DE69729672T2

DE69729672T2 - Biosensor

Info

Publication number: DE69729672T2
Application number: DE69729672T
Authority: DE
Inventors: Yoshiko Miyamoto; Toshihiko Yoshioka; Shiro Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1996-03-13
Filing date: 1997-03-03
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2017-03-04
Also published as: JPH09243591A; US5958199A; JP3370504B2; EP0795601A3; EP0795601A2; DE69729672D1; EP0795601B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor zum Erleichtern einer raschen Quantifizierung eines spezifischen Bestandteils, der in einer biologischen Probe enthalten ist, mit hoher Genauigkeit.
Bislang sind verschiedene Biosensoren als System zur Erleichterung einer einfachen Quantifizierung eines spezifischen Bestandteils entwickelt worden, der in einer Probe enthalten ist, ohne dass eine Verdünnung oder ein Rühren einer Probelösung erforderlich war.
Biosensoren unter Verwendung einer Enzymreaktion nutzen einen Träger, der ein Enzymreaktionssystem trägt oder enthält. Diese Biosensoren nutzen Licht, Farbe oder ein elektrisches Signal als Mittel zur Signalübertragung.
Ein Beispiel des Biosensors unter Nutzung des elektrischen Signals als Signalübertrager ist in der japanischen Patentoffenlegungsschrift Hei 3-202764 offenbart, demnach ein Elektrodensystem, bestehend aus einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode, auf einer elektrisch isolierenden Basisplatte durch Siebdrucken oder dergleichen gebildet ist, gefolgt durch die Bildung einer elektrisch isolierenden Schicht darauf, woraufhin eine Enzymreaktionsschicht, enthaltend ein hydrophiles Polymer, eine Oxidoreduktase und einen Elektronenakzeptor über dem vorstehend genannten Elektrodensystem gebildet wird. Zusätze von Tropfen einer Probelösung, enthaltend ein Substrat als Messsubstanz, auf die Enzymreaktionsschicht ruft eine Verdünnung der Enzymreaktionsschicht hervor. Eine Reaktion zwischen dem Substrat und dem Enzym läuft folglich ab, und das Substrat wird oxidiert, wodurch wiederum die Reduktion des Elektronenakzeptors gefördert wird. Bei Beendigung der Enzymreaktion wird der reduzierte Elektronenakzeptor elektrochemisch oxidiert, und ein Strompegel für die Oxidation, gemessen zu diesem Zeitpunkt, wird genutzt, um die Konzentration des Substrats zu ermitteln, das in der Probelösung enthalten ist.
Der Biosensor mit dem vorstehend erläuterten herkömmlichen Aufbau ist jedoch mit dem Nachteil behaftet, dass eine Reaktion des Biosensors durch Anwesenheit eines beliebigen Bestandteils variieren kann, der in der Probelösung enthalten ist und sich vom Substrat unterscheidet, und zwar selbst dann, wenn die Probelösung das Substrat in gleicher Konzentration enthält. Um ein Beispiel zu nennen, verursacht das Vorhandensein einer Substanz in der Probelösung, die den pH-Wert beeinflusst, häufig eine Änderung der Enzymaktivität, wodurch die Reaktion des Biosensors verändert wird. Im Fall einer Blutprobe, die Partikelbestandteile, wie etwa rote Blutzellen, beispielsweise enthält, ruft eine Differenz der Konzentration dieser Partikelbestandteile einen Unterschied bezüglich der Sensorreaktion hervor.
