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Ausgangspunkt
der Erfindung
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Die
Identifizierung einer biologischen Aktivität bzw. Wirksamkeit in neuen
Molekülen
wurde historisch durch Verwendung von in vitro-Assays oder ganzer
Tiere erreicht. Intakte biologische Einheiten, entweder Zellen oder
ganze Organismen, wurden zum Screenen nach antibakteriellen, antifungalen,
antiparasitären
und antiviralen Mitteln in vitro verwendet. Kultivierte Säugetierzellen
wurden ebenfalls in Screenings verwendet, die zum Nachweis potentieller
therapeutischer Verbindungen entwickelt wurden. Eine Vielzahl von
Bioassay-Endpunkten
wurde in Zellscreenings verwendet, einschließlich der Stimulation des Wachstums
oder der Differenzierung von Zellen, Veränderungen der Zellmotilität, der Produktion
spezieller Metaboliten, der Expression spezieller Proteine innerhalb
von Zellen, der veränderten
Proteinfunktion und veränderter
Leitfähigkeits-Eigenschaften.
Zytotoxische Verbindungen, die in der Krebstherapie verwendet werden,
wurden durch ihr Vermögen identifiziert,
das Wachstum von Tumorzellen in vitro und in vivo zu hemmen. Zusätzlich zu
Kulturen dispergierter Zellen wurde Gesamtgewebe in Bioassays genauso
wie in solchen, die auf der Kontraktilität von Muskeln basierten, verwendet.
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Das
in vitro-Testen ist dahingehend eine bevorzugte Methodik, als sie
die Entwicklung von Screenings mit hohem Durchlauf (high-throughput
screenings) ermöglicht:
Kleine Mengen großer
Anzahlen an Verbindungen können
in einer kurzen Zeitspanne und zu niedrigen Kosten getestet werden.
Optimalerweise sind Tiere für
die letzten Stadien der Produktevaluation vorgesehen und werden
in der Entdeckungsphase nicht verwendet; die Verwendung ganzer Tiere
ist arbeitsintensiv und extrem teuer.
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Die
Suche nach Agonisten und Antagonisten für zelluläre Rezeptoren was ein intensives
Forschungsgebiet, das die Arzneistoffentdeckung aufgrund der eleganten
Spezifität
dieser Molekültargets
zurückzuführen war.
Das Arzneistoffscreening wurde unter Verwendung von Ganzzellen durchgeführt, die
funktionelle Rezeptoren exprimieren (Manfredi, J-P. et al., (1996),
Molecular and Cellular Biology 16(9): 4700–4709) und kürzlich wurden
Bindungsas says entwickelt, die Membranfraktionen oder gereinigte
Rezeptoren verwenden, um nach Verbindungsbibliotheken für kompetitive
bzw. Konkurrenz-Liganden zu screenen.
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Die
heterologe Expression rekombinanter Säugetier-G-Protein-gekoppelter
Rezeptoren in Säugetierzellen,
die normalerweise solche Rezeptoren nicht exprimieren, wurde als
Mittel zum Studieren der Rezeptorfunktion zum Zweck des Identifizierens
von Agonisten und Antagonisten dieser Rezeptoren beschrieben. Beispielsweise
wurde der humane Muscarin-Rezeptor
(HM1) funktionell in Mauszellen exprimiert (Harpold et al., US-Patent
Nr. 5 401 629). Es hat sich herausgestellt, dass der Ratten-V1b-Vasopressin-Rezeptor
die Phosphotidylinoositol-Hydrolyse und die intrazelluläre Ca2+-Mobilisierung in chinesischen Hamster-Ovarzellen nach Agonisten-Stimulation
stimuliert (Lolat et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
6783–6787).
Diese Typen von ektopischen Expressionsstudien haben es Forschern
möglich
gemacht, die Rezeptorsignalgebungsmechanismen zu untersuchen und
Mutagenese-Studien
durchzuführen,
die bei der Identifizierung von Anteilen von Rezeptoren von Nutzen
waren, die für
die Ligandenbindung oder die Signalweiterleitung entscheidend sind.
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Es
wurden ebenfalls Experimente durchgeführt, um funktionellen G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren in Hefezellen zu exprimieren. Beispielsweise beschreibt
das US-Patent Nr. 5 482 835 auf den Namen King et al. eine transformierte
Hefezelle, die nicht dazu in der Lage ist, eine Hefe-G-Protein-α-Untereinheit
zu erzeugen, die jedoch so hergestellt wurde, dass sie sowohl eine
Säugetier-G-Protein-α-Untereinheit
als auch einen Säugetierrezeptor
produziert, der an die vorher erwähnte Säugetier-G-Protein-α-Untereinheit „gekoppelt" ist (d. h. mit dieser
interagiert). Insbesondere berichtet das US-Patent Nr. 5 482 835
von der Expression des humanen Beta-2-adrenergen Rezeptors (β2AR), einem
Sieben-Transmembran-Rezeptor (STR) in der Hefe unter der Kontrolle
des GAL1-Promotors, wobei das β2AR-Gen
durch Ersetzen der ersten 63 Basenpaare der codierenden Sequenz
durch 11 Basenpaare einer nicht-codierenden
und 42 Basenpaare einer codierenden Sequenz aus dem STE2-Gen modifiziert
wurde (STE2 codiert den Hefe-α-Faktor-Rezeptor).
Die Duke-Forscher haben herausgefunden, dass das modifizierte β2AR funktionell
in die Membran integriert war, wie es durch Studien der Fähigkeit
isolierter Membranen gezeigt wurde, in geeigneter Weise mit verschiedenen
bekannten Agonisten und Antagonisten von β2AR zu interagieren. Die Ligandenbindungsaffinität für Hefe-exprimiertes β2AR wurde
als nahezu identisch mit derjenigen angenommen, die für natürlich produziertes β2AR zu beobachten war.
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US-Patent
Nr. 5 482 835 beschreibt die Coexpression von Ratten-G-Protein-α-Untereinheit
in denselben Zellen, Hefestamm 8C, dem verwandtes Hefeprotein fehlt.
Die Ligandenbindung hatte eine G-Protein-vermittelte Signalweiterleitung
bzw. -transduktion zur Folge. US-Patent 5 482 835 lehrt, dass diese
Zellen im Screening von Verbindungen nach der Fähigkeit verwendet werden können, die
Dissoziationsrate von Gα von Gβγ in einer
Zelle zu beeinflussen. Zu diesem Zweck enthält die Zelle weiterhin einen
Pheromon-responsiven Promotor (beispielsweise BAR1 oder FUS1), gebunden
an ein Indikatorgen (beispielsweise HIS3 oder LacZ). Die Zellen
werden in Multititerplatten angeordnet und verschiedene Verbindungen
werden in jedem Well angeordnet. Die Kolonien werden dann bezüglich ihrer
Expression des Indikatorgens gescored.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue, rasche, zuverlässige und
effektive Assays zum Screenen und Identifizieren pharmazeutisch
wirksamer Verbindungen, die speziell mit der Aktivität eines
zellulären
Rezeptors oder Ionenkanals einer Zelle interagieren und diese modulieren.
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung jedes Zelltyps in den
gegenständlichen
Assays bereit, gleichgültig
ob prokaryontische oder eukaryontische Zelle. In bevorzugten Ausführungsformen
sind die Zellen der vorliegenden Erfindung eukaryontisch. In bestimmten
bevorzugten Ausführungsformen
sind die Zellen Säugetierzellen.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen
der Zellen sind die Zellen Hefezellen, wobei Zellen aus den Gattungen
Saccharomyces oder Schizosaccharomyces bevorzugt sind. Die Wirtszellen
können aus
primären
Zellen oder transformierten und/oder immortalisierten Zelllinien
abgeleitet sein.
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Die
gegenständlichen
Assays stellen ein Mittel zum Nachweis der Fähigkeit von Verbindungen bereit, die
Signalweiterleitungsaktivität
des Zielrezeptors zu modulieren, durch Scoren nach einer Nach-oben-
oder Nach-unten-Regulation eines Detektionssignales bereit. Die
Signaltransduktion kann auf einer Vielzahl von Wegen gemessen werden.
Beispielsweise kann die endogene Second-Messenger-Erzeugung in der
Hefe (beispielsweise GTP-Hydrolyse,
Kalzium-Mobilisierung oder Phospholipid-Hydrolyse) oder die erhöhte Transkription
eines endogenen Genes direkt nachgewiesen werden. Alternativ kann
die Verwendung eines Reporter- oder Indikator-Gens eine bequeme
Ablesung bereitstellen. Egal durch welche Mittel gemessen, kann
eine Veränderung
(beispielsweise eine statistisch signifikante Veränderung)
im Detektionssignal dazu verwendet werden, die Isolierung solcher
Zellen aus dem Gemisch zu erleichtern, die über einen Targetrezeptor ein
Signal empfangen haben, und können
somit dazu verwendet werden, neue Verbindungen zu identifizieren,
die als Rezeptoragonisten oder -antagonisten funktionieren.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung exprimieren die Reagenzzellen den Rezeptor von
Interesse endogen. In anderen Ausführungsformen sind die Zellen
so technisch bzw. gentechnisch verändert, dass sie ein heterologes
Rezeptorprotein exprimieren. In jeder dieser Ausführungsformen
kann es wünschenswert
sein, ein oder mehrere endogene Gene der Wirtzellen zu inaktivieren.
Beispielsweise verwenden bestimmte bevorzugte Ausführungsformen,
bei denen ein heterologer Rezeptor bereitgestellt wird, Wirtszellen, in
denen das Gen für
den homologen Rezeptor inaktiviert wurde. Desgleichen können andere
Proteine, die in das Transduzieren von Signalen aus dem Target-Rezeptor
involviert sind, inaktiviert oder mit einem Autolog oder Paralog
aus einem anderen Organismus komplementiert werden, beispielsweise
Hefe-G-Protein-Untereinheiten können
durch Säugetier-G-Protein-Untereinheiten
in Hefezellen komplementiert werden, die so gentechnisch verändert wurden,
dass sie Säugetier-G-Protein-gekoppelten
Rezeptor exprimieren.
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Weitere
Komplementierungen schließen
beispielsweise die Expression heterologer MAP-Kinase und erk-Kinasen, MEKs oder MKKs
(MAP-Kinase-Kinasen), MEKKs (MEK-Kinasen),
ras, raf, STATs, JAKs und dergleichen ein.
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In
einer Ausführungsform
kann das Assay der vorliegenden Erfindung zum Screenen nach Verbindungen
verwendet werden, die den Zellen exogen zugesetzt werden, um potentielle
Rezeptoreffektor-Verbindungen zu identifizieren.
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In
einer anderen Ausführungsform
ermöglichen
die vorliegenden Assays ein rasches Screening großer Mengen
an Polypeptiden in einer Bibliothek, die in der Zelle exprimiert
wird, um solche Polypeptide zu identifizieren, die eine Rezeptorbioaktivität agonisieren
oder antagonisieren, die ein autokrines System erzeugt. Der autokrine
Assay ist durch Verwendung einer Bibliothek rekombinanter Zellen
gekennzeichnet, wobei jede Zelle hiervon ein Target bzw. Ziel-Rezeptorprotein
einschließt,
dessen Signaltransduktionsaktivität durch Interaktion mit einem
extrazellulären
Signal moduliert werden kann, wobei die Transduktionsaktivität dazu in
der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, und ein exprimierbares
rekombinantes Gen, das ein exogenes Testpolypeptid aus einer Polypeptidbibliothek
codiert. Durch Verwendung einer Genbibliothek exprimiert das Gemisch
von Zellen kollektiv eine Population von Testpolypeptiden. In bevorzugten
Ausführungsformen schließt die Polypeptidbibliothek
zumindest 103 unterschiedliche Polypeptide,
obwohl noch mehr bevorzugt zumindest 105,
106 oder 107 unterschiedliche
(variegierte) Polypeptide, ein. Die Polypeptidbibliothek kann als Random
bzw. zufallsbedingte Peptidbibliothek, als Semi-Random-Peptidbibliothek
(beispielsweise basierend auf kombinatorischer Mutagenese eines
bekannten Liganden) oder als cDNA-Bibliothek erzeugt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Assays kann der Assay, wenn eine Testverbindung nicht die Aktivität des Rezeptorproteins
direkt zu induzieren scheint, wiederholt und durch Einführung eines
Schrittes modifiziert werden, bei dem die Zelle zunächst mit
einem bekannten Aktivator des Targetrezeptors in Berührung gebracht
wird, um die Signalübertragungswege
vom Rezeptor zu induzieren. Somit kann eine Testverbindung bezüglich ihrer
Fähigkeit
untersucht werden, die Aktivität
des Aktivators zu antagonisieren, beispielsweise zu hemmen oder
zu blockieren. Alternativ kann der Assay nach Verbindungen scoren,
die die Induktionsreaktion, die durch Behandlung der Zelle mit einem
bekannten Aktivator erzeugt wird, potenzieren. Wie hierin verwendet,
betrifft ein „Agonist" Mittel, die entweder
die Aktivierung der RezeptorSignalstoff-Stoffwechselwege induzieren,
beispielsweise durch Nachahmen eines Liganden für den Rezeptor, ebenso wie
Mittel, die die Empfindlichkeit des Rezeptors gegenüber dem
Liganden potenzieren, beispielsweise die Konzentrationen an Liganden
senken, die zum Induzieren eines speziellen Niveaus einer Rezeptor-abhängigen Signalgebung
erforderlich sind.
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Gemäß eines
Aspektes betrifft die Erfindung einen Assay zum Identifizieren einer
Verbindung, die einen heterologen Rezeptor moduliert, der durch
eine Hefezelle exprimiert wird. Die vorliegenden Assays umfassen
die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen einer Hefezelle, bei der
ein heterologer Rezeptor funktionell in einen endogenen Hefe-Signalstoff-Stoffwechselweg integriert
ist; (ii) In-Berührung-Bringen
der Hefezelle mit einer Testverbindung; und (iii) Nachweisen einer
Veränderung
in einem Signal, das durch den endogenen Hefe-Signalstoff-Stoffwechselweg
erzeugt wird.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist der Signalstoff-Stoffwechselweg ein Hefepheromonsystem-Weg.
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In
weiteren bevorzugten Ausführungsformen
umfasst der Schritt des Nachweisens ein Messen der Transkription
eines Gens, das ein endogenes Hefeprotein codiert. Die Transkription
eines Genes kann direkt oder indirekt gemessen werden. Zusätzlich können in
anderen Ausführungsformen
die Menge oder Aktivität eines
endogenen Hefeproteins untersucht werden.
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Die
in den vorliegenden Assays zu testenden Verbindungen können aus
einer Vielzahl von Quellen abgeleitet bzw. gewonnen werden. In einer
bevorzugten Ausführungsform
wird die Testverbindung aus einer Peptidbibliothek abgeleitet. In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird die Testverbindung aus einer Bibliothek von Nicht-Peptid-Verbindungen
abgeleitet.
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In
den Ausführungsformen
der vorliegenden Assays, bei denen die Aktivität eines endogenen Hefeproteins
untersucht wird, kann das endogene Hefeprotein durch ein endogenes
Hefe Gen codiert sein, das operativ an einen Promotor gebunden ist,
der gegenüber
Signalen responsiv ist, wie durch ein Hefepheromon-System erzeugt
werden. In einer Ausführungsform
kommt der Promotor natürlich
vor. In einer noch weiteren Ausführungsform
ist der Promotor nicht-natürlich vorkommend.
Derartige nicht-natürlich
vorkommende Promotoren können
durch Modifizieren eines natürlich
vorkommenden Promotors gewonnen werden, beispielsweise durch Mutieren
eines natürlich
vorkommenden Promotors. In noch weiteren Ausführungsformen des Assays ist
der Promotor ein heterologer Promotor, der operativ an ein endogenes
Hefe Gen gebunden ist.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist das zu untersuchende Hefe Gen das BAR1-Gen. In weiteren bevorzugten
Ausführungsformen
ist der Promotor, der die Expression des endogenen Hefe Gens reguliert,
ein Pheromon-responsiver Promotor. Beispiele für bevorzugte Pheromon-responsive
Promotoren schließen
den Fus1-Promtor und den Fus2-Promotor ein, die, in bestimmten Ausführungsformen,
operativ an ein heterologes endogenes Gen gebunden sind.
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In
einer noch weiteren Ausführungsform
verwenden die vorliegenden Assays Hefezellen, die ein chimäres Nukleinsäurekonstrukt
umfassen. Das chimäre
Konstrukt codiert ein Fusions protein, das die Expression eines endogenen
Genes moduliert, wobei die Expression untersuchbar ist. Die chimären Konstrukte
der Erfindung umfassen ein erstes Segment, abgeleitet von einem
ersten Gen, das ein Polypeptid codiert, das durch den Hefepheromonsystem-Weg
aktiviert wird, und ein zweites Segment, das ein Polypeptid codiert,
das eine DNA-Sequenz im regulatorischen Bereich eines endogenen
Genes von Interesse bindet. Solche Konstrukte machen das Gen von
Interesse gegenüber
einer Aktivierung durch den Hefepheromonsystem-Weg responsiv bzw. ansprechbar.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
codiert das erste Segment eines solchen Konstruktes Ste12. In weiteren
bevorzugten Ausführungsformen
codiert das zweite Segment Pho4 (oder eine DNA-bindende Domäne hiervon).
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das zu untersuchende
endogene Hefe Gen ein Pho5-Gen (das eine Pho4-bindende Stelle innerhalb
seiner regulatorischen Region enthält). Somit bindet nach Expression
des Ste12-Pho4-Fusionsproteins
(dessen Expression Pheromon-responsiv ist) das Fusionsprotein an
die Pho4-Stelle im Pho5-Gen, wodurch die Expression des Pho5-Genes
aktiviert wird. Das Pho5-Gen
codiert eine saure Phosphatase, deren Expression leicht untersuchbar
ist. In einer speziell bevorzugten Ausführungsform codiert das erste
Segment des chimären
Konstruktes ein Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 688 von Ste12 umfasst.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform codiert das zweite
Segment ein Polypeptid, das die Aminosäuren 227 bis 312 von Pho4 codiert.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die im Assay
zu verwendende Hefezelle eine Mutation in ihrem endogenen Pho4-Gen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Nachweisschritt eines Assays der vorliegenden Erfindung
ein Nachweisen der Aktivität
von Pho5 saurer Phosphatase.
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In
einer noch weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Assays umfasst der Nachweisschritt ein Nachweisen
einer Veränderung
der Aktivität
eines endogenen Enzyms, das von der Hefezelle in Reaktion auf ein
Signal exprimiert wird, das durch den endogenen Hefe-Signalstoff-Stoffwechselweg
erzeugt wird. Vorzugsweise ist der endogene Hefe-Signalstoff-Stoffwechselweg ein
Hefepheromonsystem-Weg. Eine Veränderung der
Aktivität
eines endogenen Enzyms kann beispielsweise durch Messen der Enzymaktivität des Enzyms nachgewiesen
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Assay
den Nachweis der Aktivität der
BAR1-Protease.
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Die
Aktivität
der BAR1-Protease kann auf vielen Wegen nachgewiesen werden. Beispielsweise
kann die Spaltung eines Substrats, das eine BAR1-Peptid-Erkennungssequenz
aufweist, überwacht
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das BAR1-Substrat
zumindest eine nachweisbare Markierung. In einer weiteren Ausführungsform
kommt das Substrat natürlich
vor. In einer noch weiteren Ausführungsform
ist das Substrat nicht-natürlich
vorkommend. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Substrat
die Verbindung von SEQ ID NO: 4. In einer noch weiteren bevorzugten
Ausführungsform
umfasst das Substrat die Verbindung von SEQ ID NO: 5.
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In
einer noch weiteren Ausführungsform
ist das Substrat ein chimäres
Substrat, das ein erstes Polypeptid umfasst, das, nach Spaltung
von BAR1, ein Amino-terminales Lys exponiert; und ein zweites Polypeptid,
das an den Carboxy-Terminus des ersten Polypeptids gebunden ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Schritt
des Nachweisens ein Messen der Stabilität des chimären Substrates.
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Die
BAR1-Aktivität
kann ebenfalls durch Messen der Wirkung des Enzyms auf das Wachstum
eines Testhefestamms nachgewiesen werden, der funktionelles BAR1-Enzym
nicht exprimiert. Somit kann Medium aus BAR1-exprimierenden Zellen,
die mit einer Testverbindung in Berührung gebracht wurden, mit
dem Testhefestamm kultiviert werden, um dadurch das Vorhandensein
einer BAR1-Aktivität
im Medium nachzuweisen.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Assay zum Identifizieren
einer Verbindung bereit, die einen Rezeptor in einer Zelle moduliert,
umfassend die Schritte: (i) eine Zelle bereitzustellen, die einen
Rezeptor exprimiert, der funktionell in einen endogenen Signalstoff-Stoffwechselweg der
Zelle integriert ist; (ii) In-Berührung-Bringen der Zelle mit
einer Bibliothek nicht-peptidischer Verbindungen; und (iii) Nachweisen
einer Veränderung
des Signals, das durch den endogenen Signalstoff-Stoffwechselweg
produziert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine
Hefezelle. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist der Signalstoff-Stoffwechselweg ein Hefepheromonsystem-Weg bzw.
-Stoffwechselweg. Der Schritt des Messens kann beispielsweise ein
Messen der Transkription eines endogenen Genes oder der Aktivität eines
endogenen Proteins in der Zelle umfassen.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Assay zum Identifizieren
einer Verbindung bereit, die einen Rezeptor in einer Zelle moduliert,
umfassend die Schritte: (i) eine Zelle bereitzustellen, die einen
Rezeptor exprimiert, der funktionell in einen endogenen Signalstoff-Stoffwechselweg der
Zelle integriert ist; (ii) die Zelle mit einer Bibliothek an Testpolypeptiden
in Verbindung zu bringen, wobei die Bibliothek der Testpolypeptide
durch die Zelle exprimiert wird; und (iii) eine Veränderung
des Signales nachzuweisen, das durch den endogenen Signalstoff-Stoffwechselweg
erzeugt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine Hefezelle.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Signalstoff-Stoffwechselweg
ein Hefepheromonsystem-Weg. Der Schritt des Messens kann beispielsweise
ein Messen der Transkription eines endogenen Genes oder der Aktivität eines
endogenen Proteins in der Zelle umfassen.
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In
einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Assay zum
Identifizieren einer Verbindung bereit, die ein Pheromonsystemprotein-Surrogat
-bzw. -Ersatz in einer Hefezelle moduliert, umfassend die folgenden
Schritte: (i) Bereitstellung eine Hefezelle, die ein Pheromonsystemprotein-Surrogat
umfasst, das funktionell in einen endogenen Pheromonsystem-Signalstoff-Stoffwechselweg
der Hefezelle integriert ist; (ii) In-Berührung-Bringen der Zelle mit
einer Bibliothek nicht-peptidischer Verbindungen; und (iii) Messen
einer Veränderung
des Signals, das durch den endogenen Pheromon-Signalstoff-Stoffwechselweg
der Hefezelle erzeugt wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Schritt des Messens ein Messen der Transkription eines
endogenen Gens oder der Aktivität
eines endogenen Proteins in der Zelle. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Pheromonsystemprotein-Surrogat, das untersucht werden soll,
aus der Gruppe ausgewählt,
die aus G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, G-Proteinen, Proteasen, Kinasen, Farnesyltransferasen, Carboxymethyltransferasen,
ABC-Transportern
und Cyclinen besteht.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Assay zum Identifizieren
einer Verbindung bereit, die ein Pheromonsystemprotein-Surrogat
in einer Hefezelle moduliert, umfassend die folgenden Schritte:
(i) Bereitstellen einer Hefezelle, die ein Pheromonsystemprotein-Surrogat umfasst,
das funktionell in einen endogenen Pheromonsystem-Signalstoff-Stoffwechselweg der
Hefezelle integriert ist; (ii) In-Berührung-Bringen der Zelle mit
einer Bibliothek von Testpolypeptiden, wobei die Bibliothek der
Testpolypeptide von der Zelle exprimiert wird; und (iii) Messen
einer Veränderung
des durch den endogenen Pheromon-Signalstoff-Stoffwechselweg
der Hefezelle erzeugten Signals.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Schritt des Messens ein Messen der Transkription eines
endogenen Gens oder der Aktivität
eines endogenen Proteins in der Zelle. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Pheromonsystemprotein-Surrogat, das untersucht werden soll,
aus der Gruppe ausgewählt, die
aus G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, G-Proteinen, Proteasen, Kinasen, Farnesyltransferasen,
Carboxymethyltransferasen, ABC-Transportern
und Cyclinen besteht.
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Die
Erfindung stellt weiterhin Substrate für ein BAR1-Enzym bereit. In
bevorzugten Ausführungsformen
umfasst das Substrat die Verbindung von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID
NO: 5.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein chimäres Substrat für ein BAR1-Enzym
bereit, wobei das chimäre Substrat
Folgendes umfasst: ein erstes Polypeptidsegment, gewonnen aus einem
reifen Hefeα-Faktor
und ein zweites Polypeptidsegment, gewonnen von einem zweiten, unterschiedlichen
Polypeptid, wobei nach Spaltung des ersten Polypeptidsegments durch
BAR1 eine Veränderung
der Stabilität
des zweiten Polypeptidsegments nachweisbar ist.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist das zweite Polypeptidsegment von LacZ abgeleitet. In einer noch
weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist das zweite Polypeptidsegment von einem Protein abgeleitet, das
für das
Hefezellwachstum essentiell ist. In einer noch weiteren bevorzugten
Ausführungsform
wird das zweite Polypeptidsegment von einem Heferepressorprotein
gewonnen.
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In
einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein chimäres Nukleinsäurekonstrukt
bereit, das Folgendes umfasst: ein erstes Segment, das eine Nukleotidsequenz
umfasst, die ein Polypeptid codiert, die durch ein Hefepheromonsystem-Weg
aktiviert wird; und ein zweites Segment, das eine Nukleotidsequenz
umfasst, die ein Pho4-Polypeptid codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform
codiert das erste Segment ein Ste12-Polypeptid.
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Die
Erfindung stellt weiterhin eine Hefezelle bereit, die ein chimäres Nukleinsäurekonstrukt
der Erfindung umfasst.
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Rezeptorproteine
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können irgendein Rezeptor oder
Ionenkanal sein, der mit einem extrazellulären Molekül wechselwirkt (d. h. Hormon, Wachstumsfaktor,
Peptid, Ion), um ein Signal in der Zelle zu modulieren. Um den Rezeptor
zu illustrieren, kann dieser ein Zelloberflächenrezeptor sein, oder er
kann in anderen Ausführungsformen
ein intrazellulärer
Rezeptor sein. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Rezeptor
ein Zelloberflächenrezeptor
wie beispielsweise: eine Rezeptortyrosinase-Kinase, beispielsweise
ein EPH-Rezeptor; ein Ionenkanal; ein Cytokin-Rezeptor; ein Multiuntereinheits-Immunerkennungsrezeptor,
ein Chemokin-Rezeptor; ein Wachstumsfaktor-Rezeptor oder ein G-Protein-gekoppelter
Rezeptor, wie beispielsweise ein Chemoattractant Peptid-Rezeptor,
ein Neuropeptid-Rezeptor, ein Lichtrezeptor, ein Neurotransmitter-Rezeptor
oder ein Polypeptidhormon-Rezeptor.
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Bevorzugte
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren schließen Folgendes ein: α1A-adrenerger
Rezeptor, α1B-adrenerger
Rezeptor, α2-adrenerger
Rezeptor, α2B-adrenerger
Rezeptor, β1-adrenerger Rezeptor, β2-adrenerger
Rezeptor, β3-adrenerger
Rezeptor, ml-Acetylcholin-Rezeptor
(AChR), m2 AChR, m3 AChR, m4 AChR, m5 AChR, D1-Dopamin-Rezeptor,
D2-Dopamin-Rezeptor,
D3-Dopamin-Rezeptor, D4-Dopamin-Rezeptor, D5-Dopamin-Rezeptor, A1-Adenosin-Rezeptor,
A2b-Adenosin-Rezeptor, 5-HT1a-Rezeptor, 5-HT1b-Rezeptor, 5-HT1-artiger Rezeptor,
5-HT1d-Rezeptor, 5-HT1d-artiger Rezeptor, 5-HT1d-Betarezeptor, Substanz
K (Neurokinin A)-Rezeptor, fMLP-Rezeptor, fMLP-artiger Rezeptor,
Angiotensin-II-Typ1-Rezeptor, Endothelin-ETA-Rezeptor,
Endothelin-ETB-Rezeptor, Thrombin-Rezeptor, Wachstumshormonfreisetzungshormon(GHRH)-Rezeptor,
vasoaktiver intestinaler Peptid-Rezeptor, Oxytocin-Rezeptor, Somatostatin-SSTR1 und
SSTR2, SSTR3, Cannabinoid-Rezeptor, Follikel-stimulierendes-Hormon(FSH)-Rezeptor,
Leutropin(LH/HCG)-Rezeptor,
Thyroid-stimulierendes-Hormon(TSH)-Rezeptor, Thromboxan-A2-Rezeptor,
Plättchen-aktivierender-Faktor(PAF)-Rezeptor,
C5a-Anaphylatoxin-Rezeptor, Interleukin-8(IL-8), IL-8Ra, IL-8RB, Delta-Opioid-Rezeptor,
Kappa-Opioid-Rezeptor, mip-1/RANTES-Rezeptor, Rhodopsin, Red Opsin,
Green Opsin, Blue Opsin, metabotropisches Glutamat mGluR1-6, Histamin-H2-Rezeptor,
ATP-Rezeptor, Neuropeptid-Y-Rezeptor, Amyloidproteinvorläufer-Rezeptor, Insulin-artiger-Wachstumsfaktor-II-Rezeptor,
Bradykinin-Rezeptor, Gonadotropin-Freisetzungshormon-Rezeptor, Cholecystokinin-Rezeptor,
Melanocyten-stimulierendes-Hormon-Rezeptor,
Antidiuretisches-Hormon-Rezeptor, Glucagon-Rezeptor und Adrenocorticotropisches-Hormon-II-Rezeptor.
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Bevorzugte
EPH-Rezeptoren schließen
eph, elk, eck, sek, mek4, hek, hek2, eek, erk, tyro1, tyro4, tyro5,
tyro6, tyro11, cek4, cek5, cek6, cek7, cek8, cek9, cek10, bsk, rtk1,
rtk2, rtk3, myk1, myk2, ehk1, ehk2, pagliaccio, htk, erk und nuk-Rezeptoren
ein.
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Zusätzlich kann
der vorliegende Assay zum Identifizieren von Liganden für einen
Orphan-Rezeptor verwendet
werden, d. h. einen Rezeptor mit unbekanntem Ligand, unabhängig von
der Klasse der Rezeptoren, zu der er gehört.
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In
solchen Ausführungsformen,
in denen der Target-Rezeptor ein Zelloberflächen-Rezeptor ist und die Zelle
eine Peptid-Bibliothek exprimiert, wird es in bestimmten Ausführungsformen
wünschenswert
sein, dass die Peptide in der Bibliothek eine Signalsequenz exprimieren,
um sicherzustellen, dass sie im geeigneten sekretorischen Stoffwechselweg
prozessiert werden und somit verfügbar sind, um mit Rezeptoren
auf der Zelloberfläche
zu interagieren.
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In
anderen Ausführungsformen
beherbergt die Wirtszelle ein Reporterkonstrukt, das ein Reportergen in
operativer Bindung mit ein oder mehreren transkriptionsregulatorischen
Elementen enthält,
die auf die Signaltransduktionsaktivität des Rezeptorproteins ansprechen.
Beispielhafte Reportergene schließen Enzyme ein, wie beispielsweise
Luciferase, Phosphatase oder β-Galactosidase,
die eine spektrometrisch aktive Markierung erzeugen können, beispielsweise
Veränderungen
der Farbe, der Fluoreszenz oder Lumineszenz, oder ein Genprodukt,
das einen zellulären
Phänotyp
verändert,
beispielsweise das Zellwachstum, Arzneistoffresistenz oder Auxotrophie.
In bevorzugten Ausführungsformen
codiert das Reportergen ein Genprodukt, ausgewählt aus der Gruppe, das aus
Chloramphenicolacetyltransferase, β-Galactosidase und sezernierter alkalischer
Phosphatase besteht. In noch weiteren Ausführungsformen codiert das Reportergen
ein Genprodukt, das ein Wachstumssignal verleiht. In noch weiteren
Ausführungsformen
codiert das Reportergen ein Genprodukt zum Wachstum in Medien, die
Aminotriazol oder Canavanin oder Cycloheximid enthalten.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Sequenzalignment der N-terminalen Bereiche von Gα-Untereinheiten
und von N-terminalen Sequenzen der GPA41-Gα-Hybridproteine.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die
Proliferation, Differentiation und der Tod eukaryontischer Zellen
werden durch eine Vielzahl extrazellulärer Signale kontrolliert, wie
beispielsweise Hormone, Neurotransmitter und Polypeptid-Faktoren.
Diese verstreubaren Liganden erlauben es den Zellen, Anhaltspunkte
in der Umgebung zu beeinflussen und von diesen beeinflusst zu werden.
Die Studie der Rezeptor-Liganden-Interaktion hat eine große Informationsmenge darüber erbracht,
wie die Zellen auf externe Stimuli bzw. Reize reagieren, und dieses
Wissen hat zur Entwicklung therapeutisch wichtiger Verbindungen
geführt.
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Die
vorliegende Erfindung macht einen raschen, wirksamen Assay zum Screenen
und zum Identifizieren pharmazeutisch wirksamer Verbindungen verfügbar, die
spezifisch mit der Aktivität
eines zellulären
Rezeptors oder Ionenkanals interagieren und diese modulieren. Der
vorliegende Assay ermöglicht
ein rasches Screening großer
Mengen an Verbindungen (einschließlich beispielsweise von Polypeptiden
in einer Expressionsbibliothek), um Verbindungen zu identifizieren,
die eine Rezeptorbioaktivität
induzieren oder antagonisieren.
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Im
allgemeinen ist der Assay durch Anwendung eines Gemisches von Zellen
charakterisiert, um eine Batterie von Verbindungen für Rezeptor/Kanalagonisten
oder -antagonisten zu sammeln. Wie nachstehend ausführlicher
beschrieben ist, exprimieren die Reagenz-Zellen ein Zielrezeptorprotein
oder Ionenkanal, der zum Transduzieren eines nachweisbaren Signals
in der Reagenzzelle in der Lage ist. Das Rezeptor/Kanalprotein kann
entweder endogen oder heterolog sein. In Kombination mit den offenbarten
Nachweismitteln wird eine Kultur der vorliegenden Reagenz-Zellen
Mittel zum Nachweisen von Agonisten oder Antagonisten der Rezeptorfunktion
bereitstellen.
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In
bestimmten Ausführungsformen
wird eine Testverbindung exogen zugesetzt und deren Vermögen, die
Aktivität
des Targetrezeptors oder Ionenkanals zu modulieren, wird im Assay
gescored. In anderen Ausführungsformen
werden die Zellen so verändert,
dass sie zusätzlich
ein Testpolypeptid exprimieren, das bezüglich seiner Fähigkeit
untersucht werden kann, mit dem Rezeptor oder Ionenkanal zu interagieren.
In solchen Ausführungsformen
stellt der Assay eine Population von Zellen bereit, die eine Bibliothek
von Peptiden exprimieren, die potentielle Rezeptor/Kanaleffektoren
einschließen
und solche Peptide der Bibliothek, die entwe der den Rezeptor oder
die Kanalfunktion agonisieren oder antagonisieren können, ausgewählt und
durch ihre Sequenz identifiziert werden.
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Der
Assay der vorliegenden Erfindung stellt ein bequemes Format zur
Entdeckung von Arzneistoffen bereit, die zur Modulierung der zellulären Funktion
von Nutzen sind, ebenso wie zum Verständnis der Pharmakologie von
Verbindungen, die spezifisch mit zellulären Rezeptoren oder Ionenkanälen interagieren.
Darüber hinaus
ist der vorliegende Assay insbesondere zum Identifizieren von Liganden,
gleich ob natürlich
oder künstlich,
für Rezeptoren
und Ionenkanäle
zugänglich.
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I. Definitionen
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Vor
einer weiteren Beschreibung der Erfindung sind bestimmte Begriffe,
die in der Beschreibung, den Beispielen und den beigefügten Ansprüchen verwendet
werden, zur Übersicht
hier zusammengestellt.
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Wie
hierin verwendet, schließt
der Begriff „heterologe
DNA" oder „heterologe
Nukleinsäuren" DNA ein, die natürlich nicht
als Teil des Genomes vorkommt, in dem sie vorhanden ist, oder die
an einem Ort oder Orten im Genom zu finden ist, die sich von demjenigen,
bei dem sie natürlich
auftritt, unterscheiden. Heterologe DNA ist nicht-natürlich vorkommend
in dieser Position oder ist nicht-endogen für die Zelle, in die diese eingebracht wird,
sondern wurde von anderen Zellen gewonnen. Im Allgemeinen, obwohl
nicht notwendigerweise, codiert eine solche DNA Proteine, die normalerweise
nicht von der Zelle, in der sie exprimiert wird, produziert werden. Heterologe
DNA kann auch von derselben Spezies sein, obwohl sie in bevorzugten
Ausführungsformen
von einer unterschiedlichen Spezies stammt. In besonders bevorzugten
Ausführungsformen
stammt sie vom Säugetier,
beispielsweise vom Menschen. Heterologe DNA kann ebenfalls als Fremd-DNA
bezeichnet werden. Irgendeine DNA, die ein Fachmann auf dem Gebiet
als heterolog oder für
die Zelle, in der sie exprimiert wird, fremd erkannt oder betrachtet
würde,
wird hierin vom Begriff „heterologe
DNA" mitumfasst.
Beispiele für
heterologe DNA schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, DNA, die Testpolypeptide, Rezeptoren, Reportergene, Transkriptions-
und Translations-regulatorische Sequenzen oder selektierbare oder
markierbare Markerproteine, beispielsweise ein Protein, das eine
Arzneistoffresistenz überträgt, codiert.
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Der
Begriff „heterologes
Protein", „rekombinantes
Protein" und „exogenes
Protein" werden
in der gesamten Beschreibung austauschbar verwendet und bezeichnen
ein Polypeptid, das durch DNA-Rekombinationstechniken erzeugt wird,
wobei im Allgemeinen DNA, die das Polypeptid codiert, in einen geeigneten
Expressionsvektor eingeführt
wird, der wiederum zum Transformieren einer Wirtszelle verwendet
wird, um das heterologe Protein zu erzeugen. Das heißt, das
Polypeptid wird aus einer heterologen Nukleinsäure exprimiert.
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Wie
hierin verwendet, schließen „rekombinante
Zellen" alle Zellen
ein, die durch Einbringung heterologer DNA modifiziert wurden. Kontrollzellen
schließen
Zellen ein, die im Wesentlichen mit rekombinanten Zellen identisch
sind, die jedoch ein oder mehrere der von der heterologen DNA codierten
Proteine nicht exprimieren, beispielsweise das Reportergen-Konstrukt, den heterologen
Rezeptor oder das Testpolypeptid nicht einschließen oder exprimieren.
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Wie
hierin verwendet, betrifft „Zelloberflächenrezeptor" Moleküle, die
auf der Oberfläche
von Zellen auftreten, mit der extrazellulären Umgebung interagieren und
die Information bezüglich
der Umgebung intrazellulär
in einer Art und Weise übertragen
oder transduzieren, die intrazelluläre Zweite-Messenger-Aktivitäten oder
die Transkription spezifischer Promotoren modulieren kann, was eine
Transkription spezifischer bzw. spezieller Gene zur Folge hat. Ein „heterologer
Rezeptor" ist eine
spezielle Ausführungsform
eines „heterologen Proteins", wobei der heterologe
Rezeptor von heterologer DNA codiert wird, und, nach Expression
dieser heterologen DNA in einer rekombinanten Zelle wird der heterologe
Rezeptor in der rekombinanten Zelle exprimiert.
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Wie
hierin verwendet, soll der Begriff „extrazelluläres Signal" Moleküle und Veränderungen
in der Umgebung einschließen,
die intrazellulär über Zelloberflächenproteine
transduziert werden, die direkt oder indirekt mit dem extrazellulären Signal
interagieren. Ein extrazelluläres
Signal oder Effektormolekül
schließt
jede Verbindung oder Substanz ein, die in einer gewissen Weise die
Aktivität
eines Zelloberflächenproteins
verändert. Beispiele
für solche
Signale schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, Moleküle,
wie beispielsweise Acetylcholin, Wachstumsfaktoren und Hormone,
Lipide, Zucker und Nukleotide, die an die Zelloberfläche binden und/oder
intrazelluläre
Rezeptoren und Ionenkanäle,
und modulieren die Aktivität
solcher Rezeptoren und Kanäle.
Der Begriff „extrazelluläres Signal" schließt ebenfalls
bis jetzt nicht identifizierte Substanzen ein, die die Aktivität eines
zellulären
Rezeptors modulieren und dadurch intrazelluläre Funktionen beeinflussen.
Solche extrazellulären
Signale sind potentielle pharmakologische Mittel, die dazu verwendet
werden können,
spezifische Krankheiten durch Modulieren der Aktivität spezifischer
Zelloberflächenrezeptoren
zu behandeln.
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Der
Begriff „Signaltransduktion" soll die Prozessierung
bzw. Verarbeitung physikalischer oder chemischer Signale aus der
extrazellulären
Umgebung durch die Zellmembran und in die Zelle umfassen und kann durch
ein oder mehrere Mechanismen auftreten, beispielsweise einer Aktivierung/Inaktivierung
von Enzymen (beispielsweise Proteasen oder anderen Enzymen, die
Phosphorylierungsmuster oder andere posttranslationale Modifikationen
verändern),
eine Aktivierung von Ionenkanälen
oder intrazellulären
Ionen speichern, Effektorenzymaktivierung über Guanin-Nukleotidbindungsproteinintermediate,
Bildung von Inositolphosphat, Aktivierung oder Inaktivierung von
Adenylylcyclase, direkte Aktivierung (oder Hemmung) eines Transkriptionsfaktors
und/oder eine Aktivierung. In „Signalstoff-Stoffwechselweg" betrifft die Bestandteile,
die in die „Signalübertragung" eines speziellen
Signals in eine Zelle involviert sind. Der Begriff „endogener
Signalweg" zeigt,
dass einige oder alle der Bestandteile des Signalstoff-Stoffwechselwegs
natürlich
vorkommende Bestandteile der Zelle sind. Ein Beispiel für einen
solchen Weg ist der endogene Pheromonsystemweg der Hefe.
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Der
Begriff „funktionell
integriert" (wie
in einem Rezeptor, der „funktionell
in einen Signalweg in einer Zelle integriert ist" oder „funktionell in einen endogenen
Hefe-Signalstoff-Stoffwechselweg
integriert ist")
soll die Fähigkeit
des Rezeptors betreffen, an der Oberfläche der Zelle exprimiert zu
werden und die Fähigkeit
des exprimierten Rezeptors, an Modulatoren zu binden (beispielsweise
einen Liganden des Rezeptors) und Signale in der Zelle über Bestandteile
eines Signalstoff-Stoffwechselwegs der Zelle zu transduzieren. Beispielsweise
wird ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR), der funktionell
in einen endogenen Pheromon-Reaktionsweg
einer Hefezelle integriert wird, auf der Oberfläche der Hefezelle exprimiert,
koppelt an G-Protein des Pheromon-Reaktionsweges innerhalb der Hefezelle
und transduziert ein Signal in dieser Hefezelle nach Bindung eines
Modulators an den Rezeptor.
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Der
Begriff „endogenes
Gen" soll ein Gen
in einer Zelle betreffen, das natürlicherweise ein Teil des Genoms
der Zelle ist und das am meisten bevorzugt in seinem natürlichen
Ort im Genom vorliegt (im Gegensatz zu „heterologer" DNA, die in der
Zelle transduziert wurde).
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Desgleichen
soll der Begriff „endogenes
Protein" Proteine
einer Zelle einschließen,
die durch endogene Gene der Zelle codiert werden.
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Ein
endogenes Gen kann die natürlichen
regulatorischen Elemente des Gens umfassen (beispielsweise die nativen
Promotor/Enhancer-Elemente, die natürlicherweise die Expression
des Gens regulieren) oder das endogene Gen kann „operativ gebunden werden
an" (d. h. funktionell
gekoppelt werden an) einen „heterologen
Promotor" oder ein
anderes heterologes regulatorisches Element). Ein „heterologer
Promotor" betrifft einen
Promotor, der nicht natürlicherweise
das Gen reguliert, an das der heterologe Promotor operativ gebunden
ist. Beispielsweise wird ein endogenes Hefe Gen, das nicht normalerweise
Pheromon-responsiv ist, operativ an einen heterologen Promotor gebunden,
der gegenüber
Signalen responsiv ist, die durch das Hefepheromonsystem erzeugt
werden, um dadurch eine Pheromon-Reaktivität auf das endogene Hefe Gen
zu übertragen
(nachstehend ausführlicher
beschrieben).
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Der
Begriff „Nachweis
einer Veränderung
in einem Signal, das durch einen endogenen Signalstoff-Stoffwechselweg
erzeugt wird" (beispielsweise
ein endogener Hefe-Signalstoff-Stoffwechselweg)
soll den Nachweis von Veränderungen
in den endogenen Second-Messengern,
die nach Aktivierung von Bestandteilen des endogenen Signalstoff-Stoffwechselweges
erzeugt werden, Veränderungen
in der endogenen Gentranskription, induziert nach Aktivierung von
Bestandteilen des endogenen Signalstoff-Stoffwechselwegs und/oder Veränderungen
in der Aktivität
eines endogenen Proteins (von endogenen Proteinen) nach Aktivierung
von Bestandteilen des endogenen Signalstoff-Stoffwechselweges umfassen.
Der Begriff „Nachweis
einer Veränderung
in einem Signal, erzeugt durch einen endogenen Signalstoff-Stoffwechselweg" soll jedoch nicht
das Nachweisen von Veränderungen
der Expressionsstärke
eines exogenen Rezeptorgens umfassen, das in die Zelle eingebracht
wurde, oder die Aktivität
des Rezeptorgenproduktes. Überdies
soll der Begriff „Nachweisen einer
Veränderung
in einem Signal, erzeugt durch einen endogenen Signalstoff-Stoffwechselweg", nicht die Untersuchung
allgemeiner, globaler Veränderungen
in der Zelle umfassen, wie beispielsweise Veränderungen des Zellwachstums
oder der Morphologie. Eher zeigt dieser Begriff, dass ein spezifisches
Signal, das mit dem endogenen Signalstoff-Stoffwechselweg assoziiert ist, untersucht
wird.
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Der
Begriff „Modulation" wie in „Modulation
eines (heterologen) Rezeptors" und „Modulation
einer Signaltransduktionsaktivität
eines Rezeptorproteins" soll
in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen die Induktion und/oder
Potenzierung ebenso wie die Hemmung und/oder Nach-unten-Regulation
der Rezeptoraktivität
und/oder einer oder mehrerer Signalübertragungswege stromabwärts eines
Rezeptors umfassen.
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Der
Begriff „Verbindung", wie hierin verwendet
(beispielsweise wie in „Testverbindung") soll sowohl exogen
zugesetzte Testverbindungen als auch Peptide einschließen, die
endogen aus einer Peptid-Bibliothek exprimiert werden. Beispielsweise
produziert in bestimmten Ausführungsformen
die Reagenz-Zelle die Testverbindung, die gescreent wird. Beispielsweise
kann die Reagenzzelle beispielsweise ein Testpolypeptid, eine Testnukleinsäure und/oder
ein Testkohlenhydrat erzeugen, das auf sein Vermögen hin gescreent wird, die
Rezeptor/Kanalaktivität
zu modulieren. In solchen Ausführungsformen
wird eine Kultur solcher Reagenzzellen kollektiv eine Bibliothek
potentieller Effektormoleküle
bereitstellen und solche Elemente der Bibliothek, die entweder den
Rezeptor oder Ionenkanalfunktion agonisieren oder antagonisieren,
können
ausgewählt
und identifiziert werden. Überdies
ist offensichtlich, dass die Reagenzzelle zum Nachweis von Mitteln
verwendet werden kann, die ein Signal über den Rezeptor oder Kanal
von Interesse transduzieren.
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In
weiteren Ausführungsformen
ist die Testverbindung exogen zugesetzt. In solchen Ausführungsformen
wird die Testverbindung mit der Reagenz-Zelle in Berührung gebracht.
Beispielhafte Verbindungen, die bezüglich einer Aktivität gescreent
werden können,
schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf Peptide, Nukleinsäuren,
Kohlenhydrate, kleine organische Moleküle und natürliche Produktextraktbibliotheken.
In solchen Ausführungsformen
können
sowohl Verbindungen, die die Rezeptor- oder Kanal-vermittelte Signalgebungsfunktion
agonisieren oder antagonisieren, ausgewählt und identifiziert werden.
