DE69730514T2

DE69730514T2 - Amidase

Info

Publication number: DE69730514T2
Application number: DE69730514T
Authority: DE
Inventors: Dennis Murphy; C. John REID; Dan Robertson
Original assignee: Diversa Corp
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 1996-06-17
Filing date: 1997-06-17
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2017-06-18
Also published as: US6004796A; EP0937139B1; US6429004B1; CA2258512C; US5877001A; WO1997048794A1; JP4306802B2; US6465204B1; US6525190B1; ES2227701T3; DE69730514D1; ATE275205T1; US5985646A; EP0937139A4; US6136583A; EP0937139A1; CA2258512A1; US6500659B1; AU723433B2; AU3372897A

Description

Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, die von solchen Polynucleotiden codiert werden, und die Verwendung derartiger Polynucleotide und Polypeptide sowie die Herstellung und Isolierung derartiger Polynucleotide und Polypeptide. Genauer gesagt wurde das Polypeptid der vorliegenden Erfindung als Amidase identifiziert und insbesondere als Enzym, das die Aktivität besitzt, Arginin, Phenylalanin oder Methionin vom N-terminalen Ende von Peptiden bei der Synthese von Peptiden oder Peptidmimetika zu entfernen.
Thermophile Bakterien haben eine beträchtliche Aufmerksamkeit als Quelle hoch aktiver und thermostabiler Enzyme erhalten (Bronneomeier, K. und Staudenbauer, W. L., D. R. Woods (Herausg.), The Clostridia and Biotechnology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA (1993)). Jüngst wurden die extremsten thermophilen organotrophen Eubakterien isoliert und charakterisiert, die derzeit bekannt sind. Diese Bakterien, die zur Gattung Thermotoga gehören, sind fermentative Mikroorganismen, die eine Reihe von Kohlenhydraten metabolisieren (Huber, R. und Stetter, K. O., in Ballows, et al., (Herausg.), The Procaryotes, 2. Ausgabe, Springer-Verlag, New York, S. 3809–3819 (1992)).
Da bisher die meisten aus der Gruppe der Archaea identifizierten Organismen thermophil oder hyperthermophil sind, werden die Archaebakterien auch als fruchtbare Quelle der thermophilen Enzyme betrachtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden ein neues Enzym sowie aktive Fragmente, Analoga und Derivate davon bereitgestellt.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, die ein Enzym der vorliegenden Erfindung codieren, einschließlich mRNAs, DNAs, cDNAs, genomische DNAs sowie aktive Analoga und Fragmente von derartigen Enzymen.
Nach einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung derartiger Polypeptide durch rekombinante Techniken bereitgestellt, umfassend die Züchtung rekombinanter prokaryontischer und/oder eukaryontischer Wirtszellen, enthaltend eine Nucleinsäuresequenz, die ein Enzym der vorliegenden Erfindung codiert, unter Bedingungen, die die Expression des Enzyms und anschließende Gewinnung des Enzyms fördern.
Nach einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Nutzung eines derartigen Enzyms oder eines Polypeptids, das ein derartiges Enzym codiert, bereitgestellt. Das Enzym ist nützlich für die Entfernung von Arginin-, Phenylalanin- oder Methionin-Aminosäuren vom N-terminalen Ende von Peptiden bei der Synthese von Peptiden oder Peptidmimetika. Das Enzym ist für das L- oder das „natürliche" Enantiomer der Aminosäurederivate selektiv und ist deshalb für die Herstellung optisch aktiver Verbindungen nützlich. Diese Reaktionen können in Gegenwart der chemisch reaktiveren Esterfunktionalität erfolgen, ein Schritt, der mit nicht enzymatischen Verfahren sehr schwer zu erreichen ist. Das Enzym kann auch hohe Temperaturen (mindestens 70°C) und hohe Konzentrationen organischer Lösungsmittel (> 40% DMSO) tolerieren, die beide eine Störung der Sekundärstruktur in Peptiden verursachen; dies ermöglicht die Spaltung von ansonsten resistenten Bindungen.
Nach einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden auch Nucleinsäuresonden, die Nucleinsäuremoleküle mit ausreichender Länge enthalten, bereitgestellt, um spezifisch mit einer Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren.
Nach einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Nutzung derartiger Enzyme oder Polynucleotide, die derartige Enzyme codieren, für in-vitro-Zwecke im Zusammenhang mit wissenschaftlicher Forschung bereitgestellt, beispielsweise, um Sonden zur Identifizierung ähnlicher Sequenzen zu erzeugen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren könnten.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten aufgrund der hier dargelegten Ausführungen für den Fachmann offensichtlich sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen dienen zur Erläuterung der erfindungsgemäßen Ausführungsformen und sollen den erfindungsgemäßen Umfang, wie durch die Ansprüche umfasst, nicht einschränken.
1 ist eine Darstellung der DNA mit der gesamten Länge und der entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenz des Enzyms der vorliegenden Erfindung. Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung eines automatisierten 378-DNA-Sequenziergerätes (Applied Biosystems, Inc.).
2 stellt die Fluoreszenz gegenüber der DMSO-Konzentration dar. Die ausgefüllten und leeren Kästchen zeigen individuelle Tests von Beispiel 3.
3 stellt die relativen linearen Anfangsraten dar (Anstieg bei der Fluoreszenz pro Min., d. h. „Aktivität") gegenüber der DMF-Konzentration für das reaktivere CBZ-L-Arg-AMC aus Beispiel 3.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Mit dem Begriff „Gen" ist der DNA-Abschnitt gemeint, der an der Herstellung einer Polypeptidkette beteiligt ist; er schließt die Bereiche vor und nach dem codierenden Bereich (Leader und Trailer) sowie dazwischenliegende Sequenzen (Introns) zwischen individuellen codierenden Abschnitten (Exons) ein.
Eine codierende Sequenz ist „funktional verbunden mit" einer anderen codierenden Sequenz, wenn die RNA-Polymerase die beiden codierenden Sequenzen in eine einzelsträngige mRNA transkribiert, die dann in ein einzelnes Polypeptid mit Aminosäuren translatiert wird, die von beiden codierenden Sequenzen stammen. Die codierenden Sequenzen brauchen nicht zusammenhängend sein, so lange die exprimierten Sequenzen letztendlich prozessiert werden, um das gewünschte Protein zu produzieren.
„Rekombinante" Enzyme beziehen sich auf Enzyme, die durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden, d. h. von Zellen produziert werden, die durch ein exogenes DNA-Konstrukt transformiert werden, das das gewünschte Enzym codiert. „Synthetische" Enzyme sind diejenigen, die mittels chemischer Synthese hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt im Wesentlichen reine Amidase-Enzyme bereit. Der Begriff „im Wesentlichen rein" wird hier verwendet, um ein Molekül wie ein Polypeptid (z. B. ein Amidase-Polypeptid oder ein Fragment davon) zu beschreiben, das im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten, Nucleinsäuren und anderen biologischen Materialien ist, mit denen es natürlich assoziiert ist. Beispielsweise kann ein im Wesentlichen reines Molekül, wie ein Polypeptid, mindestens 60%, bezogen auf das Trockengewicht, des Moleküls von Interesse ausmachen. Die Reinheit der Polypeptide kann unter Verwendung von Standardverfahren, einschließlich z. B. Polyacrylamidgelelektrophorese (z. B. SDS-PAGE), Säulenchromatographie (z. B. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)) und aminoterminale Sequenzanalyse von Aminosäuren, bestimmt werden.