Ein effektives Verfahren zum Verringern der Differenz bezüglich der Natur der Probelösung besteht darin, diese Differenz durch Verdünnung der Probelösung unter Verwendung einer Verdünnungslösung zu verdünnen. Dieses Verfahren ist jedoch nicht notwendigerweise vorteilhaft aus dem Aspekt eines leichten bzw. problemlosen Betriebs.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Biosensor bereit, aufweisend eine elektrisch isolierende Basisplatte, ein Elektrodensystem, umfassend eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, vorgesehen auf der elektrisch isolierenden Platte, und eine Reaktionsschicht, enthaltend ein hydrophiles Polymer, ein Enzym und einen Elektronenakzeptor, der über dem Elektrodensystem zu liegen kommt, wobei eine Konzentration des hydrophilen Polymers in der Reaktionsschicht im Bereich von 150 bis 1000 Gew.-% des Enzyms liegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das hydrophile Polymer ausgewählt aus der Gruppe, die aus Celluloseethern, wie etwa Carboxymethylcellulose, Carboxyethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxyethylmethylcellulose und dergleichen, Amylose und Stärke besteht.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Enzym ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Glucoseoxidase, Glucosedehydrogenase, Alkoholoxidase, Alkoholdehydrogenase, Cholesteroloxidase, Cholesteroldehydrogenase, Lactatoxidase, Lactatdehydrogenase, Fructosedehydrogenase, Ascorbatoxidase und Bilirubinoxidase.
Gemäß einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Reaktionsschicht aus einer ersten Schicht, enthaltend das hydrophile Polymer, und aus einer zweiten Schicht, enthaltend das hydrophile Polymer, das Enzym und den Elektronenakzeptor.
Gemäß noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das hydrophile Polymer, das in der ersten Schicht enthalten ist, aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus Hydroxymethylcellulose, Carboxyethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose und Carboxyethylmethylcellulose.
Während die neuartigen Merkmale der Erfindung insbesondere in den anliegenden Ansprüchen festgelegt sind, lässt sich die Erfindung sowohl hinsichtlich ihres Aufbaus ihres Inhalts besser verstehen und würdigen, zusammen mit weiteren Aufgaben und Merkmalen der Erfindung aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen.
1 zeigt eine schematische Querschnittsansicht eines Glucosesensors in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung unter Weglassung einer Abdeckung bzw. eines Deckels und eines Abstandhalters.
2 zeigt eine perspektivische Explosionsansicht dieses Glucosesensors unter Weglassung einer Reaktionsschicht.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezug auf Beispiele näher erläutert.
1 zeigt eine schematische Querschnittsansicht unter Darstellung eines Biosensors in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung unter Weglassung einer Abdeckung bzw. eines Deckels und eines Abstandhalters.
Zunächst werden Leitungen 2 und 3 gebildet durch Drucken einer Silberpaste unter Verwendung des Siebdruckverfahrens auf eine elektrisch isolierende Basisplatte 1, die aus Polyethylenterephthalat hergestellt ist. Ein Elektrodensystem, aufweisend eine Arbeitselektrode 4 und eine Gegenelektrode 5, hergestellt aus einer einen Harzbinder enthaltenden elektrisch leitenden Kohlenstoffpaste und eine elektrisch isolierende Schicht 6, hergestellt aus einer elektrisch isolierenden Paste, werden unter Verwendung eben dieses Druckverfahrens gebildet.
Die elektrisch isolierende Schicht 6 dient dazu, Bereiche bzw. Oberflächen von freiliegenden Abschnitten der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 konstant zu halten, und sie deckt einen Teil der Leitungen 2 und 3 ab. Nach Bildung des vorstehend genannten, die Elektrode betreffenden Segments wird eine wässerige Lösung aus einer hydrophilen Polymercarboxymethylcellulose (nachfolgend abgekürzt "CMC") über die Oberfläche des Elektrodensystems getropft, und das Resultat wird getrocknet, um eine erste Schicht zu bilden. Daraufhin wird eine wässerige Lösung eines Gemisches aus dem Enzym, dem Elektronenakzeptor und dem hydrophilen Polymer über die erste Schicht getropft und getrocknet, um eine zweite Schicht zu bilden, die das Enzym, den Elektronenakzeptor und das hydrophile Polymer enthält. In dieser Weise wird eine Reaktionsschicht 7, bestehend aus der ersten Schicht und der zweiten Schicht gebildet.