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Der
Begriff „Nicht-Peptid-Verbindung" soll Verbindungen
umfassen, die zumindest teilweise molekulare Strukturen umfassen,
die von natürlich
vorkommenden L-Aminosäureresten
verschieden sind, die durch natürliche
Peptidbindungen verbunden sind. Jedoch sollen „Nicht-peptidische-Verbindungen" Verbindungen einschließen, die
ganz oder teilweise aus peptidomimetischen Strukturen zusammengesetzt
sind, wie beispielsweise D-Aminosäuren, nicht-natürlich
vorkommende L-Aminosäuren,
modifizierte Peptid-Grundgerüste
und dergleichen, ebenso wie Verbindungen, die ganz oder teilweise
aus Molekularstrukturen zusammengesetzt sind, die mit den natürlich vorkommenden
L-Aminosäureresten,
gebunden durch natürliche Peptidbindungen, nicht
verwandt sind. „Nicht-peptidische
Verbindungen" sollen
ebenfalls natürliche
Produkte einschließen.
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Der
Begriff „chimäre Nukleinsäurekonstrukt" soll ein Nukleinsäuremolekül, vorzugsweise,
DNA, betreffen, die zumindest aus zwei verschiedenen Segmenten zusammengesetzt
ist, ein erstes Segment, abgeleitet von einem ersten Gen, und ein
zweites Segment, abgeleitet von einem zweiten Gen. Der Begriff „abgeleitet von" bzw. „gewonnen
aus" soll anzeigen,
dass die ersten und zweiten Segmente dieselbe oder eine im Wesentlichen
homologe Nukleotidsequenz aufweisen, als Gesamtheit oder Teil der
ersten bzw. zweiten Gene. Jedes der ersten und zweiten Segmente
codiert ein funktionelles Polypeptid und ist operativ gebunden,
derart, dass nach Expression des Konstruktes ein Fusionsprotein
erzeugt wird, wobei das Fusionsprotein ein erstes Polypeptid umfasst,
das durch das erste Segment codiert ist, und ein zweites Polypeptid,
das durch das zweite Segment codiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
codiert das erste Segment des chimären Konstruktes einen Hefetranskriptionsfaktor,
der auf Signale responsiv ist, die über den Pheromonsystem-Weg
transduziert werden, und das zweite Segment codiert ein DNA-bindendes
Protein, das an eine DNA-Sequenz in der regulatorischen Region eines
endogenen Gens von Interesse bindet.
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Ein „chimäres Substrat" (wie in einem „chimären Substrat" eines BAR1-Enzyms)
bedeutet ein Substrat, das aus zwei getrennten Polypeptiden zusammengesetzt
ist, die aneinander gebunden sind, wobei zumindest eines der Polypeptide
durch BAR1 spaltbar ist. Vorzugsweise exponiert das erste Polypeptid
der chimären Substrate
einen N-terminalen Lysin-Rest nach Spaltung durch BAR1 und das zweite
Polypeptid ist am C-Terminus des ersten Polypeptids gebunden. In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das erste Polypeptid ein Hefe-A-Faktor-Polypeptid.
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Der
Begriff „Pheromonsystemprotein-Surrogat" (abgekürzt als „PSP-Surrogat") soll ein heterologes Protein
in einer Hefezelle bedeuten, das funktionell mit einem Hefeprotein
des Pheromonsystem-Weges homolog ist (d. h., das PSP-Surrogat ist
funktionell in den Hefepheromonsystem-Weg integriert). Beispiele
für PSP-Surrogate
und Verfahren zur Herstellung von Hefezellen, die solche PSP-Surrogate
umfassen, sind ausführlich
in der PCT-Veröffentlichung
WO 94/23025 beschrieben. Bevorzugte PSP-Surrogate schließen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren,
G-Proteine, Proteasen, Kinasen, Farnesyltransferasen, Carboxymethyltransferasen,
ABC-Transporter und Cycline ein.
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Der
Begriff „Rezeptoreffektor" soll Agonisten und
Antagonisten einschließen,
die die Signaltransduktion über
einen Rezeptor modulieren. Rezeptoreffektormoleküle sind dazu in der Lage, an
den Rezeptor zu binden, obwohl nicht notwendigerweise an der Bindungsstelle
des natürlichen
Liganden. Rezeptoreffektoren können
die Signaltransduktion modulieren, wenn sie alleine verwendet werden,
d. h. können
Surrogat-Liganden sein, oder können
die Signaltransduktion in Gegenwart des natürlichen Liganden verändern, entweder
um die Signalgebung durch die natürlichen Liganden zu verstärken oder
zu hemmen. Beispielsweise sind „Antagonisten" Moleküle, die
die Signaltransduktionsaktivität
des Rezeptors blockieren oder senken, sie können beispielsweise die Signaltransduktion
vom Rezeptor kompetitiv, nicht-kompetitiv und/oder allosterisch
hemmen, wohingegen „Agonisten" die Signaltransduktionsaktivität eines
Rezeptors potenzieren bzw. verstärken,
induzieren oder in anderer Weise erhöhen. Die Begriffe „Rezeptoraktivator" und „Surrogatligand" betreffen einen Agonisten,
der die Signaltransduktion von einem Rezeptor induziert.
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„Orphan-Rezeptor" ist eine Bezeichnung,
die Rezeptoren verliehen wird, für
die bis jetzt keine spezifischen natürlichen Liganden beschrieben
wurden und/oder für
die keine Funktion bestimmt wurde.
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Der
Begriff „Indikatorgen" betrifft allgemein
eine exprimierbare (beispielsweise transkribierbare) und (wahlweise
translatierbare) DNA-Sequenz, die in Reaktion auf einen Signalübertragungsweg
exprimiert wird, der durch einen Target-Rezeptor oder Ionenkanal
moduliert wird. Beispielshafte Indikatorgene schließen unmodifizierte
endogene Gene der Wirtszelle, modifizierte endogene Gene oder ein
Reportergen eines heterologen Konstruktes ein, beispielsweise als
Teil eines Reportergen-Konstruktes.
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Wie
hierin verwendet, ist ein „Reportergen-Konstrukt" eine Nukleinsäure, die
ein „Reportergen" operativ zumindest
an eine transkriptionale regulatorische bzw. eine Transkriptionsregulationssequenz
gebunden einschließt.
Die Transkription des Reportergenes wird durch diese Sequenzen,
an die sie gebunden sind, kontrolliert. Die Aktivität zumindest
einer oder mehrerer diese Kontrollsequenzen ist direkt oder indirekt
durch das Targetrezeptorprotein reguliert. Beispielhafte Transkriptionskontrollsequenzen
sind Promotorsequenzen. Ein Reportergen soll ein Promotor-Reportergenkonstrukt
einschließen,
das heterolog in einer Zelle exprimiert wird.
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Der
Begriff „im
Wesentlichen homolog",
wenn er in Verbindung mit Aminosäuresequenzen
verwendet wird, betrifft Sequenzen, die im Wesentlichen in ihrer
Sequenz identisch oder ähnlich
sind, wodurch sich eine Homologie in ihrer Konformation und somit
eine ähnliche
biologische Aktivität
ergibt. Der Begriff schließt
nicht eine gemeinsame Evolution der Sequenzen ein.
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Typischerweise
sind „im
Wesentlichen homologe" Sequenzen
zumindest 50%, besonders bevorzugt zumindest 80% in ihrer Sequenz
identisch, zumindest über
irgendwelche Regionen, von denen bekannt ist, dass sie in die erwünschte Aktivität miteinbezogen
sind. Am meisten bevorzugt sind nicht mehr als 5 Reste, nicht an
den Termini, verschieden. Vorzugsweise liegt die Divergenz der Sequenz
zumindest in den vorher erwähnten
Regionen in Form von „konservativen
Modifikationen" vor.
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Der
Begriff „autokrine
Zelle", wie hierin
verwendet, betrifft eine Zelle, die eine Substanz produziert, die einen
an oder in derselben Zelle wie derjenigen, die die Substanz produziert,
befindlichen Rezeptor stimulieren kann. Beispielsweise sind Wildtype
für MATa
und MATa-Zellen
nicht autokrin. Jedoch ist eine Hefezelle, die sowohl einen a-Faktor
als auch einen a-Faktorrezeptor
oder sowohl einen a-Faktor als auch einen a-Faktorrezeptor in funktioneller
Form erzeugt, autokrin. Als Erweiterung werden Zellen, die ein Peptid
erzeugen, das auf sein Vermögen
zur Aktivierung eines Rezeptors (beispielsweise durch Aktivierung
eines G-Protein-gekoppelten
Rezeptors) gescreent wird und ebenfalls den Rezeptor exprimiert, „autokrine
Zellen" genannt.
In einigen Fällen
können
solche Zellen als „putative
autokrine Zellen" bezeichnet
werden, weil einige der Zellen Peptide aus der Bibliothek exprimieren
werden, die den Rezeptor, der exprimiert wird, nicht aktivieren
werden. In einer Bibliothek solcher Zellen, in denen eine Vielzahl
unterschiedlicher Peptide erzeugt wird, ist es wahrscheinlich, dass
ein oder mehrere der Zellen „autokrin" in einer engeren
Bedeutung des Begriffes sein werden.
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II. Allgemeiner Überblick über den
Assay
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Wie
oben dargelegt, betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum
Identifizieren von Effektoren eines Rezeptorproteins oder Komplexes
hiervon. Im Allgemeinen ist der Assay durch Verwendung einer Testzelle
charakterisiert, die einen Target-Rezeptor oder ein Ionenkanalprotein
einschließt,
deren Signaltransduktionsaktivität
durch Interaktion mit einem ext razellulären Signal moduliert werden
kann, wobei die Transduktionsaktivität dazu in der Lage ist, ein
nachweisbares Signal zu erzeugen. In bevorzugten Ausführungsformen schließt die Zelle
ebenfalls ein nachweisbares Mittel ein, beispielsweise ein Reportergen
oder ein Indikatorgen, zum Nachweisen von Signalen, die vom Rezeptor
erzeugt werden. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung wird eine Veränderung
des Signals, das durch einen endogenen Signalstoff-Stoffwechselweg
der Zelle erzeugt wird, nachgewiesen.
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Die
Fähigkeit
spezieller Verbindungen, die Signaltransduktionsaktivität eines
Target-Rezeptors
oder Kanales zu modulieren, kann durch Nachweisen einer Nach-oben-
oder Nach-unten-Regulierung
eines endogenen Nachweissignales gescort werden. Beispielsweise
kann die zweite Messenger-Erzeugung (beispielsweise die GTPase-Aktivität, Phospholipidhydrolyse
oder Proteinphosphorylierungsmuster als Beispiele) direkt gemessen
werden. In anderen Ausführungsformen
wird die Transkription eines endogenen Gens oder die Aktivität eines
endogenen Proteins als nachweisbare Ablesung verwendet.
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Alternativ
kann die Verwendung eines Indikatorgenes einen geeigneten Read-out
bzw. Ablesung bereitstellen. In weiteren Ausführungsformen besteht ein Nachweismittel
aus einem Reportergen. In jedem Falle kann eine statistisch signifikante
Veränderung
des Nachweissignales dazu verwendet werden, die Identifizierung
von Verbindungen zu erleichtern, die Rezeptor- oder Ionenkanalaktivitäten modulieren.
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Durch
dieses Verfahren können
Verbindungen, die einen Signalweg von einem speziellen Rezeptor oder
Kanal induzieren, identifiziert werden. Wenn eine Testverbindung
die Aktivität
des Rezeptor/Kanalproteins nicht zu induzieren scheint, kann der
Assay wiederholt und durch Einbringung eines Schrittes modifiziert werden,
bei dem die Reagenz-Zelle zunächst
mit einem bekannten Aktivator des Target-Rezeptors/Kanals in Berührung gebracht
wird, um eine Signaltransduktion zu erzeugen, und die Testverbindung
kann auf ihre Fähigkeit
hin untersucht werden, die aktivierten Rezeptoren/Kanäle zu hemmen,
beispielsweise um Antagonisten zu identifizieren. In noch weiteren
Ausführungsformen
können
Batterien von Verbindungen nach Mitteln gescreent werden, die die
Reaktion auf einen bekannten Aktivator des Rezeptors potenzieren
bzw. vermehren.
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Bei
der Entwicklung der vorliegenden Assays wurde erkannt, dass eine
häufige
Folge Rezeptor-vermittelter Reaktionen bzw. Antworten auf extrazelluläre Signale,
die transkriptio nelle Aktivierung oder Inaktivierung spezieller
Gene nach Exposition des bekannten Rezeptors gegenüber einem
extrazellulären
Signal war, dass eine solche Aktivität induziert. Eine solche Transkription
von Genen, kontrolliert durch Rezeptor-responsive transkriptionelle
Elemente, widerspiegelt oftmals die Aktivität des Oberflächenproteins
mittels Transduktion eines intrazellulären Signals. Um dies zu veranschaulichen,
kann das intrazelluläre
Signal, das transduziert wird, durch spezifische Interaktion eines
extrazellulären
Signales initiiert werden, insbesondere eines Liganden, mit einem
Zelloberflächenrezeptor
auf der Zelle. Die Interaktion löst
die Bewegung einer Kaskade intrazellulärer Ereignisse aus, deren letztendliche
Folge eine rasche und nachweisbare Veränderung der Transkription oder
Translation eines Genes ist. Durch Auswahl transkriptioneller regulatorischer
Sequenzen, die gegenüber
transduzierten intrazellulären
Signalen responsiv sind und die die ausgewählten Promotoren operativ an Indikatorgene
binden, deren Transkription oder Translation einfach nachweisbar
und messbar ist, stellt ein Transkriptions-basiertes Assay eine
rasche Indikation bzw. Hinweis bereit, ob ein spezifischer Rezeptor
oder Ionenkanal mit einer Testverbindung auf irgendeine Art und
Weise interagiert, die die intrazelluläre Transduktion moduliert.
Die Expression des Indikatorgens stellt somit ein wertvolles Screening-Werkzeug
zur Entwicklung von Verbindungen bereit, die als Agonisten oder
Antagonisten eines Zellrezeptors oder Ionenkanals dienen.
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Indikator-
oder Reportergen-basierte Assays dieser Erfindung messen das Endstadium
der oben beschriebenen Kaskade von Ereignissen, beispielsweise eine
transkriptionelle Modulation. Demgemäß wird bei der Ausübung einer
Ausführungsform
des Assays ein Reportergen-Konstrukt
in die Reagenz-Zelle eingebracht, um ein Nachweissignal zu erzeugen,
das von der Rezeptorsignalgebung abhängig ist. Typischerweise wird
das Reportergen-Konstrukt ein Reportergen in operativer Bindung
mit ein oder mehreren transkriptionellen regulatorischen Elementen
einschließen,
die gegenüber
der Signaltransduktionsaktivität
des Target-Rezeptors responsiv sind, wobei die Expressionsstärke des
Reportergens das Rezeptor-abhängige
Nachweissignal bereitstellt. Wie unten beschrieben, können bestimmte
endogene Gene ein nachweisbares Signal in Reaktion auf eine Signaltransduktion
von einem Rezeptor oder Ionenkanal bereitstellen, d. h. als Indikatorgene dienen.
In jeder Ausführungsform
kann die Menge der Transkription aus dem Indikatorgen unter Verwendung irgendeines
Verfahrens gemessen werden, das dem Fachmann auf dem Gebiet als
geeignet bekannt ist. Beispielsweise kann eine spezifische mRNA-Expression
unter Verwendung von Northern Blots nachgewiesen werden, oder ein
spezifisches Proteinprodukt kann durch eine charakteristische Färbung oder
eine intrinsische Aktivität
identifiziert werden.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird das Genprodukt des Indikator- oder Reportergenes durch eine
intrinsische Aktivität
nachgewiesen, die mit diesem Produkt in Verbindung steht. Beispielsweise
kann das Indikatorgen ein Genprodukt codieren, das beispielsweise
durch enzymatische Aktivität,
ein Detektionssignal, basierend auf beispielsweise Farbe, Fluoreszenz
oder Lumineszenz, entstehen lässt.
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Die
Expressionsmenge bzw. -stärke
vom Indikatorgen wird dann mit der Expressionsmenge in entweder
derselben Zelle in Abwesenheit der Testverbindung verglichen oder
sie kann mit der Menge der Transkription in einer im Wesentlichen
identischen Zelle verglichen werden, der die spezifischen Rezeptoren
fehlen. Eine Kontrollzelle kann aus derselben Zelle abgeleitet werden,
aus der die Testzelle hergestellt wurde, die jedoch nicht mit der
Verbindung behandelt wurde. Alternativ kann sie eine Zelle sein,
bei der der Rezeptor von Interesse entfernt wurde. Jede statistisch
oder in anderer Weise signifikante Differenz der Transkriptionsmenge
zeigt, dass die Testverbindung in einer gewissen Weise die Aktivität des speziellen
Rezeptors oder Ionenkanals verändert
hat.
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In
weiteren bevorzugten Ausführungsformen
stellt das Indikatorgen ein Selektionsverfahren derart bereit, dass
bei den Zellen eine Aktivierung (oder Inaktivierung) eines oder
mehrerer Signalwege eines Rezeptors oder Ionenkanals einen Wachstumsvorteil
für die
behandelte Zelle bereitstellt. Beispielsweise könnte die Expression des Indikatorgenes
die Zelllebensfähigkeit
verbessern, ein Ernährungserfordernis
der Zelle abbauen und/oder eine Resistenz gegenüber einem Arzneistoff bereitstellen.
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In
weiteren Ausführungsformen
können
Veränderungen
der intrazellulären
zweiten Messenger-Wege eher biochemisch als biologisch nachgewiesen
werden. Beispielsweise können
Veränderungen
des intrazellulären
Ca2+, der Phosphorylierungszustände von
Proteinen, die Aktivitäten
von intrazellulären
Enzymen und dergleichen nachgewiesen werden. Noch weitere Nachweistechniken
schließen
mikrophysiometrische Vorrichtungen ein, die den Nachweis kleiner
Veränderungen
beispielsweise bei den Ionen oder intrazellulären pH ermöglichen.
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Bezüglich des
Rezeptors oder der Ionenkanales kann dieser endogen durch die Wirtszelle
exprimiert werden, oder sie kann aus einem heterologen Gen exprimiert
werden, das in die Zelle eingebracht wurde. Verfahren zum Einbringen
von heterologer DNA in eukaryontische Zellen sind in der Technik
wohl bekannt und jedes derartige Verfahren kann verwendet werden.
Zusätzlich
ist DNA, die verschiedene Rezeptorproteine codiert, dem Fachmann
auf dem Gebiet bekannt oder kann durch irgendein Verfahren kloniert
werden, das dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist. In bestimmten
Ausführungsformen,
beispielsweise wenn ein exogener Rezeptor exprimiert wird, kann
es wünschenswert
sein, einen homologen Rezeptor, der in der Zelle vorliegt, beispielsweise
durch Deletion zu inaktivieren.
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Der
vorliegende Assay ist zum Identifizieren von Verbindungen von Nutzen,
die mit irgendeinem Rezeptorprotein interagieren, dessen Aktivität letztendlich
eine Signaltransduktionskaskade in der Wirtszelle induziert, die
dazu verwendet werden kann, ein nachweisbares Signal zu erzeugen.
Insbesondere können
die Assays dazu verwendet werden, funktionelle Liganden-Rezeptor-
oder Liganden-Ionenkanal-Interaktionen für Zelloberflächen-lokalisierte
Rezeptoren und Kanäle
zu testen und ebenfalls für
zytoplasmatische und Kernrezeptoren. Wie ausführlich unten beschrieben ist,
kann der vorliegende Assay zum Identifizieren von Effektoren verwendet
werden, beispielsweise von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen,
Cytokin-Rezeptoren und Ionenkanälen,
ebenso wie von Steroidhormonen oder anderen Kernrezeptoren. In bestimmten
Ausführungsformen
wird das hierin beschriebene Verfahren zum Identifizieren von Liganden
für „Orphan-Rezeptoren" verwendet, für das kein
Ligand bekannt ist.
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In
Ausführungsformen,
die eine „autokrine
Zelle" der vorliegenden
Erfindung verwenden, und bei denen die Zelloberflächenrezeptoren
die Assay-Targets sind, wird es für jedes der Peptide der Peptid-Bibliothek wünschenswert
sein, eine Signalsequenz zur Sekretion einzuschließen. In
bestimmten Ausführungsformen kann
die Expression einer solchen Signalsequenz den geeigneten Transport
des Peptides zum endoplasmatischen Reticulum, dem Golgi und letztendlich
zur Zelloberfläche
sicherstellen. Wenn eine Hefezelle die Wirtszelle ist, wird in bestimmten
Ausführungsformen
die Signalsequenz Peptide zum periplasmatischen Raum transportieren,
jedoch kann ein solcher Transport nicht notwendig sein, um eine
autokrine Stimulation zu erreichen.
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Jede
transfizierbare Zelle, die das erwünschte Zelloberflächenprotein
in einer Art und Weise exprimieren kann, dass das Protein funktioniert,
um intrazellulär
ein extrazelluläres
Signal zu transportieren, kann verwendet werden. In ähnlicher
Weise kann jedes Zelloberflächenprotein,
das dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist oder das vom Fachmann
auf dem Gebiet identifiziert werden kann, im Assay verwendet werden. Das
Zelloberflächenprotein
kann endogen auf der ausgewählten
Zelle exprimiert werden oder kann aus klonierter DNA exprimiert
werden.
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3. Wirtszellen
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Geeignete
Wirtszellen zur Erzeugung des vorliegenden Assays schließen Prokaryonten-,
Hefe- oder höhere
Eukaryontenzellen ein, einschließlich Pflanzen- und Tierzellen,
insbesondere Säugetierzellen.
Prokaryonten schließen
Gram-negative oder Gram-positive Organismen ein. Beispiele für geeignete
Säugetierwirtszelllinien
schließen
die COS-7-Linie der Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman (1981),
Cell 23: 175), CV-1-Zellen (ATCC CCL 70), L-Zellen, C127, 3T3, Chinesische-Hamster-Ovarzellen
(CHO), HeLa, HEK-293, SWISS 3T3 und BHK-Zelllinien ein.
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Wenn
Hefezellen verwendet werden, kann die Hefe von irgendeiner Spezies
sein, die kultivierbar ist und in der ein exogener Rezeptor hergestellt
werden kann, um die geeignete Signaltransduktionsmaschinerie der
Wirtszelle in Gang zu setzen. Geeignete Spezies schließen Kluyverei
lactis, Schizosaccharomyces pombe und Ustilaqo maydis ein; Saccharomyces
cerevisiae ist bevorzugt. Andere Hefen, die in der Ausübung der
vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Neurospora crassa,
Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Pichia pastoris, Candida
tropicalis und Hansenula polymorpha. Der Begriff „Hefe" wie hierin verwendet, schließt nicht
nur Hefe in einer strikt taxonomischen Bedeutung ein, d. h. einzellige
Organismen, sondern auch hefeartige vielzellige Pilze oder filamentöse Pilze.
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Die
Auswahl der geeigneten Wirtszelle wird ebenfalls durch Auswahl des
Nachweissignales beeinflusst werden. Beispielsweise können Reporterkonstrukte,
wie unten beschrieben, ein selektierbares oder screenbares Merkmal
nach transkriptioneller Aktivierung (oder Inaktivierung) in Reaktion
auf einen Signaltransduktionsweg bereitstellen, der an einen Target-Rezeptor gekoppelt
ist. Das Reportergen kann ein unmodifiziertes Gen sein, das bereits
im Wirtszellstoffwechselweg vorliegt, wie beispielsweise die Gene,
die für
den Wachstumsstopp in der Hefe verantwortlich sind. Es kann ein
Wirtszellgen sein, das operativ an einen „Rezeptor-responsiven" Promotor gebunden
ist. Alternativ kann es ein heterologes Gen sein (beispielsweise
ein „Reportergen-Konstrukt"), das so verbunden
wurde. Geeignete Gene und Promotoren werden unten diskutiert werden.
Anderen Ausführungsformen
kann die zweite Messenger-Erzeugung direkt im Nachweisschritt gemessen
werden, wie beispielsweise die Mobilisierung des intrazellulären Kalzium-
oder Phospholipid-Metabolismus können
quantifiziert werden. In noch weiteren Ausführungsformen können Indikatorgene
verwendet werden, um die Rezeptor-vermittelte Signalgebung nachzuweisen.
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Es
ist demgemäß verständlich,
dass zum Erreichen einer Selektion oder eines Screenings die Wirtszelle
einen geeigneten Phänotyp
aufweisen muss. Beispielsweise würde
die Erzeugung eines Pheromon-responsiven chimären HIS3-Gens in einer Hefe,
die ein Wildtyp-HIS3-Gen aufweist, die genetische Selektion behindern.
Somit wird zum Erreichen einer Nahrungs-bezogenen Selektion ein auxotropher
Stamm bevorzugt.
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Eine
Vielzahl von Komplementierungen zur Verwendung im vorliegenden Assay
kann konstruiert werden. Tatsächlich
sind viele genetische Hefe-Komplementierungen mit Säugetiersignaltransduktionsproteinen in
der Technik beschrieben worden. Beispielsweise demonstriert Mosteller
et al. (1994), Mol. Cell. Biol. 14: 1104–1112, dass humane Ras-Proteine
den Verlust von Ras-Mutationen in S. cerevisiae komplementieren bzw.
ergänzen
können.
Darüber
hinaus haben Toda et al. (1986), Princess Takamatsu Symp. 17: 253–60 gezeigt,
dass humane Ras-Proteine den Verlust an Ras1- und Ras2-Proteinen
in der Hefe komplementieren können
und daher funktionell homolog sind. Sowohl menschliche als auch
Hefe-Ras-Proteine können
die Magnesium- und Guanin-Nukleotid-abhängige Adenylatcyclase-Aktivität, die in
Hefemembranen vorliegt, stimulieren. Ballester et al. (1989), Cell
59: 681–6,
beschreiben einen Vektor, um das Säugetier-GAP-Protein in der
Hefe S. cerevisiae zu exprimieren. Wenn GAP in der Hefe exprimiert
wird, hemmt es die Funktion des humanen Ras-Proteins und komplementiert
den Verlust an IRA1. IRA1 ist ein Hefe Gen, das ein Protein mit
einer Homologie zu GAP codiert und stromaufwärts von Ras wirkt. Säugetier-GAP
kann deswegen in der Hefe funktionieren und mit Hefe-Ras interagieren.
Wie et al. (1994), Gene 151: 279–284 beschreiben, dass ein
humaner Ras-spezifischer Guaninnukleotid-Austauschfaktore, Cdc25GEF,
den Verlust der CDC25-Funktion in S. cerevisiae komplementieren
kann. Martegani et al. (1992), EMBO J. 11: 2151–7 beschreibt das Klonieren
durch funktionelle Komplementierung einer Maus-cDNA, die ein Homolog
von CDC25 codiert, einen Saccharomyces cerevisiae Ras-Aktivator. Vojtek
et al. (1993), J. Cell Sci. 105: 777–785 und Matviw et al. (1992),
Mol. Cell. Biol. 12: 5033–5040,
beschreiben, wie ein Maus-CAP-Protein, beispielsweise ein Adenylylcyclase-assoziiertes
Protein, das mit der Ras-vermittelten Signaltransduktion assoziiert
ist, Defekte in S. cerevisiae komplementieren kann. Papasavvas et
al. (1992), Biochem. Biophys. Res. Commun. 184: 1378–1385, schlagen
ebenfalls vor, dass inaktivierte Hefe-Adenylcyclase durch ein Säugetier-Adenylcyclase-Gen
komplementiert werden kann. Hughes et al. (1993), Nature 364: 349–352, beschreiben
die Komplementierung von byr1 in Spalthefe durch Säugetier-MAP-Kinasekinase
(MEK). Parissenti et al. (1993), Mol. Cell Endocrinol. 98: 9–16 beschreibt
die Rekonstitution von bovinem Proteinkinase C (PKC) in Hefe. Die
Ca(2+)- und Phospholipid-abhängige
Ser/Thr-Kinase-PKC spielt bedeutende Rollen bei der Transduktion
zellulärer
Signale in Säugetierzellen.
Marcus et al. (1995) PNAS 92: 6180–4 schlägt die Komplementierung von
shk1-Null-Mutationen in S. pombe entweder durch das strukturell
verwandte S. cerevisiae Ste20 oder durch Säugetier p6PAK-Protein-Kinasen
vor.
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„Inaktivierung" bedeutet bezüglich der
Gene der Wirtszelle, dass die Produktion eines funktionellen Genproduktes
vermieden oder gehemmt wird. Eine Inaktivierung kann durch Deletion
des Genes erreicht werden, durch Mutation des Promotors, so dass
eine Expression nicht eintritt oder eine Mutation der codierenden Sequenz,
so dass das Genprodukt inaktiv ist. Eine Inaktivierung kann teilweise
oder vollständig
erfolgen.
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„Komplementierung" bezüglich der
Gene der Wirtszelle bedeutet, dass zumindest eine teilweise Funktion
des inaktivierten Genes der Wirtszelle durch eine exogene Nukleinsäure ergänzt wird.
Beispielsweise können
Hefezellen durch Komplementierung von Rezeptor- und Signaltransduktionsproteinen
mit Säugetierhomologen „mammalianisiert" und sogar „humanisiert" werden. Um dies
zu veranschaulichen, kann die Inaktivierung von Hefe-Byr2/Ste11-Gen durch Expression
eines humanen MEKK-Genes komplementiert werden.
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IV. Expressionssysteme
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Ein
Ligieren einer Polynukleotid-codierenden Sequenz in ein Genkonstrukt,
beispielsweise einen Expressionsvektor und ein Transformieren oder
Transfizieren in Wirte, beispielsweise eukaryontische (Hefe, Vogel,
Insekten oder Säugetier)
oder prokaryontische (bakterielle) Zellen sind Standardverfahren,
die in der Erzeugung weiterer wohlbekannter Proteine verwendet werden,
einschließlich
von Sequenzen, die exogenen Rezeptor und Peptid-Bibliotheken codieren. Ähnliche
Verfahren oder Modifikationen hiervon können verwendet werden, um rekombinante
Reagenz-Zellen der vorliegenden Erfindung durch Gewebs-Kulturtechnologie gemäß der vorliegenden
Erfindung herzustellen bzw. zu präparieren.
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Es
ist im Allgemeinen wünschenswert,
dass der Vektor dazu in der Lage ist, sich in der Wirtszelle zu replizieren.
Er kann eine DNA sein, die in das Wirtsgenom integriert wird und
danach als Teil der chromosomalen DNA repliziert wird, oder er kann
DNA sein, die sich autonom repliziert, wie im Falle eines Plasmids.
Im letzteren Falle wird der Vektor einen Replikationsursprung einschließen, der
im Wirt funktionell ist. Im Falle eines Integrationsvektors kann
der Vektor Sequenzen einschließen,
die die Integration erleichtern, beispielsweise Sequenzen, die mit
den Wirtsequenzen homolog ist, oder die Integrasen codieren.
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Geeignete
Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit bakteriellen,
Pilz-, Hefe- und Säugetier-zellulären Wirten
sind in der Technik bekannt und beispielsweise bei Powels et al.
(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)
beschrieben. Säugetier-Expressionsvektoren
können nicht-transkribierte
Elemente, wie beispielsweise einen Replikationsursprung, einen geeigneten
Promotor und Enhancer, gebunden an das zu exprimierende Gen, enthalten
und weitere 5'-
oder 3'-flankierende
nicht-transkribierte Sequenzen und 5'- oder 3'-nicht-translatierte Sequenzen, wie
beispielsweise notwendige Ribosomen-Bindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle,
Spleiß-Donor-
und Akzeptor-Stellen und transkriptionelle Terminationssequenzen.
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Bevorzugte
Säugetier-Expressionsvektoren
enthalten sowohl prokaryontische Sequenzen, um die Vermehrung des
Vektors in den Bakterien zu erleichtern, als auch ein oder mehrere
eukaryontische Transkriptionseinheiten, die in eukaryontischen Zellen
exprimiert werden. die pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt,
pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo und pHyg-abgeleiteten
Vektoren sind Beispiele für
Säugetier-Expressionsvektoren,
die zur Transfektion eukaryontischer Zellen in der Lage sind. Einige
dieser Vektoren sind mit Sequenzen aus bakteriellen Plasmiden modifiziert,
wie beispielsweise pBR322, um die Replikation und die Arzneistoffresistenzselektion
sowohl in prokaryontischen als auch eukaryontischen Zellen zu erleichtern.
Alternativ können
Derivate von Viren, wie beispielsweise bovines Papilloma-Virus (BPV-1)
oder Epstein-Barr-Virus (pHEBo, pREP-abgeleitet und p205) zur transienten
Expression von Proteinen in eukaryontischen Zellen verwendet werden.
Die verschiedenen in der Herstellung der Plasmide und der Transformation
von Wirtsorganismen verwendeten Verfahren sind in der Technik wohl
bekannt. Für
weitere geeignete Expressionssysteme für sowohl prokaryontische als
auch eukaryontische Zellen ebenso wie für allgemeine Rekombinationsverfahren
siehe Molecular Cloning, A La boratory Manual, 2. Ausg., hsg. von
Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press:
1989), Kapitel 16 und 17.
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Transkriptions-
und Translationskontrollsequenzen und Expressionsvektoren, die beim
Transformieren von Säugetierzellen
verwendet werden, können
durch virale Quellen bereitgestellt werden. Beispielsweise werden üblicherweise
verwendete Promotoren und Enhancer von Polyoma, Adenovirus 2, Simian
Virus 40 (SV40) und humanem Zytomegalie-Virus gewonnen. DNA-Sequenzen,
die von dem SV40-Virusgenom abgeleitet sind, beispielsweise SV40
Origin, Early-and-late-Promotor, Enhancer, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen
können
dazu verwendet werden, die anderen genetischen Elemente bereitzustellen,
die für
die Expression einer heterologen DNA-Sequenz erforderlich sind.
Die frühen
und späten
(early and late) Promotoren sind insbesondere von Nutzen, weil beide
einfach aus dem Virus als Fragment gewonnen werden, das ebenfalls den
SV40-Virusreplikationsursprung enthält (Fiers et al. (1978), Nature
273: 111). Kleinere oder größere SV40-Fragmente
können
ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, dass die ungefähr 250 bp-Sequenz,
die sich von der HindIII-Stelle hin zum BglI-Ort erstreckt, der
im viralen Replikationsursprung angeordnet ist, eingeschlossen ist.
Beispielhafte Vektoren können
wie von Okayama und Berg (1983, Mol. Cell. Biol. 3: 280) offenbart,
konstruiert werden. Ein nützliches
System zur stabilen Expression auf hohem Niveau von Säugerezeptor-cDNAs
in C127 murinen Brustdrüsenepithelzellen
kann im Wesentlichen wie von Cosman et al. (1986, Mol. Immunol.
23: 935) beschrieben, konstruiert werden. Weitere Expressionsvektoren
zur Verwendung in Säugetierwirtszellen
werden aus Retroviren gewonnen.
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In
anderen Ausführungsformen
kann die Verwendung einer viralen Transfektion stabil integrierte
Kopien des Expressionsproduktes bereitstellen. Insbesondere wird
die Verwendung von retroviralen, adenoviralen oder adeno-assoziierten
viralen Vektoren als Mittel zur Bereitstellung einer stabil transfizierten
Zelllinie betrachtet, die einen exogenen Rezeptor und/oder eine
Polypeptid-Bibliothek exprimiert.
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Es
existieren mehrere Vektoren für
die Expression rekombinanter Proteine in Hefe. Beispielsweise sind
YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2 und YRP17 Klonierungs- und Expressionsvehikel,
die bei der Einbringung genetischer Konstrukte in S. cerevisiae
von Nutzen sind (siehe beispielsweise Broach et al. (1983) in Experimental
Manipulation of Gene Expression, Hsg. M. Inouye, Academic Press,
S. 83, hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen).
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Diese
Vektoren können
sich in E. coli aufgrund des Vorhandenseins des pBR322 ori und in
S. cerevisiae aufgrund der Replikationsdeterminante des Hefe2-Micronplasmids
replizieren. Zusätzlich
können
Arzneistoffresistenzmarker, wie beispielsweise Ampicillin, verwendet
werden. Überdies
versteht sich, wenn Hefe als Wirtszelle verwendet wird, dass die
Expression eines Genes in einer Hefezelle einen Promotor erfordert,
der in Hefe funktionell ist. Geeignete Promotoren schließen die
Promotoren für
Metallothionein, 3-Phosphogylceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol.
Chem. 255, 2073 (1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et
al., J. Adv. Enzyme Req. 7, 149 (1968); und Holland et al., Biochemistry
17, 4900 (1978)), wie beispielsweise Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase,
Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phospho-fructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase,
3-Phosphoglyceratmutase,
Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phospho-glucoseisomerase
und Glucokinase ein. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung
in der Hefeexpression sind weiter in R. Hitzeman et al., EPO Veröffentlichungsnummer
73 657, beschrieben. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen
Vorteil einer durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription
aufweisen, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytrochrom
C, saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus
in Verbindung stehen und das vorher erwähnte Metallothionein und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase,
ebenso wie Enzyme, die für
die Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Zuletzt
können
Promotoren, die in nur einem der beiden haploiden Paar-Typen aktiv sind,
in bestimmten Umständen
geeignet sein. Unter diesen Haploid-spezifischen Promotoren sind
die Pheromon-Promotoren MFa1 und MFα1 von besonderem Interesse.
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Es
kann in einigen Fällen
wünschenswert
sein, Insektenzellen als Wirtszellen zu verwenden. In solchen Ausführungsformen
können
rekombinante Polypeptide durch Verwendung eines Bacculovirus-Expressionssystems
exprimiert werden. Beispiele für
solche Bacculovirus-Expressionssysteme
schließen
pVL-abgeleitete Vektoren (wie beispielsweise pVL1392, pVL1393 und
pVL941), pAcUW-abgeleitete Vektoren (wie beispielsweise pAcUW1)
und pBlueBac-abgeleitete Vektoren (wie beispielsweise der β-gal-enthaltende
pBlueBac III) ein.
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Beim
Konstruieren geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen
Genen oder mit anderen Genen, die effizient in Hefe exprimiert werden,
assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressionsvektor
3' der heterologen
codierenden Sequenz ligiert, um eine Polyadenylierung und Termination
der mRNA bereitzustellen.
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V. Periplasmatische Sekretion
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In
Ausführungsformen,
in denen die Hefezellen als Wirtszelle verwendet werden und die
Verbindungen, die getestet werden, endogen aus einer Bibliothek
exprimiert werden, sei erwähnt,
dass die Hefezelle durch eine Lipid-Doppelschicht gebunden ist,
die Plasmamembran genannt wird. Zwischen dieser Plasmamembran und
der Zellwand befindet sich der periplasmatische Raum. Peptide, die
durch Hefezellen durch die Plasmamembran durch eine Vielzahl von
Mechanismen hindurch sezerniert werden, treten dadurch in der periplasmatischen
Raum ein. Die sezernierten Peptide sind dann frei, um mit anderen
Molekülen
zu interagieren, die im Periplasma vorliegen oder auf der äußeren Oberfläche der
Plasmamembran gezeigt werden. Die Peptide machen dann entweder eine
Wiederaufnahme in die Zelle durch, diffundieren durch die Zellwand
in das Medium oder werden innerhalb des periplasmatischen Raums
abgebaut.
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Die
Testpolypeptid-Bibliothek kann in das Periplasma durch mehrere beispielhafte
Mechanismen sezerniert werden, abhängig von der Art des Expressionssystems,
an das sie gebunden sind. In einer Ausführungsform kann das Peptid
strukturell an eine Hefesignalsequenz gebunden sein, wie beispielsweise
diejenige, die in einem α-Faktor-Vorläufer vorliegt,
der die Sekretion durch das endoplasmatische Reticulum und den Golgi-Apparat
leitet. Weil dies derselbe Weg ist, den das Rezeptorprotein in seiner
Reise zur Plasmamembran folgt, existiert die Möglichkeit in Zellen, die sowohl
den Rezeptor als auch die Peptid-Bibliothek für ein spezifisches Peptid erzeugen,
mit dem Rezeptor während
des Transits durch den sekretorischen Stoffwechselweg zu interagieren.
Dies wurde als in Säugetierzellen
auftretend postuliert, die eine autokrine Aktivierung zeigen. Eine
solche Interaktion könnte
eine Aktivierung des Reaktionswegs während des Transits ergeben,
was noch die Identifizierung dieser Zellen, die einen Peptidagonisten
exprimieren, ermöglichen
würde.
Für Situationen, in
denen die Peptidanagonisten gegen extern aufgebrachte Rezeptoragonisten
gesucht werden, würde
dieses System noch effektiv sein, weil sowohl der Peptidantagonist
als auch Rezeptor an die Außenseite
der Zelle zusammen geliefert werden würde. Somit wären solche
Zellen, die einen Antagonisten produzieren, selektierbar, weil der
Peptidantagonist in geeigneter Weise und rechtzeitig angeordnet
wird, um zu verhindern, dass der Rezeptor durch den extern aufgebrachten
Agonisten stimuliert wird.
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Ein
alternativer Mechanismus zur Abgabe bzw. zum Transport von Peptiden
an den periplasmatischen Raum ist die Verwendung des ATP-abhängigen Transporters
der STE6/MDR1-Klasse.
Dieser Transportweg und die Signale, die ein Protein oder Peptid
zu diesem Weg leiten, sind nicht genauso gut charakterisiert, wie es
der endoplasmatische-Reticulum-basierte sekretorische Weg ist. Nicht
desto trotz können
diese Transporter offensichtlich bestimmte Peptide direkt durch
die Plasmamembran hindurch exportieren, ohne dass die Peptide den
ER/Golgi-Weg durchqueren müssen.
Es wird angenommen, dass zumindest eine Untergruppe von Peptiden
durch diesen Weg durch Exprimieren der Bibliothek im Kontext der
a-Faktor pro Sequenz und des terminalen Tetrapeptids sezerniert
werden können.
Der mögliche
Vorteil dieses Systems besteht darin, dass der Rezeptor und das
Peptid nicht in Berührung
kommen, bis beide an die Außenoberfläche der
Zelle abgegeben werden. Somit ahmt das System strikt die Situation
eines Agonisten oder Antagonisten nach, der normalerweise von außen in die
Zelle geliefert wird. Die Verwendung jedes der beschriebenen Wege
liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung benötigt
keine periplasmatische Sekretion oder, falls eine solche Sekretion vorgesehen
ist, irgendein spezielles Sekretionssignal oder Transportweg.
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VI. Rezeptoren
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Cytokin-Rezeptoren
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In
einer Ausführungsform
ist der Target-Rezeptor ein Cytokin-Rezeptor. Cytokine sind eine
Familie löslicher
Mediatoren der Zell-zu-Zell-Kommunikation, die Interleukine, Interferone
und Kolonie-stimulierende Faktoren einschließt. Die meisten der Cytokin-Rezeptoren,
die getrennte Superfamilien bilden, besitzen keine intrinsischen
Proteintyrosin-Kinasedomänen,
jedoch ruft eine Rezeptorstimulation gewöhnlich eine rasche Tyrosin-Phosphorylierung
intrazellulärer
Proteine hervor, die die Rezeptoren selbst einschließen. Viele
Elemente der Cytokin-Rezeptorsuperfamilie aktivieren die Jak-Protein-Tyrosin-Kinase-Familie
mit einer sich ergebenden Phosphorylierung der STAT-Transkriptionsaktivatorfaktoren.
IL-2, IL-7, IL-2 und Interferon x haben sich alle als Jak-Kinasen-aktivierend
gezeigt (Frank et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7779–7783);
Scharfe et al. (1995), Blood 86: 2077–2085); (Bacon et al. (1995),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7307–7311); und (Sakatsume et al.
(1995), J. Biol. Chem. 270: 17528–17534). Ereignisse stromabwärts der
Jak-Phosphorylierung wurden eben falls beleuchtet. Beispielsweise
zeigte sich, dass eine Exposition von T-Lymphozyten gegenüber IL-2
zur Phosphorylierung von Signal-Transduktoren und Aktivatoren der
Transkription (STAT) Proteinen STAT1α, STAT2β und STAT3 führt, ebenso wie von zwei STAT-verwandten Proteinen,
nämlich
p94 und p95. Es wurde herausgefunden, dass die STAT-Proteine zum Kern
translozieren und an eine spezifische DNA-Sequenz binden, wodurch
ein Mechanismus nahegelegt ist, durch den IL-2 spezifische Gene
aktivieren kann, die in die Immunzellfunktion involviert sind (Frank
et al., siehe oben). Jak3 ist mit der Gammakette der IL-2, IL-4 und
IL-7 Cytokin-Rezeptoren assoziiert (Fuji et al. (1995), Proc. Natl.
Acad. Sci. 92: 5482–5486)
und (Musso et al. (1995), J. Exp. Med. 181: 1425–1431). Es wurde ebenfalls
gezeigt, dass die Jak-Kinasen durch zahlreiche Liganden aktiviert
werden, die Signale über
Cytokin-Rezeptoren weiterleiten, wie beispielsweise Wachstumshormon
und Erythropoietin und IL-6 (Kishimoto (1994), Stem cells Supp.
12: 37–44).
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Die
Signaltransduktion, die in den vorliegenden Assays nachgewiesen
werden kann, schließt
zusätzlich
zum direkten Nachweis von zweiten Messengern (beispielsweise durch
Messen von Veränderungen
der Phosphorylierung) Reporterkonstrukte oder Indikatorgene ein,
die Transkriptions-regulatorische Elemente einschließen, die
auf die STAT-Proteine responsiv sind. Dies ist unten beschrieben.
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Immunerkennungsrezeptor
mit vielfachen Untereinheiten (Multisubunit Immune Recognition Receptor
= MIRR)
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist der Rezeptor ein Multisubunit-Rezeptor. Rezeptoren können vielfache
Proteine umfassen, die als Untereinheiten bzw. Subunits bezeichnet
werden, von denen eine Kategorie, die als Multisubunit Rezeptor
bezeichnet wird, ein Multiuntereinheits-Immunerkennungsrezeptor
(MIRR) ist. MIRR schließen
Rezeptoren mit vielen nicht kovalent gebundenen Untereinheiten ein
und sind dazu in der Lage, mit src-Familien Tyrosin-Kinasen zu interagieren.
MIRR können
einschließen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, B-Zell-Antigenrezeptoren,
T-Zell-Antigenrezeptoren, Fc-Rezeptoren und CD22. Ein Beispiel für ein MIRR
ist ein Antigen-Rezeptor auf der Oberfläche einer B-Zelle. Um dies
weiter zu veranschaulichen, umfasst der MIRR auf der Oberfläche einer
B-Zelle Membran-gebundenes Immunglobulin (mig), gebunden mit den
Untereinheiten Ig-α und
Ig-β oder
Ig-γ, die
einen Komplex bilden, der zur Regulierung der B-Zell-Funktion in
der Lage ist, wenn sie durch ein Antigen gebunden sind. Ein Antigen-Rezeptor
kann funktionell an ein Amplifier bzw. Ampli fikations- bzw. Verstärkermolekül gebunden
sein, in einer Weise, dass das Verstärkermolekül zur Regulierung der Gentranskription
in der Lage ist.
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src-Familientyrosin-Kinasen
sind Enzyme, die zur Phosphorylierung von Tyrosin-Resten eines Target-Moleküls in der
Lage sind. Typischerweise enthält
eine src-Familientyrosin-Kinase
ein oder mehrere Bindungsdomänen
und eine Kinase-Domäne.
Eine Bindungsdomäne
einer src-Familientyrosin-Kinase ist dazu in der Lage, an ein Target-Molekül zu binden,
und eine Kinase-Domäne
ist dazu in der Lage, ein Zielmolekül, das an die Kinase gebunden
ist, zu phosphorylieren. Mitglieder der src-Familie der Tyrosin-Kinasen
sind durch eine N-terminale einmal vorkommende bzw. einzigartige
Region gekennzeichnet, gefolgt von drei Regionen, die unterschiedliche
Homologiegrade unter all den Elementen der Familie enthalten. Diese
drei Regionen werden als src-Homologieregion 1 (SH1), src-Homologieregion
2 (SH2) und src-Homologieregion 3 (SH3) bezeichnet. Sowohl die SH2-
als auch die SH3-Domänen
weisen angenommenerweise eine Proteinassoziationsfunktion auf, die
für die
Bildung der Signaltransduktions-Komplexe von Bedeutung ist. Die
Aminosäuresequenz
einer N-terminalen
einmal vorkommenden Region variiert zwischen jeder src-Familie Tyrosin-Kinase. Eine N-terminale einmal
vorkommende Region kann zumindest ungefähr die ersten 40 Aminosäurereste
des N-Terminus einer src-Familientyrosin-Kinase sein.