Eine DNA „codierende Sequenz von" einem bestimmten Enzym oder eine „Nucleotidsequenz, codierend" ein bestimmtes Enzym, ist eine DNA-Sequenz, die in ein Enzym transkribiert oder translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gesetzt wird. Eine „Promotorsequenz" ist ein regulatorischer DNA-Bereich, der eine RNA-Polymerase in einer Zelle binden und die Transkription einer stromabwärts (3'-Richtung) codierenden Sequenz initiieren kann. Der Promotor ist Teil der DNA-Sequenz. Dieser Sequenzbereich besitzt ein Startcodon an seinem 3'-Ende. Die Promotorsequenz schließt eine minimale Anzahl von Basen ein, wobei Elemente notwendig sind, um die Transkription in einem Ausmaß zu initiieren, die über dem Hintergrund nachweisbar sind. Nachdem jedoch die RNA-Polymerase die Sequenz gebunden hat und die Transkription am Startcodon (3'-Ende mit Promotor) initiiert wurde, schreitet die Transkription stromabwärts in 3'-Richtung voran. Innerhalb der Promotorsequenz findet man eine Transkriptionsinitiationsstelle (zweckmäßigerweise durch Kartierung mit S1-Nuclease definiert) sowie proteinbindende Domänen (Consensussequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein gereinigtes thermostabiles Enzym bereit, das die Entfernung von Arginin-, Phenylalanin- oder Methionin-Aminosäuren vom N-terminalen Ende von Peptiden bei der Synthese von Peptiden oder Peptidmimetika katalysiert. Das gereinigte Enzym ist eine Amidase, die von einem Organismus stammt, der hier als „Thermococcus GU5L5" bezeichnet wird, der ein thermophiler Archaea-Organismus ist, der ein sehr hohes Temperaturoptimum besitzt. Der Organismus ist strikt anaerob und wächst zwischen 55 und 90°C (optimal bei 85°C). GU5L5 wurde in einem flachen marinen hydrothermalen Gebiet in Vulcano, Italien, entdeckt. Der Organismus besitzt coccoide Zellen, die einzeln oder in Paaren auftreten. GU5L5 wächst optimal bei 85°C und einem pH-Wert von 6,0 in einem marinen Medium mit Pepton als Substrat und Stickstoff in der Gasphase.
Das erfindungsgemäße Polynucleotid wurde ursprünglich aus einer genomischen Genbank gewonnen, die von Thermococcus GU5L5 stammt, wie nachstehend beschrieben. Es enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein mit 622 Aminosäureresten codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das Amidase-Enzym der vorliegenden Erfindung ein Molekulargewicht von etwa 68,5 Kilodalton, wie anhand der Nucleotidsequenz des Gens abgeleitet wird.
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle (Polynucleotide) bereitgestellt, die das reife Enzym mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NR: 2) codieren.
Diese Erfindung stellt, zusammen mit dem isolierten Nucleinsäuremolekül, das ein in 1 (SEQ ID NR: 1) offenbartes Amidase-Enzym codiert, im Wesentlichen ähnliche Sequenzen bereit. Die isolierten Nucleinsäuresequenzen sind im Wesentlichen ähnlich, falls: (i) sie in der Lage sind, unter den hier nachstehend beschriebenen stringenten Bedingungen mit SEQ ID NR: 1 zu hybridisieren oder (ii) sie DNA-Sequenzen codieren, die zu SEQ ID NR: 1 degeneriert sind. Degenerierte DNA-Sequenzen codieren die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, haben jedoch Variationen in den Nucleotid codierenden Sequenzen. Wie hier verwendet, bezieht sich „im Wesentlichen ähnlich" auf die Sequenzen, die eine ähnliche Identität mit den Sequenzen der vorliegenden Erfindung haben. Die Nucleotidsequenzen, die im Wesentlichen ähnlich sind, können durch Hybridisierung oder Sequenzvergleich identifiziert werden. Enzymsequenzen, die im Wesentlichen ähnlich sind, können durch ein oder mehrere der folgenden Verfahren identifiziert werden: proteolytische Spaltung, Gelelektrophorese und/oder Mikrosequenzierung.
Ein Mittel zur Isolierung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein Amidase-Enzym codiert, ist dazu gedacht, eine Genbank mit einer natürlichen oder künstlich konstruierten Sonde unter Verwendung von im Fachgebiet anerkannten Verfahren abzusuchen (vgl. beispielsweise: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. M. et al. (Herausg.) Green Publishing Company Assoc. und John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Es ist dem Fachmann bewusst, dass SEQ ID NR: 1 oder Fragmente davon (umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nucleotide) eine besonders nützliche Sonde sind. Andere besonders nützliche Sonden für diesen Zweck sind hybridisierbare Fragmente zu den Sequenzen von SEQ ID NR: 1 (d. h., umfassend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nucleotide).
Im Hinblick auf die Nucleinsäuresequenzen, die mit hier offenbarten spezifischen Nucleinsäuren hybridisieren, kann die Hybridisierung unter Bedingungen der verringerten Stringenz, mittleren Stringenz oder sogar stringenten Bedingungen erfolgen. Als Beispiel der Oligonucleotidhybridisierung wird eine Polymermembran, enthaltend immobilisierte denaturierte Nucleinsäure, zuerst 30 Minuten bei 45°C in einer Lösung, bestehend aus 0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, pH 7,0, 5,0 mM Na₂EDTA, 0,5% SDS, 10X Denhardt und 0,5 mg/ml Polyriboadenylsäure, vorhybridisert. Etwa 2 × 10⁷ CpM (spezifische Aktivität 4–9 × 10⁸ CpM/μg) einer am Ende mit ³²P markierten Oligonucleotidsonde wird dann der Lösung zugegeben. Nach 12–16-stündiger Inkubation wird die Membran 30 Minuten bei Raumtemperatur in 1X SET (150 mM NaCl, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,8, 1 mM Na₂EDTA), enthaltend 0,5% SDS, gewaschen, worauf sich ein 30-minütiges Waschen der Oligonucleotidsonde in frischem 1X SET bei Tm-10°C anschließt. Die Membran wird dann einer Autoradiographie zum Nachweis der Hybridisierungssignale unterzogen.
Stringente Bedingungen bedeuten, dass die Hybridisierung nur stattfindet, wenn mindestens 90% Identität, vorzugsweise mindestens 95% Identität und am meisten bevorzugt mindestens 97% Identität zwischen den Sequenzen vorhanden ist. Vgl. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Ausg. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory), das hiermit durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit einbezogen wird.
„Identität", wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Polynucleotidsequenz, die einen Prozentsatz derselben Basen wie ein Referenznucleotid (SEQ ID NR: 1) umfasst. Beispielsweise besitzt ein Polynucleotid, das mindestens 90% mit einem Referenznucleotid identisch ist, Polynucleotidbasen, die mit 90% der Basen identisch sind, die das Referenznucleotid ausmachen, und können bei 10% der Basen, die jene Polynucleotidsequenz umfassen, unterschiedliche Basen haben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polynucleotide, die sich dadurch vom Referenzpolynucleotid unterscheiden, dass die Änderungen stumme Änderungen sind, beispielsweise verändern die Änderungen nicht die Aminosäuresequenz, die vom Polynucleotid codiert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Änderungen der Nucleotide, die zu Substitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen von Aminosäuren im Enzym führen, das vom Referenznucleotid (SEQ ID NR: 1) codiert wird. In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Aspekt behalten diese Enzyme dieselbe biologische Funktion bei wie das von Referenznucleotid codierte Enzym.
