DE69728158T2

DE69728158T2 - Immunoassays in kapillarröhrchen

Info

Publication number: DE69728158T2
Application number: DE69728158T
Authority: DE
Inventors: Amit Kumar; Sheldon Larry JANG; Kai-Yu Danton LEUNG; Michele Richard ROCCO; Charles Mark PLATSHON
Original assignee: Idexx Laboratories Inc
Current assignee: Idexx Laboratories Inc
Priority date: 1996-07-29
Filing date: 1997-07-22
Publication date: 2004-10-28
Anticipated expiration: 2017-07-23
Also published as: NZ333841A; US5976896A; CA2261747A1; WO1998004920A2; WO1998004920A3; EP0934524B1; BR9710887A; ATE262181T1; US6517778B1; CA2261747C; EP0934524A2; AU3807097A; US20020148728A1; DE69728158D1; AU732627B2

Description

Hintergrund
1. Gegenstand der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine Kassette zum sicheren Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen, die in einer Vorrichtung für ein Festphasen-Fluoreszenz-Immunoassay verwendet werden kann.
2. Hintergrund der Erfindung
Es gibt viele Umstände, bei denen eine qualitative, semiquantitative oder quantitative Detektion der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe gewünscht wird. Umstände, in denen die Detektion eines Analyten gewünscht wird, gibt es in diversen Industriezweigen einschließlich: 1) der Gesundheitsindustrie, z. B. in der klinischen oder diagnostischen Medizin (z. B. in vitro Analysen); 2) der Lebensmittel- und chemische Industrie, z. B. bei der Qualitätskontrolle von Nahrungsmittelprodukten; und 3) der Umweltüberwachungsindustrie, z. B. das Überwachen der Anwesenheit zahlreicher Verunreinigungen in der Luft, im Grundwasser oder in der Erde.
Es sind viele Assays entwickelt worden, die einzigartige Vorrichtungen und Protokolle zur Detektion der Anwesenheit von Analyten durch chemische und physikalische Mittel verwenden. Immunoassays bilden einen großen Bereich der Assays, die ihre Verwendung bei der Detektion von Analyten finden. In Immunoassays wird das Auftreten von Bindungsereignissen zwischen spezifischen Bindungspaarpartnern als ein Nachweis für die Anwesenheit eines Analyten in der Probe verwendet. Vorteile der Verwendung von Immunoassays gegenüber Nicht-Immunoassays bei der Analytdetektion schließen die hohe Sensitivität, eine hohe Spezifität, die Zuverlässigkeit und relativ kurze Assayzeiten ein.
Die Bindungsereignisse, die man sich in Immunoassays zunutze macht, treten häufig an der Oberfläche von Trägermaterialien auf, wobei ein Bindungspartner an der Oberfläche des Trägermaterials und der andere Bindungspartner in der Probe bereitgehalten wird. Die für das Abschließen eines bestimmten Immunoassay benötigte Zeit wird von der Fähigkeit der Bindungspartner in der Probe abhängen, den Partner auf der Trägeroberfläche zu erreichen und zu binden. Die Fähigkeit des Bindungspartners in der Probe mit seinem Gegenpart auf der Trägeroberfläche zu binden, hängt von vielen Faktoren ab; diese Faktoren schließen die Konzentration des Bindungspartners auf der Trägeroberfläche und das Oberflächen/Volumenverhältnis der Proben/Trägerkombination ein. Ein Verfahren zum Verringern der für ein Immunoassay benötigten Zeit ist das Erhöhen der Konzentration eines Bindungspartners auf einer Trägeroberfläche. In einem anderen Ansatz wird das Verhältnis der Oberfläche des Trägers relativ zum Volumen der zu untersuchenden Probe gesteigert.
Gebräuchliche Immunoassays schließen Radioimmunassays (RIA), Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) und Assays auf Membranbasis, wie z. B. herkömmliche Schwangerschaftstests für zu Hause, ein. Diese Immunoassays weisen zahlreiche Nachteile auf. Ein wesentlicher Nachteil von RIA ist das Erfordernis, gefährliche, radioaktive Isotope zu verwenden. Ein Nachteil von ELISA's sind die zahlreichen Schritte der Probenzugabe, die Inkubation, das Waschen, die Zugabe von Farbreagenzien, die Zugabe von Stop-Reagenzien und das Auslesen, die für die Durchführung des Assays notwendig sind; diese Manipulationen können besonders mühselig und eine Quelle für wesentliche Fehler auf diesem Gebiet sein. Ferner neigen die Enzymreaktionen dazu, temperaturempfindlich zu sein, was eine Temperaturkontrolle erforderlich macht. Im Gegensatz zum RIA, bei dem der Marker direkt detektiert wird, wird in einem ELISA der Enzymmarker nicht direkt detektiert. Stattdessen muss man ein detektierbares Produkt entstehen lassen. Darüber hinaus eignen sich ELISA-Protokolle nicht für alle Assays und alle Typen von Flüssigkeiten, wie z. B. wenn die den entsprechenden Analyten enthaltende Flüssigkeit Kontaminanten enthält, die mit einem oder mehreren individuellen Schritten im Assay interferieren, z. B. der Enzymaktivität, der Detektierbarkeit von Enzymprodukten und ähnlichem. Zusätzlich erfordern die Sicherheitsbedenken beim RIA und die Komplexität des ELISA üblicherweise, dass sie von relativ gut geschultem Personal durchgeführt werden und außerdem eine konstante Überwachung durch oder Interaktion mit dem geschultem Anwender erfordern. Ein Nachteil von Assays auf Membranbasis ist, dass sie häufig nur eine dürftige Quantifizierung und Empfindlichkeit anbieten. Viele dieser Assays benötigen auch lange Inkubationszeiten, üblicherweise von zig Minuten bis zu Stunden, was die Analyse von mehreren Proben zeitaufwendig und teuer macht.
Trotzdem ist ein ELISA ein üblicherweise verwendetes Format. In einem ELISA werden geeignete Bindungsereignisse durch das Auftreten eines detektierbaren Produktes, das durch ein auf ein Substrat einwirkendes Enzym hergestellt wird, detektiert. Die Bildung des detektierbaren Produktes kann im benötigtem Umfang durch Erhöhen der Konzentration des Substrates und/oder Erhöhen der Reaktionszeit vervielfältigt werden. Deshalb gibt es eine Möglichkeit, wenn nur wenige Enzyme gebunden werden, das Signal deutlich zu verstärken.
ELISA werden für gewöhnlich in aus Kammern bestehenden Mikrotiterplatten durchgeführt. In dem Bestreben, die Durchführbarkeit zu verbessern, wurde ein ELISA in Kapillarröhrchen gezeigt. Mit in Kapillarröhrchen durchgeführten ELISA Immunoassays ist von schnellen quantitativen Ergebnissen berichtet worden. WO 83/01119 zum Beispiel betrifft eine Apparatur zum Durchführen eines automatisierten Immunoassays, das in einem Kapillarröhrchen durchgeführt wird. Das Kapillarröhrchen durchläuft eine Vielzahl von Operationsstationen innerhalb der Apparatur, an denen sie mit verschiedenen Agenzien versorgt werden, die für das Immunoassay notwendig sind. Kapillarröhrchen werden ebenso verwendet, um schnelle und günstige Polymerase-Kettenreaktionen durchzuführen, wie sie in WO 95/21382 beschrieben werden. Die Verwendung von Kapillarröhrchen ermöglicht das Eliminieren von Kontaminationen aus dem umgebenden Labor während des Verfahrens.
Von mindestens einem bekannten ELISA, das ebenso empfindlich ist und dazu in der Lage, kleine Mengen eines Analyten nachzuweisen, wird berichtet. Siehe z. B. Chandler et. al., „A new enzyme immunoassay system suitable for field use and its application in a snake venom detection kit" Clinica Chimica Acta, 121: 225–230 (1982). Jedoch bleiben die zuvor genannten einem ELISA anhaftenden Nachteile weiterhin bestehen.
Obwohl ELISA-Assays im Labor in Kapillarröhrchen durchgeführt worden sind, sind keine erfolgreichen Produkte entwickelt worden. Ein Hauptgrund dafür ist die Schwierigkeit, zahlreiche Lösungen in und aus den Kapillarröhrchen zu bringen und die Fähigkeit, die Ergebnisse effektiv auszulesen.
Daher besteht ein erheblicher Bedarf an einem schnellen, zuverlässigen und genauen Immunoassay, das eine minimale Interaktion mit dem Anwender erfordert. Es besteht auch ein Bedarf an einem Immunoassay, das zahlreiche ähnliche oder unterschiedliche Proben aufeinanderfolgend oder gleichzeitig auf den gleichen Analyten untersuchen kann oder das nach verschiedene Analyten in der gleichen Probe oder in einer Vielzahl von Aliquots der gleichen Probe suchen kann.
Aufgaben der Erfindung
Eine Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine Kassette (1) zum sicheren Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen (2) bereitzustellen, wobei die Kassette (1) einen Rahmen (4) zum Halten der Röhrchen (2) in einer beabstandeten Weise, wobei der Rahmen (4) einen Kanal aufweist, in dem jedes Kapillarröhrchen (2) ausgerichtet werden kann; und zumindest einen Bereich (7) im Rahmen (4), um zumindest einen Teil jedes Kapillarröhrchens (2) frei zu legen, so dass ein elektromagnetisches Signal mit einem Teil jedes Röhrchens (2) in Kontakt treten kann; einen Halter (5), der in Bezug auf den Rahmen für das abdichtende Halten eines Endes jedes Kapillarröhrchens (2) angeordnet ist, wobei der Halter (5) einen entsprechenden Durchgang für jedes Kapillarröhrchen (2) und einen Anschluss (54) für jeden Durchgang aufweist, um ein Fluid passend durch den Anschluss (54) zu pumpen, umfasst, wobei der Halter (5) auch eine Kammer in Fluidverbindung mit jedem Durchgang jedes Kapillarröhrchens (2) und mit einem Einzelanschluss (54) verbunden aufweist; und wobei der Halter (5) durch einen Aufsatz (36) und eine Fassung (35) zum abdichtenden Halten eines Endes jedes Kapillarröhrchens (2) derart definiert ist, dass der Aufsatz (36) in Verbindung mit der Fassung (35) die Kammer definiert, die (a) jeden der Kapillarröhrchendurchgänge in der Fassung (35) miteinander in Fluidverbindung verbindet, und (b) zum Einzelanschluss (54) zum Verbinden mit einer Fluidquelle zum Pumpen von Fluid durch jedes Kapillarröhrchen zum Einzelanschluss (54) führt.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine Kassette (1), wie weiter oben beschrieben, zum sicheren Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen (2) bereitzustellen, wobei der Rahmen (4) zum Halten der Kapillarröhrchen (2) in einer radialen beabstandeten Weise konstruiert ist, so dass die proximalen Enden der durch den Halter (5) gehaltenen Kapillarröhrchen sich einander annähern, während die distalen Enden der Kapillarröhrchen (2) voneinander wegstreben.
Eine noch weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine Kassette (1), wie weiter oben beschrieben, zum sicheren Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen (2) bereitzustellen, wobei die Fassung (35) flexibel ist.
Eine noch weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine Kassette (1), wie weiter oben beschrieben, zum sicheren Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen (2) bereitzustellen, wobei der Rahmen (4) im wesentlichen flach ist und der Bereich für das Freilegen mindestens eines Teils jedes Kapillarröhrchens (2) eine Öffnung (7) umfasst, die sowohl von der Vorderseite als auch der Rückseite des Rahmens (4) zugänglich ist.
Eine noch weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine Kassette (1), wie weiter oben beschrieben, zum sicheren Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen (2) bereitzustellen, wobei der Rahmen (4) Schutzfortsätze (8) aufweist, die sich über den Rahmen (4) hinaus in den Kapillarröhrchenkanal entfernt vom Halter (5) erstrecken, um die distalen Enden der Kapillarröhrchen (2) vor dem Zerbrechen zu schützen.
Eine noch weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, eine Vorrichtung bereitzustellen, die eine der weiter oben beschriebenen Kassetten umfasst.
Eine noch weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung in einem Festphasen-Fluoreszenz-Immunoassay.
Zusammenfassung
Der Hauptaspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Kassette zum sicheren Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen. Die Kassette umfasst einen Rahmen zum Halten der Röhrchen in einer beabstandeten Weise, wobei der Rahmen einen Kanal aufweist, in dem jedes Kapillarröhrchen ausgerichtet werden kann; und zumindest einen Bereich im Rahmen, um zumindest einen Teil jedes Kapillarröhrchens frei zu legen, so dass ein elektromagnetisches Signal mit einem Teil jedes Röhrchens in Kontakt treten kann.
Außerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegt ein Behälter zum Halten von mehreren Teilen einer Probe. Der Behälter umfasst einen Sammelbehälter, der ausreichend ist, um ein Quantum an Fluid zu enthalten und ein Bord, das sich im Wesentlichen senkrecht von einer Seitenwand des Sammelbehälters nach außen erstreckt, wobei das Bord eine Vielzahl von darin beabstandeten Kammern aufweist.
Außerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegt ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten in einer Probe. Das Verfahren umfasst das Einbringen einer Fluidmischung in ein Kapillarröhrchen, das mindestens auf einem Teil seiner inneren Oberfläche mit einem Substrat beschichtet ist, wobei die Fluidmischung eine den Analyten vermutlich enthaltende Probe und ein Reagenz umfasst, das ein fluoreszierend markiertes Konjugat umfasst, das (a) an den Analyten oder an den Analyten und das Substrat binden kann und (b) fluoreszieren kann, wenn es mit einem geeigneten elektromagnetischen Signal bestrahlt wird; das Halten der Flüssigkeitsmischung im Kapillarröhrchen für einen Zeitraum, der für das Auftreten der Bindung zwischen dem Substrat und dem fluoreszierend markierten Konjugat ausreichend ist; das Entfernen eines Überschusses an einer Flüssigkeitsmischung aus dem Kapillarröhrchen; die äußerliche Bestrahlung des beschichteten Teils des Kapillarröhrchens mit einem elektromagnetischen Signal, das hinreichend ist, um die Fluoreszenz des gebundenen fluoreszierend markierten Konjugates auszulösen; und das Detektieren der sich daraus ergebenden Fluoreszenz, um den Analyten nachzuweisen.
Außerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegt eine Apparatur zum Nachweis mindestens eines Analyten in einer Probe. Die Apparatur umfasst einen Sammelbehälter für ein Fluid; eine Leitung, um das Fluid zu einem Anschluss zu transportieren; wobei der Anschluss so angeordnet ist, um die Probe anzuziehen und um ein Fluid durch ihn zu pumpen; ein Mittel, um mindestens einen Teil der Probe zum Anschluss zu ziehen; ein Mittel, um die Flüssigkeit durch den Anschluss zu pumpen; einen ersten Abschnitt mit VerbindungsMitteln für eine Kassette, die mindestens ein Kapillarröhrchen hält, so dass ein Ende des Kapillarröhrchens in Fluidverbindung mit dem Anschluss steht; einen zweiten Abschnitt mit Mitteln zum Halten eines Behälters, der mindestens eine Kammer aufweist, um mit dem anderen Ende des Kapillarröhrchens in Kontakt zu treten, wobei der zweite Abschnitt auch Mittel aufweist, um ein wechselndes magnetisches Feld zu erzeugen, so dass ein innerhalb der Kammer des Behälters gehaltenes magnetisierbares, metallisches Objekt ausreichend bewegt wird, um eine Probe umzurühren, wenn sie in der Kammer platziert wird; Mittel zum Halten der Kassette und des Kapillarröhrchens, damit das Kapillarröhrchen mit einem Mittel zur Signalerzeugung in Kontakt treten kann; das Mittel zur Signalerzeugung und ein Mittel zur Signaldetektion, dass so angeordnet ist, um ein vom Kapillarröhrchen emittiertes Signal als Ergebnis des in Kontakt tretens mit dem Signal vom Mittel zur Signalerzeugung zu detektieren.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination einer Kassette, die mindestens ein Kapillarröhrchen hält. Die Kombination umfasst ein Kapillarröhrchen, das mindestens auf einem Teil seiner inneren Oberfläche mit einem Substrat beschichtet ist, das ein fluoreszierend markiertes Konjugat binden kann, und einen Rahmen, der ein Mittel zur Ausrichtung des Kapillarröhrchens in einem frei gelegten Bereich des Rahmens umfasst, wobei der frei gelegte Bereich das in Kontakt treten mindestens eines Teils des beschichteten Kapillarröhrchens mit einem externen elektromagnetischen Signal, das die Fluoreszenz des gebundenen fluoreszierend markierten Konjugates auslösen kann, ermöglicht.
Außerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegt ein Kapillarröhrchen, das ein Substrat auf mindestens einem Teil seiner inneren Oberfläche umfasst, wobei das Substrat an ein fluoreszierend markiertes Konjugat gebunden werden kann.
Außerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegt ein Verfahren zur Herstellung eines Glaskapillarröhrchens für die Verwendung in einem Fluoreszenz-Immunoassay. Das Verfahren umfasst das Beschichten mindestens eines Teils der inneren Oberfläche des Kapillarröhrchens mit einem Substrat, das an ein fluoreszierend markiertes Konjugat binden kann.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist eine perspektivische Darstellung, welche das Zusammenwirken zwischen einer Kassette, die Kapillarröhrchen enthält, und einem Probenbehälter und einer Kassetten-Halter-Kombination während des Gebrauchs darstellt.
2 ist eine perspektivische Darstellung, welche das Zusammenwirken zwischen dem Probenbehälter und der Kassette bei der Lagerung darstellt.
3a ist eine perspektivische Darstellung der Vorderseite der vollständig zusammengesetzten Kassette einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die Designelemente und die in ihr gehaltenen Kapillarröhrchen zeigt.
3b ist eine perspektivische Darstellung der Rückseite der vollständig zusammengesetzten Kassette einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die Designelemente und die in ihr gehaltenen Kapillarröhrchen darstellt.
3c ist eine perspektivische Darstellung der Rückseite der vollständig zusammengesetzten Kassette einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die Designelemente und die in ihr gehaltenen Kapillarröhrchen darstellt und die insbesondere die distalen Abschnitte von Durchgängen zum Halten der Kapillarröhrchen darstellt.
3d ist eine Aufsicht auf die Vorderseite der vollständig zusammengesetzten Kassette einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die Designelemente und die in ihr gehaltenen Kapillarröhrchen darstellt.
3e ist eine Aufsicht auf die Rückseite der vollständig zusammengesetzten Kassette einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die Designelemente und die in ihr gehaltenen Kapillarröhrchen darstellt.
3f ist eine Ansicht von oben oder vom proximalen Ende der vollständig zusammengesetzten Kassette einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, welche Designelemente und insbesondere Details des Designs von der Oberseite des Aufsatzes, der ein Bauteil der Kassette bildet, darstellt.
3g ist ein Blick auf die Unterseite oder das distale Ende der vollständig zusammengesetzten Kassette einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, welche Designelemente und die in ihr gehaltenen Kapillarröhrchen darstellt.
3h ist eine Seitenansicht der vollständig zusammengesetzten Kassette einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, welche die Designelemente und die in ihr gehaltenen Kapillarröhrchen darstellt.
4 ist eine Explosionsansicht der zahlreichen Beuteile, welche das Zusammenwirken der Elemente untereinander darstellt.
5 ist eine perspektivische Darstellung, welche die distale Ausrichtung der Rückseite des Rahmens darstellt, der einen Teil einer bevorzugten Ausführungsform der Kassette der Erfindung bildet.
6 ist eine perspektivische Darstellung, welche die proximale Ausrichtung der Rückseite des Rahmens darstellt, der einen Teil einer bevorzugten Ausführungsform der Kassette der Erfindung bildet.
7 ist eine Explosionsansicht der Oberseite des Halters, der einen Teil einer bevorzugten Ausführungsform der Kassette der Erfindung bildet, welche das Zusammenwirken zwischen einer Fassung und einem Aufsatz darstellt.
8 ist eine Explosionsansicht der Unterseite des Halters, der eine Komponente einer bevorzugten Ausführungsform der Kassette der Erfindung bildet, welche das Zusammenwirken zwischen der Fassung und dem Aufsatz darstellt.
9 ist eine perspektivische Darstellung eines Probenbehälters, welche Probenkammern, einen Sammelbehälter und ein Kassettenlagerungsfach darstellt.
10 ist eine perspektivische Darstellung eines Probenbehälters, welche die zahlreichen Komponenten des Kassettenlagerungsfaches darstellt.
11 ist eine perspektivische Darstellung einer alternativen Ausführungsform des Probenbehälters.
12 ist eine perspektivische Darstellung einer Apparatur zur Verwendung mit bevorzugten Ausführungsformen der Vorrichtungen zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten, welche insbesondere die relative Position des Probenbehälters und der Kassette darstellt.
13 ist eine transparente Darstellung einer in 12 dargestellten bevorzugten Ausführungsform, die entscheidende interne Komponenten darstellt.
14a ist ein Blockdiagramm der Apparatur, welches das Zusammenwirken der verschiedenen elektronischen Teile untereinander darstellt.
14b ist ein 14a entsprechendes Blockdiagramm einer bevorzugten Ausführungsform der Apparatur, das dem Durchschnittsfachmann die auf diesem Gebiet bekannten Komponentenbezeichnungen aufzeigt.
15 ist ein vereinfachtes Schema des Festphasen-Fluoreszenz-Immunoassay (SPFIA)-Prinzips, welches das Beschichten mit einem Bindungspartner zum Einfangen anwendet, das ein Antigen in einem kompetitiven Fluoreszenz-Immunoassay umfasst.
16a ist eine charakteristische grafische Darstellung der Konzentration in Teilen pro Millionen gegen die genormte Fluoreszenz für Kalibrationsstandards, die bekannte Mengen an Penicillin G umfasst.
16b ist eine charakteristische grafische Darstellung der Konzentration in Teilen pro Millionen gegen die genormte Fluoreszenz für Kalibrierungsstandards, die bekannte Mengen von Amoxicillin umfasst.
16c ist eine charakteristische grafische Darstellung der Konzentration in Teilen pro Millionen gegen die genormte Fluoreszenz für Kalibrationsstandards, die bekannte Mengen an Ampicillin umfasst.
16d ist eine charakteristisch grafische Darstellung der Konzentration in Teilen pro Millionen gegen die genormte Fluoreszenz für Kalibrationsstandards, die bekannte Mengen von Cloxacillin umfasst.
17a ist eine charakteristische grafische Darstellung der Konzentration in Teilen pro Millionen gegen die genormte Fluoreszenz für Kalibrationsstandards, die bekannte Mengen an Cephapirin umfasst.
17b ist eine charakteristische grafische Darstellung der Konzentration in Teilen pro Millionen gegen die genormte Fluoreszenz für Kalibrationsstandards, die bekannte Mengen an Ceftiofur umfasst.
Genaue Darstellung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen
Definitionen
Die folgenden Definitionen werden vorgestellt, um dabei zu helfen, die Offenbarung und die Ansprüche dieser Anmeldung zu interpretieren.
Menge: Der Begriff Menge, wie er hier verwendet wird, betrifft die Konzentration oder Menge eines Analyten in einer Probe, entweder relativ oder absolut.
Antikörper: Der Begriff Antikörper, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Protein, das ein bestimmtes Epitop auf seinem homologen Antigen erkennt. Der Antikörper kann ein Bindungspartner zum Einfangen eines Substrates sein, der die Oberfläche eines Kapillarröhrchens umfasst, oder er kann ein Rest eines Konjugates mit einem gebundenen Fluoreszenzmarker sein. Ein Antikörper kann ein polyklonaler Antikörper, ein monoklonaler Antikörper oder ein genetisch erzeugtes Molekül sein, das den entsprechenden Partner eines spezifischen Bindungspaares binden kann.
Antigen: Der Begriff Antigen, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jede Substanz, die, wie es hier definiert wird, spezifisch an einen Antikörper bindet. Ein Antigen kann ein Bindungspartner zum Einfangen eines Substrates sein, das die Oberfläche eines Kapillarröhrchens umfasst, oder es kann der Rest eines Konjugates mit einem gebundenen Fluoreszenzmarker sein oder es kann einen Analyten umfassen.
Analyt: Der Begriff Analyt, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jede Substanz oder chemischen Bestandteil einer Probe, der analysiert wird. Durch ein Immunoassay detektierbare Analyten können jeder Analyt sein, der einen spezifischen Bindungspaarpartner erkennen und binden kann. Ein Analyt kann einer der Bindungspartner eines homologen Antikörper-Antigenbindungspaares sein, das heißt, der Analyt kann einen Antikörper oder ein Antigen in einem Immunoassay umfassen.
Kapillarröhrchen: Ein Kapillarröhrchen, wie es hier verwendet wird, hat ein großes Verhältnis von Oberflächen zu Volumen. Ein Kapillarröhrchen kann jede geeignete Form aufweisen, wobei der horizontale Querschnitt der Innenwände durch einen Zylinder, ein Oval, ein Quadrat, ein Rechteck oder jedes geeignete Polygon definiert werden kann, und Abmessungen haben, die, wie im Folgenden beschrieben wird, für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind.
Konjugat: Der Begriff Konjugat, wie er hier verwendet wird, betrifft eine Verbindung, die zwei Substanzen umfasst, wobei eine der Substanzen an die andere gekoppelt ist. Zum Beispiel kann ein erstes Konjugat an eine dritte Substanz gekoppelt werden, um ein zweites Konjugat herzustellen, das ein erstes Konjugat und eine dritte Substanz umfasst, oder ein erstes Konjugat kann an ein zweites Konjugat gekoppelt werden, um ein drittes Konjugat herzustellen, das zwei Konjugate umfasst. Die Kopplung kann kovalent oder nicht-kovalent sein.
Fluoreszenzmarker: Der Begriff Fluoreszenzmarker, wie er hier verwendet wird, betrifft eine Substanz, die, wenn sie durch ein geeignetes elektromagnetisches Signal oder Strahlung stimuliert wird, die Strahlung absorbieren und ein Signal emittiert, das nur solange bestehen bleibt, wie die stimulierende Strahlung andauert, d. h. es fluoresziert.
Fluorometer: Der Begriff Fluorometer, wie er hier verwendet wird, betrifft ein Instrument zum Messen der Fluoreszenz. Für gewöhnlich umfasst es ein Mittel zur Signalerzeugung (d. h. eine Quelle für elektromagnetische Strahlung einer geeigneten Wellenlänge, um die Fluoreszenz eines Fluoreszenzmarkers auszulösen), ein Mittel zur Signaldetektion, das einen Fluoreszenzdetektor und einen geeigneten Filter oder mehrere Filter umfasst.
Immunoassay: Der Begriff Immunoassay, wie er hier verwendet wird, betrifft eine Technik, welche Gebrauch macht von der spezifischen Bindung zwischen einem Antigen und seinem homologen Antikörper, sowohl polyklonal als auch monoklonal, um eine Analyse nach einem Analyten in einer Probe durchzuführen. Wenn das Immunoassay die Verwendung eines Fluoreszenzmarkers umfasst, der, wenn er durch ein geeignetes elektromagnetisches Signal angeregt wird, detektiert werden kann, ist das Immunoassay ein Fluoreszenz-Immunoassay oder FIA.
