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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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In
dem berühmten
Gedanken-Experiment von Maxwell betätigt ein Dämon eine Tür zwischen zwei Kästen mit
Gas auf derselben Temperatur. Der Dämon sortiert die Moleküle, wobei
die schnelleren Moleküle in
einem Kasten und die langsameren in dem anderen gehalten werden,
unter Missachtung der Grundgesetze der Thermodynamiken. Dieses Paradox
ist seit dem auf viele Arten und Weisen aufgelöst worden. Leff, H. S., und
Rex, A. F. (1990), „Resource
letter md-1: Maxwell's
demon", Am. J. Physics
58: 201–209.
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Eine ähnliche
Anordnung kann dazu verwendet werden, Partikel zu separieren. Es
wird eine Mischung von Partikel aus zwei unterschiedlichen Größen, suspendiert
in Wasser in einem Kasten, und reines Wasser in dem anderen, betrachtet.
Falls der Dämon
die Tür
zwischen den Kästen
schnell genug öffnet
und schließt, so
dass keines der größeren Partikel
Zeit hat, um durch die Türöffnung hindurch
zu diffundieren, allerdings lang genug, so dass einige der kleineren
Partikel genug Zeit haben, um in den anderen Kasten zu diffundieren,
wird eine bestimmte Separation erreicht werden.
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In
neuerer Zeit sind zwei Experimente vorgenommen worden, bei denen
ein räumlich
asymmetrisches Potential periodisch bei dem Vorhandensein einer
Anzahl von Brown'schen
Partikeln aufgebracht wird. Faucheux, L. S. et al. (1195), „Optical
thermal ratchet",
Physical Rev. Letters 74: 1504–1507;
Rousselet, J. et al: (1994), „Directional
motion of Brounian particles induced by a periodic asymmetric potential", Nature 370: 446–448.
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Es
ist gezeigt worden, dass dies zu einer direkten Bewegung der Partikel
unter einer Rate in Abhängigkeit
von dem Diffusionskoeffizienten führt. Ein Experiment (Rousselet,
J. et al. (1994), „Directional
motion of Brounian particles induced by a periodic asymmetric potential", Natur 370: 446–448) verwendete
mikro-hergestellte Elektroden auf einem Mikroskop-Objektträger, um
ein elektrisches Feld für
das Potential anzulegen. Diese Idee ist auch Gegenstand der Europäischen Patentoffenlegung
645169 vom 29. März
1995 für „Separation
of particles in a fluid – using
a saw-tooth electrode and an intermittent exitation field", Adjari, A. et al.. Das
andere Experiment (Faucheux, L. S. et al. (1995), „Optical
thermal ratchet",
Physical Rev. Letters 74: 1504–1507)
verwendete eine modulierte, optische Pinzetten-Anordnung (tweezer
arrangement).
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Diffusion
ist ein Vorgang, der leicht unter großen Maßstäben vernachlässigt werden
kann, allerdings schnell in einem Mikro-Maßstab wichtig wird. Die durchschnittliche
Zeit für
ein Molekül,
um über
einen Abstand von d zu diffundieren, ist 2t = d2/D,
wobei D der Diffusionskoeffizient des Moleküls ist. Für ein Protein oder ein anderes,
großes
Molekül
ist eine Diffusion relativ langsam unter dem Makro-Maßstab (z.
B. Hämoglobin
mit D gleich zu 7 × 10–7 cm2/s in Wasser bei Raumtemperatur benötigt ungefähr 106 Sekunden (10 Tage), um über ein Rohr von einem Zentimeter
zu diffundieren, benötigt
allerdings ungefähr
1 Sekunde, um über
einen Kanal von 10 Mikron zu diffundieren).
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Unter
Verwendung von Tools, entwickelt durch die Halbleiter-Industrie,
um Elektroniken zu Miniaturisieren, ist es möglich, aufwändige Fluid-Systeme mit Kanalgrößen bis
zu einem Mikron-Bereich klein herzustellen. Diese Vorrichtungen
können
kostengünstig
in der Massenproduktion hergestellt werden, und es wird erwartet,
dass sie sich bald in weit verbreiteter Verwendung für einfache,
analytische Tests befinden.
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Ein
Verfahren, bezeichnet als „field-flow
fractionation" (FFF),
ist verwendet worden, um Komponenten eines einzelnen Eingangsstroms
in ein System, nicht hergestellt in einem Mikro-Maßstab, sondern
mit Kanälen klein
genug, um eine laminare Strömung
zu erzeugen, zu separieren und zu analysieren. Verschiedene Felder, einschließlich Konzentrationsgradienten,
werden verwendet, um eine Kraft senkrecht zu der Strömungsrichtung
zu erzeugen, um eine Separation von Partikeln in dem Eingangsstrom
zu bewirken. Siehe z. B. Giddings, J. C., US-Patent 3,449,938, 17.
Juni 1969, „Method
for Separating and Detecting Fluid Materials"; Giddings, J. C., US-Patent 4,147,621,
3. April 1979, „Method
and Apparatus for Flow Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C. US-Patent 4,214,981,
29. Juli 1980, „Steric
Field-Flow Fractionation";
Giddings, J. C. et al., US-Patent 4,250,026, 10. Februar 1981, „Continuous
Steric FFF Device for The Size Separation of Particles"; Giddings, J. C.
et al., (1983), „Outlet
Stream Splitting for Sample Concentration in Field-Flow Fractionation", Separation Science
and Technology 18: 293–306;
Giddings, J. C. (1985), „Optimized
Field- Flow Fractionation
System Based on Dual Stream Splitters", Anal. Chem. 57: 945–947; Giddings,
J. C., US-Patent 4,830,756, 16. Mai 1989, „High Speed Separation of
Ultra-High Molecular
Weight Polymers by Hyperlayer Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C.,
US-Patent 4,141,651, 25. August 1992, „Pinched Channel Inlet System
for Reduced Relaxation Effects and Stopless Flow Injection in Field-Flow
Fractionation";
Giddings, J. C., US-Patent 5,156,039, 20. Oktober 1992, „Procedure
for Determining the Size and Size Distribution of Particles Using
Sedimentation Field-Flow Fractionation"; Giddings, J. C. US-Patent 5,193,688,
16. März
1993, „Method
and Apparatus for Hydrodynamic Relaxation and Sample Concentration
in Field-Flow Fraction Using Permeable Wall Elements"; Caldwell, K. D.
et al., US-Patent 5,240,618, 31. August 1993, „Electrical Field-Flow Fractionation
Using Redox Couple Added to Carrier Fluid"; Giddings, J. C. (1993), „Field-Flow
Fractionation: Analysis of Macromolecular, Colloidal and Particulate
Materials"; Science
260: 1456–1465;
Wada, Y., et al., US-Patent 5,465,849, 14. November 1995, „Column
and Method for Separating Particles in Accordance with Magnetic
Susceptibility".
Keine dieser Referenzen offenbart die Verwendung eines separaten
Eingangsstroms, um Partikel, diffundiert von einem Partikel enthaltenden
Eingangsstrom, aufzunehmen.
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Ein
in Bezug stehendes Verfahren für
eine Partikel-Fraktionierung ist der „Split Flow Thin Cell" (SPLITT) Prozess.
Siehe z. B. Williams, P. S., et al. (1992), „Continuous SPLITT Fractionation
Based on a Diffusion Mechanism",
Ind. Eng. Chim. Res. 31: 2172–2181;
and J. C. Giddings, US-Patent 5,039,426. Diese Publikationen offenbaren
Vorrichtungen mit Kanälen,
klein genug, um eine laminare Strömung zu erzeugen, liefern allerdings
wiederum nur einen Eingangsstrom. Ein weiteres US-Patent für J. C.
Giddings, US-Patent Nr. 4,737,268, offenbart eine SPLITT Durchfluss-Zelle,
die zwei Eingangsströme
besitzt; allerdings ist der zweite Eingangsstrom kein Indikatorstrom,
sondern vielmehr ein Partikel freier Strom. Das US-Patent 4,894,146
für Giddings
offenbart auch eine SPLITT Durchfluss-Zelle, die zwei Eingangsströme besitzt,
allerdings keinen Indikatorstrom. Alle diese SPLITT Strömungsverfahren
erfordern das Vorhandensein von mehr als einen Ausgangsstrom, um
verschiedene Partikel-Fraktionen
zu separieren.
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Keine
der vorstehenden Publikationen beschreibt eine Kanal-System-Vorrichtung, die
zum Analysieren von kleinen Partikeln in sehr kleinen Mengen einer Probe
geeignet sind, die auch größere Partikel
enthalten können,
insbesondere größere Partikel,
die dazu geeignet sind, den Indikator zu beeinflussen, der für die Analyse
verwendet ist. Keine Vorrichtungen oder Verfahren, die Indikatorströme innerhalb
der Zellen-System-Vorrichtung verwenden, werden beschrieben.
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Mikrofluide
Vorrichtungen ermöglichen
auch, vorteilhaft Gebrauch von einer Diffusion als ein schneller Separations-Mechanismus
zu machen, was auch eine effiziente und präzise Erfassung der separierten
(diffundierten) Partikel ermöglicht.
Ein Strömungsverhalten
in Mikro-Strukturen unterscheidet sich wesentlich von demjenigen
in der makroskopischen Welt. Aufgrund der extrem kleinen Trägheits-Kräfte in solchen
Strukturen ist praktisch die gesamte Strömung in Mikro-Strukturen laminar.
Dies ermöglicht
die Bewegung von unterschiedlichen Schichten eines Fluids und von
Partikeln, die am nächsten
zueinander liegen, in einem Kanal ohne irgendein Vermischen, anders
als Diffusion. Andererseits ist, aufgrund der kleinen, lateralen
Abstände
in solchen Kanälen,
eine Diffusion eine wirkungsvolle Maßnahme, um Moleküle und kleine
Partikel entsprechend zu deren Diffusionskoeffizienten zu separieren,
was allgemein eine Funktion deren Größe ist. Ein Probenstrom kann
in einer laminaren Strömung
vorliegen, mit einer Strömung,
die eine Indikator-Substanz enthält,
was ein Mittel zum Erfassen eines Analyts darstellt, das von dem
Probenstrom in den Indikatorstrom hinein diffundiert ist.
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Weigl,
B. H., Yager, P., „Silicon-Microfabricated
Diffusion-Based Optical Chemical Sensor", Sensors & Actuators B – „Europetrode" (Conference) 2.
April 1996; Zürich
Schweiz; Weigl, B. H., Holl, M. A., Schutte, D., Brody, J. P., und
Yager, P., „Diffusion-Based-Optical
Chemical Detection in Silicon Flow Structures", Analytical Methods an Instrumentation, μTAS 96 special
edition, 1996; Weigl, B. H., von den Engh, G., Kaiser, R., Altendorf,
E., an Yager, P. „Rapid
Sequential Chemical Analysis Using Multiple Fluorescent Reporter
Beads", μTAS96, Conference
Proceedings, 1996; Weigl, B. H., Hixon, G. T., Kenny, M., Zeert,
D., Dwinnell, S., Buj, T., und Yager, P., „Fluorescence Analyte Sensing
in Whole Blood Besed on Diffusion Separation in Silicon-Microfabricated
Flow Structures, SPIE Proceedings, 9.–11. Februar 1997, J. Lakowitz
(ed.), Fluorescence Sensing Technology III; und Brody, J., und Yager,
P., „Low
Reynolds Number Micro-Fluidic Devices", Solid State Sensor and Actuator Workshop,
Hilton Head SC 2.–6.
Juni 1996, beschreiben verschiedene Vorrichtungen und Verfah ren,
die eine laminare Strömung
und Diffusions-Prinzipien verwenden, um das Vorhandensein der Konzentration
von verschiedenen Analyten in Proben, z. B. das gesamte Blut, zu
erfassen und zu bestimmen.
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Die
US-Patentanmeldung Serial No. 08/625,808 „Microfabricated Diffusion-Based Chemical Sensor", angemeldet am 29.
März 1996,
nun US-Patent 5,716,852, herausgegeben am 10. Februar 1998, US-Patentanmeldung
Serial No. 08/829,679 (Attorney Docket No. 6-96A) „Microfabricated
Diffusion-Based Chemical Sensor",
angemeldet am 31. März
1997, und PCT Patentanmeldung Serial No. PCT/US 91/05245 „Microfabricated
Diffusion-Based Chemical Sensor",
angemeldet am 31. März
1997, offenbaren eine mikro-hergestellte Vorrichtung, die einen
laminaren Strömungskanal,
mindestens zwei Einlässe
in einer Fluidverbindung mit dem laminaren Strömungskanal zum Leiten in den
Strömungskanal
hinein einen Indikatorstrom und einen Probenstrom, und einen Auslass
aufweist. Kleinere Partikel in der Probenströmung diffundieren in die Indikatorströmung hinein,
was einen Erfassungsbereich bildet, in dem Messungen einer erfassbaren
Eigenschaft vorgenommen werden. Diese drei Anmeldungen offenbaren
Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Analyten in einem
Probenstrom durch Erfassen der Position innerhalb des laminaren
Strömungskanals
von Analyt-Partikel von dem Probenstrom, die in den Indikatorstrom
hinein diffundieren, was eine erfassbare Änderung in dem Indikatorstrom
verursacht. Alternativ kann die Position innerhalb des laminaren
Strömungskanals
des Bereichs, wo ein Gleichgewicht einer Diffusion des Analyts von
dem Probenstrom in den Indikatorstrom hinein aufgetreten ist, verwendet
werden, um eine Analyt-Konzentration zu bestimmen. Zusätzlich können Informationen,
die zum Bestimmen der Konzentration von Analyt-Partikel in dem Probenstrom nützlich sind,
durch Vorsehen von Einrichtungen, wie beispielsweise Probenkanälen, zum
Leiten von Probenströmen
von dem Indikatorstrom unter aufeinander folgenden Intervallen entlang
der Länge
des laminaren Strömungskanals,
erhalten werden. Änderungen
in der Intensität
der Signale von Probenkanal zu Probenkanal können dazu verwendet werden,
die Konzentration von Analyt-Partikel
in der originalen Probe zu berechnen.
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Die
Vorrichtungen dieser drei Anmeldungen können in einer Fluidverbindung
mit einer Vorrichtung stehen, wie beispielsweise diejenige, die
in der US-Patentanmeldung
Serial No. 08/534,515 „Silicon
Microchannel Optical Flow Cytome ter", angemeldet am 27. September 1995,
nun US-Patent 5,726,751, herausgegeben am 10. März 1998, offenbart ist, die
eine Single-File-Strömung
von Partikel ermöglicht
und die reflektive Oberflächen
zum Erfassen von reflektivem Licht, im Gegensatz zu transmittiertem
Licht, vorsieht. Die Vorrichtungen dieser drei Anmeldungen können alternativ
in einer Fluid-Verbindung mit einem Hülsenströmungs-Modul stehen, wie es
in der US-Patentanmeldung Serial No. 08/823,747, „Device
and Method for 3-Dimensional
Alignment of Particles in Microfabricated Flow Channels", angemeldet am 26.
März 1997,
offenbart ist.
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In
der WO97/00442 ist ein mikro-hergestelltes Extraktionssystem zum
Extrahieren von erwünschten Partikeln
aus einem Probenstrom, enthaltend sowohl erwünschte als auch nicht erwünschte Partikel,
dargestellt. Das System besitzt zwei Einlässe, einen für sowohl
einen Probenstrom als auch einen Extraktionsstrom; einen Extraktionskanal;
und zwei Auslässe,
einen für
einen Produktstrom und einen für
einen By-Produkt-Strom.
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In
der WO97/01087 ist eine Vorrichtung dargestellt, die angrenzende,
laminare Ströme
in einem Strömungskanal
einsetzt. Der Zweck dieser Strömungen
ist derjenige, einen oder mehrere der Probenströme von bestimmten Bereichen
des Strömungskanals
weg zu halten, so dass dort kein Erfordernis vorhanden ist, physikalische
Unterteilungen vorzusehen.
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Die
Verwendung von Qualitäts-Kontroll-Materialien
und internen Standard-Materialien
ist natürlich ausreichend
im Stand der Technik bekannt. Siehe L. A. Kaplan, Clinical Chemistry,
1989, 2nd ed., The C. V. Mosby Co., St. Louis, zur Diskussion von
früheren,
bekannten Verfahren und Materialien für eine Qualitätskontrolle,
für interne
Standards und für
Kalibratoren. Der Zweck einer Qualitätskontrolle des analytischen
Testens ist derjenige, sicherzustellen, dass jede Messung, durchgeführt an einer
Probe, zuverlässig
ist. Allgemein wird, in früheren,
bekannten Verfahren einer Verwendung von Qualitätskontroll-Materialien, wie
dies in Clinical Chemistry, von Kaplan, Seite 278, beschrieben ist,
eine Kontrolle täglich
(eine Unze pro Schicht) gemessen und kann in einem Levy-Jennings
Ausdruck ausgedruckt werden, der grafisch den erreichten Soll-Durchschnitt ± zwei
Standard-Abweichungen (auf der y-Achse) gegenüber der Zeit darstellt, z.
B. die Tage des Monats (auf der x-Achse). Der Sollwert ist die abgeschätzte Konzentration
des Analyts, der in der Probe von Interesse ist, innerhalb eines
bestimmten Grads einer Genauigkeit, da sich bei jedem gegebenen
Tag, der gemessene Kontrollwert leicht innerhalb der Spezifikationen
des Instruments, der Kalibrierung, usw., unterscheiden wird. Der Benutzer
muss einen Sollwert für
jeden Analyt durch reguläre
Laboratoriums-Vorgänge,
die im Stand der Technik bekannt sind, einrichten. Allerdings sollte
der gemessene Kontrollwert ziemlich konstant über die Zeit sein. Falls die
Kontrollwerte leicht nach unten oder nach oben zu dem Sollwert driften,
dann zeigt dies einen Trend an. Falls die Kontrollwerte einen plötzlichen
Sprung in den Werten, aufgezeichnet von einem Durchschnitt zu einem
anderen, darstellen, dann zeigt dies eine Verschiebung an. Falls
eine systematische Vorspannung angezeigt wird (eine Änderung
in der Genauigkeit) oder eine Änderung
in der Präzision
angezeigt wird, muss der Benutzer die Reagenzien, die internen Standards
und das Instrumentarium prüfen.
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Wie
in Clinical Chemistry von Kaplan beschrieben ist, ist der Zweck
von internen Standards derjenige, eine Genauigkeit und Präzision zu
verbessern, ebenso wie eine Prüfung
einer Qualitätskontrolle
zu erreichen, und zwar aufgrund eines gegebenen, internen Standard-Bündels, aus
einem gemessenen Wert (z. B. erfassbare Eigenschaft, korrelierbar
zu einer Konzentration, wie dies durch irgendeine von verschiedenen
Erfassungs-Einrichtungen erfassbar ist), und sollte derselbe über die
Zeit sein.
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In
früheren,
bekannten Verfahren und Materialien für die Qualitätskontrolle
und die Verwendung von internen Standards waren Qualitätskontroll-Materialien
gegenüber
solchen, verwendet für
interne Standards, unterschiedlich.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung bezieht sich allgemein auf Mikrosensoren und Verfahren
zum Analysieren des Vorhandenseins und der Konzentration von kleinen
Partikeln in Strömungen,
die diese kleinen Partikel enthalten, durch Diffusions-Prinzipien.
Die Erfindung ist, zum Beispiel, zum Analysieren von Blut nützlich,
um die Konzentration von kleinen Partikeln, wie beispielsweise Wasserstoff-,
Natrium- oder Kalziumionen, in einem Strom, der Zellen enthält, zu bestimmen,
oder zum Analysieren von Trinkwasser, um seine Reinheit zu bestimmen, nützlich.
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Diese
Erfindung schafft eine Vorrichtung zum Erfassen des Vorhandenseins
oder zum Bestimmen der Konzentration von Analyt-Partikeln in einer
Probenströmung,
die aufweist:
- a) einen laminaren Strömungskanal;
- b) mindestens drei Einlasseinrichtungen in einer Flüssigkeitsverbindung
mit dem laminaren Strömungskanal
zum jeweiligen Leiten in den laminaren Strömungskanal (1) mindestens einer
Indikatorströmung,
wobei die Indikatorströmung(en)
vorzugsweise eine Indikatorsubstanz, zum Beispiel einen pH-empfindlichen Farbstoff,
der das Vorhandensein der Analyt-Partikel, die von Interesse sind,
durch eine erfassbare Änderung
in der Eigenschaft anzeigt, wenn er mit den Analyt-Partikel in Kontakt
tritt, aufweist, (2) mindestens einer Probenströmung und (3) mindestens einer
Referenzströmung,
die als eine Kontrollströmung,
als eine interne Standardströmung
oder für
beide, oder als eine Kalibrierungsströmung, verwendet werden kann;
- c) wobei der laminare Strömungskanal
eine Dimension (entweder Tiefe und/oder Breite), ausreichend klein, um
eine laminare Strömung
der Strömungen
angrenzend zueinander zu ermöglichen,
und eine Länge,
ausreichend, um zu ermöglichen,
dass Analyt-Partikel in die Indikatorströmung(en) hinein diffundieren,
um einen Erfassungsbereich zu bilden;
- d) eine Auslasseinrichtung zum Leiten der Strömungen aus
dem laminaren Strömungskanal
heraus.
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In
der einfachsten Ausführungsform
dieser Erfindung werden eine einzelne Indikatorströmung, eine einzelne
Probenströmung,
und eine einzelne Referenzströmung
verwendet; allerdings können
die Verfahren und Vorrichtungen dieser Erfindung auch mehrere Proben-
und/oder Indikator- und/oder Referenzströmungen, alle in einer laminaren
Strömung,
verwenden.
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Die
Verfahren dieser Erfindung sind so ausgelegt, um in einer Vorrichtung
ausgeführt
zu werden, die Mikrokanäle
einer Größe so besitzt,
dass die Reynold'sche-Zahl für eine Strömung innerhalb
des Kanals unterhalb von ungefähr
1 liegt. Die Reynold'sche-Zahl
ist das Verhältnis
der Trägheitskraft
zu der Viskosität.
Eine niedrige Reynold'sche-Zahl
bedeutet, dass die Trägheitskraft
im Wesentlichen vernachlässigbar
ist, eine Turbulenz im Wesentlichen vernachlässigbar ist und die Strömung der zwei
angrenzenden Strömungen
laminar ist, d. h. die Strömungen
mischen sich nicht, mit der Ausnahme der Diffusion von Partikel,
wie dies vorstehend beschrieben ist.
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Ein
Verfahren wird hier zum Erfassen des Vorhandenseins und/oder zum
Bestimmen der Konzentration von Analyt-Partikeln in einer Probenströmung, vorzugsweise
einer Flüssigkeitsströmung, geschaffen,
das aufweist:
- a) Leiten der Probenströmung in
einen laminaren Strömungskanal
hinein;
- b) Leiten einer Indikatorströmung,
wobei die Indikatorströmung
vorzugsweise eine Indikatorsubstanz aufweist, die das Vorhandensein
der Analyt-Partikel durch eine Änderung
in einer erfassbaren Eigenschaft anzeigt, wenn sie mit Partikeln
des Analyts in Kontakt gebracht wird, in den laminaren Strömungskanal
hinein, wodurch die Probenströmung
und die Indikatorströmung
in einer angrenzenden, laminaren Strömung in dem Kanal fließen;
- c) Leiten einer Referenzströmung,
die eine konstante Konzentration enthält, umfassend Null bis zu einer Sättigung,
von Referenz-Partikeln, vorzugsweise Analyt desselben Typs wie solche
in der Probenströmung, die
eine Kontrollströmung,
eine interne Standardströmung
oder eine Kalibrierungsströmung
ist, in den laminaren Strömungskanal
hinein, wodurch die Referenzströmung
in einer laminaren Strömung
angrenzend an die Indikatorströmung
in dem Kanal fließt;
- d) Ermöglichen,
dass Analyt-Partikel in die Indikatorströmung von der Probenströmung hinein
diffundieren;
- e) Ermöglichen,
dass Referenz-Partikel in die Indikatorströmung von der Referenzströmung hinein
diffundieren; und
- f) Erfassen des Vorhandenseins oder Bestimmen der Konzentration
der Analyt- und Referenz-Partikel in der Indikatorströmung.
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Die
Verfahren und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung dienen dazu,
eine Kontrolle für
jede Probe gleichzeitig mit dem Ablauf der Probe (nicht nur einmal
pro Tag oder einmal pro jede 8-Stunden-Schicht, wie in den zuvor
bekannten Verfahren einer Qualitätskontrolle)
laufen zu lassen. Die Kontrolle kann auch als ein interner Standard
dienen. Die internen Standards dieser Erfindung erfordern kein exogenes
Material, d. h. ein Material, das unterschiedlich zu dem Analyt,
der von Interesse ist, ist. Da eine Kontrolle dieser Erfindung auch
als ein interner Standard dienen kann, liefern die Verfahren und
Vorrichtungen dieser Erfindung eine erhöhte Effektivität einer
Fluid-Analyse gegenüber
zuvor bekannten Verfahren und Vorrichtungen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
eine schematische Darstellung von Strömungen einer Proben-, Referenz-
und Indikatorströmung,
und die Änderungen
in der Indikatorströmung,
die sich aus einer Diffusion von Analyt-Partikel von der Proben-
und Referenzströmung
ergeben, und zwar in einer Ausführungsform
dieser Erfindung.
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2 zeigt
eine schematische Darstellung einer Strömung einer Probenströmung, von
zwei Indikatorströmungen,
und von zwei Referenzströmungen,
und die Änderungen
in den Indikatorströmungen,
die sich aus einer Diffusion von Analyt-Partikel von Proben- und
Referenzströmungen
ergeben, und zwar in einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung.
In dieser Ausführungsform
befinden sich zwei Indikatorströmungen
in einer Fluid-Verbindung mit einer einzelnen Einlassöffnung für die Indikatorströmung.
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3 zeigt
eine schematische Darstellung einer Probenströmung, von zwei Indikatorströmungen und von
zwei Referenzströmungen,
und die Änderungen
in den Indikatorströmungen,
die sich aus einer Diffusion von Analyt-Partikel von Proben- und
Referenzströmungen
ergeben, und zwar in einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung.
In dieser Ausführungsform
besitzt jede der zwei Indikatorströmungen eine separate Eingangsöffnung.
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4A zeigt
eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung,
wobei eine Mehrzahl von Strömungskanälen parallel über einen
Kanal an der Rückseite
des Substrats, z. B. eines Silizium-Wafers, verbunden sind.
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4B zeigt
eine schematische Darstellung der Strömungskanäle der Vorrichtung der 4A und der
Einlasskanäle
in einer Fluid-Verbindung dazu.
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4C zeigt
eine Seitenansicht von 4B.
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5 zeigt
eine schematische Darstellung einer Ausführungsform mit mehreren Strömungskanälen in einem
Substrat.
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6 stellt
eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform dieser Vorrichtung
dar.
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7, die die 7A–7C aufweist,
stellt eine Ausführungsform
dieser Vorrichtung dar, wobei die Strömungsrate durch Einsetzen einer
gemeinsamen (geteilten) Pumpeinrichtung kontrolliert wird.
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8 zeigt
eine schematische Darstellung von fünf foto-mikrografischen Darstellungen,
die während der
Verwendung der Vorrichtung dieser Erfindung, wie sie in 1 dargestellt
ist, aufgenommen sind.
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9 zeigt
eine grafische Darstellung einer Fluoreszenz-Intensität gegenüber einer
x-Koordinate (Position in der Diffusions-Richtung) von 5 Experimenten,
wobei die Probenströmung
0, 2, 4, 6, und 8 g eines menschlichen Serums Albumin (HSA)/100
ml Puffer, jeweils, enthielt. Auch ist in dieser grafischen Darstellung die
Fluoreszenz von Kontrollströmungen
dargestellt, die 3,8 g HSA/100 ml Puffer enthalten.
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10 zeigt
eine grafische Darstellung einer Fluoreszenz-Intensität gegenüber einer
Konzentration von HSA (bestimmt durch eine Vorrichtung nach dem
Stand der Technik) für
sowohl rohe (nicht korrigierte) Daten als auch korrigierte Daten.
Auch umfasst ist eine Kalibrierungskurve.
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11 zeigt
einen QC-Diagramm(Levy-Jennings)Ausdruck einer Fluoreszenz-Intensität einer
Kontrollströmung
(Kontroll-Analyt-Erfassungs-Bereich) für 20 unterschiedliche Experimente.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung schafft Vorrichtungen und Verfahren zum gleichzeitigen Überwachen
einer oder mehrerer Probenströmung(en),
während
eine oder mehrere Referenzströmung(en) überwacht
werden. Die Referenzströmungen
sind Kontrollströmungen
und/oder interne Standardströmungen.
Diese Vorrichtungen und Verfahren dienen weiterhin zum Bestimmen
der Konzentration einer Analyse in einer Probe, während kontinuierlich
die Vorrichtung kalibriert wird, da eine interne Standardströmung mit
einer bekannten Konzentration des Analyts, der von Interesse ist,
in einer laminaren Strömung
mit der Probe vorliegen kann. Diese Vorrichtungen und Verfahren
dienen weiterhin zum Bestimmen der Konzentration eines Analyts in
einer Probe mit einer erhöhten
Genauigkeit als eine Folge eines Einschließens von einer oder mehreren
Standardströmungen)
in einem laminaren Strom mit der Probe: Fluktuation in der Lichtquelle,
Temperaturänderungen,
Variationen in der Indikator-Konzentration, der Proben-Trübheit und
-Farbe, usw., werden berücksichtigt
(herausgesondert). Diese Vorrichtungen dienen auch zum kontinuierlichen Überwachen
der Genauigkeit des Systems als eine Folge einer Verwendung einer
Kontrollströmung
mit einer konstanten Konzentration.
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Wie
für Fachleute
auf dem betreffenden Fachgebiet ersichtlich werden wird, werden
allgemein, je häufiger
eine Vorrichtung kalibriert wird, desto genauer die Messungen dadurch
erhalten. Die Verwendung von internen Standards ermöglicht eine
Beibehaltung einer Genauigkeit von Messungen ungeachtet einer weniger häufigen Kalibrierung
und/oder zum Erhöhen
einer Genauigkeit von Messungen, die zu der Häufigkeit einer Kalibrierung
in Bezug gesetzt ist.
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Die
Verfahren und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung verwenden
eine Diffusion von Partikeln, die von Interesse sind, von einer
laminaren Strömung
in eine angrenzende, laminare Strömung. Eine Diffusion dient
nicht nur als ein Mittel zum Separieren von kleineren Partikeln
von einer Probenströmung,
sondern, was noch wichtiger ist, erleichtert auch ein Erfassen und
Analysieren solcher Partikel, z. B. eine Bestimmung der Konzentration
solcher Partikel, unter deren Diffusion von Probenströmungen,
in Indikatorströmungen
hinein.
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Kontrollströmungen enthalten
konstante Konzentrationen der Partikel, die von Interesse sind,
vorzugsweise nahe zu den geschätzten
Konzentrationen der Partikel, die von Interesse sind, in der Probenströmung. Vorzugsweise
verwenden die Kontrollströmungen
auch dasselbe Trägerfluid
und andere Komponenten als die Probenströmung. Kontrollströmungen werden
dazu verwendet, anzuzeigen, ob die Vorrichtung und/oder das Erfassungs-System
konsistente Ergebnisse über
die Zeit liefern oder nicht, oder ob die Vorrichtung oder das System
eingestellt werden muss, da sich die Ergebnisse über die Zeit ändern. Allgemein
zeigen Ergebnisse, die nicht innerhalb von zwei Standard-Abweichungen
des Durchschnitts, eingerichtet für vorherige Messungen einer
Partikel-Konzentration in der Kontrollströmung liegen, an, dass die Vorrichtung
oder das System eingestellt werden muss.
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Interne
Standardströmungen
enthalten konstante Konzentrationen von Partikeln, die von Interesse sind,
die dieselben oder unterschiedlich gegenüber der abgeschätzten Konzentration
der Partikel in der Probenströmung
sein können,
oder enthalten konstante Konzentrationen eines anderen (exogenen)
Materials. Interne Stan dardströmungen
werden als eine Basis eines Vergleichs mit der Probenströmung verwendet,
so dass die Ergebnisse von einer Messung der gleichen Konzentration
in der Probenströmung
eingestellt werden kann, um Variationen in System-Parametern zu
berücksichtigen,
die gleich auf die Probenströmung
und die interne Standardströmung
wirken. Der Ausdruck „Referenzströmung" umfasst sowohl Kontrollströmungen als auch
interne Standardströmungen,
und, in einer bevorzugten Ausführungsform,
kann dieselbe Strömung
sowohl als eine Kontrollströmung
als auch eine interne Standardströmung verwendet werden. Wenn
eine solche einzelne Referenzströmung
sowohl als eine Kontroll- als auch als eine interne Standardströmung verwendet wird,
wird sie die Zusammensetzung einer Kontrollströmung haben, wie dies nachfolgend
beschrieben ist. Der Ausdruck „Referenzströmung" umfasst auch Kalibrierungsströmungen,
wie sie nachfolgend beschrieben sind. Der Ausdruck „Referenz-Partikel" bezieht sich auf
die Partikel, die von Interesse sind (d. h. Partikel, die erfasst werden
sollen, und/oder gemessen werden sollen), in der Referenzströmung.
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Die
Referenzströmung
kann gleichzeitig mit der Probenströmung, in demselben Strömungskanal, überwacht
werden. Eine Erfassung von Partikeln, die von Interesse sind, in
Bezug auf deren Diffusion in Indikatorströmungen von Referenzströmungen aus
hinein, verwendet als Kontrollströmungen und interne Standardströmungen,
dient für
kontinuierliche Qualitätskontroll-Prüfungen und
zum Sammeln von experimentellen Zuständen, die zu einer verringerten
Genauigkeit in gemessenen Werten, jeweils, führen könnten. Solche experimentellen
Zustände
umfassen Lichtquellen-Fluktuationen, Variationen der Detektor-Empfindlichkeit,
Temperatur-Fluktuationen, Strömungsraten-Fluktuationen, Indikator-Konzentration
und -Qualität/Reinheit,
und Proben-Trübheit.
Ein Laufen lassen von internen Standards gleichzeitig mit der Probe
ermöglicht
eine erhöhte Genauigkeit
in den Werten, die gemessen sind. Die Verwendung einer Kontrollströmung kann
den Benutzer warnen, dass sich die Funktion des Systems wesentlich über die
Zeit seit der Anfangs-Kalibrierung als eine Folge von Faktoren geändert hat,
wie beispielsweise Energie-Fluktuationen, die die Elektroniken oder
Lampen erwärmen,
oder Fehlausrichtung, verursacht durch Bewegen des Instruments so,
dass solche Bedingungen korrigiert werden können.
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Die
Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung sind für den Benutzer
bequemer als andere Vorrichtungen und Verfahren zum Erfassen des
Vorhandenseins oder zum Bestimmen der Konzentration von Analyten
in einer Probe, da diese Erfindung eine weniger häufige Kalibrierung
zulässt.
Die Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung beseitigen die
Notwendigkeit für
gesonderte Kalibrierungs-Läufe
durch den Benutzer, aufgrund der Benutzung von Kontrollen gleichzeitig
und in demselben Strömungskanal
wie die Probenströmung,
was Informationen liefert, die anzeigen, ob die gegebene Kalibrierungskurve
(die durch den Hersteller bestimmt werden kann und die nicht durch
den Benutzer bestimmt werden muss) fortlaufend gültig ist, und die Benutzung
von internen Standards gleichzeitig und in demselben Strömungskanal
liefert Informationen über Reaktions-Zustände, die
die gemessenen Werte für
eine Probe beeinflussen und eine Korrektur davon ermöglichen.
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Ein
Vorteil der Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung ist derjenige,
dass eine Fluidströmung (nachfolgend
bezeichnet als eine Referenzströmung)
dienen kann als 1) eine Kontrolle, 2) ein interner Standard, und/oder
3) sowohl als eine Kontrolle als auch ein interner Standard. Ein
Laufen lassen von einem oder mehreren Referenzströmung(en)
gleichzeitig mit der Probe führt
zu einer Bequemlichkeit und Effizienz gegenüber früheren, bekannten Verfahren
und Vorrichtungen für
eine Fluid-Analyse.
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In
der einfachsten Ausführungsform
(siehe 1), bei der eine einzelne Probenströmung, eine
einzelne Indikatorströmung
und eine einzelne Referenzströmung
in eine Vorrichtung dieser Erfindung geleitet werden, sind zwei
Analyt-Erfassungsbereiche
vorhanden: 1) ein Proben-Analyt-Erfassungsbereich, gebildet durch Diffusion
von Proben-Analyt-Partikel in die Indikatorströmung hinein, und 2) ein Referenz-Analyt-Erfassungsbereich,
gebildet durch Diffusion von Referenz-Analyt-Partikel in die Indikatorströmung hinein.
Da die Referenzströmung
eine Kontrollströmung,
eine interne Standardströmung
oder eine Kalibrierungsströmung
sein kann, kann der Referenz-Analyt-Erfassungsbereich entweder ein
Kontroll-Analyt-Erfassungsbereich,
ein interner Standard-Analyt-Erfassungsbereich oder ein Kalibrierung-Erfassungsbereich
sein.
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Der
Ausdruck „Probenwert" bezieht sich auf
den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft, die durch die
Indikator-Substanz in dem Proben-Analyt-Erfassungsbereich gezeigt ist. In ähnlicher
Weise bezieht sich der Ausdruck „Referenzwert" auf den gemessenen
Wert einer erfassbaren Eigenschaft, gezeigt durch die Indikator-Substanz,
in dem Referenz-Analyt-Erfassungsbereich. Der Ausdruck „interner
Standard-Wert" bezieht
sich auf den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft, die
durch die Indikator-Substanz in dem internen Standard-Analyt-Erfassungsbereich
gezeigt ist. Der Ausdruck „Steuer-Wert" bezieht sich auf
den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft, die durch die
Indikator-Substanz in dem Steuer-Analyt-Erfassungsbereich gezeigt
wird.
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Messungen
einer erfassbaren Eigenschaft können
auch in Bereichen der Probenströmung,
der Referenzströmung
und der Indikatorströmung
irgendwo als die Analyt-Erfassungsbereiche genommen werden, um einen
Background zu geben, d. h. eine Basislinie, Messungen einer erfassbaren
Eigenschaft. Viele Substanzen und Lösungen haben niedrige Hintergrund-Fluoreszens-Niveaus,
z. B. das gesamte Blut emittiert ein sehr niedriges Niveau einer
(Hintergrund) Fluoreszenz aufgrund bestimmter Komponenten, wie beispielsweise
Metabolite und Nährstoffe,
die fluoreszieren, mit niedriger Konzentration. Der Ausdruck „Hintergrund-Wert
des internen Standards" bezieht
sich auf den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft in der
internen Standardströmung,
d. h. nicht in einem Analyt-Erfassungsbereich. Der Ausdruck „Kontroll-Hintergrund-Wert" bezieht sich auf
den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft in der Kontrollströmung, d.
h. nicht in dem Analyt-Erfassungsbereich.
Der Ausdruck „Proben-Hintergrund-Wert" bezieht sich auf
den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft in der Probenströmung, d.
h. nicht in einem Analyt-Erfassungsbereich. Der Ausdruck „Indikator-Hintergrund-Wert" bezieht sich auf
den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft in einem Bereich
der Indikatorströmung,
wo keine Analyt-Partikel darin hinein diffundiert sind, oder im
Wesentlichen keine Analyt-Partikel sind darin diffundiert, so dass
keine erfassbare Eigenschaft erfassbar ist, d. h. nicht in einem
Analyt-Erfassungsbereich.
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Die
bevorzugten Ausführungsformen
dieser Erfindung verwenden Flüssigkeitsströmungen,
obwohl die Verfahren und Vorrichtungen auch zur Verwendung mit gasförmigen Strömungen geeignet
sind.
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Der
Ausdruck „Erfassung", wie er hier verwendet
ist, bedeutet eine Bestimmung, dass eine bestimmte Substanz vorhanden
ist. Die Verfahren und Vorrichtungen dieser Erfindung können auch
dazu verwendet werden, die Konzentration einer Substanz in einer
Probenströmung
zu bestimmen.
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Der
Ausdruck „abgeschätzte Konzentration", wie er hier verwendet
wird, bedeutet, dass die Konzentration innerhalb eines bestimmten
Grads einer Genauigkeit bekannt ist. Vorzugsweise sollten gemessene
Werte dieser geschätzten
Konzentration innerhalb von ±zwei
Standard-Abweichungen des abgeschätzten Soll-Werts liegen.
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Der
Ausdruck „Partikel" bezieht sich auf
irgendein partikel- bzw. teilchenförmiges Material, einschließlich Molekülen, Zellen,
suspendierte oder aufgelöste
Partikel, Ionen und Atome. Die Partikel können organisch oder anorganisch
sein.
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Die
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise vor einer
Messung einer gegebenen Probe oder einer Mehrzahl von Proben kalibriert.
Eine Kalibrierung kann auch während
einer Proben-Messung unter Verwendung von Kalibrierungsströmungen durchgeführt werden.
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Der
Ausdruck „Kalibrierungsströmung", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf eine Strömung,
die eine bekannte Konzentration, einschließlich einer Konzentration von
Null, des Analyts, der von Interesse ist, enthält. Kalibrierungsströmungen werden
dazu verwendet, Kalibrierungs-Kurven zu bestimmen, die sich auf Analyt-Konzentrationen zu
gemessenen Werten einer erfassbaren Eigenschaft des Analyts beziehen.
Die Konzentrationen einer Mehrzahl von Kalibrierungsströmungen gegenüber deren
entsprechenden, gemessenen Werte einer erfassbaren Eigenschaft,
z. B. einer Fluoreszenz oder eines Absorptions-Vermögens, werden grafisch
dargestellt, um eine Kalibrierungs-Kurve zu erhalten. Kalibrierungsströmungen,
und die sich ergebenden Kalibrierungs-Kurven, die davon abgeleitet
sind, liefern Werte einer erfassbaren Eigenschaft, mit der eine Probe
oder eine Referenz verglichen werden kann. Kalibrierungsströmungen können laufen
und gemessen werden, bevor oder nachdem Probenströmungen laufen
und gemessen werden. Vorzugsweise wird eine Vorrichtung vor deren
Verwendung, und vorzugsweise nur einmal, kalibriert. Eine Kalibrierung
kann gleichzeitig mit einem Laufen lassen der Probe durch Laufen
lassen von einer oder mehreren, vorzugsweise einer Mehrzahl von
Kalibrierungsströmungen
in dem System, zusammen mit der Probenströmung durchgeführt werden.
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Eine
Kalibrierung wird durchgeführt,
um die geometrischen Parameter (strukturelle Variation), z. B. Breiten
und Tiefen des Strömungskanals,
und Oberflächen-Reflektivität, in der
Vorrichtung selbst, zu berücksichtigen.
Ein Hersteller kann eine große
Anzahl von Vorrichtungen in einer Charge herstellen, z. B. 10.000
bis 100.000 Silizium-Chips mit einer Vorrichtung dieser Erfindung
jeweils. Der Hersteller kann dann einen kleinen Prozentsatz der
Vorrichtungen in dieser Charge kalibrieren, z. B. 5–10 Vorrichtungen,
und kann Kalibrierungs-Kurven mit einem bestimmten Grad einer Genauigkeit
bestimmen. Zum Beispiel kann eine Kalibrierung bestimmen, dass die
durchschnittliche Breite des Strömungskanals
(die Dimension orthogonal zu der Diffusions-Richtung; die Breite
ist die Dimension des optischen Pfads für Ausführungsformen mit optischer
Erfassung) 50 Mikrometer beträgt,
und dass sie zwischen 49 und 51 Mikrometern variiert. Demzufolge
erkennt ein Benutzer, dass die Werte, erhalten von irgendeiner Vorrichtung
in dieser Charge, akkurat innerhalb von 4% liegen, und kann deshalb
auswählen,
die Vorrichtung nicht zu kalibrieren.
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Eine
Kalibrierung wird durch Messen einer erfassbaren Eigenschaft, z.
B. Fluoreszenz, einer Strömung,
die eine bekannte Konzentration eines Analyts enthält, durchgeführt. Irgendein
Abschnitt der Vorrichtung, der hinsichtlich Proben-Messungen überwacht
werden kann, kann kalibriert werden. Eine Kalibrierungsströmung einer
bekannten Konzentration einer Substanz, die eine erfassbare Eigenschaft
besitzt, wird an allen Abschnitten des Strömungskanals überwacht,
wo Proben-Messungen vorgenommen werden können, um dadurch eine Kalibrierungs-Kurve
für diesen
Analyt zu erhalten. Dieselbe Vorrichtung kann auch für irgendeine Zahl
von anderen Analyten, z. B. bestimmten Proteinen, einem pH-Wert,
Kationen, Viren, usw., kalibriert werden.
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Wie
für Fachleute
auf dem betreffenden Fachgebiet verständlich werden wird, können die
Kalibrierungsströmungen
allgemein die meisten, oder irgendwelche, Analyte, die analysiert
werden sollen, sein, oder eine Kalibrierungsströmung kann spezifisch für den Analyt,
der analysiert werden soll, sein. Zum Beispiel kann, falls der Analyt
ein menschliches Serum Albumin ist, die Probe mit einer Vorrichtung,
kalibriert mit einer allgemeinen Kalibrierungs-Lösung nach dem Stand der Technik,
z. B. Rhodamin, analysiert werden. Alternativ kann die Vorrichtung
innerhalb einer Kalibrierungsströmung
kalibriert werden, die eine bekannte Konzentration eines menschlichen
Serums Albumin enthält.
Die Auswahl von Kalibrierungs-Lösungen/Strömungen kann
durch eine routinemäßige Auswahl
ohne unnötiges
Experimentieren vorgenommen werden, wobei Fachleute erkennen, dass
die Genauigkeit von Messungen von Kalibrierungs-Lösungen und
der Häufigkeit
abhängt.
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Ein
Hersteller kann Kalibrierungen so durchführen, dass ein Benutzer nicht
die Vorrichtung kalibrieren muss. Ein Benutzer kann dann interne
Standards verwenden, um experimentelle Zustände zu berücksichtigen, die die gemessenen
Werte beeinflussen könnten.
Ein Benutzer kann die Vorrichtung, zusätzlich zu einer vorherigen
Kalibrierung des Herstellers, kalibrieren, falls eine größere Genauigkeit
erwünscht
ist.
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In
bestimmten Ausführungsformen
dieser Erfindung kann ein Hersteller eine Vorrichtung hinsichtlich verschiedener
Analyte kalibrieren und kann den Benutzer mit derselben Anzahl von
Kalibrierungs-Kurven, zum Beispiel in einem Software-Package, ausstatten.
In diesem Fall kann der Benutzer den Analyt, der gemessen werden
soll, eingeben, so dass das Programm korrekt die Daten mit der korrekten
Kalibrierungs-Kurve
vergleichen könnte.
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Die
Eingangs-Probenströmung
kann irgendeine Strömung
sein, die Partikel enthält,
einschließlich
von Partikeln unterschiedlicher Größen, zum Beispiel Blut, kontaminiertes
Trinkwasser, kontaminierte, organische Lösungsmittel, Urin, biotechnologische
Prozess-Proben, z. B. Fermentations-Brühen und Immuntests, Medikamenten-Analyse-Proben,
und dergleichen. Die Eingangs-Probenströmung ist nicht notwendigerweise
kontaminiert: reines Trinkwasser und hochwertige Chemikalien können mit
Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung analysiert werden,
um Konzentrationen von Analyten zu bestimmen, die keine Kontaminierungs-Bestandteile
sind, z. B. Natriumionen in sauberem Trinkwasser und Protonen in
chemischen Lösungen
(um den pH-Wert davon zu bestimmen). Der Analyt kann irgendein kleines
Partikel in der Eingangs-Probenströmung sein, der dazu geeignet
ist, in die Indikatorströmung
hinein in der Vorrichtung zu diffundieren, z. B. Sauerstoff-Moleküle, Protonen,
Kalzium- oder Natriumionen, Proteine, z. B. Albumin, organische
Moleküle,
Medikamente, Pestizide, und andere Partikel. In einer bevorzugten
Ausführungsform
diffundieren, wenn die Probenströmung
das gesamte Blut ist, kleine Ionen, wie beispielsweise Protonen
und Natriumionen, schnell über
den Kanal, wogegen größere Partikel,
wie beispielsweise große
Proteinen, langsam diffundieren. Ein Vorteil der Vorrichtung und
von Verfahren dieser Erfindung ist derjenige, dass sie zur Separation
von kleinen Analyt-Partikeln durch Diffusion von größeren Partikel
dienen, um dadurch eine Erfassung und Messung von kleineren Partikeln
durch eine optische Einrichtung zu erleichtern. Größere Partikel
tendieren dazu, Licht, verwendet durch die optische Erfassungs-Einrichtung,
zu streuen, wobei es folglich bevorzugt ist, größere, Licht streuende Partikel
von kleineren Analyt-Partikel zu separieren. Vorzugsweise sind die
Analyt-Partikel nicht größer als ungefähr 3 Mikrometer,
noch bevorzugter sind sie nicht größer als ungefähr 0,5 Mikrometer,
oder bevorzugt sind sie nicht größer als
ungefähr
1.000.000 MW, und noch bevorzugter sind sie nicht größer als
ungefähr 50.000
MW.
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Eine
oder mehrere Referenzströmung(en)
können
gleichzeitig mit einer Probenströmung
laufen und gemessen werden. Das bedeutet, dass eine oder mehrere
Referenzströmung(en)
in demselben Strömungskanal
zu derselben Zeit wie Probenströmung(en)
und Indikatorströmung(en)
(und in einer laminaren Strömung dazu)
laufen gelassen und gemessen werden können. Eine Probenströmung befindet
sich angrenzend an eine Indikatorströmung (auf einer ersten Seite
davon), und eine Indikatorströmung
befindet sich angrenzend (auf der zweiten Seite davon) zu einer
Referenzströmung.
Das bedeutet, dass sowohl eine Probenströmung als auch eine Referenzströmung angrenzend
zu der Indikatorströmung
vorliegen.
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Kontrollströmungen dienen
für Qualitäts-Kontroll-Prüfungen in
Bezug auf verschiedene Parameter in den Vorrichtungen und Verfahren
dieser Erfindung, einschließlich
einer Strömungsrate.
Eine Qualitätskontrolle (Quality
Control – QC)
der Probenströmungsrate
kann durch Ausdrucken eines QC-Diagramms (Levy-Jennings Ausdruck)
des gemessenen Kontroll-Werts durchgeführt werden, d. h. Konzentration
eines Analyts, wie sie durch eine bekannte Erfassungs-Einrichtung
erfasst, z. B. Fluoreszenz, gegenüber der Proben-Zahl. Alternativ
kann ein QC-Diagramm (Levy-Jennings
Ausdruck) von der Position (x-Koordinate) in der Diffusions-Dimension
(Tiefe) der Peak-Intensität,
die gemessen ist, gegenüber
der Proben-Zahl, vorgenommen werden.
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Alternativ
kann eine Qualitätskontrolle
der Probenströmungsrate
unter Verwendung derselben Pump-Einrichtung, z. B. eines Motors,
erreicht werden, um die Proben- und
Referenzströmungen
in dem laminaren Strömungskanal
der Vorrichtung zu pumpen. In dieser Ausführungsform kann jede der Eingangsöffnungen
mit einer Spritze ausgestattet sein, wobei jede Spritze durch einen
Motor angetrieben wird, um eine konsistente Strömungsrate sicherzustellen.
Eine Fluktuation in der Strömungsrate
der Probenströmung
wird unmittelbar durch Hinweisen auf eine entsprechende Fluktuati on
in der Kontrollströmung
erscheinen. Wiederum liefert ein QC-Ausdruck (Levy-Jennings) entweder
der Analyt-Konzentration der gemessenen Kontrollströmung oder
der gemessenen Position (x-Koordinate) des Kontrollströmung-Peaks
gegenüber
der Proben-Zahl ein einfaches Mittel, um eine Kontrollströmungsflussrate
zu prüfen.
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Sowohl
die Probenströmung
als auch die Referenzströmung(en)
werden durch dieselbe Quelle gepumpt, wobei dann die Strömungsrate
in einer Strömung
dieselbe wie die Strömungsrate
in einer anderen Strömung
ist. Dies stellt sicher, dass keine Blockade der Einlasskanäle vorhanden
ist. Deshalb kann es bevorzugt sein, einen Strömungsraten-Sensor in jedem
Einlasskanal vorzusehen, um eine Strömungsraten-Konsistenz zu bestätigen.
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Der
Ausdruck „Kontrollieren
einer Strömungsrate", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf eine Bestimmung, dass eine Probenströmung unter
einer gegebenen (erwünschten)
Strömungsrate
fließt,
durch Überwachen
der Strömungsrate
einer Kontrollströmung.
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Der
Ausdruck „interne
Standardströmung", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf eine Strömung, die
eine Konstante, geschätzte
oder bekannte Konzentration von Partikeln, vorzugsweise Analyt-Partikeln,
die von Interesse sind, enthält.
Die interne Standardströmung
enthält
vorzugsweise Analyt-Partikel desselben Typs, d. h. derselben chemischen
und molekularen Struktur, wie die Analyt-Partikel in der Probenströmung. Zum
Beispiel enthält,
falls der Analyt, der in der Probenströmung analysiert werden soll,
Kalziumionen sind, dann die interne Standardströmung eine konstante Konzentration
von Kalziumionen. Der Ausdruck „konstant", wie er hier verwendet wird, bedeutet
sich im Wesentlichen nicht ändernd.
Obwohl eine exogene Substanz, d. h. eine Substanz, die nicht bei
der Probe vorhanden ist, als Referenz-Partikel in der internen Standardströmung verwendet
und gemessen werden kann, muss ein solches exogenes Material nicht
in den internen Standards dieser Erfindung eingeschlossen sein,
da die internen Standard-Partikel nicht zu der Probenströmung wie
bei Verfahren nach dem Stand der Technik hinzu gegeben werden, sondern
in einer separaten Strömung gemessen
werden. Eine erfassbare Eigenschaft, z. B. eine Fluoreszenz, proportional
zu der Konzentration des Referenz-Partikels, das von Interesse ist,
wird in dem internen Standard-Analyt-Erfassungsbereich in demselben
Strömungskanal
zu derselben Zeit, zu der die erfassbare Eigenschaft gemessen wird,
und zwar in dem Proben-Analyt-Erfassungsbereich, gemessen. Das Verhältnis zwischen
dem letzteren Wert und dem ersteren Wert, Probenwert/interner Standard-Wert,
oder interner Standard-Wert/Probenwert, kann bestimmt werden, um
einen korrigierten Wert zum Bestimmen einer Proben-Konzentration,
z. B. durch Vergleichen mit einer Kalibrierungs-Kurve, zu liefern.
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Die
Verwendung des Verhältnisses
des Probenwerts zu dem internen Standard-Wert liefert ein Verfahren
zum Berücksichtigen
oder Kompensieren, d. h. Korrigieren, von bestimmten experimentellen
Zuständen, die
die Genauigkeit der gemessenen Werte verringern könnten, z.
B. Variationen in der Intensität
der Lichtquelle über
die Zeit, Variationen in der Farbton-Intensität (z. B. Farb-Ausbleichen),
Variationen in den Strömungsgeschwindigkeiten
zwischen einem Probenlauf und dem nächsten, zu kompensieren. Das
Laufen lassen des internen Standards in demselben Strömungskanal
zu derselben Zeit, d. h. in demselben Lauf, mit der Probe führt dazu,
dass dieselben, experimentellen Bedingungen sowohl die internen
Standardströmungen)
als auch die Probenströmung(en),
und mit demselben Grad, beeinflussen. Eine Berücksichtigung dieser experimentellen
Bedingungen erhöht
die Genauigkeit der gemessenen Werte für die Probenströmungen.
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Um
weiter die Genauigkeit der gemessenen Werte der Probenströmungen zu
prüfen,
können
die Verhältnisse
des Probenwerts zu dem internen Standard-Wert (vorzugsweise unter
Verwendung derselben Konzentration in jeder internen Standardströmung) für eine Mehrzahl
von Proben grafisch dargestellt werden, was eine Linie oder Kurve
mit korrigierten Werten ergibt. Eine Kontrollströmung kann laufen gelassen und
gemessen werden, zusammen mit demselben, internen Standard. Das
Verhältnis
des Kontroll-Werts zu dem internen Standard-Wert sollte auf die
grafische Linie von korrigierten Werten fallen.
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Andere
mathematische Operationen können
in Bezug auf die Daten, die von einer solchen Vorrichtung gesammelt
sind, durchgeführt
werden. Zum Beispiel sind die folgenden Verhältnisse zum Verbessern der
Genauigkeit des gemessenen Werts der Probe nützlich:
(Probenwert – Proben-Hintergrund-Wert)/(Referenz-Wert – Referenz-Hintergrund-Wert);
{(Probenwert – Proben-Hintergrund-Wert)/(Referenz-Wert – Referenz-Hintergrund-Wert)}/Indikator-Hintergrund-Wert;
und
(Probenwert – Indikator-Hintergrund-Wert)/(Referenz-Wert – Indikator-Hintergrund-Wert);
wie
für Fachleute
auf dem betreffenden Fachgebiet ersichtlich werden wird, ermöglicht das
Einschließen
von mehr als einen internen Standard pro Probe eine größere Korrektur
der gemessenen Werte, und verschiedene, mathematische Manipulationen
werden verwendet, um diese Korrekturen vorzunehmen. Zum Beispiel
ist es, falls das Analyt Natriumionen sind, bevorzugt, zwei interne
Standardströmungen
zu verwenden: eine mit einer hohen Konzentration an Natriumionen,
die andere mit einer niedrigen Konzentration an Natriumionen. Alternativ
kann es, falls die Probenströmung
das gesamte Blut ist, bevorzugt sein, zwei interne Standardströmungen zu
verwenden: eine, die BC1 enthält
(das niedrige Konzentrationen von bestimmten Blutkomponenten enthält), und
die andere, die BC2 enthält
(die hohe Konzentrationen dieser selben Blutkomponenten enthält). Ein
anderes Beispiel einer Verwendung von zwei internen Standards ist
der Fall, bei dem eine Probe hinsichtlich zwei Analyten analysiert
wird, z. B. Kalziumionen und menschliches Serum Albumin (HSA). In
diesem Fall befindet sich die Probenströmung in der Mitte des Strömungskanals.
Auf einer Seite der Probenströmung
ist eine Indikatorströmung
vorhanden, die das Vorhandensein und die Konzentration von Kalziumionen
anzeigen, auf der anderen Seite der Probenströmung befindet sich eine Indikatorströmung, die
das Vorhandensein und die Konzentration von HSA anzeigt. Auf der
anderen Seite der Kalzium-Indikatorströmung befindet sich eine interne Standardströmung, die
eine konstante, vorzugsweise bekannte, Konzentration an Kalzium
enthält.
Auf der zweiten Seite der Indikatorströmung befindet sich eine interne
Standardströmung,
die eine konstante, bevorzugt bekannte, Konzentration von HSA enthält. Demzufolge
ist dabei eine interne Standardströmung für jeden Analyt vorhanden.
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In
Ausführungsformen,
bei denen zwei oder mehr interne Standards für eine gegebene Probe verwendet
werden, müssen
sie mit der Kalibrierungs-Kurve verglichen werden, um zu bestimmen,
ob die Kalibrierungs-Kurve ebenso genau dafür ist, d. h. ob jeder der internen
Standard-Werte ebenso nahe zu der Kalibrierungs-Kurve liegt. Die
mathematischen Operationen, die in Bezug auf die Probenwerte und
eine Mehrzahl von internen Standard-Werten durchgeführt werden,
hängen
davon ab, ob die Kalibrierungs-Kurve gleich genau für jede der
Mehrzahl von internen Standards ist.
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Falls
die Kalibrierungs-Kurve gleich genau für jede der Mehrzahl der internen
Standards ist, dann kann, zum Beispiel, der Probenwert durch jeden
der internen Standard-Werte dividiert werden. Unter den verschiedenen,
mathematischen Operationen, die in Bezug auf Daten, erhalten von
einem Fall, durchgeführt
werden, bei dem zwei interne Standards mit einer Probe laufen, kann
der gemessene Probenwert durch jeden der zwei gemessenen, internen
Standard-Werte dividiert werden. Alternativ können zwei interne Standard-Werte gemittelt
werden, und dann kann der Probenwert durch diesen Mittelwert geteilt
werden. Wie für
Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet verständlich wird, wird die Auswahl
einer mathematischen Operation, die in Bezug auf den Probenwert
mit den internen Standard-Werten durchgeführt werden soll, durch die
mathematische Operation vorgegeben, die in Bezug auf die Kalibrierungs-Werte
und die internen Standard-Werte durchgeführt wird, wenn die Kalibrierungs-Kurve,
die verwendet werden soll, bestimmt wird: die internen Standard-Werte werden
mathematisch in derselben Art und Weise in jedem Fall verwendet,
ob nun bei einer Bestimmung einer Kalibrierungs-Kurve oder bei einer
Korrektur einer Proben-Messung.
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Falls
die Kalibrierungs-Kurve nicht gleich genau für jeden der Mehrzahl der internen
Standards ist, wie dies durch Ausdrucken einer Mehrzahl von internen
Standard-Werten bestimmt ist, und zwar gegenüber der Kalibrierungs-Kurve
für die
Vorrichtung, dann kann die mathematische Funktion, die die Beziehung
zwischen den internen Standard-Werten beschreibt, mathematisch,
z. B. durch Multiplikation, mit der Funktion, die die Kalibrierungs-Kurve
beschreibt, verknüpft
werden, um eine korrigierte Kalibrierungs-Kurve zu erhalten. Allgemein
besitzt eine Kalibrierungs-Kurve einen bestimmten Grad einer Genauigkeit
nur innerhalb eines bestimmten Konzentrations-Bereichs. Deshalb
wird, in einigen Fällen,
zum Beispiel, ein Standard-Wert mit einer hohen Konzentration weiter
von der Kalibrierungs-Kurve entfernt liegen, als, beispielsweise,
ein interner Standard-Wert einer niedrigen Konzentration. Demzufolge
ergibt ein Multiplizieren der Funktion, die die Beziehung zwischen
diesen zwei internen Standard-Werten beschreibt, mit der originalen
Kalibrierungs-Kurve eine korrigierte Kalibrierungs-Kurve. Unter
Bestimmen eines Probenwerts kann man dann die sen zu einem internen Standard-Wert
in Bezug setzen, z. B. durch Dividieren des Probenwerts durch den
internen Standard-Wert, falls die Kalibrierungs-Werte durch interne
Standard-Werte dividiert wurden, um die originale Kalibrierungs-Kurve
zu bestimmen. Dies führt
zu einer dimensionslosen Zahl, die mit der (korrigierten) Kalibrierungs-Kurve verglichen
werden kann, um eine Konzentration eines Analyts zu erhalten, d.
h. die dimensionslose Zahl wird auf der y-Achse der Kalibrierungs-Kurve
gefunden und der entsprechende x-Achsen-(Konzentration)-Wert wird
von der Kalibrierungs-Kurve gelesen.
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In
einer Ausführungsform
wird sowohl eine hohe als auch eine niedrige Konzentration von Referenz-Partikeln,
die von Interesse sind, zum Kalibrieren und für eine Proben-Korrektur verwendet.
Zum Beispiel werden Kalibrierungsströmungen, die 5, 10, und 15 g/100
ml HSA enthalten, laufen gelassen, und hinsichtlich einer Fluoreszenz überwacht.
Interne Standardströmungen,
die 3 g/100 ml (niedrig) und 18 g/100 ml (hoch) enthalten, werden
gleichzeitig laufen gelassen und hinsichtlich der Fluoreszenz überwacht.
Eine Fluoreszenz-Intensität
jeder der Kalibrierungsströmungen
(die 5, 10 und 15 g/100 ml HSA enthalten) werden gegenüber der
Fluoreszenz-Intensität
der Kontrollströmung
mit niedriger Konzentration plus der Fluoreszenz-Intensität des internen
Standards mit hoher Konzentration durch zwei dividiert. Dies führt zu einer
Kalibrierungs-Kurve, mit der Probenwerte verglichen werden können. Probenwerte,
geteilt durch das Mittel der internen Standard-Werte, für die die
Kalibrierungs-Kurve bereits dahingehend bestimmt worden ist, dass
sie ebenso gültig ist,
können
auch mit einer solchen Kalibrierungs-Kurve verglichen werden.
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Vorrichtungen
dieser Erfindung können
für räumliche
Variationen in der Licht-Intensität und in
der Lichtsammel-Effektivität
in der folgenden Art und Weise kalibriert werden: der gesamte Kanal
wird mit einer Farbstoff-Lösung
mit einem Spektrum ähnlich
zu demjenigen des Indikators (vorzugsweise der Indikator selbst,
gesättigt
mit Analyt) geflutet, um das zu erzielen, was, unter idealen Umständen, ein
gleichförmiges, optisches
Bild sein sollte. Das Inverse dieses Bilds wird dann durch alle
Proben-Bilder, verwendet
dazu, das Ansprechverhalten des optischen Systems in darauf folgenden
Proben-Messungen mit mehreren Strömungen zu „normieren" (zu korrigieren), multipliziert.
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Falls
zwei zusammensetzungsmäßig unterschiedliche
Indikatorströmungen
verwendet werden, können
zwei Referenzströmungen,
wobei jede davon Analyte enthält,
mit denen die zwei Indikatoren reagieren, verwendet werden, ohne
dass ein Indikator quer-empfindlich zu beiden Analyten ist. Alternativ
können,
falls zwei zusammensetzungsmäßig unterschiedliche
Indikatorströmungen
verwendet werden, zwei Referenzströmungen, wobei eine nur einen
Analyt enthält,
für den
einer der Indikator-Ströme empfindlich
ist, und eine zweite Referenzströmung,
die einen unterschiedlichen Analyt enthält, für den die andere Indikatorströmung empfindlich
ist, verwendet werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann eine Indikatorströmung
ein Reagenz umfassen, das, z. B., chemisch reagiert, mit einem Analyt
in einer Probe, um ein Produkt zu bilden, das durch eine andere
Indikatorströmung
erfasst wird. Ein Beispiel einer Ausführungsform, die eine Mehrzahl
von Indikatorströmungen
mit einer unterschiedlichen Zusammensetzung verwendet, ist eine
Vorrichtung, die vier Einlassströmungen
besitzt, die in einer laminaren Strömung fließen, wobei eine mittlere Strömung eine
Indikatorströmung
ist, die ein Reagenz enthält.
Zum Beispiel befindet sich auf der am weitesten links liegenden
Seite der Vorrichtung eine Probenströmung aus Blut, die nächste Strömung nach
rechts hin ist eine Indikatorströmung,
die Glukose-Oxidase
(ein Reagenz) enthält,
die dritte Strömung
ist eine Indikatorströmung,
die einen pH-empfindlichen Farbstoff enthält, und die vierte Strömung (auf
der am weitesten rechts liegenden Seite) ist eine Kontrollströmung, die
eine bekannte Menge an Glukonsäure
enthält.
Da Glukose-Partikel von der Probenströmung durch die Reagenzströmung diffundieren,
werden sie zu Glukonsäure
hin geändert,
die durch einen pH-empfindlichen Farbstoff erfasst wird, wenn die
Glukonsäuremoleküle in die
Indikatorströmung
hinein diffundieren. Die Glukonsäuremoleküle von der
Kontrollströmung
werden in die Indikatorströmung
hinein diffundieren. Die Fluoreszenz von jeder Seite der Indikatorströmung kann
gemessen werden. Der Fluoresenzwert von der Seite der Indikatorströmung am
nächsten
zu der Probenströmung
(d. h. der Proben-Analyt-Erfassungsbereich)
zeigt die Menge an Glukonsäure
an, die davon abgeleitet ist, und deshalb die Menge von Glukose
in der Probe, die mit dem Wert verglichen werden kann, der von dem
Kontrollströmung-Analyt-Erfassungsbereich
erhalten ist, was als eine (Qualitätskontroll-)Prüfung des
gemessenen Werts der Probe dient.
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Das
System kann auch eine Indikatorströmung umfassen, die in eine
der Einlasseinrichtungen hinein eingeführt ist, aufweisend einen Flüssigkeitsträger, der
Substratpartikel, wie beispielsweise Polymere oder Kügelchen,
enthält,
die eine Indikatorsubstanz, die darauf immobilisiert ist, besitzen,
wie dies in der US-Patentanmeldung „Fluorescent Reporter Beads
for Fluid Analysis",
Serial Number 08/621,170, angemeldet am 20. März 1996, nun US-Patent 5,747,349,
herausgegeben am 5. Mai 1998, beschrieben ist. Solche Substratpartikel,
die eine Indikatorsubstanz besitzen, die darauf immobilisiert ist,
sind groß genug
(besitzen einen Diffusionskoeffizienten, der klein genug ist), dass
deren Diffusion aus der Indikatorströmung heraus vernachlässigbar
ist, d. h. nicht wesentlich ist. Der Flüssigkeitsträger kann irgendeine Flüssigkeit
sein, die eine Indikatorsubstanz besitzt und die dazu geeignet ist,
Partikel, die von der Proben- und/oder Referenzströmung diffundieren,
aufzunehmen. Bevorzugte Indikatorströmungen in Fällen, bei denen die Probe das
gesamte Blut ist, weisen Wasser und Lösungen auf, die denselben,
osmotischen Druck wie das gesamte Blut haben, wie beispielsweise
Salzwasser mit einer Salzkonzentration von ungefähr 10 mM NaCl, KCl oder MgCl,
oder organische Lösungsmittel,
wie Aceton, Isopropylalkohol, Ethanol oder irgendeine andere passende
Flüssigkeit,
die nicht den Effekt des Analyts an der Indikator-Substanz oder
der Erfassungs-Einrichtung beeinflusst.
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Falls
die Konzentration von Analyt-Partikel hoch ist, d. h. hoch genug,
um die Indikator-Substanz zu sättigen,
dann können
Messungen an der voran führenden
Flanke des Analyt-Erfassungsbereichs vorgenommen werden, wo ein
lokaler Überschuss
von Indikator-Partikeln vorhanden ist. Die „voranführende Flanke" bezieht sich auf
die Grenze des Analyt-Erfassungsbereichs und der Indikatorströmung, d.
h. die Kante des Analyt-Erfassungsbereichs, die am weitesten von
der Strömung
weg liegt, von wo aus die Analyt-Partikel diffundieren.
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Kalibrierungsströmungen,
Kontrollströmungen
und interne Standardströmungen
können
alle Strömungen
sein, die eine bekannte Konzentration des Analyts, der von Interesse
ist, enthalten, d. h. sie können
zusammensetzungsmäßig dieselben
sein. Sie unterscheiden sich untereinander in Bezug auf deren Zweck
und darin, wann und wie häufig
sie verwendet werden. Kalibrierungsströmungen werden dazu verwendet,
die Vorrichtungen dieser Erfindung zu kalibrieren, d. h. die Dimensionen
und die spezifischen Details der Vorrichtung, wie beispielsweise
die Kanalbreite, zu berücksichtigen. Eine
Kalibrierung kann nur einmal für
eine gegebene Vorrichtung durchgeführt werden und wird vor, nach
oder während
der Zeit, zu der Proben-Messungen vorgenommen werden, durchgeführt. Falls
eine größere Genauigkeit
erwünscht
ist, kann eine Kalibrierung häufiger durchgeführt werden.
Interne Standardströmungen
werden verwendet, um Effekte von experimentellen Bedingungen zu
berücksichtigen,
d. h. die herauszunehmen, die die Werte, die gemessen sind, beeinflussen;
sie laufen alle zu derselben Zeit in demselben Strömungskanal
wie die Probe. Kontrollströmungen
dienen als eine Qualitäts-Kontroll-Prüfung der
gemessenen Werte und laufen vorzugsweise zu derselben Zeit und in
demselben Strömungskanal
wie die Probe.
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Eine
gegebene Strömung
kann sowohl als eine Kontrollströmung
als auch eine interne Standardströmung dienen. Zum Beispiel kann,
in einer Ausführungsform,
bei der drei Eingangsströmungen
vorhanden sind – eine
Probenströmung,
eine Indikatorströmung
und eine Referenzströmung,
die eine konstante, geschätzte Konzentration
des Analyts, der von Interesse ist, enthält –, der gemessene Wert einer
erfassbaren Eigenschaft, z. B. Fluoreszenz-Intensität, in dem
Referenz-Analyt-Erfassungsbereich gemessen werden. Dieser Wert kann gegenüber dem
verglichen werden, was dahingehend bekannt ist, dass es ein annehmbarer
Wert ist, und zwar basierend auf einer Kalibrierungs-Kurve. In diesem
Sinne dient die Referenzströmung
als eine Qualitäts-Kontroll-Prüfung, d.
h. eine Kontrollströmung.
Zusätzlich
kann (derselbe) gemessene Wert einer erfassbaren Eigenschaft als
ein interner Standard dienen, z. B. der Probenwert kann durch den
internen Standard-(Referenz)-Wert dividiert werden, um experimentelle
Bedingungen zu korrigieren. Demzufolge kann eine Referenzströmung zu
Daten führen
(ein gemessener, erfassbarer Wert), die als sowohl eine Kontrolle
als auch ein interner Standard dienen können. Natürlich ist es bevorzugt, sowohl
eine interne Standardströmung
als auch eine Kontrollströmung
zu haben, so dass die Kontrollströmung durch eine mathematische
Manipulation unter Verwendung des gemessenen Werts der internen
Standardströmung
korrigiert werden kann.
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Der
Ausdruck „laminarer
Strömungskanal", wie er hier verwendet
wird, bedeutet einen Kanal, der eine laminare Strömung unter
hydrodynamischen Bedingungen ermöglicht,
definiert durch Viskosität
und Strömungsgeschwindigkeit.
Für einen
Kanal mit gegebenen Dimensionen kann eine laminare Strömung für eine Flüssigkeit
mit einer bestimmten Viskosität
und Strömungsgeschwindigkeit
erreicht werden. Die Di mensionen der Vorrichtungen werden so ausgewählt, dass
eine laminare Strömung
aufrechterhalten wird, d. h. eine niedrige Reynold'sche Zahl, vorzugsweise
unterhalb von ungefähr
1. Das bedeutet, dass mindestens eine Dimension – entweder die Tiefe und/oder
die Breite – klein
genug ist, um eine niedrigere Reynold'sche Zahl und demzufolge eine laminare
Strömung
beizubehalten. Der laminare Strömungskanal
ist lang genug, um zu ermöglichen,
dass kleine Analyt-Partikel von einer Probenströmung, und von einer Referenzströmung, falls
eine solche Referenzströmung
Analyt-Partikel enthält,
diffundieren, und haben einen erfassbaren Effekt in Bezug auf eine
Indikator-Substanz
oder eine Erfassungseinrichtung, vorzugsweise mindestens ungefähr 2 mm
lang. In bevorzugten Ausführungsformen
dieser Erfindung liegt die Kanallänge (L) (siehe 1)
zwischen ungefähr
5 mm und ungefähr
50 mm. Die Kanaltiefe (d) (Diffusionsrichtung) beträgt vorzugsweise
zwischen ungefähr
20 Mikrometern und ungefähr
1 mm. Der Kanal ist bevorzugter relativ tief ausgebildet, z. B.
mindestens ungefähr 200
Mikrometer, was es einfacher macht, eine Indikator-Fluoreszenz mit
einfachen Optiken zu messen, und bei dem es weniger wahrscheinlich
ist, dass Partikel den Kanal verstopfen. Allerdings kann der Kanal
so flach wie möglich
ausgebildet werden, während
ein Verstopfen des Kanals mit den Partikeln, die verwendet werden, vermieden
wird. Die Kanalbreite (die Dimension orthogonal zu der Tiefe und
Länge)
ist klein genug, um eine laminare Strömung von zwei Strömungen darin
zu ermöglichen,
vorzugsweise nicht größer als
ungefähr
einen Millimeter und noch bevorzugter zwischen ungefähr 100 Mikrometern
und ungefähr
400 Mikrometern. Falls die Probe menschliches Blut umfasst, das
Blutzellen bis zu ungefähr
20–30
Mikrometern groß enthält, beträgt vorzugsweise
die Tiefe an der T-Verbindung 50 Mikrometer.
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Für eine gegebene
Strömungsgeschwindigkeit
kann der laminare Strömungskanal
lang genug gemacht werden, um den Indikator-Referenz- und Probenströmungen zu
ermöglichen,
ein Gleichgewicht in Bezug auf die Analyt-Partikel innerhalb des
Kanals zu erreichen. Ein Gleichgewicht tritt dann auf, wenn die
maximale Menge von kleineren Partikel in die Indikatorströmung hinein
von der Probenströmung,
der Kalibrierungsströmung
und/oder der Referenzströmung
aus diffundiert sind. Alternativ kann, für eine gegebene Länge eines
Strömungskanals,
die Strömungsgeschwindigkeit
verringert werden, um Zeit zu erhalten, damit ein Gleichgewicht
erreicht wird. Minimale und maximale Strömungsgeschwindigkeiten können durch
ein Programm- Experiment
durch Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet bestimmt werden.
Zum Beispiel muss die Einstellrate von Zellen berücksichtigt
werden, wenn die minimale Strömungsgeschwindigkeit
für biologische
Fluide, die Zellen, z. B. das gesamte Blut, enthalten, bestimmt
wird. Zusätzlich
müssen
Scherraten berücksichtigt
werden, da sie die Geschwindigkeit sind, unter denen sich Zellen
langsam genug bewegen, dass deren Wechselwirkung mit den Kanalwänden größer als
die Kraft werden kann, die das Fluid auf die Zellen aufbringt, um
sie fließend
entlang des Strömungskanals
zu halten. Weiterhin ist, in Fällen,
bei denen zwei oder mehr Fluide mit unterschiedlichen Viskositäten und
Geschwindigkeiten in einer angrenzenden, laminaren Strömung vorliegen,
ein Lysing von Zellen eine Möglichkeit,
die von einer abrupten Änderung
in Strömungsgeschwindigkeiten
(Geschwindigkeiten) resultiert. Es kann bevorzugt sein, abrupte Änderungen
in den Strömungsgeschwindigkeiten
in einer angrenzenden, laminaren Strömung von Fluiden zu vermeiden,
zum Beispiel in Fällen,
bei denen die Strömungsrate
so hoch ist, dass Scherkräfte
groß genug
sind, um Analyte oder andere Partikel zu beeinflussen oder zu beschädigen, z.
B. ein Lysing von Zellen, in der Probe, was zu einer Interferenz
mit Messungen führen
würde.
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Die
Vorrichtung einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung
(siehe 1) weist Kanalnuten in der Form eines „✝" oder „ψ" auf, mit einem zentralen
Strang und drei Verzweigungen, die in die Oberfläche eines Silizium-Mikrochips
hineingeätzt
sind, wobei die Oberfläche
danach mit einer Glasplatte abgedeckt wird. Die zentrale Nut bzw.
Vertiefung ist aus dem Strang des „✝" oder „ψ" gebildet, und die
Verzweigungen sind die Einlass-Einrichtungen in einer Fluidverbindung
mit dem laminaren Strömungskanal
für ein
jeweiliges Leiten der Proben-, Referenz- und Indikatorströmungen in
den laminaren Strömungskanal
hinein.
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Vorrichtungen
dieser Erfindung können
auch mehr als drei Einlass-Verzweigungen
in einer Fluidverbindung mit dem laminaren Strömungskanal zum Leiten einer
Mehrzahl von Einlassströmungen
in den Kanal hinein umfassen. Diese können in einer Anordnung ähnlich eines „Leuchters" angeordnet sein
oder können aufeinander
folgend entlang eines „Querbalkens" für die „✝" oder die Verzweigungen
der „ψ" Konfiguration angeordnet
sein, wobei die einzige Einschränkung
diejenige ist, dass die laminare Strömung aller Strömungen bewahrt
werden muss.
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Einlass-Einrichtungen
umfassen die Einlasskanäle
oder „Verzweigungen" und können auch
andere Einrichtungen, wie beispielsweise Rohre, Spritzen, und dergleichen,
umfassen, die Einrichtungen bilden, um Fluide in die Vorrichtung
einzuspritzen. Auslass-Einrichtungen umfassen Sammel-Öffnungen
und/oder Einrichtungen zum Entfernen von Fluid von dem Auslass,
einschließlich
Aufnahmen für
das Fluid, Einrichtungen, um eine Strömung durch eine kapillare Wirkung,
Druck, Schwerkraft, eine positive Verschiebung (z. B. Pumpen durch
eine Spritzenpumpe), ein elektroosmotisches (elektrokinetisches)
Pumpen, und können
andere Einrichtungen, die im Stand der Technik bekannt sind, umfassen.
Solche Aufnahmen können
Teil einer analytischen oder Erfassungs-Vorrichtung sein.
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Vorrichtungen
dieser Erfindung können
externe Erfassungs-Einrichtungen zum Messen einer erfassbaren Eigenschaft
oder einer Änderung
in einer erfassbaren Eigenschaft aufweisen. Eine Erfassung und Analyse
werden mittels Einrichtungen, die im Stand der Technik bekannt sind,
vorgenommen, einschließlich
optischer Einrichtungen, wie beispielsweise optische Spektroskopie.
Andere Einrichtungen, wie beispielsweise Absorptions-Spektroskopie,
insbesondere sichtbar, allerdings auch ultraviolett und infrarot;
Fluoreszenz; durch chemische Indikatoren, die eine Farbe oder andere
Eigenschaften ändern,
wenn sie dem Analyt ausgesetzt sind; Chemie-Lumineszenz, die durch Fachleute dahingehend
bekannt ist, auf eine Lumineszenz aufgrund einer chemischen Reaktion
Bezug zu nehmen – das
gesamte Licht, das gemessen ist, ist dasjenige, das emittiert ist,
wobei kein Licht in das System eingeführt wird, und Beispiele und
Chemie lumineszente Reagenzien umfassen „Luzigenin", das eine Lumineszenz bei einem bestimmten
(hohen) pH emittiert, Luminol und Luziferine. Andere Erfassungs-Einrichtungen
umfassen immunologische Mittel; elektrische Mittel, z. B. Elektroden,
eingesetzt in die Vorrichtung; elektrochemische Einrichtungen; radioaktive
Einrichtungen; oder virtuell irgendeine mikroanalytische Technik,
die im Stand der Technik bekannt ist, einschließlich magnetischer Resonanztechniken; oder
andere Einrichtungen, die im Stand der Technik bekannt sind, um
das Vorhandensein eines Analyts, wie beispielsweise eines Ions,
eines Moleküls,
eines Polymers, eines Virus, einer DNA-Folge, eines Antigens, eines
Mikroorganismus, oder anderer Faktoren, zu erfassen. Vorzugsweise
werden optische oder fluoreszente Einrichtungen verwendet, und Antikörper, DNA-Folgen,
und dergleichen, werden an fluoreszente Markierer an gehängt. Änderungen
in einer Indikator-Substanz, getragen innerhalb der Indikatorströmung, als
eine Folge eines Kontakts mit Analyt-Partikel, werden erfasst, ebenso
wie Hintergrund (Basislinien) Messungen, z. B. ein Hintergrund-Absorptionsvermögen der
Indikatorströmung
oder der Probenströmung.
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Vorzugsweise
ermöglicht
die Erfassungs-Einrichtung eine räumliche Auflösung, d.
h. ermöglicht
ein Lokalisieren der Position, an der eine erfassbare Eigenschaft
gemessen ist. Man kann die gesamte Tiefe (Diffusionsrichtung) des
Strömungskanals überwachen,
um die Positionen jedes Analyt-Erfassungsbereichs zu identifizieren.
Zum Beispiel liefert ein Detektor mit einem linearen Diodenfeld
eine optische Intensität
(erfassbare Eigenschaft) als eine Funktion einer Position in der
Diffusionsrichtung (Kanaltiefe). Alternativ ermöglicht eine Kamera in Form
einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (Charge Coupled Device – CCD) dem
Benutzer, einen Vergrößerungsbereich
auszuwählen,
so dass die gesamte Tiefe (Diffusionsrichtung) des Strömungskanals,
einschließlich
der Kanten, überwacht
werden kann.
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Die
Erfassungseinrichtung kann stationär sein, während die Vorrichtung dieser
Erfindung (den Strömungskanal
aufweisend) mobil ist, und Messungen werden vorgenommen, wenn die
Vorrichtung bewegt wird, vorzugsweise automatisch, und zwar in Bezug
auf die Erfassungseinrichtung. Alternativ ist die Erfassungseinrichtung
mobil, die Vorrichtung ist stationär und die Messungen werden
vorgenommen, wenn sich die Erfassungseinrichtung in Bezug auf die
Vorrichtung bewegt.
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Wie
vorstehend diskutiert ist, umfassen die Verfahren dieser Erfindung
ein Führen
einer Probe und von Referenzströmungen
in einem laminaren Fluss in einem Strömungskanal mit einer Indikatorströmung und
Erfassen des Vorhandenseins und/oder der Konzentration des Analyts
und der Referenz-Partikel in der Indikatorströmung. Die Verfahren können auch
umfassen:
Messen einer erfassbaren Eigenschaft in einem Proben-Analyt-Erfassungsbereich,
um dadurch einen Probenwert zu erhalten;
Messen der erfassbaren
Eigenschaft in einem Referenz-Analyt-Erfassungsbereich, um dadurch einen
Referenzwert zu erhalten;
wenn die Referenzströmung eine
interne Standardströmung
ist, Korrigieren der experimentellen Bedingungen durch Bestimmen
des Verhältnisses
zwischen dem Probenwert und dem Referenzwert, und wenn die Referenzströmung eine
Kontrollströmung
ist, Bestimmen der Konstanz des Referenz-Partikel-Werts über die
Zeit.
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Das
Verfahren kann alternativ, oder zusätzlich, irgendeinen der folgenden
Schritte umfassen:
wenn die Referenzströmung eine interne Standardströmung ist,
Messen einer erfassbaren Eigenschaft in der internen Standardströmung, um
dadurch einen internen Standard-Hintergrund-Wert zu erhalten;
wenn
die Referenzströmung
eine Kontrollströmung
ist, Messen einer erfassbaren Eigenschaft in der Kontrollströmung, um
dadurch einen Kontroll-Hintergrund-Wert zu erhalten;
Messen
einer erfassbaren Eigenschaft in der Probenströmung, um dadurch einen Proben-Hintergrund-Wert zu
erhalten;
Messen einer erfassbaren Eigenschaft in der Indikatorströmung in
einem Bereich der Indikatorströmung,
wo im Wesentlichen keine Analyt-Partikel dort hinein diffundiert
sind, um dadurch einen Indikator-Hintergrund-Wert zu erhalten;
Korrigieren
der experimentellen Bedingungen (Verbesserung der Genauigkeit des
gemessenen Werts der Probe eines Analyts) unter Durchführen von
mathematischen Operationen, die unter den folgenden ausgewählt sind:
- i) Subtrahieren des Proben-Hintergrund-Werts
von dem Probenwert, und dann Dividieren dieses Werts durch den Referenzwert
minus dem Referenz-Hintergrund-Wert;
- ii) Teilen des Quotienten von Schritt i) durch den Indikator-Hintergrund-Wert; oder
- iii) Subtrahieren des Indikator-Hintergrund-Werts von dem Probenwert,
und dann Teilen dieses Werts durch den Referenzwert minus des Indikator-Hintergrund-Werts.
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Wie
leicht durch Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet ersichtlich
werden wird, sind Variationen in Bezug auf die mathematischen Operationen,
durchgeführt
in Bezug auf die Werte, bestimmt durch Vorrichtungen und Verfahren
dieser Erfindung, möglich
und fallen innerhalb des Schutzumfangs und des Gedankens dieser
Erfindung.
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Die
Strömungsgeschwindigkeit
der Eingangsströmungen
(Strömungen,
eingeführt
in die Vorrichtung) liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 0,05
und ungefähr
50 mm/sec. Ohne den Wunsch, an irgendeine bestimmte Theorie gebunden
zu sein, wird angenommen, dass es in einigen Fällen bevorzugt für die Proben- und
Indikatorströmungen
ist, unter unterschiedlichen Raten zu strömen. Zum Beispiel ist, in Fällen einer
geringen Testempfindlichkeit, wo die Probe eine sehr niedrige Konzentration
eines Analyts enthält
und/oder die erfassbare Eigenschaft selbst klein ist, z. B. ein
niedriges Fluoreszenz-Quantenfeld, falls die Indikatorströmung langsamer
als die Probenströmung
fließt,
dann die Indikator-Substanz in der Indikatorströmung effektiv durch eine größere Anzahl
von Analyt-Partikel für
eine längere
Zeitperiode umgeben, d. h. jedes Indikator-Substanz-Molekül „sieht" mehr Analyt-Partikel,
da sich die letzteren langsamer hinter die ersteren bewegen. So
ist es, in diesen Fällen,
bevorzugt, Proben- und Referenzströmungen, die durch denselben
Motor gepumpt sind, und die Indikatorströmung, die durch einen unterschiedlichen
Motor gepumpt ist, zu haben.
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Die
Verfahren und Vorrichtungen dieser Erfindung ermöglichen eine Bestimmung der
Viskosität
einer Probenströmung
durch Erfassen der Position innerhalb des laminaren Strömungskanals
von Analyt-Partikel von der Probenströmung, die in die Indikatorströmung hinein
diffundieren, was eine erfassbare Änderung in der Indikatorströmung oder
in einer Indikator-Substanz in der Indikatorströmung verursacht. Wie durch
Fachleute verständlich
werden wird, kann die Viskosität
von Fluiden geändert
werden, z. B. durch Hinzugabe von Polymeren mit hohem Molekulargewicht,
wie beispielsweise Dextran mit hohem Molekulargewicht. Ein Ändern der
Viskosität
von Fluiden ändert
die Geschwindigkeit, unter der sie unter einem gegebenen Druck fließen.
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Das
Verfahren einer Ausführungsform
dieser Erfindung umfasst die Verwendung einer Indikator-Substanz,
die auf einem teilchenförmigen
Substrat immobilisiert ist, getragen innerhalb der Indikatorströmung, wie dies
vorstehend beschrieben ist. Die Partikel-Substanz ist groß genug,
dass deren Diffusion aus der Indikatorströmung hinaus vernachlässigbar
ist, d. h. sie verursacht keine erfassbare Änderung in der Eigenschaft,
die gemessen wird. Die Indikator-Substanz ist vorzugsweise eine
Substanz, die sich in der Fluoreszenz oder der Farbe beim Vorhandensein
von Analyt-Partikel,
wie beispielsweise einem Farbstoff, Enzymen und anderen organischen
Molekülen,
die Eigenschaften als eine Funktion einer Analyt-Konzentration ändern, än dert. Der Ausdruck „Indikator-Substanz" wird auch dazu verwendet,
auf polymere Kügelchen,
Antikörper,
oder dergleichen, Bezug zu nehmen, die Farbstoffe oder andere Indikatoren,
die darauf immobilisiert sind, haben. Es ist nicht notwendig, dass
die Indikatorströmung
eine Indikator-Substanz aufweist, wenn Erfassungseinrichtungen, wie
solche, die direkt elektrische, chemische oder andere Änderungen
in der Indikatorströmung,
verursacht durch die Analyt-Partikel, aufweisen, verwendet werden.
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Vorteile
dieses Systems umfassen die Tatsache, dass Analyte in getrübten und
stark gefärbten
Lösungen,
wie beispielsweise Blut, optisch ohne das Erfordernis nach einem
vorherigen Filtern oder einer Zentrifugation bestimmt werden können. Querempfindlichkeiten
von Indikator-Farbstoffen zu größeren Proben-Komponenten
(dies war ein übliches
Problem) können
vermieden werden, da die größeren Partikel
nicht in die Indikatorströmung
in der Zeit hinein diffundieren, während die Strömungen in
Kontakt stehen, und demzufolge beeinflussen sie nicht eine Erfassung
des Analyts. Alternativ können
solche Querempfindlichkeiten durch Referenzströmungen (interne Standards)
berücksichtigt
werden. Ein anderer Vorteil der Vorrichtung und des Verfahrens dieser
Erfindung ist derjenige, dass, aufgrund der geringen Tiefen (Diffusionsrichtung)
der Strömungskanäle, die
Analyt-Partikel sehr kurze Wege durchlaufen, bevor eine Messung
vorgenommen werden kann, um dadurch zu ermöglichen, dass Messungen in
einer kurzen Zeit vorgenommen werden können.
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Der
Indikator kann in einer Lösung
gehalten werden, in der er seine optimalen Charakteristika anzeigt (z.
B. Querempfindlichkeiten zu einem pH oder ionische Stärke können unter
Verwendung von stark gepufferten Lösungen unterdrückt werden).
Zusätzlich
kann der Strömungskanal
tief sein, was es einfach macht, die Indikator-Fluoreszenz mit einfachen Optiken zu
messen. Keine Membran(e), die Probe- und Indikator- und Referenzströmungen separieren,
werden benötigt;
das System ist weniger anfälliger
auf ein Biofaulen und Verstopfen als Membran-Systeme. Das System
ist auch dahingehend abstimmbar, dass Proben- Referenz- oder Indikatorströmung-Konzentrationen und/oder
Flussraten variiert werden können,
um das Signal, das erfasst werden soll, zu optimieren. Zum Beispiel
kann, falls eine Reaktion zwischen einem Analyt in einer Probe oder einer
Referenzströmung
und einem Reagenz in einer Indikatorströmung eine erfassbare Eigenschaft
nach ungefähr
fünf Sekunden
ergibt, das System so eingestellt werden, dass das Reaktions-Produkt
in dem zentralen Bereich der Vorrichtung erfasst werden wird.
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Das
Verfahren kann durch ein kontinuierliches Durchfließen lassen
einer Proben-, Referenz- und Indikatorströmung durchgeführt werden.
Die bereitschaftsmäßige Art
dieses Verfahrens macht längere
Signal-Integrationszeiten möglich.
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Vorrichtungen
dieser Erfindung können
durch Mikro-Herstellverfahren, die im Stand der Technik bekannt
sind, hergestellt werden, z. B. so, wie dies hier beispielhaft hier
angegeben ist, ein Verfahren, das ein Bilden von Kanälen in einem
Silizium-Mikrochip,
wie beispielsweise durch Ätzen
von Nuten in die Oberfläche des
Silizium-Mikrochips
hinein und Platzieren einer optisch transparenten Abdeckung, z.
B. Glas, über
der Oberfläche,
aufweist (Brody, J. P., und Yager, P. „Low Reynolds Number Micro-Fluidic
Devices" Solid State Sensor
and Actuator Workshop, Hilton Head, SC Juni 2–6, 1996). Präzisionsspritzgegossene
Kunststoffe können
auch zur Herstellung verwendet werden. Ein Deckel, vorzugsweise
aus einem optisch klaren Material, wie beispielsweise eine Glas-
oder Silicon-Gummiplatte, wird auf dem geätzten Substrat abgedichtet.
Andere Einrichtungen zum Herstellen der Vorrichtungen dieser Erfindung
umfassen die Verwendung von Silizium-Strukturen oder anderen Materialien
als eine Maske bzw. Schablone zum Formen oder Mikrobearbeiten der
Vorrichtung in Kunststoff, und andere Techniken, die im Stand der
Technik bekannt sind. Präzisionsspritzgegossene Kunststoffe,
um die Vorrichtungen zu bilden, können auch verwendet werden.
Mikro-Herstelltechniken sind im Stand der Technik bekannt, und werden
insbesondere nachfolgend beschrieben.
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Die
Vorrichtungen dieser Erfindung sind vorzugsweise mikro-hergestellte
Vorrichtungen. Der Ausdruck „mikro-hergestellt" bezieht sich auf
Vorrichtungen, die dazu geeignet sind, auf Silizium-Wafer, die leicht von
Fachleuten, die die Mikrofertigung von Silizium praktizieren, erhältlich sind,
hergestellt zu werden, und haben die Merkmale, die Größen und
die Geometrien, die sich durch solche Verfahren, wie beispielsweise
LIGA, thermoplastisches Mikromuster-Transfer, auf Harz basierendes
Mikrogießen,
Mikroformen in Kapillaren (MIMIC), nass-isotropes und anisotropes Ätzen, Laser
unterstütztes,
chemisches Ätzen
(LACE) und reaktives Ionenätzen
(RIE), oder andere Techniken, die innerhalb des Stands der Technik
der Mikroherstellung bekannt sind, ergeben. In dem Fall einer Silizium-Mikroherstellung,
werden größere Wafer
eine Mehrzahl von Vorrichtungen dieser Erfindung in einer Mehrzahl
von Konfigurationen aufnehmen. Ein paar Standard-Wafer-Größen sind
76,2 mm, 101,6 mm, 152,4 mm und 203,2 mm (3'',
4'', 6'' und 8'').
Die Anwendung der Prinzipien, die hier angegeben sind, unter Verwendung
von neuen und entstehenden Mikroherstellverfahren, liegen innerhalb
des Schutzumfangs und des Gedankens der Ansprüche.
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Die
Vorrichtungen dieser Erfindung und die Kanäle hier können so dimensioniert werden,
wie sich dies durch die Größe der Partikel,
in Bezug auf die es erwünscht
ist, dass sie erfasst werden, ergibt. Wie im Stand der Technik bekannt
ist, ist der Diffusionskoeffizient für die Analyt-Partikel umgekehrt
zu der Größe des Partikels
in Bezug gesetzt und ist demzufolge im Wesentlichen linear zu der
Größe des Partikels
in Bezug gesetzt. Wenn einmal der Diffusionskoeffizient für die Partikel,
in Bezug auf die es erwünscht
ist, dass sie erfasst werden sollen, bekannt ist, können die
Kontaktzeit der zwei Strömungen,
die Größe des zentralen
Strömungskanals,
die relativen Volumina der Strömungen,
Druck und Geschwindigkeiten der Strömungen eingestellt werden,
um das erwünschte
Diffusions-Muster zu erreichen.
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Ein
fluid-dynamisches Verhalten ist zu der Reynold'schen Zahl der Strömung direkt in Bezug gesetzt. Bei
Mikrohergestellten Vorrichtungen variiert, falls die Geschwindigkeit
mit der Kanallänge
abnimmt (wobei die Vorrichtung dahingehend angenommen wird, dass
sie in einer festgelegten Zeit unter allen Maßstäben arbeitet), dann die Reynold'sche Zahl im Verhältnis zu
dem Quadrat der Länge.
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Die
Reynold'sche Zahl
ist das Verhältnis
der Trägheitskräfte zu viskosen
Kräften.
Wenn die Reynold'sche
Zahl verringert wird, hängen
die Strömungs-Muster
mehr von viskosen Effekten und weniger von Trägheitseftekten ab. Unterhalb
einer bestimmten Reynold'schen
Zahl, z. B. ungefähr
1 (basierend auf einer Lumen-Größe eines
Systems von Kanälen
mit Biegungen und Lumen-Größen-Änderungen),
können
Trägheitseffekte
im Wesentlichen ignoriert werden. Die mikrogefertigten Vorrichtungen
dieser Erfindung erfordern keine Trägheitseffekte, um deren Aufgaben
durchzuführen,
und besitzen deshalb keine ihnen eigene Grenze in Bezug auf deren
Miniaturisierung aufgrund der Effekte der Reynold'schen Zahl. Vorrichtungs-Designgestaltungen
des Anmelders arbeiten, während
sie sich wesentlich von früher
angegebenen Designgestaltungen unterscheiden, in diesem Bereich.
Diese Mikrohergestellten Vorrichtungen dieser Erfindung erfordern
eine laminare, nicht turbulente Strömung und sind entspre chend
den vorstehenden Prinzipien ausgelegt, um Strömungen zu erzeugen, die niedrige,
Reynold'sche Zahlen
haben.
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Die
Vorrichtungen der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung
sind dazu geeignet, eine Probe mit einer Größe zwischen ungefähr 0,01
Mikrolitern und ungefähr
20 Mikrolitern innerhalb von ein paar Sekunden, z. B. innerhalb
ungefähr
drei Sekunden, zu analysieren. Sie können auch wieder verwendet
werden. Ein Verstopfen wird minimiert und ist reversibel. Ein Kanal
mit den Dimensionen von 400 μm
(Tiefe) mal 50 μm (Breite),
mit Fluiden, die unter einer Geschwindigkeit von 100 nL/s, zum Beispiel,
fließen,
zeigen eine Reynold'sche
Zahl (Re = plv/η) von 0,2, so dass das Fluid
in einem Bereich vorliegt, wo eine Viskosität gegenüber einer Trägheitskraft
dominiert.
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Durch
Einstellen der Konfiguration der Kanäle entsprechend den Prinzipien,
die vorstehend diskutiert sind, um eine geeignete Kanallänge, Strömungsgeschwindigkeit
und Kontaktzeit zwischen den Proben-Referenz- und/oder Kalibrierungsströmungen und
den Indikatorströmungen
zu erreichen, kann die Größe der Partikel,
die in der Probenströmung
verbleiben und in die Indikatorströmung hinein diffundieren, kontrolliert
werden. Die Kontaktzeit, die erforderlich ist, kann als eine Funktion
des Diffusionskoeffizienten des Partikels D und des Abstands d, über den
das Partikel mit 2t = d2/D diffundieren
muss, berechnet werden. Partikel oder Moleküle, die Diffusionskoeffizienten
größer als
D haben, werden in die Indikatorströmung hinein diffundieren, und Partikel
oder Moleküle,
die einen Diffusionskoeffizienten im Wesentlichen kleiner als D
haben, werden dies nicht tun. Falls der Diffusionskoeffizient der
größeren Partikel
ungefähr
zehnmal kleiner als D ist, sollte die Indikatorströmung vollständig frei
von den großen
Partikel sein.
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In
einigen Ausführungsformen
dieser Erfindung besitzen Kanäle
dieser Erfindung hydrophile Oberflächen, um eine Strömung von
Flüssigkeit
darin zu erleichtern und einen Betrieb der Vorrichtung um die Notwendigkeit
einer unter Drucksetzung zu ermöglichen.
Das Substrat kann so behandelt sein, um Oberflächenbenetzungseigenschaften
durch Mittel, die im Stand der Technik bekannt sind, der Herstellung
der Kanäle
folgend, zu erhöhen,
um sie hydrophil zu gestalten. Der Deckel kann auch so behandelt
werden, um ihn hydrophil zu gestalten.
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Einrichtungen,
um Druck auf die Strömung
der fluiden Strömungen über die
Vorrichtung aufzubringen, können
an den Einlassöffnungen
und/oder dem Auslass (z. B. als Vakuum, ausgeübt durch chemische oder mechanische
Mittel) vorgesehen sein. Einrichtungen, um einen solchen Druck aufzubringen,
sind im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel so, wie dies in
Shoji, S., und Esashi, M. (1994), „Microflow devices and Systems", J. Micromechanics
and Microengineering, 4: 157–171,
beschrieben sind, und umfassen die Verwendung einer Wassersäule oder
anderer Mittel eines Aufbringens von Wasserdruck, elektroendoosmotischen Kräften, optischen
Kräften,
Gravitationskräften
und Oberflächenspannungskräften. Drücke von
ungefähr
0,07 N/m2 (10–6 psi)
bis ungefähr
70.000 N/m2 (10 psi) können verwendet werden, und
zwar in Abhängigkeit
von den Erfordernissen des Systems. Vorzugsweise wird ungefähr 7 N/m2 (10–3 psi) verwendet. Die
bevorzugtesten Drücke
liegen zwischen ungefähr
20 N/m2 und ungefähr 1.000 N/m2 (ungefähr 2 mm
und ungefähr
100 mm eines Wasserdrucks).
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Die
Größe des Druckabfalls,
die benötigt
wird, um eine durchschnittliche Geschwindigkeit, v, eines Fluids
mit einer absoluten Viskosität,
n, und einer Dichte, p, durch einen kreisförmigen Kanal (Länge, l,
Durchmesser, d) zu erhalten, kann aus dem Poiseuille'schen Gesetz (Batchelor,
G. K., An Introduction to Fluid Dynamics, Cambridge Univ. Press
1967) berechnet werden:
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Unter
Verwendung von v = 100 μm/sec
und d = 100 μm
erhält
man einen Druckabfall äquivalent
zu ungefähr
3 N/m2 (0,3 mm an H2O)
pro cm einer Kanallänge.
Die Poiseuille'sche
Gleichung ist nur streng für kreisförmige Strömungskanäle gültig. Die
Kanäle
dieser Erfindung können
Querschnitte von verschiedenen Formen haben, z. B. keilförmig und
im Wesentlichen rechteckig, zusätzlich
zu kreisförmig.
Demzufolge kann, in Ausführungsformen
ohne nicht kreisförmige
Querschnitte, die Poiseuille'sche
Gleichung nur als eine ungefähre
Beziehung zwischen den Variablen, die dargestellt sind, angesehen
werden.
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Wenn
eine Flüssigkeit
in eine Vorrichtung eingeführt
wird, ist dort zuerst ein effektiver Druck, Peff =
P0 + Pst, gleich
zu der Summe des angelegten Drucks, P0,
und einem Druck aufgrund der Oberflächenspannung, vorhanden:
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Pst ist eine Funktion der Oberflächenspannung
des Fluids, γ,
des Kontaktwinkels des Fluids mit der Oberfläche, Θ, und des Krümmungsradius
der Fluid-Oberfläche, r.
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Für hydrophile
Oberflächen
ist cos Θ nahezu
1, und für
kleine Kanäle
wird kein angelegter Druck benötigt,
um die Vorrichtung zu benetzen. Dies wird als „Benetzung durch kapillare
Wirkung" bezeichnet.
Allerdings muss man, wenn die Vorrichtung einmal vollständig benetzt
ist, die Oberflächenspannung
an dem Austrittsbereich betrachten. In der Vorrichtung, die in dem
Beispiel hier beschrieben ist, war der Krümmungsradius des Fluids in
dem Ausgangsbereich mehrere Millimeter, so dass der Druck aufgrund
der Oberflächenspannung vernachlässigbar
war.
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Mit
einer Kanaltiefe von 100 μm
ist Pst ungefähr 1 cm an H2O,
so dass eine Oberflächenspannung
an der Ausgangs-Öffnung
wesentlich ist. Allerdings bedeutet, unter Verwendung eines Ätzmittels,
wie beispielsweise EPW F-Etch, wie dies nachfolgend beschrieben
ist, das {100} Ebenen von Silizium angreift, dies, dass die Ecken,
wenn sie geätzt
sind, nicht so schart sind, wie dies in den Figuren dargestellt
ist. Dies führt
zu einer graduellen Erweiterung des Kanals auf ungefähr 1 mm,
was den Effekt der Oberflächenspannung
verringert.
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Wie
in 1 dargestellt ist, ist eine Vorrichtung dieser
Erfindung in der Form eines „✝" vorgesehen, bezeichnet
hier als ein Referenz-T-Sensor 10. Die Vorrichtung kann
zum Beispiel durch Ätzen
auf einem Silizium-Mikrochip oder durch Mikrobearbeitung von Kunststoff
mikro-hergestellt werden. Die Geometrie muss nicht notwendigerweise
ein „✝" oder ein „ψ" sein. Irgendwelche
Winkel zwischen den Kanälen,
die hergestellt werden können,
werden auch ausreichen, so lange wie eine laminare Strömung beibehalten
wird. Wie vorstehend diskutiert ist, kann eine Vielzahl von Eingangs-Kanälen vorhanden
sein. In dieser Ausführungsform
ist es nur notwendig, dass sich alle Eingangs-Kanäle in einen
einzelnen Strömungskanal
vereinigen, und alle Kanäle ausreichend
klein sind, dass eine laminare Strömung (Reynold'sche Zahl geringer
als ungefähr
1) für
alle Betriebszustände
beibehalten wird. Die Probe, die kleine Partikel, die von Interesse
sind, die Probenströmung 80, enthält, wird
in die Vorrichtung über
die Probenströmung-Einlassöffnung 30 eingebracht,
von wo aus sie in den Probenströmung-Einlasskanal 50 hineinfließt. Eine
Indikatorströmung 70 wird
in eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 gebracht,
von wo aus sie in den Indikatorströmung-Einlasskanal 40 fließt. Eine
Referenzströmung 75 wird
in einen Referenzströmung-Einlassöffnung 25 hineingebracht.
Eine Erfassungseinrichtung 150 ist relativ zu dem Strömungskanal,
z. B. oberhalb oder unterhalb des Kanals, positioniert, so dass
sie eine erfassbare Eigenschaft, z. B. Fluoreszenz oder Absorptionsvermögen, erfassen
kann.
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Probenströmung 80,
Referenzströmung 75 und
Indikatorströmung 70 treffen
sich an einem Verbindungspunkt 58 an dem Beginn des Strömungskanals 100,
und die drei Strömungen
fließen
in eine parallele, angrenzende, laminare Strömung zu der Auslassöffnung 60 an
dem Ende des Strömungskanals 100.
Die Indikatorströmung 70 enthält eine
Indikator-Substanz, wie beispielsweise einen Farbstoff, der mit
Analyt-Partikel in
der Probenströmung 80 und
der Referenzströmung 75 reagiert,
was eine erfassbare Änderung
in den physikalischen Eigenschaften hervorruft. Die Indikatorströmung 70 ist
durch eine horizontale Schraffierung dargestellt, wogegen die Probenströmung 80 und
die Referenzströmung 75 durch
eine diagonale Schraffierung in entgegengesetzten Richtungen in 1 dargestellt
sind. Aufgrund der niedrigen Reynold'schen Zahl in dem kleinen Strömungskanal 100 tritt
keine durch eine Turbulenz induzierte Mischung auf und die drei
Strömungen fließen parallel
zueinander ohne Mischen. Allerdings wirkt eine Diffusion senkrecht
zu der Strömungs-Richtung,
das bedeutet senkrecht zu der Länge
(y-Koordinate), so dass Analyt-Partikel in der Probenströmung und in
der Referenzströmung
nach rechts und links, jeweils, in die Indikatorströmung 70 diffundieren,
und können schließlich gleichförmig über die
Breite des Strömungskanals 100 an
einem gleichförmigen
Analyt-Partikel-Diffusionsbereich 120 verteilt werden.
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Die
Indikatorströmung 70 fließt in den
Strömungskanal 100 hinein,
um einen Anfangs-Referenzbereich 85 zu bilden, in den hinein
Analyt-Partikel bis jetzt noch nicht diffundiert sind. Analyt-Partikel
von der Probenströmung 80,
die in die Indikatorströmung 70 hinein
diffundieren, bilden einen Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140,
wo Analyt-Partikel eine erfassbare Änderung in der Indikatorströmung 70 erzeugen,
vorzugsweise durch Verursachen einer erfassbaren Änderung
in der Eigenschaft in einer Indikator-Substanz innerhalb der Indikatorströmung 70.
Analyt-Partikel von der Referenzströmung 75, die in die
Indikatorströmung 70 hinein
diffundieren, bilden einen Referenz-Analyt-Erfassungsbereich 145,
wo Analyt-Partikel eine erfassbare Änderung in der Indikatorströmung 70 erzeugen.
Partikel einer Indikator-Substanz, z. B. Farbstoff-Partikel, können auch in
die Probenströmung 80 hinein
diffundieren, um einen diffundierten Indikator-Bereich 110 (nicht
dargestellt) zu bilden. Falls diese Änderung in einer lokalen Konzentration
der Indikator-Substanz ein Problem in einigen Anwendungen ist, kann
die Diffusionsrate wahlweise klein durch Immobilisieren auf teilchenförmigen Substanzen,
z. B. Polymeren und Reporter-Kügelchen,
gemacht werden. Polymere, wie beispielsweise Dextran mit hohem Molekulargewicht,
können
verwendet werden, um Indikator-Substanzen zu immobilisieren, um
dadurch den Diffusionskoeffizienten der Indikator-Substanz zu verringern.
Das Molekulargewicht des Polymers beträgt vorzugsweise ungefähr 1.000
bis ungefähr
100.000 g/mol. Eine Immobilisierung einer Indikator-Substanz auf einem
Polymer, wie beispielsweise auf einem Dextran mit hohem Molekulargewicht,
erhöht
auch die Viskosität der
Indikatorströmung.
Polymere mit hohem Molekulargewicht haften wesentlich unwahrscheinlicher
an den Kanalenden als die Kügelchen
an, die auch dazu verwendet werden, um Indikator-Substanzen zu immobilisieren.
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In
dem Referenz-T-Sensor 10 der 1 werden
eine Probenströmung 80,
z. B. Blut, eine Referenzströmung 75 und
eine Indikatorströmung 70,
einen Indikator-Farbstoff
enthaltend, an dem Knotenpunkt des Probenströmung-Einlasskanals 50,
dem Referenzströmung-Einlasskanals 55 und
dem Indikatorströmung-Einlasskanals 40 vereinigt,
wobei der Strömungskanal 100 (d.
h. der Verbindungspunkt 58) und die Strömung laminar am nächsten zueinander
in dem Strömungskanal 100 fließen, bis
sie die Struktur an der Auslassöffnung 60 verlassen.
Kleine Ionen, wie beispielsweise H+ und
Na+, diffundieren schnell über den
Durchmesser des Strömungskanals 100,
wogegen größere Ionen,
wie beispielsweise ein Farbstoff-Anion, nur langsam diffundieren.
Größere Partikel,
wie beispielsweise Zucker, Proteine, und dergleichen, zeigen keine
wesentliche Diffusion innerhalb der Zeit, zu der die Indikatorströmung 70,
die Referenzströmung 75 und
die Probenströmung 80 in
Kontakt zueinander stehen. Die kleineren Proben-Komponenten diffundieren
schneller und würden
näher zu dem
Verbindungspunkt 58, als dies größere Komponenten tun, ins Gleichgewicht
treten, was weiterhin in Strömungskanälen 100 in
Ausführungsformen
mit Strömungskanälen lang genug,
oder Strömungsraten,
langsam genug, um deren Ausgleich zu ermöglichen, ins Gleichgewicht
versetzen würden.
Wenn die Diffusion bis zu dem Kanal fortschreitet, werden ein Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 und
ein Referenz-Analyt-Erfassungsbereich 145 gebildet.
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Die
Analyt-Erfassungsbereiche 140 und 145 können so
groß wie
notwendig sein, um ein erfassbares Indikator-Signal zu liefern.
Ein ähnlicher
Referenzbereich 85 kann so gestaltet werden, dass er so
groß wie notwendig
sein wird, um einen erfassbaren Referenz-Hintergrund-Wert zu liefern.
Einstellungen dieser Bereiche werden so vorgenommen, wie dies hier
beschrieben ist, basierend auf den Diffusionskoeffizienten des Analyts
und der Indikator-Substanz, den Strömungsraten und den Kanalgrößen.
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Das
Vorhandensein oder die Konzentration eines Analyts, der in einer
Probenströmung
von Interesse ist, kann durch Vergleichen des gemessenen Werts (Probenwert)
der Probenströmung
einer erfassbaren Eigenschaft, z. B. sichtbares Absorptionsvermögen bei
einer bestimmten Wellenlänge,
zu dem gemessenen Wert einer Kalibrierungsströmung, einer Kontrollströmung oder
einer internen Standardströmung
(Referenzwert), bestimmt werden. Durch Überwachen der Referenzströmung gleichzeitig
mit der Abtastströmung
und in demselben Strömungskanal
wie diese, werden die Referenzströmung und die Abtastströmung denselben
experimentellen Bedingungen, einschließlich solchen Bedingungen,
die zu einer verringerten Genauigkeit des gemessenen Werts in der
Probe führen
könnten,
zum Beispiel eine Fluktuation in der Intensität der Lichtquelle, unterworfen.
Sowohl die Probenströmung
als auch die Referenzströmung
werden denselben Bedingungen ausgesetzt; deshalb werden die Effekte
dieser beeinträchtigenden
Bedingungen korrigiert (heraus subtrahiert).
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2 stellt
eine Vorrichtung dieser Erfindung dar, bei der zwei Indikatorströmungen 70A und 70B in einen
Strömungskanal 100 von
einer gemeinsam (geteilten) Einlassöffnung 20 der Indikatorströmung fließen, um
dadurch zu zwei laminaren Strömungen
(derselben) Indikatorströmung 70A und 70B zu
führen,
beide angrenzend zu der Probenströmung 80. Die Indikatorströmungen 70A und 70B und
die Probenströmung 80 sind durch
diagonale und horizontale Schraffierung, jeweils, dargestellt, wogegen
die Referenzströmungen 75A und 75B anhand
von Linien (ähnlich
eines quer liegenden „S") und einer quer
liegenden „8", jeweils, in 2, dargestellt
sind. Die Probenströmung 80 enthält kleine
Moleküle,
die von Interesse sind, und wird in die Vorrichtung über die
Probenströmung-Einlassöffnung 30 gebracht,
von wo aus sie in den Probenströmung-Einlasskanal 50 fließt. Die
Indikatorströmungen 70A und 70B werden
in die Einlassöffnung 20 für die Indikatorströmung gebracht,
von wo aus sie in die Indikatorströmung-Einlasskanäle 40A und 40B fließen. Zwei
Referenzströmungen 75A und 75B werden
in die Einlassöffnungen 25A und 25B der
Referenzströmung,
jeweils, gebracht. Die Referenzströmungen 75A und 75B können von
derselben oder von einer unterschiedlichen Zusammensetzung sein,
z. B. eine kann eine hohe Konzentration des Analyts, der von Interesse
ist, enthalten, und die andere kann eine niedrige Konzentration
des Analyts, der von Interesse ist, enthalten. Ein Detektor (nicht
dargestellt in 2) ist relativ zu dem Strömungskanal
positioniert, z. B. oberhalb oder unterhalb des Kanals, so dass
er eine erfassbare Eigenschaft, z. B. eine Fluoreszenz oder ein
Absorptionsvermögen,
erfassen kann.
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Die
Probenströmung 80,
die Referenzströmungen 75A und 75B und
die Indikatorströmungen 70A und 70B treffen
sich an einem Verbindungspunkt 58 an dem Beginn des Strömungskanals 100,
und die fünf
Strömungen
fließen
in einer parallelen, laminaren Strömung zu einer Auslassöffnung 60.
Analyt-Partikel in der Probenströmung 80 und
Referenzströmungen 75A und 75B diffundieren
in die Indikatorströmungen 70A und 70B hinein.
Analyt-Partikel in der Probenströmung 80 diffundieren
nach links und nach rechts (senkrecht zu der Richtung der Strömung) in
die Indikatorströmungen 70A und 70B hinein,
um Proben-Analyt-Erfassungsbereiche 140A und 140B (dargestellt
in 2 durch „X") zu bilden. Analyt-Partikel
in der Referenzströmung 75A diffundieren
nach rechts (senkrecht zu der Richtung der Strömung) in die Indikatorströmung 70A hinein,
um einen Referenz-Analyt-Erfassungsbereich 145A (dargestellt
in 2 durch Kreise) zu bilden. Analyt-Partikel in
der Referenzströmung 75B diffundieren
nach links (senkrecht zu der Strömungsrichtung)
in die Indikatorströmung 70B hinein,
um einen Referenz-Analyt-Erfassungsbereich 145B (dargestellt
in 2 durch Dreiecke) zu bilden. Durch Einstellen
der Strömungsrate
und der Strömungskanallänge kann
ein Gleichgewicht der Diffusion erreicht werden.
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Die
Vorrichtung in 2 dient für zwei Referenzströmungen so,
dass sie laminar innerhalb der Probenströmung fließen. Zum Beispiel kann eine
Referenzströmung
eine interne Standardströmung
sein, die eine bekannte oder „geschätzte" Kon zentration des
Analyts, der von Interesse ist, enthält. Der gemessene Wert einer
erfassbaren Eigenschaft für
die Probe (Probenwert), oder vorzugsweise eine Mehrzahl von Proben,
wird durch den gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft für einen
internen Standard (interner Standard-Wert) dividiert. Der interne
Standard-Wert wirkt dahingehend, experimentelle Bedingungen zu korrigieren (heraus
zu subtrahieren), die ansonsten die Genauigkeit der gemessenen Werte
herabsetzen würden.
Die andere Referenzströmung
kann eine Kontrollströmung
sein, die auch eine bekannte oder abgeschätzte Konzentration des Analyts,
der von Interesse ist, enthält,
und ist ansonsten identisch zu der Probe. Die Kontrolle dient als
eine (Qualitätskontrolle)
Prüfung
der bestimmten Konzentration des Analyts in der Probe. Sowohl der
gemessene Wert einer erfassbaren Eigenschaft für die Probe (Probenwert) als
auch für
die Kontrolle (Kontroll-Wert) werden durch den gemessenen Wert einer
erfassbaren Eigenschaft für
den internen Standard (interner Standard-Wert) dividiert. Die bestimmte
Konzentration des Analyts in der Probe, erhalten aus dem gemessenen
Wert einer erfassbaren Eigenschaft für die Probe (Probenwert), sollte
mit dem gemessenen Wert einer erfassbaren Eigenschaft für die Kontrolle übereinstimmen,
d. h. sie sollten beide eine minimale und ähnliche Abweichung von der
Kalibrierungs-Kurve haben. Wie für
Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet ersichtlich werden wird,
kann, falls mehr als ein interner Standard verwendet wird, eine
desto kompliziertere, mathematische Operation in Bezug auf die Daten,
erhalten durch die Vorrichtung und das Verfahren dieser Erfindung,
durchgeführt
werden, um die Genauigkeit der bestimmten Konzentration des Analyts
in einer Probe zu verbessern.
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3 stellt
eine andere Ausführungsform
der Vorrichtung dieser Erfindung dar, wobei zwei Indikatorströmungen 70A und 70B in
einer laminaren Strömung
angrenzend an die Probenströmung 80 fließen. Die Indikatorströmungen 70A und 70B sind
durch diagonale Schraffierung dargestellt, wogegen die Referenzströmungen 75A und 75B und
die Probenströmung 80 durch
horizontale Schraffierungen dargestellt sind, ungleichmäßig und
gleichmäßig, jeweils,
beabstandet. Die Probenströmung 80 enthält kleine
Partikel, die von Interesse sind, und wird in die Vorrichtung über die
Probenströmung-Einlassöffnung 30 gebracht,
von wo aus sie in den Probenströmung-Einlasskanal 50 und
dann in den Strömungskanal 100 fließt. Indikatorströmungen 70A und 70B werden
in die Indikatorströmung-Einlassöffnung 20A und 20B,
jeweils, ge bracht, von wo aus sie in die Indikatorströmung-Einlasskanäle 40A und 40B,
jeweils, und dann in den Strömungskanal 100 fließen. Zwei Referenzströmungen 75A und 75B (derselben
Zusammensetzung in diesem Beispiel) werden in die Referenzströmung-Einlassöffnungen 25A und 25B,
jeweils, gebracht. Von den Referenzströmung-Einlassöffnungen 25A und 25B fließen die
zwei Referenzströmungen 75a und 75B in
die Referenzströmung-Einlasskanäle 55A und 55B und
dann in den Strömungskanal 100.
Ein Detektor (nicht dargestellt in 3) ist relativ
zu dem Strömungskanal
so positioniert, dass er eine erfassbare Eigenschaft erfassen kann.
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Die
Probenströmung 80,
die Referenzströmungen 75A und 75B und
die Indikatorströmungen 70A und 70B treffen
sich an einem Übergangspunkt 58 in
dem Strömungskanal 100,
und die fünf
Strömungen
fließen in
einer parallelen, laminaren Strömung
zu der Auslassöffnung 60.
Analyt-Partikel in der Probenströmung 80 und
in den Referenzströmungen 75A und 75B diffundieren
in die Indikatorströmungen 70A und 70B hinein. Analyt-Partikel
in der Probenströmung 80 diffundieren
nach links und nach rechts in die Indikatorströmungen 70A und 70B,
jeweils, hinein, um Proben-Analyt-Erfassungsbereiche 140A und 140B (dargestellt
in 3 durch Kreise und Dreiecke, jeweils) zu bilden.
Analyt-Partikel in den Referenzströmungen 75A und 75B diffundieren
nach rechts und nach links, jeweils, in die Indikatorströmungen 70A und 70B hinein,
um Referenz-Analyt-Erfassungsbereiche 145A und 145B (dargestellt
in 3 durch Quadrate und „x", jeweils) zu bilden. In dieser Ausführungsform
kann wie in der einen in 2, durch Einstellen einer Strömungsrate
und einer Strömungskanalgröße, ein
Gleichgewicht einer Diffusion erreicht werden.
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Die
Vorrichtung in 3 dient für zwei Indikatorströmungen so,
dass sie laminar zu der Probenströmung und den Referenzströmungen fließen. Zum
Beispiel kann eine Indikatorströmung
ein Indikator für
einen Analyt, der von Interesse ist, sein, z. B. ein menschliches
Serum Albumin, während
die andere Indikatorströmung
ein Indikator für
einen anderen Analyt, der von Interesse ist, sein kann, z. B. Natriumionen.
Referenzströmungen,
z. B. Kontrollströmungen,
die BC1 und BC3 enthalten (die herkömmlich erhältliche Kontrollen für das gesamte
Blut sind die bekannten Konzentrationen von verschiedenen Blutkomponenten,
allerdings keine roten und weißen
Blutzellen, enthalten, und die von Biorad in Hercules, CA, erhältlich sind),
können
in einer angrenzenden, laminaren Strömung zu den Indikatorströmungen vorhanden
sein.
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4A stellt
eine Ausführungsform
dieser Erfindung dar, bei der eine Mehrzahl von T-Sensor-Vorrichtungen
in einer Fluidverbindung miteinander über eine Verteilerleitung 41 stehen. 4 stellt eine Vorrichtung mit acht Strömungskanälen 100 dar,
wobei in jede davon 1) eine Indikatorströmung und 2) entweder eine Referenzströmung (in
sieben der acht Strömungskanäle) oder
eine Probe (in einem der acht Strömungskanäle) fließt. In 4 sind
Strömungskanäle 100,
Referenzströmung-Einlasskanäle 55 und
Probenströmung-Einlasskanäle 50 nicht
schattiert, und befinden sich alle in einer Ebene des Substrats,
z. B. falls das Substrat Silizium ist, ist der Wafer bis zu derselben
Tiefe für
alle diese Elemente geätzt.
Eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20,
eine Verteilerleitung 41 und Indikatorströmung-Einlasskanäle 40 sind
schraffiert (diagonal schraffiert) und befinden sich in derselben
Ebene zueinander, allerdings ist einer davon unterschiedlich gegenüber der
ersten Ebene, die die Strömungskanäle enthält. Diese
Ausführungsform
kann durch Ätzen
von Strömungskanälen 100,
von Referenzströmung-Einlasskanälen 55 und
einem Probenströmung-Einlasskanal 50 von
einer Seite/Fläche
des Substrats aus hergestellt werden, z. B. ein Silizium-Wafer und
die Indikatorströmung-Einlassöffnung 20,
die Verteilerleitung 41 und die Indikatorströmung-Einlasskanäle 40 von
der anderen Seite/Fläche
des Substrats (Silizium-Wafer) aus. Durchgangslöcher 88 verbinden
die Kanäle 100, 55 und 50,
geätzt
auf einer Seite des Substrats, mit den Kanälen (40 und 41),
geätzt
auf der anderen Seite des Substrats. Die Verbindung erfolgt spezifisch über T-Verbindungen 59 mit
dem Indikatorströmung-Einlasskanal 40.
Eine transparente Abdeckung ist an beiden Seiten/Flächen des
Substrats abgedichtet. Löcher
sind in den transparenten Abdeckungen gebildet, um einen Zugang
zu den Öffnungen
zu schaffen, oder die Abdeckungen sind so positioniert, dass sie
nicht die Öffnungen
abdecken. Ein oder mehrere Detektoren) ist(sind) relativ zu den
Strömungskanälen so positioniert,
dass Änderungen
in einer erfassbaren Eigenschaft nicht in jedem Strömungskanal
erfasst und überwacht
werden können.
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In
dieser Ausführungsform
ist eine Mehrzahl (z. B. sieben) von Referenzströmungen in Referenzströmung-Einlassöffnungen 25 gebracht,
von wo aus die Strömungen
in Referenzströmung-Einlasskanäle 55 und dann
in einen Strömungskanal 100 fließen. Die
Probenströmung
wird in die Probenströmung-Einlassöffnung 30 gebracht,
von wo aus die Probenströmung
in einen Probenströmung-Einlasskanal 50 und
dann in einen Strömungskanal 100,
fließt.
Jeder Strömungskanal 100 enthält eine
Indikatorströmung
in einem laminaren Fluss zu entweder einer Referenz- oder einer
Probenströmung.
Die Strömungen
treten über
Auslassöffnungen 60 aus.
In dieser Ausführungsform
ist jeder Strömungskanal 100 mit
einem Indikatorströmung-Einlasskanal 40 und
entweder einem Referenz-Einlasskanal 55 oder einem Probenströmung-Einlasskanal 50 über eine
T-Verbindung 59 verbunden. Jeder Indikatorströmung-Einlasskanal 40 ist
mit einer Verteilerleitung 41 verbunden, was ermöglicht,
dass eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 mit
einer Mehrzahl von Indikatorströmungen in
eine Mehrzahl von Strömungskanälen 100 hinein
versorgt wird.
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4B stellt
einen Schnitt der Vorrichtung in 4A dar,
d. h. sie stellt die Probenströmung-Einlassöffnung 30,
den Probenströmung-Einlasskanal 50,
den Strömungskanal 100,
in Fluidverbindung damit, und eine Auslassöffnung 60, alle geätzt in einer
Ebene von einer Seite eines Silizium-Wafers aus, dar. Auch sind (durch
punktierte Linien, die die Ebene hinter der ersteren Ebene anzeigen,
und demzufolge von der anderen Seite des Wafers aus geätzt sind)
eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 und
ein Indikatorströmung-Einlasskanal 40 gezeigt.
Der Probenströmung-Einlasskanal 50 ist
mit dem Indikatorströmung-Einlasskanal über eine
T-Verbindung 59 verbunden, die ein Loch 88 aufweist.
Acht solcher Abschnitte sind in einer parallelen Art und Weise in
der Vorrichtung in 4A verbunden.
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4C zeigt
eine Seitenansicht der 4B (4C zeigt,
wie die Vorrichtung der 4B um
90 Grad auf einer Achse entlang des Strömungskanals 100 gedreht
ist). Die Probenströmung-Einlassöffnung 30 (die
sich durch eine erste Seite des Wafer-Substrats erstreckt) und der
Probenströmung-Einlasskanal 50 (stärkere Linien)
sind näher
zu dem Betrachter. Der Strömungskanal 100 und
der Indikatorströmung-Einlasskanal 40 befinden
sich in einer Ebene, und sind mit einem Probenströmung-Einlasskanal 50 über ein
Durchgangsloch 88 verbunden. Die Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 (punktierte
Linie) erstreckt sich zu der anderen Seite des Wafers.
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Die
Ausführungsform,
die in 4A dargestellt ist, dient für eine gleichzeitige,
mehrfache Bezugnahme, während
eine Probenströmung
läuft und überwacht
wird. Dies ist vorteilhaft, da ein Indikator in nur eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 eingeführt werden
muss. Eine Erfassungseinrichtung kann verwendet werden, um alle
Strömungskanäle 100 zu überwachen.
Falls eine stärkere
Hervorhebung erwünscht ist,
dann kann es bevorzugt sein, mehr als einen Detektor einzusetzen.
Alternativ kann die Vorrichtung in einer kontinuierlichen Weise
so bewegt werden, dass ein Detektor verwendet werden kann, um viele
Strömungskanäle unter
einer hohen Hervorhebung bzw. Verstärkung zu erfassen. Allerdings
können,
da jede Referenz- und Probenströmung
in einem unterschiedlichen Strömungskanal
vorhanden ist, einige experimentelle Bedingungen, z. B. Differenzen
in den Strömungsraten,
nicht berücksichtigt
werden (heraus subtrahiert werden). In dieser Ausführungsform
ist es bevorzugt, die Strömungsgeschwindigkeit
und in jedem Strömungskanal
zu überwachen,
um sicherzustellen, dass kein Verstopfen oder eine Blockade in einem
Strömungskanal
aufgetreten ist, was zu nicht erwünschten Strömungsgeschwindigkeiten in den
anderen Kanälen
führen
könnte.
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Die
Ausführungsform,
die in 4 dargestellt ist, besitzt
die Vorteile, dass dieselbe Lichtquelle, dieselben Elektroniken
und Fluide (z. B. Indikator-Lösung)
verwendet werden. Variationen in irgendwelchen Punkten davon können zu
einer verringerten Genauigkeit der Messungen führen. Weiterhin ermöglichen
die mehreren, separaten Einlässe
eine akkuratere und unabhängige
Kontrolle von Strömungsgeschwindigkeiten
der verschiedenen Fluidströmungen.
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5 stellt
eine Ausführungsform
der Vorrichtung dieser Erfindung dar, ähnlich zu derjenigen in 4, mit der Ausnahme, dass keine Verteilerleitung
vorhanden ist, die die Einlasskanäle für die Indikatorströmung verbinden. 5 stellt
ein Vorrichtung mit acht Strömungskanälen 100 dar,
wobei in jeden davon 1) eine Indikatorströmung und 2) entweder eine Referenzströmung (in
sechs der acht Strömungskanäle) oder
eine Probe (in zwei der acht Strömungskanäle) fließt. In 5 sind
Strömungskanäle 100,
Referenzströmung-Einlasskanäle 55 und
Probenströmung-Einlasskanäle 50 nicht
schraffiert, und sie befinden sich alle in einer Ebene des Substrats,
z. B. falls das Substrat Silizium ist, ist der Wafer in dieselbe
Tiefe für
alle diese Elemente geätzt. Die
Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 und
die Indikatorströmung-Einlasskanäle 40 sind
schraffiert (diagonal schraffiert) und befinden sich in derselben
Ebene zueinander, allerdings ist einer unterschiedlich gegenüber der
ersten Ebene, die die Strömungskanäle, usw.,
enthält. Ähnlich zu
der Ausführungsform
in 4 kann diese Ausführungsform
durch Ätzen
von Strömungskanälen 100,
von Referenzströmung-Einlasskanälen 55 und
von Probenströmung-Einlasskanälen 50 von
einer Seite/Fläche
des Substrats, z. B. eines Silizium-Wafers, und von Indikatorströmung-Einlassöffnungen 20 und
der Indikatorströmung-Einlasskanälen 40 von
der anderen Seite/Fläche
des Substrats (Silizium-Wafers), hergestellt werden. Eine transparente
Abdeckung ist an beiden Seiten/Flächen des Substrats abgedichtet
aufgebracht. Löcher
sind in den transparenten Abdeckungen gebildet, um einen Zugang
zu den Öffnungen
zu schaffen, oder die Abdeckungen sind so positioniert, dass sie
nicht die Öffnungen
abdecken. Ähnlich
zu der Ausführungsform,
die in 4 dargestellt ist, ermöglicht die
Ausführungsform,
dargestellt in 5, die Überwachung einer Mehrzahl von
Strömungskanälen mit
einem Detektor (nicht in 5 dargestellt).
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In
dieser Ausführungsform
ist eine Mehrzahl (z. B. sechs) von Referenzströmungen in Referenzströmung-Einlassöffnungen 25 gebracht,
von wo aus die Strömungen
in Referenzströmung-Einlasskanäle 55 und dann
in einen Strömungskanal 100 fließen. Probenströmungen werden
in Probenströmung-Einlassöffnungen 30 gebracht,
von wo aus die Probenströmungen
in die Probenströmung-Einlasskanäle 50 und
dann in einen Strömungskanal 100 fließen. Jeder
Strömungskanal 100 enthält eine
Indikatorströmung
in einem laminaren Fluss mit entweder einer Referenz- oder einer
Probenströmung.
Die Strömungen
treten durch Ausgangs-Öffnungen 60 aus.
In dieser Ausführungsform
ist jeder Strömungskanal 100 mit
einem Indikatorströmung-Einlasskanal 40 und
entweder einem Referenz- oder einem Probenströmung-Einlasskanal (55 und 50 jeweils) über eine
T-Verbindung 59 und ein Loch 88 verbunden.
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6 stellt
eine andere Ausführungsform
dieser Erfindung dar, wobei Strömungen
in Öffnungen
eingeführt
werden, wie dies beschrieben und vorstehend dargestellt ist, die
allerdings verteilende Strömungskanäle 105A und 105B enthalten,
die die Einlasskanäle
mit dem Strömungskanal 100 verbinden.
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In
der Ausführungsform,
die in 6 dargestellt ist, werden Referenzströmungen 75A und 75B in
Referenzströmung-Einlassöffnungen 25A und 25B gebracht,
von wo aus die Strömungen
in Referenzströmung-Einlasskanäle 55A und 55B,
dann in Verteilungsströmungs-Kanäle 105A und 105B und
dann in den Strömungskanal 100 fließen. Eine
Probenströmung
wird in eine Probenströmung-Einlassöffnung 30 gebracht, von
wo aus die Probenströmung
in einen Probenströmung-Einlasskanal 50 und
dann in einen Verteilerströmungskanal 105B fließt und dann
in den Kanal 100 fließt.
Die Indikatorströmungen
werden in die Indikatorströmung-Einlassöffnungen 20A und 20B gebracht,
von wo aus die Strömungen
in die Indikatorströmung-Einlasskanäle 40A und 40B,
dann in Verteilerströmungskanäle 105A und 105B und
dann in einen Strömungskanal 100 fließen. Die
Strömungen
befinden sich in einem laminaren Strom von der Einlassöffnung zu
der Auslassöffnung 60.
Die Verteilerströmungskanäle 105A und 105B müssen nicht
angewinkelt werden, wie dies dargestellt ist, sondern können gerade
oder angewinkelt unter unterschiedlichen Winkeln sein, so lange
eine laminare Strömung
aufrechterhalten wird.
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Änderungen
in einer erfassbaren Eigenschaft können in beiden Verteilerströmungskanälen 105A und 105B und
dem Strömungskanal 100 durch
Erfassungs-Vorrichtungen überwacht
werden.
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Eine
Qualitätskontrolle
der Strömungsrate
kann durch 1) Ausdrücken
eines QC-Diagramms
(siehe Beispiel 4 nachfolgend) und/oder 2) unter Verwendung einer
gemeinsamen, d. h. gemeinsam geteilten, Pumpeinrichtung, um sowohl
die Referenzströmung
als auch die Probenströmung
zu pumpen, durchgeführt
werden. Die Indikatorströmung
kann auch durch die gemeinsame Pumpeinrichtung in einigen Ausführungsformen gepumpt
werden.
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7A stellt
eine Ausführungsform
der Vorrichtung dar, bei der separate Pumpeinrichtungen für jede Eingangsströmung verwendet
sind. Eine Pumpeinrichtung 150 pumpt eine Indikatorströmung in
den Strömungskanal 100 hinein
und entlang von diesem über
eine Spritze 165, eine Indikatorströmung-Einlassöffnung 20 und
einen Indikatorströmung-Einlasskanal 40.
Eine Pumpeinrichtung 155 pumpt eine Referenzströmung in den
Strömungskanal 100 und
entlang von diesem über
die Spritze 165, eine Referenzströmung-Einlassöffnung 25 und
einen Referenzströmung-Einlasskanal 55.
Die Pumpeinrichtung 160 pumpt eine Probenströmung in
den Strömungskanal 100 und
entlang von diesem über
eine Spritze 165, eine Probenströmung-Einlassöffnung 30 und
einen Probenströmung-Einlasskanal 50.
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7B stellt
eine alternative Ausführungsform
der Vorrichtung dar, bei der eine gemeinsam geteilte Pumpeinrichtung
für Proben-
und Referenzströmungen
verwendet wird. Die gemeinsam geteilte Pumpeinrichtung 170 pumpt
eine Referenzströmung
und eine Probenströmung
in den Strömungskanal 100 und
entlang von diesem. Eine Pumpeinrichtung 150 pumpt eine
Indikatorströmung
in den Strömungskanal 100 und
entlang von diesem.
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7C stellt
eine alternative Ausführungsform
der Vorrichtung dar, bei der eine gemeinsam geteilte Pumpeinrichtung
für Proben-Indikator-
und Referenzströmungen
verwendet werden. Die gemeinsam geteilte Pumpeinrichtung 170 pumpt
eine Referenzströmung,
eine Indikatorströmung
und eine Probenströmung
in den Strömungskanal 100 und
entlang von diesem.
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Die
Verwendung einer gemeinsam geteilten Pumpeinrichtung, z. B. eines
Motors, stellt sicher, dass jede Strömung, gepumpt durch eine solche
Einrichtung, demselben Druck unterworfen wird.
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Es
kann bevorzugt sein, die Strömungsrate
in jedem Einlasskanal so zu überwachen,
um sicherzustellen, dass sich kein Hindernis für die Strömung entwickelt hat, z. B.
eine Verstopfung, und dass alle Strömungen unter der erwünschten
Strömungsrate
(den erwünschten
Strömungsraten)
fließen.
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Zahlreiche
Ausführungsformen
neben solchen, die hier erwähnt
sind, werden leicht für
Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet ersichtlich werden, die
innerhalb des Bereichs und des Schutzumfangs dieser Erfindung fallen.
Die nachfolgenden Beispiele stellen die Erfindung dar, allerdings
ist in keinster Weise beabsichtigt, die Erfindung dadurch einzuschränken.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Herstellung
eines Referenz-T-Sensors
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Ein
Zwei-Masken-Niveau-Prozess wurde verwendet, um eine Referenz-T-Sensor-Vorrichtung
dieser Erfindung auf einem Silizium-Wafer herzustellen. Die Referenz-T-Sensor-Vorrichtung
besaß einen
Strömungskanal 400 mit
einer Tiefe von 400 Mikrometern und einer Länge von 20 mm. Drei Einlasskanäle wurden
als Nuten, 30 mm lang und 200 Mikrometer tief, gebildet. Eine Einlasskanal-
und Strömungskanalbreite
betrug 50 Mikrometer.
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Das
Niveau der ersten Maske definierte die Einlässe und Auslassöffnungen,
die geätzt
waren, und zwar vollständig
durch den Wafer an der Rückseite
des Siliziums. Das zweite Niveau definierte die Fluid-Transportkanäle, d. h.
die Einlasskanäle
und die Strömungskanäle.
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Chrom-Masken
mit vier Inch wurden nach diesen Spezifikationen durch Photo Sciences,
Inc. (Torrance, CA) hergestellt, und 3'' Wafer
({100} n-Typ) mit 500 nm an SiO2, angewachsen
darauf, wurden verwendet.
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Die
Wafer wurden in einem Piranha-Bad (H2SO4 und H2O2) (2 : 1) vor einer Verarbeitung gereinigt.
Ein Primer (HMDS geschleudert bei 3000 U/min) wurde verwendet, um
eine Fotoresist-Adhäsion
zu verstärken. Ungefähr ein μm an AZ-1370-SF
(Hoechst) eines Fotoresists wurde durch Schleuderbeschichtung (3000 U/min)
niedergeschlagen, und hierauf folgte ein sanftes Einbrennen (30
min bei 90°C).
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Ein
Kontakt-Ausrichter wurde verwendet, um Wafer auszurichten und freizulegen.
Eine Belichtungszeit wurde variiert, um die besten Ergebnisse zu
erhalten. Kein Nachbehandlungseinbrennen wurde vorgenommen. Wafer
wurden in AZ-351 (verdünnt
4 : 1) (Hoechst) für
eine Minute entwickelt und in DI Wasser gespült. Ein schwarzes Klebeband
(Semiconductor Equipment Corporation, Moorpark, CA) wurde auf die
Rückseiten
der Wafer aufgebracht, um gegen das Oxid-Ätzen zu schützen.
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Die
Wafer wurden in einem gepufferten Oxid-Ätzmittel (BOE, 10 : 1 HF (49%)
und NH4F (10%)) für elf Minuten eingetaucht,
um vollständig
das nicht geschützte
Oxid wegzuätzen.
Das blaue Klebeband wurde mit der Hand entfernt und der Fotoresist
wurde in einer Azeton-Spülung
entfernt.
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Ein
Silizium-Ätzen
wurde in einer Mischung aus Ethylendiamin, Pyrokatechol und Wasser
(EPW F-etch, wie es in Reismann, A., et al. (1979) J. Electrochem.
Soc. 126: 1406–1415
beschrieben ist), eingesetzt in einem Rückfluss-Siedekolben, vorgenommen.
Dieses Ätzmittel
griff die {100} Ebenen des Siliziums unter einer Rate von ungefähr 100 μm pro Stunde
an. Fluid-Befestigungsöffnungen
wurden in dem ersten Schritt für ungefähr drei
Stunden geätzt.
Fotoresist wurde erneut aufgebracht, und die Maske, die Strömungskanäle zwischen
Fluid-Öffnungen
und dem Barrierebereich enthielt, wurde freigelegt. Die Wafer wurden
entwickelt und in jedem zweiten Schritt für ungefähr eine Stunde geätzt.
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Nach
einer Endbearbeitung wurden die Wafer erneut in einem Piranha-Bad
gereinigt und in DI-Wasser gespült.
Sie wurden dann in einzelne Vorrichtungen mit einer Abmessung von
ungefähr
1 cm mal 1 cm unterteilt.
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Ein
anodisches Bonden gemäß Wallis,
G., und Pomerantz, D. I (1969) J. Applikation. Physics 40: 3946–3949, wurde
verwendet, um Pyrex-Glas an den Silizium- Vorrichtungen zu befestigen. Teile mit
einem Quadrat von einem Inch aus Pyrex-Glas (100 μm Dicke)
von Esco Products Inc. (Oak Ridge, NJ) wurden verwendet. Zuerst
wurden das Silizium und das Pyrex-Glas in eine Lösung aus H2O2, NH4OH und H2O (1 : 4 : 6), erwärmt auf 50°C, eingetaucht. Dieser Prozess
entfernte irgendwelches organisches Material auf den Oberflächen und
machte auch die Oberfläche
hydrophil. Nach 20 Minuten in dieser Lösung wurden das Silizium und das
Pyrex mit DI Wasser gespült
und getrocknet. Ein anodisches Bonden wurde bei 400°C mit 400
V, angelegt zwischen dem Glas und dem Silizium, vorgenommen.
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Beispiel 2: Erfassung
und Messung der Konzentration des menschlichen Serums Albumin in
einem Referenz-T-Sensor
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Fünf 0,1 M
AMPSO (Aldrich) von wässrigen
Pufferlösungen
(pH 7,4) mit 0, 2, 4, 6, und 8 g/100 mL des menschlichen Serums
Albumin (HSA) wurden von Chemikalien einer analytischen Güte (Aldrich)
präpariert. Die
erhaltenen Lösungen
wurden darauf folgend als Probenströmungen verwendet. Der Analyt,
der in diesem Experiment untersucht wurde, war HSA. Eine gesättigte Lösung aus
einem fluoreszenten Albumin-Indikator-Farbstoff
AB580 (Molecular Probes, Eugene, OR), wurde mit einem Faktor von
10 mit derselben 0,1 M AMPSO Pufferlösung verdünnt und wurde als eine Indikatorströmung verwendet.
BC1, ein kommerziell erhältliches
Plasma, das 3,8 g/100 mL HSA enthält, wurde als eine Kontrollströmung verwendet.
Eine Strömungsgeschwindigkeit
von 50 nL/sec wurde verwendet.
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Die
Referenz-T-Sensor-Vorrichtung (1) wurde
auf dem Gestell eines Mikroskops befestigt, so dass der Strömungskanal,
von der T-Verbindung bis zu ungefähr 500 μm von der T-Verbindung, in dem
Sichtfeld des Objektivs lag. Die Einlassöffnungen und die Auslassöffnungen
wurden mit Injektorschleifen und mit aufrecht stehenden Rohren,
die mit Wasser gefüllt
wurden, verbunden, so dass dort eine Druckdifferenz von 30 mm Wassersäule zwischen
den Einlassöffnungen
und der Auslassöffnung
vorlag. Die Einlassöffnungen wurden
einem identischen Druck ausgesetzt, so dass sich die drei Strömungen,
in der Mitte der T-Verbindung vereinigten, und parallel zu der Auslassöffnung flossen.
Eine Injektorschleife wurde mit BC1 einer Kontroll-Lösung gefüllt, eine zweite Schleife wurde
mit einer Indikator-Farbstoff-Lösung
gefüllt,
und eine dritte Schleife wurde mit einer der Proben-Lösungen gefüllt. Die
Schleifen enthielten genug Volumen, um die Vorrichtung für ungefähr eine
Stunde zu betreiben.
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Nachdem
allen drei Injektionsschleifen ermöglicht wurde, in die Referenz-T-Sensor-Vorrichtung
zu fließen,
und nach 1 min einer Ausgleichs- und Spülzeit, wurden Fotografien über eine
Kamera, befestigt an dem Mikroskop, aufgenommen. Eine Erregungs-Filter-Mittenwellenlänge betrug
590 nm, und der Emissionsfilter war ein Longpass-Filter mit 607
nm.
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Das
Experiment ergab Fotografien, bei denen die Fluoreszenz des Analyt-Erfassungsbereichs
zwischen der Indikatorströmung
und der Probenströmung,
und zwischen der Indikatorströmung
und der Kontrollströmung,
eine Funktion der Konzentration des Analyts (HSA) war, der in die
Indikatorströmung
von der Probenströmung
und der Kontrollströmung,
jeweils, hinein diffundiert war.
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Wie
schematisch in 8 dargestellt ist, sind fünf Abschnitte
mit A–E
markiert. In jedem dieser fünf Fälle zeigte
die Fotografie der Vorrichtung die Kontrollströmung 76 (dargestellt
in der Figur mit weiß)
als dunkle Stellen (schwarz) an, zeigte die Probenströmung 80 (dargestellt
in der Figur mit weiß)
als dunkle (schwarze) Stelle an, zeigte die Indikatorströmung 70 (dargestellt
in der Figur durch horizontale Linien) als rötlich-schwarze Stellen an und
zeigte den Kontroll-Analyt-Erfassungsbereich 146 (dargestellt
in der Figur durch eine diagonale Schraffierung) als eine helle,
rote Linie an, die sich entlang der Länge des Strömungskanals erstreckt, wo HSA
von der Kontrollströmung
in die Indikatorströmung
hinein diffundiert war, und zeigte den Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 als
eine hellrote Linie an, die sich entlang der Länge des Strömungskanals erstreckt, wo HSA
von der Probenströmung
in die Indikatorströmung
hinein diffundiert ist. Zusätzlich
war, in dem ersten Fall, bei dem die Konzentration von HSA in der
Probenströmung
0 g/100 mL eines Puffers war (Abschnitt A von Experiment A), kein
erfassbarer Analyt-Erfassungsbereich zwischen der Indikatorströmung 70 und
der Probenströmung 80 vorhanden.
In dem zweiten Fall war, wo die Konzentration von HSA in der Probenströmung 80 2
g/100 mL eines Puffers betrug (Abschnitt B, Experiment B), ein Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 ungefähr von der
Hälfte
der Intensität
des Kontroll-Analyt-Erfassungsbereichs 146 zu sehen. In dem
dritten Fall, bei dem die Konzentration von HSA in der Probenströmung 80 4
g/100 mL eines Puffers betrug (Abschnitt C, Experiment C), war ein
Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 mit
ungefähr
derselben Intensität
wie der Kontroll-Analyt-Erfassungsbereich 146 zu
sehen. In dem vierten Fall, wo die Konzentration von HSA in der
Probenströmung 80 6
g/100 mL eines Puffers betrug (Abschnitt D, Experiment D), war ein
Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 mit ungefähr eineinhalbmal
der Intensität
des Kontroll-Analyt-Erfassungsbereichs 146 zu sehen. In
dem fünften
Fall, wo die Konzentration von HSA in der Probenströmung 80 8
g/100 mL an Puffer betrug (Abschnitt E, Experiment E), war ein Proben-Analyt-Erfassungsbereich 140 ungefähr zweimal
von der Intensität
des Kontroll-Analyt-Erfassungsbereichs 146 zu sehen.
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Die
Fluoreszenz-Daten, dargestellt in diesen Fotografien, wurden aufgezeichnet
und quantitativ grafisch dargestellt, wie dies in Tabelle 1 und
in 9 gezeigt ist.
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9 zeigt
eine grafische Darstellung der Fluoreszenz-Intensität gegenüber der
x-Koordinate, was die Position in der Diffusions-Richtung (Tiefe)
des Strömungskanals
ist. (Die Zahlen auf der y-Achse verringern sich, wenn sich die
Fluoreszenz erhöht,
und zwar als Folge eines Software-Artifacts: hellere (fluoreszierendere)
Bereiche sind mit niedrigen Pixel-Intensitäts-Zahlen bezeichnet, und dunklere
(geringere) Fluoreszenz) Bereiche sind mit höheren Pixel-Intensitäts-Zahlen
bezeichnet.) In dem oberen, linken Bereich der grafischen Darstellung
ist die Hintergrund-Fluoreszenz der Kontrollströmungen dargestellt: sie ist
sehr klein, und ist im Wesentlichen dieselbe für jeden der fünf Fälle. Der
große
nach unten gehende Peak an der Position 122–124 stellt
die Fluoreszenz der Kontrollströmung
dar, die 3,8 g HSA/100 mL an Puffer enthält: die Fluoreszenz ist stark
und im Wesentlichen dieselbe für
jeden der fünf
Fälle.
(Drei Daten-Punkte sind gemittelt, um jeden Daten-Wert, dargestellt
in Tabelle 1, zu erhalten.) Der flache, nach unten gehende Peak
an der Position der 30–190 stellt
die Hintergrund-Fluoreszenz der Indikatorströmung dar: sie ist nicht sehr
stark, sich von ungefähr 185
bis 189 variierend, und ist im Wesentlichen dieselbe für jeden
der fünf
Fälle.
Die vier Peaks an den Positionen 207, 207, 206 und 205 stellen
die Fluoreszenz der Proben dar, enthaltend Konzentrationen von HSA mit
2, 4, 6 und 8 g/100 mL, jeweils. Diese entsprechen den Experimenten
A, B, C, D und E, jeweils. Die Intensitäts-Werte sind 176,45; 124,15; 72,67 und
39,85 jeweils. An der oberen, rechten Position der Grafik ist die Hintergrund-Fluoreszenz
der Probentrömungen
dargestellt: sie ist sehr klein, und im Wesentlichen dieselbe für jeden
der fünf
Fälle.
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Beispiel 3: Bestimmung
der Konzentration von HSA in acht klinischen Proben und Korrigieren
durch interne Standards
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10 zeigt
eine grafische Darstellung der Fluoreszenz-Intensität gegenüber der
Konzentration von HSA von acht klinischen Proben des menschlichen
Gesamtbluts. Der Referenz-T-Sensor wurde durch Messen der Fluoreszenz-Intensität von Kalibrierungsströmungen mit
bekannten Konzentrationen (2, 4, 6 und 8 g/100 mL eines Puffers)
an HSA kalibriert. Die Indikatorströmung wurde entsprechend dem
Vorgang, der in Beispiel 2 beschrieben ist, vorgenommen. Die Kalibrierungs-Kurve
ist in 10 als eine dunkle Kurve dargestellt.
Als nächstes
wurde die Fluoreszenz von jeder der acht klinischen Proben gemessen
und grafisch (dargestellt als x) in 10 dargestellt.
Während
diese Daten gemessen wurden, wurden interne Standardströmungen,
enthaltend 3,8 g HSA/100 mL an Puffer, laufen gelassen und gemessen
und grafisch (dargestellt als Kreise) in 10 dargestellt.
Die Fluoreszenz-Intensität
von den Probenströmungen
wurde durch die Fluoreszenz-Intensität der internen Standardströmungen dividiert,
was die korrigierten Werte, dargestellt in 10 als
Dreiecke, ergab.
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10 stellt
dar, dass die korrigierten Werte näher zu der Kalibrierungs-Linie
fallen, als dies die nicht korrigierten (groben) Daten tun. Dies
stellt einen der Vorteile der Vorrichtung und des Verfahrens dieser
Erfindung dar, die eine Korrektur von experimentellen Bedingungen
unter Verwendung der internen Standardströmungen liefern. Paramax ist
ein Instrument, das für
Fachleute auf dem betreffenden Fachgebiet bekannt ist, und setzt
optische Absorptions-Messungen und ein automatisiertes Mischen von
Proben und Reagenzien ein, um die Konzentration von Analyt in klinischen
Proben zu bestimmen.
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Beispiel 4: Qualitätskontrolle
der Strömungsrate
durch grafische Darstellung eines Levy-Jennings Ausdrucks
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11 zeigt
ein QC-Diagramm (Levy-Jenning) von Daten, gesammelt von einer Vorrichtung
dieser Erfindung, um die Qualitäts-Kontroll-Funktion
der Vorrichtung zu demonstrieren. Eine Fluoreszenz-Intensität wurde
auf der y-Achse ausgedruckt und die Experiment-Nummer wurde auf
der x-Achse ausgedruckt. 11 gibt 20
Kontrollströmungen
an und zeigt, dass 18 von den 20 innerhalb von zwei durchschnittlichen
Standard-Abweichungen fallen, d. h. Soll-Wert für die Konzentration von HSA.
Nur die Experimente 4 und 7 ergaben Werte, die
außerhalb
der zwei Standard-Abweichungen
des Soll-Werts fielen. Dieser Typ eines Diagramms ist nützlich,
um eine Strömungsraten-
und/oder Reagenz-Variationen, Lampenquellen-Variationen und andere
Variationen in System-Parametern der Strömungen in der Vorrichtung dieser
Erfindung zu prüfen.
Falls die gemessenen Kontroll-Werte innerhalb von zwei Standard-Abweichungen
des Soll-Werts fallen (oder welcher Bereich auch immer präzise genug
für ein
gegebenes Projekt ist), werden diese Parameter geeignet dafür kontrolliert oder
eingehalten.