DE69725611T2

DE69725611T2 - Nicht-Nukleotid verknüpfende Reagentien

Info

Publication number: DE69725611T2
Application number: DE69725611T
Authority: DE
Inventors: George Sheng-Hui Su; Siva Rajkumar IYER; K. Sunil AGGARWAL; L. Krishan KALRA
Original assignee: BIOGENEX LAB SAN RAMON; Biogenex Laboratories Inc
Current assignee: BIOGENEX LAB SAN RAMON; Biogenex Laboratories Inc
Priority date: 1996-05-15
Filing date: 1997-05-15
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2017-05-16
Also published as: AU733647B2; WO1997043451A1; EP0954606A1; AU3146597A; JP2001509784A; CA2253969A1; EP0954606B1; EP0954606A4; US6130323A; ATE252158T1; DE69725611D1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Verwendung von Nicht-Nukleotidreagenzien als Monomereinheiten in Oligonukleotiden.
Hintergrund der Erfindung
Sowohl in Forschungsanwendungen als auch in der klinischen Diagnose ist eine bekannte Technik zum Bestimmen des Vorliegens einer speziellen Nukleotidsequenz (die „Zielnukleotidsequenz") in entweder RNA oder DNA das Durchführen eines Nukleinsäurehybridisierungsassays. In einem solchen Assay wird eine Nukleotidsonde, typischerweise ein Oligonukleotid, ausgewählt, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär mit mindestens einem Teil der Zielnukleotidsequenz ist. Typischerweise ist die Sonde markiert, um ein Mittel bereitzustellen, wodurch das Vorliegen der Sonde leicht nachgewiesen werden kann.
Wenn die markierte Sonde unter Hybridisierungsbedingungen einer Probe ausgesetzt wird, von welcher angenommen wird, dass sie die Zielnukleotidsequenz enthält, wird die Zielsequenz mit einer so markierten Sonde hybridisieren. Das Vorliegen der Zielsequenz in der Probe kann dann qualitativ oder quantitativ bestimmt werden, üblicherweise nach Trennen von hybridisierten und nichthybridisierten Sonden und Bestimmen des Vorliegens oder der Menge der markierten Sonde, welche an die Testprobe hybridisiert ist.
Frühere Verfahren zum Verbinden einer Markierung mit einer Nukleotidsonde verwendeten im Allgemeinen eine einzige Markierung, die an eine Nukleotidmonomereinheit gebunden wird, und dann das Einführen einer oder mehrer der Nukleotidmonomereinheiten in die Sonde. Zum Beispiel sind Analoga von dUTP und UTP, die eine Biotingruppe enthalten, chemisch synthetisiert und in Polynukleotide eingebaut worden (P. R. Langer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 6633 (1981)). Derartige Biotin-markierte Nukleotide können dann in Nukleinsäuresonden biologischen oder synthetischen Ursprungs eingebaut werden.
Andere Verfahren zum Markieren von Nukleotidsonden sind vorgeschlagen worden, welche es erlauben, dass Markierungen statistisch an Nukleotide in einem Nukleotidmultimer gebunden werden. Zahlreiche Vorschläge zum Einbringen mehrfach modifizierter Nukleotide oder von Nicht-Nukleotidmonomereinheiten in Oligonukleotide sind gemacht worden, in Hinblick auf die Verbesserung der Nachweisbarkeit der markierten Sonde und der Zielnukleotidsequenz.
Jedoch ist gezeigt worden, dass die Verwendung derartiger markierter Nukleotide in einer Sonde die Stabilität des Hybrids, das mit einer Zielnukleotidsequenz gebildet wird, insbesondere wenn mehrere Markierungen vorliegen, verringern kann. Eine derartige verringerte Hybridstabilität ist für Nukleinsäuresonden biologischen Ursprungs, die mehrere Biotingruppen aufweisen, für die Synthese von Oligonukleotiden, die mehrere Fluoresceinmarkierungen aufweisen, als auch für synthetische Oligonukleotide, die Biotin- und Fluoresceinmarkierungen aufweisen, gezeigt worden.
Zusätzlich sind Derivate von Nukleotid-bindenden Phosphatgruppen offenbart worden, deren nukleophile Gruppe nachfolgend auf ihren Einbau in ein Oligonukleotid markiert werden kann. Jedoch würde erwartet, dass solche Verbindungen, die auf Nukleotidderivaten basieren, einige der Nachteile aufweisen, die oben für Derivate auf Nukleotidbasis diskutiert werden.
In jüngerer Zeit sind 2-Amino-1,3-propandiolstrukturen verwendet worden, um Oligonukleotide mit Reportergruppen zu markieren (Nelsen, P. S. et al., Nuc. Acids Res. 20: 6253 (1992)). Jedoch erscheinen diese Strukturen eine niedere Kopplungseffizienz aufzuweisen und daher eine geringe Ausbeute markierter Oligonukleotide, welche weiterhin sorgfältig gereinigt werden müssen bevor sie Anwendung als Sonden für Zielsequenzen finden können.
Daher wird es als wünschenswert erachtet ein Nicht-Nukleotidreagenz bereitzustellen, welches hohe Kopplungseffizienz aufweist und daher eine höhere Ausbeute markiertes Oligomer bereitstellt.
Darüber hinaus wird es auch als wünschenswert erachtet, ein solches Reagenz bereitzustellen, welches es erlauben wird, die resultierenden Oligomere zu annealen und zu hybridisieren, mit Effizienzen, die diejenigen von Oligomeren erreichen, welche nur native Nukleotidmonomereinheiten enthalten.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert Nicht-Nukleotidreagenzien, die in der Lage sind zum Bilden eines Oligomers mit Nukleotideinheiten, wobei das Reagenz eine Verbindung der Formel: R¹-X-C-CR²-C-R³ umfasst, wobei
R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Säure-empfindlichen, basenstabilen blockierenden Gruppen und Acylcappinggruppen;
X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S, NH und N = N;
R² eine Substituentengruppe der Formel X¹-X²-X³ ist,
wobei
X¹ eine cyclische substituierte oder nichtsubstituierte C₅- bis C₇-Gruppe ist, welche das Kohlenstoffatom der Formel enthält;
X² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂, NH und N = N; und
X³ Wasserstoff oder eine verbindende funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, an eine funktionelle Gruppe zu binden; und
R³ eine verbindende Gruppe der Formel
ist,
wobei
X⁴ Halogen oder substituiertes Amino ist,
X⁵ Alkyl, Alkoxy oder Phenoxy oder ein Cyanoderivat davon ist,
X⁶ Halogen, Amino oder O ist, und
X⁷ Alkyl, Alkoxy oder Aryloxy ist oder H sein kann, aber nur wenn X⁶ O ist, oder R³ eine entweder direkt oder über eine Zwischengruppe erfolgende Bindung an einen festen Träger ist.
Solche Reagenzien können verwendet werden, um wünschenswerte Funktionalitäten in Oligomeren zu markieren oder auf andere Art einzubringen, unter Verwendung herkömmlicher automatisierter Nukleotidsyntheseprotokolle. Die vorliegenden Reagenzien bewahren den natürlichen Dreikohlenstoffinternukleotidphosphatabstand, um die Hybridisierungs- und Annealingeigenschaften des Nukleotidduplex aufrecht zu erhalten.
In der vorliegenden Erfindung werden auch Zwischenprodukte bereitgestellt, die geeignet sind zum Herstellen derartiger Nicht-Nukleotidreagenzien, Oligomere, die derartige Reagenzien enthalten, Kits, die derartige Reagenzien enthalten, und Verfahren zur Verwendung der Reagenzien beim Bilden von Oligomeren mit Nukleotideinheiten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung des Syntheseprotokolls von Beispiel 1(a), Schritte I und II;
2 ist eine schematische Darstellung des Syntheseprotokolls von Beispiel 1(a), Schritte III, IV und V;
3 ist eine schematische Darstellung des Syntheseprotokolls von Beispiel 1(b);
4 ist eine schematische Darstellung des Syntheseprotokolls von Beispiel 1(c); und
5 ist eine schematische Darstellung des Syntheseprotokolls von Beispiel 1(f).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert Nicht-Nukleotidreagenzien, die in der Lage sind zum Bilden eines Oligomers mit Nukleotideinheiten, wobei die Reagenzien Verbindungen der Formel R¹-X-C-CR²-C-R³ umfassen, worin R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Säure-empfindlichen, basenstabilen blockierenden Gruppen und Acylcappinggruppen;
X ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S, NH und N = N;
R² eine Substituentengruppe der Formel X¹-X²-X³ ist,
wobei
X¹ eine cyclische substituierte oder nichtsubstituierte C₅- bis C₇-Gruppe ist, welche das Kohlenstoffatom der Formel enthält;
X² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂, NH und N = N; und
X³ Wasserstoff oder eine verbindende funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, an eine funktionelle Gruppe zu binden; und
R³ eine verbindende Gruppe der Formel
ist,
wobei
X⁴ Halogen oder substituiertes Amino ist,
X⁵ Alkyl, Alkoxy oder Phenoxy oder ein Cyanoderivat davon ist,
X⁶ Halogen, Amino oder O ist, und
X⁷ Alkyl, Alkoxy oder Aryloxy ist oder H sein kann, aber nur wenn X⁶ O ist, oder R³ eine entweder direkt oder über eine Zwischengruppe erfolgende Bindung an einen festen Träger ist.
