeinen ist die Replikationsursprung-Komponente für Säugetier-Expressionsvektoren nicht erforderlich (der SV40-Ursprung kann typischerweise nur verwendet werden, weil er den frühen Promotor enthält).
  • Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle"-Vektoren, d. h. sie sind zur Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen fähig, können aber zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert, und dann wird der gleiche Vektor zur Expression in Hefe- oder Säugetierzellen transfiziert, obwohl er unabhängig vom Wirtszellen-Chromosom nicht replizieren kann.
  • DNA kann auch durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Das lässt sich leicht erreichen, indem Bacillus-Spezies als Wirte verwendet werden, beispielsweise indem in den Vektor eine DNA-Sequenz aufgenommen wird, die zu einer in genomischer Bacillus-DNA gefundenen Sequenz komplementär ist. Die Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor führt zu homologer Rekombination mit dem Genom und Insertion von Wnt-Polypeptid-DNA. Die Gewinnung genomischer DNA, die für Wnt-Polypeptid kodiert, ist jedoch komplexer als jene eines exogen replizierten Vektors, da Restriktionsenzym-Verdau erforderlich ist, um die Wnt-Polypeptid-DNA auszuschneiden.
  • c. Selektionsgenkomponente
  • Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder Wachsen transformierter Wirtszellen erforderlich ist, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet werden. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert sind, der das Selektionsgen enthält, überleben im Kulturmedium nicht. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Widerstand gegen Antibiotika oder andere Toxine verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Defizienzen ausgleichen oder (c) entscheidende Nährstoffe zuführen, die aus komplexen Medien nicht erhältlich sind, z. B. das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodierende Gen.
  • Bei einem Beispiel für ein Selektionsschema wird ein Arzneimittel eingesetzt, um das Züchten einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die erfolgreich mit dem heterologen Gen transformiert werden, erzeugen ein Protein, das Arzneimittel-Resistenz verleiht, und überleben somit die Selektionskur. Bei Beispielen für derartige dominante Selektion werden die Arzneimittel Neomycin, Mycophenolsäure und Hygromycin eingesetzt.
  • Ein weiteres Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugerzellen sind jene, die die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die kompetent für die Aufnahme von Wnt-Polypeptid-Nucleinsäure sind, wie DHFR- oder Thymidin-Kinase. Die Säugetier-Zelltransformanten werden Selektionsdruck ausgesetzt, den allein nur die Transformanten dank der Aufnahme des Markers überleben können. Selektionsdruck wird ausgeübt, indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, in denen die Konzentration an Selektionsmittel im Medium nacheinander verändert wird, was zur Amplifizierung sowohl des Selektionsgens als auch der DNA führt, die für Wnt-Polypeptid kodiert. Amplifizierung ist der Vorgang, durch den Gene, die für die Produktion eines Proteins, das für Wachstum entscheidend ist, stärker benötigt werden, gemeinsam mit den Chromosomen nachfolgender Generationen rekombinanter Zellen wiederholt werden. Erhöhte Mengen an Wnt-Polypeptid werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert. Andere Beispiele für amplifizierbare Gene sind Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Primaten-Metallothioneingene, Adenosin-Desaminase, Ornithin-Decarboxylase usw.
  • Beispielsweise werden Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert sind, zunächst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven DHFR-Antagonisten, enthält. Eine geeignete Wirtszelle beim Einsatz von DHFR der Wildform ist die China-Hamster-Eierstock(CHO-)Zelllinie mit Mangel an DHFR-Aktivität, die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980) hergestellt und vermehrt wird. Auf die transformierten Zellen wirken dann erhöhte Methotrexatmengen ein. Das führt zur Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig mehrerer Kopien anderer DNA, die die Expressionsvektoren umfasst, wie der für Wnt-Polypeptid kodierenden DNA. Diese Amplifizierungstechnik kann bei jedem ansonsten geeigneten Wirt verwendet werden, z. B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet des Vorhandenseins von endogenem DHFR, wenn beispielsweise ein Mutations-DHFR-Gen eingesetzt wird, das in hohem Maße gegen Mtx resistent ist ( EP 117.060 ).
  • Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wirte der Wildform, die endogenes DHFR enthalten), die mit für Wnt-Polypeptid kodierenden DNA-Sequenzen, DHFR-Protein der Wildform und einem anderen selektierbaren Marker, wie Aminoglycosid-3'phosphotransferase (APH), transformiert oder co-transformiert sind, durch Zellwachstum in Medium selektiert werden, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker enthält, wie ein Aminoglycosidantibiotikum, z. B. Kanamycin, Neomycin oder G418. Siehe US-Patent Nr. 4.965.199.
  • Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung bei Hefe ist das trp1-Gen, das in Hefe-Plasmid Yrp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutanten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit zum Wachsen in Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1. Jones, Genetics 85, 12 (1977). Das Vorhandensein der trp1-Läsion im Hefe-Wirtszellengenom stellt dann eine wirksame Umgebung für die Detektion von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit. Auf ähnliche Weise werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte Plasmide ergänzt, die das Leu2-Gen tragen.
  • Außerdem können Vektoren, die vom kreisförmigen Plasmid pKD1 mit 1,6 μm stammen, für die Transformation von Kluyveromyces-Hefen verwendet werden. Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). In jüngerer Vergangenheit wurde ein Expressionssystem für die großangelegte Herstellung von rekombinantem Kalb-Chymosin für K. lactis berichtet. Van denBerg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Mehrkopie-Expressionsvektoren für die Sekretion von reifem rekombinantem Human-Serumalbumin durch industrielle Kluyveromyces-Stämme sind ebenfalls offenbart worden. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991).
  • d. Promotorkomponente
  • Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die Wnt-Polypeptid-Nucleinsäure gebunden ist. Protoren sind stromauf (5') vom Startkodon eines strukturellen Gens (im Allgemeinen im Bereich von etwa 100 bis 1.000 bp) angeordnete untranslatierte Sequenzen, die die Transkription und Translation einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, wie der Wnt-Polypeptid-Nucleinsäuresequenz, steuern, an die sie operabel gebunden sind. Derartige Promotoren fallen typischerweise in zwei Klassen, die der induzierbaren und konstitutiven Promotoren. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die als Reaktionen auf eine bestimmte Änderung der Kulturbedingungen, z. B. das Vorhandensein oder Fehlen eines Nährstoffs oder einer Temperaturveränderung, erhöhte Mengen an Transkription aus DNA unter ihrer Kontrolle in Gang setzen. Es ist bereits eine große Anzahl an Promotoren bekannt, die von einer Vielzahl potentieller Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel an die für Wnt-Polypeptid kodierende DNA gebunden, indem der Promotor durch Restriktionsenzym-Verdau von der Quellen-DNA entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird. Sowohl die native Wnt-Polypeptid-Promotorsequenz als auch viele heterologe Promotoren können verwendet werden, um Amplifizierung und/oder Expression der Wnt-Polypeptid-DNA zu lenken. Heterologe Promotoren werden jedoch bevorzugt, da sie im Allgemeinen im Vergleich zum nativen Wnt-Polypeptid-Promotor eine größere Transkription und höhere Ausbeuten an Wnt-Polypeptiden ermöglichen.
  • Zu den Promotoren, die zur Verwendung bei prokaryotischen Wirten geeignet sind, gehören die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979), Alkaliphosphatase, ein Tryptophan(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ) und Hybrid-Promotoren wie der tac-Promotor. deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983). Es sind jedoch auch andere bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch es einem Fachmann ermöglicht wird, sie operabel an DNA zu ligieren, die für Wnt-Polypeptid kodiert (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)), wobei Linker oder Adaptoren verwendet werden, um alle er forderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung bei bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno-(S. D.-)Sequenz, die operabel an die für Wnt-Polypeptid kodierende DNA gebunden ist.
  • Promotorsequenzen sind für Eukaryoten bekannt. So gut wie alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die sich etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle befindet, wo Transkription beginnt. Eine weitere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromauf vom Start der Transkription vieler Gene zu finden ist, ist eine CXCAAT-Region, worin X jedes beliebige Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der Kodierungssequenz sein kann. Alle diese Sequenzen werden auf geeignete Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
  • Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung bei Hefe-Wirten sind die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
  • Andere Hefe-Promotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingung gesteuerten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Säurephosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoff-Stoffwechsel assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactose-Nutzung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefe-Expression werden weiters in der EP-73.657 beschrieben. Hefe-Verstärker werden bei Hefe-Promotoren ebenfalls vorteilhaft verwendet.
  • Wnt-Polypeptid-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren erhalten werden, wie Polyomavirus, Geflügelpocken-Virus (UK 2.211.504, veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomavirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Heptatitis-B-Virus und am meisten bevorzugt Simian-Virus 40 (SV40), von heterologen Säugetier-Promotoren, z. B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, von Hitzeschock-Promotoren und von dem Promotor, der normalerweise mit der Wnt-Polypeptidsequenz assoziiert ist, mit der Maßgabe, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
  • Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden zweckmäßig als ein SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan et al., Science 209, 1422–1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981). Der unmittelbare frühe Promotor des Human-Cytomegalovirus wird zweckmäßig als ein HindIII-E-Restriktionsfragment erhalten. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982). Ein System zum Exprimieren von DNA in Säugetierwirten, bei dem das Rinder-Papillomavirus als Vektor verwendet wird, ist in US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems wird in US-Patent Nr. 4.601.978 offenbart. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503–508 (1982) bezüglich der Expression von cDNA, die für Immuninterferon kodiert, in Affenzellen; Reyes et al., Nature 297, 598–601 (1982) bezüglich der Expression von Humanβ-Interferon-cDNA in Mäusezellen unter der Kontrolle eines Thymidin-Kinase-Promotors von Herpes-simplex-Virus; Canaani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982) bezüglich der Expression des Human-Interferon-β1-Gens in kultivierten Mäuseund Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777–6781 (1982) bezüglich der Expression bakterieller CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryo-Fibroblasten, China-Hamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Mäuse-NIH-3T3-Zellen unter Einsatz der langen terminalen Rous-Sarkomavirus-Wiederholung als Promotor.
  • e. Verstärkerelement-Komponente
  • Die Transkription einer DNA, die für das bei der Hämatopoese gemäß vorliegender Erfindung durch höhere Eukaroyten nützliche Wnt-Polypeptid kodiert, wird oft erhöht, indem in den Vektor eine Verstärkersequenz insertiert wird. Verstärker sind cis-wirkende DNA-Elemente, üblicherweise mit etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Verstärker sind relativ Orientierungs- und Positionsunabhängig, und sind 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 (1983)) von der Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell, 33 729 (1983)) sowie innerhalb der Kodierungssequenz selbst gefunden worden. Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984)). Bisher sind viele Verstärkersequenzen von Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Verstärker von einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele sind der SV40-Verstärker auf der späten Seite des Replikationsursprung (bp 100–270), der Cytomegalovirus-frühe Promotor-Verstärker, der Polyoma-Verstärker auf der späten Seite des Replikationsursprungs, sowie Adenovirusverstärker. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982) bezüglich Verstärkungselementen zur Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der Verstärker kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur Wnt-Polypeptid-Kodierungssequenz gespleißt werden, befindet sich aber vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
  • f. Transkriptionsterminationskomponente
  • Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Human- oder nukleierten Zellen von anderen multizellularen Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die für die Beendigung der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Derartige Sequenzen sind üblicherweise von den untranslatierten 5'- und gelegentlich 3'-Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für Wnt-Polypeptid kodierenden mRNA transkribiert sind.
  • g. Konstruktion und Analyse von Vektoren
  • Für die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben angeführten Komponenten enthalten, werden Standard-Ligationstechniken eingesetzt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der erwünschten Form erneut ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen.
  • Zur Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsmischungen verwendet, um E. coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz bei Bedarf ausgewählt. Plasmide von den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder sequenziert, indem das Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), eingesetzt wird.
  • h. Vektoren zur vorübergehenden Expression
  • Besonders nützlich bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende Expression in Säugetierzellen von DNA sorgen, die für Wnt-Polypeptid kodieren. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist, in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, so dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors ansammelt und wiederum hohe Mengen eines erwünschten Polypeptids synthetisiert, für das der Expressionsvektor kodiert. Sambrook et al., oben, S. 16.17–16.22. Systeme zur vorübergehenden Expression, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die zweckmäßige positive Identifizierung von Polypeptiden, für die klonierte DNAs kodieren, sowie das rasche Screenen derartiger Polypeptide auf erwünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. So sind Systeme für vorübergehenden Expression besonders nützlich gemäß vorliegender Erfindung, um Analoge und Varianten von Wnt-Polypeptid zu identifizieren, die ein biologisch aktives Wnt-Polypeptid sind.
  • i. Geeignete exemplarische Wirbeltierzellenvektoren
  • Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für die Adaption an die Synthese von Wnt-Polypeptid in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in Gethin et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979), EP-117.060; und EP 117.058 beschrieben. Ein besonders nützliches Plasmid für Säugetierzellkultur-Expression von Wnt-Polypeptid ist pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSV16B (WO 91/08291, Veröffentlichungsdatum 13. Juni 1991).
  • 3. Selektion und Transformation von Wirtszellen
  • Geeignete Wirtszellen zur Klonierung oder Expression der DNA in den Vektoren gemäß vorliegender Erfindung sind die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren eukaryotischen Zellen. Geeignete Prokaryoten für diesen Zweck sind Eubakterien, wie Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie Escherichia, z. B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiell, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans, und Shigella, sowie Bacilli, wie B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41P, offenbart in der am 12. April 1989 veröffentlichten DD 266.710), Pseudomonas, wie P. aeruginosa, und Streptomyces. Ein bevorzugter E. coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), es eignen sich jedoch auch andere Stämme, wie E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325). Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugt Wirt oder Elternwirt, da er ein häufiger Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produktfermentationen ist. Bevorzugt sollte die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen sekretieren. Bei spielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den für Proteine kodierenden Genen zu bewirken, und ein Beispiel für derartige Wirte ist E. coli-W3110-Stamm 27C7. Der vollständige Genotyp von 27C7 ist tonAΔptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 ompTΔdegP41kan. Stamm 27C7 wurde am 30. Oktober 1991 unter der ATCC Nr. 55.244 bei der American Type Culture Collection hinterlegt. Alternativ dazu kann der Stamm von E. coli mit mutanter periplasmatischer Protease eingesetzt werden, der in dem am 7. August 1990 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.946.783 offenbart wird. Wieder alternativ dazu sind Klonierungsverfahren geeignet, z. B. PCRoder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen. Neben Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie filamentöse Pilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für für Wnt-Polypeptid kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae oder gemeine Backhefe ist der am häufigsten verwendete niedere eukaryotische Wirtsmikroorganismus. Jedoch sind auch eine Reihe anderer Gattungen, Spezies und Stämme allgemein erhältlich und gemäß vorliegender Erfindung nützlich, wie Schizosaccharomyces pombe (Beach et al., Nature 290, 140 (1981); die am 2. Mai 1985 veröffentlichte EP-139.383); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., oben) wie z. B. K. lactis (MW98-8C, CBS683; CBS4574); K. fragilis (ATCC 12.424); K. bulgaricus (ATCC 16.045); K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., oben); K. thermotolerans, und K. marxianus; Garbe ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces, wie Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze, wie beispielsweise Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991), und Aspergillus-Wirte, wie A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger, Kelly et al., EMBO J. 4, 475–479 (1985).
  • Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem Wnt-Polypeptid stammen von multizellulären Organismen. Geeignete Wirtszellen sind zu komplexen Verarbeitungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur einsetzbar, gleichgültig, ob sie von Wirbeltier- oder Wirbellosenkultur stammt. Beispiele für Wirbellosen-Zellen sind Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche baculovirale Stämme und Varianten sowie entsprechende permissive Insektenwirtszellen von Wirten wie Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Moskito), Aedes albopictus (Moskito), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori sind identifiziert worden. Siehe beispielsweise Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in Genetic Engineering, Hrsg. Setlow et al., Band 8 (Plenum Publishing, 1986) S. 277–279; und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Eine Vielzahl viraler Stämme für die Transfektion ist allgemein erhältlich, z. B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und derartige Viren können hierin gemäß vorliegender Erfindung als Virus verwendet werden, insbesondere für die Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen.
  • Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte eingesetzt werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bacteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, das bereits manipuliert worden ist, so dass es die für Wnt-Polypeptid kodierende DNA enthält. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die DNA, die für das Wnt-Polypeptid kodiert, zum Pflanzenzellenwirt transferiert, so dass er transfiziert wird und unter geeigneten Bedingungen die für Wnt-Polypeptid kodierende DNA exprimiert. Außerdem sind Regulierungs- und Signalsequenzen verfügbar, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie der Nopalin-Synthase-Promotor und Polyadenylierungssginalsequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Außerdem können DNA-Segmente, die von der stromauf gelegenen Regionen des T-DNA-780-Gens isoliert sind, Transkriptionsmengen von durch Pflanzen exprimierbaren Genen in rekombinanter DNA enthaltendem Pflanzengewebe aktivieren oder erhöhen. ( EP 321.196 , Veröffentlichungsdatum 21. Juni 1989.)
  • Das Interesse an Wirbeltierzellen war jedoch am größten, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist zu einem Routineverfahren geworden. Siehe z. B. Tissue Culture, Academic Press, Hrsg. Kruse und Patterson (1973). Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszelllinien sind eine Afffennieren-CV1-Linie, die durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) transformiert ist; Human-Embryonal-Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977); Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); China-Hamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Mäuse-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Afrikanische Meerkatzen-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); Human-Cervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundnierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, TCC CRL 1442); Menschen-Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); Menschen-Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Milchdrüsentumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC5-Zellen; FS4-Zellen; und eine Menschen-Heptomlinie (Hep G2).
  • Wirtszellen werden transfiziert und vorzugsweise mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren für Wnt-Polypeptid-Produktion transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert, die entsprechend modifiziert sind, um Promotoren zu induzieren, Transformanten zu selektieren oder die für die erwünschten Sequenzen kodierenden Gene zu amplifizieren.
  • Transfektion bezeichnet die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob tatsächlich eine Kodierungssequenz exprimiert wird. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sind zahlreiche Verfahren zur Transfektion bekannt, beispielsweise CaPO4- und Elektroporation. Erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen anerkannt, wenn ein Hinweis auf die Tätigkeit dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
  • Transformation bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, so dass die DNA entweder als extrachromosomales Element oder durch einen chromosomalen Integranten replizierbar ist. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter Einsatz von Standardtechniken, die für solche Zellen angemessen sind. Kalziumbehandlung unter Einsatz von Kalziumchlorid, wie in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., oben, beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen eingesetzt, die beträchtliche Zellwandbarrieren enthalten. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird für die Transformation bestimmter Pflanzenzellen eingesetzt, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und der am 29. Juni 1989 veröffentlichten WO 89/05859 beschrieben. Außerdem können Zellen unter Einsatz von Ultraschallbehandlung transfiziert werden, wie in der am 10. Jänner 1991 veröffentlichten WO 91/00358 beschrieben.
  • Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände wird das Kalziumphosphat-Fällungsverfahren von Graham et al., Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetier-Zellwirtsystem-Transformationen sind im am 16. August 1983 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, etwa durch Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin usw., eingesetzt werden. Verschiedene Techniken zur Transformation von Säugetierzellen sind Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988), zu entnehmen.
  • 4. Kultivierung der Wirtszellen
  • Prokaryotische Zellen, die verwendet werden, um das gemäß vorliegender Erfindung nützliche Wnt-Polypeptid zu erzeugen, werden in geeigneten Medien kultiviert, wie allgemein in Sambrook et al., oben, beschrieben.
  • Die zur Herstellung des Wnt-Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Säugetier-Wirtszellen können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma); RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma), eignen sich zum Kultivieren von Wirtszellen. Außerdem können alle in Ham et al., Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102, 255 (1980); US-Patent Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; oder 5.122.469; der WO 90/03430; WO 87/00195; oder U.S. Patent Re. 30.985 beschriebenen Medien als Kulturmedien für die Wirtszellen verwendet werden. Beliebige dieser Medien können nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferrin oder Epidermis-Wachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Kalzium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie dem Arzneimittel GENTAMYCINTM), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolekularen Bereich vorhanden sind) und Glucose oder eine äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Alle anderen erforderlichen Ergänzungen können auch in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH und dergleichen, sind die in der Vergangenheit bei der für die Expression ausgewählten Wirtszelle eingesetzten, und sie werden Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar sein.
  • Im Allgemeinen sind die Prinzipien, Protokolle und praktischen Techniken zur Maximierung der Produktivität von Säugetier-Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology, a Practical Approach: Hrgs. M. Butler (IRL Press, 1991) zu finden.
  • Die Wirtszellen, auf die in der vorliegenden Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in Kultur sowie Zellen, die sich innerhalb eines Wirtstieres befinden.
  • 5. Detektion von Gen-Amplifizierung/-Expression
  • Gen-Amplifizierung und/oder -Expression kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder Hybridisierung in situ, wobei eine entsprechend markierte Sonde auf Basis der gemäß vorliegender Erfindung eingesetzten Sequenzen eingesetzt wird. Es können verschiedene Markierungen eingesetzt werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere 32P. Es können jedoch auch andere Techniken eingesetzt werden, wie die Verwendung von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Stelle für die Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit einer großen Vielzahl von Markern markiert werden können, wie Radionucliden, Fluoreszenzmitteln, Enzymen oder dergleichen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe erkennen können, einschließlich DNA-Duplexen, RNA-Duplexen und DNA-RNA-Hybridduplexen oder DNA-Protein-Duplexen. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann dort durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so dass bei der Duplex-Bildung auf der Oberfläche das Vorhandensein von an den Duplex gebundenem Antikörper detektiert werden kann.
  • Gen-Expression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren gemessen werden, beispielsweise durch immunhistochemische Färbung von Gewebeabschnitten und Test von Zellkultur oder Körperfluids, um die Expression des Gen-Produkts direkt zu quantifizieren. Bei immunhistochemischen Färbungstechniken wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Dehydratisierung und Fixierung, gefolgt von Umsetzung mit markierten Antikörpern, die für das gekoppelte Genprodukt spezifisch sind, wobei die Markierungen typischerweise visuell detektierbar sind, wie enzymatische Markie rungen, Fluoreszenzmarkierungen, Lumineszenzmarkierungen und dergleichen. Eine besonders empfindliche Färbungstechnik, die sich zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung eignet, wird von Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734–738 (1980), beschrieben.
  • Antikörper, die für immunhistochemische Färbung und/oder Test von Probenfluids nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können wie hierin beschrieben hergestellt werden.
  • 6. Reinigung von Wnt-Polypeptid
  • Wnt-Polypeptid kann aus dem Kulturmedium als sekretiertes Polypeptid gewonnen werden, es wird jedoch bevorzugt aus Wirtszellen-Lysaten gewonnen. Wenn das Wnt-Polypeptid Membran-gebunden ist, kann es von der Zelloberfläche unter Einsatz geeigneter Mittel freigesetzt werden, darunter Enzyme oder Detergenzien (z. B. Triton-X 100), beispielsweise Suramin, PMA, Heparin, Heparinase I und III, Plasmin, n-Octyl-β-D-Glucosid, PI-spezifische und PC-spezifische Phospholipase C und TNF-α.
  • Wenn das Wnt-Polypeptid in einer rekombinanten Zelle erzeugt wird, die nicht humanen Ursprungs ist, ist das Wnt-Polypeptid vollkommen frei von Proteinen oder Polypeptiden humanen Ursprungs. Es ist jedoch notwendig, Wnt-Polypeptid aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im Wesentlichen homogen sind, was das Wnt-Polypeptid betrifft. Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um teilchenförmige Zellbruchstücke zu entfernen. Wnt-Polypeptid wird daraufhin aus verunreinigenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Verfahren Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren sind: Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule; Ethanol-Fällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Kieselsäure oder einem Kationen-Austauschharz wie DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration beispielsweise unter Einsatz von beispielsweise Sephadex G-75TM; und Protein-SepharoseTM-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen wie IgG.
  • Wnt-Polypeptidvarianten, in denen Reste deletiert, insertiert oder substituiert worden sind, werden auf die gleiche Weise gewonnen wie Wnt-Polypeptid nativer Sequenz, wobei etwaige wesentliche Änderungen der Eigenschaften, die durch die Variation entstehen, berücksichtigt werden. Immunaffinitätssäulen, wie polyklonale Kaninchen-anti-Wnt-Polypeptid-Säule, können eingesetzt werden, um die Wnt-Polypeptid-Variante zu absorbieren, indem sie an zumindest ein verbleibendes Immun-Epitop gebunden wird.
  • Ein Proteaseinhibitor, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann ebenfalls nützlich sein, um proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und Antibiotika können enthalten sein, um das Wachstum zufälliger Verunreinigungen zu verhindern.
  • 7. Kovalente Modifikationen
  • Kovalente Modifikationen von Wnt-Polypeptid fallen in den Schutzumfang der Erfindung. Sowohl Wnt-Polypeptid nativer Sequenz als auch Aminosäuresequenzvarianten des Wnt-Polypeptid können kovalent modifiziert werden. Ein Typ kovalenter Modifikation des Wnt-Polypeptids wird in das Molekül eingeführt, indem abgezielte Aminosäurereste des Wnt-Polypeptids mit einem organischen Derivatisierungmittel umgesetzt werden, das zur Umsetzung mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des Wnt-Polypeptids fähig ist.
  • Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Haloacetaten (und entsprechenden Aminen), wie Chloressigsäure oder Chloracetamid, umgesetzt, was Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate ergibt. Cysteinylreste werden auch durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
  • Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonateat, pH 5,5–7,0, derivatisiert, weil dieses Mittel relativ spezifisch für die Histdiyl-Seitenkette ist. p-Bromophenacylbromid ist ebenfalls nützlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
  • Lysinyl- und Amino-terminale Reste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäure-Anhydriden umgesetzt. Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung, die Ladung der Lysinylreste umzukehren. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α-Amino-hältigen Resten sind Imidoester, wie Methylpicolinimidat, Pyridoxalphosphat, Pyridoxal, Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsärue, O-Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
  • Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, darunter Phenylglyoxyl, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Für die Derivatisierung von Argininresten ist es aufgrund des hohen pKa der funktionellen Guanidingruppe erforderlich, dass die Reaktion unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Weiters können diese Reagenzien mit den Lysin-Gruppen sowie mit der Arginin-ε-Aminogruppe reagieren.
  • Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann vorgenommen werden, wobei besonderes Interesse am Einführen von Spektralmarkierungen in Tyrosyl-Reste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan besteht. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Einsatz von 125I oder 134I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung für Radioimmuntests herzustellen, wobei das Chloramin-T-Verfahren geeignet ist.
  • Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R-N=C=N-R') modifiziert, worin R und R' unterschiedliche Alkylgrup pen, wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid sind. Weiters werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Umsetzung mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste umgewandelt.
  • Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich, um Wnt-Polypeptid mit einer wasserunlöslichen Stützmatrix oder Oberfläche zur Verwendung beim Verfahren zur Reinigung von Anti-Wnt-Polypeptid-Antikörpern zu vernetzen, und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel sind beispielsweise 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldhyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, darunter Disuccinimidylester, wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleimide, wie Bis-N-maleimid-1,8-octan. Derivatisierungsmittel, wie Methyl-3-((p-azidophenyl)dithio)propioimidat, ergaben photoaktivierbare Zwischenprodukten, die zur Bildung von Vernetzungen in Gegenwart von Licht fähig sind. Alternativ dazu werden reaktive wasserunlösliche Matrizen, wie Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenhydrate und die reaktiven Substrate, die in den US-Patenten Nr. 3.969.287; Nr. 3.691.016, Nr. 4.195.128; Nr. 4.247.642; Nr. 4.229.537 und Nr. 4.330.440 beschrieben werden, zur Protein-Immmobilisierung eingesetzt.
  • Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamylbzw. Aspartylresten desamidiert. Diese Reste werden unter neutralen oder basischen Bedingungen desamidiert. Die desamidierte Form dieser Reste fällt in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
  • Andere Modifikationen sind die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)), die Acetylierung des N-terminalen Amins und die Amidierung einer C-terminalen Carboxylguppe.
  • Ein weiterer Typ kovalenter Modifikation des Polypeptids, der in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fällt, umfasst die Abänderung des nativen Glycosylierungsmusters des Polypeptids. Mit Abänderung ist die Deletion einer oder mehrerer Kohlenhydrat-Gruppierungen, die im nativen Wnt-Polypeptid vorkommen, und/oder die Addition einer oder mehrerer Glycosylierungsstellen, die nicht im nativen Wnt-Polypeptid vorhanden sind, gemeint.
  • Die Glycosylierung von Polypeptiden ist typischerweise entweder N-gebunden oder Ogebunden. N-gebunden bedeutet die Bindung der Kohlenhydratgruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptid-Sequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin X eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für enzymatische Bindung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparagin-Seitenkette. Somit erzeugt das Vorhandensein einer dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine potentielle Glycosylierungsstelle. O-gebundene Glycosylierung bedeutet die Bindung eines der Zucker N-Aceylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxylaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, es können jedoch auch 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin verwendet werden.
  • Die Addition von Glycosylierungsstellen an das Wnt-Polypeptid wird zweckmäßig erreicht, indem die Aminosäuresequenz so abgeändert wird, dass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen (für N-gebundene Glycosylierungsstellen) enthält. Die Abänderung kann auch durch die Addition von einem oder mehreren oder Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninrest(e/n) bei der nativen Wnt-Polypeptidsequenz (für O-gebundene Glycosylierungsstellen) erfolgen. Aus Gründen der Einfachheit wird die Wnt-Polypeptid-Aminosäuresequenz vorzugsweise durch Veränderung auf DNA-Ebene abgeändert, vorzugsweise durch Mutation der für das Wnt-Polypeptid kodierenden DNA an vorgewählten Basen, so dass Kodone erzeugt werden, die in die erwünschten Aminosäuren translatieren. Die DNA-Mutationen) kann bzw. können unter Einsatz von Verfahren erfolgen, die oben und im obigen US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben werden.
  • Ein weiteres Mittel zum Erhöhen der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen auf dem Wnt-Polypeptid ist jenes durch chemisches oder enzymatisches Koppeln der Glycoside an das Polypeptid. Diese Verfahren sind insofern vorteilhaft, als sie nicht die Erzeugung des Polypeptids in einer Wirtszelle erfordern, die Glycosylierungsfähigkeiten für N- oder O-gebundene Glykosylierung aufweisen. In Abhängigkeit vom eingesetzten Kopplungsmodus kann bzw. können der bzw. die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxygruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen wie jene von Cystein, (d) freie Hydroxygruppen, wie jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren werden in der am 11. September 1987 veröffentlichten WO 87/05330 und in Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
  • Das Entfernen von Kohlenhydrat-Gruppierungen, die auf dem Wnt-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch erfolgen. Chemische Deglycosylierung erfordert das Einwirkenlassen der Verbindung Trifluormethanschwefelsäure oder einer äquivalenten Verbindung auf das Polypeptid. Diese Behandlung führt zur Spaltung eines Großteils der oder aller Zucker mit Ausnahme des Bindungszuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während sie das Polypeptid intakt lässt. Chemische Deglycosylierung wird von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydrat-Gruppierungen auf Polypeptiden kann unter Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo-Glycosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben.
  • Glykosylierung an potentiellen Glykosylierungsstellen kann unter Verwendung der Verbindung Tunicamycin verhindert werden, wie von Duskin et al., J. Biol. Chem. 257, 3105 (1982), beschreiben. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-Glycosid-Bindungen.
  • Ein weiterer Typ kovalenter Modifikation von Wnt-Polypeptid umfasst die Bindung des Wnt-Polypeptids an eines einer Vielzahl nicht-proteinartiger Polymere, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, wie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 offenbart.
  • Da es oft schwierig ist, die Eigenschaften eines varianten Wnt-Polypeptids im Voraus vorherzusagen, ist klar, dass ein gewisses Screenen der gewonnen Variante erforderlich ist, um die optimale Variante auszuwählen. Eine Veränderung des immunologischen Charakters des Wnt-Polypeptid-Moleküls, wie Affinität für einen bestimmten Antikörper, kann auch durch einen kompetitiven Immuntest gemessen werden. Die Wnt-Polypeptid-Variante wird in den Tests von Beispiel 2 bezüglich Veränderungen der Fähigkeit des Proteins getestet, Zell-Proliferation herbeizuführen. Andere potentielle Modifikationen der Protein- oder Polypeptideigenschaften, wie Redox- oder thermische Stabilität, Hydrophobie, Anfälligkeit für proteolytischen Abbau oder die Tendenz zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren, werden nach Verfahren getestet, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind.
  • 8. Epitop-markiertes Wnt-Polypeptid
  • Die vorliegende Erfindung umfasst chimäre Polypeptide, die ein Wnt-Polypeptid umfassen, das an ein heterologes Polypeptid fusioniert ist. Ein chimäres Wnt-Polypeptid ist ein Typ von Wnt-Polypeptid-Variante, wie hierin definiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das chimäre Polypeptid eine Fusion des Wnt-Polypeptids mit einem Markierungspolypeptid, was ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Markierung-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitop-Markierung wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxyl-Terminus des Wnt-Polypeptids bereitgestellt. Derartig Epitop-markierte Formen des Wnt-Polypeptids sind wünschenswert, da ihr Vorhandensein unter Einsatz eines markiertern Antikörpers gegen das Markierungspolypeptid detektiert wer- den kann. Auch ermöglicht es das Bereitstellen der Epitop-Markierung, dass das Wnt-Polypeptid leicht durch Affinitätsreinigung unter Einsatz des Anti-Markierungs-Antikörpers gereinigt wird. Affinitätsreinigungstechniken und Diagnosetests, an denen Antikörper beteiligt sind, werden weiter unten hierin beschrieben. Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Beispiele sind die Herpes-Simplex-Virus-Glycoprotein-D (gD-) Markierung und ihr Antikörper (Pennica et al., oben); die his-Markierung, beispielsweise his6 (Hengen, Trends Biochem. Sci. 20, 285–286 (1995) und Pennica et al., J. Biol. Chem. 270, 10915–10922 (1995)); das Grippe-HA-Markierungspolypeptid und sein Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); die c-myc-Markierung und die 8F9-, 3C7, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dazu (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985); und Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)). Es sind auch andere Markierungspolypeptide offenbart worden. Beispiele sind das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)); das KT3-Epitoppeptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); ein α-Tubulinepitoppeptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und die T7-Gen-10-Protein-Peptidmarkierung. Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990). Sobald das Markierungspolypeptid gewählt worden ist, kann ein Antikörper dagegen unter Einsatz der hierin offenbarten Techniken erzeugt werden.
  • Die allgemeinen Verfahren, die für die Konstruktion und Produktion von Epitop-markiertem Wnt-Polypeptid geeignet sind, sind die gleichen wie oben offenbart. Wnt-Polypeptid-Markierungspolypeptid-Fusionen werden am zweckmäßigsten konstruiert, indem die cDNA-Sequenz, die für den Wnt-Polypeptid-Abschnitt kodiert, im Rahmen an die Markierungspolypeptid-DNA-Sequenz fusioniert wird und das resultierende DNA-Fusionskonstrukt in geeigneten Wirtszellen exprimiert wird. Üblicherweise wird, wenn die Wnt-Polypeptid-Markierungspolypeptid-Chimären gemäß vorliegender Erfindung hergestellt werden, Nucleinsäure, die für das Wnt-Polypeptid kodiert, an ihrem 3'-Ende an Nu cleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus des Markierungspolypeptids kodiert, es sind aber auch 5'-Fusionen möglich.
  • Epitop-markiertes Wnt-Polypeptid kann zweckmäßig durch Affinitätschromatographie unter Einsatz des Anti-Markierungsantikörpers gereinigt werden. Die Matrix, an die der Affinitätsantikörper gebunden ist, ist am häufigsten Agarose, es sind aber auch andere Matrizen verfügbar (z. B. Glas mit regulierten Poren oder Poly(styroldivinyl)benzol). Das Epitop-markierte Wnt-Polypeptid kann von der Affinitätssäule eluiert werden, indem beispielsweise der Puffer-pH oder die Ionenstärke variiert werden oder chaotrope Mittel zugegeben werden.
  • 9. Wnt-Polypeptid-Immunadhäsine
  • Chimären, die aus einer Rezeptorsequenz konstruiert sind, die an eine geeignete Immunglobulin-Konstantdomänensequenz gebunden ist (Immunadhäsine), sind nach dem Stand der Technik bekannt. Zu den Immunadhäsinen, die in der Literatur berichtet werden, gehören Fusionen des T-Zellen-Rezeptors* (Gascoigne et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987)); CD4* (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Trunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990); Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin (Homing-Rezeptor) ((Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 (1990); Watson et al., Nature 349, 164-167 (1991)); CD44* (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28* und B7* (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4* (Lisley et al., ). Exp. Med. 174, 561-569 (1991)); CD22* (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); NP-Rezeptoren (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991)); und IgE-Rezeptor α* (Ridgway et al., J. Cell. Biol. 115, abstr. 1448 (1991)), worin der Stern (*) anzeigt, dass der Rezeptor ein Mitglied der Immunglobulin-Überfamilie ist.
  • Bei der einfachsten und direktesten Immunadhäsin-Konstruktion wird bzw. werden die Bindungsregionen) des „Adhäsin"-Proteins mit den Gelenks- und Fc-Regionen einer Immunglobulin-Schwerkette kombiniert. Üblicherweise wird, wenn die Wnt-Polypeptid-Immunglobulin-Chimären gemäß vorliegender Erfindung hergestellt werden, Nucleinsäure, die für Wnt-Polypeptid kodiert, C-terminal an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz kodiert, es sind jedoch auch N-terminate Fusionen möglich.