Wie vorstehend ausgeführt, verursacht das Zusetzen von Tropfen einer wässerigen Lösung aus einem Gemisch aus dem Enzym, dem Elektronenakzeptor und dem hydrophilen Polymer über die erste Schicht eine vorübergehende Auflösung der ursprünglich gebildeten ersten Schicht. Das hydrophile Polymer in der aufgelösten ersten Schicht wird teilweise mit dem Enzym sowie weiteren Substanzen in der zweiten Schicht gemischt und das Gemisch wurde im halbgemischten Zustand getrocknet, um die Reaktionsschicht 7 zu bilden, welche das Enzym, den Elektronenakzeptor und das hydrophile Polymer enthält. Da Rühren nach Zusetzen der Tropfen aus der wässerigen Lösung nicht angewendet wurde, läuft der Mischvorgang nicht vollständig ab. Dies führt dazu, dass die Oberfläche des Elektrodensystems ausschließlich mit dem hydrophilen Polymer-CMC abgedeckt wird. Das Vorliegen der ersten Schicht, enthaltend das hydrophile Polymer, verhindert wirksam Absorbieren von Protein auf die Oberfläche des Elektrodensystems.
Nach Bildung der Reaktionsschicht in dieser Weise werden eine Abdeckung 12 und ein Abstandhalter 11 auf der elektrisch isolierenden Basisplatte 1 in einer Positionsbeziehung zum Haften gebracht, wie in 2 strichliert gezeigt. Dies ergibt einen Glucosesensor.
Der Biosensor mit dem vorstehend genannten Aufbau mindert die ungünstige Einwirkung, hervorgerufen durch die Natur der Probelösung, wie etwa Induktion einer Differenz des pH-Werts, mit Unterstützung der Wirkung des hydrophilen Polymers, was zu einer Verringerung von Veränderungen der Sensorreaktion führt, induziert durch einen beliebigen Bestandteil, der in der Probelösung vorliegt und vom Substrat unterscheidet, oder durch die Differenz in ihrer Konzentration.
Der Biosensor reagiert auf beide Probearten, auf Blut und eine wässerige Glucoselösung und stellt im wesentlichen einen äquivalenten Stromwert mit beiden Proben bereit. Dies ist deshalb der Fall, weil der Biosensor die Wirkung auf die Sensorreaktion durch das Vorliegen roter Blutzellen und von Serumprotein im Blut verringert und eine Migration großer Partikelkomponenten unterbindet, wie etwa von Hämozyten, in die Reaktionsschicht hinein, wodurch diese auf dem Niveau der Oberfläche der Reaktionsschicht eingefangen werden.
Die vorstehend genannten Wirkungen können erzielt werden, wenn das hydrophile Polymer in der Reaktionsschicht in einem Bereich von 150 bis 1000 Gew.-% des Enzyms enthalten ist. Eine Konzentration des hydrophilen Polymers von weniger als 150 Gew.-% des Enzyms führt zu einer nicht zufriedenstellenden Verringerung des Einflusses durch Vorliegen von anderen Be standteilen als das Substrat auf die Sensorreaktion. Eine Konzentration des hydrophilen Polymers, die 1000 Gew.-% des Enzyms übersteigt, macht es anderweitig sehr schwierig, eine Verdünnung der Reaktionsschicht in der Probelösung hervorzurufen, wodurch die Zeit verlängert wird, die erforderlich ist für eine zufriedenstellende Messung der Sensorreaktion und wodurch Veränderungen des gemessenen Werts der Sensorreaktion verstärkt werden.
Obwohl die Konzentration des Enzyms in der Reaktionsschicht abhängig vom Enzym-Typ verändert wird, kann ein geeigneter Gehalt 3 bis 300 Einheiten pro Einheitsfläche der Arbeitselektrode betragen. In einem wegwerfbaren Sensor mit einem Aufbau, der im vorstehend angeführten Beispiel gezeigt ist, reicht der Gehalt des Enzyms in der Reaktionsschicht von 0,1 bis 10 Einheiten, d. h., 0,5 bis 50 μg, in Bezug auf das Gewicht im Fall einer repräsentativen Glucoseoxidase.