In der folgenden Offenbarung werden die folgenden Ausdrücke die angegebenen Bedeutungen aufweisen, es sei denn, eine andere Bedeutung ist aus dem Zusammenhang, in welchem der Ausdruck verwendet wird, ersichtlich.
Wie hier verwendet, soll der Ausdruck „Nukleotid" eine Untereinheit einer Nukleinsäure bedeuten, die aus einer Phosphatgruppe, einem Zucker mit fünf Kohlenstoffen und einer stickstoffenthaltenden Base besteht. Der Ausdruck soll auch Analoga derartiger Untereinheiten umfassen.
Wie hier verwendet, soll der Ausdruck „Nukleotidoligomer" oder „Oligomer" eine Kette von Nukleotiden bedeuten, die durch Phosphodiesterverbindungen verbunden sind, oder Analoga davon.
Wie hier verwendet, soll der Ausdruck „Nukleotidoligomer-enthaltende Nicht-Nukleotidmonomere" ein Oligomer bedeuten, das aus Nukleotideinheiten zusammen mit Nicht-Nukleotidmonomereinheiten besteht, die durch Phosphodiesterbindungen verbunden sind, oder Analoga davon.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Nicht-Nukleotidreagenz, welches synthetisch mit Nukleotidmonomereinheiten gekoppelt werden kann, um ein Oligomer mit definierter Sequenz herzustellen, mit einem Grundgerüst, das aus Nukleotid- und Nicht-Nukleotidmonomereinheiten besteht.
In der ersten oben bereitgestellten Formel R¹-X-C-CR²-C-R³ ist R¹ eine Substituentengruppe von welcher vorgesehen ist, dass sie entfernt wird, um die Verbindung mit anderen Einheiten in der Grundgerüststruktur eines Nukleotidoligomers, enthaltend Nicht-Nukleotidmonomere, zu erleichtern. Als solches ist R¹ im Allgemeinen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, säureempfindlichen, basenstabilen blockierenden Gruppen und Acylcappinggruppen. Derartige Gruppen sind in der Technik allgemein bekannt und umfassen z. B. Triphenylmethylverbindungen und Alkoxyderivate davon, wie etwa Dimethoxytriphenyl (DMT)-Gruppen.
Die als X gekennzeichnete Gruppe wirkt zum Teil dahingehend, um den einwandfreien intramolekularen Abstand in dem Nicht-Nukleotidreagenz zu erhalten, wenn sie als Monomereinheit fungiert. Typischerweise ist X ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus O, S, NH und N = N, wenngleich andere Atome oder Atomgruppen ebenfalls in dieser Hinsicht dienen könnten. Am üblichsten wird X O sein.
Die als R² bezeichnete Gruppe ist eine Substituentengruppe, welche vorgesehen ist, um eine Verbindung mit anderen funktionellen Einheiten und anderen funktionellen Gruppen zu erleichtern, von welchen es gewünscht sein kann, dass sie in einem Nukleotidoligomer enthalten sind, das Nicht-Nukleotidmonomere enthält.
Aufgrund der chemischen Natur des vorliegenden Nicht-Nukleotidreagenz kann es an jedem gewünschten Punkt innerhalb der Nukleotidoligomersequenz positioniert werden. Daher ist es möglich, eine große Vielzahl von Eigenschaften in Oligomeren aufzubauen, welche sowohl Nukleotid als auch Nicht-Nukleotidmonomereinheiten enthalten. Derartige Eigenschaften umfassen die Bindung spezifischer Gruppen, die hier als „funktionelle Gruppen" bezeichnet werden, an jedem gewünschten Ort innerhalb des Oligomers. Derartige Gruppen können (ohne darauf begrenzt zu sein) nachweisbare Markierungen (einschließlich enzymatisch, fluorogen, radioaktiv, chemilumineszent und dgl.), Interkalierungsmittel, Metallchelatoren, Arzneimittel, Hormone, Proteine, Peptide, Radikalerzeugungsmittel, nukleolytische Mittel, proteolytische Mittel, Katalysatoren, spezifische Bindungsmittel (einschließlich Biotin, Antigene, Haptene, Antikörper, Rezeptoren und dgl.), und andere Substanzen von biologischem Interesse, zusammen mit Mitteln, die DNA-Transport durch eine biologische Barriere (wie etwa eine Membran) modifizieren, und Substanzen, welche die Löslichkeit eines Nukleotidmultimers verändern, umfassen. Daher ist es möglich, derartige Markierungen und Mittel benachbart zu einem gewünschten Nukleotid zu positionieren.
Die R²-Gruppe weist typischerweise die Formel X¹-X²-X³ auf,
worin
X¹ eine substituierte oder unsubstituierte cyclische C₅-bis C₇-Gruppe ist, welche das Kohlenstoftatom der Formel enthält;
X² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O, S, CH₂, NH und N = N; und
X³ eine verbindende funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, an eine funktionelle Gruppe zu binden.
In dem vorliegenden Reagenz sieht die Steifheit der chemischen Struktur von X¹ das wünschenswerte Merkmal des Verlängers der Verknüpfungsgruppe und der funktionellen Gruppe weg von der oligomeren Grundgerüststruktur vor, wobei die Kopplungseffizienz des Reagenz der vorliegenden Erfindung wesentlich verbessert wird. Herkömmlicherweise wird X¹ substituiertes oder Nicht substituiertes Cyclohexan sein.
Die als X² bezeichnete Gruppe dient als eine Verbindungs- und modifizierbare reaktive Gruppe. Typischerweise ist X² ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus O, S, NH, CH₂ und N = N, wenngleich andere Atome oder Atomgruppen ebenfalls in dieser Funktion dienen können. Am üblichsten wird X² NH sein.
In der Formel ist X³ Wasserstoff oder eine verbindende funktionelle Gruppe, welche jede Länge aufweisen kann, die geeignet ist für die ausgewählte spezielle funktionelle Gruppe. Typischerweise ist X³ eine Gruppe der Formel -CO-(CH₂)-NH-funktionelle Gruppe, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 20 ist. Es ist natürlich innerhalb des Bereichs der Erfindung, die funktionelle Gruppe zu dem Reagenz vor oder nach dem Einbringen des Reagenz als eine Monomereinheit in ein Oligomer zuzugeben. Zusätzlich kann die funktionelle Gruppe auch als eine Bindung an einen festen Träger dienen.
In der Formel ist R³ eine Substituentengruppe, welche vorgesehen ist, um die Verbindung mit anderen Einheiten in der Grundgerüststruktur eines Nukleotidoligomers, das Nicht-Nukleotidmonomere enthält, oder an feste Träger und dgl. zu erleichtern. Typischerweise wird eine solche Bindung durch automatisierte Verfahren realisiert, wie etwa automatisierte DNA/RNA-Syntheseprotokolle. Als solches ist R³ im Allgemeinen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphodiestern, Phosphotriestern, Phosphiten, Phosphoramiditen, H-Phosphonaten, Alkyl-phosphonaten und Phosphorothioaten. Derartige Gruppen sind in der Technik allgemein bekannt und umfassen z. B. verbindende Phosphorgruppen der Formel
worin
X⁴ Halogen oder substituiertes Amino ist,
X⁵ Alkyl, Alkoxy oder Phenoxy ist, oder ein Cyanoderivat davon,
X⁶ Halogen, Amino oder O ist, und
X⁷ Alkyl, Alkoxy oder Aryloxy ist, oder H sein kann, nur wenn X⁶ O ist, oder R³ eine Bindung ist, entweder direkt oder über eine Zwischengruppe, an einen festen Träger.
Wie oben diskutiert werden die vorliegenden Nicht-Nukleotidreagenzien eine Linkerfunktion bzw. Verbindungsfunktion aufweisen, an welche gewünschte chemische Gruppen gebunden worden sind oder gebunden werden können, entweder vor oder nach Initiieren der Synthese des Nukleotidoligomers.
Im Allgemeinen werden die Techniken zum Binden von Gruppen an den Linkerarm ähnlich denjenigen Techniken sein, die bekannt sind zum Binden von Markierungen an Gruppen auf Proteine. Beispiele geeigneter Chemie umfassen eine Reaktion von Alkylaminen mit aktiven Estern, aktiven Iminen, Arylfluoriden oder Isothiocyanaten und die Reaktion von Thiolen mit Maleimiden, Haloacetylen, usw. (siehe im Allgemeinen Means, G. M. und R. E. Feeney, „Chemical Modification of Proteins" Holden-Day Inc. (1971); R. E. Feeney, Int. J. Peptide Protein Res. 29: 145–161 (1987)).