  • Typischerweise behält bei derartigen Fusionen das kodierte chimäre Polypeptid zumindest funktionell aktive Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette bei. Fusionen werden auch an dem C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne oder unmittelbar N-terminal zu CH1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette gebildet.
  • Die genaue Stelle, an der die Fusion vorgenommen wird, ist nicht entscheidend; besondere Stellen sind wohlbekannt und können gewählt werden, um die biologische Wirkung, Sekretion oder Bindungseigenschaften der Wnt-Polypeptid-Immunglobulin-Chimären zu optimieren.
  • Bei einigen Ausführungsformen werden die Wnt-Polypeptid-Immunglobulin-Chimären als Monomere oder Hetero- oder Homo-Multimere zusammengestellt, und insbesondere als Dimere oder Tetramere, im Wesentlichen wie in der WO 91/08298 dargestellt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Wnt-Polypeptidsequenz an den N-Terminus des C-terminalen Abschnitts eines Antikörpers (insbesondere die Fc-Domäne) fusioniert, die die Effektorfunktionen eines Immunglobulins enthält, z. B. Immunglobulin G1 (IgG1). Es ist möglich, die gesamte Schwerketten-Konstantregion an die Wnt-Polypeptidsequenz zu fusionieren. Jedoch wird bei der Fusion mehr bevorzugt eine Sequenz verwendet, die an der Gelenksregion unmittelbar stromauf von der Papain-Spaltungsstelle beginnt (die IgG-Fc chemisch definiert; Rest 216, wobei der erste Rest von der Schwerketten-Konstantregion mit 114 angenommen wird, oder analoge Stellen anderer Immunglobuline). Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Wnt-Polypeptid-Aminosäuresequenz an die Gelenksregion, CH2 und CH3 oder die CH1-, Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen einer IgG1-, IgG2- oder IgG3-Schwerkette fusioniert. Die genaue Stelle, an der die Fusion vorgenommen wird, ist nicht entscheidend, und die optimale Stelle kann durch Routineversuche bestimmt werden.
  • Bei einigen Ausführungsformen werden die Wnt-Polypeptid-Immunglobulin-Chimären als Multimere und insbesondere als Homo-Dimere oder -Tetramere zusammengestellt. Im Allgemeinen weisen diese zusammengebauten Immunglobuline bekannte Einheitsstrukturen auf. Eine Basis-Vierketten-Struktureinheit ist die Form, in der IgG, IgD und IgE vorliegen. Eine Vierereinheit wird bei den Immunglobulinen mit höherem Molekulargewicht wiederholt; IgM liegt im Allgemeinen als Pentamer aus Basis-Vierereinheiten vor, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin und gelegentlich IgG-Globulin können ebenfalls in multimerer Form in Serum vorliegen. Im Fall von Multimer kann jede Vierereinheit gleich oder voneinander verschieden sein.
  • Verschiedene exemplarische zusammengestellte Wnt-Polypeptid-Immunglobulin-Chimären innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung sind nachstehend schematisch dargestellt:
    • (a) ACL-ACL;
    • (b) ACH-(ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH, oder VLCL-ACH);
    • (c) ACL-ACH-(ACL-ACH, ACH-VHCH, VLCL-ACH, oder VLCL-VHCH);
    • (d) ACL-VHCH-(ACH, or ACL-VHCH, oder VLCL-ACH);
    • (e) VLCL-ACH-(ACL-VHCH, oder VLCL-ACH); und
    • (f) (A-Y)n-VLCL-VHCH)2,

    worin
    jedes A für identische oder voneinander verschiedene Wnt-Polypeptid- oder Aminosäu- resequenzen steht;
    VL eine variable Immunglobulin-Leichtketten-Domäne ist;
    VH eine variable Immunglobulin-Schwerketten-Domäne ist;
    CL eine konstante Immunglobulin-Leichtketten-Domäne ist;
    CH eine konstante Immunglobulin-Schwerketten-Domäne ist;
    n eine ganze Zahl größer als 1 ist;
    Y den Rest eines kovalenten Vernetzers bezeichnet.
  • Im Interesse der Kürze stellen die obigen Strukturen nur Schlüsselmerkmale dar; sie geben keine Verbindung (J) oder andere Domänen der Immunglobuline dar, und eben so wenig werden Disulfidbindungen gezeigt. Wenn solche Domänen jedoch für Bindungsaktivität erforderlich sind, sind sie so zu konstruieren, dass sie an den üblichen Positionen vorhanden sind, die sie in den Immunglobulin-Molekülen einnehmen.
  • Alternativ dazu kann die Wnt-Polypeptidsequenz zwischen Immunglobulin-Schwerketten- und -Leichtketten-Sequenzen insertiert werden, so dass ein Immunglobulin erhalten wird, das eine chimäre Schwerkette umfasst. Bei dieser Ausführungsform wird die Wnt-Polypeptidsequenz an das 3'-Ende einer Immunglobulin-Schwerkette in jedem Arm eines Immunglobulins fusioniert, entweder zwischen der Gelenks- und der CH2-Domäne oder zwischen der CH2- und der CH3-Domäne. Ähnliche Konstrukte sind von Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991), berichtet worden.
  • Obwohl das Vorhandensein einer Immunglobulin-Leichtkette bei den Immunadhäsinen gemäß vorliegender Erfindung nicht erforderlich ist, könnte eine Immunglobulin-Leichtkette entweder kovalent mit einem Wnt-Polypeptid-Immunglobulin-Schwerketten-Fusionspolypeptid assoziiert oder direkt an das Wnt-Polypeptid fusioniert vorhanden sein. Im ersteren Fall wird DNA, die für eine Immunglobulin-Leichtkette kodiert, typischerweise mit einer DNA gemeinsam exprimiert, die für das Wnt-Polypeptid-Immunglublin-Schwerketten-Fusionsprotein kodiert. Bei der Sekretion werden die Hybrid-Schwerkette und die -Leichtkette kovalent assoziiert, um eine Immunglobulin-artige Struktur bereitzustellen, die zwei Disulfid-gebundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Verfahren, die für die Herstellung derartiger Strukturen geeignet sind, werden beispielsweise im dem am 28. März 1989 ausgegebenen US-Patent Nr. 4.816.567 offenbart.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Immunglobulinsequenzen, die bei der Konstruktion der Immunadhäsine gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, von einer konstanten IgG-Immunglobulin-Schwerketten-Domäne. Für Human-Immunadhäsine wird die Verwendung von Human-IgG1- und -IgG3-Immunglobulinsequenzen bevorzugt. Ein Hauptvorteil der Verwendung von IgG1 besteht darin, dass IgG1-Immunadhäsine effizient auf immobilisiertem Protein A gereinigt werden kann. Im Gegensatz dazu erfordert die Reinigung von IgG3 Protein G, ein wesentlich weniger vielfältiges Medium. Es sollten jedoch auch andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Immunglobulinen in Betracht gezogen werden, wenn der Ig-Fusionspartner für eine bestimmte Immunadhäsin-Konstruktion gewählt wird. Beispielsweise ist das IgG3-Gelenk länger und flexibler, und so kann es größere Adhäsin-Domänen unterbringen, die sich nicht falten oder richtig funktionieren, wenn sie an IgG1 fusioniert werden. Eine weitere Überlegung kann die Wertigkeit sein; IgG-Immunadhäsine sind zweiwertige Homodimere, während Ig-Subtypen wie IgA und IgM dimere bzw. pentamere Strukturen der Basis-Ig-Homodimereinheit entstehen lassen können. Bei Immunadhäsinen, die für die Anwendung in vivo bestimmt sind, sind die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen, die von der Fc-Region spezifiziert werden, ebenfalls wichtig. Obwohl IgG1, IgG2 und IgG4 alle eine In-vivo-Halbwertszeit von 21 Tagen aufweisen, sind ihre relativen Wirksamkeiten bei der Aktivierung des Komplementsystems unterschiedlich. IgG4 aktiviert das Komplement nicht, und IgG2 weist eine deutlich schwächere Komplementaktivierung auf als IgG1. Darüber hinaus bindet sich IgG2, anders als IgG1, nicht an Fc-Rezeptoren auf mononuklearen Zellen oder Neutrophilen. Während IgG3 für die Komplementaktivierung optimal ist, beträgt seine In-vivo-Halbwertszeit in etwa ein Drittel von jener der anderen IgG-Isotypen. Eine weitere wichtige Überlegung für Immunadhäsine, die zur Verwendung als Human Therapiemittel bestimmt sind, ist die Anzahl an allotypen Varianten des speziellen Isotyps. Im Allgemeinen werden IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Allotypen bevorzugt. Beispielsweise weist IgG1 nur vier serologisch definierte allotypische Stellen auf, von denen sich zwei (G1 m und 2) in der Fc-Region befinden; und eine von diesen Stellen G1m1 ist nicht immunogen. Im Gegensatz dazu gibt es 12 serologisch definierte Allotypen in IgG3, von denen sich alle in der Fc-Region befinden; nur drei dieser Stellen (G3m5, 11 und 21) weisen einen Allotyp auf, der nicht-immunogen ist. Somit ist die potentielle Immunogenität eines γ3-Immunadhäsins größer als jene eines γ1-Immunadhäsins.
  • In Bezug auf das parentale Immunglobulin befindet sich ein nützlicher Bindungspunkt unmittelbar stromauf von den Cysteinen des Gelenks, die die Disulfidbindungen zwischen den beiden Schwerketten bilden. Bei einer häufig verwendeten Konstruktion ist das Kodon für den C-terminalen Rest des Wnt-Polypeptidteils des Moleküls direkt stromauf von den Kodonen für die Sequenz DKTHTCPPCP (Seq.-ID-Nr. 1) der IgG1-Gelenkregion angeordnet.
  • Die allgemeinen Verfahren, die für die Konstruktion und Expression von Immunadhäsinen geeignet sind, sind die gleichen wie die oben in Hinblick auf Wnt-Polypeptid offenbarten. Immunadhäsine werden am zweckmäßigsten konstruiert, indem die cDNA-Sequenz, die für den Wnt-Polypeptidabschnitt kodiert, In-Rahmen an eine Ig-cDNA-Sequenz fusioniert wird. Jedoch kann auch Fusionieren an genomische Ig-Fragmente eingesetzt werden (siehe z. B. Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987); Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Der letztere Fusionstyp erfordert das Vorhandensein von Ig-Regulationssequenzen für die Expression. cDNAs, die für IgG-Schwerketten-Konstantregionen kodieren, können durch Hybridisierung oder durch Polymerase-Kettenreaktions-(PCR-)Techniken auf Basis veröffentlichter Sequenz von cDNA-Bibliotheken isoliert werden, die von Milz- oder Peripherblut-Lymphozyten stammen. Die cDNAs, die für das Wnt-Polypeptid und Ig-Teile des Immunadhäsins kodieren, werden gemeinsam in einen Plasmidvektor insertiert, der die effiziente Expression in den gewählten Wirtszellen lenkt. Für die Expression in Säugetierzellen können Vektoren auf pRK5-Basis (Schall et al., Cell 61, 361-370 (1990)) und Vektoren auf CDM8-Basis (Seed, Nature 329, 840 (1989)) verwendet werden. Die exakte Bindung kann geschaffen werden, indem die Extra-Sequenzen zwischen den konstruierten Bindungskodonen unter Einsatz von Oligonucleotid-gelenkter Deletionsmutagenese entfernt werden (Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982); Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989)). Es können synthetische Oligonucleotide verwendet werden, bei denen jede Hälfte komplementär zur der Sequenz auf beiden Seiten der erwünschten Bindung ist; Idealerweise handelt es sich dabei um 36- bis 48-mere. Alternativ dazu können PCR-Techniken eingesetzt werden, um die beiden Teile des Moleküls Im-Rahmen mit einem geeigneten Vektor zu verbinden.
  • Die Wahl der Wirtszelllinie für die Expression des Immunadhäsins hängt hauptsächlich vom Expressionsvektor ab. Eine weitere Überlegung ist die Proteinmenge, die erforderlich ist. Milligramm-Mengen können häufig durch vorübergehende Transfektionen erzeugt werden. Beispielsweise kann die Adenovirus-EIA-transformierte 293-Human-Embryonal-Nierenzelllinie durch eine Modifikation des Kalziumphosphatverfahrens vorübergehend mit Vektoren auf pRk5-Basis transfiziert werden, um effiziente Immunadhäsin-Expression zu ermöglichen. Vektoren auf CDM8-Basis können verwendet werden, um COS-Zellen durch das DEAE-Dextran-Verfahren zu transfizieren (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. US 9 , 347–353 (1990)). Wenn größere Proteinmengen erwünscht sind, kann das Immunadhäsin nach stabiler Transfektion einer Wirtszelllinie exprimiert werden. Beispielsweise kann der Vektor auf pRK5-Basis in China-Hamster-Eierstock-(CHO-)Zellen in Gegenwart eines zusätzlichen Plasmids eingeführt werden, das für Dihydrofolatreductase (DHFR) kodiert und Resistenz gegen G418 verleiht. Klone, die gegen G418 resistent sind, können in Kultur gewählt werden; diese Klone werden in Gegenwart zunehmender Mengen an DHFR-Inhibitor Methotrexat gezüchtet; Klone werden ausgewählt, wobei die Anzahl an Genkopien, die für DHFR- und Immunadhäsin-Sequenzen kodieren, co-amplifiziert werden. Wenn das Immunadhäsin eine hydrophobe Leader-Sequenz an ihrem N-Terminus enthält, wird sie wahrscheinlich durch die transfizierten Zellen verarbeitet und sekretiert. Die Expression von Immunadhäsinen mit komplexeren Strukturen kann einzigartig geeignete Wirtszellen erfordern; beispielsweise können Komponente wie Leichtkette oder J-Kette von bestimmten Myelom- oder Hybridom-Zellwirten bereitgestellt werden (Gascoigne et al., 1987, oben, Martin et al., J. Virol. 67, 3561–3568 (1993)).
  • Immunadhäsine können zweckmäßig durch Affinitätschromatographie gereinigt werden. Die Eignung von Protein A als Affinitätsligand hängt von der Spezies und dem Isotyp der Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die in der Chimäre verwendet wird. Protein A kann verwendet werden, um Immunadhäsine zu reinigen, die auf Human-γ1-, -γ2- oder -γ4-Schwerketten basieren (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983)). Protein G wird für alle Mäuse-Isotypen und für Human-γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567–1575 (1986)). Die Matrix, an die der Affinitätsligand gebunden ist, ist am häufigsten Agarose, aber andere Matrizen sind erhältlich. Mechanisch stabile Matrizen, wie Glas mit regulierten Poren oder Poly(styroldivinyl)benzol, ermöglichen schnellere Strömungsraten und kürzere Verarbeitungszeiten, als sie mit Agarose erreicht werden können. Die Bedingungen für die Bindung eine Immunadhäsins an die Protein-A- oder -G-Affinitätssäule werden vollständig von den Eigenschaften der Fc-Domäne, das heißt, ihrer Spezies und ihrem Isotyp, diktiert. Im Allgemeinen tritt, wenn der richtige Ligand gewählt wird, effiziente Bindung direkt vom unkonditionierten Kulturfluid auf. Ein unterscheidendes Merkmal von Immunadhäsinen besteht darin, dass bei Human-γ1-Molekülen die Bindungsfähigkeit für Protein A gegenüber einem Antikörper des gleichen Fc-Typs etwas verringert ist. Gebundenes Immunadhäsin kann effizient entweder bei saurem pH (bei oder über 3,0) oder in einem neutralen pH-Puffer, der ein milde chaotropes Salz enthält, eluiert werden. Dieser Affinitätschromatographieschritt kann ein Immunadhäsin-Präparat ergeben, das zu > 95% rein ist.
  • Andere Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, können anstelle von oder zusätzlich zu Affinitätschromatographie auf Protein A oder G eingesetzt werden, um Immunadhäsine zu reinigen. Immunadhäsine verhalten sich bei thiophiler Gelchromatographie (Hutchens et al., Anal. Biochem. 159, 217–226 (1986)) und immobilisierter Metallchelatchromatographie (Al-Mashikhi et al., J. Dairy Sci. 71, 1756–1763 (1988)) ähnlich wie Antikörper. Im Gegensatz zu Antikörpern ist jedoch ihr Verhalten auf Ionenaustauschsäulen nicht nur durch ihre isoelektrischen Punkte diktiert, sondern auch durch einen Ladungsdipol, der in den Molekülen aufgrund ihrer chimären Beschaffenheit vorhanden sein kann.
  • Falls erwünscht, können die Immunadhäsine bispezifisch gemacht werden. So können die Immunadhäsine gemäß vorliegender Erfindung ein Wnt-Polypeptid und eine Domäne, wie eine extrazelluläre Domäne, einer anderen Cytokin-Rezeptor-Untereinheit kombinieren. Beispiele für Cytokin-Rezeptoren, von denen derartige bispezifische Immunadhäsinmoleküle hergestellt werden können, sind TPO- (oder mpl-Ligand), EPO-, G-CSF-, IL-4-, IL-7-, GH-, PRL-, IL-3-, GM-CSF-, IL-5-, IL-6-, LIF-, OSM-, CNTF- und IL-2-Rezeptoren. Alternativ dazu kann ein Wnt-Polypeptid bei der Erzeugung eines bispezifischen Immunadhäsins mit einem anderen Cytokin, wie den hierin beispielhaft angeführten, kombiniert werden. Für bispezifische Moleküle, wie den hierin beispielhaft angeführten, sind aufgrund der einfachen Reinigung trimere Moleküle vorteilhaft, die aus einer chimären Antikörper-Schwerkette in einem Arm und einem chimären Antikörper-Schwerketten-Leichtketten-Paar im anderen Arm ihrer Antikörper-artigen Struktur bestehen. Im Gegensatz zu Antikörper-erzeugenden Quadromen, die traditionellerweise für die Produktion bispezifischer Immunadhäsine verwendet werden, die ein Gemisch aus 10 Tetrameren erzeugen, ergeben Zellen, die mit Nucleinsäure transfiziert sind, die für die drei Ketten einer trimeren Immunadhäsin-Struktur kodieren, ein Gemisch aus nur drei Molekülen, und die Reinigung des erwünschten Produktes aus diesem Gemisch ist entsprechend einfacher.