Im folgenden werden spezifische Beispiele der vorliegenden Erfindung erläuert.
Beispiel 1
Ein Glucosesensor wird als Beispiel des Biosensors herangezogen.
Wie in 1 gezeigt, wurden die Leitungen 2 und 3, das Elektrodensystem, aufweisend die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 und eine elektrisch isolierende Schicht 6 auf der elektrisch isolierenden Basisplatte 1 gebildet, die aus Polyethylenterephthalat hergestellt ist.
Nachdem das die Elektrode betreffende Segment gebildet war, wurden 5 μl einer 0,25 gew.-%igen wässerigen Lösung einer hydrophilen Polymercarboxymethylcellulose (CMC) über die Oberfläche des Elektrodensystems getropft, gefolgt vom Trocknen für 10 Minuten in einem Heißtrockner bei 50°C zur Bildung der ersten Schicht. Eine zweite Schicht wurde über der ersten derart gebildeten Schicht gebildet durch Tropfen von 4 μl einer wässerigen Lösung eines Gemisches, zubereitet durch Auflösen von 10 mg einer Enzymglucoseoxidase (Ecl.1.3.4; nachfolgend abgekürzt als "GOD" bezeichnet), 16 mg eines Elektronenakzeptorkaliumferricyanids und 20 mg des hydrophilen Polymers CMC in 1 ml Wasser und das Resultat wurde für 10 Minuten in einem Heißtrockner bei 50°C getrocknet, um die Reaktionsschicht 7 zu bilden, die das hydrophile Polymer, das Enzym und den Elektronenakzeptor enthält. Das gesamte in der ersten Schicht und der zweiten Schicht der Reaktionsschicht enthaltene CMC beläuft sich auf 231 Gew.-% der Glucoseoxidase. Die Menge an Glucoseoxidase beträgt etwa 40 μg (äquivalent zu etwa 8 Einheiten).
Nach Bilden der Reaktionsschicht in der vorstehend angeführten Weise wurden die Abdeckung 12 und der Abstandhalter 11 zum Haften auf der elektrisch isolierenden Platte 1 in eine Positionsbeziehung gebracht, die in 2 strichliert gezeigt ist. Dies ergab einen Glucosesensor gemäß dem Beispiel 1.
Probelösungen für den Glucosesensor waren Glucoselösungen, enthaltend Glucose in einer Konzentration von 0 bis 800 mg/dl, die mit reinem Wasser, 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 oder einer 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7 formuliert wurden. Wenn die Probelösung (3 μl) aus einer Öffnung eines Schlitzes 13 auf dem Abstandhalter zugeführt wurde, der als Probezuführöffnung dient, durchsetzt die Probelösung einen Probezuführpfad, der durch den Schlitz 13 festgelegt ist, bis auf das Niveau des Luft-auslasses 14. Die Probelösung infiltriert daraufhin die Reaktionsschicht 7, was die Auflösung der Reaktionsschicht 7 hervorruft. Die Glucose, die in der Probelösung enthalten ist, wird durch die Glucoseoxidase an bzw. in der Reaktionsschicht 7 oxidiert. Übertragene Elektronen rufen dadurch eine Reduktion des Kaliumferricyanids hervor unter Erzeugung von Kaliumferrocyanid, und das derart gebildete Kaliumferrocyanid wird proximal auf die Oberfläche des Elektrodensystems übertragen.
1 Minute nachdem die Probe zugeführt war, wurde eine Spannung von +0,5 V zwischen der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 des Elektrodensystems angelegt. Eine Messung eines Stromwerts nach 5 Sekunden zeigte, dass die gewonnenen Werte von der Glucosekonzentration in der Glucoselösung abhängen, die formuliert ist mit reinem Wasser, 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bzw. einer 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7. Stromwerte in Reaktion auf die Glucosekonzentration in den Glucoselösungen, formuliert mit reinem Wasser (nachfolgend bezeichnet als "reine Wasserglucoselösung"), 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 (nachfolgend als "PBS-Glucoselösung mit pH 5" bezeichnet) oder 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7 (nachfolgend als "PBS-Glucoselösung mit pH 7" bezeichnet) waren nahezu gleich.