Man ist sich auch bewusst, dass derartige Sonden vorzugsweise mit einem analytisch nachweisbaren Reagenz markiert sein können, und vorzugsweise markiert sind, um die Identifizierung der Sonde zu erleichtern. Nützliche Reagenzien schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Radioaktivität, fluoreszierende Farbstoffe oder Enzyme, die in der Lage sind, die Bildung eines nachweisbaren Produkts zu katalysieren. Die Sonden sind daher nützlich, um komplementäre Kopien der DNA von anderen tierischen Quellen zu isolieren oder derartige Quellen nach verwandten Sequenzen zu durchmustern.
Die codierende Sequenz für das Amidase-Enzym der vorliegenden Erfindung wurde identifiziert, indem eine genomische DNA-Bank von Thermococcus GU5L5 hergestellt wurde und die Genbank nach Clonen mit Amidase-Aktivität durchmustert wurde. Derartige Verfahren zur Konstruktion einer genomischen Genbank sind im Fachgebiet gut bekannt. Ein Mittel umfasst beispielsweise das Scheren von DNA, die von GU5L5 isoliert wurde, durch physikalisches Brechen. Eine kleine Menge der gescherten DNA wird auf einem Agarosegel überprüft, um zu bestätigen, dass die Mehrheit der DNA im gewünschten Größenbereich liegt (etwa 3–6 kb). Die DNA wird dann unter Verwendung von Mungbohnen-Nuclease mit glatten Enden versehen, bei 37°C inkubiert und mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die DNA wird dann unter Verwendung von EcoRI-Methylase methyliert. EcoRI-Linker werden dann an die glatten Enden ligiert, indem T4-DNA-Ligase verwendet wird und bei 4°C inkubiert wird. Die Ligierungsreaktion wird dann beendet und die DNA wird mit EcoRI-Restriktionsenzym zurückgeschnitten. Die DNA wird dann auf einem Saccharosegradienten größenfraktioniert, wobei die im Fachgebiet bekannten Verfahren befolgt werden, beispielsweise Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982, das hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einbezogen ist.
Dann wird ein Plattentest durchgeführt, um die ungefähre Konzentration der DNA zu bestimmen. Es werden dann Ligierungsreaktionen durchgeführt und 1 μl der Ligierungsreaktion wird verpackt, um eine Genbank zu konstruieren. Das Verpacken kann beispielsweise durch die Verwendung von gereinigten λgt1 1-Phagenarmen, gespalten mit EcoRI, und DNA, gespalten mit EcoR1, nach Bindung von den EcoRI-Linkern erfolgen. Die DNA und die λgt11-Arme werden mit DNA-Ligase ligiert. Die ligierte DNA wird dann in infektiöse Phagenpartikel verpackt. Die verpackten Phagen werden verwendet, um E.coli-Kulturen zu infizieren, und die infizierten Zellen werden auf Agarplatten verteilt, um Platten zu erhalten, die Tausende einzelne Phagenplaques tragen. Die Genbank wird dann amplifiziert.
Fragmente des Gens mit der gesamten Länge der vorliegenden Erfindung können als Hybridisierungssonde für eine cDNA- oder eine genomische Genbank verwendet werden, um DNA voller Länge und andere DNAs zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit dem Gen oder ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Sonden dieser Art haben mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15 und noch mehr bevorzugt mindestens 30 Basen und können bei spielsweise mindestens 50 oder mehr Basen enthalten. Die Sonde kann auch verwendet werden, um einen DNA-Clon, der dem Transkript voller Länge entspricht, und einen genomischen Clon oder Clone zu identifizieren, die das gesamte Gen, einschließlich regulatorischer und Promotorbereiche, Exons und Introns, enthalten.
Die isolierten Nucleinsäuresequenzen und andere Enzyme können dann auf Beibehaltung der biologischen Aktivität gemessen werden, die für das Enzym der vorliegenden Erfindung charakteristisch ist, beispielsweise in einem Test zum Nachweis der enzymatischen Amindase-Aktivität. Derartige Enzyme schließen verkürzte Formen der Amidase und Varianten wie Deletions- und Insertionsvarianten ein.
Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann in Form von DNA vorliegen, wobei DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein und, falls sie einzelsträngig ist, kann sie der codierende Strang oder der nicht codierende (Antisense) Strang sein. Die codierende Sequenz, die das reife Enzym codiert, kann mit der in 1 (SEQ ID NR: 1) gezeigten codierenden Sequenz und/oder der des hinterlegten Clons identisch sein oder kann eine sich unterscheidende codierende Sequenz sein, wobei diese codierende Sequenz als Folge der Redundanz oder Degeneration des genetischen Codes dasselbe reife Enzym codiert wie die DNA von 1 (SEQ ID NR: 1).
Das Polynucleotid, das das reife Enzym von 1 (SEQ ID NR: 2) codiert, kann einschließen, ist aber nicht beschränkt auf: nur die codierende Sequenz für das reife Enzym; die codierende Sequenz für das reife Enzym und zusätzliche codierende Sequenz wie eine Leader-Sequenz oder eine Proproteinsequenz; die codierende Sequenz für das reife Enzym (und fakultativ zusätzliche codierende Sequenz) und die nicht codierende Sequenz wie Introns oder die nicht codierende Sequenz 5' und/oder 3' von der codierenden Sequenz für das reife Enzym.
Somit umfasst der Begriff „Polynucleotid, das ein Enzym (Protein) codiert" ein Polynucleotid, das nur die codierende Sequenz für das Enzym sowie ein Polynucleotid umfasst, das eine zusätzliche codierende und/oder nicht codierende Sequenz umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Varianten der hier vorstehend beschriebenen Polynucleotide, die Fragmente, Analoga und Derivate des Enzyms codieren, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NR: 2) besitzt. Die Variante des Polynucleotids kann eine natürlich auftretende allele Variante des Polynucleotids oder eine nicht natürlich auftretende Variante des Polynucleotids sein.
Somit schließt die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die dasselbe reife Enzym codieren, wie in 1 (SEQ ID NR: 2) gezeigt, sowie Varianten derartiger Polynucleotide ein, wobei die Varianten ein Fragment, Derivat oder Analogon des Enzyms von 1 (SEQ ID NR: 2) codieren. Derartige Nucleotidvarianten schließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten ein.
Wie hier vorstehend angegeben, kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz besitzen, die eine natürlich auftretende allele Variante der in 1 dargestellten codierenden Sequenz (SEQ ID NR: 1) ist. Wie aus dem Fachgebiet bekannt, ist eine allele Variante eine alternative Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition von einem oder mehreren Nucleotiden haben kann, die im Wesentlichen nicht die Funktion des codierten Enzyms ändern.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Polynucleotide ein, wobei die das reife Enzym codierende Sequenz in demselben Leserahmen an eine Polynucleotidsequenz fusioniert sein kann, die die Expression und Sekretion eines Enzym aus einer Wirtszelle unterstützt, beispielsweise eine Leader-Sequenz, die die Funktion hat, den Transport eines Enzyms aus der Zelle zu kontrollieren. Das Enzym mit einer Leader-Sequenz ist ein Präprotein und kann die Leadersequenz haben, die von der Wirtszelle gespalten wird, um die reife Form des Enzyms zu bilden. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, das das reife Protein plus zusätzliche 5'-Aminosäurereste ausmacht. Ein reifes Protein mit einer Prosequenz ist ein Proprotein und ist eine inaktive Form des Proteins. Wenn die Prosequenz einmal gespalten wird, bleibt ein aktives reifes Protein zurück.