Reagenz: Der Begriff Reagenz, wie er hier verwendet wird, betrifft eine Substanz, die an einer chemischen Reaktion oder physikalischen Wechselwirkung beteiligt ist. Ein Reagenz kann einen aktiven Bestandteil umfassen, d. h. einen Bestandteil, der direkt an einer chemischen Reaktion (z. B. kovalente Bindung) oder physikalischen Wechselwirkungen (z. B. nicht-kovalente Bindung) beteiligt ist, wie z. B. ein fluoreszierend markiertes Konjugat und andere Materialien oder Verbindungen, die direkt oder indirekt an der chemischen Reaktion oder physikalischen Wechselwirkung beteiligt sind. Es kann einen gegenüber der chemischen Reaktion oder der physikalischen Wechselwirkung inerten Bestandteil beinhalten, wie z. B. Katalysatoren, Stabilisatoren, Puffer und ähnliches.
Spezifische Bindung: Spezifische Bindung, wie im Folgenden verwendet, bezieht sich auf die chemische Erkennung zwischen zwei Substanzen, welche die Kopplung dieser Substanzen zum Ergebnis hat. Diese Kopplung kann beinhalten, ist jedoch nicht begrenzt auf eine kovalente oder eine nicht-kovalente Wechselwirkung. Zum Beispiel besitzt die spezifische Bindung zwischen einem Antigen und seinem entsprechendem Antikörper eine größere Affinität als die nicht-spezifische Bindung jedes spezifischen Bindungspartners mit einer nicht entsprechenden Substanz.
Spezifisches Bindungspaar: Spezifisches Bindungspaar, wie es hier verwendet wird, betrifft zwei Substanzen, die spezifisch miteinander binden.
Spezifischer Bindungspaarpartner: Spezifischer Bindungspaarpartner, wie hier verwendet, betrifft einen Partner eines spezifischen Bindungspaares. Zum Beispiel ein Konjugat, ein Hapten, ein Antigen oder ein Antikörper können ein spezifischer Bindungspaarpartner sein.
Substrat: Der Begriff Substrat, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Material, das an ein anderes Material gebunden wird oder angelagert werden kann. Dieses Material ist für gewöhnlich die Oberfläche eines Materials (z. B. die innere Oberfläche eines Kapillarröhrchens), ein Feststoff auf einer Oberfläche oder ein erster Feststoff auf einem zweiten Feststoff. Für gewöhnlich kann ein Substrat einen Bindungspartner zum Einfangen eines Bindungspartnerpaares umfassen, das an einen zweiten Partner des Bindungspaares binden kann. Zum Beispiel kann ein Substrat ein Antikörper-Konjugat mit einer Substanz sein, die an die innere Oberfläche einer Kapillarwand bindet, wobei der Antikörper als ein Bindungspartner zum Einfangen eines Bindungspaares betrachtet würde. Das entsprechende Antigen-Konjugat, das mit einem fluoreszierenden Marker konjugiert ist, würde der zweite Bindungspartner sein.
Einleitung
In einem breitem Aspekt stellt diese Erfindung eine Kassette (1) zum sicheren Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen (2) bereit, wobei die Kassette (1) einen Rahmen (4) zum Halten der Röhrchen (2) in einer beabstandeten Weise, wobei der Rahmen (4) einen Kanal aufweist, in dem jedes Kapillarröhrchen (2) ausgerichtet werden kann; und zumindest einen Bereich (7) im Rahmen (4), um zumindest einen Teil jedes Kapillarröhrchens (2) frei zu legen, so dass ein elektromagnetisches Signal mit einem Teil jedes Röhrchens (2) in Kontakt treten kann; ein Halter (5), der in Bezug auf den Rahmen für das abdichtende Halten eines Endes jedes Kapillarröhrchens (2) angeordnet ist, wobei der Halter (5) einen entsprechenden Durchgang für jedes Kapillarröhrchen (2) und einen Anschluss (54) für jeden Durchgang aufweist, um ein Fluid passend durch den Anschluss (54) zu pumpen, umfasst; wobei der Halter (5) auch eine Kammer in Fluidverbindung mit jedem Durchgang jedes Kapillarröhrchens (2) und mit einem Einzelanschluss (54) verbunden aufweist; und wobei der Halter (5) durch einen Aufsatz (36) und eine Fassung (35) zum abdichtenden Halten eines Endes jedes Kapillarröhrchens (2) derart definiert ist, dass der Aufsatz (36) in Verbindung mit der Fassung (35) die Kammer definiert, die (a) jeden der Kapillarröhrchendurchgänge in der Fassung (35) miteinander in Fluidverbindung verbindet, und (b) zum Einzelanschluss (54) zum Verbinden mit einer Fluidquelle zum Pumpen eines Fluids durch jedes Kapillarröhrchen zum Einzelanschluss (54) führt.
Das Immunoassay ist zum Nachweisen von Analyten in zahlreichen Branchen verwendbar, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf die Gesundheitsvorsorge, die Lebensmittelverarbeitung, die Chemie, die Umweltüberwachung und ähnliches. Daher beinhalten die Arten von Proben verschiedene Fluids, die vermutlich einen Zielanalyten, wie z. B. Blut, Plasma, Urin, Speichel und ähnliches; Lebensmittelprodukte, wie z. B. Milch, Wein, Bier und ähnliches; chemische Flüssigkeiten, Abwasserströme von chemischen Unternehmen, Flüssen und ähnliches, enthalten. Unter gewissen Umständen kann es erforderlich sein, die Proben vor dem Immunoassay vorzubehandeln. Wenn die Probe am Anfang komplex, fest oder viskos ist, kann es erforderlich sein, sie zu extrahieren, zu lösen oder zu verdünnen, um eine Probe mit den geeigneten Charakteristika für die Verwendung in einem Immunoassay zu erhalten. Des Weiteren sollte die Probe so sein, dass die in ihr gebildeten Komplexe zum binden im entsprechenden Immunoassay stabil sind. Bindungskomplexe des entsprechenden Immunoassays werden für gewöhnlich bei pH-Werten, die im Bereich von etwa 5 bis etwa 9 liegen, stabil sein. Der pH-Wert der Probe kann, wenn notwendig, durch Verdünnen mit einem geeigneten Puffer eingestellt werden, so dass er bei etwa 7 liegt.
Eine große Auswahl an Analyten kann mittels des entsprechenden Verfahrens detektiert werden. Nachweisbare Analyten können alle Analyten sein, die durch einen spezifischen Bindungspaarpartner erkannt und gebunden werden können. Der Analyt kann ein Antigen und ein Antigenrezeptor (z. B. ein Antikörper) oder ein Hapten sein. Entsprechende Analyten beinhalten natürlich auftretende und synthetische kleine organische Verbindungen, Proteine, Saccharide, Nukleinsäuren und ähnliches. Beispielhafte Analyten schließen Verbindungen ein, die bei der Aufzucht von domestizierten Tieren (z. B. Antibiotika und Nahrungsmittelergänzungsstoffe), als Nahrungsmittelzusatzstoffe, als natürlich auftretende Kontaminanten, als Farbstoffe, als Mikroorganismen und ihre Toxine und ähnliches, verwendet werden. Andere Analyten schließen physiologisch aktive Verbindungen, in physiologischen Flüssigkeiten gefundene Pathogenmarker, Toxine, Oberflächenmembranproteine, Zytokine, Antikörper, humane Lymphozytenantigenproteine, Hormone, natürliche und synthetische Arzneimittel, Proteine von Bakterien, Pilzen und Viren und ähnliches ein. Andere Analyten schließen Verbindungen ein, die in der Umwelt gefunden werden, wie z. B. Pestizide, Herbizide, organische Bestandteile von Abwassereinleitungen und ähnliches.
Beispiele für im Immunoassay detektierbare spezifische Analyten schließen Verbindungen aus der Arzneimittelfamilie auf Sulfonamidbasis, wie z. B. Sulfamethazin, Sulfadimethozin, Sulfathiazol, Sulfachinoline und andere; Tetrazyklin, Gentamizin, Chloramphenicol, Aflatoxin, Digoxin und Salmonella mit ein. Weitere Analyten schließen Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Benzen, Toluen, Ethylbenzen und Xylene mit ein.
Das Immunoassay ist insbesondere zum Detektieren von Analyten, wie z. B. Antibiotika in Milchproben, wertvoll und wird derzeit bevorzugt für diese Verbindungen verwendet. Antibiotika werden Kühen zur Prävention und Behandlung von Infektionen, wie z. B. Mastitis, verabreicht und um das Wachstum der Tiere und die Milchproduktion zu steigern. Antibiotika werden in dem Bestreben ein erkranktes Tier schnell in die produzierende Herde zurückzubringen durch fehlende Auszeichnung und illegale Verabreichung missbraucht.
Für den Zweck des Erhalts einer sicheren und gesunden Nahrungszufuhr ist es wichtig, die Existenz von Antibiotikaresten in Milch und Milchprodukten zu identifizieren, überwachen und minimieren. Da Milch und Milchprodukte überall konsumiert werden, sollten Antibiotikarückstände aus verschiedenen Gründen vermieden werden: (i) Einige Antibiotikarückstände können allergische Reaktionen bei empfindlichen Konsumenten (ca. 5 bis 10% der Bevölkerung ist überempfindlich gegenüber Penicillin und anderen Antibiotika) verursachen, (ii) kleine Konzentrationen von Antibiotikarückständen können bei der Selektion von resistenten Stämmen an Pathogenen helfen, die schädlich für Menschen sind und (iii) Antibiotikarückstände können mit Starterkulturen wechselwirken, die bei der Herstellung von prozessierten Milchprodukten, wie z. B. Käse und Joghurt, verwendet werden. In Folge dessen hat die Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimitteln (US FDA) der Vereinigten Staaten Sicherheits/Toleranzniveaus für Antibiotikarückstände in Milch und Milchprodukten, wie in Tabelle I dargestellt, festgelegt.
Die Antibiotika, die am häufigsten an säugende Kühe verabreicht werden und somit solche Antibiotika, die für gewöhnlich als Kontaminanten in Milch und Milchprodukten gefunden werden, stammen aus der β-Lactam Gruppe (Penicillin G, Ampicillin, Cloxacillin, Cephapirin, Ceftiofur und Amoxicillin). Die Strukturen dieser Verbindungen sind beim Nachschlagen im „Merck Index" – 11. Ausgabe, zu finden.
Tabelle I. U.S.F.D.A. Sicherheit/Toleranzniveaus für β-Lactamwirkstoffe in Milch
Die Immunoassays
Abhängig von der Art des zu detektierenden Analyten können unterschiedliche Immunoassay-Formate eingesetzt werden. Ein bestimmtes Immunoassay-Format kann abhängig von der Art des Analyten, der Art der Probe und ähnlichem, modifiziert werden. Für gewöhnlich basieren die im vorliegenden Verfahren verwendbaren Immunoassays auf der Bildung von Komplexen zwischen spezifischen Bindungspaarpartnern. Ein Substrat, das einen ersten Bindungspaarpartner umfasst, wird jedem Immunoassay, das in dem vorliegenden Verfahren verwendet wird, gemein sein. Das Immunoassay verwendet auch einen zweiten Bindungspaarpartner, der ein fluoreszierend markiertes Konjugat umfasst, das an einen Analyten oder an beide, den ersten Bindungspaarpartner und einen Analyten, koppeln kann. In der ganzen Beschreibung wird der Begriff „Einfangen" zusammen mit Bindungspartner oder spezifischem Bindungspaarpartner verwendet. Es bezieht sich auf einen spezifischen Bindungspaarpartner, der ein Substrat auf der inneren Oberfläche eines Kapillarröhrchens umfasst, obwohl es nicht auf diese Verwendung begrenzt ist, wenn an anderer Stelle darauf hingewiesen wird.
Sowohl Sandwich als auch kompetitive Immunoassay-Formate können in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden. Das jeweilig verwendete Immunoassay-Format hängt von den jeweiligen Analytcharakteristika, den Probencharakteristika, den verfügbaren Reagenzien und ähnlichem ab.
In einem Sandwich-Immunoassay wird ein fluoreszierend markiertes Konjugat verwendet, dass ein spezifischer Bindungspartner ist, wobei das fluoreszierend markierte Konjugat den Analyten an einer Stelle bindet, die eine andere ist als die, an die der andere Bindungspartner, der sich auf der inneren Oberfläche des Kapillarröhrchens befindet, bindet. Das fluoreszierend markierte Konjugat wird mit einer Probe vermengt und die sich daraus ergebende Mischung wird in das Kapillarröhrchen aufgezogen. Der Analyt wird an das fluoreszierend markierte Konjugat und an den anderen Rest des Bindungspartners des Substrates binden, damit die Menge an gebundenem Fluoreszenzmarker an der Kapillarröhrchenwand direkt proportional zur Menge des vorhandenen Analyten sein wird.
Bei einer Art eines kompetitiven Immunoassays bindet ein fluoreszierend markierter Konjugat-Bindungspartner über ein auf dem Substrat vorhandenes Analogon des Analyten direkt an den Analyten oder das Substrat. Folglich „konkurrieren" der Analyt und das Substrat um die Bindung mit dem fluoreszierend markierten Konjugat-Bindungspartner. In diesem Format hat sowohl das Substrat als auch der Analyt einen Bindungsbereich (auch bezeichnet als ein epitopischer Bereich), der mit dem fluoreszierend markierten Konjugat-Bindungspartner bindet. Der Rest des Substrates kann ein Ligand, ein Antikörper oder ein bindendes Fragment davon sein, üblicherweise analog zu einem epitopischen Bereich des Analyten. Hier ist die Menge des an die Innenwand des Kapillarröhrchens gebundenen Fluoreszenzmarkers umgekehrt proportional zur Menge des vorhandenen Analyten.
Bei einer anderen Art eines kompetitiven Immunoassays konkurriert ein fluoreszierend markiertes Konjugat mit dem Analyten um Bindungsstellen des Bindungspartners zum Einfangen des Substrats. Bei diesem Format kann der Bindungspartner zum Einfangen einen Antikörper umfassen, wobei sowohl der Analyt als auch das fluoreszierend markierte Konjugat homologe Antigen-Bindungspartner umfassen. Bei Abwesenheit des Analyten wird das fluoreszierend markierte Konjugat nicht in Konkurrenz um Bindungsstellen auf dem Bindungspartner zum Einfangen des Substrates treten. Daher ist die Menge des fluoreszierenden Markers, der an die Innenwand des Kapillarröhrchens gebunden ist, umgekehrt proportional zur Menge des vorliegenden Analyten.
Mit Blick darauf wird deutlich, dass ein Aspekt außerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten in einer Probe ist, wobei das Verfahren das Einbringen einer Fluidmischung in ein Kapillarröhrchen umfasst, das ein Substrat aufweist, das einen Bindungspartner zum Einfangen umfasst, wobei die Fluidmischung eine vermutlich den Analyten enthaltende Probe und ein Reagenz umfasst, das ein fluoreszierend markiertes Konjugat umfasst, das (a) an den Analyten oder an den Analyten, wenn dieser durch den Bindungspartner zum Einfangen gebunden ist, und an das Substrat binden kann; (b) fluoreszieren kann, wenn es mit einem geeigneten elektromagnetischen Signal bestrahlt wird. Das Verfahren umfasst weiter das Behalten der Fluidmischung im Kapillarröhrchen für einen Zeitraum, der ausreichend ist, damit die Bindung zwischen dem Substrat und dem fluoreszierend markierten Konjugat stattfinden kann; das Entfernen der überschüssigen Flüssigkeitsmischung aus dem Kapillarröhrchen; das Bestrahlen des beschichteten Bereichs des Kapillarröhrchens von außerhalb mit einem elektromagnetischen Signal, das ausreichend ist, um eine Fluoreszenz des gebundenen fluoreszierend markierten Konjugates auszulösen; und das Detektieren der sich daraus ergebenden Fluoreszenz zum Nachweisen des Analyten.
In einem kompetitiven Immunoassay ist ein besonders geeignetes Protokoll eines, in dem ein fluoreszierend markiertes Konjugat zuerst mit einer vermutlich den Analyten enthaltenden flüssigen Probe vermengt wird, um eine im wesentlichen homogene Mischung bereitzustellen, und dann die Probe in das Kapillarröhrchen aufgenommen wird. Das fluoreszierend markierte Konjugat kann ein Feststoff oder bevorzugt eine gepufferte Lösung sein und kann, soweit angemessen, zum Verdünnen der Probe dienen und den geeigneten pH bereitstellen.
Sobald die vermutlich den Analyten enthaltende Probe mit dem geeigneten fluoreszierend markierten Konjugat vermengt worden ist, wird die sich daraus ergebende Mischung in den Innenraum des Kapillarröhrchens, das im Inneren mit einem geeigneten Rest eines Bindungspaarpartners zum Einfangen eines Substrates, das für den gesuchten Analyten geeignet ist, eingebracht. Bevorzugt wird eine Probe durch Kapillarkraft eingebracht, obwohl auch eine externe Kraft, wie z. B. durch Ansaugen oder Überdruck, eingesetzt werden kann. In dem Beispiel, auf das oben Bezug genommen wird, ist ein Antibiotikum in Milch, ein Antigen-Analogon eines entsprechenden Antibiotikas, auf der inneren Oberfläche des Kapillarröhrchens gebunden. Die gesamte innere Oberfläche oder ein Teil davon kann beschichtet sein. Jedoch muss die Oberfläche ausreichend beschichtet sein, damit eine Bindungsreaktion zwischen dem fluoreszierend markierten Konjugat und dem Rest des Bindungspartners zum Einfangen des Substrates stattfinden kann, so dass das Kapillarröhrchen durch Bestrahlen und Detektieren der sich daraus ergebenden Fluoreszenz ausgelesen werden kann. Üblicherweise werden in das Kapillarröhrchen eingebrachte Probenvolumen in einem Bereich von etwa 2 bis etwa 20 μl, üblicherweise etwa 5 bis etwa 15 μl, noch üblicher etwa 5 bis etwa 10 μl, liegen.
Nachdem die Probenmenge in das Kapillarröhrchen eingebracht worden ist, wird die Probe über einen Zeitraum, der hinreichend ist, damit die Bindung stattfinden kann, inkubiert, d. h. um Komplexe zwischen Partnern von spezifischen Bindungspaaren, z. B. ein fluoreszierend markierter Konjugat-Bindungspartner und dem das gebundene Antigen umfassende Substrat, auszubilden. Der Inkubationsschritt wird üblicherweise bei Raumtemperatur stattfinden, obwohl Temperaturen im Bereich von etwa 10°C bis etwa 50°C verwendet werden können. Inkubationszeiten werden üblicherweise im Bereich von etwa 0.5 bis etwa 5 Minuten, üblicherweise etwa 0.5 bis etwa 3 Minuten und noch üblicher etwa 2 Minuten liegen. Die zum Einbringen einer Waschlösung in das Kapillarröhrchen benötigte Zeit wird häufig für die Inkubation ausreichen.
Zum Durchführen des Immunoassays werden die vorliegenden Verfahren größten Teils einzig und allein von dem Kapillarröhrchen und dem fluoreszierend markierten Konjugat abhängen. Doch können in einigen Situationen komplexere Protokolle verwendet werden. Zum Beispiel kann man anstatt des direkt markierten Konjugat-Bindungspartners den Bindungspartner indirekt markieren. Wenn der Bindungspartner ein Antikörper ist, kann man einen Fluoreszenz-markierten anti-Antikörper verwenden, um ein universelles Fluoreszenzreagenz zu haben. Es kann sich eine Situation ergeben, in der man sowohl ein fluoreszierend markiertes Konjugat als auch seinen reziproken Bindungspartner zugibt, wobei das Konjugat mit dem Analyten um den reziproken Bindungspartner konkurriert. Das Kapillarröhrchen kann einen Bindungspartner zum Einfangen umfassen, welcher den reziproken Bindungspartner einfängt. Zum Beispiel kann der reziproke Bindungspartner ein Antikörper sein und das Kapillarröhrchen kann mit Protein A oder G beschichtet sein, um alle Antikörper einzufangen.
Nach einem Inkubationsschritt wird jedes fluoreszierend markierte Konjugat, das frei im Medium vorliegt, bevorzugt aus dem Kapillarröhrchen entfernt. Das Entfernen von ungebundenem fluoreszierend markierten Konjugat wird in geeigneter Weise durch Einbringen einer Waschflüssigkeit, die ungebundenes fluoreszierend markiertes Konjugat aus dem Kapillarröhrchen verdrängt, durchgeführt. Eine Vielzahl von Waschflüssigkeiten können für den Waschschritt ihre Anwendung finden. Der pH der Waschflüssigkeit wird ein pH sein, bei dem die Bindungspaarkomplexe stabil sind. Für gewöhnlich wird der pH im Bereich von 5 bis 9, üblicherweise 6 bis 8 und noch üblicher bei etwa 7 liegen. Abhängig von der Art des Fluoreszenzmarkers des Konjugates können Waschlösungen eingesetzt werden, welche die Fluoreszenz des Konjugatmarkers erhöhen. Zum Beispiel kann die Fluoreszenz eines bestimmten Fluoreszenzmarkers in einer leicht alkalischen oder basischen Lösung erhöht werden. In einem solchen Fall kann ein Puffer mit einem pH über 7, für gewöhnlich jedoch kleiner als 9, eingesetzt werden. Als Beispiel umfassen Waschflüssigkeiten Wasser, Puffer, wie z. B. Phosphat, Phosphat-gepufferte Salzlösungen (PBS), Salzlösung, Carbonatpuffer und ähnliche. Die Waschflüssigkeit kann in das Kapillarröhrchen unter Verwendung jedes geeigneten Mittels eingebracht werden. Für gewöhnlich wird die Waschflüssigkeit unter Verwendung der gleichen Mittel in das Kapillarröhrchen eingebracht wie die Mittel, die für das Einbringen der Probe verwendet werden. Die Waschlösung kann mehrmals aufgenommen werden, üblicherweise nicht häufiger als etwa 6 mal, noch üblicher nicht mehr als etwa 2 mal, oder die Waschlösung kann durch das Kapillarröhrchen unter Verwendung einer Spritze, Pumpe oder einer anderen Vorrichtung gezwungen werden.
Nach dem Waschschritt, in dem das ungebundene markierte Konjugat aus den Kapillarröhrchen gewaschen wird, wird die Anwesenheit des fluoreszierend markierten Konjugates, das an den Bindungspartner zum Einfangen auf dem Substrat auf der Kapillarröhrchenoberfläche gebunden bleibt, in einem Detektionsschritt detektiert. Der Detektionsschritt kann direkt nach dem Waschschritt durchgeführt werden oder kann, wenn notwendig, für einen bestimmten Zeitraum verzögert werden. Obwohl der Detektionsschritt mit Waschflüssigkeit im Kapillarröhrchen durchgeführt werden kann, kann das Kapillarröhrchen bevorzugt vor dem Detektionschritt getrocknet werden, um die Möglichkeit der Interferenz im darauffolgenden Detektionsschritt zu minimieren. Der Trocknungsschritt kann durch ein geeignetes Mittel, wie z. B. Zentrifugieren, Lufttrocknen, Vakuumtrocknen und ähnlichem ausgeführt werden. Bevorzugte Techniken werden im Folgenden diskutiert. Wenn der Detektionsschritt verzögert wird, kann das Kapillarröhrchen für einen angemessenen Zeitraum unter Umgebungs- oder verringerten Temperaturbedingungen gelagert werden.
Viele verschiedene Fluoreszenzmarker können in den vorliegenden Immunoassays verwendet werden. Geeignete Fluoreszenzmarker sollten zur Konjugation mit Antigenen, Haptenen oder Antikörpern in der Lage sein, um in den fluoreszierend markierten Konjugat verwendet zu werden. Die Auswahl des Fluoreszenzmarkers basiert auf einem Vorteil bei der Synthese, dem Emmissionsmaximum, der Quantumeffizienz, der Stabilität unter den Assaybedingungen und ähnlichem, jedoch ist der Fluoreszenzmarker für die Erfindung nicht entscheidend, solange es eine minimale Quantenausbeute gibt, um die erwünschte Empfindlichkeit bereit zu stellen. Eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Fluoreszenzmarkern kann verwendet werden. Beispielhafte Fluoreszenzmarker zur Veranschaulichung schließen Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, Texas Red, Phycoerythrin, Cy-5^® und Allophycoerythrin und insbesondere Fluoreszenzmarker, die über etwa 550 nm fluoreszieren, noch bevorzugter Fluoreszenzmarker, die über 600 nm fluoreszieren und Licht bei einer Absorption über 500 nm wirksam absorbieren; noch bevorzugter 650 nm wie z. B. Cy-5^®, ein. Die Fluoreszenzmarker können mittels jedes geeigneten Verfahrens konjugiert werden, um das fluoreszierend markierte Konjugat zu bilden. Siehe z. B. Harlow & Lane, Antibodies (1988), S. 353–358.
Wenn die fluoreszierend markierten Konjugate verwendet werden, wird die Detektion durchgeführt, indem zuerst ein Bereich des Kapillarröhrchens, das den Detektionsbereich umfasst, bestrahlt wird und dann dass sich daraus ergebende emittierte Fluoreszenzsignal gemessen wird. Jedes geeignete Mittel zur Bestrahlung kann zur Bereitstellung der geeigneten Wellenlänge verwendet werden. Beispielhafte Mittel zur Bestrahlung schließen Laser, Licht emittierende Dioden, Wolframlampen und ähnliches ein. Die Wellenlänge des von Mittel zur Stimulation verwendeten Lichts wird vom einzelnen Fluoreszenzmarker abhängen. Für gewöhnlich werden die Wellenlängen des Bestrahlungslichtes im Bereich von 300 bis 900 nm, üblicherweise von etwa 350 bis 800 nm und noch üblicher von etwa 450 bis 800 nm liegen. Zum Beispiel wird die Wellenlänge des Bestrahlungslichtes etwa im Bereich von 630 bis 650 nm liegen, wenn Cy-5^® der Fluoreszenzmarker ist. Es wird die Fluoreszenz der fluoreszierend markierten Konjugate, die im Kapillarröhrchen vorhanden sind, gemessen. Das Messen des emittierten Signals wird durch Detektieren der emittierten Photonen im Detektionsbereich erfolgen. Mittel zum Messen der Fluoreszenz sind kommerziell erhältlich und jeder geeignete Fluoreszenzdetektor kann verwendet werden. Verschiedenartige Photodioden, Photomultiplier und ähnliches können verwendet werden, und in einigen Beispielen wird ein visueller Nachweis ausreichen, wenn ein fluoreszierend markiertes Konjugat verwendet wird, das im sichtbaren Spektrum fluoresziert.
Abhängig davon ob ein kompetitives oder Sandwich-Immunoassay verwendet wird, und die verwendeten Reagenzien, wird die Fluoreszenzintensität direkt oder umgekehrt proportional zur Menge an Analyten in der Probe sein. Wenn jemand an einem qualitativen Ergebnis oder einem semiquantitativen Ergebnis, wie zum Beispiel der Bestimmung, ob die Menge eines Analyten über einer vorbestimmten Grenze liegt gegen die Bestimmung der Konzentration des Analyten, interessiert ist, wird die Menge des fluoreszierend markierten Konjugates so ausgewählt, damit im Vergleich zur Abwesenheit des Analyten oder des Analyten unter dem vorbestimmten Wert ein klares Signal bereitgestellt wird. Daher kann eine Menge an Konjugat verwendet werden, die in Abwesenheit des Analyten im Detektionsbereich im Grunde nicht erscheinen wird und bei der niedrigsten Konzentration ein starkes Signal bereitstellen wird, das man bei einem Analyten in der Probe oder umgekehrt anzutreffen erwarten würde.
