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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Behandlung
einer Nierenerkrankung. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren
zur Behandlung von Zuständen,
welche sich bei Säugern
einschließlich
Menschen mit einem chronischen Nierenversagen oder einer Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen einstellen. Das Verfahren beinhaltet bevorzugt die
Verabreichung bestimmter Proteine der osteogenen Protein-/knochenmorphogenetischen
Protein-(OP/BMP)Familie
innerhalb der TGF-β-Protein-Superfamilie. Die
Verfahren umfassen noch allgemeiner die Verabreichung bestimmter
Morphogene, Induktoren dieser Morphogene oder Agonisten der entsprechenden
Morphogenrezeptoren, oder die Implantierung von Nierenzellen, welche
mit diesen Morphogenen induziert wurden.
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Hintergrund
der Erfindung
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Das
Nierensystem von Säugetieren
dient hauptsächlich
zwei Aufgaben, nämlich
des Abtransports von katabolischen Abfallprodukten aus dem Blutstrom
und der Aufrechterhaltung des Flüssigkeits-
und Elektrolytengleichgewichts im Körper. Nierenversagen stellen
daher lebensbedrohende Krankheitszu stände dar, bei welchen der Anstieg
von Kataboliten und anderer Toxine und/oder die Entstehung von beachtlichen
Ungleichgewichten bei den Elektrolyten oder den Flüssigkeiten
zu einem Versagen anderer Hauptorgansysteme und zum Tod führen kann.
Nierenversagen wird grundsätzlich
in "akut" oder "chronisch" eingeteilt. Wie
nachfolgend im Detail beschrieben wird, sind die Unterschiede zwischen
diesen beiden Zuständen
nicht lediglich eine Frage der Schwere und der Schnelligkeit, sondern
vielmehr spiegeln diese die Unterschiede in der Ätiologie, der Prognose und
der Behandlung wieder.
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Akutes Nierenversagen
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Das
akute Nierenversagen ist definiert als eine abrupte Beendigung oder
eine beachtliche Reduktion der Nierenfunktion, und in nicht weniger
als 90 bis 95% der Fälle
kann sie sekundär
zu einer Verletzung, einer Operation oder eines anderen akuten medizinischen
Zustandes auftreten. Akutes Nierenversagen kann auf pre-renale Ursachen
(beispielsweise verminderte Herz-Ausgangsleistung, Hypovolämie, veränderte Gefäßresistenz)
oder auf post-renale Ursachen (beispielsweise Behinderungen oder
Einschränkungen
der Harnleiter, der Harnblase oder der Harnröhre) beruhen, welche nicht
direkt die Nieren betreffen und welche – sofern sie rechtzeitig behandelt
werden – keinen
bedeutsamen Nephronenverlust oder andere Beschädigungen an den Nieren verursachen
mögen.
Alternativ hierzu kann das akute Nierenversagen auf intrinsische
Nierenursachen beruhen, welche eine direkte Beschädigung oder
eine Verletzung der Nieren umfassen und welche eine dauerhafte Schädigung der
Nephronen oder anderer Nierenstrukturen verursachen mögen. Intrinsische
Ursachen eines akuten Nierenversagens beinhalten – wenn auch
nicht ausschließlich – infektiöse Erkrankungen
(beispielsweise verschiedene bakterielle, virale und para sitäre Infektionen),
entzündliche
Erkrankungen (beispielsweise Glomerulonephritis, systemischer Lupus
erythematodes), Ischämie
(beispielsweise Nierenarterienverstopfung), toxische Syndrome (beispielsweise
Vergiftung mit Schwermetallen, Nebeneffekte einer antimikrobiellen
Behandlung oder einer Chemotherapie) und direkte Verletzungen.
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Die
Diagnose und die Behandlung eines akuten Nierenversagens ist ähnlich vielfältig wie
seine Ursachen. Bei menschlichen Patienten kann eine Oligurie (Urinausstoß < 400 ml/Tag) oder
eine Anurie (Urinausstoß < 50 ml/Tag) in 50
bis 70% der Fälle
auftreten. Die BUN-Werte können
auf 10 bis 20 mg/dL/Tag oder schneller ansteigen, die Kreatininwerte
im Plasma können
auf 0,5 bis 1,0 mg/dL/Tag ansteigen, und eine metabolische Azidose
tritt fast immer auf. Sofern nicht behandelt, kann das Elektrolyten-
und Flüssigkeitsungleichgewicht
(beispielsweise eine Hyperkaliämie,
eine Azidose, ein Ödem),
welches mit einem akuten Nierenversagen verbunden ist, zu lebensbedrohlicher
Arrhythmie, kongestiver Herzinsuffizienz oder multiplem Organsystemversagen
führen. Üblicherweise
sind gegenwärtige
Therapien auf die zugrunde liegenden Ursachen des akuten Nierenversagens
(beispielsweise pre-renal, post-renal oder infektiöse Ursachen)
und auf die Handhabung der Komplikationen ausgerichtet. Aufgrund
der Schwere des akuten Nierenversagens dauern Vorfälle selten
länger
als einige Wochen an, ohne zum Tod zu führen, und werden auf der Basis
einer stationären
Behandlung behandelt.
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Chronisches Nierenversagen
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Das
chronische Nierenversagen lässt
sich definieren als eine fortschreitende, dauerhafte und bedeutsame
Erniedrigung der glomerulären
Filtrationsrate (GFR) aufgrund eines bedeutsamen und kontinuierlichen Verlustes
an Nephro nen. Ein chronisches Nierenversagen beginnt üblicherweise
an einem Punkt, an welchem eine chronische Niereninsuffizienz (d.
h. eine dauerhafte Erniedrigung der Nierenfunktion von mindestens
50 bis 60%) aus etwa einer Beschädigung
des Nierengewebes eingetreten ist, welche einen merklichen Verlust von
Nephroneinheiten verursacht hat. Die anfängliche Beschädigung kann,
aber muss nicht mit einem Vorfall eines akuten Nierenversagens verbunden
gewesen sein. Ungeachtet der Natur der anfänglichen Beschädigung äußert sich
ein chronisches Nierenversagen in einem "endgültigen
gemeinsamen Weg" von
Zeichen und Symptomen, als da wären
der schrittweise Verlust an Nephronen und das schrittweise Absinken
der GFR. Dieser schrittweise Rückgang
der Nierenfunktion ist langsam, dem Anschein nach aber unabwendbar,
und umspannt üblicherweise
viele Jahre oder Dekaden bei menschlichen Patienten.
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Das
frühe Stadium
eines chronischen Nierenversagens beginnt üblicherweise dann, wenn die
GFR auf ein Drittel einer normalen GFR abgesunken ist (beispielsweise
30 bis 40 ml/min für
einen durchschnittlichen erwachsenen Menschen). Als Ergebnis des
bedeutsamen Nephronverlustes und im Rahmen eines scheinbaren "Versuchs", die allgemeine
GFR mit weniger Nephronen aufrechtzuerhalten, wird die durchschnittliche
einzelne Nephron-GFR (SNGFR) durch Adaption der verbliebenen Nephronen
sowohl auf struktureller als auch auf funktioneller Ebene erhöht. Eine
strukturelle Erscheinungsform dieser Adaption, welche leicht durch
eine mikroskopische Untersuchung der Biopsienproben erkennbar ist,
stellt eine "kompensierende Hypertrophie" sowohl der Glomerula
als auch der Tubuli der Niere dar – ein Prozess welcher im wahrsten
Sinne des Wortes das Filtrationsvolumen erhöht, welches durch jedes verbliebene
Nephron durch eine buchstäbliche Ausweitung
der Glomerula und der Tubuli erzeugt werden kann. Zwar enthält der Harn
der untersuchten Subjekte mit einem chronischen Nierenversagen als
Ergebnis der Hypertrophie oder der Dilatation der Sammelröhren ausgedehnte
Hautabstoßungen
("casts"), üblicherweise
mit dem zwei- bis sechsfachen des normalen Durchmessers, welche
die Diagnose erleichtern und als Niereninsuffizienzhautabstoßungen ("renal failure casts") bezeichnet werden.
Zugleich kommt es zu funktionellen Veränderungen in den verbleibenden
Nephronen, wie zum Beispiel verminderte Absorption oder erhöhte Sekretion
von normalerweise ausgeschiedenen Flüssigkeiten, welche verantwortlich
sein können
für die
hormonellen oder parakrinen Veränderungen
woanders im Körper
(beispielsweise erhöhte
Werte des Nebenschilddrüsenhormons
(parathyroid hormone, PTH) als Antwort auf die Veränderungen
der Kalzium- und Phosphatmengen im Serum).
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In
der vollständigen
Wiederherstellung der GFR oder anderer Parameter der Nierenfunktionen
sind diese Anpassungen im frühen
Stadium eines chronischen Nierenversagens nicht erfolgreich und
unterliegen die verbliebenen Nephronen vielmehr einer erhöhten Gefährdung Ihres
Verlustes. Beispielsweise ist die erhöhte SNGFR mit mechanischen
Belastungen an der Glomerula aufgrund der Hypertonie und der Hyperperfusion verbunden.
Der Verlust an unversehrten Podozytenverbindungen führt zu einer
erhöhten
Permeabilität
der Glomerula für
Makromoleküle
oder zu einer "Undichtigkeit" der glomerulären Kapsel.
Reichhaltige Effekte werden ebenfalls an den mesengialen-, epithelialen
und endothelialen Zellen beobachtet, sowie eine erhöhte Einlagerung
von Kollagen und anderer Matrixproteine. Eine Sklerose sowohl der
Glomerula als auch der Tubuli ist ein weiteres gemeinsames Symptom
der hypertrophierenden Nephronen, und das Risiko einer Koagulation in
dem Glomerulum ist erhöht.
Insbesondere diese Anpassungen der verbliebenen Nephronen durch
den Vorantrieb der SNGFR weit über
ihre normalen Werte hinaus vermindert eigentlich die Kapazität der verbliebenen Nephronen,
auf die akuten Veränderungen
im Wasser-, Flüssigkeits-
oder Säurehaushalt
zu antworten, was aus diesem Grund tatsächlich die Wahrscheinlichkeit
eines zusätzlichen
Nephronenverlustes erhöht.
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Mit
fortschreitendem chronischen Nierenversagen nimmt die GFR auf weniger
als 10% des normalen Wertes ab (beispielsweise 5 bis 10 ml/min)
und die untersuchten Subjekte treten in das Endstadium der Nierenerkrankung
(ESRD) ein. Während
dieser Phase führt
die Unfähigkeit
der verbliebenen Nephronen, auf angemessene Weise Abfallprodukte
aus dem Blut zu entfernen, bei Aufrechterhaltung des Flüssigkeits-
und Elektrolytengleichgewichts und Zurückhaltung von nützlichen
Produkten zu einem raschen Abfall, in welchem viele Organsysteme
und insbesondere das kardiovaskuläre System ausfallen können. Es
kann beispielsweise zu erwarten sein, dass die BUN- und Kreatinin-Werte
ansteigen und dass bei einem BUN-Wert von 60 bis 100 mg/dL sowie
einem Kreatininwert im Serum von 8 bis 12 mg/dL typischerweise ein
Urämiesyndrom
auftreten wird, in welchem die Nieren die Endprodukte des Stickstoffstoffwechsels
nicht mehr entfernen können.
An diesem Punkt wird das Nierenversagen rasch fortschreiten und
zum Tod führen,
sofern nicht das untersuchte Subjekt eine Nierenersatztherapie erhält (d. h.
eine chronische Hämodialyse,
eine kontinuierliche Peritonealdialyse oder eine Nierentransplantation).
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Jedes
Jahr erhalten in den Vereinigten Staaten ungefähr 600 Patienten pro einer
Million eine chronische Dialyse, wobei durchschnittlichen Kosten
von annähernd
60.000 bis 80.000 $ pro Patient und pro Jahr entstehen. Bei den
jährlichen
neuen Fällen
einer Nierenerkrankung im Endstadium beruhen annähernd 28 bis 33% auf einer
diabetische Nephropathie (oder einer diabetischen Glomerulopathie
oder einer diabetischen Nierenhypertrophie), 24 bis 29% beruhen
auf eine hypertensiven Nephrosklerose (oder einer hypertensiven Glomerulosklerose)
und 15 bis 22% beruhen auf eine Glomerulonephritis. Die fünfjährige Überlebensrate
für alle
chronischen Dialysepatienten beträgt ungefähr 40%, wobei bei Patienten über 65 fällt die
Rate jedoch auf ungefähr
20% abfällt.
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Morphogene und Wachstumsfaktoren
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Eine
große
Anzahl an Proteinen ist nun identifiziert worden, die anscheinend
als Morphogene oder Wachstumsfaktoren agieren, welche die Zellproliferation
oder Differenzierungen regulieren. Üblicherweise üben diese
Wachstumsfaktoren ihre Wirkungen an spezifischen Gruppen oder Untergruppen
von Zellen oder Geweben aus. Auf diese Weise sind beispielsweise
epidermale Wachstumsfaktoren, Nervenwachstumsfaktoren, Fibroblastenwachstumsfaktoren,
verschiedene Hormone und viele andere Proteine, welche die Zellproliferation
oder Differenzierung induzieren oder inhibieren, identifiziert worden,
und es ist gezeigt worden, dass sie einige Untergruppen von Zellen
oder Geweben beeinflussen.
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Eine
Gruppe von morphogenen Proteinen, welche nachstehend als "Morphogene" bezeichnet sind, umfassen
Mitglieder der Familie der osteogenen Proteine/knochenmorphogenetischen
Proteine (OP/BMPs), welche anfänglich
aufgrund ihrer Fähigkeit,
eine ektopische endochondrale Knochenmorphogenese zu induzieren,
identifiziert wurden. Eine anschließende Charakterisierung der
Nukleinsäure-
und Aminosäuresequenzen
der BMPs hat gezeigt, dass sie eine Untergruppe der TGF-β-Superfamilie
darstellen. Es wurde nun gezeigt, dass Mitglieder dieser Morphogenfamilie
das Säuger
osteogene Protein-1 (OP-1, ebenfalls bekannt als BMP-7), das osteogene
Protein-2 (OP-2), das osteogene Protein-3 (OP-3), das BMP-2 (ebenfalls
bekannt als BMP-2A oder CBMP-2A), das BMP-3, das BMP-4 (ebenfalls bekannt als
BMP-2B oder CBMP-2B), das BMP-5, das BMP-6, das Vgr-1 und das GDF-1
sowie das Xenopus homologe VgI und die Drosophila homologen DPP und
60A umfassen. Die Mitglieder dieser Familie kodieren sezernierte
Polypeptide, welche sich gemeinsame strukturelle Merkmale teilen
und welche in ähnlicher
Weise von einer Pro-Protein Form prozessiert werden, um ein Carboxy-terminales
reifes Protein mit einem konservierten Muster an Cysteinen zu ergeben.
Die aktive Formen dieser Proteine sind entweder Disulfid-gebundene
Homodimere eines einzelnen Familienmitgliedes oder Heterodimere
von zwei verschiedenen Mitgliedern (siehe beispielsweise Massague
(1990) Annu. Rev. Cell Biol., 6: 597; Sampath et al. (1990) J. Biol.
Chem. 265: 13198)
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Die
Mitglieder dieser Morphogenfamilie an Proteinen werden während der
Entwicklung an einer Vielzahl an Geweben exprimiert. Beispielsweise
wurde gezeigt, dass BMP-3 in der Entwicklung der menschlichen Lunge
und Niere exprimiert wird (Vukicevic et al. (1994) J. Histochem.
Cytochem. 42: 869–875).
Es wurde gezeigt, dass BMP-4 in der Entwicklung der Gliedmaßen, des
Herzens, der Gesichtsprozessierung und des gekürzten ("condensed") Mesenchyms exprimiert wird, welches
verbunden ist mit den frühen
Schnurrhaarfolikeln in embryonalen Mäusen (Jones et al. (1991) Development
111: 531–542);
ferner wurde immunhistochemisch gezeigt, dass OP-1 (BMP-7) verbunden ist mit den Grundmembranen
bei menschlichen Embryos, enthaltend solche der sich entwickelnden
Lungen, des Pankreas, der Haut und der gewundenen Tubuli der Nieren
(Vukicevic et al. (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun. 198: 693–700). Einige
dieser Morphogene (beispielsweise OP-2 und BMP-2) wurden nicht in
Analysen des reifen Gewebes detektiert, was eine Rolle für diese
Morphogene nur in der frühen
Entwicklung nahe legt (Ozkay nak et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:
25220–25227). Im
Gegensatz hierzu sind große
Mengen an Nager OP-1 Expression in reifen Mäusenieren beobachtet worden (Ozkaynak
et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commum. 179: 116–123). Dies
deutet auf eine mögliche
Rolle für
in der Niere synthetisiertes OP-1 als parakrinem Regulator des Knochenwachstums
hin, und es wäre übereinstimmend
mit der Rolle der Nieren sowohl in der Kalziumregulation als auch
der Homöostase
der Knochen.
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Für eine große Vielzahl
an Wachstumsfaktoren wurde in Betracht gezogen, dass diese an der
Wachstumsregulation und an der Reparatur von Nierengeweben beteiligt
sein könnten
(beispielsweise rezensiert in Toback (1992) Kidney Intl. 41: 226–246). So
wurde beispielsweise gefunden, dass EGF, TGF-α, TGF-β, IGF-I, IGF-II, PDGF, FGF,
Renin/Angiotensin II, IL-1 und OP-1 sämtlich von verschiedenen reifen
Nierenzellen exprimiert werden und dass sie eine Wirkung auf die
renale Zellproliferation oder Differenzierung zeigen (siehe Toback
(1992) supra, Ozkaynak et al. (1991) supra). Zu verschiedenen der
genannten Faktoren ist zusätzlich
gefunden worden, dass sie in der sich entwickelnden Niere exprimiert
werden, enthaltend IGF-I, TGF-β und
OP-1 (beispielsweise rezensiert in Bard et al. (1994) Mech Develop.