Deshalb kann beispielsweise das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung ein reifes Enzym oder ein Enzym mit einer Prosequenz oder ein Enzym mit sowohl einer Prosequenz als auch einer Präsequenz (Leader-Sequenz) codieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polynucleotide, die mit den hier vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, falls mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 95% Identität zwischen den Sequenzen bestehen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hier vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen", dass die Hybridisierung nur auftritt, falls mindestens 95% und vorzugsweise mindestens 97% Identität zwischen den Sequenzen bestehen. Die Polynucleotide, die mit den hier vorstehend beschriebenen Polynucleotiden in einer bevorzugten Ausführungsform hybridisieren, codieren Enzyme, die entweder im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder dieselbe Aktivität wie das reife Enzym beibehalten, das durch die DNA von 1 (SEQ ID NR: 1) codiert wird.
Alternativ kann das Polynucleotid mindestens 15 Basen, vorzugsweise mindestens 30 Basen und stärker bevorzugt mindestens 50 Basen besitzen, die mit einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung hybridisieren, wobei es eine Identität damit aufweist, wie hier vorstehend beschrieben, und die Aktivität beibehalten kann oder nicht. Beispielsweise können derartige Polynucleotide, z. B. zur Gewinnung des Polynucleotids, als Sonden für das Polynucleotid von SEQ ID NR: 1 oder als PCR-Primer eingesetzt werden.
Somit ist die vorliegende Erfindung auf Polynucleotide gerichtet, die mindestens eine 70%-ige Identität, vorzugsweise mindestens 90%-ige Identität und stärker bevorzugt mindestens eine 95%-ige Identität mit einem Polynucleotid besitzen, das das Enzym von SEQ ID NR: 2 sowie Fragmente davon codiert, wobei die Fragmente mindestens 30 Basen und vorzugsweise mindestens 50 Basen besitzen, und auf Enzyme gerichtet, die von derartigen Polynucleotiden codiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Enzym, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NR: 2) besitzt, sowie Fragmente, Analoga und Derivate eines derartigen Enzyms.
Bei Bezugnahme auf das Enzym von 1 (SEQ ID NR: 2) bedeuten die Begriffe „Fragment", „Derivat" und „Analogon" ein Enzym, das im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität beibehält wie ein derartiges Enzym. Somit schließt ein Analogon ein Proprotein ein, das durch Spaltung des Proproteinanteils aktiviert werden kann, um ein aktives reifes Enzym zu produzieren.
Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Enzym, ein natürliches oder ein synthetisches Enzym, vorzugsweise ein rekombinantes Enzym sein.
Das Fragment, Derivat oder Analogon des Enzyms von 1 (SEQ ID NR: 2) kann (i) eines sein, bei dem ein oder mehrere der Aminosäurereste mit einem konservierten oder nicht konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise einem konservierten Aminosäurerest) substituiert sind, und ein derartiger substituierter Aminosäurerest kann einer sein, der durch den genetischen Code codiert wird oder nicht, oder (ii) eines sein, bei dem ein oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe einschließen oder (iii) eines sein, bei der das reife Enzym mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie eine Verbindung, um die Halbwertszeit des Enzyms zu erhöhen (beispielsweise Polyethylenglykol) oder (iv) eines sein, bei dem die zusätzlichen Aminosäuren an das reife Enzym fusioniert sind, wie ein Leader oder eine sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Enzyms verwendet wird, oder eine Proproteinsequenz. Es wird davon ausgegangen, dass derartige Fragmente, Derivate oder Analoga aufgrund der hier dargelegten Ausführungen im Anwendungsbereich des Fachmanns liegen.
Die Enzyme und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und werden vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt.
Der Begriff „isoliert" bedeutet, dass das Material von seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wird (z. B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich auftritt). Beispielsweise ist ein natürlich auftretendes Polynucleotid oder Enzym, das in einem lebenden Tier vorliegt, nicht isoliert, aber dasselbe Polynucleotid oder Enzym, das von einigen oder allen der gemeinsam vorliegenden Materialien im natürlichen System getrennt wird, ist isoliert. Derartige Po lypeptide könnten Teil eines Vektors sein und/oder derartige Polynucleotide oder Enzyme könnten Teil einer Zusammensetzung sein und immer noch so isoliert sein, dass ein derartiger Vektor oder eine derartige Zusammensetzung nicht Teil seiner/ihrer natürlichen Umgebung ist.
Die Enzyme der vorliegenden Erfindung schließen das Enzym von SEQ ID NR: 2 (insbesondere das reife Enzym) sowie Enzyme ein, die mindestens 70% Ähnlichkeit (vorzugsweise mindestens 70% Identität) mit dem Enzym von SEQ ID NR: 2 aufweisen, und mehr bevorzugt mindestens 90% Ähnlichkeit (mehr bevorzugt mindestens 90% Identität) mit dem Enzym von SEQ ID NR: 2 aufweisen und noch mehr bevorzugt mindestens 95% Ähnlichkeit (noch mehr bevorzugt mindestens 95% Identität) mit dem Enzym von SEQ ID NR: 2 aufweisen und schließen auch Teile von derartigen Enzymen mit einem derartigen Anteil des Enzyms ein, der im Allgemeinen mindestens 30 Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren enthält.
Wie im Fachgebiet bekannt, wird die „Ähnlichkeit" zwischen zwei Enzymen bestimmt, indem die Aminosäuresequenz und seine konservierten Aminosäuresubstituenten eines Enzyms mit der Sequenz eines zweiten Enzyms verglichen werden. Die Ähnlichkeit kann durch Verfahren bestimmt werden, die gut im Fachgebiet bekannt sind, beispielsweise einem BLAST-Programm (Basic Local Alignment Search Tool am National Center for Biological Information).
Eine Variante, d. h. ein „Fragment-", „Analogon-" oder „Derivat " Enzym und Referenzenzym können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen unterscheiden, die in jeder Kombination vorliegen können.
Unter den bevorzugten Varianten sind diejenigen, die sich von einer Referenz aufgrund von konservativen Aminosäuresubstitutionen unterscheiden. Derartige Substitutionen sind diejenigen, die eine gegebene Aminosäure in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Merkmalen ersetzen. Typischerweise werden der Austausch einer Aminosäure gegen eine andere zwischen den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile; der Austausch der Hydroxylreste Ser und Thr; der Austausch der sauren Reste Asp und Glu; die Sub stitution zwischen den Amidresten Asn und Gln; der Austausch der basischen Reste Lys und Arg und der Austausch zwischen den aromatischen Resten Phe, Tyr als konservative Substitutionen erachtet.
Am allermeisten werden die Varianten bevorzugt, die dieselbe biologische Funktion und Aktivität wie das Referenzpolypeptid, von dem sie sich unterscheiden, beibehalten.
Fragmente oder Teile des Enzyms der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung des entsprechenden Enzyms voller Länge durch Peptidsynthese verwendet werden; deshalb können die Fragmente als Zwischenprodukte zur Herstellung von Enzymen voller Länge verwendet werden. Fragmente oder Anteile der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Polynucleotide voller Länge der vorliegenden Erfindung zu synthetisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung einschließen, Wirtszellen, die gentechnisch mit erfindungsgemäßen Vektoren hergestellt werden, und die Herstellung von erfindungsgemäßen Enzymen durch rekombinante V erfahren.