Wie oben diskutiert, kann aufgrund der chemischen Natur des vorliegenden Nicht-Nukleotidreagenz es an jedem gewünschten Punkt innerhalb der Nukleotidoligomersequenz positioniert werden. Daher ist es möglich eine große Vielzahl von Eigenschaften in Oligomeren zu entwickeln, welche sowohl Nukleotid- als auch Nicht-Nukleotidmonomereinheiten enthalten. Derartige Eigenschaften umfassen die Bindung spezifischer funktioneller Gruppen an jede gewünschte Stelle innerhalb des Oligomers.
Andere Vorteile, die durch die Praxis der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, umfassen die Möglichkeit zum Immobilisieren der definierten Sequenz auf einem festen Träger durch Verwendung der Linkerarmfunktionalität, die mit einer chemischen Gruppe des Trägers verbunden ist, um z. B. Nukleotidaffinitätsträger aufzubauen. Mehrere chemische Reste können ebenfalls in das Oligomer über mehrere Nicht-Nukleotidmonomereinheiten in eine speziellen Nukleotidoligomersequenz eingebracht werden.
Man kann auch Oligomere vorsehen, welche von natürlich auftretenden Polynukleotiden dahingehend abweichen, dass sie veränderte Aktivitäten umfassen, durch Verwendung von Proteinen und Enzymen, welche auf Polynukleotide wirken. Zum Beispiel wird die Anordnung der Nicht-Nukleotidmonomereinheit auf dem 3'-Terminus auf einem ansonsten reinen Polynukleotid Resistenz gegenüber einem Abbau durch Schlangengiftphosphodiesterasen einführen oder wird spezifische Spaltstellen für ausgewählte Nukleasen liefern.
Hybridisierungssonden können ebenfalls entwickelt werden durch Einfügen von hybridisierbaren Nukleotidmonomereinheiten und Nicht-Nukleotidmonomereinheiten. Zum Beispiel kann eine gemischte Synthese von Nukleotid- und Nicht-Nukleotidmonomeren durchgeführt werden, wobei eine definierte Sequenz von Nukleotidmonomeren synthetisiert wird, gefolgt durch eine Sequenz von einer oder mehreren Nicht-Nukleotidmonomereinheiten, optional gefolgt durch einen zweiten Block aus einer definierten Sequenz von Nukleotidmonomeren.
Die vorliegende Erfindung liefert auch die Möglichkeit zum Aufbau synthetischer Sonden, die gleichzeitig Nukleotidmultimere nachweisen, welche sich durch ein oder mehrere Basenpaare unterscheiden. Dies kann realisiert werden durch Verwendung der Nicht-Nukleotidreagenzien, die hier beschrieben sind, um die Nukleotide in einer Sonde durch Nicht-Nukleotidmonomereinheiten an ausgewählten Stellen zu ersetzen, wo Unterschiede auftreten in der Nukleotidsequenz der verschiedenen Zielnukleotidsequenzen.
In ausgewählten Ausführungsformen der Erfindung werden markierte Hybridisierungssonden als Oligomere mit einer definierten Sequenz entwickelt, bestehend aus Nukleotid und Nicht-Nukleotidmonomeren. Derartige Nicht-Nukleotidmonomereinheiten können in einer ausgewählten Region in Gruppen zusammengefasst werden oder in die Sequenz des Nukleotidoligomers eingefügt werden. Die Nicht-Nukleotidmonomereinheiten können chemisch markiert sein zur Verwendung in Hybridisierungsreaktionen.
In der vorliegenden Erfindung wird das Nicht-Nukleotidreagenz auf eine Art bereitgestellt, welche es erlaubt, dass es schrittweise zugegeben wird, um ein gemischtes Nukleotid-, Nicht-Nukleotidoligomer unter Verwendung derzeitiger DNA/RNA-Syntheseverfahren herzustellen. Derartige Reagenzien würden normalerweise schrittweise zugegeben werden, um die entsprechende Monomereinheit an eine wachsende Oligonukleotidkette zu binden, welche kovalent an einem festen Träger immobilisiert ist. Typischerweise wird das erste Nukleotid an den Träger über eine spaltbare Esterbindung vor der Initiierung der Synthese gebunden. In der vorliegenden Erfindung kann das Nicht-Nukleotidreagenz geeigneterweise gebunden an derartige feste Träger, z. B. an Glas mit fester Porengröße (CPG), an Harze, Polymere, wie etwa Polystyrol und dgl., bereitgestellt werden. Schrittweise Verlängerung der Oligonukleotidkette wird normalerweise in der 3'- nach 5'-Richtung durchgeführt. Derartige Nukleinsäuresyntheseverfahren werden z. B. bereitgestellt in S. A. Narang, „Synthesis and Applications of DNA and RNA", Academic Press (1987) und in M. J. Gait „Oligonucleotide Synthesis", IRL Press, Washington, D. C. (1984).
Wenn die Synthese abgeschlossen ist, wird das Oligomer von dem Träger durch Hydrolisieren der Esterbindung abgespalten und das ursprünglich an den Träger gebundene Nukleotid wird der 3'-Terminus des resultierenden Oligomers. Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung sowohl ein Reagenz zum Herstellen von Oligomeren, die ein Gemisch aus Nukleotid- und Nicht-Nukleotidmonomereinheiten enthalten, zusammen mit Verfahren zur Verwendung derartiger Reagenzien beim Aufbau derartiger Oligomere.
Typischerweise werden die vorliegenden Reagenzien zwei Kopplungsgruppen enthalten, um die schrittweise Aufnahme in ein Oligomer von Nukleotid- und Nicht-Nukleotidmonomereinheiten zu erlauben. Die erste der Kopplungsgruppen wird die Eigenschaft aufweisen, dass sie wirkungsvoll an den Terminus einer wachsenden Kette aus Monomereinheiten koppeln kann. Die zweite der Kopplungsgruppen ist in der Lage schrittweise die wachsende Kette aus gemischten Nukleotid- und Nicht-Nukleotidmonomeren zu verlängern. Dies erfordert typischerweise, dass die zweite Kopplungsgruppe inaktiviert ist während die erste Kopplungsgruppe gekoppelt wird, um zu dieser Zeit nicht wesentlich zu koppeln, kann die zweite Kupplungsgruppe hiernach aktiviert werden, um dann an die Nicht-Nukleotidmonomereinheit zu koppeln. Die Inaktivierung wird vorzugsweise durchgeführt mit einer Schutzgruppe auf der zweiten Kopplungsgruppe, welche dann entfernt werden kann, um die zweite Kopplungsgruppe zu aktivieren. Es ist ebenfalls im Bereich der Erfindung vorgesehen, dass eine solche „Inaktivierung" und „Aktivierung" einfach durchgeführt werden kann durch Verändern der Reaktionsbedingungen (z. B. pH-Wert, Temperatur, Konzentration der Reagenzien und dgl.), mit zweiten Kopplungsgruppen geeigneter chemischer Struktur, welche sich selbst zur Inaktivierung und Aktivierung durch solche Techniken eignen. Derartige Kopplungsgruppen erlauben die benachbarte Bindung von in sowohl Nukleotidals auch Nicht-Nukleotidmonomereinheiten. Es wird als wünschenswert erachtet, dass derartige Kopplungsgruppen durch Kopplungs- und Entschützungsschritte wirken, welche mit automatisierten Standard-DNA-Syntheseverfahren kompatibel sind.
Derartige Verfahren erfordern typischerweise, dass Synhese in einer Richtung bzw. unidirektional auftritt und dass alle Kopplungsspaltungs- und Entschützungsschritte unter „nicht nachteiligen Bedingungen" auftreten, d. h. sie beeinflussen das Oligomergrundgerüst und seine verschiedenen Komponenten nicht wesentlich nachteilig.
Daher liefert die vorliegende Erfindung Oligomere, die die vorliegenden Nicht-Nukleotidreagenzien enthalten, als auch Verfahren zur Verwendung derartiger Reagenzien bei der Synthese von Oligomeren die sowohl Nukleotid- als auch Nicht-Nukleotideinheiten enthalten.
Die Erfindung liefert weiterhin Zwischenprodukte, welche geeignet sind zur Synthese der vorliegenden Nicht-Nukleotidreagenzien. Eine Ausführungsform eines solchen Zwischenprodukts wird bereitgestellt durch die Formel: R¹-X-C-CR²-C-R³ worin
R¹ Wasserstoff ist; X Sauerstoff ist;
R² eine Substituentengruppe der Formel X¹-X²-X³ ist, worin X¹ zusammen mit dem Kohlenstoffatom der Formel Cyclohexan ist, X² NH ist und X³ H ist; und
R³ OH ist.
In dieser Ausführungsform weist das Zwischenprodukt eine Struktur auf, die ähnlich derjenigen der vorliegenden Reagenzien ist, ohne dass die funktionellen Gruppen bei R¹, X³ und R³ eingeschlossen sind.
