DE69732667T2

DE69732667T2 - Vorrichtung und verfahren zum nachweis und identifizieren von infektiösen wirkstoffen

Info

Publication number: DE69732667T2
Application number: DE69732667T
Authority: DE
Inventors: J. Bruce BRYAN; Stephen Gaalema; B. Randall MURPHY
Original assignee: Prolume Ltd
Current assignee: Prolume Ltd
Priority date: 1996-12-12
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2017-12-13
Also published as: US6649357B2; EP1015872A2; US6682899B2; AU6012898A; DE69732667D1; CA2271717A1; JP2001511887A; ATE290205T1; EP1015872B1; JP3795533B2; WO1998026277A3; US6649356B2; AU741076B2; US20030013103A1; US20030059798A1; WO1998026277A2; JP2006145545A; US6458547B1; US20030113741A1; JP4287853B2

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Anmeldung Serien-Nr. 60/037,675, welche am 11. Februar 1997 angemeldet wurde und die der vorläufigen US-Anmeldung Serien-Nr. 60/033,745, welche am 12. Dezember 1996 angemeldet wurde.
Ein bestimmter Gegenstand dieser Anmeldung steht in Beziehung mit dem Gegenstand in der US-Anmeldung Serien-Nr. 08/757,046, welche am 25. November 1996 angemeldet auf Bruce Bryan wurde, betitelt „Bioluminescent Novelty Items" (B) und zur US-Anmeldung Serien-Nr. 08/597,274, welche am 6. Februar 1996 auf Bruce Bryan angemeldet wurde, betitelt „Bioluminescent Novelty Items". Diese Anmeldung steht auch in Bezug zur US-Anmeldung Serien-Nr. 08/908,909, welche am 8. August 1997 auf Bruce Bryan angemeldet wurde, betitelt „Detection and Vizualization of Neoplasms and other Tissues" und zur vorläufigen US-Anmeldung Serien-Nr. 60/023,374, welche am 8. August 1996 eingereicht wurde, betitelt „Detection and Vizualization of Neoplasms and other Tissues".
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Identifikation eines Analyten in einem biologischen Medium unter Verwendung von Biolumineszenz. Insbesondere wird ein Verfahren zur Diagnose von Krankheiten unter Anwendung einer Festphasenmethodik und eines Luciferase-Luciferin Biolumineszenz erzeugenden Systems bereitgestellt. Verfahren unter Verwendung von Biomineralisation zur Abscheidung von Silicium auf einer Trägermatrix werden hierin auch bereitgestellt.
Hintergrund der Erfindung
Biolumineszenz
Lumineszenz ist ein Phänomen, in welchem Energie spezifisch auf ein Molekül übertragen wird, um einen angeregten Zustand zu erzeugen. Rückkehr zu einem niedrigeren Energiezustand ist begleitet von der Abgabe eines Photons (hγ). Lumineszenz umfasst Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz und Biolumineszenz. Biolumineszenz ist der Prozess, bei welchem lebende Organismen Licht emittieren, das für andere Organismen sichtbar ist. Lumineszenz kann wie folgt dargestellt werden: A + B → X^• + Y X^• → X + hγ wobei X^• ein elektronisch angeregtes Molekül ist und hγ Lichtemission nach Rückkehr von X^• zu einem niedrigeren Energiezustand darstellt. Wo die Lumineszenz Biolumineszenz ist, leitet sich die Erzeugung des angeregten Zustands von einer enzymkatalysierten Reaktion ab. Die Farbe des emittierten Lichts in einer biolumineszenten (oder chemilumineszenten oder anders lumineszenten) Reaktion ist charakteristisch für das angeregte Molekül und ist unabhängig von seiner Anregungsquelle und der Temperatur.
Eine essentielle Bedingung für Biolumineszenz ist die Verwendung von molekularem Sauerstoff, entweder gebunden oder frei, in Anwesenheit einer Luciferase. Luciferasen sind Oxygenasen, die in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff auf ein Substrat wirken, Luciferin, und die das Substrat in einen angeregten Zustand versetzen. Unter Rückkehr zu einer niedrigeren Energiestufe wird Energie in Form von Licht freigesetzt [für Übersichtsartikel siehe z.B. McElroy et al. (1966) in Molecular Architecture in Cell Physiology, Hayashi et al., Hrsg., Prentice-Hall, Inc. Englewood Cliffs, NJ, Seiten 63–80; Ward et al., Kapitel 7 in Chemi- and Bioluminescence, Burr, Hrsg., Marcel Dekker, Inc. NY, Seiten 321–358; Hastings, J. W. in (1995) Cell Physiology:Source Book, N. Sperelakis (Hrsg.), Academic Press, Seiten 665–681; Luminescence, Narcosis and Life in the Deep Sea, Johnson, Vantage Press, NY, siehe besonders Seiten 50–56].
Obgleich insgesamt selten, ist Biolumineszenz in Meeresorganismen verbreiteter als in den Landorganismen. Biolumineszenz hat sich aus nicht weniger als dreißig evolutiv unterschiedlichen Ursprüngen entwickelt und ist daher in einer Vielfalt von Wegen bekundet, so dass die biochemischen und physiologischen Mechanismen verantwortlich für Biolumineszenz in unterschiedlichen Organismen unterschiedlich sind. Biolumineszente Arten umfassen viele Gattungen und schließen mikroskopische Organismen ein, wie zum Beispiel Bakterien [in erster Linie Meeresbakterien, einschließlich Vibrio-Arten], Pilze, Algen und Dinoflagellaten bis hin zu Meeresorganismen, einschließlich Arthropoden, Mollusken, Echinodermen und Chordaten, und Landorganismen, einschließlich anneliden Würmern und Insekten.