Wirtszellen werden gentechnisch mit den Vektoren hergestellt (transduziert oder transformiert oder transfiziert), die die erfindungsgemäßen Polynucleotide enthalten. Derartige Vektoren können beispielsweise ein Clonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, eines Viruspartikels, eines Phagen etc. vorliegen. Die gentechnisch hergestellten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien gezüchtet werden, die dementsprechend für die Aktivierung von Promotoren, die Selektion von Transformanten oder die Amplifikation der Gene der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Die Kulturbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und dergleichen, sind diejenigen, die zuvor bei der Wirtszelle verwendet wurden, die zur Expression ausgewählt wurde, und sind für den Fachmann offensichtlich.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung von Enzymen durch rekombinante Verfahren verwendet werden. Deshalb können die Polynucleotide beispielsweise in jeden aus einer Reihe von Expressionsvektoren zur Expression eines Enzyms eingeschlossen werden. Derartige Vektoren schließen chromosomale, nicht chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen ein, z. B. SV40-Derivate; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefe-Plasmide; Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitet sind, Virus-DNA wie Vaccinia, Adenovirus, Hühnerpockenvirus und Pseudotollwut. Jedoch kann jeder andere Vektor verwendet werden, so lange er replizierbar und im Wirt überlebensfähig ist.
Die geeignete DNA-Sequenz kann in den Vektor mittels einer Reihe von Verfahren eingebaut werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz in (eine) geeignete Restriktionsendonucleaseschnittstelle(n) durch im Fachgebiet bekannte Verfahren eingebaut. Es wird davon ausgegangen, dass derartige Verfahren und andere im Anwendungsbereich des Fachmanns liegen.
Die DNA-Sequenz im Expressionsvektor ist funktional mit (einer) geeigneten Expressionskontrollsequenz(en) (Promotor) verbunden, um die mRNA-Synthese zu lenken. Als repräsentative Beispiele derartiger Promotoren kann man erwähnen: LTR- oder SV40-Promotor, den E. coli-lac- oder trp-Promotor, den Lambda-Phagen-P_L-Promotor und andere Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder deren Viren kontrollieren. Der Expressionsvektor enthält auch eine ribosomale Bindungsstelle zur Translationsinitiation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zur Amplifikationssexpression einschließen.
Zusätzlich können Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere Selektionsmarkergene enthalten, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion von transformierten Wirtszellen wie Dihydrofolatreduktase oder Neomycinresistenz für die eukaryontische Zellkultur oder wie Tetracyclin oder Ampicillinresistenz in E. coli bereitzustellen.
Der Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz, wie hier vorstehend beschrieben, sowie einen geeigneten Promotor oder eine geeignete Kontrollsequenz enthält, kann verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, damit der Wirt das Protein exprimieren kann.
Als repräsentative Beispiele geeigneter Wirte können erwähnt werden: Bakterienzellen, wie E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; Pilzzellen wie Hefe; Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; tierische Zellen wie CHO, COS oder Bowes-Melanom; Adenoviren; Pflanzenzellen etc. Es wird davon ausgegangen, dass aufgrund der hier dargelegten Ausführungen die Auswahl eines geeigneten Wirts im Anwendungsbereich des Fachmanns liegt.
Genauer gesagt, schließt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte ein, die eine oder mehrere Sequenzen umfassen, wie vorstehend ausführlich erklärt. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in den eine erfindungsgemäße Sequenz vorwärts oder rückwärts orientiert eingebaut wurde. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt ferner regulatorische Sequenzen einschließlich beispielsweise eines Promotors, der funktional mit der Sequenz verbunden ist. Der Fachmann kennt zahlreiche geeignete Vektoren und Promotoren und sie sind im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren werden anhand von Beispielen bereitgestellt: Bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBluescript II (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eukaryontisch: pXT1, pSG5 (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Jedoch kann jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, solange sie im Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
Die Promotorbereiche können von jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicoltransferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit Selektionsmarkern gewählt werden. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7. Besonders bekannte Bakterienpromotoren schließen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_R, P_L und trp ein. Eukaryontische Promotoren schließen den sehr frühen CMV-Promotor, HSV-Thymidinkinase-Promotor, den frühen und späten SV40-Promotor, LTRs aus Retrovirus und Maus-Metallothionein-I-Promotor ein. Die Wahl des geeigneten Vektors und Promotors liegt gänzlich im Anwendungsbereich des Fachmanns.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere Eukaryontenzelle wie eine Säugerzelle sein oder eine niedrigere Eukaryontenzelle wie eine Hefezelle sein oder die Wirtszelle kann eine Prokaryontenzelle wie eine Bakterienzelle sein. Die Einfüh rung des Konstruktes in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion oder Elektroporation (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)) erfolgen.
Die Konstrukte in Wirtszellen können in einer herkömmlichen Weise verwendet werden, um das von der rekombinanten Sequenz codierte Genprodukt herzustellen. Alternativ können die erfindungsgemäßen Enzyme durch herkömmliche Peptidsynthesegeräte synthetisch hergestellt werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können auch verwendet werden, um derartige Proteine unter Verwendung von RNAs zu produzieren, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung stammen.
Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit sowohl prokaryontischen als auch eukaryontischen Wirten werden von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), beschrieben, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme einbezogen wird.
Die Transkription der DNA, die die Enzyme der vorliegenden Erfindung codiert durch höhere Eukaryonten, wird durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente, gewöhnlich etwa 10 bis 300 bp groß, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Beispiele schließen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs bp 100 bis 270, einen frühen Promotorenhancer des Cytomegalievirus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer ein.
Im Allgemeinen schließen die rekombinanten Expressionsvektoren Replikationsursprünge und Selektionsmarker, die eine Transformation der Wirtszelle zulassen, z. B. das Ampicillinresistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae-TRP1-Gen, und einen Promotor ein, der von einem stark exprimiertem Gen stammt, um die Transkription einer stromabwärts liegenden Struktursequenz zu lenken. Derartige Promotoren können von Operons stammen, die un ter anderem glycolytische Enzyme wie 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), α-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine codieren. Die heterologe Struktursequenz wird in der entsprechenden Phase mit Translationsinitiations- und Terminationssequenzen und vorzugsweise einer Leader-Sequenz zusammengefügt, die die Sekretion des translatierten Enzyms lenken kann. Fakultativ kann die heterologe Sequenz ein Fusionsenzym einschließlich eines N-terminalen Identifikationspeptids codieren, das die gewünschten Merkmale verleiht, z. B. die Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Nützliche Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien werden konstruiert, indem eine DNA-Struktursequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiations- und Terminationssignalen, in funktionaler Lesephase mit einem funktionalen Promotor eingebaut wird. Der Vektor umfasst einen oder mehrere phänotypische Selektionsmarker und einen Replikationsursprung, um die Aufrechterhaltung des Vektors sicherzustellen und um, falls gewünscht, die Amplifikation im Wirt bereitzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte zur Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies in der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl andere auch als Mittel der Wahl verwendet werden können.
Als repräsentatives, jedoch nicht begrenzendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren zur Verwendung in Bakterien einen Selektionsmarker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, die von im Handel erhältlichen Plasmiden stammen, die genetische Elemente des gut bekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Derartige im Handel erhältliche Vektoren schließen beispielsweise pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese Abschnitte des pBR322-„Rückgrats" sind mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und dem Wachstum des Wirtsstammes bis zu einer geeigneten Zelldichte wird der ausgewählte Promotor durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturverschiebung oder chemische Induktion) induziert und die Zellen werden für einen zusätzlichen Zeitraum gezüchtet.
Die Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen und der sich ergebende Rohextrakt für die weitere Reinigung zurückbehalten.
Mikrobenzellen, die bei der Expression von Proteinen verwendet werden, können durch jedes praktische Verfahren zertrümmert werden, einschließlich einem Einfrier-Aufbau-Zyklus, Ultraschall, mechanischen Aufbrechen oder Verwendung von zelllysierenden Agentien, wobei der Fachmann derartige Verfahren gut kennt.