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syk-Familienkinasen
sind Enzyme, die zur Phosphorylierung von Tyrosin-Resten eines Target-Moleküls in der
Lage sind. Typischerweise enthält
eine syk-Familienkinase ein oder mehrere Bindungsdomänen und
eine Kinasedomäne.
Eine Bindungsdomäne
einer syk-Familie Tyrosin-Kinase ist dazu in der Lage, an ein Target-Molekül zu binden
und eine Kinasedomäne
ist dazu in der Lage, ein Target-Molekül, das an die Kinase gebunden
ist, zu phosphorylieren. Elemente der syk-Familie von Tyrosin-Kinasen
sind durch zwei SH2-Domänen
für die
Proteinbindungs- bzw. -assoziationsfunktion und eine Tyrosin-Kinasedomäne gekennzeichnet.
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Ein
primäres
Zielmolekül
ist dazu in der Lage, einen Signalweiterleitungsweg durch Modifizieren
eines zweiten Messenger-Moleküles
weiter zu verlängern.
Primäre
Ziel- bzw. Target-Moleküle können einschließen, sind
jedoch nicht beschränkt
auf, Phosphatidylinositol-3-kinase
(PI3K), P21rasGAPase-aktivierendes Protein und
assoziierte P190- und P62-Protein, Phospholipasen, wie beispielsweise
PLCγ1 und
PLCγ2, MAP-Kinase, Shc
und VAV. Ein primäres
Target-Molekül
ist dazu in der Lage, zweite Messenger-Moleküle zu produzieren, die dazu
in der Lage sind, ein transduziertes Signal weiter zu verstärken. Zweite
Messenger-Moleküle schließen ein,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, Diacylglycerol und Inositol 1,4,5-Triphosphat (IP3). Zweite Messenger-Moleküle sind
dazu in der Lage, physiologische Ereignisse zu initiieren, die zur
Veränderungen
in der Gentranskription führen
können.
Beispielsweise kann die Produktion von IP3 eine Freisetzung von
intrazellulärem Kalzium
zur Folge haben, was dann zur Aktivierung von Calmodulin-Kinase
II führt,
die dann zur Serinphosphorylierung eines DNA-Bindungsproteins führt, das
als ets-1-Proto-Onco-Protein bezeichnet wird. Diacylglycerol ist
dazu in der Lage, das Signaltransduktionsprotein, die Protein-Kinase
C zu aktivieren, die die Aktivität des
AP1 DNA-Bindungsproteinkomplexes beeinträchtigt. Die Signalübertragungswege
können
zur Transkriptionsaktivierung von Genen führen, wie beispielsweise c-fos,
egr-1 und c-myc.
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shc
kann man sich als Adaptermolekül
vorstellen. Ein Adaptermolekül
umfasst ein Protein, das zwei anderen Proteinen ermöglicht,
einen Komplex zu bilden (beispielsweise ein Drei-Molekül-Komplex). Das shc-Protein
ermöglicht
es, dass ein Komplex gebildet wird, der Grb2 und SOS einschließt. shc
umfasst eine SH2-Domäne,
die dazu in der Lage ist, sich mit der SH2-Domäne von Grb2 zu assoziieren.
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Moleküle eines
Signaltransduktionsweges können
miteinander unter Verwendung von Erkennungssequenzen sich binden.
Erkennungssequenzen ermöglichen
die spezifische Bindung zwischen zwei Molekülen. Erkennungssequenzen können sich
abhängig
von der Struktur der Moleküle
variieren, die miteinander binden. Ein Molekül kann ein oder mehrere Erkennungssequenzen
aufweisen und kann als solches mit ein oder mehreren unterschiedlichen
Molekülen
assoziieren.
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Signaltransduktionswege
für MIRR-Komplexe
sind dazu in der Lage, die biologischen Funktionen einer Zelle zu
regulieren. Solche Funktionen schließen ein, sind jedoch nicht
beschränkt
auf, auf die Fähigkeit einer
Zelle zu wachsen, sich zu differenzieren und zelluläre Produkte
zu sezernieren. MIRR-induzierte Signaltransduktionswege können die
biologischen Funktionen spezieller Typen von Zellen, die in spezielle
Antworten bzw. Reaktionen durch ein Tier involviert sind, regulieren,
beispielsweise Immunreaktionen, Entzündungsreaktionen und allergische
Reaktionen. Zellen, die in eine Immunreaktion involviert sind, können beispielsweise B-Zellen,
T-Zellen, Makrophagen, dendritische Zellen, natürliche Killerzellen und Plasmazellen
einschließen. Zellen,
die in entzündliche
Reaktionen eingeschlossen sind, können beispielsweise Basophile,
Mastzellen, Eosinophile, Neutrophile und Makrophagen einschließen. Zellen,
die in allergische Reaktionen involviert sind, können beispielsweise Mastzellen,
Basophile, B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen einschließen.
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In
beispielhaften Ausführungsformen
des vorliegenden Assays wird die Signaltransduktion durch Nachweisen
eines zweiten Messengers, wie beispielsweise phosphoryliertem src-artigen Protein gemessen, und
schließt
Reporterkonstrukte oder Indikatorgene ein, die Transkriptions-regulatorische
Elemente einschließen,
wie beispielsweise Serumresponselement (SRE), 12-O-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat-Reaktionselement,
zyklisches AMP-Reaktionselement,
c-fos-Promotor oder ein CREB-responsives Element.
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Kernrezeptoren
-
In
einer weiteren Ausführungsform
ist der Zielrezeptor ein Kernrezeptor. Die Kernrezeptoren können als
Liganden-abhängige
Transkriptionsfaktoren betrachtet werden. Diese Rezeptoren stellen
eine direkte Bindung zwischen den extrazellulären Signalen, hauptsächlich Hormonen
und Transkriptionsreaktionen bereit. Deren Transkriptionsaktivierungsfunktion
wird durch endogene kleine Moleküle
bzw. Small Molecules reguliert, die beispielsweise Steroidhormone,
Vitamin D, Ecdyson, Retinsäuren
bzw. Retinoidsäuren
und Schilddrüsenhormonen,
die leicht durch die Plasmamembran hindurchgehen und an ihre Rezeptoren
innerhalb der Zelle binden (Laudet und Adelmant (1995), Current
Biology 5: 124). Die Hauptzahl dieser Rezeptoren scheint drei Domänen zu enthalten:
eine variable Amino-terminale Domäne; eine hoch konservierte,
DNA-bindende Domäne
und eine moderat konservierte Carboxy-terminale Ligandenbindungs-Domäne (Power
et al. (1993), Curr. Opin. Cell Biol. 5: 499–544). Beispiele schließen die Östrogen-,
Progesteron-, Androgen-, Schilddrüsenhormon- und Mineralocorticoid-Rezeptoren
ein. Zusätzlich
zu den bekannten Steroid-Rezeptoren wurden zumindest 40 Orphan-Mitglieder
dieser Superfamilie identifiziert (Laudet et al. (1992), EMBO J.
11: 1003–1013).
Es existieren zumindest vier Gruppen von Orphan-Kernrezeptoren,
repräsentiert
durch NGF 1, FTZ-F 1 Rev-erbs und RARs, die nach evolutionären Standards
nur weitläufig
miteinander verwandt sind (Laudet et al., siehe oben). Während die
Steroidhormon-Rezeptoren ausschließlich als Homodimere an ein
Palindrom ihres Hormon-responsiven Elementes binden, binden andere
Kernrezeptoren als Heterodimere. Interessanterweise binden einige
Orphan-Rezeptoren als Monomere an ähnliche Response-Elemente und
erfordern für
ihre Funktion ein spezifisches Motiv, das in basischen Amino-Säureresten
reich ist und das Carboxy-terminal zur DNA-Bindungsdomäne angeordnet
ist (Laudet und Adelmant, siehe oben).
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In
bevorzugten Ausführungsformen
verwendet das vorliegende Assay ein Hormon-abhängiges
Reporterkonstrukt zur Selektion. Beispielsweise können Glucocortikoid-Responseelemente
(GREs) und Schilddrüsenhormon-Rezeptor
Enhancer-artige DNA-Sequenzen
(TREs) dazu verwendet werden, die Expression eines Reporterkonstruktes
in Reaktion auf Hormonbindung an Hormon-Rezeptoren zu steuern. GREs
sind Enhancer-artige DNA-Sequenzen, die eine Glucocortikoid-Ansprechbarkeit über eine
Interaktion mit dem Glucocortikoid-Rezeptor verleihen. Siehe Payvar
et al. (1983), Cell 35: 381 und Schiedereit et al. (1983) Nature
304. TREs sind GREs ähnlich,
außer
dass sie eine Schilddrüsenhormon-Ansprechbarkeit über eine
Interaktion mit Schilddrüsenhormon-Rezeptor
verleihen. Es ist bekannt, dass ein Steroid- oder Schilddrüsenhormon
Zellen durch erleichterte Diffusion eindringt und an sein spezifisches
Rezeptorprotein bindet, wodurch eine allosterische Veränderung
des Proteins beginnt. Als Folge dieser Veränderung ist der Hormon-Rezeptorkomplex
dazu in der Lage, an bestimmte spezifische Stellen auf Transkriptions-regulatorischen
Sequenzen mit hoher Affinität zu
binden.
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Viele
der primären
Effekte der Steroid- und Schilddrüsenhormone schließen eine
erhöhte
Transkription einer Untergruppe von Genen in spezifischen Zelltypen
ein. Überdies
existieren Hinweise, dass eine Aktivierung der Transkription (und
folglich der erhöhten
Expression) von Genen, die gegenüber
Steroid- und Schilddrüsenhormonen
responsiv sind (durch Interaktion von Chromatin mit Hormonrezeptor/Hormonkomplex)
durch Bindung des Komplexes an Enhancer bewirkt wird, die mit den
Genen assoziiert sind.
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Mehrere
Steroidhormon- und Schilddrüsenhormon-responsiven
Transkriptionskontrolleinheiten, von denen einige gezeigt haben,
dass sie Enhancer einschließen,
wurden identifiziert. Diese schließen den Maus-Brustdrüsen-Tumorvirus
5'-long terminal
repeat (MMTV LTR), responsiv gegenüber Glucocortikoid, Aldosteron
und Androgenhormonen ein; die transkriptionellen Kontrolleinheiten
für Säugetierwachstumshormongene,
responsiv auf Glucocortikoide, Östrogene
und Schilddrüsenhormone;
die Transkriptionskontrolleinheiten für Säugetier-Prolaktingene und Progesteron-Rezeptorgene,
responsiv gegenüber Östrogenen;
die Transkriptionskontrolleinheiten für Vogel-Ovalbumin-Gene, responsiv
gegenüber
Progesteronen; Säugetier-Metallothionein-Gentranskriptionskontrolleinheiten,
responsiv gegenüber Glucocortikoiden;
und Säugetier-Leber-alpha2u-Globulin-Gentranskriptionskontrolleinheiten,
responsiv gegenüber
Antrogenen, Östrogenen, Schilddrüsenhormonen
und Glucocortikoiden. Solche Steroidhormon- und Schilddrüsenhormon-responsiven Transkriptionskontrolleinheiten
können
dazu verwendet werden, Reporterkonstrukte oder Indikatorgene zu
erzeugen, die gegenüber
Agonisten und Antagonisten der Steroidhormon- oder Schilddrüsenhormonrezeptoren gegenüber empfindlich
sind. Siehe beispielsweise die US-Patente 5 298 429 und 5 071 773,
beide auf den Namen Evans et al. Darüber hinaus beschreibt der Stand
der Technik die funktionelle Expression solcher Rezeptoren in Hefe.
Siehe ebenfalls beispielsweise Caplan et al. (1995), J. Biol. Chem.
270: 5251–5;
und Baniahmad et al. (1995), Mol. Endokrinol. 9: 34–43.
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Rezeptortyrosin-Kinasen
-
In
einer noch weiteren Ausführungsform
ist der Zielrezeptor eine Rezeptortyrosin-Kinase. Die Rezeptortyrosin-Kinasen
können
in fünf
Untergruppen auf Grundlage struktureller Ähnlichkeiten ihrer extrazellulären Domänen und
der Organisation der Tyrosinkinase-katalytischen Region in ihren zytoplasmatischen
Domänen
unterteilt werden. Untergruppe I (epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)
Rezeptor-artig), II (Insulin-Rezeptor-artig) und die eph/eck-Familie
enthalten Cystein-reiche Sequenzen (Hirai et al. (1987), Science
238: 1717–1720
und Lindberg und Hunter (1990), Mol. Cell. Biol. 10: 6316–6324).
Die funktionellen Domänen
der Kinaseregion dieser drei Klassen von Rezeptortyrosin-Kinasen
sind als eine benachbarte Sequenz codiert (Hanks et al. (1988),
Science 141: 42–52).
Untergruppen III (Plättchen
abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) Rezeptor-artig) und IV (die
Fibroblasten-Wachstumsfaktor
(FGF) Rezeptoren) sind insofern gekennzeichnet, als sie Immunglobulin
(Ig)-artige Faltungen in ihren extrazellulären Domänen aufweisen, ebenso wie sie
Kinasedomänen
aufweisen, die in zwei Teilen aufgeteilt sind, durch einen variablen
Streckenabschnitt nicht-verwandter Aminosäuren (Yanden und Ullrich (1988),
siehe oben und Hanks et al. (1988), siehe oben).
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Die
Familie mit der mit Abstand größten Menge
bekannter Mitglieder ist die EPH-Familie. Seit der Beschreibung
des Prototyps, des EPH-Rezeptors (Hirai et al. (1987), Science 238:
1717–1730)
wurde von Sequenzen für
zumindest 10 Mitglieder dieser Familie berichtet, wobei offensichtlich
autologe Rezeptoren nicht mitgezählt
wurden, die in mehr als einer Spezies zu finden sind. Zusätzliche
Teilsequenzen und die Geschwindigkeit, in der neue Mitglieder nach
wie vor berichtet werden, legt nahe, dass diese Familie noch größer ist (Maisonpierre
et al. (1993), Oncogene 8: 3277–3288;
Andres et al. (1994), Oncogene 9: 1461–1467; Henkemeyer et al. (1994),
Oncogene 9: 1001–1014;
Ruiz et al. (1994), Mech. Dev. 46: 87–100; Xu et al. (1994), Development
120: 287–299;
Zhou et al. (1994), J. Neurosci. Res. 37: 129–143; und Referenzen in Tuzi
und Gullick (1994), Br. J. Cancer 69: 417–421). Bemerkenswerterweise
wurden trotz der großen
Anzahl der Elemente in der EPH-Familie all diese Moleküle als Orphan-Rezeptoren
ohne bekannte Liganden identifiziert.
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Die
Expressionsmuster, die für
einige der EPH-Familienrezeptoren bestimmt wurden, weisen darauf hin,
dass für
diese Moleküle
in der frühen
Vertebraten-Entwicklung eine bedeutende Rolle besteht. Insbesondere
die Zeitgebung und die Muster der Expression von sek, mek4 und einigen
der anderen Rezeptoren während
der Phase der Gastrulation und der frühen Organogenese haben Funktionen
für diese
Rezeptoren in den bedeutenden zellulären Interaktionen nahegelegt,
die in der Ausbildung des Embryos in diesem Stadium involviert sind
(Gilardi-Hebenstreit
et al. (1992), Oncogene 7: 2499–2506;
Nieto et al. (1992), Development 116: 1137–1150; Henkemeyer et al., siehe
oben, Ruiz et al.; siehe oben; und Xu et al., siehe oben). sek,
beispielsweise, zeigt eine bemerkenswert frühe Expression in den beiden
Arealen des Maus-Embryos, die eine offensichtliche Segmentierung
zeigen, nämlich
die Somiten im Mesoderm und die Rhombomeren des Rautenhirns; daher
der Name sek, für
segmental exprimierte Kinase (Gilardi-Hebenstreit et al., siehe
oben; Nieto et al., siehe oben). Wie bei Drosophila wurden diese
segmentalen Strukturen des Säugetier-Embryos
als bedeutende Elemente bei der Etablierung des Körperplanes
in Zusammenhang gebracht. Die Beobachtung, dass die sek-Expression
dem Auftreten morphologischer Segmentierung vorangeht, legt eine
Rolle für
sek bei der Bildung dieser segmentalen Strukturen oder bei der Bestimmung
Segment-spezifischer Zelleigenschaften, wie beispielsweise der Zelllinien-Kompartimentierung
(Nieto et al., siehe oben), nahe. Überdies wurden EPH-Rezeptoren
durch ihr Expressionsmuster mit der Entwicklung und Aufrechterhaltung
nahezu jeden Gewebes im embryonalen und adulten Körper in
Zusammenhang gebracht. Beispielsweise wurden EPH-Rezeptoren im gesamten
Nervensystem nachgewiesen, den Testes, dem knorpeligen Modell des
Skeletts, dem Zahn-Primordia, dem infundibularen Bestandteil der
Hirnanhangsdrüse,
verschiedenen Epithelgeweben, Lungen-, Pankreas-, Leber- und Nierengeweben.
Beobachtungen wie beispielsweise diese, haben auf bedeutende und
einzigartige Rollen für
die Kinasen der EPH-Familie
in der Entwicklung und Physiologie hingewiesen, jedoch wurde ein
weiterer Fort schritt beim Verständnis
ihrer Wirkung ernsthaft durch das Fehlen von Information bezüglich ihrer Liganden
beschränkt.
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Wie
hierin verwendet, betrifft der Begriff „EPH-Rezeptor" oder „EPH-artiger
Rezeptor" eine Klasse
von Rezeptortyrosin-Kinasen, die zumindest 11 paraloge Gene umfassen,
obwohl viel mehr Orthologe innerhalb dieser Klasse existieren, beispielsweise
Homologe von unterschiedlichen Spezies. EPH-Rezeptoren sind im Allgemeinen
eine diskrete Gruppe von Rezeptoren, die durch Homologie verwandt
sind und einfach erkennbar sind, sie sind beispielsweise typischerweise
durch eine extrazelluläre
Domäne
gekennzeichnet, die eine charakteristische Beabstandung von Cystein-Resten
nahe dem N-Terminus und zwei Fibronectin-TypIII-Repeats enthalten (Hirai et al. (1987),
Science 238: 1717–1720;
Lindberg et al. (1990), Mol. Cell. Biol. 10: 6316–6324; Chan
et al. (1991), Oncogene 6: 1057–1061;
Maisonpierre et al. (1993), Oncogene 8: 3277–3288; Andres et al. (1994),
Oncogene 9: 1461–1467;
Henkemeyer et al. (1994), Oncogene 9: 1001–1014; Ruiz et al. (1994), Mech.
Dev. 46: 87–100;
Xu et al. (1994), Development 120: 287–299; Zhou et al. (1994), J.
Neurosci. Res. 37: 129–143;
und Referenzen in Tuzi und Gullick (1994), Br. J. Cancer 69: 417–421). Beispielhafte
EPH-Rezeptoren schließen die
eph, elk, eck, sek, mek4, hek, hek2, eek, erk, tyroI, tyro4, tyro5,
tyro 6, tyro11, cek4, cek5, cek6, cek7, cek8, cek9, cek10, bsk,
rtk1, rtk2, rtk3, myk1, myk2, ehk1, ehk2, pagliaccio, htk, erk und
nuk-Rezeptoren ein. Der Begriff „EPH-Rezeptor" betrifft die Membranform
des Rezeptorproteins ebenso wie lösliche extrazelluläre Fragmente,
die die Fähigkeit
beibehalten, den Liganden der vorliegenden Erfindung zu binden.
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In
beispielhaften Ausführungsformen
wird das Nachweissignal durch Nachweisen einer Phosphorylierung
von intrazellulären
Proteinen bereitgestellt, beispielsweise MEKKs, MEKs oder Map-Kinasen
oder durch Verwendung von Reporterkonstrukten oder Indikatorgenen,
die Transkriptions-regulatorische Elemente einschließen, die
auf c-fos und/oder c-jun ansprechen. Unten beschrieben.
-
G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren
-
Eine
Familie der Signaltransduktionkaskaden, die in eukaryontischen Zellen
zu finden sind, verwendet heterotrimäre „G-Proteine". Viele unterschiedliche
G-Proteine interagieren bekannterweise mit Rezeptoren. G-Protein-Signalgebungssysteme
schließen
drei Bestandteile ein: den Rezeptor selbst, ein GTP-Bindungsprotein
(G-Protein) und ein intrazelluläres
Target- Protein.
Die Zellmembran dient als Schalttafel. Botschaften, die durch unterschiedliche
Rezeptoren eintreffen, können
eine einzige Wirkung erzeugen, wenn die Rezeptoren auf denselben
Typ von G-Protein einwirken. Andererseits können Signale, die einen einzigen
Rezeptor aktivieren, mehr als eine Wirkung erzeugen, wenn der Rezeptor
auf unterschiedliche Arten von G-Proteinen einwirkt, oder wenn die
G-Proteine auf unterschiedliche Effektoren einwirken können.
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In
ihrem Ruhezustand sind die G-Komplexe, die aus Alpha(α)-, Beta(β)- und Gamma(γ)-Untereinheiten bestehen,
mit dem Nukleotid Guanosin-diphosphat (DGP) komplexiert und sind
mit Rezeptoren in Kontakt. Wenn ein Hormon oder ein anderer erster
Messenger an den Rezeptor bindet, verändert sich die Rezeptorkonformation
und dies verändert
seine Interaktion mit dem G-Protein. Dies veranlasst die α-Untereinheit
GDP freizusetzen und das häufiger
vorkommende Nukleotid Guanosin-triphosphat (GTP) ersetzt es, unter
Aktivierung des G-Proteins.
Das G-Protein dissoziiert dann und teilt die Alpha-Untereinheit
ab, von den noch komplexierten β-
und γ-Untereinheiten.
Entweder die Gα-Untereinheit
oder der Gβγ-Komplex interagiert
abhängig vom
Weg mit einem Effektor. Der Effektor (der oftmals ein Enzym ist)
konvertiert wiederum ein inaktives Vorläufermolekül in einen aktiven „Second-Messenger", der durch das Zytoplasma
diffundieren kann, und eine metabolische Kaskade auslöst. Nach
wenigen Sekunden wandelt das Gα GTP
zu GDP um, wodurch es selbst inaktiviert wird. Das inaktivierte
Gα kann
sich dann mit dem Gβγ-Komplex
reassoziierten.
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Hunderte,
wenn nicht tausende Rezeptoren wandeln Botschaften durch heterotrimere
G-Proteine um, von
denen zumindest 17 getrennte Formen isoliert wurden. Obwohl die
größte Variabilität in der α-Untereinheit zu
sehen ist, wurde von mehreren unterschiedlichen β- und γ-Strukturen berichtet. Es existieren
zusätzlich mehrere
unterschiedliche G-Protein-abhängige
Effektoren.
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Die
meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren umfassen eine einzige Proteinkette,
die um die Plasmamembran sieben Mal herumgewickelt ist. Solche Rezeptoren
werden oftmals als Sieben-Transmembran-Rezeptoren (STRs) bezeichnet.
Mehr als hundert unterschiedliche STRs wurden gefunden, einschließlich vieler
verschiedener Rezeptoren, die denselben Liganden binden, und es
existieren wahrscheinlich viel mehr STRs, die auf ihre Entdeckung
warten.
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Zusätzlich wurden
STRs identifiziert, für
die natürliche
Liganden unbekannt sind; diese Rezeptoren werden „Orphan"-G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren genannt, wie oben beschrieben. Beispiele schließen Rezeptoren
ein, die von Neote et al. (1993), Cell 72, 415, Kouba et al., FEBS
Lett. (1993), 321, 173; Birkenbach et al. (1993) J. Virol. 67, 2209,
kloniert wurden.
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Die „exogenen
Rezeptoren" der
vorliegenden Erfindung können
irgendein G-Protein-gekoppelter
Rezeptor sein, vorzugsweise für
die Zelle exogen, die gentechnisch verändert werden soll, für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung. Dieser Rezeptor kann ein Pflanzen- oder Tierzell-Rezeptor
sein. Ein Screening zur Bindung an Pflanzenzell-Rezeptoren kann
bei der Entwicklung von beispielsweise Herbiziden von Nutzen sein. Im
Falle eines Tierrezeptors kann dieser einen Ursprung von Wirbellosen
oder Wirbeltieren aufweisen. Als Wirbellosen-Rezeptor wird ein Insektenrezeptor bevorzugt
und würde
die Entwicklung von Insektiziden erleichtern. Der Rezeptor kann
ebenfalls ein Vertebraten, insbesondere ein Säugetier, noch mehr bevorzugt
ein menschlicher Rezeptor sein. Der exogene Rezeptor ist ebenfalls
vorzugsweise ein Sieben-Transmembran-Segmentrezeptor.
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Bekannte
Liganden für
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren schließen ein: Purine und Nukleotide,
beispielsweise Adenosin, cAMP, ATP, UTP, ADP, Melatonin und dergleichen;
biogene Amine (und verwandte natürliche
Liganden), beispielsweise 5-Hydroxy-tryptamin, Acetylcholin, Dopamin,
Adrenalin, Histamin, Noradrenalin, Tyramin/Octopamin und andere
verwandte Verbindungen; Peptide, beispielsweise adrenocorticotrophe Hormone
(acth), Melanozyten-stimulierendes Hormon (MFH); Melanocortine,
Neurotensine (nt), Bombesin und verwandte Peptide, Endotheline,
Cholecystokinin, Gastrin, Neurokinin b (nk3), Invertebraten-Tachykinin-artige
Peptide, Substanz k (nk2), Substanz p (nk1), Neuropeptid y (npy),
Thyrotropin-freisetzender Faktor (trf), Bradykinin, Angiontensin
ii, Beta-Endorphin, c5a Anaphalatoxin, Calcitonin, Chemokine (ebenfalls
als Intercrine bezeichnet), corticotropher Freisetzungsfaktor (crf),
Dynorphin, Endorphin, fmlp und andere formylierte Peptide, Follitropin
(fsh), Pilzpaarungspheromone, Glaanin, gastrischer inhibitorischer
Polypeptidrezeptor (gip), gGlucagon-artige Peptide (glps), Glucagon,
Gonadotropin-freisetzendes Hormon (gnrh), Wachstumshormon-Freisetzungshormon
(ghrh), Insekten-diuretisches Hormon, Interleukin-8, Leutropin (lh/hcg),
Met-enkephalin, Opioid-Peptid, Oxytocin, Parathyroidhormon (pth)
und pthrp, Hirnanhangsdrüsen-Adenylylcyclase-aktivierendes
Peptid (pacap), Secretin, Somatostatin, Thrombin, Thyrotropin (tsh),
vasoaktives intestinales Peptid (vip), Vasopressin, Vasotocin; Eicosanoide
wie beispielsweise ip-Prostacyclin, pg-Prostaglandine, tx- Thromboxane; retinal-basierte
Verbindungen, beispielsweise Vertebraten 11-cis-Retinal, Wirbellosen 11-cis-Retinal
und andere verwandte Verbindungen; Lipide und Lipid-basierte Verbindungen,
wie beispielsweise Cannabinoide, Anandamid, Lysophosphatidinsäure, Blutplättchen-Aktivierungsfaktor,
Leukotriene und dergleichen; exzitatorische Aminosäuren und
Ionen wie beispielsweise Kalziumionen und Glutamat.
-
Beispiele
für G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, dopaminerge, muskarincholinerge, a-adrenerge, b-adrenerge,
Opioid (einschließlich
delta und mü),
Cannabinoid, serotoninerge und GABAerge-Rezeptoren. Bevorzugte Rezeptoren
schließen
die Rezeptoren der 5HT-Familie, der Dopamin-Rezeptoren, der C5a-Rezeptor
und FPRL-1-Rezeptor, Cyclohistidyl-prolin-diketopiperazin-Rezeptoren,
Melanocyten-stimulierendes
Hormon Freisetzungs-hemmender-Faktor-Rezeptor und Rezeptoren für Neurotensin,
Thyrotropin-Freisetzungshormon, Calcitonin, Cholecytokinin-A, Neurokinin-2,
Histamin-3, Cannabinoid, Melanocortin oder Adrenomodulin, Neuropeptid-Y1
oder Galanin ein. Weitere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs)
sind in der Technik aufgelistet. Der Begriff „Rezeptor" wie hierin verwendet, umfasst sowohl
natürlich
vorkommende als auch mutierte Rezeptoren.
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Viele
dieser G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, wie der Hefe a- und α-Faktor-Rezeptor,
enthalten sieben hydrophobe Aminosäure-reiche Regionen, von denen
angenommen wird, dass sie innerhalb der Plasmamembran liegen. Spezifische
humane G-Protein-gekoppelte STRs, für die Gene isoliert wurden
und für
die Expressionsvektoren konstruiert werden könnten, schließen solche
ein, die hierin aufgelistet sind, und andere, die in der Technik
bekannt sind. Somit würde
das Gen operabel an einen Promotor gebunden sein, der funktionell
in der Zelle ist, die gentechnisch verändert werden soll, und an eine
Signalsequenz, die ebenfalls in der Zelle funktioniert. Beispielsweise
schließen
im Falle der Hefe geeignete Promotoren Ste2, Ste3 und gal10 ein. Geeignete
Signalsequenzen schließen
solche von Ste2, Ste3 und von anderen Genen ein, die Proteine codieren,
die von Hefezellen sezerniert werden. Vorzugsweise, wenn eine Hefezelle
verwendet wird, würden
die Codone des Gens für
die Expression in der Hefe optimiert werden. Siehe Hoekema et al.
(1987), Mol. Cell. Biol. 7: 2914–24; Sharp et al. (1986), 14:
5125–43.
-
Die
Homologie von STRs ist in Dohlman et al., Ann. Rev. Biochem. (1991),
60: 653–88,
diskutiert. Wenn STRs verglichen werden, ist ein getrenntes Raummuster
der Homologie er kennbar. Die Transmembrandomänen sind oftmals am Ähnlichsten,
wohingegen die N- und C-terminalen Regionen und die zytoplasmatische
Loop-verbindenden Transmembransegmente V und VI verschiedener sind.
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Die
funktionelle Signifikanz unterschiedlicher STR-Regionen wurde durch
Einbringung von Punktmutationen (sowohl Substitutionen als auch
Deletionen) studiert und durch Konstruieren von Chimären von
unterschiedlichen, jedoch verwandten STRs. Synthetische Peptide,
die individuellen Segmenten entsprechen, wurden auf ihre Aktivität getestet.
Eine Affinitätsmarkierung
wurde dazu verwendet, Ligandenbindungsstellen zu identifizieren.
-
In
bestimmten Ausführungsformen
kann der G-Protein-gekoppelte Rezeptor, wenn der Wildtyp exogene
G-Protein-gekoppelte Rezeptor nicht in Hefe funktionell gemacht
werden kann, für
diesen Zweck mutiert werden. Ein Vergleich würde bezüglich der Aminosäuresequenzen
des exogenen Rezeptors und des Heferezeptors durchgeführt werden
und Regionen mit hoher und niedriger Homologie würden identifiziert werden. Versuchsmutationen
würden
dann durchgeführt
werden, um Regionen zu unterscheiden, die in die Liganden oder G-Protein-Bindung involviert
sind, um sie von solchen zu unterscheiden, die für die funktionelle Integration
in die Membran notwendig sind. Der exogene Rezeptor würde dann
in der letzteren Region mutiert werden, um dem Heferezeptor mehr
zu ähneln,
bis eine funktionelle Integration erreicht wurde. Wenn das nicht
ausreichend war, um eine Funktionalität zu erreichen, würden Mutationen
als nächstes
in den Regionen durchgeführt werden,
die in die G-Protein-Bindung
involviert sind. Mutationen würden
in Regionen durchgeführt
werden, die in die Ligandenbindung Involviert sind, jedoch nur als
letzte Ausflucht, und danach würden
Bemühungen
erfolgen, die Ligandenbindung durch Herstellen konservativer Substitutionen
zu erhalten, wenn immer dies möglich ist.
Beispielsweise könnte
der V-VI-Loop eines heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptors
durch denjenigen des Hefe-STE2- oder -STE3-Rezeptors ersetzt werden).
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In
einer noch weiteren Ausführungsform
kann ein kompatibles G-Protein bereitgestellt werden. Ein kompatibles
G-Protein zur Verwendung in den vorliegenden Assays kann eine heterologe
oder chimäre
G-Protein-Untereinheit (oder Untereinheiten) einschließen, wie
beispielsweise solche, die in der Technik beschrieben sind (siehe
beispielsweise PCT/US94/03143) und ist ausführlicher unten diskutiert.
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Vorzugsweise
wird das Hefe Genom so modifiziert, dass es nicht mehr dazu in der
Lage ist, die Heferezeptoren zu produzieren, die mit den exogenen
Rezeptoren in ihrer funktionellen Form homolog sind.
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A. Chemoattractant-Rezeptoren
-
Ein
beispielhaftes GPCR ist der N-Formylpeptid-Rezeptor, ein klassisches
Beispiel für
einen Kalzium-mobilisierenden GPCR, der durch Neutrophile exprimiert
wird und durch andere Phagozytenzellen des Säugetierimmunsystems (Snyderman
et al. (1988) in Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, Seiten
309–323).
N-Formylpeptide von bakteriellem Ursprung binden an den Rezeptor
und schalten ein Komplexaktivierungsprogramm ein, das eine direkte
Zellbewegung, die Freisetzung inflammatorischer Granula-Inhalte
und die Aktivierung einer latenten NADPH-Oxidase, die für die Produktion
von Metaboliten molekularen Sauerstoffs von Bedeutung ist, zur Folge
hat. Der Weg, der durch die Rezeptor-Liganden-Interaktion begonnen wird, ist im Schutz
des Wirtes vor pyogenen Infektionen entscheidend. Eine ähnliche
Signaltransduktion tritt in Reaktion auf die inflammatorischen Peptide
C5a und IL-8 auf.
-
Zwei
weitere Formylpeptid-Rezeptor-artige (FPRL) Gene wurden auf Grundlage
ihrer Fähigkeit
kloniert, an ein Fragment der NFPR-cDNA-Codierungssequenz zu hybridisieren.
Diese wurden FPRL1 (Murphy et al. (1992), J. Biol. Chem., 267: 7637–7643) und
FPRL2 (Ye et al. (1992), Biochem. Biophys. Res. Comm., 184: 582–589), genannt.
Es wurde herausgefunden, dass FPRL2 die Kalziummobilisierung in
Maus-Fibroblasten vermittelt, die mit dem transfiziert und gegenüber Formyl-Peptid
exponiert wurden. Im Gegensatz band der Prototyp N-Formylpeptid-Liganden,
wenn sie in heterologen Zelltypen exprimiert wurden nicht, obwohl
FPRL1 sich als 69% identisch in seiner Aminosäuresequenz mit NFPR herausgestellt
hat. Dies führt
zur Hypothese der Existenz eines bis jetzt nicht identifizierten
Liganden für
den FPRL1-Orphan-Rezeptor (Murphy et al., siehe oben).
-
B. G-Proteine
-
Im
Falle eines exogenen G-Protein-gekoppelten Rezeptors muss die Hefezelle
dazu in der Lage sein, ein G-Protein zu produzieren, das durch den
exogenen Rezeptor aktiviert wird, und das wiederum den Hefe-Effektor(en)
aktivieren kann. Die Technik schlägt vor, dass die endo gene Hefe
Gα-Untereinheit
(beispielsweise GPA) oftmals mit den „bekannten" Gα-Untereinheiten ausreichend
homolog ist, die nativ mit dem exogenen Rezeptor assoziiert ist,
damit eine Kopplung auftritt. Es wird wahrscheinlicher notwendig
sein, die Hefezelle gentechnisch zu verändern, um eine fremde Gα-Untereinheit
zu produzieren, die in geeigneter Weise mit dem exogenen Rezeptor
interagieren kann. Beispielsweise kann die Gα-Untereinheit des Hefe G-Proteins durch
die Gα-Einheit
ersetzt werden, die nativ mit dem exogenen Rezeptor assoziiert ist.
-
Dietzel
und Kurjan (1987), Cell, 50: 1001) demonstrierten, dass Ratten-Gas
funktionell an den Hefe Gβγ-Komplex
koppelte. Jedoch komplementierte Ratten-Gαi2 nur, wenn es beträchtlich überexprimiert
wurde, wohingegen Gα0 überhaupt
nicht komplementierte. Kang et al., Mol. Cell. Biol. (1990), 10:
2582). Folglich ist es mit einigen fremden Gα-Untereinheiten nicht möglich, das
Hefe Gα einfach
zu ersetzen.
-
Wenn
der exogene G-Protein-gekoppelte Rezeptor nicht adäquat an
Hefe Gβγ durch die
Gα-Untereinheit gekoppelt
ist, die nativ mit dem Rezeptor assoziiert ist, kann die Gα-Untereinheit modifiziert
werden, um die Kopplung zu verbessern. Diese Modifikationen nehmen
oftmals die Form von Mutationen ein, die die Ähnlichkeit der Gα-Untereinheit
mit der Hefe Gα erhöhen, während die Ähnlichkeit
mit der Rezeptor-assoziierten Gα gesenkt
wird. Beispielsweise kann ein Rest so verändert werden, dass er mit dem
entsprechenden Hefe Gα-Rest
identisch wird oder zumindest zur selben Austauschgruppe dieses
Restes gehört.
Nach der Modifikation kann die modifizierte Gα-Untereinheit „im Wesentlichen
homolog" mit der
fremden und/oder Hefe Gα-Untereinheit
sein.
-
Die
Modifikationen werden vorzugsweise in Regionen des Gα konzentriert,
die wahrscheinlich in die Gβγ-Bindung
involviert sind. In einigen Ausführungsformen
werden die Modifikationen die Form des Ersetzens eines oder mehrere
Segmente des Rezeptor-assoziierten Gα mit dem entsprechenden Hefe
Gα-Segment(en) einnehmen,
wodurch eine chimäre
Gα-Untereinheit gebildet
wird. In anderen Ausführungsformen
können Punktmutationen
ausreichend sein.
-
Diese
chimäre
Gα-Untereinheit
wird mit dem exogenen Rezeptor und dem Hefe Gβγ-Komplex interagieren, wodurch eine Signaltransduktion
ermöglicht
wird. Während
die Ver wendung der endogenen Hefe-βγ bevorzugt wird, kann, wenn
eine fremde oder chimäre
Gβγ dazu in
der Lage ist, das Signal zum Hefeeffektor zu transduzieren, dieses
stattdessen verwendet werden.
-
C. Gα-Struktur
-
Einige
Aspekte der Gα-Struktur
sind für
das Design modifizierter Gα-Untereinheiten
relevant. Die Amino-terminalen 66 Reste von GPA1 werden mit den
bekannten Domänen
von humanen Gαs,
Gαi2, Gαi3, Gα16 und Transducin
ausgerichtet. In den GPA41-Gα-Hybriden
sind die Amino-terminalen 41 Reste (abgeleitet von GPA1) identisch,
enden mit der Sequenz LEKQRDKNE und sind zur Hervorhebung unterstrichen.
Alle Reste, die dem Glutamat (E)-Rest
an Position 41 folgen, werden den humanen Gα-Untereinheiten zugerechnet,
einschließlich
des Konsensusnukleotid-Bindungsmotivs -GxGxxG-. Perioden in den
Sequenzen zeigen Lücken an,
die zum Maximieren der Alignments in dieser Region eingebracht wurden.
Der Codon-Bias ist Säugetier. Für Alignments
der gesamten codierenden Regionen von GPA mit Gas, Gai und GαO, Gαq und Gαz siehe Dietzel
und Kurjan (1987), Cell 50: 573) und Lambright et al. (1994), Nature
369: 621–628).
Zusätzliche
Sequenzinformation wird durch Mattera et al. (1986), FEBS Lett.
206: 36–41),
Bray et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83K 8893–8897) und
Bray et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5115–5119),
bereitgestellt.
-
Das
Gen, das ein G-Protein-Homolog von S. cerevisiae codiert, wurde
unabhängig
von Dietzel und Kurjan (siehe oben) (SCG1) und von Nakafuku et al.
(1987), Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2140–2144) (GPA1), kloniert. Eine
Sequenzanalyse zeigte einen hohen Homologiegrad zwischen dem Protein,
das durch dieses Gen und von Säugetier-Gα codiert
wurde. GPA1 codiert ein Protein von 472 Aminosäuren im Vergleich mit ungefähr 340 bis
350 Aminosäuren
für die
meisten Säugetier-Gα-Untereinheiten
in vier beschriebenen Familien, nämlich Gas, Gαi, Gαq und Gα12/13. Nichts
desto weniger teilt GPA1 seine Gesamtsequenz und strukturelle Homologie
mit allen Gα-Proteinen,
die bis heute identifiziert wurden. Die höchste Gesamthomolgie in GPA1 besteht
zur Gai-Familie (48% Identität
oder 65% mit konservativen Substitutionen) und die niedrigste mit
GQS (33% Identität
oder 51% mit konservativen Substitutionen) (Nakafuku et al., siehe
oben).
-
Die
Regionen mit einer hohen Sequenzhomologie unter den Gα-Untereinheiten
sind in ihrer gesamten primären
Sequenz verteilt, wobei die Regionen des höchsten Homologiegrades an die
Sequenz kartieren, die die Guanin-Nukleotidbindungs/GTPase-Domäne umfasst.
Diese Domäne
ist strukturell der αβ-Faltung
der ras-Proteine ähnlich
und dem Proteinsynthese-Elongationsfaktor
EF-Tu. Diese hoch konservierte Guanin-Nukleotid-Bindungsdomäne besteht
aus sechssträngingem β-Blatt, umgeben
von einem Satz von fünf α-Helices. Es
liegt innerhalb dieser β-Faltblätter und β-Helices,
dass der höchste
Grad an Konservierung zwischen allen Gα-Proteinen, einschließlich GPA1,
beobachtet wird. Die geringste Sequenz- und Strukturhomologie ist
innerhalb des dazwischenliegenden Loops zwischen den β-Faltblättern und α-Helices
zu finden, die die Kern-GTPase-Domäne definieren. Es existieren
insgesamt vier „dazwischenliegende
Loops" oder „Inserte", die in allen Gα-Untereinheiten
vorliegen. In den Kristallstrukturen, von denen bis heute für die GDP-
und GTPγS-ligandierten
Formen von Rinderstab-Translucin berichtet wurde (Noel et al. (1993),
Nature 366: 654–663);
(Lambright et al. (1994), Nature 369: 621–628), sind Loop-Reste außerhalb
der Kern-GTPase-Struktur zu finden. Funktionelle Rollen für diese
Loop-Strukturen wurden in nur einigen Fällen etabliert. Eine direkte
Rolle bei der Kopplung an Phosphodiesterase-γ wurde für Reste innerhalb der Inserte
3 und 4 von Gαt
demonstriert (Rarick et al. (1992), Science 256: 1031–1033);
(Artemyev et al. (1992), J. Biol. Chem. 267: 25067–25072),
wohingegen eine „GAP-artige" Aktivität dem großen α-helikalen
Insert-1-Domänen
von GαS
(Markby et al. (1993), Science 262: 1805–1901), zugeschrieben wurde.
-
Während die
Amino- und Carboxy-Termini der Gα-Untereinheiten
keine auffällige
Homologie entweder auf der primären,
sekundären
oder tertiären
Ebene teilen, existieren mehrere Verallgemeinerungen, die über diese
vorgenommen werden können.
Zunächst
wurden die Amino-Termini der Gα-Untereinheiten
in den Zusammenbau der Gα-
mit Gβγ-Komplexe
in Verbindung gebracht und mit der Membranassoziation über N-terminale
Myristoylierung. Zusätzlich
wurden die Carboxytermini mit der Assoziation von Gαβγ-heterotrimären Komplexen
mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Verbindung gebracht (Sullivan
et al. (1987), Nature 330: 758–760);
West et al. (1985), J. Biol. Chem. 260: 14428–14430); (Conklin et al. (1993),
Nature 363: 274–276); (Kallal
und Kurjan (1997), Mol. Cell. Biol. 17: 2897). Daten zur Unterstützung dieser
Verallgemeinerungen über die
Funktion des N-Terminus stammen aus verschiedenen Quellen, einschließlich sowohl
biochemischer als auch genetischer Studien.
-
1 zeigt
die Amino-terminalen 66 Reste von GPA1 aligned mit den verwandten
Domänen
von humanem Gαs,
Gαi2, Gαi3, Gα16 und Translucin.
In den GPA41-Gα-Hybriden
sind die Amino-terminalen 41 Reste (abgeleitet von GPA1) identisch,
enden mit der Sequenz -LEKQRDKNE- (SEQ ID NO: 47). Alle Reste folgend
dem Glutamat (E)-Rest an Position 41 werden den humanen Gα-Untereinheiten
zugeschrieben, einschließlich
des Konsensusnukleotid-Bindungsmotivs, das in der Aminosäuresequenz
-GxGxxG- dargestellt ist. Perioden in den Sequenzen zeigen Lücken an,
die zur Maximierung der Alignments in dieser Region eingebracht
wurden. Der Codon-Bias ist Säugetier.
Für Alignments
der gesamten codierenden Regionen von GPA1 mit Gαs, Gαi und GαO, Gαq und Gαz siehe Dietzel und Kurjan (1987),
Cell 50: 573) und Lambright et al. (1994), Nature 369: 621–628. Zusätzliche
Sequenzinformationen werden von Mattera et al. (1986), FEBS Lett.
206: 36–41,
Bray et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8893–8897 und
Bray et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5115–5119, bereitgestellt.
-
In
weiteren biochemischen Studien, die die Überprüfung der Rolle des Amino-Terminus
von Gα bei
der Steuerung der Assoziation zwischen Gα und Gβγ-Untereinheiten zum Ziel hatte,
wurden proteolytische oder genetisch trunkierte Versionen der Gα-Untereinheiten
bezüglich
ihrer Fähigkeit
untersucht, mit Gβγ-Komplexen
zu assoziieren, Guaninnukleotide zu binden und/oder Effektormoleküle zu aktivieren.
In allen Fällen
waren die Gα-Untereinheiten
mit trunkierten Amino-Termini in allen drei Funktionen defizient
(Graf et al. (1992), J. Biol. Chem. 267: 24307–24314); (Journot et al. (1990),
J. Biol. Chem. 265: 9009–9015);
und (Neer et al. (1988), J. Biol. Chem. 263: 8996–9000).
Slepak et al. (1993, J. Biol. Chem. 268: 1414–1423) berichteten von einer
Mutationsanalyse der N-terminalen 56 Aminosäuren von Säugetier-Gαo, exprimiert in Escherichia
coli. Moleküle mit
einer apparent reduzierten Fähigkeit,
mit exogen zugesetzten Säugetier-Gβγ zu interagieren,
wurden in der mutierten Bibliothek identifiziert. Wie die Autoren
dargelegt haben, war der zum Screenen der Mutanten verwendete Assay
des Ausmaßes
der ADP-Ribosylierung des mutierten Gα durch Pertussis-Toxin keine
vollständig
zufriedenstellende Probe der Interaktionen zwischen Gα und Gβγ. Mutationen,
die als die Interaktion der Untereinheiten hemmend identifiziert
wurden, können
unter Verwendung dieses Assays nach wie vor die Komplexierung von
Gα und Gβγ ermöglichen,
während
die Ribosylierung von Gα durch
ein Toxin sterisch gehindert wird. Genetische Studien, die die Rolle
der Amino-terminalen Determinanten von Gα in der heterotrimeren- Unterheitsassoziation überprüften, wurden
sowohl in Hefesystemen unter Verwendung von GPA1-Säugetier-Gα-Hybriden
(Kang et al. (1990), Mol. Cell. Biol. 10: 2582–2590) als auch in Säugetiersystemen
unter Verwendung von Gαi/Gαs-Hybriden
(Russell und Johnson (1993), Mol. Pharmacol. 44: 255–263) durchgeführt. In den
letzteren Studien wurden Genfusionen zusammengesetzt aus Hefe GPA1
und Säugetier-Gα-Sequenzen von
Kang et al. (siehe oben) konstruiert und bezüglich ihrer Fähigkeit
untersucht, einen GPA1-Null-Phänotyp in
S. cerevisiae zu komplementieren (d. h. eine konstitutive Aktivierung
des Pheromon-Reaktionsweges).