Um die Verwendung der vorliegenden Reagenzien zu erleichtern, können Kits zur Verwendung beim Aufbauen von Oligomer bereitgestellt werden, um die Praxis des oben beschriebenen Verfahrens zu vereinfachen. Der Kit wird typischerweise ein Aufnahmemittel enthalten, welches so gestaltet ist, dass es ein oder mehrere Reagenzbehälter und mindestens einen ersten Behälter aufnehmen kann, umfassend (1) ein Reagenz der Formel: R¹-X-C-CR²-C-R³ worin
R¹, X, R² und R³ wie früher definiert sind. Das Reagenz kann als eine Lösung bereitgestellt werden, umfassend ein Lösungsmittel und das Reagenz oder (2) das Reagenz in einer Menge, die geeignet ist, um die gewünschte Konzentration aufzubauen wenn Lösungsmittel von einem anderen Behälter verwendet wird, um den Reagenzbehälter auf ein vorbestimmtes Niveau aufzufüllen.
In vielen Fällen wird der Kit auch mindestens einen zweiten Behälter aufweisen, enthaltend (1) ein Reagenz, das bei der Synthese von Oligomeren verwendet wird, oder (2) ein Reagenz, das bei dem Nachweis der funktionellen Gruppe, die in ersterem Reagenz enthalten ist, verwendet wird, oder Behältnisse mit beiden derartigen Materialien. Solche Reagenzien sind in der Technik allgemein bekannt und erfordern hier keine weitere Beschreibung. Spezifische Beispiele sind in den allgemeinen Beispielen der Erfindung unten angegeben. Geeignete Anweisungen zum Durchführen des Verfahrens der Erfindung werden in dem Kit ebenfalls enthalten sein.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung und sollen nicht als begrenzend für den Bereich ausgelegt werden.
Experimentelles
In der Offenbarung der Experimente, welche folgt, sind alle angegebenen Gewichte in Gramm (g), Milligramm (mg), Mikrogramm (μg), Nanogramm (ng) oder Pikogramm (pg), alle Mengen sind in Mol (mol), Millimol (mmol), Mikromol (μmol), Nanomol (nmol), Pikomol (pmol) oder Femtomol (fmol) angegeben, alle Konzentrationen sind als Volumenprozent (%), Volumenanteile (V/V), Molar (M), Millimolar (mM), Mikromolar (μM), Nanomolar (nM), Pikomolar (pM) oder normal (N) angegeben, alle Volumen sind in Liter (l), Milliliter (ml) oder Mikroliter (μl) angegeben und lineare Abmessungen sind in Millimeter (mm) oder Nanometer (nm) angegeben, es sei denn es ist anders angegeben.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Synthese von Reagenzien der vorliegenden Erfindung, als auch ihrer Verwendung bei der Bildung von Oligomeren mit Nukleotideinheiten gemäß der Erfindung.
In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet: „CX" soll Cyclohexan bedeuten, „Bz" soll Benzoyl bedeuten, „CED" soll Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit bedeuten und „LC" soll Langkette bedeuten.
Beispiel 1
Reagenzien entsprechend der vorliegenden Erfindung können gemäß chemischer Synthesetechniken, die in der Technik allgemein bekannt sind, synthetisiert werden. Die folgenden Syntheseprotokolle zeigen die Synthese einer ausgewählten Verbindung innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
(a) Synthese von Reagenzverbindung 1, worin R¹ Dimethoxytriphenyl (DMT) ist, X O ist, R² Cyclohexan-NH-CO-Biotin ist und R³ Phosphoramidit ist.
[VERBINDUNG 1]
Das Syntheseprotokoll für Verbindung 1 ist unten aufgeführt und in den 1 und 2 dargestellt:
Schritt I: Synthese von BzO-CX
Zu einer eiskalten Lösung von 500 g 4,4-bis(Hydroxymethyl)-1-cyclohexen in 3,0 l Pyridin wurden tropfenweise 1,03 l Benzoylchlorid gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, als TLC-Analyse (Ethylacetat/Hexan 1 : 4 V/V) zeigte, dass die Reaktion abgeschlossen war. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von 100 mL Wasser gequencht, gefolgt durch Rühren bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingedampft, um einen sirupartigen Rückstand zu erhalten. Dieser wurde in Methylenchlorid gelöst und mit 5%-iger wässriger NaHCO₃-Lösung gewaschen. Die organische Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, um 1500 g Rohprodukt zu erhalten.
Dieses Produkt wurde durch Säulenchromatographie über Silikagel unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (1 : 4, V/V) zum Eluieren des Produkts gereinigt (Ausbeute 1050 g). Das gewünschte Produkt wurde unter Hochvakuum für 2 Tage getrocknet.
Schritt II: Synthese von NH₂-CX
Zu einer gerührten Lösung von 120 g BzO-CX in 300 ml Diglyme, wurde unter Argon tropfenweise eine Lösung von 5,5 g NaBH₄ in 150 ml Diglyme getropft. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf 70°C erhitzt. Eine Lösung von 23,4 ml BF₃-Et₂O in 30 mL Diglyme wurde dann langsam zu dem Reaktionsgemisch gegeben und das resultierende Gemisch bei 70°C für 1 Stunde gerührt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 2,5 ml Wasser gequencht. Dies wurde gefolgt durch die Zugabe von 50 g Hydroxylamin-O-sulfonsäure und das Reaktionsgemisch wurde bei 100°C für 3 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt und dann in 1,2 l Methylenchlorid extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit 500 ml Wasser, gefolgt von einer 5%-igen NaHCO₃-Lösung (2 × 300 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfen entfernt, um 270 g Rohprodukt zu ergeben.
Reinigen des Rohprodukts durch Kieselgelsäuienchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, das 2,5 bis 8,0% Methanol in Methylenchlorid umfasst, zum Eluieren des Produkts, erbrachte 50 g reines 4-Aminoisomer von NH₂-CX. Kleine Mengen des ungewünschten 3-Aminoisomers von NH₂-CX wurden ebenfalls gebildet.
Schritt III: Synthese von BzO-CX-Biotin
Zu 13,5 g der Aminoverbindung NH₂-CX, die oben erhalten wurde, wurden 200 ml Methylenchlorid gegeben. Zu der resultierenden Lösung wurden 18,8 g Biotinyl-N-hydroxysuccinimidester (Biotin-NHSu), gelöst in 200 ml DMF, gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 15 min bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt durch die Zugabe von 10,3 ml Triethylamin. Man ließ die Reaktion für 1,5 Stunden fortschreiten, als die TLC-Analyse zeigte, dass die Reaktion abgeschlossen ist.
Methylenchlorid wurde durch Rotationsverdampfen entfernt und der resultierende Rückstand wurde mit 30 ml Methanol und mit 25 ml 10%-iger wässriger Natriumcarbonatlösung behandelt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt und dann mit 1,2 l Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Salzlösung (2 × 400 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, um letztendlich 22 g Rohprodukt zu ergeben.
Dieses Produkt wurde durch Säulenchromatographie über Silikagel unter Verwendung einer Gradientenelution mit 2,5 bis 8,0% Methanol in Methylenchlorid gereinigt, um 15 g zu ergeben.
Schritt IV: Synthese von DMT-CX-Biotin
Zu einer gerührten Lösung von 14,3 g BzO-CX-Biotin in 200 ml DMF wurden 20 ml 25%-iges Natriummethoxid in Methanol gegeben und das resultierende Gemisch wurde bei 0 bis 5°C für 1 Stunde gerührt. Der pH-Wert der Lösung wurde dann auf 7,0 durch die Zugabe von 60 g Dowex 50X8-100 Harz zu dem Reaktionsgemisch, gefolgt durch Rühren für 15 min, eingestellt. Das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft, um DMF zu entfernen. Der resultierende Rückstand wurde in 10 mL Methylenchlorid gelöst und das Produkt durch die Zugabe von 100 mL Hexan präzipitiert. Das Produkt wurde dann unter Hochvakuum getrocknet.
Das auf diese Art erhaltene Rohprodukt wurde zweimal mit Pyridin azeotrop destilliert und dann in 300 ml Pyridin gelöst. Zu diesem wurden 8,13 g DMT-Cl gegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur unter Argon für 1, 5 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 5 ml Methanol gequencht. Das Reaktionsgemisch wurde in 1 l Methylenchlorid aufgenommen, der organische Extrakt mit 5%-iger NaHCO₃-Lösung gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Verdampfen der Lösungsmittel im Vakuum erbrachte 26 g Rohprodukt, welches durch Säulenchromatographie über Silikagel, Eluieren mit Methylenchlorid/Methanol (100 : 4 V/V) gereinigt wurde, um 5,7 g zu ergeben.