  • 10. Derivate von Wnt-Polypeptiden mit langer Halbwertszeit
  • Funktionelle Wnt-Polypeptid-Derivate zur Verwendung bei den Verfahren gemäß vorliegender Erfindung umfassen Wnt-Immunglobulin-Chimären (Immunadhäsine) und andere Moleküle mit längerer Halbwertszeit. Andere Derivate der Wnt-Polypeptide, die eine längere Halbwertszeit aufweisen als die nativen Moleküle, umfassen das Wnt-Polypeptid oder eine Wnt-Immunglobulin-Chimäre, die kovalent an ein nicht proteinartiges Polymer gebunden ist. Das nicht proteinartige Polymer ist üblicherweise ein hydrophiles synthetisches Polymer, d. h. ein Polymer, das ansonsten in der Natur nicht vorkommt. Es sind jedoch auch Polymere nützlich, die in der Natur vorkommen und durch rekombinante oder In-vitro-Verfahren hergestellt werden, ebenso wie Polymere, die aus nativen Quellen isoliert werden. Hydrophile Polyvinylpolymere fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, z. B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Besonders nützlich sind Polyalkylenether, wie Polyethylenglykol (PEG); Poylalkylene, wie Polyoxyethylen, Polyoxypropylen und Blockcopolymere aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (PluronicsTM); Polymethacrylate; Carbomere; verzweigte oder unverzweigte Polysaccharide, die die Saccharid-Monomere D-Mannose, D- und L-Galactose, Fucose, Fructose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Glucuronsäure, Sialsäure, D-Galacturonsäure, D-Mannuronsäure (z. B. Polymannuronsäure oder Algininsäure), D-Glucosamin, D-Galactosamin, D-Glucose und Neuraminsäure, einschließlich Homopolysacchariden und Heteropolysacchariden, wie Lactose, Amylopectin, Stärke, Hydroxyethylstärke, Amylose, Dextransulfat, Dextran, Dextrine, Glycogen, oder die Polysaccharid-Untereinheit von Säuremucopolysacchariden, z. B. Hyaluronsäure; Polymere von Zuckeralkoholen, wie Polysorbit und Polymannit; Heparin oder Heparon. Das Polymer vor der Vernetzung muss nicht wasserlöslich sein, ist es aber vorzugsweise, aber das fertige Konjugat muss wasserlöslich sein. Außerdem sollte das Polymer in der Konjugatform nicht in hohem Maße immunogen sein, und ebenso wenig sollte es Viskosität aufweisen, die mit intravenöser Infusion oder Injektion inkompatibel ist, wenn beabsichtigt ist, es auf solchen Wegen zu verabreichen.
  • Vorzugsweise enthält das Polymer nur eine einzige Gruppe, die reaktiv ist. Das trägt dazu bei, die Vernetzung von Proteinmolekülen zu vermeiden. Es liegt jedoch im Schutz umfang der vorliegenden Erfindung, die Reaktionsbedingungen zu optimieren, um die Vernetzung zu verringern, oder die Reaktionsprodukte durch Gelfiltration oder Chromatographiesiebe zu reinigen, um im Wesentlichen homogene Derivate zu gewinnen.
  • Das Molekulargewicht des Polymers kann wünschenswert im Bereich von etwa 100 bis 500.000 liegen und beträgt vorzugsweise von etwa 1.000 bis 20.000. Das gewählte Molekulargewicht hängt von der Natur des Polymers und dem Substitutionsgrad ab. Im Allgemeinen ist das Molekulargewicht, das eingesetzt werden kann, um so niedriger, je größer die Hyrophilie des Polymers und je höher der Substitutionsgrad ist. Optimale Molekulargewichte werden durch Routineversuche ermittelt.
  • Das Polymer ist im Allgemeinen durch einen multifunktionellen Venetzer, der mit dem Polymer und einem oder mehreren Aminosäure- oder Zuckerrest(en) des Wnt-Polypeptids oder der Wnt-Immunglobulinchimäre, das bzw. die zu binden ist bzw. sind, kovalent an das Wnt-Polypeptid oder an die Wnt-Immunglobulinchimäre gebunden. Es fällt jedoch in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, das Polymer direkt zu vernetzen, indem ein derivatisiertes Polymer mit dem Hybrid umgesetzt wird oder umgekehrt.
  • Die Stelle der kovalenten Vernetzung auf dem Wnt-Polypeptid oder der Wnt-Immunglobulinchimäre umfasst die N-terminate Aminogruppe und die ε-Aminogruppen, die auf Lysinresten zu finden sind, sowie andere Amino-, Imino-, Carboxy-, Sulfhydryl-, Hydroxy- oder andere hydrophile Gruppen. Das Polymer kann kovalent direkt an den Hybrid gebunden werden, ohne dass ein multifunktioneller (üblicherweise ein bifunktioneller) Vernetzer verwendet wird. Kovalente Bindung an Aminogruppen wird durch bekannte Chemie auf Basis von Cyanurchlorid, Carbonyldiimidazol, reaktiven Aldehydgruppen (PEG-Alkoxid plus Diethylacetal von Bromacetaldehyd; PEG plus DMSO und Essigsäureanhydrid oder PEG-Chlorid plus dem Phenoxid von 4-Hydroxybenzaldehyd, aktiven Succinimidylestern, aktiviertem Dithiocarbonat-PEG, 2,4,5-Trichlorphenylchlorformat- oder P-Nitrophenylchlorformat-aktiviertem PEG) erreicht. Carboxygruppen werden durch Kopplung von PEG-Amin unter Einsatz von Carbodiimid derivatisiert.
  • Polymere werden durch Oxidation unter Einsatz von Chemikalien, z. B. Metaperiodat, oder Enzymen, z. B. Glucose- oder Galactoseoxidase (die beide das Aldehydderivate des Kohlenhydrats erzeugen), gefolgt von Umsetzung mit Hydrazid oder Amino-derivatisierten Polymeren an Oligosaccharidgruppen konjugiert, auf die gleiche Weise wie von Heitzmann et al., P. N. A. S. 71, 3537–41 (1974), oder Bayer et al., Methods in Enzymology 62, 310 (1979), für die Markierung von Oligosacchariden mit Biotin oder Avidin beschrieben. Weiters sind andere chemische oder enzymatische Verfahren besonders vorteilhaft, die bisher eingesetzt worden sind, um Oligosaccharide zu binden, da im Allgemeinen weniger Substitutionen als Aminosäurestellen für die Derivatisierung vorhanden sind und die Oligosaccharidprodukte daher homogener sind. Die Oligosaccharidsubstituenten werden vor der Polymer-Derivatisierung auch gegebenenfalls durch Enzym-Verdau modifiziert, um Zucker zu entfernen, beispielsweise durch Neuraminidase-Verdau.
  • Das Polymer trägt eine Gruppe, die mit der Aminosäure-Seitenkette oder dem N- oder C-Terminus des gebundenen Polypeptids direkt reaktiv ist oder die mit dem multifunktionellen Vernetzer reaktiv ist. Im Allgemeinen sind Polymere, die derartige reaktive Gruppen aufweisen, für die Herstellung immobilisierter Proteine bekannt. Um hier derartige Chemie einzusetzen, sollte ein wasserlösliches Polymer eingesetzt werden, das ansonsten auf die gleiche Weise derivatisiert wird wie unlösliche Polymere, die bisher für die Protein-Immobilisierung eingesetzt worden sind. Cyanogenbromid-Aktivierung ist ein besonders nützliches Verfahren zum Einsatz bei der Vernetzung von Polysacchariden.
  • „Wasserlöslich" bedeutet in Bezug auf das Ausgangspolymer, dass das Polymer oder seine reaktive Zwischenverbindung, die für die Konjugation eingesetzt wird, ausreichend wasserlöslich ist, um an einer Derivatisierungsreaktion teilzunehmen.
  • „Wasserlöslich" in Bezug auf das Polymerkonjugat bedeutet, dass das Konjugat in physiologischen Fluids wie Blut löslich ist.
  • Der Substitutionsgrad bei einem solchen Polymer variiert in Abhängigkeit von der Anzahl an reaktiven Stellen auf dem Protein abhängig davon, ob das gesamte Protein oder ein Fragment davon verwendet wird, ob das Protein eine Fusion mit einem heterologen Protein (z. B. einer Wnt-Immunglobulinchimäre) ist, vom Molekulargewicht, der Hydrophilie und anderen Eigenschaften des Polymers und den speziellen gewählten Proteinderivatisierungsstellen. Im Allgemeinen enthält das Konjugat etwa 1 bis 10 Polymermoleküle, während jede heterologe Sequenz mit einer im Wesentlichen unbegrenzten Anzahl an Polymermolekülen substituiert sein kann, so lange die erwünschte Aktivität nicht wesentlich beeinträchtigt wird. Der optimale Vernetzungsgrad lässt sich leicht durch eine Versuchsmatrix bestimmen, in der die Zeit, die Temperatur und andere Reaktionsbedingungen variiert werden, um den Substitutionsgrad zu verändern, woraufhin die Fähigkeit der Konjugate, auf die erwünschte Weise zu arbeiten, bestimmt wird.
  • Das Polymer, z. B. PEG, wird durch eine breite Auswahl von Verfahren vernetzt, die an sich für die kovalente Modifikation von Proteinen mit nicht proteinartigen Polymeren wie PEG bekannt sind. Bestimmte dieser Verfahren werden jedoch für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht bevorzugt. Cyanuronchlorid-Chemie führt zu vielen Nebenreaktionen, darunter Protein-Vernetzung. Außerdem kann sie mit besonders hoher Wahrscheinlich zur Inaktivierung von Proteinen führen, die Sulfhydrylgruppen enthalten. Carbonyldiimidazol-Chemie (Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131, 25–33 (1983)) erfordert einen hohen pH (> 8,5), was Proteine inaktivieren kann. Darüber hinaus ist, da die „aktivierte PEG"-Zwischenverbindung mit Wasser reagieren kann, ein sehr großer molarer Überschuss an „aktiviertem PEG" gegenüber Protein erforderlich. Die hohen PEG-Konzentrationen, die für die Carbonyldiimidazol-Chemie erforderlich sind, haben auch zu Problemen bei der Reinigung geführt, da sowohl Gelfiltrationschromatographie als auch hydrophile Wechselwirkungs-Chromatographie beeinträchtigt werden. Außerdem kann durch die hohe Konzentration an „aktiviertem PEG" Protein gefällt werden, ein Problem, das an sich bereits bekannt ist (Davis, US-Patent Nr. 4.179.337). Andererseits ist die Aldehyd-Chemie (Royer, US-Patent Nr. 4.002.531) effizienter, da sie nur ei nen 40fachen molaren Überschuss von PEG und eine 1- bis 2 stündige Inkubation erfordert. Das von Royer für die Herstellung des PEG-Aldehyds vorgeschlagene Mangandioxid ist jedoch „aufgrund der ausgeprägten Tendenz von PEG zur Bildung von Komplexen mit Oxidationsmitteln auf Metall-Basis" problematisch (Harris et al., J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, 341–52 (1984)). Der Einsatz einer Moffatt-Oxidation unter Verwendung von DMSO und Essigsäureanhydrid beseitigt dieses Problem. Außerdem muss das von Royer vorgeschlagene Natriumborhydrid bei einem hohen pH eingesetzt werden und weist eine deutliche Tendenz zur Reduktion von Disulfid-Bindungen auf. Im Gegensatz dazu wird Natriumcyanborhydrid bevorzugt, das bei neutralem pH wirksam ist und kaum die Tendenz aufweist, Disulfid-Bindungen zu reduzieren.
  • Funktionalisierte PEG-Polymere zum Modifizieren des Wnt-Polypeptids oder der Wnt-Immunglobulinchimären gemäß vorliegender Erfindung sind von Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL, USA) erhältlich. Derartige im Handel erhältliche PEG-Derivate umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Amino-PEG, PEG-Aminosäureester, PEG-Hydrazid, PEG-Thiol, PEG-Succinat, carboxymethyliertes PEG, PEG-Propionsäure, PEG-Aminosäuren, PEG-Succinimidylsuccinat, PEG-Succinimidylpropionat, Succinimidylester von carboxymethyliertem PEG, Succinimidylcarbonat von PEG, Succinimidylester von Aminosäure-PEGs, PEG-Oxycarbonylimidazol, PEG-Nitrophenylcarbonat, PEG-Tresylat, PEG-Glycidylether, PEG-Aldehyd, PEG-Vinylsulfon, PEG-Maleimid, PEG-Orthopyridyldisulfid, heterofunktionelle PEGs, PEG-Vinylderivate, PEG-Silane und PEG-Phospholide. Die Reaktionsbedingungen für die Kopplung dieser PEG-Derivate variieren in Abhängigkeit vom Protein, dem erwünschten PEGylierungsgrad und dem eingesetzten PEG-Derivat. Zu den Faktoren, die an der Wahl der PEG-Derivate beteiligt sind, gehören: der erwünschte Punkt der Bindung (Lysin oder Cystein), die hydrolytische Stabilität und Reaktivität der Derivate, Stabilität, Toxizität und Antigenität der Bindung, Eignung zur Analyse usw. Spezifische Anweisungen zur Verwendung eines bestimmten Derivats sind vom Hersteller erhältlich.
  • Die Konjugate mit langer Halbwertszeit gemäß vorliegender Erfindung werden durch Gelfiltration von den unreagierten Ausgangsmaterialien getrennt. Heterologe Spezies der Konjugate werden auf die gleiche Weise voneinander getrennt. Das Polymer kann auch wasserunlöslich sein, ebenfalls ein hydrophiles Gel.
  • Die Konjugate können auch durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden. Die Chemie vieler der elektrophil aktivierten PEGs führt zu einer Reduktion der Aminogruppenladung des PEGylierten Produktes. So kann hochauflösende Ionenaustauschchromatographie eingesetzt werden, um die freien und konjugierten Proteine zu trennen und Spezies mit unterschiedlichem Ausmaß an PEGylierung zu trennen. Tatsächlich ist die Trennung unterschiedlicher Spezies (z. B. solcher, die einen oder zwei PEG-Reste enthalten) auch aufgrund des Unterschieds in den Ioneneigenschaften der nicht umgesetzten Aminosäuren möglich.
  • B. Therapeutische Einsätze für das Wnt-Polypeptid
  • Es wird angenommen, dass das Wnt-Polypeptid und das Wnt-Polypeptidgen therapeutische Verwendung zur Verabreichung an ein Säugetier bei der Behandlung von Erkrankungen oder Störungen findet, die durch eine Abnahme hämatopoetischer Zellen gekennzeichnet sind. Beispiele für diese Erkrankungen oder Störungen sind: Anämie (einschließlich makrozytischer und aplastischer Anämie); Thrombozytopenie; Hypoplasie; Verbrauchskoagulopathie (DIC); Myelodysplasie; Immun- (Autoimmun-) thrombozytopenische Purpura (ITP); und HIV-induzierte ITP. Außerdem können diese Wnt-Polypeptidmoleküle bei der Behandlung von Patienten nützlich sein, die eine Blutung erlitten haben. Wnt-Polypeptid und Wnt-Polypeptidgen, die zu einer Erhöhung der Proliferation hämatopoetischer Zellen führen, können auch eingesetzt werden, um die Repopulation reifer Blutzelllinien bei Zellen zu verbessern, die Chemo- oder Strahlentherapie oder Knochenmarkstransplantationstherapie unterzogen worden sind. Im Allgemeinen wird erwartet, dass diese Moleküle zu einer Verbesserung der Proliferation, Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung von primitiven hämatopoetischen Zellen führen.
  • Das Wnt-Polypeptid kann in den oben angeführten klinischen Umständen allein oder in Kombination mit einem oder mehreren Cytokinen, darunter Wachstumsfaktoren oder Antikörpern, verabreicht werden. Das kann eine wirksame Verringerung der Dosis an Wnt-Polypeptid erleichtern. Geeignete Dosen für derartige zusätzliche Moleküle werden nachstehend erörtert.
  • Bei Gentherapie-Anwendungen werden Gene in Zellen eingebracht, um In-vivo-Synthese eines therapeutisch wirksamen genetischen Produktes zu erreichen, beispielsweise zum Ersetzen eines defekten Gens. „Gentherapie" umfasst sowohl herkömmliche Gentherapie, bei der eine bleibende Wirkung durch eine einzige Behandlung erzielt wird, und die Verabreichung von Gen-Therapiemitteln, was die einmalige oder wiederholte Verabreichung eines therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNAs und -DNAs können als Therapiemittel zum Blockieren der Expression bestimmter Gene in vivo eingesetzt werden. Es ist bereits gezeigt worden, dass kurze Antisense-Oligonucleotide in Zellen importiert werden können, wo sie trotz ihrer geringen intrazellulären Konzentrationen, die durch ihre beschränkte Aufnahme durch die Zellmembran verursacht wird, als Inhibitoren wirken (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143–4146 (1986)). Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um ihre Aufnahme zu verstärken, beispielsweise durch Substitution ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
  • Es steht eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung, um Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen einzuführen. Die Techniken variieren in Abhängigkeit davon, ob die Nucleinsäure in kultivierte Zellen in vitro oder in vivo in die Zellen des beabsichtigten Wirts transferiert werden. Techniken, die für den Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen in vitro geeignet sind, umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Kalziumphosphat-Fällungsverfahren usw. Zu den zurzeit bevorzugten In-vivo-Gentransfertechniken gehören die Transfektion mit viralen (typischerweise retroviralen) Vektoren und durch virale Hüllprotein-Liposom-vermit telte Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäurequelle mit einem Mittel zu versehen, das auf die Zielzellen abzielt, wie z. B. einem Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembranprotein oder die Zielzelle spezifisch ist, einem Liganden für einen Rezeptor auf der Zielzelle usw. Wenn Liposome eingesetzt werden, können Proteine, die sich an ein Zelloberflächenmembranprotein binden, das mit Endocytose assoziiert ist, für das Abzielen und/oder zur Erleichterung der Aufnahme eingesetzt werden, z. B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die bei der Zyklisierung Internalisierung erfahren, sowie Proteine, die auf intrazellulare Lokalisation abzielen und die intrazellulare Halbwertszeit erhöhen. Die Technik der Rezeptor-vermittelten Endocytose wird beispielsweise von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987); und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414 (1990) beschrieben. Ein Überblick über die zurzeit bekannten Genmarkierungs- und Gentherapie-Protokolle ist Anderson et al., Science 256, 808–813 (1992), zu entnehmen.
  • Für therapeutische Anwendungen wird das gemäß vorliegender Erfindung nützliche Wnt-Polypeptid einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, in einer physiologisch annehmbaren Dosisform verabreicht, einschließlich jener, die einem Menschen intravenös als Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über einen bestimmten Zeitraum verabreicht werden können. Alternative Verabreichungswege sind intramuskuläre, intraperitoneale, intra-cerebrospinale, subkutane, intra-artikulare, intrasynoviale, intrathekale, orale, topische oder Inhalations-Wege. Die Wnt-Polypeptide werden auch auf geeignete Weise auf intratumoralem, peritumoralem, intraläsionalem oder periläsionalem Weg oder an die Lymphe verabreicht, um lokale sowie systemische therapeutische Wirkungen zu erzielen.