Verschiedene Säugerzellkultursysteme können ebenfalls verwendet werden, um das rekombinante Protein zu exprimieren. Beispiele von Säuger-Expressionssystemen schließen die von Gluzman, Cell, 23: 175 (1981) beschriebenen COS-7-Linien von Affennierenfibroblasten und andere Zellinien ein, die einen kompatiblen Vektor exprimieren können, beispielsweise die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säuger-Expressionsvektoren umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer und auch jegliche notwendigen ribosomalen Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Spleißdonor- und -akzeptorstellen, Transkriptionsterminationssequenzen und flankierende nicht transkribierte 5'-Sequenzen. DNA-Sequenzen, die von dem SV40-Spleißvorgang stammen, und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die erforderlichen nicht transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
Das Enzym kann aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren, die die Ammoniumsulfat- oder Ethanolpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lektinchromatographie einschließen, gewonnen und gereinigt werden. Es können gegebenenfalls Proteinrückfaltungsschritte zur Vollendung der Konfiguration des reifen Proteins verwendet werden. Schließlich kann die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) für Endreinigungsschritte verwendet werden.
Die Enzyme der vorliegenden Erfindung können ein natürlich gereinigtes Produkt oder ein Produkt aus chemisch synthetischen Verfahren sein oder durch rekombinante Verfahren von einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt (beispielsweise durch Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen in Kultur) produziert werden. Abhängig vom in einem rekombinanten Herstellungsverfahren verwendeten Wirt können die Enzyme der vorliegenden Erfindung glycosyliert oder nicht glycosyliert sein. Erfindungsgemäße Enzyme können auch einen Methioninaminosäurerest am Anfang einschließen oder nicht.
Die Enzyme, ihre Fragmente oder weitere Derivate oder Analoga davon oder diese exprimierende Zellen können als Immunogen verwendet werden, um dagegen Antikörper zu produzieren. Diese Antikörper können beispielsweise polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung schließt auch chimäre, Einzelketten- und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsgenbank ein. Verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Produktion derartiger Antikörper und Fragmente verwendet werden.
Gegen die Enzyme, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, erzeugte Antikörper können durch direkte Injektion der Enzyme in ein Tier oder durch Verabreichung der Enzyme an ein Lebewesen, vorzugsweise nicht menschlich, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper bindet dann an die Enzyme selbst. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment der Enzyme codiert, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die die nativen Gesamtproteine binden. Derartige Antikörper können dann verwendet werden, um das Enzym aus Zellen zu isolieren, die jenes Enzym exprimieren.
Zur Herstellung monoclonaler Antikörper kann jedes Verfahren verwendet werden, das Antikörper bereitstellt, die durch kontinuierliche Zelllinienkulturen produziert werden. Beispiele schließen das Hybridomverfahren (Köhler und Milstein, 1975, Nature, 256: 495–497), das Triomverfahren, das menschliche B-Zellhybridomverfahren (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und das EBV-Hybridomverfahren ein, um menschliche monoclonale Antikörper (Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96) zu produzieren.
Die für die Produktion von Einzelketten-Antikörpern (US-Patent 4,946,778) beschriebenen Verfahren können übernommen werden, um Einzelketten-Antikörper für erfindungsgemäße immunogene Enzymprodukte zu produzieren. Es können auch transgene Mäuse verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen erfindungsgemäße immunogene Enzymprodukte zu exprimieren.
Gegen das Enzym der vorliegenden Erfindung erzeugte Antikörper können zur Durchmusterung nach ähnlichen Enzymen aus anderen Organismen und Proben verwendet werden. Derartige Durchmusterungsverfahren sind im Fachgebiet bekannt. Ein derartiger Durchmusterungstest wird beispielsweise in „Methods for Measuring Cellulase Activities", Methods in Enzymology, Bd. 160, S. 87–116, beschrieben und hiermit durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit einbezogen. Antikörper können auch als Sonde verwendet werden, um Genbänke zu durchmustern, die aus diesem oder anderen Organismen erzeugt wurden, um diese oder kreuzreaktive Aktivitäten zu identifizieren.
Der Begriff „Antikörper", wie hier verwendet, bezieht sich auf intakte Immunglobulinmoleküle sowie Fragmente von Immunglobulinmolekülen wie Fab-, Fab'-, (Fab')₂-, Fv- und EKA-Fragmente, die an ein Epitop eines Amidase-Polypeptids binden können. Diese Antikörperfragmente, die noch etwas von der Fähigkeit zurückbehalten haben, selektiv an das Antigen des Antikörpers, von dem sie stammen, zu binden (z. B. ein Amidase-Antigen), können unter Verwendung von aus dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden (vgl. z. B. Harlow und Lane, a. a. O.) und werden ferner wie folgt beschrieben.

(1) Ein Fab-Fragment besteht aus einem monovalenten Antikörper-bindenden Fragment eines Antikörpermoleküls und kann durch Spaltung eines Gesamtantikörpermoleküls mit dem Enzym Papain hergestellt werden, so dass sich ein Fragment ergibt, das aus einer intakten leichten Kette und einem Anteil einer schweren Kette besteht.
(2) Ein Fab-Fragment eines Antikörpermoleküls kann durch Behandlung eines ganzen Antikörpermoleküls mit Pepsin erhalten werden, worauf eine Reduktion folgt, so dass sich ein Molekül ergibt, das aus einer intakten leichten Kette und einem Anteil einer schweren Kette besteht. Man erhält zwei Fab'-Fragmente pro Antikörpermolekül, das auf diese Weise behandelt wird.
(3) Ein (Fab')₂-Fragment eines Antikörpermoleküls kann durch Behandlung eines ganzen Antikörpermoleküls mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten werden. Ein (Fab')₂-Fragment ist ein Dimer zweier Fab'-Fragmente, die durch zwei Disulfidbrücken zusammengehalten werden.
(4) Ein Fv-Fragment wird als gentechnisch hergestelltes Fragment definiert, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette enthält, die als zwei Ketten exprimiert wird.
(5) Ein Einzelketten-Antikörper („EKA") ist ein gentechnisch hergestelltes Einzelkettenmolekül, das die variable Region einer leichten Kette und die variable Region einer schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten, flexiblen Polypeptidlinker verbunden sind.

Wie in dieser Erfindung verwendet, bezieht sich der Begriff „Epitop" auf eine antigene Determinante auf einem Antigen wie ein Amidase-Polypeptid, an das ein Paratop eines Antikörpers wie ein Amidase-spezifischer Antikörper bindet. Antigene Determinanten bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und können spezifische dreidimensionale Strukturmerkmale sowie spezifische Ladungsmerkmale aufweisen.
Die vorliegende Erfindung wird ferner mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben; jedoch sollte klar sein, dass die vorliegende Erfindung nicht auf derartige Beispiele begrenzt ist. Alle Teile oder Mengen, wenn nicht anders spezifiziert, sind auf das Gewicht bezogen.
Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte, häufig vorkommende Verfahren und/oder Begriffe beschrieben.
„Plasmide" werden durch ein kleines p bezeichnet, das vor und/oder hinter Großbuchstaben und/oder Zahlen steht. Die hier aufgeführten Ausgangsplasmide sind entweder im Handel erhältlich, stehen uneingeschränkt öffentlich zur Verfügung oder können von zur Ver fügung stehenden Plasmiden nach veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Zusätzlich sind Plasmide, die zu den im Fachgebiet beschriebenen äquivalent sind, bekannt und für den Fachmann offensichtlich.