Biolumineszenz, ebenso wie andere Typen von Chemilumineszenz, wird für qualitative Bestimmungen von spezifischen Substanzen in Biologie und Medizin verwendet. Zum Beispiel wurden Luciferase-Gene kloniert und als Reportergene in zahlreichen Untersuchungen für viele Zwecke benutzt. Da die unterschiedlichen Luciferase-Systeme unterschiedliche spezifische Anforderungen besitzen, können sie verwendet werden, um eine Vielfalt von Substanzen zu detektieren und zu quantifizieren. Die Mehrheit der kommerziellen Biolumineszenzanwendungen basiert auf Glühwürmchen [Photinus pyralis]-Luciferase. Eine der ersten und immer noch weit verbreiteten Untersuchungen umfasst die Verwendung der Glühwürmchen-Luciferase, um die Anwesenheit von ATP zu detektieren. Sie wird auch verwendet, um andere Substrate oder Cofaktoren in der Reaktion zu detektieren und zu quantifizieren. Jede Reaktion, die NAD(H), NADP(H) oder langkettige Aldehyde, entweder direkt oder indirekt herstellt oder benutzt, kann mit der lichtemittierten Reaktion von bakterieller Luciferase gekoppelt werden.
Ein anderes Luciferase-System, welches kommerziell für analytische Zwecke benutzt wurde, ist das Aequorin-System. Das gereinigte Quallen-Photoprotein, Aequorin, wird verwendet, um intrazelluläres Ca²⁺ und seine Änderungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu detektieren und zu quantifizieren. Das Aequorin-Photoprotein ist relativ klein [etwa 20 kDa], nicht giftig und kann in Zellen injiziert werden in Mengen, ausreichend um Calcium über einen weiten Konzentrationsbereich (3 × 10^–7 bis 10^–4 M] zu detektieren.
Wegen ihrem analytischen Nutzen wurden viele Luciferasen und Substrate untersucht und gut charakterisiert und sind kommerziell erhältlich [z.B. ist Glühwürmchen-Luciferase erhältlich von Sigma, St. Louis, MO, und Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN; rekombinant hergestellte Glühwürmchen-Luciferase oder andere Reagenzien, welche auf diesem Gen basieren oder zur Verwendung mit diesem Protein, sind erhältlich von Promega Corporation, Madison, WI; die Aequorin-Photoprotein-Luciferase aus Qualle und Luciferase aus Renilla sind kommerziell erhältlich von Sealite Sciences, Bogart, GA; Coelenterazin, das natürlich vorkommende Substrat für diese Luciferasen, ist erhältlich von Molecular Probes, Eugene, OR]. Luciferasen und in Beziehung stehende Reagenzien werden als Reagenzien zur Diagnostik, Qualitätskontrolle, Umwelttests und anderen solchen Analysen verwendet.
US 5,096,807 offenbart ein abbildendes Immunountersuchungs-Detektionsgerätesystem und ein Verfahren, welches fähig ist, mehrere lichtemittierende Reaktionen von kleinen Probenvolumen gleichzeitig zu detektieren und die Reaktionen zu quantifizieren. Das System macht Verwendung von einem Probenträger in Form zum Beispiel einer 96-Loch Mikrotiterplatte, in welcher die biolumineszenten Reaktionen stattfinden und Mittel zur Detektion des erzeugten Lichts und zur Erzeugung eines Signals, welches durch die Intensität der Reaktion bestimmt ist.
Chips, Untersuchungen und Mikroelektronik
Mikroelektronik, Chiparrays und andere Festphasen räumlich ansteuerbarer Arrays sind zur Verwendung in der Diagnostik und anderen Anwendungsmöglichkeiten entwickelt worden. Anwesend sind Verfahren zur Detektion positiver Ergebnisse mangelhaft oder ungelegen. Es besteht ein Bedarf für verbesserte, insbesondere für schnellere Detektionsverfahren. Deshalb ist es hierin eine Aufgabe, Detektionsmittel und -verfahren zur Verfügung zu stellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere infektiösen Erkrankungen, unter Verwendung von Chip-Methodik und einem Luciferase-Luciferin Biolumineszenz erzeugenden System bereitgestellt. Eine Chipvorrichtung zum Ausüben der Verfahren wird hierin auch bereitgestellt. Der Chip schließt einen integrierten Photodetektor, der die Photonen, die durch das biolumineszente System emittiert werden, detektiert, ein. Das Verfahren kann mit jeder geeigneten Chipvorrichtung, einschließlich selbst ansteuerbarer und nicht selbst ansteuerbarer Ausführungen, die wie hierin beschrieben modifiziert ist, zur Detektion von Photonen, die durch Biolumineszenz erzeugende Systeme erzeugt werden, ausgeführt werden. Die hierin bereitgestelle Chipvorrichtung ist verwendbar zur Verwendung in einer Arrayausführung für die Detektion und Identifikation infektiöser Mittel in biologischen Proben.