Schritt V: Synthese von Biotin-CX-CED-Phosphoramidit
Das in Schritt IV oben erhaltene Zwischenprodukt wurde in das entsprechende Phosphoramidit unter Verwendung von Standardverfahren übergeführt. So wurden 4,0 g DMT-CX-Biotin in 40 ml Methylenchlorid gelöst und die resultierende Lösung mit 2,3 ml 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit und 600 mg DIPA-Tetrazolsalz behandelt. Nach 15 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml Methanol gequencht. Das Reaktionsgemisch wurde in 400 ml Methylenchlorid gegossen und die organische Schicht mit 5%-iger Natriumbicarbonatlösung (2 × 100 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Entfernung der Lösungsmittel durch Rotationsverdampfen ergab 5,8 g Rohprodukt, welches durch Säulenchromatographie über Silikagel, eluiert mit CH₂Cl₂/Methanol/TEA (100 : 2 : 1, V/V/V) gereinigt wurde, um 3,6 g reine Verbindung 1 zu ergeben.
(b) Synthese der Reagenzverbindung 2, worin R¹ Dimethoxytriphenyl (DMT) ist, X Oist, R² Cyclohexan-H-CO(CH₂)₅NHCOOF₃ ist und R³ Phosphoramidit ist.
[Verbindung 2]
Das Syntheseprotokoll für Verbindung 2 ist unten angegeben und in 3 dargestellt:
Schritt I: Synthese des BzO-CX-Linkers
Zu 15,0 g der NH₂-CX-Zwischenstufe (hergestellt in Schritt 2 von Beispiel 1a), gelöst in 150 ml Methylenchlorid, wurde tropfenweise eine Lösung von 21,2 g 6-Trifluoracetamidocapronsäure-N-Hydroxysuccinimidester (Linker-NHSu) in 150 ml Methylenchlorid gegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 min gerührt und dann mit 12,1 ml Triethylamin behandelt. Nach 90 min Rühren bei Raumtemperatur zeigte TLC-Analyse (CH₂Cl₂/Methanol, 9 : 1), dass die Reaktion abgeschlossen war.
Methylenchlorid wurde durch Rotationsverdampfen entfernt, der resultierende Rückstand mit 150 ml Methanol behandelt, gefolgt durch 30 ml 10%-ige wässrige Na₂CO₃-Lösung und das Gemisch wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch in 1,0 l CH₂Cl₂ gegossen und der organische Extrakt mit 5%-iger Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wurden die Lösungsmittel im Vakuum verdampft, um 22 g Rohprodukt zu ergeben. Blitzchromatographiereinigung unter Verwendung von CH₂Cl₂/Methanol (100 : 3, V/V) als der Eluent, erbrachte 10,6 g reines Produkt.
Schritt II: Synthese von DMT-CX-Linker
Zu einer gerührten Lösung von 10,3 g BzO-CX-Linker in 100 ml DMF wurden 15 ml 25% Natriummethoxid in Methanol gegeben und das resultierende Gemisch wurde bei 0 bis 5°C für 1 Stunde gerührt. Der pH-Wert der Lösung wurde dann auf 7,0 eingestellt durch die Zugabe von 45 g Dowex 50X8-100 Harz zu dem Reaktionsgemisch, gefolgt durch Rühren für 15 min. Das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft, um DMF zu entfernen. Der resultierende Rückstand wurde in 5 ml Methylenchlorid gelöst und das Produkt durch die Zugabe von 50 ml Hexan präzipitiert. Das Produkt wurde dann unter Hochvakuum getrocknet.
Das auf diese Art erhaltene Rohprodukt wurde zweimal azeotrop mit Pyridin destilliert und dann in 100 ml Pyridin gelöst. Zu diesem wurden 5,9 g DMT-Cl gegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter Argon für 1,5 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 3 ml Methanol gequencht und für 30 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 500 ml Methylenchlorid aufgenommen, der organische Extrakt mit 5%-iger NaHCO₃-Lösung (300 ml × 2) gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Verdampfen der Lösungsmittel im Vakuum erbrachte 11,9 g Rohprodukt, welches durch Säulenchromatographie über Silikagel gereinigt wurde, unter Elution mit Methylenchlorid/Methanol (100 : 2 V/V), um 5,7 g zu ergeben.
Schritt III: Synthese von N-Linker-CX-CED-Phosphoramidit
Das im obigen Schritt II erhaltene Zwischenprodukt wurde in das entsprechende Phosphoramidit unter Verwendung von Standardverfahren übergeführt. So wurden 3,0 g DMT-CX-Linker in 50 mL Methylenchlorid gelöst und die resultierende Lösung wurde mit 2,2 ml 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit und 560 mg DIPA-Tetrazolsalz gelöst. Nach 15 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch die Zugabe von 1,0 ml Methanol gequencht. Das Reaktionsgemisch wurde in 300 ml Methylenchlorid gegossen, die organische Schicht mit 5%-iger Natriumbicarbonatlösung (2 × 80 ml) gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Entfernung von Lösungsmitteln durch Rotationsverdampfen ergab 4,3 g Rohprodukt, welches durch Säulenchromatographie über Silikagel gereinigt wurde, unter Elution mit CH₂Cl₂/Methanol/TEA (100 : 1 : 1, V/V/V) – Ausbeute 3,1 g reine Verbindung 2.
(c) Synthese der Reagenzverbindung 3, worin R¹ Dimethoxytriphenyl (DMT) ist, X O ist, R² Cyclohexan-NH-CO-Fluorescein ist und R³ Phosphoramidit ist.
[VERBINDUNG 3]
Das Syntheseprotokoll für Verbindung 3 ist unten angegeben und in 4 dargestellt:
Schritt I: Synthese von 4-Amino-1,1-bis(hydroxymethyl)cyclohexan
Zu 30,6 g NH₂-CX, gelöst in 400 ml Methanol, wurden 39,3 ml einer Lösung aus Natriummethoxid (25% Gew/V) in Methanol gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur für 1 Stunde unter wasserfreien Bedingungen gerührt. Die Reaktion wurde durch TLC unter Verwendung eines Gemischs aus Methylenchlorid : Methanol (9 : 1) als Lösungsmittel beobachtet. Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand mit 60 ml Wasser behandelt, in einem Eisbad gekühlt und dann durch langsame Zugabe von Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Methylenchlorid (4 × 100 ml) extrahiert und der wässrige Anteil im Vakuum konzentriert, um 21,5 g Produkt, das Natriumchlorid enthielt, zu ergeben. Der Rückstand wurde mit 200 ml Methanol behandelt, filtriert und im Vakuum wurden Lösungsmittel entfernt, um 13,2 g des gewünschten Produkts zu ergeben.
Schritt II: 5-(& 6-)Carboxyfluoresceindipivaloat
Zu einer Lösung von 25 g 5-(&-6)-Carboxyfluorescein in 200 ml Pyridin wurden 25,8 g Diisopropylethylamin gegeben und das resultierende Gemisch auf –10°C gekühlt. Zu der gekühlten Lösung wurden tropfenweise 32,8 ml Pivaloylchlorid gegeben und das Gemisch wurde für 2 Stunden unter Argon gerührt. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur über 2 Stunden erwärmen. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockene eingedampft und der Rückstand mit 1,0 l Methylenchlorid extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Wasser (2 × 500 ml) extrahiert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, um 43,4 g Rohprodukt zu ergeben. Blitzchromatographiereinigung dieses Rohprodukts (Silikagel, CH₂Cl₂/MeOH, Gradientenelution 2 bis 8% MeOH) erbrachte 22,0 g reines Produkt.
Schritt III: 5-(& 6-)Carboxyfluorsceindipivaloylsuccinimidylester
Zu einer Lösung von 28,3 g 5-(und 6-)Carboxyfluoresceindipivaloat in 250 ml Methylenchlorid wurden unter Argon 7,1 g N-Hydroxysuccinimid gegeben, gefolgt durch 13 g DCC. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht unter wasserfreien Bedingungen gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat bis zur Trockene eingedampft, um 39 g Rohprodukt zu ergeben. Dieses Produkt wurde durch Säulenchromatographie über Silikagel gereinigt, unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (1 : 1, V/V) als der Eluent, um 27,4 g zu ergeben.
Schritt IV: Fluorescein-CX-Amid
13,2 g 4-Amino-1,1-bis(hydroxymethyl)cyclohexan wurden azeotrop mit 50 ml wasserfreiem DMF unter Verwendung von Rotationsverdampfung bei 55°C destilliert. Zu diesem wurden 75 ml wasserfreies DMF gegeben, gefolgt durch 19,5 g 5-(& 6-)Carboxyfluoresceindipivaloylsuccinimidylester unter Argon. 3,3 g Triethylamin wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur über Nacht unter wasserfreien Bedingungen gerührt. Die Lösung wurde bis zur Trockene unter Verwendung von Rotationsverdampfung bei 55 ± 5°C eingedampft. Der Rückstand wurde in 500 ml Methylenchlorid extrahiert und der organische Rückstand mit Wasser (2 × 100 ml) gewaschen. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wurden Lösungsmittel im Vakuum entfernt, um 32 g Rohprodukt zu ergeben. Blitzchromatographiereinigung dieses Rohprodukts (Silikagel, CH₂Cl₂/MeOH, Gradientenelution 3–6% MeOH) erbrachte 7,4 g reines Produkt.