  • Derartige Dosisformen umfassen physiologisch annehmbare Träger, die an sich nichttoxisch und nicht-therapeutisch sind. Beispiele für derartige Träger sind Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine, wie Humanserumalbumin, Puffersubstanzen, wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, partielle Glyceridgemische von gesättigten Pflanzenfettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyten, wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidale Kieselsäure, Magnesiumtrisilikat, Polyvinylpyrrolidon, Substanzen auf Cellulose-Basis und PEG. Träger für topische oder auf Gel basierende Formen von Wnt-Polypeptiden sind Polysaccharide, wie Natriumcarboxymethylcellulose oder -methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymere, PEG und Holzwachsalkohole. Für alle Verabreichungen werden geeigneterweise herkömmliche Depotformen verwendet. Derartige Formen sind beispielsweise Mikrokapseln, Nanokapseln, Liposome, Pflaster, Inhalationsformen, Nasensprays, Sublingualtabletten und Retard-Präparate. Das Wnt-Polypeptid wird typischerweise in derartigen Vehikeln in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml formu liert.
  • Geeignete Beispiele für Retard-Präparate sind halbdurchlässige Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die das Wnt-Polypeptid enthalten, wobei derartige Matrizen in Gestalt von Formteilen vorliegen, z. B. als Filme oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrizen sind Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat) wie von Langer et al., oben, und Langer, oben, beschrieben oder Poly(vinylalkohol), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere aus L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., oben), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., oben), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie das Lupron DepotTM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat bestehen) sowie Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine für kürzere Zeiträume frei. Wenn eingekapselte Wnt-Polypeptide für eine lange Zeit im Körper verbleiben, können sie als Ergebnis des Einwirkens von Feuchtigkeit bei 37°C denaturiert werden oder aggregieren, was zu einem Verlust der biologischen Wirkung und möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. In Abhängigkeit vom beteiligten Mechanismus können zweckmäßige Strate gien für die Proteinstabilisierung entwickelt werden. Wenn beispielsweise entdeckt wird, dass der Aggregationsmechanismus intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thio-Disulfid-Austausch ist, kann Stabilisierung erreicht werden, indem Sulfhydrylreste modifiziert werden, aus sauren Lösungen lyophilisiert wird, der Feuchtigkeitsgehalt reguliert wird, wobei geeignete Additive eingesetzt und spezifische Polymermatrixzusammensetzungen entwickelt werden.
  • Retard-Wnt-Polypeptidzusammensetzung umfassen auch liposomal festgehaltene Polypeptide. Liposome, die das Wnt-Polypeptid enthalten, werden nach bekannten Verfahren hergestellt, wie in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980), und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben. Üblicherweise gehören die Liposome dem kleinen (etwa 200 bis 800 Angstrom) unilamellaren Typ an, bei dem der Lipidgehalt über etwa 30 Mol-% Cholesterin liegt, wobei das gewählte Verhältnis für die optimale Wnt-Polypeptid-Therapie eingestellt wird. Liposome mit erhöhter Zirkulationszeit werden in US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
  • Zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von Erkrankung hängt die geeignete Dosis des Wnt-Polypeptids von der Art der zu behandelnden Erkrankung, wie oben definiert, der Schwere und dem Verlauf der Erkrankung, davon, ob die Antikörper zu präventiven oder therapeutischen Zwecken eingesetzt werden, von der vorherigen Therapie, der Krankengeschichte des Patienten und der Reaktion auf Wnt-Polypeptid sowie dem Ermessen des behandelnden Arztes ab. Das Wnt-Polypeptid wird dem Patienten geeigneterweise einmal oder über eine Reihe von Behandlungen verabreicht.
  • Je nach der Art und Schwere der Krankheit stellen etwa 1 μg/kg bis 15 mg/kg Wnt-Polypeptid eine anfängliche Kandidatendosis zur Verabreichung an einen Patienten dar, gleichgültig, ob beispielsweise durch eine oder mehrere getrennte Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion. Eine typische tägliche Dosis kann im Bereich von etwa 1 μg/kg bis 100 μg/kg (z. B. 1–50 μg/kg) oder mehr liegen, je nach den oben ge nannten Faktoren. Beispielsweise kann die Dosis die gleiche wie jene für andere Cytone, wie G-CSF, GM-CSF und EPO, sein. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger wird die Behandlung in Abhängigkeit vom Zustand fortgesetzt, bis eine gewünschte Unterdrückung der Krankheitssymptome auftritt. Es können jedoch auch andere Dosisschemata nützlich sein. Das Fortschreiten dieser Therapie lässt sich leicht durch herkömmliche Techniken und Tests überwachen.
  • Wenn gemeinsam mit dem Wnt-Polypeptid ein oder mehrere Cytokine verabreicht werden, können geringere Dosen des Wnt-Polypeptids eingesetzt werden. Geeignete Dosen für ein Cytokin liegen im Bereich von etwa 1 μg/kg bis etwa 15 mg/kg Cytokin. Eine typische tägliche Dosis des Cytokins kann im Bereich von etwa 1 μg/kg bis 100 μg/kg (z. B. 1–50 μg/kg) oder mehr liegen. Beispielsweise kann die Dosis die gleiche wie jene für andere Cytokine, wie G-CSF, GM-CSF und EPO, sein. Das oder die Cytokine) kann bzw. können vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung des Wnt-Polypeptids verabreicht werden. Das bzw. die Cytokine) und das Wnt-Polypeptid können kombiniert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zur gleichzeitigen Verabreichung an das Säugetier zu bilden. Bei bestimmten Ausführungsformen sind die Mengen an Wnt-Polypeptid und Cytokin solche, dass eine synergistische Repopulation von Blutzellen (oder eine synergistische Zunahme der Proliferation und/oder Differenzierung hämatopoetischer Zellen) beim Säugetier auftritt, nachdem diesem das Wnt-Polypeptid und das Cytokin verabreicht worden sind. Mit anderen Worten, die koordinierte Wirkung der zwei oder mehr Mittel (d. h. des Wnt-Polypeptids und des Cytokins bzw. der Cytokine) in Bezug auf die Repopulation von Blutzellen (oder Proliferation/Differenzierung von hämatopoetischen Zellen) ist größer als die Summe der individuellen Wirkungen dieser Moleküle.
  • Therapeutische Formulierungen von Wnt-Polypeptid werden zur Lagerung hergestellt, indem Wnt-Polypeptid mit dem erwünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Hrsg. A. Osol (1980)) in Form von lyophilisiertem Kuchen oder wässrigen Lösungen gemischt werden. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für die Rezipienten in den eingesetzten Dosen und Konzentrationen ungiftig und umfassen Puffer, wie Posphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, darunter Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (unter etwa 10 Resten); Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, darunter Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie EDTA; Zuckeralkohole, wie Mannit oder Sorbit; Salz-bildende Gegenionen, wie Natrium; und/oder nicht-ionische Tenside, wie Tween, PluronicsTM oder Polyethylenglykol (PEG).
  • Das Wnt-Polypeptid kann auch in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden (beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)mikrokapseln), in kolloidalen Arzneimittelabgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nano-Teilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen sein. Derartige Techniken werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, oben, offenbart.
  • Wnt-Polypeptid zur Verwendung bei der Verabreichung in vivo muss steril sein. Das lässt sich leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach der Lyophilisierung und Rekonstitution erreichen. Wnt-Polypeptid wird normalerweise in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert. Therapeutische Wnt-Polypeptidzusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, beispielsweise einen Beutel oder eine Phiole für intravenöse Lösung mit einem Stöpsel, der mit einer Hyperdermalinjektionsnadel durchstochen werden kann.
  • Bei topischer Verabreichung wird das Wnt-Polypeptid geeigneterweise mit anderen Bestandteilen kombiniert, wie Trägern und/oder Adjuvanzien. Es gibt keine Beschränkungen für die Art derartiger anderer Bestandteile, außer jener, dass sie physiologisch an nehmbar und für ihre beabsichtigte Verabreichung wirksam sein müssen und die Aktivität der Wirkbestandteile der Zusammensetzung nicht beeinträchtigen können. Beispiele für geeignete Vehikel sind Salben, Cremen, Gele oder Suspensionen, mit oder ohne gereinigtem Collagen. Es können auch Hautbinden, -pflaster und -bandagen mit den Zusammensetzungen imprägniert werden, vorzugsweise in flüssiger oder halbflüssiger Form.
  • Um eine Gelformulierung zu erhalten, kann das in einer flüssigen Zusammensetzung formulierte Wnt-Polypeptid mit einer wirksamen Menge eines wasserlöslichen Polysaccharids oder synthetischen Polymers wie PEG gemischt werden, um ein Gel mit einer angemessenen Viskosität zur topischen Anwendung zu bilden. Das Polysaccharid, das verwendet werden kann, umfasst beispielsweise Cellulosederivate, wie veretherte Cellulosederivate, einschließlich Alkylcellulosen, Hydroxyalkylcellulosen und Alkylhydroxyalkylcellulosen, beispielsweise Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Hydroxypropylcellulose; Stärke und fraktionierte Stärke; Agar; Algininsäure und Alginate; Gummi Arabicum; Pullullan; Agarose; Carrageenan; Dextrane; Dextrine; Fructane; Inulin, Mannane; Xylane; Arabinane; Chitosane; Glykogene; Glucane; sowie synthetische Biopolymere; sowie Kautschuke, wie Xanthanlösung; Guar Gum; Johannisbrotgummi; Gummi Arabicum; Tragacanthgummi; und Karayagummi; sowie Derivate und Gemische davon. Das bevorzugte Gelierungsmittel gemäß vorliegender Erfindung ist eines, das für biologische Systeme inert, nicht toxisch, einfach herzustellen und nicht zu verlaufend oder viskos ist und das darin gehaltene Wnt-Polypeptid nicht destabilisiert.
  • Vorzugsweise ist das Polysaccharid eine verethertes Cellulosederivat, mehr bevorzugt eines, das gut definiert, gereinigt und in der USP angeführt ist, beispielsweise Methylcellulose- und Hydroxyalkylcellulosederivate, wie Hydroxypropylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose. Am meisten bevorzugt wird gemäß vorliegender Erfindung Methylcellulose.
  • Das für die Gelierung nützliche Polyethylenglykol ist typischerweise ein Gemisch aus PEGs mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, um die entsprechende Viskosität zu erzielen. Beispielsweise ist ein Gemisch aus einem PEG mit einem Molekulargewicht von 400 bis 600 und einem mit einem Molekulargewicht von 1.500 für diesen Zweck wirksam, wenn es im geeigneten Verhältnis gemischt ist, um eine Paste zu erhalten.
  • Der Begriff „wasserlöslich" in Bezug auf die Polysaccharide und PEGs ist so zu verstehen, dass kolloidale Lösungen und Dispersionen umfasst sind. Im Allgemeinen wird die Löslichkeit der Cellulosederivate durch den Grad der Substitution von Ethergruppen bestimmt, und die gemäß vorliegender Erfindung nützlichen stabilisierenden Derivate sollten eine ausreichende Menge derartiger Ethergruppen pro Anhydroglucoseeinheit in der Cellulosekette aufweisen, um die Derivate wasserlöslich zu machen. Ein Grad der Ethersubstitution von zumindest 0,35 Ethergruppen pro Anhydroglucoseinheit ist im Allgemeinen ausreichend. Außerdem können die Cellulosederivate in Form von Alkalimetaltsalzen, beispielsweise der Li-, Na-, K- oder Cs-Salze, vorliegen.
  • Wenn Methylcellulose im Gel eingesetzt wird, umfasst es vorzugsweise etwa 2 bis 5%, mehr bevorzugt etwa 3% des Gels, und das Wnt-Polypeptid ist in einer Menge von etwa 300 bis 1.000 mg pro ml Gel vorhanden.
  • Eine wirksame Menge an Wnt-Polypeptid zum therapeutischen Einsatz hängt beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten ab. Demgemäß ist es notwendig, dass der Therapeut die Dosis titriert und den Verabreichungsweg nach Bedarf modifiziert, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen. Typischerweise verabreicht der Kliniker das Wnt-Polypeptid, bis eine Dosis erreicht ist, die die gewünschte Wirkung erzielt. Eine typische Tagesdosis für die systemische Behandlung kann im Bereich von etwa 1 μg/kg bis zu 10 mg/kg oder mehr betragen, in Abhängigkeit von den oben genannten Faktoren. Als alternativer allgemeiner Vorschlag wird das Wnt-Polypeptid-Rezeptor in einer Dosis formuliert und an den Zielort oder ein Zielgewebe abgegeben, mit der im Gewebe eine Wnt-Polypeptid-Menge über etwa 0,1 ng/cm3 bis zu einer maximalen Dosis erzielt werden kann, die wirksam aber nicht übermäßig toxisch ist. Diese Konzentration innerhalb des Gewebes sollte falls möglich durch Verabreichungssysteme, wie kontinuierliche Infusion, nachhaltige Freisetzung, topische Anwendung oder Injektion in empirisch ermittelten Häufigkeiten, beibehalten werden. Der Fortschritt dieser Therapie lässt sich durch herkömmliche Tests leicht überwachen.
  • C. Nicht-therapeutische Verwendungen für das Wnt-Polypeptid
  • Wnt-Nucleinsäure ist nützlich, um durch in der vorliegenden Beschreibung beispielhaft angeführte rekombinante Techniken Wnt-Polypeptid herzustellen, das dann für die Herstellung von Anti-Wnt-Antikörpern mit verschiedenen in der Folge beschriebenen Einsatzmöglichkeiten verwendet werden kann.
  • Das Wnt-Polypeptid (Polypeptid oder Nucleinsäure) kann verwendet werden, um die Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen in vitro herbeizuführen. Insbesondere ist daran gedacht, dieses Molekül verwenden zu können, um die Proliferation von Stammzellen/Progenitorzell-Populationen herbeizuführen (z. B. flASK-Zellpopulationen, die wie im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben erhalten werden). Auf diese Zellen, die ex vivo zu züchten sind, können gleichzeitig andere bekannte Wachstumsfaktoren oder Cytokine einwirken, wie die hierin beschriebenen. Das führt zur Proliferation, Differenzierung und/oder Aufrechterhaltung der Zellen.
  • Gemäß wieder einem anderen Aspekt der Erfindung kann das Wnt-Polypeptid für die Affinitätsreinigung von Wnt-Rezeptor verwendet werden. Kurz gesagt umfasst diese Technik Folgendes, (a) das Kontaktieren einer Wnt-Rezeptor-Quelle mit einem immobilisierten Wnt-Polypeptid unter solchen Bedingungen, dass der zu reinigende Wnt-Rezeptor selektiv an den immobilisierten Rezeptor adsorbiert wird; (b) das Waschen des immobilisierten Wnt-Polypeptids und seines Trägers, um nicht adsorbiertes Material zu entfernen; und (c) das Eluieren der Wnt-Rezeptormoleküle vom immobilisiertem Wnt-Poly peptid, an das sie adsorbiert sind, mit einem Eluierungspuffer. Gemäß einer Ausführungsform für Affinitätsreinigung ist Wnt-Polypeptid kovalent an eine inerte und poröse Matrix (z. B. mit Cyanogenbromid umgesetzte Agarose) gebunden. Bevorzugt wird ein Wnt-Polypeptid-Immunadhäsin, das auf einer Protein-A-Säule immobilisiert ist. Eine Lösung, die Wnt-Rezeptor enthält, wird dann durch das Chromatographiematerial hindurchgeschickt. Der Wnt-Rezeptor wird an der Säule adsorbiert und wird daraufhin freigesetzt, indem die Eluierungsbedingungen geändert werden (z. B. durch Änderung des pH oder der Ionenstärke).
  • Das Wnt-Polypeptid kann zum kompetitiven Screenen auf potentielle Agonisten oder Antagonisten für die Bindung an die Zelloberflächenrezeptoren verwendet werden. Derartige Agonisten oder Antagonisten können potentielle Therapiemittel darstellen.
  • Bei einer bevorzugten Technik zum Identifizieren von Molekülen, die sich an das Wnt-Polypeptid binden, wird ein chimäres Polypeptid (z. B. ein Epitop-markiertes Wnt-Polypeptid oder Wnt-Polypeptid-Immunadhäsin) verwendet, das an eine feste Phase, wie den Napf einer Testplatte, gebunden ist. Bindung von Molekülen, die gegebenenfalls markiert (z. B. radiomarkiert) sind, an den immobilisierten Rezeptor kann bewertet werden.
  • Die Wnt-Polypeptide sind auch als Molekulargewichtsmarker nützlich. Um ein Wnt-Polypeptid als Molekulargewichtsmarker zu verwenden, wird beispielsweise Gelfiltrationschromatographie oder SDS-PAGE eingesetzt, um Proteine) abzutrennen, für das bzw. die das Molekulargewicht im Wesentlichen auf normalem Weg ermittelt werden soll. Wnt-Polypeptid und andere Molekulargewichtsmarker werden als Standards verwendet, um eine Bandbreite von Molekulargewichten bereitzustellen. Beispielsweise können Phosphorylase b (Molekulargewicht = 97.400), Rinderserumalbumin (Molekulargewicht = 68.000), Ovalbumin (Molekulargewicht = 46.000), ein Wnt-Polypeptid (Molekulargewicht in Abhängigkeit von der Kodierungssequenz, wie von Gavin et al., oben, beschrieben, beispielsweise von 38.000 bis 42.000) Trypsininhibitor (Molekulargewicht = 20.100) und Lysozym (Molekulargewicht = 14.400) als Molekulargewichtsmarker verwendet werden. Die anderen hier erwähnten Molekulargewichtsmarker sind im Handel von Amersham Corporation, Arlington Heights, Illinois, USA, erhältlich. Die Molekulargewichtsmarker sind im Allgemeinen markiert, um ihre Detektion zu erleichtern. Beispielsweise können die Marker biotinyliert sein und können nach der Trennung mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase inkubiert werden, so dass die verschiedenen Marker durch Lichtdetektion detektiert werden können.
  • Das gereinigte Wnt-Polypeptid und die dafür kodierende Nucleinsäure können auch als Reagenzien für Untersuchungen des Mechanismus von Wnt-Polypeptid und seines Rezeptors eingesetzt werden, um die Rolle des Wnt-Polypeptids und des Wnt-Rezeptors bei normalem Wachstum und normaler Entwicklung sowie anormales Wachstum und anormale Entwicklung zu untersuchen, beispielsweise bei Malignitäten oder bei Erkrankungen oder Störungen.
  • D. Wnt-Polypeptid-Antikörper-Herstellung
  • 1. Polyklonale Antikörper
  • Zu den potentiellen therapeutischen Anwendungen für Anti-Wnt-Antikörper, insbesondere neutralisierende Antikörper, gehören die Behandlung von Störungen, Stammzelltumoren und anderen Tumoren an Stellen der Wnt-Expression, einschließlich jener Tumore, die durch Überexpressionen von Wnts gekennzeichnet sind.
  • Polyklonale Antikörper werden im Allgemeinen in Tieren durch mehrere subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des relevanten Antigens und eines Adjuvans gezüchtet. Es kann nützlich sein, das relevante Antigen an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z. B. Schlüsselloch-Limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor, indem ein biofunktionelles oder derivatisierendes Mittel eingesetzt wird, beispielsweise Male imidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl2 oder R1N=C=NR, worin R und R1 unterschiedliche Alkylgruppen sind.