„Spaltung" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur auf bestimmte Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen hier verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Anforderungen wurden so verwendet, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Enzymeinheiten in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Für die Zwecke der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Plasmidkonstruktion werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Enzymeinheiten in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden durch den Hersteller spezifiziert. Normalerweise betragen die Inkubationszeiten etwa 1 Stunde bei 37°C, sie können jedoch nach den Anweisungen des Herstellers variieren. Nach der Spaltung erfolgt eine Elektrophorese des Reaktionsansatzes direkt auf einem Polyacryamidgel, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente wird unter Verwendung von 8%-igem Polyacrylamidgel durchgeführt, beschrieben von Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).
„Oligonucleotide" bezieht sich entweder auf ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert werden können. Derartige synthetische Oligonucleotide können ein 5'-Phosphat haben oder nicht. Diejenigen, die keines haben, ligieren nicht mit einem anderen Oligonucleotid ohne Hinzufügen eines Phosphats von einem ATP in Gegenwart einer Kinase. Ein synthetisches Oligonucleotid ligiert mit einem Fragment, das nicht dephosphoryliert wurde.
„Ligierung" bezieht sich auf den Vorgang der Erzeugung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis et al., Id., S. 146). Wenn nicht anders bereitgestellt, kann die Ligierung unter Verwendung bekannter Puffer und Bedin gungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg von ungefähr äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erfolgen.
Wenn nicht anders angegeben, erfolgte die Transformation, wie in dem Verfahren von Sambrook, Fritsch und Maniatis, 1989, beschrieben.
Beispiel 1
Bakterielle Expression und Reinigung von Amidase
Eine genomische Genbank von Thermococcus GU5L5 wurde nach Amidase-Aktivität durchmustert, wie in Beispiel 2 beschrieben, und ein positiver Clon wurde identifiziert und isoliert. Die DNA dieses Clons wurde als Matrize in einer 100 μl-PCR-Reaktion unter Verwendung der folgenden Primersequenzen verwendet:
Das Protein wurde in E. coli exprimiert. Das Gen wurde unter Verwendung von PCR mit den vorstehend angegebenen Primern amplifiziert.
Nach der Amplifikation wurde das PCR-Produkt in die EcoRI- und BamHI-Schnittstellen von pQET1 cloniert und durch Elektroporation in E. coli M15(pREP4) transformiert. Die sich ergebenden Transformanten wurden in 3 ml-Kulturen gezüchtet und ein Teil dieser Kultur wurde induziert. Ein Teil der nicht induzierten und der induzierten Kulturen wurde unter Verwendung von Z-L-Phe-AMC (vgl. nachstehend) getestet.
Die vorstehend aufgeführten Primersequenzen können auch verwendet werden, um das Zielgen aus dem hinterlegten Material durch die vorstehend beschriebenen Hybridisierungstechniken zu isolieren.
Beispiel 2
Nachweis einer Amidase aus Thermococcus GU5L5
Herstellung der Expressionsgenbank
pBluescript-Plasmide enthaltende Kolonien mit Zufallsinsertionen aus dem Organismus Thermococcus GU5L5 wurden nach dem Verfahren von Hay und Short erhalten (Hay, B. und Short, J., Strategies. 1992, 5, 16). Die sich ergebenden Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern aufgenommen und verwendet, um einzeln jede der Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zu beimpfen. Die Vertiefungen enthielten 250 μl LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin, 80 μg/ml Methicillin und 10 Vol.-% Glycerin (LB Amp/Meth, Glycerin). Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C ohne Schütteln gezüchtet. Daraus bestand die „Quellen Gen Bank"; jede Vertiefung der Quellen Gen Bank enthielt somit eine Stammkultur mit E. coli-Zellen, von denen jede ein pBluescript-Plasmid mit einer einzigartigen DNA-Insertion enthielt.
Durchmusterung nach Amidase-Aktivität
Die Platten der Quellen Gen Bank wurden verwendet, um das Inokulat auf eine einzelne Platte (die „Kondensierten Platte"), enthaltend 200 μl LB Amp/Meth, Glycerin in jeder Vertiefung, zu vermehren. Dieser Schritt erfolgte unter Verwendung des High Density Replicating Tool (HDRT) von Beckman Biomek mit 1% Bleiche, Wasser, Isopropanol und einem Lufttrocknungssterilisationszyklus zwischen jeder Inokulation. Jede Vertiefung der Kondensierten Platte enthielt somit 10 bis 12 verschiedene pBluescript-Clone aus jeder der Quellen-Genbank-Platten. Die Kondensierte Platte wurde 16 h bei 37°C gezüchtet und dann verwendet, um zwei weiße Polyfiltronics-Mikrorotiter-Tochterplatten mit 96 Vertiefungen zu beimpfen, die in jeder Vertiefung 250 μl LB Amp/Meth (ohne Glycerin) enthielten. Die ursprüngliche kondensierte Platte wurde bei –80°C gelagert. Die beiden kondensierten Tochterplatten wurden 18 Std. bei 37°C inkubiert.
Die „600 μM Substratstammlösung" wurde wie folgt hergestellt: 25 mg N-Morphourea-L-phenylalanyl-7-amido-4-trifluormethylcumarin (Mu-Phe-AFC, Enzyme Systems Products, Dublin, CA) wurden in einem geeigneten Volumen DMSO gelöst, so dass sich eine 25,2 mM Lösung ergab. 250 μl DMSO-Lösung wurden zu etwa 9 ml 50 mM, pH 7,5 Hepes-Puffer, enthaltend 0,6 mg/ml Dodecylmaltosid, zugegeben. Das Volumen wurde mit dem vorstehenden Hepes-Puffer auf 10,5 ml gebracht, so dass sich eine trübe Lösung ergab.
Mu-Phe-AFC
50 μl der „600 μM Stammlösung" wurden jeder Vertiefung einer weißen kondensierten Platte unter Verwendung von Biomek zugegeben, so dass sich eine Endkonzentration des Substrats von 100 μM ergab. Die Fluoreszenzwerte (Anregung = 400 nm, Emission = 505 nm) wurden auf einem Plattenlesegerät-Fluorometer unmittelbar nach Zugabe des Substrats aufgezeichnet. Die Platte wurde 60 min bei 70°C inkubiert und die Fluoreszenzwerte wurden erneut aufgezeichnet. Die ersten und letzten Fluoreszenzwerte wurden subtrahiert, um festzustellen, ob ein aktiver Clon aufgrund der Fluoreszenzzunahme bei der Mehrheit der anderen Vertiefungen vorlag.
Isolierung des aktiven Clons
Um den einzelnen Clon zu isolieren, der die Aktivität trug, wurden die Quellen Gen Bank-Platten aufgetaut und die einzelnen Vertiefungen verwendet, um eine neue Platte, enthaltend LB Amp/Meth, einzeln zu beimpfen. Wie vorstehend, wurde die Platte bei 37°C inkubiert, um die Zellen zu züchten, und 50 μl 600 μM Substratstammlösung wurden unter Verwendung von Biomek zugegeben. Sobald die aktive Vertiefung aus der Quellen-Platte identifiziert war, wurden die Zellen von der Quellen-Platte verwendet, um die über Nacht gezüchteten 3 ml-Kulturen mit LB/AMP/Meth anzuimpfen. Die Plasmid-DNA wurde aus den Kulturen isoliert und zur Sequenzierung und Konstruktion von Expressionssubclonen verwendet.