Um einen Chip zu vorzubereiten, wird eine geeignete Matrix für die Chipherstellung ausgewählt, der Chip durch eine geeignete Derivatisierung der Matrix zum Binden von Makromolekülen wird hergestellt und schließt die Bindung von Photodioden, Fotomultiplieren CCD (eine ladungsgekoppelte Vorrichtung) oder einen anderen geeigneten Detektor zum Messen der Lichtproduktion ein; Anheften eines geeignete Makromoleküls, wie zum Beispiel einem biologischen Molekül oder einem Antiliganden, z.B. einem Rezeptor, wie zum Beispiel ein Antikörper, an den Chip, wobei an eine zugewiesene Position darauf bevorzugt ist. Gegenwärtig sind Photodioden unter den bevorzugten Detektoren und hierin spezifiziert. Jedoch ist es selbstverständlich, dass andere geeignete Detektoren anstelle davon eingesetzt werden können.
In einer Ausführungsform wird der Chip unter Verwendung eines integrierten Schaltkreises mit einem Array, wie zum Beispiel einem X-Y-Array, von Photodetektoren hergestellt. Die Oberfläche des Schaltkreises ist behandelt, um sie inert gegenüber den Bedingungen der Diagnose-Untersuchungen, für welche der Chip gedacht ist, zu machen und sie ist angepasst, wie zum Beispiel durch Derivatisieren, zum Binden von Molekülen, wie zum Beispiel Antikörpern. Ein ausgewählter Antikörper oder ein Panel von Antikörpern, wie zum Beispiel ein Antikörper spezifisch für ein bestimmtes bakterielles Antigen, ist auf der Oberfläche des Chips über jeden Photodetektor befestigt. Nach dem Kontaktieren des Chips mit einer Testprobe wird der Chip mit einem zweiten Antikörper, der mit einer Komponente eines Biolumineszenz erzeugenden Systems verknüpft ist, wie zum Beispiel einer Luciferase oder Luciferin, und spezifisch für das Antigen ist, in Kontakt gebracht. Die verbleibenden Komponenten der Biolumineszenz erzeugenden Reaktion werden hinzugegeben und wenn irgendwelche der Antikörper, verknüpft mit einer Komponente eines Biolumineszenz erzeugenden Systems, auf dem Chip anwesend sind, wird Licht erzeugt werden und durch den benachbarten Photodetektor detektiert werden. Der Photodetektor ist operativ mit einem Computer verknüpft, welcher mit Informationen programmiert ist, die gebundenen Antikörper zu identifizieren, der den Vorgang aufzeichnet und dabei die Antigene, die in der Testprobe anwesend sind, identifiziert.
Der Chip wird in jeder gewünschten Untersuchung eingesetzt, wie zum Beispiel eine Untersuchung für eine infektiöse Erkrankung oder antibiotischer Sensitivität, durch, zum Beispiel, Verknüpfen eines Antikörpers oder eines Panels von Antikörpern mit der Oberfläche, Kontaktieren des Chips mit einer Testprobe einer Körperflüssigkeit, wie zum Beispiel Urin, Blut und zerebralem spinalem Fluid (CFS), für eine ausreichend lange Zeit, abhängig von der Ausführung der Untersuchung, so dass die/eine Zielstruktur in der Probe gebunden werden kann; Waschen des Chips und dann Inkubieren mit einem zweiten Antikörper, der mit einer Luciferase oder einem Antikörper:Luciferase Fusionsprotein konjugiert ist; Initiieren der biolumineszenten Reaktion; Detektieren von Licht an jeder Stelle mit einer gebundenen Zielstruktur, durch die Photodiode in dem Chip; Übertragung des elektronischen Signals vom Chip an einen Computer zur Analyse.
In einer Ausführungsform ist der Chip eine nicht selbst ansteuerbare mikroelektronische Vorrichtung zur Detektion von Lichtphotonen, emittiert durch lichtemittierende chemische Reaktionen. Die Vorrichtung schließt ein, ein Substrat, einen Array von Orten, hierin benannt als Mikrostellen, darauf bestimmt, und einen unabhängigen Photodetektor, der optisch mit jeder Mikrostelle gekoppelt ist. Jede Mikrostelle weist einen einzelnen chemischen Reaktanten auf, der Lichtphotonen emittieren wird, wenn eine Reaktion daran stattfindet. Jeder Photodetektor erzeugt ein abgetastetes Signal als Antwort auf die Photonen, emittiert an der entsprechenden Mikrostelle, wenn die Reaktion daran stattfindet und jeder Photodetektor ist unabhängig von den anderen Photodetektoren. Die Vorrichtung schließt auch eine elektronische Schaltung ein, welche die abgetasteten Signale erfasst, welche durch jeden Photodetektor erzeugt werden, und erzeugt Ausgabedaten-Signale davon. Die Ausgabedaten-Signale sind Indikativ für das Licht, das an jeder Mikrostelle emittiert wird.