Kang et al. zeigten, dass Wildtyp-Säugetier-Gαs, Gαi, jedoch nicht Gα0-Proteine dazu in
der Lage sind, mit Hefe Gα zu
assoziieren und den GPAI-Null-Phänotyp
unterdrücken,
jedoch nur, wenn sie überexprimiert
werden. Fusionsproteine, die die Aminoterminalen 330 Reste der GPA1-Sequenz,
gebunden an 160, 143 oder 142 Reste der Säugetier-Gαs, Gαi und Gαo-Carboxyl-terminalen Regionen
jeweils enthalten, werden an den Hefepaarungsreaktionsweg gekoppelt,
wenn sie auf High-Copy-Plasmiden mit stark induzierbaren (CUP) oder
konstitutiven (PGK) Promotoren überexprimiert
werden. Alle drei dieser Hybridmoleküle waren dazu in der Lage,
die GPA1-Null-Mutation in einem Wachstumsstopassay zu komplementieren
und waren zusätzlich
dazu in der Lag, die α-Faktor-Responsivität und die
Paarung der Teststämme
zu hemmen. Diese letzten beiden Beobachtungen argumentieren, dass
Hybridhefe-Säugetier-Gα-Untereinheiten
dazu in der Lage sind, direkt mit Hefe Gβγ zu interagieren, wodurch die
normale Funktion des Hefeheterotrimers unterbrochen wird. Fusionen,
die die Amino-terminale Domäne
von Gαs,
Gαi oder
Gαo enthalten,
komplementierten den GPAI-Null-Phänotyp nicht, was auf ein Erfordernis
nach Determinanten in den Amino-terminalen 330 Aminosäureresten
von GPA1 zur Assoziation und Sequestration von Hefe Gβγ-Komplexen
hinweist. Zusammen genommen legen diese Daten nahe, dass die Terminanden
in der Amino-terminalen Region von Gα-Untereinheiten nicht nur die
Fähigkeit zur
Assoziierung mit Gβγ-Untereinheiten
im Allgemeinen determinieren, sondern ebenfalls mit spezifischen Gβγ-Unterheiten
in einer Spezies-beschränkten
Art und Weise.
-
Hybrid-Gαi/Gαs-Untereinheiten
wurden in Säugetier-Expressionssystemen
untersucht (Russell und Johnson (siehe oben)). In diesen Studien
wurde eine große
Anzahl chimärer
Gα-Untereinheiten bezüglich einer
Fähigkeit
zur Aktivierung von Adenylylcyclase untersucht und deswegen, indirekt,
auf ein Vermögen,
mit Gβγ zu interagieren
(d. h. Kopplung von Gα an
Gβγ = inaktive
Cyclase; Nicht-Kopplung von Gα an
Gβγ = aktive Cyclase).
Aus diesen Studien ergab sich ein komplexes Bild, bei dem Determinanten
im Bereich zwischen den Resten 25 und 96 der Hybride sich als den
Zustand der Aktivierung dieser Allele determinierend herausgestellt haben,
wie es in der Geschwindigkeit des Guanin-Nukleotid-Austausches unter
GTP-Hydrolyse und dem Umfang, in dem sie in vivo Adenylylcyclase
aktivierten, widergespiegelt wurde. Diese Daten könnten interpretiert werden,
um die Hypothese zu unterstützen,
das strukturelle Elemente in der Region zwischen dem Amino-terminalen
Methionin und dem ~1-Blatt, identifiziert in der Kristallstruktur
von Gαt
(siehe Noel et al., siehe oben und Lambright et al., siehe oben)
in die Bestimmung bzw. Determinierung des Zustands der Aktivierung
des Heterotrimers durch (1) Antreiben der Assoziierung/Dissoziierung
zwischen Gα-
und Gβγ-Untereinheiten;
(2) durch Antreiben bzw. Steuern bzw. Kontrollieren des GDP/GTP-Austausches,
involviert sind. Während
kein direkter Beweis von diesen Studien bereitgestellt wurde, um
die Idee zu unterstützen,
dass Reste in diesem Bereich von Gα- und Reste in den Gβγ-Untereinheiten
einander berühren,
stellen diese Daten nichts desto weniger einen positiven Hinweis
für die
Konstruktion einer Hybrid-Gα-Untereinheit
bereit, die eine Funktion beibehält.
Es besteht jedoch ein negativer Indikator, der sich von dieser Arbeit
ableiten lässt,
insofern als einige Hybridkonstrukte eine konstitutive Aktivierung
der chimären
Proteine zur Folge hatten (d. h. ein Verlust der Rezeptor-abhängigen Stimulierung
der Gβγ-Dissoziierung und
Effektor-Aktivierung).
-
D. Konstruktion chimärer Gα-Untereinheiten
-
Bei
der Entwicklung von Gα-Untereinheiten,
die zum Übertragen
bzw. Transmittieren von Signalen in der Hefe in der Lage sind, die
von Säugetier-G-Protein
gekoppelten Rezeptoren abstammen, wurden zwei allgemeine Desiderata
erkannt. Zunächst
sollten die Untereinheiten so viel der nativen Säugetierproteinsequenz wie möglich beibehalten.
Als Zweites sollte die Expressionsstärke bzw. das Niveau der Expression
für die
heterologen Komponenten so nahe wie möglich der Konzentration ihrer
endogenen Gegenstücke
nahekommen. Die von King et al. (1990), Science 250: 121–123, für die Expression
des humanen β2-adrenergen
Rezeptors und von Gαs
in Hefe beschriebenen Ergebnisse zusammengenommen mit negativen
Ergebnissen, die von Kang et al. (siehe oben) mit Volle-Länge-Säugetier-Gα-Untereinheiten,
die von Gas verschieden waren, erzielt wurden, führten uns zu den folgenden
Bevorzugungen für
die Entwicklung von Hefestämmen,
bei denen Säugetier-G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren an den Pheromon-Reaktionsweg gekoppelt werden konnten.
- 1. Säugetier-Gα-Untereinheiten
werden unter Verwendung der nativen Sequenz jeder Untereinheit exprimiert,
oder, alternativ, als minimale Genfusionen mit Segmenten aus dem
Amino-Terminus von GPA1, der die homologen Reste aus den Säugetier-Gα-Untereinheiten
ersetzt.
- 2. Säugetier-Gα-Untereinheiten
werden aus dem GPA1-Promotor entweder auf Low-Copy-Plasmiden oder nach
Integration in das Hefe Genom als Single-Copy-Gene exprimiert.
- 3. Endogene Gβγ-Untereinheiten
werden durch die Hefe STE4- und STE18-Stellen bzw. -Orte bereitgestellt werden.
-
E. Ortsgerichtete Mutagenese
gegen zufallsbedingte Mutagenese
-
Es
existieren zwei allgemeine Ansätze
zur Lösung
von Struktur-Funktionsproblemen der Art, die durch Ansätze präsentiert
werden, die Determinanten zu definieren, die in der Vermittlung
der Assoziation der das G-Protein-Heterotrimer umfassenden Untereinheiten
involviert sind. Der erste oben diskutierte Ansatz bezüglich von
Hybrid-Konstrukten, ist ein vernünftiger
Ansatz, bei dem spezielle Mutationen oder Veränderungen in ein Molekül auf Grundlage
der verfügbaren
experimentellen Beweislage eingebracht werden. In einem zweiten Ansatz
werden zufallsbedingte Mutagenese-Techniken, gekoppelt mit der Selektion
oder Screening-Systemen dazu
verwendet, große
Mengen an Mutationen in ein Molekül einzubringen und dass die
Sammlung zufallsbedingt mutierter Moleküle dann einer Selektion nach
dem erwünschten
Phänotyp
unterworfen wird oder ein Screening durchgeführt wird, bei dem der erwünschte Phänotyp gegen
einen Hintergrund unerwünschter
Phänotypen
beobachtet werden kann. Bei der zufallsbedingten Mutagenese kann
man ein gesamtes Molekül
mutagenisieren oder kann durch eine Kassettenmutation vorgehen.
Im ersteren Fall wird die gesamte codierende Region eines Moleküls durch
eine von mehreren Verfahren (chemisch, PCR, dotierte Oligonukleotid-Synthese) mutagenisiert
und diese Sammlung zufallsbedingt mutierter Moleküle wird
einer Selektion oder Screening-Verfahren unterworfen. Die zufallsbedingte
Mutagenese kann auf diese Weise in Fällen angewendet werden, in denen
das Molekül,
das untersucht wird, relativ klein ist, und es existieren kraftvolle
und stringente Selektionen oder Screenings, die dazu in der Lage
sind, zwischen den unterschiedlichen Klassen mutierter Phänotypen
zu unterscheiden, die sich unweigerlich ergeben werden. Im zweiten
Ansatz werden diskrete Regionen eines Proteins, entsprechend ihrer
definierten strukturellen (d. h. α-Helices, β-Faltblätter, Turns,
Oberflächenloops)
oder funktionellen Determinanten (beispielsweise katalytischen Spalten,
Bindungsdeterminanten, Transmembransegmenten) einer sättigenden
oder halb-zufallsbedingten Mutagenese unterworfen, und diese mutagenisierten
Kassetten werden erneut im Kontext des ansonsten Wildtyp-Allels
eingebracht. Eine Kassetten-Mutagenese
ist am meisten von Nutzen, wenn experimenteller Beweis verfügbar ist,
der eine spezielle Funktion für
eine Molekülregion
nahelegt, und es existieren kraftvolle Selektions- und/oder Screening-Ansätze, die
verfügbar sind,
um zwischen interessierenden und nicht-interessierenden Mutanten zu unterscheiden.
Eine Kassetten-Mutagenese ist ebenfalls von Nutzen, wenn das Stammmolekül vergleichsweise
groß ist
und es erwünscht ist,
die funktionellen Domänen
eines Moleküls
durch Mutagenisieren des Moleküls
in einer schrittartigen Weise zu kartieren, d. h. ein Mutieren einer
linearen Kassette von Resten am einen Zeitpunkt und darauf die Untersuchung
ihrer Funktion.
-
Die
vorliegende Erfindung betrachtet die Anwendung der zufallsbedingten
Mutagenese, um die Determinanten, die in die Gα-Gβγ-Assoziierung involviert sind,
weiter zu skizzieren. Die zufallsbedingte Mutagenese kann durch
viele Mittel erreicht werden, einschließlich:
- 1.
PCR-Mutagenese, bei der die fehleranfällige Taq-Polymerase zur Erzeugung
mutierter Allele von Gα-Untereinheiten
verwendet wird, die direkt in Hefe bezüglich einer Fähigkeit
zur Kopplung an Hefe Gβγ untersucht
werden.
- 2. Chemische Mutagenese, bei der Expressionskassetten, die Gα-Untereinheiten
codieren, gegenüber
Mutagenen exponiert werden, und die Proteinprodukte der mutierten
Sequenzen werden direkt in Hefe bezüglich ihrer Fähigkeit,
an Hefe Gβγ zu koppeln,
untersucht.
- 3. Dotierte Synthese von Oligonukleotiden, die Teile des Gα-Gens codieren.
- 4. In-vivo-Mutagenese, bei der zufallsbedingte Mutationen in
die codierende Region von Gα-Untereinheiten durch
Passage durch einen Mutatorstamm von E. coli, XL1-Red (mutD5 mutS
mutT) (Stratagene, Menasa, WI) eingebracht werden.
-
Die
zufallsbedingte Mutagenese kann auf Regionen fokussiert werden,
die unter dem Verdacht stehen, dass sie in die Gα-Gβγ-Assoziation involviert sind,
wie im nächsten
Abschnitt diskutiert wird. Die zufallsbedingten Mutagenese-Ansätze sind
auf zwei Gründen
durchführ bar.
Zunächst
hat man in der Hefe die Fähigkeit,
stringente Screenings zu konstruieren und einfache Selektionen (Wachstum
gegen Tod, Transkription gegen Fehlen einer Transkription), die
in Säugetiersystemen
nicht leicht verfügbar
sind. Zweitens, wenn Hefe verwendet wird, ist es möglich, effizient
durch Tausende von Transformanten rasch zu screenen. Eine Kassettenmutagenese
wird sofort durch die Beobachtung nahegelegt (siehe unten), dass
die GPA41-Hybride an den Pheromon-Reaktionsweg koppeln. Diese relativ
kleine Region von Gα-Untereinheiten
repräsentiert
ein vernünftiges
Ziel für
diese Art von Mutagenese. Ein weiterer Bereich, der einer Kassettenmutagenese
gegenüber anfällig ist,
ist derjenige, der die Oberfläche
der Switch-Region von Gα-Untereinheiten
definiert, die Lösungsmittel-exponiert
in den Kristallstrukturen von Gαi
und Translucin vorliegen. Aus den unten beschriebenen Daten kann
die Oberfläche
Reste enthalten, die in direktem Kontakt mit Hefe Gβγ-Untereinheiten stehen,
und können
deswegen ein vernünftiges
Ziel für
die Mutagenese darstellen.
-
F. Rationelles Design
chimärer
Gα-Untereinheiten
-
Mehrere
Klassen an rationell entwickelten GPA1-Säugetier-Gα-Hybriduntereinheiten wurden
auf ihre Fähigkeit
getestet, an Hefe βγ zu koppeln.
Die ersten und größten Klassen
von Hybriden sind solche, die unterschiedliche Längen der GPA1-Amino-terminalen
Domäne
stelle der homologen Regionen der Säugetier-Gα-Untereinheiten codieren. Diese
Klasse an Hybridmolekülen
schließt
GPHBAMH1, GPH41,
GPAID und GPALW-Hybride,
unten beschrieben, ein. Die Begründung
für die
Konstruktion dieser Hybrid-Gα-Proteine
basiert auf den Ergebnissen, die oben beschrieben wurden, die die
Bedeutung der Amino-terminalen Reste von Gα bei der Vermittlung der Interaktion
mit Gβγ beschreiben.
-
Vorzugsweise
wird die Hefe Gα-Untereinheit
durch eine chimäre
Gα-Untereinheit
ersetzt, in der ein Teil, beispielsweise zumindest ungefähr 20, besonders
bevorzugt zumindest ungefähr
40 Aminosäuren,
die im Wesentlichen mit den entsprechenden Resten des Amino-Terminus
der Hefe Gα homolog
sind, ersetzt, wird an eine Sequenz fusioniert, die im Wesentlichen
mit dem Hauptkörper
eines Säugetier(oder
anderen exogenen)-Gα homolog
ist. Während
40 Aminosäuren
der vorgeschlagene Startpunkt ist, können kürzere oder längere Anteile
getestet werden, um die minimale Länge zu bestimmen, die zum Koppeln
an Hefe Gβγ erforderlich ist,
und die maximale Länge,
die mit der Zurückhaltung
der Kopplung bzw. Beibehaltung der Kopplung an den exogenen Rezeptor
kompatibel ist. Es wird gegenwärtig
angenommen, dass nur die finalen 10 oder 20 Aminosäuren am
Carboxyterminus der Gα-Untereinheit
zur Interaktion mit dem Rezeptor erforderlich sind.
-
GPHBAMH1-Hybride. Kang et al., siehe oben, beschrieben
Hybrid-Gα-Untereinheiten,
die die Amino-terminalen 310 Reste von GPA1 fusioniert an die Carboxy-terminalen
160, 143 und 142 Reste jeweils von GαS, Gαi2 und Gαo codieren. In allen Fällen überprüften Kang
et al., ob die Hybridproteine dazu in der Lage waren, den Wachstumshalt-Phänotyp der
gpaI-Stämme zu komplementieren.
Diese Erkenntnisse wurden bestätigt und
zusätzlich
wurden Hybride zwischen GPA1- und Gαi3 konstruiert und getestet
sowie zwischen Gαq
und Gα16.
Alle Hybride dieses Typs wurden getestet, und es ergab sich, dass
sie funktionell den Wachstumsstopp-Phänotyp von gpaI-Stämmen komplementieren.
-
GPA41-Hybride.
Die Begründung
für die
Konstruktion eines Minimalhybrids, das nur 41 Aminosäuren von
GPAI codiert, beruht auf dem biochemischen Beweis für die Rolle
des Amino-Terminus von Gα-Untereinheiten,
oben diskutiert, zusammen mit der folgenden Beobachtung. Gβ- und Gγ-Untereinheiten
agieren bekannterweise mit α-helikalen
Domänen
an ihren jeweiligen Amino-Termini (Pronin et al. (1992), Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 89: 6220–6224);
Garritsen et al. (1993). Der Vorschlag, dass die Amino-Termini von
Gα-Untereinheiten ein
helikales Knäuel
bilden können
und dass dieses helikale Knäuel
in die Assoziierung von Gα mit
Gβγ involviert
ist (Masters et al. (1986), Protein Engineering 1: 47–54); Lupas
et al. (1992), FEBS Lett. 314: 105–108), führt zur Hypothese, dass die
drei Untereinheiten des G-Proteinheterotrimers miteinander reversibel durch
Umwinden und Nicht-Umwinden
ihrer Amino-terminalen helikalen Regionen interagieren. Ein Mechanismus
dieses Typs wurde nahegelegt, ebenso aus einer Analyse von Leucin-Zippermutanten
des GCN4-Transkriptionsfaktors
(Harbury et al. (1993), Science 262: 1401–1407). Die Begründung zur
Konstruktion von Hybriden wie solchen, die von Kang et al., siehe
oben, beschrieben wurden, die eine Vielzahl von Hefesequenzen enthalten
und nur minimale Säugetiersequenz,
stammt aus ihrer Fähigkeit,
in Assays der Kopplung zwischen Gα-
und Gβγ-Untereinheiten
zu funktionieren. Jedoch wurden diese Chimären niemals bezüglich ihrer
Fähigkeit
untersucht, sowohl an Säugetier-G-Protein
gekoppelte Rezeptoren als auch Hefe Gβγ-Untereinheiten zu binden und
daher einen Hybrid-Signalgebungsweg in Hefe zu rekonstituieren.
-
GPA41-Hybride, die konstruiert und getestet
wurden, schließen
Gαs, Gαi2, Gαi3, Gαq, Gαoa, Gαob und Gα16 ein. Hybride von Gαs, Gαi2, Gαi3 und Gα16 komplementieren funktionell
den Wachstumsstopp-Phänotyp von
gpa1-Stämmen,
wohingegen GPA41-Hybride von Gαoa und Gαob dies nicht tun. Zusätzlich zum Testen in Wachstumsstoppassay
wurden diese Konstrukte bezüglich
des empfindlicheren Transkriptions-Assays zur Aktivierung eines
fusI-p-HIS3-Gens
untersucht. In diesen beiden Assays koppeln das GPA41-Gαs-Hybrid
weniger gut als die GPA41i2, -i3 und -16-Hybride,
während
GPA41-oa- und -ob-Hybride in keinem Assay funktionieren.
-
Mehrere
prädiktive
Algorithmen zeigen, dass die Amino-terminale Domäne bis zur hoch konservierten Sequenz-Motiv
-LLLLGAGESG- (SEQ ID NO: 46) (das erste L im Motiv ist Rest 43 in
GPA1) eine helikale Struktur mit amphipathischen Charakter bildet.
Unter der Annahme einer heptahelikalen Wiederholungseinheit können die
folgenden Hybride zwischen GPA1 und GαS dazu verwendet werden, die
Anzahl helikaler Repeats in diesem Motiv zu bestimmen, die zur Hybridfunktion
notwendig sind:
GPA1–7/Gαs8–394
GFA1–14/Gαs15–394
GPA1–21/Gαs22–394
GPA1–28/Gαs29–394
GPA1–35/Gαs36–394
GPA1–421Gαs43–394
-
Bei
diesen Hybriden ist die Vorhersage, dass die strukturelle Wiederholungseinheit
in der Amino-terminalen Domäne
bis zum Tetraleucin-Motiv 7 ist und dass Swapping-Sequenzen in den
Einheiten von 7 tatsächlich
das Swappen von Einheits-Turns von Turns der helikalen Struktur
ermöglichen
wird, die diese Domäne
umfasst.
-
Eine
zweite Gruppe von „Doppel-Crossover"-Hybriden dieser
Klasse sind solche, die an der ersten putativen Heptad-Wiederholung,
beginend mit Rest G11 in GPA1, ausgerichtet werden. In diesen Hybriden
werden helikale Repeats von GPA in das GαS-Grundgerüst geswapped, eine Heptad-Einheit
pro Zeitpunkt.
GαS1–10/GPA11–17/Gαs18–394
GαS1–17/GPA18–24/GαS25–394
GαS1–17/GPA24S-31/GαS32–394
GαS?–171GPA32–38/GαS39–394
-
Die
Lücke,
die zwischen den Resten 9 und 10 in der GαS-Sequenz eingebracht wird,
soll das Alignment des -LLLLGAGE- (Aminosäuren 1–8 von SEQ ID NO: 46) Sequenzmotivs
schützen.
Diese Klasse von Hybriden kann durch Kassettenmutagenese jeder Heptadeinheit,
gefolgt vom Screening dieser Kollektionen von „Heptad"-Bibliotheken in Standardkopplungsassays
komplementiert werden.
-
Eine
dritte Klasse von Hybriden auf Grundlage der Vorhersage, dass der
Amino-Terminus eine helikale Domäne
mit einer Heptad-helikalen Wiederholungseinheit bildet, sind solche,
die den gesamthydrophoben oder -hydrophilen Charakter der gegenüberliegenden
Seiten der vorhergesagten helikalen Struktur (siehe Lupas et al.,
siehe oben) beeinträchtigen.
In diesem Modell hat sich herausgestellt, dass die α- und d-Positionen der
Heptad-Wiederholung abcdefg-konservierte hydrophobe Reste sind,
die eine Seite der Helix definieren, wohingegen die e- und g-Positionen
die geladene Seite der Helix definieren. In dieser Klasse von Hybriden wird
die Sequenz des GaS-Stammes aufrechterhalten, außer für spezifische Substitutionen
an ein oder mehreren der folgenden entscheidenden Reste, um die
unterschiedlichen helikalen Flächen
von GaS mehr „GPA1-artig" zu machen.
K8Q
+1–10
EIOG
Q12E
R13S
N14D
–E15P
E15F
K17L
E21R
K28Q
K32L
V36R
-
Diese
Kollektion einzelner Mutationen könnte auf ihre Kopplungseffizienz
an Hefe Gβγ gescreent
und danach in Kombinationen konstruiert werden (doppelt und größer, falls
notwendig).
-
Eine
vierte Klasse an Hybridmolekülen,
die diese Region von GPA1/Gα-Hybriden überspannt,
sind solche, die Kreuzungen zwischen GPA1 und Ga-Untereinheiten
aufweisen, die durch drei Primer-PCR eingebracht wurden. In diesem
Ansatz werden die beiden Außen-Primer durch Sequenzen
am Startmethionin von GPA auf der 5'-Seite und an Tetraleucin-Motiv von GaS (beispielsweise)
auf der 3'-Seite
codiert. Eine Reihe von Kreuzungs-Primern, die unterschiedliche
Kreuzungspunkte überspannen,
können
mit den Außen-Primern gemischt
werden, um eine Reihe von Molekülen
herzustellen, von denen jede unterschiedliche Mengen an GPA1 und
GaS-Sequenzen jeweils aufweist.
-
GPAID- und GPALW-Hybride.
Die Regionen einer hohen Homologie zwischen Gβγ-Untereinheiten, die durch Sequenz-Alignment
identifiziert wurden, sind im gesamten Molekül verteilt. Die G1-Region,
die das hoch konservierte -GSGESGDST-Motif enthält, wird unmittelbar von einer
Region mit einer sehr niedrigen Sequenzkonservierung gefolgt, der „il"- oder Insert1-Region. Beide, Sequenz
und Längen,
variieren beträchtlich
zwischen den il-Regionen
der Gα-Untereinheiten.
Durch Aligning der Sequenzen von Gα-Untereinheiten wurden konservierte
Regionen, die die il-Region banden, identifiziert, und zwei zusätzliche
Klasse von GPA1-Gα-Hybriden
wurden konstruiert. Die GPAID-Hybride codieren
die Amino-terminalen 102 Reste von GPA1 (bis zu Sequenz -QARKLGIQ-),
fusioniert in-frame an Säugetier-Gα-Untereinheiten,
wohingegen die GPALW-Hybride die Amino-terminalen
244 Reste von GPA1 codieren (bis zu Sequenz -LIHEDIAKA- in GPA1).
Der Grund zur Konstruktion der GPAID- und
GPALW-Hybride bestand darin, die Hypothese
zu testen, dass die il-Region
von GPA1 zur Vermittlung der Interaktion von GPA1 mit Hefe Gβγ-Untereinheiten
zur stabilen Expression der Hybridmoleküle oder zur Funktion der Hybridmoleküle erforderlich
ist. Die GPAID-Hybride enthalten die Amino-terminale Domäne von GPA1,
fusioniert an die il-Domäne
von Säugetieruntereinheiten
und enthalten deswegen die GPAIL-Region
nicht, wohingegen die GPALW-Hybride die
Amino-terminalen 244 Reste von GPA enthalten, einschließlich der
gesamten il-Region (wie durch Sequenz-Alignments identifiziert).
Hybride sowohl von GPAID- als auch GPALW-Klassen wurden für GaS, C-αi2, Gαi3, Gαoa und
Gα16 konstruiert;
keines dieser Hybride komplementierte den gpaI-Wachstumsstopp-Phänotyp.
-
Anschließend an
die Konstruktion und das Testen der GPAID-
und GPALW-Klassen von Hybriden wurden die
Kristallstrukturen von G-Translucin sowohl in der GDP- als auch
GTPγS-ligandierten Form
und die Kristallstruktur mehrerer Gαil-Varianten in der GTPγS-ligandierten und
GDP-ALF4-Form berichtet (Noel et al., siehe
oben; Lambright et al., siehe oben; und Coleman et al. (1994), Science
265: 1405–1412).
Die Kristallstrukturen zeigen, dass die il-Region, definiert durch
Sequenz-Alignment, eine konservierte Struktur aufweist, die sechs α-Helices
in einer starren Anordnung umfasst, und dass die Kreuzungen, die
für die
Konstruktion der GPAID- und GPALW-Hybride
ausgewählt
sind, mit der Konservierung der strukturellen Merkmale der il-Region nicht
kompatibel waren, die in den Kristallen beobachtet wurde. Die für die GPAID-Hybride gewählte Kreuzung fällt in das
Zentrum der langen αA-Helix; eine Chimärisierung
dieser Helix destabilisiert aller Wahrscheinlichkeit nach diese
und die Proteinstruktur insgesamt. Dasselbe stimmt auch bezüglich der
für die
GPALW-Hybride gewählte Kreuzung, bei der der
Cross-over-Punkt zwischen GPA1 und der Säugetier-Gα-Untereinheit an das Ende der kurzen αC-Helix fällt und
deswegen diese stören
und das Protein destabilisieren kann.
-
Der
Fehler bzw. das Versagen der GPAID- und
GPALW-Hybride ist vorhergesagtermaßen auf
eine Störung
kritischer struktureller Elemente in der il-Region wie oben diskutiert
zurückzuführen. Auf
Grundlage neuer Alignments und der in Noel et al. (siehe oben),
Lambright et al. (siehe oben) und Coleman et al. (siehe oben) präsentierten
Daten kann dieses Problem abgewendet werden, wobei die ras-artige
Kerndomäne
und die il-helikale Domäne
außerhalb
bekannter struktureller Elemente die α-Helices eingebracht werden.
-
Hybrid A GαS1–67/GPA66–299/GαS203–394
-
Dieses
Hybrid enthält
das gesamte il-Insert von GPA1 in die GaS-Sequenz eingebracht.
-
Hybrid B GPA1–41/GαS4443–67/GP466–299/GαS203–394
-
Dieses
Hybrid enthält
die Amino-terminalen 41 Reste von GPA1 anstelle der 42 Aminoterminalen
Reste von GaS, die in Hybrid A zu finden sind.
-
Gαs-Hybride.
Es bestehen Hinweise darauf, dass die „Switch-Region", die von den Resten
171–237 von
Gα-Transducin
(unter Verwendung der Nummerierung von Noel et al. (siehe oben))
ebenfalls eine Rolle bei der Gβγ-Kopplung
spielt. Zunächst
verhindert die G226A in GαS
die GTP-induzierte Konformationsänderung,
die mit dem Austausch von GDP für
GTP nach Rezeptoraktivierung durch den Liganden eintritt. Dieser Rest
kartiert auf die hoch konservierte Sequenz -DVGGQ-, die in allen
Gα-Untereinheiten
vorliegt und die in die GTP-Hydrolyse
involviert ist. Sowohl in den Gαt-
als auch Gαil-Kristallstrukturen
liegt dieses Sequenzmotiv in der Loop bzw. Schleife, die das β-Dreifaltblatt
und die α2-Helix
im Guaninnukleotid-Bindungskern verbindet. Zusätzlich zur Blockierung der
Konformationsänderung,
die nach GTP-Bindung auftritt, verhindert diese Mutation ebenfalls
die Dissoziation von GTP-ligandierten Gα von Gβγ. Zweitens zeigen die Vernetzungsdaten,
dass ein hoch konserviertes Cystein-Rest in der α2-Helix (C215 in Gαo, C210 in
Gαt) an
den Carboxy-terminalen Bereich der Gβ-Untereinheiten vernetzt werden
kann. Zuletzt identifiziert ein genetischer Beweis (Whiteway et al.
(1993), Mol. Cell. Biol. 14: 3233–3239) einen bedeutenden einzelnen
Rest im GPA1 (E307) im β2-Faltblatt der
Kernstruktur, die in direkter Berührung mit βγ sein kann. Eine Mutation im
GPA1-Protein an dieser Position unterdrückt den konstitutiven Signalsgebungs-Phänotyp einer
Vielzahl von STE4 (Gβ)
dominant negativen Mutationen, von denen ebenfalls bekannt ist,
dass sie in der Gα-,
Gβγ-Assoziation
(wie durch zwei Hybridassay in Hefe ebenso wie durch mehrere konventionelle
Gentests bestimmt) defektiv bzw. mangelhaft sind.
-
Die
Hypothese, dass Switch-Region-Determinanten in die Assoziation von
Gα mit Gβγ involviert
sind, wurde durch Konstruieren einer Reihe von Hybrid-Gα-Proteinen,
die Anteile von GPA1 und GαS
in verschiedenen Kombinationen codieren, getestet.
-
Es
wurden zwei Schlüsse
gezogen. Zunächst
unterdrückt
im Kontext des Amino-Terminus von GαS DGPA1-Switch-Region eine Kopplung
an Hefe Gβγ (SGS), wohingegen
im Kontext des GPA1-Amino-Terminus die GPA1-Switch-Region eine Kopplung
mit Gβγ (GPβγ-SGS) stabilisiert.
Dies legt nahe, dass diese beiden Regionen von GPA1 zusammenarbeiten,
um Interaktionen zwischen Gα-Untereinheiten
und Gβγ-Untereinheiten
zu ermöglichen.
Dieser Schluss wird ein wenig durch die Beobachtung gelindert, dass
das GPA41-GαS-Hybrid, das die GPA1-Switch-Region
nicht enthält,
dazu in der Lage ist, den Wachstumsstopp-Phänotyp
von gpaI-Stämmen
zu komplementieren. Ein quantitativer Unterschied zwischen dem Verhalten
des GPA41-GaS-Allels und des GPAI-SGS-Allels
wurde nicht bemerkt, wenn jedoch diese Interaktion ein wenig degeneriert
ist, kann es schwierig sein, diese genau zu quantifizieren. Der
zweite Schluss, der aus diesen Ergebnissen gezogen werden kann,
besteht darin, dass andere Determinanten in die Stabilisierung der Interaktion
von Gα mit
Gβγ invol viert
sind, über
diese beiden Regionen hinaus, weil keines der GPA1-GαS-Hybridproteine
genauso effizient an Hefe-Gβγ wie natives
GPA1 koppelt.
-
Die
Rolle der Oberflächen-exponierten
Reste dieser Region können
für das
wirksame Koppeln an Gβγ entscheidend
sein und können
in Hybridmoleküle
wie folgt nachstehend eingebaut werden.
-
GαS-GPA-Switch GαS1–202/GPA298–350/GαS253–394
-
Dieses
Hybrid codiert die gesamte Switch-Region von GPA1 im Kontext von
GaS.
-
GαS-GPA-α2 GQS1–226/GPA322–332/GQS238–394
-
Dieses
Hybrid codiert die a2-Helix von GPA1 im
Kontext von GaS.
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GPA41-GαS-GPA-a2GPAI-41/GQS43–226/GPA322–332/GQS238–394
-
Dieses
Hybrid codiert die 41 Reste Amino-terminale Domäne von GPA1 und die α2-Helix von
GPA1 im Kontext von Gαs.
-
Zuletzt
wird die letzte Klasse der Hybride diskutiert werden, die hier ausgewählt wurde,
die die Oberflächen-exponierten
Reste der β2-
und β3-Faltblätter von αS so verändern, dass
diese der GPA1 QS-Helix ähneln.
Diese veränderten α2-helikalen
Domänen
weisen die folgende Struktur auf (die Position der geänderten Reste
entsprechen GαS).
L203K
K211E
D215G
K216S
D229S
-
Diese
einzelnen Mutationen können
in ein GαS-Grundgerüst eingebaut
werden, einzeln und in paarweise Kombinationen. Zusätzlich können diese
im Kontext sowohl der Vollen-Länge-GαS als auch des GPA41-GαS-Hybrides
eingebracht werden, das früher
beschrieben wurde. Es wird für
alle vorhergesagt, dass die Kopplung von Gα-Untereinheiten an Hefe-Gβγ-Untereinheiten mittels
verbesserter elektrostatischer und hydrophober Kontakte zwischen dieser
Region und den Regionen von Gβ,
die durch Whiteway und Mitarbeiter definiert wurden, verbessert
wird (Whiteway et al. (siehe oben), die den Ort (Orte) definieren,
die mit GPA1 interagieren).
-
In
Zusammenfassung hat die Identifizierung von Hybrid-Gα-Untereinheiten,
die an den Hefe-Pheromonweg
koppeln, zu den nachfolgenden allgemeinen Beobachtungen geführt. Zuerst
assoziieren alle GPABAMH1-Hybride mit Hefe-Gβγ und deswegen
enthalten diese Hybride zumindest die Determinanten in GPA1, die
zum Koppeln an den Pheromon-Reaktionsweg notwendig sind. Zweitens
enthalten die Amino-terminalen 41 Reste von GPA ausreichende Determinanten,
um die Kopplung von Gα-Hybriden
an Hefe-Gβγ bei einigen,
jedoch nicht allen Fällen
zu erleichtern und dass einige Gα-Untereinheiten
Regionen außerhalb
der ersten 41 Reste enthalten, die ausreichend ähnlich zu solchen in GPA1 sind,
um die Interaktion vom GPA1 selbst in Abwesenheit der Amino-terminalen
41 Reste von GPA1 zu erleichtern. Als drittes existieren weitere Determinanten
in den ersten 310 Resten von GPA1, die in die Kopplung von Gα-Untereinheiten
an Hefe-Gβγ-Untereinheiten
involviert sind.
-
Die
verschiedenen Klassen von Hybriden, die oben erwähnt sind, sind nicht wechselseitig
ausschließend.
Beispielsweise könnte
ein GPA1-enthaltendes GPA141- ebenfalls
die L203K-Mutation
aufweisen.
-
Während zu
Vereinfachungszwecken Hybride von Hefe-GPA1 und Säugetier-Gαs beschrieben
wurden, wird erkennbar sein, dass Hybride aus anderen Hefe-Gα-Untereinheiten
und/oder anderen Säugetier-Gα-Untereinheiten
hergestellt werden können,
insbesondere Säugetier-Gαi-Untereinheiten. Überdies
sind Hybride aus drei oder mehr Stammproteinen ebenfalls möglich, wohingegen
die beschriebenen Hybride aus zwei parentalen bzw. Stammproteinen
konstruiert sind.
-
Wie
in den Beispielen dargestellt, sind chimäre Gα-Untereinheiten insbesondere
beim Koppeln von Rezeptoren an Gai-Spezies von Nutzen.
-
G. Expression von Gα
-
Kang
et al., siehe oben, berichteten, dass mehrere Klassen nativer Säugetier-G-Untereinheiten
dazu in der Lage waren, funktionell mit Hefe-α-Untereinheiten zu interagieren,
wenn die Ex pression von Gα aus
einem konstitutiv aktiven, starken Promotor (PGK) oder aus einem
starken induzierbaren Promotor (CUP) gesteuert wurde. Diese Autoren
berichteten, dass Ratten-GαS, -Gαi2 oder -Gαo eine hohe
Konzentration exprimierten, gekoppelt an Hefe-βγ. Eine hohe Expression von Säugetier-Gα (d. h. nicht-stöchiometrisch
bezüglich Hefe-βγ ist für die Anwendungen
wie solche, die in dieser Anmeldung beschrieben sind, nicht wünschenswert. Die
Rekonstruktion von G-Protein-gekoppeltem Rezeptorsignal-Transductionen
in Hefe erfordert die Signalgebungskomponente des heterotrimeren
Komplexes (Gβγ) stöchiometrisch
mit Gα-Untereinheiten
vorhanden zu sein. Ein Überschuss
an Gα-Untereinheiten
(wie er zum Koppeln von Säugetier-Gαi2 und -Gαo an Hefe-βγ in Kang
et al. erforderlich war) würde
das Signal in den Systemendämpfen,
in denen Gβγ-Subeinheiten
das Signal transduzieren. Ein Überschuss
an Gα-Untereinheiten
erhöht
die Hintergrundstörung
der Signalgebung im System auf unakzeptable hohe Werte. Vorzugsweise
sind die Konzentrationen von Gα-
und Gβγ-Untereinheiten ausgeglichen.
Beispielsweise können
heterologe Gα-Untereinheiten
aus Vektoren mit niedriger Kopienanzahl (Low-Copy-Vectors) (CEN
ARS) exprimiert werden, die endogenen GPA1-Promotor und die GPA1
3'-untranslatierte
Region aufweisen. Das minimale Kriterium, angewendet auf eine heterologe
Gα-Untereinheit
bezüglich
ihrer Fähigkeit,
funktionell an den Hefe-Pheromonweg zu koppeln, besteht darin, dass
sie einen gpaI-Genotyp komplementiert, wenn er aus dem GPA1-Promotor
auf Low-Copy-Plasmiden oder aus einem integrierten, Ein-Kopien-Gen
exprimiert wird, komplementiert. In der in dieser Anmeldung beschriebenen
Arbeit wurden alle heterologen Gα-Untereinheiten
in zwei biologischen Systemen untersucht. In dem ersten Assay wurden
heterologe Gα-Untereinheiten
auf ihr Vermögen
getestet, funktionell den Wachstumsanhalt-Phänotyp von gpaI-Stämmen zu
komplementieren. Im zweiten Assay wird die Transkription eines Fus1-HIS3-Reportergens
dazu verwendet, das Ausmaß zu
messen, in dem der Pheromon-Reaktionsweg aktiviert wird und daher das
Ausmaß,
in dem die heterologe Gα-Untereinheit
den endogenen Hefe-Gβγ-Komplex
sequestriert. Säugetier-Gαs, Gαi2, Gαi3, Gαq, Gα11, Gα16, Gαoa, Gαob und Gαz
von Ratten-, Maus- oder Menschenursprung wurden aus einem Low-Copy-CEN-ARS-Vektor
exprimiert, der den GPA1-Promotor enthielt. Eine funktionelle Komplementierung
von gpaI-Stämmen
wurde in keinem Assaysystem mit jedem dieser Volle-Länge-Gα-Konstrukte
beobachtet, mit der Ausnahme von Ratten und humanem GαS.
-
H. Chimäre Hefe-βγ-Untereinheiten
-
Eine
Alternative zur Modifikation einer Säugetier-Gα-Untereinheit zur verbesserten
Signaltransduktion ist die Modifikation der entsprechenden Stellen
in den Hefe-Gβ-
oder -Gγ-Untereinheiten. Die
bereits bezüglich Gα-Untereinheiten
diskutierten Prinzipien treffen mutatis mutandis auch auf Hefe-Gβ- oder -Gγ zu.
-
Beispielsweise
können
in bestimmten Ausführungsformen
die Hefe-Ste4p Gβ-Untereinheit
mit einer Kassettenmutagenese als Ziel definiert werden. Insbesondere
würde die
Region von Ste4p, die mehrere der dominant negativen, Signal-defektiven
Mutationen codiert, ein ausgezeichnetes Ziel für eine Kassettenmutagenese
sein, wenn nach einer Kopplung von Hefe-Gβγ an spezifische Säugetier-Gα-Untereinheiten
gesehen wird.
-
V. Testverbindungen
-
Exogen zugesetzte
Verbindungen
-
Ein
neuer Trend in der medizinischen Chemie schließt die Produktion von Gemischen
von Verbindungen ein, die hierin als Bibliotheken bezeichnet werden.
Während
die Verwendung von Bibliotheken von Peptiden in der Technik wohl
etabliert ist, wurden neue Techniken entwickelt, die die Produktion
von Gemischen anderer Verbindungen, beispielsweise von Benzodiazepinen
ermöglichten
(Bunin et al. (1992), J. Am. Chem. Soc. 114: 10987; DeWitt et al.
(1993), Proc. Natl. Acad. Sci, USA 90: 6909), wie auch von Peptoiden
(Zuckermann (1994), J. Med. Chem. 37: 2678), Oligocarbamaten (Cho
et al. (1993), Science 261: 1303) und Hydantoinen (DeWitt et al.,
siehe oben). Rebek et al. haben eine Ansatz zur Synthese von molekularen
Bibliotheken kleiner organischer Moleküle mit einer Diversität von 104–105 beschrieben
(Carell et al. (1994), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell
et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994, 33: 2061).
-
Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung irgendwelcher
der zahlreichen Ansätze
in kombinatorischen Bibliothekverfahren, die in der Technik bekannt
sind, gewonnen werden, einschließlich: biologischer Bibliotheken;
räumlich
adressierbarer paralleler Festphasen- oder Lösungsphasen-Bibliotheken, synthetischer
Bibliotheken-Verfahren,
die eine Dekonvolution erforderlich machen, das „Ein-Kügelchen-eine-Verbindung"-Bibliothekverfahren
und synthetische Bibliotheken-Verfahren unter Verwendung einer Affinitätschromatographieselektion.
Der biologische Bibliothek-Ansatz ist auf Peptid-Bibliotheken beschränkt, wohingegen
die andere vier Ansätze
auf Peptid-, Nicht-Peptid-,
Oligomer- oder kleine Molekül-Bibliotheken
von Verbindungen anwendbar sind (Lam, I. S., Anticancer Drug Des.
1997, 12: 145).
-
In
einer Ausführungsform
ist die Testverbindung ein Peptid in einem Peptidomimetikum. In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
sind die Verbindungen kleine organische nicht-peptidische Verbindungen.
-
Weitere
beispielhafte Verfahren zur Synthese molekularer Bibliotheken sind
in der Technik beispielsweise in: Erb et al. (1994), Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91: 11422; Horwell et al. (1996), Immunopharmacology 33:
68; und in Gallop et al. (1994), J. Med. Chem. 37: 1233. Zusätzlich können Bibliotheken
wie solche, die in gemeinsamem Besitzstand befindlichen Anmeldungen
beschrieben sind, wie USSN 08(864 241, USSN 08/864 240 und USSN
08/835 623, verwendet werden, um Verbindungen zum Testen der vorliegenden
Erfindung bereitzustellen. Der Inhalt jeder dieser Anmeldungen ist
ausdrücklich
hierin durch diese Bezugnahme mitaufgenommen.
-
Bibliotheken
aus Verbindungen können
in Lösung
(beispielsweise Houghten (1992), Biotechniques 13: 412–421) oder
auf Kügelchen
bzw. Perlen (Lam (1991), Nature 354: 82–84), auf Chips (Fodor (1993),
Nature 364: 555–556),
Bakterien (Ladner USP 5 223 409), Sporen (Ladner USP '409), Plasmide (Cull
et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 1865–1869) oder
auf Phagen (Scott und Smith (1990), Science 249: 386–390); (Devlin
(1990), Science 249: 404–406);
(Cwirla et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378–6382);
(Felici (1991), J. Mol Biol. 222: 301–310); (Lader, siehe oben)
präsentiert
werden.
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In
bestimmten Ausführungsformen
werden die Testverbindungen exogen in Hefezellen zugesetzt, die einen
rekombinanten Rezeptor exprimieren, und Verbindungen, die die Signaltransduktion über den
Rezeptor modulieren, werden ausgewählt. In anderen Ausführungsformen
exprimieren die Hefezellen die zu testenden Verbindungen. Beispielsweise
kann eine Kultur der vorliegenden Hefezellen weiter modifiziert
werden, dass sie kollektiv eine Peptid- Bibliothek exprimieren, wie es ausführlicher
in der PCT-Offenlegung WO94/23025 beschrieben ist, deren Inhalt
durch diese Bezugnahme hierin ausdrücklich mitaufgenommen ist.
-
Weitere
Arten von Peptid-Bibliotheken können
ebenfalls exprimiert werden, siehe beispielsweise US-Patente 5 270
181 und 5 292 646 und PCT-Veröffentlichung
WO94/02502). In einer noch weiteren Ausführungsform sind die kombinatorischen
Polypeptide aus einer cDNA-Bibliothek
erzeugt worden.
-
Beispielhafte
Verbindungen, die bezüglich
einer Aktivität
gescreent werden können,
schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, Peptide, Nukleinsäuren,
Kohlenhydrate, kleine organische Moleküle und natürliche Produktextrakt-Bibliotheken.
In solchen Ausführungsformen
können
beide Verbindungen, die den Rezeptor oder Kanal-vermittelten Signalfunktion
agonisieren oder antagonisieren, ausgewählt und identifiziert werden.
-
Peptid-Bibliotheken
-
In
bestimmten Ausführungformen
können
Hefezellen gentechnisch verändert
werden, um die zu testenden Verbindungen zu produzieren. Dieses
Assaysystem weist den Vorteil der Erhöhung der effektiven Konzentration
der zu testenden Verbindung auf. In einer Ausführungsform kann ein Verfahren
wie das in WO94/23025 beschriebene Verfahren verwendet werden.
-
Andere
Verfahren können
ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise sind Peptid-Bibliotheken Systeme,
die simultan eine hoch diverse und zahlreiche Kollektion von Peptiden
in einer Form zeigen, die eine Interaktion mit einem Ziel erlaubt.
Diese Peptide können
in Lösung
(Houghten (1992), Biotechniques 13: 412–421) oder auf Perlen (Lam
(1991), Nature 354: 82–84),
Chips (Fodor (1993), Nature 364: 555–556), Bakterien (Ladner USP
5 223 409), Sporen (Ladner USP '409),
Plasmiden (Cull et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865–1869) oder
auf Phagen (Scott und Smith (1990), Science 249: 386–390); (Devlin
(1990), Science 249: 404–406);
(Cwirla et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378–6382);
(Felici (1991), J. Mol. Biol. 22: 301–310); (Ladner, siehe oben)
präsentiert
werden. Viele dieser Systeme sind bezüglich der maximalen Länge der
Peptide oder der Zusammensetzung des Peptids limitiert (beispielsweise
Cys ausgenommen). Sterische Faktoren, beispielsweise die Nähe eines
Trägers,
kann die Bindung stören. Üblicherweise
erfolgt das Screening nach einer Bindung in vitro an ein artifiziell
präsentiertes
Ziel, nicht bezüglich
der Aktivierung oder Hemmung eines zellulären Signaltransduktionsweges
in einer lebenden Zellen. Während
ein Zelloberflächenrezeptor
als Target verwendet werden kann, wird das Screening nicht zeigen,
ob die Bindung des Peptids eine allosterische Veränderung
der Konformation des Rezeptors verursacht.
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Das
Laden et al. Patent, USSN 5 096 815, beschreibt ein Verfahren zum
Identifizieren neuer Proteine oder Polypeptide mit einer erwünschten
DNA-Bindungsaktivität.
Halb-zufallsbedingt
(„variegierte") DNA, die eine große Anzahl
unterschiedlicher potentieller Bindungsproteine codiert, wird in
exprimierbarer Form in geeignete Hefezellen eingebracht. Die Ziel-DNA-Sequenz
wird in ein gentechnisch verändertes
Operon eingebaut, derart, dass die Bindung des Proteins oder Polypeptids
die Expression eines Genproduktes, das für das Gen unter selektiven
Bedingungen zerstörerisch
ist, verhindern wird. Zellen, die die selektiven Bedingungen überleben,
sind somit Zellen, die ein Protein exprimieren, das die Target-DNA
bindet. Während
angenommen wird, dass Hefezellen für das Testen verwendet werden
können,
sind bakterielle Zellen bevorzugt. Die Interaktionen zwischen dem
Protein und der Target-DNA tritt nur in der Zelle (und dann nur
im Kern), nicht im Periplasma oder Zytoplasma ein, und das Target
ist eine Nukleinsäure
und nicht ein Rezeptorprotein. Die Substitution zufallsbedingter
Peptid-Sequenzen für
funktionelle Domäne
in zellulären
Proteinen ermöglicht
eine gewisse Determination der spezifischen Sequenzerfordernisse
für das
Erreichen der Funktion. Obwohl die Einzelheiten der Erkennungsphänomene,
die bei der Lokalisierung der Proteine innerhalb der Zelle eintreten, größtenteils
unbekannt bleiben, wurden die Beschränkungen der Sequenzvariation
mitochondrialer Target-Sequenzen und Proteinsekretions-Signalsequenzen unter
Verwendung von zufallsbedingten Peptiden ans Licht gebracht (Lemire
et al. (1989), J. Biol. Chem. 264: 20206 und Kaiser et al. (1987),
Science 235: 312).