Beispiel 3
Thermococcus GU5L5-Amidase-Charakterisierung Substratspezifität
Indem die folgenden Substrate (vgl. nachstehend für die Definitionen der Abkürzungen): CBZ-L-Ala-AMC, CBZ-L-Arg-AMC, CBZ-L-Met-AMC, CBZ-L-Phe-AMC und 7-Methylumbelliferylheptanoat mit 100 μM, 1 Stunde bei 70°C, in den Tests verwendet wurden, wie im Clonnachweis-Abschnitt beschrieben, betrug die relative Aktivität der Amidase 3 : 3 : 1 : < 0,1 : < 0,1 für die Verbindungen CBZ-L-Arg-AMC : CBZ-L-Phe-AMC : CBZ-L-Met-AMC : CBZ-L-Ala-AMC : 7-Methylumbelliferylheptanoat. Die Anregungs- und Emissi onswellenlängen für die 7-Amido-4-methylcumarine betrugen 380 bzw. 460 nm und 326 sowie 450 für Methylumbelliferon.
Die Abkürzungen stehen für folgende Verbindungen:
CBZ-L-Ala-AMC = Na-Carbonylbenzyloxy-L-alanin-7-amido-4-methylcumarin
CBZ-L-Arg-AMC = Na-Carbonylbenzyloxy-L-arginin-7-amido-4-methylcumarin
CBZ-D-Arg-AMC = Na-Carbonylbenzyloxy-D-arginin-7-amido-4-methylcumarin
CBZ-L-Met-AMC = Na-Carbonylbenzyloxy-L-methionin-7-amido-4-methylcumarin
CBZ-L-Phe-AMC = Na-Carbonylbenzyloxy-L-phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin
Organische Lösungsmittelsensitivität
Die Aktivität der Amidase bei ansteigenden Konzentrationen von Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde wie folgt getestet: jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte wurden 10 μl 3 mM CBZ-L-Phe-AMC in DMSO, 25 μl Zelllysat, enthaltend die Amidase-Aktivität, und 250 μl eines variablen Gemisches von DMSO: pH 7,5, 50 mM Hepes-Puffer zugegeben. Die Reaktionen wurden 1 Stunde bei 70°C erhitzt und die Fluoreszenz wurde gemessen. 2 zeigt die Fluoreszenz gegenüber der Konzentration von DMSO. Die ausgefüllten und leeren Kästchen zeigen einzelne Tests.
Die Aktivität und Enantioselektivität der Amidase bei ansteigenden Konzentrationen von Dimethylformamid (DMF) wurde wie folgt getestet: jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte wurden 30 μl 1 mM CBZ-L-Arg-AMC oder CBZ-D-Arg-AMC in DMF, 30 μl Zelllysat, enthaltend die Amidase-Aktivitäten, und 240 μl eines variablen Gemisches von DMF:pH 7,5, 50 mM Hepes-Puffer zugegeben. Die Reaktionen wurden 1 Stunde bei RT inkubiert und die Fluorezenz in 1-minütigen Intervallen gemessen. 3 zeigt die relativen linearen Anfangsraten (Anstieg der Fluoreszenz pro min, d. h. „Aktivität") gegenüber der Konzentration von DMF für das reaktivere CBZ-L-Arg-AMC.
Die lineare Anfangsrate („Aktivität") der L- und D-CBZ-Arg-AMC-Substrate sind in den Tabellen 1 und 2 nachstehend dargestellt:
Tabelle 1 Aktivität von CBZ-L-Arg-AMC
Tabelle 2 Aktivität von CBZ-D-Arg-AMC
Die vorstehenden Daten zeigen, dass das Enzym eine ausgezeichnete Selektivität für das L- oder das „natürliche" Enatiomer des derivatisierten Aminosäuresubstrats hat.
Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind im Lichte der vorstehenden Ausführungen möglich und somit kann die Erfindung im Rahmen der Patentansprüche im Anhang anders, als speziell beschrieben, in die Praxis umgesetzt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynucleotid oder rekombinantes Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polynucleotid, das die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NR: 2 dargestellt codiert; (b) dem Polynucleotid gemäß (a), umfassend die Sequenz von Nucleotid 1 bis 1869 wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt; (c) einem Polynucleotid umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID NR: 1; (d) einem Polynucleotid, das eine Sequenz umfasst, die mindestens 70% Sequenzidentität mit der Nucleinsäuresequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt hat; (e) dem Polynucleotid gemäß (a) bis (d), wobei T auch U sein kann; (f) einem Polynucleotid, das in seiner Sequenz komplementär ist zu dem Polynucleotid gemäß (a) bis (e); (g) einem Fragment des Polynucleotids gemäß (b) bis (f), das mindestens 15 Basen lang ist und mit dem Polynucleotid gemäß (a) bis (f) hybridisiert unter Hybridisierungsbedingungen von 0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, pH 7,0, 5,0 mM Na₂EDTA, 0,5% SDS, 10 × Denhardts, und 0,5 mg/ml Polyriboadenylsäure bei 45°C; und (h) einem Polynucleotid umfassend eine Sequenz, die mit der Nucleinsäuresequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt hybridisiert unter Hybridisierungsbedingungen von 0,9 M NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, pH 7,0, 5,0 mM Na₂EDTA, 0,5% SDS, 10 × Denhardts, und 0,5 mg/ml Polyriboadenylsäure bei 45°C.
Polynucleotid nach Anspruch 1, umfassend eine Sequenz, die 90% Sequenzidentität mit der Nucleinsäuresequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt hat.
Polynucleotid nach Anspruch 1, umfassend eine Sequenz, die 95% Sequenzidentität mit der Nucleinsäuresequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt hat.
Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polynucleotid aus einem Prokaryonten isoliert ist.
Vektor, der ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 einschließt.
Vektor nach Anspruch 5, der ein Expressionsvektor ist.
Vektor nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Vektor ein Plasmid ist oder virusabgeleitet ist.
Wirtszelle, transformiert mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 7.
Wirtszelle nach Anspruch 8, wobei die Zelle prokaryontisch ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, wobei die Zelle ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus tierischen Zellen, Säugerzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen, Hefezellen und Bakterienzellen.
Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten Zelle, umfassend das Transformieren oder Transfizieren der Zelle mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 7, sodass die Zelle ein Polypeptid exprimiert, dass von dem isolierten oder rekombinanten Polynucleotid nach Anspruch 1, enthalten in dem Vektor, codiert wird.
Isoliertes oder rekombinantes Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NR: 2 dargestellt hat; (b) einem Polypeptid, das von dem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird; (c) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70% identisch mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID NR: 2 dargestellt ist; und (d) einem Polypeptid, das zumindest eine Sequenz von 30 aufeinander folgenden Aminosäureresten eines Polypeptids gemäß (a) bis (c) umfasst.
Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, umfassend Züchten der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 8 bis 10 unter Bedingungen, die die Expression eines Polynucleotids erlauben, das das Polypeptid nach Anspruch 12 codiert, und Isolieren des Polypeptids, wobei das Polypeptid ein Enzym mit Amidaseaktivität ist.
Antikörper, die das Polypeptid nach Anspruch 12 binden.
Antikörper nach Anspruch 14, wobei die Antikörper polyclonal oder monoclonal sind.
Verfahren zum Entfernen von Arginin, Phenylalanin oder Methionin vom N-terminalen Ende von Peptiden im Rahmen der Peptid- oder Peptidomimetikasynthese, umfassend: Verabreichen einer Menge des Polypeptids nach Anspruch 13, die wirksam ist für die Entfernung von Arginin, Phenylalanin oder Methionin vom N-terminalen Ende von Peptiden im Rahmen der Peptid- oder Peptidomimetikasynthese.