Blut wurde als weitere Probelösung für den Glucosesensor herangezogen. 1 Minute nach Probezufuhr wurde eine Spannung von +0,5 V zwischen der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 des Elektrodensystems angelegt. Eine Messung des Stromwerts nach 5 Sekunden zeigte in ähnlicher Weise Stromwerte in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration in der Blutprobelösung. Der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration in der Blutprobelösung betrug etwa 98% des Stromwerts in Reaktion auf die Glucoselösung derselben Glucosekonzentration.
Vergleichsbeispiel 1
Zum Vergleich wurde ein Glucosesensor mit demselben Aufbau wie in Beispiel 1 zubereitet, mit der Ausnahme, dass das Enzym und der Elektronenakzeptor dem Gemisch zur Bildung der zweiten Schicht der Reaktionsschicht unter Weglassung der hydrophilen Schicht zugesetzt wurden. Der Gehalt an CMC in der ersten Schicht der Reaktionsschicht betrug 31 Gew.-% der Glucoseoxidase. Mit dem Glucosesensor gemäß dem Vergleichsbeispiel 1 war der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration in der PBS-Glucoselösung mit dem pH-Wert 5 im wesentlichen derselbe wie derjenige der Rein-Wasser-Glucoselösung. Der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration in der PBS-Glucoselösung mit pH-Wert 7 betrug etwa 60 bis 70% desjenigen der Rein-Wasser-Glucoselösung, wodurch keine lineare Beziehung zwischen dem Stromwert und der Glucosekonzentration angezeigt wird. Der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration in der Blutprobelösung betrug etwa 70 bis 80% desjenigen der Rein-Wasser-Glucoselösung dieser Glucosekonzentration. Die Ergebnisse legen nahe, dass ein Stromwert geringer Reaktion bzw. Empfindlichkeit das Signal/Rausch-Verhältnis erhöht, was eine Verringerung der Messgenauigkeit des Sensors hervorruft, und das die individuelle Differenz bezüglich des Bluthämatokrit-Pegels eine ungünstige Wirkung auf den Stromwert des Sensors in Reaktion auf die Glucosekonzentration hervorruft.
Beispiel 2
Folgend auf die Prozedur wie in Beispiel 1 wurden die Leitungen 2 und 3, das Elektrodensystem, aufweisend die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5, und die elektrisch iso lierende Schicht 6 auf der elektrisch isolierenden Basisplatte 1 gebildet, die aus Polyethylenterephthalat hergestellt war.
In einer Weise, ähnlich wie in Beispiel 1, wurde nach Bildung der ersten Schicht, enthaltend das hydrophile Polymer, die zweite Schicht darauf gebildet unter Verwendung einer wässerigen Lösung eines Gemisches, zubereitet durch Auflösen von 50 mg Hydroxyethylcellulose, 10 mg GOD und 16 mg Kaliumferricyanid, in 1 ml Wasser zur Bildung der Reaktionsschicht 7, welche das hydrophile Polymer, das Enzym und den Elektronenakzeptor enthält. Der gesamte Gehalt an hydrophilem Polymer in den ersten und zweiten Schichten belief sich auf 531 Gew.-% der Glucoseoxidase.
Daraufhin wurden die Abdeckung und der Abstandhalter 11 zum Haften an der elektrisch isolierenden Basisplatte 1, wie in Beispiel 1 gebracht. Dies ergab einen Glucosesensor gemäß Beispiel 2.