Schritt V: Synthese von DMT-CX-Fluorescein
Zu 7,4 g Produkt, das aus Schritt IV oben erhalten wurde, wurden 50 ml wasserfreies Pyridin gegeben und das Gemisch azeotrop destilliert. Der Rückstand wurde in 50 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Zu diesem wurden 4,6 g DMT-Cl gegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur über Nacht unter Argon gerührt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 10 ml Methanol gequencht und für 30 min gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde in 250 ml Methylenchlorid aufgenommen, der organische Extrakt mit 75 ml 5%-iger NaHCO₃-Lösung gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Verdampfung der Lösungsmittel im Vakuum erbrachte 13,5 g Rohprodukt, welches durch Säulenchromatographie über Silikagel gereinigt wurde, wobei zuerst mit 1,0 l Hexan : Ethylacetat (6,5 : 3,5, V/V) und dann mit 2,0 l Hexan : Ethylacetat (1 : 1, V/V) eluiert wurde, um 5,8 g zu ergeben.
Schritt VI: Synthese von Fluorescein-CX-CED-Phosphoramidit
Das in Schritt V oben erhaltene Zwischenprodukt wurde in das entsprechende Phosphoramidit unter Verwendung von Standardverfahren übergeführt. So wurden 5,8 g DMT-CX-Fluorescein in 100 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst und die resultierende Lösung mit 3,0 g Diisopropylethylamin behandelt, gefolgt durch 1,9 g 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,0 ml Methanol gequencht. Das Reaktionsgemisch wurde in 200 ml Methylenchlorid gegossen, die organische Schicht mit 5%-iger Natriumbicarbonatlösung (2 × 75 ml) gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Entfernung der Lösungsmittel durch Rotationsverdampfen ergab 8,0 g Rohprodukt, welches durch Säulenchromatographie über Silikagel gereinigt wurde, unter Elution mit Hexan/Ethylacetat/TEA (Gradientenelution – 30,0 bis 35,0% Ethylacetat in Hexan, enthaltend 0,5% TEA), um 4,2 g reine Verbindung 3 zu ergeben.
(d) Synthese der Reagenzverbindung 4, worin R¹ Dimethoxytriphenyl (DMT) ist, X O ist, R² Cyclohexan-NH-CO(CH₂)₅NHCOCF₃ ist und R³ -OCOCH₂CH₂CONH-CPG ist.
(VERBINDUNG 4]
Das Syntheseprotokoll für Verbindung 4 ist unten angegeben:
Schritt 1: Herstellung von N-Linker-Succinat:
Zu einer gerührten Lösung von 1,95 g DMT-N-Linker-CX in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid wurden 100 mg 4-Dimethylaminopyridin gegeben, gefolgt von 1,2 g Succinanhydrid. Die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur für 15 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch die Zugabe von 10 ml einer 5%-igen Lösung von Natriumbicarbonat in Wasser gequencht und das Gemisch wurde für 30 min gerührt. Das rohe Reaktionsgemisch wurde dann bis zur Trockene im Vakuum eingedampft und der resultierende Rückstand zweimal mit 50 ml Methylenchlorid extrahiert.
Der organische Extrakt wurde mit 5%-iger wässriger Zitronensäurelösung (2 × 20 ml) gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Verdampfung der Lösungsmittel im Vakuum erbrachte 1,9 g des Rohprodukts. Dieses Produkt wurde durch Blitzchromatographiereinigung über Silikagel unter Verwendung von CH₂Cl₂/CH₃OH (100 : 5, V/V) als der Eluent gereinigt.
Schritt 2: Herstellung von N-Linker-CPG:
Zu einer Suspension von 4,0 g LCAA-CPG in 14 ml Methylenchlorid in einem 50 ml Rundkolben wurden 105 mg N-Linker-Succinat und 0,7 ml Triethylamin gegeben. Dies wurde gefolgt durch die Zugabe von 20 mg wasserfreiem Hydroxybenzotriazol und 70 mg Benzotrizolyl-N-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP-Reagenz).
Das resultierende Gemisch wurde vorsichtig für 2 Stunden geschüttelt, dann filtriert, mit Methylenchlorid (10 ml × 2) gewaschen und luftgetrocknet. Der Feststoff wurde in einen 100 ml Rundkolben übergeführt, mit 36 ml Pyridin, 4 ml Essigsäureanhydrid und 0,4 ml N-Methylimidazol behandelt und die resultierende Suspension über Nacht geschüttelt. Das Gemisch wurde dann saugfiltriert und der Feststoff mit Methanol (10 ml × 3) gewaschen. Der Feststoff wurde weiterhin mit Methylenchlorid (10 ml × 3), gefolgt durch wasserfreien Ether (10 ml × 3) gewaschen. Der Feststoff wurde luftgetrocknet und dann schließlich über Nacht unter Hochvakuum getrocknet.
(e) Synthese der Reagenzverbindung 5, worin R¹ Dimethoxytriphenyl (DMT ist, X O ist, R² Cyclohexan-NH-CO-Biotin ist und R³ -OCOCH₂CH₂CONH-CPG ist.
[VERBINDUNG 5]
Das Syntheseprotokoll für Verbindung 5 ist in 5 angegeben und unten ausgeführt:
Schritt 1: Herstellung von Biotinsuccinat:
Zu einer gerührten Lösung von 2,0 g DMT-CX-Biotin in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid wurden 100 mg 4-Dimethylaminopyridin, gefolgt von 1,2 g Succinanhydrid gegeben. Die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur für 15 Stunden gerührt, zu welchem Zeitpunkt TLC-Analyse des Reaktionsgemischs durchgeführt wurde (9 : 1 CH₂Cl₂/CH₃OH), wodurch angezeigt wurde, dass die Reaktion abgeschlossen war.
Das Reaktionsgemisch wurde durch die Zugabe von 10 ml einer 5%-igen Lösung von Natriumbicarbonat in Wasser gequencht und das Gemisch wurde für 30 min gerührt. Das rohe Reaktionsgemisch wurde dann bis zur Trockene im Vakuum eingedampft und der resultierende Rückstand zweimal 50 ml Methylenchlorid extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit 5%-iger wässriger Zitronensäurelösung (20 ml × 2) gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Verdampfung der Lösungsmittel im Vakuum erbrachte 2,4 g des Rohprodukts. Das Produkt wurde durch Blitzchromatographiereinigung über Silikagel unter Verwendung von CH₂Cl₂/CH₃OH (100 : 4, V/V) als der Eluent gereinigt.
Schritt 2: Herstellung von Biotin-CPG:
Zu einer Suspension von 4,0 g LCAA-CPG in 14 ml Methylenchlorid in einem 50 ml Rundkolben wurden 110 mg Biotinsuccinat und 0,7 ml Triethylamin gegeben. Dies wurde gefolgt durch die Zugabe von 20 mg wasserfreiem Hydroxybenzotriazol und 70 mg BOP-Reagenz. Das resultierende Gemisch wurde vorsichtig für 2 Stunden geschüttelt, dann filtriert, mit Methylenchlorid (20 ml × 2) gewaschen und luftgetrocknet. Der Feststoff wurde in einen 100 ml Rundkolben übergeführt, mit 36 ml Pyridin, 4 ml Essigsäureanhydrid und 0,4 ml N-Methylimidazol behandelt und die resultierende Suspension über Nacht geschüttelt.
Das Gemisch wurde dann saugfiltriert und der Feststoff mit Methanol (10 ml × 3) gewaschen. Der Feststoff wurde weiterhin mit Methylenchlorid (10 ml × 3), gefolgt durch wasserfreien Ether (10 ml × 3) gewaschen. Der Feststoff wurde luftgetrocknet und dann schließlich über Nacht unter Hochvakuum getrocknet. Die Beladung des Biotin-derivatisierten CPG wurde als 31,3 μmol/Gramm unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt.
(f) Synthese der Reagenzverbindung 6, worin R¹ Dimethoxytriphenyl (DMT) ist, X O ist, R² Cyclohexan-NH-CO(CH₂)₅NHCO- Biotin ist und R³ Phosphoramidit ist.