48: 3–11).
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Interessanterweise
wurde gezeigt, dass TGF-β in
einem metanephrischem Nager-Organkultursystem ein verzögertes allgemeines
Wachstum und segmentelle Differenzierung aller Segmente der sich
entwickelnden Nephronen zeigt, mit Ausnahme des dicken aufsteigenden
distalen Tubulus der frühen
Extremitäten
(Avner und Sweeney (1990) Pediatr Nephrol. 4: 372–377). Zusätzlich wurde
eine erhöhte
TGF-β Expression
in verschiedenen Modellen einer Nierenerkrankung gefunden, was darauf
hindeutet, dass eine TGF-β vermittelte Erhöhung in
der Synthese von extrazellulären
Matrixkomponenten verwickelt sein könnte in die Ätiologie
der diabetischen Nephropathie (oder diabetischen Glomerulopathie
oder diabetischen Nierenhypertrophie), in die Nierenfibrose, die
Glomerulosklerose und in die Glomerulonephritis, die interstitielle
Fibrose und in die hypertensive Nephrosklerose (Shankland et al.
(1994) Kidney Intel. 46: 430–442;
Yamamoto et al. (1994) Kidney Intl. 45: 916–927; Yanamoto et al. (1993)
PNAS 90: 1814–1818;
Tamaki et al. (1994) Kidney Intl. 45: 525–536; Border et al. (1990)
Nature 346: 371–374;
Hamaguchi et al. (1995) Hypertension 26: 199–207).
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Ebenfalls
von Interesse ist die Tatsache, dass die Serummengen des humanen
Wachstumsfaktors (GH) erhöht
sind in untersuchten Subjekten mit einer chronischen Nierenerkrankung
(Wright et al. (1968) Lancet 2: 798; Samaan and Freeman (1970) Metabolism
19: 102). Es wurde gezeigt, dass rekombinantes GH helfen kann, das
Proteingleichgewicht unterernährter
Patienten mit einem chronischen Nierenversagen aufrechtzuerhalten
und das "Aufholen" im Wachstum bei
Kindern mit einem chronischem Nierenversagen zu fördern. Es
wurde nahe gelegt, dass diese Wirkungen vermittelt werden durch
IGF-I (siehe beispielsweise Koppel (1992) Miner. Electrolyte Metab.
18: 269–275).
Obwohl in einigen Studien gefunden wurde, dass die Verabreichung
von IGF-I den Nierenplasmafluss und die GFR in Patienten mit chronischem
Nierenversagen erhöht (beispielsweise
Guler et al. (1989) PNAS 86: 2868–2872; Hirschberg et al. (1993)
Kidney Intl. 43: 387–397), haben
andere Studien gefunden, dass diese Wirkung lediglich vorübergehend
ist (Miller et al. (1994) Kidney Intl. 46: 201–207).
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Obwohl
von einigen Wachstumsfaktoren gezeigt wurde, dass sie sowohl in
dem sich entwickelndem als auch in dem reifen Nierengewebe exprimiert
werden, und obwohl zumindest von einem gezeigt wurde, dass es die
Nierenfunktion kurzfristig erhöhen
kann, konnte demnach bislang von niemandem gezeigt werden, dass
es einen therapeutischen Vorteil in der Verhinderung, Inhibierung
oder Verzögerung
des fortschreitenden Verlustes der Nierenfunktion gibt, welche das
chronische Nierenversagen charakterisiert. Es besteht darum ein Behandlungsbedarf,
um den fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion zu verhindern,
welche die Abhängigkeit
Hunderttausender Patienten von einer chronischen Dialyse begründet und
zu dem verfrühten
Tod Zehntausender jährlich
führt.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung sowie pharmazeutische
Zubereitungen zur Verwendung in der Behandlung von untersuchten
Säugetiersubjekten
mit einem chronischen Nierenversagen oder einer Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen oder einer Gefährdung
im Hinblick auf eine Nierenaustauschtherapie. Solche untersuchten
Subjekte umfassen Subjekte, die bereits an einem chronischen Nierenversagen
leiden oder bereits eine Nierenaustauschtherapie erhalten haben,
sowie jegliche untersuchten Subjekte, von welchen vernünftigerweise
angenommen wird, dass sie einen fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion
verbunden mit einem fortschreitenden Verlust von funktionsfähigen Nephroneinheiten
erleiden werden. Ob ein bestimmtes Subjekt eine Gefährdung besitzt,
stellt eine Determination dar, welche routinemäßig von einem Fachmann auf
dem betreffenden medizinischen oder veterinärmedizinischen Gebiet durchgeführt werden
kann. Subjekte mit einem chronischen Nierenversagen oder mit einer
Gefährdung
für ein chronisches
Nierenversagen oder mit einer Gefährdung des Bedarfs an einer
Nierenaustauschtherapie umfassen, wenn auch nicht ausschließlich, die
nachfolgend genannten: Subjekte, welche betrachtet werden können als
unter einem chronischen Nierenversagen, einer Nierenerkrankung im
Endzustand, einer chronischen diabetischen Nephropathie, einer hypertensiven
Nephrosklerose, eine chronischen Glomerulonephritis, einer angeborenen
Nephritis und/oder einer Nierendysplasie leidend; Subjekte, die
eine Biopsie aufweisen, welche auf eine glomeruläre Hypertrophie, eine tubuläre Hypertrophie,
eine chronische Glomerulosklerose und/oder eine chronische tubulointerstitielle
Sklerose hinweist; Subjekte, die einen Ultraschallbefund, einen
Kernspintomographie- (MRI,
magnet resonance imaging), einen Computertomographie- (CAT, computer assisted
tomography) oder einen anderen nicht-invasive Untersuchungsbefund
aufweisen, welcher auf eine Nierenfibrose hinweist; Subjekte, die
eine unübliche
Anzahl an deutlichen Hautabstoßungen
("broad casts") in Ihrem Harnsediment
zeigen; Subjekte, die eine GFR haben, welche chronisch unter ungefähr 50%,
vorzugsweise unter ungefähr
40%, 30% oder 20% der erwarteten GFR für das Subjekt liegt; humane
männliche
Subjekte, die mindestens ungefähr
50 kg wiegen und eine GFR haben, die chronisch unter ungefähr 50 ml/min
und vorzugsweise unter ungefähr
40 ml/min, 30 ml/min oder 20 ml/min liegt; humane weibliche Subjekte,
die mindestens ungefähr 40
kg wiegen und eine GFR haben, welche chronisch unter ungefähr 40 ml/min
und vorzugsweise unter ungefähr
30 ml/min, 20 ml/min oder 10 ml/min liegt; Subjekte, die eine Anzahl
von funktionellen Nephroneinheiten aufweisen, die unter ungefähr 50% und
vorzugsweise unter ungefähr
40%, 30% oder 20% der Anzahl an funktionellen Nephroneinheiten eines
gesunden, aber ansonsten gleichartigen Subjektes liegt; Subjekte,
die eine einzelne Niere besitzen; und schließlich Subjekte, die Empfänger einer
Nierentransplantation sind.
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Die
Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nutzen
teilweise die Entdeckung, dass bestimmte Proteine eines eukaryotischen
Ursprungs verwendet werden können
als renal therapeutisch wirksame Mittel in der Behandlung von Subjekten
mit einer Gefährdung,
wie sie nachfolgend definiert wird, eines chronischen Nierenversagens
oder dem Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie. Im allgemeinen
sind diese renal therapeutisch wirksamen Mittel Proteine oder sie
basieren auf Proteinen, welche Mitglieder der osteogenen Protein/knochenmorphogenetischen
Protein (OP/BMP) Proteinfamilie sind. Folglich enthalten nutzbare
OP/BMP renal therapeutisch wirksame Mittel dieser Erfindung Polypeptide
oder funktionelle Varianten von Polypeptiden, welche mindestens
die C-terminale 6-oder 7-Cystein Domäne eines Säugerproteins aufweisen, ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5,
BMP6, BMP9, sowie Proteine, welche mindestens 70% oder vorzugsweise
75% oder 80% Homologie in der Aminosäuresequenz mit der Aminosäuresequenz
der 7-Cystein Domäne
von humanen OP-1 aufweisen und welche im Stande sind, (a) die Chontrogenese
des Reddi-Sampath ektopischen Knochenassays (Sampath and Reddi (1981),
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78: 7599–7603) oder eines im wesentlichen äquivalenten
Assays hierzu zu induzieren; (b) signifikant den fortschreitenden
Verlust an Nierenfunktion in einem Standardtiermodell eines chronischen
Nierenversagens zu verhindern, zu inhibieren, zu verzögern oder
zu mildern; oder (c) eine klinisch bedeutsame Verbesserung in einem
Standardmarker der Nierenfunktion hervorzurufen, wenn er einem Säuger verabreicht
wird, der ein chronisches Nierenversagen oder eine Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen besitzt. Allgemeiner gesprochen stellt die Erfindung
die Verwendung von "Morphogenen" bereit, welche dimere
Proteine darstellen, welche die Morphogenese von einer oder mehreren
eukaryoti schen Zellen (beispielsweise von Säugern), Geweben oder Organen
induzieren. Hierbei sind von besonderem Interesse Morphogene, welche
die Morphogenese zumindest von Nierengewebe bei Säugern induzieren,
enthaltend die Formierung von funktionellem Nierenepithel und insbesondere
von funktionellem Glomerula- und Tubularepithel. Die Morphogene
umfassen ein Paar an Polypeptiden, welche – wenn sie gefaltet sind – eine Konfiguration annehmen,
die ausreichend ist für
das sich ergebende dimere Protein, eine morphogenetische Antwort
in Zellen und Geweben auszulösen,
welche spezifische Rezeptoren für
diese Morphogene ausweisen. Dies sind Morphogene, welche im allgemeinen
alle der nachfolgenden biologischen Funktionen in einer morphogenetisch
toleranten Umebung induzieren: Stimulierung der Proliferation von
Vorläuferzellen;
Stimulierung der Differenzierung von Vorläuferzellen; Stimulierung der
Proliferation von differenzierten Zellen; und Unterstützung des
Wachstums sowie der Versorgung von differenzierten Zellen. "Vorläufer"-Zellen sind neutrale
Zellen, welche im Stande sind, in einen oder mehreren spezifischen
Typen an differenzierten Zellen zu differenzieren, abhängig von
ihren Genomrepertoire und der Gewebespezifität der toleranten Umgebung,
in welcher die Morphogenese induziert wird. Die Morphogene können ferner
den Beginn eines Seneszenz- oder eines Stilllegungsvermittelten
("senescence- or
quiescence-associated")
Verlustes des Phänotypus
und/oder der Gewebefunktion verzögern
oder mildern. Die Morphogene können
ferner die phänotypische
Expression von differenzierten Zellen stimulieren, umfassend die
Expression von metabolischen und/oder funktionellen, beispielsweise
sekretorischen, Bestandteilen hiervon. Zusätzlich können die Morphogene die erneute
Differenzierung von festgelegten Zellen unter angemessenen Umgebungsbedingungen
induzieren. Wie bereits oben erwähnt, sind
Morphogene, welche die Proliferation und/oder die Differenzierung
zumindest von Nierengewebe des Säugers
induzieren und/oder das Wachstum, die Versorgung und/oder die funktionellen
Eigenschaften von Säugernephronen
unterstützen,
hierbei von besonderem Interesse.
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Gemäß bevorzugten
Ausführungsformen
hat besitzt das Paar Morphogenpolypeptiden eine Aminosäuresequenz,
welche jeweils eine Sequenz aufweist, die eine definierte Beziehung
mit einer Aminosäuresequenz
eines Referenzmorphogens teilt. Bevorzugte Morphogenpolypeptide
teilen sich hierin eine definierte Beziehung mit einer Sequenz,
welche in dem morphogenetisch aktiven humanen OP-1, SEQ ID Nr. 4,
dargeboten ist. Jedoch könnte
jede oder mehrere der natürlich
vorkommenden oder biosynthetischen Sequenzen, welche vorliegend
offenbart werden, in ähnlicher
Weise als eine Referenzsequenz verwendet werden. Bevorzugte Morphogenpolypeptide
teilen sich eine definierte Beziehung mit zumindest der C-terminalen
sechs-Cystein Domäne
von humanen OP-1, Reste 43 bis 139 der SEQ ID Nr. 4. Bevorzugt teilen
sich Morphogenpolypeptide eine definierte Beziehung mit zumindest
der C-terminalen sieben-Cystein Domäne von humanen OP-1, Reste 38 bis 139
der SEQ ID Nr. 4. Dies bedeutet, dass jedes bevorzugte Morphogenpolypeptid
in einem dimeren Protein mit einer morphogenetischen Aktivität eine Sequenz
aufweist, welche mit einer Referenzsequenz korrespondiert oder hierzu
funktionell äquivalent
ist.
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Funktionell äquivalente
Sequenzen enthalten funktionell äquivalente
Anordnungen von Cysteinresten, welche innerhalb der Referenzsequenz
bereitgestellt sind, enthaltend Aminosäureinsertionen oder Deletionen, welche
die lineare Anordnung dieser Cysteine abändern, jedoch nicht ihre Beziehung
in der gefalteten Struktur des dimeren Morphogenproteins wesentlich
beeinträchtigen,
einschließlich
ihrer Fähigkeit,
solche intra- oder inter-Disulfidkettenbindun gen zu formen, die
für eine
morphogenetische Aktivität
erforderlich sein können. Funktionell äquivalente
Sequenzen enthalten ferner jene Sequenzen, worin eine oder mehrere
Aminosäurereste
sich von dem korrespondierenden Rest der Referenzmorphogensequenz
unterscheiden, beispielsweise der C-terminalen sieben-Cystein Domäne (oder
des "Skelettes") von humanen OP-1,
vorausgesetzt, dass dieser Unterschied nicht die morphogenetische
Aktivität
zerstört.
Dementsprechend sind konservative Substitutionen der korrespondierenden
Aminosäuren
in der Referenzsequenz bevorzugt. Aminosäurereste, die "konservative Substitutionen" für entsprechende
Reste in einer Referenzsequenz darstellen, sind jene, die physikalisch
oder funktionell gleichartig zu den entsprechenden Referenzresten
sind, beispielsweise jene, die eine ähnliche Größe, Gestalt, elektrische Ladung,
chemische Eigenschaften einschließlich der Fähigkeit, kovalente oder Wasserstoffbindungen
zu bilden, oder dergleichen besitzen. Besonders bevorzugte konservative
Substitutionen sind jene, welche die Kriterien erfüllen, die
für eine "akzeptierte Punktmutation" in Dayhoff et al.
(1978) 5 Atlas auf Protein Sequence and Structure, Suppl 3, ch.
22 (Seiten 354–352),
Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. 20007, definiert sind,
deren Lehre hierin durch Bezugnahme eingebunden wird.
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In
bestimmten Ausführungsformen
wird ein Polypeptid hierin angepasst, von welchem vermutet wird, dass
es ein funktionelles Äquivalent
zu einem Referenzmorphogenpolypeptid ist, verwendend das Verfahren von
Needleman et al. (1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453, konventionell implementiert
in Computerprogrammen, wie dem Align Programm (DNAstar, Inc.). Wie
oben bereits erwähnt,
werden interne Lücken
und Aminosäureinsertionen
in der Kandidatensequenz zum Zwecke der Kalkulation der definierten
Beziehung ignoriert, konventionell ausgedrückt als ein Wert der Homologie oder
Identität
der Aminosäuresequenz
zwischen den Kandidaten- und den Referenzsequenzen. "Homologe Aminosäuresequenz" ist dabei dahingehend
zu verstehen, dass die Ähnlichkeit
der Aminosäuresequenz
gemeint ist. Homologe Sequenzen teilen sich identische oder ähnliche
Aminosäurereste,
worin ähnliche
Reste konservative Substitutionen sind für entsprechende Aminosäurereste
oder "erlaubte Punktmutation" von entsprechenden
Aminosäureresten
in einer abgestimmten Referenzsequenz. Demnach ist eine Polypeptidsequenz
eines Kandidaten, der sich 70% Homologie mit einer Referenzsequenz
teilt, eine solche, in welcher jegliche 70% jedes der abgestimmten
Reste entweder identisch ist mit den entsprechenden Resten in der
Referenzsequenz oder konservative Substitutionen der korrespondierenden
Reste in der Referenzsequenz darstellt.
-
Von
besonderem Interesse hierin sind Morphogene, welche – wenn sie
Säugern
angeboten werden – den
normalen Stand der Differenzierung und des Wachstums von Nephroneinheiten
induzieren oder aufrechterhalten. Von noch größerem Interesse sind hierin
Morphogene, welche – wenn
Sie einem Säuger
verabreicht werden – die
Ausbildung einer kompensatorischen Hypertrophie einschließlich einer
glomerulären
Hypertrophie und/oder einer tubulären Hypertrophie verhindern,
inhibieren oder verzögern.
Solche Morphogene können
verwendet werden, um einen Säuger
zu behandeln, der ein chronisches Nierenversagen oder eine Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen besitzt, indem der fortschreitende Verlust von funktionellen
Nephroneinheiten und der folgende fortschreitende Verlust der Nierenfunktion
verhindert, inhibiert oder verzögert wird.