Zur Quantifizierung kann das sich ergebende elektrische Signal mittels geeigneter Hardware und Software genau gemessen werden. Der Bereich, in dem die Fluoreszenz gemessen wird, wird kontrolliert, um gleichmäßige Werte bereitzustellen. Es können Kontrollen verwendet werden, in denen das Signal zur Konzentration des Analyten bestimmt wird, so dass das Signal mit der Konzentration des Analyten in der Immunoassayprobe direkt in Zusammenhang gebracht werden kann. Auf diese Art und Weise kann sowohl die Anwesenheit als auch die Menge des Analyten in der Probe bestimmt werden.
Wie im Folgenden diskutiert, wird für gewöhnlich nur eine kleine Menge der Probe (weniger als etwa 1 ml) mit dem Konjugat vermengt. Wie im Folgenden noch im Detail diskutiert wird, wird dies bevorzugt in einer kleinen Kammer eines Probenbehälters unter Verwendung eines Mittels zum Umrühren durchgeführt. Es könnte wichtig sein, dass der Vermengungs- und Inkubationsschritt und der darauf folgende Inkubationsschritt im Verfahren zu dieser Erfindung für denselben begrenzten Zeitraum durchgeführt werden, um in einer Serie Schwankungen von Test zu Test zu minimieren. Daher kann es bevorzugt sein, die Verfahrensschritte zu automatisieren, um Fehler der Anwender im größt möglichen Umfang zu eliminieren. Dies wird im Detail in der folgenden Diskussion der in den Figuren dargestellten bevorzugten Vorrichtungen und Apparaturen diskutiert.
Daher kann aufgrund der vorhergehenden Diskussion gesagt werden, dass ein Festphasen-Fluoreszenz-Immunoassay (SPFIA) einen Vorteil aus der Spezifität einer Bindungspaaraffinität, z. B. Antikörper-Antigen-Erkennung, zieht und einen geeigneten Fluoreszenzmarker zur Detektion einbringt. 15 stellt das Prinzip des SPFIA dar. Eine Probe (z. B. Milch) wird mit einer bekannten Menge eines Fluoreszenz-markierten Antikörpers, der für einen Analyten spezifisch ist (z. B. ein β-Lactam-Antibiotikum) vermengt. Eine größtenteils unmittelbare Bindungsreaktion wird zwischen dem Antikörper und dem Analyten in der Probe auftreten. Ein Trägermaterial, z. B. die innere Wand eines Glaskapillarröhrchens, als Substrat, das ein Antigen analog zum daran gebundenen Analyten umfasst, wird dann gegenüber der Probe ausgesetzt. Sobald die Probe aus dem Kapillarröhrchen entfernt worden ist, wird das Kapillarröhrchen mit einem Fluorometer untersucht und die Fluoreszenz nachgewiesen. Im Beispiel zur Milch, das in 15 dargestellt ist, wird ein Substrat, das mit Milchproben inkubiert worden ist, die hohe Konzentrationen eines Antibiotikums aufweisen, weniger freie Fluoreszenz-markierte Antikörpermoleküle zum Reagieren mit dem Antigensubstrat aufweisen, wodurch sich niedrigere Fluoreszenzsignale ergeben. Umgekehrt werden Milchproben mit niedrigen Konzentrationen eines Antibiotikums mehr freie Antikörpermoleküle aufweisen, wodurch mehr Fluoreszenzkonjugate an das Substrat binden werden und sich höhere Fluoreszenzsignale ergeben werden. Mathematisch ist das gemessenen Fluoreszenzsignal umgekehrt proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe für diese kompetitiven Assays. In 15 ist der Analyt daher das Antibiotikum, und der Rest des Bindungspartners zum Einfangen des Substrates auf der inneren Kapillarröhrchenoberfläche ist ein Antigen (z. B. ein Analog des Analyten), das durch das Fluoreszenz-markierte Antikörperkonjugat gebunden wird.
Das Kapillarröhrchen und seine Herstellung
Ein wichtiger Aspekt ist das einzigartige Kapillarröhrchen, das zumindest auf einem Teil seiner inneren Oberfläche mit einem Substrat beschichtet ist, das dazu in der Lage ist, an ein fluoreszierend markiertes Konjugat zu binden. Eine große Vielzahl von Kapillarröhrchen, die für verschiedene Verwendungen entworfen worden sind, sind im Stand der Technik bekannt und sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Für gewöhnlich sind Kapillarröhrchen, die in dem vorliegendem Verfahren verwendet werden, aus einer Substanz hergestellt, die es Licht zur Bestrahlung oder Fluoreszenzemissionen ermöglicht, die Kapillarröhrchenwand zu überwinden. Daher muss das Signal die wand durchdringen, wenn ein elektromagnetisches Signal von einer externen Quelle mit der Kapillarröhrchenwand in Kontakt tritt. Die resultierende Fluoreszenz muss dann durch die Wand hindurch nach außen übertragen werden. Materialien, aus denen geeignete Kapillarröhrchen gebildet werden können, schließen Gläser, wie z. B. Weichgläser, Silikatgläser und Quarzglas ein. Andere Materialien schließen Kunststoffe, wie z. B. Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid (PVC) und ähnliche ein. Andere Materialien mögen dem Durchschnittsfachmann nach dem Lesen dieser Offenbarung ersichtlich werden. Eine derzeit bevorzugte Ausführungsform ist ein Borosilikat-Glaskapillarröhrchen, wie z. B. das, das bei Drummond Scientific aus Broomall in Pennsylvania erhältlich ist.
Kapillarröhrchen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können eine große Vielfalt an Formaten aufweisen, solange flüssige Medien wirksam durch Ansaugen oder Kapillarkraft aufgenommen werden können. Die Kapillarröhrchen können Querschnitte haben, die kreisförmig, quadratisch, rechteckig, oval oder ähnliches sind. Für gewöhnlich haben die Kapillarröhrchen kreisförmige Querschnitte. Die Innendurchmesser geeigneter Kapillarröhrchen können im Bereich von etwa 0.1 Mikrometer (μm) bis etwa 1 Millimeter (mm), üblicherweise etwa 0.3 μm bis etwa 1.0 mm und noch üblicher etwa 0.50 μm bis etwa 1 mm liegen, bevorzugt etwa 0.65 mm in einem Immunoassay für Milch. Der Außendurchmesser für ein geeignetes Kapillarröhrchen kann etwa 1.0 mm bis etwa 1.5 mm sein. Die Länge von geeigneten Kapillarröhrchen wird üblicherweise bei etwa 10 mm bis etwa 150 mm liegen. Üblicherweise wird die Länge mindestens bei etwa 15 mm, noch üblicher mindestens bei etwa 25 mm bis zu etwa 250 mm für eine einfache Handhabung, liegen. Obwohl die Kapillarröhrchen durch eine ebene Schicht verbunden sein können, sind sie für gewöhnlich freistehende, einzelne Kapillarröhrchen.
Für Glaskapillarröhrchen kann zur Verbesserung der Bindung eines Substrates an das Glas die Oberfläche mit einem Material zum Erhöhen der Bindungsfähgikeit auf der inneren Oberfläche beschichtet werden. Zumindest ein Bereich der inneren Oberfläche des Kapillarröhrchens, ein Detektionsbereich, wird mit einem geeigneten Substrat beschichtet, dass einen Partner eines Bindungspaares beinhaltet. Der Partner eines auf der Oberfläche gebundenen Bindungspaares im Detektionsbereich bindet direkt oder indirekt über ein intermediäres Bindungsagens an ein fluoreszierend markiertes Konjugat. Abhängig von den einzelnen verwendeten Verfahren zum Beschichten des Kapillarröhrchens kann der Bereich die gesamte innere Oberfläche des Kapillarröhrchens umfassen oder kann auf einen Teil der inneren Oberfläche des Kapillarröhrchens begrenzt sein. Der Bereich der inneren Oberfläche, der einen darauf gebundenen Bindungspartner zum Einfangen umfasst, wird üblicherweise von etwa 10 bis 100% der inneren Oberfläche reichen und wird für gewöhnlich in einem Bereich von etwa 30 bis etwa 100% der inneren Oberfläche reichen. Bevorzugt sind mehr als etwa 80% der inneren Oberfläche beschichtet. Das gesamte Kapillarröhrchen oder ein Ende davon kann in das Beschichtungsmedium zum Beschichten in geeigneter Weise eingetaucht werden. Wenn es an einem Ende eingetaucht wird, kann das Beschichtungsmedium in geeigneter Weise bis zu einer vorbestimmten Höhe, die durch eine Riefe oder andere Angaben auf dem Kapillarröhrchen dargestellt werden kann, durch jedes geeignete Mittel, z. B. durch Kapillarkraft, in das Kapillarröhrchen aufgenommen werden. Alternativ dazu kann die Flüssigkeit in einen Teil oder über die gesamte Länge des Kapillarröhrchens gepumpt oder aufgesogen werden. Das bedeutet, dass die gesamte oder ein Teil der äußeren Oberfläche ebenfalls mit dem Bindungspartner zum Einfangen beschichtet werden kann.
Abhängig von dem jeweils verwendeten Immunoassay-Format im vorliegenden Verfahren können eine Vielzahl von Agenzien als Bindungspartner dienen. Für gewöhnlich soll ein Bindungspartner eines Paares mit seinem komplementären Bindungspaarpartner in den entsprechenden Immunoassays mit ausreichender Affinität komplexieren oder binden, um den im jeweiligen Verfahren verwendeten Waschprozeduren standzuhalten. Üblicherweise wird die Affinität zwischen dem Bindungspartner und seinem komplementären Bindungspaar bei mindestens etwa 10⁶ l/mol, häufiger bei mindestens etwa 10⁸ l/mol oder höher liegen. Ein Partner eines Bindungspaares wird direkt oder indirekt an ein fluoreszierend markiertes Konjugat binden oder komplexieren. Zum Beispiel bindet in einem kompetitiven Immunoassay-Format der Bindungspartner zum Einfangen (z. B. das Analyt-Analogon auf der inneren Oberfläche der Kapillare) direkt an ein fluoreszierend markiertes Konjugat. In einem Sandwich-Immunoassay-Format wird der Bindungspartner zum Einfangen mit dem fluoreszierend markierten Konjugat indirekt über den Analyten komplexieren. Beispielhafte Bindungspartner schließen Rezeptoren, wie z. B. Antikörper und deren Bindungsfragmente (z. B. F(ab) und F(ab)₂ Fragmente), Lektin, Liganden, wie z. B. Antigene, Haptene oder andere reziproke Bindungspartner; und Konjugate, die Liganden und Rezeptoren umfassen, die an den Fluoreszenzmarker gebunden sind, ein.
Anstatt einen Bereich des Innenraumes des Kapillarröhrchens mit einem Substrat zu beschichten, das einen einzelnen Bindungspartner zum Einfangen enthält, kann die innere Oberfläche des Kapillarröhrchens mit zwei oder mehr Bindungspartnern zum Einfangen an den gleichen oder unterschiedlichen Stellen beschichtet werden. In dieser Ausführungsform wird jeder andersartige Bindungspartner zum Einfangen für die Detektion eines anderen Analyten in der Probe einbezogen. Wenn die Bindungspartner sich an der gleichen Stelle befinden, kann der mit allen Analyten verbundene Fluoreszenzmarker unabhängig bestimmt werden, z. B. durch unterschiedliche maximale Emissionswellenlängen, mit einem Unterschied von mindestens etwa 10 nm und/oder einer unterschiedlichen Verzögerungszeit bei der Emission. Dadurch kann nach einer Vielzahl von Analyten gleichzeitig gesucht werden.
Um die Innenwände der Kapillarröhrchen für die Verwendung im vorliegenden Verfahren zu beschichten, werden die Kapillarröhrchen mit einer Lösung, die den Bindungspartner zum Einfangen umfasst, in Kontakt gebracht. Zum Beschichten der inneren Kapillarröhrchenoberfläche mit der Substrat-Lösung können zum Teil, abhängig von der Art des Substrates und der Art der Innenwand, eine Vielzahl von Techniken eingesetzt werden. Bei den meisten Proteinen, bestimmten Antikörpern, Albuminen und Globulinen haften die Proteine ohne kovalente Bindung an der Oberfläche und sind unter den Bedingungen des Immunoassays stabil.
Beim Herstellen der entsprechenden Kapillarröhrchen, wie für Proteine oben dargestellt, kann es ausreichend sein, die Kapillarröhrchen mit unbehandelten Oberflächen mit einer Lösung in Kontakt zu bringen, die das Bindungsreagenz enthält. Die Lösung zum Binden ist für gewöhnlich eine gepufferte Lösung mit etwa 10^–7 bis 10^–3 g Protein/ml. Für gewöhnlich wird für direkte Assays der Protein-Bindungspartner ein Antikörper oder ein Fragment davon sein. Für indirekte Assays wird das Protein für gewöhnlich ein Gegenstück des Analyten sein. Größtenteils wird der Protein-Bindungspartner ein Antikörper oder ein Fragment davon sein. Verfahren zum stabilen Beschichten von Glas- oder Kunststoffoberflächen sind gut bekannt. Siehe z. B. Harlow & Lane, Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988). In vielen Beispielen, in denen der Bindungspartner kein Protein ist, kann es mit einem Protein verbunden werden, wodurch die Bindungsstellen weiterhin zugänglich bleiben für die Bindung mit dem komplementären Bindungspartner. Zum Beispiel können Haptene mit einem Protein konjugiert werden, dass nicht mit dem Immunoassay in Wechselwirkung treten wird. Auf diese Art und Weise kann andererseits ein Nicht-Bindungsanalyt oder dessen Nachahmer oder Analogon direkt an die innere Oberfläche des Kapillarröhrchens gebunden werden, ohne die Oberfläche funktionalisieren zu müssen, um eine kovalente Bindung der ansonsten Nicht-Bindungssubstanz zu ermöglichen.
Im Falle des bevorzugten Kapillarröhrchens, d. h. Glas, wird es bevorzugt, zuerst die innere Oberfläche mit einem Agens zu beschichten, das die Bindung des Proteins an die Oberfläche verbessert. Wenn daher der Bindungspartner eine stabile Bindung an die innere Oberfläche des Kapillarröhrchens nicht ermöglicht, wird die Oberfläche aktiviert oder funktionalisiert, um eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung des Bindungspartners an die Oberfläche des Kapillarröhrchens zu ermöglichen. Die jeweils verwendete Technik zum Behandeln der Oberfläche des Kapillarröhrchens wird von der Zusammensetzung des Kapillarröhrchens und des Bindungspartners abhängen, z. B. die funktionellen Gruppen, die an den Bindungspartnern für eine Reaktion verfügbar sind. Mit Oberflächen wie Kunststoffen, z. B. Polystyrol und Polyethylen, kann die Oberfläche funktionalisiert werden, um für reaktionsfähige Amino, Carboxyl-, Thio-, Sulfonyl-, Hydroxyl- oder anderen funktionellen Gruppen durch Acylierung, Nitrierung und Reduktion, Oxidation mit Ozon, Chlorsulfonierung und ähnlichem eine Basis zu schaffen. Die spezifische funktionelle Gruppe, die auf der Oberfläche des Kapillarröhrchens bereit gestellt wird, wird vom Bindungspartner abhängen. Wenn der Bindungspartner von Natur aus keine verwendbare zugängliche funktionelle Gruppe umfasst, kann der Bindungspartner derart modifiziert werden, damit eine Basis für eine funktionelle Gruppe geschaffen wird, die mit der aktivierten Oberfläche, z. B. eine Amino- mit einer Carboxyl-, ein Thiol- mit einem aktivierten Olefin, eine Hydroxyl- mit einem aktivierten Halogen und ähnlichem, reagieren wird. Für eine nicht-kovalente Bindung des Bindungspartners an die Oberfläche kann eine hydrophobe Oberfläche bereit gestellt werden, d. h., eine Oberfläche, die eine langkettige Alkyl- oder Alkenylgruppe gebunden hat, z. B. durch eine Silikonbindungsgruppe.
Zur Behandlung der Oberflächen von Glaskapillarröhrchen kann die Oberfläche durch Verwendung einer Verbindung auf Silikonbasis, die als einen Teil der Verbindung einen Silikonrest aufweist, der mit der Glasoberfläche des Kapillarröhrchens reagiert und dem anderen auf Kohlenstoff basierenden Teil der Verbindung, der eine geeignete funktionelle Gruppe, z. B. Alkyl, Alkenyl, Amino, Carboxyl, Sulfonyl, Thiol, aktiviertes Olefin, wie z. B. Maleimido und ähnlichem, bereitstellt, die entweder kovalent oder nicht-kovalent (z. B. durch Van-der-Waals Kräfte) mit dem Bindungspartner bindet, „funktionalisiert" werden.
Für gewöhnlich wird die Beschichtung mittels eines Materials auf Silikonbasis durchgeführt, dass eine Basis für die kovalente oder nicht-kovalente Ausbildung eines geeigneten Substrates auf der inneren Oberfläche bereitstellt. Geeignete Materialien auf Silikonbasis schließen Silane oder Siloxane ein, die über das Silikon an die innere Glasoberfläche binden und eine in den Zylinder des Kapillarröhrchens ausgeweitete Oberfläche, an die ein geeignetes Substrat gebunden ist, bereitstellen. Dies wird aus 15 ersichtlich. Beispiele für geeignete Siloxanmaterialien schließen Aminoalkylsiloxane und Alkyl- oder Alkenyltrialkoxylsilane ein. Geeignete Aminoalkylsiloxane, die im Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden, wenn die Aminoalkylgruppe aus etwa 2 bis 6 Kohlenstoffatomen besteht und die Alkoxylgruppen aus etwa 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bestehen. Bevorzugt werden die Materialien auf Silanbasis durch die Formel R-Si(OR₁)₃ dargestellt, wobei R ein Alkyl oder Alkenyl aus etwa 12 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen ist und R₁ ein Alkyl aus 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Ein besonders bevorzugtes Material auf Silanbasis ist eine Verbindung, die durch die Formel R-Si(OR₁)₃ dargestellt ist, wobei R eine geradkettige Alkylkette von 18 Kohlenstoffatomen ist und R₁ ein Ethyl. Bevorzugt wird Octadecyltriethoxylsilan als Beschichtungsmaterial für das Silan ausgewählt, das bei Pierce Chemical Company als AqualSil^® erhältlich ist.
Nachdem der Bindungspartner an die Oberfläche des Kapillarröhrchens gebunden worden ist, können nichtspezifische Wirkstellen oder „hot spots" auf der Oberfläche des Kapillarröhrchens verbleiben. Diese Wirkstellen müssen vor der Verwendung der Kapillarröhrchen in dem jeweiligen Verfahren besetzt oder blockiert werden. Ansonsten können nicht-spezifische Adsorptionen der zahlreichen Assay-Reagenzien auftreten. Eine nicht-spezifische Adsorption sollte vermieden werden, da sie zu einer nicht-spezifischen Bindung des Markers an die Oberfläche führen kann. Ein Blockieren der Wirkstellen kann durch in Kontakt treten der inneren Oberfläche des Kapillarröhrchens mit einer Vielzahl von Blockierungs-Lösungen erzielt werden. Das Beschichten der Oberfläche des Kapillarröhrchens mit der Blockierungslösung kann mittels der oben beschriebenen Verfahren zum Beschichten der Oberfläche mit dem Bindungspartner erzielt werden. Die ausgewählte Blockierungslösung wird vom jeweilig durchgeführten Immunoassay abhängen. Siehe z. B., Harlow und Lane, Antibodies (1988) 497, siehe oben. Beispiele für Blockierungslösungen schließen Blotto, Blotto/Tween, Tween, BSA und Pferdeserum ein.
Für gewöhnlich wird eine Beschichtung auf Silanbasis durch Inkubieren eines geeigneten Kapillarröhrchens in einer Lösung, die das Material auf Silanbasis in einem geeignetem Lösungsmittel, wie z. B. Wasser, gelöst enthält, für einen Zeitraum und bei einer Temperatur, die ausreichend ist, um ein Anbinden des Silanmaterials an die innere Oberfläche des Glaskapillarröhrchens zu ermöglichen, durchgeführt. Ein geeigneter Temperaturbereich liegt bei etwa 10°C bis etwa 50°C, wobei die Raumtemperatur bevorzugt wird. Das Anbinden wird innerhalb von etwa 10 Minuten stattfinden, jedoch können die Kapillarröhrchen für eine Stunde oder mehr inkubiert werden. Das Kapillarröhrchen wird dann durch geeignete Mittel, wie z. B. durch Reinigen mit Stickstoff oder anderen geeigneten Gasen oder durch Zentrifugieren getrocknet. Jegliche Restfeuchtigkeit kann durch Inkubieren des Kapillarröhrchens bei einer geeigneten Temperatur, wie z. B. von etwa 110°C bis etwa 140°C, für etwa eine Stunde im Ofen und/oder mittels eines Vakuums entfernt werden. Nach der Inkubation lässt man das Kapillarröhrchen vor der Behandlung zur nächsten Beschichtung auf Raumtemperatur abkühlen. Sobald das Glas durch das Silanmaterial alkyliert ist, ist es empfänglich für eine nicht-kovalente Bindung mit klebrigen Proteinen. Ein Substrat, das einen Bindungspartner zum Einfangen umfasst, d. h. ein Protein, das an einen Bindungspartner zum Einfangen eines Antigen-Antikörper-Bindungspaares konjugiert ist, kann an die silanisierte Substratschicht gekoppelt werden. Alternativ dazu kann ein Protein, das mit einer anderen Proteinsubstanz konjugiert ist, die ein Anbinden an ein drittes Substrat ermöglicht, das den Bindungspartner zum Einfangen umfasst, aufgebracht werden. Wenn die silanisierte Schicht mit einem Protein oder einem konjugierten Protein beschichtet wird, ist für gewöhnlich eine längere Inkubationszeit erforderlich, üblicherweise zwischen etwa 1 bis etwa 24 Stunden für einen vergleichbaren Zeitraum. Nach dem Beschichten mit geeigneten Substratschichten wird eine letzte Beschichtung mit einer unschädlichen Proteinlösung zum Blockieren aufgetragen, um zuvor bereits diskutierte „hot spots", die frei liegende Alkylgruppen umfassen, abzubedecken. Alternativ dazu kann der Blockierungsschritt nach dem Aufbringen der zweiten Schicht, jedoch vor dem Aufbringen der dritten Schicht, in den Fällen, in denen eine dritte Schicht verwendet wird, stattfinden. Die beschichteten und blockierten Kapillarröhrchen werden für gewöhnlich in der Blockierungslösung für mindestens 1 Stunde und bis zu 24 Stunden inkubiert. Das Kapillarröhrchen wird dann weitestgehend getrocknet. Eine Waschlösung, wie z. B. deionisiertes Wasser, wird dann durch das Kapillarröhrchen geleitet, um jedwedes Substratmaterial zu entfernen, dass nicht an die Oberfläche des Kapillarröhrchen oder an ein anderes Substrat gebunden ist. Das Kapillarröhrchen wird dann durch ein geeignetes Mittel weitestgehend getrocknet. Es ist Vorteilhaft durch Inkubieren des Kapillarröhrchens in einem Vakuumofen bei der höchst möglichen Temperatur, die keines der gebundenen Proteine denaturieren würde, z. B. für zumindest eine Stunde bei etwa 37°C, das Entfernen von Restwasser zu begünstigen. Nachdem die Kapillarröhrchen hergestellt worden sind, können sie sofort verwendet werden oder für den Gebrauch zu einem späteren Zeitpunkt auf geeignete Weise gelagert werden. Kapillarröhrchen können zur Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt bei Raumtemperatur oder verringerten Temperaturbedingungen gelagert werden. Beispiel 9, Beispiel 10 und Beispiel 11 beschreiben im Detail die Herstellung von Kapillarröhrchen für die Verwendung mit einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
Ein weiterer Aspekt umfasst ein Verfahren zur Herstellung eines Glaskapillarröhrchens zur Verwendung in einem Fluoreszenz-Immunoassay, wobei das Verfahren das Beschichten zumindest eines Teils der inneren Oberfläche des Kapillarröhrchens mit einem Substrat, dass an ein fluoreszierend markiertes Konjugat binden kann, umfasst. In einem bevorzugten Aspekt umfasst das Verfahren das Beschichten zumindest eines Teils der inneren Oberfläche des Kapillarröhrchens mit einem Material auf Silanbasis und Anbinden eines Proteinkonjugates an das Material auf Silanbasis, wobei das Konjugat an ein fluoreszierend markiertes Konjugat binden kann. Proteinkonjugate, die besonders geeignet sind, schließen Rinderserumalbumin (BSA) und menschliches Serum Albumin (HSA) ein, wobei das erstgenannte bevorzugt wird.
Eine Kassette zur Verwendung mit Kapillarröhrchen
Durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellte Kapillarröhrchen können einzeln oder in Kombination für ein Immunoassay, entsprechend dem oben diskutierten Verfahren, verwendet werden. Wie im Weiteren diskutiert wird, kann das Assay manuell oder automatisch durchgeführt werden. Ein Ende eines einzelnen Kapillarröhrchens kann in eine Probe eingebracht werden und die Probe durch jedes dafür geeignete Mittel, z. B. Kapillarkraft oder aktives Pumpen, angesaugt werden, um eine geeignet große Probe im Kapillarröhrchen bereit zu stellen. Alternativ dazu können eine Vielzahl von mit geeigneten Bindungspartnern beschichtete Kapillarröhrchen verwendet werden, damit eine Vielzahl von Immunoassays an einer Probe oder ein einzelnes Immunoassay in mehreren Proben nach einem oder mehreren Analyten suchen kann/können. Die Kapillarröhrchen können in einer Kassette gehalten werden, die eine sequentielle oder gleichzeitige Verwendung ermöglicht und/oder die ein Wechselwirken mit anderen Vorrichtungen und/oder Apparaturen ermöglicht, um ein Immunoassay dieser Erfindung durchzuführen.
Daher ist ein anderer Aspekt dieser Erfindung eine Kombination einer Kassette, die mindestens ein Kapillarröhrchen hält, wobei die Kassette ein Kapillarröhrchen, das mindestens auf einem Teil seiner inneren Oberfläche mit einem Substrat beschichtet ist, dass ein fluoreszierend markiertes Konjugat binden kann, und einen Rahmen, der ein Mittel zum Anordnen des Kapillarröhrchens in einem Bereich des Rahmens umfasst, der es erlaubt, mindestens einen Teil des beschichteten Kapillarröhrchens einem äußeren elektromagnetischen Signal auszusetzen, dass bei jedem gebundenen fluoreszierend markierten Konjugat eine Fluoreszenz auslösen kann, umfasst. Die Fluoreszenz wird dann mit einem geeigneten Mittel zur Signaldetektion detektiert.
Der eigentliche Aspekt dieser Erfindung ist eine Kassette zum sicheren Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen, wobei die Kassette eine Vielzahl von Durchgängen zum Ausrichten der Kapillarröhrchen darin aufweist, und mindestens ein Teil der Kassette es ermöglicht, die Kapillarröhrchen einem äußeren elektromagnetischen Signal auszusetzen, das die Fluoreszenz eines fluoreszierend markierten Konjugates auf der inneren Oberfläche auslösen kann. Die Kassette weist bevorzugt einen Halter mit einem entsprechenden Durchgang und einem Anschluss, der es einer Flüssigkeit ermöglicht, durch das Kapillarröhrchen geleitet zu werden, auf. Die Kassette kann mittels dem Durchschnittsfachmann bekannter Verfahren hergestellt werden und ist bevorzugt spritzgegossen. Die Kassette ist besonders geeignet für das Zusammenwirken mit einem einzigartigen Probenbehälter und mit einer halbautomatisierten Apparatur für ein Fluoreszenz-Immunoassay, wie es im Folgenden im Detail diskutiert wird.