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In
bestimmten Ausführungsfonmen
der vorliegenden Erfindung liegen die getesteten Verbindungen in Form
von Peptiden aus einer Peptid-Bibliothek vor. Die Peptid-Bibliothek
der vorliegenden Erfindung nimmt die Form eine Zellkultur ein, in
der im Wesentlichen jede Zelle ein und üblicherweise nur ein Peptid
der Bibliothek exprimiert. Während
die Diversität
der Bibliothek maximiert wird, wenn jede Zelle ein Peptid einer
unterschiedlichen Sequenz produziert, ist es üblicherweise klug, die Bibliothek
so zu konstruieren, dass eine gewisse Redundanz vorliegt. Abhängig von
der Größe können die
kombinatorischen Peptide der Bibliothek wie sie sind exprimiert
werden oder können
in größere Fusionsproteine
eingebaut werden. Das Fusionsprotein kann beispielsweise eine Stabilität gegen
einen Abbau oder eine De naturierung ebenso wie ein Sekretionssignal
bereitstellen, wenn es sezerniert wird. In einer beispielhaften
Ausführungsform
einer Bibliothek für
intrazelluläre Expression
wird beispielsweise zur Verwendung in Verbindung mit intrazellulären Targetrezeptoren,
die Polypeptid-Bibliothek als Thioredoxin-Fusionsproteine exprimiert
(siehe beispielsweise US-Patente
5 270 181, 5 292 646 und die PCT-Offenlegung WO94/02502). Das kombinatorische
Peptid kann am Terminus des Thioredoxin-Proteins befestigt werden
oder für
kurze Peptid-Bibliotheken,
in die so genannte aktive Schlaufe eingefügt werden.
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In
einer Ausführungsform
wird die Peptid-Bibliothek so gewonnen, dass sie eine kombinatorische
Bibliothek von Polypeptiden exprimiert, die nicht auf irgendwelchen
bekannten Sequenzen basieren, noch von cDNA abgeleitet sind. Das
heißt,
die Sequenzen der Bibliothek sind größtenteils zufallsbedingt. In
bevorzugten Ausführungsformen
sind die kombinatorischen Polypeptide im Bereich von 3–110 Aminosäuren Länge, besonders
bevorzugt 5–50
und am meisten bevorzugt zumindest 10, 13, 15, 20 oder 25 Aminosäurereste
lang. Vorzugsweise sind die Polypeptide der Bibliothek gleichförmig lang.
Es wird verständlich
sein, dass die Länge
des kombinatorischen Peptids irgendwelche unerheblichen Sequenzen,
die vorliegen können,
um die Expression zu erleichtern, beispielsweise Signalsequenzen
oder Invariante Anteile eines Fusionsproteins, nicht widerspiegeln.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird die Peptid-Bibliothek so gewonnen, dass sie eine kombinatorische
Bibliothek von Polypeptiden exprimiert, die zumindest teilweise
auf einer bekannten Polypeptidsequenz oder eines Teils hiervon basieren
(nicht eine cDNA-Bibliothek).
Das heißt,
die Sequenzen der Bibliothek sind halb-zufallsbedingt, und sind
durch kombinatorische Mutagenese einer bekannten Sequenz abgeleitet.
Siehe beispielsweise Ladner et al., PCT-Veröffentlichung WO90/02909; Garrard
et al., PCT-Veröffentlichung WO92/09690;
Marks et al. (1992), J. Biol. Chem. 267: 16007–16010; Griffths et al. (1993),
EMBO J. 12: 725–734;
Clackson et al. (1991), Nature 352: 624–628; und Barbas et al. (1992),
PNAS 89: 4457–4461.
Demgemäß können Polypeptide,
die für
einen Target-Rezeptor bekannte Liganden sind, durch Standardtechniken mutagenisiert
werden, um eine variegierte Bibliothek von Polypeptidsequenzen zu
gewinnen, die weiter nach Agonisten und/oder Antagonisten gescreent
werden. Beispielsweise kann der Surrogat-Ligand, der für FPRL-1 identifiziert
wurde, beispielsweise Ser-Leu-Leu-Trp-Leu-Thr-Cys-Arg-Pro-Trp-Glu-Ala-Met-Peptid mutagenisiert
werden, um eine Bibliothek von Peptiden zu erzeugen, die eine gewisse
Beziehung zum originalen Tridecapeptid aufweisen. Diese Bibliothek
kann in einer Reagenz- Zelle
der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, und andere Rezeptor-Aktivatoren
können
aus der Bibliothek isoliert werden. Dies kann die Identifizierung noch
potenterer FPRL-1-Surrogant-Liganden
ermöglichen.
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Alternativ
kann die Bibliothek unter Bedingungen exprimiert werden, bei denen
die Zellen mit dem ursprünglichen
Tridecapeptid in Berührung
gebracht werden, beispielsweise wird der FPRL-1-Rezeptor durch den
Surrogat-Liganden induziert. Peptide von einer exprimierten Bibliothek
können
auf Grundlage ihrer Fähigkeit,
die Induktion zu potenzieren oder die Induktion zu inhibieren, isoliert
werden, verursacht durch den Surrogat-Liganden. Das Letztere wird
selbstverständlich
potentielle Antagonisten von Chemoattractans-Rezeptoren identifizieren.
In noch weiteren Ausführungsformen
kann der Surrogant-Ligand dazu verwendet werden, exogene Verbindungsbibliotheken
(Peptid und Nicht-Peptid) zu screenen, die durch Modulieren der
Aktivität des
identifizierten Surrogats, vermutlich ebenfalls in ähnlicher
Weise die Wirkung des nativen Liganden auf den Zielrezeptor bewirken
werden. In solchen Ausführungsformen
kann der Surrogat-Ligand auf die Zellen aufgebracht werden, obwohl
es bevorzugt durch die Reagenz-Zelle erzeugt wird, wodurch eine
autokrine Zelle bereitgestellt wird.
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In
einer noch weiteren Ausführungsform
werden die kombinatorischen Polypeptide aus einer cDNA-Bibliothek
erzeugt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung erzeugen die Hefezellen kollektiv eine „Peptid-Bibliothek", die vorzugsweise
zumindest 103 bis 107 unterschiedliche
Peptide einschließt,
sodass diverse Peptide simultan bezüglich ihrer Fähigkeit
untersucht werden können,
mit dem exogenen Rezeptor zu interagieren. In einer besonders bevorzugten
Ausführungsform
werden zumindest einige Peptide der Peptid-Bibliothek in das Periplasma
sezerniert, wobei sie mit den „extrazellulären" Bindungsstellen
eines exogenen Rezeptors interagieren können. Sie ahmen somit die klinische
Interaktion von Arzneistoff mit zellulären Rezeptoren enger nach.
Diese Ausführungsform
kann optional weiterhin verbessert werden (in Assays, die eine Pheromon-Sekretion
nicht erfordern), indem die Pheromon-Sekretion vermieden wird und
dadurch eine Konkurrenz zwischen dem Peptid und dem Pheromon um
die Signalpeptidase und andere Bestandteile des Sekretionssystemes
zu vermeiden.
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In
bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden die Peptide der Bibliothek durch
ein Gemisch aus DNA-Molekülen
unterschiedlicher Sequenz codiert. Jedes Peptid-codierende DNA-Molekül ist mit
einem Vektor-DNA-Molekül
ligiert, und das sich ergebende rekombinant DNA-Molekül wird in
eine Hefezelle eingebracht. Weil es eine Frage der Chance ist, welches
Peptid-codierende DNA-Molekül
in eine spezielle Zelle eingebracht wird, ist es nicht vorhersehbar,
welches Peptid diese Zelle erzeugen wird. Jedoch auf Basis der Kenntnis
der Weise, in der das Gemisch hergestellt wurde, kann man bestimmte
statistische Vorhersagen über
das Gemisch von Peptiden in der Peptid-Bibliothek machen.
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Die
Peptide der Bibliothek können
aus konstanten und variablen Resten zusammengesetzt sein. Wenn der
n-te Rest derselbe für
alle Peptide der Bibliothek ist, ist diese eine so genannte konstante
Bibliothek. Wenn der n-te Rest variiert, abhängig vom fraglichen Peptid,
ist sie eine variable Bibliothek. Die Peptide der Bibliothek werden
zumindest einen und üblicherweise
mehr als einen variablen Rest aufweisen. Ein variabler Rest kann
zwischen irgendeinem von 2 oder 20 der genetisch codierten Aminosäuren variieren;
die variablen Reste des Peptids können in derselben oder in einer
anderen Weise variieren. Darüber
hinaus kann die Frequenz des Auftretens der erlaubten Aminosäuren an
einer speziellen Resteposition gleich oder verschieden sein. Das
Peptid kann ebenfalls ein oder mehrere konstante Reste aufweisen.
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Es
existieren zwei Hauptwege, in denen die erforderlichen DNA-Gemische
erzeugt werden. Bei einem Verfahren werden die DNAs Base für Base synthetisiert.
Wenn eine Variation erwünscht
ist, wird an einer Basenposition, die durch den genetischen Code
vorgegeben ist, ein geeignete Gemisch an Nukleotiden mit der naszenten
DNA umgesetzt, eher als das reine Nukleotid-Reagenz einer konventionellen
Polynukleotid-Synthese.
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Das
zweite Verfahren stellt eine exaktere Kontrolle über die Aminosäure-Variation
bereit. Zunächst werden
Trinukleotid-Reagenzien hergestellt, wobei jedes Trinukleotid ein
Codon eines (und nur eines) der Aminosäuren ist, das in der Peptid-Bibliothek
dargeboten wird. Wenn ein spezieller variabler Rest synthetisiert
werden soll, wird ein Gemisch der geeigneten Trinukleotide hergestellt
und mit der naszenten bzw. naszierenden DNA umgesetzt. Wenn einmal
die notwendige „degenerierte" DNA vollständig ist,
muss diese mit den DNA-Sequenzen
verbunden werden, was notwendig ist, um die Expression des Peptids
sicherzustellen, wie unten ausführlicher
diskutiert wird, und das vollständige
DNA-Konstrukt muss in die Hefezelle eingebaut werden.
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In
Ausführungsformen,
in denen die Testverbindungen Peptide sind, kann es wünschenswert
sein, solche Peptide im Kontext einer Leader-Sequenz zu exprimieren.
Hefezellen werden durch eine Lipid-Bilayer gebunden, die als die
Plasmamembran bezeichnet werden. Zwischen dieser Plasmamembran und
der Zellwand befindet sich der periplasmatische Raum. Peptide, die
durch Hefezellen durch die Plasmamembran hindurch sezerniert werden,
durch eine Vielzahl von Mechanismen, treten dadurch in den periplasmatischen
Raum ein. Die sezernierten Peptide sind dann frei, mit anderen Molekülen zu interagieren,
die im Periplasma vorliegen oder auf der Außenoberfläche der Plasmamembran dargeboten
werden. Die Peptid machen dann entweder eine Wiederaufnahme in die
Zelle durch, diffundieren durch die Zellwand in das Medium oder
werden innerhalb des periplasmatischen Raums abgebaut.
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Die
Test-Polypeptid-Bibliothek kann in das Periplasma durch irgendeine
Anzahl beispielhafter Mechanismen sezerniert werden, abhängig von
der Natur des Expressionssystems, an das sie gebunden sind. In einer
Ausführungsform
kann das Peptid strukturell an eine Hefesignalsequenz gebunden sein,
wie beispielsweise diejenige, die im α-Faktor-Präcursor vorliegt, die eine Sekretion
durch das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat leitet.
Weil dies derselbe Weg ist, dem das Rezeptorprotein auf seiner Reise
zur Plasmamembran folgt, besteht die Gelegenheit in den Zellen,
die sowohl den Rezeptor als auch die Peptid-Bibliothek exprimieren,
dass ein spezifisches Peptid mit dem Rezeptor während des Transits durch den
sekretorischen Weg interagiert. Es wurde postuliert, dass dies in
Säugetierzellen
eintritt, die eine autokrine Aktivierung zeigen. Eine solche Interaktion
könnte
eine Aktivierung der Reaktionswege während des Transits ermöglichen,
was noch die Identifizierung solcher Zellen erlauben würde, die
einen Peptid-Agonisten exprimieren. Für Situationen, in denen die
Peptid-Agonisten für
extern aufgebrachte Rezeptor-Agonisten gesucht werden, wäre dieses System
nach wie vor effektiv, weil sowohl der Peptid-Antagonist als auch
der Rezeptor an der Außenseite
der Zelle zusammen geliefert werden würden. Somit wären solche
Zellen, die einen Antagonisten produzieren, selektierbar, weil der
Peptid-Antagonist in geeigneter Weise und zeitgerecht angeordnet
wäre, um
zu verhindern, dass der Rezeptor durch extern aufgebrachten Agonisten
stimuliert wird.
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Ein
alternativer Mechanismus zur Abgabe von Peptiden an den periplasmatischen
Raum besteht darin, die ATP-abhängigen
Transporter der STE6/MDR1-Klasse zu verwenden. Der Transportweg
und die Signale, die ein Protein oder Peptid zu diesem Weg dirigieren,
sind nicht so gut charakterisiert, wie es beim endoplasmatischen
Retikulum basierten sekretori schen Weg der Fall ist. Nichts desto
trotz können
diese Transporter offensichtlich bestimmte Peptide effizient exportieren,
direkt durch die Plasmamembran hindurch, ohne dass die Peptide den
ER/Golgi-Weg durchqueren müssen.
Es wird angenommen, dass zumindest eine Untergruppe von Peptiden
durch diesen Weg durch Exprimieren der Bibliothek im Kontext der α-Faktor-Prosequenz und
des terminalen Tetrapeptids sezerniert werden kann. Der mögliche Vorteil
dieses Systems besteht darin, dass der Rezeptor und das Peptid nicht
miteinander in Berührung
kommen, bis beide an die externe Oberfläche der Zelle abgegeben werden.
Somit macht das System strikt die Situation eines Agonisten oder
Antagonisten nach, der normalerweise von außerhalb der Zelle abgegeben
wird. Die Verwendung jedes der beschriebenen Wege liegt innerhalb
des Umfangs der Erfindung. Die vorliegende Erfindung erfordert keine
periplasmatische Sekretion oder, falls eine solche Sekretion bereitgestellt
wird, irgendeines speziellen Sekretionssignals oder Transportweges.
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VI. Screening und Selektion
-
Die
Fähigkeit
spezieller Testverbindungen, eine Signaltransduktionsaktivität des Rezeptors
von Interesse zu modulieren, kann durch Nachweisen der Nach-oben-
oder Nach-unten-Regulation
eines Nachweissignals gescort werden. Beispielsweise können Veränderungen
der endogenen Hefe-Zweiten-Messenger-Erzeugung (beispielsweise GTPase-Aktivität, Phospholipid-Hydrolyse
oder Protein-Phosphorylierungsmuster oder Enzym-Aktivität) direkt
gemessen werden. Alternativ kann die Verwendung eines Indikatorgenes
oder eines heterologen Reportergenes einen geeigneten Read-out bereitstellen.
In jedem Falle kann die Veränderung des
Nachweissignales dazu verwendet werden, die Identifizierung von
Verbindungen, die die Signalgebung über den Rezeptor modulieren,
zu vereinfachen.
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Zweite Messenger-Produktion
(Second Messenger Production)
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In
bestimmten Ausführungsformen
können
Veränderungen
der intrazellulären
zweiten Messenger-Wege biochemisch nachgewiesen werden, d. h. durch
Messen der Veränderungen
der zweiten Messenger, die durch Modulation eines endogenen Hefe-Signalgebungsweges
erzeugt werden. Beispielsweise können
Veränderungen
der intrazellulären
Ca2+, Phosphorylierungszustände von
Proteinen, Aktivitäten
intrazellulärer
Enzyme und dergleichen nachgewiesen werden. Noch weitere Nachweistechniken
schließen
mikrophysiometrische Vorrichtungen ein, die den Nachweis kleiner
Veränderungen
in beispielsweise Ionen oder den intrazellulären pH ermöglichen. In weiteren beispielhaften
Ausführungsformen
können
die Modulation beispielsweise der Adenylylcyclase, des zyklischen
GMP, von Phosphodiesterasen, Phosphoinositidasen, Phosphoinositolkinasen
und Phospholipasen ebenso wie einer Vielzahl von Ionen untersucht
werden.
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In
einer Ausführungsform
kann die GTPase enzymatischer Aktivität durch G-Proteine in Plasmamembran-Zubereitungen
gemessen werden, in dem der Abbau bzw. die Aufschlüsselung
von γ32P GTP unter Verwendung von Techniken bestimmt
werden, die in der Technik bekannt sind (beispielsweise siehe Signal
Transduction: A Practical Approach. G. Milligan, Hsg. Oxford University
Press, Oxford England). Wenn Rezeptoren, die cAMP modulieren, getestet
werden, wird es möglich
sein, Standardtechniken für
die cAMP-Detektion zu verwenden, beispielsweise kompetitive Assays,
die [3H]cAMP in Gegenwart unmarkiertem cAMP quantifizieren.
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Bestimmte
Rezeptoren und Ionenkanäle
stimulieren die Aktivität
von Phospholipase C, die den Abbau von Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat
zu 1,4,5-IP3 (das intrazelluläres
Ca++ mobilisiert) und Diacylglycerol (DAG)
stimuliert (das Proteinkinase C aktiviert). Inositol-Lipide können unter
Verwendung von Standard-Lipidextraktionstechniken extrahiert und
analysiert werden. DAG kann ebenfalls unter Verwendung einer Dünnschichtchromatographie
gemessen werden. Wasserlösliche
Derivat aller drei Inositol-Lipide (IP1, IP2, IP3) können ebenfalls
unter Verwendung von Radiomarkierungstechniken oder HPLC quantifiziert
werden.
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Das
andere Produkt des PIP2-Abbaus, DAG, kann ebenfalls aus Phosphatidylcholin
erzeugt werden. Der Abbau dieses Phospholipids in Reaktion auf Rezeptor-vermittelte
Signalgebung kann ebenfalls unter Verwendung einer Vielzahl von
Radiomarkierungstechniken gemessen werden. Die Aktivierung von Phospholipase
A2 kann in einfacher Weise unter Verwendung bekannter Techniken
quantifiziert werden, einschließlich
beispielsweise der Erzeugung von Arachodonat in der Zelle.
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In
anderen Ausführungsformen,
beispielsweise im Falle bestimmter Rezeptoren und Ionenkanäle, kann
es wünschenswert
sein, nach Veränderungen
der zellulären
Phosphorylierung zu screenen. Derartige Assayformate können von
Nutzen sein, wenn der Rezeptor von Interesse eine Rezeptorkinase
oder Phosphatase ist. Beispielsweise Immunblotting (Lyons und Nelson (1984),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7426–7430) unter Verwendung von
Anti-Phosphotyrosin-,
Anti-Phosphoserin- oder Anti-Phosphothreonin-Antikörpern. Zusätzlich können Tests
nach einer Phosphorylierung ebenfalls von Nutzen sein, wenn der
Rezeptor selbst nicht eine Kinase sein kann, jedoch Proteinkinasen
oder Phosphatase aktiviert, die stromabwärts des Signaltransduktionsweges
funktionieren.
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Eine
solche Kaskade ist der MAP-Kinaseweg, der sowohl mitogene, Differenziations-
und Stress-Reaktionen in unterschiedlichen Zelltypen zu vermitteln
scheint. Die Stimulation von Wachstumsfaktorrezeptoren haben die
Ras-Aktivierung, gefolgt von einer sequentiellen Aktivierung von
c-Raf, MEK und p44- und p42-MAP-Kinasen (ERK1 und ERK2) zur Folge.
Eine aktivierte MAP-Kinase phosphoryliert dann viele regulatorische
Schlüsselproteine,
einschließlich
p90RSK und Elk-1, die phosphoryliert werden, wenn die MAP-Kinase
zum Kern transloziert. Homologe Wege existieren in Säugetier-
und Hefezellen. Beispielsweise umfasst ein essentieller Teil des
S.-cerevisiae-Pheromon-Signalgebungsweges eine Proteinkinase-Kaskade, die aus
den Produkten der STE11, STE7 und FUS3/KSS1-Gene zusammengesetzt
ist (das letztere Paar wird unterschieden und ist funktionell redundant).
Demgemäß kann eine
Phosphorylierung und/oder Aktivierung von Elementen dieser Kinase-Kaskade
nachgewiesen und verwendet werden, um ein Einschalten des Rezeptors
zu quantifizieren. Phosphotyrosin-spezifische Antikörper sind verfügbar, um
Zunahmen der Tyrosinphosphorylierung zu messen und Phospho-spezifische
Antikörper
sind kommerziell erhältlich
(New England Biolabs, Beverly, MA).
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In
noch weiteren Ausführungsformen
kann das nachweisbare Signal durch Verwendung von Enzymen oder chromogenen/fluoreszierenden
Sonden bzw. Proben erzeugt werden, deren Aktivitäten von der Konzentration eines
zweiten Messengers abhängig
ist, wie beispielsweise Kalizium, Hydrolyseprodukten von Inositolphosphat,
cAMP etc. Beispielsweise kann die Mobilisierung von intrazellulärem Kalzium
oder der Einstrom von Kalzium von außerhalb der Zelle unter Verwendung
von Standardtechniken gemessen werden. Die Auswahl geeigneter Kalizum-Indikator,
fluorenszierender, bioluminiszierender, Metallochromer oder Ca++-empfindlicher Mikroelektroden
hängt vom
Zelltyp und der Magnitude und Zeitkonstante des Ereignisses unserer
Studie ab (Borle (1990), Environ Health Perspect. 84: 45–56). Als
beispielhaftes Verfahren einer Ca++-Detektion
können Zellen
mit dem Ca++-empfindlichen fluoreszierenden
Farbstoff fura-2 oder indo-1 beladen werden, unter Verwendung von
Standard verfahren, und irgendeine Veränderung des Ca++ wird
unter Verwendung eines Fluorometers gemessen.
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Nachweis der
Transkription oder der Transkriptionsprodukte
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Zusätzlich zur
direkten Messung der zweiten Messenger-Produktion kann die Signaltransduktionsaktivität eines
Rezeptors durch Detektion eines Transkriptionsproduktes gemessen
werden, beispielsweise durch Nachweisen einer Rezeptor/Kanal-vermittelten
Transkriptionsaktivierung (oder Repression) eines endogenen Gens
(Gene). Der Nachweis des Transkriptionsproduktes schließt den Nachweis
des Gentranskriptes, den Nachweis des Produktes direkt (beispielsweise
durch Immunassay) oder den Nachweis einer Aktivität des Proteins
(wie beispielsweise einer enzymatischen Aktivität oder chromogenen/fluorogenen
Aktivität
ein; von denen jedes im Allgemeinen hierin als Mittel zum Nachweisen
der Expression des Indikatorgenes bezeichnet wird. Das Indikatorgen
kann ein unmodifiziertes endogenes Gen der Hefezelle oder ein modifiziertes
endogenes Gen sein.
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In
einer Ausführungsform
ist das Indikatorgen ein unmodifiziertes endogenes Gen. Beispielsweise kann
das vorliegende Verfahren auf dem Nachweis der Transkriptionsstärke eines
solchen Pheromon-Systemweg-reponsiven endogenen Gens beruhen, wie
dem Bar1 oder Fu1, Fu2, Paarungsfaktor, Ste3 Ste13, Kex1, Ste2,
Ste6, Ste7, sSst2 oder Chs1 (Appletauer und Achstetter (1989), Eur.
J. Biochem. 181: 243).
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In
weiteren Ausführungsformen
kann die Empfindlichkeit eines endogenen Indikatorgens durch Manipulieren
der Promotorsequenz am natürlichen
Ort für
das Indikatorgen erhöht
werden. Eine solche Manipulation kann sich von Punktmutationen für die endogenen
regulatorischen Elemente zu groß angelegtem
Ersatz aller oder aller wesentlichen Teile der regulatorischen Elemente
erstrecken. Die frühere
Diskussion von Mutationen bezüglich
von G-Proteinen
und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren wird hierin wiederholt.
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Beispielsweise
kann im Falle des Bar1-Gens der Promotor des Genes so modifiziert
werden, dass die Transkription von Bar1 nach Aktivierung des Hefe-Pheromonsystemweges
erhöht
wird. Die Bar1-Gentranskription wird nach Exposition von Hefezellen
gegenüber
dem Paarungsfaktor inaktiviert. Die Sequenz des Bar1-Gens ist in
der Technik bekannt (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4 613 572).
Darüber
hinaus wurden die Sequenzen, die für eine α- Faktor-erhöhte Expression des Bar1 erforderlich
ist und anderer Pheromon-responsiver Gene, identifiziert (Appletauer
und Achstetter (1989), Eur. J. Biochem. 181: 243; Hagen et al. (1991), Mol.
Cell. Biol. 11: 2952). In einer beispielhaften Ausführungsform
kann der Hefe-Bar1-Promotor
durch Mutagenese so verändert
werden, dass er responsiver wird, beispielsweise gegenüber einer
stärkeren
Promotorgen-Transkription, nach Simulation des Hefe-Pheromonwegs. Standardtechniken
zur Mutagenisierung des Promotors können verwendet werden. In solchen
Ausführungsformen
ist es wünschenswert,
dass das konservierte Oligonukleotid-Motiv, das von Appletauer et
al. beschrieben wird, konserviert ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann der endogene Bar1-Promotor einer Hefezelle ersetzt werden, beispielsweise
durch homologe Rekombination, durch einen Bar1-Promotor, der so
verändert
wurde, dass er eine höhere
Expressionsstärke
von Bar1 nach Pheromon-Stimulierung
verursacht.
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In
einer weiteren beispielhaften Ausführungsform kann der Promotor
(oder andere Transkriptions-regulatorische Sequenzen) des endogenen
Genes mit einer heterologen Promotor-Sequenz „ausgeschaltet" werden, beispielsweise,
um ein chimäres
Gen am Indikator endogenen Gen-Ort zu bilden. Wiederum können zur
Verwendung solcher Techniken wie homologer Regulation die regulatorische
Sequenz am genomischen Ort des Indikatorgenes so verändert werden.
Beispielsweise kann der Bar1-Promotor am Bar1-Ort ersetzt werden
durch den Promotor für
das fus1(oder fus2)-Gen. Der fus 1-Promotor weist eine höhere Ansprechbarkeit gegenüber der
Stimulation durch Pheromon-Induktion als der Bar1-Promotor auf und
kann demgemäß die Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisse
und den dynamischen Bereich des Indikatorgens erhöhen. Beispielsweise wurde
fus1 und fus2 für
Promotoren an anderen Orten substituiert, wie beispielsweise der
can1-Promotor. Diese Stämme
wurden Canavanin-empfindlich
nach Expression des can1-Gens. Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet,
um die fus1- und fus2-Promotoren stromaufwärts des ura3-Gens anstelle
des ura3-Promotors einzufügen,
wodurch eine Uracil-Prototrophie in einer Art und Weise übertragen
wurde, die von der Aktivierung des Hefe-Pheromonsignalweges abhängig ist.
Desgleichen können
die fus1- und fus2-Promotorregionen
stromaufwärts
der anderen Gene eingeführt
werden, um ihre Expression zu kontrollieren: gal1 (verleiht eine
Desoxygalactose-Empfindlichkeit oder Galactose-Empfindlichkeit aufgrund
des gleichzeitigen Verlustes des gal10-Gens); β-D-Glucanase (exg1: ein einfach
untersuchtes extrazelluläres
Enzym); Chitinase (cts1); Asparaginase (ast3: hydrolysiert Asparagin
zu Ammoniak und Aspartat); und Invertase (suc2); sezernierte saure Phosphatase
(pho3 oder pho5).
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Es
kann in bestimmten Ausführungsformen
wünschenswert
sein, das Niveau der Transkriptionsaktivierung des endogenen Indikatorgens
durch den Signalweg zu erhöhen,
um beispielsweise das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis des Testsystems zu verbessern
oder um das Niveau der Reaktion auf ein Niveau einzustellen, das
für eine
spezielle Nachweistechnik geeignet ist. In einer Ausführungsform
kann die Transkriptionsaktivierungsfähigkeit des Signalweges durch Überexpression
einer oder mehrerer der in die intrazelluläre Signalkaskade involvierten
Proteine amplifiziert werden, insbesondere von Enzymen, die in den
Weg involviert sind. Beispielsweise kann eine erhöhte Expression
von Jun-Kinasen (JNKs) das Niveau der Transkriptionsaktivierung
durch ein Signal in einem MEKK/JNKK-Weg potenzieren. Desgleichen
kann die Überexpression
eines oder mehrerer Signaltransduktionsproteine im Hefe-Pheromonweg die Konzentration
der Fus1-, Fus2- und/oder Bar1-Expression erhöhen. Dieser Ansatz kann ebenfalls
dazu verwendet werden, das Niveau der Transkription eines heterologen
Reportergens (unten beschrieben) ebenso zu verstärken.
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Enzymaktivierung
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In
noch weiteren Ausführungsformen
kann eher als die Messung der zweiten Messenger-Produktion oder von Veränderungen
der Transkription die Aktivität
endogener Hefeproteine untersucht werden. Beispielsweise kann in
einer Ausführungsform
der Signaltransduktionsweg des Rezeptors die Expression nach oben regulieren
oder ein Enzym in anderer Weise aktivieren, das zum Modifizieren
eines Substrates in der Lage ist, das der Zelle zugesetzt werden
kann. Das Signal kann durch Verwendung eines nachweisbaren Substrates nachgewiesen
werden, und in diesem Falle wird der Verlust des Substratsignales überwacht
oder alternativ durch Verwendung eines Substrates, das ein nachweisbares
Produkt verwendet. In bestimmten Ausführungsformen kommt das Substrat
natürlich
vor. Alternativ kann das Substrat nicht-natürlich vorkommend sein.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Enzym, das das Substratpeptid spaltet, das Produkt des BAR1-Gens,
dessen Expression durch Simulation des Hefe-Pheromonweges nach oben
reguliert wird. Somit können
Hefezellen, die erzeugt wurden, um den Pheromonsignalweg zum Nachweis
auszubeuten, mit einem geeigneten Detektionsmittel in Berührung ge bracht
werden, d. h. ein Substratpeptid, das durch BAR1 gespalten werden
kann, um ein nachweisbares Fragment freizusetzen, beispielsweise
ein nachweisbar markiertes Fragment, und die Ebene der BAR1-Aktivität wird somit
bestimmt.
-
Veränderungen
der Enzym-Aktivität,
die durch die Interaktion einer Testverbindung und eines Rezeptors
vermittelt werden, können
durch eine Vielzahl von Mitteln nachgewiesen werden. In bevorzugten
Ausführungsformen
wird die Umwandlung des Substrates unter Verwendung eines semiquantitativen
Plattenassays gemessen, um die BAR1p-Aktivität, wie in Beispiel 2 beschrieben,
zu messen. Als illustrative Ausführungsform können Zellen,
denen endogenes BAR1 fehlt (als „Testhefestamm" bezeichnet) in einem
geeigneten Medium gezüchtet
werden. Die Über-Nacht-Kulturen
können
dann auf Medium gegossen werden, das α-Faktor enthält, einige Minuten stehengelassen
werden und abgegossen werden. Dies hat die Bildung konfluenter und
sogar eines Rasens von Testwellen zur Folge. Weil der ausplattierte
Rasen von Zellen kein BAR1-Gen aufweist, ist er gegenüber α-Faktor überempfindlich,
was dessen Wachstum auf der α-Faktor-Platte
anhält.
Ein Medium aus BAR1-induzierbaren Hefezellen, das gegenüber Testverbindungen
exponiert wurde, kann auf seine Fähigkeit getestet werden, das
Wachstum der BAR1-defizienten Testhefezellen im Rasen zu ermöglichen.
Das Wachstum des Zellrasens zeigt, dass BAR1 im Medium anwesend
ist und dass deswegen das Pheromonsystem der BAR1-induzierbaren
Hefezelle durch Kontakt mit der Testverbindung moduliert wurde.
Unter Verwendung dieses Assays können
zweifache Unterschiede in der BAR1-Aktivität über einen hundertfachen Konzentrationsbereich
unterschieden werden.
-
In
besonders bevorzugten Ausführungsformen
erzeugt die Umwandlung des Substrates zum Produkt durch das Enzym
eine nachweisbare Veränderung
der optischen Eigenschaften der Testzelle, beispielsweise wird das
Substrat und/oder das Produkt chromogen oder fluorogen aktiv. In
einer illustrativen Ausführungsform verursacht
der Signaltransduktionsweg eine Veränderung der Aktivität eines
proteolytischen Enzyms, unter Veränderung der Geschwindigkeit,
in der sie ein Substratpeptid spaltet (oder einfach das Enzym hin
zum Substrat aktiviert). Das Substratpeptid kann ein fluorogenes
Donor-Radikal einschließen,
beispielsweise ein Fluoreszenz-imitierendes Radikal und ein Akzeptorradikal,
beispielsweise ein aromatisches Radikal, das die Fluoreszenzenergie
des fluorogenen Donor-Radikals absorbiert, wenn das Akzeptorradikal
und das fluorogene Donor-Radikal kovalent in enger Nachbarschaft
gehalten werden. Siehe beispielsweise USSN 5 527 681, 5 506 115,
5 429 766, 5 424 186 und 5 316 691; und Capobianco et al. (1992),
Anal. Biochem. 204: 96–102.
Beispielsweise weist das Substratpeptid eine Fluoreszenz-Donor-Gruppe
wie beispielsweise 1-Aminobenzoesäure (Anthranilsäure oder
ABZ) oder Aminomethylcoumarin (AMC) auf, lokalisiert an einer Position
am Pepsid und einen Fluoreszenz-Quencher-Gruppe, wie beispielsweise
Lucifer-Gelb bzw. Lucifer Yellow, Methyl-Rod oder Nitrobenzo-2-oxo-1,3-diazol
(NBD) bei einer unterschiedlichen Position nahe dem distalen Ende
des Peptids. Eine Spaltstelle für
das aktivierte Enzym wird zwischen jeder der Stellen für den Donor
und die Akzeptor-Gruppen angeordnet. Der intramolekulare Resonanzenergietransfer
vom Fluoreszenz-Donor-Molekül
zum Quencher wird die Fluoreszenz des Donor-Moleküls quenchen
bzw. löschen,
wenn die beiden ausreichend nah beabstandet sind, beispielsweise
wenn das Peptid intakt ist. Nach Spaltung des Peptids jedoch wird
der Quencher von der Donor-Gruppe abgespalten und lässt ein
fluoreszierendes Fragment zurück.
Somit hat die Aktivierung des Enzyms eine Spaltung des Nachweispeptids
zur Folge und ein Dequenching der fluoreszierenden Gruppe. In einer
bevorzugten Ausführungsform
wird das zur Untersuchung der BAR1-Aktivität verwendete Substrat an einen
fluoreszierenden Donor konjugiert, wie beispielsweise 5-[(2-Aminoethyl)amino]naphtalin-1-sulfonsäure (EDANS)
und ein Quench-Akzeptor wie beispielsweise 4-(4-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure (DABCYL).
In einer bevorzugten Ausführungsform
besteht das Substrat aus einem Peptid, das die BAR1p-Erkennungssequenz
mit (EDANS) und (DABCYL), jeweils and den COOH- und NH2-Termini
befestigt, enthält.
In einer weiteren Ausführungsform
umfasst das Substrat weiterhin eine GABA-Gruppe zwischen der EDANS-Gruppe
und der ersten Aminosäure
am COOH-Terminus (beispielsweise der Trp-Rest). Die intrinsische
Fluoreszenz von EDANS reduziert erwarteterweise das Substrat dramatisch
wegen einem intramolekularen Fluoreszensresonanz-Energietransfer
(FRET) an die DABCYL-Gruppe. Weil FRET außerhalb von Distanzen von 100
A insignifikant wird, wird die Fluoreszenz von EDANS nach Spaltung
des Substrats wiederhergestellt (Matayoshi et al. (1990), Science
247: 954). Somit kann die proteolytische Aktivität kontinuierlich durch Aufzeichnen
der Zunahme der Fluoreszenzintensität über die Zeit überwacht
werden.
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Alternativ
kann eine Benzamidin-, Benzyloxycyrbonyl(Cbz)-Gruppe am N-Terminus
des Substrates und eine Rhodamin-Gruppe am C-Terminus des Substrates
befestigt werden. Freies Rhodamin oder mono-substituiertes Rhodamin
existiert in erster Linie als hoch fluoreszentes Chinon. Jedoch
existiert bis-substituiertes Rhodamin als tatsächlich nicht-fluoreszierendes
Lacton (McGrath et al., Virologty, 1996 217: 131). Somit weist das
bis-substituierte
BAR1p-Substrat eine sehr geringe Fluoreszenz auf. Die Peptide am
Substrat werden vor ihrer Spaltung durch Aminopeptidasen geschützt. Die
Spaltung des Peptids mit BAR1p macht das restliche Rhodamin-angefügte Peptid
gegenüber
einer Aminopeptidasenspaltung empfänglich. Aminopeptidase-Entfernung
des Peptids von Rhodamin hat die Produktion von hoch fluoreszierenden
mono-substituierten und freien Rhodamin-Molekülen zur Folge.
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In
einer Ausführungsform
ist das zu untersuchende Substrat natürlich-vorkommender Hefe-α-Faktor. In einer
bevorzugten Ausführungsform
umfasst ein Substrat die folgende Verbindung:
DABCYL-Trp-Leu-Gln-Leu-Lys-Pro-Gly-Gln-Pro-Met-Tyr-EDANS
(SEQ ID NO: 4)
-
In
einer noch weiteren Ausführungsform
umfasst ein bevorzugtes Substrat die Verbindungen:
Cbz-Trp-Leu-Gln-Leu-Lys-Pro-Gly-Gln-Pro-Met-Tyr-NH2-Rhodamine (SEQ ID NO: 5).
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Zymogen-Aktivierung
-
In
einer zusätzlichen
Ausführungsform
kann die Bar1-Aktivität
durch Nachweisen der Aktivierung eines Enzym-Vorläufers zu
einem aktiven Enzym gemessen werden. Zymogene sind Enzym-Vorläufer, die
nach einer spezifischen beschränkten
proteolytischen Behandlung aktiv werden. Bei der Herstellung eines
Zymogen-Substrates zur Verwendung in den vorliegenden Assays wird
eine Bar1-empfindliche Stelle (beispielsweise die Sequenz von ungefähr 9–10 Aminosäuren vom
Hefe-α-Faktor,
einschließlich
der Leu-Lys-Sequenz) zwischen der Vorläufer-Pro-Region eines Zymogens
und der reifen (aktiven) Proteinsequenz durch Standardgentechnik
eingeführt.
Die Behandlung des Zymogens mit Bar1p setzt dann aktives Enzym aus
dem Zymogen frei. Unter Verwendung dieses Nachweisverfahrens können Hefezellen
oder Überstände aus
Hefezellen, die durch eine Verbindung stimuliert werden, zur Erzeugung
von Bar1, durch Messen der Umwandlung von Zymogen zu aktivem Enzym
getestet werden, beispielsweise durch Nachweisen der Spaltung eines
Substrates, das gegenüber
einer Spaltung durch das aktive Enzym empfindlich ist. Beispiele
für Zymogene,
die in solchen Assays nütz lich
sind, schließen
Trypsinogen, Plasminogen, Prothrombin, Pepsinogen, Fibrinogen und
Hefe-Carboxypeptidase Y ein Verfahren zum Untersuchen der Aktivität der aktiven
Enzyme, die aus diesen Zymogenen abgeleitet sind, sind in der Technik
wohl bekannt.
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Das
obige System kann ebenfalls zur intrazellulären Zymogen-Prozessierung angepasst
werden. In einer beispielhaften Ausführungsform kann die Bar1-Protease
zytoplasmatisch durch Exzision der Sequenzen exprimiert werden,
die zur Sekretion aus dem Gen notwendig sind, was die intrazelluläre Expression
des reifen Bar1-Proteins zur Folge hat. Zellen, die dieses intrazelluläre Bar1p
exprimieren, werden dann gentechnisch so verändert, dass sie intrazelluläres Zymogen
mit einer Bar1p-sensitiven Spalt- und Aktivierungsstelle, wie oben beschrieben,
coexprimieren.
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Um
eine Bar1p-Aktivität
nachzuweisen, d. h. die Umwandlung des Zymogens zum aktiven Enzym, können mehrere
Assays verwendet werden. Beispielsweise kann das bakterielle Lac-Alpha-Fragment mit
einem großen
Peptid oder Protein fusioniert werden. Eine solche Funktion ach
Lac-Alpha unfähig,
mit dem Lac-Omega-Fragment zu komplementieren (diese Komplementierung
ist die Basis der Blau-Weiß-Unterscheidung
von In-frame-Insertionsklonen in Lac-Alpha-Vektoren). Wenn jedoch
eine solche Bar1-empfindliche Stelle benachbart der Lac-Alpha-Peptidfusionskreuzung
eingeschlossen ist, wird eine Behandlung mit Bar1p das funktionelle
Lac-Alpha-Peptid freisetzen, das nunmehr dazu in der Lage ist, Lac-Alpha-Omega
zu komplementieren. Somit kann die Bar1-Aktivität als Farbveränderung
in der Zelle abgelesen werden. β-Galactosidase-Enzymaktivität kann durch
irgendeine in einer Vielzahl von üblicherweise verwendeten Verfahren
nachgewiesen und gemessen werden, wobei die am meisten bevorzugten
das chromogene Assay auf Basis von Indigo-Farbstoffbildung nach
Behandlung des X-gal-Substrates ist. In einer weiteren Ausführungsform
kann dieses System in die obige Zymogen-Ausführungsform eingebaut werden,
was sowohl β-Galactosidase
als auch Zymogen-Ablesungen ermöglicht.
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Substrat-Stabilität
-
In
einer noch weiteren Ausführungsform
eines Assays, der auf der Detektion der Modulation eine Enzymaktivität beruht,
kann ein Enzymsubstrat derart modifiziert werden, dass die Spaltung
durch das Enzym eine Destabilisierung des Substrates zur Folge hat
(ein Beispiel hiervon ist weiter in Beispiel 5 beschrieben). Beispielsweise
sind Proteine mit Lys an ihrem N-Terminus in Hefe instabil (Bachmair
und Varshavsky (1989), Cell 56: 1019). Demgemäß wird ein Enzymsubstrat abgespalten
werden, sodass ein N-terminales Lys exponiert wird und an ein einfach
zu untersuchendes Nachweisprotein fusioniert werden kann. Beispielsweise
kann das BAR1-Substrat, α-Faktor,
an ein nachweisbares Gen, beispielsweise ein lacZ-Gen, fusioniert
werden. In bevorzugten Ausführungsformen
kann es wünschenswert
sein, das endogene BAR1-Gen zu modifizieren, um Signale zur Sekretion
zu entfernen (vorliegend am N- und
C-Terminus von BAR1), wodurch eine Interaktion von BAR1 mit zytoplasmatischen
Substraten erhöht
wird. In bestimmten Ausführungsformen
ist das Nachweisprotein ein essentielles Protein, das somit eine
Negativselektion für
die BAR1-Expression oder -Aktivität bereitstellt. In anderen
Ausführungsformen
kann ein Repressorprotein als Nachweisprotein verwendet werden, wodurch
eine positive Ablesung bereitgestellt wird.
-
Verwendung
chimärer
Konstrukte zur Herstellung endogener Pheromon-responsiver Gene
-
In
einer noch weiteren Ausführungsform
können
chimäre
Konstrukte verwendet werden, die eine Pheromon-Ansprechbarkeit für endogene
Hefe-Gene verleiht, die normalerweise nicht Pheromon-ansprechbar sind,
wie in Beispiel 6 beschrieben ist. Solche Konstrukte umfassen ein
Segment eines Genes, das einen Pheromon-induzierbaren Transkriptionsfaktor
codiert, wie beispielsweise den Ste12p-Transkriptionsfaktor. Beispielsweise
wird im Falle einer Pheromon-Signalgebung Ste12p ein potenter Transkriptionsaktivator
von Genen, deren Promotoren eine wohl definierte DNA-Bindungsstelle
enthalten (das Pheromon-Respons-Element oder PRE). Die chimären Konstrukte
umfassen weiterhin ein zweites Segment, das eine DNA-Bindungsdomäne codiert,
die eine DNA-Sequenz im Promotor des endogenen Genes codiert, auf
das eine Pheromon-Ansprechbarkeit übertragen werden soll. Das
Gen, aus dem das zweite Segment abgeleitet ist, wird auf Grundlage
der erwünschten
Ablesung ausgewählt
werden. Wenn beispielsweise der Assay unter Verwendung von Gen A
als Ablesung konstruiert werden soll (wegen der Vereinfachung der
Untersuchung für
das Produkt von Gen A), dann codiert das zweite Segment des chimären Konstruktes
eine DNA-Bindungsdomäne,
die an den Gen-A-Promotor bindet und eine Expression eines Genes
A induziert, das untersucht werden soll. Beispielsweise codiert
in einer bevorzugten Ausführungsform
das zweite Segment des Konstruktes die DNA-Bindungsdomäne von Pho4p.
Wildtyp-Pho4p bindet und aktiviert de Promotor des PHO5, ein sezerniertes
alkalisches Phosphatase-Gen. Nach Expression des chimären Konstruktes
wird die Signalgebung durch den Pheromonreaktionsweg das Pho4-Ste12-Fusionsprotein,
das durch das chimäre
Konstrukt codiert ist, aktivieren, und danach wird dieses Pho4-Ste12-Fusionsprotein
an die Pho4-Bindungsstelle im Pho5-Promotor binden und die Expression
des PHO5-Genes induzieren.
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In
Assays, die Chimäre
Konstrukte verwenden, wird die Modulation eines Rezeptors durch
eine Testverbindung eine Veränderung
der Transkription eines Genes zur Folge haben, das normalerweise
nicht Pheromon-responsiv ist. In bevorzugten Ausführungsformen
ist dieses Gen einfach nachweisbar. Beispielsweise kann in einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegende Assay dazu verwendet werden, Pho5, eine sezernierte
saure Phosphatase, zu messen. Die saure Phosphatase-Aktivität kann unter
Verwendung von Standardtechniken gemessen werden. Beispielsweise
kann der Überlagerungs-Assays
von Toh-e et al. (J. Bacteriol. 1973) verwendet werden. Beispielsweise
werden Zellen auf das geeignete Medium aufgesetzt und über Nacht wachsengelassen.
Für jede
Platte wird ein Gemisch aus 2 ml geschmolzener 1%iger Agarose in
50 mM NaAc pH 4,0, 700 μl
H2O und 300 μl α-Naphthyl saures Phosphat (50
mg/ml) hergestellt und auf die Platte aufgebracht. Danach werden
1 ml D-Dianisidin Fast Blue Salz B (50 mg/ml in 50 mM NaAc ph 4,0)
auf die Platte gegossen. Der Grad der Farbentwicklung ist ein Maß für die Konzentration
der sauren Phosphatase, die durch das Pflaster aus Zellen erzeugt
wurde. Eine solche Farbentwicklung weist auf die Modulation eines
Rezeptors durch eine Testverbindung hin.
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In
bestimmten Ausführungsformen
werden solche chimären
Konstrukte weiterhin eine Kernlokalisierungssequenz umfassen.
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Wie
oben angezeigt, ist die DNA-Bindungsdomäne des Konstruktes (d. h.,
die durch das zweite Segment des Konstrukts codiert ist) aus der
PHO4 DNA-Bindungsdomäne.
Die Sequenz der PHO4 DNA-Bindungsdomäne ist in der Technik bekannt.
Das Konstrukt kann ein Segment des natürlich vorkommenden PHO4-Gens
umfassen oder kann ein Segment umfassen, das aus dem natürlich vorkommenden
PHO4-Gen abgeleitet ist, das jedoch verändert wurde, beispielsweise
durch Mutation. In bevorzugten Ausführungsformen codiert das zweite
Gensegment die Aminosäuren
227–312
der PHO4 DNA-Bindungsdomäne.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird das Pheromon-induzierbare Transkriptionsfaktor (d. h. durch
das erste Gensegment des Konstruktes codiert) vom Ste12-Gen abgleitet.
Irgendeines einer Vielzahl von Ste12-Fragmenten kann in den gegenständlichen
Kon strukten verwendet werden. Die Sequenz von Ste12 ist in der Technik
bekannt. Es existieren mehrere Informationsquellen bezüglich der
Sequenz von Ste12, auf die sich der Fachmann berufen kann, wenn
das Segment von Ste12 ausgewählt
wird, das in das chimäre Konstrukt
eingebaut werden soll. Beispielsweise wurden Fusionen zwischen der
Ga14-DNA-Bindungsdomäne und unterschiedlichen
Regionen von Ste12 hergestellt (Song et al., Genes & Development,
1991). Zusätzlich wurden
Deletions- und Insertions-Mutanten von Ste12 konstruiert und auf
ihre Fähigkeit
hin getestet, die Paarung und die Transkriptionsaktivität eines
ste12Δ-Stammes
wiederherzustellen (Kirman-Correia et al., Mol. Cell. Biol., 1993).
