DE69725881T2

DE69725881T2 - Verfahren zur expression von heterologen proteinen in hefe

Info

Publication number: DE69725881T2
Application number: DE69725881T
Authority: DE
Inventors: Patricia Tekamp-Olson; P. James MERRYWEATHER
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2017-12-13
Also published as: AU5794598A; JP2001518073A; DE69738768D1; JP2001506497A; US20030036511A1; EP0948538A1; PT948538E; US6083723A; ATE426030T1; EP1935901A1; DE69725881D1; US7084262B2; EP1365028B1; US20030077831A1; EP0946736A1; US6083910A; US20020055169A1; ATE253120T1; DE69739319D1; US20050124042A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Produktion rekombinanter Proteine unter Verwendung von Hefe-Wirtszellen als Expressionssystem. Insbesondere bezieht sie sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Expression von heterologen Proteinen und deren Sekretion als biologisch aktive Reifeproteine.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Expressionssysteme mit Hefen als Wirt wurden verwendet, um Hefefremde Proteine zu exprimieren und zu sezenieren. Es wurden zahlreiche Ansätze im Hinblick auf den Grad der Expression und den Ertrag biologisch aktiver reifer Proteine entwickelt.
Solche Ansätze haben Modifikationen der verschiedenen molekularen Komponenten mit einbezogen, die an der Expression und Sekretion von Proteinen bei Hefe beteiligt sind. Diese Komponenten umfassen die regulatorischen Regionen für Translation und Termination bei der Genexpression; Signalpeptid- und Sekretions-Leader-Peptidsequenzen, welche die Vorläuferform des heterologen Proteins durch den sekretorischen Stoffwechselweg der Hefe geleiten; und Bearbeitungsstellen, welche Leader-Peptidsequenzen von der Polypeptidsequenz des interessierenden Proteins abtrennen.
Die Expression des interessierenden Proteins kann durch Verwendung von regulatorischen Regionen, die von der Hefe erkannt werden, verstärkt werden. Eine erhöhte Ausbeute des interessierenden heterologen Proteins wird im Allgemeinen durch Verwendung von Hefe abgeleiteten Signal- und Sekretions-Leader-Peptidsequenzen erreicht. Man glaubt, dass die Verwendung von nativen Signal-Leader-Peptidsequenzen die Leitung des interes sierenden Proteins durch den sekretorischen Stoffwechselweg des Hefe-Wirts verbessert.
Vorangegangene Arbeiten haben gezeigt, dass Volllängen-Hefe-α-Faktor-Signal-Leader-Sequenzen verwendet werden können, um die Expression und Verarbeitung heterologer Proteine in Hefe-Wirtszellen zu steuern. Wesentliche Verbesserungen der Expressionseffizienz können durch Verwendung von verkürzten α-Faktor-Leader-Sequenzen erreicht werden, insbesondere bei heterologen Proteinen, die mittels der Volllängen-Sequenz nur wenig exprimiert werden oder deren Expression auf die Volllängen-Sequenz nicht reagiert.
Obwohl gezeigt wurde, dass die verschiedenen im Stand der Technik verfügbaren Ansätze bei einigen Proteinen funktionieren, bleiben Probleme bei der post-translationalen Verarbeitung bestehen. Oft ist die Menge des sezenierten Proteins unannehmbar niedrig oder ungenaue Verarbeitung führt zu inaktiven Formen des Proteins. Dies trifft insbesondere bei Proteinen zu, die zunächst als Vorläufer-Polypeptidsequenz exprimiert werden und deren Einnahme einer nativen Konfirmation durch Anwesenheit einer nativen Propeptidsequenz im Vorläufer-Polypeptid erleichtert wird.
Verfahren zur Expression heterologer Proteine und deren Sekretion in biologisch aktiver Form unter Verwendung einer Hefe-Wirtszelle als Expressionssystem werden benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Nukleotidsequenzen bereit, die für eine Signalsequenz für ein in Hefe sezeniertes Protein, eine native N-terminale oder C-terminale Propeptidsequenz eines reifen interessierenden Proteins und eine Peptidsequenz für das reife interessierende Protein codieren. Jedes dieser Elemente ist mit einer Bearbeitungsstelle verbunden, die in vivo von ei nem proteolytischen Hefe-Enzym erkannt wird. Irgendeine oder alle dieser Bearbeitungsstellen können bevorzugte Bearbeitungsstellen sein, die modifiziert wurden oder von synthetischer Herkunft sind, für effizienteres Schneiden in vivo. Alle diese Elemente sind wiederum funktionell mit einem Hefe-Promotor und wahlweise anderen regulatorischen Sequenzen verbunden.
Die Nukleotid-codierenden Sequenzen dieser Zusammenstellungen können zusätzlich eine Leader-Peptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfassen. Wenn es vorhanden ist, ist dieses Element, das ebenfalls mit einer Bearbeitungsstelle, die in vivo von einem proteolytischen Hefe-Enzym erkannt wird, verbunden ist, 3' von der Hefe-Signalsequenz und 5' von der Sequenz des reifen interessierenden Proteins positioniert. Daher entfernt das Schneiden durch ein proteolytisches Hefe-Enzym die Hefe-Leader-Sequenz vom Hybrid-Vorläufermolekül, das die Sequenz des reifen interessierenden Proteins umfasst.
Diese Zusammenstellungen sind bei Verfahren zur Expression heterologer Säugerproteine und deren Sekretion in biologisch aktiver reifer Form nützlich. Daher stellt die Erfindung auch Vektoren bereit, die die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen umfassen, und Hefe-Wirtszellen, die stabil mit einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz transformiert sind. Solche Zellen können dann kultiviert werden und auf Sekretion des biologisch aktiven reifen interessierenden Proteins durchgemustert werden.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Expression heterologer Proteine und deren Sekretion in biologisch aktiver reifer Form bereit, das eine Hefe-Wirtszelle als Expressionssystem verwendet, wobei das Verfahren das Transformieren der Hefe-Zelle mit einem Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz umfasst, umfasst.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbesondere bei der Produktion von Säugerproteinen, deren Einnahme einer nativen Konfirmation durch Anwesenheit einer nativen Propeptidsequenz im Vorläuferpolypeptid erleichtert wird, nützlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Karte des Plasmids pAB24.
2 ist eine Karte der rhPDGF-B-Expressionskassette in pAGL7PB und pYAGL7PB.
3 ist eine Karte des rhPDGF-B-Expressionsplasmids pYAGL7PB.
4 ist eine Karte der rhPDGF-B-Expressionskassette in pL7PPB und pYL7PPB.
5 zeigt die letzten Schritte der Konstruktion der rhPDGF-B-Expressionskassette in pL7PPB.
6 ist eine Karte des rhPDGF-B-Expressionsplasmids pYL7PPB.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren für die Expression von interessierenden heterologen Proteinen, insbesondere Heterologen von Säugerproteinen, und für deren Sekretion in einer biologisch aktiven reifen Form, unter Verwendung einer Hefe-Wirtszelle als Expressionssystem bereit. Mit "biologisch aktiver reifer Form" ist ein Protein gemeint, deren Konformationsform ähnlich zu der nativen Konformation ist, so dass seine biologische Aktivität im Wesentlichen dieselbe wie die biologische Aktivität des nativen Proteins ist.
Zusammensetzungen/Zusammenstellungen der vorliegenden Erfindung sind Nukleotidsequenzen, die für Hybrid-Vorläuferpolypeptide codieren, die jeweils die Polypeptidsequenz für ein interessierendes reifes heterologes Protein umfassen. Expressionsvektoren, die diese Nukleotidsequenzen umfassen, alle unter der funktionellen Kontrolle einer Hefe-Promotorregion, und einer Hefe-Terminatorregion, werden ebenfalls bereitgestellt. Erfindungsgemäße Verfahren umfassen das stabile Transformieren einer Hefe- Wirtszelle mit den Vektoren, wobei Expression der Nukleotidsequenz, die für das Hybrid-Vorläuferpolypeptid codiert, zur Sekretion des reifen heterologen interessierenden Proteins in einer biologisch aktiven Form führt.
Mit "interessierendem heterologen Protein" ist ein Protein gemeint, das nicht in der Natur von der Hefe-Wirtszelle exprimiert wird. Bevorzugt ist das heterologe Protein ein Säugerprotein, was im Wesentlichen homologe und funktionell äquivalente Varianten davon mit umfasst. Mit "Variante" ist ein Polypeptid gemeint, das von dem nativen Polypeptid durch Deletion (sogenannte Verkürzung) oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure(n) am N-terminalen und/oder C-terminalen Ende des nativen Proteins; Deletion oder Addition von einer oder mehrerer Aminosäure(n) an einer oder mehreren Stelle(n) im nativen Polypeptid; oder durch Substitution von einer oder mehrerer Aminosäure(n) an einer oder mehreren Stelle(n) im nativen Polypeptid abgeleitet ist. Solche Varianten können zum Beispiel aus genetischen Polymorphismen oder aus menschlicher Manipulation hervorgehen. Verfahren für solche Manipulationen sind im Stand der Technik allgemein bekannt.
Zum Beispiel können Aminosäuresequenz-Varianten des Polypeptids durch Mutationen in der klonierten DNA-Sequenz, die für das native interessierende Polypeptid codiert, hergestellt werden. Verfahren zur Mutagenese und zum Abändern von einer Nukleotidsequenz sind im Stand der Technik wohl bekannt. Siehe zum Beispiel Walker und Gaastra, Hrsg. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488–492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol., 154: 367–382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); US-Patent Nr. 4 873 192; und die darin zitierten Referenzen. Eine Anleitung bezüglich geeigneter Aminosäuresubstitutionen, die nicht die biologische Aktivität des interessierenden Proteins beeinflussen, können im Modell von Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) gefunden werden, auf die hier expressis verbis Bezug genommen wird. Konservative Substitutionen, wie beispielsweise der Austausch einer Aminosäure durch eine andere, die ähnliche Eigenschaften hat, können bevorzugt sein. Beispiel konservativer Substitutionen umfassen Gly <=> Ala, Val <=> Ile <=> Leu, Asp <=> Glu, Lys <=> Arg, Asn <=> Gln, und Phe <=> Trp <=> Tyr, sind aber nicht darauf beschränkt.
Bei Konstruieren von Varianten des interessierenden Proteins werden die Modifikationen so vorgenommen, dass die Varianten weiterhin die gewünschte Aktivität besitzen. Ganz offensichtlich sollten jegliche Mutationen, die in der DNA vorgenommen werden, die für das Variantenprotein codiert, die Sequenz nicht aus dem Leserahmen bringen und bevorzugt keine komplementären Regionen bilden, die eine sekundäre mRNA-Struktur hervorbringen könnten. Siehe EP-Patentanmeldung Nr. 75 444.
Daher umfassen erfindungsgemäße Proteine die natürlich vorkommenden Formen sowie deren Varianten. Diese Varianten werden im Wesentlichen homolog und funktionell äquivalent zum nativen Protein sein. Eine Variante eines nativen Proteins ist "im Wesentlichen homolog" zum nativen Protein, wenn mindestens etwa 80%, bevorzugt mindestens etwa 90%, und insbesondere mindestens etwa 95% seiner Aminosäuresequenz identisch mit der Aminosäuresequenz des nativen Proteins sind. Eine Variante kann in nur 1, 2, 3 oder 4 Aminosäuren abweichen. Mit "funktionell äquivalent" ist gemeint, dass die Sequenz der Variante eine Kette definiert, die ein Protein hervorbringt, das im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie das interessierende native Protein besitzt. Solche funktionell äquivalenten Varianten, die wesentliche Sequenzvariationen umfassen, sind ebenfalls von der Erfindung umfasst. Daher besitzt eine funktionell äquivalente Variante des nativen Proteins genügend biologische Aktivität, um therapeutisch nützlich zu sein. Mit "therapeutisch nützlich" ist effek tiv zum Erreichen eines therapeutischen Ziels gemeint, wie zum Beispiel Heilen einer Wunde.
Verfahren zum Bestimmen funktioneller Äquivalenz sind im Stand der Technik verfügbar. Biologische Aktivität kann unter Verwendung von Assays gemessen werden, die spezifisch zur Messung der Aktivität des nativen Proteins gestaltet wurden, einschließlich Assays, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind. Zusätzlich können Antikörper, die gegen das biologisch aktive native Protein gezogen wurden, auf ihre Fähigkeit getestet werden, die funktionell äquivalente Variante zu binden, wobei effektive Bindung auf ein Protein hinweist, das eine Konformation besitzt, die ähnlich zu der des nativen Proteins ist.