[VERBINDUNG 6]
Das Syntheseprotokoll für Verbindung 6 ist unten angegeben und in 5 aufgeführt:
Schritt I: Synthese von BzO-CX-Biotin-LC
Zu 32,0 g NH₂-CX-Zwischenprodukt (hergestellt wie in Beispiel 1 a diskutiert), gelöst in 500 ml wasserfreiem Methylenchlorid, wird tropfenweise eine Lösung von 39,5 g LC Biotin-NHSu (hergestellt durch die Reaktion von 6-Aminocapronsäure mit dem NHSu-Ester von Biotin) in 500 ml wasserfreiem DMF, zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 min gerührt und dann mit 12,1 ml Triethylamin behandelt. Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur zeigte TLC-Analyse (CH₂Cl₂/Methanol, 9 : 1), dass die Reaktion bis zur Vollständigkeit abgelaufen war. Methylenchlorid wurde durch Rotationsverdampfen entfernt, die resultierende Lösung mit Methanol (20 ml), gefolgt durch 10%-iges wässriges Na₂CO₃ (20 ml), behandelt und das Gemisch für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch in 2,0 l Ethylacetat gegossen und der organische Extrakt mit Salzlösung (500 ml × 2) gewaschen. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wurden die Lösungsmittel im Vakuum verdampft, um 64 g Rohprodukt zu ergeben. Blitzchromatographiereinigung dieses Rohprodukts (Silikagel, CH₂Cl₂/MeOH, Gradientenelution 5 bis 8% MeOH) erbrachte 30 g reines Produkt.
Schritt II: Synthese von DMT-CX-Biotin-LC
Zu einer gerührten Lösung von 29,8 g BzO-CX-Biotin-LC in 300 ml DMF wurden 34,5 ml 25% Natriummethoxid in Methanol gegeben und das resultierende Gemisch bei 0 bis 5°C für 1 Stunde gerührt. Der pH-Wert der Lösung wurde dann auf 7,0 durch die Zugabe von 100 g Dowex 50X8-100 Harz zu dem Reaktionsgemisch, gefolgt durch Rühren für 15 min, eingestellt. Das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft, um DMF zu entfernen. Der resultierende Rückstand wurde in 60 ml Methylenchlorid gelöst und das Produkt durch die Zugabe von 200 ml Hexan präzipitiert. Das Produkt wurde dann unter Hochvakuum getrocknet.
Das auf diese Art erhaltene Rohprodukt wurde zweimal mit Pyridin azeotrop destilliert und dann in 500 ml Pyridin gelöst. Zu diesem wurden 14,0 g DMT-Cl gegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur unter Argon für 1,5 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 5 ml Methanol gequencht und für 30 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 1,5 l Methylenchlorid aufgenommen, der organische Extrakt mit 5%-iger NaHCO-₃ Lösung (500 ml × 2) gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Verdampfung der Lösungsmittel im Vakuum erbrachte 26,0 g Rohprodukt, welches durch Säulenchromatographie über Silikagel, unter Elution mit Methylenchlorid/Methanol (100 : 8 V/V) gereinigt wurde, um 12,0 g zu ergeben.
Schritt III. Synthese von ^tBuBz-DMT-CX-Biotin-LX
Zu einer gerührten Lösung von 12,0 g DMT-CX-Biotin in 300 ml wasserfreiem Pyridin wurden 13,0 ml TMSCl gegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Argon gerührt. Dies wurde gefolgt durch die Zugabe von 4,4 ml 4-tert-Butylbenzoylchlorid zu dem Reaktionsgemisch und man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur für 3 Stunden fortschreiten. Das Reaktionsgemisch wurde durch die Zugabe von 80 ml Wasser, gefolgt durch Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur, aufgearbeitet. Das Reaktionsgemisch wurde eingedampft, um das meiste des Pyridins zu entfernen und der resultierende Rückstand wurde in 1,0 l Methylenchlorid gelöst. Der organische Extrakt wurde mit 5%-iger NaHCO₃-Lösung (300 ml × 2) gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Entfernung von Lösungsmitteln durch Rotationsverdampfen ergab 18,3 g Rohprodukt.
Blitzchromatographiereinigung dieses Rohprodukts (Silikagel, EtOAc/CH₂Cl₂/MeOH, Gradientenelution mit Lösungen, enthaltend 5 bis 10 Teile MeOH in EtOAc/CH₂Cl₂, 50 : 50 Teile, V/V/V) ergab 8,3 g reines Produkt.
Schritt IV: Synthese von LC-Biotin-CX-CED-Phosphoramidit
Das in Schritt III oben erhaltene Zwischenprodukt wurde in das entsprechende Phosphoramidit unter Verwendung von Standardverfahren übergeführt. So wurden 8,2 g ^tBuBz-DMT-CX-Biotin-LC in 100 ml Methylenchlorid gelöst und die resultierende Lösung mit 4,0 ml 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit und 600 mg DIPA-Tetrazolsalz gelöst. Nach 15 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml Methanol gequencht. Das Reaktionsgemisch wurde in 1,0 l Methylenchlorid gegossen, die organische Schicht mit 5%-iger Natriumbicarbonatlösung (2 × 300 ml) gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Entfernung von Lösungsmitteln durch Rotationsverdampfen ergab 10,5 g Rohprodukt, welches durch Säulenchromatographie über Silikagel gereinigt wurde und wobei mit CH₂Cl₂/Methanol/TEA (100 : 1 : 1, V/V/V) eluiert wurde, um 5,0 g reine Verbindung 6 zu ergeben.
Beispiel 2
Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung können in Oligomere eingebaut werden, umfassend Nukleotid- und Nicht-Nukleotideinheiten, durch Substituieren der vorliegenden Nicht-Nukleotidreagenzien an Stellen ausgewählter Nukleotideinheiten in Standardnukleotidsyntheseprotokollen, wie etwa automatisierten DNA/RNA-Syntheseprotokollen.
(a) Verwendung von Biotin-CX durch direktes Binden an Polystyrolplatten:
Synthetische Oligomere, enthaltend eine oder mehrere Biotingruppen als Teil der Sequenz, wurden mit einer 5'-Phosphatgruppe markiert. Diese 5'-Phosphatgruppe wird dann verwendet, um kovalent das Oligomer auf Polystyrolmikrotiterplatten zu binden.
Die nichtgebundenen Sonden werden abgewaschen und die gebundenen Sonden werden durch die Reaktion von Biotin mit Streptavidin, konjugiert an alkalische Phosphatase, nachgewiesen. Die alkalische Phosphatase katalysiert die Hydrolyse eines chromogenen Substrats.
So wurden 30mere synthetisiert, welche eine 5'-Phosphat-Gruppe und Biotingruppenmarkierungen an den Positionen 13, 19 und 25 (5' → 3') enthielten. Zwei verschiedene Oligomere wurden synthetisiert: eines mit Biotin-CX-Phosphoramidit, hergestellt gemäß Beispiel 1, und das zweite Oligomer mit Biotin-dC (ein kommerziell erhältliches nukleosidisches Biotinphosphoramidit).
Jedes der Oligomere wurde auf eine Konzentration von 10 fmol/μl in destilliertem Wasser verdünnt. Die Oligomere wurden durch Erhitzen bei 95°C für 10 min denaturiert, gefolgt durch Kühlen mit Eis für 10 min. Die geeignete Menge denaturierter Oligomere wurde in die Vertiefungen kalter Covalink NH-Module gegeben, gefolgt durch die Zugabe von EDC-Puffer, enthaltend Melm, und dann erfolgte über Nacht Inkubation bei 50°C. Nichtgebundene Sonden wurden abgewaschen und die gebundenen Oligomere wurden durch Binden von Streptavidin, konjugiert an alkalische Phosphatase, nachgewiesen. pNPP wurde als das Substrat für das Enzym verwendet und die Farbentwicklung wurde bei 405 nm beobachtet. Das obige Experiment wurde unter Verwendung beider Oligomere bei einer Konzentration von 5 fmol/μl wiederholt. Die unter Verwendung der beiden verschiedenen Biotinstrukturen erhaltenen Signalintensitäten wurden verglichen. Bei 5 fmol/μl ergab Biotin-CX 95% der Anzeige (OD 405 nm) von Biotin-dC. Bei 10 fmol/μl ergab Biotin-CX 106% der Anzeige von Biotin-dC.
(b) Verwendung von Biotin-CX in einem Hybridisierungsassay:
Das Oligomer Alu-011 ist ein 56mer mit einem internen Biotinrest in Position 25 (5' → 3'), der aufgebaut wird, um komplementär zum Templat Alu-011A zu sein. Zwei verschiedene Oligomere wurden synthetisiert: eines mit Biotin-CX und das andere mit Biotin-dC. Oligomere wurden im Trityl-ON-Modus synthetisiert und dann über Kartusche gereinigt, unter Verwendung von PolyPak (Glen Research Inc.) Reversphase-Kartuschen. Diese beiden Oligomere wurden in Hybridisierungsassays verwendet, um das Templat Alu-011A nachzuweisen.
Das Templat Alu-011A wurde an CovaLink-Polystyrolmikrotiterplatten unter Verwendung der 5'-Phosphatgruppe, wie oben beschrieben, gebunden. Die Sonden wurden auf 25 fmol/μl in Hybridisierungspufter verdünnt und 100 μl der verdünnten Sonden wurden in die Vertiefungen gegeben und bei 42°C für 5 Stunden bis über Nacht inkubiert. Überschüssige Sonden wurden mit Puffer abgewaschen und die Biotin-markierten Sonden wurden wie oben beschrieben nachgewiesen.