In einer anderen Ausführungsform wird eine mikroelektronische Vorrichtung zur Detektion und Identifizierung von Analyten in einer fluiden Probe unter Verwendung lichtemittierender Reaktionen bereitgestellt. Die Vorrichtung schließt ein, ein Substrat, einen Array von Mikrostellen, der darauf zur Aufnahme der zu analysierenden fluiden Probe festgelegt ist, ein getrenntes, auf die Zielstruktur gerichtetes Mittel, welches an einer Befestigungsschicht von jeder Mikrostelle befestigt ist und einen unabhängigen Photodetektor, der optisch an jede Mikrostelle gekoppelt ist. Jedes auf die Zielstruktur gerichtete Mittel ist vorzugsweise spezifisch zum Binden eines ausgewählten Analyten, der in der aufgenommenen Probe anwesend sein kann. Jeder Photodetektor erzeugt ein abgetastetes Signal in Antwort auf Lichtphotonen, emittiert an der korrespondierenden Mikrostelle, wenn der ausgewählte Analyt, der daran gebunden ist, exponiert wird gegenüber einem zweiten bindenden Mittel, welches auch spezifisch zum Binden des gewählten Analyten oder gerichtet auf den Mittel-ausgewählten Analytenkomplexes ist und verknüpft ist mit einer oder mehreren Komponenten einer lichtemittierenden Reaktion. Der Chip wird dann mit den verbleibenden Komponenten in Reaktion gebracht, um die Photonen zu emittieren, wenn der ausgewählte Analyt anwesend ist. Eine elektronische Schaltung nimmt die abgetasteten Signale, welche durch jeden Photodetektor erzeugt werden, auf und erzeugt Ausgabedaten-Signale hiervon, die indikativ für das Licht sind, welches an jeder Mikrostelle emittiert wird.
In noch einer anderen Ausführungsform wird eine mikroelektronische Vorrichtung zur Detektion und Identifizierung von Analyten in einer biologischen Probe unter Verwendung von Luciferase-Luciferin Biolumineszenz zur Verfügung gestellt. Die Vorrichtung schließt ein, ein Substrat, einen Array von Mikrostellen, der darauf zur Aufnahme der zu analysierenden Probe festgelegt ist, einen getrennten Antiliganden, wie zum Beispiel einen Rezeptorantikörper, der an die Befestigungsschicht von jeder Mikrostelle befestigt ist und einen unabhängigen Photodetektor, der optisch gekoppelt zu jeder Mikrostelle ist. Jeder Rezeptorantikörper ist spezifisch zur Bindung eines ausgewählten Analyten, der in der aufgenommenen Probe anwesend sein kann. Jeder Photodetektor erzeugt ein abgetastetes Signal in Antwort auf Biolumineszenz, die an der entsprechenden Mikrostelle emittiert wird, wenn der ausgewählte Analyt, der an den entsprechenden Rezeptorantikörper gebunden ist, exponiert wird gegenüber einem zweiten Antikörper, der auch spezifisch zu dem ausgewählten Analyten oder zu dem Rezeptorantikörper-ausgewählten Analytenkomplex ist und verbunden ist mit einer oder mehreren Komponenten einer Luciferase-Luciferin Reaktion, und dann in Reaktion gebracht wird mit den verbleibenden Komponenten, um Biolumineszenz zu erzeugen, wenn der ausgewählte Analyt anwesend ist. Ein elektronischer Schaltkreis nimmt das abgetastete Signal von jedem Photodetektor auf und erzeugt Ausgabedaten-Signale hiervon. Die Ausgabedaten-Signale sind indikativ für die Biolumineszenz, die an jeder Mikrostelle durch die Reaktion emittiert wird.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Detektion und Identifizierung von Analyten in einer biologischen Probe unter Verwendung von Luciferase-Luciferin Biolumineszenz zur Verfügung gestellt. Das Verfahren schließt ein, das Bereitstellen einer mikroelektronischen Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 36, die Derivatisierung der Oberfläche, um die Befestigung eines Rezeptorantikörpers oder einer Vielzahl von Antikörpern daran an jeder Mikrostelle zu erlauben oder zu verstärken und das Anheften eines spezifischen Rezeptorantikörpers oder einer Vielzahl hiervon an die Oberfläche an jeder Mikrostelle. Der ausgwählte Antikörper ist spezifisch zum Binden eines ausgewählten Analyten, der in der Probe anwesend sein kann. Das Verfahren schließt auch ein das Aufbringen der Probe auf die Oberfläche, so dass die ausgwählten Analyten an den Rezeptorantikörper, befestigt an der Oberfläche an jeder Mikrostelle, binden werden, das Waschen der Probe von der Oberfläche nach Abwarten einer ausreichend langen Zeitspanne für den ausgewählten Analyten, um mit dem Rezeptorantikörper an jeder Mikrostelle zu binden, das Exponieren der Oberfläche gegenüber einem zweiten Antikörper, der spezifisch ist, den ausgewählten Analyten, der schon durch den Rezeptorantikörper an jeder Mikrostelle gebunden ist, zu binden, wenn der ausgewählte Analyt anwesend ist, wobei der zweite Antikörper verknüpft ist mit einem von einer Luciferase und einem Luciferin und das Initiieren der Reaktion durch Aufbringen des anderen von der Luciferase und Luciferin auf die Oberfläche. Das Verfahren schließt auch das Detektieren der Lichtphotonen, emittiert durch die Reaktion, unter Verwendung eines Photodetektors, optisch gekoppelt mit jeder Mikrostelle, ein, wobei jeder Photodetektor ein abgetastetes Signal stellvertretend der Biolumineszenzaktivität daselbst erzeugt, das Lesen des abgetasteten Signals von jedem Photodetektor und das Erzeugen von Ausgabedaten-Signalen davon, die Indikativ sind für die