Die Nukleotidsequenzen, die für die reifen interessierenden heterologen Proteine codieren, können Sequenzen sein, die von Nicht-Hefe-Organismen kloniert wurden, oder es können synthetisch abgeleitete Sequenzen sein, die für gewöhnlich unter Verwendung von bei Hefe bevorzugten Codons hergestellt wurden. Beispiele für heterologe Proteine, die für die Erfindung geeignet sind, umfassen TGF-alpha und TGF-beta (transforming growth factor), Somatostatin (wie bei SRIF 1), Parathormon, und insbesondere PDGF (platelet-derived growth factor) und IGF (insulin growth factor), von denen alle eine native Prosequenz als Teil des Vorläuferproteins besitzen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Somit sind die erfindungsgemäßen Zusammenstellungen Nukleotidsequenzen, die in 5'-3'-Richtung und funktionell verbunden (a) eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Initiationsregion, (b) eine codierende Sequenz für ein Hybrid-Vorläuferpolypeptid, und (c) eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Terminationsregion umfassen, wobei das Hybrid-Vorläuferpolypeptid umfasst: 5'-SP-(PS)_n–1(LP-PS)_n–2-(NPRO_MHP-PS)_n–3-MHP-(PS-CPRO_MHP)_n–4-3' worin
SP eine Signalpeptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfasst;
PS eine Bearbeitungsstelle umfasst, die in vivo durch ein proteolytisches Hefe-Enzym gespalten wird;
LP eine Leader-Peptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfasst;
NPRO_MHP eine native N-terminale Propeptidsequenz eines interessierenden, reifen, heterologen Proteins umfasst;
MHP eine Peptidsequenz für das interessierende reife, heterologe Säugerprotein umfasst;
CPRO_MHP eine native C-terminale Propeptidsequenz des interessierenden, reifen, heterologen Säugerproteins umfasst; und
n – 1, n – 2, n – 3 und n – 4 unabhängig = 0 oder 1 sind;
wobei die Bearbeitungsstellen eine proteolytische Verarbeitung des Vorläuferpolypeptids in vivo durch eine Hefe-Wirtszelle zu dem reifen Protein ermöglichen, und wobei zumindest n – 3 oder n – 4 = 1 ist.
Wie bei dem interessierenden heterologen Protein kann jedes der anderen im Hybrid-Vorläuferpolypeptid vorhandene Element eine bekannte natürlich vorkommende Polypeptidsequenz sein oder synthetisch abgeleitet sein, einschließlich aller Varianten davon, die die Funktion des Elements, wie sie hierin beschrieben ist, nicht ungünstig beeinflussen. Mit "ungünstig beeinflussen" ist gemeint, dass die Aufnahme der Variantenform des Elements in Bezug auf das Hybrid-Vorläuferpolypeptid, das die native Form des Elements umfasst, zu einem verminderten Ertrag des sezernierten interessierenden, reifen, heterologen Proteins führt.
Bei der Konstruktion der Nukleotidsequenz, die für das Hybrid-Vorläuferpolypeptid codiert, liegt es im Bereich des Fachwissens, Adapter oder Linker zu verwenden, um die Nukleotidfragmente, die die verschiedenen Elemente des Vorläuferpeptids codieren, zu verknüpfen. Siehe zum Beispiel Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York). Daher kann das Hybrid-Vorläuferpolypeptid zusätzliche Elemente umfassen, die 5' oder 3' von irgendeinem der oben aufgelisteten primären Elemente positioniert sind, wobei die Hefe-Leitpeptidsequenz und die damit verbundene von Hefe erkannte Bearbeitungsstelle mit eingeschlossen sind, wenn sie vorhanden sind.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist SP eine Präsequenz, die eine N-terminale Sequenz von dem Vorläuferpolypeptid der reifen Form eines in Hefe sezernierten Proteins ist. Wenn die Nukleotidsequenz, die für das Hybrid-Vorläuferpolypeptid codiert, in einer transformierten Hefe-Wirtszelle exprimiert wird, dient die Signalpeptidsequenz dazu, das Hybrid-Vorläuferpolypeptid, das das interessierende reife, heterologe Protein umfasst, in das endoplasmatische Retikulum (ER) zu leiten. Die Verlagerung in das Lumen des ER stellt den ersten Schritt in den sekretorischen Stoffwechselweg der Hefe-Wirtszelle dar. Obwohl das erfindungsgemäße Signalpeptid heterolog in Bezug auf die Hefe-Zelle sein kann, ist das Signalpeptid bevorzugt ein für diese Zelle natives.
Die erfindungsgemäße Signalpeptidsequenz kann eine bekannte, natürlich vorkommende Signalsequenz sein oder irgendeine Variante davon, wie oben beschrieben, die die Funktion des Signalpeptids nicht ungünstig beeinflusst. Beispiele für Signalpeptide, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfassen die Signalpeptidsequenzen für α-Faktor (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5 602 034; Brake et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642–4646); Invertase (WO 84/01153); PHO5 (DK 3614/83); YAP3 (yeast aspartic protease 3; PCT-Veröffentlichung Nr. 95/02059); und BAR1 (PCT-Veröffentlichung Nr. 87/02670), sind aber nicht darauf beschränkt. Alternativ dazu kann die Signalpeptidsequenz aus genomischen oder cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von Hybridisierungs-Sondentechniken, die im Stand der Technik verfügbar sind (siehe Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York), bestimmt wer den, oder sogar synthetisch abgeleitet sein (siehe zum Beispiel WO 92/11378).
Während des Eintritts in das ER wird das Signalpeptid von dem Vorläuferpolypeptid an der Bearbeitungsstelle abgespalten. Die Bearbeitungsstelle kann jede Peptidsequenz umfassen, die in vivo von einem proteolytischen Hefe-Enzym erkannt wird. Diese Bearbeitungsstelle kann die bei dem Signalpeptid natürlich vorkommende Bearbeitungsstelle sein. Bevorzugt ist die natürlich vorkommende Bearbeitungsstelle modifiziert, oder die Bearbeitungsstelle ist synthetisch abgeleitet, so dass sie eine bevorzugte Bearbeitungsstelle ist. Mit "bevorzugter Bearbeitungsstelle" ist eine Bearbeitungsstelle gemeint, die in vivo von einem proteolytischen Hefe-Enzym effizienter als die natürlich vorkommende Stelle gespalten wird. Beispiele bevorzugter Bearbeitungsstellen umfassen dibasische Peptide, insbesondere jede Kombination der zwei basischen Reste Lys und Arg, das heißt Lys-Lys, Lys-Arg, Arg-Lys oder Arg-Arg, insbesondere Lys-Arg, sie sind aber nicht darauf beschränkt. Diese Stellen werden von der Endopeptidase, die vom KEX2-Gen von Saccharomyces cerevisiae codiert wird (siehe Fuller et al., Microbiology, 1986: 273–278), oder der äquivalenten Protease von anderen Hefe-Arten (siehe Julius et al., (1983), Cell 32: 839–852) gespalten. Im Fall, dass die KEX2-Endopeptidase eine Stelle innerhalb der Peptidsequenz des interessierenden reifen, heterologen Proteins spaltet, können andere bevorzugte Bearbeitungsstellen verwendet werden, so dass die interessierende Peptidsequenz unberührt bleibt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York).
Eine funktionelle Signalpeptidsequenz ist essentiell, um extrazelluläre Sekretion eines heterologen Proteins aus einer Hefe-Zelle zu bewirken. Zusätzlich kann das Hybrid-Vorläuferpolypeptid eine Sekretions-Leader-Peptidsequenz eines in Hefe sezernierten Proteins umfassen, um diesen Sekretionsprozess weiter zu erleichtern. Wenn sie anwesend ist, wird die Leader- Peptidsequenz im Allgemeinen unmittelbar 3' von der Signalpeptidsequenz-Bearbeitungsstelle positioniert. Mit "Sekretions-Leader-Peptidsequenz" (LP) ist ein Peptid gemeint, das den Transport eines Vorläuferpolypeptids, welches für die Zwecke dieser Erfindung das Hybrid-Vorläuferpolypeptid ist, das das zu sezernierende reife, heterologe Protein umfasst, vom ER zum Golgi-Apparat und von dort zu einem sekretorischen Vesikel zur Sekretion über die Zellmembran in den Zellwandbereich und/oder in das Wachstumsmedium leitet. Die Leader-Peptidsequenz kann im Hinblick auf die Hefe-Wirtszelle nativ oder heterolog sein, ist aber bevorzugt gegenüber der Wirtszelle nativ.
Die Leader-Peptidsequenz der vorliegenden Erfindung kann eine natürlich vorkommende Sequenz bei demselben in Hefe sezernierten Protein sein, das als Quelle für die Signalpeptidsequenz gedient hat, eine natürlich vorkommende Sequenz für ein anderes in Hefe sezerniertes Protein, oder eine synthetische Sequenz (siehe zum Beispiel WO 92/11378 und WO 95/02059), oder jegliche Varianten davon, die die Funktion des Leader-Peptids nicht ungünstig beeinflussen.
Für die Zwecke der Erfindung ist die Leader-Peptidsequenz, wenn sie vorhanden ist, bevorzugt von demselben in Hefe sezernierten Protein abgeleitet, das als Quelle der Signalpeptidsequenz diente, und insbesondere von einem α-Faktor-Protein. Eine Reihe von Genen, die für α-Faktor-Vorläuferproteine codieren, wurden kloniert und ihre kombinierten Signal-Leader-Peptidsequenzen wurden identifiziert. Siehe zum Beispiel Singh et al. (1983), Nucleic Acids Res., 11: 4049–4063; Kurjan et al., US-Patent Nr. 4 546 082; US-Patent Nr. 5 010 182. α-Faktor-Signal-Leader-Peptidsequenzen wurden verwendet, um heterologe Proteine in Hefe zu exprimieren. Siehe zum Beispiel Elliott et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 7080–7084; Bitter et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 5330–5334; Smith et al. (1985), Science, 229: 1219–1229; WO 95/02059; US-Patente Nr. 4 849 407 und 5 219 759.
Alpha-Faktor, ein Oligopeptid-Paarungspheromon von etwa 13 Resten Länge, wird aus einem größeren Vorläuferpolypeptid von 100 bis zu 200 Resten Länge, typischer etwa 120–160 Resten, hergestellt. Dieses Vorläuferpolypeptid umfasst die Signalsequenz, welche aus ungefähr 19–23 (typischer 20–22 Resten), besteht, die Leader-Sequenz, welche aus ungefähr 60 Resten besteht, und typischerweise 2–6 Tandem-Wiederholungen der reifen Pheromonsequenz. Obwohl die Signalpeptidsequenz und Volllängen-α-Faktor-Leader-Peptidsequenz verwendet werden können, wird für diese Erfindung bevorzugt eine verkürzte α-Faktor-Leader-Peptidsequenz mit dem Signalpeptid verwendet, wenn beide Elemente im Hybrid-Vorläufermolekül vorhanden sind.
Mit "verkürzter" α-Faktor-Leader-Peptidsequenz ist ein Teil der α-Faktor-Leader-Peptidsequenz gemeint, der ungefähr 20 bis ungefähr 60 Aminosäuren enthält, bevorzugt ungefähr 25 bis etwa 50 Reste, insbesondere ungefähr 30 bis ungefähr 40 Reste. Verfahren zur Verwendung verkürzter α-Faktor-Leader-Sequenzen, um die Sekretion heterologer Proteine in Hefe zu steuern, sind im Stand der Technik bekannt. Siehe insbesondere US-Patent Nr. 5 602 034. Wenn die Hybrid-Vorläuferpolypeptidsequenz ein verkürztes α-Faktor-Leader-Peptid umfasst, befinden sich die Deletionen beim Volllängen-Leader bevorzugt am C-terminalen Ende und werden so vorgenommen, dass mindestens eine Glykosylierungsstelle (-Asn-Y-Thr/Ser-, wobei Y jeder Aminosäurerest ist) in der verkürzten Peptidsequenz bleibt. Diese Glykosylierungsstelle, deren Modifikation innerhalb des Fachwissens liegt, wird bewahrt, um die Sekretion zu erleichtern (siehe insbesondere WO 89/02463).
Wenn die Hybrid-Vorläuferpolypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung eine Leader-Peptidsequenz umfasst, wie beispielsweise die α-Faktor-Leader-Sequenz, wird es in unmittelbarer Nachbarschaft des 3'-Endes der Leader-Peptidsequenz eine Bearbeitungsstelle geben. Diese Bearbeitungsstelle ermöglicht es einem proteolytischen Enzym, das für die Hefe-Wirtszelle nativ ist, die Hefe-Sekretions-Leader-Peptidsequenz vom 5'-Ende der nativen N-terminalen Propeptidsequenz des interessierenden reifen, heterologen Proteins abzuspalten, wenn vorhanden, oder vom 5'-Ende der Peptidsequenz des interessierenden reifen, heterologen Proteins. Die Bearbeitungsstelle kann jede Peptidsequenz umfassen, die in vivo von einem proteolytischen Hefe-Enzym erkannt wird, so dass das interessierende reife, heterologe Protein korrekt verarbeitet werden kann. Die Peptidsequenz für diese Bearbeitungsstelle kann eine als native Bearbeitungsstelle der Leader-Peptidsequenz natürlich vorkommende Peptidsequenz sein. Bevorzugt wird die natürlich vorkommende Bearbeitungsstelle modifiziert sein, oder die Bearbeitungsstelle wird synthetisch erstellt, so dass sie eine bevorzugte Bearbeitungsstelle ist, wie oben beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung umfasst die Nukleotidsequenz, die für das Hybrid-Vorläuferpolypeptid codiert, eine native Propeptidsequenz (PRO_MHP) für das interessierende reife, heterologe Protein. Mit "nativer Propeptidsequenz" oder "nativer Prosequenz" ist der Teil eines intermediären Vorläuferpolypeptids (der "Proprotein" genannt wird) für ein reifes sezerniertes Protein gemeint, der nach Abspaltung der nativen Signalpeptidsequenz (oder Präsequenz) vom anfänglichen Vorläuferpolypeptid (oder "Präproprotein") am N-terminalen und/oder C-terminalen Ende der reifen Proteinsequenz erhalten bleibt. Die Reste der Propeptidsequenz sind nicht im reifen, sezernierten Protein enthalten. Vielmehr werden solche Extrareste durch proteolytische Enzyme nahe dem Ende des sekretorischen Stoffwechselweges an Bearbeitungsstellen entfernt, und zwar im trans-Golgi-Netzwerk (Griffiths und Simons (1986), Science, 234: 438–443) und in sekretorischen Granula (Orci et al. (1986), J. Cell Biol., 103: 2273–2281).