  • Tiere werden gegen das Antigen, immunogene Konjugate oder Derivate immunisiert, indem 1 mg oder 1 μg des Peptids oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina Freundschem Komplettem Adjuvans kombiniert und die Lösung intradermal an mehreren Stellen injiziert wird. Einen Monat später erhalten die Tiere an mehreren Stellen eine subkutane Boosterinjektion mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge an Peptid oder Konjugat in Freundschem Komplettem Adjuvans. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf Antikörpertiter getestet. Die Tiere erhalten bis zu den Titerplateaus Boosterinjektionen. Vorzugsweise erhält das Tier eine Boosterinjektion mit dem Konjugat desselben Antigens, aber konjugiert an ein anderes Protein und/oder durch einen anderen Vernetzer. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Auch werden auf geeignete Weise Aggregierungsmittel wie Alaun verwendet, um die Immunreaktion zu verstärken.
  • 2. Monoklonale Antikörper
  • Monoklonale Antikörper werden von einer Population im Wesentlichen homogener Antikörper erhalten, d. h. die individuellen Antikörper, aus denen die Population besteht, sind mit Ausnahme möglicher natürlich vorkommender Mutationen, die in geringeren Mengen vorhanden sein können, identisch. Somit gibt der Modifikator „monoklonal" an, dass der Antikörper das Merkmal aufweist, kein Gemisch aus diskreten Antikörpern zu sein. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper unter Einsatz des Hybridom-Verfahren hergestellt werden, das erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschreiben worden, oder sie können durch rekombinante DNA-Verfahren (Cabilly et al., oben) hergestellt werden.
  • Beim Hybridom-Verfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie ein Hamster, wie oben beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper erzeugen oder erzeugen können, die sich spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten werden dann mit unter Einsatz eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie Polyethylenglykol, mit Myelomzellen fusioniert, wodurch eine Hybridom-Zelle gebildet wird. (Goding, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, S. 59–103 (Academic Press, 1986)).
  • Die so hergestellten Hybridom-Zellen werden in ein geeignetes Kulturmedium eingesät und darin gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten, parentalen Myelomzellen hemmen. Wenn den parentalen Myelomzellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), Substanzen, die das Wachstum von Zellen mit HGPRT-Defizienz verhindern.
  • Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die wirksam fusioniert werden, die stabile Expression von Antikörper in hoher Menge durch die ausgewählten Antikörper produzierenden Zellen unterstützen und für ein Medium wie HAT-Medium empfindlich sind. Von diesen sind bevorzugte Myelom-Zelllinien Mäuse-Myelomlinien, wie jene, die von MOPC-21- und MPC-11-Mäusetumoren abgeleitet sind, die vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, erhältlich sind, und SP-2-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Human-Myelom- und Mäuse-Human-Heteromyelom-Zelllinien sind ebenfalls für die Erzeugung von monoklonalen Human-Antikörpern beschrieben worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoconal Antibody Production Techniques and Applications, S. 51–63 (Marcel Dekker, Inc., New York, (1987))).
  • Kulturmedium, in dem Hybridomzellen wachsen, wird bezüglich der Produktion monoklonaler Antikörper getestet, die gegen das Antigen gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität monoklonaler Antikörper, die durch Hybridomzellen erzeugt werden, durch Immunfällung oder durch einen Bindungstest in vitro bestimmt, wie Radioimmuntest (RIA) oder Enzym-gebundenen Immunabsorbenstest (ELISA).
  • Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson et al., Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
  • Nachdem Hybridomzellen identifiziert worden sind, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität erzeugen, können die Klone durch Verfahren mit limitierter Verdünnung subkloniert und durch Standardtechniken gezüchtet werden (Goding, oben). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck sind beispielsweise D-MEModer RPMI-16040-Medium. Außerdem können die Hybridomzellen in vivo als Aszites-Tumoren in einem Tier gezüchtet werden.
  • Die durch die Subklone ausgeschiedenen monoklonalen Antikörper werden vom Kulturmedium, Aszitesfluid oder Serum auf geeignete Weise durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren abgetrennt, wie beispielsweise Protein-A-Sepharose, Hydroxyapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie.
  • DNA, die für die monoklonalen Antikörper kodiert, lässt sich unter Einsatz herkömmlicher Verfahren (z. B. unter Einsatz von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für Schwer- und Leichtketten von Mäuse-Antikörpern kodieren) leicht isolieren und sequenzieren. Die Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle für derartige DNA. Sobald sie isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren angeordnet werden, die dann in Wirtszellen, wie E. coli-Zellen, Affen-COS-Zellen, China-Hamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen, die ansonsten kein Immunglo bulinprotein produzieren, transfiziert werden, um die Synthese monoklonaler per in den rekombinanten Wirtszellen zu erzielen. Übersichtsartikel über die rekombinante Expression von für den Antikörper kodierender DNA in Bakterien sind jene von Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5, 256–262 (1993), und Plückthun, Immunol. Revs. 130, 151–188 (1992).
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform können Antikörper oder Antikörperfragmente von Antikörper-Phagenbibliotheken isoliert werden, die unter Einsatz von Techniken erzeugt wurden, die in McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschrieben werden. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschreiben die Isolierung von Mäuse- bzw. Human-Antikörpern unter Einsatz von Phagenbibliotheken. Spätere Publikationen beschreiben die Produktion von Human-Antikörpern mit hoher Affinität (im nM-Bereich) durch Ketten-Mischen (Mark et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992)) sowie kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie für die Konstruktion sehr großer Phagenbibliotheken (Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res. 21, 2265–2266 (1993)). Somit sind diese Techniken sinnvolle Alternativen für herkömmliche Monoklonal-Antikörper-Hybridom-Techniken zum Isolieren monoklonaler Antikörper.
  • Die DNA kann beispielsweise auch modifiziert werden, indem die Kodierungssequenz für Human-Schwer- und -Leichtketten-Konstantdomänen anstelle der homologen Mäuse-Sequenzen verwendet wird (Cabilly et al., oben; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)), oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der Kodierungssequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodierungssequenz.
  • Typischerweise ersetzen derartige Nicht-Immunglobulin-Polypeptide die konstanten Domänen eines Antikörpers, oder sie ersetzen die variablen Domänen einer Antigen-Kombinationsstelle eines Antikörpers, um einen chimären zweiwertigen Antikörper zu erzeugen, der eine Antigen-Kombinationsstelle, die Spezifität für ein Antigen aufweist, und eine weitere Antigen-Kombinationsstelle umfasst, die Spezifität für ein anderes Anti- gen aufweist.
  • Chimäre oder Hybrid-Antikörper können auch in vitro unter Einsatz bekannter Verfahren in der synthetischen Proteinchemie hergestellt werden, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel umfassen. Beispielsweise können Immuntoxine unter Einsatz einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck sind Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
  • 3. Humanisierte und Human-Antikörper
  • Verfahren zum Humanisieren nicht-menschlicher Antikörper sind nach dem Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus nicht-menschlicher Quelle in ihn eingebracht werden. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise von einer variablen „Import"-Domäne stammen. Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeiter (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)), durch Ersetzen der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen durchgeführt werden. Demgemäß sind solche „humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly et al., oben), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz einer nicht-menschlichen Spezies ersetzt ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, bei denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste von analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern ersetzt sind.
  • Die Wahl humaner variabler Domänen, die sowohl leicht als auch schwer sein können, zur Verwendung bei der Herstellung der humanisierten Antikörper ist sehr wichtig für die Verringerung der Antigenität. Nach dem sogenannten „best fit" Verfahren wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagetier-Antikörpers gegenüber der gesamten Bibliothek bekannter Human-Variabeldomänen-Sequenzen gescreent. Die humane Sequenz, die der des Nagetiers am nächsten kommt, wird dann als humaner Rahmen (FR) für den humanisierten Antikörper akzeptiert (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Bei einem anderen Verfahren wird ein bestimmter Rahmen verwendet, der von der Konsenssequenz aller menschlicher Antikörper einer bestimmten Untergruppe von Leicht- oder Schwerketten abgeleitet ist. Es kann der gleiche Rahmen für mehrere verschiedene humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
  • Es ist weiters wichtig, dass Antikörper mit Beibehaltung hoher Affinität für das Antigen und anderen günstigen biologischen Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden nach einem bevorzugten Verfahren humanisierte Antikörper nach einem Analyseverfahren für die parentalen Sequenzen und verschiedene begriffliche humanisierte Produkte unter Einsatz dreidimensionaler Modelle der parentalen und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulin-Modelle sind allgemein erhältlich und Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung vertraut. Es sind Computerprogramme verfügbar, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter Immunglobulinsequenz-Kandidaten veranschaulichen und anzeigen. Die Untersuchung dieser Displays ermöglicht es zu analysieren, welche wahrscheinliche Rolle die Reste bei der Funktionsweise der Immunglobulinsequenz-Kandidaten spielen, d. h. die Analyse von Resten, welche die Fähigkeit des Immunglobulin-Kandidaten zur Bindung seines Antigens beeinflussen. Auf diese Weise können FR-Reste der Konsens- und Import-Sequenz ausgewählt und so kombiniert werden, dass die gewünschte Antikörper-Eigenschaft, wie z. B. erhöhte Affinität für das/die Zielantigen(e), erreicht wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und wesentlich an der Beeinflussung der Antigen-Bindung beteiligt.
  • Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere (beispielsweise Mäuse) zu erzeugen, die bei Immunisierung fähig ist, ein volles Repertoire humaner Antikörper zu erzeugen, ohne dass endogenes Immunglobulin erzeugt wird. Beispielsweise wird beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion-(JH-) Gens bei chimären und Keimlinien-mutierten Mäusen zur vollständigen Hemmung der endogenen Antikörperproduktion führt. Der Transfer der Human-Keimlinien-Immunglobulin-Genanordnung bei derartigen Keimlinien-mutierten Mäusen führt bei Antigen-Anregung zur Produktion humaner Antikörper. Siehe beispielsweise Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); Bruggerman et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993). Humane Antikörper können auch in Phagen-Display-Bibliotheken erzeugt werden (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)).
  • 4. Bispezifische Antikörper
  • Bispezifische Antikörper (BsAbs) sind Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. BsAbs können als Tumor-Targeting- oder -Abbildungsmittel verwendet werden und können eingesetzt werden, um mit Enzymen oder Toxinen auf eine Zelle abzuzielen, die das Wnt-Polypeptid aufweist. Derartige Antikörper können von Antikörpern voller Länge oder Antikörperfragmenten abgeleitet sein (z. B. bispezifischen F(ab')2-Antikörpern). Gemäß vorliegender Erfindung kann der BsAb einen Arm aufweisen, der sich an das Wnt-Polypeptid bindet, und einen anderen Arm aufweisen, der sich an ein Cytokin oder einen anderen Cytokinrezeptor (oder eine Untereinheit davon) bindet, wie die Rezeptoren für TPO, EPO, G-CSF, IL-4, IL-7, GH, PRL; die α- oder β-Untereinheiten der IL-3-, GM-CSF-, IL-5-, IL-6-, LIF-, OSM- und CNTF-Rezeptoren; oder die α-, β- oder γ-Untereinheiten des IL-2-Rezeptorkomplexes.
  • Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind fachbekannt. Herkömmlicherweise basiert die Herstellung bispezifischer Antikörper voller Länge auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Schwerketten verschiedene Spezifitäten aufweisen (Milstein et al. Nature 305, 537–599 (1983)). Wegen der statistischen Verteilung von Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten erzeugen diese Hybridomen (Quadromen) ein mögliches Gemisch von 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die richtige bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des richtigen Moleküls, die für gewöhnlich durch affinitätschromatographische Schritte durchgeführt wird, ist eher aufwändig, und die Produktausbeuten sind niedrig. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
  • Gemäß einem anderen und bevorzugteren Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit den geeigneten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-kombinierende Stellen) mit Sequenzen konstanter Immunglobulindomänen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerketten-Konstantdomäne, die zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), welche die für die Immunglobulin-Leichtketten-Bindung erforderliche Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. Die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, falls gewünscht, Immunglobulin-Leichtkette kodierenden DNAs werden in gesonderte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dies stellt eine größere Flexibilität beim Einstellen der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen bereit, wenn ungleiche Verhältnisse der drei Polypeptidketten bei der Konstruktion verwendet werden, um optimale Ausbeuten zu erhalten. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen eine hohe Ausbeute liefert oder wenn die Verhältnisse von keiner speziellen Signifikanz sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes sind die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (die zweite Bindungsspezifität bereitstellend) im anderen Arm zusammengesetzt. Es hat sich erwiesen, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulin-Kettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls eine einfache Art der Trennung bereitstellt. Dieser Ansatz wird in der am 3. März 1994 veröffentlichten WO 94/04690 offenbart. Für weitere Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
  • Bispezifische Antikörper umfassen vernetzte oder „Heterokonjugat"-Antikörper. Beispielsweise kann einer der Antikörper im Heterokonjugat an Avidin, der andere an Biotin gekoppelt sein. Solche Antikörper sind beispielsweise für das Targeting von Immunsystemzellen gegen unerwünschte Zellen (US-Patent Nr. 4.676.980) und zur Behandlung der HIV-Infektion (WO 91/00360; WO 92/00373; und EP 03089 ) vorgeschlagen worden. Heterokonjugat-Antikörper können unter Anwendung irgendwelcher dienlichen Vernetzungsverfahren hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsagenzien sind nach dem Stand der Technik bekannt und beispielsweise im US-Patent 4.676.980 gemeinsam mit einer Reihe von Vernetzungstechniken offenbart.
  • Techniken zur Erzeugung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten sind in der Literatur ebenfalls beschrieben worden. Die folgenden Techniken können auch für die Produktion zweiwertiger Antikörperfragmente eingesetzt werden, die nicht notwendigerweise bispezifisch sind. Nach diesen Techniken können Fab'-SH-Fragmente aus E. coli gewonnen werden, die chemisch gekoppelt werden können, um zweiwertige Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten BsAb-F(ab')2-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde getrennt aus E. coli ausgeschieden und gelenktem chemischem Koppeln in vitro unterzogen, um den BsAb zu bilden. Der so gebildete BsAb konnte sich an Zellen binden, die den HER2-Rezeptor und normale Human-T-Zellen überexprimieren sowie die lytische Aktivität von zytotoxischen Human-Lymphozyten gegen Human-Brusttumor- Ziele auslösen. Siehe auch Rodrigues et al., Int. J. Cancers (Suppl.) 7, 45–50 (1992). Es sind auch verschiedene Techniken zur Herstellung und Isolation zweiwertiger Antikörperfragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur beschrieben worden. Beispielsweise sind zweiwertige Heterodimere unter Einsatz von Leucin-Zippern erzeugt worden. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547–1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide von den Fos- und Jun-Proteinen wurden durch Genfusion an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschriebene „ Diakörper"-Technologie stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung von BsAb-Fragmenten bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerketten-Domäne (VH), die durch einen Linker, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den beiden Domänen auf der selben Kette zu ermöglichen, an eine variable Leichtketten-Domäne (VL) gebunden. Demgemäß sind die VH- und VL-Domänen eines Fragments dazu gezwungen, sich mit den komplementären VL- und VH-Domänen eines anderen Fragments zu paaren, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Es ist auch eine andere Strategie zur Herstellung von BsAb-Fragmenten unter Einsatz von Einzelketten-Fv-(sFv-)Dimeren berichtet worden. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
  • E. Fertigwaren
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Fertigware bereitgestellt, die Materialien enthält, die für die Behandlung der oben beschriebenen Leiden nützlich sind. Die Fertigware umfasst einen Behälter und ein Etikett. Geeignete Behälter sind beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Teströhren. Die Behälter können aus einer Vielzahl von Materialien wie Glas oder Kunststoff bestehen. Der Behälter beinhaltet eine Zusammensetzung, die für die Behandlung des Zustandes wirksam ist und eine sterile Zugangsöffnung haben kann (beispielsweise kann der Behälter ein Beutel oder eine Phiole für intravenöse Lösung mit einem Stöpsel sein, der mit einer Hyperder malinjektionsnadel durchstochen werden kann). Der Wirkbestandteil in der Zusammensetzung ist das Wnt-Polypeptid. Das Etikett, das sich auf dem Behälter befindet oder ihm zugeordnet ist, zeigt an, dass die Zusammensetzung für die Behandlung des gewählten Zustands verwendet wird. Die Fertigware kann weiters einen zweiten Behälter umfassen, der ein Cytokin zur gleichzeitigen Verabreichung mit dem Wnt-Polypeptid beinhaltet. Ein oder mehrere weitere Behälter können mit der Fertigware bereitgestellt werden, die beispielsweise einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Ringer-Lösung oder Glucoselösung beinhalten. Die Fertigware kann weiters andere Materialien umfassen, die von einem kommerziellen und Benutzerstandpunkt aus wünschenswert sind, einschließlich anderer Puffer, Verdünner, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Anweisungen für die Verwendung.
  • F. Nicht therapeutische Anwendungen für Antikörper gegen Wnts
  • Wnt-Polypeptid-Antikörper sind auch als Affinitätsreinigungsmittel nützlich. Bei diesem Verfahren werden die Antikörper gegen Wnts auf einem geeigneten Träger, wie Sephadex-Harz oder Filterpapier, immobilisiert, wobei nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren eingesetzt werden. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer Probe in Kontakt gebracht, die die zu reinigenden Wnts enthält, und daraufhin wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe mit Ausnahme der Wnts entfernt, die an den immobilisierten Antikörper gebunden sind. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, wie Glycinpuffer, pH 5,0, der das Wnt-Polypeptid vom Antikörper löst.
  • Wnts-Antikörper können auch bei Diagnosetests für Wnt-Polypeptid nützlich sein, beispielsweise seine Expression in spezifischen Zellen, Geweben oder Serum nachweisen. Für Diagnoseanwendungen werden die Antikörper typischerweise mit einer detektierbaren Gruppierung markiert. Bei der detektierbaren Gruppierung kann es sich um eine handeln, die fähig ist, entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal zu erzeu gen. Beispielsweise kann die detektierbare Gruppierung ein Radioisotop sein wie 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I; eine Fluoreszenz- oder Chemolumineszenzverbindung, wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; radioaktive isotopische Markierungen, wie beispielsweise 125I, 32P, 14C oder 3H; oder ein Enzym, wie alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase.
  • Es kann jedes Verfahren eingesetzt werden, das nach dem Stand der Technik bekannt ist, um die Polypeptid-Variente getrennt an die detektierbare Gruppierung zu konjugieren, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); sowie Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
  • Die Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können bei jedem bekannten Testverfahren eingesetzt werden, wie kompetitiven Bindungstests, direkten oder indirekten Sandwich-Tests und Immunfällungstests. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, S. 147–158 (CRC Press., Inc., 1987).