-
Alternativ
kann die vorliegende Erfindung genutzt werden mit Verfahren und
Zusammensetzungen, welche ein Morphogen-stimulierendes Mittel oder
einen Induktor eines Morphogens an Stelle eines Morphogens enthalten.
Ein "Induktor eines
Morphogens" ist
eine Verbindung, welche in vivo die Produktion, beispielsweise die
Expression, einer therapeutisch wirksamen Konzentration eines endogenen
Morphogens im Körper eines
Säugers
stimuliert, die ausreichend ist, um das Nierengewebe zu regenerieren
oder zu versorgen und/oder um den zusätzlichen Verlust davon zu inhibieren.
Es wird verstanden, dass solche Verbindungen Substanzen umfassen.
welche – wenn
Sie einem Säuger
verabreicht werden – auf
Zellen von Gewebe(n) oder Organ(en) wirken, die üblicherweise befähigt sind,
ein Morphogen zu produzieren und/oder zu sezernieren, welches innerhalb
des Genoms des Säugers
kodiert wird, und welches veranlasst, dass die endogenen Mengen
des Morphogens im Körper
des Säugers
verändert
werden. Endogene oder verabreichte Morphogene können als endokrine, parakrine
oder autokrine Faktoren wirken. Dies bedeutet, dass endogene Morphogene von
den Zellen synthetisiert werden können, in welchen morphogenetische
Antworten durch benachbarte Zellen oder durch Zellen eines entfernten
Gewebes induziert werden, in dessen Bedingungen das sezernierte
endogene Morphogen an die Stelle der Morphogenese transportiert
wird, beispielsweise durch den individuellen Blutstrom. In bevorzugten
Ausführungsformen
stimuliert das Mittel die Expression und/oder Sekretion eines endogenen
Morphogens derart, dass die Menge davon in Nierengeweben erhöht wird.
-
In
einer weiteren Ausführungsformen
kann das Mittel, welches als Agonist eines Morphogenrezeptors wirkt,
anstelle des Morphogens selbst verabreicht werden. Ein "Agonist" eines Rezeptors
bedeutet eine Verbindung, die an einen Rezeptor bindet und für die solch
eine Bindung ein ähnliches
funktionelles Ergebnis hat, als wenn der natürliche endogene Ligand des
Rezeptors gebunden worden wäre.
Dies bedeu tet, die Verbindung muss – nach Interaktion mit den
Rezeptor – die
gleichen oder im Wesentlichen ähnliche
transmembrane und/oder intrazelluläre Wirkungen erzeugen wie der
endogene Ligand. Somit bindet ein Agonist eines Morphogenrezeptors
an den Rezeptor und solch eine Bindung hat das gleiche oder ähnliche
funktionelle Ergebnis wie eine Morphogenbindung (beispielsweise
Induktion der Morphogenese). Die Aktivität oder das Potenzial eines Agonisten
kann geringer sein als die des natürlichen Liganden, in solch
einem Fall wird der Agonist als "partieller
Agonist" bezeichnet;
oder sie kann gleich oder größer sein
als der natürliche
Ligand, in solch einen Fall wird er als "vollständiger Agonist" bezeichnet. Auf
diese Weise kann z. B. ein kleines Peptid oder ein anderes Molekül, welches
die Aktivität
eines Morphogens bezüglich
seiner Bindung an einen Morphogenrezeptor und der Aktivierung des
Morphogenrezeptors zu imitieren vermag, als ein Äquivalent des Morphogens verwendet werden.
Bevorzugt ist der Agonist ein vollständiger Agonist, aber partielle
Rezeptoragonisten können
auch in vorteilhafter Weise verwendet werden. Verfahren zur Identifizierung
solcher Agonisten sind auf dem vorliegenden Fachgebiet bekannt und
beinhalteten Assays für
Verbindungen, die Morphogen-vermittelte Antworten induzieren (beispielsweise
Induktion der Differenzierung von metanephrischem Mesenchym, Induktion
der endochondralen Knochenformierung und dergleichen). Solch ein
Mittel kann ebenfalls als ein Morphogen-"Imitator", "Nachahmer", oder "Analogon" bezeichnet werden.
-
Die
OP/BMP renal therapeutisch wirksamen Mittel der Erfindung bzw. das
Morphogen, der Morphogen-Induktor und der Agonist des Morphogenrezeptors
der Erfindung können
auf beliebigem Verabreichungsweg appliziert werden, welcher mit
dem ausgewählten
Mittel kompatibel ist, und sie können
mit jedem pharmazeutisch zulässigen
Träger
formuliert werden, welcher dem Verabreichungsweg angemessen ist.
Bevorzugte Verabreichungswege sind parenteral und insbesondere intravenös, interperitoneal
und renal intracapsular (in die Capsula adiposa perirenalis). Über einen
längeren
Zeitraum werden Behandlungen ebenfalls bevorzugt ambulant begleitet.
Es wird erwartet, dass die täglichen
Dosierung der renal therapeutisch wirksamen Mittel im Bereich von
ungefähr
0,01 bis 1000 μg/kg
Körpergewicht
und vorzugsweise von ungefähr
10 bis 300 μg/kg
Körpergewicht
liegt, obwohl präzise
Dosierungen in Abhängigkeit
von dem jeweils verwendeten therapeutischen Mittel und dem jeweiligen
medizinischen Zustand und der Krankengeschichte des Subjektes schwanken
werden.
-
Abschließend können gemäß weiteren
Ausführungsformen
die Nierenzellen in die Niere des Subjektes implantiert werden,
welches ein chronisches Nierenversagen oder eine Gefährdung für ein chronisches Nierenversagen
oder eine Gefährdung
zum Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie besitzt, um als Quelle für ein Morphogen
und/oder zur Bereitstellung einer Quelle für zusätzliches funktionelles Nierengewebe
zu dienen. Diese Zellen können
renale mesenchymale Vorläuferzellen
oder solche renale mesenchymale Vorläuferzellen sein, welche dahingehend
induziert wurden, eine metanephrische Differenzierung zu durchlaufen.
Die Zellen können
von einem Spender (beispielsweise einem Spender mit passendem Gewebetyp,
einem Geschwisterteil, einem eineiigen Zwilling) erhalten werden;
sie können
von einer Gewebekultur (beispielsweise undifferenzierte Nierenmesenchymkultur,
fötale
Nierengewebekultur) erhalten werden; oder sie können vom Subjekt explantiert
und anschließend
nach Proliferation und/oder Differenzierung erneut implantiert werden. Vorzugsweise
werden die Zellen durch Behandlungen mit einem Morphogen (beispielsweise
OP-1) entweder vor oder nach der Implantation dahingehend induziert,
eine metanephrische Differenzierung zu durchlaufen.
-
Die
Behandlungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich in der Verhinderung,
Inhibierung oder Verzögerung
des fortschreitenden Verlustes von funktionellen Nephroneinheiten
und des folgenden fortschreitenden Verlustes der Nierenfunktion,
welche ein chronisches Nierenversagen typisiert. Als solches sind
sie von großem
Nutzen in der Verhinderung oder Verzögerung des Bedarfs an einer
chronischen Dialyse oder an einer Nierenaustauschtherapie in Subjekten
mit einer chronischen Niereninsuffizienz, oder der Verringerung
der notwendigen Häufigkeit
einer chronischen Nierendialyse in Subjekten mit einer Nierenerkrankung
im Endstadium. Als solches sind sie weiterhin nützlich in der Verlängerung
des Lebens und in der Aufrechterhaltung der Lebensqualität von Subjekten
mit einer Gefährdung
für ein
chronisches Nierenversagen oder von Subjekten, die bereits unter
einem chronischen Nierenversagen leiden.
-
Kurze Beschreibung
der
-
In
der Zeichnung zeigen:
-
1 ein
Balkendiagramm, welches die durchschnittlichen Kreatininwerte im
Serum von Gruppen von scheinoperierten ("SHAM")
oder teilweise nephrektomierten ("NX Contr" und "OP-1")
Ratten zeigt. Fünf
bis sechs Monate nach der Operation erhielten die Ratten Injektionen
des Vehikels allein ("Nx
control" und "SHAM") oder 1, 3, 10 bzw.
50 μg/kg
Körpergewicht
von dem löslichem
OP-1 ("OP-1") dreimal die Woche über vier
bis acht Wochen.
-
2 ein
Balkendiagramm, welches die durchschnittlichen Harnstoffwerte im
Serum von Gruppen von scheinoperierten ("SHAM")
oder teilweise nephrek tomierten ("Nx Control" und "OP-1")
Ratten zeigt. Fünf
bis sechs Monate nach der Operation erhielten die Ratten Injektionen
des Vehikels allein ("Nx
control" und "SHAM") oder 1, 3, 10 bzw.
50 μg/kg
Körpergewicht
von dem löslichen
OP-1 ("OP-1") dreimal die Woche über vier
bis acht Wochen.
-
3 Flächen A bis
C, welche mikroskopische Aufnahmen von Nierengewebe aus Ratten bei
einer 10× Vergrößerung darstellen.
(A) Gewebe einer scheinoperierten Ratte; (B) Gewebe einer Ratte
mit einem chronischen Nierenversagen nach einer 5/6 Nephrektomie
(Nx control); (C) Gewebe einer Ratte, die mit OP-1 nach einer 5/6
Nephrektomie behandelt wurde.
-
4 Flächen A bis
C, welche mikroskopische Aufnahmen von Nierengewebe aus Ratten bei
einer 40× Vergrößerung darstellen.
(A) Gewebe einer scheinoperierten Ratte; (B) Gewebe einer Ratte
mit einem chronischen Nierenversagen nach einer 5/6 Nephrektomie
(Nx control); (C) Gewebe einer Ratte, die mit OP-1 nach einer 5/6
Nephrektomie behandelt wurde.
-
5 ein
Liniendiagramm, welches die durchschnittlichen Kreatininwerte im
Serum über
neun Wochen für
Gruppen von teilweise nephrektomierten Ratten zeigt. Zwei bis drei
Wochen nach der Operation erhielten die Ratten Injektionen des Vehikels
allein ("Control") oder 10 μg/kg Körpergewicht
von dem löslichen OP-1
("OP-1") dreimal die Woche.
-
6 ein
Liniendiagramm, welches die durchschnittlichen Kreatinin-Beseitigungsraten
("creatinine clearance
rates") als eine
Messung der GFR über acht
Wochen für
Gruppen von teilweise nephrektomierten Ratten zeigt. Zwei bis drei
Wochen nach der Operation erhielten die Ratten Injektionen des Vehikels
allein ("Control") oder 10 μg/kg Körpergewicht
von dem löslichen
OP-1 ("OP-1") dreimal die Woche.
-
7 Flächen 7-1 bis 7-12,
welche einen röhrenförmigen Abgleich
der Aminosäuresequenzen
von verschiedenen natürlich
vorkommenden Morphogenen mit einer bevorzugten Referenzsequenz des humanen
OP-1, Reste 38–139
der SEQ ID Nr. 4 darstellen. Die Morphogenpolypeptide, die in dieser
Fig. gezeigt sind, sind gleichfalls in der Sequenzliste gekennzeichnet.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
I. Definitionen
-
Um
den Gegenstand der vorliegenden Erfindung deutlicher und prägnanter
herauszustellen, sind die nachfolgenden Definitionen angegeben,
welche für
bestimmte Begriffe in der nachfolgenden Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet
werden.
-
Renal
therapeutisch wirksame Mittel. Wie es hierin verwendet wird, bezeichnet
der Begriff "renal
therapeutisch wirksames Mittel" ein
Polypeptid oder eine funktionelle Variante eines Polypeptides, welches
zumindest die C-terminale sechs- oder sieben-Cystein Domäne eines
Säugerproteins
umfasst, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus OP-1, OP-2, OP-3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6,
BMP9 sowie Proteinen, welche mindestens 70% oder vorzugsweise 75%
oder 80% Aminosäuresequenzhomologie
mit der Aminosäuresequenz
der sieben-Cystein Domäne
des humanen OP-1 aufweisen; und welches (a) geeignet ist, eine Chondrogenese
in dem Reddi- Sampath
ektopischen Knochenessays (Sampath and Reddi (1981), Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) 78: 7599–7603)
oder eines im wesentlichen äquivalenten
Assays zu induzieren; (b) im Stande ist, signifikant den fortschreitenden
Verlust der Nierenfunktion in einem Standardtiermodell eines chronischen
Nierenversagens zu verhindern, zu inhibieren, zu verzögern oder
zu mildern; oder (c) im Stande ist, eine klinisch signifikante Verbesserung
in einem Standardmarker der Nierenfunktion hervorzurufen, wenn es
einem Säuger
appliziert wird, der ein chronisches Nierenversagen oder eine Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen besitzt. Wie es hierin verwendet wird, weist prozentualer
Anteil der "Homologie" zwischen zwei Aminosäuresequenzen
auf den prozentualen Anteil von Aminosäureresten hin, die innerhalb
der Sequenzen identisch oder ähnlich
sind; und wie es hierin weiterhin verwendet wird, sind "ähnliche" Reste "konservative Substitutionen", welche die Kriterien
erfüllen,
die für
eine "akzeptierte
Punktmutation" in
Dayhoff et al (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure Vol.
5 (Suppl. 3), Seiten 354–352,
Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., definiert sind.
-
Therapeutische
Wirksamkeit. Wie es hierin verwendet wird, gilt als ein renal therapeutisch
wirksames Mittel der Erfindung ein solches, welches eine "therapeutische Wirksamkeit" besitzt, und eine
Menge des Mittels gilt als eine solche mit einer "therapeutischen Wirksamkeit", wenn die Verabreichung
dieser Menge des Mittels ausreichend ist, um eine klinisch bedeutsame
Verbesserung in einem Standardmarker der Nierenfunktionen hervorzurufen,
wenn es einem Säugersubjekt
(beispielsweise einem menschlichen Patienten) mit einem chronischen
Nierenversagen oder einer Gefährdung
für ein
chronisches Nierenversagen appliziert wird. Solche Marker der Nierenfunktion
sind in der medizinischen Literatur umfangreich bekannt und umfassen, wenn
auch nicht aus schließlich,
Erhöhungsraten
der BUN Mengen, Erhöhungsraten
des Kreatinins im Serum, statische Messungen des BUN, statische
Messungen des Kreatinins im Serum, glomeruläre Filtrationsrate (GFR), Verhältnis von
BUN/Kreatinin, Serumkonzentrationen von Natrium (Na+),
Harn/Plasmaverhältnisse
für Kreatinin,
Harn/Plasmaverhältnisse
für Harnstoff,
Osmolarität
des Harns, täglicher
Harnausstoß und
dergleichen (siehe z. B. Brenner und Lazarus (1994) in Harrison's Principles of Internal
Medicine, 13. Ausgabe, Isselbacher et al., eds., McGraw Hill Text,
New York; Luke und Strom (1994), in Internal Medicine, 4. Auflage,
J. H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St. Louis.).
-
Glomeruläre Filtrationsrate
(GFR). Die "glomeruläre Filtrationsrate" oder "GFR" ist proportional
zur Beseitigungsrate im Harn einer Plasma gebundenen Substanz, welche
nicht von Serumproteinen gebunden wird, welche ungehindert entlang
der Glomerula filtriert wird und welche weder sezerniert noch durch
die Nierentubuli resorbiert wird. Somit ist die GFR, wie sie hierin
verwendet wird, vorzugsweise definiert durch die nachfolgende mathematische
Gleichung:
wobei U
conc die
Harnkonzentrationen des Markers, P
conc die
Plasmakonzentration des Markers und V die Harnflussrate in ml/min
ist. Optional ist GFR für
Körperoberflächenbereiche
("body surface areas") berichtigt. Somit können die
GFR-Werte, wie sie
hierin verwendet werden, als Einheiten von ml/min/1,73 m
2 betrachtet werden.
-
Die
bevorzugte Messung der GFR stellt die Beseitigung von Inulin dar,
aber aufgrund der Schwierigkeit, die Konzentration dieser Substanz
zu messen, wird üblicherweise
in klinischen Einstellungen die Beseitigung von Kreatinin verwendet.
Für einen
durchschnittlich großen,
gesunden menschlichen Mann (70 Kilogramm, 20 bis 40 Jahre) wird
z. B. erwartet, dass eine übliche
GFR, die über
die Beseitigung von Kreatinin gemessen wird, annäherungsweise 125 ml/min mit
Plasmakonzentrationen des Kreatinins von 0,7 bis 1,5 mg/dL ergibt.
Für eine
vergleichbare durchschnittlich große Frau wird erwartet, dass
eine übliche
GFR, die über
die Beseitigung von Kreatinin gemessen wird, annäherungsweise 115 ml/min mit
Kreatininwerten von 0,5 bis 1,3 mg/dL ergibt. Bei guter Gesundheit
sind menschliche GFR-Werte relativ stabil bis ungefähr dem 40. Lebensjahr,
ab welchem üblicherweise
die GFR mit dem Alter beginnt anzusteigen. Für untersuchte Personen, die
bis zum 85. oder 90. Lebensjahr überleben,
kann die GFR auf 50% der vergleichbaren Werte beim 40. Lebensjahr
herabgesetzt sein.
-
Erwartete
glomeruläre
Filtrationsrate (GFRexp). Ein Schätzwert der "erwarteten GFR" oder "GFRexp" könnte bereitgestellt
werden basierend auf Überlegungen über das
Alter des Subjektes, das Gewicht, das Geschlecht, den Körperoberflächenbereich
und den Grad der Muskulatur sowie die Plasmakonzentrationen mancher
Markerverbindung (beispielsweise Kreatinin), wie er über einen
Bluttest bestimmt wird. Auf diese Weise kann als Beispiel eine erwartete
GFR oder GFRexp bestimmt werden als:
-
-
Diese
Schätzung
berücksichtigt
nicht solche Faktoren wie Oberflächenbereich,
Grad der Muskulatur oder prozentualer Anteil an Körperfett.