Solche Experimente stellen eine Anleitung bezüglich der Anteile von Ste12
bereit, die in die Konstrukte eingebaut werden können, und diese Anteile sind
wahrscheinlich einer Mutation zugänglich.
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Die
chimären
Konstrukte der vorliegenden Erfindung können ein Segment umfassen,
das von einer natürlichen
DNA-Sequenz abgeleitet ist, oder die gegenständlichen Konstrukte können ein
Segment umfassen, das zu einem natürlich vorkommenden Gen homolog
ist, das jedoch verändert
wurde, beispielsweise durch Mutation. Irgendeines der Standardverfahren
zur Herstellung von Mutationen, die in der Technik bekannt oder
hierin diskutiert sind, können
für diesen
Zweck verwendet werden.
-
Beispielsweise
umfasst in bevorzugten Ausführungsformen
das erste Gensegment, das in das Konstrukt eingebaut wird, eine
Nukleotidsequenz, die die Aminosäuren
1–473
des natürlich
vorkommenden Ste12 codiert. In einer weiteren Ausführungsform
umfasst das Konstrukt eine Nukleotidsequenz, die die Aminosäuren 214–473 des
natürlich
vorkommenden Ste12 codiert. In einer weiteren Ausführungsform
umfasst das Konstrukt eine Nukleotidsequenz, die die Aminosäuren 214–688 von
natürlich
vorkommenden Ste12 umfasst. In einer noch weiteren Ausführungsform
umfasst das Konstrukt eine Nukleotidsequenz, die Aminosäuren 1–688 von
natürlich
vorkommendem Ste12 codiert.
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In
noch weiteren Ausführungsformen
kann das Segment des Konstruktes, das aus dem Ste12-Gen abgeleitet ist,
eine Mutation umfassen. Beispielsweise kann in einer Ausführungsform
eine solche Mutation die Einfügung
einer oder mehrerer Aminosäuren
zur Folge haben, beispielsweise die Insertion von Lys-Leu zwischen
den Aminosäuren
85 und 86 von Ste12. In einer weiteren Ausführungsform kann eine solche
Mutation die Insertion von Ser-Leu zwischen den Amionosäuren 103
und 104 zur Folge haben. In einer noch weiteren Ausführungs form
können
1 oder mehrere Aminosäuren
deletiert werden, beispielsweise die Aminosäuren 253–305, 572–669 oder 588–669.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist das endogene Hefe Gen, das einem Gen entspricht, das im Konstrukt
vorliegt, gestört.
Beispielsweise können
in bevorzugten Ausführungsformen
Hefezellen, die ein Ste12-PHO4-Konstrukt tragen, derart gentechnisch
verändert
werden, dass das PHO4-Gen der Wirtshefezelle gestört werden
kann. In weiteren Ausführungsformen
kann das PHO3-Gen, das ebenfalls eine sezernierte saure Phosphatase
codiert, das jedoch unter Hoch-Phosphat-Bedingungen induziert wird,
und das weiter durch Thiamin-Aussonderung bzw. -Abreicherung erhöht wird,
gestört
werden kann.
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Heterologe Ablesungen:
Reportergen-Konstrukte
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In
noch weiteren Ausführungsformen
kann ein heterologes Genkonstrukt dazu verwendet werden, die Modulation
eines Rezeptors nachzuweisen. Durch Auswahl von transkriptionalen
regulatorischen Sequenzen, die gegenüber transduzierten intrazellulären Signalen
responsiv sind und operativ die ausgewählten Promotoren an Reportergene
binden, deren Transkription oder Translation einfach nachweisbar
und messbar ist, stellt ein Transkription-basierter Assay einen
raschen Nachweis bereit, ob ein spezifischer Rezeptor mit einer
Testverbindung in irgendeiner Weise interagiert, die die intrazelluläre Transduktion
moduliert. Die Expression des Reportergens stellt somit ein wertvolles
Screening-Werkzeug zur Entwicklung von Verbindungen bereit, die
als Agonisten oder Antagonisten eines solchen Rezeptors dienen.
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Reportergen-basierte
Assays dieser Erfindung messen das Endstadium der oben beschriebenen
Kaskade von Ereignissen, beispielsweise einer Transkriptionsmodulation.
Demgemäß wird bei
der Ausübung
einer Ausführungsform
der Erfindung ein Reportergen-Konstrukt in die Reagenz-Zelle eingeführt, um
ein Nachweissignal zu erzeugen, abhängig von der Rezeptorsignalgebung.
Typischerweise wird das Reportergen-Konstrukt ein Reportergen in
operativer Bindung mit ein oder mehreren Transkriptions-regulatorischen
Elementen einschließen,
die gegenüber
der Signaltransduktionsaktivität
des Targetrezeptors responsiv sind, wobei die Expressionstärke des
Reportergens das Rezeptor-abhängige
Detektionssignal bereitstellt. In einer weiteren Ausführungsform
kann die Menge der Transkription aus dem Indikatorgen unter Verwendung
irgendeines Verfahrens gemessen werden, von dem dem Fachmann auf
dem Gebiet bekannt ist, dass es geeignet ist.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird das Produkt des Reportergenes durch intrinsische Aktivität nachgewiesen,
die mit diesem Produkt assoziiert ist. Beispielsweise kann das Indikatorgen
ein Genprodukt codieren, das, durch enzymatische Aktivität, ein Detektionssignal
auf Grundlage beispielsweise von Farbe, Fluoreszenz oder Lumineszenz
entstehen lässt.
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Die
Expressionsmenge aus dem Reportergen wird dann mit der Expressionsmenge
in jeder der selben Zellen in Abwesenheit der Testverbindung verglichen,
oder sie kann mit der Menge der Transfektion in einer im Wesentlichen
identischen Zelle verglichen werden, der die spezifischen Rezeptoren
fehlen. Eine Kontrollzelle kann aus denselben Zellen gewonnen werden,
aus denen die Testzelle hergestellt wurde, die jedoch nicht mit
der Verbindung behandelt wurde. Alternativ kann sie eine Zelle sein,
in der der Rezeptor von Interesse nicht vorliegt. Irgendeine Veränderung
der Transkriptionsmenge (Beispiel 2 eine statistisch signifikante
Veränderung)
zeigt, dass die Testverbindung in einer gewissen Weise die Aktivität des spezifischen
Rezeptors oder Ionenkanals verändert
hat.
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In
anderen bevorzugten Ausführungsformen
stellt das Reportergen ein Selektionsverfahren derart bereit, dass
Zellen, bei denen eine Aktivation (oder Inaktivation) eines oder
mehrerer Signalwege eines Rezeptors oder Ionenkanals vorliegt, einen
Wachstumsvorteil gegenüber
der behandelten Zelle bereitstellt. Beispielsweise könnte die
Expression des Indikatorgens die Zelllebensfähigkeit erhöhen, ein Zellernährungserfordernis
lindern und/oder eine Arzneistoffresistenz bereitstellen.
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Viele
beispielhafte Reportergene und Transkriptions-regulatorische Elemente
sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und andere können durch
Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, identifiziert oder synthetisiert
werden. Derartige Beispiele von Reportergenen schließen ein,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, CAT (Chloramphenicolacetyltransferase) (Alton und Vapnek (1979),
Nature 282: 864–869),
Luciferase und andere Enzymdetektionssysteme wie beispielsweise β-Galaktosidase;
Glühwürmchen-Luciferase
(deWet et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 725–737); bakterielle Luciferase
(Engebrecht und Silverman (1984), PNAS 1: 4145–4158; Baldwin et al. (1984),
Biochemistry 23: 3663–3667);
alkalische Phosphatase (Toh et al. (1989), Eur. J. Biochem. 182:
231–238;
Hall et al. (1983), J. Mol. Appl. Gen. 2: 101), humane placentale
sezernierte alkalische Phosphatase (Cullen und Malim (1992), Methods
in Enzymol. 2: 362–368); β-Lactamase
oder GST.
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Transkriptionskontrollelemente
zur Verwendung in den Reportergen-Konstrukten oder zum Modifizieren
des Genortes eines Indikatorgens schließen ein, sind jedoch nicht
beschränkt
auf, Promotoren, Enhancher und Repressor- und Aktivator-Bindungsstellen.
Geeignete Transkriptions-regulatorische Elemente können aus den
Transkriptions-regulatorischen Regionen von Genen abgeleitet werden,
deren Expression rasch induziert wird, im Allgemeinen innerhalb
von Minuten eines Kontakts zwischen dem Zelloberflächenprotein
und dem Effektorprotein, das die Aktivität des Zelloberflächenproteins
moduliert. Beispiele für
solche Gene schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, the immediate early genes (unmittelbare frühe Gene) (siehe Sheng et al. (1990),
Neuron 4: 477–485),
wie beispielsweise c-fos. Immediate-Early-Gene, die nach Bindung eines Liganden
an ein Zelloberflächenprotein
rasch induziert werden. Die Transkriptionskontrollelemente, die
zur Verwendung in den Genkonstrukten bevorzugt sind, schließen Transkriptionskontrollelemente
für Immediate-Early-Gene,
Elememente, die aus anderen Genen abgeleitet sind, die einige oder
alle der Charakteristika der Immediate-Early-Gene zeigen, oder synthetische
Elemente ein, die derart konstruiert sind, dass Gene in operativer
Bindung hiermit derartige Charakteristika zeigen. Die Eigenschaften
bevorzugter Gene, aus denen die Transkriptionskontrollelemente abgeleitet
sind, schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, niedrige oder nicht nachweisbare Expression in ruhenden Zellen,
eine rasche Induktion der Transkriptionsniveaus innerhalb von Minuten
nach extrazellulärer
Stimulation, die Induktion, die transient bzw. vorübergehend
ist und von einer neuen Proteinsynthese abhängt, abschließende Shut-off
der Transkription erfordert eine neue Proteinsynthese und mRNAs,
die aus diesen Genen transkribiert wurden, weisen eine kurze Halbwertszeit
auf. Es ist nicht notwendig, dass all diese Eigenschaften vorliegen.
-
Weitere
Promotoren und Transkriptionskontrollelemente, zusätzlich zu
den oben beschriebenen, schließen
das vasoaktive intestinale Peptid(VIP)-Genpromotor (CAMP-responsiv;
Fink et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6662–6666);
Somatostatin-Gen-Promotor (cAMP-responsiv,
Montminy et al. (1986); Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 6682–6686);
den Proenkephalin-Promotor
(responsiv gegenüber
cAMP, Nikotinsäureagonisten und
Phorbolestern; Comb et al. (1986), nature 323: 353–356); den
Phosphoenolpyruvatcarboxy-Kinase-Gen-Promotor (cAMP-responsiv; Short
et al. (1986), J. Biol. Chem. 261: 9721–9726); den NGFI-A-Gen-Promotor (responsiv
gegen über
NGF, cAMP und Serum; Changelian et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci.
86: 377–381)
und andere ein, die bekannt sein können oder die vom Fachmann
auf dem Gebiet hergestellt werden können.
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Im
Falle von Rezeptoren, die zyklisches AMP modulieren, kann ein Transkriptions-basierter
Read-out bzw. Ablesung unter Verwendung des zyklischen AMP-Reaktionselement-Bindungsproteins,
CREB, konstruiert werden, das ein Transkriptionsfaktor ist, dessen
Aktivität
durch Phosphorylierung an einem speziellen Serin reguliert wird
(S133). Wenn dieser Serin-Rest phosphoryliert ist, bindet CREB an
eine Erkennungssequenz, die als CRE bekannt ist (cAMP-responsives
Element), das am 5' von
Promotoren zu finden ist, von denen bekannt ist, das sie gegenüber erhöhten cAMP-Konzentrationen
responsiv sind. Nach Bindung von phosphoryliertem CREB an wird für die Transkription
aus diesem Promotor erhöht.
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Die
Phosphorylierung von CREB ist in Reaktion sowohl auf erhöhte cAMP-Konzentrationen
als auch erhöhte
intrazelluläre
Ca-Konzentrationen ersichtlich. Erhöhte cAMP-Konzentrationen haben die Aktivierung von
PKA zur Folge, was wiederum CREB phosphoryliert und zur Bindung
an CRE und Transkriptionsaktivierung führt. Erhöhte intrazelluläre Kaliziumkonzentrationen
haben eine Aktivierung von Kalzium/Calmodulin-responsiver Kinase
II (CaM-Kinase II) zur Folge. Die Phosphorylierung von CREB durch
CaM-Kinase II ist effektiv dieselbe wie die Phosphorylierung von
CREB durch PKA und hat die Transkriptionsaktivierung von CRE-enthaltenden
Promotoren zur Folge.
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Ein
Transkriptions-basierter Read-out kann in Zellen konstruiert werden,
die ein Reportergen enthalten, dessen Expression durch einen basalen
Promotor angetrieben wird, der ein oder mehrere CRE enthält. Veränderungen
der intrazellulären
Konzentration an Ca++ (eine Folge von Veränderungen
der Aktivität
des Rezeptors nach Bindung mit einem Liganden) haben Veränderungen
der Expressionsstärke
des Reportergenes zur Folge, wenn: a) CREB ebenfalls in der Zelle
coexprimiert wird und b) entweder eine endogene oder heterologe
CaM-Kinase CREB in Reaktion auf Erhöhungen des Kalzium phosphoryliert
oder, wenn eine exogen exprimierte CaM-Kinase II in derselben Zelle
vorliegt. Mit anderen Worten, kann eine Stimulierung der PLC-Aktivität des Phosphorylierung
von CREB und eine erhöhte
Transkription aus dem CRE-Konstrukt zur Folgen haben, während eine
Hemmung der PLC-Aktivität
eine gesenkte Transkription aus dem CRE-responsiven Konstrukt zur
Folge haben kann.
-
Wie
in Bonni et al. (1993), Science 262: 1575–1579, beschrieben, führt die
Beobachtung dass CNTF-Behandlung von SK-N-MC-Zellen zur erhöhten Interaktion
von STAT/p9i und STAT-verwandten
Proteinen mit speziellen DNA-Sequenzen führt, zum Vorschlag, dass diese
Pro teine Schlüsselregulatoren
der Veränderungen
der Genexpression sein könnten,
die durch CNTF ausgelöst
werden. Konsistent mit dieser Möglichkeit
ist die Erkenntnis, dass DNA-Sequenzelemente ähnlich den
Konsensus-DNA-Sequenzen, die für
die STAT/p91-Bindung erforderlich sind, stromaufwärts eine
Anzahl von Genen vorliegen, von denen sich kürzlich herausgestellt hat,
dass sie von CNTF induziert werden (beispielsweise humanes c-fos,
Maus-c-fos, Maus-tis11,
Ratten-junB, Ratten-SOD-1 und CNTF). Diese Autoren zeigten die Fähigkeit
von STAT/p91-Bindungsstellen eine CNTF-Reaktivität auf ein nicht-responsives
Reportergen zu übertragen.
Demgemäß kann ein
Reporterkonstrukt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zum
Nachweis einer Signaltransduktion durch StAT-Proteine, beispielsweise
aus Cytokin-Rezeptoren, durch Verwendung von –71 bis +109 des Maus-c-fos-Genes
fusioniert an das bakterielle Chloramphenicolacetyltransferasegen
(–71 fosCAT)
oder ein anderes nachweisbares Reportergen erzeugt werden. Die Induktion
durch einen Cytokin-Rezeptor
induziert die Tyrosinphosphorylierung von STAT und STAT-verwandten
Proteinen mit einer anschließenden
Translokation und Bindung dieser Proteine an STAT-RE. Dies führt dann
zur Aktivierung der Transkription von Genen, die dieses DNA-Element
enthalten, innerhalb ihrer Promotoren.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist das Reportergen ein Gen, dessen Expression eine phänotypische
Veränderung
verursacht, die screenbar oder selektierbar ist. Wenn die Veränderung
selektierbar ist, erzeugt die phänotypische
Veränderung
einen Wachstumsunterschied oder einen Unterschied der Überlebensrate
zwischen Zellen, die das Reportergen exprimieren und die dieses
nicht exprimieren. Falls die Veränderung screenbar
ist, erzeugt die phänotypische
Veränderung
einen Unterschied in einigen nachweisbaren Eigenschaften der Zelle,
durch die die Zelle, die den Reporter exprimiert, von solchen, die
es nicht tun, unterschieden werden kann. Die Selektion ist gegenüber dem
Screening zu bevorzugen, insofern, als sie ein Mittel zum Amplifizieren
solcher Zellen aus der Zellkultur bereitstellen kann, die ein Testpolypeptid
exprimieren, das ein Rezeptoreffektor ist.
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Das
Reportergen wird an den Rezeptorsignalgebungsweg so gekoppelt, dass
die Expression des Reportergenes abhängig von der Aktivierung des
Rezeptors ist. Diese Kopplung kann durch operatives Verbinden des
Reportergenes mit einem Rezeptor-responsiven Promotor erreicht werden.
Der Begriff „Rezeptor-responsiver
Promotor" zeigt
einen Promotor an, der durch ein Produkt des Rezeptorsignaltransduktionsweges
reguliert wird.
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Alternativ
kann der Promotor ein Promotor sein, der durch den Rezeptorweg exprimiert
wird, durch Vermeiden der Expression eines Produktes, das für die Zelle
zerstörerisch
ist. Mit einem Rezeptor-unterdrückten
Promotor screent man nach Agonisten durch Binden des Promotors an
ein schädliches
Gen und für
Antagonisten durch dessen Bindung an ein vorteilhaftes Gen. Die
Unterdrückung
kann durch operatives Binden eines Rezeptor-induzierten Promotors
an ein Gen erreicht werden, das mRNA codiert, das antisens ist gegenüber zumindest
einem Anteil der mRNA, die durch das Reportergen codiert wird (gleichgültig ob
in der codierenden oder der flankierenden Region), um eine Translation
dieser mRNA zu hemmen. Die Unterdrückung kann ebenfalls durch
Binden eines Rezeptor-induzierten Promotors an ein Gen gewonnen
werden, das ein DNA-Bindungsrepressorprotein codiert und durch Einbauen
eines geeigneten Operatorortes in den Promotor oder einer weiter
geeigneten Region des Reportergens.
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Im
Falle der Hefe fließen
geeignete positiv selektierbare (vorteilhafte) Gene wie folgend
ein: URA3, LAS2, HIS3, LEU2, TRP1; ADE1,2,3,4,5,7,8; ARG1,3,4,5,6,8;
HIS1,4,5; THR1,4; TRP2,3,4,5; LEU1,4; MET2,3,4,8,9,14,16,19; URA1,2,4,5,10;
HOM3,6; ASP3; CHO1; ARO2,7; CYS3; OLE1; INO1,2,4; PRO1,3. Zahllose
andere Gene sind potentiell selektive Marker. Das Obere ist in wohl-charakterisierte
biosynthetische Wege involviert. Das Imidazolglycerolphosphatdehydratase
(IGP-Dehydratase)-Gen (HIS3) wird bevorzugt, weil es sowohl ziemlich
empfindlich ist, als auch über
einen breiten Bereich an Expressionsstärken selektiert werden kann.
Im einfachsten Falle ist die Zelle für Histidin autotroph (erfordert
Histidin zum Wachstum) in Abwesenheit einer Aktivierung. Die Aktivierung
führt zur
Synthese des Enzyms und die Zelle wird prototroph für Histidin
(erfordert Histidin nicht). Somit erfolgt die Selektion bezüglich eines
Wachstums in Abwesenheit von Histidin. Weil nur einige wenige Moleküle pro Zelle
für eine
Histidin-Prototrophie erforderlich sind, ist der Assay sehr empfindlich.
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In
einer komplexeren Version des Assays können die Zellen bezüglich einer
Resistenz gegenüber Aminotriazol
(AT) ausgewählt
werden, ein Arzneistoff, der die Aktivität der IGP-Dehydratase hemmt. Zellen mit einer
niedrigen, fixierten Expressionsstärke von HIS3 sind gegenüber dem
Arzneistoff empfindlich, wohingegen Zellen mit höheren Stärken resistent sind. Die Menge
an AT kann ausgewählt
werden, um Zellen mit einer Basisstärke der HIS3-Expression (was auch
immer diese Stärke
ist) zu hemmen, erlauben jedoch das Wachstum von Zellen mit einem
induzierten Expressionsniveau. In diesem Falle erfolgt die Selektion nach
dem Wachstum in Abwesenheit von Histidin und in Anwesenheit einer
geeigneten Konzentration an AT.
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In
geeigneten Assays können
so genannte gegen-selektierbare oder negativ-selektierbare Gene
verwendet werden. Geeignete Gene schließen ein: URA3 (Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase; hemmt das Wachstum
von 5-Fluororotsäure),
LYS2 (2-Aminoadipatreduktase;
hemmt das Wachstum von α-Aminoadipat als
einziger Stickstoffquelle), CYH2 (codiert das ribosomale Protein
L29; Cycloheximid-empfindliches Allel ist gegenüber einem resistenten Allel
dominant), CAN1 (codiert Argininpermease; Null-Allele verleiht gegen
Arginin-Analog Canavanin eine Resistenz) und andere rezessive Arzneistoff-resistente Marker).
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In
einem Beispiel betrifft das Reportergen das Hefezellwachstum. Die
natürliche
Reaktion auf ein Signaltransduktion über die Hefe-Pheromonsystemreaktionswege
ist für
Zellen, einen Wachstumstopp durchzumachen. Dies ist der bevorzugte
Weg, nach Antagonisten gegenüber
einem Liganden/Rezeptor-Paar zu selektieren, das den Weg induziert.
Ein autokriner Peptid-Antagonist
würde die
Aktivierung des Weges hemmen; daher wäre die Zelle dazu in der Lage,
zu wachsen. Somit könnte
das FAR1-Gen als endogener gegen-selektierbarer Marker bezeichnet
werden. Das FAR1-Gen wird vorzugsweise inaktiviert, wenn nach einer
Agonistenaktivität
gescreent wird.
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Das
Reportergen kann ebenfalls ein screenbares Gen sein. Die gescreente
Eigenschaft kann eine Veränderung
der Zellmorphologie, des Metabolismus oder anderer screenbarer Merkmale
sein. Geeignete Marker schließen β-Galactosidase
(XgaI, C12FDG, Lachs-gaI, Magenta-GaI (die letzteren
beiden von Biosynth AG)), alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase,
Exo-Glucanase (Produkt des Hefe-exbl-Gens; nichtessentiell, sezerniert);
Luciferase; bakterielles grün
fluoreszierendes Protein; (humane plazentale) sezernierte alkalische
Phosphatase (SEAP); und Chloramphenicoltransferase (CAT). Einige
der obigen kann gentechnisch verändert
werden, sodass sie sezerniert werden (obwohl nicht β-Galactosidase).
Ein bevorzugtes screenbares Reportergen ist eine β-Galactosidase;
Hefezellen, die das Enzym exprimieren, wandeln das farblose Substrat XgaI
in ein blaues Pigment um. Wiederum kann der Promoto Rezeptor-induziert
oder Rezeptor-inhibiert sein.
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In
bestimmten Assays kann es wünschenswert
sein, Veränderungen
des Wachstums in Screening-Verfahren zu verwenden. Beispielsweise
ist eine der Konsequenzen der Aktivierung des Pheromonsignalweges
in Wildtyp-Hefe ein Wachstumsstopp. Wenn man auf einen Agonisten
eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors testet, kann diese normale
Reaktion des Wachstumsstopps dazu verwendet werden, Zellen zu selektieren,
in denen der Pheromonreaktions-Weg gehemmt wurde. Das heißt, Zellen,
die gegenüber
einer Testverbindung exponiert sind, werden in ihrem Wachstum angehalten,
wenn die Verbindung ein Agonist ist, werden jedoch normal wachsen,
wenn die Verbindung neutral ist oder ein Antagonist ist. Somit kann
die Wachstumsstoppreaktion dazu vorteilhaft verwendet werden, Verbindungen
zu entdecken, die als Agonisten oder Antagonisten dienen. Darüber hinaus
kann die Wirkung des Wachstumsstopps ein selektiver Vorteil in Gegenwart eines
Mittels sein, das gegenüber
mitotischen Zellen zytotoxisch ist. Beispielsweise wird während des
Wachstumsstopp-Fensters das zytotoxische Mittel der Kultur zugesetzt.
Zellen, die mit dem Zellzyklus fortfahren, beispielsweise die in
ihrem Wachstum nicht angehalten sind, werden getötet. Nach einiger Zeit folgend
dem Zusatz des zytotoxischen Mittels kann dieses aus der Kultur
gewaschen werden und die überlebenden
Zellen können
mit ihrer Proliferation fortschreiten. Zellen, die durch die Testverbindung
angehalten wurden, werden in der überlebenden Population angereichert.
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Jedoch
ist in bestimmten Ausführungsformen
(insbesondere solchen, in denen eine autokrine Peptid-Bibliothek
verwendet wird) der Wachstumsstopp als Konsequenz der Aktivierung
des Pheromonreaktions-Weges eine unerwünschte Wirkung, weil die Zellen,
die Agonisten binden, in ihrem Wachstum anhalten, wohingegen die
umgebenden Zellen, die nicht an Peptide binden, in ihrem Wachstum
fortfahren. Die Zellen von Interesse werden dann überwuchert
oder ihr Nachweis durch die Hintergrundzellen unklar, wodurch die Identifizierung
der Verbindung von Interesse durcheinandergebracht wird. Um dieses
Problem zu überwinden, lehrt
die vorliegende Erfindung die gentechnische Veränderung der Zelle derart, dass:
1) ein Wachstumsstopp nicht als Folge einer exogenen Signalwegaktivierung
eintreten kann (beispielsweise durch Inaktivierung des FAR1-Gens);
und/der 2) ein selektiver Wachstumsvorteil durch Aktivierung des
Weges verliehen wird (beispielsweise durch Transformieren einer
auxotrophen Mutante mit einem HIS3-Gen unter der Kontrolle eines Pheromon-responsiven
Promotors und Ausüben
selektiver Bedingungen).
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Es
ist wünschenswert,
dass der exogene Rezeptor auf einer kontinuierlichen Basis gegenüber den Peptiden
exponiert wird. Dies ist leider wahrscheinlich Folge einer Desensibilisierung
des Pheromonweges gegenüber
dem Reiz. Beispielsweise ist bekannt, dass der Paarungssignaltransduktionsweg
durch mehrere Mechanismen desensibilisiert wird, einschließlich des
Pheromon-Abbaus und der Modifikation der Funktion des Rezeptors,
von G-Proteinen und/oder stromabwärts liegenden Elementen des
Pheromonsignaltransduktions-Weges durch die Produkte der SST2, STE50,
AFR1 (Konopka, J. B. (1993), Mol. Cell, Biol. 13: 6876–6888) und
SGV1-, MSGS- und SIG1-Gene. Selektierte Mutationen in diesen Genen
können
zu einer Überempfindlichkeit
gegenüber
Pheromon und einem Unvermögen
führen,
sich an das Vorhandensein von Pheromon anzupassen. Beispielsweise
stellt die Einbringung von Mutationen, die mit Funktionen in den
Stämmen,
die heterologe G-Protein-gekoppelte Rezeptoren exprimieren, eine
signifikante Verbesserung bei Wildtyp-Stämmen dar und ermöglicht die
Entwicklung extrem empfindlicher Bioassays für Verbindungen, die mit den
Rezeptoren interagieren. Andere Mutationen, beispielsweise STE50,
sgv1, Bar1, ste2, ste3, pik1, msg5, sig1 und aft1 weisen die ähnliche
Wirkung der Erhöhung
der Empfindlichkeit des Bioassays auf. Somit kann die Desensibilisierung
durch Mutieren vermieden werden (was ein Deletieren miteinschließen kann)
des SST2-Gens, sodass es nicht mehr länger ein funktionelles Protein
produziert oder durch Mutieren eines der anderen oben aufgelisteten
Gene.
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Wenn
eine Testverbindung dabei versagt, die Aktivität eines Rezeptors zu stimulieren,
kann der Assay wiederholt und durch Einführung eines Schrittes modifiziert
werden, bei dem die Reagenz-Zelle zunächst mit einem bekannten Aktivator
des Zielrezeptor/Kanals in Berührung
gebracht wird, um eine Signaltransduktion zu induzieren, und die
Testverbindung kann bezüglich
ihrer Fähigkeit
untersucht werden, den aktivierten Rezeptor/Kanal zu hemmen, beispielsweise
um Antagonisten zu identifizieren. In noch weiteren Ausführungsformen können Batterien
von Verbindungen bezüglich
Mitteln gescreent werden, die die Reaktion auf einen bekannten Aktivator
der Rezeptors potenzieren.
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XII. Genetische Marker
in Hefestämmen
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Hefestämme, die
für Histidin
auxotroph sind (HIS3) sind bekannt, siehe Struhl und Hill (1987),
Mol. Cell. Biol. 7: 104; Fasullo und Davis, Mol. Cell. Biol. (1986)
8: 4370. Das HIS3(Imidazolglycerolphosphatdehydratase)-Gen wurde
als selektiver Marker in Hefe verwendet. Siehe Sikorski und Heiter
(1989), Genetics 122: 19; Struhl et al., PNAS (1979) 76: 1035; und
für FUS1-HIS3-Fusionen,
siehe Stevenson et al. (1992), Genes Dev. 6: 1293.
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XIII. Pharmazeutische
Zubereitungen für
identifizierte Mittel
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Nach
dem Identifizieren bestimmter Testverbindungen in dem gegenständlichen
Assay, beispielsweise als potentielle Surrogat- bzw. Ersatzstoffliganden
oder Rezeptor-Antagonisten, wird der Fachmann, der den vorliegenden
Assay ausübt,
fortfahren, die Wirksamkeit und Spezifität der ausgewählten Verbindungen
sowohl in vitro als auch in vivo zu testen. Gleichgültig, ob
für nachfolgendes
In-vivo-Testen oder zur Verabreichung an ein Tier als zugelassener
Arzneistoff können
im vorliegenden Assay identifizierte Mittel in pharmazeutischen Zubereitungen
zur in vivo-Verabreichung an ein Tier, vorzugsweise einen Menschen,
formuliert werden.
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Die
im vorliegenden Assay selektierten Verbindungen oder pharmazeutisch
verträgliche
Salze hiervon können
demgemäß zur Verabreichung
mit einem biologisch akzeptablen Medium formuliert werden, wie beispielsweise
Wasser, gepufferte Salzlösung,
Polyol (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglycol
und dergleichen) oder geeigneten Gemischen hiervon. Die optimale
Konzentration des aktiven Inhaltsstoffs (Inhaltsstoffe) im ausgewählten Medium
kann empirisch bestimmt werden, gemäß Verfahren, die dem Medizinchemiker
wohl bekannt sind. Wie hierin verwendet schließt „biologisch akzeptables Medium" jedes und alle Lösungsmittel,
Dispersionsmedien und dergleichen ein, die für den erwünschten Verabreichungsweg der
pharmazeutischen Zubereitung geeignet sein können. Die Verwendung solcher
Medien für
pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technik bekannt. Ausgenommen
insofern, als irgendwelche herkömmlichen
Medien oder Mittel mit der Aktivität der Verbindung inkompatibel
sind, wird deren Verwendung in der pharmazeutischen Zubereitung
der Erfindung ins Auge gefasst. Geeignete Trägerstoffe und deren Formulierung, einschließlich anderer
Proteine, sind beispielsweise im Buch Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA 1985) beschrieben.
Diese Trägerstoffe
schließen
injizierbare „Depotformulierungen" ein. Auf Grundlage
des Obigen schließen
solche pharmazeutischen Zubereitungen, obwohl nicht ausschließlich, Lösungen oder
gefriergetrocknete Pulver der Verbindung in Verbindung mit einem
oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmitteln
ein und sind in gepufferten Medien bei einem geeigneten pH enthalten
und sind mit physiologischen Flüssigkeit
isoosmotisch. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Verbindung
in einer sterilen Zubereitung zur topischen und/oder systemischen
Verabreichung angeordnet sein. Im Falle gefriergetrockneter Zubereitungen
kann ein Unterstützen
von Trägerstoffen
wie beispielsweise, jedoch nicht ausschließlich, Mannitol oder Glycin
verwendet werden und geeignete gepufferte Lösungen des erwünschten
Volumens werden bereitgestellt werden, um adäquate isotonische gepufferte
Lösungen
des erwünschten
pHs bereitzustellen. Ähnliche Lösungen können ebenfalls
für die
pharmazeutischen Zusammensetzungen von Verbindungen in isotonischen Lösungen des
erwünschten
Volumens verwendet werden und schließen ein, jedoch nicht ausschließlich, die Verwendung
gepufferter Salzlösungen
mit Phosphat oder Citrat in geeigneten Konzentrationen, um isotonische
pharmazeutische Zubereitungen des erwünschten pHs zu allen Zeitpunkten
zu gewinnen (beispielsweise neutraler pH).
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Beispiele
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Die
Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele
besser verständlich werden,
die lediglich zu Veranschaulichungszwecken bestimmter Aspekte und
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung mitaufgenommen wurden und die Erfindung
nicht einschränken
sollen. Alle Patente, veröffentlichten
Patentanmeldungen und anderen Bezugnahmen, die hierin offenbart
sind, sind ausdrücklich
durch Bezugnahme mitaufgenommen.
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Beispiel 1: Entwicklung
von Assays zur Bar1-Proteaseaktivität
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Dieses
Beispiel beschreibt die Entwicklung von Assays zur Erleichterung
der Verwendung der Bar1-Protease als Anzeige für die Induktion des Pheromonreaktions-Weges
in S. cerevisiae. Das S.-cerevisiae-BAR1-Gen codiert eine Protease,
die das Hefe-α-Faktor-Peptidpheromon erkennt
und spaltet. Bar1p spaltet das reife 13 Aminosäure-α-Faktor-Peptid zwischen den
Resten 6 und 7 (Leu-Lys), und macht das Pheromon inaktiv. Bar1p
weist drei Merkmale auf, die es potentiell als Ablesesystem nützlich machen:
(1) Das BAR1-Gen wird durch Signalgebung durch den Pheromonreaktions-Weg
induziert. (2) Bar1p wird sezerniert und (3) Bar1p ist ein katalytisches
Enzym, das die Signalamplifikation ermöglicht (Review von Sprague
und Thorner in The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces,
Bd. 2, 1992).
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Stamm-Konstruktion
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Um
die Entwicklung eines Assays für
die Bar1p-Aktivität
zu erleichtern, wurde das BAR1-Gen
in zwei Hefeexpressionsplasmide kloniert. Eines, ein Low-Copy-Vektor,
bei dem das Gen unter seinem Promotor steht, und das andere, ein
High-Copy-Vektor, bei dem das Gen durch den starken konstitutiven
S. cerevisiae PGK-Promotor gesteuert wird. Beide Plasmide enthalten
das S.-cerevisiae-LEU2-Gen, um eine Selektion in Hefe aufrechtzuerhalten.
Die Primer:
#1- 5' CTAATCTCGAGTTAAGAAGGCCGTT
3' (SEQ ID NO: 1)
und
#2-
5' GTTAAGGATCCTGTACTCCAGATTT
3' (SEQ ID NO: 2)
wurden
dazu verwendet, um die Basen –480
bis 1760 des BAR1-Gens von genomischer Hefe-DNA zu amplifizieren.
Das amplifizierte Produkt trägt
eine Xho1-Stelle an seinem 5'-Ende, eine BamH1-Stelle
an seinem 3'-Ende
und enthält
den vollständigen
Bar1-Openreading-Frame bzw. offenes Leseraster ebenso wie alle Promotorelemente,
von denen bekannt ist, dass sie die BAR1-Expression beeinflussen
(Kronstad et al., Cell 1987). Das Produkt wurde mit Xho und BamH
digeriert und in einen Hefeexpressionsvektor subkloniert (pRS415,
hierin als Cadus 1014 bezeichnet; siehe beispielsweise Sikorski
und Hieter, 1989, Genetics, 122: 19) das mit Xho1 und BamH1 digeriert
wurde. Das sich ergebende Plasmid wurde als Cadus 3974 bezeichnet.
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Um
das PGK-BAR1-Expressionsplasmid zu erzeugen, wurden Primer Nr. 2
und Primer
#3- 5' GATATCGTCTCACATGTCTGCAATTA
3' (SEQ ID NO: 3)
dazu
verwendet, Sequenzen zu amplifizieren, die nur das BAR1-offene-Leseraster
aus dem PCR-Produkt, das oben beschrieben wurde, codieren. Das Produkt
trägt eine
BsmB1-Stelle (Digestion mit BsmB1 hat einen NcoI-kompatiblen Überhang
zur Folge) an seinem 5'-Ende
und ein BamH1-Ort an seinem 3'-Ende.
Das Produkt wurde mit BsmB1 und BamH1 digeriert und in Cadus 1651
subkloniert, das mit Nco1 und BamH1 digeriert wurde. Das sich ergebende
Plasmid wurde als Cadus 3975 bezeichnet.
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Cadus
1014, 3974, 1651 und 3975 wurden in Cadus 579 (MATαBar1::hisG::URA3
trp1 leu2 ura3 his3 FUS1::HIS3 sre14::TRP1) eingebracht, ein Hefestamm,
dem seine eigene Kopie des BAR1-Gens fehlt.
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Bar1-Plattenassay
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Ein
halb-quantitativer Plattenassay wurde dazu verwendet, die Bar1p-Aktivität zu messen.
Obwohl Bar1p aus irgendeiner Quelle in diesem Assay verwendet werden
kann, wurde in diesem Beispiel Bar1p, produziert von CY 11362 (Cadus
579, das Cadus 397 enthält)
verwendet. CY-11362-Zellen wurden bis zur Sättigung über Nacht in SD-LEU-Medium
gezüchtet.
Die Zellen wurden aus der Kultur durch Filtration entfernt. Die Aktivität von Bar1p
in den konditionierten Medien wurde durch Tüpfel von 2 μl auf eine Bar1-Assayplatte
(unten beschrieben) gemessen. Um die Empfindlichkeit des Assays
zu bestimmen, wurden acht Zweifach-Serienverdünnungen des konditionierten
Mediums durchgeführt
und 5 μl
jeder Verdünnung
wurde auf die Assayplatte aufgebracht.
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Die
Assayplatten wurden wie folgt hergestellt. CY-579-Zellen wurden über Nacht
in YEPD-Medium gezüchtet. Die Über-Nacht-Kulturen
wurden bis zu OD600 0,1 verdünnt und
einige Stunden wachsengelassen (bis zu OD600 0,4).
Die Zellen wurden dann auf OD600 0,1 in
H2O verdünnt
und 5 ml wurden auf eine YEPD + α-Faktor-Platte
gegossen (1 μg α-Faktor verteilte
sich gleichmäßig auf
der Oberfläche
einer YEPD-Platte knapp vor der Anwendung), wurde einige Minuten
stehengelassen und abgegossen. Dies hat die Bildung eines konfluenten
und gleichmäßigen Zellrasens
auf der YEPD + α-Faktor-Platte
zur Folge. Die konditionierten Medien wurden dann auf die Assayplatte
aufgebracht und die Platte wurde bei 30°C für 1–2 Tage inkubiert.
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Weil
CY 579 das BAR1-Gen fehlt, ist es gegenüber α-Faktor überempfindlich, was einen Wachstumsstopp
auf der YEPD + α-Faktor-Platte
zur Folge hat. Wenn die auf den Rasen aufgebrachten konditionierten Medien
eine Bar1p-Aktivität
enthalten, wird der α-Faktor
in diesem Bereich zerstört
und ermöglicht
das Wachstum der CY-579-Zellen.
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Unter
Verwendung dieses Assays können
zweifache Unterschiede in der Bar1-Aktivität über einen hundertfachen Konzentrationsbereich
unterschieden werden. Somit ist dieser Assay zur Bereitstellung
einer Aktivierung des Pheromonreaktions-Wegs in Zellen von Nutzen,
die nur das endogene BAR1-Gen exprimieren. Die Reihen von Reihenverdünnungen
von CY-11362-konditionierten
Medien, die in diesem Beispiel beschrieben sind, werden dazu verwendet,
eine Standardkurve zu erzeugen und um somit ein halb-quantitatives Assay
für die
Bar1p-Aktivität bereitzustellen.
Zu diesem Zwecke wurde ein großer
Pool von CY-11362-konditionierten
Medien hergestellt und Teilmengen wurden zur Verwendung in anschließenden Experimenten
eingefroren.
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Fluoreszierende
Bar1-Substrate
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Zwei
neue fluoreszierende Substrate wurden entwickelt, um die Aktivität der Bar1p-Protease
in Flüssigkeitsassays
zu überwachen,
die einem High-troughput-Screening gegenüber zugänglich sind. Jedes dieser Substrate
schließt
die Bar1p-Peptid-Erkennungssequenz ein und wurde so entwickelt,
dass die Spaltung von Bar1 ein deutliches Fluoreszenzsignal zur
Folge hat. Das erste Signalsubstrat, nämlich
DABCYL-(GABA)-Trp-Leu-Gln-Leu-Lys-Pro-Gly-Gln-Pro-Met-Tyr-EDANS (SEQ ID NO:
4)
basiert auf einem Substrat für die HIV-1-Protease (Matayoshi
et al., Science, 1990). Das Substrat besteht aus einem Peptid, das
die Bar1p-Erkennungssequenz mit einem fluoreszierenden Donor, nämlich 5-[(2-Aminoethyl)amino]naphthalin-1-sulfonsäure (EDANS)
und einem Löschungsakzeptor,
nämlich
4-(4-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure (DABCYL) gebunden an den
COOH- bzw. NH2-Termini, enthält. Die
intrinsische Fluoreszenz von EDANS wird erwarteterweise dramatisch
in diesem Substrat reduziert, wegen einer intramolekularen Fluoreszenzresonanzenergieübertragung
(FRET) an die DABCYL-Gruppe. Weil FRET jenseits von Distanzen von
100 A insignifikant wird, wird die Fluoreszens von EDANS nach Spaltung
des Peptids wiederhergestellt (Matayoshi et al., Science, 1990).
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Das
zweite Substrat
Cbz-Trp-Leu-Gln-Leu-Lys-Pro-Gly-Gln-Pro-Met-Tyr-NH)2-Rhodamin (SEQ ID NO: 5)
basiert auf
einem Substrat für
die Adenovirus-Proteinase (McGrath et al., Virology, 1996). Freies
Rhodamin oder mono-substituiertes Rhodamin existiert in erster Linie
als hoch fluoreszierendes Chinon. Jedoch existiert bis-substituiertes
Rhodamin als tatsächlich
nicht fluoreszierendes Lacton (McGrath et al., Virology, 1996).
Somit zeigt das bis-substituierte Bar1p-Substrat eine sehr geringe Fluoreszenz.
Dieses Substrat kann in einem gekoppelten Assay verwendet werden,
das eine Spaltung zunächst
durch Bar1p und dann durch zugesetzte Aminopeptidase einschließt. Die
Peptide auf dem Substrat werden vor einer Spaltung durch Aminopeptidasen geschützt. Die
Spaltung des Peptids mit Bar1p macht das übrige Rhodamin-gebundene Peptid
gegenüber
einer Spaltung durch zugesetzte Aminopeptidase empfindlich. Die
Aminopeptidase-Entfernung des Peptids von Rhodamin hat die Produktion
von hoch fluoreszierenden mono-substituierten und freien Rhodamin-Molekülen zur
Folge.
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Zymogen-Aktivierungsassays
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In
einer zusätzlichen
Ausführungsform
kann die Bar1-Aktivität
durch Untersuchen der Aktivierung eines Enzymvorläufers zu
einem aktiven Enzym gemessen werden. Zymogene sind Enzymvorläufer, die
nach spezifischer, begrenzter proteolytischer Behandlung aktiv werden.
Eine Bar1-empfindliche Stelle (beispielsweise die Sequenz von ungefähr 9–10 Aminosäuren von
Hefe-α-Faktor
einschließlich
der Leu-Lys-Sequenz) wird zwischen der Vorläuferpro-Region eines Zymogens und der reifen
(aktiven) Proteinsequenz durch gentechnische Standardtechniken eingebracht.
Eine Behandlung des Zymogens mit Bar1p setzt dann aktives Enzym
aus dem Zymogen frei. Unter Verwendung dieses Nachweisverfahrens
können
Hefezellen oder Überstände aus
Hefezellen, die durch ein Verbindung zur Herstellung von Bar1 stimuliert
wurden, auf ihr Vermögen
hin getestet werden, ein Zymogen zu aktivieren. Die Zymogen-Aktivität wird dann
durch Verfahren gemessen, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt
sind. Beispiele für
Zymogene, die in solchen Assays nützlich sein können, schließen Trypsinogen,
Plasminogen, Prothrombin, Pepsinogen, Fibrinogen und Hefecarboxypeptidase
Y ein.
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Das
obige System kann ebenfalls für
eine intrazelluläre
Zymogen-Verarbeitung angepasst werden. Die Bar1-Protease kann zytoplasmatisch
durch Aufschneiden der Sequenzen exprimiert werden, die für die Sekretion
aus dem Gen notwendig sind, was eine intrazelluläre Expression des reifen BAR1-Proteins
zur Folge hat. Die Zellen, die dieses intrazelluläre Bar1p
exprimieren, werden dann gentechnisch verändert, sodass sie intrazellulär Zymogen
mit einer Bar1p-empfindlichen Spalt- und Aktivierungsstelle wie
oben beschrieben coexprimieren.
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Die
Fusion des bakteriellen Lac-Alpha-Fragmentes mit einem großen Peptid
oder Protein macht es unmöglich,
mit diesem eine Komplementierung mit dem Lac-Omega-Fragment durchzuführen (dies
ist die Basis der Blau-Weiß-Unterscheidung
von In-frame-Insertionsklonen
in Lac-Alpha-Vektoren). Wenn jedoch eine solche Fusion von Lac-Alpha
mit einem anderen Peptid oder Protein einen Bar1-empfindlichen Ort
nahe der Fusionskreuzung derart aufweist, dass eine Behandlung mit
Bar1p ein funktionelles Lac-Alpha-Peptid freisetzt, das nunmehr
zu einer Lac-Alpha-Omega-Komplementierung in der Lage ist. Die β-Galactosidase-Enzymaktivität kann durch
irgendeines einer Vielzahl üblicherweise
verwendeter Verfahren nachgewiesen und gemessen werden, wobei das
am meisten bevorzugte ein chromogener Assay auf Grundlage einer
Indigo-Farbstoffbildung ist, nach Behandlung des Xgal-Substrats.
Dieses System kann in die Zymogen-Ausführungsform wie oben eingebaut
werden, was sowohl β-Galactosidase-
als auch Zymogen-Ablesungen erlaubt.
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Beispiel 2: Nachweis der
Ste2p-Aktivierung unter Verwendung des Bar1-Plattenassays
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Dieses
Beispiel demonstriert die Nützlichkeit
des Bar1-Plattenassays zum Überprüfen einer
Agonisten-induzierten Aktivierung des S.-cerevisiae-Pheromonrezeptors,
Ste2p.
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Stammkonstruktion
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Zunächst wird
das Gen, das das S.-cerevisiae-Gα,
GPA1, codiert, in das Genom von CY 8034 (MATa gpa1*1162far1-1 ste2*1154
ste14::trp1::LYS2 fus1-HIS3 ura3 trp1 leu2 lys2 his3 ade2-1 met1)
durch Transformation mit einem Integrationsplasmid, das GPA1 (Cadus
3907) integriert, eingebracht, was CY 11364 erzeugt. Als nächstes wurde
das Gen, das das S.-cerevisiae-RGS-Protein,
SST2, codiert, in diesem Stamm zerstört, um CY 11645 zu erzeugen.
Weil Sst2p in die Desensibilisierung des Phermononreaktions-Weges
involviert ist, hat seine Zerstörung
einer erhöhte
Signalgebung durch den Weg zur Folge (Review von Sprague und Thomer in
Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces, Bd. 2,
1992).
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Ein
High-Copy-Ste2-Expressionsplasmid wurde wie folgt konstruiert. Das
4,3kb-BamH1-Fragment, das
das gesamte STE2-Gen enthielt, wurde aus dem Hefeexpressionsplamid
Yep24-STE2 ausgeschnitten (bezogen von J. Thomer, Univ. von Californien
Berkeley) und in den BamH1-Ort von pRS425 (Cadus 1018) kloniert
(Sikorski und Heiter, Genetics, 1989). Das sich ergebende Plasmid,
Cadus 2456, und die Vektorkontrolle, Cadus 1018, wurden darauf in
CY 11645 eingebracht, um CY 11728 bzw. CY 11727 zu erzeugen.