Die vorliegende Erfindung sorgt für die Anwesenheit von Propeptidsequenzen, die natürlicherweise am N-terminalen und/oder C-terminalen Ende der nativen Proprotein-Vorläuferform des interessierenden reifen, heterologen Proteins vorliegen. Daher kann eine Propeptidsequenz zwischen dem 3'-Ende der Signalpeptidsequenz-Bearbeitungsstelle, oder dem 3'-Ende der von Hefe erkannten Bearbeitungsstelle neben der Leader-Peptidsequenz, wenn sie vorhanden ist, und dem 5'-Ende der Peptidsequenz für das interessierende reife, heterologe Protein, positioniert sein (eine N-terminale Propeptidsequenz, PRO_MHP), oder direkt neben dem 3'-Ende der Peptidsequenz für das interessierende reife, heterologe Protein (eine C-terminale Propeptidsequenz, CPRO_MHP), abhängig von der Orientierung innerhalb des nativen Proproteins. Die Erfindung sorgt außerdem für die Aufnahme von sowohl einer N-terminalen als auch einer C-terminalen Propeptidsequenz, die die Peptidsequenz für das interessierende reife, heterologe Protein flankieren, wenn beide Propeptidsequenzen im nativen Proprotein existieren. Wenn sowohl eine N-terminale als auch eine C-terminale Propeptidsequenz im nativen Proprotein vorliegt, wird die bevorzugte Aufnahme beiden Propeptidsequenzen ins Hybrid-Vorläuferpolypeptid experimentell bestimmt.
Es sind Verfahren im Stand der Technik zur Bestimmung der natürlich vorkommenden Bearbeitungsstellen für die nativen Signalpeptid- und Propeptidsequenzen eines Präproproteins verfügbar (siehe zum Beispiel von Heijne (1983), Eur. J. Biochem., 133: 17–21, (1984) J. Mol. Biol., 173: 243–251, (1986) J. Mol. Biol., 184: 99–105, und (1986) Nucleic Acids Res., 14: 4683–4690), so dass die native N-terminale und/oder C-terminale Propeptidsequenz zur Verwendung in der Erfindung bestimmt werden kann.
Unmittelbar 3' der nativen N-terminalen Propeptidsequenz (wenn diese vorhanden ist) oder unmittelbar 5' der C-terminalen Propeptidsequenz (wenn diese vorhanden ist) liegt eine Bearbeitungsstelle, die in vivo von einem proteolytischen Hefe-Enzym erkannt wird. Diese Bearbeitungsstelle erlaubt die Abspaltung der Propeptidsequenz von der Peptidsequenz für das interessierende reife, heterologe Protein (MHP). Es ist klar, dass diese Bearbeitungsstelle die natürlich vorkommende Bearbeitungsstelle für die Propeptidsequenz sein kann, wenn die natürlich vorkom mende Stelle in vivo von einem proteolytischen Enzym der Hefe-Wirtszelle erkannt wird. Bevorzugt ist die natürlich vorkommende Bearbeitungsstelle modifiziert, oder die Bearbeitungsstelle ist synthetisch abgeleitet, so dass sie eine bevorzugte Bearbeitungsstelle ist. Beispiele von bevorzugten Bearbeitungsstellen umfassen jene, die oben für die andere Verarbeitung diskutiert wurden, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugt werden alle diese Bearbeitungsstellen ähnlich sein, so dass dasselbe proteolytische Hefe-Enzym die Spaltung der Signal- und Leader-Peptidsequenzen und der nativen Propeptidsequenz(en) bewirkt.
Entsprechend der Erfindung, wie oben erwähnt, stellen die Hefe-Signalpeptid- und Sekretions-Leader-Peptidsequenzen sowie die nativen Propeptidsequenzen, jene Teile des Hybrid-Vorläuferpolypeptids der Erfindung dar, die die Sequenz für das interessierende reife, heterologe Protein durch den sekretorischen Stoffwechselweg einer Hefe-Wirtszelle leiten können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Nukleotidsequenz des Hybrid-Vorläuferpolypeptids in 5'- zu 3'-Richtung: 5'-AFSP-tAFLP-PS_L-NPRO_PDGF-PS_NPRO-M_PDGF-3' wobei:
AFSP eine α-Faktor-Signalpeptidsequenz und eine Bearbeitungsstelle umfasst;
tAFLP eine verkürzte α-Faktor-Sekretions-Leader-Peptidsequenz umfasst;
PS_L eine bevorzugte Bearbeitungsstelle für die Leader-Peptidsequenz umfasst;
NPRO_PDGF die Peptidsequenz für ein natives N-terminales Propeptid von einem reifen PDGF ("platelet-derived growth factor") umfasst;
PS_NPRO eine bevorzugte Bearbeitungsstelle für die N-terminale Propeptidsequenz umfasst; und
M_PDGF die Sequenz für reifes PDGF umfasst.
Bevorzugt sind die α-Faktor-Signalpeptid- und die verkürzte α-Faktor-Sekretions-Leader-Peptidsequenzen vom Matα-Gen von S. cerevisiae abgeleitet, wie in den Beispielen dargestellt. Die bevorzugte verkürzte α-Faktor-Leader-Peptidsequenz umfasst den N-terminalen Teil der Volllängen-Leader-Sequenz; das heißt, die Leader-Sequenz beginnt mit dem ersten Aminosäurerest der Volllängensequenz und erstreckt sich auf die Länge von ungefähr 20 bis ungefähr 60 Aminosäureresten, bevorzugt ungefähr 25 bis ungefähr 50 Resten, insbesondere ungefähr 30 bis ungefähr 40 Resten. In einer Ausführungsform wird ein Leader von ungefähr 35 Resten verwendet.
Das reife Protein dieser bevorzugten Ausführungsform ist humaner PDGF ("platelet-derived growth factor"). PDGF, das primäre Mitogen im Serum für Zellen mesenchymaler Herkunft, wird in Blutplättchen-alpha-Granula gespeichert. Verletzung von Blutgefäßen aktiviert die Freisetzung von PDGF aus diesen Granula in der Nähe der verletzten Gefäße. Dieses Mitogen wird als potentes Chemoattraktans für Fibroblasten und glatte Muskelzellen, sowie Monozyten und Neutrophile. Die mitogene Aktivität des lokalisierten PDGF führt zur Proliferation dieser Zellen am Verletzungsort, was zum Wundheilungsprozess beiträgt.
Gereinigter nativer PDGF ("platelet-derived growth factor"), ein Glykoprotein von ungefähr 30000 Dalton, setzt sich aus zwei Disulfid-verknüpften Polypeptidketten zusammen. Zwei Formen dieser Ketten, die als A und B bezeichnet werden, wurden identifiziert. Das native Protein tritt als Homodimer AA oder BB, oder als Heterodimer AB, oder als Gemisch daraus auf. Eine partielle Aminosäuresequenz für die PDGF-A-Kette wurde identifiziert (Johnsson et al. (1984), EMBO J., 3: 921–928) und es wurden cDNAs, die für zwei Formen von PDGF-A-Kettenvorläufer codieren, beschrieben (US-Patent Nr. 5 219 759). Die A-Kette leitet sich von einer proteolytischen Verarbeitung eines 211-Aminosäuren-Vorläuferpolypeptids ab. Die cDNA, die für die PDGF-B-Kette codiert, wur de ebenfalls beschrieben (Nature (1985), 316: 748–750). Die B-Kette leitet sich von einer proteolytischen Verarbeitung eines 241-Aminosäuren-Vorläufers ab.
Das erfindungsgemäße reife PDGF-Protein besitzt die biologisch aktive dimere Form, einschließlich der Homodimere PDGF-AA und PDGF-BB oder des Heterodimers PDGF-AB, und aller im Wesentlichen homologen und funktionell äquivalenten Varianten davon, wie oben beschrieben. Zum Beispiel kann die native Aminosäuresequenz der A-Kette oder der B-Kette entweder am N-terminalen oder am C-terminalen Ende verkürzt sein. Die Entfernung von bis zu 15 bzw. bis zu 10 Aminosäuren vom N-terminalen oder C-terminalen Ende der B-Kette beeinflusst die biologische Aktivität der Variante nicht. Zusätzlich können Aminosäure-Substitutionen vorgenommen werden. Zum Beispiel kann eine Aminosäure wie Serin irgendeinen der Cysteinreste an Positionen 43, 52, 53 und 97 der nativen humanen B-Kette und an entsprechenden Positionen in der nativen A-Kette ersetzen, und zwar unter Erhalt von im Wesentlichen homologen und funktionell äquivalenten Varianten der nativen Kette. Varianten der A-Kette sind auf der Basis von klonierten DNA-Sequenzen bekannt, wie zum Beispiel Varianten, die zusätzliche 6 oder 19 Aminosäuren am C-terminalen Ende besitzen. Siehe zum Beispiel Tong et al. (1987), Nature, 328: 619–621; Betsholtz et al. (1986), Nature, 320: 695–699. Eine PDGF-B-Kettenvariante kann der entsprechende, im Wesentlichen homologe Teil der Aminosäuresequenz sein, der vom v-sis-Gen des Affen-Sarkomvirus codiert wird. Die homologe Region des Produkts dieses Gens, p28^sis beginnt bei Aminosäure 67 und setzt sich bis zu Aminosäure 175 fort, und sie unterscheidet sich von der humanen B-Kette nur in 4 Aminosäureresten (siehe zum Beispiel europäische Patentanmeldung Nr. 0 487 116 A1). Funktionell äquivalente Varianten können mit Assays im Hinblick auf die biologische Aktivität untersucht werden, wie in den Beispielen beschrieben.
Die Nukleotidsequenz, die für das erfindungsgemäße reife PDGF-Protein codiert, kann genomische cDNA oder synthetische DNA sein. Die Gene, die für die nativen Formen von PDGF codieren, wurden sequenziert, und es sind einige Varianten im Stand der Technik bekannt. Die Expression von PDGF-Homodimeren und -Heterodimeren ist zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 4 766 073, 4 769 328, 4 801 542, 4 845 075, 4 849 407, 5 045 633, 5 128 321 und 5 187 263 beschrieben. Basierend auf den bekannten Aminosäuresequenzen für die A- und B-Kettenpolypeptide können synthetische Nukleotidsequenzen, die für PDGF-A-Ketten- und -B-Ketten-Polypeptide codieren, in vitro unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik verfügbar sind, erzeugt werden. Siehe insbesondere Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York). Wenn das interessierende reife Protein das Heterodimer PDGF-AB ist, können die Nukleotidsequenzen, die für die Hybrid-Vorläuferpolypeptide codieren, die die A- und B-Ketten-Polypeptide umfassen, als Teil einer Expressionskassette zusammengesetzt werden, oder in getrennten Expressionskassetten zusammengesetzt werden, zur Co-Transformation einer Hefe-Wirtszelle.
In dieser bevorzugten Ausführungsform, die reifes PDGF umfasst, enden das C-terminale Ende der verkürzten α-Faktor-Sekretions-Leader-Peptidsequenz und das der nativen N-terminalen Propeptidsequenz in einer bevorzugten Bearbeitungsstelle, bevorzugt einer dibasischen Bearbeitungsstelle, die spezifisch für die KEX2-Endopeptidase von S. cerevisiae ist. Die Dipeptide können jede der Kombinationen der basischen Reste Lys und Arg sein, insbesondere ein Lys-Arg-Dipeptid.
Das native Präpro-PDGF-B umfasst zusätzlich ein 51-Aminosäuren C-terminales Propeptid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nukleotidsequenz, die für das Hybrid-Vorläuferpolypeptid codiert, in 5'-3'-Richtung die folgende modifizierte Sequenz: 5'-AFSP-tAFLP-PS_L-NPRO_PDGF-PS_NPRO-M_PDGF-PS_CPRO-CPRO_PDGF-3' worin
CPRO_PDGF eine C-terminale Propeptidsequenz für das interessierende reife, heterologe PDGF-Protein umfasst; und
PS_CPRO eine bevorzugte Bearbeitungsstelle für die C-terminale Propeptidsequenz umfasst.
Vorzugsweise ist die bevorzugte Bearbeitungsstelle für die C-terminale Propeptidsequenz ähnlich zu der der Leader-Peptidsequenz und der N-terminalen Propeptidsequenz, so dass dasselbe proteolytische Hefe-Enzym die Abspaltung der α-Faktor-Leader-Peptidsequenz und der Sequenzen beider nativer Propeptide bewirkt. Die Aufnahme dieser zwei zusätzlichen Komponenten wird experimentell bestimmt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Hybrid-Vorläuferpolypeptid in 5'-3'-Richtung: 5'-AFSP-AFLP-PS_L-M_IGF-PS_CPRO-CPRO_IGF-3' worin:
AFSP eine α-Faktor-Signalpeptidsequenz und eine Bearbeitungsstelle umfasst;
AFLP eine α-Faktor-Sekretions-Leader-Peptidsequenz umfasst;
PS_L eine bevorzugte Bearbeitungsstelle für die Leader-Peptidsequenz umfasst;
M_IGF die Peptidsequenz für einen reifen Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor (IGF) umfasst;
PS_CPRO eine bevorzugte Bearbeitungsstelle für die C-terminale Propeptidsequenz umfasst;
und CPRO_IGF die Peptidsequenz für ein natives C-terminales Propeptid des reifen IGF umfasst.