Unter Verwendung der Mengen an Krea tinin im Plasma wurde diese Formel
nichtsdestoweniger als kostengünstiges
Mittel zur Abschätzung
der GFR bei menschlichen Männern verwendet.
Weil Kreatinin von den gestreiften Muskeln produziert wird, wird
die erwartete GFR oder GFRexp von menschlichen
weiblichen Subjekten geschätzt
durch dieselbe Gleichung, aber multipliziert mit 0,85, um die erwartete
Differenzen in der Muskelmasse zu berücksichtigen (siehe Lehmann
et al. (1990) AM. J. Kidney Dis. 16(3): 236–243).
-
Deutliche
Hautabstoßung.
Die mikroskopische Untersuchung des Harnsedimentes auf die Anwesenheit
von ausgebildeten Elementen stellt eine Standardprozedur in der
Urinanalyse dar. Unter den ausgebildeten Elementen, die im Urin
anwesend sein können,
sind zylinderförmige
Massen von agglutinierten Materialien, die üblicherweise eine Matrize oder
eine "Hautabstoßung" des Lumens eines
distal gebogenen Tubulus oder der sammelnden Tubuli darstellen.
In gesunden menschlichen Subjekten haben solche Hautabstoßungen üblicherweise einen Durchmesser von 15 bis 25 μm. In Subjekten
mit einem chronischen Nierenversagen kann indes die Hypertrophie
der Tubuli die Präsenz
von "deutlichen
Hautabstoßungen" oder "Hautabstoßungen des Nierenversagens" mit einem zwei-
bis sechsfachen Durchmesser der normalen Hautabstoßungen zur
Folge haben, wobei diese häufig
ein homogenes wachsartiges Aussehen aufweisen. Somit bezeichnet
eine "deutliche
Hautabstoßung", wie sie hierin
verwendet wird, eine "Hautabstoßung im
Harnsediment", welche
einen Durchmesser des zwei- bis sechsfachen des normalen besitzt
bzw. ungefähr
30 bis 150 μm
bei humanen Hautabstoßungen
beträgt.
-
Chronisch.
Wie es hierin verwendet wird in Bezug auf klinische Indikationen,
wie Hautabstoßungen
im Urin, gemessener GFR oder anderer Marker der Nierenfunktion,
bedeutet "chronisch" persistierend für einen Zeitraum
von mindestens drei und vorzugsweise mindestens sechs Monaten. Somit
ist z. B. ein Subjekt mit einer gemessenen GFR chronisch unter 50%
des GFRexp ein Subjekt, in dem die GFR gemessen
und gefunden wurde, dass sie unter 50% der GFRexp in
mindestens zwei voneinander getrennten Messungen liegt, die voneinander
mindestens drei und vorzugsweise mindestens sechs Monate getrennt
liegen und für
die kein medizinisch korrekter Grund vorliegt, anzunehmen, dass
die GFR während
der Zwischenzeit wesentlich (beispielsweise um 10%) höher lag.
-
Subjekte
mit einem chronischen Nierenversagen oder einer Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen. Wie es hierin verwendet wird, bezeichnet ein Subjekt
mit einem chronischen Nierenversagen oder mit einer Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen oder mit einer Gefährdung für den Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie
ein Subjekt, von welchem vernünftigerweise
erwartet werden kann, dass es an einem fortschreitenden Verlust
der Nierenfunktion verbunden mit einem fortschreitenden Verlust
der funktionellen Nephroneinheiten leidet. Ob ein bestimmtes Subjekt
ein chronisches Nierenversagen oder eine Gefährdung für ein chronisches Nierenversagen
besitzt, stellt eine Feststellung dar, die routinemäßig von
einem Fachmann auf dem betreffenden medizinischen oder veterinärmedizinischen
Gebiet durchgeführt
werden kann. Subjekte mit einem chronischen Nierenversagen oder
einer Gefährdung
für ein
chronisches Nierenversagen oder einer Gefährdung für den Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie
umfassen, wenn auch nicht ausschließlich, die folgenden Subjekte:
Subjekte, die betrachtet werden können als unter einem chronischen Nierenversagen,
einem Nierenversagen im Endstadium, einer chronischen diabetischen
Nephropathie, einer hypertensiven Nephrosklerose, einer chronischen
Glomerulonephritis, angeborener Nephritis und/oder renaler Dysplasie
leidend; Subjek te, die eine Biopsie haben, welche auf eine glomeruläre Hypertrophie,
eine tubuläre Hypertrophie,
eine chronische Glomerulosklerose und/oder eine chronische tubulointerstitielle
Sklerose hinweist; Subjekte, die einen Ultraschallbefund, einen
Kernspinntomographie- (MRI, magnet resonanz imaging), einen Computertomografie-
(CAT, Computer assistant tomografy) oder einen anderen nicht invasiven
Untersuchungsbefund aufweisen, welcher auf eine Nierenfibrose hindeutet;
Subjekte, die eine unübliche
Anzahl an deutlichen Hautabstoßungen
im Harnsediment aufweisen; Subjekte, die eine GFR aufweisen. welche
chronisch unter ungefähr
50% und insbesondere unter ungefähr
40%, 30% oder 20% der zu erwartenden GFR des Subjektes liegt; menschliche
männliche
Subjekte, die mindestens ungefähr
50 kg wiegen und eine GFR besitzen, welche chronisch unter ungefähr 50 ml/min
und insbesondere unter ungefähr
40 ml/min, 30 ml/min oder 20 ml/min liegt; menschliche weibliche
Subjekte, die mindestens ungefähr
40 kg wiegen und eine GFR besitzen, welche chronisch unter ungefähr 40 ml/min
und insbesondere unter ungefähr
30 ml/min, 20 ml/min oder 10 ml/min liegt; Subjekte, die eine Anzahl
an funktionellen Nephroneinheiten besitzen, welche unter ungefähr 50% und
insbesondere unter ungefähr
40%, 30% oder 20% der Anzahl an funktionellen Nephroneinheiten liegt,
die ein gesundes, aber ansonsten gleiches Subjekt besitzt; Subjekte,
die eine einzelne Niere aufweisen und Subjekte, die Empfänger einer
Nierentransplantation sind.
-
II Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
-
A. Allgemeines
-
Die
vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der überraschenden Entdeckung, dass
die Verabreichung von bestimmten, auf Proteinen basierenden, renal
therapeutisch wirksamen Mitteln an Subjekte mit einem chronischen
Nieren versagen oder mit einer Gefährdung für ein chronisches Nierenversagen
die Sterbewahrscheinlichkeiten und/oder die Erkrankungsziffern erniedrigen
kann und den fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion, welcher
das chronische Nierenversagen charakterisiert, zu verhindern, zu
inhibieren, zu verzögern
oder zu mildern vermag. Alternativ oder zusätzlich kann die Verabreichung
der renal therapeutisch wirksamen Mittels gemäß der vorliegenden Erfindung
den fortschreitenden Verlust an funktionellen Nephroneinheiten und
den fortschreitenden Abfall in der glomerulären Filtrationsrate (GFR),
welcher langsam aber unweigerlich zum Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie
(d. h. Nierentransplantation oder chronische Dialyse) oder dem Tod
führt,
verhindern, inhibieren oder verzögern.
In bevorzugten Ausführungsformen
sind die therapeutischen wirksamen Mittel der Erfindung Mitglieder
der osteogenen Protein/knochenmorphogenetischen Protein (OP/BMP)
Familie innerhalb der TGF-β Proteinsuperfamilie.
-
B. Renal therapeutisch
wirksame Mittel
-
Die
renal therapeutisch wirksamen Mittel der vorliegenden Erfindung
sind natürlich
vorkommende Proteine oder funktionelle Varianten der natürlich vorkommenden
Proteine innerhalb der osteogenen Protein/knochenmorphogenetischen
Protein (OP/BMP) Familie innerhalb der TGF-β Proteinsuperfamilie. Dies bedeutet, dass
diese Proteine eine eindeutige Untergruppe bilden, welche hiernach
als die "OP/BMP
Familie" bezeichnet ist
innerhalb der losen evolutionären
Gruppierung der Sequenz-verwandten Proteine, welche als die TGF-β Superfamilie
bekannt sind. Mitglieder dieser Proteinfamilie umfassen sezernierte
Polypeptide, die sich gemeinsame strukturelle Merkmale teilen und
die gleichartig prozessiert werden, ausgehend von einer pro-Protein Form,
um ein Carboxy-terminales reifes Protein zu erhalten. Inner halb
des reifen Proteins teilen sich alle Mitglieder ein konserviertes
Motiv von sechs oder sieben Cysteinresten, welche eine 97–106 Aminosäuredomäne definieren,
wobei die aktive Form dieser Proteine entweder ein Disulfid-gebundenes
Homodimer eines einzelnen Familienmitgliedes oder ein Heterodimer
aus zwei unterschiedlichen Mitgliedern ist (siehe beispielsweise Massague
(1990), Annu. Rev. Cell Biol. 6: 597; Sampath et al. (1990), J.
Biol. Chem. 265: 13198). In seiner reifen, natürlichen Form ist z. B. das
aus einer natürlichen
Quelle gewonnene humane OP-1 ein glykosiliertes Dimer, das üblicherweise
ein mittleres Molekulargewicht von ungefähr 30 bis 36 kDa besitzt, wie
es auf einem SDS-PAGE bestimmt wird. Wenn es reduziert wird, ergibt
das 30 kDa Protein zwei glykosilierte Peptiduntereinheiten, welche
mittlere Molekulargewichte von ungefähr 16 kDa und 18 kDa besitzen.
Das unglykosilierte Protein besitzt ein mittleres Molekulargewicht
von ungefähr
27 kDa. Wenn es reduziert wird ergibt das 27 kDa Protein zwei unglykosilierte
Polypeptidketten, die Molekulargewichte von ungefähr 14 kDa
bis 16 kDA besitzen.
-
Üblicherweise
werden natürlich
vorkommende OP/BMP Proteine als Vorläufer ("Prekursoren") translatiert, welche eine N-terminale
Signalpeptidsequenz, eine "pro"-Domäne und eine "reife" Proteindomäne besitzen.
Das Signalpeptid ist üblicherweise
weniger als 30 Reste lang und es wird rasch nach der Translation an
einer Schnittstelle geschnitten, die vorausberechnet werden kann
durch Verwendung des Verfahrens nach Von Heijne (1986), Nucleic
Acids Research 14: 4683–4691.
Die "pro"-Domäne ist sowohl
in der Sequenz als auch in der Länge
variabel, wobei sie von ungefähr
200 bis über
400 Resten reichen kann. Die pro-Domäne wird abgespalten, um die "reife" C-terminale Domäne von ungefähr 115 bis
180 Resten zu erhalten, welche die konservierte sechs oder sieben
Cystein C-terminale Domäne
von 97 bis 106 Resten enthält.
Wie es hierin verwendend wird, bezieht sich die "pro-Form" eines OP/BMP Familienmitgliedes auf
ein Protein, welches ein gefaltetes Paar von Polypeptiden umfasst,
jedes umfassend eine pro-Domäne
in entweder kovalenter oder nicht kovalenter Bindung mit den reifen
Domänen
des OP/BMP Polypeptides. Üblicherweise
ist die pro-Form des Proteins unter physiologischen Bedingungen
löslicher
als die reife Form. Es scheint so, als wäre die pro-Form die primäre Form,
welche von kultivierten Säugerzellen
ausgeschieden wird. Die "reife
Form" des Proteins
bezieht sich auf die reife C-terminale Domäne, welche nicht gebunden ist – d. h.
weder kovalent noch nicht kovalent – mit der pro-Domäne. Von
jedem Präparat
von OP-1 ist zu berücksichtigen,
dass es die reife Form enthält,
wenn die Menge der pro-Domäne
in dem Präparat
nicht mehr als 5% der Menge der "reifen" C-terminalen Domäne beträgt.
-
Die
OP/BMP Familienmitglieder, welche hierin nützlich sind, enthalten jede
der bekannten, natürlich vorkommenden
nativen Proteine einschließlich
allelen, phylogenetischen Entsprechungen und anderen Varianten hiervon,
ob natürlich
bezogen oder biosynthetisch hergestellt (enthaltend beispielsweise "Muteine" oder "Proteinmutanten"), sowie auch neue,
aktive Mitglieder der OP/BMP Proteinfamilie.
-
Besonders
nützliche
Sequenzen enthalten jene, welche die C-terminalen sieben-Cystein
Domänen von
Säugern
umfassen, vorzugsweise humane, wie humanes OP-1, OP-2, OP-3, BMP2,
BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP8 und BMP9. Andere Proteine, welche nützlich sind
in der Anwendung der Erfindung, enthalten aktive Formen von GDF-5,
GDF-6, GDF-7, DPP, Vgl, Vgr-1, 60A, GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6,
GDF-7, BMP10, BMP11, BMP13, BMP15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP oder
NURAL und Aminosäuresequenzvarianten
hiervon. In einer gegenwär tig
bevorzugten Ausführungsform
werden die renal therapeutisch wirksamen Mittel der Erfindung ausgewählt aus
einem beliebigen Vertreter aus der Gruppe: OP-1, OP-2, OP-3, BMP2,
BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 und BMP9.
-
Publikationen,
die sowohl diese Sequenzen als auch deren chemische und physikalische
Eigenschaften offenbaren, beinhalten: OP-1 und OP-2:
US 5 011 691 A ,
US 5 266 683 A sowie Ozkaynak
et al. (1990), EMBO J. 9: 2085–2093;
OP-3: WO 94/10203 A1; BMP2, BMP3 und BMP4:
US 5 013 649 A , WO 91/18098
A1, WO 88/00205 A1 sowie Wozney et al. (1988), Science 242: 1528–1534; BMP5
und BMP6: WO 90/11366 A1 sowie Celeste et al. (1991), Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 87: 9843–9847;
Vgr-1: Lyons et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 4554–4558; DPP:
Padgett et al. (1987), Nature 325: 81–84; Vgl: Weeks (1987), Cell
51: 861–867;
BMP-9: WO 95/33830 A1; BMP10: WO 94/26893 A1, BMP-11: WO 94/26892
A1; BMP12: WO 95/16035 A1; GDF-1: WO 92/00382 sowie Lee et al. (1991),
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 4250–4254; GDF-8: WO 94/21681 A1;
GDF-9: WO 94/15966 A1; GDF-10: WO 95/10539 A1; GDF-11: WO 96/01845
A1; BMP-15: WO 96/36710 A1; MP121: WO 96/0316 A1; GDF-5 (CDMP-1,
MP52): WO 94/15949 A1, WO 96/14335 A1, WO 93/16099 A1 sowie Storm
et al. (1994), Nature 368: 639–643;
GDF-6 (CDMP-2, BMP13): WO 95/01801 A1, WO 96/14335 A1 sowie WO 95/10635
A1; GDF-7 (CDMP-3, BMP12): WO 95/10802 A1 und WO 95/10635 A1; BMP-3b:
Takao et al. (1996), Biochem. Biophys Res. Comm. 219: 656–662; GDF-3:
WO 94/15965 A1; 60A: Blaster et al. (1993), Cell 73: 687–702 sowie
Gen Bank Recherchennummer L12032. Gemäß einer anderen Ausführungsform
beinhalten nützliche
Proteine biologisch aktive biosynthetische Konstrukte, enthaltend
neue biosynthetische Proteine und Chimärproteine, welche unter Verwendung
von Sequenzen von zwei oder mehreren bekannten Proteinen der OP/BMP
Familie konstruiert wurden. In diesem Zusammenhang wird auch auf
die biosyntheti schen Konstrukte verwiesen, welche in der
US 5 011 691 A offenbart
sind, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird
(beispielsweise COP-1, COP-3, COP-4, COP-5, COP-7 und COP-16).
-
Gemäß anderen
bevorzugten Ausführungsformen
enthalten die hierin nützlichen
renal therapeutisch wirksamen Mittel therapeutisch wirksame Proteine,
in welchen die Aminosäuresequenzen
eine Sequenz umfassen, die sich mindestens 70% Aminosäuresequenz "Homologie" und vorzugsweise
75% oder 80% Homologie mit der C-terminalen sieben-Cystein Domäne teilt,
welche in den aktiven Formen des humanen OP-1 vorhanden ist (d.
h. die Reste 330–431,
wie sie in der SEQ ID Nr. 2 der
US 5 266 683 A gezeigt sind). Gemäß anderen
bevorzugten Ausführungsformen
enthalten die hierin nützlichen
renal therapeutisch wirksamen Mittel therapeutisch wirksame Proteine,
in welchen die Aminosäuresequenzen
eine Sequenz umfassen, die sich mindestens 60% Aminosäuresequenz
Identität
und vorzugsweise 65% oder 70% Identität mit der C-terminalen sieben-Cystein
Domäne
teilt, welche in den aktiven Formen des humanen OP-1 vorhanden ist.
Somit kann eine Kandidaten Aminosäuresequenz, von welcher angenommen
wird, dass sie eine therapeutische Wirksamkeit in der vorliegenden
Erfindung besitzt, abgestimmt werden mit der Aminosäurensequenz
der C-terminalen sieben-Cystein Domäne des humanen OP-1 unter Verwendung
des Verfahrens nach Needleman et al. (1970), J. Mol. Biol. 48: 443–453, welches
vorteilhafter Weise in Computerprogrammen, wie das Align Programm (DNAstar,
Inc.), inkorporiert ist. Wie für
den Fachmann ersichtlich, enthalten homologe oder funktionell äquivalente
Sequenzen funktionell äquivalente
Anordnungen der Cysteinreste innerhalb der konservierten Cysteindomäne einschließlich Aminosäureinsertionen
oder Deletionen, welche die lineare Anordnung dieser Cysteine abwandeln,
welche jedoch nicht wesentlich deren Beziehung in der gefalteten
Struktur des dimeren Proteins einschließlich deren Fähigkeit,
solche intra- oder inter-Disulfidkettenbindungen auszubilden, wie
sie für
die biologische Aktivität
nötig sein
können,
beeinträchtigen.