Biolumineszenz, die an an jeder Mikrostelle durch die Reaktion emittiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein System zur Detektion und Identifizierung von Analyten in einer biologischen Probe unter Verwendung von Luciferase-Luciferin Biolumineszenz zur Verfügung gestellt. Das System schließt ein: eine mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 36, einen getrennten Rezeptorantikörper, befestigt an der Befestigungsschicht jeder Mikrostelle, wobei jeder Rezeptorantikörper spezifisch für einen ausgewählten Analyten ist, der in der aufgenommenen Probe anwesend sein kann. Ein abgetastetes Signal in Reaktion auf Biolumineszenz, die an an der entsprechenden Mikrostelle emittiert wird, wenn der ausgewählte Analyt gebunden an den entsprechenden Rezeptorantikörper exponiert wird gegenüber einem zweiten Antikörper auch spezifisch zu dem ausgewählten Analyten und verknüpft mit einem von einer Luciferase und einem Luciferin, und dann umgesetzt wird mit dem anderen der Luciferase und Luciferin, um die Biolumineszenz zu erzeugen, wenn der ausgewählte Analyt anwesend ist. Eine elektronische Schaltung nimmt das abgetastete Signal von jedem Photodetektor auf und erzeugt Ausgabedaten-Signale hiervon, indikativ für die Biolumineszenz, emittiert an jeder Mikrostelle durch die Reaktion. Das System umfasst ein verarbeitendes Instrument einschließlich einem Eingabeschnittstellenschaltkreis zum Empfangen der Ausgabedaten-Signale, indikativ für die Biolumineszenz, emittiert an jeder Mikrostelle, einen Speicher zum Speichern eines Datenerfassungsarrays, welcher eine Ortsangabe zugehörig zu jeder Mikrostelle besitzt, eine Ausgabevorrichtung zur Erzeugung sichtbarer Anzeige als Antwort auf ein Ausgabevorrichtungssignal und eine verarbeitende Schaltung. Die verarbeitende Schaltung liest die Ausgabedaten-Signale, empfangen durch den Eingabeschnittstellenschaltkreis, korreliert diese Signale mit den entsprechenden Mikrostellen, integriert die korrelierten Ausgabedaten-Signale über einen gewünschten Zeitraum durch Ansammeln dieser in dem Datenerfassungsarray und erzeugt das Ausgabevorrichtungssignal, welches, wenn es auf die Ausgabevorrichtung angelegt wird, die Ausgabevorrichtung veranlasst, sichtbar eine Anzeige, welche in Bezug zur Anwesenheit der ausgewählten Analyten steht, zu erzeugen.
In anderen Ausführungsformen ist der Chip selbst ansteuerbar. Wenn in dem Verfahren selbst ansteuerbare Chips verwendet werden, sind gegenwärtig solche bevorzugt, die an mikroelektronische selbst ansteuerbare, selbst zusammenbauende Chips von Systemen angepaßt werden können, wie diejenigen, die in den internationalen PCT-Anmeldungen Nrn. WO 95/12808; WO 96/01836 und WO 96/07917 beschrieben sind und auch in Arrays, wie die, die in US-Patent Nr. 5,451,683. beschrieben sind. Die selbstansteuerbaren Chips sind derart gestaltet, dass jede einzelne Vertiefung einmal zu einer Zeit angesteuert werden kann in Anwesenheit des Rests durch Ändern der Ladung an einer einzelnen Mikrostelle und dann Schicken der Analyten oder Reagenzien durch freie Strömungselektrophorese dadurch, aber der Zusammenbau vollzieht sich nur an der Stelle nachdem der Chip zusammengebaut wurde. Diese Vorrichtungen sind modifiziert zur Verwendung in den Verfahren hierin durch Ersetzen der offenbarten Detektionsmittel mit den Luciferase/Luciferin Systemen.
In einer anderen, hierin zur Verfügung gestellten Ausführungsform befinden sich Elektroden, eine Anode und eine Kathode am Boden bzw. am oberen Rand jeder Vertiefung, um den Zufluss von Analyten und Reagenzien durch freie Strömungselektrophorese zu ermöglichen. Die Antikörper sind an jeder Mikrostelle auf einer MYLAR (gerichtetes Polyethylenterephthalat)-Schicht vor dem Zusammenbau des Chips befestigt (zum Beispiel unter Verwendung eines Messpunktmatrixdruckers). Daher ist es nicht selbst ansteuerbar in dem Sinn, dass es eine Vielzahl von individuellen Vertiefungen besitzt, wobei jedes eine Photodiode enthält, welche in den Halbleiterschicht-Boden von jeder Vertiefung eingebaut ist.
In der Praxis können spezifische Antiliganden, z.B. Antikörper, direkt an der Matrix des Chips befestigt werden oder an eine mittlere reflektierende Trägermatrix, wie zum Beispiel für hitzestabiles MYLAR, das in der Mitte jeder Vertiefung positioniert ist. Die Probe wird mit dem Chip in Kontakt gebracht, gewaschen und eine Vielzahl von Sekundärantikörpern-Luciferase-Konjugaten oder Fusionsproteinen wird zugegeben. Die Vertiefungen werden gewaschen und die verbleibenden Komponenten der biolumineszenten Reaktion werden zugegeben, um die Reaktion zu starten. Licht, welches in einer Vertiefung erzeugt wird, wird detektiert durch die Photodiode, Fotomultiplier, CCD (englisch: charge coupled device; ladungsgekoppelte Vorrichtung) oder einem anderen geeigneten Detektor in der Halbleiterschicht und das Signal wird weitergeleitet an eine verarbeitende Einheit, typischerweise ein Computer. Die verarbeitende Einheit zeigt die Vertiefung oder die Vertiefungen, die positiv sind, an. Jede Vertiefung korrespondiert mit einem speziellen Liganden und erlaubt dadurch die Identifikation des infektiösen Mittel. Alle Schritte können automatisiert werden.