Eine detaillierte Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der Kassette wird in der Beschreibung der Zeichnungen bereitgestellt, und alternative Ausführungsformen werden danach aufgezeigt.
Ein Probenbehälter zur Verwendung in Immunoassays
Kapillarröhrchen, die wie oben beschrieben hergestellt werden, können mit handelsüblichen Behältern, die zum eigenständigen aufnehmen der Reagenzien und Abfälle der Immunoassays, wie z. B. Mikrotiterkammern oder -platten geeignet sind, verwendet werden. Alternativ dazu können die Kapillarröhrchen zusammen mit einem Probenbehälter verwendet werden, wobei dieser so ausgelegt ist, dass er ein Reagenz und ein Mittel zum Vermengen von in den Kammern gehaltenem Fluid enthält.
Ein anderer Aspekt, der nicht Teil dieser Erfindung ist, ist daher ein Behälter zum Halten mehrerer Portionen einer Probe, wobei der Behälter einen Sammelbehälter, der ausreichend ist, um eine bestimmte Menge eines Fluids zu Halten und eine Vielzahl von beabstandeten Kammern darin umfasst. Bevorzugt enthält der Probenbehälter ebenfalls eigenständig eine metallische Scheibe zum Vermengen einer innerhalb der Kammer enthaltenen Flüssigkeit und weist Mittel auf, um die metallische Scheibe davor zu bewahren, aus der Kammer zu fallen, bevorzugt eine Rückhaltekante mit einem Durchmesser, der kleiner ist als der Außendurchmesser der metallischen Scheibe. Der Probenbehälter kann durch eine beliebige Anzahl von dem Durchschnittsfachmann bekannter Verfahren hergestellt werden und ist bevorzugt spritzgegossen.
Der Probenbehälter und die Kassette können kombiniert werden, um ein Einweg-Immunoassay-Testkit auszubilden. Bei diesem Aspekt hat der Probenbehälter für die Lagerung und den Transport einen Bereich zum sicheren Halten der Kassette. Einzelheiten zum Probenbehälter und zur Kassette und zur Probenbehälterkombination werden in der Beschreibung der Figuren bereitgestellt.
Eine Apparatur zur Durchführung des Verfahrens zum Untersuchen auf Analyten
Die Verfahren zum Untersuchen auf Analyten können manuell durchgeführt werden. Die Wasch- und Trocknungsschritte können ebenfalls manuell durchgeführt werden. Das Kapillarröhrchen kann ebenfalls in Übereinstimmung mit der Erfindung zusammen mit einem handelsüblichen Fluorometer verwendet werden.
Jedoch wird es bevorzugt, dass die Verfahren von einer automatisierten oder halbautomatisierten Apparatur durchgeführt werden. Da die Inkubationszeiten für die SPFIA in Kapillarröhrchen relativ kurz ist, ist die Wahrscheinlichkeit größer, dass die zeitliche Koordinierung des Benutzers ineffizient ist und sich dadurch die Reproduzierbarkeit verschlechtert. Daher sollte eine Immunoassay-Apparatur für die Verwendung mit den oben diskutierten Immunoassays die Fähigkeit haben, eines oder mehrere Kapillarröhrchen und einen Probenbehälter zu handhaben, um den Fluss der und die Aufnahme von Fluids zu regulieren, um einen wesentlichen Teil der Schritte des Immunoassays auszuführen, wobei der Schritt zum Detektieren und Analaysieren des Fluoreszenzsignals mit eingeschlossen ist. Die Fähigkeit eine Vielzahl von Immunoassays an einer Vielzahl von Proben durchzuführen, erhöht ebenfalls die Effizienz. Darüber hinaus ist eine quantitative Analyse mit einem integrierten, halbautomatisierten Immunoassay möglich.
Ein anderer Aspekt, der nicht Teil dieser Erfindung ist, ist daher eine Apparatur zur Bestimmung der Anwesenheit mindestens eines Analyten in einer Probe, wobei die Apparatur einen Sammelbehälter, ein Mittel zum Regulieren des Flusses der innerhalb des Sammelbehälters oder im Probenbehälter enthaltenen Fluids, ein erster Abschnitt zum Anbringen der Kassette der vorliegenden Erfindung und auf ähnliche Weise den Probenbehälter, ein Mittel zum Trocknen der Kapillarröhrchen, ein Fluorometer zum Messen des Fluoreszenzniveaus und ein Mittel zum Analysieren der sich daraus ergebenden Signale und Anzeigen eines qualitativen oder semiquantitativen Ergebnisses und optional eines quantitativen Ergebnisses, umfasst.
Die Apparatur kann mit der Kassette und der Probenbehälterkombination und bestimmten Varianten davon zusammenarbeiten. In einem typischen Immunoassay, das die Kassette und Probenbehälterkombination in Zusammenarbeit mit der Apparatur verwendet, wird eine Probe in eine oder mehrere Kammern im Probenbehälter gegeben. Der Probenbehälter wird auf der Apparatur angeordnet und ein darin enthaltener Magnetrührer bewegt die Metallscheiben des Probenbehälters, um den Inhalt der Kammern, der ein fluoreszierend markiertes Konjugat-Reagenz und die Probe umfasst, zu vermengen, damit es den Analyten in der Probe ermöglicht wird, an das fluoreszierend markierte Konjugat zu binden. Nachdem die Probe und das Reagenz richtig vermengt worden sind, ordnet die Apparatur den Probenbehälter unter der auf ihr angebrachten Kassette an und zieht die Mixtur in eines oder mehrere Kapillarröhrchen, z. B., durch Ansaugen. Die Mixtur wird in den Kapillarröhrchen für eine ausreichende Zeit inkubiert, damit eine geeignete Menge eines fluoreszierend markierten Konjugates an den Bindungspartner zum Einfangen des Substrates auf der Oberfläche des Kapillarröhrchens binden kann. Nach der Inkubation leitet die Apparatur eine Waschlösung durch das Kapillarröhrchen, um jegliches ungebundene Material zu entfernen. Das sich daraus ergebende Restfluid wird durch die Apparatur in den Sammelbehälter des Probenbehälters entleert. Die Apparatur benachrichtigt dann den Benutzer, die Kassette auf der Zentrifuge anzuordnen, um die Kapillarröhrchen trocknen zu schleudern.
Die Apparatur ordnet danach die Kassette in unmittelbarer Nähe eines Fluorometers an. Die Kapillarröhrchen werden über eine frei gelegte Öffnung, die auf der Kassette angeordnet ist, einem elektromagnetischen Signal ausgesetzt, und die emittierte Fluoreszenz wird anschließend durch einen Fluoreszenzdetektor detektiert. Das detektierte Signal kann abhängig von den verwendeten Steuervorrichtungen und der verwendeten Analysesoftware zu qualitativen, semiquantitativen oder quantitativen Analysen verarbeitet werden.
Der mögliche Grad der Quantifizierung mittels der Apparatur mit den Vorrichtungen hängt, wie bereits zuvor diskutiert, von der Affinität des Bindungspartners zum Einfangen, der Detektorempfindlichkeit, der zum Analysieren des Signals verwendeten Mathematik und ob Standards und/oder Kontrollen verwendet werden und wenn dem so ist, von der Art der Standards und/oder Kontrollen ab. Für gewöhnlich kann eine Affinität von etwa 10⁶ l/mol eine Empfindlichkeit im Bereich von Teilen pro Millionen ergeben und eine Affinität von etwa 10⁹ l/mol kann eine Empfindlichkeit im Bereich von Teilen pro Milliarde ergeben.
Die grundlegendste Form der Quantifizierung ist die Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten. Damit dies eintritt, muss für das Immunoassay die Konzentration des Analyten in der Probe über einem niedrigeren Grenzwert zur Quantifizierung liegen. Für gewöhnlich wird ein semiquantitatives Ergebnis angezeigt. Ein Barcode, welcher der Kassette und dem Probenbehälterkitt beiliegt, enthält Informationen in Bezug auf das Niveau der Fluoreszenz, die mit der Grenze zwischen positivem und negativem Ergebnis übereinstimmen, so wie es durch zulässige Niveaus, wie z. B. den in Tabelle I dargestellten Sicherheits/Toleranzniveaus, angegeben wird. Für gewöhnlich wird jeder Reagenzanteil in Folge von, neben anderen Dingen, Schwankungen in der Bindungsaffinität des Substrat des Bindungspartners zum Einfangen ein anderes zugehöriges kritisches Niveau für die Fluoreszenz aufweisen. Das Gerät wird das Niveau der Fluoreszenz messen und es mit dem Niveau für ein positives und negatives Ergebnis des spezifischen Immunoassays, das mit der Konzentration von Interesse übereinstimmt, vergleichen.
Eine weitere quantitative Analyse ist mit der vorliegenden Erfindung möglich. 16a–d bis 17a–b stellen Diagramme der genormten Fluoreszenz gegen die Konzentration des Analyten in Teilen pro Milliarden (ppb) für die in der vorliegenden Erfindung verwendeten β-Lactamantibiotika dar. Die genormte Fluoreszenz entspricht dem Fluoreszenzniveau, das von einem an die Oberfläche eines Kapillarröhrchens gebundenen Fluoreszenzmarker emittiert wird, wobei der Analyt als Prozentanteil des Niveaus an Fluoreszenz, die durch einen an die Oberfläche eines Kapillarröhrchens ohne einen Analyten, d. h. ein Blindwert, gebundenen Fluoreszenzmarker emittiert wird, enthalten ist. Da die Konzentration umgekehrt proportional zum Fluoreszenzniveau für ein Vergleichsassay ist, haben die durch eine Vielzahl von Konzentrationspunkten gebildeten Kurven eine negative Steigung. Wenn eine Probe auf der Apparatur gefahren wird, können die sich dabei ergebenden Fluoreszenzsignale mit den Fluoreszenzsignalen, die durch einen Blindversuch parallel mit der Probe generiert werden, verglichen werden. Der sich daraus ergebende Prozentsatz kann auf einem geeigneten Graphen dargestellt werden und eine relative Konzentration des Analyten in der Probe kann bestimmt werden.
Für gewöhnlich wird die Apparatur durch die Verwendung eines Niveaus für ein positives und negatives Ergebnis der Fluoreszenz oder einem quantitativen Ergebnis durch Darstellen eines genormten Niveaus an Fluoreszenz gegen die Konzentration und Berechnen einer Annäherung an eine Ausgleichsgerade entsprechend den Kurven, ein semiquantitatives Ergebnis errechnen. Daher kann eine mehrstufige Kalibrationskurve verwendet werden, wobei die quantitative Bestimmung der Menge des Analyten in einer Probe möglich ist, wenn die Konzentration innerhalb des linearen Bereiches des Ausgleichspolynoms interpoliert wird. Noch bessere quantitative Ergebnisse sind möglich, wenn Standards angefertigt werden, die parallel mit einem Proben-Immunoassay laufen, wobei der gleiche Anteil des Fluoreszenzmarkers sowohl für das Probenkonjugat als auch das Blindwertkonjugat verwendet wird. Da die Milchproduktion durch die FDA reguliert wird, sind die Immunoassays für β-Lactamantibiotika vergleichbar reguliert. Die FDA fordert für gewöhnlich, dass positive Immunoassayergebnisse bestätigt werden. In Folge dessen sollten positive und negative Kontrollen mit diesen Immunoassays gefahren werden. Ein dafür geeignetes Verfahren ist die Verwendung einer Kontrollkassette, die Positiv-, Negativ- und Blindwert-Konzentrationen des Analyten umfasst. Diese Kontrollkassette kann sofort im Anschluss an ein positives Testergebnis mit dem Immunoassay gefahren werden.
Detaillierte Beschreibung der Figuren
Mit einer detaillierten Beschreibung der zahlreichen Aspekte der vorliegend bereitgestellten Erfindung wird jetzt eine detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Vorrichtungen und der Apparatur für die Verwendung mit dem Verfahren zum Untersuchen auf Analyten als auch eine detaillierte Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, wie es mit den Vorrichtungen und der Apparatur verwendet wird, gegeben. Obwohl eine Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in beachtlichen Details gegeben wird, sollten diese jedoch nicht als begrenzend für die im Folgenden diskutierten Beschreibungen und deren im Folgenden diskutierten Abwandlungen angesehen werden. Andere Abwandlungen der beschriebenen Ausführungsformen, die in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen, können dem Durchschnittsfachmann ersichtlich werden.
In Bezug auf die Terminologie wird in der detaillierten Beschreibung der verschiedenen Aspekte dieser Erfindung erwähnt, dass auf Teile der Vorrichtungen Bezug genommen wird als „oben", „unten", „Vorderseite", „Rückseite", „proximale" und „distale" Teile. Dies wird gänzlich der Einfachheit halber getan und um die Beschreibung zu den schematischen Darstellungen in den Zeichnungen in Bezug zu setzen. Es sollte deutlich werden, dass die Vorrichtungen in jeder Position oder Orientierung ihre Funktion erfüllen kann und es liegt im Schutzumfang der Erfindung, dass sie dies tun.
1 ist eine perspektivische Darstellung der Vorderseite der Vorrichtungen einer bevorzugten Ausführungsform, welche das Zusammenwirken zwischen den Komponenten während des Gebrauchs darstellt. Die Vorrichtungen, die bevorzugt transportierbar und wegwerfbar sind, umfassen eine Kassette 1, für das abdichtende Halten von 4 radial beabstandeten Antigen-beschichteten Kapillarröhrchen 2, in denen die Reaktion stattfindet; und ein Probenbehälter 3, der eine Probe, ein fluoreszierend markiertes Konjugat-Reagenz und andere Fluids, wie z. B. flüssigen Abfall, enthält; und zum Lagern der Kassette 1. Der Probenbehälter 3 ist derart unter der Kassette 1 durch eine im Folgenden diskutierte Apparatur angeordnet, um es der Kassette 1 in Zusammenarbeit zu ermöglichen, aus dem Probenbehälter 3 in jedes Kapillarröhrchen 2 Fluid aufzunehmen. Die radiale Ausrichtung der Kapillarröhrchen 2 dient dazu sicherzustellen, dass in Zusammenarbeit mit einer frei gelegten Öffnung 7 jedes Kapillarröhrchen 2 einem Mittel zur Signaldetektion, das im Folgenden diskutiert werden wird, im gleichen Winkel ausgesetzt wird, und damit jedes Kapillarröhrchen 2 einer zentrifugalen Kraft parallel zu seiner Längsachse ausgesetzt werden kann, während es innerhalb der Kassette gesichert ist.
2 ist eine perspektivische Darstellung der Vorrichtungen einer bevorzugten Ausführungsform, die das Zusammenwirken zwischen den Komponenten der Vorrichtung bei Nichtgebrauch während der Lagerung darstellt. Die Kassette 2 gleitet unter ein Paar Halteplättchen 83, 84, die nachfolgend diskutiert werden und rastet in einer Position ein, in der es durch die Halteplättchen 83, 84 und ein Paar Befestigungsklemmen 75, 76, die nachfolgend diskutiert werden (siehe auch 10), gesichert wird.
3a bis 3h zeigen die vollständig zusammengesetzte Kassette 1 aus Perspektiven, welche alle Seiten der Kassette 1 darstellen und die insbesondere Details der verschiedenen Designmerkmale darstellen.
4 ist eine Explosionsdarstellung der Vorrichtungen einer bevorzugten Ausführungsform, die das Zusammenwirken unter den Elementen der Kassette 1 und dem Probenbehälter 3 darstellen. Die Kassette 1 umfasst einen Rahmen 4 und einen Halter 5 zum Sichern der Kapillarröhrchen 2 innerhalb des Rahmens 4. Der Rahmen 4 umfasst ein steifes, im Wesentlichen flaches rechteckiges Gehäuse, das bevorzugt aus Polystyrol hergestellt wird, vier radial ausgerichtete Ausgänge 6 zum Aufnehmen von vier Glaskapillarröhrchen 2, die bevorzugt mit einem Antigen (zur Durchführung eines kompetitiven Assays) beschichtet sind, eine frei gelegte Öffnung 7, um es einem Lichtstrahl zu ermöglichen, mit den Kapillarröhrchen in Kontakt zu treten, wenn sie innerhalb der Kassette 1 gesichert sind, und vier Schutzfortsätze 8 zum Schutz der Spitzen der Kapillarröhrchen 2.
5 und 6 zeigen perspektivische Darstellungen von dem, was als die Rückseite des Rahmens 4 bezeichnet werden kann. In einer bevorzugten dargestellten Ausführungsform bildet der Rahmen ein im Wesentlichen flaches und hohles Rechteck von etwa 4 Zentimeter bis etwa 10 Zentimeter, bevorzugt etwa 5.6 Zentimeter lang entlang einer Seite 9 und einer Wand 10; etwa 1 Zentimeter bis etwa 8 Zentimeter breit, bevorzugt etwa 2.7 Zentimeter breit entlang zweier Seitenwände 11, 12; und etwa 2 Millimeter bis etwa 1.3 Zentimeter hoch, bevorzugt etwa 8 Millimeter hoch entlang der drei Wände 10, 11, 12. Die vier Durchgänge 6 entspringen einem rechteckigen hervorstehendem Segment 13, das sich von der Wand 10 her erstreckt. Das hervorstehende Segment 13 erstreckt sich bevorzugt etwa 2 Millimeter von der langen Wand 10 entlang der horizontalen Ebene des Rahmens 4, wie in 5 dargestellt ist, und hat den gleichen Querschnitt wie die lange Wand 10, etwa 3.7 Zentimeter lang. Angeordnet auf der Längskante des herausragenden Segments 13 sind drei Clips 14 zum sicheren Verbinden des Halters 5, der nachfolgend diskutiert wird, mit dem hervorstehenden Segment 13. Senkrecht aus dem herausragenden Segment 13 hervorstehend befinden sich zwei Führungsstifte 15, 16, ein erster Führungsstift 15 und ein segmentierter zweiter Führungsstift 16, jeder zum Führen einer Fassung 35 und eines Aufsatzes 36, die nachfolgend diskutiert werden, in eine Position auf dem Rahmen 4. Der erste Führungsstift 15 hat einen äußeren Durchmesser zwischen 2 Millimeter und 5 Millimeter, bevorzugt etwa 3 Millimeter; und ist etwa 1.5 Millimeter bis etwa 5 Millimeter lang oder von einer ausreichenden Länge, so dass das Ende des ersten Führungsstiftes 15 bündig mit der Oberseite des Aufsatzes 36 abschließt, wenn die zwei zusammenwirkend ineinandergreifen. Der segmentierte zweite Führungsstift 16 hat im Wesentlichen die gleiche Länge wie der erste Führungsstift 15 und eine Außendurchmesser, der dem des ersten Führungsstiftes 15 an der Basis des segmentierten zweiten Führungsstiftes 16 und bis zu einer Kante 17, die entlang des Perimeters des segmentierten zweiten Führungsstiftes 16 etwa auf halber Höhe entlang der Längsachse des segmentierten zweiten Führungsstiftes 16 angeordnet ist, ähnelt. Von der Kante 17 bis zum Ende des segmentierten zweiten Führungsstiftes 16 liegt der Außendurchmesser des segmentierten zweiten Führungsstiftes 16 zwischen etwa 1.5 Millimeter bis etwa 4.5 Millimeter, bevorzugt etwa 2.5 Millimeter. Auf jeden Fall sollte in dieser bevorzugten Ausführungsform der segmentierte zweite Führungsstift 16 eine Kante 17 aufweisen, die zwei bestimmte Außendurchmesser definiert, die komplementär zum Innendurchmesser eines dazugehörigen auf dem Aufsatz 36 angeordneten Führungsschachtes 50, der nachfolgend diskutiert wird, sind. Es ist die Funktion der verschiedenen Formen der zwei Führungsstifte 15, 16, nur eine Orientierung für das Zusammensetzen mit dem Aufsatz 36 zu ermöglichen.
Wie in 6 dargestellt ist, liegen entlang der 8 Millimeter breiten Seite des hervorstehenden Segments 13 vier gleichmäßig beabstandete Öffnungen 18, jede mit einem Durchmesser von etwa 5 Millimeter, zur Aufnahme der Kombination aus Kapillarröhrchen 2 und Fassung 35, die im Folgenden diskutiert wird. Die Öffnungen 18 führen in den Durchgang 6, der eine Aufnahmekammer 19 und einen engen Schacht 20, dargestellt in 5 und 6, umfasst. Zum Zwecke der Beschreibung kann der Durchgang in zwei Paare, ein inneres Paar und ein äußeres Paar, aufgeteilt werden. Die Achse des inneren Paares erstreckt sich radial in Richtung der Längsseite 9, bevorzugt in einem etwa 5° Winkel von einer imaginären Linie senkrecht zum Zentrum der Ebene, die durch die Längswand 10 definiert wird. Die Achse des äußeren Paares erstreckt sich radial in Richtung der Längsseite 9, bevorzugt in einem etwa 18° Winkel von einer imaginären Linie senkrecht zum Zentrum der Ebene, die durch die Längswand 10 definiert wird. Die Winkel, in denen die Kapillarröhrchen 2 sich ausgehend von einer imaginären Linie senkrecht zum Zentrum der Ebene, die durch die Längsseite 10 definiert wird, ausstrecken werden, hängen von den Abmessungen der Kassette 1 ab, sollten jedoch so ausgelegt sein, dass die Kapillarröhrchen 2 radial ausgerichtet sind, um ein einheitliches frei legen jedes Kapillarröhrchens 2 gegenüber einem Mittel zur Signaldetektion, das nachfolgend diskutiert wird, sicherzustellen, wenn die Kassette 1 in einer kreisförmigen Zentrifuge, die ebenso nachfolgend diskutiert wird, angeordnet ist und um einheitliche Zentrifugalkräfte auf jedes Röhrchen zu gewährleisten. Das heißt, wenn eine imaginäre Linie entlang der Längsachse jedes Kapillarröhrchens 2 gezogen wird, wenn dieses in der Kassette 1 angeordnet ist, sollte ein Ende jeder Linie sich einem zentralen Punkt nähern und der Bogen, der durch die Kombination der anderen Enden der Linien ausgebildet wird, sollte einen Kreisabschnitt ausbilden. Die Aufnahmekammern 19 des inneren Paares liegen entlang des Achsenwinkels, haben den gleichen Durchmesser wie die Öffnungen 18 oder sind leicht kegelförmig und sind bevorzugt etwa 4.5 Millimeter tief. Die Aufnahmekammern 19 des äußeren Paares liegen ebenfalls entlang des Achsenwinkels, haben den gleichen Durchmesser wie die Öffnungen 18 oder sind leicht kegelförmig und sind bevorzugt etwa 6.5 Millimeter tief. Aufgabe der unterschiedlichen Tiefen der Aufnahmekammern 19 ist das zusammenwirkende Ineinandergreifen mit dem Aufsatz, der nachfolgend diskutiert wird. Die innere Aufnahmekammer 19 und Schacht 20 -Kombinationen sind etwa 1.5 Zentimeter bis etwa 2 Zentimeter, bevorzugt etwa 1.75 Zentimeter lang, und die äußere Aufnahmekammer 19 und Schacht 20 -Kombinationen sind etwa 1.3 Zentimeter bis etwa 1.8 Zentimeter, bevorzugt etwa 1.6 Zentimeter lang. Die Länge der Kombinationen der inneren und äußeren Aufnahmekammern 19 und engen Schächte 20 werden durch die radiale Ausrichtung der Durchgänge 6 und einer durch eine frei gelegte Öffnung 7 gebildeten Kurve bestimmt, wobei die Kurve die Funktion hat, sicherzustellen, dass jedes radial ausgerichtete Kapillarröhrchen 2, dass innerhalb des Rahmens 4 angeordnet ist, gleichmäßig dem Mittel zur Signaldetektion, wie nachfolgend diskutiert wird, ausgesetzt wird, wenn die Kassette 1 in einer im Folgenden noch zu beschreibenden Zentrifuge angeordnet ist. Jeder Schacht 20 hat eine Stärke, die zum gleitenden Einpassen eines Kapillarröhrchens 2 darin ausreichend ist. Jede Aufnahmekammer 19 und Schacht 10 -Kombination ist im Querschnitt entlang der oberen Ebene des Rahmens 4 offen. Dies führt im Querschnitt zu einer parabolen Form des Schachtes 20, die etwa 5 Millimeter tief ist. Der Querschnitt ist ein Nebenprodukt der Ausgestaltung eines Werkzeuges, das zur Herstellung des Rahmens 4 verwendet wird. Darüber hinaus hat der Querschnitt des Schachtes 20 ebenso die Aufgabe jeglichen Schaden eines darin gehaltenen Kapillarröhrchens 2 deutlich zu machen. Am Ende der Schächte 20 sind Öffnungen 21, wie in 5 dargestellt, durch welche die Kapillarröhrchen 2 für die Präsentation gegenüber der frei gelegten Öffnung 7 hindurchführen. Wie zuvor bereits diskutiert, bildet die frei gelegte Öffnung 7 eine Kurve, die der radialen Ausrichtung der Kapillarröhrchen 2 entspricht, um ein gleichmäßiges frei legen der Kapillarröhrchen 2 gegenüber einem im Folgenden noch zu diskutierenden Mittel zur Signaldetektion sicherzustellen. Die frei gelegte Öffnung 7 hat einen Querschnitt, so dass bevorzugt ein Abschnitt von etwa 8 Millimeter jedes Kapillarröhrchens 2 entlang der durch die frei gelegte Öffnung 7 ausgebildeten Kurve frei gelegt wird, wenn diese innerhalb des Rahmens 4 durch den im Folgenden noch zu diskutierenden Halter 5 gesichert sind. Die Längsseite 9 umfasst eine Kante, die bevorzugt etwa 1.5 Millimeter tief und bevorzugt etwa 3.2 Millimeter hoch ist, wobei das durch die Kante ausgebildete 'L' der Rückseite des Rahmens 4 gegenübersteht. Die Abmessungen der Kante sind derart, dass der Längsseite 9 eine ausreichende strukturelle Abstützung geboten wird, um sie im Wesentlichen starr zu machen. In dieser bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich die Kante an beiden Enden etwa 3.2 Millimeter bis zu einem gekrümmten Ende der zwei Seitenwände 11, 12 in den Rahmen 4 aus. Auf der Oberseite der gekrümmten Enden jeder der zwei Seitenwände 11, 12 befindet sich eine halbrunde Wölbung zum Abstützen 22, 23, die sich bevorzugt etwa 1.6 Millimeter von der Kante der zwei Seitenwände 11, 12 entlang der gleichen Ebene erstreckt. Die Wölbungen zum Abstützen 22, 23 haben die Aufgabe sicherzustellen, dass die Kassette 1 nicht erschüttert wird, wenn sie mit der Rückseite des Rahmens 4, welche der Oberfläche gegenüber liegt, flach auf die Oberfläche gelegt wird. Die Aufgabe der Wölbungen zum Abstützen 22, 23 ist notwendig, um die Kapillarröhrchen 2 gegenüber einem Mittel zur Signaldetektion in einem geeigneten Winkel einheitlich auszurichten, wenn die Kassette 1, welche die Kapillarröhrchen 2 enthält, in eine Zentrifuge, wie im Folgenden diskutiert wird, eingesetzt wird, die ein frei legen gegenüber dem im Folgenden noch zu diskutierenden Mittel zur Signaldetektion ermöglicht. Entlang der Längsseite 9 sind vier Öffnungen 24 zur Aufnahme der distalen Enden der Kapillarröhrchen, und sich von der Längsseite 9 zu jeder Aufnahmeöffnung 24 erstreckend, befinden sich die Fortsätze zum Schützen der Enden der Kapillarröhrchen 2. Jeder Fortsatz 8 erstreckt sich bevorzugt etwa 3.2 Millimeter von der Längsseite 9 im gleichen Winkel wie das entsprechende Kapillarröhrchen 2, dass sich durch die Aufnahmeöffnung 24 auf der Längsseite 9 erstreckt, damit das Ende jedes Fortsatzes 8 im Wesentlichen bündig mit der Spitze jedes Kapillarröhrchens 2 abschließt. Wie in 4 dargestellt, weist die Vorderseite des Rahmens 4 eine Schräge 25, 26 an jedem Ende der frei gelegten Öffnung 7 auf, die etwa 8 Millimeter von den Ecken, die durch die Kante der Längsseite 9 ausgebildet werden, angeordnet ist. Jede Schräge 25, 26 verläuft parallel zur Längsseite 9, erstreckt sich von jeder Seitenwand 11, 12 bis zur frei gelegten Öffnung 7 aus und neigt sich in einem etwa 45° Winkel in Richtung auf die Rückseite des Rahmens 4 und in Richtung auf die Längswand 10. Die Schrägen 25, 26 haben die Funktion es der Längsseite 9 zu ermöglichen, die distalen Enden der Kapillarröhrchen über die Aufnahmeöffnungen 24 abzustützen, so dass sie zur Ebene des Rahmens 4 parallel liegen, wodurch die Verwendung von Kunststoff oder zusätzlichen Funktionsbaugruppen zum Sicherstellen eines geeigneten frei Legens der Kapillarröhrchen 2 gegenüber dem im Folgenden noch zu diskutierenden Mitteln zur Signalerzeugung und Detektion minimiert wird.