Darum werden interne Lücken
und Aminosäureinsertionen
zum Zwecke der Berechnung des Grades an Homologie oder Identität zwischen
den Kandidaten und den Referenzensequenzen in der Sequenz des Kandidaten
ignoriert.
-
Hierin
wird unter "Homologie
der Aminosäuresequenz" verstanden, dass
sowohl die Identität
als auch die Ähnlichkeit
der Aminosäuresequenz
darin enthalten ist. Wie es hierin verwendet wird, weist demnach
ein prozentualer Anteil an "Homologie" zwischen zwei Aminosäuresequenzen
auf den prozentualen Anteil von Aminosäureresten hin, die zwischen
den Sequenzen identisch oder ähnlich
sind. "Ähnliche" Reste stellen "konservative Substitutionen" dar, welche die
Kriterien für
eine "akzeptierte
Punktmutation" erfüllen, wie
sie in Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure
Vol. 5 (Suppl. 3), Seiten 354–352,
Natl. Biomed. Res. Fund., Washington, D.C. definiert sind. Somit
sind "konservative
Substitutionen" Reste,
welche physikalisch oder funktionell ähnlich zu den entsprechenden
Referenzenresten sind, welche eine ähnliche Größe, Gestalt, elektrische Ladung
und/oder chemische Eigenschaften besitzen, wie die Fähigkeit,
kovalente oder Wasserstoff(brücken)
bindungen zu formen, oder dergleichen. Beispiele für konservative
Substitutionen beinhalten die Substitution einer Aminosäure durch
eine andere mit ähnlichen
Charakteristika, beispielsweise Substitutionen innerhalb der folgenden
Gruppen: (a) Valin, Glycin; (b) Glycin, Alanin; (c) Valin, Isoleutin,
Leucin; (d) Asparaginsäure,
Glutaminsäure;
(e) Asparagin, Glutamin; (f) Serin, Threonin; (g) Lysin, Arginin,
Methionin; und (h) Phenylalanin, Tyrosin. Die Bezeichnungen "konservative Substitution" oder "konservative Variation" beinhalten ebenfalls
die Verwendung einer substituierten Aminosäure an Stelle einer unsubstituierten
Ausgangsaminosäure
in einer vorgegebenen Polypeptidkette, vorausgesetzt, dass die sich
daraus ergebende substituierte Polypeptidkette ebenfalls eine therapeutische
Wirksamkeit in der vorliegenden Erfindung besitzt.
-
Die
renal therapeutisch wirksamen Mittel der Erfindung sind ebenfalls
charakterisiert durch biologische Aktivitäten, welche vom Fachmann leicht
bestimmt werden können.
im Speziellen ist ein renal therapeutisch wirksames Mittel der vorliegenden
Erfindung (a) im Stande, die Chodrogenese in dem Reddi-Sampath ektopischen
Knochenassay (Sampath and Reddi (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
78: 7599–7603)
oder einem im wesentlichen äquivalenten
Assay zu induzieren; (b) im Stande, bedeutsam den fortschreitenden
Verlust der Nierenfunktion in einem Standardtiermodell des chronischen
Nierenversagens zu verhindern, zu inhibieren, zu verzögern oder
zu mildern; oder (c) im Stande, eine klinisch bedeutsame Verbesserung
in einem Standardmarker der Nierenfunktion herbeizuführen, wenn
es einem Säuger
mit einem chronischen Nierenversagen oder einer Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen appliziert wird.
-
Der
Reddi-Sampath ektopische Knochenassay ist auf dem Fachgebiet bekannt
als Assay für
die Chondrogeneseaktivität.
Der Assay, welcher leicht ausgeführt
werden kann, ist beispielsweise beschrieben und diskutiert in Sampath
and Reddi (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78: 7599–7603; und
Wozney (1989), "Bone
Morphogenetic Proteins",
Progress in Growth Factor Research 1: 267–280. Viele äquivalente
Assays, welche andere Tier- und Gewebestellen verwenden, können vom
Fachmann verwendet oder entwickelt werden, um die biologische Aktivität der renal
therapeutisch wirksamen Mittel der vorliegenden Erfindung zu evaluieren.
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In
diesem Zusammenhang sei z. B. auf die Bioassays verwiesen, welche
in der
US 5 226 683
A beschrieben sind.
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Die
renal therapeutisch wirksamen Mittel der vorliegenden Erfindung
können
ebenfalls in Tiermodellen des chronischen Nierenversagens getestet
werden. Säugermodelle
des chronischen Nierenversagens sind z. B. Mäuse, Ratten, Meerschweinchen,
Katzen, Hunde, Schafe, Ziegen, Schweine, Kühe, Pferde und nicht humane
Primaten, sie können
entworfen werden durch Zufügung
einer adäquaten,
direkten oder indirekten Verletzung oder Beschädigung des Nierengewebes des
Tieres. Tiermodelle des chronischen Nierenversagens können z.
B. entworfen werden mittels der Durchführung einer partiellen (beispielsweise
5/6) Nephrektomie, welche die Anzahl an funktionellen Nephroneinheiten
auf eine Menge reduziert, die eine kompensatorische Nierenhypertrophie,
weiteren Nephronenverlust und den fortschreitenden Abfall der Nierenfunktion
auslöst, was
das chronische Nierenversagens charakterisiert.
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Schließlich können die
renal therapeutisch wirksamen Mittel der vorliegenden Erfindung
evaluiert werden aufgrund ihrer therapeutischen Wirksamkeit in der
Verursachung einer klinisch bedeutsamen Verbesserungen in einem
Standardmarker der Nierenfunktion, wenn sie einem Säugersubjekt
(beispielsweise einem menschlichen Patienten) mit einem chronischen
Nierenversagen oder einer Gefährdung
für ein
chronisches Nierenversagen appliziert werden. Solche Marker der
Nierenfunktion sind in der medizinischen Literatur bekannt und enthalten,
wenn auch nicht ausschließlich,
die Anstiegsraten der BUN Mengen, die Anstiegsraten des Kreatinins
im Serum, die statischen Messungen des BUN, die statischen Messungen
des Kreatinins im Serum, die glomeruläre Filtrationsrate (GFR), das
Verhältnis
von BUN/Kreatinin, die Konzentrationen von Natrium (Na+)
im Serum, das Urin/Plasma-Verhältnis
für Kreatinin,
das Urin/Plasma-Verhältnis
für Harnstoff,
die Osmolärität des Urins,
den täglichen
Urinausstoß und
dergleichen (siehe z. B. Brenner and Lazarus (1994), in Harrison's Principles of Internal
Medicine, 13. Ausgabe, Isselbacher et al., eds., McGraw Hill Text,
New York; Luke and Strom (1994), in Internal Medicine, 4. Ausgabe,
J. H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St. Louis.).
-
Die
renal therapeutisch wirksamen Mittel, welche hierin genannt sind,
können
von intakter oder gestützter
("truncated") genomischer oder
cDNA oder von synthetischen DNAs in prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirtszellen exprimiert werden. Die dimeren Proteine können aus
dem Kulturmedium isoliert werden und/oder in vitro erneut gefaltet
und dimerisiert werden, um biologisch aktive Zusammensetzungen auszubilden.
Heterodimere können
in vitro ausgebildet werden durch Kombination von verschiedenen
gesonderten Polypeptideketten. Alternativ können Heterodimere in einer
einzelnen Zelle ausgebildet werden durch Co-Expression der Nukleinsäuren, welche
die verschiedenen gesonderten Polypeptidketten kodieren. Als Beispiel
für verschiedene
exemplarische Produktionsprotokolle für ein rekombinantes heterodimeres
Protein sei auf die WO 93/09229 A1 oder die
US 5 411 941 A verwiesen.
Gegenwärtig
bevorzugte Wirtszellen umfassen, wenn auch nicht ausschließlich, Prokaryonten
einschließlich
E. coli oder Eukaryonten einschließlich Hefe, Saccharomices,
Insektenzellen oder Säugerzellen,
wie CHO, COS oder BSC Zellen. Der Fachmann auf dem Fachgebiet vermag
zu erkennen, dass auch andere Wirtszellen vorteilhafterweise verwendet
werden können.
Detaillierte Beschreibungen der Proteine, die nützlich sind in der Ausübung dieser
Erfindung, einschließlich
der Art und Weise, wie sie herzustellen sind, deren Verwendung und
Tests für
die chondrogenetische Aktivität,
sind in zahlreichen Publikationen offen bart, was auch für die
US 5 266 683 A und
für die
US 5 011 691 A gilt,
deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
-
C. Morphogene Induktoren
und Agonisten:
-
In
der nachfolgenden Tabelle 1 sind verschiedene natürlich vorkommende
Mitglieder der OP/BMP Familie, die bisher identifiziert wurden,
einschließlich
deren Nomenklatur, wie sie hierin verwendet wird, deren Literaturnachweise
der Sequenzliste und Publikationsquellen für die Aminosäuresequenzen
der Proteine in ganzer Länge,
die nicht in der Sequenzliste berücksichtigt sind, zusammengefasst.
Jede der generischen Bezeichnungen, welche in Tabelle 1 wiedergegeben
sind, ist beabsichtigt und sollte verstanden werden als die therapeutisch
wirksamen Proteine umfassend diejenigen, welche von Nukleinsäuren exprimiert
werden, welche die identifizierten Sequenzen kodieren, die nachstehend
aufgeführt
und in der Sequenzliste dargestellt sind, oder ein aktives Fragment
oder ein aktiver Vorläufer
hiervon oder ein funktionelles Äquivalent
hiervon, wie eine natürlich
vorkommende oder biosynthetische Variante. Natürlich vorkommende Varianten
enthalten sowohl allele Variantenformen, die von anderen Individuen
einer einzelnen biologischen Spezies isoliert wurden, als auch Speziesvarianten
(Homologe), die von phylogenetisch verschiedenen biologischen Spezies
isoliert wurden.
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-
-
-
Wie
in 7 gezeigt ist, besitzen die OP-2
und OP-3 Proteine
einen zusätzlichen
Cysteinrest in der konservierten C-terminalen Region (siehe beispielsweise
Rest 41 der SEQ ID Nr. 6 und 7). Das GDF-1 Protein hat einen Einschub
("insert") von vier Aminosäuren innerhalb
der konservierten C-terminalen Cystein-Domäne (Reste 44–47 der
SEQ ID Nr. 13). Des weiteren fehlt den BMP-2 und BMP-4 Proteinen
ein Aminosäurerest innerhalb
der Cysteindomäne.
Somit illustriert der Abgleich dieser Aminosäuresequenzen in 7 Grundsätze der Abgleiche, die hierin
verwendet wurden, in Bezug auf die bevorzugte Referenzsequenz des
humanen OP-1, Reste 38–139
der SEQ ID Nr. 4.
-
Zusätzlich zu
den OP/BMP renal therapeutisch wirksamen Mitteln, die im vorhergehenden
Abschnitt beschriebenen sind, kann die vorliegende Erfindung durch
Verwendung von "Morphogenen", wie sie hierin
beschrieben werden, ausgeführt
werden. Morphogene, welche in der vorliegenden Erfindung nützlich sind,
beinhalten jene, in welchen die Aminosäuresequenzen der Morphogenpolypeptide
eine Sequenz enthalten, die mindestens eine 70% Homologie oder "Ähnlichkeit" der Aminosäuresequenz und vorzugsweise
80% Homologie oder Ähnlichkeit
mit einer Referenzsequenz, ausgewählt aus den vorhergehenden
natürlichen
OP/BMP Familienmitgliedern, aufweist. Vorzugsweise ist das Referenzprotein
humanes OP-1 und ist die Referenzsequenz hiervon die C-terminale
sieben-Cystein Domäne, die
in aktiven Formen von humanem OP-1, Reste 38–139 der SEQ ID Nr. 4 vorliegt.
Morphogene, welche hierin demnach nützlich, sind umfassen allele,
phylogenetische Entsprechungen und andere Varianten der bevorzugten
Referenzsequenz, ob natürlich
vorkommend oder biosynthetisch hergestellt (beispielsweise enthaltend "Muteine" oder "Proteinmutanten"), ebenso wie neuartige
Mitglieder der OP-BMP
Proteinfamilie, wie sie oben dargestellt und identifi ziert sind,
beispielsweise in Verbindung mit Tabelle 1. Bestimmte besonders
bevorzugte Morphogenpolypeptide teilen sich mindestens 60% Aminosäureidentität mit der
bevorzugten Referenzsequenz des humanen OP-1, vorzugsweise mindestens
65% Aminosäureidentität hiermit.
-
Gemäß anderen
bevorzugten Ausführungsformen
sind die Morphogenpolypeptide, welche in der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind, definiert durch eine generische Aminosäuresequenz. So beherbergen
z. B. die generische Sequenz 7 (SEQ ID Nr. 1) und die generische
Sequenz 8 (SEQ ID Nr. 2), die nachstehend offenbart werden, die
Homologien, welche zwischen bevorzugten OP/BMP Proteinfamilienmitgliedern
geteilt werden, die bis heute identifiziert wurden, enthaltend zumindest
OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, 60A, DPP, Vgl, BMP-5, BMP-6,
Vgr-1 und GDF-1 (SEQ ID Nr. 4–15,
24 und 26–29).
Die generischen Sequenzen enthalten sowohl die Aminosäureidentität, die von
diesen Sequenzen in der C-terminalen Domäne geteilt wird, definiert
durch die sechs- und sieben-Cystein Domänen (generische Sequenzen 7
bzw. 8) als auch alternative Reste für die variablen Positionen
innerhalb der Sequenz. Die generischen Sequenzen stellen eine passende
Cystein-Domäne
bereit, worin inter- oder intramolekulare Disulfidbindungen ausgebildet
werden können,
und sie enthalten bestimmte kritische Aminosäuren, die wahrscheinlich die
Tertiärstruktur
der gefalteten Proteine beeinflussen. Darüber hinaus ermöglichen
die generischen Sequenzen ein zusätzliches Cystein an Position
41 (generische Sequenz 7) oder Position 46 (generische Sequenz 8),
wodurch die aktiven Sequenzen von OP-2 und OP-3 umspannt werden. Generische
Sequenz 7
wobei jedes Xaa unabhängig ausgewählt ist aus einer Gruppe von
einer oder mehreren spezifizierten Aminosäuren, welche wie folgt definiert
sind: "res." bedeutet "Rest" und Xaa an res.
2 = (Tyr oder Lys); Xaa an res. 3 = Val oder Ile); Xaa an res. 4
= (Ser, Asp oder Glu); Xaa an res. 6 = (Arg, Gkn, Ser, Lys oder
Ala); Xaa an res. 7 = (Asp oder Glu); Xaa an res. 8 = (Leu, Val
oder Ile); Xaa an res. 11 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn oder Ser); Xaa
an res. 12 = (Asp, Arg, Asn oder Glu); Xaa an res. 13 = (Trp oder
Ser); Xaa an res. 14 = (Ile oder Val); Xaa an res. 15 = (Ile oder
Val); Xaa an res. 16 = (Ala oder Ser); Xaa an res. 18 = (Glu, Gln,
Leu, Lys, Pro oder Arg); Xaa an res. 19 = (Gly oder Ser); Xaa an res.
20 = (Tyr oder Phe); Xaa an res. 21 = (Ala, Ser, Asp, Met, His, Gln,
Leu oder Gly); Xaa an res. 23 = (Tyr, Asn oder Phe); Xaa an res.
26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln, Ala oder Ser); Xaa an res. 28 = (Glu,
Lys, Asp, Gln oder Ala); Xaa an res. 30 = (Ala, Ser, Pro, Gln, Ile
oder Asn); Xaa an res. 31 = (Phe, Leu oder Tyr); Xaa an res. 33
= (Leu, Val und Met); Xaa an res. 34 = (Asn, Asp, Ala, Thr oder
Pro); Xaa an res. 35 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala oder Lys); Xaa an
res. 36 = (Tyr, Cys, His, Ser oder Ile); Xaa an res. 37 = (Met,
Phe, Gly oder Leu); Xaa an res. 38 = (Asn, Ser oder Lys), Xaa an
res. 39 = (Ala, Ser, Gly oder Pro); Xaa an res. 40 = (Thr, Leu oder
Ser), Xaa an res. 44 = (Ile, Val oder Thr); Xaa an res. 45 = (Val, Leu,
Met oder Ile); Xaa an res. 46 = (Gln oder Arg); Xaa an res. 47 =
(Thr, Ala oder Ser); Xaa an res. 48 = (Leu oder Ile); Xaa an res.
49 = (Val oder Met); Xaa an res. 50 = (His, Asn oder Arg); Xaa an
res. 51 = (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala oder Val); Xaa an res. 52 = (Ile,
Met, Asn, Ala, Val, Gly oder Leu); Xaa an res. 53 = (Asn, Lys, Ala,
Glu, Gly oder Phe); Xaa an res. 53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly oder
Phe); Xaa an res. 54 = (Pro, Ser oder Val); Xaa an res. 55 = (Glu,
Asp, Asn, Gly, Val, Pro oder Lys); Xaa an res. 56 = (Thr, Ala, Val,
Lys, Asp, Tyr, Ser, Gly, Ile oder His); Xaa an res. 57 = (Val, Ala
oder Ile); Xaa an res. 58 = (Pro oder Asp); Xaa an res. 59 = (Lys,
Leu oder Glu); Xaa an res. 60 = (Pro, Val oder Ala); Xaa an res.