Die Gestaltung, Herstellung und Verwendungen von nicht selbst ansteuerbaren und programmierbaren, selbst ansteuerbaren und selbst zusammenbauenden mikroelektronischen Systemen und Vorrichtungen, welch aktiv kontrollierte mehrstufige und gebündelte Reaktionen in mikroskopischen Formaten ausführen zur Detektion der elektromagnetischen Emissionen einer biolumineszenten Reaktion werden hierin bereitgestellt. Diese Reaktionen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, die meisten molekularbiologischen Prozeduren, wie zum Beispiel Nukleinsäure und Protein Nukleinsäure-Hybridisierungen, Antikörper/Antigen Reaktionen und verwandte klinische Diagnostik.
Die resultierenden Chips, welche eine Siliciummatrix und Photodioden oder andere lichtdetektierende Mittel einschließen, werden zur Verfügung gestellt. Das Silicium kann unter Verwendung enzymatischer Auftragung aufgetragen werden, ähnlich zu der enzymatischen Auftragung durch Radiolarians und Kieselalgen. Es werden auch Chips zur Verfügung gestellt, in welchen die Absorption von Siliziumdioxid oder Derivaten davon vorteilhaft als ein Mittel zur Detektion zum Einsatz kommt. Solches Siliziumdioxid hat ein Adsorptionsmaximum von etwa 705 nm, welches der Wellenlänge emittiert durch das Aristostornias Biolumineszenz erzeugende System entspricht. Enzymatische Verfahren zum Auftrag von Silicium auf eine Oberfläche befinden sich auch hierin.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch in einer synthetischen Synapse verwendet werden. Ein geeignetes Enzym, vorzugsweise Acetylcholinesterase, wird mit einer Luciferase fusioniert, wie zum Beispiel durch rekombinante Expression. Die Luciferase ist entweder in einer inaktiven oder aktiven Konformation. Geeignete Mutationen in beiden Proteinen können ausgewählt werden, um sicherzustellen, dass die Luciferase geeignete konformationelle Änderungen ausführen kann, wie hierin beschrieben. Die sich ergebende Fusion wird an einem erfindungsgemäßen Chip befestigt. Infolge des Bindens des Liganden an das Ezym, wie zum Beispiel das Binden von Acetylcholin an die Esterase, wird die verknüpfte Luciferase, wenn vorher inaktiv, durch das Binden aktiviert, oder wenn vorher aktiv, wird sie durch das Binden inaktiviert. In Anwesenheit der verbleibenden Komponenten eines Biolumineszenz erzeugenden Systems wird Licht produziert (oder wird gequencht), welcher Wechsel durch die Photodioden, welche mit dem Chip assoziiert sind, detektiert wird. Die Detektion erzeugt ein Signal, welches verarbeitet wird, wie zum Beispiel durch einen Computer, und übertragen wird durch geeignete Mittel, wie zum Beispiel eine Faser, zu einer Elektrode, welche befestigt ist an jede gewünschte Vorrichtung oder ein Effektor, vorzugsweise ein Muskel. Auf den Empfang des Signals hin vollzieht sich Arbeit, wie zum Beispiel ein Muskelzucken.
Kurze Beschreibung der Skizzen
1 ist ein schematisches Blockdiagramm einer mikroelektronischen Vorrichtung zur Detektion und Identifizierung von Analyten in einer biologischen Probe unter Verwendung von Biolumineszenz, wobei die mikroelektronische Vorrichtung einen Array von Mikrostellen und einen Photodetektor, der optisch gekoppelt mit jeder Mikrostelle ist, zur Detektion der Biolumineszenz, welche an der korrespondierenden Mikrostelle emittiert wird, einschließt;
2 ist eine Ansicht von oben auf das Plättchen für die mikroelektronische Vorrichtung von 1, welche den Photodetektorarray aufgelegt auf einem Halbleitersubstrat zeigt;
3 ist eine perspektivische Ansicht der mikroelektronischen Vorrichtung von 1, einschließlich des Plättchens von 2, untergebracht in einer keramischen Doppelreihenbaugruppe (englisch: dual-inline package; DIP), und 3A ist eine vergrößerte Ansicht, welche die Testvertiefung, ausgestaltet in der DIP im Detail zeigt;
4 ist ein schematisches Diagramm, welches eine Pixelelementarzellenschaltung zur Detektion der Biolumineszenz, emittiert an jeder Mikrostelle in dem Array zeigt;
5 ist ein Graph, der die Spannungspegel an den drei Leitungsknoten der Pixelelementarzellenschaltung von 4 als eine Funktion der Zeit während des Arbeitsvorgangs der Vorrichtung zeigt;
6 ist ein Systemblockdiagramm, welches die mikroelektronische Vorrichtung von 1 zeigt, befestigt auf einer Adapter-Schaltkreisbaugruppe, die seriell angeschlossen an einen Computer, der programmiert ist, um den seriellen Ausgabedatenstrom zu lesen, um die Ausgabedaten mit dem Array von Mikrostellen zu korrelieren, um die mit jeder Mikrostelle korrelierten Daten über einen vorbestimmten Zeitraum, welcher unter Verwendung einer Eingabevorrichtung bestimmt ist, zu integrieren, um die Analyten anwesend in dem biologischen Medium durch in Bezug nehmen auf ein Analytenspeicherabbild zu identifizieren und um die Ergebnisse auf einer Ausgabevorrichtung anzuzeigen; und
7 zeigt die mikroelektronische Vorrichtung von 1, aufgenommen in einer Schaltkreisbaugruppe, welche es vom Anwender nicht verlangt, die Baugruppe direkt handzuhaben.
