DE69730011T2

DE69730011T2 - Herstellung einer Martix von hoher Dichte, sowie Verfahren zur Wiedergabe für einen fiberoptischen Biosensor

Info

Publication number: DE69730011T2
Application number: DE69730011T
Authority: DE
Inventors: Daniel Pinkel; Richard Segraves; Ye Zhai; G. Donna ALBERTSON
Original assignee: Medical Research Council; University of California
Current assignee: Medical Research Council; University of California
Priority date: 1996-01-26
Filing date: 1997-01-24
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2017-01-25
Also published as: EP0879299A4; JP2000505281A; JP4029921B2; US5837196A; EP0879299B1; WO1997027326A1; EP0879299A1; DE69730011D1; ATE272212T1

Description

Diese Erfindung wurde teilweise mit Unterstützung der Regierung unter dem Grant (oder Vertrag) Nr. CA 45919 gemacht, welcher von den National Institutes of Health vergeben wird. Die Regierung hat an dieser Erfindung gewisse Rechte.
Diese Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung von Biosensoren, welche biologische "Bindungspartner" (Moleküle, die spezifisch andere Moleküle binden, um einen Bindungskomplex wie beispielsweise Antikörper-Antigen, Lektin-Kohlenhydrat, Nukleinsäure-Nukleinsäure, Biotin-Avidin usw. zu bilden) umfassen, die mit optischen Fasern verknüpft sind. Die Erfindung stellt verbesserte Methoden zur Befestigung verschiedener Biomoleküle an festen Oberflächen, insbesondere optischen Fasern, bereit. Chargen von optischen Fasern werden serienmäßig mit derselben Spezies von Bindungspartner hergestellt, aus ihrer bestimmten Charge ausgeeinzelt und mit ähnlichen optischen Fasern aus anderen Chargen mit anderen Spezies von Bindungspartnern wieder gruppiert.
Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter dem Grant Nr. CA 45919, welcher von dem National Institute of Health vergeben wird, und unter dem Grant Nr. DE-AC0376SF0098, welcher von dem Department of Energy vergeben wird, gemacht. Die Regierung hat an dieser Erfindung gewisse Rechte.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Biosensoren sind Sensoren, welche chemische Spezies mit hoher Selektivität auf der Basis von molekularer Erkennung statt der physikalischen Eigenschaften von Analyten nachweisen. Siehe z. B. Advances in Biosensors, A. P. F. Turner, Herausg., JAI Press, London (1991). Viele Typen von Biosensorvorrichtungen sind in den vergangenen Jahren entwickelt worden, einschließlich Enzymelektroden, optischer Immunsensoren, Ligand-Rezeptor-Amperometern und Sonden für gedämpfte Wellen. Updike und Hicks, Nature 214: 986 (1967), Abdel-Latif et al., Anal. Lett. 21: 943 (111988); Giaever, J. Immunol. 110: 1424 (1973); Sugao et al., Anal. Chem. 65: 363 (1993), Rogers et al., Anal. Biochem. 182: 353 (1989).
Biosensoren, welche ein biologisches "Bindungsmolekül" umfassen, das an einer optischen Faser befestigt ist, sind im Stand der Technik, am häufigsten als Detektoren für gedämpfte Wellen, wohlbekannt (siehe z. B. U.S.-Patent 4,447,546 von Hirschfeld und U.S.-Patente 4,582,809 und 4,909,990 von Block et al.). Um die Empfindlichkeit und Selektivität zu maxi mieren, benutzen derartige Biosensoren typischerweise eine einzelne Spezies eines biologischen Bindungsmoleküls, welche an der Sensorfläche befestigt ist.
Derartige Biosensoren mit einer "einzelnen Spezies" sind in der Hinsicht beschränkt, dass diese kein internes Mittel aufweisen, um im Hinblick auf eine nicht spezifische Bindung korrigiert oder kalibriert zu werden. Somit müssen sie gegen einen externen Standard kalibriert werden. Zusätzlich sind sie auf den Nachweis eines einzigen Analyten beschränkt.
Biosensoren, welche zwei oder mehrere Spezies biologischer Bindungspartner umfassen, überwinden diese Beschränkungen. Ein Biosensor "mit mehreren Spezies" erlaubt im Prinzip den gleichzeitigen Nachweis von so viel verschiedenen Typen von Analyten, wie es Spezies von biologischen Bindungspartnern gibt, die in den Sensor eingebaut sind. Zusätzlich liefert der Vergleich der Mengen eines einzelnen Analyten, der an mehrere Spezies von Bindungspartnern bindet, ein Maß für die nicht spezifische Bindung und wirkt somit als eine interne Kontrolle für die Variabilität der Messung, die durch die nicht spezifische Bindung eingeführt wird.
Zusätzlich stellt der Einschluss von Fasern, die biologische Bindungspartner tragen, die für verschiedene Analyten spezifisch sind, von denen bekannt ist, dass sie bei einem bestimmten Test ein Hintergrundsignal erzeugen, ein Mittel bereit, um gleichzeitig das Hintergrundsignal zu messen und dieses abzuziehen. Die Bereitstellung einer Mehrzahl von Fasern, die verschiedene Spezies von Bindungspartnern tragen, erlaubt den Nachweis einer Mehrzahl von Komponenten, die zu einem Hintergrund oder einem anderen Signal beitragen, und das Aussortieren des Beitrags von jeder Komponente zu diesem Signal.
Damit dieser besonders nützlich ist, ist es für einen Biosensor mit mehreren Spezies erforderlich, dass der Sensor ein separates Signal bereitstellt, welches das Binden von Analyten an jede der verschiedenen Spezies von Bindungspartnern, welche die Sonde umfasst, kennzeichnet. Somit muss jede Spezies von Bindungspartner individuell "adressiert" werden.
Zusätzlich wird eine "Sensorfläche" (die Oberfläche, welche die biologischen Bindungspartner trägt), welche einen relativ kleinen Oberflächenbereich aufweist, die Messung kleiner Probenvolumina erleichtern, da weniger Probenmaterial benötigt wird, um die Sensorfläche vollständig einzutauchen. Ein Detektor mit kleinem Oberflächenbereich wird sich ebenfalls zur Verwendung für in vitro-Messungen als vorteilhaft erweisen. Die Herstellung eines Detektors, welcher eine große Anzahl an unterschiedlichen biologischen Bindungspartnern trägt, die einen kleinen Bereich belegen, kann als die Herstellung einer hochdichten Anordnung von biologischen Bindungspartnern angesehen werden.
Die Erzeugung von hochdichten Anordnungen biologischer Bindungspartner, wo jede Spezies von Bindungspartner einzeln adressiert wird, führt zu enormen Herstellungsproblemen. Einer der bis heute erfolgreichsten Ansätze ist die fotolithografische Festphasensynthese in großem Maßstab, für welche die Affymax Inc. die Pionierarbeit geleistet hat (siehe z. B. Fodor et al., Science 251: 767–773 (1991) und U.S.-Patent Nr. 5,143,854). Bei diesem Ansatz werden Anordnungen von Peptiden oder Nukleinsäuren chemisch auf einem festen Träger synthetisiert. Unterschiedliche Moleküle werden gleichzeitig an unterschiedlichen vorher bestimmten Orten auf dem Substrat durch die Verwendung eines fotolithografischen Verfahrens synthetisiert, welches selektiv fotolabile Schutzgruppen auf den wachsenden Molekülen an besonders ausgewählten Orten auf dem Substrat entfernt. Die resultierende Anordnung von Molekülen ist "räumlich adressiert". In anderen Worten wird die Identität jedes biologischen Moleküls durch seine Lage auf dem Substrat bestimmt.
Der fotolithografische Ansatz ist jedoch auf Moleküle beschränkt, die chemisch synthetisiert werden können. Somit ist er typischerweise auf Peptide, die kürzer sind als ca. 50 Aminosäuren, und Nukleinsäuren, die kürzer sind als ca. 150 Basenpaare, beschränkt. Zusätzlich erzeugt der fotolithografische Ansatz typischerweise solche Anordnungen auf einem planaren Substrat (z. B. einem Glasobjektträger) und liefert keinen intrinsischen Mechanismus, durch welchen ein Signal, das durch die Bindung eines bestimmten biologischen Bindungspartners erzeugt wird, übertragen werden kann.
Das U.S.-Patent Nr. 5,250,264 von Walt et al. offenbart einen Sensor, welcher eine faseroptische Anordnung umfasst, die eine "Mehrzahl von unterschiedlichen Farbstoffen, die in individuellen Raumpositionen auf der Oberfläche des Sensors immobilisiert sind" verwendet. Jeder Farbstoff ist in der Lage, auf einen anderen Analyten (z. B. pH, O₂, CO₂ usw.) anzusprechen, und der Sensor als Ganzes ist in der Lage, gleichzeitige Messungen mehrerer Analyten zu liefern.
Obwohl der von Walt et al. offenbarte Sensor kein Biosensor ist, beschreibt die Literaturstelle ein Mittel zur Herstellung eines Sensors, welcher eine Mehrzahl einzeln adressierter "Detektionskomponenten" trägt. Bei Walt et al. werden die optischen Fasern zunächst zusammengesetzt, um ein Bündel zu bilden. Transmissionsenden einer Faser oder einer Gruppe von Fasern werden dann spezifisch beleuchtet. Jede beleuchtete Faser überträgt das Licht zu ihrem entsprechenden Sensorende, wo das Licht eine Sensorfarbstoffmischung "fotopolymerisiert", was den Farbstoff an das Sensorende binden lässt. Dieser Prozess wird mit unterschiedlichen Fasern für unterschiedliche fotopolymerisierte Farbstoffe wiederholt. Die Wiederholung setzt sich fort, bis eine Sensoranordnung aufgebaut ist.
Dieser Ansatz leidet unter den Beschränkungen, dass er fotopolymerisierbare Sensorfarbstoffe erfordert, und ist somit in der Anzahl an unterschiedlichen Spezies pro Sonde durch die Anzahl an unterschiedlichen Farbstofftypen beschränkt. Zusätzlich stellt diese Literaturstelle keine Mittel bereit, um einzeln adressierte biologische Moleküle (z. B. Peptide, Nukleinsäuren, Antikörper) an dem Sensor zu befestigen. Somit liefern Walt et al. kein Mittel zur Herstellung von Biosensoren.
Hartmann et al., Sensors and Actuators B, Band 28 (1995), 143–149 beschreiben eine Immobilisation in einem Schritt von Immunglobulin G und das Potential der Methode bei der Anwendung in Immunsensoren. Einzelschichten von Antikörpern, welche in eine Polymereinzelschicht eingearbeitet sind, werden auf der unteren Phase einer Langmuir-Blodgett-Wanne hergestellt. Die Langmuir-Blodgett-Wanne wird mit einer festen Oberfläche in Kontakt gebracht, wodurch das Immunglobulin G an der festen Oberfläche befestigt wird, so dass dieses spezifisch ein zweites Molekül erkennen und binden kann.
US-A-5,194,393 betrifft einen optischen Biosensor, welcher auf einer Fluoreszenzenergieübertragung beruht, bestehend aus (a) einem festen Träger, (b) einer Langmuir-Blodgett-Folie, welche an (a) befestigt ist, (c) wenigstens einem fluoreszierenden Farbstoff, welcher in wenigstens einer der oberen vier Schichten der LB-Folie angeordnet ist, (d) einem Rezeptormolekül, welches in oder an der obersten Schicht der LB-Folie gebunden oder angeordnet ist, und (e) einen mobilen fluoreszierenden Farbstoff.
Hartmann et al., Proceedings of the International Solid-State Sensors and Actuators Conference – Transducers '95, 25.–29. Juni 1995 und Found. Sensors and Actuators Technol., Schweden, Band 2 (1995), 505–508 beschreiben ein Einschrittverfahren, bei welchem gemischte Folien, die aus funktionalisierter Cellulose und Immunglobulin G (IgG) bestehen, vollständig auf optische Wellenleiter transferiert werden. Aufgrund der Einbettung des IgG in die Matrix und einem Fotopolymerisationsverfahren ist die Stabilität der Folien im Vergleich zu reinen IgG-Folien verbessert.
Steinitz, J. Immunological Methods 187 (1995), 171–177 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Teilchen aus Nitrocellulose mit 1–3 Mikrometer Größe, welche in der Lage sind, Protein zu absorbieren. Protein wird auf vorgeformte Teilchen absorbiert, die erzeugt wurden, indem zuerst ein Blatt Nitrocellulosepapier in DMSO gelöst wurde und dieses dann mit Natriumcarbonat/Bicarbonatpuffer ausgefällt wurde.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, wie es in Anspruch [1] beschrieben wird.
Die Erfindung stellt ebenfalls verbesserte Verfahren zur Befestigung von verschiedenen Biomolekülen (z. B. Nukleinsäuren) an festen Oberflächen bereit. Die Verfahren beinhalten die Verwendung einer Matrixlösung, welche das interessierende Biomolekül und ein organisches oder anorganisches Matrixpolymer umfasst. Typischerweise ist die Matrixlösung eine einphasige Lösung, welche sowohl das Matrixpolymer (z. B. Nitrocellulose) in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. DMSO) als auch eine wässrige Lösung der Nukleinsäure oder eines anderen Biomoleküls umfasst. Die Matrixlösungen der Erfindung können zur Befestigung von Nukleinsäuren und anderen Biopolymeren auf irgendeiner festen Oberfläche verwendet werden, die üblicherweise als eine feste Oberfläche bei einer Nukleinsäurehybridisierung, in Immuntests und dergleichen verwendet wird. Beispielhafte feste Oberflächen umfassen Glas (z. B. optische Fasern, Objektträger und Kügelchen), Kunststoffe, Quarz und dergleichen.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein neues Mittel zur Herstellung von Biosensoren bereit, welche eine Mehrzahl von biologischen "Bindungspartnern" (Moleküle, die spezifisch an andere Moleküle binden, um einen Bindungskomplex wie z. B. Antikörper-Antigen, Lektin-Kohlenhydrat, Nukleinsäure-Nukleinsäure, Biotin-Avidin usw. zu bilden) umfassen, die mit optischen Fasern verknüpft sind. Insbesondere stellt das Verfahren ein Mittel bereit, um eine hochdichte Anordnung biologischer Bindungspartner herzustellen, wobei jede Spezies von Bindungspartner einzeln adressiert wird. Im Gegensatz zu gewissen Verfahren im früheren Stand der Technik sind die biologischen Bindungspartner, die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden, nicht auf chemisch synthetisierte Oligonukleotide oder Peptide beschränkt, sondern umfassen stattdessen Nukleinsäuren, Antikörper, Proteine, Lektine oder andere Bindungspartner, die aus Zellen, Geweben oder Organismen stammen, in ihrem nativen Zustand oder anderweitig durch die Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie modifiziert.
Insbesondere umfassen die Biosensoren der vorliegenden Erfindung eine Mehrzahl von optischen Fasern, die zusammengebündelt sind, um eine optische Faseranordnung zu bilden. Das Sensorende jeder optischen Faser oder Gruppe von optischen Fasern, welche die optische Faseranordnung umfasst, trägt eine besondere Spezies eines biologischen Bindungspartners. Optische Signale, welche durch die Bindung eines Analyten an einen biologischen Bindungspartner erzeugt werden, werden entlang der entsprechenden optischen Fasern zu einem Transmissionsende geleitet, welches an einem Detektor befestigt sein kann. Der Nachweis des Signals aus den Fasern, welche jeder Spezies von biologischem Bindungspartner entsprechen, liefert eine gleichzeitige Messung der Bindung einer Mehrzahl von Analyten.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von faseroptischen Biosensoren bereit. Das Verfahren beinhaltet die Bereitstellung einer Mehrzahl von optischen Fasern, welche zu einer Mehrzahl von getrennten Fasergruppen oder Chargen gruppiert sind. Jede Faser hat ein Sensorende und ein Transmissionsende, und die Fasern in jeder Gruppe sind derart orientiert, dass die Sensorenden gleich ausgerichtet sind. Jede Gruppe von Fasern wird dann behandelt, um eine einzige Spezies eines biologischen Bindungspartners an den Sensorenden der aufbauenden Fasern zu befestigen. Alternativ kann eine Mehrzahl von Spezies des biologischen Bindungspartners an jeder Gruppe befestigt werden, solange die Mehrzahl der Spezies der biologischen Bindungspartner, welche an einer Fasergruppe befestigt ist, von der Mehrzahl an Spezies verschieden ist, die an den anderen Fasergruppen befestigt ist.
Fasern oder Gruppen von Fasern werden dann ausgewählt und einzeln von ihren entsprechenden Chargen abgetrennt. Eine oder mehrere der einzeln abgetrennten Fasern aus jeder Gruppe werden dann an ihren Sensorenden mit anderen Fasern aus anderen Chargen kombiniert, um eine optische Faseranordnung zu erzeugen. Die Sensorenden können in einer im Wesentlichen planaren Orientierung angeordnet werden oder können lagenweise angeordnet werden, um eine geschichtete Sensorfläche zu bilden. Die optische Faseranordnung enthält Fasern, die in der Lage sind, gleichzeitig die Bindung von Komponenten einer Testprobe an die verschiedenen Bindungspartner auf den verschiedenen Fasern der optischen Faseranordnung zu testen.
Die Identität der Charge jeder Faser wird während des Bündelungsverfahrens vorzugsweise an oder nahe an dem Transmissionsende der Fasern festgehalten. Diese Transmissionsenden werden dann einzeln zu Detektoren, wie beispielsweise einer Mehrzahl optischer Sensoren, adressiert. Die Lage und räumliche Anordnung der Transmissionsenden, welche den bestimmten biologischen Bindungspartnern entsprechen, sind voneinander verschieden und bekannt.
Somit sorgt die Erfindung für die Herstellung einer hochdichten Anordnung von biologischen Bindungspartnern, bei welcher jeder Bindungspartner einzeln adressiert wird. Ein optisches Signal, welches durch die Bindung des Bindungspartners an sein Substrat, um einen Bindungskomplex zu bilden, erzeugt wird, wird für jeden einzelnen Test durch die optische Faser oder die Gruppe von Fasern zu einem Detektor geleitet. Somit ist die Bindung eines Moleküls an einen bestimmten biologischen Bindungspartner spezifisch nachweisbar. Durch ein Prüfen der adressierten Transmissionsenden der Fasern oder der Gruppen von Fasern können die adressierten Transmissionsenden einmalige Muster übertragen, welche bei der schnellen Identifizierung von Analyten in der Probe durch den Sensor helfen.
In einer Ausführungsform kann die Faseroptik Nukleinsäurebindungspartner tragen, an welche Nukleinsäuren in der Testprobe hybridisieren können. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke "Nukleinsäure" oder "Nukleinsäuremolekül" auf ein Deoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidpolymer in entweder einzel- oder doppelsträngiger Form, und dieses würde, falls es nicht anderweitig beschränkt ist, bekannte Analoge natürlicher Nukleotide umfassen, welche in einer ähnlichen Weise wie natürlich vorkommende Nukleotide wirken können.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Biosensor eine Mehrzahl von Fasern, wobei jede Faser ein Sensorende und ein Transmissionsende einschließt, das Sensorende von wenigstens einer ersten Faser daran befestigt einen ersten biologischen Bindungspartner aufweist und das Sensorende wenigstens einer zweiten Faser daran befestigt einen zweiten biologischen Bindungspartner aufweist, eine Transmissionsanordnung mit ersten und zweiten Positionen, welche die Transmissionsenden der ersten und zweiten Fasern adressieren, Mittel zum Adressieren der Transmissionsenden der ersten und zweiten Fasern zu der Transmissionsanordnung, optische Abfragemittel benachbart zu den Transmissionsenden zur Untersuchung der vergleichsweisen Befestigung von Analyten an den Sensorenden der Fasern. Die Sensorenden der ersten und zweiten Fasern können so angeordnet werden, dass diese eine geschichtete Sensorfläche bilden. Die ersten und zweiten Bindungspartner können Nukleinsäuren, z. B. DNA und cDNA, sein. Die Nukleinsäuren können auf spezifischen Bereichen von einem oder mehreren menschlichen Chromosomen kartiert wer den oder können exprimierte Sequenzen wie z. B. cDNA oder mRNA sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Targetnukleinsäuren ca. 1.000 bis 1.000.000 Nukleotide in Komplexität.
Anordnungen, welche Nukleinsäure tragen, sind besonders nützlich in Vergleichenden Genomischen Hybridisierungstests (CGH), um chromosomale Anomalien, insbesondere Zunahmen oder Abnahmen in der Kopienzahl bestimmter chromosomaler Bereiche, nachzuweisen. Bei einem Beispiel dieses Ansatzes wird eine erste Ansammlung von (Sonden-)Nukleinsäuren mit einer ersten Markierung markiert, während eine zweite Ansammlung von (Sonden-)Nukleinsäuren mit einer zweiten Markierung markiert wird. Ein Biosensor, wie er oben beschrieben wird, ist einer, bei welchem die biologischen Bindungspartner Targetnukleinsäuren sind. (Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Targetnukleinsäuren" typischerweise auf Nukleinsäuren, die an den optischen Fasern befestigt sind, welche die faseroptische Anordnung umfasst, während "Sondennukleinsäuren" jene Nukleinsäuren sind, die frei in Lösung vorliegen, welche mit den Targetnukleinsäuren hybridisieren.) Das Hybridisierungsverhältnis der Nukleinsäuren wird durch das Verhältnis der zwei (erste und zweite) Markierungen bestimmt, die an jede Faser in der Anordnung binden. Wenn es chromosomale Deletionen oder Vervielfachungen gibt, werden Unterschiede in dem Verhältnis der Signale von den zwei Markierungen nachgewiesen. Die Identifizierung der spezifischen optischen Fasern in der Anordnung, welche zu diesen Verhältnissen führt, wird die Nukleinsäuresequenz, welche die Sonde trägt, und damit die Nukleinsäuresequenz, die verändert ist, anzeigen.
Die Targetnukleinsäuren (die Nukleinsäuren, die an den optischen Fasern befestigt sind) können DNA und cDNA umfassen und können auf spezifischen Bereichen in menschlichen Chromosomen kartiert werden. Zusätzlich weisen die Targetnukleinsäuren vorzugsweise ca. 1.000 bis 1.000.000 Nukleotide in Komplexität auf. Die Komplexität der Sequenz, die zu der Targetnukleinsäure komplementär ist, beträgt vorzugsweise weniger als 1% der Gesamtkomplexität der Sequenzen in der Probe.
Die erste und zweite Markierung sind vorzugsweise fluoreszierende Markierungen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die ersten Sondennukleinsäuren mRNA oder cDNA aus einer Testzelle und die zweiten Sondennukleinsäuren umfassen mRNA oder cDNA aus einer Referenzzelle. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stammen die ersten Sondennukleinsäuren aus einem Testgenom, und die zweiten Sondennukleinsäuren stammen aus einem Referenzgenom. Das Testgenom kann Nukleinsäuren aus fötalem Gewebe oder aus einem Tumor umfassen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden Anordnungen von optischen Fasern offenbart, bei welchem das Abfrageende jeder Faser in der Anordnung eine Mehrzahl biologischer "Bindungspartner" umfasst. Jeder Bindungspartner ist an einer oder mehreren optischen Fasern befestigt, die spezifisch adressiert werden oder am Transmissionsende als mit dem bestimmten Bindungspartner verbunden identifiziert werden. Durch die richtig adressierten und abgefragten Transmissionsenden findet die Messung statt.
In einer spezifischen Ausführungsform werden Anordnungen von optischen Fasern, die Nukleinsäuremoleküle tragen, offenbart. Diese optischen Fasern weisen an ihren Abfrageenden spezifische Nukleinsäuren, wie beispielsweise Nukleinsäuren mit einer gewissen minimalen Länge (z. B. 400 bp) oder welche aus bestimmten Bibliotheken stammen (z. B. gleichmäßig entlang eines bestimmten Chromosoms angeordnet oder ein bestimmtes Gen darstellend), auf.
Es ist ein Vorteil der offenbarten Vorrichtung und des Verfahrens, dass die aufgebaute Anordnung für ein schnelles Screenen ausgedehnter Anordnungen von biologischen Bindungspartnern maßgeschneidert werden kann. Unter Verwendung der bereits angegebenen Informationen können Anordnungen zusammengestellt werden, welche gleichzeitig und schnell Proben von Nukleinsäurevariationen über gesamte Genome hinweg überwachen können. Beispielsweise könnte ein faseroptischer Sensor, der 30.000 Targetnukleinsäuren trägt, die jeweils 100 kb genomische DNA enthalten, eine vollständige Abdeckung des menschlichen Genoms ergeben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung, welche eine Gruppe von Fasern zeigt, deren Sensorenden zur gemeinsamen Behandlung zusammengebunden sind, um einen Bindungspartner zu befestigen, und deren Transmissionsenden einzeln markiert sind, um zu ermöglichen, dass die Fasern der dargestellten Gruppe von Fasern ähnlicher Gruppen unterschieden werden können, wenn später eine nachfolgende Abtrennung der Fasern von der Gruppe stattfindet.
2 stellt eine Mehrzahl von unterschiedlichen Chargen einer Behandlungslösung mit den Sensorenden der Gruppe von Fasern von 1 dar, welche zur Behandlung in eine der Faserchargen eingetaucht werden;
3 stellt unterschiedliche Gruppen von vorher behandelten Fasern dar, welche Seite an Seite mit Fasern vorliegen, die aus jeder Gruppe ausgeeinzelt wurden, um diese zu einer gemeinsamen hochdichten Anordnung zusammenzufassen.
4 stellt eine zusammengesetzte hochdichte Anordnung nur an den Sensor- und Transmissionsenden dar, mit einer Anordnung der Sensorenden in einer geschichteten Anordnung zur Beleuchtung durch das Abfragelicht und den Detektorenden, die identifiziert und einzeln zu einer Sensoranordnung adressiert werden, wobei die hier dargestellte Sensoranordnung eine entsprechenden Anordnung von Kondensorlinsen zum Übertragen der Faserbeleuchtung zu einer Detektoroberfläche aufweist;
5 stellt ein vergleichendes genomisches Hybridisierungsverfahren dar, das zum Vergleich mit zwei Proben durchgeführt wird, welche vorher mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert wurden und zusammen in einer gemeinsamen Charge zugegeben werden.
Die 6A und 6B stellen ein vergrößertes Detail der gemeinsamen Charge von 5 dar, welche an den geschichteten Abfragefasern am Sensorende der Anordnung zur Anregung der Fluorophore, die an den Bindungspartnern befestigt sind, ohne übermäßige direkte Beleuchtung der Fasern selbst, durchleuchtet wird.
Die 7A und 7B stellen einen Detektor dar, welcher in Verbindung mit einer optischen Faseranordnung oder mit irgendeiner anderen Anordnung von Lichtquellen (z. B. einer Anordnung von hybridisierten fluoreszierenden Sonden) verwendet werden kann.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die vorliegende Erfindung ist eine deutliche Verbesserung für faseroptische Biosensoren, Verfahren zur Herstellung von Biosensoren und Verfahren zur Durchführung von qualitativen und quantitativen Messungen von biologischen Molekülen unter Verwendung eines einzigartigen faseroptischen Biosensors. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Konstruktion eines Biosensors bereit, welcher eine hochdichte Anordnung von biologischen Bindungspartnern umfasst.
Die Biosensoren der vorliegenden Erfindung umfassen im Allgemeinen ein Bündel von gleich ausgerichteten optischen Fasern. Jede einzelne optische Faser oder Gruppe von Fasern innerhalb des Biosensors trägt eine einzige Spezies eines biologischen Bindungspartners. Wie hierin verwendet, sind biologische Bindungspartner Moleküle, die andere Moleküle spezifisch erkennen und binden, wodurch sie einen Bindungskomplex bilden. Typische Bindungskomplexe umfassen Antikörper-Antigen, Lektin-Kohlenhydrat, Nukleinsäure-Nukleinsäure, Biotin-Avidin, Rezeptor-Rezeptorligand usw., sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Ausdruck "spezifisch erkennen und binden" bezieht sich auf die Bindung eines biologischen Bindungspartners an ein bestimmtes Molekül und an kein anderes Molekül, welchem der biologische Bindungspartner normalerweise ausgesetzt ist. Im Fall von Nukleinsäuren tritt die spezifische Bindung durch Hybridisierung auf, und die Ausdrücke "spezifische Hybridisierung" oder "hybridisiert spezifisch mit" beziehen sich auf die Hybridisierung, bei welcher eine Sondennukleinsäure im Wesentlichen an eine Targetnukleinsäure bindet und an andere Nukleinsäuren, die in dem Biosensor vorliegen, unter definierten stringenten Bedingungen im Wesentlichen nicht bindet. Ein Fachmann wird erkennen, dass ein Verringern der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ermöglichen wird, dass Fehlpaarungen der Sequenz toleriert werden. Das Ausmaß der tolerierten Fehlpaarungen kann durch geeignete Einstellung der Hybridisierungsbedingungen gesteuert werden.
Der Ausdruck "Spezies", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen biologischen Bindungspartner, der in der Lage ist, spezifisch ein bestimmtes Targetmolekül zu binden. Somit können beispielsweise biologische Bindungspartner beide Nukleinsäuren sein; wenn sie aber unterschiedliche Nukleotidsequenzen aufweisen, so dass diese mit unterschiedlichen Molekülen spezifisch hybridisieren, werden sie als unterschiedliche Spezies angesehen. In ähnlicher Weise werden zwei Antikörper, die für verschieden Epitope spezifisch sind, als verschiedene Spezies angesehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform trägt der Biosensor zwei oder mehrere unterschiedliche Spezies biologischer Bindungspartner. Die Verwendung von zwei oder mehreren Spezies von Bindungspartnern erlaubt den gleichzeitigen Nachweis von zwei oder mehreren Analyten in einer Testprobe, wobei die Anzahl an nachweisbaren Analyten nur durch die Anzahl an unterschiedlichen biologischen Bindungspartnern, die auf dem Biosensor vorliegen, begrenzt wird. Der Biosensor kann ggf. zusätzliche optische Fasern einschließen, auf welchen biologischen Bindungspartnern fehlen. Diese zusätzlichen Fasern können Komponenten zum Nach weis verschiedener physikalischer Parameter der Testprobe, wie z. B. Temperatur oder pH, tragen oder sie können alternativ gar keine Komponente aufweisen und einfach als eine optische Leitung zur Sichtbarmachung dienen, wodurch sie als ein Endoskop dienen, um die Einführung der Biosensorsonde bei verschiedenen in vivo-Anwendungen zu steuern.
Ein Biosensor, welcher eine Mehrzahl von biologischen Bindungspartnern trägt, erlaubt den gleichzeitigen Test einer Mehrzahl von Analyten in einer Probe. Zusätzlich liefert die Messung der Bindung eines einzigen Analyten an eine Anzahl unterschiedlicher Spezies von biologischen Bindungspartnern eine Kontrolle für die nicht spezifische Bindung. Ein Vergleich des Ausmaßes der Bindung von unterschiedlichen Analyten in einer Testprobe erlaubt die Auswertung der relativen Zunahme oder Abnahme der unterschiedlichen Analyten. Aufgrund der kleinen Querschnittsfläche der optischen Fasern schließlich liefert das Zusammenbündeln zu einer optischen Anordnung einer Anzahl von optischen Fasern, die jeweils einen anderen biologischen Bindungspartner tragen, einen effektiven Mechanismus zur Herstellung von hochdichten Anordnungen biologischer Bindungspartner, welche für eine große Vielzahl von in vivo- und in vitro-Tests geeignet sind.
I. Aufbau des Biosensors
Der einzigartige faseroptische Biosensor der vorliegenden Erfindung, sein Aufbau, seine Konstruktion bzw. seine Bestandteile sind in den 1–6 dargestellt. Jeder einzelne faseroptische Biosensor ist aus einer Mehrzahl faseroptischer Stränge 10 zusammengesetzt, welche koaxial entlang ihrer Länge angeordnet sind, um eine einzelne, getrennte Konstruktion zu bilden. Der Biosensor umfasst somit eine optische Faseranordnung 14, in welcher die kleinste gemeinsame sich wiederholende Einheit ein einzelner faseroptischer Strang 10 ist.
Ein bevorzugter faseroptischer Biosensor wird in 4 dargestellt. Wie man dort sieht, umfasst ein einzelner faseroptischer Strang 10 eine einzelne optische Faser mit einem stabförmigen Schaft und zwei Faserenden, die als ein Sensorende 11 und ein Transmissionsende 12 bezeichnet werden, welche jeweils eine im Wesentlichen planare Endoberfläche bereitstellen. Der optische Faserstrang 10 ist typischerweise aus Glas oder Kunststoff zusammengesetzt und ist ein flexibler Stab, welcher in der Lage ist, Lichtenergie weiterzuleiten, die an beiden seiner Enden 11, 12 eingeführt wird. Derartige optische Fasern 10 sind allgemein bekannt und im Handel erhältlich. Alternativ kann der Anwender selbst optische Fasern gemäß den herkömmlichen Praktiken und Techniken herstellen, die in der wissenschaftlichen und industriellen Literatur berichtet werden. Dementsprechend wird die optische Faser 10 als allgemein bekannt und als solche verfügbar angesehen.
Man wird erkennen, dass die 1–6 Darstellungen sind, bei welchen die Merkmale absichtlich vergrößert und über ihren normalen Maßstab hinaus übertrieben wurden, um sowohl für Klarheit als auch für die Darstellung extremer Details zu sorgen. Typischerweise weist die herkömmliche optische Faser einen Querschnittsdurchmesser von 5–500 Mikrometern auf und wird routinemäßig in Längen eingesetzt, die von Zentimetern (z. B. im Labor) bis zu Kilometern (z. B. auf dem Gebiet der Telekommunikation) reichen. Wenn sie in einem Biosensor verwendet werden, reichen die optischen Fasern typischerweise jedoch vorzugsweise in der Länge von Zentimetern bis zu ca. einem Meter.
Auch wenn die optische Faser 10 in den 1–4 als ein zylindrischer verlängerter Stab dargestellt wird, welcher im Wesentlichen kreisförmige Endoberflächen aufweist, gibt es kein Erfordernis oder eine Voraussetzung, dass diese spezielle Konfiguration beibehalten wird. Im Gegenteil kann die optische Faser polygonal oder entlang ihrer Länge asymmetrisch geformt sein, am Sensorende oder Transmissionsende spezielle Muster und Formen bereitstellen und muss keine Endoberfläche liefern, die im Wesentlichen planar ist. Nichtsdestotrotz ist die optische Faser in einer bevorzugten Ausführungsform im Wesentlichen zylindrisch.
Jede optische Faser 10 kann individuell entlang ihrer Länge axial umhüllt sein. Die Umhüllung kann irgendein Material sein, welches einen niedrigeren Brechungsindex aufweist und eine Übertragung von Lichtenergiephotonen aus der optischen Faser 10 in die äußere Umgebung verhindert. Die Umhüllung kann somit aus einer Vielzahl von unterschiedlichen chemischen Formulierungen zusammengesetzt sein, einschließlich verschiedener Gläser, Silikone, Kunststoffe, Gewebe, Beschichtungen und Abschirmungsmaterial mit unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung und Formulierung. Verfahren zur Umhüllung, einschließlich Abscheidung, Extrusion, Spritzlackieren und Umkleiden, stehen in der Wissenschaft und Industrie zur Verfügung, und jedes dieser bekannten Verfahren kann ausgewählt werden, um die Bedürfnisse und Anforderungen des Anwenders zu erfüllen.
Der Anwender hat eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Auswahl, was die Konfiguration des Sensorendes 11 der optischen Faser 10 betrifft. Wie oben angegeben, kann das Sensorende 11 eine Oberfläche darstellen, die im Wesentlichen planar und glatt ist. Alternativ kann das Sensorende 11 eine Endoberfläche bereitstellen, die im Wesentlichen konvex oder konkav ist.
Man wird erkennen, dass der Bereich und die Vielfalt der dimensionalen und konfigurationalen Variation der optischen Faser 10 nur durch die Fähigkeit des Anwenders begrenzt wird, anschließend einen biologischen Bindungspartner auf dem geplanten Sensorende 11 des Stranges anzuordnen und zu immobilisieren. Die Verwendung von konkaven oder konvexen Sensorenden 11 wird einen größeren Oberflächenbereich bereitstellen, auf welchem ein biologischer Bindungspartner immobilisiert werden kann, wodurch die Effizienz (das Signal zu Rauschen-Verhältnis pro optischer Faser) des Biosensors erhöht wird.
Während die einzelne sich wiederholende Komponente des faseroptischen Biosensors die individuelle optische Faser 10 ist, ist es die Ansammlung einer Mehrzahl solcher Fasern, die eine diskrete optische Faseranordnung 14 bilden, welche den gleichzeitigen Nachweis einer Mehrzahl von Analyten erlaubt. Wenn die optischen Fasern angeordnet werden, um eine diskrete optische Faseranordnung 14 zu bilden, werden die gleich ausgerichteten Sensorenden 11 der Fasern zusammen angeordnet, um eine Sensorfläche 13 zu bilden. Ein typischer Biosensor wird in 4 und in den 6A und 6B dargestellt, bei welchen die Sensorfläche 13 in einer übertriebenen, in hohem Maße vereinfachten Ansicht ohne Rücksicht auf den Maßstab erscheint. Die optische Faseranordnung 14 umfasst einen gleichmäßig stabförmigen Sammelkörper, welcher eine Sensorfläche 13 und eine Transmissionsfläche 15 bildet.
In der Praxis schätzt man, dass es typischerweise 1.000–3.000 faseroptische Stränge in einer herkömmlichen bildgebenden Faser von 0,5 mm Durchmesser und nahezu 1 Million Stränge pro Quadratmillimeter gibt. Die Gesamtzahl der einzelnen faseroptischen Stränge, welche die optische Faseranordnung 14 der vorliegenden Erfindung bilden, wird ungefähr genauso groß sein, wobei die Gesamtzahl mit dem Querschnittsdurchmesser jeder optischen Faser, dem Packungsmuster der einzelnen optischen Fasern in dem Sammelkörper und der Dicke des Hüllmaterials, wenn ein solches eingesetzt wird, variiert. Man wird erkennen, dass ein Biosensor mit einem Quadratmillimeter, welcher nahezu 1 Million Stränge enthält, bei welchen Gruppen von ca. 33 optischen Fasern jeweils mit einer anderen Spezies eines biologischen Bindungspartners markiert sind, eine Sensorfläche 13 erzeugen wird, die ungefähr 30.000 verschiedene Spezies von biologischen Bindungspartnern auf 1 Quadratmillimeter umfasst. Wie oben erklärt wurde, könnte ein solcher Sensor biologische Nukleinsäurebindungspartner bereitstellen, welche das gesamte menschliche Genom in Abständen von 10 Megabasen abdecken.
Die Sensorfläche 13 muss nicht als eine planare Oberfläche angeordnet sein. Dagegen können die einzelnen optischen Fasern "geschichtet" sein, so dass diese aus der optischen Anordnung mit unterschiedlichen Abständen hervorstehen. Dieses wird die Exposition von jedem Sensorende 11 einer optischen Faser sowohl an die Probenflüssigkeit als auch an eine durchleuchtende Lichtquelle 19 maximieren, wie in den 6A und 6B gezeigt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Sensorenden 11 der optischen Fasern, welche die optische Faseranordnung 14 umfasst, in einem zufälligen oder willkürlichen Muster zusammengebündelt, um die Sensorfläche 13 zu bilden. Alternativ kann die Anordnung der Sensorenden 11 in hohem Maße geordnet sein, wobei das Sensorende von jeder Faser eine bestimmte vorbestimmte Lage in der Sensorfläche 13 einnimmt. Wie oben angegeben wurde, weisen die Sensorenden 11 der optischen Fasern 10, welche die Sensorfläche 13 der optischen Faseranordnung 14 bilden, daran befestigt einen biologischen Bindungspartner auf.
Jede optische Faser oder Gruppe von Fasern, welche die optische Faseranordnung 14 umfasst, kann eine andere Spezies eines biologischen Bindungsmoleküls tragen. Auch wenn die Verwendung einer einzelnen Spezies eines biologischen Bindungspartners pro optischer Faser oder Gruppe von Fasern bevorzugt ist, kann alternativ jede optische Faser oder Gruppe von Fasern eine Mehrzahl von biologischen Bindungspartnern tragen, solange wie diese Mehrzahl von den biologischen Bindungspartnern oder der Mehrzahl von biologischen Bindungspartnern abweicht, die auf anderen Fasern oder Gruppen von Fasern vorliegen, welche die optische Faseranordnung 14 umfasst. Die Fasern, welche die gleiche Spezies von Bindungspartner tragen, können physikalisch zusammengruppiert werden, wodurch getrennte Bereiche der Sensorfläche 13 erzeugt werden, die durch das Vorliegen eines bestimmten biologischen Bindungspartners gekennzeichnet sind, oder alternativ können die Fasern, die verschiedene Bindungspartner tragen, vermischt werden, wobei die Sensorfläche 13 eine relativ gleichmäßige oder willkürliche oder zufällige Verteilung der Spezies der biologischen Bindungspartner repräsentiert.
Die Transmissionsfläche 15 der optischen Anordnung kann eine im Wesentlichen planare optische Anordnung darstellen, an welcher jegliche weiteren Befestigungen fehlen. Jedoch ist in einer bevorzugten Ausführungsform die Transmissionsfläche 15 dauerhaft oder lösbar an einem Detektor 20 befestigt, wie in 4 dargestellt ist. Der Detektor kann eine oder mehrere Linsen zum Fokussieren und zur Vergrößerung eines optischen Signals umfassen, das entlang der optischen Fasern übertragen wird, welche die optische Faseranordnung 14 umfasst. Der Detektor kann zusätzlich eine Vorrichtung umfassen, um das optische Signal in ein digitales oder analoges elektrisches Signal umzuwandeln. Bevorzugte Detektoren umfassen Fotozellen (Fotomultiplier) oder ladungsgekoppelte Vorrichtungen (CCDs). Ein einzelner Fotomultiplier oder ein CCD-Element kann angeordnet werden, um das gesammelte Signal zu messen, das von der gesamten Transmissionsfläche 15 des Biosensors geliefert wird. Alternativ kann eine CCD-(oder eine andere)Kamera auf die Transmissionsfläche des Biosensors fokussiert werden, um gleichzeitig Signale von allen optischen Fasern abzulesen, was eine individuelle Auswertung des Signals von jeder Faser oder Gruppe von Fasern erlaubt. In einer anderen Ausführungsform werden Mehrfach-CCD-Elemente oder Fotoröhren verwendet, um jeweils ein Signal nachzuweisen, welches das Binden einer einzigen Spezies des biologischen Bindungspartners, der auf der Sensorfläche 13 des Biosensors vorliegt, darstellt. Somit ist der Detektor vorzugsweise so angeordnet, dass er das Signal von einzelnen optischen Fasern 10 oder von Gruppen von optischen Fasern abliest, wobei alle optischen Fasern 10 in einer Gruppe dieselbe Spezies des biologischen Bindungspartners tragen.
Zusätzlich zum Nachweisen von optischen Signalen aus einer faseroptischen Anordnung kann der Detektor 20 im Allgemeinen verwendet werden, um optische Signale aus irgendeiner Anordnung von Lichtquellen zu amplifizieren und nachzuweisen. So kann beispielsweise die Anordnung von Lichtquellen eine Anordnung von fluoreszierenden Punkten sein, wie sie auf der Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten Sonden, die mit Anordnungen von Targetnukleinsäuren hybridisieren, beruht. In ähnlicher Weise kann die Anordnung in fluoreszenzmarkierten Antikörpern, welche an eine Anordnung von Proteinen gebunden sind, an welche die Antikörper binden, oder umgekehrt in fluoreszenzmarkierten Proteinen, die an eine Anordnung von Antikörpern gebunden sind, bestehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform, die für solche Anwendungen geeignet ist, welche in den 7A und 7B dargestellt ist, kann der Detektor 20 eine zusammengesetzte Objektivlinse 31 umfassen, die in einer Anordnung von einzelnen Linsen 32 besteht. Die einzelnen Linsen sind derart angeordnet, dass jede Linse auf eine Stelle 34 in der Anordnung fokussiert ist, wo die Fluoreszenz gemessen werden soll. Der Detektor kann wahlweise einen Strahlungsteiler 35, eine zweite Linse 36, einen optischen Filter 37 und eine Nachweisvorrichtung wie beispielsweise eine Kamera 38 umfassen. Der Strahlungsteiler wird dann verwendet, um ein Anregungslicht 39 auf die Anordnung von Lichtquellen zu lenken. Die resultierende Fluoreszenz an jedem Punkt wird dann durch die zusammengesetzte Objektivlinse 31 fokussiert, gegebenenfalls durch eine zweite Linse fokussiert, gegebenenfalls durch einen optischen Filter gefiltert und dann entweder mit dem Auge oder durch ein Nachweismittel wie beispielsweise eine Kamera nachgewiesen.
Das zusammengesetzte Objektiv kann gegossen, gepresst, geätzt oder aus Glas, Kunststoff, Quarz oder anderen Materialien, die als für die Linsenherstellung geeignet bekannt sind, geschliffen worden sein. Die zusammengesetzte Linse kann als ein einzelnes Stück gebildet werden oder kann alternativ zusammengesetzt werden, indem einfache Linsen aneinander befestigt werden, um ein zusammengesetztes Objektiv zu bilden.
II. Herstellung des Biosensors
Die 1–4 stellen ein Verfahren zur Herstellung eines Biosensors dar, welcher eine Mehrzahl von optischen Fasern umfasst, die biologische Bindungspartner tragen. Im Allgemeinen beinhaltet das Verfahren die Bereitstellung einer Mehrzahl von optischen Fasern, wobei jede Faser ein Sensorende und ein Transmissionsende aufweist, wobei eine bestimmte Spezies eines biologischen Bindungspartners an dem Sensorende jeder Faser befestigt ist. Fasern mit unterschiedlichen Bindungspartnern werden kombiniert, um eine optische Faseranordnung zu bilden, wobei die Fasern gleich ausgerichtete Sensorenden zum gleichzeitigen Test einer Probe aufweisen. Die Transmissionsenden der kombinierten einzelnen Fasern werden zur Abfrage adressiert, um den faseroptischen Sensor zu erzeugen.
1 stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform dar, welche im Detail ein Verfahren angibt, um die optischen Fasern mit befestigten biologischen Bindungspartnern bereit zu stellen. Eine Mehrzahl optischer Fasern 10 wird bereitgestellt, wobei jede Faser ein Sensorende 11 und ein Transmissionsende 12 aufweist. Die Fasern werden zusammen angeordnet, um eine Mehrzahl von Fasergruppen oder Bündeln 16 zu bilden, wie in 2 gezeigt ist, wobei die Fasern in jedem Bündel koaxial nebeneinander angeordnet sind, wobei die Sensorenden 11 jeder Faser am selben Ende des Bündels gleich ausgerichtet sind. Die Fasern, welche jedes Bündel umfasst, können gegebenenfalls markiert sein 17, um ihre Identifizierung zu ermöglichen, wenn sie anschließend aus dem Bündel entfernt werden.
Wie in 2 gezeigt wird, wird jedes Bündel von Fasern getrennt behandelt, um eine bestimmte Spezies eines biologischen Bindungspartners 18 an den Sensorenden 11 der optischen Fasern, welche das bestimmte Bündel umfasst, zu befestigen. Viele Verfahren zur Immobilisierung von biologischen Bindungspartnern 18 auf einer Vielzahl von festen Oberflächen sind im Stand der Technik bekannt. Im Allgemeinen kann die gewünschte Kompo nente kovalent gebunden werden oder nicht kovalent durch unspezifische Bindung befestigt werden.
Bei der Herstellung des Sensorendes 11 kann zur Befestigung des Bindungspartners eine Vielzahl unterschiedlicher Materialien, insbesondere als Laminate, eingesetzt werden, um verschiedene Eigenschaften zu erhalten. Beispielsweise können Proteine (z. B. Rinderserumalbumin) oder Mischungen von Makromolekülen (z. B. Denhardt's Lösung) eingesetzt werden, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden, eine kovalente Konjugation zu vereinfachen, den Signalnachweis zu verstärken oder dergleichen.
Wenn eine kovalente Bindung zwischen einem biologischen Bindungspartner und der Oberfläche des Sensorendes 11 gewünscht wird, wird die Oberfläche gewöhnlich polyfunktional sein oder in der Lage sein, polyfunktional gemacht zu werden. Funktionale Gruppen, die auf der Oberfläche vorliegen können und zur Verknüpfung verwendet werden können, können Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogruppen, ethylenische Gruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dergleichen umfassen.
Die kovalente Verknüpfung des Bindungspartners mit dem Sensorende kann direkt oder über einen kovalenten Linker erfolgen. Im Allgemeinen sind Linker entweder hetero- oder homobifunktionale Moleküle, die zwei oder mehrere reaktive Stellen enthalten, welche jeweils eine kovalente Bindung mit dem entsprechenden Bindungspartner bilden können. Linker, die zum Verbinden biologischer Bindungspartner geeignet sind, sind den Fachleuten wohlbekannt. Beispielsweise können biologische Bindungspartner über einen Peptidlinker, über einen Kohlenstoffkettenlinker mit gerader oder verzweigter Kette oder durch einen heterozyklischen Kohlenstoff verbunden werden. Heterobifunktionale Vernetzungsreagenzien, wie z. B. aktive Ester von N-Ethylmaleimid, wurden weithin verwendet. Siehe z. B. Lerner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 78: 3403–3407 (1981) und Kitagawa et al., J. Biochem. 79: 233–236 (1976), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Die Art und Weise, eine große Vielzahl von Verbindungen mit verschiedenen Oberflächen zu verknüpfen, ist wohlbekannt und in der Literatur reich illustriert. Proteine können beispielsweise mit Linkern oder mit funktionellen Gruppen auf dem Sensorende 11 verknüpft werden, indem diese über ihre Amino- oder Carboxyltermini oder über Seitengruppen auf verschiedenen aufbauenden Aminosäuren gekoppelt werden. So ist die Kopplung über eine Disulfidverknüpfung an ein Cystein häufig.
In ähnlicher Weise sind Methoden zur Immobilisierung von Nukleinsäuren durch Einführung verschiedener funktioneller Gruppen auf den Molekülen bekannt (siehe z. B. Bischoff et al., Anal. Biochem. 164: 336–344 (1987); Kremsky et al., Nuc. Acids Res. 15: 2891–2910 (1987), worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird). Modifizierte Nukleotide können auf dem Target platziert werden, indem PCR-Primer verwendet werden, die das modifizierte Nukleotid enthalten, oder durch enzymatisches Markieren der Enden mit modifizierten Nukleotiden.
Bevorzugte Methoden der Immobilisierung der Nukleinsäuren und anderer Biomoleküle auf festen Oberflächen beinhalten die Verwendung einer Matrixlösung, welche die interessierende Nukleinsäure und ein organisches oder anorganisches Matrixpolymer umfasst. Typischerweise ist die Matrixlösung eine einphasige Lösung, die sowohl das Matrixpolymer als auch die Nukleinsäure oder das andere Biomolekül umfasst. In einigen Ausführungsformen wird die Matrixlösung hergestellt, indem das Matrixpolymer in einem geeigneten Lösungsmittel und eine wässrige Lösung des Biomoleküls gemischt werden. Beispielhafte Lösungsmittel für das Matrixpolymer, die zu diesem Zweck nützlich sind, umfassen organische polare Lösungsmittel wie z. B. DMSO, DMF und Tetramethylensulfon, wie auch Acetonitril/Wasserlösungen und Bligh- und Dyer-Einphasenlösungen.
Alternativ kann eine zweiphasige Lösung verwendet werden, welche eine konzentrierte wässrige Lösung der gewünschten Nukleinsäure oder eines anderen Biomoleküls und das Matrixpolymer in einem organischen unpolaren Lösungsmittel wie z. B. Xylol, Toluol oder Chloroform umfasst. In diesen Ausführungsformen muss die zweiphasige Lösung beschallt oder anderweitig emulgiert werden, um den Kontakt zwischen dem Matrixpolymer und der Nukleinsäure sicherzustellen.
Eine große Vielzahl von organischen und anorganischen Polymeren, sowohl natürliche als auch synthetische, kann als das Matrixpolymermaterial in der Lösung eingesetzt werden. Veranschaulichende Polymere, welche vorzugsweise eine geringe Fluoreszenz aufweisen, umfassen Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Rayon, Nylon, Poly(vinylbutyrat), Polyvinylidendiflurorid (PVDF), Silikone, Polyformaldehyd, Cellulose, Celluloseacetat, Nitrocellulose und dergleichen.
Die Matrixlösungen der Erfindung können zur Befestigung von Nukleinsäuren und anderen Biopolymeren an jeder festen Oberfläche, die üblicherweise als eine feste Oberfläche bei einer Nukleinsäurehybridisierung, Immuntests und dergleichen verwendet wird, benutzt wer den. Beispielhafte feste Oberflächen umfassen Glas (z. B. optische Fasern, Objektträger und Kügelchen) Kunststoffe, Quarz und dergleichen.
Ein besonderes bevorzugtes Verfahren zur Befestigung von biologischen Molekülen wie z. B. Nukleinsäuren an dem Sensorende einer optischen Faser oder einer anderen festen Oberfläche besteht in dem Mischen einer Lösung von Nitrocellulose in DMSO mit dem biologischen Molekül oder mit einer hoch konzentrierten wässrigen Lösung des Moleküls. Die resultierende Matrixlösung wird auf das Sensorende der Faser getüpfelt und getrocknet. Das Verhältnis von Nitrocellulose zu biologischem Molekül wird vorzugsweise eingestellt, um sicherzustellen, dass das biologische Molekül in der Lage ist, spezifisch mit seinem Bindungspartner (z. B. einer komplementären Nukleinsäure) zu binden, wenn es an der Oberfläche befestigt ist. Im Fall von Nukleinsäuren liegt das Verhältnis von Matrixpolymer (z. B. Nitrocellulose) zu Nukleinsäure typischerweise zwischen ca. 1 : 10 und ca. 2 : 1 pro Gewicht, gewöhnlich zwischen ca. 1,5 : 10 bis ca. 1 : 1 pro Gewicht.
Eine beispielhafte Vorschrift ist wie folgt. Eine Stammlösung, bestehend aus ca. 2 g Nitrocellulose gelöst in 50 ml DMSO wird ca. 100 : 1 mit DMSO verdünnt. Die verdünnte Lösung wird dann mit einer geeigneten Menge der Nukleinsäure gemischt, so dass das endgültige Verhältnis von Nitrocellulose zu Nukleinsäure in dem oben angegebenen Bereich liegt. Beispielsweise können 4 μl der verdünnten DMSO-Lösung (umfassend 1,6 μg Nitrocellulose) mit 10 μg DNA gemischt werden. Alternativ kann die DMSO-Lösung mit einer konzentrierten wässrigen Lösung der DNA gemischt werden, um das gewünschte Verhältnis zu erreichen. Die Nukleinsäure muss nicht markiert werden oder absolut rein sein, und die wässrige Lösung kann Proteine wie beispielsweise Restriktionsenzyme enthalten. Die Matrixlösung, welche die Nitrocellulose und die Nukleinsäure enthält, wird wenn nötig erwärmt, um die Nukleinsäure zu denaturieren, und auf eine saubere, mit Säure gewaschene Oberfläche aufgetragen. Die Punkte werden dann für ca. 0 bis ca. 60 Minuten bei ca. 70°C erwärmt, um die Lösung zu trocknen.
Was 3 betrifft, werden, nachdem die biologischen Bindungspartner 18 an den Sensorflächen 11 der optischen Fasern 10, die jedes Bündel umfasst, befestigt sind, einzelne Fasern oder Gruppen von Fasern aus jedem Bündel abgetrennt. In 3 sind nur vier Faserbündel F₁–F₄ dargestellt. In dem Verlauf der Abtrennung aus jedem der entsprechenden Faserbündel F₁–F₄ entstehen die einzelnen Fasern 10_a –10_d . Die entsprechenden Fasern werden zu der optischen Faseranordnung 14 umgruppiert.
Die einzelnen Fasern oder Gruppen von Fasern können vor der Abtrennung von dem ursprünglichen Bündel markiert werden, um die Identifizierung des Bindungspartners, welcher an eine bestimmte Faser oder Gruppe gebunden ist, während der späteren Schritte des Zusammenbaus zu erleichtern. Die abgetrennten Fasern oder Gruppen von Fasern werden wieder mit Fasern oder Gruppen von Fasern kombiniert, die aus anderen Bündeln abgetrennt wurden, um eine optische Faseranordnung 14 zu bilden, welche eine Mehrzahl von Fasern oder Gruppen von Fasern umfasst, wobei jede Faser oder Gruppe von Fasern eine andere Spezies eines biologischen Bindungspartners trägt.
4 stellt dar, dass Mitglieder der optischen Faseranordnung 14 derart orientiert sind, dass die Sensorenden 11 von allen aufbauenden optischen Fasern 10 am selben Ende der optischen Faseranordnung 14 gleich ausgerichtet sind, wodurch sie eine Sensorfläche 13 bilden. Die Fasern können in einer im Wesentlichen planaren Konfiguration oder geschichtet angeordnet sein, wie in den 6A und 6B dargestellt wird.
Die Fasern können an der Sensorfläche 13 in einer im Wesentlichen zufälligen oder willkürlichen Weise gebündelt sein, wobei die relative Lage eines Sensorendes 11 einer bestimmten Faser innerhalb der Sensorfläche 13 durch den Zufall festgelegt wird. Alternativ können die Fasern in der Faseranordnung in einer in hohem Maße geordneten Weise angeordnet werden, so dass die Lage jeder bestimmten optischen Faser 10 in der Sensorfläche 13 vorher festgelegt wird.
Die Transmissionsenden 12 der optischen Fasern, welche die optische Faseranordnung 14 umfasst, werden adressiert, um eine Abfrage und einen Nachweis der Bindungsereignisse an die biologischen Bindungspartner, die an der Sensorfläche 13 befestigt sind, zu erlauben. Das Adressieren wird durch irgendeines von einer Anzahl von Mitteln erreicht, die den Fachleuten wohlbekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Transmissionsenden 12 von einzelnen optischen Fasern oder Gruppen von optischen Fasern, die alle dieselbe Spezies eines biologischen Bindungspartners tragen, räumlich adressiert. Dieses umfasst ein örtliches Fixieren der optischen Fasern oder der Bündel von optischen Fasern an festgelegten Orten in Bezug auf die anderen optischen Fasern oder Bündel von optischen Fasern, welche die optische Faseranordnung 14 umfasst, siehe z. B. 4. Am typischsten kann dieses erreicht werden, indem die Faseranordnung an einem faseroptischen Verbindungsstück und einer Pressklemme (ferrule) befestigt wird (siehe z. B. AMP, Inc. Harrisburg, PA).
Alternativ können die Transmissionsenden 12 adressiert werden, indem das Transmissionsende jeder optischen Faser 10 oder eines Bündels von optischen Fasern, welche einen bestimmten biologischen Bindungspartner tragen, an einem einzelnen Detektor befestigt wird. Von jedem Detektor ist anschließend bekannt, dass er mit einem bestimmten biologischen Bindungspartner verbunden ist, und es besteht kein Bedarf, eine festgelegte räumliche Beziehung zwischen irgendwelchen Transmissionsenden 12 beizubehalten.
Der Nachweis eines Signals aus dem Biosensor (der optischen Anordnung) kann durch visuelle Inspektion der Transmissionsfläche 15 der optischen Faseranordnung 14 oder durch die Verwendung von einem oder mehreren Detektoren 20 erreicht werden. Wie oben angegeben, kann die Transmissionsfläche dauerhaft oder lösbar an einer einzelnen optischen Linse oder einem System von mehreren optischen Linsen befestigt sein. Die Linse oder die Linsen können angeordnet sein, um ein optisches Signal von der gesamten Transmissionsfläche 15 oder von ausgewählten Unterregionen der Transmissionsfläche zu fokussieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Linsen so angeordnet, dass sie jeweils ein optisches Signal aus dem Bereich der Transmissionsfläche 15 fokussieren, das einem einzelnen biologischen Bindungspartner entspricht. Im Extremfall wird das Signal für jede optische Faser, welche die optische Faseranordnung 14 umfasst, individuell fokussiert.
Wieder kann bei einer vorliegenden Linse oder einem Linsensystem das Signal einfach visuell nachgewiesen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jedoch die Verwendung von Detektoren in Erwägung gezogen. Bevorzugte Detektoren sind Vorrichtungen, die ein optisches Signal in ein digitales oder analoges elektrisches Signal umwandeln. Typische Detektoren gehören zu den zwei allgemeinen Typen: Fotozellen und ladungsgekoppelte Vorrichtungen (CCDs). Ein einzelner Fotomultiplier oder ein CCD-Element können verwendet werden, um das Gesamtsignal zu messen, das von der gesamten Transmissionsfläche 15 des Biosensors geliefert wird. Bevorzugter werden jedoch Mehrfach-CCD-Elemente oder Fotoröhren verwendet, um jeweils ein Signal nachzuweisen, welches die Bindung einer einzelnen Spezies des biologischen Bindungspartners, die auf der Sensorfläche 13 der optischen Faseranordnung 14 vorliegt, darstellt.
Das Detektorsystem kann mit einem computerbetriebenen Datenaufnahmesystem und einem Analyseprogramm eingesetzt werden. In dieser Ausführungsform können unter der Voraussetzung eines vollautomatisierten, computergesteuerten Verarbeitungsgeräts und Messsystems, die Daten, die von dem Biosensor erhalten werden, zu unmittelbar nützlicher Information verarbeitet werden. Durch Verwendung eines derart vollautomatisierten, computerbe triebenen Geräts und Analysesystems können nicht nur eine Vielzahl unterschiedlicher Messungen durchgeführt und verschiedene Parameter gleichzeitig innerhalb einer einzelnen Flüssigkeitsprobe gemessen werden, sondern können ebenfalls viele verschiedene Flüssigkeitsproben individuell der Reihe nach zum Nachweis von mehreren interessierenden Analyten gleichzeitig analysiert werden – wobei jede individuelle Flüssigkeitsprobe serienmäßig auf ihren Vorgänger folgt.
II. Methoden der Verwendung
Eine Vielzahl von in vitro-Messungen und analytischen Bestimmungen kann durchgeführt werden, indem ein faseroptischer Biosensor verwendet wird, der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde. In vitro-Anwendungen und Testtechniken können gleichzeitig durchgeführt werden, indem eine oder mehrere Flüssigkeitsproben verwendet werden. Jede gleichzeitig durchgeführte Messung oder Bestimmung von unterschiedlichen interessierenden Analyten wird individuell, genau und präzise durchgeführt. Die beobachteten Ergebnisse werden dann korreliert und/oder verrechnet, um präzise Informationen in Bezug auf eine Vielzahl unterschiedlicher Parameter oder Liganden individuell bereitzustellen.
Der faseroptische Biosensor der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls unter einer Vielzahl von unterschiedlichen in vivo-Bedingungen sowohl bei Menschen als auch Tieren eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung liefert genaue und präzise Messungen und Bestimmungen unter Verwendung eines einzelnen diskreten faseroptischen Biosensors statt des herkömmlichen Bündels verschiedener Sensoren, die für begrenzte Zwecke miteinander verbunden wurden. Die vorliegende Erfindung stellt somit einen Sensor mit minimalem Durchmesser für eine Einführung im Katheter in vivo bereit: ein minimales Eindringen in den Blutstrom oder die Gewebe des lebenden Patienten zu Testzwecken, und ein Minimum an Beschwerden und Schmerzen für den lebenden Patienten, bei einer maximalen Genauigkeit und Präzision wie auch einer Mehrzahl von Messungen von Parametern sowohl in qualitativer als auch/oder quantitativer Hinsicht.
Der Biosensor der vorliegenden Erfindung kann zum Nachweis einer großen Vielzahl von Analyten benutzt werden, was von dem ausgewählten bestimmten biologischen Bindungspartner abhängt. Wie oben angegeben, sind biologische Bindungspartner Moleküle, die andere Moleküle spezifisch erkennen und binden, wodurch sie einen Bindungskomplex bilden. Typische Bindungskomplexe umfassen Antikörper-Antigen, Lektin-Kohlenhydrat, Nukleinsäure-Nukleinsäure, Biotin-Avidin, Rezeptor-Rezeptorligand usw., sind aber nicht darauf beschränkt. Jedes Element des Bindungskomplexes kann als das biologische Bindungselement verwendet werden, das an dem Sensorende 11 der optischen Fasern, welche der Biosensor umfasst, befestigt wird. So kann beispielsweise, wenn gewünscht wird, einen Antikörper in einer Probe nachzuweisen, das entsprechende Antigen an dem Sensorende befestigt werden. Umgekehrt kann, wo gewünscht wird, das Antigen in der Probe nachzuweisen, der Antikörper an dem Sensorende befestigt werden.
Die Auswahl von Bindungspartnern für einen bestimmten Test ist den Fachleuten wohlbekannt. Wenn Proteine nachgewiesen werden sollen, sind typischerweise Antikörper als der biologische Bindungspartner am meisten bevorzugt. Wenn enzymatische Substrate nachgewiesen werden sollen, sind Enzyme bevorzugte biologische Bindungspartner, und wenn Nukleinsäuren nachgewiesen werden sollen, sind Nukleinsäurebindungspartner am meisten bevorzugt. So wurden beispielsweise faseroptische Biosensoren beschrieben, die Enzyme wie z. B. Xanthinoxidase und Peroxidase benutzen, um Hypoxanthin und Xanthin nachzuweisen (Hlavay et al., Biosensors and Bioelectronics 9(3): 189–195 (1994), welche alkalische Phosphatase verwenden, um Pestizide auf Organophosphorbasis nachzuweisen (Gao et al. Proceedings – Lasers and Electro-Optics Society, Annula Meeting, 8(4): Abstract 20782 (1994), und welche Antikörper oder DNA-bindende Proteine verwenden (Anderson et al., Fiber Optic Mecical and Fluorescent Sensors and Applications, Proc. S. P. I. E. 1648: 39–43 (1992).
Natürlich kann der Biosensor so gestaltet werden, dass er gleichzeitig mehrere unterschiedliche Klassen von Analyten nachweist. So kann der Sensor eine Kombination von zwei oder mehreren verschiedenen Klassen von biologischen Bindungspartnern tragen. Die Sensorfläche 13 wird einen oder mehrere Bindungspartner tragen, die beispielsweise ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäuren, Proteinen, Antikörpern, Kohlenhydraten, Biotin, Avidin und Lektinen.
In der einfachsten Anwendung kann der Biosensor der vorliegenden Erfindung benutzt werden, um einen einzigen Analyten in einer Testprobe nachzuweisen. Die Testprobe kann in vivo, in Kultur oder in vitro vorliegen. Der Test kann einfaches Vorliegen oder Fehlen des Analyten registrieren oder kann die Menge des Analyten, die in der Probe vorliegt, quantifizieren.
Der Test kann entweder in einem direkten oder in einem kompetitiven Format durchgeführt werden. In einem direkten Format wird die Menge des Analyten direkt bestimmt, indem der Analyt gemessen wird, der an den biologischen Bindungspartner gebunden ist. In einem kompetitiven Format liegt ein bekannter Analyt in der Probe vor, und der Testanalyt wird durch seine Fähigkeit nachgewiesen, mit dem bekannten Analyten um die biologischen Bindungspartner, die auf der Sensorfläche 13 vorliegen, zu konkurrieren.
In einem bevorzugten Verfahren der Anwendung leiten die optischen Fasern 10, welche die optische Faseranordnung 14 umfasst, ein optisches Signal, das ein Anzeichen ist für die Bindung zwischen einem biologischen Bindungspartner auf der Sensorfläche 11 und dem Analyten in der Probe. Das optische Signal kann durch eine Anzahl von Mitteln, die den Fachleuten bekannt sind, erzeugt werden. Typischerweise wird das optische Signal durch eine fluoreszierende, lumineszente oder kolorimetrische Markierung erzeugt, die an dem Sensorende 11 der optischen Faser 10 vorliegt. Typischerweise ist die Konzentration der Markierung an dem Sensorende der optischen Faser eine Funktion der Konzentration des Analyten, der spezifisch an den biologischen Bindungspartner bindet, der auf diesem Sensorende vorliegt.
Methoden der Bereitstellung einer Markierung, deren Konzentration eine Funktion der Menge eines Analyten ist, welcher spezifisch mit dem biologischen Bindungspartner assoziiert ist, sind den Fachleuten wohlbekannt. In dem einfachsten Ansatz ist der Analyt selbst markiert. Ein Binden des Analyten an den Bindungspartner bringt dann die Markierung in die Nähe des Sensorendes 11, an welchem der Bindungspartner befestigt ist. Alternativ kann ein markierter "blockierender" Analyt in der Testprobe bereitgestellt werden oder vorab an den Biosensor gebunden werden. Ein Verdrängen des markierten "blockierenden" Analyten durch den nicht markierten Testanalyten in der Probe erzeugt eine Verringerung der Markierung, die an das Sensorende gebunden ist, wobei die Verringerung zu der Konzentration des nicht markierten Analyten in der Testprobe proportional ist.
Andere Ansätze können einen zweiten biologischen Bindungspartner verwenden, welcher selbst markiert ist. Der erste biologische Bindungspartner, der an dem Sensorende befestigt ist, bindet und immobilisiert dadurch den Analyten. Der zweite, markierte Bindungspartner bindet dann an den Analyten, der auf dem Sensorende immobilisiert ist, wodurch die Markierung in enge Nähe zu dem Sensorende gebracht wird, wo sie nachgewiesen werden kann.
Lumineszierende Markierungen werden nachgewiesen, indem das Licht gemessen wird, das durch die Markierung erzeugt wird und entlang der optischen Faser geleitet wird. Lumineszierende Markierungen erfordern typischerweise keine Beleuchtung von außen.
Im Gegensatz dazu erfordern kolorimetrische oder fluoreszierende Markierungen typischerweise eine Lichtquelle. Kolorimetrische Markierungen erzeugen typischerweise eine Zunahme in der optischen Extinktion und/oder eine Veränderung in dem Absorptionsspektrum der Lösung. Kolorimetrische Markierungen werden gemessen, indem die Änderung in dem Absorptionsspektrum oder der Gesamtextinktion von Licht, welches durch eine festgelegte Lichtquelle erzeugt wurde, verglichen wird. Bei der vorliegenden Erfindung wird die Änderung in der Lichtextinktion oder dem Absorptionsspektrum vorzugsweise über die optischen Fasern nachgewiesen, welche der Biosensor umfasst. Die Änderung in der Extinktion oder dem Absorptionsspektrum kann als eine Änderung bei der Beleuchtung von einer absolut geeichten Lichtquelle gemessen werden, oder kann alternativ in Bezug auf eine zweite "Referenzlichtquelle" durchgeführt werden. Die Lichtquelle kann außerhalb des Biosensors vorliegen oder kann als ein integraler Bestandteil bereitgestellt werden. In einer Ausführungsform werden einige der aufbauenden optischen Fasern Licht von der Signal- und/oder Referenzquelle zu der Sensorfläche leiten. Für eine maximale Empfindlichkeit wird das Licht, das verwendet wird, um Änderungen in der Extinktion oder dem Absorptionsspektrum zu messen, direkt auf die Sensorfläche des Biosensors gerichtet.
Fluoreszierende Markierungen erzeugen Licht als Reaktion auf eine Anregung durch eine Lichtquelle. Das emittierte Licht, welches typischerweise eine andere (niedrigere) Wellenlänge aufweist als das Anregungslicht, wird durch die optische Faser nachgewiesen, an welche die fluoreszierende Markierung gebunden wurde.
Das Anregungslicht kann durch einen integralen Bestandteil des Biosensors oder durch eine separate Lichtquelle gemäß einer Anzahl von Methoden, die den Fachleuten wohlbekannt sind, bereitgestellt werden. Systeme mit gedämpften Wellen beinhalten das Einführen eines Lichtstrahls am Transmissionsende 12 der optischen Faser. Dieser Lichtstrahl wird entlang der Faser geleitet, bis er das Sensorende 11 der Faser erreicht, wo er in der Testlösung eine elektromagnetische Wellenform erzeugt, welche als die gedämpfte Wellenkomponente bekannt ist. Die gedämpfte Wellenkomponente kann ausreichen, um einen Fluorophor anzuregen und ein Fluoreszenzsignal zu erzeugen. (Siehe beispielsweise U.S. Pat. Nr. 4,447,546 und U.S. Pat. Nr. 4,909,990, auf welche hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird).
In einer anderen Ausführungsform wird das Anregungslicht außerhalb des Biosensors bereitgestellt. Es ist besonders bevorzugt, dass das Licht als eine "Durchleuchtung (transillumina tion)" senkrecht zu den Sensorenden 11 der optischen Fasern bereitgestellt wird (siehe z. B. 4). Dieses liefert ein erhöhtes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis, da bei dieser Anordnung der größte Teil des Anregungslichts nicht entlang der optischen Fasern geleitet wird. Die einzelnen optischen Fasern 10, welche der Biosensor umfasst, können geschichtet sein, wie beispielsweise in den 6A und 6B gezeigt wird, um zu verhindern, dass einzelne Fasern einander beschatten, wenn sie durchleuchtet werden.
Um ein vorgegebenes Testformat zu optimieren, kann ein Fachmann die Empfindlichkeit des Fluroreszenznachweises für unterschiedliche Kombinationen von optischer Faser, Sensorflächenkonfiguration, Fluorochrom, Anregungs- und Emissionsbanden und dergleichen feststellen. Die Empfindlichkeit für den Nachweis des Analyten durch verschiedene Konfigurationen der optischen Faseranordnung können leicht festgestellt werden, indem beispielsweise der Biosensor verwendet wird, um eine Verdünnungsreihe von fluoreszenzmarkierten Analyten zu messen. Die Empfindlichkeit, Linearität und der dynamische Bereich, die durch die verschiedenen Kombinationen von Fluorochrom und Biosensor erreichbar sind, können so festgestellt werden. Reihenverdünnungen von Paaren von Fluorochromen in bekannten relativen Verhältnissen können ebenfalls analysiert werden, um die Genauigkeit festzustellen, mit welcher Messungen des Fluoreszenzverhältnisses die tatsächlichen Fluorochromverhältnisse über den dynamischen Bereich hinweg widerspiegeln, der durch die Detektoren und den Biosensor zugelassen wird.
Anwendung bei der Vergleichenden Genomischen Hybridisierung
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Biosensor der vorliegenden Erfindung in einem Vergleichenden Genomischen Hybridisierungstest (CGH) verwendet. Die Vergleichende Genomische Hybridisierung (CGH) ist ein neuerer Ansatz, der verwendet wird, um das Vorliegen amplifizierter oder deletierter Nukleotidsequenzen nachzuweisen und deren chromosomale Lage zu identifizieren. (Siehe Kallioniemi et al., Science 258: 818–821 (1992), WO 93/18186 und die parallele Anmeldung U.S.S.N. 08/353,018, die am 9. Dezember 1994 angemeldet wurde, worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird).
Bei der traditionellen Implementierung der CGH wird genomische DNA aus normalen Referenzzellen wie auch aus Testzellen (z. B. Tumorzellen) isoliert. Die zwei Nukleinsäuren (DNA) werden mit unterschiedlichen Markierungen markiert und dann in situ mit Metaphasechromosomen einer Referenzzelle hybridisiert. Die repetitiven Sequenzen in sowohl der Referenz- als auch der Test-DNA können entfernt werden oder deren Hybridisierungsvermögen kann durch gewisse Mittel wie beispielsweise eine nicht markierte Blockierungsnukleinsäure (z. B. Cot-1) verringert werden. Chromosomale Bereiche in den Testzellen, die in einer erhöhten oder verminderten Kopienzahl vorliegen, können schnell identifiziert werden, indem Bereiche nachgewiesen werden, wo das Verhältnis des Signals von den zwei DNAs verändert ist. Beispielsweise werden jene Bereiche, von denen die Kopienzahl in den Testzellen verringert wurde, ein relativ niedrigeres Signal bei der Test-DNA als die Referenz zeigen, im Vergleich zu anderen Bereichen des Genoms. Bereiche, deren Kopienzahl in den Testzellen erhöht wurde, werden ein relativ höheres Signal bei der Test-DNA zeigen.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen CGH-Test bereit, bei welchem der Biosensor der vorliegenden Erfindung das Metaphasechromosom ersetzt, welches als das Hybridisierungstarget bei der traditionellen CGH verwendet wird. Stattdessen sind die biologischen Bindungspartner, die auf dem Biosensor vorliegen, Nukleinsäuresequenzen, welche aus unterschiedlichen Bereichen des Genoms ausgewählt sind. Der Biosensor selbst wird zu einer Art "Glaschromosom", wo die Hybridisierung einer Nukleinsäure mit einem bestimmten Bindungspartner im Hinblick auf die Information äquivalent ist zu der Hybridisierung dieser Nukleinsäure mit dem Bereich auf einem Metaphasechromosom, von welchem der biologische Bindungspartner abgeleitet ist. Zusätzlich können Nukleinsäurenbindungspartner, die normalerweise nicht in dem Genom enthalten sind, beispielsweise Virusnukleinsäuren, eingesetzt werden.
Insbesondere kann in einem CGH-Test der Biosensor in Verfahren benutzt werden, um die Kopienzahl von wenigstens zwei Nukleinsäuresequenzen in einer ersten Sammlung von Nukleinsäuremolekülen relativ zu der Kopienzahl derselben Sequenzen in einer zweiten Sammlung quantitativ zu vergleichen, wie in 5 dargestellt wird. Die Methode umfasst das Markieren der Nukleinsäuremoleküle in der ersten Sammlung 25 und der Nukleinsäuremoleküle in der zweiten Sammlung 26 mit einer ersten bzw. zweiten Markierung, wodurch wenigstens zwei Sammlungen von Nukleinsäuresonden gebildet werden. Die erste und zweite Markierung sollten voneinander unterscheidbar sein.
Wie hierin verwendet, ist der Ausdruck "Sonde" somit definiert als eine Sammlung von Nukleinsäuremolekülen (entweder RNA oder DNA), die in der Lage sind, eine Targetnukleinsäure mit komplementärer Sequenz durch einen oder mehrere Typen von chemischen Bindungen, gewöhnlich durch Bildung von Wasserstoffbrücken, zu binden. Die Sonden werden vorzugsweise direkt oder indirekt markiert, wie im Folgenden beschrieben wird. Sie weisen typischerweise eine hohe Komplexität auf, indem sie beispielsweise aus der gesamten genomi schen DNA oder mRNA hergestellt werden, die aus einer Zelle oder Zellpopulation isoliert wurde.
Die so gebildeten Sonden 30 werden entweder gleichzeitig oder nacheinander mit einer Mehrzahl von Targetnukleinsäuren, die auf der Sensorfläche 13 des Biosensors der Anordnung 14 vorliegen, unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht, dass eine Nukleinsäurehybridisierung mit den Targetnukleinsäuren auftreten kann. Hier wird eine durchleuchtende Lichtquelle 19 verwendet. Nach dem Inkontaktbringen der Sonden mit den Targetnukleinsäuren wird das Ausmaß der Bindung jeder Sonde und das Verhältnis der Bindung der Sonden für jede Spezies von Targetnukleinsäure bestimmt. Je größer das Bindungsverhältnis an eine Targetnukleinsäure ist, desto größer ist typischerweise das Verhältnis der Kopienzahl der Sequenzen in den zwei Sonden, welche an die Nukleinsäure binden. Somit erlaubt ein Vergleich der Verhältnisse von gebundenen Markierungen bei den Targetnukleinsäuresequenzen einen Vergleich der Verhältnisse der Kopienzahl von verschiedenen Sequenzen in den Sonden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Komplexität der Sequenz jeder Targetnukleinsäure in dem Biosensor sehr viel geringer als die Komplexität der Sequenz der ersten und zweiten Sammlungen markierter Nukleinsäuren. Der Ausdruck "Komplexität" wird hierin gemäß der üblichen Bedeutung dieses Ausdrucks verwendet, wie dieser durch Britten et al., Methods of Enzymol. 29: 363 (1974) etabliert wurde. Siehe ebenfalls Cantor und Schimmel, Biophysical Chemistry: Teil III bei 1228–1230 für eine weitere Erklärung der Komplexität von Nukleinsäuren.
Die Methoden werden typischerweise durchgeführt, indem Techniken verwendet werden, die für eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung geeignet sind. Somit sind die ersten und zweiten Markierungen gewöhnlich fluoreszierende Markierungen.
Um die Hybridisierung von repetitiven Sequenzen in den Sonden an die Targetnukleinsäuren zu hemmen, können unmarkierte Blockierungsnukleinsäuren (z. B. Cot-1-DNA) mit den Sonden gemischt werden. Somit konzentriert sich die Erfindung auf die Analyse der nicht repetitiven Sequenzen in einem Genom. Jedoch würde die Verwendung von repetitiven Sequenzen als Targets auf dem Biosensor und ein Weglassen der blockierenden Nukleinsäuren erlauben, dass für repetitive Sequenzen Bestimmungen der relativen Kopienzahl durchgeführt werden.
In einer typischen Ausführungsform wird eine Sammlung von Sondennukleinsäuren aus einer Testzelle, Zellpopulation oder dem untersuchten Gewebe hergestellt; und die zweite Sammlung von Sondennukleinsäuren wird aus einer Referenzzelle, Zellpopulation oder einem Gewebe hergestellt. Referenzzellen können normale gesunde Zellen sein oder diese können aus einer Probe von krankem Gewebe stammen, die als ein Standard für andere Aspekte der Krankheit dient. Wenn beispielsweise die Referenzsonde genomische DNA ist, die aus normalen Zellen isoliert wird, dann ist die Kopienzahl jeder Sequenz in dieser Sonde in Bezug auf die anderen bekannt (z. B. zwei Kopien jeder autosomalen Sequenz und eine oder zwei Kopien jeder Sequenz auf einem Geschlechtschromosom, abhängig von dem Geschlecht). Ein Vergleich von dieser mit einer Testsonde erlaubt den Nachweis von Abweichungen vom Normalfall. Alternativ kann die Referenzsonde aus genomischer DNA aus einem Primärtumor hergestellt werden, welche bei ihren unterschiedlichen Sequenzen wesentliche Abweichungen in der Kopienzahl enthalten kann, und die Testsonde kann aus genomischer DNA von metastatischen Zellen von diesem Tumor hergestellt werden, so dass der Vergleich die Unterschiede zwischen dem Primärtumor und seinen Metastasen zeigt. Weiterhin können beide Sonden aus normalen Zellen hergestellt werden. Beispielsweise erlaubt ein Vergleich von mRNA-Populationen zwischen normalen Zellen von unterschiedlichen Geweben den Nachweis einer differenziellen Genexpression, die ein kritisches Merkmal der Gewebedifferenzierung ist. Somit werden im Allgemeinen die Ausdrücke Test und Referenz zur Vereinfachung verwendet, um zwischen den zwei Sonden zu unterscheiden, diese beinhalten aber keine anderen Kennzeichen der Nukleinsäuren, welche sie enthalten.
Targetnukleinsäuren
Die Targetnukleinsäuren, welche die biologischen Bindungspartner umfassen, die an den Sensorenden 11 der optischen Fasern 10 befestigt sind, und die Sonden können beispielsweise RNA, DNA oder cDNA sein. Die Nukleinsäuren können aus irgendeinem Organismus stammen. Die Nukleinsäuren können genomische Sequenzen sein, welche speziellen Bereichen auf einem Chromosom entsprechen, oder können exprimierte Sequenzen wie beispielsweise cDNA oder mRNA sein. Gewöhnlich stammen die Nukleinsäure in den Targetsequenzen und die Sonden aus derselben Spezies.
Die "Targetnukleinsäuren", welche biologische Bindungspartner umfassen, stammen typischerweise aus einem definierten Bereich des Genoms (z. B. einem Klon oder mehreren fortlaufenden Klonen aus einer genomischen Bibliothek), oder entsprechen einer funktionalen genetischen Einheit, welche vollständig sein kann oder nicht (beispielsweise eine voll ständige oder partielle cDNA). Die Targetnukleinsäuren können ebenfalls inter-Alu- oder PCR-Produkte von degenerierten Oligonukleotidprimern umfassen, die von solchen Klonen abgeleitet sind. Wenn die Genexpression analysiert wird, kann ein Targetelement eine vollständige oder partielle cDNA umfassen.
Die Targetnukleinsäuren können beispielsweise spezielle Gene enthalten oder können aus einem chromosomalen Bereich stammen, von welchem vermutet wird, dass dieser mit erhöhter oder verminderter Kopienzahl in den interessierenden Zellen, z. B. Tumorzellen, vorliegt. Die Targetnukleinsäure kann ebenfalls eine mRNA oder eine cDNA, die von einer solchen mRNA abgeleitet ist, sein, welche in dem Verdacht stehen, mit anormalen Niveaus transkribiert zu werden.
Alternativ können die Targetnukleinsäuren Nukleinsäuren mit unbekannter Bedeutung oder Lage umfassen. Die Anordnung solcher Targetnukleinsäuren, welche die Sensorfläche 13 eines Biosensors der vorliegenden Erfindung umfasst, könnte Nukleinsäuren repräsentieren, die von Positionen abgeleitet sind, die entweder kontinuierlich oder an diskreten Punkten irgendeinen gewünschten Bereich eines Genoms abfragen, einschließlich dem gesamten Genom, eines einzelnen Chromosoms oder eines Teils eines Chromosoms, aber nicht darauf beschränkt. Die Anzahl an Targetelementen und die Komplexität der Nukleinsäuren würde jeweils die Abfragedichte festlegen. Beispielsweise könnte ein Biosensor, welcher 300 unterschiedliche Spezies einer Targetnukleinsäure (biologische Bindungspartner) trägt, wobei jede Targetnukleinsäure DNA von einem unterschiedlichen genomischen Klon ist, das gesamte menschliche Genom in Abständen von 10 Megabasen abfragen. Eine Anordnung von 30.000 Elementen, die jeweils 100 kb genomische DNA enthalten, könnte eine vollständige Abdeckung des menschlichen Genoms ergeben.
In ähnlicher Weise könnte eine Anordnung von Targetnukleinsäuren, die Nukleinsäuren aus anonymen cDNA-Klonen umfassen, eine Identifizierung von solchen erlauben, die in einigen interessierenden Zellen differenziell exprimiert werden, wodurch die Aufmerksamkeit auf die Untersuchung dieser Gene gelenkt wird.
Bei einigen Ausführungsformen werden vorher kartierte Klone aus einem bestimmten interessierenden chromosomalen Bereich als Targets verwendet. Solche Klone werden als Folge des schnellen Fortschritts der weltweiten Initiative in der Genforschung verfügbar.
Kartierte Klone können aus Bibliotheken hergestellt werden, die aus einzelnen Chromosomen, mehreren Chromosomen oder aus einem Segment eines Chromosoms aufgebaut wurden. Standardtechniken werden verwendet, um Fragmente geeigneter Größe in Vektoren, wie beispielsweise Cosmide, künstliche Hefechromosomen (YACs), künstliche bakterielle Chromosomen (BACs) und den P1-Phagen, zu klonieren.
Während es möglich ist, wie eben beschrieben Klonbibliotheken zu erzeugen, sind Bibliotheken, welche sich über ganze Chromosomen erstrecken, ebenfalls im Handel erhältlich. Beispielsweise sind chromosomenspezifische Bibliotheken aus dem menschlichen und anderen Genomen bei Clonetech (South San Francisco, CA) oder bei der American Type Culture Collection (siehe ATCC/NIH Repository of Catalogue of Human and Mouse DNA Probes and Libraries, 7. Ausg. 1993) erhältlich.
Wenn nötig können die oben beschriebenen Klone genetisch oder physikalisch kartiert werden. Beispielsweise können FISH und Digitalbildanalyse verwendet werden, um die Orte auf einem Chromosom zu identifizieren und zu kartieren, an welche spezifische Cosmid-Inserts hybridisieren. Dieses Verfahren wird beispielsweise bei Lichter et al., Science 247: 64–69 (1990) beschrieben. Die physikalisch kartierten Klone können dann verwendet werden, um einen interessierenden Bereich, der unter Verwendung von CGH oder anderen Methoden identifiziert wurde, definitiver zu kartieren.
Ein Fachmann wird erkennen, dass jegliche Targetnukleinsäuren so ausgewählt werden können, dass eine Anzahl von Nukleinsäuren mit unterschiedlicher Länge und Sequenz einen bestimmten Bereich auf einem Chromosom darstellt. Somit kann beispielsweise die Sensorfläche 13 des Biosensors mehr als eine Kopie eines klonierten Stücks DNA tragen, und jede Kopie kann in Fragmente mit unterschiedlichen Längen zerteilt sein. Ein Fachmann kann die Länge und Komplexität der Targetsequenzen einstellen, um für eine optimale Hybridisierung und Erzeugung eines Signals bei einem vorgegebenen Hybridisierungsverfahren zu sorgen und für die erforderliche Auflösung zwischen unterschiedlichen Genen oder genomischen Lagen zu sorgen. Typischerweise werden die Targetsequenzen eine Komplexität zwischen ca. 1 kb und ca. 1 Mb aufweisen.
Herstellung von Sondennukleinsäuren
Wie bei den Targetnukleinsäuren (jene, die an dem faseroptischen Sensor befestigt sind), kann eine große Vielzahl von Nukleinsäuren als Sondennukleinsäuren in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Sonden können beispielsweise genomische DNA umfassen, welche das gesamte Genom aus einem bestimmten Organismus, Gewebe oder Zelltyp repräsentiert, oder können einen Teil des Genoms, wie beispielsweise ein einzelnes Chromosom, umfassen.
Um Expressionsspiegel eines bestimmten Gens oder bestimmter Gene zu vergleichen, können die Sondennukleinsäuren von mRNA oder cDNA abgeleitet werden, die aus einem interessierenden Organismus, Gewebe oder einer Zelle hergestellt wurden. Beispielsweise kann eine Test-cDNA oder -mRNA zusammen mit mRNA oder cDNA aus normalen Referenzzellen mit einer Anordnung von Targetnukleinsäuren auf dem Sensor, welche Klone aus einer normalisierten cDNA-Bibliothek umfasst, hybridisiert werden. Zusätzlich können Sonden, die aus genomischer DNA von zwei Zellpopulationen erzeugt wurden, mit einer Target-cDNA-Anordnung hybridisiert werden, um jene cDNAs nachzuweisen, die aus Bereichen mit veränderter DNA-Kopienzahl in dem Genom stammen.
Die Methoden der Erfindung sind geeignet, um die Kopienzahl von bestimmten Sequenzen in jeglicher Kombination von zwei oder mehreren Populationen von Nukleinsäuren zu vergleichen. Ein Fachmann wird erkennen, dass die bestimmten Populationen der Probennukleinsäuren, die verglichen werden, für die Erfindung nicht kritisch sind. Beispielsweise kann genomische oder cDNA aus zwei verwandten Spezies verglichen werden. Alternativ können Expressionsspiegel von bestimmten Genen in zwei oder mehreren Gewebe- oder Zelltypen verglichen werden. Wie oben angegeben, sind die Methoden bei der Diagnose von Krankheiten besonders nützlich.
Standardverfahren können verwendet werden, um Nukleinsäuren (entweder DNA oder mRNA) aus geeigneten Geweben zu isolieren (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1985)). Herkömmliche Methoden zur Herstellung von cDNA aus mRNA können ebenfalls verwendet werden.
Die besonderen Zellen oder das Gewebe, aus welchem die Nukleinsäuren isoliert werden, werden von der bestimmten Anwendung abhängen. Typischerweise wird zum Nachweis von Anomalien, die mit Krebs zusammenhängen, genomische DNA aus Tumorzellen isoliert. Für einen pränatalen Nachweis einer Krankheit wird fötales Gewebe verwendet.
Wenn die Gewebeprobe klein ist, so dass eine kleine Menge der Nukleinsäuren verfügbar ist, können Amplifikationstechniken wie beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von degenerierten Primern verwendet werden. Für eine allgemeine Beschreibung der PCR siehe PCR Protocols, Innis et al. Herausg., Academic Press, 1990. Zusätzlich kann die PCR verwendet werden, um Sequenzen zwischen repetitiven Sequenzen mit hoher Kopienzahl selektiv zu amplifizieren. Diese Methoden verwenden Primer, die zu in hohem Maße repetitiven eingefügten Sequenzen (z. B. Alu) komplementär sind, um selektiv Sequenzen zu amplifizieren, die zwischen zwei Mitgliedern der Alu-Familie vorliegen (siehe Nelson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6686 (1989)).
Eine CGH auf dem zytogenetischen Niveau erleichtert die Suche nach Krankheitsgenen durch ein Identifizieren von Bereichen mit Unterschieden in der Kopienzahl, beispielsweise zwischen einem normalen und einem Tumorgenom. Beispielsweise wurden CGH-Studien für die Analyse von Variationen der Kopienzahl bei Brustkrebs angewendet (siehe z. B. Kallioniemi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2156–2160 (1994)).
Bei der CGH liegt die Auflösung, mit welcher eine Änderung der Kopienzahl kartiert werden kann, in der Größenordnung von mehreren Megabasen. Bei der vorliegenden Erfindung ist die Auflösung eine Funktion der Länge der genomischen DNA-Segmente, welche die Targetnukleinsäuresequenzen umfassen, und des Unterschieds in der Kartenposition zwischen benachbarten Klonen. Eine Auflösung von mehr als einem Faktor von 10mal besser als bei der Standard-CGH kann mit der vorliegenden Erfindung erreicht werden. Diese verbesserte Lokalisierung wird die Anstrengungen, kritische Gene, die an einer Krankheit beteiligt sind, zu identifizieren, erleichtern und einen empfindlicheren Nachweis von Anomalien erlauben, an welchen ein kleiner Bereich des Genoms beteiligt ist, wie beispielsweise bei Mikrodeletionssyndromen.
Markieren von Nukleinsäuresonden
Wie oben angegeben, werden die Nukleinsäuren, welche mit den Targetnukleinsäuren hybridisiert werden, vorzugsweise markiert, um einen Nachweis der Hybridisierungskomplexe zu erlauben. Die Nukleinsäuresonden, die in der unten beschriebenen Hybridisierung verwendet werden, können vor der Hybridisierungsreaktion nachweisbar markiert werden. Alternativ kann eine nachweisbare Markierung ausgewählt werden, welche an das Hybridisierungsprodukt bindet. Wie oben angegeben, wird die Targetnukleinsäureanordnung mit zwei oder mehreren Sondennukleinsäuren entweder gleichzeitig oder nacheinander hybridisiert. Somit werden die Sonden jeweils vorzugsweise mit einer getrennten und unterscheidbaren Markierung markiert.
Die bestimmte Markierung oder nachweisbare Gruppe, die an den Sondennukleinsäuren befestigt ist, wird so ausgewählt, dass diese die Hybridisierung der Sonde mit der Targetsequenz nicht wesentlich stört. Die nachweisbare Gruppe kann irgendein Material sein, das eine nachweisbare physikalische oder chemische Eigenschaft aufweist. Derartige nachweisbare Marierungen wurden auf dem Gebiet der Nukleinsäurehybridisierungen weit entwickelt, und im Allgemeinen kann jede Markierung, die bei solchen Methoden nützlich ist, für die vorliegende Erfindung angewendet werden. Somit ist eine Markierung jede Zusammensetzung, die durch spektroskopische, fotochemische, biochemische, immunochemische, elektrische, optische oder chemische Mittel nachweisbar ist.
Bevorzugte Markierungen erzeugen jedoch ein optisches Signal. Somit umfassen besonders nützliche Markierungen in der vorliegenden Erfindung fluoreszierende Farbstoffe (z. B. Fluorescein, Isothiocyanat, Texasrot, Rhodamin und dergleichen) und Markierungen, die ein kolorimetrisches Signal erzeugen, wie beispielsweise verschiedene Enzyme (z. B. Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und weitere, die häufig in einem ELISA verwendet werden).
Die Nukleinsäuren können indirekt markiert werden, indem Liganden verwendet werden, für welche nachweisbare Antiliganden verfügbar sind. Beispielsweise können biotinylierte Nukleinsäuren nachgewiesen werden, indem gemäß Techniken, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, markiertes Avidin oder Streptavidin verwendet wird. Zusätzlich können antigene oder haptene Moleküle nachgewiesen werden, indem markierte Antiseren oder monoklonale Antikörper verwendet werden. Beispielsweise können N-Acetoxy-N-2-acetylaminofluoren-markierte oder Digoxigenin-markierte Sonden nachgewiesen werden, indem Antikörper verwendet werden, die mit diesen Verbindungen spezifisch immunreagieren (z. B. FITC-markierter Schaf-anti-Digoxigenin-Antikörper (Boehringer Mannheim)). Zusätzlich können markierte Antikörper gegen Thymidin-Thymidin-Dimere verwendet werden (Nakane et al., ACTA Histochem. Cytochem. 20: 229 (1987)).
Im Allgemeinen sind Markierungen bevorzugt, welche in einer Kopienzahl nachweisbar sind, die so gering wie möglich ist, wodurch die Empfindlichkeit des Tests maximiert wird, und welche dennoch über jedem Hintergrundsignal nachweisbar sind. Es wird bevorzugt eine Markierung ausgewählt, die ein lokalisiertes Signal liefert, wodurch für eine Raumauflösung des Signals von jedem Targetelement gesorgt wird.
Die Markierungen können durch eine Vielzahl von Mitteln, die den Fachleuten bekannt sind, an die DNA gekoppelt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sonde markiert, indem eine Nicktranslation oder eine Verlängerung mit Zufallsprimern verwendet wird (Rigby et al., J. Mol. Biol., 113: 237 (1977) oder Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1985)).
Hybridisierung von markierten Nukleinsäuren mit Targets
Die Kopienzahl von bestimmten Nukleinsäuresequenzen in zwei Sonden wird verglichen, indem die Sonden mit einer oder mehreren Targetnukleinsäurenanordnungen (Biosensoren) hybridisiert werden. Die Intensität des Hybridisierungssignals und das Verhältnis der Intensitäten, welche durch die Sonden mit jedem der Targetelemente erzeugt werden, werden festgestellt. Je größer das Verhältnis der Signalintensitäten bei einer Targetnukleinsäure ist, desto größer ist typischerweise das Verhältnis der Kopienzahl der Sequenzen in den zwei Sonden, die an die Targetsequenz binden. Somit erlaubt ein Vergleich der Verhältnisse der Signalintensität bei den Targetelementen einen Vergleich der Verhältnisse der Kopienzahl von unterschiedlichen Sequenzen in den Sonden.
Es werden Standardhybridisierungstechniken verwendet, um eine Targetnukleinsäureanordnung zu sondieren. Geeignete Methoden werden in Literaturstellen beschrieben, welche CGH-Techniken beschreiben (Kallioniemi et al., Science 258: 818–821 (1992) und WO 93/18186). Mehrere Führer für allgemeine Techniken stehen zur Verfügung, z. B. Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teile I und II (Elsevier, Amterdam 1993). Für eine Beschreibung von Techniken, die für in situ-Hybridisierungen geeignet sind, siehe Gall et al., Meth. Enzymol. 21: 470–480 (1981) und Angerer et al. in Genetic Engineering: Principles and Methods, Setlow und Hollaender, Herausg. Bd. 7, Seiten 43–65 (Plenum Press, New York, 1985).
Im Allgemeinen umfassen Nukleinsäurehybridisierungen, welche die Biosensoren der vorliegenden Erfindung verwenden, die folgenden Hauptschritte: (1) Prähybridisierungsbehandlung, um die Zugänglichkeit der Target-DNA zu erhöhen und um die unspezifische Bindung zu verringern; (2) Hybridisierung der Mischung von Nukleinsäuren mit den Nukleinsäuretargets auf dem Biosensor; (3) Posthybridisierungswaschgänge, um in der Hybridisierung nicht gebundene Nukleinsäurefragmente zu entfernen, und (4) Nachweis der hybridisierten Nukleinsäurefragmente. Die Reagenzien, welche in jedem dieser Schritte verwendet werden, und deren Anwendungsbedingungen variieren in Abhängigkeit von der bestimmten Anwendung.
Bei einigen Anwendungen ist es nötig, das Hybridisierungsvermögen von repetitiven Sequenzen zu blockieren. Es ist eine Anzahl von Methoden zur Entfernung und/oder Unbrauchbarmachung des Hybridisierungsvermögens von repetitiven Sequenzen bekannt (siehe z. B. WO 93/18186).
Beispielsweise können Massenverfahren verwendet werden. Bei vielen Genomen, einschließlich des menschlichen Genoms, ist ein Großteil der gemeinsamen repetitiven DNA innerhalb einiger weniger Familien von in hohem Maße wiederholten Sequenzen wie beispielsweise Alu enthalten. Diese Methoden nutzen die Tatsache aus, dass die Hybridisierungsgeschwindigkeit von komplementären Sequenzen steigt, wenn ihre Konzentration steigt. Somit werden repetitive Sequenzen, welche im Allgemeinen in einer hohen Konzentration vorliegen, nach Denaturierung und Inkubation unter Hybridisierungsbedingungen schneller doppelsträngig als andere. Die doppelsträngigen Nukleinsäuren werden dann entfernt, und der Rest wird in den Hybridisierungen verwendet. Methoden zur Abtrennung einzelsträngiger von doppelsträngigen Sequenzen umfassen die Verwendung von Hydroxyapatit oder immobilisierten komplementären Nukleinsäuren, die an einem festen Träger befestigt sind. Alternativ kann die teilweise hybridisierte Mischung verwendet werden, und die doppelsträngigen Sequenzen werden nicht in der Lage sein, mit dem Target zu hybridisieren.
Alternativ können nicht markierte Sequenzen, welche zu den Sequenzen komplementär sind, deren Hybridisierungsvermögen gehemmt werden soll, zu der Hybridisierungsmischung zugegeben werden. Diese Methode kann verwendet werden, um die Hybridisierung von repetitiven Sequenzen wie auch von anderen Sequenzen zu hemmen. Beispielsweise kann "Cot-1"-DNA verwendet werden, um selektiv die Hybridisierung von repetitiven Sequenzen in einer Probe zu hemmen. Um Cot-1-DNA herzustellen, wird DNA extrahiert, aufgebrochen, denaturiert und zu einer C₀t ~ 1 renaturiert (zur Beschreibung der Reassoziierungskinetiken und C₀t-Werte siehe Tijssen, supra auf den Seiten 48–54). Da in hohem Maße repetitive Sequenzen schneller reassoziieren, sind die resultierenden Hybride im Hinblick auf diese Sequenzen in hohem Maße angereichert. Die verbleibenden einzelsträngigen (d. h. Sequenzen mit einer einzigen Kopie) werden mit S1-Nuklease verdaut, und die doppelsträngige Cot-1-DNA wird gereinigt und verwendet, um die Hybridisierung von repetitiven Sequenzen in einer Probe zu blockieren. Auch wenn Cot-1-DNA wie oben beschrieben hergestellt werden kann, ist sie ebenfalls im Handel erhältlich (BRL). Eine Reassoziierung zu großen C₀t-Werten wird dazu führen, dass DNA blockiert wird, die repetitive Sequenzen enthält, welche mit einer niedrigeren Kopienzahl vorliegen.
Analyse von nachweisbaren Signalen aus Hybridisierungen
Standardmethoden zum Nachweis und zur Analyse von Signalen, die durch markierte Sonden erzeugt wurden, können verwendet werden. Insbesondere wird das optische Signal, das durch Bindung einer markierten Sonde an einen bestimmten Bindungspartner erzeugt wurde, entlang der optischen Fasern 10 befördert, an welchen dieser Bindungspartner befestigt wurde. Wie oben angegeben, kann das optische Signal direkt sichtbar gemacht werden oder mit Hilfe eines Detektors 20 in ein analoges oder digitales elektronisches Signal umgewandelt werden. Um die Anzeige der Ergebnisse zu erleichtern und die Empfindlichkeit beim Nachweis von kleinen Unterschieden in der Fluoreszenzintensität zu verbessern, werden vorzugsweise ein Detektor und ein digitales Signalanalysesystem verwendet. Der Detektor kann mit einem oder mehreren Filtern ausgerüstet sein, um die Emissionswellenlängen durchzulassen, während Anregungswellenlängen herausgefiltert werden, wodurch das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis erhöht wird. Die Verwendung von Filtern wird ebenfalls die Unterscheidung zwischen Bindungsereignissen erleichtern, an welchen die zwei oder mehr unterschiedlich markierte Sonden beteiligt sind. Derartige Detektor/Filter/Signalverarbeitungssysteme sind den Fachleuten wohlbekannt.

Claims

Ein Verfahren zur Befestigung eines biologischen Bindungspartners (18) an einer festen Oberfläche (11) unter Verwendung eines Matrixpolymers, das in einer Lösung gelöst ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellen einer Matrixlösung, welche den biologischen Bindungspartner und ein solubilisiertes Matrixpolymer, das in der Lösung gelöst ist, umfasst; und Inkontaktbringen der Matrixlösung mit der festen Oberfläche, wodurch der biologische Bindungspartner derart befestigt wird, dass dieser ein zweites Molekül spezifisch erkennen und binden kann.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt des Bereitstellens der Matrixlösung das Inkontaktbringen einer wässrigen Lösung, welche den biologischen Bindungspartner umfasst, mit einer zweiten Lösung, die das Matrixpolymer umfasst, umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der biologische Bindungspartner eine Nukleinsäure ist und derart an der festen Oberfläche befestigt wird, dass die Nukleinsäure in der Lage ist, spezifisch mit einer komplementären Nukleinsäure zu hybridisieren.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Matrixpolymer Nitrocellulose ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der biologische Bindungspartner eine Nukleinsäure ist und das Verhältnis von Nitrocellulose zu Nukleinsäure zwischen ca. 1 : 10 und 2 : 1, bezogen auf das Gewicht, liegt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der biologische Bindungspartner eine Nukleinsäure ist und das Verhältnis von Nitrocellulose zu Nukleinsäure zwischen ca. 1,5 : 10 und 1 : 1, bezogen auf das Gewicht, liegt.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Matrixlösung Nitrocellulose, welche in DMSO gelöst ist, umfasst.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, welches weiterhin den Schritt des Trocknens der Matrixlösung nach dem Inkontaktbringen der Matrixlösung mit der festen Oberfläche umfasst.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Oberfläche ein Glasobjektträger ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die feste Oberfläche ein Sensorende einer optischen Faser ist.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines faseroptischen Bündels zum Messen einer Mehrzahl biologischer Bindungspartner innerhalb einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellen einer Mehrzahl optischer Fasern, wobei jede Faser ein Sensorende (11), an welchem eine Spezies eines biologischen Bindungspartners (18) befestigt ist, und ein Transmissionsende (12) aufweist, wobei der biologische Bindungspartner an dem Sensorende jeder optischen Faser durch ein Verfahren gemäß Anspruch 10 unter Verwendung eines solubilisierten Matrixpolymers befestigt wird, wodurch der biologische Bindungspartner ein zweites Molekül spezifisch erkennen und binden kann; Vereinigen der Fasern mit verschiedenen Bindungspartnern, um eine optische Faseranordnung (14) zu bilden, in welcher die Fasern gleich ausgerichtete Sensorenden für einen gleichzeitigen Test einer Probe aufweisen; und Adressieren des Transmissionsendes der vereinigten einzelnen Fasern zum Abfragen, um den faseroptischen Sensor für die Probe herzustellen.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines faseroptischen Bündels gemäß Anspruch 11, wobei der Schritt des Bereitstellens umfasst: Bereitstellen einer Mehrzahl von optischen Fasern, wobei jede Faser ein Sensorende und ein Transmissionsende aufweist; Anordnen der Mehrzahl von optischen Fasern in einer Mehrzahl von Fasergruppen, wobei jede Fasergruppe gleich ausgerichtete Sensorenden aufweist, zur gleichzeitigen Behandlung; Bereitstellen einer Mehrzahl von verschiedenen Chargen, wobei jede Charge eine einzige Spezies eines biologischen Bindungspartners umfasst, welcher zur Befestigung an den gleich ausgerichteten Sensorenden der optischen Fasern einer ausgewählten Gruppe von optischen Fasern bei der Behandlung geeignet ist; Anordnen und Behandeln der gleich ausgerichteten Sensorenden von verschiedenen Fasergruppen in verschiedenen Chargen mit verschiedenen biologischen Bindungspartnern, um eine Mehrzahl von Gruppen optischer Fasern herzustellen, wobei die Sensorenden der optischen Fasern von jeder Gruppe dieselbe Spezies des biologischen Bindungspartners aufweisen, und die Sensorenden der optischen Fasern von verschiedenen Gruppen verschiedene Spezies von biologischen Bindungspartnern aufweisen; und Abtrennen von Fasern aus jeder Gruppe von Fasern, wodurch eine Mehrzahl an optischen Fasern bereitgestellt wird, wobei jede Faser ein Sensorende und ein Transmissionsende aufweist, wobei jede Faser an ihrem Sensorende eine Spezies eines biologischen Bindungspartners befestigt hat.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines faseroptischen Bündels gemäß Anspruch 12, wobei das Vereinigen von getrennten Fasern mit verschiedenen Bindungspartnern mit gleich ausgerichteten Sensorenden ein zufälliges Ansammeln der Sensorenden beinhaltet.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines faseroptischen Bündels gemäß Anspruch 12, wobei das Vereinigen von getrennten Fasern mit verschiedenen Bindungspartnern mit gleich ausgerichteten Sensorenden das Zusammensetzen der Sensorenden, um eine schichtweise angeordnete Sensorfläche zu bilden, beinhaltet.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines faseroptischen Bündels gemäß Anspruch 12, wobei das Vereinigen von getrennten Fasern mit verschiedenen Bindungspartnern mit gleich ausgerichteten Sensorenden das Zusammensetzen der Sensorenden, um eine planare Sensorfläche zu bilden, beinhaltet.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines faseroptischen Bündels gemäß irgendeinem der Ansprüche 11 bis 15, wobei das Adressieren des Transmissionsendes der vereinigten einzelnen Fasern zum Abfragen das Adressieren der Transmissionsenden von jeder der einzelnen Fasern in einer optischen Anordnung beinhaltet.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines faseroptischen Bündels gemäß irgendeinem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Transmissionsenden der optischen Fasern von jeder Gruppe, die ähnliche Bindungspartner aufweisen, ähnliche Markierungen aufweisen, um die Transmissionsenden, welche Bindungspartnern entsprechen, zu unterscheiden.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines faseroptischen Bündels gemäß irgendeinem der Ansprüche 12 bis 15 und 17, wobei das Bereitstellen einer Mehrzahl von Chargen mit verschiedenen Bindungspartnern Chargen von Nukleinsäurebindungspartnern beinhaltet, an welche Nukleinsäuren in der Probe hybridisieren könnten.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines faseroptischen Bündels gemäß Anspruch 18, wobei die Nukleinsäurebindungspartner jeweils spezifischen Bereichen auf Chromosomen entsprechen.
Ein Verfahren zum Konstruieren eines faseroptischen Bündels gemäß Anspruch 18, wobei die Nukleinsäurebindungspartner jeweils exprimierten Sequenzen entsprechen.