63 = (Ala oder Val); Xaa an res. 65 = (Thr, Ala oder Glu); Xaa an
res. 66 = (Gln, Lys, Arg oder Glu); Xaa an res. 67 = (Leu, Met oder
Val); Xaa an res. 68 = (Asn, Ser, Asp oder Gly); Xaa an res. 69
= (Ala, Pro oder Ser); Xaa an res. 70 = (Ile, Thr, Val oder Leu);
Xaa an res. 71 = (Ser, Ala oder Pro); Xaa an res. 72 = (Val, Leu,
Met oder Ile); Xaa an res. 74 = (Tyr oder Phe); Xaa an res. 75 =
(Phe, Tyr, Leu oder His); Xaa an res. 76 = (Asp, Asn oder Leu);
Xaa an res. 77 = (Asp, Glu, Asn, Arg oder Ser); Xaa an res. 78 =
(Ser, Gln, Asn, Tyr oder Asp); Xaa an res. 79 = (Ser, Asn, Asp,
Glu oder Lys), Xaa an res. 80 = (Asn, Thr oder Lys); Xaa an res.
82 = (Ile, Val oder Asn); Xaa an res. 84 = (Lys oder Arg), Xaa an
res. 85 = (Lys, Asn, Gln, His, Arg oder Val); Xaa an res. 86 = (Tyr,
Glu oder His); Xaa an res. 87 = (Arg, Gln, Glu oder Pro); Xaa an
res. 88 = (Asn, Glu, Trp oder Asp); Xaa an res. 90 = (Val, Thr,
Ala oder Ile); Xaa an res. 92 = (Arg, Lys, Val, Asp, Gln oder Glu);
Xaa an res. 93 = (Ala, Gly, Glu oder Ser); Xaa an res. 95 = (Gly
oder Ala); Xaa an res. 97 = (His oder Arg).
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Die
generische Sequenz 8 (SEQ ID Nr. 2) enthält die gesamte generische Sequenz
7 und zusätzlich enthält sie an
ihrem N-Terminus die folgende Sequenz (SEQ ID Nr. 14):
-
-
Demnach,
beginnend am Rest 7, ist jedes "Xaa" in der generischen
Sequenz 8 eine vorgegebene Aminosäure, wie sie für die generische
Sequenz 7 definiert ist, mit den Unterschied, dass jede Nummer für den Rest,
wie er in der generischen Sequenz 7 beschrieben ist, sich um 5 in
der generischen Sequenz 8 verschiebt. Folglich bezieht sich "Xaa an res. 2 = (Tyr
oder Lys)" in der
generischen Sequenz 7 auf "Xaa
an res. 7" in der generischen
Sequenz 8. In der generischen Sequenz 8 ist Xaa an res. 2 = (Lys,
Arg, Ala oder Gln); Xaa an res. 3 = (Lys, Arg oder Met); Xaa an
res. 4 = (His, Arg oder Gln); und Xaa an res. 5 = (Glu, Ser, His,
Gly, Arg, Pro, Thr oder Tyr).
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Wie
oben angemerkt, besitzen bestimmte gegenwärtig bevorzugte Morphogenpolypeptidsequenzen, welche
in der vorliegenden Erfindung nützlich
sind, eine Identität
größer als
60%, vorzugsweise eine Identität größer als
65%, mit der Aminosäuresequenz,
welche die bevorzugte Referenzse quenz von hOP-1 definiert. Diese
besonders bevorzugten Sequenzen beinhalten allele und phylogenetisch
entsprechende Varianten der OP-1 und OP-2 Proteine einschließlich des
Drosophila 60A Proteins. Dementsprechend enthalten in bestimmten
besonders bevorzugten Ausführungsformen
nützliche
Morphogene aktive Proteine, die Paare von Polypeptidketten innerhalb
der generischen Aminosäuresequenz
einschließen,
welche hierin als "OPX" (SEQ ID Nr. 3) bezeichnet
werden, wobei die Sequenz die sieben-Cystein Domäne definiert und die Homologien
zwischen verschiedenen identifizierten Varianten von OP-1 und OP-2
beherbergt. Wie hierin beschrieben, wird jedes Xaa an einer vorgegebenen
Position unabhängig
ausgewählt
aus den Resten, die an der entsprechenden Position an der C-terminalen
Sequenz von Maus oder humanen OP-1 oder OP-2 vorhanden sind (siehe SEQ
ID Nr. 4–7
und/oder SEQ ID Nr. 15–22).
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In
noch anderen bevorzugten Ausführungsformen
besitzen nützliche
Morphogenpolypeptide Aminosäuresequenzen,
die eine Sequenz enthalten, welche von einer Nukleinsäure kodiert
wird, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an DNA oder
RNA hybridisiert, welche die Referenzmorphogensequenzen kodieren,
beispielsweise die C-terminalen Sequenzen, welche die konservierte
C-terminalen sieben-Domänen von
OP-1 oder OP-2 definieren, beispielsweise die Nukleotide 1036–1341 und
die Nukleotide 1390–1695
der SEQ ID Nr. 15 bzw. 19. Wie hierin verwendet, sind stringente
Hybridisierungsbedingungen definiert als Hybridisierung entsprechend
bekannter Techniken in 40% Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung
und 0,1% SDS bei 37°C über Nacht
und Waschung in 0,1 × SSPE,
0,1% SDS bei 50°C.
-
Wie
oben angemerkt, sind Morphogene, welche in der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind, im allgemeinen dimere Proteine, die ein gefaltetes Paar der
obigen Polypeptide enthalten. Morphogene sind inaktiv, wenn sie
reduziert sind, wobei sie jedoch als oxidierte Homodimere aktiv
sind wie auch dann, wenn sie in Kombination mit anderen Morphogenen
dieser Erfindung oxidiert werden, um Heterodimere herzustellen.
Darum können
Mitglieder eines gefalteten Morphogenpolypeptides in einem morphogenetisch
aktiven Protein unabhängig
ausgebildet werden aus jedem der oben beschriebenen spezifischen
Morphogenpolypeptide. Wie oben angemerkt, ist hierin ein Protein
im allgemeinen morphogenetisch, wenn es die Entwicklungskaskade
der zellulären
und molekularen Ereignisse induziert, die in der Bildung von neuem
organspezifischem Gewebe mündet.
Die Morphogene sind im allgemeinen befähigt, alle der folgenden biologischen
Funktionen in einer morphogenetisch toleranten Umwelt zu induzieren:
Stimulierung der Proliferation von Vorläuferzellen; Stimulierung der
Differenzierung von Vorläuferzellen;
Stimulierung der Proliferation von differenzierten Zellen; und Unterstützung des
Wachstums und der Erhaltung von differenzierten Zellen.
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Die
Morphogene, welche in den Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen
dieser Erfindung nützlich
sind, umfassen Proteine, welche jede der oben beschriebenen Polypeptidketten
umfassen, ob aus natürlich
vorkommenden Quellen isoliert oder durch rekombinante DNA oder andere
synthetische Techniken erzeugt, und beinhalten sowohl allele und
phylogenetisch entsprechende Varianten dieser Proteine, als auch
biosynthetische Varianten (Muteine) hiervon sowie verschiedene verstümmelte ("truncate") und fusionierte
Konstrukte. Es wird ebenfalls vorgesehen, dass Deletionen und zusätzliche
Mutationen aktiv sind, einschließlich derer, welche die konservierte
C-terminale sechs- oder sieben-Cystein
Domäne
abwandeln, sofern die Abwandlung die Beziehungen dieser Cysteine
in der gefalteten Struktur nicht funktionell stört. Demnach werden solche aktive
Formen als gleichwertig zu den speziell beschriebenen Konstrukten
betrachtet, die hierin offenbart sind. Die Proteine können Formen
enthalten, die ein verändertes
Glykosilierungsmuster aufweisen, einen veränderten N-Terminus, eine Familie
von verwandten Proteine, die Regionen von homologer Aminosäuresequenz
besitzen, sowie verstümmelte
oder mutierte aktive Formen der natürlichen oder biosynthetischen
Proteine, die durch Expression von rekombinanter DNA in Wirtszellen
hergestellt wurden.
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In
diesem Zusammenhang stellt 7 einen
Abgleich der Aminosäuresequenzen
der aktiven Regionen der natürlich
vorkommenden Proteine dar, welche hierin identifiziert oder gewürdigt wurden
als OP/BMP renal therapeutisch wirksame Mittel, beinhaltend humanes
OP-1 (hOP-1, SEQ ID Nr. 4 und 15–16), Maus OP-1 (mOP-1, SEQ
ID Nr. 5 und 17–18),
humanes und Maus OP-2 (SEQ ID Nr. 6, 7 und 19–22), Maus OP-3 (SEQ ID Nr.
25–26),
BMP-2 (SEQ ID Nr. 8), BMP-4 (SEQ ID Nr. 9), BMP-3 (SEQ ID Nr. 27),
DPP (aus Drosophila, SEQ ID Nr. 10), VgI (aus Xenopus, SEQ ID Nr.
11), Vgr-1 (aus Maus, SEQ ID Nr. 12), GDF-1 (aus Maus und/oder Mensch,
SEQ ID Nr. 13, 30 und 31), 60A Protein (aus Drosophila, SEQ ID Nr.
23 und 24), BMP-5 (SEQ ID Nr. 28) und BMP-6 (SEQ ID Nr. 29). Die
Sequenzen wurden im Wesentlichen abgeglichen und berechnet gemäß dem Verfahren
von Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 443–453 unter
Verwendung des Align Programms (DNAstar, Inc.). In 7 weisen
drei Punkte darauf hin, dass die Aminosäure an dieser Position dieselbe
ist wie die entsprechende Aminosäure
in hOP-1. Drei Bindestriche weisen darauf hin, dass keine Aminosäure an dieser
Position anwesend ist, wobei sie zum Zwecke der Illustrierung der
Homologien eingefügt
sind. So "fehlt" z. B. Aminosäurerest
60 von BMP-2 (CBMP-2A) und BMP-4 (CBMP-2B). Selbstverständlich enthalten
beide Aminosäuresequenzen
in dieser Region Asn- Ser
(Rest 58, 59), wobei BMP-2 dann Lys und Ile enthält, während BMP-4 Ser und Ile enthält. 7 illustriert ebenso die Handhabung der
Insertionen in der Aminosäuresequenz
des Morphogens: Zwischen den Resten 56 und 57 von BMP-3 ist ein
Val Rest eingefügt;
zwischen den Resten 43 und 44 von GFD-1 ist die Aminosäuresequenz
Gly-Gly-Pro-Pro eingefügt. Solche
Abweichungen von der Referenzmorphogensequenz wurden zum Zwecke
der Berechnung der definierten Beziehung zwischen ihnen, beispielsweise
GDF-1 und hOP-1, ignoriert. Wie es aus den Vergleichen der Aminosäuresequenz
ersichtlich ist, die in 7 dargestellt
sind, können
erhebliche Aminosäureänderungen
im Vergleich zur Referenzsequenz durchgeführt werden, während die
Aktivität
beibehalten wird. Während sich
z. B. die GDF-1 Proteinsequenz, die in 7 beschrieben
ist, nur ungefähr
50% Aminosäureidentität mit der
hOP-1 Sequenz teilt, teilt sich die GDF-1 Sequenz eine Aminosäuresequenz-Homologie
(oder "Ähnlichkeit") größer als
70% der mit der hOP-1 Sequenz, wobei "Homologie" oder "Ähnlichkeit" erlaubte konservative Aminosäuresubstitutionen
innerhalb der abgeglichenen Sequenz umfasst, wie es beispielsweise
von Dayhoff et al. (1979) 5 Atlas of Protein Sequence and Structure
Suppl. 3, Seiten 345–362
(M. O. Dayhoff, ed., Natl. BioMed. Res. Found., Washington D.C.)
definiert wird.
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Demnach
umfasst die Erfindung gemäß einem
weiteren bevorzugten Aspekt Morphogene, die Spezies von Polypeptidketten
umfassen, welche eine generische Aminosäuresequenz besitzen, die hierin
als "OPX" bezeichnet wird,
welche die sieben-Cystein Domäne
definiert und den Identitäten
und Homologien zwischen den verschiedenen identifizierten OP-1 und
OP-2 Proteinen Rechnung trägt.
OPX ist in SEQ ID Nr. 3 dargestellt. Wie hierin beschrieben, ist
jedes Xaa an einer vorgegebenen Position unabhängig ausgewählt aus den Resten, die an
der entsprechenden Position in der C-terminalen Se quenz von Maus
oder Mensch OP-1 oder OP-2 (siehe 7 und
SEQ ID Nr. 4–7
und/oder SEQ ID Nr. 15–22)
auftreten.
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Gemäß einer
anderen Gruppe an Ausführungsformen
kann einem Säuger
eine wirksame Menge eines Mittels appliziert werden, welches dazu
befähigt
ist, eine erhöhte
endogene Expression eines OP/BMP renal therapeutisch wirksamen Mittels
oder eines Morphogens zu stimulieren oder zu induzieren. So kann
z. B. ein Mittel, welches befähigt
ist, die OP-1 Produktion
und/oder Sekretion aus Nierengewebe zu stimulieren oder zu induzieren,
einem Säuger
bereitgestellt werden, beispielsweise durch systemische Verabreichung
an den Säuger
oder durch direkte Verabreichung des Morphogen stimulierenden Mittels
an das Nierengewebe. Alternativ kann das Morphogen stimulierende
Mittel oder der "Morphogen
Induktor" die Expression
und/oder Sekretion des Morphogens an einer entfernten Stelle (beispielsweise
an einem anderen Gewebeort als Nierengewebe) induzieren, damit das
exprimierte Morphogen zu dem Nierengewebe fließt. Ein Verfahren zur Identifizierung und
Erprobung von Mitteln, welche befähigt sind, die Mengen an endogenen
Morphogenen in einem vorgegebenen Gewebe anzupassen, ist im Detail
in den veröffentlichten
Anmeldungen WO 93/05172 A1 und WO 93/05751 A1 beschrieben, deren
Lehren hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. Kurz zusammengefasst,
können
Kandidatenverbindungen identifiziert und getestet werden durch in
vitro Inkubation mit einem Testgewebe oder Zellen hiervon oder einer
Kulturzelllinie, die davon abgeleitet ist, über einen Zeitraum, welcher
ausreichend ist, um es der Verbindung zu ermöglichen, die Produktion eines
Morphogens, das von den Zellen dieses Gewebes produziert wird, zu
beeinflussen, beispielsweise die Expression und/oder die Sekretion.
Hierbei können
passendes Gewebe oder kultivierte Zellen eines passenden Gewebes
vorzugsweise ausgewählt
werden aus Nierenepithel, Fibroblasten und Osteoblasten.
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Gemäß einer
anderen Gruppe von Ausführungsformen
kann das Mittel, welches als Agonist eines OP/BMP renal therapeutisch
wirksamen Mittels oder eines Morphogenrezeptors wirkt, an Stelle
des OP/BMP renal therapeutisch wirksamen Mittels oder des Morphogens
selbst appliziert werden. Solch ein Mittel kann ebenfalls als Morphogen-"Imitator", "Nachahmer" oder "Analogon" bezeichnet werden.
Demnach kann z. B. ein kleines Peptid oder ein anderes Molekül, welches
die Aktivität
eines OP/BMP renal therapeutisch wirksamen Mittels oder Morphogens
bezüglich
der Anbindung und Aktivierung des OP/BMP renal therapeutisch wirksamen
Mittels oder Morphogenrezeptors imitieren kann, als äquivalent
zu dem OP/BMP renal therapeutisch wirksamen Mittel oder Morphogen
verwendet werden. Vorzugsweise ist der Agonist ein vollständiger Agonist,
wobei jedoch partielle Rezeptoragonisten ebenfalls in vorteilhafter
Weise verwendet werden können.
Verfahren zur Identifizierung solcher Agonisten sind auf dem Fachgebiet
bekannt und umfassen Assays für
Verbindungen, welche Morphogen-vermittelte Antworten induzieren
(beispielsweise Induktion der Differenzierung von metanephrischen
Mesenchym, Induktion der endochondralen Knochenformierung). So sind
z. B. Verfahren zur Identifizierung von Morphogen-Induktoren oder
Agonisten von Morphogenrezeptoren in der US Seriennummer 08/478097,
angemeldet am 7. Juni 1995, und in der US Seriennummer 08/507598,
angemeldet am 26. Juli 1995, angegeben, deren Offenbarungen hierin
durch Bezugnahme aufgenommen wird.
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Schließlich können gemäß anderen
Ausführungsformen
Zellen in die Niere eines Subjektes mit einem chronischen Nierenversagen
oder einer Gefährdung
für ein
chronisches Nierenversagen oder mit einer Gefährdung hinsichtlich des Bedarfs
an einer Nierenaustauschtherapie implantiert wer den, um als Quelle
für ein OP/BMP
renal therapeutisch wirksames Mittel oder Morphogen zu dienen und/oder
um eine Quelle für
zusätzliches
funktionelles Nierengewebe bereitzustellen. Solche Zellen können Wirts-
oder Spenderzellen sein, welche normalerweise OP/BMP renal therapeutisch
wirksame Mittel oder Morphogene exprimieren, welche derart transformiert
wurden, dass sie OP/BMP renal therapeutisch wirksame Mittel oder
Morphogene exprimieren, oder welche mit OP/BMP renal therapeutisch
wirksamen Mitteln oder Morphogenen behandelt wurden.