8 ist ein schematisches Querschnittsdiagramm eines Dreilagen-CCD-Chips mit vielen Vertiefungen (ein Chip, welcher eine Photodiode/CCD enthält).
9 zeigt eine vergrößerte schematische Darstellung einer CCD-Chip-Schicht mit vielen Vertiefungen und einer mittleren reflektierenden Schicht und eine schematische Abbildung einer einzelnen Vertiefung.
10 zeigt eine vergrößerte schematische Darstellung von spezifischen Antikörpern, welche an der mittleren reflektierenden Schicht des CCD-Chips mit vielen Vertiefungen von 8 befestigt sind.
11 ist ein Querschnitt einer einzelnen Vertiefung, welcher die relative Position der CCD, der reflektierenden Spiegelschicht und der Kathode und Anode abbildet. Antikörpern, welche an der mittleren reflektierenden Schicht befestigt sind, hängen seitenverkehrt über der Photodiode. Gebundenes Antigen wird unter Verwendung eines Antikörper-Luciferase-Fusionsproteins detektiert und Licht erzeugt von der biolumineszenten Reaktion wird detektiert von der Photodiode und zur Identifikation an eine verarbeitende Einheit weitergeleitet.
12 ist ein Querschnitt von drei selbstansteuerbaren Mikrostellen, die unter Verwendung mikrolithographischer Techniken hergestellt wurden (siehe Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 96/01836). Inbegriffen sind Pfeile, welche die Positionierung der Photodiode angeben.
13 ist ein Querschnitt einer mikrolithographisch hergestellten Mikrostelle; Antikörper oder andere Rezeptoren sind verknüpft mit der Befestigungsschicht.
14 ist eine schematische Darstellung eines selbstansteuerbaren Chip mit 64 Mikrostellen, der hier tatsächlich hergestellt, mit Oligonukleotiden angesteuert und getestet wurde.
15 zeigt eine vergrößerte schematische Darstellung einer mikromaschinell bearbeiteten Vorrichtung mit 96 Mikrostellen.
16 ist ein Querschnitt einer mikromaschinell bearbeiteten Vorrichtung.
17 zeigt eine schematische Darstellung einer artifiziellen Siliciumsynapse.
18 zeigt eine schematische Ansicht eines Acetylcholinesterase-Luciferase-Fusionsproteins und eines Acetylcholinesterasefluorochrom-Konjugats, welches in der Siliciumsynapse verwendet wird.
19 beschreibt die Methodik für die Platzierung von Siliciumsynapsen und Elektroden im menschlichen Rückenmark, um eine permanente Rückenmarkläsion zu überbrücken.
20 beschreibt ein Schema zur Bedienung von hierin beschriebenen Chips in diagnostischen Untersuchungen zur Detektion infektiöser Mikroorganismen.
Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen Inhaltsverzeichnis

A. Definitionen
B. Biolumineszenz erzeugende Systeme
1. Allgemeine Beschreibung
a. Luciferasen
b. Luciferine
c. Aktivatoren
d. Reaktionen
2. Ctenophoren und coelenterate Systeme
a. Das Aequorin-System
(1) Aequorin-Photoprotein
(2) Luciferin
b. Das Renilla-System
3. Crusteaceen, vorzugsweise Cyrpidina (Vargula)-Systeme
a. Vargula Luciferase
(1) Reinigung von Cyrpidina
(2) Präparation durch rekombinante Verfahren
b. Vargula Luciferin
c. Reaktion
4. Biolumineszenz erzeugende Systeme aus Insekten, einschließlich Glühwürmchen, Schnellkäfer und anderen Insektensystemen
a. Luciferase
b. Luciferin
c. Reaktionen
5. Bakterielle Systeme
a. Luciferasen
b. Luciferine
c. Reaktionen
6. Andere Systeme
a. Dinoflaggelate Biolumineszenz erzeugende Systeme
b. Systeme von Mollusken, wie z.B. Latia und Pholas
c. Regenwürmer und andere Anneliden
d. Glühwürmer
e. Meerespolychatenwurmsysteme
f. Südamerikanischer Railway Beetle
7. Fluoreszierende Proteine
a. Grün und blau fluoreszierende Proteine
b. Phycobiliproteine
C. Design und Herstellung von Chips
1. Nicht selbstansteurbare Chips
2. Selbst ansteuerbare Chips
a. Matrixmaterialien
b. Herstellungsverfahren
i. Mikrolithographie
ii. Mikromaschinelle Herstellung
c. Selbstansteuerung von Chips
3. Befestigung von biologischen Molekülen an Chips
a. Derivatisierung von Siliciumdioxid-Trägermaterial
b. Befestigung von biologischen Molekülen
D. Bildung von Luciferase-Konjugaten
1. Linker
2. Luciferase-Fusionsproteine
3. Nukleinsäure- und Peptidnukleinsäure-Konjugate
E. Radiolarians und Kieselalgen zur Auftragung von Silicium auf Matrizen
F. Verfahren zur Verwendung des Chips

A. Definitionen
Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie im Allgemeinen von einem Fachmann des Bereichs, zu welchem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
Wie hierin vorgesehen, bezieht sich Chemilumineszenz auf eine chemische Reaktion, in welcher Energie spezifisch auf ein Molekül übertragen wird, welches dadurch veranlasst wird, elektronisch angeregt zu werden und nachfolgend ein Photon unter Emittierung von sichtbarem Licht freisetzt. Temperatur trägt zu dieser übertragenen Energie nicht bei. Daher führt Chemilumineszenz zur direkten Umwandlung von chemischer Energie in Lichtenergie. Biolumineszenz bezieht sich auf die Teilmenge von Chemilumineszenzreaktionen, die Luciferine und Luciferasen (oder die Photoproteine) einschließen. Biolumineszenz schließt hierin Phosphoreszenz nicht mit ein.