Wieder mit Bezug auf 5 und 6, kann man dort ein Paar von parabolisch geformten weiblichen Schächten 27, 28 erkennen. Die weiblichen Schächte 27, 28 umfassen ein parabolisches Element 29, 30, wobei der Höchstpunkt der Parabel in Richtung der Längswand 10 weist, und eine biegsame Klemme 31, 32 mit einer Kante 33, 34. Jeder weibliche Schacht 27, 28 ist bevorzugt etwa 6.4 Millimeter von der Längswand 10 entfernt und zu jeder Seitenwand 11, 12 benachbart angeordnet und steht von der Rückseite des Rahmens 4 etwa 8 Millimeter in einem 90° Winkel ab. Die biegsamen Klemmen 31, 32 in Verbindung mit den Kanten 33, 34 arbeiten als ein Verschlussmechanismus, um die Kassette 1 über die weiblichen Schächte 27, 28 an einem im Folgenden noch zu diskutierenden Gerät, das für die Verwendung mit der Kassette 1 entworfen worden ist, zu befestigen.
4 zeigt die vier bevorzugt mit einem Antigen beschichteten Kapillarröhrchen 2. Jedes Kapillarröhrchen 2 ist bevorzugt aus einem transparenten Siliziumdioxidglas gefertigt, noch bevorzugter Borosilikatglas, und ist etwa 10 Millimeter bis etwa 250 Millimeter, bevorzugt etwa 20 Millimeter bis etwa 150 Millimeter und am meisten bevorzugt etwa 35 Millimeter lang, mit einem Innendurchmesser von etwa 0.5 Millimeter bis etwa 1 Millimeter, bevorzugt etwa 0.65 Millimeter. Es soll festgehalten werden, dass, wenn die Probe Milch ist, ein Innendurchmesser des Kapillarröhrchens 2, der kleiner ist als ein bevorzugter Wert von 0.65 Millimeter, für das Immunoassay unzureichend sein kann, da Ansammlungen von Materialien in der Milch die Kapillarröhrchen 2 verstopfen können und Auswirkungen auf den Flüssigkeitsstrom haben können. Die Kapillarröhrchen 2 werden kraftschlüssig in die im Folgenden beschriebene Fassung an einem Ende eingeführt und werden gleitend in die Durchgänge 6 des Rahmens 4 am anderen Ende eingeführt.
7 ist eine Explosionsdarstellung der Oberseite des Halters 5, und 8 ist eine Explosionsdarstellung der Unterseite des Halters 5 zum Halten von vier in den Rahmen 4 einzusetzenden Kapillarröhrchen. Der Halter 5 umfasst eine Fassung 35 und einen Aufsatz 36. Die Fassung 35 ist bevorzugt aus flexiblem Krayton^® hergestellt und umfasst einen flachen rechteckigen Unterbau 37, bevorzugt etwa 8 Millimeter breit mit einer Länge von etwa 3 Zentimetern und etwa 1.6 Millimeter dick, zwei Führungsöffnungen 38, 39 und vier mit dem Unterbau 37 verbundene Kragen 40. Die Kragen 40 haben die Aufgabe, die Kapillarröhrchen 2 für das Einsetzen in die Durchgänge 6 des Rahmens 4 mit Hilfe der Führungsöffnungen 38, 39, welche die auf dem herausragenden Segment 13 des Rahmens 4 befindlichen Führungsstifte 15, 16 gleitend ergreifen, kraftschlüssig festzuhalten. Der Durchmesser der Führungsöffnungen 38, 39 ist in etwa gleich dem Außendurchmesser des ersten auf dem herausragenden Segment 13 des Rahmens 4 befindlichen Führungsstiftes 15, bevorzugt etwa 3.4 Millimeter. Jeder Kragen 40 hat einen engen Durchgang 41 mit einem Innendurchmesser, der ausreichend ist, um das Einsetzen eines Kapillarröhrchens 2 und das Festhalten darin unter Reibung zu ermöglichen, einen Kegel 42, der als Führung zum Einsetzen der Kapillarröhrchens dient, und eine Öffnung 43, um das Einsetzen der Kapillarröhrchen 2 zu ermöglichen. Die Verbindung aus Fassung 35 und Kapillarröhrchen 2 gleiten über die vier Öffnungen 18 auf dem herausragenden Segment 13 in den Rahmen 4 hinein. Die Abmessungen der Kragen 40 sind derart ausgelegt, damit sie gleitend in die entsprechenden Aufnahmekammern 19 des Rahmens 4, wie zuvor bereits beschrieben, hineinpassen. Zum Zwecke der Beschreibung können die Kragen 40 entsprechend der inneren und äußeren Paare der Durchgänge 6 im Rahmen 4 in zwei Paare aufgeteilt werden. Das innere Kragenpaar 40 ist bevorzugt etwa 4.8 Millimeter lang und steht radial vom Zentrum des Unterbaus 37 im gleichen Winkel ab, wie das entsprechende innere Durchgangspaar 6 des Rahmens 4. Das äußere Kragenpaar 40 ist bevorzugt etwa 6.4 Millimeter lang und steht radial vom Zentrum des Unterbaus 37 im gleichen Winkel ab, wie das entsprechende äußere Durchgangspaar 6 des Rahmens 4. Die unterschiedlichen Längen der Kragen haben die Aufgabe, dass äußere Paar der radial ausgerichteten Kapillarröhrchen zu verlängern, so dass die distalen Enden aller Kapillarröhrchen 2 eine parallele Linie zur Längsseite 9 des Rahmens 4 ausbilden, damit jedes Kapillarröhrchen 2 in jede Probenkammer, wie im Folgenden noch zu diskutieren, in eine äquivalente Tiefe eindringt. Jeder Kragen 40 misst bevorzugt etwa 3.2 Millimeter im Durchmesser und weitet sich am Kegel 42 etwa 3 Millimeter vom Ende bis zur Öffnung 43, die einen Außendurchmesser von etwa 4.8 Millimeter und einen Innendurchmesser von etwa 3.2 Millimeter aufweist.
7 und 8 zeigen den rechteckigen Aufsatz 36, der bevorzugt aus steifem Polystyrol hergestellt wird, zum Sichern der Fassung 35 und Kapillarröhrchen 2 -Verbindung im Rahmen 4. Der Aufsatz 36 kann jede für das zusammenwirkende Ineinandergreifen der Fassung 35 und des hervorstehenden Segments 13 des Rahmens 4 geeignete Abmessung aufweisen, er umfasst jedoch bevorzugt zwei lange Wände 44, 45 mit einer Länge von etwa 3.8 Zentimeter bei einer Höhe von etwa 5 Millimeter; zwei kurze Wände 46, 47 mit einer Höhe von etwa 4.8 Millimeter bei einer Breite von etwa 9.5 Millimeter auf der Oberseite, die am Boden auf eine Breite von etwa 8 Millimeter abfällt; und eine Oberseite 48 mit einer Länge von etwa 3.8 Zentimeter bei einer Breite von etwa 9.5 Millimeter. Neben den kurzen Wänden 46, 47 angeordnet, befinden sich zwei asymmetrische Führungsschächte 49, 50, ein erster Führungsschacht 49 und ein segmentierter zweiter Führungsschacht 50, jeder zum gleitenden Ergreifen der Führungsstifte 15 bzw. 16 auf dem herausragenden Segment 13 des Rahmens 4 in Verbindung mit den Führungsöffnungen 38, 39 der Fassung 35. Der erste Führungsschacht 49 erstreckt sich etwa .5 Millimeter bis etwa 3 Millimeter, bevorzugt etwa 1.5 Millimeter hoch über die Oberseite 48, um eine Erhöhung auszubilden; er hat einen Innendurchmesser von zwischen etwa 2.1 Millimeter bis etwa 5.1 Millimeter, bevorzugt etwa 3.1 Millimeter oder einen Innendurchmesser, so dass er den ersten Führungsstift 15, der auf dem herausragenden Segment 13 des Rahmens 4 angeordnet ist gleitend ergreift; und liegt bevorzugt zwischen etwa 1.5 Millimeter bis etwa 5 Millimeter tief oder weist eine ausreichende Tiefe auf, damit die Oberseite des ersten Führungsstiftes 15 bündig mit der Oberseite des ersten Führungsschachtes 49 abschließt, wenn die zwei wie zuvor bereits beschrieben zusammenwirkend ineinander greifen. Der segmentierte zweite Führungsschacht 50 erstreckt sich etwa .5 Millimeter, bevorzugt etwa 1.5 Millimeter hoch über der Oberseite 48, um eine Erhöhung auszubilden; hat einen Innendurchmesser von zwischen etwa 2.1 Millimeter bis etwa 5.1 Millimeter, bevorzugt etwa 3.1 Millimeter oder einen ausreichenden Durchmesser zum gleitenden Ergreifen der Basis des segmentierten zweiten Führungsstiftes 16, der auf dem herausragenden Segment 13 des Rahmens 4 angeordnet ist und sich vom Ende her, das dem Raum gegenüberliegt, der durch die vier Wände 44, 45, 46, 47 bis zu einer Kante 51, die sich auf halben Wege von dem segmentierten zweiten Führungsschacht 50 befindet, ausgebildet wird, erstreckt. Von der Kante 51 bis zum oberen Ende des segmentierten zweiten Führungsschachtes 50, hat der segmentierte zweite Führungsschacht 50 einen Innendurchmesser von zwischen etwa 1.7 Millimeter bis zu etwa 4.7 Millimeter, bevorzugt etwa 2.7 Millimeter oder einen ausreichenden Innendurchmesser zum gleitenden Ergreifen des oberen Teils des segmentierten Führungsstiftes 16, der sich auf dem herausragenden Segment 13 des Rahmens 4 befindet. Der segmentierte zweite Führungsschacht 50 ist bevorzugt zwischen etwa 1.5 Millimeter bis etwa 5 Millimeter tief oder weist einer ausreichenden Tiefe auf, damit das obere Ende des segmentierten zweiten Führungsstiftes 16, das sich auf dem herausragenden Segment 13 des Rahmes 4 befindet, bündig mit dem oberen Ende des segmentierten zweiten Führungsschachtes 50 abschließt, wenn die zwei, wie zuvor bereits beschrieben, zusammenwirkend ineinander greifen. In jedem Fall sollte der segmentierte zweite Führungsschacht 50 eine Kante 51 aufweisen, die zwei unterschiedliche Durchmesser definiert, so dass der segmentierte zweite Führungsschacht 50 komplementär mit dem entsprechenden segmentierten zweiten Führungsstift 16, der sich auf dem herausragenden Segment 13 des Rahmens 4 befindet, ist und gleitend ineinander greifen können. Die asymmetrischen Führungsschächte 49, 50 sind so angeordnet, dass sie mit den Führungsstiften 15, 16 und Führungsöffnungen 38, 39 in einer Linie liegen. Der Unterschied bei den Abmessungen der zwei asymmetrischen Führungsschächte 49, 50 dient dazu nur eine Orientierung für das Ineinandergreifen des Halters 5, der den Aufsatz 36 und die Fassung 35 umfasst, mit dem Rahmen 4, wie zuvor diskutiert, zu ermöglichen. Das heißt, dass der segmentierte zweite Führungsschacht 50 nur den segmentierten zweiten Führungsstift 16, der auf dem herausragenden Segment 13 des Rahmens 4 angeordnet ist, ergreifen kann und nicht den ersten Führungsstift 15, der vergleichbar angeordnet ist. Dadurch wird sicher gestellt, dass die Öffnung eines einzelnen im Folgenden noch zu diskutierenden Anschlusses 54, der auf dem Aufsatz 36 angeordnet ist, von der Rückseite des Rahmens 4 weg zeigt, wenn der Halter 5 und der Rahmen 4 vollständig zusammengesetzt sind, um die Kassette 5 auszubilden. Auf der Oberseite 48 des Aufsatzes 36 eingelassen ist eine Wanne 52, die bevorzugt etwa 2.2 Zentimeter lang ist, etwa 1.6 Millimeter breit und bevorzugt etwa 1.6 Millimeter tief und die sich in den Raum öffnet, der durch die vier Wände 44, 45, 46, 47 ausgebildet wird. Die Wanne 52 ist so ausgestaltet, damit sie eine abgedichtete Kammer ausbildet, wenn sie den Unterbau 37 der Fassung 35 berührt, so dass die Kapillarröhrchen 2 in Fluidverbindung miteinander stehen. Die Abdichtung wird durch einen engen ovalen Grad 53, dargestellt in 8, bereitgestellt, der die Wanne 52 etwa 2 Millimeter von den Kanten der Wanne 52 in dieser bevorzugten Ausführungsform einkreist, sie kann jedoch in jeder geeigneten Distanz um die Wanne 52 herum liegen; und etwa 3 Millimeter von den Enden der Wanne 52, und presst gegen den Unterbau 37 der Fassung 35. In seinem Zentrum mit der Wanne 52 verbunden, befindet sich ein Einzelanschluss 54, dargestellt in 7, mit einem Innendurchmesser von bevorzugt etwa 3.2 Millimeter, der mit einer im Folgenden noch zu diskutierenden Luer-Bohrung zum Pumpen von Fluid durch die Kammer, die durch die Wanne 52 und den Fassungsunterbau 37 ausgebildet wird, verbunden werden kann. Der Einzelanschluss 54 ist etwa 8 Millimeter lang und ist derart ausgerichtet, dass sein Durchlass parallel zur horizontalen Ebene der Oberseite 48 verläuft, während er von der Wanne 52 in einem senkrechten Winkel, wie in 7 dargestellt, absteht. Eine Öffnung 55, welche den Einzelanschluss 54 mit der Wanne 52 verbindet, ist im Zentrum der Wanne 52, wie in 7 dargestellt, angeordnet. Alle Längswände 44, 45 des Aufsatzes 36 enthalten drei gleichmäßig angeordnete rechteckige Öffnungen 56, die zu den drei gleichmäßig angeordneten Clips 14 passen, die, wie zuvor bereits beschrieben, auf der Längskante des auf dem Rahmen 4 befindlichen herausragenden Segmentes 13 angeordnet sind. Das Zusammenwirken zwischen den Öffnungen 56 und den Clips 14 dient dazu den Aufsatz 36, die Fassung 35 und die Kapillarröhrchen 2 -Kombination über dem herausragenden Segment 13 des Rahmens 4 zu sichern; mit Hilfe der Führungsstifte 15, 16, der Führungsöffnungen 38, 39 und der Führungsschächte 49, 50; und mit zusätzlicher Hilfe des Winkels der langen Wände des Aufsatzes 44, 45, die durch die kurzen Wände des Aufsatzes 47, 47 ausgebildet werden. Der Verbindungsrahmen 4, Kapillarröhrchen 2, Fassung 35 und Aufsatz 36 umfassen daher die Kassette 1 in dieser bevorzugten Ausführungsform.
9 und 10 sind perspektivische Darstellungen einer bevorzugten Ausführungsform des Probenbehälters 3, der bevorzugt aus Polypropylen hergestellt ist. Der Probenbehälter 3 umfasst vier gleichmäßig beabstandete Kammern 57 zum Halten von Aliquots eines fluoreszierend markierten Konjugat-Reagenzes und/oder einer Probe, einen Sammelbehälter 58 zum Halten eines Fluids, wie z. B. Flüssigabfällen; und ein geformtes Lagerungsfach für die Kassette 59. Der Probenbehälter 3 bildet ein Quadrat mit bevorzugt etwa 6 Zentimetern an allen Seiten. Die Kammern 57 werden durch ein Bord 60 gestützt. Das Bord 60 erstreckt sich von einer Wand 61 aus, welche über die gesamte Breite des Behälters 3 läuft, und mit zwei Seitenwänden 62, 63 verbunden ist. Die Wand 61, von der sich aus das Bord 60 erstreckt, ist etwa 6 Zentimeter lang und bevorzugt etwa 9.5 Millimeter hoch. Die zwei Seitenwände 62, 63 sind jeweils bevorzugt etwa 2.5 Zentimeter lang und bevorzugt etwa 1.4 Zentimeter hoch. Das Bord 60 entspringt der langen Wand 61 bevorzugt etwa 1.6 Millimeter unter der Oberkante der Wand 61, so dass eine Kante 64 ausgebildet wird, die zum Zurückhalten von ausgelaufener Flüssigkeit dient. Das Bord 60 erstreckt sich von der Wand 61 aus in einem leicht abwärts gerichteten Winkel, der dazu dient die ausgelaufene Flüssigkeit in den im Folgenden noch zu diskutierenden Sammelbehälter 58 zu leiten, und erstreckt sich über etwa 9.5 Millimeter und bindet rechtwinklig dazu an eine Wand 67, die vom Bord zum Boden 68 des im Folgenden noch zu diskutierenden Sammelbehälters 58 abfällt. Alle auf dem Bord 60 angeordneten Kammern 57 haben eine parabolische Form mit einem Innendurchmesser von bevorzugt etwa 8 Millimeter und einer Tiefe von bevorzugt etwa 4.7 Millimeter. In mindestens einer Kammer 57 befindet sich ein metallisches Objekt, das eine rostfreie Stahlscheibe 65 zum Vermengen umfasst. Durch ein magnetisches Wechselfeld unter der Scheibe 65 wird ein getrocknetes fluoreszierend markiertes Konjugat-Reagenz, das sich auf dem Boden der Kammer 57 befindet oder wahlweise am Boden der Kammer 57 anheftet, rekonstituiert, wenn eine Lösung (wahlweise eine Probe enthaltend) zur Kammer 57 hinzugegeben wird. Eine Rückhaltekante 66 mit einem Durchmesser von etwa 4.8 Millimeter befindet sich entlang der Öffnung zu jeder Kammer 57 und hat die Aufgabe zu verhindern, dass die Scheibe 65 aus der Kammer 57 fällt.
Der Sammelbehälter 58 ist definiert durch eine Wand 67, die, wie zuvor bereits diskutiert, etwa 5 Zentimeter von der Kante des Bords 60 aus bis zu einem Boden 68 abfällt; die Abschnitte der Seitenwände 62, 63, die sich vom Bord 60 aus erstrecken und eine geformte Mittelwand 69, die sich bevorzugt etwa 1.3 Zentimeter vom Boden 68 aus erhebt, so dass sie in etwa bündig mit der Oberkante der Seitenwände 62, 63 abschließt und ebenso zum Lagerungsfach für die Kassette 59, das im Folgenden diskutiert werden soll, gehört. Wie zuvor bereits diskutiert hat der Sammelbehälter 58 die Aufgabe, das Fluid aufzunehmen, das über den Einzelanschluss 54 auf dem Aufsatz 36 der Kassette 1 durch die Kapillarröhrchen 2 läuft. Das Volumen des Sammelbehälters 58 wird durch die Länge und Höhe der Wand 67 und dem Abstand von der Wand 67 bis zur geformten Mittelwand 69 definiert und sollte ausreichend bemessen sein, um ein angemessenes Vielfaches des kombinierten Volumens an Fluid, das von allen Kapillarröhrchen 2 aufgenommen werden kann, die innerhalb der Kassette 1 enthalten sind, aufzunehmen.
9 und 10 zeigen ebenso das geformte Lagerungsfach für die Kassette 59, das zum Probenbehälter 3 gehört. Das Fach 59 ist ausgestaltet, um eine geformte Kontur um die Kassette 1 herum auszubilden und die Kassette 1 innerhalb des Probenbehälters 3 für die Lagerung und den Transport, wie in 2 dargestellt, sicher aufzubewahren. Das Fach 59 ist an seiner Peripherie durch die geformte Mittelwand 69, einer Rückwand 70 gegenüber der Mittelwand, zwei Teilwände 71, 72 und einen Boden 73 definiert. Die Mittelwand 69 ist ausgestaltet worden, um den Abmessungen zu entsprechen, die durch den Teil der Kassette 1 definiert wird, der die Längswand 10 des Rahmens 4 und des Aufsatzes 36, der, wie in 2 dargestellt, auf dem hervorstehenden Segment 13 des Rahmens 4 gesichert wird, umfasst. In der Mitte der Mittelwand 69 befindet sich ein ausgewölbter Abschnitt 74, der einen Halbkreis ausbildet, der sich zum Bord 60 krümmt und derartige Abmessungen aufweist, dass es den Teil der Kassette 1, der durch den Einzelanschluss 54 definiert wird, wobei der durch die Krümmung des ausgewölbten Abschnitts 74 definierte Bogen im Wesentlichen dem Bogen der Krümmung ähnelt, der durch den Einzelanschluss 54 definiert wird, so dass der ausgewölbte Abschnitt 74 im Wesentlichen einen einheitlichen Kontakt mit der Peripherie des Einzelanschluss 54 ausbildet, gleitend aufnehmen kann. Die Mittelwand 69 erstreckt sich in gerader Linie auf beiden Seiten des gewölbten Abschnitts 74, knickt senkrecht auf beiden Seiten zur Rückwand 70 hin ab, um eine Form auszubilden, die den Aufsatz 36 der Kassette 1 umgibt und knickt wiederum senkrecht auf beiden Seiten ab und setzt an den beiden Seitenwände 62 und 63 an. Auf diese Weise bildet die Mittelwand 69 eine Form, die im Wesentlichen einen gleichmäßigen Kontakt mit der Oberfläche der Kassette, die durch die Seite der Kassette 1, die den Halter 5 enthält, ausgebildet wird, ausbildet. Sich nahe an jeder Ecke des gewölbten Abschnitts 74 befindend und der Rückwand gegenüberliegend, befinden sich ein Paar Befestigungsclips 75, 76 in Verbindung mit dem Paar Rückhalteplatten 83, 84, die im Folgenden noch diskutiert werden, zum sicheren Halten der Kassette 1 innerhalb des Lagerfachs 59. Die Befestigungsclips 75, 76 sind mit Abstand zum Boden 73 angeordnet, so dass sie die Ecke des Aufsatzes 36, welcher die Ecke umfasst, die durch die vordere Wand 44 und Oberseite 48 des Aufsatzes 36 der Kassette 1 ausgebildet wird, wenn die Kassette innerhalb des Fachs 59 des Probenbehälters 3 mit der Rückseite zum Boden 73 gewandt, wie in 2 dargestellt, angeordnet ist, ergreift. Die beiden Teilwände 71, 72 erstrecken sich von der Rückwand 70 weg über etwa 1 Zentimeter und haben die gleiche Höhe wie die Rückwand 70. An jeder Ecke, die durch die Teilwände 71, 72 und die Rückwand 70 ausgebildet wird, erstreckt sich eine Säule 77, 78 vom Boden 73 bis zur Kante der Wände 70, 71, 72. Jede Säule 77, 78 liegt mit zwei Seiten an jeder Ecke, sie bilden eine Seite 79, 80 aus, die sich senkrecht von jeder der Teilwände 71, 72 erstreckt und sich über eine Entfernung aufeinander zu bewegen, die etwa gleich der Entfernung von jeder Kante ist, die durch die Seite 9 und den Rahmen 4 der Kassette 1 bis zur Basis des äußeren Paars der Schutzfortsätze 8 ausgebildet wird, und Winkel zur Rückwand 70, deren Winkel dem Winkel des äußeren Paares der Schutzfortsätze 8 entsprechen, um eine abgewinkelte Seite 81, 82 auszubilden. Die Säulen 77, 78 haben die Aufgabe, die Seiten der Kassette 1 festzuhalten, welche die Längsseite 9 des Rahmens 4 und die Schutzfortsätze 8 umfassen, die sich von der Längsseite 9 her erstrecken, wobei die Spitzen der Schutzfortsätze 8 gegen die Rückwand 70 lehnen und die Ecken der Längsseite 9 der Kassette 1 lehnen gegen die Seiten der Säulen 79, 80 und der Teilwände 71, 72, wie in 2 dargestellt. Sich von jeder der Ecken, die durch die Teilwände 71, 72 und die Seiten der Säulen 79, 80 ausgebildet werden, erstreckend, befindet sich eine schmale Rückhalteplatte 83, 84, die ein Quadrat mit Seiten gleicher Breite zur angrenzenden Seite der Säule 79, 80 ausbildet und in einem Abstand vom Boden 73 angeordnet ist, so dass die Vorderseite des Teils des Schlittens, der sich an die Ecken anschließt, die den Schutzfortsätzen 8 der Kassette 1 am nächsten liegen, derart gegen die Unterseite jeder Rückhalteklappe 83, 84 lehnt, dass die Kassette 1 innerhalb des Lagerfaches 59 des Probenbehälters 3, wie zuvor bereits diskutiert worden ist und in 2 dargestellt, gesichert wird. Zum Verbinden der Basis der Ecken, die durch die zentrale Wand 69 und die kurzen Wände 62, 63 ausgebildet werden, mit den Enden der Teilwände 71, 72 gibt es eine gekrümmte Kante 85, 86, die dazu dient, dass Entfernen der Kassette 1 aus dem Lagerungsfach 59 zu erleichtern. Die gekrümmten Kanten 85, 86 krümmen sich nach innen, um einen Bogen auszubilden, welcher zur Form eines menschlichen Fingers komplementär ist und erheben sich in einem Abstand über den Boden 63, der für Abschnitte der Kanten der Seitenwände 11, 12 des Rahmens 4 der Kassette 1 ausreichend ist, um sich gegen die gekrümmten Absätze 85, 86 zu lehnen, wenn sie innerhalb des Lagerungsfaches 59 des Probenbehälters 3, wie in 2 dargestellt ist, gesichert werden. Sich von der Rückwand 70 nach innen erstreckend und entlang konvergierender Achsen befinden sich drei Streben 87, 88, 89 zum Bereitstellen einer Stütze für die Kassette 1, während diese durch Verankerung an den vorderen Verbindungsstellen der Aufnahmekammern 19 des Rahmens 4 und der Ecke der Kante, die durch die Längsseite 9 des Rahmens 4 ausgebildet wird, im Lagerungsfach 59 des Probenbehälters 3 angeordnet ist. Die Streben 87, 88, 89 weisen Abmessungen auf, die einen distalen Kontakt der Aufnahmekammer 19 -Verbindungen ermöglichen, während sie einen Weg für die engen Schächte 20 bereitstellen. In einer dargestellten bevorzugten Ausführungsform umfassen die Streben 87, 88, 89 drei enge Wände, können jedoch auch drei Fortsätze entlang der Rückwand 70 und drei Fortsätze zum Verbinden mit den zuvor beschriebenen Verbindungsstellen umfassen. Entlang der Außenkanten aller Außenwände 62, 63, 70, 71, 72 gibt es eine 3 Millimeter breite Kante 90, welche die physikalische Abstützung des Probenbehälters 3 unterstützt.