Die erhaltenen Signalintensitäten unter Verwendung der beiden verschiedenen Biotinstrukturen wurden verglichen. Unter identischen Bedingungen erzeugten Biotin-CX-markierte Oligomere ungefähr ein 5-fach stärkeres Signal als Oligomere, die mit Biotin-dC markiert sind.

Claims

Nicht-Nukleotid-Reagenz, welches in der Lage ist, ein Oligomer mit Nukleotideinheiten zu bilden, wobei das Reagenz eine Verbindung der Formel: R¹-X-C-CR²-C-R³ umfasst, wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, säureempfindlichen, basenstabilen blockierenden Gruppen und Acyl-Kappen-Gruppen; X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, S, NH und N = N; R² eine Substituentengruppe der Formel X¹-X²-X³ ist, wobei X¹ eine cyclische substituierte oder nicht substituierte C₅-C₇-Gruppe ist, welche das Kohlenstoffatom der Formel enthält; X² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, S, CH₂, NH und N = N; und X³ Wasserstoff ist, oder eine verbindende funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, an eine funktionelle Gruppe zu binden; und R³ eine verbindende Phosphorgruppe der Formel
ist, wobei X⁴ ein Halogen oder eine substituierte Aminogruppe ist, X⁵ eine Alkylgruppe, Alkoxygruppe oder Phenoxygruppe oder ein Cyanderivat davon ist, X⁶ ein Halogen, eine Aminogruppe oder O ist, und X⁷ eine Alkylgruppe, Alkoxygruppe oder Aryloxygruppe ist oder H sein kann, aber nur wenn X⁶ O ist, oder R³ eine entweder direkt oder über eine Zwischengruppe erfolgende Bindung an einen festen Träger ist.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Triphenylmethylverbindungen und Alkoxyderivaten davon.
Reagenz nach Anspruch 2, wobei R¹ Dimethoxytriphenyl ist.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei X O ist.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei X¹ Cyclohexan ist.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei X² NH ist.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei X³ eine verbindende Gruppe der Formel -CO-(CH₂)_n-NH- ist, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 20 ist.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei X³ außerdem eine funktionelle Gruppe umfasst.
Reagenz nach Anspruch 8, wobei die funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Markierungen, Metall-Chelatbildnern und spezifischen Bindungssubstanzen.
Reagenz nach Anspruch 9, wobei die funktionelle Gruppe eine Fluoreszenz-Markierung ist.
Reagenz nach Anspruch 10, wobei die Fluoreszenz-Markierung Fluorescein ist.
Reagenz nach Anspruch 9, wobei die funktionelle Gruppe eine spezifisches Bindungssubstanz ist.
Reagenz nach Anspruch 12, wobei die spezifische Bindungssubstanz Biotin ist.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei R³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphodiestern, Phosphotriestern, Phosphiten, Phosphoramiditen, H-Phosphonaten, Alkyl-phosphonaten und Phosphothioaten.
Reagenz nach Anspruch 1, wobei R³ eine entweder direkt oder über eine Zwischengruppe erfolgende Bindung an einen festen Träger umfasst.
Reagenz nach Anspruch 15, wobei die Zwischengruppe -O-CH(CH₂)₂-CO- umfasst.
Oligomer mit Nukleotid-Einheiten und Nicht-Nukleotid-Einheiten, wobei mindestens eine der Nicht-Nukleotid-Einheiten eine Verbindung der Formel: R¹-X-C-CR²-C-R³ umfasst, wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, säureempfindlichen, basenstabilen blockierenden Gruppen und Acyl-Kappen-Gruppen, oder R¹ eine Bindung an eine benachbarte monomere Einheit ist; X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, S, NH und N = N; R² eine Substituentengruppe der Formel X¹-X²-X³ ist, wobei X¹ eine cyclische, substituierte oder nicht substituierte C₅-C₇-Gruppe ist, welche das Kohlenstoffatom der Formel enthält; X² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, S, CH₂, NH und N = N; und X³ Wasserstoff ist, oder eine verbindende funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, an eine funktionelle Gruppe zu binden; und R³ eine verbindende Phosphorgruppe der Formel
ist, wobei X⁴ ein Halogen oder eine substituierte Aminogruppe ist, X⁵ eine Alkylgruppe, Alkoxygruppe oder Phenoxygruppe oder ein Cyanderivat davon ist, X⁶ ein Halogen, eine Aminogruppe oder O ist, und X⁷ eine Alkylgruppe, Alkoxygruppe oder Aryloxygruppe ist oder H sein kann, aber nur wenn X⁶ O ist, oder R³ eine Bindung an eine benachbarte monomere Einheit oder, direkt oder über eine Zwischengruppe, an einen festen Träger ist, mit der Maßgabe, dass mindestens eine der Gruppen R¹ und R³ eine Bindung ist.
Verfahren zur Herstellung eines Oligomers mit Nukleotid-Einheiten und Nicht-Nukleotid-Einheiten, umfassend Koppeln mindestens einer Nicht-Nukleotid-Einheit, umfassend eine Verbindung der Formel: R¹-X-C-CR²-C-R³ wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, säureempfindlichen, basenstabilen blockierenden Gruppen und Acyl-Kappen-Gruppen, oder R¹ eine Bindung an eine benachbarte monomere Einheit ist; X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, S, NH und N = N; R² eine Substituentengruppe der Formel X¹-X²-X³ ist, wobei X¹ eine cyclische, substituierte oder nicht substituierte C₅-C₇-Gruppe ist, welche das Kohlenstoffatom der Formel enthält; X² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, S, CH₂, NH und N = N; und X³ Wasserstoff ist, oder eine verbindende funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, an eine funktionelle Gruppe zu binden; und R³ eine verbindende Phosphorgruppe der Formel
ist, wobei X⁴ ein Halogen oder eine substituierte Aminogruppe ist, X⁵ eine Alkylgruppe, Alkoxygruppe oder Phenoxygruppe oder ein Cyanderivat davon ist, X⁶ ein Halogen, eine Aminogruppe oder O ist, und X⁷ eine Alkylgruppe, Alkoxygruppe oder Aryloxygruppe ist oder H sein kann, aber nur wenn X⁶ O ist, oder R³ eine entweder direkt oder über eine Zwischengruppe erfolgende Bindung an eine benachbarte monomere Einheit oder an einen festen Träger ist, an mindestens eine monomere Nukleotid-Einheit über eine Bindung entweder an R¹ oder an R³.
Kit für die Herstellung eines Oligomers mit Nukleotid-Einheiten und Nicht-Nukleotid-Einheiten, umfassend einen Behälter, der zur Aufnahme eines oder mehrerer individueller Reagenzbehälter geeignet ist; und einen ersten Behälter, der ein Reagenz der Formel: R¹-X-C-CR²-C-R³ enthält, wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, säureempfindlichen, basenstabilen blockierenden Gruppen und Acyl-Kappen-Gruppen; X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, S, NH und N = N; R² eine Substituentengruppe der Formel X¹-X²-X³ ist, wobei X¹ eine cyclische, substituierte oder nicht substituierte C₅-C₇-Gruppe ist, welche das Kohlenstoffatom der Formel enthält; X² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, S, CH₂, NH und N = N; und X³ Wasserstoff ist, oder eine verbindende funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, an eine funktionelle Gruppe zu binden; und R³ eine verbindende Phosphorgruppe der Formel
ist, wobei X⁴ ein Halogen oder eine substituierte Aminogruppe ist, X⁵ eine Alkylgruppe, Alkoxygruppe oder Phenoxygruppe oder ein Cyanderivat davon ist, X⁶ ein Halogen, eine Aminogruppe oder O ist, und X⁷ eine Alkylgruppe, Alkoxygruppe oder Aryloxygruppe ist oder H sein kann, aber nur wenn X⁶ O ist, oder R³ eine entweder direkt oder über eine Zwischengruppe erfolgende Bindung an einen festen Träger ist.
Kit nach Anspruch 19, weiterhin umfassend einen zweiten Behälter, enthaltend (1) ein bei der Synthese von Oligomeren verwendetes Reagenz, oder (2) ein zum Nachweis einer mit dem Reagenz assoziierten funktionellen Gruppe verwendetes Reagenz.
Chemisches Zwischenprodukt für die Synthese eines Nicht-Nukleotid-Reagenzes, welches in der Lage ist, mit Nukleotid-Einheiten ein Oligomer zu bilden, wobei das Zwischenprodukt eine Verbindung der Formel: R¹-X-C-CR²-C-R³ umfasst, wobei R¹ Wasserstoff ist; X Sauerstoff ist; R² eine Substituentengruppe der Formel X¹-X²-X³ ist, wobei X¹ Cyclohexan ist, X² NH ist, und X³ N ist; und R³ OH ist.