Bevorzugt sind die α-Faktor-Signalpeptid- und α-Faktor-Sekretions-Leader-Peptidsequenzen vom Matα-Gen von S. cerevisiae abgeleitet, wie für die bevorzugte Ausführungsform für PDGF ausgeführt.
Das reife Protein dieser bevorzugten Ausführungsform ist IGF ("insulin-like growth factor"), insbesondere IGF-I. IGF-I gehört einer Familie von Polypeptiden an, die als Somatomedine bekannt sind. IGF-I stimuliert Wachstum und Teilung einer Vielzahl von Zelltypen, insbesondere während der Entwicklung. Siehe zum Beispiel die europäischen Patentanmeldungen Nr. 560 723 A und 436 469 B. Daher werden Prozesse wie skeletales Wachstum und Zellreplikation von IGF-I-Spiegeln beeinflusst.
IGF-I ist strukturell und funktional dem Insulin ähnlich, unterscheidet sich aber antigenisch davon. In dieser Hinsicht ist IGF-I ein einzelkettiges Polypeptid mit drei Disulfidbrücken innerhalb der Kette und vier Domänen, die als A-, B-, C- bzw. D-Domänen bekannt sind. Die A- und B-Domänen sind über die C-Domäne verbunden und sind zu den entsprechenden Domänen von Proinsulin homolog. Die D-Domäne, eine C-terminale Prosequenz, ist in IGF-I vorhanden, aber nicht in Proinsulin. IGF-I besitzt 70 Aminosäurereste und hat eine molekulare Masse von ungefähr 7,5 kDa. Siehe Rinderknecht (1978), J. Biol. Chem., 253: 2769 und FEBS Lett., 89: 283. Für einen Übersichtsartikel zu IGF siehe Humbel (1990) Eur. J. Biochem., 190: 445–462.
Das erfindungsgemäße reife IGF-Protein ist die biologisch aktive Form und jede im Wesentlichen homologe und funktionell äquivalente Variante davon, wie oben definiert. Funktionell äquivalente Varianten können mit Assays für die biologische Aktivität bestimmt werden, einschließlich des Assays, der in den Beispielen beschrieben ist. Beispielhafte Assays umfassen bekannte Radiorezeptor-Assays unter Verwendung von plazentalen Membranen (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5 324 639; Hall et al. (1974), J. Clin. Endocrinol. and Metab., 39: 973–976 und Marshall et al. (1974), J. Clin. Endocrinol. and Metab., 39: 283–292), einen Bioassay, der die Fähigkeit des Moleküls misst, den Einbau von Tritium-markiertem Thymidin auf dosisabhängige Weise in die DNA von BALB/c 3T3-Fibroblasten zu erhöhen (siehe zum Beispiel Tamura et al. (1989), J. Biol. Chem. 262: 5616–5621) und ähnliche, auf die hier expressis verbis Bezug genommen wird.
Der Stand der Technik bietet eine wesentliche Richtschnur bezüglich der Herstellung und Verwendung von IGF-I-Varianten. Zum Beispiel umfasst ein Fragment von IGF-I im Allgemeinen mindestens ungefähr 10 aufeinanderfolgende Aminosäurereste des Volllängenmoleküls, bevorzugt ungefähr 15–25 aufeinanderfolgende Aminosäurereste des Volllängenmoleküls, und insbesondere ungefähr 20–50 oder mehr aufeinanderfolgende Aminosäurereste des Volllängen-IGF-I. Der Begriff "IGF-I-Analogon" erfasst auch Peptide, die ein oder mehrere Peptidmimiks ("Peptoide") aufweisen, wie beispielsweise jene, die in der internationalen Veröffentlichung WO 91/04282 beschrieben sind. Mehrere IGF-I-Analoga und Fragmente sind im Stand der Technik bekannt und umfassen jene, die zum Beispiel in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986), 83: 4904–4907; Biochem. Biophys. Res. Commun. (1987), 149: 398–404; J. Biol. Chem. (1988), 263: 6233–6239; Biochem. Biophys. Res. Commun. (1989), 165: 766–771; Forsberg et al. (1990), Biochem. J., 271: 357–363; US-Patenten Nr. 4 876 242 und 5 077 276; internationalen Veröffentlichungen WO 87/01038 und WO 89/05822 beschrieben sind.
Beispielhafte Analoga umfassen eines mit einer Deletion des Glu-3 des reifen Moleküls, Analoga, bei denen bis zu fünf Aminosäuren des N-Terminus abgeschnitten sind, ein Analogon mit einer Verkürzung um die ersten drei N-terminalen Aminosäuren und ein Analogon, das die ersten 17 Aminosäuren der B-Kette von humanem Insulin anstelle der ersten 16 Aminosäuren von humanem IGF-I umfasst.
Die Nukleotidsequenz, die für das erfindungsgemäße reife IGF-Protein codiert, kann genomisch, cDNA, oder synthetische DNA sein. Die Gene, die für die nativen Formen von IGF codieren, wurden sequenziert, und mehrere Varianten sind im Stand der Technik wohl bekannt. IGF-I und dessen Varianten können über eine Vielzahl von Wegen hergestellt werden, die im Stand der Tech nik wohl bekannt sind. Zum Beispiel können die IGF-I-Polypeptide direkt aus Blut, zum Beispiel aus Serum oder Plasma, mittels bekannter Methoden isoliert werden. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4 769 361; Svoboda et al. (1980), Biochemistry, 19: 790–797; Cornell und Boughdady (1982), Prep. Biochem., 12: 57 und (1984) Prep. Biochem., 14: 123. Alternativ dazu kann IGF-I chemisch synthetisiert werden, und zwar mittels jeder von mehreren Techniken, die dem Fachmann bekannt sind. Siehe zum Beispiel Stewart und Young (1984), Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois) und Barany und Merrifield (1980), The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology (Hrsg. Gross und Meienhofer), S. 3-254, Bd. 2 (Academic Press, New York) für Festphasenpeptid-Synthesetechniken; und Bodansky (1984), Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Berlin) und Gross und Meienhofer, Hrsg. (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 1, für klassische Lösungssynthese. Die erfindungsgemäßen IGF-I-Polypeptide können auch mittels des Verfahrens der simultanen multiplen Peptidsynthese chemisch hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Houghten (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5131–5135; US-Patent Nr. 4 631 211.
In dieser bevorzugten Ausführungsform, die reifes IGF-I umfasst, endet das C-terminale Ende der verkürzten α-Faktor-Sekretions-Leader-Peptidsequenz und das N-terminale Ende der nativen C-terminalen Propeptidsequenz auf eine bevorzugte Verarbeitungsstelle, bevorzugt eine dibasische Verarbeitungsstelle, die bezüglich der KEX2-Endopeptidase von S. cerevisiae spezifisch ist. Die Dipeptide können jede Kombination der basischen Reste Lys und Arg sein, insbesondere ein Lys-Arg-Dipeptid.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen sind zur Herstellung von interessierenden biologisch aktiven, reifen, heterologen Proteinen in einer Hefe-Wirtszelle nützlich, wenn sie funktionell mit einem Hefe-Promotor verknüpft sind. Auf diese Weise werden die Nukleotidsequenzen, die für die erfindungsgemäßen Hybrid-Vorläuferpolypeptide codieren, in Expressionskassetten zur Einführung in eine Hefe-Wirtszelle bereitgestellt. Diese Expressionskassetten umfassen eine transkriptionelle Initiationsregion, die mit der Nukleotidsequenz, die für das Hybrid-Vorläuferpolypeptid codiert, verknüpft ist. Solch eine Expressionskassette wird mit einer Vielfalt von Restriktionsstellen zur Insertion der Nukleotidsequenz, die unter der transkriptionellen Regulation der regulatorischen Regionen stehen soll, bereitgestellt. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Marker-Gene enthalten.
Solch eine Expressionskassette umfasst in 5'-3'-Richtung und funktionell miteinander verknüpft eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Initiationsregion, eine codierende Nukleotidsequenz für das Hybrid-Vorläuferpolypeptid, die die Sequenz des interessierenden reifen Proteins umfasst, und eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Terminationsregion. Mit "funktionell verknüpft" ist gemeint, dass die Expression der codierenden Sequenz für das Hybrid-Vorläuferpolypeptid unter der regulatorischen Kontrolle der von Hefe erkannten Transkriptions- und Translations-Initiations- und -Terminationsregionen steht.
Mit "von Hefe erkannten Transkriptions- und Translations-Initiations- und -Terminationsregionen " sind regulatorische Regionen gemeint, die eine codierende Sequenz, in diesem Fall die Nukleotidsequenz, die für die Hybrid-Polypeptidsequenz codiert, flankieren und die Transkription und Translation der codierenden Sequenz in einer Hefe kontrollieren. Diese regulatorischen Regionen müssen im Hefe-Wirt funktionell sein. Die Transkriptions-Initiationsregion, der Hefe-Promotor, stellt eine Bindestelle für RNR-Polymerase bereit, um die Translation der codierenden Sequenz stromabwärts gerichtet (3') zu initiieren. Der Promotor kann ein konstitutiver oder induzierbarer Promotor sein und er kann nativ, analog, fremd oder heterolog in Bezug auf den spezifischen Hefe-Wirt sein. Zusätzlich kann der Promotor die natürliche Sequenz oder alternativ dazu eine synthetische Sequenz sein. Mit "fremd" ist gemeint, dass die Transkriptions-Initiationsregion bei der interessierenden nativen Hefe, in die die Transkriptions-Initiationsregion eingeführt wird, nicht zu finden ist.
Geeignete native Hefe-Promotoren umfassen den Wild-Typ-α-Faktor-Promotor, sowie andere Hefe-Promotoren, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugt wird der Promotor aus der Liste ausgewählt, die Promotoren für die glykolytische Enzyme Phosphoglucoisomerase, Phosphofructokinase, Phosphotrioseisomerase, Phosphoglucomutase, Enolase, Pyruvatkinase (PyK), Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GRP oder GAPDH), Alkoholdehydrogenase (ADH) (EPO-Veröffentlichung Nr. 284 044) umfasst. Siehe zum Beispiel EPO-Veröffentlichungen Nr. 120 551 und 164 556.
Synthetische Hybridpromotoren setzen sich aus der stromaufwärts gelegenen Aktivatorsequenz eines Hefe-Promotors, welche eine induzierbare Expression ermöglicht, und der Transkriptions-Aktivierungsregion eines anderen Hefe-Promotors zusammen und dienen auch als funktionelle Promotoren in einem Hefe-Wirt. Beispiele von Hybridpromotoren umfassen RDH/GAP, wobei die induzierbare Region des ADH-Promotors mit der Aktivierungsregion des GAP-Promotors kombiniert ist (US-Patente Nr. 4 876 197 und 4 880 734). Andere Hybridpromotoren, die stromabwärts gelegene Aktivatorsequenzen von irgendeinem der ADH2-, GAL4-, GAL10- oder PHO5-Gene in Kombination mit den Transkriptions-Aktivierungsregionen von glykolytischen Enzymen wie GAP oder PyK verwenden, sind im Stand der Technik verfügbar (EPO-Veröffentlichung Nr. 164 556). Bevorzugter ist der Hefe-Promotor der induzierbare ADH/GAP-Hybridpromotor.
Von Hefe erkannte Promotoren umfassen auch natürlich vorkommende Nicht-Hefe-Promotoren, die Hefe-RNA-Polymerase binden und die Translation der codierenden Sequenz initiieren. Solche Promotoren sind im Stand der Technik verfügbar. Siehe zum Beispiel Co hen et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1078; Mercereau-Puigalon et al. (1980), Gene, 11: 163; Panthier et al. (1980), Curr. Genet., 2: 109; Henikoff et al. (1981), Nature, 283: 835; und Hollenberg et al. (1981), Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96: 119.
Die Terminations-Regulationsregion der Expressionskassette kann die native der Transkriptions-Initiationsregion sein, oder von einer anderen Quelle abgeleitet sein, vorausgesetzt, dass sie von dem Hefe-Wirt erkannt wird. Die Terminations-Regionen können jene der nativen α-Faktor-Transkriptions-Terminations-Sequenz sein, oder eine andere von Hefe erkannte Terminationssequenz, wie jene für glykolytische Enzyme, die oben genannt wurden. Bevorzugter ist der Transkriptions-Terminator der Mat-α(α-Faktor)-Transkriptions-Terminator, der in dem US-Patent Nr. 4 870 008 beschrieben ist.
Die Nukleotidsequenzen, die die erfindungsgemäßen Hybrid-Vorläuferpolypeptide codieren, werden in Expressionskassetten zur Expression in einem Hefe-Wirt bereitgestellt. Die Kassette umfasst 5'- und 3'-regulatorische Sequenzen, die funktionell mit der Nukleotidsequenz, die für das interessierende Hybrid-Vorläuferpolypeptid codieren, verknüpft sind. Die Kassette kann auch mindestens eine zusätzliche interessierende Nukleotidsequenz umfassen, die in den Hefe-Wirt co-transformiert werden soll. Alternativ dazu können die zusätzlichen Nukleotidsequenzen in einer anderen Expressionskassette bereitgestellt werden. Wo es angebracht ist, kann die Nukleotidsequenz, die für die interessierenden Hybrid-Vorläuferpolypeptid- und alle zusätzlichen Nukleotidsequenzen codieren, für eine erhöhte Expression in der transformierten Hefe optimiert werden. Das heißt, diese Nukleotidsequenzen können für eine verbesserte Expression unter Verwendung von bei Hefe bevorzugten Codons synthetisiert werden. Verfahren zum Synthetisieren von bei Hefe bevorzugten interessierenden Nukleotidsequenzen sind im Stand der Technik verfügbar (siehe zum Beispiel US-Patente Nr. 5 219 759 und 5 602 034).