11 stellt eine perspektivische Darstellung einer anderen Ausführungsform des Probenbehälters 103 dar. Der Probenbehälter 103 umfasst vier gleichmäßig beabstandete auf einem Bord 160 getragene Kammern 157 zum Aufnehmen von Aliquots eines fluoreszierend markierten Konjugat-Reagenzes und/oder einer Probe, wie in einer oben bereits diskutierten bevorzugten Ausführungsform, und einen Sammelbehälter 158 zum Aufnehmen eines Fluids, wie z. B. flüssigem Abfall; er wird definiert durch das Bord 160, drei Wände 162, 163, 170 und einen Boden 173. Der Probenbehälter 103 bildet ein Quadrat, dass bevorzugt die gleichen Abmessungen aufweist, wie eine bevorzugte Ausführungsform des zuvor bereits diskutierten Behälters 3. Die beiden Wände 162, 163, die senkrecht zum Bord 160 verlaufen, sind bevorzugt etwa 1.4 Zentimeter hoch, und die Wand 170 auf der gegenüberliegenden Seite des Bord 160 ist bevorzugt etwa 9.5 Millimeter hoch. Sich entlang der Oberkante der Wände 162, 163, 170 erstreckend, liegt eine etwa 3 Millimeter Kante 190, welche die physikalische Abstützung des Probenbehälters 3 unterstützt. Die vier Kammern 157 sind entlang des Bords 160 in einer gleichmäßig beabstandeten Weise angeordnet, sie haben bevorzugt die gleichen Abmessungen wie die Kammern 57 einer zuvor bereits diskutierten bevorzugten Ausführungsform. Die Kammern 157 beinhalten bevorzugt eine rostfreie Scheibe oder Platte 165 zum Vermengen eines getrockneten Reagenzes, das auf den Boden der Kammer 157 ruht, wahlweise kann die Scheibe mit dem Reagenz beschichtet sein. Das Reagenz wird rekonstituiert, wenn eine Lösung, die wahlweise eine Probe enthält, in die Kammer 157 gegeben wird. Die Kammern enthalten eine Rückhaltekante 166, die der Rückhaltekante 66 einer zuvor bereits beschriebenen bevorzugten Ausführungsform ähnelt. Das Bord 160 hat bevorzugt die gleichen Abmessungen wie das Bord 60 der oben diskutierten bevorzugten Ausführungsform mit einer Wand 176, die sich bis auf den Boden 173, bevorzugt ähnlich der korrespondierenden Wand 67 einer oben diskutierten bevorzugten Ausführungsform, erstreckt.
In der in 11 dargestellten alternativen Ausführungsform wird der Sammelbehälter 159 durch die drei Wände 162, 163, 170, das Bord 167 und den Boden 173 definiert und, wie oben bereits erwähnt, arbeitet in gleicher Weise, um ein Fluid zu enthalten, wie z. B. flüssigen Abfall, wie es der Sammelbehälter 59 einer bereits oben diskutierten bevorzugten Ausführungsform tut. Bevorzugt etwa 3.2 Zentimeter vom Rand des Bords 160 angeordnet, liegt eine Schräge 195, die sich quer durch den Sammelbehälter 159 von einer Seite bis zur anderen 162, 163 erstreckt. Die Schräge 195 ist bevorzugt etwa 4.7 Millimeter breit und fällt in einem etwa 45° Winkel ab, um ein zweites Bord 196 etwa 3.2 Millimeter über dem Boden 173 und etwa 1 Zentimeter tief auszubilden. Die Schräge 195 dient dazu ein Fluid, bevorzugt flüssig, davor zu bewahren, gegen die Rückwand 170 gespritzt zu werden, wenn der Probenbehälter 103 gekippt wird. Die Kassette 1 kann in dieser Ausführungsform des Probenbehälters 103 auch durch Flachlegen auf den Boden 173, so dass die Schutzfortsätze 8 der Rückwand 170 gegenüber liegen, gelagert werden. Die Kassette 1 kann im Probenbehälter 103 durch eine Kunststoffabdeckung oder durch ähnliche Mittel gesichert werden.
12 ist eine perspektivische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform der Apparatur 200 für die Verwendung mit der Kassetten 1 und Probenbehälter 3 -Kombination. 13 ist eine Transparentdarstellung einer bevorzugten Ausführungsform der Apparatur 200, welche die kritischen internen Komponenten zeigt. Bezugnehmend auf die 12 und 13 umfasst die Apparatur 200 eine Präparationsstation 201, eine Zentrifuge 202 zum Trocknen der Kapillarröhrchen 2, eine Station zur Signalerzeugung und -Detektion 203 zum Messen des Signals, einen alphanumerischen Tastaturcontroller 204, um ein Interagieren zwischen dem Operator und der Apparatur 200 zu ermöglichen, eine Flüssigkristallanzeige (LCD) 205 zum Darstellen von Input- und Output-Nachrichten und analytischen Ergebnissen, die durch eine im Folgenden noch zu diskutierende Computervorrichtung erzeugt werden, und einen Drucker 206 zum Ausdrucken der Ergebnisse.
Nochmals bezugnehmend auf 12 und 13 umfasst die Präparationsstation 201 einen Sammelbehälter 207, der ein Fluid beinhalten kann, eine Leitung 208 zum Transportieren des Fluids zu einem Anschluss 209, eine Spritze 210 zum Aufziehen einer Probe zum Anschluss 209 und zum Pumpen von Fluid vom Sammelbehälter 207 durch den Anschluss 209; ein erster Abschnitt umfasst eine zuvor bereits beschriebene Luer-Bohrung 211 zum Anschließen des Einzelanschlusses 54 der Kassette 1 an den Anschluss 209 und um eine Fluidverbindung mit dem Anschluss 209 der Apparatur 200 zu ermöglichen; ein zweiter Abschnitt umfasst einen Behälterhalter 212 zum Festhalten des Probenbehälters 3 und eines Magnetrührers 213 zum Vermengen von Flüssigkeit in den Kammern 57. Der Magnetrührer 213 ist unter dem Behälterhalter 212 in eine Art und Weise angeordnet, um sich an den Kammern 57 des Probenbehälters 3 auszurichten, wenn der Probenbehälter 3 im Behälterhalter 212 angeordnet ist. Die Zentrifuge 202 wird in einem schützenden Fach 214 aufbewahrt und umfasst eine Platte, die dazu in der Lage ist, sicher in die Kassette 1 einzugreifen. Die Station zur elektromagnetischen Signalerzeugung und -Detektion 203 umfasst ein Mittel zur Signalerzeugung 215, wie z. B. einen Laser oder eine Wolframlampe, die dazu geeignet ist, ein elektromagnetisches Signal einer geeigneten Wellenlänge zu emittieren, um eine Anregung und Fluoreszenz einer fluoreszierende Verbindung in der Proben-Reagenzmischung zu bewirken, und ein Mittel zur Signaldetektion 216, wie z. B. einen Photonendetektor zum Detektieren von Fluoreszenz, wobei der Photonendetektor einen Photomultiplier, eine Photoröhre, eine Photozelle oder eine Silikondiode umfassen kann, und bevorzugt eine Silikondiode umfasst.
14a ist ein Blockdiagramm der Apparatur einer bevorzugten Ausführungsform, welche das Zusammenwirken der elektronischen Teile untereinander darstellt und 14b ist ein ähnliches Blockdiagramm der Apparatur, welches dem Durchschnittsfachmann bekannte Bezeichnungen zahlreicher Komponenten darstellt. Eine logik- und motorkontrollierte Platinenbaugruppe (PCA) 300, im Folgenden als Kontroll-PCA bezeichnet, hat die Aufgabe eine Verbindung mit den zahlreichen Komponenten der Apparatur 200 zu kontrollieren. Ein 40-adriges Flachbandkabel 301, das mit zwei 40-poligen Flachbandbuchsen 302, 303 verbunden ist, hat die Aufgabe, die Kontroll-PCA 300 mit einer Abzweigungs-PCA für die Präparationsstation 304 zum Kontrollieren der zahlreichen Komponenten der Präparationsstation 201 zu verbinden.
Die elektrischen Komponenten, die mit der PCA für die Präparationsstation 304 verbunden sind, umfassen das folgende:
einen Motor für die Spritze 305 zum Steuern und genauem Kontrollieren der Bewegung der Spritze 210, wobei der Motor für die Spritze 305 mit der PCA für die Präparationsstation 304 über einen ersten 8-poligen Amplitudenmodulator 306 verbunden ist;
einen Motor für den Rührer 307 zum Steuern des Magnetrührers 213, wobei der Motor für den Rührer 307 mit der PCA für die Präparationsstation 304 über einen zweiten 8-poligen Amplitudenmodulator 308 verbunden ist;
einen Aufzugsmotor 309 zum Bewegen des Behälterhalters 212, um den Probenbehälter 3 richtig unter der Kassette 1 anzuordnen, wobei der Aufzugsmotor 309 mit der PCA für die Präparationsstation 304 über einen dritten 8-poligen Amplitudenmodulator 310 verbunden ist;
ein Ventil 311 zur Kontrolle der Flussrichtung des Fluids, das in dem Sammelbehälter 207 enthalten ist, wobei das Ventil 311 mit der PCA für die Präparationsstation 304 durch einen 6-poligen Amplitudenmodulator 312 verbunden ist;
einen Sensor für die Spritze 313 zum Überwachen der Position der Spritze 210, wobei der Sensor für die Spritze 313 mit der PCA für die Präparationsstation 304 über einen vierten 8-poligen Amplitudenmodulator 314 verbunden ist;
einen Sensor für den Rührer 315 zum Überwachen der Position des Magnetrührers 213, wobei der Sensor für den Rührer 315 mit der PCA für die Präparationsstation 304 über einen fünften 8-poligen Amplitudenmodulator 316 verbunden ist; und
einen Sensor für den Aufzug 317 zum Überwachen der Position des Aufzugsmotors 309, wobei der Sensor für den Aufzug 317 mit der PCA für die Präparationsstation 304 über einen sechsten 8-poligen Amplidutenmodulator 318 verbunden ist.
Ein 16-poliger Amplitudenmodulator 319 verbindet die Kontroll-PCA 300 mit drei zusätzlichen PCA-Karten, einer Laser-PCA zum Kontrollieren der Arbeit des Mittels zur Signalerzeugung, wobei die Laser-PCA 320 mit der Kontroll-PCA 300 über einen 6-poligen Molex pocket header 321 verbunden ist; eine Vorverstärker-PCA 322 zum Amplifizieren eines photogenerierten Signals vor der Verarbeitung durch die Kontroll-PCA 300, wobei die Vorverstärker-PCA 322 mit der Kontroll-PCA 300 über einen 5-poligen Molex pocket header 323 verbunden ist; und eine Barcode-PCA 324 zum Verbinden mit einem im Folgenden noch zu diskutierenden gewerblich erhältlichen Barcodelesestift, wobei die Barcode-PCA 324 mit der Kontroll-PCA 300 über einen 4-poligen Molex pocket header 325 verbunden ist. Ein 18-poliger Amplitudenmodulator 326 verbindet die zahlreichen elektrischen Komponenten der Zentrifuge 202 mit der Kontroll-PCA 300. Die elektrischen Komponenten der Zentrifuge 202 umfassen einen Motor für den Rotor 327 zum Drehen der Zentrifuge 202, einen Sensor für die Rotortür 328 zum Detektieren der Öffnung der Tür des schützenden Faches 214 und einen Sensor für die Rotor-Ruhestellung 329 zum Erleichtern der Bestimmung der Position der Kassette 1, während sich diese in der Zentrifuge 202 befindet, um eine genaue Präsentation der Kassette 1 gegenüber der Station zur Signalerzeugung und -Detektion 203 zu ermöglichen. Ein 50-adriges Flachbandkabel 330, das mit zwei 50-poligen Flachbandbuchsen 331, 332 verbunden ist, verbindet eine periphere Adapter-PCA 333, welche die Aufgabe hat mit der alphanumerischen Tastatur 204, dem Drucker 206, der Flüssigkristallanzeige 205 und einem Audiosummer 334 zum Bereitstellen einer hörbaren Rückmeldung für den Operator über den funktionellen Status der Apparatur 200 zu interagieren. Eine auf der Rückseite der Apparatur 200 angeordnete Anschlussfeld-PCA 335 ist mit einem externen DC-Netzanschluss 336, einem RS-232-Anschluss 337 und einer Barcodelesestift-Eingangsverbindung 338 verbunden. Die Anschlussfeld-PCA 335 ist mit der Kontroll-PCA 300 über ein 10-adriges Flachbandkabel 339, das an jedem Ende mit einer 10-poligen Flachbandbuchse 340, 341 verbunden ist und über ein Stromkabel 342 verbunden. Der Hauptstrom für die Apparatur 200 wird über einen seriellen Zusammenschluss zwischen einem 110-Volt Eingangsstecker 343, einem Stromeingangsmodul 344, einem Signalumwandler 345 und einem AC-Eingangskabel 346, wie es in 14a und 14b dargestellt ist, geliefert. Zwei 2-polige Mini-Fit Molexanschlüsse 347 verbinden das AC-Stromkabel 346 und das DC-Stromkabel 342 mit der Kontroll-PCA 300. Der automatisierte, nicht operatorabhängige Teil der Apparatur 200 -Systemsoftware wird durch einen löschbares, programmierbares, ausschließlich lesbares Speicher(EPROM)-Modul 348 bereitgestellt, das mit der Kontroll-PCA 300 über einen 30-poligen Eckanschluss 349 verbunden ist.
Ein charakteristisches Immunoassay unter Verwendung von bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
15 zeigt eine vereinfachte Darstellung des Festphasen-Fluoreszenz-Immunoassays (SPFIA) einer bevorzugten Ausführungsform. In einem charakteristischen Immunoassay unter Verwendung einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind durch den Operator, wie in 12 dargestellt, die Kassette 1 und der Probenbehälter 3 auf der Präparationsstation 201 anzuordnen, dann werden 100 μl einer Probe, die eventuell einen entsprechenden Analyten enthält, wie z. B. Milch, die vermutlich β-Lactamantibiotika enthält, in eine oder mehrere im Probenbehälter 3 angeordnete Kammern 57 gegeben, die ein getrocknetes Stabilisierungsreagenz enthalten, das einen Antikörper für den entsprechenden Analyten umfasst, wobei der Antikörper mit einem stark fluoreszierenden Marker, wie z. B. einem Cyaninfarbstoff (Cy-5^®), Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin und Allophycoerythrin oder jegliche andere Verbindung mit einer ausreichenden Quantenausbeute oder Effizienz, um eine geeignete Fluoreszenz bereitzustellen und das mit keiner Reaktion des Immunoassays wechselwirken wird oder mit einer biolumineszierenden Verbindung konjugiert ist. Ein mit der Kassette 1 und dem Probenbehälter 3 -Kombinationskit bereitgestellter Barcode wird dann mittels eines herkömmlich erhältlichen Standardbarcodelesestiftes, der mit der Barcodelesestift-Eingangsverbindung 338 verbunden ist, um Informationen zur Kalibrierung der Apparatur 200 bereitzustellen, ausgelesen. Zum Beispiel kann der Barcode den Schwellenwert der Fluoreszenz für ein positives oder negatives Ergebnis für ein bestimmtes Immunoassay enthalten. Der Operator gibt dann zusätzliche Informationen über den alphanumerischen Tastaturcontroller 204 ein und startet anschließend die Apparatur 200. Die Probe und das fluoreszierend markierte Konjugat-Reagenz werden dann, während sie in der Kammer 57 vorliegen, durch das Anlegen eines magnetischen Feldes, für das der Magnetrührer 213, der unter dem Behälterhalter 212 der Apparatur 200 angeordnet ist, sorgt, so dass die Metallscheibe 65 sich herumdreht, rotiert oder herumrührt, um die Probe und die Konjugat-Reagenz-Kombination für eine ausreichende Zeit zum Binden des fluoreszierend markierten Konjugats und des Analyten entsprechend zu vermengen, vermengt. Die Kassette 1 ist über den Einzelanschluss 54 auf dem Aufsatz 36 der Kassette 1 mit der Luer-Bohrung 211 der Präparationsstation 201 der Apparatur 200 verbunden und ist oberhalb des Probenbehälters 3 mit der Vorderseite der Kassette 1 dem Sammelbehälter 58 gegenüberstehend angeordnet. Innerhalb der Kassette 1 ist jedes Kapillarröhrchen 2 zumindest zum Teil auf der inneren Oberfläche mit einem Antigenanalogon des oder einem Nachahmer des entsprechenden Analyten beschichtet. Der Probenbehälterhalter 212 und damit auch der Probenbehälter 3 werden durch den Aufzugsmotor 309 angehoben, so dass die Spitzen der Kapillarröhrchen 2 mit jeder Probe und jeder fluoreszierend markierten Konjugat-Reagenzmischung in den Kammern 57 in Kontakt kommen. Der Probenbehälter 1 ist auf eine Art und Weise ausgerichtet, die es der Kassette 1 ermöglicht, so angeordnet zu werden, dass die Kapillarröhrchen die Probe und die fluoreszierend markierte Konjugat-Reagenzmischung in einer ausreichenden Tiefe und in einem ausreichenden Winkel penetrieren können, um eine ausreichende Menge der Probe und der fluoreszierend markierten Konjugat-Reagenzmischung in jedes Kapillarröhrchen 2 zu ziehen. Die Probe und die fluoreszierend markierte Konjugat-Reagenzmischung werden dann über die Kapillarkraft und Ansaugen mit Hilfe der verwendeten Spritze 210 zum Einzelanschluss 54 des Aufsatzes 36 der Kassette 1 gezogen, und es wird ihnen dann ermöglicht, für einen Zeitraum in einem oder mehreren Kapillarröhrchen 2 zu inkubieren, währenddessen ein Prozentsatz des nicht an den Analyten gebundenen fluoreszierend markierten Konjugates an das Antigen, das von dem Substrat umfasst wird, dass die Kapillarröhrchen 2 -wände umfasst, binden wird. wenn eine verhältnismäßig große Menge des Analyten in der Probe vorhanden ist, wird sehr wenig fluoreszierend markiertes Konjugat an das Substrat der Kapillarröhrchen 2 -wände binden, und wenn eine verhältnismäßig kleine Menge des Analyten in der Probe vorhanden ist, wird eine große Menge des fluoreszierend markierten Konjugates an das Substrat der Kapillarröhrchen 2 -wände binden.
Nach der Inkubationsperiode wird eine im Sammelbehälter 207 der Apparatur 200 befindliche Flüssigkeit mittels der Spritze 210 durch jedes Kapillarröhrchen 2 über die Luer-Bohrung 211 und dem auf dem Aufsatz 36 befindlichen Einzelanschluss 54 gepumpt. Die Flüssigkeit tritt dann in die Kammer ein, welche durch die Wanne 52 und den Fassungsunterbau 37 ausgebildet wird, und tritt anschließend in jedes Kapillarröhrchen 2 ein. Die Flüssigkeit stoppt die Reaktion und wäscht überschüssiges Fluid aus jedem Kapillarröhrchen 2. Vor oder gleichzeitig mit dem Pumpen der Flüssigkeit in jedes Kapillarröhrchen 2 richtet der Aufzugsmotor 309 den Probenbehälterhalter 212 und damit auch den Probenbehälter 3 aus, damit die Kapillarröhrchen 2 über dem Sammelbehälter 58 innerhalb des Probenbehälters 3 angeordnet werden, so dass das aus jedem Kapillarröhrchen 2 gepumpte Fluid in den Abfallsammelbehälter 58 des Probenbehälters 3 ausgestoßen wird. Der Probenbehälter 3 wird dann beiseite gelegt und die Kassette 1 wird eingelegt und durch die Zentrifuge 202, die auf der Apparatur 200 für die Verwendung mit der Kassetten 1 und Probenbehälter 3 -Kombination angeordnet ist, getrocknet. Nach dem Trocknen und während sie sich in der Zentrifuge 202 befindet, wird die Kassette 1 vor dem Mittel zur Signalerzeugung 215 angeordnet, so dass die frei gelegte Öffnung 7 des Rahmens 4 es dem Mittel zur Signalerzeugung 215 erlaubt, ein Signal zu emittieren, das im Wesentlichen das Kapillarröhrchen 2 durchdringt. Das Mittel zur Signaldetektion 216, das in Nachbarschaft zum Mittel zur Signalerzeugung 215 liegt, detektiert dann jede Fluoreszenz, die durch das gebundene Konjugat, welches den Fluoreszenzmarker enthält, emittiert wird. Dieses Signal wird dann durch den EDV-Teil der Apparatur 200 verarbeitet und die Anwesenheit des Analyten, alternativ dazu die Menge des vorhandenen Analyten, bestimmt, wo die Analytkonzentration umgekehrt proportional zum Fluoreszenzniveau in dieser bevorzugte Ausführungsform (ein kompetitives Assay) ist. 16a–d bis 17a–b zeigen graphische Darstellungen der genormten Fluoreszenz gegen die Konzentration von sechs β-Lactamantibiotika in Teilen pro Millionen bei unterschiedlichen Konzentrationsniveaus. Eine angenäherte Polynomanpassung der durch die Mehrfachpunkte generierten Kurven kann von der Apparatur 200 verwendet werden, um ein quantitatives Ergebnis bereitzustellen, wobei der EDV-Teil der Apparatur 200 die Menge des Analyten in der Probe durch graphisches Darstellen der beobachteten Niveaus der Fluoreszenz auf den geeigneten Kalibrationslinien für den einzelnen Analyten interpoliert und die entsprechende Konzentration für dieses Fluoreszenzniveau bestimmt.
In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sei darauf hingewiesen, dass der Operator nur die Schritte zum Anordnen des Probenbehälters 3 in dem Probenbehälterhalter 212, das Zugeben einer Probe zum Probenbehälter 3, optional das Auslesen des Barcodes, das Starten der Apparatur 200, das Umsetzen der Kassette 1 in die Zentrifuge 202 und das Entsorgen der Kassette 1 und des Probenbehälters 3 durchführt. Die Apparatur 200 führt alle anderen Schritte des oben diskutierten Immunoassays durch.
Alternative Ausführungsformen und Abwandlungen von bevorzugten Ausführungsformen
Auch wenn die vorliegende Erfindung in beachtlichem Detail mit Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, sind andere Ausführungsformen möglich. Zum Beispiel sind Abwandlungen der Kassette innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung, so wie sie durch die angehängten Ansprüche beschrieben werden, möglich.
Eine bevorzugte Abwandlung für die Immunoassaychemie ist es, einfach den Marker und den Bindungspartner im kompetitiven Fluoreszenz-Immunoassay einer bevorzugten Ausführungsform auszutauschen. Das heißt, dass das fluoreszierend markierte Konjugat-Reagenz ein analoges Antigen des oder Nachahmer des Analyten enthalten kann, wobei das Antigen mit dem Fluoreszenzmarker konjugiert ist; und der Antikörper des Analyten auf der Oberfläche der Kapillarröhrchens gebunden ist. In diesem Fall konkurriert das fluoreszierend markierte Antigenkonjugat mit dem Antigen des Analyten um Bindungsstellen auf dem Antikörper, der auf der Oberfläche der Kapillarröhrchen gebunden ist. Wie in dem kompetitiven Fluoreszenz-Immunoassay einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fluoreszenzniveau umgekehrt proportional zur Menge des Analyten in der Probe sein.
Zusätzlich zu den bereits oben beschriebenen kompetitiven Fluoreszenz-Immunoassays der bevorzugten Ausführungsformen kann auch ein nicht kompetitives Sandwich-Fluoreszenz-Immunoassay verwendet werden. In diesem Fall wird die Probe mit einem fluoreszierend markierten Konjugat-Reagenz vermengt und in das Kapillarröhrchen aufgezogen. Der Analyt bindet an das Konjugat und an einen Bindungspartner zum Einfangen auf dem Substrat, das eine Oberfläche des Kapillarröhrchens mit einbezieht. Das Kapillarröhrchen wird gewaschen, wahlweise getrocknet und einem Mittel zur Signalerzeugung und einem Mittel zur Signaldetektion ausgesetzt, um das Fluoreszenzniveau zu messen. In einem Sandwich-Immunoassay wie diesem ist die Menge an Fluoreszenz direkt proportional zur Menge des Analyten in der Probe.
Obwohl ein oben als bevorzugte Ausführungsform beschriebenes Immunoassay ein kompetitives Inhibitions-Immunoassay ist, das einen Fluoreszenzmarker verwendet, können ebenso andere Immunoassay-Verfahren genutzt werden. Diese beinhalten ELISA-Sandwich-Immunoassays, wobei eine Analytenprobe mit einem freien Antikörper des Antigens vermengt wird und danach gewaschen und mit einem enzymgebundenen Antikörper, der für ein anderes Epitop des Analyten spezifisch ist, weiter vermengt wird. Jeder freie Antikörper wird dann weggewaschen und ein Enzymsubstrat wird zugegeben, um mit der Enzymmixtur einen Komplex zu bilden. Der Nachweis des Analyten kann dann kolorimetrisch oder über andere Mittel bewirkt werden, wobei das Niveau des Signals positiv mit der Konzentration des zu detektierenden Analyten korrelliert wird.
Wie oben bereits angemerkt, können Änderungen am Immunoassay unterschiedliche Marker erfassen, wie z. B. Enzyme für die Verwendung bei einem nicht kompetitiven Immunoassay. Auf die gleiche Weise kann ein Enzymmarker in einem kompetitiven Immunoassay verwendet werden, wobei die Detektion eines durch eine UV-Lampe erzeugten Signals über einen UV-Detektor für das Absorptionsvermögen erfolgt und das ausgelesene Absorptionsvermögen in negativer Beziehung zur Konzentration des Analyten in der Probe steht. Alternativ dazu kann der Durchschnittsfachmann bekannte RIA-Immunoassays zusammen mit einer geeigneten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwenden.