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D. Subjekte für die Behandlung
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Die
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung können
generell für
Säugersubjekte
mit einem chronischen Nierenversagen oder einer Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen oder mit einer Gefährdung zum Bedarf an einer
Nierenaustauschtherapie (d. h. chronische Dialyse oder Nierentransplantation)
angewendet werden. Säugersubjekte,
die entsprechend den Verfahren der Erfindungen behandelt werden,
können – wenn auch
nicht ausschließlich – menschliche
Subjekte oder Patienten umfassen. Indes kann die Erfindung zusätzlich verwendet
werden zur Behandlung von domestizierten Säugern, die als menschliche
Begleiter gehalten werden (beispielsweise Hunde, Katzen, Pferde)
und die einen bedeutsamen kommerziellen Wert haben (beispielsweise
Milchkühe,
Schlachtrinder, Sporttiere), die einen bedeutsamen wissenschaftlichen
Wert haben (beispielsweise gefangen gehaltene oder freie Exemplare
vom Aussterben bedrohter Arten), oder die einen anderweitigen Wert
besitzen. Ferner müssen
die Subjekte zur Behandlung mit den Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung grundsätzlich
nicht zusätzlich
zu den Indikationen zur Behandlung mit einem OP/BMP renal therapeutisch
wirksamen Mittel oder Morphogen Indikationen aufweisen, die mit
einer Gefährdung
für ein chronisches Nierenversagen
verbunden sind. Dies bedeutet, dass erwartet wird, dass die Subjekte
zur Behandlung ansonsten frei sind von Indikationen zur Behandlung
gemäß der vorliegenden
Erfindungen. In manchen Fällen
können
jedoch die Subjekte andere Symptome aufweisen (beispielsweise Osteodystrophie),
für die
eine Behandlung mit einem OP/BMP renal therapeutisch wirksamen Mittel
oder Morphogen angezeigt wäre.
In solchen Fällen
sollte die Behandlung dementsprechend angepasst werden, so dass
eine übermäßige Dosierung
vermieden wird.
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Ein
Fachmann auf dem medizinischen oder dem veterinärmedizinischen Fachgebiet ist
dazu ausgebildet, Subjekte zu erkennen, die eine beträchtliche
Gefährdung
für ein
chronischen Nierenversagen oder eine beträchtliche Gefährdung zum
Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie aufweisen. Insbesondere
von klinischen und nicht klinischen Versuchen sowie der angesammelten
Erfahrung in Bezug auf die derzeit offenbarten und andere Behandlungsverfahren
wird erwartet, dass sie den ausgebildeten Praktiker darüber informieren zu
entscheiden, ob ein vorgegebenes Subjekt ein chronisches Nierenversagen
oder eine Gefährdung
für ein chronisches
Nierenversagen oder eine Gefährdung
im Hinblick auf den Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie besitzt
und ob eine bestimmte Behandlung am besten geeignet ist für die Erfordernisse
der Subjekte einschließlich
der Behandlung entsprechend der vorliegenden Erfindung.
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Ein
Säugersubjekt
kann oder würde
generell als an einem chronischen Nierenversagen oder an einer Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen oder an einer Gefährdung
im Hinblick auf den Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie leidend
angesehen werden, wenn dieses Subjekt bereits als an einem Befinden
leidend diagnostiziert wurde, welches üb licherweise zu einem fortschreitenden
Verlust der Nierenfunktion in Verbindung mit einem fortschreitenden
Verlust von funktionellen Nephroneinheiten führt. Solche Befinden umfassen,
wenn auch nicht ausschließlich,
chronisches Nierenversagen, Nierenerkrankung im Endstadium, chronische
diabetische Nephropathie, hypertensive Nephrosklerose, chronische
Glomerulonephritis, angeborene Nephritis, renale Dysplasie und dergleichen.
Diese und andere auf dem Fachgebiet bekannte Erkrankungen und Befinden
führen üblicherweise
zu einem fortschreitenden Verlust von funktionellen Nephronen und
zum Ausbruch eines chronischen Nierenversagens.
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Häufig kann
jemand, der auf den medizinischen oder veterinärmedizinischen Fachgebieten
ausgebildet ist, eine Prognose, eine Diagnose oder eine Behandlungsentscheidung
abgeben, welche auf einer Untersuchung einer Nierenbiopsieprobe
basiert. Solche Biopsien bieten eine Fülle an Informationen, welche
in der Diagnose von Beschwerden der Niere nützlich sind, müssen aber
aufgrund der Invasivität
der Maßnahme
und der zusätzlichen
Verletzung einer wahrscheinlich ungesunden Niere nicht notwendigerweise
für alle
Subjekte geeignet sein. Gleichwohl können Subjekte mit einem chronischen
Nierenversagen oder mit einer Gefährdung für ein chronisches Nierenversagen
oder mit einer Gefährdung
i Hinblick aur den Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie durch
histologische Anzeichen von Nierenbiopsien erkannt werden, welche – wenn auch
nicht ausschließlich – glomeruläre Hypertrophie,
tubuläre
Hypertrophie, Glomerulosklerose, tubulointerstitielle Sklerose und
dergleichen umfassen.
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Weniger
invasive Techniken zur Bewertung der Morphologie der Niere umfassen
MRI, CAT und Ultraschallabtastung. Abtastungstechniken, welche Kontrast-
oder bildgebende Mittel (beispielsweise radioaktive Färbemittel)
verwenden, stehen ebenfalls zur Verfügung, aber es sollte angemerkt
werden, dass einige Vertreter derselben besonders toxisch auf Nierengewebe
und Strukturen wirken und deren Verwendung aus diesem Grund für Subjekte
mit einem chronischen Nierenversagen oder mit einer Gefährdung für ein chronisches Nierenversagen
weniger angezeigt sein können.
Solche nicht-invasive
Abtasttechniken können
dazu verwendet werden, um Zustände,
wie eine Nierenfibrose oder Sklerose, fötale Nierenfibrose, Nierenzysten
und eine grobe renale Hypertrophie nachzuweisen, die ein Subjekt
mit einem chronischen Nierenversagen oder mit einer Gefährdung für ein chronisches
Nierenversagen oder mit einem Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie befallen
könnten.
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Sehr
häufig
basieren Prognosen, Diagnosen und/oder Behandlungsentscheidungen
auf klinischen Indikationen der Nierenfunktion. Eine solche Indikation
ist die Anwesenheit einer unüblichen
Anzahl von "deutlichen" oder "Niereninsuffizienz-" Hautabstoßungen im
Sediment des Urins, welche eine tubuläre Hypertrophie anzeigen und
die kompensatorische Nierenhypertrophie nahe legen, die ein chronisches
Nierenversagen typisiert. Eine bessere Indikation der Nierenfunktion
ist die glomeruläre
Fließrate
(GFR), welche direkt durch Bewertung der Beseitigungsrate von bestimmten
Markern gemessen oder die aus indirekten Messungen abgeleitet werden
kann.
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Es
sei angemerkt, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die Messung
der GFR oder auf die Diagnose eines chronischen Nierenversagens
gerichtet ist. Die Verfahren zur Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung
müssen
daher nicht auf Subjekte beschränkt
sein, die mit irgend einer bestimmten Messung der GFR oder irgend
eines anderen bestimmten Markers der Nierenfunktion angezeigt werden.
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Zwar
ist es nicht erforderlich, dass die GFR eines Subjektes oder irgend
eines anderen besonderen Marker der Nierenfunktion bestimmt wird,
bevor die Behandlungen gemäß der vorliegenden
Erfindungen durchgeführt
werden. Nichtsdestoweniger wird die Messung der GFR als ein bevorzugtes
Mittel zur Beurteilung der Nierenfunktion angesehen.
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Wie
auf dem Fachgebiet bekannt ist, spiegelt die GFR die Beseitigungsrate
von Plasma zu Harn einer Referenz- oder Markerverbindung wider. Die in
Betracht zu ziehende Markerverbindung ist üblicherweise eine solche, die
ungehindert durch die Glomerula filtriert wird, die aber nicht aktiv
ausgeschieden oder durch die Nierentubuli resorbiert wird und die
nicht wesentlich durch die im Umlauf befindlichen Proteine gebunden
wird. Die Beseitigungsrate ist üblicherweise
definiert durch die oben angegebene Formel, welche sich auf das
Volumen des Urins, das innerhalb von 24 Stunden erzeugt wird, und
auf die relativen Konzentrationen des Markers im Urin und im Plasma
bezieht. Um präziser
zu sein, sollte die GFR ebenfalls in Bezug auf den Körperoberflächenbereich
korrigiert werden. Die "Goldstandard" Referenzverbindung
stellt Inulin dar aufgrund seiner Filtrationseigenschaften und seiner
Eigenschaft, nicht an Serum zu binden. Die Konzentration dieser
Verbindung ist jedoch im Blut oder im Urin schwierig zu bestimmen.
Die Beseitigungsraten anderer Verbindungen einschließlich p-Aminohippurat
(PAH) und Kreatinin werden deshalb häufig an Stelle von Inulin verwendet.
Zusätzlich
werden häufig
verschiedene Gleichungen verwendet, die eine Vereinfachung der Abschätzung der
aktuellen GFR durch Nichtberücksichtigung
der tatsächlichen
Konzentrationen des Markers im Urin, der tatsächlichen täglich produzierten Volumina
an Urin oder der tatsächlichen
Körperoberflächenbereiche
anstreben. Diese Werte können
durch Schätzwerte,
die auf anderen Faktoren basieren, durch Grundwerte, die für das gleiche
Subjekt er mittelt wurden, oder durch Standardwerte für gleiche
Subjekte ersetzt werden. Diese Schätzwerte sollten jedoch mit
Vorsicht verwendet werden, weil sie zu ungeeigneten Annahmen basierend
auf der Nierenfunktion von normalen oder gesunden Subjekten führen können.
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Verschiedene
Verfahren und Formeln wurden in der Wissenschaft entwickelt, die
einen erwarteten GFR-Wert für
ein gesundes Subjekt mit bestimmten Charakteristika beschreiben.
Insbesondere sind solche Formeln verfügbar, welche einen erwarteten
GFR-Wert bereitstellen basierend auf den Mengen an Kreatinin im
Plasma, dem Alter, dem Gewicht und dem Geschlecht. Eine solche Formel
für einen
erwarteten GFR-Wert wird oben dargeboten. Selbstverständlich können auch
andere Formeln verwendet und können
Tabellen von Standardwerten für
Subjekte eines vorgegebenen Alters, Gewichts, Geschlechts und/oder
einer Kreatininkonzentration im Plasma entwickelt werden. Neuere
Verfahren zur Messung oder Abschätzung
der GFR (beispielsweise unter Verwendung von NMR- oder MRI-Techniken)
sind nun ebenfalls in der Wissenschaft verfügbar und können in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung verwendet werden (siehe beispielsweise
US 5 100 646 A und
5 335 660 A ).
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Ungeachtet
der Art und Weise, in welcher die GFR gemessen oder abgeschätzt wird,
kann ein Subjekt im allgemeinen als an einem chronischen Nierenversagen
oder an einer Gefährdung
für ein
chronisches Nierenversagen oder an einer Gefährdung im Hinblick auf den
Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie leidend betrachtet werden,
wenn das Subjekt eine GFR besitzt, welche chronisch unter ungefähr 50% der
erwarteten GFR für
dieses Subjekt liegt. Die Gefährdung
wird als um so größer angesehen,
desto tiefer die GFR abfällt. Demnach
wird ein Subjekt zunehmend als gefährdet an gesehen, wenn das Subjekt
eine GFR besitzt, welche chronisch unter ungefähr 40%, 30% oder 20% der erwarteten
GFR liegt.
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Ungeachtet
der Art und Weise, in welcher die GFR gemessen oder abgeschätzt wird,
kann ein menschliches männliches
Subjekt, das mindestens ungefähr
50 kg wiegt, im allgemeinen als an einem chronischen Nierenversagen
oder an einer Gefährdung
für ein
chronisches Nierenversagen oder an einer Gefährdung im Hinblick auf den
Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie leidend betrachtet werden,
wenn das Subjekt eine GFR bestzt, welche chronisch unter ungefähr 50 ml/min
liegt. Die Gefährdung
wird als um so größer angesehen,
desto tiefer die GFR abfällt.
Demnach wird ein Subjekt zunehmend als gefährdet betrachtet, wenn das
Subjekt eine GFR besitzt, die chronisch unter ungefähr 40, 30
oder 20 ml/min liegt.
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Ungeachtet
der Art und Weise, in welcher die GFR gemessen oder abgeschätzt wird,
kann ein menschliches weibliche Subjekt, das mindestens ungefähr 40 kg
wiegt, im allgemeinen als an einem chronischen Nierenversagen oder
an einer Gefährdung
für ein
chronisches Nierenversagen oder an einer Gefährdung im Hinblick auf den
Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie leidend betrachtet werden,
wenn das Subjekt eine GFR besitzt, welche chronisch unter ungefähr 40 ml/min
liegt. Fällt
die GFR auf einen tieferen Wert ab, wird die Gefährdung als größer angesehen.
Demnach wird ein Subjekt zunehmend als gefährdet betrachtet, wenn das
Subjekt eine GFR besitzt, die chronisch unter ungefähr 30, 20
oder 10 ml/min liegt.
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Durch
Verwendung einer Vielzahl an Verfahren, welche die histologischen
Untersuchungen, nicht-invasive Abtast techniken, Evaluierung von
klinischen Indikatoren und andere oben beschriebene und auf dem Fachgebiet
bekannte Techniken umfassen, können
auf medizinischem und veterinärmedizinischem
Fachgebiet Schätzwerte
entweder der Anzahl an funktionellen Nephroneinheiten, über welche
ein Subjekt verfügt, oder
des prozentualen Anteils an funktionellen Nephroneinheiten, über welche
ein Subjekt in Bezug auf ein gesundes, aber ansonsten gleiches Subjekt
(beispielsweise eines Artgenossen des Subjektes von annäherungsweise
dem gleichen Alter, Gewicht und Geschlecht) verfügt, bereitgestellt werden.
Somit kann z. B. eine Biopsie eine Abnahme in der Dichte der funktionellen
Nephronen aufdecken, oder eine Bildgebung mit gefilterten Mitteln
kann einen Verlust an funktionellem Nierengewebe und/oder Filterungskapazität anzeigen.
Solche Maßnahmen
oder Schätzwerte
stellen ein weiteres Mittel bereit, um anzugeben, wann ein Subjekt
ein chronisches Nierenversagen oder eine Gefährdung für ein chronisches Nierenversagen
oder eine Gefährdung zum
Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie aufweist. Folglich kann
im allgemeinen ein Subjekt als an einem chronischen Nierenversagen
oder an einer Gefährdung
für ein
chronisches Nierenversagen oder an einer Gefährdung im Hinblick auf den
Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie leidend betrachtet werden,
wenn dieses Subjekt über
eine Anzahl an funktionellen Nephroneinheiten verfügt, die
weniger als ungefähr
50% der Anzahl an funktionellen Nephroneinheiten eines gesunden,
aber ansonsten gleichen Subjektes beträgt. Die Gefährdung wird – wie oben – als um
so größer angesehen,
wenn die Anzahl an funktionellen Nephronen weiter abfällt. Somit
wird ein Subjekt als zunehmend gefährdet angesehen, wenn das Subjekt über eine
Anzahl an funktionellen Nephronen verfügt, welche unter ungefähr 40, 30
oder 20% der Anzahl für
ein gleiches, aber gesundes Subjekt liegt.
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Abschließend sie
angemerkt, dass Testpersonen, die eine einzelne Niere besitzen,
ungeachtet der Art und Weise des Verlustes der anderen Niere (beispielsweise
aufgrund eines physischen Traumas, einer operativen Entfernung,
eines angeborenen Defektes) prima facie als gefährdet im Hinblick auf ein chronisches
Nierenversagen oder auf den Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie
angesehen werden können.
Dies gilt insbesondere für
solche Subjekte, die eine Niere aufgrund einer Erkrankung oder eines
Zustandes verloren haben, welcher der verbliebenen Niere zusetzen
könnte.
In gleicher Weise können
Subjekte, die bereits Empfänger
eines Nierentransplantates sind oder die bereits eine chronische
Dialyse empfangen (beispielsweise chronische Hämodialyse oder kontinuierliche
ambulante Peritonealdialyse), prima facie als an einem chronischen Nierenversagen
oder an einer Gefährdung
im Hinblick auf den Bedarf an einer weiteren Nierenaustauschtherapie
leidend betrachtet werden.
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E. Formulierungen und
Behandlungsverfahren
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Die
OP/BMP renal therapeutisch wirksamen Mittel, Morphogene, Morphogeninduktoren
oder Agonisten von Morphogenrezeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung
können
auf einem beliebigen Weg verabreicht werden, welcher mit dem jeweils
verwendeten Morphogen, Induktor oder Agonisten vereinbar ist. Somit kann
die Verabreichung, soweit erforderlich, oral oder parenteral sein,
umfassend intravenöse,
intraperitoneale und in die Capsula adiposa perirenalis aufgebende
Applikationswege. Die Verabreichung kann zusätzlich durch periodische Injektionen
eines großen
Bolus des Mittels erfolgen, oder sie kann konstanter durch intravenöse oder
intraperitoneale Verabreichung aus einem externen (beispielsweise
einem i. V.-Beutel) oder internen (beispielsweise eines bioerodablen
Implantates) Reservoir durchgeführt
werden.