Zusätzliche Sequenzmodifikationen zum Erhöhen der Expression von codierenden Nukleotidsequenzen in einem zellulären Wirt sind bekannt. Diese umfassen die Eliminierung von Sequenzen, die für unechte Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellensignale, Transposon-ähnliche Wiederholungen, codieren, und von anderen wohl-charakterisierten Sequenzen, die für die Genexpression schädlich sein können. Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Durchschnittswerte für einen vorgegebenen zellulären Wirt eingestellt werden, die durch Bezugnahme auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, errechnet werden. Wenn möglich wird die codierende Nukleotidsequenz dahingehend modifiziert, dass vorausgesagte Haarnadel-Sekundär-mRNA-Strukturen vermieden werden.
Beim Herstellen der Expressionskassette können die verschiedenen Nukleotidsequenzfragmente so manipuliert werden, dass sie die Sequenzen in der richtigen Orientierung und geeigneter Weise im richtigen Leserahmen bereitstellen. Dazu können Adapter oder Linker verwendet werden, um die Nukleotidfragmente zu verbinden, oder es können andere Manipulationen involviert sein, um geeignete Restriktionsschnittstellen, das Entfernen überflüssiger Nukleotide, das Entfernen von Restriktionsschnittstellen oder ähnliches zu erreichen. Zu diesem Zweck können in vitro-Mutagenese, Primer-Reparatur, Restriktion, Anlagerung und Resubstitutionen, z. B. Transitionen oder Transversionen, vorgenommen werden. Siehe insbesondere Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York).
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können in ein Replikon ligiert werden (z. B. Plasmid, Cosmid, Virus, Mini-Chromosom), und somit einen Expressionsvektor bilden, der zur autonomen DNA-Replikation in vivo befähigt ist. Bevorzugt ist das Replikon ein Plasmid. Solch ein Plasmid-Expressionsvektor wird in einem oder mehreren Replikationssystem(en), bevorzugt in zwei Replikationssystemen, aufrechterhalten, die die stabile Aufrechterhaltung für Expressionszwecke in einer Hefe-Wirtszelle, und für Klonierungszwecke in einem prokaryotischen Wirt, ermöglichen. Beispiele solcher Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektoren umfassen Yep24 (Botstein et al. (1979), Gene, 8: 17–24; pCl/l (Brake et al. (1984); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4642–4646), und Yrp17 (Stinchcomb et al. (1982), J. Mol. Biol., 158: 157).
Zusätzlich kann ein Plasmid-Expressionsvektor ein Plasmid mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein, wobei die Kopienzahl im Allgemeinen im Bereich von 1 bis ungefähr 200 liegt. Bei Hefe-Vektoren mit hoher Kopienzahl befinden sich im Allgemeinen mindestens 10, bevorzugt mindestens 20, und üblicherweise nicht über 150 Kopien in einem einzelnen Wirt. Abhängig vom ausgewählten heterologen Protein ist entweder ein Vektor mit hoher oder niedriger Kopienzahl wünschenswert, abhängig von der Wirkung des Vektors und des fremden Proteins auf den Wirt. Siehe beispielsweise Brake et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4642–4646. Erfindungsgemäße DNA-Konstrukte können auch mittels eines integrierenden Vektors in das Hefe-Genom integriert werden. Beispiele solcher Vektoren sind im Stand der Technik bekannt. Siehe beispielsweise Botstein et al. (1979), Gene, 8: 17–24.
Der zur Expression des erfindungsgemäßen heterologen Proteins ausgewählte Wirt ist bevorzugt eine Hefe. Mit "Hefe" sind ascosporogene Hefen (Endomycetale), basidiosporogene Hefen und Hefen, die zu den Fungi Imperfecti gehören (Blastomyceten), gemeint. Die ascosporogenen Hefen werden in zwei Familien aufgeteilt, Spermophthoraceen und Sacchromycetaceen. Letztere setzt sich aus vier Subfamilien zusammen, Schizosaccharomycoideae (z. B. Genus Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae und Saccharomycoideae (z. B. Genera Pichia, Kluyveromyces und Saccharomyces). Die basidiosporogenen Hefen umfassen die Gattungen Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium und Filobasidiella. Hefen, die zu den Fungi Imperfecti gehören, werden in zwei Familien aufgeteilt, Sporobolomycetaceae (z. B. Genera Sporobolomyces, Bullera) und Cryptococcaceae (Genus Candida). Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung sind Spezies innerhalb der Gattungen Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces und Candida. Von besonderem Interesse sind die Saccharomyces-Arten S. cereviseae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis und S. oviformis. Spezies von besonderem Interesse in der Gattung Kluyveromyces umfassen K. lactis. Da die Klassifizierung von Hefen sich in der Zukunft verändern mag, sollen für die Zwecke dieser Erfindung Hefen so definiert sein, wie in Skinner et al., Hrsg. 1980, Biology and Activities of Yeast (Soc. App. Bacteriol. Symp. Series Nr. 9) beschrieben. Zusätzlich zum vorstehenden ist der Durchschnittsfachmann wahrscheinlich mit der Hefebiologie und der Manipulation der Hefe-Genetik vertraut. Siehe zum Beispiel Bacila et al., Hrsg. (1978), Biochemistry and Genetics of Yeast; Rose und Harrison, Hrsg. (1987), The Yeasts (2. Ausgabe); Strathern et al., Hrsg. (1981), The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces.
Die Auswahl geeigneter Hefen und anderer Mikroorganismen als Wirte für die Ausführung der vorliegenden Erfindung liegt im Fachwissen des Standes der Technik. Wenn Hefe-Wirte für die Expression ausgewählt werden, umfassen geeignete Wirte jene, von denen gezeigt wurde, dass sie unter anderem gute Sekretionskapazität, niedrige proteolytische Aktivität, und insgesamt Vitalität besitzen. Hefe und andere Mikroorganismen sind allgemein von einer Vielzahl von Quellen zu erhalten, einschließlich des Yeast Genetic Stock Center, Abteilung für Biophysik und medizinische Physik, Universität von Kalifornien, Berkeley, Kalifornien; und der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
Verfahren zum Einbringen exogener DNA in Hefe-Wirte sind im Stand der Technik wohl bekannt. Es gibt eine breite Vielfalt von Wegen, Hefe zu transformieren. Zum Beispiel wird Sphäroblastentransformation von Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1919–1933 und Stinchcomb et al., EPO- Veröffentlichung Nr. 45 573 gelehrt, worauf hierin expressis verbis Bezug genommen wird. Die Transformanden werden in einem geeigneten Nährmedium gezogen und gegebenenfalls unter selektivem Druck gehalten, um das Bewahren der endogenen DNA zu sichern. Wenn die Expression induzierbar ist, kann das Wachstum des Hefe-Wirts bis zum Erhalt einer hohen Zelldichte erlaubt werden, und dann wird die Expression induziert. Das sezernierte, reife heterologe Protein kann mittels jeder konventionellen Methode geerntet werden und mittels Chromatographie, Elektrophorese, Dialyse, Lösungsmittel-Lösungsmittel-Extraktion und ähnlichem gereinigt werden.
Die folgenden Beispiele werden im Wege einer Veranschaulichung und nicht einer Begrenzung gegeben.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele beschreiben die Konstruktion eines Expressionsvektors, der die Nukleotidsequenz, die für reifes humanes PDGF-B entsprechend der offenbarten Erfindung codiert, umfasst. Beispiele, die die Verwendung dieses Expressionsvektors zur Herstellung von biologisch aktivem reifen PDGF-BB in einem Hefe-Wirt zeigen, werden ebenfalls bereitgestellt.
Zusätzliche Beispiele beschreiben einen Expressionsvektor, der die Nukleotidsequenz umfasst, die für reifes humanes IGF-I entsprechend der offenbarten Erfindung codiert, und zeigen die Verwendung dieses Expressionsvektors zur Herstellung von biologisch aktivem reifen IGF-I in einem Hefe-Wirt.
Beispiel I: Plasmidvektor pAB24
Der Vektor, der zur Expression von rhPDGF-BB ausgewählt wurde, pAB24, ist ein Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektor. Das Plasmid ist eine Chimere aus Sequenzen von pBR322, das sich von mehreren natürlich vorkommenden bakteriellen Plasmiden ableitet, und Sequenzen des endogenen S. cerevisiae 2-μ-Plasmids (Broach (1981) in Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (Cold Spring Harbor Press, New York), 1: 445–470). Es codiert außerdem für Gene, die die Selektion sowohl in E. coli als auch in S. cerevisiae-Wirten ermöglichen. Der pBR322-Teil von pAB24 umfasst das Ampicillin-Resistenz (Ap^r) verleihende Gen, das für β-Lactamase codiert, sowie ein Gen, das Tetrazyklin-Resistenz (Tc^r) verleiht. Diese Gene erlauben die Transformation von kompetentem E. coli und die Selektion von Plasmid enthaltenden Bakterien. Eine nur einmal vorkommende BamHI-Klonierungsstelle, die in dem Gen vorhanden ist, das für Tetrazyklin-Resistenz codiert, ist die Schnittstelle, die zur Insertion einer Expressionskassette verwendet wird. Der pBR322-Teil des Vektors umfasst auch einen ColE1-ähnlichen Replikationsursprung, der die Replikation in E. coli ermöglicht. Zwei S. cerevisiae-Gene, die von Yep24 abgeleitet sind (Botstein et al. (1979), Gene, 8: 17–24), URA3 und leu2d, erlauben die Selektion in Hefe-Wirtsstämmen, denen entweder eines oder beide dieser Gene fehlen. Dem letzten Gen, leu2d, fehlt ein Teil der 5'-untranslatierten Promotorregion und erfordert eine hohe Plasmidkopienzahl zum Wachstum in Leucin-Mangelmedium. Dies ist notwendig, um eine ausreichende LEU2-Proteinexpression zur Komplementation von Hefe-Stämmen, denen LEU2 fehlt, zu erreichen (Erhart und Hollenberg (1983), J. Bacteriol., 156: 625–635). Die 2-μ-Sequenzen von pAB24 übertragen die Replikation und die Teilung des Expressions-Plasmids in S. cerevisiae. 1 zeigt eine schematische Karte von Plasmid pAB24 mit Schlüsselrestriktionsschnittstellen und genetischen Elementen. Eine Beschreibung der Konstruktion von pAB24 findet sich in der europäischen Patentveröffentlichung EPO-0 324 274 B1.
Drei Expressions-Plasmide, die das PDGF-B-Gen enthalten, pYAGL7PB, pYL7PPB (auch bekannt als pYAGL7PPB) und PYJST400, wurden verwendet, um PDGF-BB in einem Hefe-Wirt zu produzieren. Alle diese Expressionsvektoren verwenden pAB24 als Plasmid, in das die Expressionskassette, die das PDGF-B-Gen umfasst, insertiert wurde.
Beispiel 2: Konstruktion von Expressions-Plasmid pYRGL7PB
Allgemeine Beschreibung
Das Plasmid pYAGL7PB umfasst eine Expressionskassette mit den folgenden Eigenschaften. Transkription wird durch den induzierbaren Hybrid-Hefe-Promotor ADH/GAP vermittelt. Dieser Promotor umfasst auf den Transkriptionsfaktor ADR2 reaktive Sequenzen vom S. cerevisiae ADH2-Gen (Beier und Young (1982), Nature, 300: 724–728) und Promotorsequenzen vom S. cerevisiae-Gen TDH3, das für das glykolytische Enzym Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAP) codiert. Die auf den Transkriptionsfaktor ADR2 reaktiven Sequenzen vermitteln den stromabwärts gelegenen Sequenzen eine induzierbare Gentranskription. Die Induktion wird durch Glukose-Depletion in Wachstumsmedium erreicht. Die Termination der Transkription wird von Terminator, der von S. cerevisiae Mating-Faktortyp alpha (Matα)-Gen (Brake et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4642–4646) abgeleitet ist, vermittelt.
Die Kassette umfasst außerdem einen offenen Leserahmen, der eine verkürzte Matα-Sequenz, fusioniert an eine Sequenz, die für das humane PDGF-B-Gen codiert, codiert. Der verkürzte α-Faktor-Leader vermittelt die Sekretion von Proteinfusionen im Leserahmen. Er ist ein Derivat des S. cerevisiae α-Faktor-Leaders, dem Produkt des Matα-Gens (Kurjan und Herskowitz (1982), Cell, 30: 933–943). Eine dibasische Aminosäure-Verarbeitungsstelle befindet sich an der α-Faktor-Leader/PDGF-B-Verknüpfung, um die Produktion von korrekt verarbeitetem rhPDGF-BB-Polypeptid mittels Hefe zu erleichtern. 2 zeigt eine Karte der pYAGL7PB-Expressionskassette, die diese Eigenschaften und die Restriktionsenzymschnittstellen, die für die Konstruktion dieser Expressionskassette relevant sind, hervorhebt. Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens, der für das primäre Translationsprodukt des verkürzten α-Faktor-Leader-PDGF-B codiert, sind in SEQ ID NO. 1 bzw. SEQ ID NO. 2 wiedergegeben.