Die Abmessung der Kassette und des Probenbehälters können abhängig von der einzelnen Anwendung und Verwendung von dem bereits beschrieben abweichen. Alles was benötigt wird, sind Abmessungen, die für die Verwendung mit einer Apparatur geeignet sind, die beliebige analytische Instrumente umfasst, die ausreichend sind, um das ausgewählte Immunoassay durchzuführen. Zum Beispiel erfassen diese Abmessungen eine Kapillarröhrchenlänge, die ausreichend ist, um eine Substratmenge und eine Probenmischung zu enthalten, eine Kassette, die einen Bereich umfasst, der dazu geeignet ist, wenigstens einen Teil jedes Röhrchens einem emittierten Signal auszusetzen, und einen Probenbehälter mit Kammern darin, die ausreichend sind, um eine Probe und eine Reagenzlösung aufzunehmen. Darüber hinaus kann wahlweise ein Sammelbehälter mit einem Abfallbeseitigungsmittel enthalten sein, das ein Vakuumsystem umfasst, das zum Beispiel mit der Kassette verbunden ist, wobei das entnommene Produkt der Kapillarröhrcheninhalte in einem separaten Behälter oder einer Kammer enthalten ist.
In vielen Fällen wird die Apparatur, die Kassette oder die Röhrchengestaltung von der Art des verwendeten Immunoassays, der Instrumentation, mit der das Objekt wechselwirkt und Bedingungen, unter denen das Objekt verwendet wird, abhängen. Immunoassays, die für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung oder Abwandlungen davon angepasst werden können, beinhalten ein ELISA, ein RIA und ein FIA, wie zuvor bereits diskutiert, können jedoch ebenso andere Bioassays beinhalten, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf zahlreiche andere Immunoassays, die andere Marker, wie z. B. Enzyme, Isotope, fluoreszierende und biolumineszierende Verbindungen, physikalische Konstrukte, Reaktanden und andere für die Verwendung in Kapillarröhrchen geeignete Bioassays, verwenden. Die Ausstattung kann maßgeschneiderte oder handelsübliche analytische Instrumente beinhalten, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf Spektrophotometer, Chromatographen zum Sammeln von Fraktionen des Immunoassays, Zählvorrichtungen, Densitometer, diagnostische Instrumente und forensische Instrumente; und andere Instrumente, die für die Verwendung mit einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung notwendig sind. Bedingungen für die Verwendungen beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf klinische Laboratorien, die Verwendung im Feld, wie z. B. im Freiland und/oder in der Landwirtschaft, der Molkerei und gewerblichen Einrichtungen; und in Forschungs- oder Kriminallaboratorien. Alternative Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können daher verwendet werden, um sie an die obigen Verwendungen, Bedingungen für die Verwendung, und die Zusammenarbeit mit anderen Vorrichtungen anzupassen.
Die Kassette kann im Wesentlichen aus einer Einheit mit den beschichteten Kapillarröhrchen bestehen, die in der Kassette kraftschlüssig versiegelt sind. Alternativ dazu können die Kapillarröhrchen in der Kassette durch ein anderes Mittel als durch Reibung, wie z. B. eine adhäsive Abdichtung, versiegelt werden. Noch eher als radial können die Kapillarröhrchen linear beabstandet werden. In diesem Fall erfolgt die Trocknung bevorzugt über andere Mittel als durch Zentrifugation, wie z. B. durch Luftrocknung, durch Reinigen mit einem Gas, wie z. B. Stickstoff; oder durch ein Vakuum. Die Kassette kann eine Vielzahl von Kammern aufweisen, wobei jede unabhängig mit jedem Kapillarröhrchen verbunden ist. In diesem Fall kann eine noch größere Vielfalt von Immunoassays in jedem Kapillarröhrchen durchgeführt werden, einschließlich der Verwendung von unterschiedlichen detektierbaren Ereignissen und Mitteln zur Detektion. Der Schutz der Kapillarröhrchen kann ebenso durch verschiedenartige Mittel bewerkstelligt werden, wie z. B. die Verwendung einer eingehängten Abdeckplatte, die optional über den Spitzen der Kapillarröhrchen angeordnet werden kann und von den Kapillarröhrchen entfernt werden kann, wenn Flüssigkeit aufgezogen oder zu den Kapillarröhrchen zugegeben wird, oder die Kapillarröhrchen können in und aus der Kassette geschoben werden. Der Bereich der Kassette zum Freilegen jedes Kapillaröhrchens gegenüber einem Mittel zur Signaldetektion kann ebenfalls gestaltet werden, so dass nur eine Seite der Kassette offen ist, da im Falle von Fluoreszenz-Immunoassays das Mittel zur Signalerzeugung und Mittel zur Signaldetektion zueinander benachbart sein können. Zusätzlich kann eine klare Kunststoffhülle über der frei liegenden Öffnung 7 angeordnet sein, um die Kapillarröhrchen vor Beschädigung zu schützen.
Eine Ausführungsform einer einteiligen Anordnung ist eine Kassette, in der die Kapillarröhrchen innerhalb der Kassette, die eine zentrale Öffnung zum Freilegen gegenüber einem Mittel zur Signaldetektion aufweist, linear beabstandet sind. Auf einer Seite der Kapillarröhrchen kann eine Aufnahmekammer zur Aufnahme einer Probe, wie z. B. Milch, liegen. Eine Spritze auf der anderen Seite der Kapillarröhrchen kann verwendet werden, um Proben in die Kapillarröhrchen aufzuziehen. Zum Einleiten der Immunoassayprobe in die Aufnahmekammer, steht diese über Durchgänge, die mit einzelnen Kammern für Reagenzien in Fluidverbindung mit jedem Kapillarröhrchen verbunden sind, in Kontakt mit den Kapillarröhrchen. Die Reagenzkammern können Reagenzien enthalten, so dass eine Rückwärtsbewegung der Spritze eine Probe in diese Kammern ziehen kann, und das Vermengen lassen von Probe und Reagenz in jeder Kammer durch magnetische oder andere Mittel, die hier diskutiert werden oder dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, gestoppt wird. Die Rückwärtsbewegung der Spritze kann dann fortgesetzt werden und dazu genutzt werden, die Reagenz-Probenmischung aus der Mischungs/Reagenzkammer in die Kapillarröhrchen zu ziehen, damit eine Inkubation und eine Immunoassayreaktion stattfinden kann. Die gleiche Spritze kann verwendet werden, um ein Fluid über einen Durchlass, der mit dem distalen Ende jedes Kapillarröhrchens verbunden ist, zu treiben, wobei eine dritte Kammer, die z. B. Waschflüssigkeit enthält, über ein Ventil oder Funktionsmittel geöffnet werden kann, so dass eine Vorwärtsbewegung der Spritze das Fluid in den Durchgang und durch jedes Kapillarröhrchen zwingt. In dieser Ausführungsform wäre ein Trocknungsschritt nicht erforderlich.
Die Kassette kann ebenso eine vollkommen andere Form aufweisen. Zum Beispiel kann die Kassette eine Scheibe umfassen, wobei die Kapillarröhrchen über die ganze Scheibe hinweg radial beabstandet sind und eine Probe an der Außenseite der Scheibe zu den Kammern auf eine Art zugegeben werden kann, dass eine Probe in jedes Kapillarröhrchen gezogen werden kann, und in die erste Kammer durch gepumptes Fluid, das über einen Anschluss im Zentrum der Scheibe zu den Röhrchen zugegeben wird, ausgestoßen werden kann; oder anderen Abwandlungen einer kreisförmigen Kassette.
In ähnlicher Weise kann eine kreisförmige Scheibe verwendet werden, wobei die Probe zu einer ersten Kammer nahe dem Zentrum der Scheibe gegeben wird. Nach Einwirkung von Zentrifugalkräften kann die Probe, die auch mit einem Reagenz in der ersten Reaktionskammer reagieren kann, in Kapillarröhrchen oder innerhalb der Scheibe radial beabstandete Durchgänge aufgezogen werden, wobei eine oder mehrere zweite Kammern an der Außenseite der Scheibe und in fluider Anbindung mit den Kapillarröhrchen stehend, überschüssige Fluids sammeln oder für weitere Reaktionsschritte bereitstellen können. Abwandlungen dieser Ausführungsform können zusätzliche Kapillardurchgänge und/oder Kammern beinhalten. Alternativ dazu kann die Kassette ähnlich einem Tortenkeil geformt sein, so dass eine Vielzahl von Kassetten zusammengefasst werden kann, um einen Kreis zum Trocknen in einer Zentrifuge auszubilden oder um es zu ermöglichen, dass, wie zuvor bereits beschrieben, Reaktionen stattfinden.
Eine andere Ausführungsform ist eine „Gatling gun"-Anordnung, wobei die Kapillarröhrchen entlang der Außenseite der Längsseite eines Zylinders oder durch eine Scheibe oder eine Vielzahl von Scheiben, die Öffnungen zum Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen in einer kreisförmigen Art enthalten, beabstandet sind. In diesem Fall kann der Zylinder sich drehen, um ein bestimmtes Röhrchen zu einer Probenquelle oder zu einer Fluidquelle zum Waschen, Zugeben von Reagenz oder anderen gewünschten Fluids zu jedem Röhrchen bereitzustellen. Der Zylinder kann ebenso rotieren, um ein Kapillarröhrchen gegenüber einem Mittel zur Signalerzeugung und Detektion bereitzustellen. Alternativ dazu kann der Zylinder mit einem kreisförmigen Probenbehälter mit mehreren Kammern zur seriellen oder simultanen Probenentnahme und/oder Waschen und Ausstoßen von Fluid und sogar mehreren Mittel zur Signalerzeugung und Detektion zusammenwirken. Die kreisförmig beabstandeten Kapillarröhrchen können eine zentrale Spritze umgeben, die in Fluidverbindung mit den Kapillarröhrchen steht und Fluid in die Kapillarröhrchen aufzieht und/oder Fluid von den Kapillarröhrchen in beliebige Kammern und/oder Reaktionsstellen auf der Oberfläche der Kapillarröhrchen befördert.
Die Kassette kann ebenso aus einer im Wesentlichen rechteckige Form bestehen, in der eine Vielzahl von Kapillarröhrchen proportional beabstandet sind und in zwei Reihen angeordnet; z. B. sind Röhrchen in einer Kassette angeordnet, die eine frei gelegte Öffnung auf jeder Seite hat, die dadurch die simultane Detektion eines Analyten in zwei oder mehreren Proben ermöglicht. In dieser Ausführungsform können zwei Paare von Mitteln zur Signalerzeugung und Detektion simultan verwendet werden, wobei die Kassette so aufgebaut ist, dass jede Reihe von Kapillarröhrchen simultan oder unabhängig voneinander mit Mitteln zur Signalerzeugung und Detektion in Kontakt treten kann, wenn sie auf einer geeignet aufgebauten Apparatur, wie z. B. auf einem analytischen Instrument, befestigt ist.
Die Kassette kann ebenso aus verschiedenen Arten von Kunststoff hergestellt sein, wie z. B. Polyvinylchlorid, Polyethylenen, Polyurethanen, Polystyrolen, Polypropylenen und anderen Kunststoffmaterialien. Die Kapillarröhrchen können ebenfalls wahlweise aus Kunststoff hergestellt sein, wie z. B. Polyvinylchlorid, Polyurethanen, Polystyrolen, Polypropylenen, Polyethylenen und anderen Kunststoffmaterialien, die für gewöhnlich verwendet werden, um Kapillarröhrchen oder Schlauchmaterial herzustellen. Bevorzugt interferiert das ausgewählte Material weder mit der Chemie des Immunoassays noch mit irgendwelchen Analyten oder deren Produkten oder dem Mittel zur Signalerzeugung und Detektion. Bevorzugt erlaubt das ausgewählte Material eine kostengünstige und dadurch eine Einwegkassettenausführung.
Der Probenbehälter kann sich ebenfalls von einer bevorzugten und einer oben beschriebenen alternativen Ausführungsform unterscheiden. Er kann mehr als vier Probenkammern haben, größere oder kleinere Probenkammern, und sogar mehrere Abfallsammelbehälter oder andere Kammern. Alternativ dazu kann der Abfallsammelbehälter einen Schwamm oder ähnliche absorbierende Materialien umfassen. Er kann ebenso ein Vakuumsystem, das mit einem Abfallsammelbehälter, wie zuvor bereits diskutiert, in Fluidverbindung steht, und zahlreiche Materialien, bevorzugt kostengünstigen Materialien, wie zuvor bereits für die Kassette erörtert, umfassen.
Abwandlungen von bevorzugten Ausführungsformen der Apparatur zur Verwendung mit einer bevorzugten Kassette und einer Probenbehälterkombination, wie hier offenbart, sind ebenfalls möglich. Ein wichtiger Aspekt für eine alternative Ausführungsform der Apparatur zur Verwendung mit einer bevorzugten Ausführungsform der Kassette und dem Probenbehälter ist, dass Ausführungsformen der Apparatur mit der Kassette und dem Probenbehälter kommunizieren können, dass die Apparatur mit geeigneter Elektronik und/oder Optik für ein bestimmtes Immunoassay ausgestattet ist und dass die Apparatur zur Durchführung mit einem oder zum Anschluss an ein Instrument, dass ein automatisiertes Immunoassay durchführen kann, geeignet ist und das qualitative, semiquantitative und/oder quantitative Ergebnisse berechnet. Ein anderer Aspekt der Apparatur zur Verwendung mit einer bevorzugten Ausführungsform der Kassette und Probenbehälterkombination ist, dass die Apparatur einen geeigneten wesentlichen Teil der Mittel aufnimmt oder steuert, um das Fluid in und aus den Kammern, Kapillarröhrchen und Kammern zu bewegen.
Aspekte einer alternativen Ausführungsform der Apparatur zur Verwendung mit alternativen Ausführungsformen der Kassette und des Probenbehälters werden sich abhängig von der Auslegung der alternativen Ausführungsform der Kassette und des Probenbehälters unterscheiden, führen jedoch bevorzugt zu einem Immunoassay-Kapillarröhrchen und sind bevorzugt relativ einfach, schnell, zuverlässig und erfordern minimale Eingriffe durch den Benutzer.
Zahlreiche Abwandlungen einer bevorzugten Ausführungsform der Apparatur können zur Verwendung mit einem Fluoreszenz-Immunoassay oder anderen Immunoassays eingesetzt werden. Ein Vakuumsystem kann anstatt einer Spritze innerhalb oder in Zusammenarbeit mit der Apparatur eingesetzt werden, um Fluid aus den Kapillarröhrchen und/oder dem Probenbehälter zu entfernen. Auf die gleiche Weise können Mittel zum Vermengen der Probe und Reagenzien andere sein als mittels eines magnetischen Feldes, wie z. B. Schütteln durch Vibration oder durch physikalisches Vermengen.
Zahlreiche Arten spektroskopischer Geräte können ebenso eingesetzt werden. Solche Abwandlungen werden durch das Immunoassay, den entsprechenden Analyten und andere Kriterien vorgegeben und würden für den Durchschnittsfachmann offensichtlich sein. Diese Abwandlungen beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf die Verwendung von unterschiedlichen Mitteln zur Signalerzeugung, die beinhalten, jedoch nicht begrenzt sind auf Argonlampen, Xenonlampen, Wasserstofflampen, Deuteriumlampen, Wolframlampen, einen Nernststift, Nickelchromdraht, ein Globar und Hohlkathodenlampen oder anderen geeigneten Mitteln zur Signalerzeugung, die imstande sind, emittierte Signale zur Verfügung zu stellen, die geeignete Wellenlängen in einem oder mehreren Bereichen des ultravioletten, sichtbaren, Nahinfraroten, Infraroten, ferninfraroten Lichts abdecken; zahlreiche Wellenlängen-Selektoren, die beinhalten, jedoch nicht begrenzt sind auf Filter, die Differenzfilter und Glassabsorptionsfilter einschließen und Monochromatoren, die Prismamonochromatoren, wie z. B. Fluoridprismen, Quarzglass oder Quarzprismen, Glassprismen, Natriumchloridprismen und Kaliumbromidprismen einschließen; und Gitter; und zahlreiche Hilfssmittel zur Signaldetektion, die beinhalten, jedoch nicht begrenzt sind auf Photomultiplier, Photoröhren, Photozellen, Silikondioden und Halbleitern.
Abwandlungen der Mittel zur Signalverarbeitung können ebenso eingesetzt werden, um quantitative Ergebnisse, wie z. B. eine konstante automatische Kalibration der Mittel zur Signalerzeugung und Detektion, die Verwendung eines differenzierteren Analogons zum digitalen Konverter, die Verwendung von mehrstufigen Kalibrationskurven, z. B. eine Annährungsgerade für Kurven, wie z. B. den in den 16a–d bis 17a–b dargestellten, und der Datenverdichtung und Analysen, die statistische Analysen einschließen. Die Apparatur kann ebenso ein Computer-Diskettenlaufwerk zum Laden einer Computerdiskette zur Speicherung eines Ergebnisses, das durch die Mittel zur Signalverarbeitung und Berechnung in einer auf dem Computer speicherbaren Datei erzeugt wird, enthalten. Das Ergebnis kann über den RS-232-Anschluss an der Apparatur auf eine externe Computer- oder eine Speichervorrichtung zur anspruchsvolleren Datenverdichtung und Analyse transferiert werden. Es sollte bemerkt werden, dass die Verwendung eines löschbaren, programmierbaren, ausschließlich lesbaren Speicher(EPROM)Moduls, wie in einer bevorzugten Ausführungsform der Apparatur, es relativ einfach macht, die Software der Apparatur zu modifizieren, um sie an zahlreiche Immunoassay-Formate, Niveaus an Datenverdichtung und Analysen und Wechselwirkung mit externen und/oder internen Vorrichtungen und/oder Komponenten anzupassen.
Alternative Ausführungsformen der Apparatur können ebenso zahlreiche Niveaus der Automatisierung beinhalten. Eine Ausführungsform der Apparatur kann so ausgelegt werden, dass mit der autonomen Apparatur nur die Steuerung durch Instrumente möglich ist und alle Datenverdichtungen und Analysen durch einen Computer durchgeführt werden, der mit der Apparatur über einen Anschluss, wie z. B. einen RS-232, einen IEEE-488 (HP-IB), eine Anschlussverbindung und ähnliches verbunden oder vernetzt ist. In ähnlicher Weise kann die Steuerung der Apparatur durch eine Verbindung mit einem Computer, wie zuvor bereits beschrieben, automatisiert werden, in der alle Steuerungseingaben durch den Computer geregelt werden und durch einen Benutzer oder alternativ dazu durch ein Computerprogramm initiiert werden.
Zusätzlich kann eine bevorzugte Ausführungsform der Apparatur oder Abwandlungen davon mit Laborrobotern, wie z. B. zylindrischen, kartesischen und artikulierenden Robotern und ähnlichem verbunden werden, um die vollständige Automatisierung des Immunoassays zu ermöglichen. Die Robotervorrichtung kann programmiert werden, um eine Probe aus einem zentralen Behälter zu entfernen und zu jeder Kammer zuzugeben und alternativ dazu, um jegliche dem Assay vorgeschaltete Probenbearbeitung und notwendige Vorbereitung, wie z. B. Filtration, Extraktion, Verdünnen, Entfernen von bestimmten Komponenten und anderen von der Probe abhängigen Manipulationen, durchzuführen. Die Robotervorrichtung kann ebenso den Probenbehälter und die Kassette auf der Apparatur anbringen und danach die Kassette zur Zentrifuge oder einer anderen Vorrichtung bewegen und den Probenbehälter entsorgen. Die Robotervorrichtung kann in einer alternativen Ausführungsform der Apparatur eingebaut werden, oder sie kann ein handelsüblicher Roboter für die Verwendung im Labor sein und dem Durchschnittsfachmann der vorliegenden Erfindung bekannt sein.
Beispiele
Beispiel 1 – Vorbereitung der Kapillarröhrchenoberfläche
Die Oberfläche der Borosilikat, Glaskapillarröhrchen (Drummond Scientific, Broomall, PA) wurde mit einem silanisierenden Reagenz in Übereinstimmung mit dem Verfahren zur Aquasil^®-Silanisationsbeschichtung gemäß Beispiel 9 behandelt, mit einem Proteinsubstrat beschichtet, dass mit einem reaktiven Protein konjugiert ist, das Kapillarröhrchen wurde blockiert, und getrocknet und inkubiert. Die Länge der einzelnen Kapillarröhrchen beträgt 3.5 Zentimeter (cm) mit einem Innendurchmesser von 0.65 Millimetern (mm) und einem Außendurchmesser von einem Millimeter. Mittels dieser Kapillarröhrchen erzielt man ein hohes Oberflächen zu Volumenverhältnis und minimiert die Verwendung von Reagenzien. Kapillarröhrchen mit anderen Abmessungen können verwendet werden. Das hohe Oberflächen zu Volumenverhältnis ermöglichte eine kurze zweiminütige Inkubation. Röhrchen mit anderen Abmessungen für den Innendurchmesser wurden ebenfalls untersucht, jedoch wurde festgestellt, dass die Röhrchen mit einem Innendurchmesser von 0.65 mm die brauchbarsten bei frischen, Rohmilchproben waren, die häufig Fetttröpfchen enthalten, die einige 100 Mikrometer (μm) groß sein können. Solche Fettpartikel können möglicherweise die Kapillarröhrchenkanäle verstopfen, wenn Röhrchen mit einem kleineren Innendurchmesser verwendet werden. Nebenbei erfolgt der Transport von Reaktanden zur inneren Oberfläche des Röhrchens, wo die messbaren Bindungsreaktionen stattfinden, in der Regel durch Diffusion. Daher werden mögliche Probleme infolge nicht reproduzierbaren Schüttelns eliminiert.
Beispiel 2 – Synthese von Antigenkonjugaten zur Beschichtung von Kapillarröhrchen
Die Antigenkonjugate zum Beschichten auf der Oberfläche der Kapillarröhrchen wurden durch Binden des geeigneten β-Lactam-Arzneimittels, wie z. B. Penicillin G, Ampicillin, Cloxacillin, Cephapirin, Ceftiofur, Amoxicillin und ähnlichem, mit einem Trägerprotein, entweder Rinderserumalbumin (BSA) oder einem Polypeptidcopolymer, das aus Lysin und Alaninuntereinheiten (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) besteht, hergestellt. Das kovalente Binden des Antigens an ein Trägerprotein wurde durch die Verwendung von konventionellen homobifunktionellen oder heterobifunktionellen Linkern, wie z. B. Succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), Bis(sulfosuccinimidyl)suberat und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), gemäß dem vom Hersteller vorgegebenen Verfahren durchgeführt.
Beispiel 3 – Allgemeines Verfahren zum Beschichten des Antigenkonjugates auf der Oberfläche der Kapillarröhrchen
Nach der Behandlung zur Oberflächensilanisierung wurden die Kapillarröhrchen für von etwa 30 Minuten bis 24 Stunden in einer gepufferten Lösung des Antigenkonjugates (20–40 μg/ml) inkubiert. Die Inkubationstemperatur lag für gewöhnlich bei 4–7°C, obgleich gelegentlich eine Inkubation bei Raumtemperatur ausgeführt worden ist. Die Kapillarröhrchen wurden entfernt, mit destilliertem Wasser gewaschen, in einem Strom von komprimierter Luft getrocknet und dann in eine Lösung aus Rinder-Serumalbumin (0.1% BSA in PBS-Phosphat-gepufferter Salzlösung pH = 7.2, 0.05% Proclin 300 (Supelco) einem Biozid) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Zweck der Inkubation mit BSA war es, alle Lösungsbereiche auf der Oberfläche zu blockieren, die nicht durch das Antigenkonjugat beschichtet worden sind. Die Röhrchen wurden wiederholt entfernt, mit destilliertem Wasser gewaschen und in einem Strom aus komprimierter Luft (137,9–206,9 kPa (20–30 psi)) getrocknet. Sie wurden im Dunkeln bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Folienbeutel mit einem indizierenden Trockenpäckchen gelagert. Das Einhalten der trockenen und dunklen Bedingungen war wichtig, um die Stabilität der beschichteten Kapillarröhrchen zu erhalten.
Beispiel 4 – Herstellung von Fluoreszenz-markierten Antikörperkonjugaten
a. Antikörperherstellung
Antikörper für die Antibiotika der Penicillin-Familie wurden durch immunisierte Ziegen mit einem Konjugat aus Keyhole-Limpet-Hemocyanin (KLH) (Sigma Chemical) und Ampicillin (Sigma) hergestellt. Ampicillin wurde verwendet, da es eine für die Konjugation verfügbare Aminogruppe aufweist. Das erhaltene Blut wurde auf eine Kreuzreaktivität mit Penicillin G, Ampicillin, Cloxacillin und Amoxicillin (Sigma) hin untersucht. Die Kreuzreaktivität dieser Antikörper mit Penicillin G und Ampicillin war vergleichbar, während die Kreuzreaktivität für Cloxacillin und Amoxicillin um ungefähr 50% geringer ausfiel. Dieser Antikörper zeigte eine Kreuzreaktivität von weniger als 1% mit Ceftiofur (UpJohn Inc.) und Cephapirin (Sigma). Antikörper gegen Ceftiofur wurden durch Immunisieren von Ziegen mit KLH-Ceftiofur entwickelt. Ein Monoklonaler gegen Cephapirin wurde mittels konventioneller Techniken mit KLH-Cephapirin, wie beim Konjugat, entwickelt. Enzym-Immunoassaystudien zeigen, dass die Kreuzreaktivität des Ceftiofurantikörpers mit den entsprechend anderen 5 β-Lactamarzneimitteln geringer als 1% gewesen ist. Die Kreuzreaktivität des Cephapirinantikörpers mit den anderen 5 β-Lactamantibiotika war geringer als 0.1%.
b. Herstellung eines Fluoreszenz-markierten Antikörperkonjugates
Monoklonale und polyklonale Antikörper wurden mittels konventioneller Reinigungstechniken, wie durch C. Schmidt 1989, „The Purification of Large Amounts of Monoclonal Antibodies", Journal of Biotechnology, Volume 11, S. 235–252 gelehrt, hergestellt. Unter Verwendung der Fluoreszenzmarker Cy-5^® wurden Cy-5^®-Antikörperkonjugate mittels der zuvor publizierten und durch den Hersteller (Biological Detection Systems, Pittsburgh, PA) bereitgestellten Protokolle hergestellt. Der Cy-5^®-Fluoreszenzmarker, erhältlich mit einer NHS-Esterfunktionalität, wurde mit Aminogruppen des Antikörpers verbunden. Die Reinigung und die Isolation des konjugierten Farbstoffes wurde mittels Chromatographie durchgeführt. Eine spektroskopische Untersuchung zeigte, dass die Anzahl an Cy-5^®-Farbstoffmolekülen, die mit jedem Antikörpermolekül verbunden waren, für gewöhnlich zwischen 2 und 4 lag. Das Verhältnis von Antikörpermolekül zu Cy-5^®-Molekül wird durch das Modifizieren der Reaktionsbedingung, wie z. B. Zeit der Konjugation und/oder Verhältnis der Cy-5^® Konzentration zur Antikörperkonzentration in der Reaktionsmischung, gesteuert. Studien, die von Serie zu Serie durchgeführt worden sind, zeigten, dass es keinen signifikanten Anstieg der Fluoreszenzintensität bei Zunahme der Anzahl der Cy-5^®-Moleküle pro Antikörpermolekül gab. Tatsächlich verringerte sich die Fluoreszenzintensität häufig, wenn das Fluorophor/Antikörper-Verhältnis größer war als 4. Dieses Phänomen wurde besonders offensichtlich, wenn monoklonale Antikörper verwendet worden sind. Zu diesem Zeitpunkt ist unklar, ob diese Verringerung eine Folge des zunehmenden Quenschens durch hohes Beladen mit dem Fluorophor oder eine Folge der verringerten Antikörperbindungsaffinität, die eine Folge der Inaktivierung der Antikörpererkennungsstellen war, ist.