Probelösungen für den Glucosesensor waren Glucoselösungen, enthaltend Glucose mit einer Konzentration von 0 bis 800 mg/dl, formuliert mit reinem Wasser, 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bzw. 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7. Wie in Beispiel 1 wurde 1 Minute nach Zufuhr der Probelösung (3 μl) aus der Probezufuhröffnung eine Spannung von +0,5 V zwischen der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 des Elektrodensystems angelegt. Eine Messung des Stromwerts nach 5 Sekunden zeigte, dass die erhaltenen Werte von den Glucosekonzentrationen in den Glucoselösungen abhängen, die formuliert waren mit reinem Wasser, 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bzw. 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7. Der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration war im wesentlichen gleich zwischen der Rein-Wasser-Glucoselösung, der PBS-Glucoselösung mit pH-Wert 5 und der PBS-Glucoselösung mit pH-Wert 7.
Blut wurde als weitere Probelösung für den Glucosesensor verwendet. 1 Minute nach Probezufuhr wurde eine Spannung von +0,5 V zwischen der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 des Elektrodensystems angelegt, und in ähnlicher Weise zeigte eine Messung des Stromwerts nach 5 Sekunden einen Stromwert abhängig von der Glucosekonzentration in der Blutprobelösung. Der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration in der Blutprobelösung betrug etwa 96% des Stromwerts in Reaktion auf die Glucoselösung dieser Glucosekonzentration.
Vergleichsbeispiel 2
In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurde nach Bilden der ersten Schicht, enthaltend das hydrophile Polymer, die zweite Schicht darauf gebildet unter Verwendung einer wässerigen Lösung aus einem Gemisch, zubereitet durch Auflösen von 12 mg Hydroxyethylcellulose, 10 mg GOD und 16 mg Kaliumferricyanid in 1 ml Wasser zur Bildung der Reaktionsschicht 7, enthaltend das hydrophile Polymer, das Enzym und den Elektronenakzeptor. Der gesamte Gehalt an hydrophilem Polymer in den ersten und zweiten Schichten belief sich auf 131 Gew.-% der Glucoseoxidase.
Die Abdeckung 12 und der Abstandhalter 11 wurden daraufhin auf der elektrisch isolierenden Basisplatte 1, wie in Beispiel 1, zum Haften gebracht. Dies ergab einen Glucosesensor gemäß dem Vergleichsbeispiel 2.
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurde 1 Minute nach Zufuhr der Probelösung (3 μl) aus der Probezuführöffnung 13 eine Spannung von +0,5 V zwischen der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 des Elektrodensystems angelegt. Eine Messung des Stromwerts nach 5 Sekunden zeigte, dass die erhaltenen Werte abhängig waren von den Glucosekonzentrationen in den Glucoselösungen, formuliert mit reinem Wasser, 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bzw. 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7. Der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration in der PBS-Glucoselösung mit pH-Wert 5 war im wesentlichen derselbe wie im Fall der Rein-Wasser-Glucoselösung. Der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration in der PBS-Glucoselösung mit pH-Wert 7 betrug hingegen in etwa 60 bis 70% desjenigen der Rein-Wasser-Glucoselösung, was keine lineare Beziehung zwischen dem Stromwert und der Glucosekonzentration anzeigt. Der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration in der Blutprobelösung betrug etwa 75 bis 85% desjenigen der Rein-Wasser-Glucoselösung dieser Glucosekonzentration. Die Ergebnisse legen nahe, dass ein niedriger Stromwert das Signal/Rausch-Verhältnis erhöht, was zu einer Verringerung der Messgenauigkeit des Sensors führt, und diese individuelle Differenz des Bluthämatokrit-Pegels ruft eine ungünstige Wirkung auf den Stromwert des Sensors hervor.
Beispiel 3
Derselben Prozedur wie in Beispiel 1 folgend, wurde nach Bilden der ersten Schicht, enthaltend das hydrophile Polymer, die zweite Schicht darauf gebildet, unter Verwendung einer wässerigen Lösung aus einem Gemisch, zubereitet durch Auflösen von 10 mg GOD, 16 mg Kaliumferricyanid und 20 mg Carboxyethylcellulose in 1 ml Wasser zur Bildung der Reaktionsschicht 7, enthaltend das hydrophile Polymer, das Enzym und den Elektronenakzeptor. Der gesamte Gehalt an hydrophilem Polymers in den ersten und zweiten Schichten belief sich auf 231 Gew.-% der Glucoseoxidase.