Schrittweise Konstruktion von pYAGL7PB
Es folgt eine Beschreibung der aufeinanderfolgenden Schritte, die vorgenommen wurden, um diesen Expressionsvektor zu konstruieren.
Konstruktion eines synthetischen PDGF-B-Gens und Klonierung in einen Hefe-Expressionsvektor
Das synthetische Gen, das für die partielle dibasische Verarbeitungsstelle und rhPDGF-B (SEQ ID NO. 3–4) codiert, wurde aus 17 überlappenden Oligonukleotiden (SEQ ID NO. 5–21) hergestellt, wie von Urdea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 (1983): 7461–7465) beschrieben. Die Ligation der Fragmente führt zu einem XbaI-SalI-Fragment, welches nachfolgend in einen XbaI-SalI geschnittenen pPAG/αF-Vektor insertiert wurde.
Das Plasmid pPAG/αF ist ein pBR322-Derivat mit einer Expressionskassette, die von BamHI-Schnittstellen skizziert wird. Die Expressionskassette umfasst den ADH/GAP-Hybrid-Promotor, sowie den offenen Leserahmen, der für den Hefe-α-Faktor-Leader (BamHI-XbaI), ein XbaI-SalI-Genfragment, und den Matα (α-Faktor)-Transkriptionsterminator (SalI-BamHI) codiert. Die Substitution mit einem XbaI-SalI-Genfragment (im Leserahmen), das zur heterologen Proteinexpression geeignet ist, in dieses Plasmid erlaubt die Expression und Sekretion des heterologen Proteins. Die Isolierung des Hefe-Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP)-Genpromotors, der Ursprung der ADH2-Komponente des Promotors, und die Konstruktion eines Hybrid-ADH/GAP-Promotors sind in den US-Patenten Nr. 4 876 197 und 4 880 734 beschrieben. Die Isolierung des Hefe-α-Faktor-Gens einschließlich des Transkriptionsterminators ist im US-Patent Nr. 4 870 008 beschrieben.
Nach Didesoxysequenzierung fand man heraus, dass die synthetische Gensequenz eine einzelne Basenpaarmutation aufweist, welche mittels Standardverfahren repariert wurde. Das Plasmid pPAGBB-1 ist das Plasmid, das von pPAG/αF abgeleitet ist, das das korrekte synthetische PDGF-B (XbaI-SalI)-Gen enthält.
Konstruktion eines synthetischen Gens von verkürztem α-Faktor-Leader mit dibasischer Prozessierungsstelle
Der verkürzte α-Faktor-Leader vermittelt die Sekretion von Hybrid-Polypeptiden im richtigen Leserahmen. Er ist ein Derivat des S. cerevisiae α-Faktor-Leaders, dem Sekretions-Leader für Mating-Faktortyp alpha, das Produkt des Matα-Gens (Kurjan und Herskowitz (1982), Cell, 30: 933–943), und besteht aus den ersten 35 Aminosäuren des nativen Leaders. Die Konstruktion und Verwendung eines Gens von verkürztem α-Faktor-Leader zum Vermitteln der Sekretion ist in der EPO-Veröffentlichung 0 324 274 B1 beschrieben. Es wurden synthetische Oligonukleotide, die für einen vergleichbaren partiellen (Aminosäuren 8–35) verkürzten α-Faktor-Leader (L7) und einen Teil der dibasischen Prozessierungsstelle codieren, aus Oligonukleotiden hergestellt, die in SEQ ID NO. 22 dargestellt sind und diese führten, wenn sie mit dem in SEQ ID NO. 23 dargestellten komplementären Strang zusammengesetzt wurden, zu einem PstI-BglII-Fragment mit einem 3'-ACGTC- und einem 5'-CTAG-Überhang, um eine einfache Ligation in die Expressionskassette zu ermöglichen.
Konstruktion von pAGL7PB
Der Zweck dieser Konstruktion war die Substitution des größten Teils des Volllängen-α-Faktor-Leaders PstI-BglII-Genfragments in der PDGF-B-Expressionskassette von pPAGBB-1 durch das oben beschriebene synthetische, partiell verkürzte PstI-BglII-Genfragment des α-Faktor-Leaders. Ein 1,9 kb PstI-Fragment mit pBR322-Sequenzen, der ADH/GAP-Hybridpromotor (am 5'-Ende durch eine BamHI-Schnittstelle gekennzeichnet) und die partielle 5'-α-Faktor-Leader-Gensequenz (die für die ersten sieben Aminosäuren des nativen α-Faktor-Leaders codiert) wurden von pPAGBB-1 isoliert. Es wurde mit kinasierten, aneinander angelagerten synthetischen Oligonukleotiden 1,49/3°.40 ligiert. Nach Verdauung mit BamHI erhielt man ein partielles 5'-Fragment einer Expressionskassette, das Sequenzen für den ADH/GAP-Hybridpromotor und den 5'-Teil des verkürzten α-Faktor-Leaders umfasste.
Ganz ähnlich wurde ein BglII-Fragment, das das synthetische PDGF-B-Gen, den α-Faktor-Terminator (am 3'-Ende durch eine BamHI-Schnittstelle gekennzeichnet) und pBR322-Sequenzen enthielt, von pPAGBB-1 isoliert. Es wurde mit kinasierten, aneinander angelagerten synthetischen Oligonukleotiden 2.32/4°.50 ligiert. Nach Verdauung mit BamHI erhielt man ein partielles 3'-Fragment einer Expressionskassette, die Sequenzen für den 3'-Teil des verkürzten α-Faktor-Leaders, PDGF-B, und den α-Faktor-Leader-Transkriptionsterminator umfasste. Die vollständige PDGF-B-Expressionskassette erhielt man nach Ligation der partiellen 5'- und 3'-Expressionskassetten-Genfragmente und Verdauung mit BamHI. Die BamHI-Expressionskassette wurde in die BamHI-Schnittstelle eines pBR322-abgeleiteten Vektors (pBRΔEco-Sal) unter Erhalt von Plasmid pAGL7PB kloniert. Eine Karte der PDGF-B-Expressionskassette in diesem Plasmid ist in 2 gezeigt.
Konstruktion von pYAGL7PB
Die PDGF-B-Expressionskassette von pAGL7PB wurde durch BamHI-Verdauung isoliert und in die BamHI-Schnittstelle des oben beschriebenen Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektors pAB24 insertiert. Ein Hefe-Expressions-Plasmid, pYAGL7PB, wurde isoliert. Eine Plasmidkarte von pYAGL7PB ist in 3 gezeigt. Die Nukleotidsequenz der vollständigen Expressionskassette und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens (ORF; open reading frame), der für das primäre Translationsprodukt des verkürzten α-Faktor-Leaders PDGF-B codiert, sind in SEQ ID NO. 24 bzw. SEQ ID NO. 25 angegeben.
Identifikation des Expressionsstamms: MB2-1 (pYAGL7PB)
Das Expressionsplasmid pYAGL7PB wurde mittels Standardverfahren in S. cerevisiae MB2-1 transformiert und es wurden prototrophe Uracilkolonien selektiert. Einzelne Kolonien von unabhängigen Transformanden wurden nach Animpfen von einzelnen Kolonien in Medium, das Leucin-Prototrophe selektiert, im Hinblick auf die Expression durchgemustert. Das Medium ist außerdem reich an Glukose, um die Expression von Sequenzen unter ADR2-Regulation (einschließlich des PDGF-B-Gens) reprimiert zu halten. Die Kulturen wurden anschließend verdünnt und in Medium mit wenig Glukose und ohne Uracil bis zur Konfluenz gezogen. Zellfreie Kulturüberstände wurden präpariert, mittels Immunoaktivität (ELISA) auf PDGF-BB hin und mittels mitogener Aktivität auf 3T3-Zellen untersucht. Es wurde eine stark PDGF-BB-exprimierende Kolonie identifiziert, MB2-1 (pYAGL7PB#5).
Beispiel 3: Konstruktion des Expressions-Plasmids pYL7PPB
Allgemeine Beschreibung
Das Plasmid pYL7PPB (auch bekannt als pYAGL7PPB) umfasst eine Expressionskassette mit den folgenden Eigenschaften. Transkriptions-Initiation und -Termination wird von dem induzierbaren Hybrid-Hefe-Promotor ADH/GAP und dem Mata-Transkriptions-Terminator vermittelt, die oben beschrieben wurden. Das Gen umfasst außerdem einen offenen Leserahmen, der für einen verkürzten Hefe-α-Faktor-Leader codiert, um Sekretion von rhPDGF-BB zu vermitteln. Die Propeptidsequenz, die in dem Expressionskonstrukt enthalten ist, ist lediglich die native N-terminale Propeptidsequenz; die native C-terminale Propeptidsequenz wurde nicht in das Konstrukt aufgenommen. Die Aufnahme der N-terminalen Propeptidsequenz führt zu erhöhter Expression von rhPDGF-BB, vermutlich auf Grund einer verbesserten Faltung. Dibasische Verarbeitungsstellen an den Verknüpfungen verkürzter α-Faktor-Leader/N-terminales Propeptid und N-terminales Propeptid/PDGF-B wurden mitaufgenommen, um die Produktion von korrekt verarbeitetem rhPDGF-BB-Polypeptid durch Hefe zu erleichtern. 4 zeigt eine Karte der pYL7PPB-Expressionskassette, die diese Eigenschaften und die Schnittstellen, die für die Konstruktion dieser Expressionskassette relevant sind, hervorhebt. Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens, der für das primäre Translationsprodukt des verkürzten α-Faktor-Leader-proPDGF-B codiert, sind in SEQ ID NO. 26 bzw. SEQ ID NO. 27 gezeigt.
Schrittweise Konstruktion von pYL7PPB
Quelle der rhPDGF-B-cDNA
Eine klonierte cDNA, die für das native humane präproPDGF-B codiert, λhPDGFb-17, wurde von den Mitarbeitern Arne Östman und Carl Heldin bereitgestellt. Die Isolierung der cDNA, die für hPDGF-B codiert, wurde unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek, die aus RNA erstellt wurde, die von einer humanen klonalen Gliom-Zelllinie, U-343 MGa Cl2 (Östman et al. (1988), J. Biol. Chem., 263: 16202–16208), isoliert wurde, erreicht.
Konstruktion von pSV7d-PDGF A103-B1
Das Plasmid psV7d-PDGF A103-B1 war die Quelle für die N-terminale Propeptid-PDGF-B-cDNA. Das Plasmid wurde wie im folgenden beschrieben konstruiert.
Das 3kb-Eco-R1-PDGF-B-cDNA-Insert aus Klon λhPDGFb-17 wurde ausgeschnitten und in die nur einmal vorkommende Eco-RI-Schnittstelle des Säuger-Expressionsvektors pSV7d kloniert, was Plasmid phPDGFβ-1 (auch bekannt als pSV7d-PDGF-B1) ergab.
Ein Säuger-Plasmid, pSV7d-PDGF A103-β1, für die Koexpression von sowohl PDGF-A- als auch -B-Ketten von ihren jeweiligen cDNAs, wurde wie folgt konstruiert. Das Plasmid phPDGFβ-1 wurde mit PstI unter Bedingungen, die den Verdau an einer der zwei Plasmid-PstI-Schnittstellen begünstigten (erwünschter Einzel-Verdau an der Schnittstelle im Ampicillin-Resistenzgen des pSV7d-Vektorrückgrats), verdaut und mit PstI-verdautem pSV7d-PDGF-A103(D1) legiert. Letzteres Plasmid ist strikt analog zum PDGF-B-Säuger-Expressionsplasmid phPDGFβ-1, mit der Ausnahme, dass es cDNA umfasst, die für die lange 211 Aminosäurenform der PDGF-A-Kette codiert, und nicht für die PDGF-B-Ketten-cDNA. Dieses Plasmid enthält eine einzelne PstI-Schnittstelle im Ampicillin-Resistenzgen des pSV7d-Vektorrückgrats.
Nach der Transformation wurden die Bakterienkolonien mit den entsprechenden oder geeignet markierten EcoRI-cDNA-Sonden auf Anwesenheit von sowohl PDGF-B- als auch PDGF-A-cDNA-Sequenzen durchgemustert. Kolonien, die sowohl für PDGF-B- als auch für -A-Kettensequenzen positiv waren, wurden weiter durch EcoRI-Verdau von Plasmid-DNA durchgemustert, und Plasmid pSV7d-PDGF A103-B1, das das vorhergesagte EcoRI-Muster aufwies, wurde identifiziert.
Mutagenese der hPDGF-B-cDNA
Die PDGF-B-cDNA wurde mutiert, um (1) eine SacI-Schnittstelle einzufügen, die das Einfügen des verkürzten α-Faktor-Sekretions-Leaders ermöglicht, und um (2) die hPDGF-B-cDNA-Sequenz, die die dibasischen Aminosäuren Arg-Arg codiert, so zu verändern, dass sie Lys-Arg codiert. Diese dibasische Kombination wird von dem dibasisch-verarbeitenden Hefe-Enzym KEX2-Endopeptidase effizienter geschnitten als Arg-Arg. Die Matrize für die Mutagenese wurde wie folgt hergestellt.