  • Kompetitive Bindungstests basieren auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Testprobenanalyten um die Bindung mit einer begrenzten Antikörpermenge zu konkurrieren. Die Menge an Wnt-Polypeptid in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge an Standard, die an die Antikörper gebunden wird. Um das Bestimmen der Menge an Standard zu erleichtern, die gebunden wird, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenz insolubilisiert, so dass der Standard und der Analyt, die an die Antikörper gebunden werden, auf zweckmäßige Weise von dem Standard und Analyten getrennt werden können, die ungebunden bleiben.
  • Sandwich-Tests umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, die jeweils fähig sind, sich an einen anderen immunogenen Abschnitt oder ein Epitop des zu detektierenden Proteins zu binden. Bei einem Sandwich-Test wird der Testprobenanalyt von einem ersten Antikörper gebunden, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, und daraufhin bindet sich ein zweiter Antikörper an den Analyten, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert werden (direkte Sandwich-Tests) oder kann unter Einsatz eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwich-Test). Eine Art von Sandwich-Test ist beispielsweise ein ELISA-Test, bei dem die detektierbare Gruppierung ein Enzym ist.
  • III. Experimenteller Teil
  • Nachstehend folgen Beispiele für spezifische Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise einschränken.
  • Alle hierin sowohl oben als auch nachstehend zitierten Publikationen, Patente und Patentanmeldungen sind in ihrer Gesamtheit durch Verweis hierin aufgenommen.
  • BEISPIEL 1
  • Screenen von Wnt-Genen in Zellen und Zelllinien
  • Sowohl hämatopoetische Stammzellenpopulation als auch Stromazelllinien, die das Wachstum hämatopoetischer Stamm-/Progenitor-Zellen unterstützen, wurden durch RT-PCR-Analyse auf Wnt-Expression untersucht. Für diese Versuche wurden hämatopoetische Fötalleber- und Knochenmark-Stamm-/Progenitorzellpopulationen im Wesentlichen wie beschrieben hergestellt (siehe beispielsweise Beispiel 2A der PCT/US95/03718; und Zeigler et al., Blood 84, 2422–2430 (1994)).
  • Kurz zusammengefasst wurde aus Tag-14- bis Tag-15-Fötalleber eine Einzelzellsuspension hergestellt, und AA4+-Zellen wurden durch immunadhärentes Schwenken unter Einsatz der AA4+-Antikörper ausgewählt, die von Hybridom-Überständen gereinigt wurden, wie von Zeigler et al., oben, beschrieben. Sca+-c-kit+-Dual-Positiv-Zellen wurden durch Durchflusszytometrie-Sortierung aus der AA4+-Zellpopulation gewonnen, wobei das Ly6-A/E-Phycoerythrin-Konjugat (Pharmingan, San Diego, CA, USA) eingesetzt wurde, um Sca+-Zellen zu gewinnen, und Fluorescein-konjugierte Antikörper zu c-Kit (ebenfalls von Pharmingan) verwendet wurden. LinIoSac+-Knochenmarkzellen wurden durch Magnetperlen-Abreicherung (Dynal, Inc., Great Neck, New Jersey, USA; Ploemacher et al., Bloods 74, 2755–2763 (1989)) von Linien-Antigen exprimierenden Zellen von Gesamt-Knochenmark und Selektion von LinIoSca+-Zellen durch Durchflusszytometrie-Sortierung unter Einsatz von Lin-Cocktail-Antikörpern von Caltag (South Francisco, Kalifornien, USA) gewonnen, wie beschrieben (siehe Beispiel 2A der PCT/US95/03718; und Zeigler et al., oben).
  • Für die RT-PCR-Analyse dieser Zellsubpopulationen wurden PCRs mit Tag-Polymerase (Cetus) auf AA4+Sca+-cDNA oder einer 7-4-Zelllinien-cDNA-Bibliothek durchgeführt, wobei jeder Sense-Primer (LL1-7) mit dem Wnt3-Antisenseprimer verwendet wurde (Sense Primer,
    Figure 00920001
    Antisense-Primer „Wnt3" 5' GCC(C/G)CGGCC(G/A)CA(G/A)CACAT3' (Seq.-ID-Nr. 9)). Weitere PCRs wurden mit dem Primer Wnt1a (5'(G/C)TG GA(A/G) TG(C/T) AA(A/G) TG(C/T) CAT 3' (Seq.-ID-Nr. 10) und Wnt2a 5'(A/G)CA (A/G)CA CCA (A/G)TG (A/G)AA 3' (Seq.-ID-Nr. 11) durchgeführt. PCR-Produkte wurden als stumpfendige Fragmente in Smal-linearisiertes pGEM7 (Promega) kloniert und durch Hybridisierung mit den Oligo nucleotiden Liem1 5' GAC CTG GTG TAC 3' (Seq.-ID-Nr. 12) oder Liem2 5 TG(T/C) TG(T/C) GGC CG(G/C) GGC 3' (Seq.-ID-Nr. 13) auf Wnt-Sequenzen gescreent. Diese Analyse wurde unter Einsatz der folgenden spezifischen Primer für Wnt-5a und Wnt-10b bestätigt, wobei Wnt-3a als negative Kontrolle eingesetzt wurde,
    Figure 00930001
  • Durch diese Versuche wurden in Fötalleber-AA4+Sca+-Zellen nur Wnt-5a und Wnt-10b detektiert. Ähnliche Versuche wurden an einer Fötalleber-Stromazelllinie 7–4 durchgeführt (hergestellt wie in der parallelen und gleichzeitig übertragenen PCT/US95/03718 (WO 95/27062); und Zeigler et al., oben, beschrieben), worin nur die Expression von Wnt-5a detektiert wurde. So wurde festgestellt, dass in hohem Maße angereicherte Stamm-/Progenitorzellen und Stromazellen, die ihre Expansion unterstützen, Wnts exprimieren.
  • Diese Beobachtungen wurden durch RT-PCR auf mRNAs von einer in hohem Maße angereicherten Fötalleber-Stammzellenpopulation AA4+Sca+kit+ („flASK"-Zellen, hergestellt wie in der parallelen und gleichzeitig übertragenen PCT/US95/03718 (WO 95/27062); und Zeigler et al., oben, beschrieben, wobei die oben beschriebenen Antikörper-Reagenzien eingesetzt wurden) ausgeweitet. Wnt-5a und Wnt-10b, nicht aber Wnt-3a wurden in den flASK-Zellen nachgewiesen. Darüber hinaus zeigte der Mangel an Wnt-3a-Expression in flASK-Zellen, dass auf Ebene der Detektion der RT-PCR-Tests hämatopoetische Stammzellen nur eine Untermenge der möglichen Wnt-Gene exprimieren.
  • Bei weiteren Versuchen wurde gezeigt, dass Wnt-5a und Wnt 10b mRNAs in den Stammzellenpopulationen AA4+, AA4+Sca+flk2+ und AA4+Sca+flk2– (Zeigler et al., oben) exprimiert werden. Es ist wichtig, dass die Expression dieser Wnt-mRNAs in drei verschiedenen hämatopoetischen Stamm-/Progenitorzellen-Subsätzen, die jeweils unabhängig voneinander durch c-kit- oder flk2-Expression gereinigt wurden, wobei alle drei Subsätze zum langfristigen Transplantieren in letal bestrahlte Tiere fähig waren, in starkem Maße darauf hinweist, dass diese Liganden in der lokalen Mikroumgebung der hämatopoetischen Stamm-/Progenitorzelle eine Rolle spielen. Die Expression von Wnt-5a in Fötalleber-Stromazelllinie, 7–4, wie oben beschrieben, und von Wnt-5a- und Wnt-10b-mRNAs in reiferen hämatopoetischen (AA4–)-Fötalleberzellen wies weiters darauf hin, dass (i) ein Großteil der hämatopoetischen Fötalleber-Mikroumgebung sowie hämatopoetischer Stamm-/Progenitorzellen potentiell als Quelle für Wnts dienen kann und dass (ii) die Expression von Wnt auf diesen Zellen die Wnt-vermittelte parakrine oder autokrine Regulierung der Differenzierung dieser Zellen ermöglichen könnte.
  • BEISPIEL 2
  • Analyse von Wnts bei der Hämatopoese
  • A. Expansion von hämatopoetischen Stamm-/Progenitorzellen, stimuliert durch konditionierte Medien von Wnt-transfizierten Zellen
  • Ein Stroma-freies Suspensionskultursystem in vitro wurde entwickelt, um die Funktion von Wnts auf in hohem Maße angereicherten hämatopoetischen Stamm-/Progenitorzellpopulationen zu untersuchen, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden. Für diese Versuche wurden Suspensionskultur der angereicherten sortierten Zellen in 24-Napf-Costar-Platten mit 5.000 Zellen/Napf durchgeführt, eingesät in 0,5 ml HSC-Medium und kultiviert bei 37°C mit 5% CO2. HSC-Medium enthielt 50% F12/50% Niedrigglucose-DMEM, 10% wärmebehandeltes Fötalrinderserum (Hyclone), 1 mM Glutamin und Mäuse-Kit-Ligand (KL), wie angegeben (R&D Systems). Konditioniertes Medium von 293 Zellen, das mit klonierten Wnt-Genen transfiziert war, wurde zum Zeitpunkt der Plattierung zugegeben. Spezifisch wurden Wnt-5a-cDNAs aus einer 7-4-Fotalleber Stromazelllinien-cDNA-Bibliothek kloniert, und Wnt-10b-cDNAs wurden unter Einsatz von RT-PCR von flASK-Zellen-mRNAs kloniert. Für die Molekularklonierung von WntcDNAs wurde Poly-A+RNA nach dem Fast-Track-Verfahren (Invitrogen) kloniert, und cDNA wurde hergestellt, indem Poly-A+RNA- und dT18-Primer in Gegenwart von 0,1 M Methylquecksilberhydroxid denaturiert wurden, gefolgt vom Abschrecken mit 20 mM β-Mercaptoethanol und Streckung in insgesamt 20 μl mit Superscript-Umkehrtranskriptase gemäß Empfehlung (Gibco).
  • Ein Wnt-5a-PCR-Fragment wurde verwendet, um cDNA-Bibliothek aus 7-4-Zelllinie zu screenen, und wurde in den pSPORT-1-Vektor ligiert (Gibco). Die Wnt-5a-Kodierungsregion wurde aus einem Klon, Wnt5a.13.pSPORT-1, sequenziert, und die vorhergesagten Aminosäuren entsprachen mit Ausnahme von (H207 > Y) den zuvor berichteten (Gavin et al., Genes und Dev. 4, 2319–2332 (1990)). Eine Wnt-10b-cDNA wurde durch RT-PCR von flASK-Zellen kloniert, wobei die Primer wn10b.5ri (5'GGA ATT CCG GGC TTC GAC ATG CTG GAG GA 3' (Seq.-ID-Nr. 20)) und wnt10b.3kpn (5' GGG GTA CCC CAG GCT CAC CTT CAT TTA CAC A 3' (Seq.-ID-Nr. 21)) verwendet wurden, und in pGEM7 kloniert. Die vorhergesagte Klonierungssequenz entsprach genau der an anderer Stelle berichteten (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2268–2272 (1995)).
  • Für die Überexpression von Mäuse-Wnts in Säugetierzellen und die Herstellung von konditioniertem Medium (CM) aus den Wnt-Genprodukte enthaltenden Zellen, wurden die so erhaltenen Wnt-1-, Wnt-5a- und Wnt-10b-cDNAs als EcoRI-/Hind-III-Fragmente in einen Expressionsvektor pRK5tkneo kloniert (Holmes, Science 253, 1278–1280 (1991)). Für die Produktion von CM wurden 293 Zellen nach dem Kalziumphosphatverfahren (Gorman, DNA Cloning: A Practical Approach, IRL, Washington, D. C. (1985)) transfiziert, Medium wurde nach zumindest 48 h entnommen, mit 3.000 × g zentrifugiert und steril-filtriert. Bei den meisten Versuchen unter Einsatz von CM wurde das CM bis zu einer Endkonzentration von 5–10% zugegeben. Bei vorherigen Versuchen unterstützten die meisten bekannten Cytokine das Überleben von flASK-Zellen in Suspensionskulturen nicht, wenn sie als einzelne Faktoren in Gegenwart von 10% Rinderfötenserum zugegeben wurden (siehe beispielsweise Bodine et al., Blood 78, 914–920 (1991)). Die Zugabe von KL mit 100 ng/ml lieferte jedoch einen wirksamen Stimulus für Zellüberleben und -Proliferation von granulozytischen Progenitoren (Anderson et al., Cell 63, 235–24 (1990); Zsebo et al., Cell 63, 195–201 (1990)). Interessanterweise lieferte Kontroll-293-CM eine etwa zweifache stimulierende Wirkung, wenn es Suspensionskulturen mit KL zugegeben wurde. Die Zugabe von konditioniertem Medium (CM) von 293 Zellen, transfiziert mit einer Wnt-5a-cDNA, rief eine 2- bis 3fach größere Expansion hervor als Kontroll-CM.
  • Das Vorhandensein von Wnt-5a-Proein im CM von transfizierten Zellen wurde durch Immunfällungen und Western-Blotting bestätigt. Für diese Versuche wurde ein chimäres Wnt-5a-Gen hergestellt, das für die ersten 55 Aminosäuren (AA) von Herpes-simplex-Virus-Glycoprotein D kodiert, gefolgt von Wnt-5a-AA-38-379 in gDCT-IpRKSb (Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 92, 1142–1146 (1995)). Der Kontrollvektor, der in den Versuchen unter Beteiligung von gDWnt5a verwendet wurde, wurde aus gDCT-1pRK5b hergestellt, indem die CT-1-cDNA als ein Xhol-Xbal-Fragment ausgeschnitten wurde, die überhängenden Nucleotide aufgefüllt wurden und der gDpRK5b-Vektor mit T4-DNA-Ligase geschlossen wurde (Collaborative Research). Es wurde erwartet, dass das resultierende Konstrukt für die ersten 54 AA von gD kodiert, gefolgt von D-Stop. Ein Fragment, das für 6 Histidinreste kodiert, wurde durch PCR im Rahmen an den Carboxy-Terminus von Wnt-5a im gDpRk5b-Vektor angehängt.
  • Für Immunfällungsversuche zur Analyse von Wnt-Expression durch transfizierte Zellen wurden 293 Zellen, die mit gDpRK5b oder gDWnt5apRK5b transfiziert waren, in 100 μCi (35S)Methionin/(35S)Cystein (Amersham) markiert, lysiert, und Proteine wurden mit 586-mAb plus Protein-A-Sepharose (Pharmacia) gefällt. Die Präzipitate wurden nach Standardverfahren gewaschen, elektrophoresiert und fluorographiert.
  • Zum Vergleich riefen die wirkungsvollen Cytokine IL-3 und GM-CSF, die als einzelne Faktoren zu Kulturen mit KL zugegeben wurden, eine um das 1,5- bis 2fach größere Expansion hervor als Kontrollen. Weitere Versuche zeigten, dass Titrierung von KL auf 25 ng/ml für eine geringere Expansion der Zellanzahl sorgte, aber die Kulturen ein verringertes Ausmaß an granulozytischer Proliferation/Differenzierung aufwiesen. Die Zugabe von Wnt-1-, Wnt-5a- und Wnt-10b-CM zu den Suspensionskulturen von flASK-Zellen plus 25 ng/ml KL stimulierte die Zell-Proliferation 7-, 8- bzw. 11fach gegenüber jener von Kontroll-CM nach 7 Tagen in Kultur, wie in 1 gezeigt. Synergiewirkung zwischen KL und Wnts war offensichtlich, da Wnt-CM allein nur sehr geringes Zellüberleben/-Proliferation auslöste. Bisher ist Wnt-1-Expression im hämatopoetischen System noch nicht detektiert worden, aber Wnt-1-CM war bei diesem Test wirksam. Diese Ergebnisse zeigen die Möglichkeit, dass deutliche Signalisierungswege von mehreren Wnt-Liganden zu einer ähnlichen Reaktion hämatopoetischer Zellen oder dem Vorhandensein eines gemeinsamen Wnt-Rezeptors in hämatopoetischen Stamm-/Progenitorzellen führen.
  • B. Erhaltung des Blastzellen-Phänotyps und Foci-Bildung von mit Wnts verstärkten hämatopoetischen Progenitorzellen
  • Bei Mäusen sind Wnts für die Entwicklung mehrerer primitiver Zelltypen wichtig, und bei Xenopus wird angenommen, dass sie an der Zellschicksalsbestimmung beteiligt sind. Die Rolle von Wnts beim Differenzierungpotential von pluripotenten hämatopoetischen Stamm-/Progenitorzellen wurde bewertet, indem die Morphologie kultivierter Zellen in cyto-gefärbten Präparaten untersucht wurde. Für die Cytospin-Analyse wurden Zellen in Suspensionskultur wie oben beschrieben gezüchtet, auf ein Glasplättchen versponnen und dann mit Wright Geimsa gefärbt, um die hämatopoetischen Zelltypen und die -Morphologie zu zeigen. Für diese Versuche wurde Cytospin-Analyse von flASK-Zellen mit Cytospin-Präparaten von (A) flASK-Zellen unmittelbar nach der Zell-Sortierung, (B) flASK-Zellen nach Suspensionskultur in Kontroll-CM plus 25 ng/ml KL und (C) flASK-Zellen nach Suspensionskultur in Wnt-5a-CM plus KL durchgeführt. Obwohl die Zugabe von KL zu den Suspensionskulturen unabdingbar war, bestand auch bei verringerten Konzentrationen die Wirkung von KL allein darin, die Differenzierung und Proliferation von granulozytischen Zellen von HSCs im Vergleich zu frisch isolierten flASK-Zellen zu fördern. In Wnt-5a- oder Wnt-10b-CM oder teilweise gereinigtem rekombinantem Wnt-5a kultivierte Zellen (siehe nachstehender Abschnitt C) ließ jedoch eine größere Vielfalt von Zelllinien mit geringerer Spezialisierung auf granulozytische Linien entstehen. Myeloidzellen (Makrophagen und Neutrophile), Megakaryozyten und frühe Erythroidzellen wurden durch Cytospin-Analyse von Suspensionskulturen nach der Behandlung mit Wnt-5a-CM beobachtet. Bemerkenswerterweise war das Verhältnis primitiver Blasten zu differenzierten mononuklearen Zellen in Kulturen mit rekombinantem Wnt-5a um mehr als das Vierfache erhöht (29% ± 3,4 im Vergleich zu 7% ± 0,8 für die Kontrolle). Die Wirkung von Wnts plus KL bestand darin, umfassende Zellexpansion zu fördern, das heißt die Netto-Zunahme der Zellanzahl ausgehend vom anfänglichen HSC-Inoculum, während auch ein um das Vierfache größerer Anteil an Zellen mit einer primitiven Blastzellen-Morphologie erhalten wurde.