Probelösungen für den Glucosesensor waren Glucoselösungen, enthaltend Glucose, mit einer Konzentration von 0 bis 800 mg/dl, formuliert mit reinem Wasser, 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bzw. 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7. Wie im Beispiel 1 wurde 1 Minute nach Zufuhr der Probelösung (3 μl) aus der Probezufuhröffnung 13 eine Spannung von +0,5 V zwischen der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 des Elektrodensystems angelegt. Eine Messung des Stromwerts nach 5 Sekunden zeigte, dass die erhaltenen Werte abhängig waren von den Glucosekonzentrationen in den Glucoselösungen, formuliert mit reinem Wasser, 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bzw. 100 mM Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7. Der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration war im wesentlichen gleich zwischen der Rein-Wasser-Glucoselösung, der PBS-Glucoselösung mit pH-Wert 5 und der PBS-Glucoselösung mit pH-Wert 7.
Blut wurde als weitere Probelösung für den Glucosesensor verwendet. 1 Minute nach Probezufuhr wurde eine Spannung von +0,5 V zwischen der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 des Elektrodensystems angelegt. In ähnlicher Weise zeigte eine Messung des Stromwerts nach 5 Sekunden, dass die Stromwerte abhängig waren von der Glucosekonzentration in der Blutprobelösung. Der Stromwert in Reaktion auf die Glucosekonzentration in der Blutprobelösung betrug etwa 97% des Stromwerts in Reaktion auf die Glucoselösung dieser Glucosekonzentration.
Obwohl der Glucosesensor in den vorstehend genannten Beispielen verwendet wurde, ist die vorliegende Erfindung anwendbar auf unterschiedliche Biosensoren unter Verwendung eines Enzym-bezogenen Reaktionssystems, wie etwa auf einen Alkoholsensor, einen Sucrosesensor, einen Cholesterolsensor, einen Lactatsensor, einen Fructosesensor und dergleichen.
Das Enzym ist nicht beschränkt auf die Glucoseoxidase; vielmehr können andere Enzyme, wie etwa Glucosedehydrogenase, Alkoholoxidase, Alkoholdehydrogenase, Cholesteroloxidase, Cholesteroldehydrogenase, Lactatoxidase, Lactatdehydrogenase, Fructosedehydrogenase, Ascorbinsäureoxidase und Bilirubinoxidase, verwendet werden.
In den vorstehend angeführten Beispielen wurde die Verhinderungswirkung der ersten Schicht, enthaltend das hydrophile Polymer mit Bezug auf das Adsorptionsvermögen von Protein, auf die Oberfläche des Elektrodensystems erläutert unter Verwendung von CMC als hydrophiles Polymer. Eine ähnliche Verhinderungswirkung kann erzielt werden durch beliebige Celluloseether, wie Hydroxyethylcellulose, Carboxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxyethylmethylcellulose und dergleichen.
Obwohl die vorstehend genannten Beispiele CMC, Hydroxyethylcellulose und Carboxyethylcellulose als hydrophiles Polymer, enthaltend in der zweiten Schicht, nutzten, kann eine ähnliche Verhinderungswirkung erzielt werden durch beliebige Celluloseether, wie etwa Hydroypropylcellulose, Carboxyethylmethylcellulose und dergleichen, wie etwa Amylose, Stärke und ihre Derivate.
Im Gegensatz zu dem Kaliumferricyanid, das in den vorstehend genannten Beispielen verwendet wurde, können andererseits p- Benzochinon, Phenazinmethosulfat, Indophenol und seine Derivate, Kalium-β-naphthochinon-4-sulfonat, Methylen-Blau, Ferrocen und seine Derivate als Elektronenakzeptor verwendet werden.