Die ~3 kb große EcoRI-hPDGF-B-cDNA wurde aus pSV7d-PDGF A103-B1 isoliert und in die EcoRI-Schnittstelle unter Erhalt von Plasmid pPPB/6 insertiert. Die Nukleotidsequenz des 2,7 kb großen PstI-EcoRI-cDNA-Fragments wurde bestätigt. Das 0,9 kb große PstI-NcoI-cDNA-Fragment wurde in die PstI-NcoI-Schnittstellen von M13 insertiert und die Nukleotidsequenz des Inserts wurde bestätigt. Eine partielle Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz der PDGF-B-cDNA sind in SEQ ID NO: 28 bzw. SEQ ID NO: 29 angegeben.
Eine doppelte Mutagenese des M13-PstI-NcoI-PDGF-B-cDNA-Fragments wurde mittels Standardmethoden unter Verwendung der folgenden Primer durchgeführt. Primer 1 (SEQ ID NO: 30) führt eine SacI-Schnittstelle ein; Primer 2 (SEC ID NO: 31) verwandelt Arg-Arg an der Propeptid/PDGF-B-Verknüpfung zu Lys-Arg. Zusätzliche Mutationen werden eingeführt, um die Detektion mutierter Sequenzen durch Hybridisieren mit dem markierten Primer zu erleichtrn. Es ergeben sich keine Veränderungen in der primären Aminosäuresequenz durch die Primer 1-Mutagenese; lediglich der Arg ⇔ Lys-Aminosäureaustausch ergab sich aus der Primer 2-Mutagenese. Mutierte hPDGF-B-Inserts wurden durch Hybridisierung mit radioaktiv markierten Primer 1- und Primer 2-Sonden detektiert. Die DNA-Sequenz wurde bestätigt und es wurde (doppelsträngiges) RF-Plasmid hergestellt.
Konstruktion von pL7PPB (pAGL7PPB)
Die unten stehenden Schritte führen im Wesentlichen zur Substitution des XhoI-SalI-Teils der PDGF-B-Expressionskassette in pAGL7PB, der für den C-terminalen Teil des verkürzten α-Faktor-Leaders, die dibasische Lys-Arg-Verarbeitungsstelle und PDGF-B codiert (2), durch ein XhoI-SalI-Genfrag-ment, das für den C-terminalen Teil des verkürzten α-Faktor-Leaders, eine dibasische Lys-Arg-Verarbeitungsstelle, das N-terminale Propeptid von PDGF-B, eine dibasische Lys-Arg-Verarbeitungsstelle und PDGF-B codiert. Die Sequenzen, die für das N-terminale PDGF-B-Propeptid und PDGF-B codieren, leiteten sich von cDNA ab, wie oben beschrieben. Eine Karte der daraus hervorgehenden Expressionskassette ist in 4 gezeigt.
Ein 447 by großes SacI-SphI-Fragment, das den größten Teil des proPDGF-B-Gens umfasst, wurde von der M13 RF, die die modifizierte präproPDGF-B-cDNA enthält, isoliert. Synthetische Oligonukleotide, die Sequenzen umfassen, die für den C-terminalen Teil von verkürztem α-Faktor-Leader, eine dibasische Lys-Arg-Verarbeitungsstelle und den N-terminalen Teil des PDGF-B-Propeptids codieren (SEQ ID NO: 32–33), wurden miteinander verbunden, was ein Fragment mit einem 3'-SacI-Überhang ergab. Synthetische Oligonukleotide, Sph-Sal I/Sph-Sal II, die Sequenzen umfassen, die für die letzten 14 Aminosäuren von PDGF-B und Stopp-Codons codieren, wurden unter Erhalt eines SphI-SalI-Fragments verknüpft (SEQ ID NO: 34–35). Diese zwei Sätze aneinander angelagerter Oligonukleotide wurden mit dem 447 by großen SacI-SphI-proPDGF-Genfragment ligiert. Dies führte zu einem Genfragment, das Sequenzen umfasste, die den C-terminalen Teil von verkürztem α-Faktor-Leader, eine dibasische Lys-Arg-Verarbeitungsstelle und proPDGF-B codierten.
Synthetische Oligonukleotide, die Sequenzen umfassen, die die mittleren Aminosäuren des verkürzten α-Faktor-Leaders codieren, wurden verknüpft, was zu einem Fragment mit einem 5'XhoI-Überhang führte (SEQ ID NO: 32–33). Diese aneinander angelagerten Oligonukleotide wurden mit pAGL7PB ligiert, der mit XhoI (einmal vorkommende Schnittstelle im pAGL7PB-Plasmid, die in der Expressionskassette liegt, siehe 2), geschnitten wurde. Nach dem Anlagern der Oligonukleotide wurde das modifizierte Plasmid mit SalI verdaut, was zum Verlust des pAGL7PB-XhoI-SalI-Fragments führte und zu einem Vektor/Gen-Fragment führte.
Der letzte Schritt der Konstruktion der PDGF-B-Expressionskassette war die Ligation des Genfragments in das Vektor/Gen-Fragment unter Erhalt von Plasmid pL7PPB (pAGL7PPB), wie in 5 gezeigt. Das PstI-BamHI-Insertfragment wurde isoliert und Nukleotidsequenzierung bestätigte, dass die gewünschte Konstruktion erhalten wurde. Eine Karte der PDGF-B-Expressionskassette in pL7PPB ist in 4 gezeigt.
Konstruktion von pYL7PPB (pYAGL7PPB)
Die PDGF-B-Expressionskassette von pL7PPB wurde nach BamHI-Verdau isoliert und in die BamHI-Schnittstelle des Hefe-Shuttle-Vektors pAB24, der oben beschrieben ist, insertiert, woraus das Hefe-Expressionsplasmid pYL7PPB hervorging. Eine Karte von pYL7PPB ist in 6 gezeigt. Die Nukleotidsequenz der vollständigen Expressionskassette und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens (ORF), der für den verkürzten α-Faktor-Leader Lys-Arg-proPDGF-B codiert, sind in SEQ ID NO: 36 bzw. SEQ ID NO: 37 angegeben. Die vollständige Nukleotidsequenz des Hefe-Expressionsplasmids pYL7PPB wurde bestimmt.
Identifikation des Expressionsstamms: MB2-1 (pYL7PPB)
Das Expressionsplasmid pYL7PPB wurde mittels Standardverfahren in S. cerevisiae MB2-1 transformiert und Plasmid beherbergende, Uracil-Prototrophe wurden als isolierte Kolonien selektiert. Individuelle Kolonien von unabhängigen Transformanten wurden nach Animpfen von isolierten Kolonien in Wachstumsmedium, das auf Leucin-Prototrophe selektiert, im Hinblick auf Expression durchgemustert. Das Medium hat auch einen hohen Glukosegehalt, um die Expression von Sequenzen unter ADR2-Regulation (einschließlich des PDGF-B-Gens) reprimiert zu halten. Die Kulturen wurden anschließend verdünnt und bis. zur Konfluenz in selektivem Wachstumsmedium ohne Uracil mit niedrigem Glukosegehalt gezogen. Zellfreie Überstände wurden mittels Immunaktivität (ELISA) auf PDGF-BB hin, und mittels mitogener Aktivität auf 3T3-Zellen untersucht. Gefrorene Stammlösungen wurden von mehreren Transformanten hergestellt, die gleichbleibend hohe Expressionsspiegel zeigten. Nach wiederholtem Testen wurde die Transformande, die im Durchschnitt die höchste Expression von PDGF-BB zeigte, MB2-1 (pYL7PPB#22), ausgewählt.
Beispiel 4: Expressionsplasmid pYJST400
Die dibasische Lys-Arg-Verarbeitungsstelle zwischen der α-Faktor-Leader-Sequenz und dem N-terminalen Propeptid wurde durch in vitro-Mutagenese aus dem Expressionsplasmid pYL7PPB entfernt, um Expressionsplasmid pYJST400 zu konstruieren. Daher besitzt pYJST400 eine einzelne dibasische Verarbeitungsstelle, welche sich an der Propeptid/PDGF-B-Verknüpfung befindet. Die Eliminierung dieser ersten Verarbeitungsstelle wurde vorgenommen, um ihre relative Wirkung auf die Sekretion von rhPDGF-BB aus der Hefe zu bestimmen, die von dem α-Faktor-Leader-Peptid vermittelt wird.
Beispiel 5: Expression von rekombinantem humanen PDGF-BB
Rekombinantes humanes PDGF-BB wird mittels eines Stammes der Hefe Saccharomyces cerevisiae, produziert, der mit einem Hefe-Expressionsplasmid mit hoher Kopienzahl genetisch modifiziert ist, das ein Gen umfasst, das für humanes PDGF-B codiert. Der bevorzugte S. cerevisiae-Stamm MB2-1 hat den GenoART: Matα, ura3Δ, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, pep4Δ, [cir°] Er ist auxotroph für Uracil, Leucin und Histidin, was diese Nährsupplemente erfordert, wenn man ihn auf Minimalmedium zieht. MB2-1 enthält kein endogenes 2-μ-Plasmid, welches dazu tendiert, die Stabilität eingeführter Plasmide zu stören und eine Rekombination zwischen endogenen und eingeführten Plasmiden hervorruft. Der Stamm exprimiert keine funktionelle Protease A, das Produkt des PEP4-Gens, welche die Produktion heterologer Poteine stört. MB2-1 wurde so gestaltet, dass er diese vorteilhaften Eigenschaften aufweist, welche die Selektion auf hohe Expression heterologer Proteine umfassen.
Die Hefe-Expressionsplasmide pYAGL7PB, pYL7PPB und pYJSST400 wurden in den Hefe-Stamm MB2-1, wie von Hinnen et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929–1933, beschrieben, transformiert und auf ura-, 8% Glukose, Sorbitol-Platten ausplattiert. Transformanden wurden auf leu-, 8% Glukose-Flüssigmedium für 24 Stunden gezogen und dann auf leu-, 8% Glukose-Sorbitol-Platten ausplattiert, um einzelne Kolonien zu erhalten. Einzelne Kolonien wurden angeimpft und in 3 ml leu-, 8% Glukose-Medium für 24 Stunden bei 30°C gezogen, und dann in 1 Liter (1 : 50) ura-, 1% Glukose-Medium angeimpft und für 75 Stunden bei 30°C gezogen. Hefe-Kulturmedium wurde mittels des humanen Vorhautfibroblasten-Mitogen-Assays (siehe Beispiel 5 unten) auf PDGF-Aktivität hin untersucht.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, führte die Aufnahme der Sequenz, die für das N-terminale Propeptid codiert, zu einer im Mittel 3,4-fachen Erhöhung der Sekretion von rhPDGF-BB, gemessen durch Bioaktivität und mittels ELISA. Zusätzlich führte das Entfernen der Lys-Arg-Verarbeitungsstelle an der Leader/Propeptid-Verknüpfung zu einer 2,8-fachen Abnahme der rhPDGF-BB-Sekretion (Tabelle 1).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Anwesenheit des nativen N-terminalen Propeptids die Sekretion von biologisch aktivem reifen rhPDGF-BB verstärkt, wenn es von bevorzugten Verarbeitungsstellen, die für eine verbesserte Erkennung durch ein proteolytisches Enzym der Hefe-Wirtszelle modifiziert wurden, flankiert wird. Daher erleichtert das Schneiden an der Leader/Propeptid-Verknüpfung sowie an der Propeptid/PDGF-B-Verknüpfung offensichtlich die richtige Faltung und/oder Verarbeitung und/oder den Transport des pro-PDGF-B, was zu erhöhter Sekretion von reifem rhPDGF-BB führt.
αF_L1–35PDGF-B = ein verkürzter α-Faktor-Leader, bestehend aus den N-terminalen Aminosäuren 1–35 im Leserahmen fusioniert mit reifem humanen PDGF-B. Eine einzelne Verarbeitungsstelle (KEX₂) trennt die Leader-Sequenz von der reifen PDGF-B-Sequenz.
αF_L1–35pro = ein verkürzter α-Faktor-Leader, bestehend aus den N-terminalen Aminosäuren 1–35 plus natives N-terminales Propeptid für humanes PDGF-B im Leserahmen fusioniert mit reifem humanen PDGF-B. KEX₂-Verarbeitungsstellen trennen die Leader-Sequenz von der N-terminalen Propeptidsequenz (KEX₁) und die N-terminale Sequenz von der reifen PDGF-B-Sequenz (KEX₂).
αF_L1–35ΔKRproPDGF-B = ein verkürzter α-Faktor-Leader, bestehend aus den N-terminalen Aminosäuren 1–35 plus natives N-terminales Propeptid für humanes PDGF-B im Leserahmen fusioniert mit reifem humanen PDGF-B. Die KEX₁-Verarbeitungsstelle zwischen der Leader-Sequenz und der N-terminalen Propeptidsequenz wurde entfernt (ΔKR).
Beispiel 6: Humaner Vorhautfibroblast (HFF) Mitogen-Assay für PDGF
Humane Vorhautfibroblasten-Stammlösungen wurden eingefroren gelagert; das Einfrieren wurde bei Passage 13 vorgenommen. Vor der Verwendung wurden HFF aufgetaut und dann ließ man sie in T75-Flaschen wachsen, bis sie konfluent waren, was für gewöhnlich nach 5–7 Tagen geschah. Das Wachstumsmedium enthielt Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 20% fötales Rinderserum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 300 μg/ml L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Die Zellen wurden bei 37°C in angefeuchteter 7% CO₂, 93% Luftatmosphäre, inkubiert. Zum Zeitpunkt der Konfluenz wurden die Zellen passagiert, indem die Monolayer mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne C²⁺ und Mg²⁺ gespült wurden, indem sie in Trypsin enthaltendem EDTA dissoziiert wurden und mit Wachstumsmedium verdünnt wurden. Nach dem Auftauen wurden die Zellen nicht mehr als achtmal passagiert.
Um im Hinblick auf PDGF zu untersuchen, wurden HFFs wie folgt ausplattiert. Die Zellen wurden wie oben gespült und mit Trypsin dissoziiert. Die trypsinierten Zellen wurden pelletiert und mit einer Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml in Medium resuspendiert, das dem Wachstumsmedium ähnlich war, mit der Ausnahme, dass 5% FBS durch 20% FBS ersetzt wurden; 100 μl der Suspension wurden auf jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt; und dann wurden die Zellen 5–6 Tage unter den oben beschriebenen Bedingungen inkubiert.
PDGF in der Probe wurde bestimmt, indem ³H-Thymidin-Einbau in HFF-DNA, stimuliert durch PDGF, untersucht wurde. Es wurden Proben zu den Vertiefungen gegeben, die HFF-Monolayer enthielten, und die Assay-Platten wurden, wie oben, für 18 Stunden inkubiert. Die HFF-Kulturen wurden dann mit [Methyl-³H]-thymidin (10 μC/ml Endkonzentration, 1 μC/Vertiefung) bei 37°C unter den oben beschriebenen Inkubationsbedingungen für 8 Stunden pulsmarkiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und fixiert. Die Fixierung geschah durch Inkubation mit 5 Trichloressigsäure (TCA) und dann 100% Methanol für 15 Minuten, gefolgt von der Trocknung an der Luft. Die Zellen wurden dann mittels 0,3 N NaOH abgelöst und dann in einem Flüssigszintillationszähler vermessen.
Kontrollproben wurden behandelt wie oben für die Proben beschrieben und wurden wie folgt präpariert. Für Positivkontrollen wurde PDGF, bezogen von PDGF, Inc., auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml in DMEM mit 10 mg/ml BSA verdünnt. Es wurde eine Standardkurve erstellt; der erste Messpunkt war 10 ng/ml, die übrigen Messpunkte waren zweifache serielle Verdünnungen. Jede Verdünnung wurde in dreifacher Ausführung getestet. Negativkontrollen, welchen sowohl Probe als auch Kontroll-PDGF fehlte, wurden ebenfalls untersucht.
Beispiel 7: Expressionsplasmide pYLUI
Das Plasmid pYLUIGF24 umfasst eine Expressionskassette mit dem Hybrid-Hefe-Promotor ADH/GAP und Matα-Faktor-Leader-Sequenzen, die mit einer Sequenz fusioniert sind, die für das humane IGF-I-A-Gen codieren. Diese Sequenz wurde unter Verwendung von bei Hefe bevorzugten Codons abgeleitet. Eine dibasische Aminosäure-Verarbeitungsstelle ist an der α-Faktor-Leader/IGF-I-A-Verknüpfung vorhanden. Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens, der für ein primäres Translationsprodukt des α-Faktor-Leader/IGF-I-A codiert, sind in SEQ ID NO: 38 bzw. SEQ ID NO: 39 wiedergegeben.
Das Plasmid pYLUIGF34 unterscheidet sich von pYLUIGF24 nur in seinem offenen Leserahmen. Diese Kassette umfasst einen offenen Leserahmen, der für eine Volllängen-Matα-Faktor-Leader-Sequenz codiert, fusioniert mit einer Sequenz, die für das humane IGF-I-A-Gen mit seiner C-terminalen Prosequenz codiert. Dibasische Aminosäure-Verarbeitungsstellen sind an den α-Faktor-Leader/IFG-I-A- und -IGF-I-A/IGF-I-A-Prosequenz-Verknüpfungen vorhanden. Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens, der für ein primäres Translationsprodukt von α-Faktor-Leader-proIGF-I-A codiert, sind in SEQ ID NO: 40 bzw. SEQ ID NO: 41 wiedergegeben.
Beide Plasmide wurden erzeugt, indem die jeweilige Expressionskassette in die nur einmal vorkommende BamHI-Klonierungsstelle des Hefe-Shuttle-Vektors pAB24 insertiert wurde, wie oben beschrieben.
Beispiel 8: Expression von rekombinantem humanen IGF-I-A
Rekombinantes humanes IGF-I-A wird von einem Stamm der Hefe Saccaromyces cerevisiae hergestellt, der mit einem Hefe-Expressionsplasmid mit hoher Kopienzahl, das ein Gen umfasst, das für humanes IGF-I-A codiert, genetisch modifiziert wurde. Die Hefe-Expressionsplasmide pYLUIGF24 und pYLUIGF34 wurden mit tels Verfahren, die zuvor genannt wurden, in einen Hefe-Stamm transformiert.
Westernblot-Daten zeigten an, dass richtig verarbeitetes IGF-IA-Protein mit der Prosequenz, modifizierter KEX2-Verarbeitungsstelle, und einem Hefe-Sekretions-Leader erhalten wurde.
Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in der Beschreibung genannt sind, zeigen den Wissensstand des Fachmanns in dem Fachgebiet an, zu der diese Erfindung gehört.
Obwohl die vorstehende Erfindung für Zwecke der Klarheit und des Verständnisses mittels Veranschaulichung und Beispiel im Detail beschrieben wurde, ist es offensichtlich, dass bestimmte Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der anhängenden Ansprüche durchgeführt werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleotidsequenz, die in 5' → 3'-Richtung und funktionell gebunden (a) eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Initiationsregion, (b) eine codierende Sequenz für ein Hybrid-Vorläuferpolypeptid und (c) eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Terminationsregion umfasst, wobei das Hybrid-Vorläuferpolypeptid umfasst: 5'-SP-(PS)_n–1-(LP-PS)_n–2-(NPRO_MHP-PS)_n–3-MHP-(PS-CPRO_MHP)_n–4-3' worin SP eine Signalpeptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfasst; PS eine bevorzugte Bearbeitungsstelle, die in vivo durch ein proteolytisches Hefeenzym gespalten wird, umfasst; LP eine Leader-Peptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfasst; NPRO_MHP eine native N-terminale Propeptidsequenz eines interessierenden, reifen, heterologen Säugerproteins umfasst; MHP eine Peptidsequenz für das interessierende, reife, heterologe Säugerprotein umfasst; CPRO_MHP eine native C-terminale Propeptidsequenz des interessierenden, reifen, heterologen Säugerproteins umfasst; und n – 1, n – 2, n – 3 und n – 4 unabhängig = 0 oder 1; wobei die Bearbeitungsstellen eine proteolytische Verarbeitung des Vorläuferpolypeptids in vivo durch eine Hefe-Wirtszelle zu dem reifen Protein ermöglichen und wobei zumindest n – 3 oder n – 4 = 1.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 1, wobei das Säugerprotein ein PDGF-Protein oder ein IGF-Protein oder Varianten davon ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 1, wobei das Protein ein humanes Protein ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 3, wobei das humane PDGF, PDGF-BB oder Varianten davon ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 4, wobei SP eine Signalpeptidsequenz für Saccharomyces cerevisiae-α-Faktor ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 5, wobei der α-Faktor Mat-α oder Varianten davon ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 6, wobei n – 2 = 1, n – 3 = 1 und n – 4 = 0.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 7, wobei LP eine gestutzte Lederpeptidsequenz ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 8, wobei die codierende Sequenz für das Hybrid-Vorläuferpolypeptid die Nucleotidsequenz hat, die in SEQ ID NO: 26 angegeben ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 8, wobei das Hybrid-Vorläuferpolypeptid die Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 27 angegeben ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 3, wobei n – 3 = 0 und n – 4 = 1 und das humane IGF-Protein IGF-I-A oder Varianten davon ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 11, wobei SP eine Signalpeptidsequenz für einen Saccharomyces cerevisiae-α-Faktor ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 12, wobei der α-Faktor Mat-α oder Varianten davon ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 13, wobei die codierende Sequenz für das Hybridvorläuferpolypeptid die Nucleotidsequenz hat, die in SEQ ID NO: 40 angegeben ist.
Nucleotidsequenz nach Anspruch 13, wobei das Hybridvorläuferpolypeptid die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 41 angegeben ist, hat.
Vektor, umfassend eine Nucleotidsequenz, die in 5' → 3'-Richtung und funktionell gebunden (a) eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Initiationsregion, (b) eine codierende Sequenz für ein Hybrid-Vorläuferpolypeptid und (c) eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Terminationsregion umfasst, wobei das Hybrid-Vorläuferpolypeptid umfasst: 5'-SP-(PS)_n–1-(LP-PS)_n–2-(NPRO_MHP-PS)_n–3-MHP-(PS-CPRO_MHP)_n–4-3' worin SP eine Signalpeptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfasst; PS eine bevorzugte Bearbeitungsstelle, die in vivo durch ein proteolytisches Hefeenzym gespalten wird, umfasst; LP eine Leader Peptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfasst; NPRO_MHP eine native N-terminale Propeptidsequenz eines interessierenden, reifen, heterologen Säugerproteins umfasst; MHP eine Peptidsequenz für das interessierende, reife, heterologe Säugerprotein umfasst; CPRO_MHP eine native C-terminale Propeptidsequenz des interessierenden reifen, heterologen Säugerproteins umfasst; und n – 1, n – 2, n – 3 und n – 4 unabhängig = 0 oder 1; wobei die Bearbeitungsstellen eine proteolytische Verarbeitung des Vorläuferpolypeptids in vivo durch eine Hefe-Wirtszelle zu dem reifen Protein ermöglichen und wobei zumindest n – 3 oder n – 4 = 1.
Vektor nach Anspruch 16, wobei der Vektor der Hefe-Shuttle-Vektor pAB24 ist.
Hefe-Wirtszelle, die in stabiler Weise mit einer Nucleotidsequenz transformiert ist, die eine Expressionskassette umfasst, wobei die Expressionskassette in 5' → 3'-Richtung und funktionell gebunden (a) eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Initiationsregion, (b) eine codierende Sequenz für ein Hybrid-Vorläuferpolypeptid und (c) eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Terminationsregion umfasst, wobei das Hybrid-Vorläuferpolypeptid umfasst: 5'-SP-(PS)_n–1-(LP-PS)_n–2-(NPRO_MHP-PS)_n–3-MHP-(PS-CPRO_MHP)_n–4-3' worin SP eine Signalpeptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfasst; PS eine bevorzugte Bearbeitungsstelle, die in vivo durch ein proteolytisches Hefeenzym gespalten wird, umfasst; LP eine Leader Peptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfasst; NPRO_MHP eine native N-terminale Propeptidsequenz eines interessierenden, reifen, heterologen Säugerproteins umfasst; MHP eine Peptidsequenz für das interessierende, reife, heterologe Säugerprotein umfasst; CPRO_MHP eine native C-terminale Propeptidsequenz des interessierenden reifen, heterologen Säugerproteins umfasst; und n – 1, n – 2, n – 3 und n – 4 unabhängig = 0 oder 1; wobei die Bearbeitungsstellen eine proteolytische Verarbeitung des Vorläuferpolypeptids in vivo durch eine Hefe- Wirtszelle zu dem reifen Protein ermöglichen und wobei zumindest n – 3 oder n – 4 = 1.
Zelle nach Anspruch 18, wobei die Bearbeitungsstellen Dipeptide sind, die durch KEX2-Genprodukt von Saccharomyces gespalten werden.
Zelle nach Anspruch 19, wobei die Dipeptide 5'-Lys-Arg-3' sind.
Zelle nach Anspruch 20, wobei die Hefezelle zu der Gattung Saccharomyces gehört.
Zelle nach Anspruch 21, wobei die Hefezelle S. cerevisiae ist.
Verfahren zur Expression von heterologen Proteinen und zu ihrer Sekretion in biologisch aktiver reifer Form unter Verwendung einer Hefe-Wirtszelle als Expressionssystem, wobei das Verfahren umfasst: Transformieren der Hefezelle mit einem Vektor, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die in der 5' → 3'-Richtung und funktionell gebunden (a) eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Initiationsregion, (b) eine codierende Sequenz für ein Hybrid-Vorläuferpolypeptid und (c) eine von Hefe erkannte Transkriptions- und Translations-Terminationsregion umfasst, wobei das Hybrid-Vorläuferpolypeptid umfasst: 5'-SP-(PS)_n–1-(LP-PS)_n–2-(NPRO_MHP-PS)_n–3-MHP-(PS-CPRO_MHP)_n–4-3' worin SP eine Signalpeptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfasst; PS eine bevorzugte Bearbeitungsstelle, die in vivo durch ein proteolytisches Hefeenzym gespalten wird, umfasst; LP eine Leader Peptidsequenz für ein in Hefe sezerniertes Protein umfasst; NPRO_MHP eine native N-terminale Propeptidsequenz eines interessierenden, reifen, heterologen Säugerproteins umfasst; MHP eine Peptidsequenz für das interessierende, reife, heterologe Säugerprotein umfasst; CPRO_MHP eine native C-terminale Propeptidsequenz des interessierenden reifen, heterologen Säugerproteins umfasst; und n – 1, n – 2, n – 3 und n – 4 unabhängig = 0 oder 1; wobei die Bearbeitungsstellen eine proteolytische Verarbeitung des Vorläuferpolypeptids in vivo durch eine Hefe-Wirtszelle zu dem reifen Protein ermöglichen und wobei zumindest n – 3 oder n – 4 = 1.