Beispiel 5 – Verfahren zur Analyse von Analyten in Proben Immunoassayprotokoll

(a) Eine abgemessene Menge eines fluoreszierend markierten Konjugates, das ein Antikörper-Cy-5^®-Konjugat (bevorzugt getrocknet, z. B. lyophilisiert oder luftgetrocknet) umfasst, wurde mit einer Probe Milch in einem kleinen Behälter, wie z. B. der Kammer einer Mikrotiterplatte, zusammengeführt. Die Rohmilchprobe und das Antikörperkonjugat wurden auf einem Vibrationsschüttler für 10 Sekunden gemischt.
(b) Die Lösung aus (a) wurde dann in das geeignete Kapillarröhrchen mittels einer Mehrfachverteilervorrichtung, z. B. einer modifizierten Pipettierhilfe oder einer Ausführungsform der Kassette der vorliegenden Erfindung, langsam aufgesogen.
(c) Die Lösung wurde dann, während sie im Röhrchen vorlag, für einen Zeitraum, der ausreichend gewesen ist, um mit dem an der inneren Oberfläche des Röhrchens gebundenen Antigen, z. B. für zwei Minuten, zu reagieren, inkubiert.
(d) Alle Reagenzien wurden dann aus den Kapillarröhrchen mit fließendem destilliertem Wasser von dem Ende aus, das dem Ende gegenüber liegt, von dem die Lösung aus eingebracht worden ist, ausgewaschen. Die Reagenzien wurden dann mit einem Strom komprimierter Luft (137,9–206,9 kPa (20–30 psi)) getrocknet.
(e) Die Fluoreszenzintensität der Röhrchen wurde dann mittels eines Fluorometers, das mit einem 3 mW Halbleiter-Diodenlaser (λmax = 635 nm, TOLD 9521 (s), Toshiba, Japan) -Mittel zur Signalerzeugung ausgestattet war, geeigneten Optiken zum Filtern des Signals und eines Stromoutputs einer Silikon-p-i-n-Flächendiode, zum Generieren eines analogen photoelektrischen Stromes, gemessen. Der sich daraus ergebende photoelektrische Strom wurde amplifiziert, von einem analogen in ein digitales Signal konvertiert und auf einem Computer verarbeitet, um die Anwesenheit eines Analyten und ein semiquantitatives Messen der Menge des Analyten in einer Probe zu bestimmen.

Das Verarbeiten über einen Computer beinhaltet das Vergleichen des Fluoreszenzniveaus des nachgewiesenen Signals mit Dosiswirkungskurven, wie in 16a–d und 17a–b dargestellt. Ein genormtes Fluoreszenzsignal wird auf der Y-Achse dargestellt und die relative Konzentration in Teilen pro Millionen wird auf der X-Achse dargestellt. Tabelle 1 zeigt U.S.F.D.A. Sicherheits/Toleranzniveaus für die sechs β-Lactamarzneimittel in Milch.
Beispiel 6 – Herstellung eines Kapillarröhrchens zur Verwendung in einem kompetitiven Immunoassay zum Nachweis von Cephapirin in Milch
Ein Borosilikatglaskapillarröhrchen mit einer Länge von 65 mm und einem Innendurchmesser von 0.6 mm (Drummond Scientific) wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und dann in einem Luftstrom getrocknet, bis im Wesentlichen das ganze destillierte Wasser von der Oberfläche des Kapillarröhrchens verdunstet war. Das Kapillaröhrchen wurde dann in einer 2.5% Aminopropyltriethoxysilatethanollösung für 20 Minuten bei 80°C inkubiert.
Das inkubierte Kapillarröhrchen wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und in einem Luftstrom getrocknet. Das getrocknete Kapillarröhrchen wurde dann für zwei Stunden bei 120°C inkubiert. Nach der Inkubation ließ man das Kapillarröhrchen bei Raumtemperatur abkühlen.
Das Kapillarröhrchen wurde dann in Anwesenheit einer Pufferlösung, die ein Konjugat des Cepharin-Rinderserumalbumin(BSA)-Konjugates umfasst, inkubiert. Das Cepharin-BSA-Konjugat wurde durch Zusammengeben von 65 mg Cepharin, 46 mg EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid) und 26 mg N-HS (N-Hydroxysuccinimid) (Pierce Chemical) in einem 16 × 100 mm Glasröhrchen zubereitet. 1 ml DMF (N,N-Dimethylformamid) (Fisher Scientific) wurde zum Röhrchen gegeben und die Inhalte des Röhrchens wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten vermengt. 100 mg BSA wurden in 3 ml 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.2, in einem separaten 16 × 100 Glasröhrchen gelöst. Die Cephapirinlösung wurde mit der BSA-Lösung zusammengegeben und bei Raumtemperatur für eine Stunde vermengt. Das Cephapirin-BSA-Konjugat wurde mit einer Gelfiltrationssäule (Sephadex G-25) unter Verwendung von 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.2 als Äquilibrierungs- und Elutionspuffer gereinigt. Die Kapillarröhrchen wurden im sich daraus ergebenden Cephapirin-BSA-Konjugat für 3 Stunden inkubiert, wobei während dieser Zeit das Cephapirin-BSA-Konjugat an die Oberfläche des Kapillarröhrchens gebunden wurde. Nach dem Inkubieren wurde das Kapillarröhrchen mit destilliertem Wasser gewaschen und in einem Luftstrom getrocknet.
Das Kapillarröhrchen wurde dann bei 25°C für zwei Stunden in einer Blockierlösung aus 10% Saccharose, 0.1% Rinderserumalbumin und 0.05% Proclin 300 inkubiert, um alle freien Bindungsstellen auf der Oberfläche des Kapillarröhrchens, die nicht durch das Antigen besetzt wurden, zu blockieren. Nach der Inkubation des Kapillarröhrchens in der Blockierlösung wurde das Kapillarröhrchen mit destilliertem Wasser gewaschen und in einem Luftstrom getrocknet.
Beispiel 7 – Herstellung des Anti-Cephapirin-Cy-5^®-Konjugates
1 Milligramm des in 0.2 ml 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.2, gelösten aktivierten Cy-5^®-Farbstoffes (Biological Detector Systems), wurde mit 2 ml einer Cephapirin-Antikörperlösung (4 mg/ml Cephapirin-Antikörper in einem 20 mM Kaliumphosphatpuffer bei pH von 7.2) zusammengegeben. Die Cy-5^®-Farbstoff/Cephapirinlösung wurde dann bei Raumtemperatur für eine Stunde vermengt. Das sich daraus ergebende Cy-5^®-Cephapirinkonjugat wurde auf einer Gelfiltrationslösung (Sephadex G-25) gereinigt, wobei 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.2, sowohl als Äquilibrierungs- als auch als Elutionspuffer verwendet wurde.
Beispiel 8 – Manuelles Immunoassay mit Milch, das vermutlich Cephapirin enthält
Etwa 4 bis 5 μl der Antikörperkonjugatlösung, wie in Beispiel 7 hergestellt, wurden zu 0.5 ml Milch, die vermutlich Cephapirin enthält, gegeben, was zu einer Gesamtkonjugatkonzentration in der Milch von 10 μl/ml führt. Die Milch-Konjugatmischung wurde dann für wenige Sekunden inkubiert.
Ein Ende des in Beispiel 6 hergestellten Kapillarröhrchens wurde in die inkubierte Milch eingetaucht. Ein 10 μl Milchpropfen wurde mittels Kapillarkraft in das Kapillarröhrchen aufgenommen. Die Milch bedeckte ebenfalls die Außenseite des Kapillarröhrchens bis zu etwa 20 mm hoch.
Das Kapillarröhrchen wurde dann auf den Kopf gestellt, so dass der 10 μl Flüssigkeitspropfen sich in einen Bereich in das Kapillarröhrchen hinunterbewegt, in dem die äußere Oberfläche des Kapillarröhrchens nicht mit der Milch in Kontakt getreten war. Der Probenpropfen wurde in dem Kapillarröhrchen für eine Minute inkubiert, damit die Reaktion stattfinden kann, um so ein nachweisbares Fluoreszenzsignal für eine positive Probe zu erzeugen.
Der Pfropfen wurde dann im Kapillarröhrchen mit 100 μl an destilliertem Wasser gewaschen. Nach dem Waschen des Kapillarröhrchens wurde das Kapillarröhrchen mit einem Luftstrom aus einem Luftpulser getrocknet.
Das Kapillarröhrchen wurde dann mit einem Laser bestrahlt, wobei die Wellenlänge des Lichts vom Laser bei 632.8 nm lag. Nach dem Bestrahlen wurde ein sehr intensives emittiertes Signal mit einer Wellenlänge von 667 nm nachgewiesen. Die Intensität des emittierten Signals zeigte, dass kein Cephapirin in der untersuchten Milch vorhanden gewesen ist.
Beispiel 9 – Verfahren zum Beschichten eines Kapillarröhrchens mit 4-Amino-penicillinsäure AquaSil^®-Silanisationsbeschichtung
Ein oder mehrere Glaskapillarröhrchen wurden in einer 0.2% AquaSil^®-Octodecyltriethoxy-Silan (Pierce Chemical #42797) deionisierten Wasserlösung auf eine Art untergetaucht, die eine vollständige Beschichtung der gewünschten Abschnitte der Kapillarröhrchen sicherstellt und dann für 40 ± 30 Minuten bei Raumtemperatur in der Lösung inkubiert. Das Kapillarröhrchen wurde dann in die Zentrifuge gesetzt und bei 1000 rpm für 10 ± 5 Minuten zum Trockenschleudern des Kapillarröhrchens zentrifugiert. Alternativ dazu kann das Kapillarröhrchen luftgetrocknet werden, mit einem Gas oder einem geeigneten Mittel zum ausreichenden Trocknen des Kapillarröhrchens getrocknet werden.
Das mit AquaSil^® beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann in einen 125 ± 10°C-Ofen für 60 ± 10 Minuten gelegt. Als nächstes ließ man das Kapillarröhrchen auf Raumtemperatur abkühlen und danach in einer getrockneten Folien-Ziplocktüte bei Raumtemperatur lagern, bis eine weitere Beschichtung erforderlich wurde. Unter diesen Lagerungsbedingungen ist das Kapillarröhrchen für lange Zeiträume stabil.
BSA-Biotin-Kapillarröhrchenbeschichtung
Das mit AquaSil^®beschichtete Kapillarröhrchen wurde in eine BSA-Biotin(Rinderserumalbumin)-Lösung getaucht, die aus einer 200 μg/ml BSA-Biotin-Stammlösung (Sigma #A-3294) besteht, die mit 20 mM phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)-pH 7.2 um 1 : 200 verdünnt worden ist. 100 ml der 20 mM PBS-pH 7.2 Lösung kann durch Vermengen von 268 g zweibasigen Kaliumphosphates (K₂HPO₄) (Fisher #P284-3), 60.2 mg einbasigen Kaliumphosphates (KH₂PO₄·H₂O) und 875 mg Natriumchlorid (Fisher #P285-3) hergestellt werden, wobei der pH bei 7.2 ± 0.1 lag.
Nachdem sichergestellt worden ist, dass alle gewünschten Bereiche mit der Lösung in Kontakt getreten sind, wurde das mit BSA-Biotin beschichtete Kapillarröhrchen dann in Lösung für 1 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde das mit BSA-Biotin beschichtete Kapillarröhrchen bei 1000 rpm für 10 ± 5 Minuten zentrifugiert, um das Kapillarröhrchen trocken zu schleudern. Das BSA-Biotin beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann in einer getrockneten Folienziplocktüte bei 4°C gelagert, bis eine weitere Beschichtung erforderlich wurde. Das Kapillarröhrchen war unter diesen Lagerungsbedingungen für lange Zeiträume stabil.
Blockieren der Kapillarröhrchen mit Rinderserumalbumin
Das BSA-Biotin beschichtete Kapillarröhrchen wurde in einer 0.1% BSA/10% Saccharose-Blockierlösung untergetaucht. 100 ml der 0.1% BSA/10% Saccharose-Blockierlösung können durch Vermengen von 10 g Saccharose (Fisher #S-53) mit 80 ml deionisiertem Wasser, Vermengen der Lösung zum Lösen der Saccharose, Zugeben vom 100 ml BSA (Sigma #A-3294) zur Saccharoselösung, langsames Mischen der Saccharose-BSA-Lösung, Zugeben von 0.05 ml ProClin 300 (Supelco #4-8127) und Zugeben von zusätzlichem deionisiertem Wasser, um das Volumen auf 100 ml einzustellen, hergestellt werden.
Nachdem sichergestellt worden ist, dass alle gewünschten Bereiche berührt worden waren, wurden die mit der BSA-Saccharose blockierten Kapillarröhrchen dann für 1 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden die Kapillarröhrchen bei 100 rpm für 10 ± 5 Minuten zentrifugiert, um das Kapillarröhrchen trocken zu schleudern.
Das mit BSA-Biotin und mit BSA-Saccharose beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann in einer getrockneten Folienziplocktüte bei 4°C gelagert, bis eine weitere Beschichtung erforderlich wurde. Das Kapillarröhrchen ist unter diesen Bedingungen für lange Zeiträume stabil.
Beschichten der Kapillarröhrchen mit NeutrAvidin-4-amino-penicillinsäure
Das mit BSA-Biotin/BSA-Saccharose beschichtete Kapillarröhrchen wurde in einer Lösung eines 40 mg/ml NeutrAvidin-amino-penicillinsäure (NAV-APA)-Konjugates untergetaucht, wobei die NAV-APA-Konjugatlösung durch Verdünnen der NAV-APA-Konjugat-Stammlösung mit 20 mM PBS-pH 7.2 auf 40 μg/ml hergestellt worden ist.
Nachdem sichergestellt worden ist, dass alle gewünschten Abschnitte der Kapillarröhrchen mit der Lösung in Kontakt getreten sind, wurde das NAV-APA beschichtete Kapillarröhrchen dann für 1–24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde das NAV-APA beschichtete Kapillarröhrchen bei 1000 rpm für 10 ± 5 Minuten zentrifugiert, um das Kapillarröhrchen trocken zu schleudern.
Das NAV-APA beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann in einem Behälter untergetaucht, der deionisiertes Wasser enthält, so dass alle Oberflächen des Kapillarröhrchens mit dem Wasser in Kontakt getreten sind. Das NAV-APA beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann bei 1000 rpm für 10 ± 5 Minuten zentrifugiert, um das Kapillarröhrchen trocken zu schleudern.
Das NAV-APA beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann in einen auf 37°C geheizten Vakuumofen gestellt. Der Ofen wurde auf 81,36 kPa (24 in. Hg.) evakuiert. Das beschichtete Kapillarröhrchen wurde unter Vakuum für 60 Minuten erhitzt. Der Ofen wurde dann abgeschaltet, die Vakuumleitung geschlossen und die Vakuumpumpe ausgestellt. Das NAV-APA beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann in dem evakuierten Ofen über Nacht aufbewahrt.
Das AquaSil^®/BSA-Biotin/NAV-APA beschichtete Kapillarröhrchen kann mit dem abgeschirmten Einsatz in einer getrockneten Folienziplocktüte aufbewahrt oder das Kapillarröhrchen kann in einen verschließbaren, getrockneten Behälter umgefüllt und in eine Folienziplocktüte gelegt und bei 4°C bis zur Verwendung in einer manuellen Ausführung des Immunoassays oder zum Zusammenbau der Kassetten der vorliegenden Erfindung gelagert werden.
Beispiel 10 – Verfahren zum Beschichten eines Ceftiofur Kapillarröhrchens
Ein oder mehrere Kapillarröhrchen wurden mit dem AquaSil^®-Kapillar-Beschichtungsverfahren, dem BSA/Biotin-Kapillar-Beschichtungsverfahren und dem BSA-Blockier-Verfahren, wie in Beispiel 9 beschrieben, hergestellt.
Das BSA-Biotin und BSA-Saccharose beschichtete Kapillarröhrchen wurde in einer 20 μl/ml NeutrAvidin-Ceftiofur-Konjugatlösung untergetaucht, so dass alle gewünschten Abschnitte des Kapillarröhrchens mit der Säure in Kontakt getreten sind, wobei die Konjugatlösung durch Verdünnen der NAV-Ceftiofur-Konjugat-Stammlösung auf 20 μg/ml in 20 mM PBS-pH 7.2 hergestellt worden ist.
Das NAV-Ceftiofur beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann für 1–24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde das NAV-Ceftiofur beschichtete Kapillarröhrchen bei 1000 rpm für 10 ± Minuten zentrifugiert, um das Kapillarröhrchen trocken zu schleudern.
Das NAV-Ceftiofur beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann in einem Behälter untergetaucht, der deionisiertes Wasser enthält, so dass alle gewünschten Abschnitte des Kapillarröhrchens mit dem deionisierten Wasser in Kontakt getreten sind.
Das NAV-Ceftiofur beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann bei 1000 rpm für 10 ± 5 Minuten zentrifugiert, um das Kapillarröhrchen trocken zu schleudern.
Das NAV-Ceftiofur beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann in einen auf 37°C erhitzten Vakuumofen gestellt. Der Ofen wurde auf 81,36 kPa (24 in. Hg.) evakuiert. Das beschichtete Kapillarröhrchen wurde unter Vakuum für 60 Minuten erhitzt. Der Ofen wurde dann abgeschaltet, die Vakuumleitung geschlossen und die Vakuumpumpe abgestellt. Das NAV-Ceftiofur beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann im evakuierten Ofen über Nacht aufbewahrt.
Das AquaSil/BSA-Biotin/NAV-Ceftiofur beschichtete Kapillarröhrchen kann mit dem abgeschirmten Einsatz in einer getrockneten Folienziplocktüte aufbewahrt oder das Kapillarröhrchen kann in einen verschließbaren, getrockneten Behälter umgefüllt und in eine Folienziplocktüte gelegt und bei 4°C bis zur Verwendung in einer manuellen Version des Immunoassays oder zum Zusammenbau der Kassette der vorliegenden Erfindung, gelagert werden.
Beispiel 11 – Verfahren zum Beschichten von Cephapirin-Kapillarröhrchen
Ein oder mehrere Glaskapillarröhrchen wurden mit dem AquaSil-Beschichtungsverfahren aus Beispiel 9 hergestellt. Das AquaSil-beschichtete Kapillarröhrchen wird dann in einer 25 μg/ml BSA-Cephapirin-Lösung zum Beschichten untergetaucht, so dass alle gewünschten Abschnitte des Kapillarröhrchens mit der Lösung zum Beschichten in Kontakt getreten sind, wobei die BSA-Cephapirin-Lösung zum Beschichten durch Verdünnen der BSA-Cephapirin-Konjugat-Stammlösung auf 25 μg/ml mit 20 mM PBS-pH 7.2 hergestellt worden ist.
Das mit BSA-Cephapirin beschichteten Kapillarröhrchen wurde dann für ein 1–24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Kapillarröhrchen bei 1000 rpm für 10 ± 5 Minuten zentrifugiert, um das Kapillarröhrchen trocken zu schleudern.
Das BSA-Cephapirin beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann in einer getrockneten Folienziplocktüte bei 4°C gelagert, bis eine weitere Beschichtung erforderlich wurde. Das Kapillarröhrchen ist bei diesen Bedingungen für lange Zeiträume stabil.
Das mit BSA-Cephapirin beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann mit der in Beispiel 9 beschriebenen BSA-Blockierlösung beschichtet. Das mit BSA-Cephapirin beschichtete und mit BSA-Saccharose blockierte beschichtete Kapillarröhrchen wurden dann in einem Behälter untergetaucht, der deionisiertes Wasser enthält, so dass alle gewünschten Bereiche des Kapillarröhrchens mit dem Wasser in Kontakt getreten sind.
Das mit BSA-Cephapirin beschichtete und mit BSA-Saccharose blockierte Kapillarröhrchen wurde dann bei 1000 rpm für 10 ± 5 Minuten zentrifugiert, um das Kapillarröhrchen trocken zu schleudern.
Das mit BSA-Cephapirin beschichtete und mit BSA-Saccharose blockierte Kapillarröhrchen wurden dann in einem auf 37°C erhitzten Vakuumofen gestellt. Der Ofen wurde auf 81,36 kPa (24 in. Hg.) evakuiert. Das beschichtete Kapillarröhrchen wurde unter Vakuum für 60 Minuten erhitzt. Der Ofen wurde dann abgestellt, die Vakuumleitung geschlossen und die Vakuumpumpe abgestellt. Das NAV- Ceftiofur beschichtete Kapillarröhrchen wurde dann im evakuierten Ofen über Nacht aufbewahrt.
Das AquaSil^®/BSA-Cephapirin/BSA-Saccharose beschichtete Kapillarröhrchen kann mit dem abgeschirmten Einsatz in einer getrockneten Folienziplocktüte aufbewahrt oder das Kapillarröhrchen kann in einen verschließbaren, getrockneten Behälter umgefüllt und in einer Folienziplocktüte gelegt und bei 4°C bis zur Verwendung in einer manuellen Ausführung des Immunoassays oder für den Zusammenbau der Kassette der vorliegenden Erfindung gelagert werden.
Beispiel 12 – Verfahren des mit den Vorrichtungen und Apparaturen verwendeten Immunoassays
Das Immunoassay wurde durch Aufsetzen bevorzugter Ausführungsformen der Kassette und des Probenbehälters auf einer bevorzugten Ausführungsform der Apparatur (ebenso als Parallux Processor Idetek, Sunnyvale, CA bezeichnet) und Zugeben von 100 Mikroliter von roher, unpasteurisierter Milch in jede Kammer des Probenbehälters begonnen. Ein Strichcode mit Informationen zur Kalibrierung für das bestimmte Kit wurde ausgelesen. Geeignete Identifikationsinformationen wurden über die Tastatur eingegeben und die Apparatur begann mit dem Durchlauf des Immunoassays. Die Bewegung der Magneten durch die Magnetrührer unter dem Behälter schüttelten die Metallscheiben in den Kammern des Probenbehälters für 20 Sekunden, damit das getrocknete Reagenz, das einen Fluoreszenzmarker in jeder Kammer umfasst, in der Probenmilch homogen gelöst wurde. Nach dem Vermengen wurde der Probenbehälter durch den Hubmotor angehoben, so dass die Spitzen der Kapillarröhrchen in der Kassette in die Milch untergetaucht wurden. Eine Spritzenpumpe wurde betätigt, um Milch in die Kapillarröhrchen aufzuziehen, wo sie für eine Inkubationszeit von zwei Minuten verblieb. Nach dem Abschluss der Inkubation wurde die Spritzenpumpe verwendet, um alle Inhalte der Röhrchen in den Behälter zu waschen. Die Waschlösung kam von einem Sammelbehälter in der Apparatur. Der Probenbehälter wurde verworfen und die Kassette wurde in der Zentrifuge (eine Lesestation genannt) angeordnet. Die Zentrifuge schleuderte bei 3000 rpm für 20 Sekunden, um jegliche verbliebene Waschlösung aus den Röhrchen zu holen. Diesem Schritt folgte das frei legen gegenüber einem Diodenlaserbeam zum Messen der Fluoreszenz. Die Fluoreszenzsignale von jedem Röhrchen wurden gesammelt, amplifiziert, zu einem digitalen Signal konvertiert und verarbeitet.
Die in diesem Beispiel verwendete Kassette enthielt Reagenzien für 3 separate Immunoassays. Das vierte Röhrchen und die entsprechende Kammer waren leer. Das erste Immunoassay war für Cephapirin, das zweite für Ceftiofur und das dritte für die Penicillinfamilie der Arzneimittel (Penicillin G, Ampicillin, Cloxacillin und Amoxicillin). Folglich war eine einzelne Kassette in der Lage sechs Analyten zu detektieren.
Für semiquantitative Immunoassays wurden die Fluoreszenzsignale mit einem Wert verglichen, der durch den Strichcode eingegeben worden ist. Jeder gemessene Fluoreszenzwert über dem Strichcodewert ergab ein positives Ergebnis und jeder gemessene Wert gleich dem oder unter dem Strichcodewert ergab ein negatives Ergebnis.
Für quantitative Immunoassays wurden die Rohsignale der Fluoreszenz als eine Funktion der Spitzenkonzentration in Rohmilch dargestellt, um eine mehrstufige Standardkurve, wie unten dargestellt, z. B. für das Penicillin G Immunoassay, zu erzeugen.

Claims

Eine Kassette (1) zum sicheren Halten einer Vielzahl von beabstandeten Kapillarröhrchen (2), wobei die Kassette (1) umfasst: einen Rahmen (4) zum Halten der Röhrchen (2) in einer beabstandeten Weise, wobei der Rahmen (4) einen Kanal aufweist, in dem jedes Kapillarröhrchen (2) ausgerichtet werden kann; und zumindest einen Bereich (7) im Rahmen (4), um zumindest einen Teil jedes Kapillarröhrchens (2) frei zu legen, so dass ein elektromagnetisches Signal mit einem Teil jedes Röhrchens (2) in Kontakt treten kann; einen Halter (5), der in Bezug auf den Rahmen für das abdichtende Halten eines Endes jedes Kapillarröhrchens (2) angeordnet ist, wobei der Halter (5) einen entsprechenden Durchgang für jedes Kapillarröhrchen (2) und einen Anschluss (54) für jeden Durchgang, um ein Fluid passend durch den Anschluss (54) zu pumpen, aufweist; wobei der Halter (5) auch eine Kammer in Fluidverbindung mit jedem Durchgang jedes Kapillarröhrchens (2) und mit einem Einzelanschluss (54) verbunden aufweist; und wobei der Halter (5) durch einen Aufsatz (36) und eine Fassung (35) zum abdichtenden Halten eines Endes jedes Kapillarröhrchens (2) derart definiert ist, dass der Aufsatz (36) in Verbindung mit der Fassung (35) die Kammer definiert, die (a) jeden der Kapillarröhrchendurchgänge in der Fassung (35) miteinander in Fluidverbindung verbindet, und (b) zum Einzelanschluss (54) zum Verbinden mit einer Fluidquelle zum Pumpen von Fluid durch jedes Kapillarröhrchen zum Einzelanschluss (54) führt.
Die Kassette nach Anspruch 1, wobei der Rahmen (4) zum Halten der Kapillarröhrchen (2) in einer radialen beabstandeten Weise konstruiert ist, so dass die proximalen Enden der durch den Halter (5) gehaltenen Kapillarröhrchen sich einander annähern, während die distalen Enden der Kapillarröhrchen (2) voneinander wegstreben.
Die Kassette nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Fassung (35) flexibel ist.
Die Kassette nach Anspruch 3, wobei der Rahmen (4) im wesentlichen flach ist und der Bereich für das Freilegen mindestens eines Teils jedes Kapillarröhrchens (2) eine Öffnung (7) umfasst, die sowohl von der Vorderseite als auch der Rückseite des Rahmens (4) zugänglich ist.
Die Kassette nach Anspruch 4, wobei der Rahmen (4) Schutzfortsätze (8) aufweist, die sich über den Rahmen (4) hinaus in den Kapillarröhrchenkanal entfernt vom Halter (5) erstrecken, um die distalen Enden der Kapillarröhrchen (2) vor dem Zerbrechen zu schützen.
Eine Vorrichtung mit einer Kassette wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert.
Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 6 in einem Festphasen-Fluoreszenz-Immunoassay.