-
Detektion der Ste2p-Aktivierung
unter Verwendung des Bar1-Plattenassays
-
Über-Nacht-Kulturen
von CY 11727 und CY 11728 wurden in SD-LEU-Medium bis zu einem OD600 von 0,2 verdünnt, und für einige Stunden bei 30°C wachsengelassen
(bis zu einem OD600 0,4). Die Zellen wurden durch
Zentrifugation gesammelt, mit 1X SD-LEU-Medium gewaschen und in 2 ml SD-LEU-Medium
resuspendiert. Die Kulturen wurden in Hälften aufgeteilt und α-Faktor (10 μg) wurden
in einer Teilmenge zugesetzt und Trägerstoff (in diesem Falle H2O) wurde dem anderen zugesetzt. Nach 2 Stunden
Inkubation bei 30°C
wurden die Zellen entweder durch vier aufeinanderfolgende Runden
der Zentrifugation oder durch Filtration entfernt und 5 μl konditionierte
Medien wurden auf eine Bar1-Assayplatte (beschrieben in Beispiel
1) aufgebracht. Eine Standardkurve wurde ebenfalls mit jedem Experiment
durchgeführt
(in Beispiel 1 beschrieben), um die Ergebnisse zu quantifizieren.
-
Eine
geringe oder keine Bar1p-Aktivität
wurde in konditionierten Medien aus Zellen nachgewiesen, denen das
Ste2p-Expressionsplasmid fehlt. In Zellen, die Ste2p exprimieren,
hatte eine Exposition gegenüber Agonisten
eine größer als
achtfache Zunahme der Bar1p-Aktivität zur Folge. Diese Daten zeigen,
dass der Bar1-Plattenassay zum Nachweis der Aktivierung des S.-cerevisiae-G-Protein-gekoppelten
Rezeptors Ste2p verwendet werden kann. Durch Analogie kann dieser
Assay verwendet werden, um die Aktivierung irgendeines Rezeptors
(einschließlich
nicht homologer, beispielsweise Säugetier-GPCRs), gekoppelt an
S.-cerevisiae-Pheromonreaktions-Wege,
zu verwenden.
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Beispiel 3: Nachweis der
Melatonin-1b-Rezeptoraktivierung in S. cerevisiae unter Verwendung
des Bar1-Plattenassays
-
Dieses
Beispiel demonstriert die Nützlichkeit
des Bar1-Plattenassays zum Nachweisen der Aktivierung von Säugtier-G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren, die an den S.-cerevisia-Pheromonreaktions-Weg gekoppelt sind.
Für diesen
Zweck wurden Hefestämme,
die Melatonin-1b-Rezeptor exprimieren, konstruiert.
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Plasmid und
Stammkonstruktion
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Ein
Plasmid, pcDNA3-hML1b, das den vollständigen Open-Reading-Frame des
humanen Melatonin-1b-Rezeptors enthält, wurde als geeignete Genquelle
verwendet. Die Sequenz des Melatonin-1b-Rezeptors ist in der Technik
bekannt (siehe beispielsweise Genbank Zugangsnummer U253451). Die
Primer
5' CCTCCGGTCTCCCATGTCAGAGAACGGCTCCTT
3' (SEQ ID NO: 6)
und
5' CCTCCGGTCTGGGATCCGAGAGCATCTGCCTGGTGC
3' (SEQ ID NO: 7)
wurden
dazu verwendet, die Rezeptorsequenzen aus diesem Plasmid zu amplifizieren.
Das amplifizierte Produkt trägt
BsaI-Stellen sowohl an den 5'-
als auch 3'-Enden.
Eine Digestion mit BsaI hatte ein Produkt mit einem NcoI-kompatiblem Überhang
am 5'-Ende und einen
BamHI-kompatiblen Überhang
am 3'-Ende zur Folge. Dieses
Produkt wurde Gel-gereinigt und in Cadus 1651 subkloniert, der mit
NcoI und BamHI digeriert wurde. Das sich ergebende Plasmid wurde
als Cadus 3693 bezeichnet.
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Cadus
1651 und 3693 wurden in CY 11645 transformiert (beschrieben in Beispiel
2), um CY 11729 bzw. CY 11730 zu erzeugen. Um zu verifizieren, dass
Melatonin-1b-Rezeptoren, exprimiert in CY 11730, dazu in der Lage
sind, durch Agonisten aktiviert zu werden und dass diese Aktivierung
eine Signalgebung durch den Pheromonreaktions-Weg zur Folge hat,
wurde die Expression des integrierten FUS1-HIS3-Reporters überprüft. Rasen
von CY-11729- und
CY-11730-Zellen wurden auf SD-LEU-HIS-pH-6,8-Platten auf SD-LEU-pH-6,8-Über-Nacht-Kulturen wie
in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Nach Präparation der Rasen wurde Melatonin
(20 μg)
auf die Platten aufgetüpfelt
und die Platten wurden bei 30°C über Nacht inkubiert.
Nur Zellen, die das Melatonin-1b-Expressionsplasmid (CY 11630) enthielten,
wuchsen, und diese Zellen wuchsen nur innerhalb der Diffusionszone
des aufgebrachten Melatonins. Diese Daten zeigen die funktionelle
Expression des humanen Melatonin-1b-Rezeptors in Hefe und die Kopplung dieses
Rezeptors an den Pheromonreaktions-Weg.
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Nachweis von
Melatonin-1b-Rezeptoraktivierung unter Verwendung des Bar1-Plattenassays
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Über-Nacht-Kulturen
von CY 11729 und CY 11730 wurden in SD-LEU-pH-6,8-Medium bis zu
einer OD600 von 0,2 verdünnt und für wenige Stunden bei 30°C wachsengelassen
(bis OD600 0,4). Die Zellen wurden durch
Zentrifugation gesammelt, einmal mit SD-LEU-pH-6,8-Medium gewaschen
und in 2 ml SD-LEU-pH-6,8-Medium resuspendiert. Melatonin (10 μg) wurden
einer Teilmenge zugesetzt und Trägerstoff (in
diesem Falle DMSO) wurde dem anderen Teil zugesetzt. Nach 4 Stunden
Inkubation bei 30°C
wurden die Zellen durch vier aufeinanderfolgende Zentrifugationsrunden
oder durch Filtration entfernt und 2 μL der konditionierten Medien
wurden auf eine Bar1-Assayplatte (oben beschrieben) aufgebracht.
Eine Standardkurve wurde ebenfalls bei jedem Experiment bestimmt,
um die Ergebnisse zu quantifizieren. Eine geringe oder keine Bar1p-Aktivität wurde
in konditionierten Medien aus Zellen nachgewiesen, denen das Melatonin-1b-Rezeptorexpressionsplasmid
fehlte.
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In
mehreren Experimenten führte
der Zusatz von 10 μg
Melatonin zu Zellen, die den Rezeptor exprimieren, zu einer ungefähr zwei-
bis achtfachen Induktion von Bar1p. Somit kann der Bar1-Plattenassay
dazu verwendet werden, die Aktivierung von Säugetier-G-Protein-gekoppeltem Rezeptor
in S. cerevisiae nachzuweisen.
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Beispiel 4: Nachweis der
C5a-Rezeptoraktivierung in S. cerevisiae unter Verwendung des Bar1-Plattenassays
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In
diesem Beispiel wird die C5a-Rezeptoraktivierung unter Verwendung
des Bar1-Plattenassays
in einem Hefestamm untersucht, der die Chimäre Gα, GPA141-Gαi3 exprimiert.
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Stammkonstruktion
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Die
Chimäre
Gα, GPA141-Gαi3
wurde in den GPA1-Locus von CY 8034 eingebracht, um CY 11365 zu erzeugen.
Um die Integration zu verifizieren, wurde die Expression des FUS1-HIS3-Reporters in
CY 8034 und CY 11365 verglichen. Weil CY 8034 ein Gα-Protein
nicht exprimiert, wird der Pheromonreaktions-Weg konstitutiv in
diesem Stamm aktiv. Somit würde
erwartet werden, dass die Integration von GPA141-Gαi3 die Expression
des Reporters senken würde.
Wie erwartet, wurde die Reportergen-Expression in CY 11365 reduziert,
sie wurde jedoch nicht vollständig
eliminiert. Die Restaktivität
ist wahrscheinlich auf eine unvollständige Kopplung der GPAI41-Gαi3-Chimäre an Hefe-Gβγ zurückzuführen.
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Cadus
1303, ein High-Copy-Hefeexpressionsvektor, der den C5a-Rezeptor
Open-Reading-Frame
fusioniert an den Hefe-PGK-Promotor enthält und Cadus 1289, die Vektorkontrolle,
wurden in CY 11365 transformiert, um CY 11458 bzw. CY 11457 zu erzeugen.
Die Expression des FUS1-HIS3-Reporters in diesen Zellen unter Verwendung
des Merck-C5a-Rezeptoragonisten,
CHA-CHA, wurde wie in Beispiel 2 überprüft. Wie erwartet, wuchsen nur
Zellen, die den C5a-Rezeptor exprimieren (CY 11458) auf SD-LEU-HIS-pH-6,8-Platten, die
1 mM Aminotriazol enthielten und diese Zellen wuchsen nur innerhalb
der Diffusionszone von aufgebrachtem CHA-CHA.
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Nachweis von
C5α-Rezeptoraktivierung
unter Verwendung des Bar1-Plattenassays
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Über-Nacht-Kulturen
von CY 11457 und CY 11458 wurden in SD-LEU-pH-6,8-Medium bis zu
einer OD600 von 0,2 verdünnt und für einige Stunden bei 30°C wachsengelassen
(bis OD600 0,4). Die Zellen wurden durch
Zentrifugation gesammelt, einmal mit SD-LEU-pH-6,8-Medium gewaschen
und in 2 ml SD-LEU-pH-6,8-Medium resuspendiert. CHA-CHA (10 μg) wurden
einer Teilmenge zugesetzt und Trägerstoff (in
diesem Falle DMSO) wurde dem anderen Teil zugesetzt. Nach 4 Stunden
Inkubation bei 30°C
wurden die Zellen entweder durch vier aufeinanderfolgende Runden
einer Zentrifugation oder durch Filtration entfernt und 5 μl der konditionierten
Medien wurden auf eine Bar1-Assayplatte (beschrieben in Beispiel
1) aufgebracht. Eine Standardkurve wurde jedem Experiment bestimmt,
um die Ergebnisse zu quantifizieren. Eine Exposition von Zellen,
die C5a-Rezeptor exprimieren, gegenüber CHA-CHA, hatte eine erhöhte Bar1p-Aktivität zur Folge,
obwohl die Induktion weniger als diejenige war, die bei Ste2p oder
Melatonin-1b-Rezeptoren ersichtlich war.
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Beispiel 5: Nachweis einer
Bar1p-vermittelten Proteindegradation
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Dieses
Beispiel veranschaulicht eine Ausführungsform der vorliegenden
Assays, bei der Enzym-vermittelte Spaltung von α-Faktor durch Bar1p dazu verwendet
werden kann, die Stabilität
eines Substrats zu kontrollieren, das als selektierbares Ereignis
verwendet werden kann. Die Spaltung eines α-Faktors durch Bar1p lässt einen
N-terminalen Lysin-Rest zurück.
Proteine mit Lysin an ihrem End-Terminus zeigten sich als in Hefe instabil
(Bachmair und Varshavsky, 1989, Cell 56: 1019). Deswegen können chimäre Substratproteine,
deren Stabilität
in Hefe durch die Konzentrationen an Bar1p kontrolliert wird, konstruiert
werden. Die α-Faktor-Peptidsequenz wird
in den Open-Reading-Frames eines einfach zu untersuchenden Proteins
eingebracht. Die Bar1p-Induktion verursacht dann eine Spaltung der α-Faktor-Sequenz
innerhalb des chimären
Substrates und einen Abbau des Substrates durch den N-Ende-Regel-Weg.
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Die α-Faktor-Peptidsequenz
wird an den N-Terminus eines Modellsubstrates fusioniert, beispielsweise an
LacZ, unter Verwendung von Standard-DNA-Rekombinationstechniken.
Das Konstrukt wird unter der Kontrolle eines konstitutiven, moderat
exprimierten Promotors in einem Hefeexpressionsvektor angeordnet.
Dieser Vektor wird in Hefezellen eingebracht, in denen eine Bar1p-Aktivität nach Stimulierung
mit einer geeigneten Testverbindung induziert werden kann, und LacZ
(entweder Enzymaktivität
oder Proteinkonzentration) wird darauf in Zellen überprüft, die
mit den Testverbindungen in Berührung
gebracht wurden. Testverbindungen, die Bar1p induzieren, werden
auf Grundlage der gesenkten Stabilität des chimären LacZ-Substrates ausgewählt.
-
In
alternativen Ausführungsformen
kann LacZ beispielsweise mit einem essentiellen Gen ersetzt werden
(um eine Negativselektion für
die Bar1p-Aktivität
bereitzustellen) oder mit einem Repressorprotein, (um eine positive
Selektion für
eine Bar1p-Aktivität
bereitzustellen).
-
In
bestimmten Ausführungsformen
des Assays kann es wünschenswert
sein, die Signale zur Sekretion zu entfernen, die am N- und C-Terminus
von Bar1p vorliegen, um dadurch ein Targeting von Bar1p in die Sekretionsmaschine
zu hemmen. Dies ermöglicht
einen größeren Zugang
von Bar1p zum chimären
Substrat, das in Zytoplasma vorliegt.
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Beispiel 6: Konstruktion
von PHO4/STE12-Chimären
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion von Hefeexpressionsplasmiden,
die eine Reihe von PHO4/STE12-Chimären codiert. Diese Chimären werden
dazu verwendet, ein einfach zu untersuchendes Genprodukt herzustellen,
wobei die sezernierte saure Phosphatase Pho5p Pheromon-induzierbar
ist. Veränderungen
der Genexpression als Folge der Pheromoninduktion werden durch den
Ste12b-Transkriptionsfaktor vermittelt. In Gegenwart von Pheromonsignalgebung
wird Ste12p ein potenter Transkriptionsaktivator von Genen, deren
Promotoren eine wohl definierte DNA-Bindungsstelle enthalten (das
Pheromon-Respons-Element oder ERP) (Review von Sprague und Thoer
in The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces,
Bd. 2, 1992). Der Transkriptionsfaktor Pho4p wird aktiviert, wenn
Zellen bezüglich
Phosphat abgereichert sind. Einmal aktiviert, bindet Pho4p an Promotorelemente
in mehreren Genen, einschließlich
Pho5, und induziert deren Transkription (Review von Johnson und
Carlson in the Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces,
Bd. 2, 1992). Chimäre
Transkriptionsfaktoren, die die Transkriptionsaktivierungsdomänen von
Ste12p enthalten, wurden durch Fusionieren von Regionen von Ste12p
mit der DNA-Bindungsdomäne von Pho4p
konstruiert. Die Expression dieser Chimären in Hefe hat eine Induktion
der Pho5-Expression zur Folge, wenn der Pheromonreaktions-Weg aktiviert
wird. Diese Aktivität
ist auf die Stimulierung durch die Ste12-Transkriptionsaktivierungsdomäne zurückzuführen, die
mit dem Pho5-Promotor durch Pho4-DNA-Bindungsdomäne in Nachbarschaft gebracht
wird. Die Expression von Pho5 kann einfach durch mehrere wohl definierte
Verfahren zum Nachweisen von saurer Phosphatase-Aktivität untersucht
werden.
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Ein
Hefeexpressionsplasmid wurde konstruiert, das den Hefe-ADH-Promotor
enthält,
fusioniert an Sequenzen, die ein 11 Aminosäure-Kernlokalisierungssignal
und die PHO4-DNA-Bindungsdomäne codieren (Aminosäuren 227–312). Sequenzen,
die die PHO4-DNA-Bindungsdomäne codieren,
wurden aus genomischer Hefe-DNA unter Verwendung der Primer
5'CGACTAAGCTTATGGGTGCACCTCCTAAAAAGAAGAGAAAGGTAGCCCCGCACGGATCGAGCCAT
3' (SEQ ID NO: 8)
und
5' CCGGAATTCCGTGCTCACGTTC-3'. (SEQ ID NO: 9)
amplifiziert.
Das PCR-Produkt codiert die Pho4-DNA-Bindungsdomäne flankiert von einer HindIII-Stelle
und Sequenzen, die ein Kernlokalisierungssignal an ihrem 5'-Ende und eine EcoRI-Stelle
an ihrem 3'-Ende
codieren. Dieses Produkt wurde mit HindIII und EcoRI digeriert und
Gel-aufgereinigt. Plasmid pCD72 (Cadus 3973) wurde von Dr. J. Broach
gewonnen. Es ist ein High-Copy-Hefevektor, der den ADH-Promotor
und Transkriptionsterminationssequenzen ebenso wie Sequenzen enthält die die
GAL4-DNA-Bindungsdomäne
codieren. Die Digestion dieses Plasmids mit HindIII und EcoRI hat
drei Fragmente zur Folge; eines, das das Vektorgrundgerüst, den
ADH-Promotor, flankiert von HindIII-Überhängen, enthält, ein zweites, das die ADH-Transkriptionsterminationssequenzen
mit einem EcoRI-Überhang
an seinem 5'-Ende
und einem HindIII-Überhang
an seinem 3'-Ende
enthält,
und ein drittes, das die GAL4-DNA-Bindungsdomäne mit einem HindIII-Überhang
an einem 5'-Ende
und einen EcoRI-Überhang
an seinem 3'-Ende
enthält.
Die ersten beiden Fragmente wurden Gel-aufgereinigt und in einer Dreistück-Legierung
mit dem digerierten und Gel-gereinigten PCR-Amplifikationsprodukt verwendet. Das
sich ergebende Plasmid wurde als Cadus 4129 bezeichnet.
-
Fragmente
von STE12 wurden in-frame 3' zur
Pho4-DNA-Bindungsdomäne
und 5' der ADH-Transkriptionsterminationssequenzen
durch Verwendung entweder der EcoRI-Stelle, der EcoRI- und BamHI-Stellen oder
der EcoRI- und PstI-Stellen in Cadus 4129 subkloniert. Die Auswahl
von Ste12-Fragmenten basierte auf zwei Studien, von denen eine mit
Fusionen zwischen Ga14-DNA-Bindungsdomäne und unterschiedlichen Regionen
von Ste12 durchgeführt
wurde (Song et al., Genes & Development,
1991) und eine, bei der Deletions- und Insertionsmutanten von Ste12
konstruiert und bezüglich
ihrer Fähigkeit
getestet wurden, eine Paarung und Transkriptionsaktivität gegenüber einem
ste12Δ-Stamm
wiederherzustellen (Kirkman-Correia et al. Mol. Cell. Biol., 1993).
Plasmide, die die unterschiedlichen Ste12-Fragmente codieren, wurden von Dr. S.
Fields bezogen.
-
-
Cadus
4183 wurde durch Digerieren von pOF22 (GAL4-STE12 1–688) (Cadus
3918) mit EcoRI konstruiert, Das 2,8-kb-Fragment, das den gesamten
STE12-Open-Reading-Frame enthielt wurde Gel-gereinigt und in den
EcoRI-Ort von Cadus 4129 subkloniert. Cadus 4183 wurde durch Digerieren
von pYZ1 (GAL4-STE12 214–688)
(Cadus 3916) mit EcoRI konstruiert. Das 2,2-kb-EcoRI-Fragment, das
die Aminosäuren
214–688
von Ste12p codiert, wurde Gel-gereinigt und in den EcoRI-Ort von
Cadus 4129 subkloniert. Cadus 4185 wurde durch Digerieren von pYB1
(GAL4-STE12 214–473)
(Cadus 3972) mit EcoRI und BamHI konstruiert. Das 780-bp-Fragment,
das die Aminosäuren
214–473
von Ste12p codierte, wurde Gel-aufgereinigt
und an Cadus 4129 ligiert, der mit EcoRI und BamHI digeriert wurde.
Cadus 4186 wurde durch Digerieren von pOG4 (GAL4-STE12 1–473) konstruiert
(Cadus 3919), mit EcoRI und BamHI. Das 1,42-kb-Fragment, das die Aminosäuren 1–473 von
Ste12p codiert, wurde Gel-gereinigt und an Cadus 4129 ligiert, das
mit EcoRI und BamHI digeriert wurde. Die Primer
5' CCGGAATTCATGAAAGTCCAAATAACC
3' and (SEQ ID NO:
10)
und
5' GCCTGCAGAATTATATTATATCAGGTTG
3' (SEQ ID NO: 11)
wurden
dazu verwendet, die Insertions- und Deletionsmutanten von Ste12p
zu amplifizieren. Die amplifizierten Produkte tragen EcoRI-Stellen
an ihren 5'-Enden
und PstI-Stellen an ihren 3'-Enden.
Sie wurden mit EcoRI und PstI digeriert, Gel-gereinigt und an Cadus
4129 ligiert, das mit EcoRI und PstI digeriert wurde. Cadus 4747 enthält das amplifizierte
Produkt von Plasmid ik85 (Cadus 3913), Cadus 4553 das Produkt von
Plasmid ik103 (Cadus 3910), Cadus 4554 das Produkt von D11 (D253–305) (Cadus
3911), Cadus 4555, das Produkt von D7 (D512–699) (Cadus 3912) und Cadus
4556 das Produkt von D22 (D588–669).
-
Beispiel 7: Detektion
der Ste2p-Aktivierung unter Verwendung der PHO4/STE12-Chimäre
-
Dieses
Beispiel zeigt die Verwendung der PHO4/STE12-Chimäre (beschrieben
in Beispiel 5) zur Induktion der Expression des PHO5-Genes, wenn
der Pheromonreaktions-Weg aktiviert ist.
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Stammkonstruktion
-
Das
endogene PHO4-Gen wurde in Cy 1638 gestört (MATα far1*1442 tbt1-1 FUS1-HIS3
trp1 ura3 leu2 his3 suc2) mit dem Gen, das eine Kanamycin-Resistenz
codiert, nämlich
KanMX2 (Yeast 10: 1793–1808), Primer
5' GAGCAAAGGAGACAGAACAAGAGTAGCAGAAAGTCCAGCTGAAGCTTCGTACGC
3' (SEQ ID NO: 12)
und
5' CACGTGCTCACGTTCTGCTGTAGGTGACGGATGTAGCATAGGCCACTAGTGGATCTG
3' (SEQ ID NO: 13)
wurden
dazu verwendet, das KanMX2-Gen zu amplifizieren. Das Amplifikationsprodukt
wurde durch Sequenzen flankiert, die den 5'- und 3'-Enden des PHO4-Gens entsprechen. Dieses
DNA wurde in CY 1639 transformiert. Transformanten wurden auf YEPD
+ Geneticin (200 μ/ml)
Platten selektiert. Die Störung
von PHO4 in diesem Stamm, CY 9788, wurde durch Bestimmung der sauren
Phosphatase-Aktivität
in Zellen verifiziert, die auf Phosphat-depletiertem YEPD-Medium gezüchtet wurden
(100 ml YEPD, 1 ml NH4OH, 1 ml MgSO4 (1 M); stehenlassen 30 Minuten; filtern)
(Biscon und Thomer, Genetics (1982). Die saure Phosphatase-Aktivität wurde
unter Verwendung des Überschichtungs-
bzw. Overlay-Assays von Toh et al. (J. Bacteriol., 1973) bestimmt. Die
Zellen wurden auf YEPD- oder Phosphat-depletierten YEPD-Platten aufgebracht
und über
Nacht wachsengelassen. Für
jede Platte wurde ein Gemisch aus 2 ml geschmolzener 1%iger Agarose
in 50 mM NaAc, pH 4,0, 700 μl
H2O und 300 μl α-Naphthyl saures Phosphat (50
mg/ml) hergestellt und auf die Platte aufgebracht. Danach wurde
1 ml D-Dianisidin Fast Blue Salt B (50 mg/ml in 50 mM NaAc, pH 4,0)
auf die Platte gegossen. Das Ausmaß der Farbentwicklung ist ein
Maß für die saure
Phosphatase-Aktivität,
die durch das Zellpflaster produziert wurde. Wie erwartet, wies
CY 9788 eine viel niedrigere saure Phosphatase-Aktivität als CY
1638 auf.
-
Die
kleine Menge an saurer Phosphatase-Aktivität, die bei CY 9788 beobachtet
wurde, ist wahrscheinlich die von Pho3p, Das PHO3-Gen codiert ebenfalls
eine sezernierte saure Phosphatase, jedoch wird dessen Expression
nicht durch Pho4p reguliert. Anstelle dessen wird seine Expression
unter Hoch-Phosphat-Bedingungen induziert und wird weiter durch
Thiamin-Verarmung erhöht
(Review von Vogel und Hinnen, 1990, Mol. Microbiol). Weil dieses
Gen nicht essentiell ist und seine Gegenwart erfordern würde, dass
alle Assays unter Bedingungen einer Phosphat-Verarmung durchgeführt werden,
wurde es gestört,
die Primer
5' CATGAAGCTTCTCCTACTACCAAGACTG
3' and (SEQ ID NO:
14)
5' GATCGAATTCGGTAATTTGGAATGGC
3' (SEQ ID NO: 15)
wurden
dazu verwendet, Sequenzen am 5-Ende des PHO3-Gens zu amplifizieren.
Das Amplifikationsprodukt, das eine HindIII-Stelle an seinem 5'-Ende und eine EcoRI-Stelle
an seinem 3'-Ende
trägt,
wurde mit HindIII und EcoRI digeriert und Gel-aufgereinigt. Die
Primer
5' GATCGAATTCCTGTTCCACCGGCC
3' and (SEQ ID NO:
16)
5' GATCTCTAGAGAGGCGATTGCTGTAATGC
3' (SEQ ID NO: 17)
wurden
dazu verwendet, Sequenzen in den 3'-untranslatierten Bereich des PHO3-Gens
zu amplifizieren. Das Amplifikationsprodukt, das eine EcoRI-Stelle
an seinem 5'-Ende
und eine XbaI-Stelle an seinem 3'-Ende
trägt, wurde
mit EcoRI und XbaI digeriert und Gel-gereinigt. Der URA3-markierte
Integrationsvektor pRS406 (Cadus 1011) (Sikorski und Hieter, 1989,
Genetics) wurde mit HindIII und XbaI digeriert, Gel-gereinigt und
in einer Dreistück-Ligation mit
den beiden PCR-Produkten verwendet. Das sich ergebende Zweischritt-Disruptions-Plasmid (Boeke et
al., 1988), nämlich
Cadus 4602, wurde mit Hpa1 digeriert und dazu verwendet, CY 9788
zu einer Uracil-Prototrophie zu transformieren. Eine anschließende Selektion
nach Ura-Derivaten dieser Transformante unter Verwendung von S-FOA
ergab CY 11643, das die Deletion des PHO3-Gens trug. Die Disruption
von PHO3 in CY 11643 wurde durch Messen der Säurephosphatase-Aktivität auf YEPD-Platten
und auf Phosphat, depletierten YEPD-Platten wie oben beschrieben
verifiziert. Wie erwartet, wies die CY 11643 eine extrem niedrige
Phosphatase-Aktivität
auf beiden Platten auf. Die Aktivität seines Mutterstammes, nämlich CY
9788, war auf der YEPD-Platte sehr hoch (aufgrund des Vorliegens
von Pho3p), jedoch auf der Phosphat-depletierten SD-Platte sehr
niedrig (aufgrund des Fehlens von Pho4p). Zuletzt war die Aktivität des ursprünglichen
Stammes, CY 1638, auf beiden Platten sehr hoch, was darauf hinweist,
dass sowohl Pho4 als auch Pho3 gestört bzw. unterbrochen waren.
-
Die
neun PHO4/STE12-chimären
Plasmide (beschrieben in Beispiel 5) und Cadus 4129, das nur die Pho4-DNA-Bindungsdomäne codiert,
wurden dann zu CY 11643 transformiert.
-
Detektion von Ste2p-Aktivierung
durch Messung der Pho4p-Aktivität
in Stämmen,
die die PHO4/STE12-Chimären
enthalten
-
Zellen
wurden über
Nacht in SD-TRP-Medien gezüchtet.
Die Über-Nacht-Kulturen
wurden auf einen OD600 von 0,2 verdünnt und
einige Stunden wachsengelassen (bis zu OD600 0,4).
Die Kulturen wurden zur Hälfte
(jeweils 2,5 ml) aufgespalten und α-Faktor (25 μg) wurde zu einer Teilmenge
zugesetzt. Nach 2,5 Stunden bei 30°C wurden die Zellen durch Zentrifugation
gesammelt, dreimal mit H2O gewaschen, einmal
mit 50 mM NaAc pH 4,0, und in 250 μl 50 mM NaAc pH 4,0 resuspendiert.
Die saure Phosphatase-Aktivität
wurde im Wesentlichen wie von Torriani beschrieben bestimmt (Biochem.
Biophys. ACTA, 1960). 100 μl
Zellen wurden zu 400 μl
p-Nitrophenolphosphat (1 mg/ml in 50 mM NaAc pH 4,0) zugesetzt.
Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden 270 μg gesättigte NaCO3 zugesetzt,
um die Reaktion zu stoppen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation
entfernt und die optische Dichte bei 420 nm wurde bestimmt. Die
Aktivitäten
wurden bis zur optischen Dichte bei 600 nm von 100 μl Zellen
in 900 μl
H2O normalisiert. Die Ergebnisse der beiden
unabhängigen Experimente
sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst:
-
-
Zellen,
die nur die Pho4p-DNA-Bindungsdomäne exprimieren (CY 11643 +
Cadus 4129) (und keinen Ste12-Bestandteil), wiesen eine extrem niedrige
saure Phosphatase-Aktivität
auf, die nicht durch Exposition gegenüber α-Faktor erhöht wurde. Im Gegensatz hierzu
wurde eine Pheromon-induzierbare saure Phosphatase-Aktivität in allen
Stämmen
beobachtet, die Pho4/Ste12-Chimären
exprimieren. Zwei der Chimären,
nämlich
Pho4/Ste12 (214–473)
(Cadus 4184) und Pho4/Ste12 (1–473)
(Cadus 4185) wiesen ebenfalls hohe Konzentrationen einer konstitutiven
Pho5p-Aktivität
auf, jedoch nur ein zwei- bis vierfaches Induktionsverhältnis. Mehrere
Chimären
wiesen ähnliche
Induktionsverhältnisse
auf. Andere wiesen eine sehr niedrige konstitutive Aktivität und ähnliche
Induktionsverhältnisse
von fünf-
bis zehnfach auf. Diese Daten zeigen, dass die Pho4/Ste12-chimären Transkriptionsfaktoren
dazu verwendet werden können,
das PHO5-Gen Pheromon-induzierbar zu machen. Als Erweiterung kann
diese Ablesung dazu verwendet werden, die Aktivierung irgendeines
G-Protein-gekoppelten Rezeptors, der in S. cerevisiae exprimiert
wird, nachzuweisen, ebenso wie eine Aktivierung irgendeines Pheromonreaktions-Weg-Bestandteils,
stromabwärts
des Rezeptors. Eine solche Aktivierung kann auf eine Modulation
durch eine Verbindung oder durch eine Protein-Protein-Interaktion zurückzuführen sein
(beispielsweise durch Interaktion mit einem klonierten heterologen
Genprodukt).
-
Beispiel 8: Funktionelle
Expression eines Säugetier-G-Protein-gekoppelten
Rezeptors und Liganden in einer Hefestamm
-
In
diesen Beispiel wird die Konstruktion einer Hefezelle, die einen
G-Protein-gekoppelten Rezeptor exprimiert, und die zur Verwendung
in der vorliegenden Assays geeignet ist, beschrieben. Dieses Beispiel
weist folgende Einzelheiten au: (1) Expression des humanen C5a-Rezeptors in Hefe;
(2) Expression des nativen Liganden dieses Rezeptors, des humanen
C5a, in Hefe; und (3) Aktivierung des endogenen Hefe-Pheromon-Weges
nach Stimulation des C5a-Rezeptors durch C5a, wenn diese beiden
Moleküle
innerhalb desselben Stammes einer autokrinen Hefe exprimiert werden.
Im Anschluss sind die experimentellen Daten, die die Nützlichkeit
autokriner Stämme
der Hefe, die den humanen C5a-Rezeptor funktionell exprimieren,
dargelegt.
-
Humanes
C5a ist ein 74 Aminosäure-Polypeptid,
das sich aus dem fünften
Bestandteil eines Komplementes ableitet, während der Aktivierung der Komplementkaskade;
es ist das Wirksamste der Komplement-abgeleiteten Anaphylatoxine.
C5a ist ein starker Aktivator von Neurophilen und der Makrophagenfunktionen
einschließlich
zytotoxischer Superoxidradikale und der Induktion einer Chemotaxe
und einer Anhaftung. Zusätzlich
simuliert C5a die Kontraktion von glatten Muskeln, induziert die
Degranulation von Mastzellen, induziert die Serotonin-Freisetzung aus den
Blutplättchen
und erhöht
die Gefäßpermeabilität. Das C5a-Anaphylatoxin
kann ebenfalls entzündliche
Reaktionen durch Simulierung der Produktion von Zytokinen amplifizieren bzw.
verstärken.
Weil C5a ein hoch wirksames Entzündungsmittel
ist, ist es das primäre
Target zur Entwicklung von Antagonisten, die zur Intervention bei
einer Vielzahl von entzündlichen
Prozessen verwendet werden sollen.
-
Der
C5a-Rezeptor liegt auf Neutrophilen, Mastzellen, Makrophagen und
glatten Muskelzellen vor und koppelt durch G-Proteine zur Übertragung
von Signalen, die durch die Bindung von C5a initiiert werden.
-
Expression
des C5a-Rezeptors
-
Das
Plasmid pCDM8-C5aRc, das die cDNA-Sequenz trägt, die den humanen C5a-Rezeptor
codiert, wurde von N. Gerard und C. Gerard (Harvard Medical School,
Boston, MA) (Gerard und Gerard 1991) bezogen. Eine Sequenz, die
C5a codiert, wurde auf diesem Plasmid durch PCR unter Verwendung
von VENT-Polymerase gewonnen (New England Biolabs Inc., Beverly,
MA), und unter Verwendung der nachfolgenden Primer:
#1-GGTGGGAGGGTGCTCTCTAGAAGGAAGTGTTCACC (SEQ
ID NO: 18)
#2-GCCCAGGAGACCAGACCATGGACTCCTTCAATTATACCACC (SEQ
ID NO: 17)
-
Primer
Nr. 1 enthält
einen einzigen Basenpaar-Mismatch (unterstrichen) zur C5a-Rezeptor-cDNA. Er führt eine
XbaI-Stelle (fettgedruckt) 201 Basenpaare stromabwärts des
TAG-Stoppcodons
der C5a-Rezeptor-codierenden Sequenz ein. Primer Nr. 2 enthält zwei
Mismatch-Basen und dient dazu, eine NcoI-Stelle (fettgedruckt) zu
erzeugen, die das ATG-Startcodon
umgibt (doppelt unterstrichen). Die zweite Aminosäure wird von
einer Asparaginsäure
zu einem Asparagin-Rest verändert.
Dies ist die einzige Veränderung
der primären Aminosäuresequenz
vom humanen Wildtyp-C5a-Rezeptor.
-
Das
PCR-Produkt wurde mit NcoI und XbaI (Stellen fettgedruck) eingeschränkt und
in Cadus 102 (Yep51Nco) kloniert, ein Gal-10-Promotor-Expressionvektor.
Die Sequenz des gesamten Insertes wurde durch Didesoxy-Sequenzierung
unter Verwendung multipler Primer bestimmt. Die Sequenz zwischen
den NcoI- und XbaI-Stellen erwies sich als mit der humanen C5a-Rezeptorsequenz identisch,
die bei GenBank (Zugangsnummer J05327) hinterlegt wurde, mit Ausnahme
solcher Veränderungen,
die von den PCR-Primern codiert werden. Das C5a-Rezeptor-codierende Insert wurde auf
CADUS 1289 (pLPXt) übertragen,
ein PGK-Promotor-Expressionsvektor,
unter Verwendung der NcoI- und XbaI-Stellen, um den C5a-Rezeptor-Hefeexpressionsklon,
nämlich
CADUS 1303, zu erzeugen.
-
Eine
Version des C5a-Rezeptors, der eine Hefe-Invertase-Signalsequenz
und eine mac-Epitop-Markierung
an seinem Amino-Terminus enthält,
wurde in Cadus 1270 transferierter Hefe unter Kontrolle eines GAL10-Promotors
exprimiert. Plasmide, die eine nicht-markierte Version des C5a-Rezeptors
und ein myc-markiertes Derivat von FUS1 codieren, dienten als Kontrollen.
Die Expression des markierten Rezeptors in der Hefe wurde durch
Western Blot unter Verwendung des anti-myc-monoklonalen Antikörpers 9E10
bestätigt.
In der Bahn, die den Extrakt aus der Cadus-1270-Transformante enthielt,
ist das Protein mit dem monoklonalen anti-myc-Antikörper 9E10
reaktiv, das eine Größe wie erwartet
von ungefähr
40 kD aufweist. Es sei angemerkt, dass dieses Rezeptorkonstrukt
nicht mit demjenigen identisch ist, das für die autokrinen Aktivierungsexperimente
verwendet wird. Der Rezeptor ist nicht markiert, enthält keine
Signalsequenz und wird durch den PGK-Promotor angetrieben.
-
Expression
des Liganden C5a
-
Ein
synthetisches Konstrukt der Sequenz, die C5a codiert, wurde von
C. Gerard (Harvard Medical School, Boston, MA) bezogen. Dieses synthetische
Gen wurde als FLAG-markiertes Molekül für die Sekretion von E. coli
bezeichnet (Gerard und Gerard (1990), Biochemistry 29: 9274–9281).
Die C5a-codierende Region, die noch den E.-coli-Condon-Bias enthält, wurde
unter Verwendung von VENT-Polymerase amplifiziert (New England Biolabs
Inc. Beverly, MA) durch 30 Zyklen bzw. Umläufe unter Verwendung der folgenden
Primer:
C5a5' =
CCCCTTAAGCGTGAGGCAGAAGCTACTCTGCAAAAGAAGATC (SEQ ID NO: 20)
C5a3' = GAAGATCTTCAGCGGCCGAGTTGCATGTC (SEQ ID
NO: 21)
-
Ein
PCR-Produkt von 257 bp wurde Gel-isoliert, mit AfIII und BgIII restringiert
und in CADUS 1215 kloniert (ein Expressionsvektor, der so entwickelt
wurde, dass er Peptid-Sequenzen
im Kontext von Mfα exprimiert),
um CADUS 1297 zu ergeben. Die Homologie-Regionen zum synthetischen C5a-Gen sind
unterstrichen. Der 5'-Primer
enthält
ebenfalls Prä-Proα-Faktor-Sequenz.
Nach Translation und Prozessierung der Prä-Pro-α-Faktor-Sequenz sollte authentisches
humanes C5a durch eine Hefe sezerniert werden, die CADUS 1297 enthält. Die
Insertsequenz in CADUS 1297 wurde in beiden Richtungen durch das
Didesoxy-Verfahren sequenziert
und mit derjenigen, die durch die PCR-Primer vorausgesagt wurde,
identisch befunden und mit der publizierten Sequenz des synthetischen
C5a-Gens (Franke et al. (1988), Methods in Enzymology 162: 653–668).
-
Die
beiden Reihen von Experimenten demonstrierten abgesehen von der
autokrinen Aktivierung von Hefe, die unten dargestellt ist, dass
CADUS 1297 zur Expression von C5a in Hefe verwendet werden kann.
- 1) C5a wurde immunologisch sowohl in Kulturüberstand
als auch lysierten Zellen unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Enzym-gebundenen Immunsorbent-Assays (ELISA) (Tabelle 1) nachgewiesen. Dieser
Assay zeigte, dass die Konzentration von C5a im Kulturüberstand
ungefähr
50–100
nM betrug. Im Vergleich hierzu ist in Daten, die von Säugetierzellen
gewonnen wurden, die Bindung von C5a an seinen Rezeptor konstant
1 nM (Boulay et al. (1991), Biochemistry 30: 2993–2999).
- 2) C5a, exprimiert in Hefe, konkurrierte um die Bindung mit
kommerziell bezogenen (Amersham Corporation, Arlington Heights,
IL) radiomarkiertem C5a auf induzierten HL60-Zellen.
-
Aktivierung des Pheromon-Reaktions-Weges
in autokriner Hefe, die humanen C5α-Rezeptor und humanes C5a exprimiert
-
Die
Aktivierung des Hefe-Pheromonreaktions-Weges durch Interaktion von
C5a mit dem C5a-Rezeptor wurde unter Verwendung eines Wachstums-Read-out
demonstriert. Der zur Analyse verwendete Stamm, CY 455 (MATα tbt1-1 ura3
leu2 trp1 his3 fus1-HIS3 can1 ste14::TRP1 ste3*1156) enthält die folgenden
signifikanten Modifikationen. Ein Pheromon-induzierbares HIS3-Gen, nämlich fus1-HIS3,
wird am Fus1-Locus integriert. Ein Hybridgen, das eine Sequenz enthält, die
die ersten 41 Aminosäuren
von Gpa1 (die Hefe-Gα-Untereinheit) fusioniert
an eine Sequenz, die humanes Gai2a (minus Codon für die N-terminalen 33 Aminosäuren) codiert,
ersetzt GPA1 an seinem normalen chromosomalen Ort. Das Hefe-STE14-Gen
wird gestört,
um das Basissignalniveau durch den Pheromonreaktions-Weg zu stören. Das
Hefe-a-Faktor-Rezeptorgen, nämliche
STE3, wird deletiert. Die letzten beiden Modifikationen sind wahrscheinlich
nicht essentiell, scheinen jedoch das Signal-zu-Störpegel-Verhältnis zu
verbessern.
-
CY
455 (MATα tbt1-1
ura3 leu2 trp1 his3 fus1-HIS3 can1 ste14::TRP1 ste3*1156) wurde
mit den nachfolgenden Plasmiden transformiert:
Cadus 1280 +
Cadus 1215 = Receptor– Ligand– =
(R–L–)
Cadus
1313 + Cadus 1215 = Receptor+ Ligand– =
R+L–
Cadus
1289 + Cadus 1297 = Receptor– Ligand+ =
(R–L+)
Cadus
1303 + Cadus 1297 = Receptor+ Ligand+ = (R+L+)
-
„Receptor" betrifft den humanen
C5a-Rezeptor.
-
Der
Ligand betrifft humanes C5a.
-
Drei
Kolonien wurden aus jeder Transformation aufgenommen und über Nacht
in Medien gezüchtet, denen
Leucin und Uracil fehlte, bei pH 6,8 mit 25 mM PIPES (LEU URA pH
6,8 mit 25 mM PIPES). Diese Medien wurden durch Zusatz von 0,45
ml steriler 1 M KOH und 2,5 ml sterilem 1 M PIPEs pH 6,8 auf 100
ml Standard-SD-LEU-URA-Medien hergestellt. Nach Über-Nacht-Wachstum wird der
pH der Medien üblicherweise auf
ungefähr
pH 5,5 angesäuert. Über-Nacht-Kulturen
wurden einmal mit 25 mM PIPES pH 6,8 gewaschen und in einem gleichen
Volumen von Medium resuspendiert, dem Leucin, Uracil und Histidin
fehlte (LEU URA HIS pH 6,8 mit 25 mM PIPES). Die optische Dichte
bei 600 nM einer 1/20-Verdünnung dieser
Kulturen wurde bestimmt, und die Kulturen wurden in 25 mM PIPES
pH 6,8 auf einem End-OD600 von 0,2 verdünnt. Ein
Volumen (5 μl)
dieser Verdünnung,
das 10.000 Zellen äquivalent
war, wurde auf selektive (HIS+ TRP pH 6,8)-Platten aufgetüpfelt. Nur
solche Stämme,
die sowohl C5a als auch seinen Rezeptor (R+L+) exprimieren, zeigen ein
Wachstum auf selektiven Platten, denen Histidin fehlt. Alle Teststämme sind
dazu in der Lage, auf Platten zu wachsen, die Histidin enthalten.
Der R+L+-Stamm wächst
auf Platten, die bis zu 5 mM Aminotriazol enthalten, die höchste getestete
Konzentration.
-
Zur
Verifizierung der Pheromonweg-Aktivierung und Quantifizierung der
Stimulation wurde die Aktivität des
fus1-Promotors kolorimetrisch unter Verwendung einer fusI-lacZ-Fusion
in einem ähnlichen
Satz von Stämmen
bestimmt. CY 878 (MATα tbt1-1
fusI-HIS3 caN1 ste14:trp1::LYS2 ste3* 1156 gpa1(41)-Gαi2) wurde als
Ausgangsstamm für
diese Experimente verwendet. Dieser Stamm ist ein trp1-Derivat von
CY 455. Die Transformanden für
dieses Experiment enthielten CADUS 1584 (pRS424-fus1-lacZ) zusätzlich zu
den Rezeptor- und
Liganden-Plasmiden. Vier Stämme
wurden über
Nacht in SD LEU URA TRP pH 6,8 mit 50 mM PIPES bis zu einem OD600 von weniger als 0,8 gezüchtet. Ein
Assay der β-Galactosidase-Aktivität kann unter
Verwendung von Verfahren, die in der Technik bekannt sind (Guarente
1983) durchgeführt
werden. Diese Experimente zeigen, dass die Expression des C5a-Rezeptors
und des Liganden (R+L+)-Zellen eine autokrine Stimulation und β-Galactosidase-Aktivität zur Folge
hat.
-
Projizierte Anwendungen
der autokrinen C5a-Stämme
-
Eine
primäre
Verwendung der autokrinen C5A-Stämme
liegt in der Entdeckung eines C5a-Antagonisten. Inhibitoren der biologischen
Funktion von C5a würden
erwarteterweise gegen eine Gewebsschädigung schützen, die sich aus einer Entzündung in
einem breiten Bereich inflammatorischer Krankheitsprozesse ergeben
würde,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf: Atemnotsyndrom (Duchateau et al. (1984), Am. Rev. Respir. Dis.
130: 1058); (Hammerschmidt et al. (1980), Lancet 1: 947); septische
Lungenverletzung (Olson et al. (1985), Ann. Surg. 202: 771); Arthritis
(Banerjee et al. (1989), J. Immunol. 142: 2237); ischämische und
postischämische
myokardiale Verletzung (Weisman (1990), Science 146: 249), (Weisman
(1990), Science 146: 249); (Crawford et al. (1988), Circulation
78: 1449) und Verbrennungsverletzung (Gelfand et al. (1982), J.
Clin. Invest. 70: 1170).
-
Das
autokrine C5a-System wie beschrieben kann dazu verwendet werden,
C5a-Antagonisten wie folgt zu isolieren:
-
1. High-Troughput-Screenings
zum Identifizieren von Antagonisten von C5a
-
Ein
geradliniger Ansatz schließt
das Screening von Verbindungen ein, um solche zu identifizieren,
die das Wachstum des R+L+-Stammes, oben beschrieben, in selektiven
Medien hemmen, die jedoch das Wachstum desselben Stammes oder eines
R+L–-Stammes
in nicht- selektiven
Medien nicht hemmen. Ein Gegenscreening ist notwendig, um solche
Verbindungen aus der Betrachtung zu eliminieren, die im Allgemeinen
gegenüber
Hefe toxisch sind. Initiale Experimente dieses Typs haben zur Identifizierung
von Verbindungen mit potentiell therapeutischer Nützlichkeit
geführt.
-
2. Identifizierung
von Antagonisten unter Verwendung einer negativen Selektion
-
Der
Ersatz eines fusI-HIS3-Read-out durch ein oder mehrere negative
Selektionsschemata (fus1-URA3/FOA, fus1-GAL1/Galactose oder Desoxygalactose,
Far1 sst2 oder weitere Mutationen, die die Hefe gegenüber einem
Wachstumsstopp überempfindlich
machen) würden
ein Testsystem erzeugen, bei dem das Vorhandensein eines Antagonisten
das Wachstum des Assay-Stammes zur Folge haben würde. Ein solcher Ansatz wäre bei High-Throughput-Screening von Verbindungen
anwendbar ebenso wie zur Selektion von Antagonisten aus zufallsbedingten
Peptid-Bibliotheken, die in autokriner Hefe exprimiert werden. Eine
Optimierung von Screenings diesen Types würde das Screening der R+L+-Stämme bei
einer Konzentration von Aminotriazol einschließen, das das Wachstum des R+L–-Stammes
beendet (beispielsweise 0,6–0,8
mM) und ein Gegenscreening des R+L–-Stammes bei einer Konzentration
von Aminotriazol, die eine identische Wachstumsrate ergibt (beispielsweise
0,14 mM). Zusätzlich
könnte
das System eines von mehreren kolorometrischen, fluoreszierenden
oder chemiluminiszierenden Read-outs verwenden. Einige der Gene,
die an den fus1-Promotor für
diese alternativen Read-outs verwendet werden können, schließen lacZ
(kolorimetrische und fluoreszierende Substrate), Glucoronidase 20
(kolorimetrische und fluoreszierende Substrate), Phosphatasen (beispielsweise
PHO3, PHO5, alkalische Phosphatase; kolorimetrische und chemilumineszierende
Substrate), grünes
Protein (endogene Fluoreszenz), Meerrettich-Peroxidase (kolorometrisch), Luciferase
(Chemilumineszenz), ein. Die autokrinen C5a-Stämme
weisen eine weitere Nützlichkeit
wie folgt auf:
-
3) Bei der Identifizierung
neuer C5a-Agonisten aus zufallsbedingten Peptid-Bibliotheken, die
in autokriner Hefe exprimiert werden.