Obwohl die vorstehend angeführten Beispiele Wasser als Lösungsmittel zum Auflösen des hydrophilen Polymers, des Enzyms und des Elektronenakzeptors nutzten, können verschiedene Pufferlösungen ebenfalls verwendet werden, wie etwa Phosphat-Pufferlösung, Citrat-Pufferlösung, Acetat-Pufferlösung, Tris(hydroxymethyl)aminomethanhyddrochlorid-Pufferlösung und dergleichen.
In den vorstehend angeführten Beispielen wurden das Enzym und der Elektronenakzeptor in der Probelösung gelöst; diese Bestandteile können jedoch fixiert sein, so dass sie in der Probelösung unlöslich sind.
Die Bildung einer zusätzlichen Schicht, enthaltend Lecithin über der Reaktionsschicht kann für ein problemloses bzw. gleichmäßiges Einleiten der Probe nützlich sein.
Obwohl in den vorstehend angeführten Beispielen ein bipolares Elektrodensystem, bestehend aus einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode, verwendet wurde, kann ein Dreifach-Elektrodensystem, bestehend aus einer Referenzelektrode, zusätzlich zu den vorstehend genannten beiden Elektroden eine präzisere Messung erleichtern.
Wie vorstehend diskutiert, vermag die vorliegende Erfindung einen Biosensor bereitzustellen, der die Quantifizierung einer Zielsubstanz mit guter Genauigkeit frei von der Wirkung jedes Bestandteils erleichtern kann, der in der Probelösung mit Ausnahme des Substrats enthalten ist.
Obwohl die vorliegende Erfindung im Hinblick auf die aktuell bevorzugten Ausführungsformen erläutert wurden, wird bemerkt, dass diese Offenbarung nicht als beschränkend anzusehen ist. Verschiedene Abwandlungen und Modifikationen erschließen sich dem Fachmann auf diesem Gebiet der Technik, an die sich die vorliegende Erfindung wendet, nach einem Studium der vorstehend angeführten Offenbarung.

Claims

Biosensor, aufweisend: Eine elektrisch isolierende Basisplatte (1), ein Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode (4) und einer Gegenelektrode (5), die auf der Basisplatte (1) vorgesehen sind, und eine Reaktionsschicht (7), enthaltend ein hydrophiles Polymer, ein Enzym und einen Elektronenakzeptor, der über dem Elektrodensystem gebildet ist, wobei die Reaktionsschicht (7) das hydrophile Polymer in einem Bereich von 150 bis 1000 Gew.-% des Enzyms enthält.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei der Gehalt an Enzym in der Reaktionsschicht (7) 0,5 bis 50 μg beträgt.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei das hydrophile Polymer ausgewählt ist aus Carboxymethylcellulose, Carboxyethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxyethylmethylcellulose, Amylose und Stärke.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei das Enzym zumindest ein solches ist, ausgewählt aus Glucoseoxidase, Glucosedehydrogenase, Alkoholoxidase, Alkoholdehydrogenase, Cholesteroloxidase, Cholesteroldehydrogenase, Lactatoxidase, Lactatdehydrogenase, Fructosedehydrogenase, Ascorbinsäureoxidase und Bilirubinoxidase.
Biosensor nach Anspruch 1, wobei die Reaktionsschicht (7) aus einer ersten Schicht, enthaltend das hydrophile Poly mer, und einer zweiten Schicht, enthaltend das hydrophile Polymer, Enzym und den Elektronenakzeptor besteht.
Biosensor nach Anspruch 5, wobei das hydrophile Polymer, das in der ersten Schicht enthalten ist, zumindest ausgewählt ist aus Carboxymethylcellulose, Carboxyethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose und Carboxyethylmethylcellulose.
Verfahren unter Verwendung eines Biosensors in Übereinstimmung mit Anspruch 2, wobei das Verfahren die Schritte aufweist: Zusetzen einer Probelösung, enthaltend ein Substrat, zu der Reaktionsschicht (7); Lösen der Reaktionsschicht (7) in der Probelösung; und Ermitteln einer Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat.