DE69730142T2

DE69730142T2 - Diagnose spongiformer encephalopathie

Info

Publication number: DE69730142T2
Application number: DE69730142T
Authority: DE
Inventors: John Collinge
Original assignee: D Gen Ltd
Current assignee: D Gen Ltd
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1997-10-15
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2017-10-16
Also published as: ATE272842T1; EP0934531B1; US6998231B2; US20020081645A1; ES2134749T3; WO1998016834A1; AU4711597A; EP0934531A1; DE69730142D1; ES2134749T1; CA2268904A1; DE934531T1; NZ335290A; JP2001503141A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Typisieren einer Probe eines Prions oder spongiformer Enzephalopathie, eine Ausrüstung, welche für den Einsatz bei einem solchen Typisierungsverfahren geeignet ist, ein Verfahren zum Identifizieren einer Infektion bei einem Tier und/oder Gewebe mit boviner spongiformer Enzephalopathie (BSE), ein Verfahren zum Bewerten und/oder Vorhersagen der Anfälligkeit eines Tieres für BSE, eine Ausrüstung zum Einsatz bei einem solchen Bewertungs- und/oder Vorhersageverfahren, ein Verfahren für die Behandlung einer Prionenkrankheit, Verbindungen, welche für ein solches Verfahren geeignet sind, sowie den Einsatz solcher Verbindungen und pharmazeutischer Wirkstoffe, welche solche Verbindungen enthalten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Molekularanalyse der Prionenstammvariation und die Ätiologie der „neuen Variante" der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit.
Die Prionenkrankheiten oder übertragbare spongiforme Enzephalopathien sind eine Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen, von welchen sowohl Menschen als auch Tiere befallen werden, und welche zwischen Säugetieren durch die Inokulation mit infiziertem Gewebe oder in einigen Fällen auch über die Aufnahme infizierter Gewebe mit der Nahrung übertragen werden können. Sie stehen in Zusammenhang mit der Akkumulation einer anomalen Isoform eines durch einen Wirt codierten Glykoproteins, dem Prionenprotein (PrP) in betroffenen Gehirnen, welches die zentrale und möglicherweise einzige Komponente des übertragbaren Wirkstoffes oder Prions¹ zu sein scheint. Diese krankheitsbezogene Isoform, PrP^sc, unterscheidet sich von der normalen zellulären Isoform, PrP^c, durch seine Unlöslichkeit und die partielle Resistenz gegenüber Proteasen. PrP^sc wird durch einen post-translationalen Mechanismus², welcher eher eine konformative als eine kovalente Modifikation³ zu beinhalten scheint, von PrP^c abgeleitet. Transgene, humane molekulargenetische und in vitro-Konversionsstudien stützen ein Modell zur Prionenvermehrung, welches eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen Wirts-PrP^c und inokuliertem PrP^sc beinhaltet, wobei PrP^sc so agiert, dass es die Umwandlung von PrP^c in weiteres PrP^sc in einem autokatalytischen Prozess fördert, welcher am effizientesten abläuft, wenn die interagierenden Proteine eine identische Primärstruktur^4–7 aufweisen. Zusätzlich zur einmaligen Biologie dieser Erkrankungen hat sich das Interesse an ihnen aufgrund der Epidemie einer neuartigen Prionenkrankheit, bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE)⁸, in Großbritannien und nun auch in anderen Ländern, sowie auch durch die Möglichkeit, dass es sich hierbei um eine signifikante Bedrohung der Volksgesundheit durch Aufnahme BSE-infizierter Gewebe mit der Nahrung, intensiviert. Von BSE ist bekannt, dass es bereits bei einer Reihe anderer Spezies, einschließlich Hauskatzen (feline spongiforme Enzephalopathie) und in Gefangenschaft gehaltene exotische Huftiere (Nyala und Kudu), Prionenkrankheiten hervorgerufen hat, vermutlich durch die Aufnahme von mit BSE kontaminierter Nahrung⁹. Die Pathogenität boviner Prionen für den Menschen ist unbekannt, obwohl die Ergebnisse von Versuchen mit transgenen Mäusen, welche das humane Prionenprotein exprimieren, und welchen eine Speziesbarriere zu humanen Prionen fehlt, darauf schließen lassen, dass die Induktion der humanen Prionenerzeugung durch bovine Prionen ineffizient ist¹⁰.
Obwohl viele konvergierende Beweislinien die „nur Protein"-Hypothese für die Prionenvermehrung¹ stützen, muss nun die Gegenwart multipler ausgeprägter Isolate oder „Stämme" von Wirkstoffen, welche bei durch Inzucht erzeugten Mäusen des gleichen Prionenproteingenotyps stabil weitergegeben werden können, innerhalb dieses Modells zufriedenstellend erläutert werden. Die Stämme können bei der Passage in Mäusen¹¹ anhand ihrer unterschiedlichen Inkubationszeiträume und der Neuropathologiemuster unterschieden werden. Zum Beispiel wird eine Reihe charakteristischer natürlicher Scrapie-Stämme bei Schafen erkannt, während BSE durch einen einzigen Wirkstoffstamm⁹ verursacht zu werden scheint. Unterstützung für die Behauptung, dass Stammesspezifität durch PrP allein co diert wird, liefert die Studie zweier verschiedener Stämme übertragbarer Nerz-Enzephalopathieprionen, welche bei Hamstern seriell vermehrt werden können; diese werden als „überaktiv", Hyper (HY), und „einschläfernd", Drowsy (DY)¹², bezeichnet. Diese Stämme können durch ausgeprägte physiochemische Eigenschaften des akkumulierten PrP^sc im Gehirn der betroffenen Hamster¹³ unterschieden werden. Nach eingeschränkter Proteolyse lassen sich stammesspezifische Migrationsmuster des PrP^sc auf Polyacrylamidgelen erkennen. DY-PrP^sc scheint proteaseanfälliger zu sein als HY-PrP^sc, welches nach einer Proteinase-K-Behandlung auf Western-Blots ein anderes Bandmuster des PrP^sc zeigt. Dies steht in Zusammenhang mit unterschiedlichen N-terminalen Enden von HY- und DY-PrP^sc nach der Proteasebehandlung und impliziert unterschiedliche Konstellationen von HY- und DY-PrP^sc14. Weiters stützt die Demonstration, dass diese stammesspezifischen physiochemischen Eigenschaften während der in vitro-Erzeugung von proteaseresistentem PrP aufrecht erhalten werden kann, wenn PrP^c mit HY- oder DY-Hamster-PrP^sc gemischt wird, außerdem das Konzept, dass Prionenstämme unterschiedliche PrP-Konformer¹⁵ beinhalten.
Die humanen Prionenkrankheiten treten in ererbter, erworbener und sporadischer Form auf. Etwa 15% sind ererbt, in Verbindung mit Codiermutationen im Prionenproteingen (PRNP)¹⁶. Zu erworbenen Prionenerkrankungen zählen Kuru und iatrogene CJD (Creutzfeldt-Jacob-Krankheit). Anerkannte iatrogene Übertragungswege sind die Behandlung mit Wachstumshormon oder Gonadotropin abgeleitet aus humaner Leichenhypophyse, Dura mater oder Hornhauttransplantation sowie die Verwendung unzureichend sterilisierter neurochirurgischer Instrumente¹⁷. Die Mehrzahl humaner Prionenkrankheiten tritt jedoch als sporadische CJD auf, bei der keine pathogenen PRNP-Mutationen und keine Vorgeschichte iatrogener Exposition vorkommen. Die Mehrzahl der Fälle sporadischer CJD sind homozygot am polymorphen Rest 129, was ein verbreiteter Proteinpolymorphismus bei humanem PrP ist, welcher nachweislich eine Schlüsselrolle bei der genetischen Anfälligkeit für humane Prionenkrankheiten^6,16,18–20 spielt. Kürzlich berichtete Will et al. vom Auftreten einer neuartigen Form einer humanen Prio nenkrankheit in Großbritannien, welche ungewöhnlicherweise junge Menschen betrifft und welche ein hochkonsistentes und einzigartiges klinisch-pathologisches Muster²¹ aufweist. Bis heute sind alle untersuchten Patienten homozygot (für Methionin) am polymorphen Rest 129 des PrP und es liegen keine Codierungsmutationen vor²². Keiner der Patienten hat eine Vorgeschichte iatrogener Exposition gegenüber humanen Prionen. Dies könnte bedeuten, dass man es nun in Großbritannien mit einem neuen Risikofaktor für CJD zu tun hat, und die diätetische Exposition gegenüber spezifischen bovinen Innereien vor deren gesetzlichem Ausschluss aus der humanen Ernährung in Großbritannien 1989, scheint der wahrscheinlichste Kandidat zu sein. Das Anfälligkeitsrisiko für BSE oder einer Variante oder einer verwandten Erkrankung ist gegenwärtig, so glaubt man, das höchste für Individuen, die am polymorphen Rest 129 des PrP homozygot sind (sowie homozygot für Methionin ein höheres Risiko birgt als für Valin). Es ist nicht bekannt, wie viele Stämme humaner Prionen die Creutzfeldt-Jacob-Krankheit (CJD) verursachen; in Verbindung mit unterschiedlichen klinischpathologischen Typen sporadischer CJD²³ wurde bis heute nur von zwei unterschiedlichen Mustern proteaseresistentem PrP berichtet.
US-Patentschrift Nr. 4,892,814 offenbart ein Verfahren zum Diagnostizieren der Creutzfeldt-Jacob-Krankheit und deren Unterscheidung von anderen Ursachen für Demenz bei Patienten. Die Diagnose erfolgt durch das Analysieren von Zerebrospinalflüssigkeit aus einer Versuchsperson und das Bestimmen der Gegenwart von p130- oder p131-Proteinen.
WO 96/17249 beschreibt die Identifikation spongiformer Enzephalopathie bei Tieren durch das Identifizieren eines Wirkstoffes, welcher mit Anti-Apoliprotein-Antikörpern kreuzreagiert.
Race et al. (AM J VET RES 53 883–889 (1992)) beschreibt einen Vergleich der Scrapie-Diagnose basierend auf dem PrP-res-Nachweis mit einer Diagnose basierend auf einer histologischen Untersuchung von Schafsgehirnen. Das Verfahren beinhaltet das Vergleichen von Western-Blots von Prionenproteinproben aus Quellen einschl. Schaf, Hamster und Maus.
Priola et al. (Molecular Neuro Biology 8 113–120 (1994)) diskutiert die Transformation zwischen der normalen proteasesensitiven Form des PrP und der anormalen proteaseresistenten Form des PrP, welche für Scrapie und spongiforme Enzephalopathien charakteristisch ist. Die Autoren schlagen vor, dass es eine Interaktion zwischen PrP-res und endogenen sulfatierten Glycosaminoglykanen bei der Akkumulation von PrP-res gibt.
Dementsprechend sieht ein erster Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Typisieren einer Probe eines Prions oder spongiformer Enzephalopathie vor, wobei das Verfahren das Vergleichen und/oder Identifizieren ähnlicher physio-chemischer Eigenschaften der Probe mit einer Standardprobe bekannten Typs aufweist. Die Standardprobe eines bekannten Typs kann jede der in der Technik bekannten sein sowie weitere Proben eines bekannten Typs. Diese Standardprobe eines bekannten Typs kann die bovine spongiforme Enzephalopathie oder die Creutzfeldt-Jacob-Krankheit sein.
Das Vergleichen und/oder Identifizieren ähnlicher Eigenschaften (sofern nicht unähnliche physio-chemische Eigenschaften mit einbezogen werden), sind in der Technik gut bekannte Verfahren. Der Vergleich jeder beliebigen physiochemischen Eigenschaft kann verwendet werden, zum Beispiel ein Vergleich der Proteaseresistenz und/oder Glykoformenverhältnisse. Ein geeigneter Proteaseresistenzvergleich ist die Proteinase-K-Resistenz.
Die Standardprobe bekannten Typs kann eine bovine spongiforme Enzephalopathie-Probe sein, welche vom Rind oder nicht vom Rind abgeleitet ist. Insbesondere kann die bovine spongiforme Enzephalopathie von Säugetieren oder Geflügel abgeleitet sein, oder von Katzen, Schafen, Hirschen, Menschen oder anderen Primaten (geeigneterweise Makaken) oder Mäusen.
Das Verfahren zum Typisieren einer Probe eines Prions oder einer spongiformen Enzephalopathie kann die folgenden Schritte aufweisen: Unterziehen der Probe einer Digestion durch eine Protease, Elektrophoresieren des Resultates des Digestionsschrittes und Vergleichen des daraus resultierenden Musters der Elektrophorese mit einem Standardelektrophoresemuster einer bekannten Probe. Ähnliche und/oder leicht abgewandelte Verfahren sind im Allgemeinen gut bekannte, in der Technik ständig eingesetzte Verfahren.
Ein Verfahren zum Typisieren einer Probe oder einer spongiformen Enzephalopathie gemäß der Erfindung, kann ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Krankheit enthalten. Das Verfahren, ob nun für die Diagnose einer Krankheit oder nicht, kann eine Probe beinhalten, welche von Säugetieren oder Geflügel abgeleitet ist, insbesondere von einem Menschen oder anderen Primaten (geeigneterweise Makaken), Rindern, Schafen, Hirschen oder Mäusen.
Die zu typisierende Probe ist bevorzugt aus Gehirngewebe, anderem Gewebe des zentralen Nervensystems, einem Gewebe des lymphoretikulären Systems (einschließlich Milz, Tonsille oder Lymphknoten), Zerebrospinalflüssigkeit und/oder dem Blut abgeleitet. Eine Probe aus einem oder mehreren einzelnen Gewebe/n kann entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bei den Gegenständen gemäß des ersten Aspektes der Erfindung kann das Elektrophoresemuster der bekannten Probe ein Muster aufweisen, welches im wesentlichen dem von Typ 4 wie in 4 gezeigt ähnlich ist, oder einem äquivalenten Muster, wenn die Elektrophorese unter veränderten Bedingungen stattfindet.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung bietet eine Ausrüstung zum Typisieren einer Prionen- oder spongiformen Enzephalopathie-Probe oder zum Diagnostizieren eines Prions oder spongiformer Enzephalopathie, wobei die Ausrüstung einen Prionen- oder Enzaphalopathie-Elektrophoresegelstandard enthält. Gegebenenfalls kann die Ausrüstung Mittel beinhalten, um den Vergleich physio-chemischer Eigenschaften der zu typisierenden Proben und des Gelstandards bereitzustellen. Zu solchen Mitteln zählt ein Proteaseenzym wie Proteinase K. Die Ausrüstung kann den Gelstandard und gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe zusammen mit Anweisungen zur Verwendung der Ausrüstung und/oder Packmittel, wie einen Behälter, enthalten.
Ein dritter Aspekt der Erfindung bietet ein Verfahren zum Identifizieren einer Infektion bei einem Tier und/oder Gewebe mit boviner spongiformer Enzephalopathie, wobei das Verfahren das Bereitstellen eines Prionenproteins aus dem Tier und/oder Gewebe, sowie das Identifizieren aufweist, dass das Prionenprotein dadurch gekennzeichnet sein kann, dass es nach Proteinase-K-Digestion drei charakteristische Banden auf einem Elektrophoresegel aufweist, wobei die Bande i) eine Bande mit dem höchsten Molekulargewicht mit dem höchsten Anteil, ii) eine Bande mit dem geringsten Molekulargewicht mit dem geringsten Anteil, und iii) eine Bande mit einem Molekulargewicht zwischen i und ii, und einem Anteil zwischen i und ii enthalten, oder dadurch gekennzeichnet, dass sie im Wesentlichen ähnliche glykoforme Anteile wie bovine spongiforme Enzephalopathie aufweisen. Bei dem Verfahren gemäß dem dritten Aspekt kann das Tier und/oder Gewebe, aus dem die Prionenprobe entnommen wird, von Säugetieren oder Geflügel abgeleitet sein, und insbesondere von Menschen (oder anderen Primaten – geeigneterweise Makaken), Schafen oder Mäusen. Die Prionenprobe kann aus einem oder mehreren der Folgenden abgeleitet werden: Hirngewebe, anderem Gewebe des zentralen Nervensystems, einem Gewebe des lymphoretikulären Systems (einschließlich Milz, Tonsille oder Lymphknoten), Zerebrospinalflüssigkeit und/oder dem Blut.
Ein vierter Aspekt der Erfindung bietet ein Verfahren zum Bewerten und/oder Vorhersagen der Anfälligkeit eines Tieres, insbesondere eines humanen Individuums, für bovine spongiforme Enzephalopathie oder ein Derivat davon, wobei das Verfahren den Schritt der Bestimmung des Genotyps des Individuums am polymorphen Rest 129 des PrP enthält. Die Bestimmung kann sein, ob das Individuum am polymorphen Rest 129 des PrP homozygot oder heterozygot ist, insbesondere ob das Tier am polymorphen Rest 129 des PrP homozygot für Methionin oder Valin ist. Der anfälligste Genotyp für bovine spongiforme Enzephalopathie ist derzeit homozygot für Methionin (MM). Dieser Genotyp tritt in etwa 38% der Bevölkerung Großbritanniens auf. Weitere anfällige Genotypen sind in der Reihenfolge abnehmender Anfälligkeit Valin/Valin-homozygot und Methionin/Valinheterozygot. Das Verfahren des vierten Aspektes der Erfindung kann mit Hilfe von DNA durchgeführt werden, welche aus einer biologischen Probe des Tieres gewonnen wurde, insbesondere wenn die biologische Probe Blut ist.
Ein fünfter Aspekt der Erfindung betrifft eine Ausrüstung zum Einsatz bei der Bewertung und/oder Vorhersage der Anfälligkeit eines Tieres, insbesondere eines humanen Individuums, für bovine spongiforme Enzephalopathie oder einem Derivat davon, welche zumindest ein Paar von Primern umfasst, welches für die PCR-Amplifikation von zumindest einem Teil der Gencodierung für PrP geeignet ist. Zu geeigneten Primern zählen
5'-GTTTTCCAGTGCCCATCAGTG-3' und
5'-CTATGCACTCATTCATTATGC-3'
Wir haben eine große Auswahl an Fällen humaner Prionenkrankheiten untersucht, um Muster von proteaseresistentem PrP zu identifizieren, welche unterschiedliche, natürlich vorkommende Prionenstammtypen kennzeichnen könnten. Wir haben dann eine „neue Variante" der CJD untersucht, um zu bestimmen, ob sie einen charakteristischen Stammestyp darstellt, welcher anhand molekularer Kriterien von anderen Formen der CJD unterschieden werden kann. Hier veranschaulichen wir, dass die sporadische und iatrogene CJD mit drei charakteristischen Mustern von proteaseresistentem PrP auf Western-Blots in Verbindung steht. Typ 1 und 2 zeigen sich, wie zuvor beschrieben, bei sporadischer CJD sowie bei einigen iatrogenen CJD-Fällen. Ein dritter Typ zeigt sich bei erworbenen Prionenkrankheiten, welche über einem peripheren Weg der Exposition gegenüber Prionen entstehen. Die „neue Variante" der CJD steht in Verbindung mit einem einmaligen und hochkonsistenten Auftreten von proteaseresistentem PrP auf Western-Blots, welches ein charakteristisches Glykosylierungsmuster beinhaltet. Während die Übertragung von CJD auf durch Inzucht erzeugte Mäuse ein Muster erzeugt, welches charakteristisch für eingeimpfte CJD ist, erzeugt die Übertragung von BSE ein Glykoformverhältnismuster, welches der „neuen Variante" der CJD nahezu ähnlich ist. Ähnlich zeigen experimentelle BSE bei Makaken und natürlich erworbene BSE bei Hauskatzen ein nicht zu unterscheidendes Glykoformmuster im Vergleich zu experimenteller muriner BSE und der „neuen Variante" der CJD. Die Übertragung von CJD des Typs 1, 2 und 3 auf transgene Mäuse, welche humanes PrP exprimieren, enthüllt die Persistenz oder Umwandlung des Stammestyps in Abhängigkeit vom Genotyp des PRNP-Codons 129, womit der unterstützenden Nachweis für die „nur Protein"-Hypothese der Infektiosität erbracht ist, und was darauf schließen lässt, dass Stammesvarianten durch eine Kombination von PrP-Konstellation und Glykosylierung codiert werden könnte.
Dementsprechend bietet die vorliegende Erfindung Verfahren zum Typisieren, Diagnostizieren und Identifizieren von Infektionen und Ausrüstungen gemäß der Patentansprüche und der Beschreibung.
Sporadische und erworbene CJD
Normalerweise sind auf Western-Blots von proteaseresistentem PrP aus CJD-Fällen drei Banden zu sehen. Die beiden größeren Molekulargewicht-Banden stellen die großen glykosylierten PrP-Formen dar, während die kleinere Bande nichtglykosyliertes PrP²³ (1) darstellt. Parchi et al. beschrieb zwei charakteristische Muster bei sporadischer CJD: ein Muster vom Typ 1 zeigte sich bei der Mehrzahl der CJD-Fälle mit Homozygotie für Methionin (MM) am polymorphen Rest 129 des PrP; ein Muster vom Typ 2 zeigte sich bei einer Minderheit der MM-Fälle und bei allen Methionin/Valin-heterozygoten (MV) und Valin-heterozygoten (VV)²³ Fällen. Wir führten bei insgesamt 26 neuropathologisch bestätigten sporadischen CJD-Fällen, welche alle drei PRNP-Codon-129-Genotypen darstellten, Western-Blot-Analysen proteaseresistenter Prionenproteine durch; es wurden Fälle, die sowohl vorangegangen als auch zeitnah mit der bovinen spongiformen Enzephalopathieepidemie waren, einbezogen (Tabelle 1). Wir bestätigten die Erkenntnisse von Parchi et al.²³, dass bei sporadischer CJD MM-Fälle zwei charakteristische Bandenmuster aufwiesen (bezeichnet mit Typ 1 und 2) (1a und b und Tabelle 1), während die VV- und MV-Fälle alle das Bandenmuster vom Typ 2 zeigten²³ (1c und Tabelle 1). In unserer Probe sporadischer CJD fanden wir heraus, dass MM vom Typ 2 häufiger auftrat als MM vom Typ 1 (Tabelle 1). Außerdem verzeichnete Parchi et al. Unterschiede beim Verhältnis von proteaseresistentem PrP in jedem der drei Banden zwischen den Patienten mit sporadischer CJD vom Typ 1 und 2²³. In unserer größeren Versuchsreihe zeigte sich ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Fällen des Typs 1 und des Typs 2 bezüglich des Verhältnisses der Glykoform mit niedrigem Molekulargewicht, jedoch nicht bezüglich der beiden anderen Banden (Legende 4).
Danach untersuchten wir eine Auswahl iatrogener CJD, einschließlich Patienten mit von humaner Hypophyse abgeleiteten Wachstumshormonen mit allen drei PRNP-Codon-129-Genotypen, einem Patienten mit von humaner Hypophyse abgeleitetem Gonadotropin und einem Patienten, der CJD nach einer Dura mater Transplantation entwickelt hatte. Ein drittes charakteristisches Bandenmuster von proteaseresistentem PrP wurde bei allen Hypophysenhormon-bezogenen Fällen, welche vom PRNP-Codon-129-Genotyp MV oder VV (2) waren, nachgewiesen. Bei diesem Muster vom „Typ 3" sind alle drei Banden verschoben, und zwar im Einklang mit einer etwa 2–3 kDa Verringerung der Größe des proteaseresistenten PrP, die im Vergleich zur sporadischen CJD vom Typ 2 nachgewiesen wurde. Es gab bei dieser Probe keine signifikanten Unterschiede im Glykoform verhältnis zwischen CJD vom Typ 1 und Typ 3 oder zwischen Typ 2 und Typ 3 (Legende 4). Der einzelne MM-Wachstumshormon-Fall besaß ein Bandenmuster, welches bei der Western-Blot-Analyse nicht von den Fällen sporadischer CJD vom Typ 1 zu unterscheiden war (2). Der Dura mater-bezogene Fall besaß ein Bandenmuster, welches von sporadischer CJD vom Typ 2 nicht zu unterscheiden war (2). Die Möglichkeit, dass es eine weitere Heterogenität innerhalb einzelner PrP^sc-Typen geben kann, wird derzeit noch untersucht.
Übertragungsstudien auf Mäuse
Wir untersuchen die Übertragungseigenschaften von CJD bei transgenen Mäusen, welche humanes PrP exprimieren, jedoch kein murines PrP (bezeichnet mit HuPrP^+/+ Prn-p^%, da sie homozygot für das humane Transgenarray sind). Diesen Mäusen fehlt eine Speziesbarriere für humane Prionen, und die meisten oder alle geimpften Mäuse erliegen der Prionenerkrankung mit durchweg kurzen Inkubarionszeiten^10,24, meist im Bereich von 180–220 Tagen (Daten nicht gezeigt). Dies ist ein merklicher Unterschied zu Studien mit nicht-transgenen Mäusen mittels der gleichen Inokula, bei denen die Übertragungen selten sind, und wenn sie auftreten, stehen sie in Verbindung mit längeren und variablen Inkubationszeiten. Die Übertragung der CJD vom Typ 2 (alle drei Codon-129-Genotypen) oder Typ 3 (alle mit Genotyp MV oder W) resultierte in der Erzeugung von proteaseresistentem humanem PrP in den Mäusen mit einem identischen Bandenmuster im Vergleich zum primären Inokulum (d. h. Typ 2 bzw. Typ 3) (3). Die eingesetzten HuPrP^+/+ Prn-p^%-Mäuse codieren Valin am Rest 129²⁵. Die Übertragung von CJD vom Typ 1 (alle mit Genotyp MM) führte jedoch durchweg zu einem Bandenmuster vom Typ 2 des humanen proteaseresistenten PrP, welches in den Mäusen erzeugt wurde (3). Das Verhältnis unterschiedlicher Glykoformen auf Western-Blots von Gehirnhomogenaten aus diesen Mäusen war von dem der humanen Fälle selbst nicht zu unterscheiden (Daten nicht gezeigt).
Neue Variante der CJD
Die Proteinase-K-Behandlung von PrP^sc aus der „neuen Variante" der CJD offenbarte die charakteristische Bandenverschiebung, die sich nach der Digestion im Vergleich zum proteaseresistenten Fragment zeigte, wodurch die vollständige Digestion der proteasesensitiven N-Enden-Region des PrP^sc unter den angewandten Bedingungen bestätigt wurde (1d). Alle untersuchten Patienten mit der „neuen Variante" der CJD waren homozygot für Methionin am polymorphen Rest 129²². Es zeigten sich keine bekannten oder neuartigen Codiermutationen des PRNP bei den sequenzierten Fällen der „neuen Variante" der CJD oder den Fällen der sporadischen CJD. Die Western-Blot-Analyse dieser zehn Fälle der „neuen Variante" der CJD offenbarte ein konsistentes und charakteristisches Muster der proteaseresistenten PrP-Formen, welche anhand der Bandengrößen eindeutig von den Fällen der sporadischen CJD vom Typ 1 und 2 (1, a–c) unterschieden werden konnten, und von der CJD vom Typ 3 durch ein markantes und charakteristisches Muster der Bandenintensitäten, welche sich von allen drei CJD-Typen unterschieden (4). Deglykosylierung mit PNGaseF führte zu einer einzelnen Bande, was ungeachtet des Glykosylierungszustandes auf eine konsistente proteolytische Spaltstelle schließen lässt (1e), und welches sich von dem bei sporadischer CJD gezeigten unterscheidet. Die Glykoform mit hohem Molekulargewicht war die am häufigsten vorkommende mit relativ wenig nichtglykosyliertem PrP im Vergleich zu CJD vom Typ 1, 2 und 3. Diese Unterschiede in der Bandenintensität zu den CJD-Typen 1–3 waren alle statistisch hochsignifikant (Legende 4). Ein Streudiagramm der relativen Verhältnisse der Glykoform mit hohem Molekulargewicht und der Glykoform mit niedrigem Molekulargewicht offenbart zwei sich nicht überlappende Fallpopulationen: die „neue Variante" der CJD besitzt ein charakteristisches Muster, weiches sich deutlich von allen zuvor erkannten Typen sporadischer und iatrogener CJD unterscheidet (5a).
Vergleich mit BSE
Da sich die Bandenintensitäten des proteaseresistenten PrP bei der „neuen Variante" der CJD deutlich von der sporadischen und iatrogenen CJD unterschieden, haben wir untersucht, ob sich dieses charakteristische Glykoformmuster auch bei natürlicher oder experimentell übertragener BSE zeigt. Zuerst verglichen wir Übertragungen von BSE und CJD auf die gleichen durch Inzucht erzeugten Mäuse. Vergleichende Übertragungsdaten bei transgenen Mäusen standen nicht zur Verfügung, da BSE bis heute nicht auf HuPrP^+/+ Prn-p^%-Mäuse (> 500 Tage nach der Inokulation) übertragen wurde. Die Glykoformverhältnisse, die sich bei den CJD-Übertragungen im Vergleich zu FVB-Mäusen des Wildtyps zeigten, ließen sich nicht von denen der drei Typen der CJD unterscheiden (5b). Die BSE-Übertragung in sowohl die Wildtyp-FVB und C57BL/6-Mäuse ergab jedoch Verhältnisse, welche denen der „neuen Variante" der CJD nahezu gleich waren (5b und 6). Ähnlich waren die Bandengrößen des proteaseresistenten PrP, die sich bei der Übertragung von BSE in Mäuse des Wildtyps zeigten im Vergleich zu den Übertragungen der CJD vom Typ 2 zu einem geringeren Molekülgewicht hin verschoben (Daten nicht gezeigt). Danach untersuchten wir natürlich übertragene BSE bei Hauskatzen (feline spongiforme Enzephalopathie²⁶) und experimentelle BSE bei einem Makaken²⁷. Auch diese Fälle entsprachen nahezu der „neuen Variante" der CJD und der experimentellen murinen BSE (7a und 5b). Die BSE selbst war mit Hilfe des 3F4 monoklonalen (erhältlich von Senetek Plc., Senescence Technology, Maryland Heights, Missouri, USA) oder des R073 polyklonalen Antikörpers auf Western-Blots nicht nachweisbar. Jedoch wurde mit Hilfe eines Kaninchen-Antikörpers zu einem synthetischen humanen PrP-Peptid (95–108) ein PrP^sc-Signal von Homogenaten des Hirnstammes aus natürlich infizierter BSE erkannt und das Muster der Glykoformen (% hoch MW 51,2, % niedrig MW 33,9, % nichtglykosyliert 14,9) war nahezu gleich der übertragenen BSE und der „neuen Variante" der CJD. Dieser Antikörper wies auch PrP^sc von Hauskatze, Makake und Mensch nach, wobei ähnliche Ergebnisse zu R037- und 3F4-Antiseren erzeugt wurden (Daten nicht gezeigt).
Diskussion
Sporadische und iatrogene CJD scheint in Verbindung mit der Herstellung dreier Typen des humanen PrP^sc zu stehen, welche sich nach proteolytischer Spaltung durch unterschiedliche Bandengrößen auf Western-Blots unterscheiden lassen. Typ 1 und 2 stehen in Verbindung mit unterschiedlichen klinisch-pathologischen Phänotypen der sporadischen CJD²³, und Type 3 zeigt sich bei Fällen iatrogener CJD, bei der es anstelle eines direkten CNS-Weges (Dura mater Transplantation) über einen peripheren Weg (intramuskuläre Injektion von aus humaner Leichenhypophyse abgeleiteten Hormonen) zu einer Exposition gegenüber Prionen kam. Es ist allgemein anerkannt, dass solche Fälle des peripheren Erwerbs einen charakteristischen Phänotyp aufweisen, welcher sich eher mit zerebellärer Ataxie und einer psychiatrischen Störung darstellt als eine Demenzerkrankung²⁸. Iatrogene CJD, welche aus einer CNS-Exposition entsteht, ähnelt normalerweise der klassischen sporadischen CJD²⁸. Die neue Variante der CJD kann, während sie PrP^sc-Bandengrößen ähnlich der CJD vom Typ 3 aufweist, durch ein charakteristisches Muster der Bandenintensitäten von allen drei Typen der CJD unterschieden werden. Dieser charakteristische Molekularmarker, welcher die „neue Variante" der CJD eindeutig von sporadischer CJD unterscheidet, dient, basierend auf vergleichenden klinisch-pathologischen Studien und epidemiologischer²¹ Überwachung, der Unterstützung des Ansatzes, dass die „neue Variante" der CJD eine charakteristische und neuartige Unterart einer Prionenkrankheit ist, und zwar in Bezug auf einen zuvor nicht erkannten Prionenstamm. Die begrenzte Anzahl unterschiedlicher humaner PrP^sc-Typen macht das spontane Auftreten eines neuartigen Typs, welcher in den letzten zwei Jahren bei zwölf Individuen in Großbritannien der gleiche ist, ausgesprochen unwahrscheinlich als eine Erklärung für die „neue Variante" der CJD. Die alternative Schlussfolgerung ist, dass diese Fälle aus einer gewöhnlichen Expositionsquelle gegenüber eines neuen Prionenstammes entstanden sind, und das Fehlen jeglicher Vorgeschichte einer üblichen iatrogenen Exposition lässt darauf schließen, dass es sich hierbei um einen neuartigen Tierstamm handelt. Dass sich die Glykoform-„Signatur" der „neuen Variante" der CJD bei BSE selbst zeigt – experimentelle murine BSE (während die CJD-Übertragung auf diese Maustypen die CJD-„Signatur" erzeugt) und die natürlich übertragene BSE bei Hauskatzen und experimentelle BSE bei Makaken – steht im Einklang mit der Hypothese, dass die „neue Variante" der CJD aus der BSE-Übertragung auf den Menschen resultiert. Übertragungsstudien der „neuen Variante" der CJD bei HuPrP^+/+ Prn-P^%-Mäusen werden derzeit durchgeführt; es wird von Interesse sein, die Inkubationszeiten und Muster der Neuropathologie mit anderen CJD-Übertragungen (welche auch derzeit untersucht werden) zu vergleichen. Die PrP^sc-Typisierung wird sofort in breitangelegten epidemiologischen Studien zur Anwendung kommen: es besteht die Möglichkeit, dass BSE andere klinisch-pathologische Phänotypen bei Menschen erzeugen kann, insbesondere bei unterschiedlichen Altersgruppen und unterschiedlichen ethnischen Populationen, welche nicht als „neue Variante" der CJD erkannt werden. Weiters kann dieses Verfahren auch das Typisieren verschiedener Tiere zulassen, um zu sehen, ob BSE auch natürlich auf diese Spezies übertragen wurde. Es besteht insbesondere der Verdacht, dass BSE auf die Schafspopulation²⁹ übertragen worden sein könnte und dort erhalten bleibt. Das Typisieren bekannter Scrapie-Stämme, welche vor der BSE-Epidemie vorhanden waren, und frische Isolate werden in diesem Zusammenhang von Bedeutung sein.
Dieser molekulare Marker kann bereits bei der Differentialdiagnose der „neuen Variante" der CJD verwendet werden. Die „neue Variante" der CJD ist sowohl in ihren klinischen Merkmalen atypisch als auch beim Elektroenzephalogramm, so dass die Diagnose von der Neuropathologie abhängig ist, entweder bei der Autopsie oder in einigen Fällen bei der Gehirnbiopsie. Obwohl jedoch die Gehirnbiopsie spongiforme Enzephalopathie und PrP-Immunreaktivität zeigen kann, welche für eine Diagnose der CJD adäquat ist, sind die charakteristischen neuropathologischen Merkmale, welche für eine Diagnose der „neuen Variante" der CJD notwendig sind, in der Biopsieprobe möglicherweise nicht vorhanden²¹. Da PrP im lymphoretikulären System exprimiert wird und die Prionenreplikation in der Milz und in anderen lymphoretikulären Geweben³⁰ stattfindet, kann es möglich sein, diesen molekularen Marker der „neuen Variante" der CJD bei der Tonsillen-³¹ oder Lymphknotenbiopsie nachzuweisen und so die Gehirnbiopsie zu vermeiden.
Die Ätiologie der sporadischen CJD bleibt unklar, kann aber eine somatische PRNP-Mutation oder die spontane Umwandlung von PrP^c zu PrP^sc als ein seltenes stochastisches Ereignis beinhalten. Die sporadische CJD steht in Verbindung mit PrP^sc vom Typ 1 oder 2. Typ 1 steht immer in Verbindung mit Genotyp MM, Typ 2 mit allen Genotypen (MM, MV oder VV). Typ 3 zeigt bei der iatrogenen CJD Genotyp MV oder VV. Nur humanes PrP M129 scheint PrP^sc vom Typ 1 zu bilden, während entweder humanes PrP M129 oder humanes PrP V129 PrP^sc vom Typ 2 bilden kann.
Da sich PrP^sc vom Typ 3 nur bei MM- und VV-Individuen zeigt, besteht die Möglichkeit, dass nur humanes PrP V 129 diesen Typ bilden kann. Da sich PrP^sc vom Typ 3 bei Fällen peripher, erworbener iatrogener CJD zeigt, ist es möglich, dass dieser Stamm im lymphoretikulären System ausgewählt oder vorzugsweise davon hergestellt wird, wo die Prionenreplikation bei der experimentell übertragenen Krankheit auf Mäuse³² zuerst stattfindet. Wenn ein solcher PrP^sc-Typ vorzugsweise von humanem PrP V129 gebildet wurde, könnte dies der Überschuss des PRNP-Codon-129 VV-Genotyps unter den Fällen von CJD, die in Verbindung mit dem Hypophysenhormon^19,20,23 stehen, erklären. Es werden weitere Studien erforderlich sein, um zu bestimmen, ob das Muster des Typs 3 ein konsistenter Marker peripherer, im Gegensatz zu zentraler, Prionenexposition oder sporadischer CJD ist. Es ist jedoch von Interesse, dass sich beim Muster des Typs 4 ähnliche Bandgrößen zeigen („neue Variante" der CJD) (welche vom PRNP-Genotyp MM sind), welches sich durch periphere (vermutlich diätetische) Exposition gegenüber bovinen Prionen entwickelt zu haben scheint. Die Bildung bestimmter PrP^sc-Typen scheint durch den Wirts-PRNP-Codon-129-Genotyp begrenzt zu sein.
Diese Erkenntnis wird gestützt durch die Beobachtung, dass sich PrP^sc vom Typ 1 beim Übergang auf transgene Mäuse, welche humanes PrP exprimieren, welches an Rest 129 Valin codiert, in Typ 2 umwandelt, während Typ 2 und 3 bei einem solchen Übergang unverändert bleiben.
Dass sich unterschiedliche Typen des humanen PrP^sc in Verbindung mit charakteristischen klinisch-pathologischen Phänotypen der CJD zeigen und beim Übergang auf Mäuse beibehalten werden können, spricht dafür, dass diese charakteristische humane Prionenstämme darstellen. Die Erkenntnis, dass Stämme unterschiedliche post-translationale Modifikationen des PrP zu beinhalten scheinen, welche fortbestehen oder (wenn PrP-Genotypen falsch zugeordnet werden) beim Übergang auf Mäuse vorhersagbar zwischen einzelnen Stämmen umgewandelt werden können, stimmt mit einem „nur Protein"-Modell der Prionenvermehrung überein, bei dem Stämme durch post-translationale Modifikation des PrP selbst codiert werden, ohne dass eine Nukleinsäure oder ein anderer Co-Faktor notwendig wäre. Die Banden, die sich im Anschluss an die proteolytische Spaltung bei der Western-Analyse des PrP zeigen, stellen diglykosyliertes, monoglykosyliertes (an jeder der beiden N-verknüpften Glykosylierungsstellen³⁴) und nichtglykosyliertes PrP dar, und zwei separate Merkmale dieser Banden, Verschiebungen in der Mobilität und Unterschiede bei den relativen Intensitäten, scheinen in Verbindung mit dem Stammestyp zu stehen. Die Mobilitätsverschiebungen nach der Spaltung, welche sich bei allen drei Banden zeigen, implizieren unterschiedliche PrP-Konformationen (zu welchen auch unterschiedliche Zusammensetzungsstadien zählen können). Die Unterschiede bei den Glykoformverhältnissen könnten eine bevorzugte Umwandlung bestimmter Glykoformen in bestimmte Konformationsstadien anzeigen. Es wurde argumentiert, dass die unterschiedliche PrP-Glykosylierung in unterschiedlichen Gehirnregionen einen Mechanismus bereitstellen könnte, um auf die Neuropathologie abzuzielen, welche sich bei unterschiedlichen Stammestypen zeigt, da sich Prionen möglicherweise am effizientesten in Zellpopulationen replizieren, welche ein ähnlich glykosyliertes PrP auf der Zelloberfläche exprimieren. Sowohl die PrP-Konformation als auch die Gly kosylierung können zum Stammestyp beitragen, allerdings werden weitere Studien erforderlich sein um zu untersuchen, ob diese beiden post-translationalen Modifikationen des PrP unabhängig zum Stammestyp beitragen können, oder ob es sich um eng verknüpfte Phänomene handelt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt, dass Prionenkrankheiten mit veränderten Glykosylierungsmustern einher gehen und insbesondere bovine spongiforme Enzephalopathie und die neue Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit von anderen Formen der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit unterscheiden. Es besteht die Möglichkeit, dass bestimmte glykosylierte Formen des PrP an der Erzeugung oder der Stabilität der mit der Krankheit in Verbindung stehenden Isoformen des PrP beteiligt sind. Demzufolge werden Inhibitoren des biosynthetischen Verarbeitungspfades für Zucker, welche an die Glykoproteine gebunden sind, die Prionenreplikation hemmen und können daher als Grundlage für therapeutische Agenzien für Tier- und Human-Prionenkrankheiten verwendet werden.
Dementsprechend sieht ein sechster Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung einer Prionenkrankheit durch Verabreichung einer Verbindung vor, welche die Anlagerung der Zucker an Proteine und Glykoproteine verhindert.
Die vorliegende Erfindung sieht außerdem gemäß einem siebenten Aspekt einen pharmazeutischen Wirkstoff vor, welcher eine Verbindung aufweist, welche die Anlagerung der Zucker an einem Protein oder Glykoprotein verhindert, in Kombination mit einer pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanz.
Die vorliegende Erfindung sieht außerdem gemäß einem achten Aspekt eine Verbindung vor, welche die Anlagerung von Zuckern an Proteine oder Glykoproteine verhindert, zum Einsatz als eine aktive pharmazeutische Substanz.
Die Verbindung ist insbesondere von Nutzen bei der Verhinderung und/oder Behandlung einer Prionenkrankheit. Zu den zu behandelnden Prionenkrankheiten zählt jede derartige in der Wissenschaft bekannte Krankheit, einschließlich der bovinen spongiformen Enzephalopathie und der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (einschließlich der in dieser Anmeldung beschriebenen „neuen Variante" der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit), sowohl bei bovinen, humanen oder anderen Individuen.
Die Verbindung kann für eine solche Verwendung in einem pharmazeutisch akzeptablen Arzneimittelträger verabreicht werden, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren anderen pharmazeutisch aktiven Wirkstoffen.
Viele solcher Inhibitoren der Zuckeranlagerung an Proteine und Glykoproteine sind in der Wissenschaft bekannt. Ein Beispiel ist Deoxynojirimycin und jedes seiner Derivate.
Die vorliegende Erfindung sieht außerdem gemäß einen neunten Aspekt die Verwendung einer Verbindung vor, welche die Anlagerung von Zuckern an Proteine oder Glykoproteine verhindert, bei der Herstellung eines Medikamentes für die Verhinderung oder Behandlung einer Prionenkrankheit. Die zu behandelnde Prionenkrankheit ist die oben beschriebene.
Die Verabreichung einer solchen Verbindung für die Verhinderung oder Behandlung einer Prionenkrankheit muss entweder direkt in das infizierte Gewebe erfolgen, oder es handelt sich bevorzugt um eine Verbindung, welche in der Lage ist, die Blut-Gehirn-Barriere zu überwinden. Der therapeutische Wirkstoff kann zweckmäßigerweise oral, rektal oder topisch verabreicht werden, und die Verabreichung kann für die verbleibende Lebenszeit des Patienten erfolgen.
Alle Merkmale, einschließlich der bevorzugten Merkmale einzelner Aspekte der Erfindung wie oben beschrieben, gelten auch für andere Aspekte der Erfindung.
Die Erfindung wird nun mit Hilfe der folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele erläutert, welche dem Zweck der Veranschaulichung dienen, sowie in Bezug auf die beiliegenden Zeichen, welche Folgendes zeigen:
TABELLE 1 zeigt die Verteilung der PRNP-Genotypen und des Bandentyps des proteaseresistenten PrP bei neuropathologisch bestätigten Fallen der sporadischen, iatrogenen und der „neuen Variante" der CJD. MM = Methionin-homozygoter Genotyp am PRNP-Codon 129; MV und VV bezieht sich auf Methionin-/Valin-Heterozygoten bzw. Valin-Homozygoten.
TABELLE 2 zeigt die Inkubationszeiten für die Übertragung der Prionenkrankheiten auf transgene und Wildtyp-Mäuse.
1 zeigt Western-Blots von Proteinase-K-behandelten Gehirn-Homogenaten aus Patienten mit der sporadischen und der „neuen Variante" der CJD mit Hilfe des monoklonalen Anti-PrP-Antikörpers 3F4. Nummern neben horizontalen Balken zeigen die Positionen der Molekulargewichtsmarker (Kilodalton). (a) Spur 1, sporadische CJD vom Typ 1, PRNP-Genotyp MM; Spur 2 sporadische CJD vom Typ 2, PRNP-Genotyp MM; Spur 3 iatrogene CJD vom Typ 3, PRNP-Genotyp VV; Spur 4, „neue Variante" der CJD, PRNP-Genotyp MM, Bandenmuster „Typ 4". (b) Spur 1 und 2, sporadische CJD vom Typ 1 bzw. 2 (beide mit PRNP-Genotyp MM); Spur 3–7 Fälle der „neuen Variante" der CJD (alle PRNP-Genotyp MM). (c) Spur 1, sporadische CJD vom Typ 2, PRNP-Genotyp MV; Spur 2, sporadische CJD vom Typ 2, PRNP-Genotyp VV; Spur 3–7, „neue Variante" der CJD (alle PRNP-Genotyp MM). (d) „Neue Variante" der CJD vor (1) und nach (2) Behandlung mit Proteinase K. (e) Western-Blot von deglykolysiertem PrP. Spur 1, sporadische CJD vom Typ 2, PRNP-Genotyp MM; Spur 2, „neue Variante" der CJD, PRNP-Genotyp MM. Die Nummer neben horizontalen Balken zeigt die Position des Molekulargewichtmarkers an (Kilodalton).
2 zeigt Western-Blots von Proteinease-K-behandelten Gehirn-Homogenaten aus Patienten mit iatrogener CJD mit Hilfe des monoklonalen Anti-PrP-Antikörpers 3F4. Nummern neben waagerechten Balken zeigen die Positionen der Molekulargewichtsmarker (Kilodalton). Spuren: 1, sporadische CJD (PRNP-Genotyp MM) vom Typ 1; 2, iatrogene (Wachstumshormon-bezogene) CJD (PRNP-Genotyp MM) vom Typ 1; 3 und 4, sporadische CJD (PRNP-Genotyp MM) vom Typ 2; 5, iatrogene (Dura mater-bezogene) CJD (PRNP-Genotyp MM) vom Typ 2; 6 und 7, iatrogene (Wachstumshormon-bezogene) CJD (PRNP-Genotyp VV) vom Typ 3; 8, iatrogene (Wachstumshormon-bezogene) CJD (PRNP-Genotyp MV) vom Typ 3; 9, sporadische CJD (PRNP-Genotyp MV) vom Typ 2; 10, „neue Variante" der CJD (PRNP-Genotyp MM) vom Typ 4.
3 zeigt die Übertragung der CJD auf transgene Mäuse, welche nur humanes PrP exprimieren. Western-Blots primärer humaner Inokula und Mäusegehirn-Homogenate im Anschluss an die Behandlung mit Proteinase K mit Hilfe des monoklonalen Anti-PrP-Antikörpers 3F4. Nummern neben waagerechten Balken zeigen die Positionen von Molekulargewichtmarkern (Kilodalton). „Hu" steht für humane Inokula, „Mo" steht für transgene Mäuse, welche die Krankheit nach der Inokulation mit diesem humanen Fall entwickeln. Nummern neben waagerechten Balken zeigen die Positionen von Molekulargewichtmarkern (Kilodalton). Spur 1 und 2, sporadische CJD (MV) vom Typ 2 → Maustyp 2; Spur 3 und 4, sporadische CJD (MV) vom Typ 2 → Maustyp 2; Spur 5 und 6, iatrogene (Wachstumshormon-bezogene) CJD (MM) vom Typ 1 → Maustyp 2; Spur 7 und 8, sporadische CJD (MM) vom Typ 1 → Maustyp 2; Spur 9 und 10, sporadische CJD (MM) vom Typ 1 → Maustyp 2; Spur 11 und 12, sporadische CJD (VV) vom Typ 2 → Maustyp 2; Spur 13 und 14, iatrogene (Gonadotropin-bezogene) CJD (VV) vom Typ 3 → Maustyp 3; Spur 15 und 16, iatrogene (Dura mater-bezogene) CJD vom Typ 2 → Maustyp 2.
4 zeigt die Verhältnisse unterschiedlicher PrP-Glykoformen bei Typ 1, 2, 3 und 4 („neue Variante") der CJD. Die %-Angabe jeder Form dient als Mittel wert ± Standardfehler (s. e. m.) der drei Bandentypen. H = Glykoform mit hohem Molekulargewicht, L = Glykoform mit niedrigerem Molekulargewicht, U = nichtglykosyliert. Die Ergebnisse (%) waren Folgende: hohes Molekulargewicht: Typ 1, 25,7 ± 2,6 (n = 6); Typ 2, 25,2 ± 0,7 (n = 18); Typ 3, 28,4 ± 1,2 (n = 4); „neue Variante" der CJD („Typ 4"), 47,8 ± 1,1 (n = 9). Niedriges Molekulargewicht: Typ 1, 41,9 ± 2,2; Typ 2, 45,7 ± 0,7; Typ 3, 44,2 ± 1,3; Typ 4, 37,8 ± 0,7. Nichtglykosyliert: Typ 1, 32,5 ± 1,3; Typ 2, 29,1 ± 0,9; Typ 3, 27,4 ± 2,3; Typ 4, 14,3 ± 1,3. Die Unterschiede zwischen Typ 1 und 2 waren signifikant bezüglich der Glykoform mit geringem Molekulargewicht (P < 0,05), jedoch nicht bei der Glykoform mit hohem Molekulargewicht oder der nichtglykosylierten Form. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen Typ 1 und 3 sowie zwischen Typ 2 und 3. Alle drei Banden unterschieden sich hochsignifikant zwischen Typ 4 und 1, Typ 2 und 3 (Glykoform mit hohem Molekulargewicht bei jedem Fall P < 0,0001). Es wurden in allen Fällen ungepaarte zweiseitige T-Tests durchgeführt.
5 zeigt ein Streudiagram der Verhältnisse des proteaseresistenten PrP bei der Glykoform mit hohem Molekulargewicht und mit niedrigem Molekulargewicht bei einzelnen humanen Fällen und Tieren mit übertragener CJD oder natürlich oder experimentell übertragener BSE. (a) Vergleich der sporadischen, iatrogenen und der „neuen Variante" der CJD. Typ 1 der CJD wird mit schwarzen Vierecken dargestellt, Typ 2 mit weißen Vierecken, Typ 3 durch Kreuze und Typ 4 („neue Variante" der CJD) durch weiße Rauten. (b) Vergleich von CJD-Typen mit natürlicher und experimentell übertragener BSE. Alle Fälle sporadischer und iatrogener CJD (Typ 1–3) sind mit schwarzen Vierecken dargestellt, und die Fälle der „neuen Variante" sind mit weißen Kreisen dargestellt. Die CJD-Übertragungen auf FVB-Mäuse sind mit weißen Vierecken gekennzeichnet, BSE-Übertragungen auf FVB- und C57BL/6-Mäuse mit Kreuzen bzw. schwarzen Kreisen. Natürlich übertragene BSE bei einer Hauskatze ist mit einem schwarzen Dreieck gekennzeichnet und experimentelle BSE bei Makaken mit einer schwarzen Rautenform.
6 zeigt die Übertragung von BSE auf Wildtyp-C57BL/6- und -FVB-Mäuse. Western-Blot von Gehirn-Homogenaten im Anschluss an die Vorbehandlung mit Proteinase K mit Hilfe des Anti-PrP-Antikörpers R073. Nummern neben waagerechten Balken zeigen die Positionen von Molekulargewichtmarkern (Kilodalton). Spuren 1–3, C57BL/6-Mäuse; Spuren 4–8, FVB-Mäuse.
7 zeigt einen Western-Blot von Gehirn-Homogenaten aus einem BSE-inokulierten Makaken (Spur 1) mit Hilfe des Antikörpers R073 im Anschluss an die Vorbehandlung mit Proteinase K, sowie einer Hauskatze mit feliner spongiformer Enzephalopathie (Spur 2 und 3, vor bzw. nach der Behandlung mit Proteinase K). Nummern neben waagerechten Balken zeigen Positionen von Molekulargewichtmarkern (Kilodalton).
8 zeigt die Übertragung von Prionenkrankheiten auf Mäuse. a, Streudiagramm der Verhältnisse des proteaseresistenten PrP in den Glykoformen hochmolekularer Masse (diglykosyliert) und niedrigmolekularer Masse (monoglykosyliert) bei einzelnen humanen Fällen und FVB-Mäusen mit experimentell übertragener CJD, vCJD oder BSE. Die PrP^sc-Typen 1–3 sporadischer und iatrogener CJD-Fälle, schwarze Vierecke; vCJD, weiße Kreise; Übertragungen typischer CJD auf FVB-Mäuse, weiße Vierecke; BSE auf FVB-Mäuse, Kreuze. Übertragungen von vCJD auf FVB-Mäuse, weiße Dreiecke. b, c, Western-Blots von Gehirn-Homogenaten nach Vorbehandlung mit Proteinase K mit Hilfe des polyklonalen Anti-PrP-Antikörpers 95–108 (Ref. 44) (b) oder des monoklonalen Anti-PrP-Antikörpers 3F4 (c). Die Verfahren waren die aus Ref. 43, außer dass für die PrP-Glykoformanalyse ein chemifluoreszentes Substrat (ECF, Amersham) verwendet wurde, und die Verhältnisse wurden auf einem Storm 840 Phosphoimager (Molecular Dynamics) analysiert. b, Übertragung von vCJD und BSE auf nichttransgene FVB-Mäuse. Spur 1, humane vCJD; 2, vCJD-inokulierte FVB-Maus (gleicher Fall wie Spur 1); 3, BSE; 4, BSE-Inokulierte FVB-Maus (gleicher Fall wie Spur 3). c, Übertragung von vCJD auf HuPrP^+/+ Prn-p^0/0 transgene Mäuse. Spur 1, humane CJD, PrP^sc vom Typ 2, 2, transgene Maus inokuliert mit dem CJD-Fall von Spur 1, welche das Muster von Typ 2 zeigt; 3, humaner vCJD-Fall, transgene Maus PrP^sc vom Typ 4 inokuliert mit vCJD von Spur 3, welche das Muster von Typ 5 zeigt; humaner CJD-Fall, PrP^sc vom Typ 2, 6 und 7, PrP^sc-Muster vom Typ 5 bei vCJD-inokulierten transgenen Mäusen.
9 zeigt Western-Blots von Proteinase-K-behandelten Proben aus Patienten mit CJD, mit Hilfe des monoklonalen Anti-PrP-Antikörpers 3F4. Nummern neben waagerechten Balken zeigen Positionen von Molekulargewichtmarkern (Kilodalton). Spuren: 1, CJD Stammestyp 2; 2, CJD Stammestyp 6; 3, CJD Stammestyp 7; Spuren 4, 5 und 6, CJD Stammestyp 1, 2 bzw. 4.
BEISPIELE
Beispiel 1
Verfahren
Auswahl und molekulargenetische Analyse von Patienten
Sechsundzwanzig neuropathologisch bestätigte Fälle sporadischer CJD einschließlich aller drei Codon-129-Genotypen, sechs neuropathologisch bestätigte Fälle iatrogener CJD und zehn neuropathologisch bestätigte Fälle der „neuen Variante" der CJD verzeichnet von der National CJD Surveillance Unit oder die Prion Disease Group, von der gefrorenes Gehirngewebe zu Studienzwecken erhältlich war, wurden untersucht. Die verwendeten Gehirnproben waren Hirnrinde, meist frontale Hirnrinde. DNA wurde aus Blut- oder Gehirngewebe extrahiert und auf die Gegenwart bekannter oder neuartiger Codiermutationen im Prionenproteingen (PRNP) und zur Bestimmung des Codon-129-Genotyps analysiert. Bei 8/10 Patienten mit der „neuen Variante" der CJD und der Mehrzahl der Patienten mit sporadischer und iatrogener CJD wurde der komplette offene Leserahmen von PRNP mit Hilfe von Oligonukleotidprimeren PCR-amplifiziert, welche so ausge wählt waren, dass ein Intronen-Polymorphismus 5' zum offenen Leserahmen nicht überlagert wurde, was die Amplifizierung bestimmter Allele, wie zuvor beschrieben³⁵, verhindern kann. Das PCR-Produkt wurde in Agarosegelen größenfraktioniert, um Insertions- oder Deletionsmutationen auszuschließen, und die PCR-Produkte wurden dann auf beiden DNA-Strängen mit Hilfe eines automatisierten ABI 373- oder 377-DNA-Sequenzers sequenziert.
Western-Blot-Analyse
Zwischen 10 und 20 mg Gehirngewebe wurden in Lysispufferlösung (0,5% NP-40, 0,5% Natriumdeoxycholat in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) durch Reihendurchlauf durch Nadeln mit abnehmendem Durchmesser homogenisiert. Das Homogenat wurde durch Zentrifugierung bei 2000 U/min für 5 Minuten geklärt. Proteinase K (BDH) wurde zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml hinzugefügt und die Proben wurden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Pefabloc (Boehringer) auf 1 mM beendet. Die Proben wurden mit 2 × SDS Ladepufferlösung (125 mM Tris-HCl, 4% SDS, 20% Glycerol, 0,02% Bromophenolblau, pH-Wert 6,8) gemischt und 10 Minuten gekocht. Dann wurden sie bei 14.000 U/min in einer Mikrozentrifuge 5 Minuten vor der Elektrophorese zentrifugiert. Zwischen 1 und 20 μl Probe wurden auf 16% Tris-Glycerin-Gelen (Novex)³⁶ elektrophoresiert. Die Gele wurden dann mittels Elektroblotting auf eine PVDF-Membran (Millipore) übertragen, entweder mit Hilfe eines Tank- oder eines halbtrockenen Blotting-Systems³⁷. Die Membranen wurden in 5% BLOTTO (5% fettfreies Milchpulver in PBS mit 0,05% Tween 20) 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Nach dem Waschen in PBST (PBS mit 0,05% Tween 20) wurden die Membranen mit monoklonalem Anti-PrP-Antikörper 3F4³⁸ (verdünnt 1 : 5.000 in PBST) oder mit polyklonalem Kaninchenantikörper R073³⁹ (verdünnt 1 : 10.000 in PBST) zwischen 1 Stunde und über Nacht inkubiert. Im Anschluss an das Waschen wurde die Membran mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Kaninchen-Antimaus-Antikörper (Sigma) oder Ziegen-Antimaus-Antikörper (Sigma) bei einer Verdünnung von 1 : 10.000 in PBST 1 Stunde inkubiert. Die Membranen wurden nochmals in PBST gewaschen und mit Hilfe eines chemilumineszenten Substrates (ECL; Amersham) mit einem Biomax-MR-Film (Kodak) entwickelt.
Deglykosylierung von Prionenproteinen
25 μl 10% Gehirnhomogenat, vorbehandelt mit Proteinase K, wurden in 0,5% SDS, 1% β-Mercaptoethanol 10 Minuten bei 100°C denaturiert. NP-40 wurde auf 1% zugefügt und die Proteine wurden in 500 Einheiten PNGaseF (New England Biolabs) mit Hilfe des geschützten Puffers bei 37°C 2 Stunden inkubiert. Im Anschluss an die Digestion wurden die Proteine mit 4 Volumen Methanol präzipitiert und in SDS-Leading-Pufferlösung resuspendiert und ein Western-Blot wie oben hergestellt.
Mengenbestimmung der PrP-Glykoform-Verhältnisse
Die Blots wurden auf einem Hoefer-Scanning-Densitometer (Modell GS300) gescannt und die relativen Mengen der unterschiedlichen Glykoformen erhielt man durch computerisierte Integration der Spitzen, welche jede der drei charakteristischen Banden darstellen. Das Scannen erfolgte auf Expositionen innerhalb der linearen Spanne des fotografischen Filmes.
Übertragungsstudien bei transgenen und nicht-transgenen Mäusen
Es wurden strenge Biosicherheitsprotokolle befolgt. Transgene Mäuse, welche humanes PrP exprimieren, wurden gezüchtet und in einem mikrobiologischen Tierbehältnis der Stufe I gehalten und dann in ein Behältnis der Stufe II umgesetzt, in dem die intrazerebrale Inokulation in einem mikrobiologischen Sicherheitsschrank der Klasse I stattfand. Die Vorbereitung der Inokula und Entfernung der Gewebe erfolgte in einem mikrobiologischen Behältnis der Stufe III. Alle Mäuse wurden zweimal wöchentlich auf die Entwicklung klinischer Anzeichen für Scrapie untersucht. Beim Einsetzen der Anzeichen wurden die Mäuse täglich untersucht. Die Mäuse wurden selektiv getötet, wenn sie Anzeichen von Schmerz zeigten. Die Kriterien für die klinische Diagnose von Scrapie bei Mäusen waren die zuvor beschriebenen⁴⁰. Transgene Linien, welche humanes PrP, jedoch kein murines PrP exprimieren, wurden durch Züchten der Mäuse, welche transgen für humanes PrP (bezeichnet mit Tgl52, hergestellt wie zuvor beschrieben²⁵) sind, mit Mäusen, welche für PrP-Null-Allele⁴¹ homozygot sind, etabliert. Alle Mäuse wurden genotypisiert, um die Gegenwart des HuPrP-Transgens oder PrP-Null-Allels durch Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Genom-DNA, welche man durch Schwanzbiopsie wie beschrieben⁴² erhielt, zu bestätigen. Tgl52-Mäuse besitzen Expressionsniveaus von humanem PrP von 200% im Vergleich zu dem, was sich in normalem humanem Gehirn zeigt⁴². Die Mäuse wurden mit Halothan/O₂ anästhetisiert und mit 30 μl eines 1% Gehirnhomogenates in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) intrazerebral in den Scheitellappen inokuliert.
Beispiel 2
Charakteristische Prionenstämme werden anhand ihrer biologischen Eigenschaften bei der Übertragung auf Labortiere und der physischen und chemischen Unterschiede in den PrP^sc-Stämmen unterschieden. Wir haben nun gefunden, dass die biologischen und molekularen Übertragungseigenschaften der vCJD im Einklang damit stehen, dass es sich hierbei um das humane Gegenstück zur BSE handelt.
Wir haben transgene Mäuse untersucht, welche nur humanes PrP (HuPrP^+/+ Prn-p^0/0) exprimieren, welchen im Vergleich zu nicht-transgenen (FVB) Mäusen nachweislich eine Speziesbarriere für humane Prionen aus einem iatrogenen CJD-Fall fehlt. Alle 16 weiteren CJD-Fälle, welche eine große Spannbreite klinisch-pathologischer Phänotypen einschließen, alle drei PrP^sc-Typen, welche bei sporadischen und erworbenen Prionenkrankheiten nachgewiesen wurden, sowie alle PRNP-Genotypen am polymorphen Codon 129, einer Hauptdeterminante der ge netischen Anfälligkeit für humane Prionenkrankheiten, wurden auf diese trangenen Mäuse übertragen.
Nahezu alle inokulierten Mäuse erkrankten in ähnlich kurzen Inkubationszeiträumen, was im Einklang mit dem Fehlen der Speziesbarriere für diese Isolate steht (Tabelle 2). Diese transgenen Mäuse exprimieren humanes PrP homozygot für Valin am Codon 129. Jedoch gab es keinen signifikanten Unterschied bei den mittleren Inkubationszeiten zwischen Inokula der unterschiedlichen Codon-129-Genotypen. Die PrP^sc-Typisierung dieser Übertragungen zeigte, dass die gleichen Prionentypen, welche sich bei sporadischer und iatrogener CJD (Typ 1–3) zeigen, erzeugt werden, im Unterschied zu dem der sich bei vCJD (Typ 4) zeigt. Bei FVB-Mäusen zeigten sich, mit längeren und variablen Inkubationszeiträumen, nur vereinzelte Übertragungen.
Im Gegensatz dazu wurde eine effiziente Übertragung von vCJD auf FVB-Mäuse beobachtet (Tabelle 2), obwohl die Inkubationszeiträume verlängert waren. Umgekehrt war die Befallrate der vCJD bei den transgenen Mäusen im Vergleich zur typischen CJD verringert, und die Inkubationszeiten waren im Allgemeinen realisierbarer und verlängert. Die mittleren Inkubationszeiten zu diesen sechs vCJD-Fällen waren bei beiden Maustypen ähnlich. Der klinische Verlauf bei vCJD-inokulierten transgenen Mäusen war viel länger als bei den Übertragungen der typischen CJD. vCJD bei Menschen steht außerdem in Verbindung mit einer langen klinischen Dauer. Neben der Ausprägung der typischen neurologischen Merkmale liefen einige Mäuse beständig rückwärts. Dieses ungewöhnliche klinische Anzeichen zeigte sich bei den Übertragungen der typischen CJD, fataler familiärer Insomnie oder anderer ererbter Prionenkrankheiten nicht.
BSE wird effizient auf FVB-Mäuse übertragen, obgleich mit verlängerten und variablen Inkubationszeiten (Tabelle 2), welche im zweiten Durchlauf (Daten nicht gezeigt) mit einer konsistenten kurzen Inkubationszeit von etwa 140 Tagen beginnen. Übertragungen von BSE auf die transgenen Mäuse fanden in Inkubati onszeiträumen statt, welche nicht viel über denen der klassischen CJD lagen, jedoch haben wir nun eine Übertragung mit viel längeren Inkubationszeiträumen beobachtet (Tabelle 2). Diese Übertragungen ähneln denen der vCJD mit einer langen klinischen Dauer und dem Rückwärtslaufen einiger Tiere sowie den ansonsten typischen klinischen Merkmalen der Maus-Scrapie.
Es gab auffällige Ähnlichkeiten bei den PrP-Depositionsmustern zwischen BSE- und vCJD-inokulierten Tieren (detaillierte neuropathologische Studien werden an anderer Stelle veröffentlicht). Solche Muster werden vom Wirtsgenotyp sowie vom Agensstamm bestimmt. Uns zeigten sich charakteristische Muster bei den beiden Maustypen, jedoch erzeugten in beiden Fällen vCJD und BSE nahezu ähnliche Muster. Bei vCJD- und BSE-inokulierten nicht-transgenen Mäusen gab es PrP-Plaques und diffuse PrP-Deposition. Bei vCJD- und BSE-inokulierten HuPrP^+/+ Prn-p^0/0 transgenen Mäusen zeigte sich uns ein vorrangig perizelluläres Muster der PrP-Immunfärbung (Daten nicht gezeigt). PrP-Plaques sind ein seltenes Merkmal der Prionenkrankheit bei Mäusen. Gelegentlich zeigten scheininokulierte transgene Mäuse eine schwächere und weniger extensive perizelluläre PrP-Immunfärbung, wahrscheinlich als Reflektion des hohen Levels der PrP^c-Überexpression bei diesen Mäusen. Der Western-Blot für PrP^sc war bei allen diesen Kontrollen negativ.
Wir haben eine Western-Blot-Analyse durchgeführt, um die bei diesen Übertragungen erzeugten PrP^sc-Typen zu bestimmen. Wir haben zuvor nachgewiesen, dass der bei vCJD (Typ 4) auftretende PrP^sc-Typ ein Glykoformenverhältnis aufweist, welches dem übertragener BSE bei mehreren anderen Spezies nahezu gleicht². vCJD-inokulierte FVC-Mäuse erzeugten Maus-PrP^sc mit Typ 4-ähnlichen Glykoformverhältnissen und Fragmentgrößen, welche von denen bei BSE-inokulierten FVB-Mäusen (1a, b) nicht zu unterscheiden sind.
Bei der Übertragung von vCJD auf HuPrP^+/+ Prn-p^0/0 transgene Mäuse, bei denen humanes PrP^sc erzeugt wird, können Fragmentgrößen in Inokulum und Wirt direkt verglichen werden. Wieder wies das erzeugte PrP^sc Typ 4-ähnliche Glykoformverhältnisse auf. Jedoch unterscheiden sich die Fragmentgrößen von denen im Inokulum und waren nicht von denen im PrP^sc-Muster vom Typ 2 zu unterscheiden (1c). Wir haben dieses neue Muster mit Typ 5 bezeichnet.
Von einer Veränderung der Fragmentgröße bei der Übertragung auf Mäuse eines unterschiedlichen Codon-129-PrP-Genotyps als das Inokulum wurde zuvor berichtet. PrP^sc vom Typ 1, gesehen bei CJD-Fällen des 129 MM PRNP-Genotyps, wandelt sich bei der Übertragung auf diese transgenen Mäuse, welche 129 VV humanes PrP exprimieren, beständig in PrP^sc vom Typ 2 um. Die Glykoformverhältnisse des ursprünglichen Inokulums werden auch beibehalten². Abrupte Veränderungen der biologischen Eigenschaften (,Mutation') der murinen Scrapie-Stämme bei der Übertragung auf Mäuse unterschiedlicher Genotypen sind allgemein bekannt. Wir waren jedoch nicht in der Lage, PrP^sc mit Hilfe von Western-Blots bei BSE-inokulierten transgenen HuPrP^+/+ Prn-p^0/0-Mäuse nachzuweisen. Dies könnte das selektive Töten vieler dieser Mäuse schon kurz nach der klinischen Diagnose anstatt in einem fortgeschritteneren klinischen Stadium reflektieren. Obwohl von der Übertragung von Prionenkrankheiten ohne nachweisbares PrP^sc beim primären Übergang berichtet wurde, ist es wichtig, die Übertragung durch Studien des zweiten Übergangs zu bestätigen.
Die Prionentiter dieser primären Inokula sind unbekannt, können allerdings bei den humanen Fällen höher sein, da Rinder mit BSE vor den Endstadien der Krankheit selektiv getötet sein werden. Bei klinischen, pathologischen und molekularen Kriterien zeigt die vCJD jedoch eine beachtliche Ähnlichkeit bei ihren Übertragungseigenschaften zur BSE, und unterscheidet sich doch sehr von allen anderen Formen der sporadischen und erworbenen CJD. Diese Daten ergeben den zwingenden Beweis, dass BSE und vCJD vom gleichen Prionenstamm verursacht werden. Zusammengenommen mit dem temporären und räumlichen Zusammenhang der vCJD mit der BSE, jedoch nicht mit Scrapie oder anderen Tierprionenkrankheiten, und den BSE-Übertragungsstudien bei Makaken, lässt dies stark darauf schließen, dass vCJD durch BSE-Exposition verursacht wird. Die theoretische Möglichkeit, dass sowohl BSE als auch vCJD aus der Exposition gegenüber einer gemeinsamen nicht identifizierten Quelle entstehen, scheint gering.
Die Erzeugung eines charakteristischen molekularen Stammestyps bei der Übertragung der vCJD auf Mäuse, welche humanes Valin 129 PrP exprimieren, lässt darauf schließen, dass BSE, welche auf Menschen diesen Genotyps übertragen wird, einen ähnlichen Stamm erzeugen könnte. Solche Fälle können sich in ihrem klinischen und pathologischen Phänotyp von der vCJD unterscheiden, könnten jedoch durch PrP^sc-Typisierung identifiziert werden.
Obwohl argumentiert wurde, dass die Speziesbarriere in den PrP-Primärstrukturunterschieden zwischen Spender und Wirt liegt, unterstreichen unsere Daten, dass der Stammestyp genauso wichtig sein kann. Da die Prionenvermehrung Interaktionen zwischen PrP^sc und Wirts-PrP^c beinhaltet, und Stämme in Verbindung mit Unterschieden bei der PrP-Konstellation und Glykosylierung stehen, können solche PrP-Interaktionen am effizientesten sein, wenn die interagierenden Proteine nicht nur die gleiche Sequenz besitzen, sondern ähnliche Konstellationspräferenzen und Glykosylierung aufweisen. Die Nichtübereinstimmung des Codon 129 zwischen Inokulum und HuPrP^+/+ Prn-p^0/0 Mäusen hat keine signifikante Auswirkung auf die CJD-Übertragung, dies könnte bei BSE allerdings anders sein. Alle vCJD-Fälle weisen den 129-MM-Genotyp auf. Obwohl unsere 129-VV-Mäuse viel weniger anfällig für BSE als für die typische CJD sind, was auf eine erhebliche Speziesbarriere schließen lässt, könnten 129-MM-Mäuse, welche humanes PrP exprimieren, anfälliger sein.
Beispiel 3
Proben aus 100 CJD-Patienten wurden gemäß der bereits oben beschriebenen Verfahren PrP^sc-typisiert. Dementsprechend können zwei neue charakteristische Muster des proteaseresistenten PrP auf Western-Blots identifiziert werden. Diese wurden mit Typ 6 und 7 (9) benannt, und man geht davon aus, dass es sich um zusätzliche Untertypen der klassischen CJD handelt.
Literaturhinweise

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Claims

Verfahren zum Typisieren einer Probe eines Prions oder spongiformer Enzephalopathie, wobei das Verfahren das Vergleichen und Identifizieren ähnlicher physio-chemischer Eigenschaften der Probe mit einer Standardprobe des bekannten PrP^sc-Typs aufweist, und wobei die physio-chemischen Eigenschaften die Größen und Verhältnisse charakteristischer PrP^sc-Glykoformen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Verfahren außerdem den Vergleich der Proteaseresistenz der Probe mit der Standardprobe des bekannten PrP^sc-Typs aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem die Standardprobe des bekannten PrP^sc-Typs die bovine spongiforme Enzephalopathie oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit ist.
Verfahren nach Anspruch 3, bei welchem die spongiforme Enzephalopathie von Säugetieren oder Geflügel abgeleitet ist, insbesondere von Rindern, Katzen, Hirschen, Schafen, Menschen oder anderen Primaten (geeigneterweise Makaken) oder Mäusen.
Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Unterziehen der Probe einer Digestion durch eine Protease, Elektrophoresieren des Resultates des Digestionsschrittes und Vergleichen des daraus resultierenden Musters der Elektrophorese mit einem Standardelektrophoresemuster einer bekannten PrP^sc-Probe.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Typisieren der Probe ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Krankheit aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem die zu typisierende Probe von Säugetieren oder Geflügel abgeleitet ist, insbesondere von einem Menschen oder einem anderen Primaten (geeigneterweise Makaken), Rindern, Katzen, Schafen, Hirschen oder Mäusen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem die zu typisierende Probe aus Hirngewebe, anderem Gewebe des zentralen Nervensystems, einem Gewebe des lymphoretikulären Systems, einschließlich Milz, Tonsille oder Lymphknoten, Zerebrospinalflüssigkeit und/oder dem Blut abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem das Elektrophoresemuster der bekannten PrP^sc-Probe ein Muster aufweist, welches im Wesentlichen ähnlich dem des in 4 beschriebenen Typs 4 ist.
Verfahren zum Identifizieren einer Infektion bei einem Tier und/oder Gewebe boviner spongiformer Enzephalopathie, wobei das Verfahren das Bereitstellen eines Prionenproteins aus einem Tier und/oder einer Gewebeprobe, sowie das Identifizieren aufweist, dass das Prionenprotein dadurch gekennzeichnet sein kann, dass es drei charakteristische Bänder auf einem Elektrophoresegel gefolgt von Proteinase-K-Digestion aufweist, wobei die Bänder i) ein Band mit dem höchsten Molekulargewicht mit dem höchsten Anteil, ii) ein Band mit dem geringsten Molekulargewicht mit dem geringsten Anteil, und iii) ein Band mit einem Molekulargewicht zwischen i und ii, und einem Anteil zwischen i und ii enthalten, und dadurch gekennzeichnet sind, dass sie im Wesentlichen ähnliche glykoforme Anteile wie bovine spongiforme Enzephalopathie aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem das Tier oder Gewebe nicht-bovin ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, bei welchem das Tier und/oder Gewebe, aus dem das Prion entnommen wurde, von Säugetieren oder Geflügel abgeleitet ist, insbesondere von Menschen oder anderen Primaten (geeigneterweise Makaken), Rindern, Katzen, Hirschen, Schafen oder Mäusen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, bei welchem das Prion aus Hirngewebe, anderem Gewebe des zentralen Nervensystems, einem Gewebe des lymphoretikulären Systems, einschließlich Milz, Tonsille oder Lymphknoten, Zerebrospinalflüssigkeit und/oder dem Blut abgeleitet ist.
Verwendung einer Verbindung, welche die kovalente Anlagerung von Zuckern an Proteine oder Glykoproteine bei der Herstellung eines Medikamentes zum Verhindern oder Behandeln der bovinen spongiformen Enzephalopathie oder der Variante Creutzfeldt-Jakob-Krankheit verhindert.
Verwendung nach Anspruch 14, bei welcher die Verbindung Deoxynojirimycin oder ein Derivat davon ist.