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Das
therapeutisch wirksame Mittel gemäß der Erfindung kann einem
Individuum durch jedes geeignete Mittel bereitgestellt werden, vorzugsweise
direkt (beispielsweise lokal, wie durch eine Injektion oder durch topische
Verabreichung an einen Gewebeort) oder systematisch (beispielsweise
parenteral oder oral). Sofern das Mittel parenteral bereitgestellt
werden soll, wie z. B. intravenös,
subkutan, intramuskulär,
intraorbital, über die
Augen, intraventricular, intercranial, intracapsular, intraspinal,
intracysternal, intraperitoneal, bukkal, rektal, vaginal, intranasal
oder durch Aerosolverabreichung, umfasst das Mittel vorzugsweise
einen Teil einer wässrigen
Lösung.
Die Lösung
ist physiologisch annehmbar, so dass über die Abgabe des gewünschten
Mittels an den Patienten hinaus die Lösung nicht anderweitig das
Elektrolyten- und/oder Volumengleichgewicht des Patienten nachteilig
beeinflusst. Das wässrige
Medium für
das Mittel kann somit normale physiologische Saline (beispielsweise
9,85% NaCl, 0,15 M, pH 7–7,4)
enthalten. Solch eine das Mittel enthaltende wässrige Lösung kann z. B. durch Auflösung des
Mittels in 50% Ethanol, enthaltend Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) oder
0,1% HCl oder äquivalente
Lösungsmittel,
hergestellt werden. Ein Volumen der sich hieraus ergebenden Lösung wird
dann z. B. auf 10 Volumen Phosphat gepufferte Saline (PBS), die
ferner 0,1–0,2%humanes
Serumalbumin (HSA) enthalten kann, hinzugefügt. Die sich daraus ergebende
Lösung
wird vorzugsweise ausgiebig gevortext.
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Sofern
erwünscht,
kann die Löslichkeit
des Mittels erhöht
werden durch Verbindung mit einem geeigneten Molekül. So führt z. B.
die Verbindung des reifen OP/BMP oder des dimeren Morphogens mit
der pro-Domäne
zu der pro-Form des Proteins, welche üblicherweise löslicher
oder disper gierbarer in physiologischen Lösungen ist als die entsprechende
reife Form. Es wird tatsächlich
angenommen, dass endogene OP/BMP Proteine in dieser Form in den
Säugerkörper transportiert
werden (beispielsweise sezerniert und zirkulierend). Die lösliche Form
des Proteins kann aus Kulturmedium der Säugerzellen erhalten werden,
beispielsweise mit Nukleinsäure
transfizierten Zellen, die für
das OP/BMP Protein oder Morphogen kodieren und befähigt sind, diese
zu exprimieren. Alternativ kann eine lösliche Spezies formuliert werden
durch Komplexbildung des reifen Dimeres (oder eines aktiven Fragments
hiervon) mit einer pro-Domäne
oder eines Fragmentes hiervon, welches die Löslichkeit erhöht (wie
es weiter unten näher
erläutertist).
Ein anderes Molekül,
welches im Stande ist, die Löslichkeit
zu erhöhen,
und besonders geeignet ist für
die orale Verabreichungen, stellt Kasein dar. So erhöht z. B.
das Hinzufügen
von 0,2% Kasein die Löslichkeit
der reifen aktiven Form von OP-1 um 80%. Andere Verbindungen, welche
in Milch und/oder verschiedenen Serumproteinen gefunden wurden,
können
ebenfalls nützlich
sein.
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Schließlich können, wie
oben bereits angemerkt, gemäß einer
anderen Gruppe von Ausführungsformen
Nierenzellen in die Niere eines Subjektes mit einem chronischen
Nierenversagen oder mit einer Gefährdung für ein chronisches Nierenversagen
oder mit einer Gefährdung
im Hinblick auf den Bedarf an einer Nierenaustauschtherapie implantiert
werden, um als Quelle für
ein OP/BMP renal therapeutisch wirksames Mittel oder Morphogen zu
dienen und/oder um eine Quelle für
zusätzliches
funktionelles Nierengewebe bereitzustellen. Diese Zellen können beliebige
passende Säugerzellen
sein, umfassend renale mesenchymale Vorläuferzellen oder renale mesenchymale
Vorläuferzellen,
die induziert wurden, eine metanephrische Differenzierung zu durchlaufen.
Zellen können
von einem Spender (beispielsweise einem Spender mit passendem Gewebetyp,
einem Geschwisterteil, eineiigen Zwillingen) stammen, sie können aus
einer Gewebekultur (beispielsweise undifferenzierte renale Mesenhymkultur,
fötale
Nierengewebekultur) stammen, oder sie können von einem Subjekt explantiert
und sodann nach Proliferation und/oder Differenzierung reimplantiert
worden sein. Vorzugsweise werden die Zellen durch Behandlungen mit
einem OP/BMP renal therapeutisch wirksamen Mittel oder Morphogen
(beispielsweise OP-1) induziert, eine metanephrische Differenzierung
zu durchlaufen, entweder vor oder nach einer Implantation. Somit
können
z. B. renale mesenchymale Vorläuferzellen
von einem Subjekt transplantiert und kann in vitro die Proliferation
ermöglicht
oder herbeigeführt
und die metanephrische Differenzierung durch ein Morphogen induziert
oder ermöglicht
werden und können
die Zellen erneut an einen Ort implantiert werden, wo sie eine Quelle
eines Morphogens darstellen und/oder weiter in funktionelles Nieregewebe
differenzieren.
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Vorzugsweise
stellt die Erfindung die Verwendung zur Herstellung eines Medikamentes
bereit, worin das Medikament für
die orale oder parenterale Verabreichung geeignet ist, z. B.: (i)
intravenös;
oder (ii) intraperitoneal; oder (iii) in die Capsula adiposa perirenalis;
oder (iv) wobei ein Stent in diesen Säuger für eine solche Verabreichung
implantiert worden ist (wobei dieser Stent gegebenenfalls ein intravenöser Stent,
ein intraperitonealer Stent oder ein Stent in die Capsula adiposa
perirenalis ist); oder (v) mittels einer implantierten Vorrichtung.
-
Der
Gebrauch der Erfindung einschließlich zusätzlicher bevorzugter Aspekte
und Ausführungsformen hiervon
ist zum Zwecke eines besseren Verständnisses in den folgenden Beispielen,
welche hierin nur zur Illustration dargeboten werden und welche
die Erfindung in keiner Weise einschränken, näher erläutert.
-
Beispiele
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Das Remnant
Rattennierenmodell
-
Es
wurde eine teilweise (5/6) Nephrektomie an einer Ratte oder das
Remnant Rattennierenmodell (RRKM) verwendet, wie es im Wesentlichen
in Vukicevic et al. (1987) J. Bone Mineral Res. 2: 533 beschrieben ist.
Männliche
Ratten (2 bis 3 Monate alt, ungefähr 150 bis 200 Gramm wiegend)
wurden einer einseitigen Nephrektomie (entweder linke oder rechte
Niere) unterzogen. Nach ungefähr
einer Woche wurden 2/3 der verbliebenen Niere operativ entfernt.
Unmittelbar nach der Operation stieg das Kreatinin im Plasma und
die BUN-Menge aufgrund des Verlustes von Nierenmasse und -funktion
dramatisch an. im Laufe der nächsten mehreren
Wochen dieser "akuten" Versagensphase nahmen
die Kreatinin- und
BUN-Werte im Plasma der überlebenden
Tiere etwas in Richtung der normalen Werte ab, blieben aber erhöht. Die
Nierenfunktion erschien dann über
einen unterschiedlichen Zeitraum relativ konstant oder stabil zu
bleiben. Nach diesem Punkt traten die Tiere in eine Periode des
chronischen Nierenversagens ein, in welcher ein im Wesentlichen
linearer Abfall der Nierenfunktion beobachtet wurde, der mit dem
Tod endete.
-
Als
Operationskontrollen wurden zusätzliche
Ratten einer "Schein-"Operation unterzogen,
in der die Nieren entkapselt (decapsulated) wurden, ohne das Nierengewebe
zu entfernen.
-
Interventionsmodell
für das
chronischen Nierenversagen
-
In
diesem Modell wurden sowohl nephrektomierte als auch scheinoperierte
Ratten für
ungefähr
fünf bis
sechs Monaten nach der Operation gehalten. An diesem Punkt passierten
die überlebenden
nephrektomierten Tiere die stabile Phase und traten in die Phase
des chronischen Nierenversagens ein.
-
Die
Ratten wurden in acht Gruppen mit zwölf Ratten in jeder Gruppe unterteilt.
Zwei Gruppen der nephrektomierten Ratten wurden als Kontrollen verwendet
(Nx Kontrollen), wobei eine dieser Gruppen überhaupt keine Behandlung mehr
erhielt, während
die andere Injektionen nur des Vehikelpuffers erhielt. Zusätzlich hierzu
wurden zwei der scheinoperierten Gruppen als Kontrollen verwendet
(sham Kontrollen), wobei eine Gruppe nur den Vehikelpuffer erhielt,
während
die andere Gruppe lösliches
OP-1 (sOP-1) mit 10 μg/kg
Körpergewicht erhielt.
Vier Versuchsgruppen der nephrektomierten Ratten wurden verwendet,
wobei sie sOP-1 mit 1, 3, 10 oder 50 μg/kg Körpergewicht durch intraperitoneale
Injektion (OP-1 Nx Tiere) erhielten. Die OP-1 behandelten Ratten
und diejenigen Ratten, welche nur das Vehikel erhielten, erhielten
wöchentlich
drei Injektionen über
vier bis acht Wochen hinweg. Das totale Injektionsvolumen betrug
300 μl.
Zwischen den beiden Nx Kontrollgruppen bzw. zwischen den beiden
sham Kontrollgruppen wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede
beobachtet.
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Im
Vergleich mit der sham Gruppe, welche nur das Vehikel erhielt, wies
die Nx Kontrolle, welche nur das Vehikel erhielt, ein erheblich
(p < 0,01) erhöhtes Serumkreatinin
(1) am Ende der Studie auf, was auf einen bedeutsamen
Verlust der Nierenfunktionen hinweist. Obwohl die nephrektomierten
Ratten, welche mit entweder 1 oder 3 μg/kg Körpergewicht sOP-1 behandelt
wurden, kein deutlich herabgesetztes Kreatinin im Serum im Vergleich
mit der Nx Kontrolle aufwiesen, zeigten nephrektomierte Ratten,
welche mit sOP-1 bei einer Dosierung von 10 oder 50 μg/kg Körpergewicht
behandelt wurden, eine bedeutsame (p < 0,05) Abnahme der Kreatininwerte (1). Ähnliche
Ergebnisse wurden für
die Harnmengen im Serum beobachtet: Obwohl nephrektomierte Ratten,
welche mit entweder 1 oder 3 μg/kg
Körpergewicht
sOP-1 behandelt wurden, keine bedeutsame Abnahme des Harnstoffs
im Serum im Vergleich mit der Nx Kontrolle aufwiesen, zeigten nephrektomierte
Ratten, welche mit sOP-1 bei einer Dosierung von 10 oder 50 μg/kg Körpergewicht
behandelt wurden, bedeutsame (p < 0,01)
Abnahmen der Harnstoffmengen im Serum (2). Alle
nephrektomierten Ratten wiesen erheblich (p < 0,01) höheren Harnstoff im Serum auf
im Vergleich mit den scheinoperierten Ratten (2).
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Die
histologischen Beobachtungen weisen darauf hin, dass die OP-1 behandelten
nephrektomierten Ratten im Gegensatz zu der mit dem Vehikel behandelten
Nx Kontrollgruppe eine relativ normale Histologie der Glomerula
aufweisen. 3 zeigt z. B. typische Nierenproben
von (A) normalen Rattennieren, (B) unbehandelten Nx Kontrolltieren,
und (C) OP-1 behandelten nephrektomierten Ratten bei niedriger Auflösung (10×). 4 zeigt ähnliche
Proben bei höherer
Auflösung
(40×).
Die histomorphometrische Analyse weist darauf hin, dass OP-1 Nx
Ratten im Vergleich mit den Nx Kontrollratten ein reduziertes Eintreten
einer Glomerulosklerose und eines Schleifenkollapses ("loop collapse"), eine relativ verstreute
Sklerose und Mikroaneurysmen sowie eine lebensfähige Glomerula zeigen (Tabelle
2).
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Keine
der Ratten in irgend einer Gruppe starb während dieser Studie.
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Vorbeugendes
Modell für
ein chronisches Nierenversagen
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Ratten
wurden einer partiellen Nephrektomie oder Scheinoperation wie oben
beschrieben unterzogen. Um die Eignung von OP/BMP renal therapeutisch
wirksamen Mitteln zur Verhinderung, Inhibierung oder Verzögerung eines
chronischen Nierenversagens zu untersuchen, wurde es den Ratten
in diesem Modell ermöglicht,
sich über
ungefähr
zwei Wochen nach der Operation zu erholen, bevor die OP-1 Therapie
eingeleitet wurde. An diesem Punkt passierten die überlebenden
Tiere die Phase des akuten Nierenversagens und waren noch nicht
in die Phase eines chronischen Nierenversagens eingetreten.
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Die
Ratten wurden in zwei Gruppen von 15- bis 20 Ratten aufgeteilt.
Eine Gruppe erhielt nur den Vehikelpuffer (Nx Kontrolle), wohingegen
die andere Gruppe eine OP-1 Behandlung mit 10 μg/kg Körpergewicht erhielt, welche
intraperitoneal dreimal die Woche verabreicht wurde. Die Verabreichung
von OP-1 oder dem Vehikel wurde über
einen Zeitraum von ungefähr
acht bis neun Wochen fortgesetzt.
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Während den
Wochen 1 bis 5 der Behandlung zeigten beide Gruppen erhöhtes Kreatinin
im Serum (> 100 μmol/L) in
Bezug auf scheinoperierte Kontrollen (35 ± 7 μmol/L). Nach ungefähr fünf Wochen
begannen beide Gruppen, einen Anstieg des Kreatinins im Serum zu
zeigen, was den Beginn eines fortschreitenden oder chronischen Nierenversagens
nahelegt. Der Anstieg im Kreatinin des Serums war jedoch merklich
weniger rasch und er war in der OP-1 behandelten Gruppe erheblich
geringer als in den Nx Kontrollen (5: p < 0,02 in Woche 6
und 8; p < 0,01
in Woche 7 und 9). Gleichfalls wurden ähnliche Ergebnisse in den BUN-Werten
im Serum beobachtet.
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Nennenswerter
zeigten die Messungen der GFR, basierend auf Kreatininwerten im
Serum und Harn, einen höchst
signifikanten Abfall in beiden Gruppen der nephrektomierten Ratten
(< 1,8 ml/min)
in Bezug auf die scheinoperierten Kontrollen (4,7 ± 1,1 ml/min.).
Die GFR beider Gruppen fiel kontinuierlich zwischen den Wochen 1
bis 3 der Behandlung ab. Nach ungefähr drei Wochen stabilisierte
sich jedoch die GFR in der OP-1 behandelten Gruppe, wohingegen sich
der Abfall der Nierenfunktion in den Nx Kontrollen fortsetzte. In
der fünften
Woche wurde der Unterschied in den GFR Werten zwischen OP-1 behandelten
und Nx Kontrollratten statistisch signifikant (p < 0,02). Dieser Unterschied
in der GFR stieg während
der Zeit kontinuierlich an (p < 0,01 in
der sechsten Woche; p < 0,001
in der siebten und achten Woche), während die Nx Kontrollen kontinuierlich abfielen,
die OP-1 behandelten Ratten jedoch stabil blieben (6).
Am Ende der neunten Woche waren 40% der Nx Kontrollratten tot, wohingegen
keine der OP-1 behandelten Ratten starb.
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Die
histologische Evaluierung der Gewebeschnitte bestätigte, dass
OP-1 behandelte Ratten eine größere Erhaltung
oder Versorgung der Glomerula wie auch der proximalen und distalen
Tubulistrukturen zeigten. Es gab bei den OP-1 behandelten Ratten
ebenfalls Anzeichen von nephrogenetischen Mesenchymverdichtungen
und dem Auftreten von nephrogenetischen Entwicklungsstrukturen.
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse von verschiedenen Standard-quantitativen
(beispielsweise Anfärben
der extrazellulären
Matrix mit PAS) und semi-quantitativen (beispielsweise visuelle
Reihenfolge) histomorphometrischen Messungen, welche für Gewebescheiben
der Nx Kontrolle und der OP-1 behandelten Nx Ratten eingeholt wurden.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die OP-1 Behandlung von
nephrektomierten Ratten in ei ner allgemeinen Verbesserung (oder reduzierten
Degeneration) der Morphologie des Nierengewebes, einer erhöhten mesenchialen
oder perivaskulären
Verdickung, einer verminderten Glomerulosklerose und Schleifenkollaps,
einer verminderten Anwesenheit von "verstreuter" Sklerose und Mikroaneurysmen sowie
einer Steigerung der Lebensfähigkeit
der Glomerula resultiert.
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Äquivalente
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Die
Erfindung kann in anderen besonderen Formen ausgeführt werden,
ohne von deren Geist oder den essenziellen Eigenschaften abzuweichen.
Die vorangehenden Ausführungsformen
sind daher unter allen Gesichtspunkten als der Veranschaulichung
dienend zu betrachten und schränken
die hierin beschriebene Erfindung in keiner Weise ein. Der Schutzbereich
der Erfindung ist folglich ausschließlich durch die beigefügten Ansprüche bestimmt
und nicht durch die vorhergehende Beschreibung, wobei beliebige
Abänderungen,
die von der Bedeutung und dem Umfang der Ansprüche im Äquivalenzbereich abgedeckt
sind, mit umfasst sind.
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