  • Wnts sind an der Regulierung von Zelladhäsionssystemen beteiligt, und es ist vorgeschlagen worden, dass Zell-Zell-Wechselwirkungen für die Zellschicksalsbestimmung wichtig sein können (Hinck et al., J. Cell. Biol. 124, 729–741 (1994); Peiffer, Development Suppl., 163–176 (1993)). Während der ersten 4 bis 5 Tage der Suspensionskultur in Wnt-CM wurde eine dramatische Zunahme der Anzahl an lose haftenden Zellaggregaten oder haftenden hämatopoetischen „Foci" beobachtet. Um die räumliche Organisation und Morphologie dieser Foci zu analysieren, wurden flASK-Zellen in HSC-Medium mit 25 ng/ml Mäuse-KL auf Lab-Tek-Glaskammerplättchen (NUNC, Naperville, Illinois, USA) plattiert, die mit 50 mg/ml Human-Plasma-Fibronectin (Gibco) beschichtet waren, 4 bis 5 Tage lang in Kontroll-CM plus 25 ng/ml KL sowie (E) Wnt-5a-CM (gDWnt5a) plus 25 ng/ml KL kultiviert und dann in situ cyto-gefärbt, um die interzelluläre Organisation der Foci beizubehalten. Fibronectin wurde bei diesem Test als adhäsives Substrat verwendet, da es die Adhäsion von CFU-S-Progenitoren in vitro vermitteln kann (Williams et al., Nature 352, 438–441 (1991)). Nach 3 bis 5 Tagen in Kultur wurde typischerweise festgestellt, dass sich Cluster aus 5 bis mehr als 30 Blasen mit niedrigem Verhältnis zwischen Cytoplasma und Zellkern mit einem oder mehreren darunterliegenden anhaftenden Myeloidzellen in Kontakt befanden, wenn sich die Kontrollkultur in Präparat D mit Wnt-5a-behandelten Zellen in Präparat (E) in Kontakt befand. Die Bildung dieser Blastzellen-Foci wurde als Reaktion auf Wnt-CM dramatisch verstärkt, was auf eine Rolle von Wnts bei der Zellexpansion über die Regulierung zellulärer Wechselwirkungen hindeutet.
  • Im Lichte der verbesserten Proliferation und Zell-Zell-Haftung von in Wnt-CM kultivierten Zellen wurden die Linien-Phänotypen und Adhäsionssysteme der kultivierten Zellen durch Durchflusszytometrie analysiert. Für Zellanalyse- und Sortierungsversuche wurden Phycoerythrin-konjugierte Antikörper (Ly6A/E, TER-119, CD14), Fluorescein-konjugierte Antikörper (c-kit, CD13, CD31, CD44, CD45, CD49d, CD49e, GR1, VCAM-1, ICAM-1, L-Selectin), CD11a- und CD29-Antikörper von Pharmingen bezogen; Phycoerythrin-konjugierte Mac-1-, Flurescein-konjugierte Antikörper (CD4, CD8a und B220) und alle sekundären und Lin-Cocktail-Antikörper wurden von Caltag bezogen.
  • Die flASK-Zellen wurden 7 Tage lang in gDWnt5a-CM (Wnt-CM) oder gD-CM (Kontroll-CM) kultiviert und bezüglich der Expression von Zelloberflächenantigenen bewertet. Die Expression von Antigenen, die bei reifen hämatopoetischen Zellen (CD4,CD8a, CD13, CD14, B220, VCAM-1) festgestellt wurde, war bei frisch sortierten flASK-Zellen niedrig oder negativ und blieb nach der Kultur auf ähnlichen Niveaus. In beiden Zuständen wurde wenig oder keine Veränderung in Bezug auf die Expression von CD11a, CD29, CD31, CD44, CD45, CD49d, CD49e, GR1, L-Selectin, ICAM-1 beobachtet. Mit Wnt-5a-CM versorgte Kulturen wiesen jedoch eine Steigerung der Anzahl an Zellen auf, die Sca+ (154 ± 22,6%), c-kit+ (158 ± 36%), Sca+-c-kit+ (131 ± 9,4%) oder Ter119+ (237 ± 25,8%) waren. Diese Zelloberflächen-Antigenprofile waren mit der Cytospin-Analyse gut vergleichbar und bestärkten die Erkenntnis, dass Wnts plus KL die Erhaltung eines größeren Anteils an primitiven Blastzellen als KL alleine während der Ex-vivo-Kultur von HSCs fördern.
  • C. Notwendigkeit von sekretiertem Wnt-Protein in Wnt-konditioniertem Medium für die Proliferation von hämatopoetischen Stamm-/Progenitorzellen
  • Es wurden mehrere Ansätze verwendet, um eine direkte Rolle von Wnts auf HSCs von der Alternative zu unterscheiden, dass Wnts die Produktion anderer Wachstumsfaktoren in den transfizierten Zellen stimulieren. Antikörper-Abreicherungsversuche wurden durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Proliferation durch sekretierte Wnt-Proteine vermittelt wurde, die im Medium vorhanden waren. Eine Epitop-Markierung wurde durch genetisches Engineering auf Wnt-5a aufgesetzt, um die Abreicherung mit leicht erhältlichen Antikörper-Reagenzien zu ermöglichen. Chimäre Proteine wurden wie im obigen Abschnitt A beschrieben konstruiert, die für die Signalsequenz und die N-terminale Domäne des Herpesvirus-Glycoproteins D (gD) kodieren, gefolgt von Wnt-5a (gDWnt5a, gDWnt5aHis6). Die Transfektion des gDWnt5a-Kontrukts in 293 Zellen lenkte die Expression eines Polypeptids mit 47 bis 49 kD, das aus Lysaten spezifisch durch ein mAb (5B6) immungefällt wurde, das ein N-terminales Epitop von gD erkannte. Immunabreicherungsversuche wurden durchgeführt, um das durch die 293 transfizierten Zellen erzeugte Wnt-Protein (gDWnt5apRk5b oder Kontroll-gDpRK5b) vom CM mit mAb5B6 zu entfernen. Inkubation von gDWnt5aHis6-CM in mAb-5B6, das an Protein A gebunden oder an Glas mit kontrollierten Poren (5B6-CPG) gekoppelt war, reduzierte die Zellexpansion auf Kontrollwerte. Gemeinsam weisen diese Daten darauf hin, dass sekretierte Wnts die beobachteten Zellexpansionen in vitro vermitteln. Um zu testen, ob Wnts die Zell-Proliferation direkt stimulieren können, wurde die Aktivität von teilweise gereinigtem Wnt-5a-Protein im Suspensionskulturtest bewertet. Vorläufige Versuche zeigten, dass Zellextrakte eine reichere Quelle für Wnt-5a-Protein bereitstellten als CM. Für die Reinigung von gD.Wnt5a.His6 wurden stabile Linien von CHOdp12-Zellen (DHFR–-Zellen, siehe beispielsweise Bennett et al., J. Biol. Chem. 766, 23060 (1991)), die mit dem DHFR+-Plasmid gD.Wnt5a.His6pSVi.del.d transfiziert worden waren, ausgewählt und in Glutathion-S-Transferase- (GHT-) freiem Medium gehalten. Extrakte wurden aus gD.Wnt5a.His6-CHO-Zellen wie folgt hergestellt. Zellen wurden in 50 mM Tri ethanolamin, 100 mM NaCl, 0,4% SDS, 1% PMSF und 2% Triton-X-100 lysiert. Die Reinigung von gD.Wnt5a.His6 vom Lysat wurde durch Bindung des gD-Epitops an 5B6-CPG, ausgiebiges Waschen in PBS und Säure-Eluierung erreicht. Das Eluat wurde neutralisiert, gegen PBS dialysiert und in 8 M Harnstoff erneut gefaltet. Das erneut gefaltete Wnt-5a-Protein wurde in HSC-Medium verdünnt, so dass die Harnstoffkonzentration im Stammzellen-Suspensionskulturtest unter 60 mM Wnt-5a betrug.
  • Gelanalyse zeigte, dass das Protein als Monomer mit 47 bis 49 kD unter reduzierenden Bedingungen wanderte. Wenn es dem Suspensionskulturtest zugegeben wurde, zeigte sich, dass rekombinantes Wnt-5a-Protein die Zellexpansion mit etwa 40–80 ng/m) oder 1–2 nM um das Fünffache stimuliert.
  • D. Stimulation von Gesamt-CFC-Expansion von hämatopoetischen Progenitorzellen durch Wnt-Protein
  • Ein wichtiges Maß für hämatopoetische Progenitorzellen ist die Fähigkeit zur Bildung von Kolonien in halbfestem Medium als Reaktion auf Linien-spezifische Zytokine und Mehrlinien-Kolonie-stimulierende Faktoren. Da die Zugabe von Wnts plus KL zu flASK-Zellkulturen den Anteil an Zellen mit einer primitiven Morphologie und Zelloberflächen-Phänotyp erhöhte, wurden Versuche durchgeführt, um zu analysieren, ob sich auch die Anzahl an sich stark vermehrenden Kolonie-bildenden Zellen erhöht hatte. Die Häufigkeit von Kolonie-bildenden Zellen (CFCs) in flASK-Zellkulturen wurde untersucht, indem die Koloniebildung von Zellen gemessen wurde, die in Myeloidmethylcellulose erneut plattiert wurden, die eine Kombination aus Cytokinen (KL, IL-3, IL-6 und Epo) und Wnt-CM oder Kontroll-CM enthielt. Für die Kolonietestversuche wurden Methylcellulose-Kulturen in 35 mM Platten mit 1.000 Zellen in 1,0 ml kompletter Myleoid-Methylcellulose (Stern Cell Technologies, Inc.) oder in B-Zellen-Bedingungen angesetzt, die aus Basis-Methylcellulose bestand, die 50 ng/ml Mäuse-KL und 50 ng/ml Mäuse-IL-7 (R&D Systems) enthielt. Konditioniertes Medium wurde zum Zeitpunkt der Plattierung zugegeben. Die Platten wurden an Tag 12 nach der Plattierung abgelesen. Nach Sus pensionskultur waren die Gesamt-CFCs, die von 1.000 Zellen im Ausgangskultur Inoculum stammten, in Wnt-5a-CM um das Dreifache größer als in Kontroll-CM. Darüber hinaus war, wenn Zellen von Tag-12-Myeloidmethylcellulosekulturen geerntet und erneut plattiert wurden, die kumulative Expansion von Zellen, die durch Wnt-5a-CM herbeigeführt wurde, um mehr als das 235fache größer als bei Kontroll-CM, was weitgehend auf die Unfähigkeit von in Kontroll-CM gezüchteten Zellen zur effizienten Replattierung zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse liefern einen überzeugenden funktionellen Beleg dafür, dass sekretierte Wnts das Überleben/die Proliferation von multipotenten hämatopoetischen Progenitoren in Suspensionskultur verstärken und die Expansion primitiver, sich stark vermehrender Kolonie-bildender Zellen direkt stimulieren können.
  • Die Kolonie-Bildung von frisch isolierten Fötalleber-AA4+Sca+-Zellen in Wnt-5a-CM wurde ebenfalls getestet. Wnt-5a-CM stimulierte die Koloniebildung um etwa das Dreifache in Myeloidmethylcellulose. Unter B-Zellen-Bedingungen stimulierte Wnt-5a-Cm die Koloniebildung um das Vierfache. Die Koloniebildung war bei Knochenmark-Lin1oSca+-Zellen in Myleoid- und B-Zellen-Methylcellulose um das Zweifache erhöht. Insgesamt zeigen diese Daten, dass Wnt-CM die Koloniebildung durch in hohem Maße angereicherte Fötalleber- und Knochemark-HSCs unter Bedingungen verstärkt, unter denen Myeloid- oder B-Zellen-Progenitoren detektiert werden.
  • E. Expansion von hämatopoetischen Stamm-/Progenitorzellen nach der Transduktion mit einem Retrovirus, das ein Wnt-Protein trägt
  • Um die direkten Wirkungen von Wnt-Expression auf HSCs weiter zu untersuchen, wurde ein repräsenatives Wnt-Proteinprodukt, Wnt-5a, über retrovirale Transduktion eingeführt. Ein bicistronischer LNL6-Vektor auf Rous-Sarcomavirus-Basis wurde so konstruiert, dass Wnt-5a 3' zum Gag-Gen angeordnet wurde und sich LacZ stromab von der internen Ribosomeneintrittsstelle des Encephalomyocarditisvirus befand. Spezifisch wurde für die viralen Konstruktion- und Transduktionsversuche Wnt5a.13.pSPORT-1 mit EcoRI/BamHI verdaut, das Insert wurde mit T4-DNA-Polymerase (U.S. Biochemical) ab gestumpft und in abgestumpfte BgIII/BamHI-Stellen des pLNL6-Vektors kloniert (Chattas et al., Mol. Cell. Biol. 11, 5848–5859 (1991)). Wnt5a/LNL6 oder der parentale LNL6-Vektor wurde durch ein Kalziumphosphat-Verfahren in BOSC23-Zellen transfiziert (Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8392–8396 (1993)). Vitale Überstände von den transfizierten BOSC-Zellen wurden nach 48 bis 72 Stunden abgenommen und bei –20 °C gelagert und für die Transduktion von flASK-Zellen eingesetzt. Transduktionen der flASK-Zellen wurden mit 100.000 Zellen pro ml 48 h lang in vitalen Überständen durchgeführt, die mit den Mäuse-Cytokinen IL-3 (25 ng/ml), IL-6 (50 ng/ml) und KL (10 ng/ml) ergänzt waren. Die Transduktionseffizienz von Zellen, die Methylcellulose-Kolonien ergaben, wurde durch PCR-Analyse im Wesentlichen so getestet, wie in Gerard et al., Human Gene Therapy 7, 343–354 (1996), beschrieben. Die Expression der biscistronischen mRNA in transduzierten flASK-Zellen wurde bestätigt, indem die LacZ-Akivität unter Einsatz des FACS-Gal-Verfahrens gemessen wurde (Fiering et al., Cytometry 12, 291–301 (1991)). Die hinzugefügten Cytokine IL-3, IL-6 und KL erhöhten die Transduktionseffizienz, die durch FACS-Gal-Analyse 48 h nach der Transduktion auf etwa 20 geschätzt wurde. Eine potentielle früh wirkende Wirkung von Wnt-5a auf das Überleben/die Proliferation der Zellen wurde gemessen, indem die Zellanzahl 48 h nach der Transduktion gezählt wurde. Wnt5a/LNL6-transduzierte Zellen expandierten um annähernd das Zweifache (2A). Es ist anzumerken, dass dieses) Überleben/Proliferation der Zellen insofern beeindruckend ist, als ein zusätzlicher Vorteil neben den starken Wirkungen der früh wirkenden Cytokine IL-3, IL-6 und KL beobachtet wurde. Kultur der Wnt5a/LNL6-transduzierten Zellen für 7 Tage zeigte eine ausgiebige Proliferation im Vergleich zu jener von Kontrollzellen (2B). Zellen aus 2-Tage-Transduktionen wurden ebenfalls erneut in Myeloidmethylcellulose plattiert. Transduktion mit Wnt5a/LNL6 stimulierte eine um das Dreifache größere Expansion von CFCs als der Kontrollvektor (2C). Die Effizienz der CFC-Transduktion wurde durch PCR-Analyse von Kolonien, die aus den Methylcellulosekulturen gepflückt wurden, auf 14 bis 47% geschätzt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • Figure 01100001

Claims (22)

  1. In-vitro-Verfahren zur Verbesserung der Vermehrung, Differenzierung oder Erhaltung einer haematopoetischen Stamm/Progenitor-Zelle, umfassend das Einwirkenlassen einer Menge eines Human-Wnt-Polypeptids Wnt-1, -2, -3, -4, -5a, -7a oder -7b oder eines funktionellen Derivats davon, das zumindest etwa 90%ige Aminosäuresequenzidentität mit den Polypeptiden aufweist, auf die Zelle.
  2. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zelle eine CD34+-Zelle ist.
  3. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zelle eine AA4+-Zelle ist.
  4. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zelle eine Fötalleber-AA4+, Sca+, Krt+-(flASK-)Zelle ist.
  5. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, das die Vermehrung der Zelle in Bezug auf eine unbehandelte Zelle verbessert.
  6. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, das die Differenzierung der Zelle in Bezug auf eine unbehandelte Zelle verbessert.
  7. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, das die Erhaltung der Zelle in Bezug auf eine unbehandelte Zelle verbessert.
  8. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, das weiters das Einwirkenlassen eines weiteren Cytokins auf die Zelle umfasst.
  9. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 8, worin das weitere Cytokin ein Linienspezifisches Cytokin ist.
  10. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin das weitere Cytokin aus der aus Thrombopoietin (TPO); Erythropoietin (EPO); Makrophagen-Kolonie-Stimulationsfaktor (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); Interleukin-1 (IL-1); IL-1α; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-9; IL-10; IL-11; IL-12; Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und Kit-Ligand (KL) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  11. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zelle in Zellkultur vorliegt.
  12. Verwendung eines Human-Wnt-Polypeptids Wnt-1, -2, -3, -4, -5a, -7a oder -7b oder eines funktionellen Derivats davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Vermehrung, Differenzierung und Erhaltung einer haematopoetischen Stamm-/Progenitor-Zelle bei einem Krebspatienten.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, worin der Patient an verringerten Mengen an Blutzellen leidet oder von ihm angenommen wird, dass er daran leidet.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, worin die verringerten Mengen an Blutzellen durch Chemotherapie, Strahlentherapie oder Knochenmarkstransplantationstherapie verursacht sind.
  15. Verwendung eines Human-Wnt-Polypeptids Wnt-1, -2, -3, -4, -5a, -7a oder -7b oder eines funktionellen Derivats davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Repopulation von Blutzellen bei einem Menschen zur Behandlung haematopoetischer Erkrankungen oder Störungen.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, worin die Blutzellen rote Blutkörperchen sind.
  17. Verwendung nach Anspruch 15, worin die Blutzellen Myeloidzellen sind.
  18. Verwendung nach Anspruch 15, worin die Blutzellen Lymphzellen sind.
  19. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 18, worin das Medikament weiters ein Cytokin umfasst, das zu einer synergistischen Repopulation der Blutzellen beim Menschen führt.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, worin das Cytokin Erythropoietin (EPO); Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulationsfaktor (GM-CSF); Kit-Ligand (KL); oder Interleukin-3 (IL-3) ist.
  21. Fertigware, umfassend: einen Behälter; ein Etikett auf dem Behälter; und eine Zusammensetzung, die einen im Behälter enthaltenen Wirkstoff umfasst; worin die Zusammensetzung die Repopulation von Blutzellen bei einem Säugetier bewirkt, das Etikett auf dem Behälter anzeigt, dass die Zusammensetzung zur Repopulation von Blutzellen bei einem Säugetier verwendet werden kann und der Wirkstoff in der Zusammensetzung ein Wnt-Polypeptid Wnt-1, -2, -3, -4, -5a, -7a oder -7b oder ein funktionelles Derivat davon ist.
  22. Fertigware nach Anspruch 21, das einen weiteren Behälter umfasst, der ein weiteres Cytokin beinhaltet.
DE69725587T 1996-08-16 1997-08-07 Verwendung von wnt polypeptiden Expired - Lifetime DE69725587T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

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