-
Neue
Peptid-Antagonisten würden
zur Struktur/Funktionsanalysen beitragen, die als Anleitung für das rationelle
Design von C5a-Antagonisten verwendet werden könnten.
-
4) Bei der Identifizierung
von Rezeptormutanten
-
Konstitutiv
aktive, d. h. Liganden-unabhängige
Rezeptoren können
aus in hohem Grade mutagenisierten Populationen durch Wachstum auf
selektiven Medien ausgewählt
werden. Diese konstitutiv aktiven Rezeptoren können eine Nützlichkeit dabei aufweisen,
die Kartierung der Interaktionsstellen zwischen dem Rezeptor und
dem G-Protein zu ermöglichen.
Die Identifizierung solcher Stellen kann für das rationelle Design von
Arzneistoffen wichtig sein, um die Interaktion zu blockieren. Zusätzlich können Rezeptoren
bezüglich
einer Fähigkeit
ausgewählt
werden, durch einige Agonisten stimuliert zu werden, jedoch nicht
von anderen, oder gegenüber Antagonisten resistent zu sein. Diese Varianten-Rezeptoren
würden
bei der Kartierung von Stellen der Interaktion zwischen Rezeptor
oder Agonist oder Antagonist helfen und würden deswegen zu rationalen
Arzneistoff-Designbemühungen
beitragen.
-
5) Bei der Identifizierung
von Molekülen,
die mit Gαi2
interagieren
-
Verbindungen
oder Peptide, die direkt den GDP-Austausch aus Gai2 hemmen, würden dieselbe
Wirkung wie C5a-Antagonisten in diesen Assays haben. Zusätzliche
Information würden
Inhibitoren des GDP-Austausches von C5a-Antagonisten unterscheiden.
Diese Information könnte
durch Assays gewonnen werden, die Folgendes bestimmen:
- 1. Hemmung durch Testverbindungen der Gαi2-Aktivierung aus anderen Rezeptoren,
- 2. Versagen der Testverbindungen, mit radioaktiv markiertem
C5a um die Bindung an den C5a-Rezeptor zu konkurrieren,
- 3. Versagen von Testverbindungen, die Aktivierung anderer Gα-Untereinheiten
durch C5a zu hemmen, und
- 4. Hemmung der Signalgebung durch Testverbindungen aus konstitutiv
aktiven Versionen von C5a oder anderen Rezeptoren.
-
Beispiel 9: Konstruktion
einer Hybrid-Gα-Genkonstruktion
aus zwei Sätzen
chimärer
Hefe/Säugetier-Gα-Gene, nämlich GPA41-Gα und
GPAIBAM-Gα
-
Die
Gα-Untereinheit
der heterotrimeren G-Proteine muss sowohl mit dem βγ-Komplex
als auch dem Rezeptor interagieren. Weil die Domänen von Gα, die für jede dieser Interaktionen verantwortlich
sind, bisher noch nicht vollständig
definiert wurden, und weil unser letztendliches Ziel Gα-Proteine
erfordert, die mit einem Säugetier-Rezeptor
auf der einen Seite und den Hefe-βγ-Untereinheiten
auf der anderen Seite kommunizieren, wurden humane Hefe-Gα-Proteine mit einer
optimierten Fähigkeit,
beide Funktionen durchzuführen,
gewonnen. Aus diesen hier berichteten Studien wurde bestimmt, dass
der Einschluss eines nur kleinen Anteils des Amino-Terminus von
Hefe-Gα erforderlich
ist, ein Säugetier-Gα-Protein
an die Hefe-βγ-Einheiten zu koppeln.
Es wurde angenommen, dass ein weiterer Vorteil der Verwendung dieser
limitierten Chimären
die Konservierung der gesamten Säugetierdomäne des Gα-Proteins
sein müsste,
von der angenommen würde,
dass sie in Rezeptorkontakt und Interaktion involviert wäre. Somit
war die Wahrscheinlichkeit, dass diese Chimären ihre Fähigkeit beibehalten würden, funktionell
mit einem Säugetierrezeptor
zu interagieren, der an derselben Hefezelle exprimiert wird, als
sehr hoch angesehen.
-
Plasmid-Konstruktionen
-
PRS416-GPA1
(Cadus 1069). Ein XbaI-SacI-Fragment, das die gesamte GPA1-Promotorregion, die codierende
Region und ungefähr
250 Nukleotide der 3'-
und translatierten Region codiert, wurde aus 10 Ycplac111-GPA1 (von
S. Reed, Scripps Institute) ausgeschnitten und in den YEp-Vektor
pRS416 kloniert (Sikorski und Hieter, Genetics 122: 19 (1989)),
geschnitten mit XbaI und SacI.
-
Ortsgerichtete
Mutagenese von GPA1 (Cadus 1075, 1121 und 1122). Ein 1,9-kb-EcoRI-Fragment, das die
gesamte GPA1-codierende Region und 200 Nukleotide aus dem 5'-untranslatierten Bereich enthielt, wurde kloniert,
EcoRI-geschnitten, Phosphatase-behandelt, mit pALTER-1 (Prometa)
und durch Elektroporation transformiert (Biorad Gene Pulser) in
DHSαF'-Bakterien, um Cadus
1075 zu gewinnen. Rekombinante Phagemide wurden mit M13KO7-Helferphagen
gewonnen und einsträngige
rekombinante DNA wurde extrahiert und gemäß den Anweisungen des Herstellers
aufgereinigt. Eine neue NcoI-Stelle wurde am Startmethionin von GPA1
durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese unter Verwendung des
synthetischen Oligonukleotids eingebracht:
5' GATATATTAAGGTAGGAAACCATGGGGTGTACAGTGAG 3'. (SEQ ID NO: 22)
-
Positive
Klone wurden in Ampicillin selektiert und mehrere unabhängige Klone
wurden in beiden Richtungen über
die neue NcoI-Stelle bei +1 hinweg sequenziert. Die Klone, die die
richtigen Sequenzen enthielten, wurden als Cadus 1121 und 1122 zurückbehalten.
-
Konstruktion
von GPA1-basiertem Expressionsvektor (Cadus 1127). Der zur Expression
von Volle-Länge-
und Hybrid-Säugetier-Gα-Proteinen
in Hefe, nämlich
Cadus 1172, verwendete Vektor wurde in der folgenden Weise konstruiert.
Ein 350-Nukleotid-Fragment, das die 3'-untranslatierte
Region von GPA1 überspannte,
wurde mit Taq-Polymerase (AmpliTaq; Perkin Elmer) unter Verwendung
der Oligonukleotid-Primer A (5' CGAGGCTCGAGGGAACGTATAATTAAAGTAGTG
3') (SEQ ID NO:
23)
und
B (5' GCGCGGTACCAAGCTTCAATTCGAGATAATACCC
3'). (SEQ ID NO:
22)
amplifiziert. Das 350-Nukleotid-Produkt wurde durch Gel-Elektrophorese
unter Verwendung von GeneClean II (Bio101) aufgereinigt und wurde
direkt in den pCRII-Vektor durch einzelne Nukleotid-Überlappung
TA-Klonierung (InVitrogen) kloniert. Rekombinante Klone wurden durch
Restriktionsenzym-Kartierung und durch Didesoxynukleotid-Sequenzierung
charakterisiert. Rekombinante Klone enthielten eine neue XhoI-Stelle
5' zur authentischen
GPA1-Sequenz und eine neue KpnI-Stelle 3' zur authentischen GPAI-Sequenz, die
jeweils von Primer A und Primer B abstammten.
-
Die
NotI- und SacI-Stellen im Polylinker von Cadus 1013 (pRS414) wurden
durch Restriktion mit diesen Enzymen, gefolgt von Einfüllen mit
dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase
I entfernt und einer Blunt-End-Ligation (Ligation mit stumpfen Enden)
unterworfen, um Cadus 1092 zu ergeben, Das 1,4-kb-PstI-EcoRI-5'-Fragment von GPA1
aus Ycplac111-GPA1, das den GPA1-Promotor und die 5'-untranslatierte
von Region von GPAI enthielt, wurde durch Gel-Elektrophorese unter
Verwendung von GeneClean (BioIO1) aufge reinigt und in PstI-EcoRI-restringiertes
Cadus 1013 kloniert, um Cadus 1087 zu ergeben. Das PCR-amplifizierte
XhoI-KpnI-Fragment, das die 3'-untranslatierte
Region von GPA codierte, wurde aus Cadus 1089 ausgeschnitten und
in XhoI-KpnI-restringiertes Cadus 1087 kloniert, um Cadus 1092 zu
ergeben. Die Not1- und Sac1-Stellen im Polylinker von Cadus 1092
wurden durch Restriktion mit diesen Enzymen entfernt, mit Klenow-Fragment
der DNA-Polymerase
I aufgefüllt
und einer Blunt-End-Ligation unterworfen, um Cadus 1110 zu gewinnen.
Die Region von Cadus 1122, die die Region von GPA1 aus der EcoRI-Stelle
bei –200
bis 120 codierte, wurde mit Vent-DNA-Polymerase amplifiziert (New
England Biolabs, Beverly, MA) mit den Primern
5' CCCGAATCCACCAATTTCTTTACG
3' (SEQ ID NO: 25)
und
5' GCGGCGTCGACGCGGCCGCGTAACAGT
3' (SEQ ID NO: 26).
-
Das
amplifizierte Produkt, das eine EcoRI-Stelle an seinem 5'-Ende trug und neue
SacI-, NotI- und SaII-Stellen an seinem 3'-Ende wurden mit EcoRI und SaII restringiert,
unter Verwendung von GeneClean II (BiolO1) Gel-gereinigt und in
EcoRI und SaII restringiertes Cadus 1110 kloniert, um Cadus 1127
zu gewinnen. Die DNA-Sequenz des Vektors zwischen der EcoRI-Stelle
bei –200
und der KpnI-Stelle am 3'-Ende
der 3'-untranslatierten
Region wurde durch Restriktionsenzym-Kartierung und Didesoxynukleotid-DNA-Sequenzanalyse
verifiziert.
-
PCR-Amplifizierung
von GPA41-Gα-Proteinen und Klonierung in
Cadus 1127. cDNA-Klone, die die humane Gα-Untereinheiten Gαs, Gαi2, Gαi3 und S.-cerevisiae-GPA1
klonieren, wurden mit Vent-thermostabiler Polymerase (New England
Biolabs, Beverly, MA) amplifiziert. Die Primer-Paare, die in der
Amplifikation verwendet waren, waren wie folgt:
GαS Primer
1: 5'CTGCTGGAGCTCCGCCTGCTGCTGCTGGGTGCTGGAG3' (SacI 5') (SEQ ID NO: 27)
Primer
2: 5'CTGCTGGTCGACGCGGCCGCGGGGGTTCCTTCTTAGAAGCAGC3' (SalI 3') (SEQ ID NO: 28)
Primer
3: 5'GGGCTCGAGCCTTCTTAGAGCAGCTCGTAC3' (XhoI 3') (SEQ ID NO: 29)
Gαi2 Primer
1: 5'CTGCTGGAGCTCAAGTTGCTGCTGTTGGGTGCTGGGG3' (SacI5') (SEQ ID NO: 30)
Primer
2: 5'CTGCTGGTCGACGCGGCCGCGCCCCTCAGAAGAGGCCGCGGTCC3' (SalI 3') (SEQ ID NO: 31)
Primer
3: 5'GGGCTCGAGCCTCAGAAGAGGCCGCAGTC3' (XhoI 3') (SEQ ID NO: 32)
Gαi2 Primer
1: 5'CTGCTGGAGCTCAAGCTGCTGCTACTCGGTGCTGGAG3' (SacI5') (SEQ ID NO: 33)
Primer
2: 5'CTGCTGGTCGACGCGGCCGCCACTAACATCCATGCTTCTCAATAAAGTC3' (SalI 3') (SEQ ID NO: 34)
Primer
3: 5'GGGCTCGAGCATGCTTCTCAATAAAGTCCAC3' (XhoI 3') (SEQ ID NO: 35)
-
Nach
der Amplifizierung wurden die Produkte durch Gel-Elektrophorese
unter Verwendung von GeneClean II (Biol 01) gereinigt und wurden
mit den geeigneten Restriktionsenzymen zum Klonieren in Cadus 1127 gespalten.
-
Die
Hybrid-GPA41-Gα-Untereinheiten wurden über eine
SacI-Stelle kloniert, die an der erwünschten Position nahe dem 5'-Ende der amplifizierten
Gene eingeführt
wurde und über
eine SaII- oder XhoI-Stelle, die in die 3'-untranslatierte Region eingebracht
wurde. Ligationsgemische wurden in kompetente Bakterien elektrophoretisiert
und Plasma-DNA wurde aus 50 Kulturen Ampicillin-resistenter Bakterien
hergestellt.
-
Konstruktion
von Integrationsvektoren, die die GPA41-Gα-Untereinheiten
codieren. Die codierende Region jedes GPA41-Gα-Hybrids
wurde in einen Integrationsvektor (pRS406 = URA3 AmpR) unter Verwendung der
BssHII-Stellen kloniert, die die Polylinker-Klonierungsstellen in diesem Plasmid
flankieren. Cadus 1011 (pRS406) wurde mit BssHII restringiert, mit
alkalischer Shrimps-Phosphatase nach den Anweisungen des Herstellers
behandelt und der linearisierte Vektor wurde durch Gel-Elektrophorese
aufgereinigt. Inserte aus jedem der GPA41-Gα-Hybride
wurden mit BssHII aus dem parentalen Plasmid ausgeschnitten und
Gel-aufgereinigtes Cadus 1011 subkloniert.
-
Konstruktion
von GPABAM-Gα-Konstrukten. Eine neue BamHI-Stelle
wurde in-frame in die GPA1-codierende Region durch PCR-Amplifikation
unter Verwendung von Cadus 1179 (die eine Wildtyp-GPA1-Allel mit einer
neuen NcoI-Stelle am Startmethionin codierte) als Matrize, VENT-Polymerase
und der nachfolgenden Primer eingebracht: Primer A = 5'GCATCCATCAATAATCCAG3' (SEQ ID NO: 36)
und Primer B = 5'GAAACAATGGATCCACTTCTTAC3' (SEQ ID NO: 37).
Das 1,1-kb-PCR-Produkt wurden mit GeneClean II (Bio101) Gel-gereinigt,
mit NcoI und BamHI restringiert und einkloniert, NcoI-BamHI-geschnitten
und Cadus 1122 phosphatasiert, um Cadus 1605 zu gewinnen. Die Sequenz
von Cadus 1605 wurde durch Restriktionsanalyse und Didesoxy-Sequenzierung
doppelsträngiger
Matrizen verifiziert. Rekombinante GPABAM-Gα-Hybride
von Gαs,
Gαi2 und
Gα16 wurden
erzeugt. Die Konstruktion von Cadus 1855 codierender rekombinanter GPABAM-Gα16
dient als Masterbeispiel: Die Konstruktionen der anderen Hybride
folgten einer analogen Klonierungsstrategie. Der Elternstamm Cadus
1617, der natives Gα16
codierte, wurde mit NcoI und BamHI restringiert, mit alkalischer
Shrimp-Phosphatase nach den Anleitungen des Herstellers behandelt
und der linearisierte Vektor wurde durch Gel-Elektrophorese aufgereinigt. Cadus 1605
wurde mit NcoI und BamHI restringiert und das 1,1-kb-Fragment, das
die Amino-terminalen 60% von GPA 1 codierten, wurden mit einer neuen
BamHI-Stelle am 3'-Ende
restringiert und wurden in das NcoI- und BamHI-restringierte Cadus
1617 kloniert. Das sich ergebende Plasmid, das das GPABAM-Gα16-Hybrid
codierte, wurde durch Restriktionsanalyse verifiziert und in Testerstämmen untersucht
bezüglich
der Fähigkeit,
an Hefe-Gβγ zu koppeln
und dadurch den GPA1-Nullphänotyp
zu unterdrücken.
Zwei zusätzliche
GPABAM-Gα-Hybride,
GPABAM-Gas und GPABAM-Gαi2, beschrieben
in dieser Anmeldung, wurden in einer analogen Weise hergestellt,
unter Verwendung von Cadus 1606 als parentalem Plasmid zur Konstruktion
des GPABAM-Gαi2-Hybrids und Cadus 1181 als
Parentalplasmid für
die Konstruktion des GPABAM-Gαs-Hybrids.
-
Kopplung
durch chimäre
Gα-Proteine.
Die Gα-Chimären, die
oben beschrieben wurden, wurden bezüglich der Fähigkeit getestet, einen Säugetier-G-Protein-gekoppelten
Rezeptor an den Pheromonreaktions-Weg in der der Hefe zu koppeln.
-
Beispiel 10: Screening
für Modulatoren
einer Gα-Aktivität
-
Screenings
für Modulatoren
einer Gα-Aktivität können ebenfalls
durchgeführt
werden, wie es in den nachfolgenden Beispielen zu Veranschaulichungszwecken
dargestellt ist, die nicht-einschränkend sein
sollen. Die Stämme
CY 4874 und CY 4877 sind isogen, jedoch bezüglich des Vorhandenseins der
Q205L-Mutation im klonierten Gαi2-Gen kloniert in Plasmid 1. Die Stämme CY 4901
und CY 4904 weisen jeweils chromosomal integrierte chimäre Gα-Fusionen auf, die
41 Aminosäuren
von gpaI am N-Terminus des humanen Gαi2-Gens aufweisen
und sind isogen, jedoch bezüglich
des Vorhandenseins einer konstitutiv aktivierenden Mutation im C5a-Rezeptorgen
von CY 4901. Stamm-CY5058 ist ein gpaI-Mutante, die nur die Hefe-Gβγ-Untereinheiten und
keine Gα-Untereinheit
trägt.
Dieser Stamm ist ein Kontrollstamm, um die Spezifität der Wirkung
an der Gα-Untereinheit
zu demonstrieren.
-
I. Unterdrückung der
Aktivierung durch Mutation von Gα
-
Die
Q205L-Mutation ist eine konstitutiv aktivierte GTPase defiziente
Mutante des humanen Gαi2-Gens. Anatagonisten-Verbindungen, Chemikalien
oder andere Substanzen, die auf Gαi2 einwirken, können durch deren Wirkung erkannt
werden, um das Aktivierungsniveau zu reduzieren und somit das Signal
aus dem fus1-lacZ-Reportergen auf das zweite Plasmid (Plasmid 2).
-
A. GTPase Gαi2-Mutanten
-
- Testbestandteil = gpa41-Gαi2 (Q205L)
- Kontrollbestandteil = gpa41-Gαi2
-
Ebenso
wie die CY4874- und CY4877-Konstrukte, die oben ausgeführt wurden,
können ähnliche Stämme mit
fus1-His3 oder fus2-CNA-1-Wachstumsablesungen ebenfalls verwendet
werden. Die fusI-His3-Stämme
sind zum Screening nach Antagonisten bevorzugt und die fusII-CAN1-Stämme sind
für Antagonisten-Screenings
bevorzugt.
-
-
In
jedem Fall sollte ein Antagonist verursachen, dass sich der Teststamm
mehr wie der Kontrollstamm verhält.
-
B. GTPase Gαs-Mutanten
(Gα-Spezifität)
-
- Testbestandteil = Gαs(Q227L)
- Kontrollbestandteil = Gαs
-
-
In
jedem Falle würde
ein unspezifischer Antagonist verursachen, dass sich der Teststamm
mehr wie der Kontrollstamm verhält.
-
Zusätzliche
Medienerfordernisse: –TRP
für die
Gα-Plasmid-Aufrechterhaltung
in fus1-HIS3 und fus2-CAN1-Screenings und –TRP-URA für Gα- und fus1-lacZ-Plasmid-Aufrechterhaltung
in fus1-lacZ-Screenings.
-
II. Unterdrückung der
Aktivierung durch Rezeptoren
-
Konstitutiv C5a-Rezeptoren
-
- Testbestandteil = C5aR* (Pa184L,
aktivierter C5a-Rezeptor)
- Kontrollbestandteil = C5aR
-
Die
C5aR*-Mutation weist einen Leucin-Rest anstelle des Prolin-Restes
des Wildtyps an Position 184 der Aminosäuresequenz auf.
-
-
In
jedem Falle sollte ein Antagonist verursachen, dass der Teststamm
sich mehr wie der Kontrollstamm verhält.
-
Zusätzliche
Medienerfordernisse: –LEU
für die
Rezeptorplasmid-Aufrechterhaltung in fusI-HIS3 und fus2-CAN1-Screenings und –LEU-URA
für Rezeptor
und fus1-lacZ-Plasmid-Aufrechterhaltung
in fus1-lacZ-Screening, nicht-gepufferte Hefemedien (pH 5,5).
-
Beispiel 11: Identifizierung
eines Surrogat-Liganden unter Verwendung der Expression einer zufallsbedingten Peptid-Bibliothek
in einer Hefe, die einen Säugetier-Orphan-Rezeptor exprimiert
-
FPRL-1
(Formylpeptid-Rezeptor-artiger 1) ist ein strukturelles Homolog
des Formylpeptid-Rezeptors (FPR).
FPR ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, exprimiert auf neutrophilen
und phagozytischen Zellen, der durch N-Formylpeptide bakteriellen
Ursprungs stimuliert wird. Eine spezifische Bindung des natürlichen
Liganden, f-Met-Leu-Phe, stimuliert die Transduktion eines Signales,
um Kalzium zu mobilisieren, was zelluläre Veränderungen einschließlich einer
Chemotaxis und der Freisetzung von Granula-Inhaltsstoffen zur Folge
hat. Niedrig-stringente Hybridisierung von HL60-cDNA-Bibliotheken
mit einer FPRcDNA-Sonde ermöglicht
die Identifizierung des verwandten Rezeptors, FPRL-1 (Murphy et
al., siehe oben; Ye et al., siehe oben). Die FPRL-1-cDNA codiert
ein 351 Aminosäureprotein
mit 69% Se quenzhomologie gegenüber
FPR (Murphy et al., siehe oben), FPR und FPRL-1 erwiesen sich als
mit humanem Chromosom 19 co-zu-lokalisieren und wiesen ein Gewebsexpressionsmuster
auf, das demjenigen von FPR identisch war, d. h. die Expression
ist auf Zellen von Myeloid-Ursprung beschränkt (Murphy et al., siehe oben).
Ye et al. (siehe oben) demonstrierten eine schwache Bindung von
f-Met-Leu-Phe (μm-Konzentrationen)
an Fibroblasten, die mit FPRL-1-cDNA transfiziert waren. Im Gegensatz
hierzu konnte Murphy et al. (siehe oben) keine Bindung von N-Formylpeptiden
an Xenopusoocyten nachweisen, die mit FPRL-1-cDNA transfiziert waren. FPRL-1 scheint
ein Orphan-Rezeptor zu sein, dessen spezifischer Ligand sich von
den Formylpeptid-Liganden, auf die FPR anspricht, unterscheidet.
-
In
diesen beispielhaften Experimenten werden die folgenden Details
beschrieben: (1) Etablierung eines Hefestammes, der entwickelt wurde,
um den humanen Ophan-G-Protein-gekoppelten
Rezeptor FPRL-1 zu exprimieren; (2) Expression einer zufallsbedingten
Peptid-Bibliothek
im vorher erwähnten
Hefestamm; und (3) Aktivierung des endogenen Hefe-Pheromonweges nach
Stimulierung des FPRL-1-Rezeptors durch ein Peptid, codiert durch
eine zufallsbedingte Bibliothek, exprimiert mit demselben Hefestamm.
-
Herstellung des FPRL-1-Hefeexpressionsvektors
-
Ein
Plasmid, pFPRL1–L31,
das ein 2,6-kb-EcoRI-XhoI-Fragment enthielt, das FPRL-1-cDNA codiert, im
Blue Script II SK+ Vektor wurde von Philip Murphy (NIH) erzielt.
Die Sequenz, die FPRL1 codierte, wurde durch die Polymerase-Kettenreaktion
unter Verwendung von VENT-Polymerase amplifiziert (New England Biolabs
Inc., Beverly, MA) durch 20 Zyklen und die nachfolgenden Oligonukleotid-Primer:
#1
5' GGCGCCCGGTCTCCCATGGAAACCAACTTCTCCACT
(SEQ ID NO: 38)
#2 5' GGCGCCCGGTCTCCGATCCCATTGCCTGTAACTCAGTCTC
(SEQ ID NO: 39)
-
Das
PCR-Produkt wurde aufgereinigt, mit BsaI restringiert und in Cadus
1651 (p1PBX-1) kloniert, ein PGK-Promotor-angetriebener Expressionsvektor,
unter Verwendung von NcoI- und
BamHI-Stellen, um Cadus 2311 zu gewinnen. Die Sequenz des gesamten
Insertes wurde bestimmt und mit der FPRL-1-Sequenz, die bei GenBank
hinterlegt war (Zugangsnummer M84562) als identisch befunden.
-
Herstellung
von zufallsbedingten Oligonukleotiden
-
Bibliothek-Recycling-Protokoll
zur Identifizierung eines Ersatzstoff-Liganden
-
Der
Hefestamm CY1141 (MATalpha Far1*144 tbt1-fus1-HIS3 can1 ste14::trp1::LYS2
ste3*1156 gpal(41)-Galphai2 lys2 ura3 leu2 trp1 his3) wurde in den
Experimenten wie folgend verwendet. CY1141 enthält ein Pheromon-induzierbares
HIS3-Gen, fus1-HIS3, integriert am FUS1-Locus und ein Hybridgen,
das die ersten 41 Aminosäuren
von GPA1 (Hefe-Gα), fusioniert
an eine Sequenz codiert, die humanes Gαai2 codiert (dem Codone fehlen,
die die N-terminalen 33 Aminosäuren
codieren), unter Ersetzen von GPA1 an seinem chromosomalen Ort.
Das Hefe-STE14-Gen wird gestört,
um die Basiskonzentration der Signalgebung durch den Pheromonreaktions-Weg
zu senken. Das Hefe-α-Faktor-Rezeptorgen,
STE3, wird deletiert. CY1141 wurde mit Cadus 2311 transformiert,
so dass sich CY6571 ergab, ein Stamm, der den humanen Orphan-Rezeptor
FPRL-1 exprimiert.
-
CY6571
zeigte LIRMA (Liganden unabhängige
Rezeptor-vermittelte Aktivierung), d. h. eine Aktivierung des Hefe-Pheromonweges
in Abwesenheit eines Liganden. Es wurde bestimmt, dass das Hefewachstum auf
selektiven Medien, das sich aus LIRMA ergibt, durch zusätzliche
2,5 millimolare Konzentrationen an 3-Aminotriazol (AT) eliminiert
wurde. AT ist ein Inhibitor des HIS3-Genproduktes, das zur Reduzierung
des Hintergrundwachstums dient. Deswegen wurden Selektionsprotokolle
die die Identifizierung von Surrogat-Liganden für den FPRL-1-Rezeptor zum Ziel
haben, bei dieser Konzentration von AT durchgeführt.
-
CY6571
wurde zu 10 ml Standardsynthesemedium (SD), dem Leucin (–Leu) fehlte,
inokuliert und über Nacht
bei 30°C
inkubiert. Die 10 ml Über-Nacht-Kultur
wurde dazu verwendet, 50 ml YEPD zu inokulieren; diese Kultur wurde
bei 30°C
4,5 bis 5 Stunden inkubiert, und zu diesem Zeitpunkt wurden die
Zellen geerntet und zur Transformation mit DNA präpariert,
die eine zufallsbedingte Peptid-Bibliothek (Alpha-NNK (6.24.94))
codierte, die Tridecapeptide mit zufälliger Sequenz codierten, durch
Elektroporation. Nach Elektroporation (in 0,2 cm Kuvetten, 0,25 μF, 200 Ω, 1,5 kV)
wurden die Zellen sofort in 1 ml eiskalter 1 M Sorbitol verdünnt, und
100 μl Teilmengen
wurden auf 10 Synthesemedienplatten (pH 6,8) angeordnet, denen Leucin
und Uracil fehlte (–Leu –Ura). Die
Platten wurden bei 30°C
für 2–4 Tage
inkubiert und zu diesem Zeitpunkt wurden zwei Replikas jedes ursprünglichen
Transformationsplatte für
synthetische Medien hergestellt (pH 6,8), denen Leucin, Uracil und
Histidin fehlte, und die mit 2,5 mM AT (–Leu –Ura –His +2,5 mM AT) supplementiert
waren. Die Replikas wurden bei 30°C
für 3–5 Stunden
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kolonien, wie auf den
Replika selbst von zweien vorlagen, aus den Platten abgeschabt,
in einem Gesamtvolumen von 10 ml H2O (5
ml jede Platte). Die OD600 jeder Zellsuspension
wurde bestimmt und die Rohplasma-Isolationen wurden auf 8–16 OD-Einheiten
von Zellen für
jeden Pool durchgeführt.
Insgesamt 8 Pools ergaben sich aufgrund der niedrigen Anzahl von
Hefekolonien, die in vier Plattensätzen vorlagen. Die aus diesen
Rohplasmid-Isolationen gewonnenen Pellets (die so genannte „Zerschlagen
und Aufgreifen"-Technik,
Methods in Yeast Genetics – A
Laboratory Manual, 1990, M. D. Rose, F. Winston und P. Heiler, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), wurden
in 40 μl
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert, und 1 μl wurde verwendet,
um E. coli durch Elektroporation (0,1 cm Kuvetten, 0,25 μF, 200 Ω, 1,8 kV)
zu transformieren. Nach der Elektroporation wurden die Zellen unmittelbar
in 1 ml 2XYT-Medien verdünnt
und unter Schütteln
bei 37°C
für 30
Minuten inkubiert und nach dieser Zeit wurden die Zellen dazu verwendet,
50 ml 2XYT, ergänzt
mit 100 μg/ml
Ampicillin, zu inokulieren. Die 10 sich ergebenden Kulturen wurden
bei 37°C über Nacht
inkubiert. Plasma-DNA wurde aus jeder dieser Bakterienkulturen unter
Verwendung von Qiagen-Säulen
isoliert (Qiagen Inc. Chatsworth, CA)). Jedes Plasmid-DNA-Pellet
wurde in 50 μl
Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0 resuspendiert.
-
Stamm-CY6571
wurde mit 1 μl
jedes Plasmid-Pools durch Elektroporation transformiert. Nach der Elektroporation
wurden die Zellen in 400 μl
1 M Sorbitol verdünnt.
Aus jeder elektrophoretisierten Zellsuspension wurden 1 μl und 400 μl Zellen
auf –Leu-Ura-Synthetsmedien ausplattiert,
pH 6,8, um „Niedrige
Dichte"- und Hohe
Dichte"-Ausplattierungen
zu gewinnen. Die Platten wurden bei 30°C für 3 Tage inkubiert, und zu
diesem Zeitpunkt wurden Replikas der beiden der niedrigen und hoch-dichten
Platten hergestellt, für –Leu –Ura –His +2,5
mM AT. Für
diese Fälle,
in denen die Anreicherung nach einem Plasmid, das zur Übertragung
eines His+-Phänotyps
in der Lage ist, auftrat, würde
dies eine amplifizierte Anzahl an His+-Kolonien an beiden der niedrigen
und hoch-dichten Platten widerspiegeln, sichtbar an den Tagen 2–3, obwohl
die Amplifikation an den Platten am offensichtlichsten sein würde, die
eine hohe Dichte an Zellen empfingen. Im FPRL-1-Experiment zeigten
1/8 Poole eine Amplifikation von His+-Kolonien. Die Zellen wurden
aus der Platte in 5 ml Wasser abgeschabt, der OD600 der
Zellsuspension wurde bestimmt und eine Rohplasmid-Isolierung wurde
auf 15 OD-Einheiten von Hefezellen durchgeführt. Das erzielte Pellet wurde
in 40 μl
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert, und 1 μl wurden
verwendet, um E. coli zu transformieren. Die Plasmid-DNA wurde durch
Miniprep aus 3 ml 2XYT-Kulturen aus einzelnen Bakterienkolonien
isoliert, die sich aus dieser Transformation ergaben. 10 DNA-Pellets (A1 bis A10),
die von den individuellen Bakterienkolonien abgeleitet wurden, wurden in
20 μl 10
mM Tris 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert und zur Transformation von
CY6571 verwendet (das den FPRL-1-Expressionsvektor enthielt) und
CY6263 (CY1141, das einen Kontrollexpressionsvektor enthielt, dem
jegliche Rezeptorsequenz fehlte), durch Elektroporation. Cadus 1625,
ein Kontrollvektor, dem Sequenzen fehlen, die ein Peptid codieren,
wurde eingeschlossen und zur Transformation sowohl der Rezeptor+-
als auch der Rezeptor–-Stämme der
Hefe verwendet. Transformanden wurden zunächst auf –Leu –Ura pH 6,0 selektiert, dann
wurden drei Hefetransformanden jedes Typs (aus 11 CY6571-Transformanden und
11 CY6263-Transformationen) auf –Leu –Ura pH 6,8 aufgebracht, um
die Kolonien zu expandieren. Wen sie einmal expandiert waren, wurden
Streifen der Transformanden auf –Leu –Ura –His +2,5 mM AT durchgeführt, um das
Wachstum in Abwesenheit von Histidin zu testen. Alle Plasmide außer dem
als A2 bezeichneten, übertrugen
einen Wachstumsvorteil auf die Medien, denen Histidin fehlte, auf
Hefe, die das FPRL-1-codierende Plasmid trug, jedoch nicht auf Hefen,
denen das Rezeptorplasmid fehlte. Die Peptidsequenz, von der sich
herausgestellt hat, dass sie durch die Plasmide A1 und A3–A10 codiert
wird ist; SerLeuLeuTrpLeuThrCysArgProTrpBluAlaMet, (SEQ ID NO: 40)
und wird codiert durch die Nukleotid-Sequenz 5'- TCT CTG CTT TGG CTG ACT TGT CGG CCT
TGG GAG GCG ATG-3'.
(SEQ ID NO: 41).
-
Aktivierung des Pheromonreaktions-Weges
in Hefe, die den FPRL-1-Rezeptor und den Peptid-Agonisten exprimiert
-
Zur
Verifizierung der Pheromonweg-Aktivierung und Quantifizierung der
Stimulation wurde die Aktivität des
fus1-Promotors kolorimetrisch unter Verwendung einer fus1-lacZ-Fusion
in parallelen Reihen von Teststämmen
bestimmt. CY1141, oben beschrieben, wurde als Empfängerstamm
für diese
Experimente verwendet. Die Transformanden enthielten Cadus 1584
(pRS424-fusI-lacZ) zusätzlich
zu den Rezeptor (R
+/–)- und Liganden(L
+/–)-Plasmiden.
Vier Stämme,
die die identischen Plasmide trugen, wurden über Nacht in Minimalmedien
gezüchtet,
denen Leucin, Uracil und Tryptophan fehlte, pH 8,6. Die Über-Nacht-Kulturen
wurden dazu verwendet, –Leu –Ura –Trp pH
6,8 Medien zu inokulieren und diese neuen Kulturen wurden für ungefähr 4,5 bis
5 Stunden bis zu einer OD
600 von weniger
als 0,4 gezüchtet.
Ein Assay der β-Galactosidase-Aktivität (Guarente
1983) in Zellen aus diesen Kulturen ergab die folgenden Ergebnisse:
- Units
- Einheiten
-
Das
Vorhandensein von Rezeptor- und Peptid-codierenden Plasmiden ergab
durchschnittlich eine achtfache Simulierung über Hintergrundkonzentrationen
von β-Galactosidase.
-
Beispiel 12: Identifizierung
von Surrogat-Liganden unter Verwendung einer Expression einer zufallsbedingten Peptid-Bibliothek
in Hefe, die Säugetier-Orphan-Rezeptor
MDR-15 exprimiert
-
In
einer ähnlichen
Weise wurde ein Plasmid, das den Monozyten-abgeleiteten Rezeptor
15 enthielt (MDR15; Barella et al. (1995), Biochem. J. 309: 773–9) dazu
verwendet, einen Hefestamm (CY6573) zu konstruieren, der diesen
Rezeptor exprimiert. Der Rezeptor ist eine alternative Spleiß-Form des
Burkitt's-Lymphom-RezeptorI
(BLR1), der durch eine humane Burkitt's-Lymphom-cDNA (Dobner et al. (1992),
Eur. Jr. Immunol. 22, 2795–2799)
codiert ist. Stamm-CY6573 wurde in einer ähnlichen Weise mit der NNK13-Bibliothek transformiert
und im Anschluss an eine Selektion auf zehn –Leu –Ura (4,4 × 105 Kolonien
pro Platte) wurden Replika auf –Leu –Ura –His + 1
mM AT-Platten ausplattiert. Nach Reisolierung von Plasmid-Poolen und Retransformation
in die Stämme
CY6573 zeigen acht von zehn Pools eine signifikant angereicherte
Koloniebildung auf –Leu –Ura –His + 1
mM AT-Platten. Acht einzigartige Plasmide, die aus diesen Pools
abgeleitet waren, wurden in CY6573 retransformiert, was auf –Leu –Ura –His + 1
Mm AT-Platten ein Wachstum verlieh. Eines dieser Plasmide versagte
dabei, ein Wachstum in einem Hefestamm zu verleihen, dem der MDR15-Rezeptor
fehlte.
-
Beispiel 13: Identifizierung
eines Liganden unter Verwendung der Expression einer zufallsbedingten
Peptit-Bibliothek in Hefe, die den humanen Thrombin-Rezeptor exprimiert
-
Der
Rezeptor für
Thrombin, ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, liegt auf zahlreichen
Zelltypen vor, einschließlich
Blutplättchen,
glatter Gefäßmuskulatur,
Fibroblasten und einer Untergruppe von Zellen, die im Immunsystem
funktionieren. Thrombin, eine Serin-Protease bindet an und spaltet
das Rezeptormolekül
an Rest 41 und erzeugt einen neuen Rezeptor-N-Terminus. Die Nach-Spaltung der N-terminale
Reste dienen dann als „angebundener
Ligand", um das
Rezeptormolekül
zu aktivieren (Vu et al., 1994). Es hat sich gezeigt, dass in Blutplättchen die
Signalgebung durch den Thrombin-Rezeptor zahlreiche Wirkungen zur
Folge hat, einschließlich
der Stimulierung von Phospholipase C, der Mobilisierung intrazellulären Ca2+ und der Hemmung der Adenylylcyclase.
-
In
diesem Beispiel werden Experimente, die Folgendes ausführen, beschrieben:
(1) Etablierung eines Hefestammes, der entwickelt wurde, um den
humanen G-Protein-gekoppelten Rezeptor für Thrombin zu exprimieren;
(2) Expression einer zufallsbedingten Peptid-Bibliothek im vorher
erwähnten
Hefestamm und (3) Aktivierung des endogenen Hefe-Pheromonweges nach
Stimulierung des Thrombin-Rezeptors durch Peptide, die durch eine
zufallsbedingte Bibliothek codiert werden, exprimiert innerhalb
desselben Hefestamms.
-
Herstellung
eines Hefeexpressionsvektors für
einen Säugetier-Thrombin-Rezeptor
-
Der
humane Thrombin-Rezeptor wurde durch PCR aus pcDNA3:Hu-Thr9b-5' (Bristol Myers Squibb) unter
Verwendung der folgenden Oligonukleotide amplifiziert:
5' GGGCCATGGGGCCGCGGCGGTTG
3' (SEQ ID NO: 42)
5' CCCGGATCCTAAGTTAACAGCTTTTTGTATAT
3' (SEQ ID NO: 43)
-
Das
amplifizierte Produkt wurde durch Gel-Elektrophorese aufgereinigt,
mit NcoI und BamHI restringiert und an NcoI- und BamHI-geschnittenes
CADUS 1871 ligiert, ein PGK-Promotor
gesteuerter Expressionsvektor, so dass sich CADUS 2260 ergab. Eine
Klonierung in CADUS 1871 führt
ein neues Stoppcodon ein, dem das Triplet GlySerVal nach dem authentischen
Carboxy-terminalen Codon des humanen Thrombin-Rezeptors (Threonin)
vorangeht. Zusätzlich
wird eine Invertase-Signalsequenz an den authentischen Amino-Terminus
des Rezeptors fusioniert.
-
CY7467
zeigte LIRMA (Liganden-unabhängige
Rezeptor-vermittelte Aktivierung), d. h. eine Aktivierung des Hefe-Pheromonweges
in Abwesenheit des Liganden. Es wurde bestimmt, dass das Hefewachstum auf
selektiven Medien, die sich aus LIRMA ergeben, durch Zusatz von
2,5 millimolaren Konzentrationen von 3-Aminotriazol (AT) eliminiert
wurden. AT ist ein Inhibitor des HIS3-Genproduktes, das zur Reduktion
des Hintergrundwachstums dient. Deswegen wurden Selektionsvorschriften,
die die Identifizierung neuer Peptid-Liganden für den humanen Thrombin-Rezeptor
zum Ziel haben, bei dieser Konzentration von AT durch geführt.
-
Herstellung
von zufallsbedingten Oligonukleotid-Bibliotheken
-
Wie
oben beschrieben.
-
Recycling-Vorschrift zur
Identifizierung eines Sunogat- bzw. Ersatzliganden
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Der
Hefestamm CY1141 (MATalpha far1* 1442 tbt1-1 fus1-HIS3 can1 ste14::trp1::LYS2 ste3*1156gpal(41)-Galphai2
lys2 ura3 leu2 trp1 is3) wurde mit Cadus 2260 transformiert, um
den Stamm CY7467 zu erhalten, der den humanen Thrombin-Rezeptor
exprimiert. CY7467 wurde zu 10 ml Standard-Synthesemedium (SD) inokuliert,
dem Leucin (–Leu)
fehlt, und wurde über
Nacht bei 30°C
inkubiert. Die 10 ml Über-Nacht-Kultur
wurde dazu verwendet, 50 ml YEPD-Medien zu inokulieren; diese Kultur
wurde bei 30°C
für 4,5
bis 5 Stunden inkubiert, und zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen
geerntet und zur Transformation mit DNA vorbereitet, die eine zufallsbedingte
Peptid-Bibliothek codiert [Alpha-NNK (6.24.94)], durch Elektroporation.
Nach der Elektroporation (in 0,2 cm Kuvetten, 0,25 mF, 200 W, 1,5
kV) wurden die Zellen sofort in 1 ml eiskaltem 1 M Sorbitol verdünnt und
100 ml Teilmengen wurden auf 10 Synthesemedienplatten (pH 6,8) ausplattiert,
denen Leucin und Uracil fehlte (–Leu –Ura). Die Platten wurden bei
30°C für 2–4 Tage
inkubiert, und zu diesem Zeitpunkt wurden zwei Replikas jeder originalen
Transformationsplatte zu Synthesemedien (pH 6,8) durchgeführt, denen
Leucin, Uracil und Histidin fehlte, und die mit 2,5 mM AT (–Leu –Ura –His + 2,5
mM AT) supplementiert waren. Die Replika bzw. Kopien wurden bei
30°C für 3–5 Tage
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die auf den Replika-Sets von
jeweils zwei vorliegenden Kolonien aus den Platten abgeschabt in
ein Gesamtvolumen von 10 ml H2O (5 ml je
Platte). Die OD600 jeder Zellsuspension
wurde bestimmt und Rohplasma-Isolierungen wurden auf 8–16 OD-Einheiten
von Zellen für
jeden Pool durchgeführt.
Insgesamt 10 Pools ergaben sich. Die Pellets, die sich aus den Rohplasmid-Isolierungen
ergaben, wurden in 40 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert,
und 1 ml wurde verwendet, um E. coli durch Elektroporation zu transformieren
(0,1 cm Kuvetten, 0,25 mF, 200 W, 1,8 kV). Nach der Elektroporation
wurden die Zellen unmittelbar in 1 ml 2XYT-Medien verdünnt und
unter Schütteln
bei 37°C
für 30
Minuten inkubiert, wonach die Zellen dazu verwendet wurden, 50 ml
2XYT zu inokulieren, das mit 100 μg/ml
Ampicillin supplementiert war. Die zehn sich ergebenden Kulturen
wurden bei 37°C über Nacht
inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde aus jeder dieser bakteriellen Kulturen
isoliert, unter Verwendung von Quiagen-Säulen (Quiagen Inc., Chatsworth,
CA). Jedes Plasmid-DNA-Pellet wurde in 50 ml Tris 10 mM, EDTA 1
mM, pH 8,0 resuspendiert.
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Stamm-CY7467
wurde mit 1 ml jedes Plasmid-Pools durch Elektroporation transformiert.
Nach der Elektroporation wurden die Zellen in 400 ml 1 M Sorbitol
verdünnt.
Aus jeder elektroporatisierten Zellsuspension wurden 1 ml und 400
ml Zellen auf –Leu –Ura Synthesemedien,
pH 6,8 ausplattiert, um „niedrig-dichte" und „hoch-dichte" Ausplattierungen
zu gewinnen. Die Platten wurden bei 30°C für 3 Tage inkubiert, und zu
diesem Zeitpunkt wurden Kopien der beiden niedrig und hoch-dichte
Platten auf –Leu –Ura –His + 2,5
mM AT durchgeführt.
Für diese
Fälle,
in denen sich eine Anreicherung für ein Plasmid, das zur Übertragung
eines His+-Phänotyps
in der Lage war, aufgetreten war, würde dies durch eine amplifizierte
Anzahl von His+-Kolonien auf sowohl den niedrig als auch hoch-dichte
Platten reflektiert werden, die bei den Tagen 2–3 sichtbar sind, obwohl die
Amplifikation am offensichtlichsten auf den Platten sein würde, die
eine hohe Dichte von Zellen aufwiesen. In diesem Experiment zeigten
3/10 Pools eine Amplifikation von His+-Kolonien. Die Zellen aus
jeder dieser Platten wurden in 5 ml H2O
ausgekratzt, die OD600 der Zellsuspensionen
wurde bestimmt und Rohplasma-Isolationen wurden auf 8–16 OD-Einheiten
von Hefezellen durchgeführt.
Die gewonnenen Pellets wurden in 40 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH
8,0 resuspendiert und 1 ml wurde dazu verwendet, E. coli zu transformieren.
Plasmid-DNA wurde durch Miniprep aus 3 ml 2XYT-Kulturen von einzelnen
Bakterienkolonien isoliert, die sich aus diesen Transformationen
ergaben (drei bakterielle Kolonien für jeden DNA-Pool wurden auf diese Art
und Weise verarbeitet). DNAs, die sich aus den drei individuellen
Bakterienkolonien pro Pool ergaben, wurden in 20 ml 10 mM Tris,
1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. Die drei DNAs, die pro Pool abgeleitet
waren, wurden sequenziert und codierten identische Peptide. Somit
wurden drei verschiedene DNA-Sequenzen abgeleitet, von denen eine
jeweils einen amplifizierten Pool repräsentierte. Ein Plasmid, das
jedes der drei ursprünglich
amplifizierten Pools repräsentiert,
wurde zur Transformation von CY7468 verwendet (das den Thrombin-Rezeptorexpressionsvektor
enthält)
und CY6263 (CY1141), der einen Kontrollexpressionsvektor enthält, dem
jegliche Rezeptorsequenz fehlt), durch Elektroporation. CADUS 1625,
ein Kontrollvektor, dem Sequenzen fehlen, die ein Peptid codieren,
wurde eingeschlossen und wurde dazu verwendet, sowohl die Rezeptor+-
als auch die Rezeptor-Stämme
der Hefe zu transformieren. CADUS 1651, ein Kontrollvektor, dem
Sequenzen fehlen, die einen Rezeptor codieren, wurde eingeschlossen
und zur Transformation sowohl der Liganden+- als auch Liganden-Stämme der
Hefe verwendet. Die Transformanden wurden zunächst auf –Leu –Ura, pH 6,8 ausgewählt, darauf
wurden zwei Hefe-Transformanden jedes Typs auf –Leu –Ura; pH 6,0 aufgebracht, um
diese Kolonien zu expandieren. Wenn sie einmal expandiert waren,
wurden Streifen der Transformanden auf –Leu –Ura –His + 2,5 mM AT durchgeführt, um
auf das Wachstum in Abwesenheit von Histidin zu testen. Eines der
drei Plasmide, das getestet wurde, übertrug auf die Medien, denen
Histidin fehlte, auf Hefe einen Wachstumsvorteil, die das Thrombin-codierende
Plasmid trugen, jedoch nicht auf Hefe, die das Rezeptorplasmid trugen.
Die von diesem Plasmid codierte Peptidsequenz ist: Val-Cys-Pro-Ala-Arg-Tyr-Val-Leu-Pro-Gly-Pro-Val-Leu (SEQ
ID NO: 45) und wurde durch die Nukleotidsequenz GTT TGT CCT GCG
CGT TAT GTG CTG CCT GGG CCT GTT TTG. (SEQ ID NO: 44) codiert.
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