Wie hierin vorgesehen, bezieht sich Biolumineszenz, welche ein Typ der Chemilumineszenz ist, auf die Emission von Licht durch biologische Moleküle, vorzugsweise Proteine. Die essenzielle Bedingung für Biolumineszenz ist molekularer Sauerstoff, entweder gebunden oder frei in Anwesenheit einer Oxygenase, einer Luciferase, welche auf ein Substrat, ein Luciferin, einwirkt. Biolumineszenz wird erzeugt durch ein Enzym oder ein anderes Protein (Luciferase), welches eine Oxygenase ist, das auf ein Substrat Luciferin (ein Biolumineszenzsubstrat) in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff einwirkt und das Substrat in einen angeregten Zustand versetzt, welcher bei der Rückkehr zu einer niedrigeren Energiestufe die Energie in Form von Licht freisetzt.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Substrate und Enzyme zur Erzeugung von Biolumineszenz, im Allgemeinen auf Luciferin bzw. Luciferase. Wenn auf eine bestimmte Art hiervon verwiesen wird, wird zur Klarheit jeder Gattungsbegriff mit dem Namen des Organismus, von welchem er sich ableitet, zum Beispiel bakterielles Luciferin oder Glühwürmchenluciferase, verwendet.
Wie hierin verwendet, bezieht sich Luciferase, auf Oxygenasen, die eine lichtemittierende Reaktion katalysieren. Zum Beispiel katalysieren bakterielle Luciferasen die Oxidation von Flavinmononukleotid (FMN) und aliphatischen Aldehyden, welche Reaktion Licht erzeugt. Eine andere Klasse der Luciferasen, welche unter den Meeresanthropoden gefunden wird, katalysiert die Oxydation von Cypridina [Vargula] Luciferin, und eine andere Klasse von Luciferasen katalysiert die Oxidation von Coleoptera Luciferin.
Luciferase bezieht sich daher auf ein Enzym oder Photoprotein, welches eine biolumineszente Reaktion (eine Reaktion, die Biolumineszenz erzeugt) katalysiert. Die Luciferasen, wie zum Beispiel Glühwürmchen- und Renilla Luciferasen, sind Enzyme, welche katalytisch wirken und während der Biolumineszenz erzeugenden Reaktion unverändert bleiben. Die Luciferase-Photoproteine, wie zum Beispiel die Aequorin- und Oblein-Photoproteine, an welche Luciferin nicht kovalente gebunden ist, werden verändert, wie zum Beispiel durch die Freisetzung des Luciferins während der Biolumineszenz erzeugenden Reaktion. Die Luciferase ist ein Protein, welches natürlich in einem Organismus oder einer Variante oder einer Mutante davon vorkommt, wobei eine solche Variante, die eine oder mehrere Fähigkeiten, wie zum Beispiel Thermo- oder pH-Stabilität, die sich vom natürlich vorkommenden Protein unterscheiden, besitzt, durch Mutagenese hergestellt wird. Luciferasen und modifizierte Mutanten oder Variantenformen davon sind gut bekannt.
Daher bedeutet zum Beispiel ein Verweis auf „Renilla Luciferase" ein Enzym, welches von einem Mitglied der Gattung Renilla isoliert wurde, oder ein äquivalentes Molekül, welches aus jedlicher anderer Quelle erhalten wurde, wie zum Beispiel von einem anderen Anthozoa, oder das synthetisch hergestellt wurde.
Die Luciferasen und Luciferin und Aktivatoren hiervon werden als Biolumineszenz erzeugende Reagenzien oder Komponenten bezeichnet. Typischerweise wird während der Untersuchung eine Teilmenge dieser Reagenzien bereitgestellt werden oder ansonsten an besonderen Stellen auf der Oberfläche des Chips immobilisiert werden. Biolumineszenz wird infolge des Kontaktierens der Chipoberfläche mit den verbleibenden Reagenzien erzeugt werden und das erzeugte Licht wird durch Photodioden detektiert an den Stellen des Arrays, wo eine spezifische Zielstruktur durch den immobilisierten Antiliganden detektiert worden ist. Daher werden, wie hierin verwendet, die Komponenten Luciferasen, Luciferine und andere Faktoren, wie zum Beispiel O₂, Mg²⁺, Ca²⁺ auch als Biolumineszenz erzeugende Reagenzien [oder Agenzien oder Komponenten] bezeichnet.
Wie hierin verwendet bedeutet „nicht streng katalytisch", dass das Photoprotein als ein Katalysator wirkt, um die Oxidation des Substrats zu fördern, aber es wird in der Reaktion verändert, da das gebundene Substrat oxidiert wird und gebundener molekularer Sauerstoff in der Reaktion verwendet wird. Solche Photoproteine werden durch Addition des Substrats und molekularen Sauerstoffs unter geeigneten Bedingungen, welche dem Fachmann bekannt sind, regeneriert.
Wie hierin verwendet bezieht sich Biolumineszenz-Substrat auf die Verbindung, die in Anwesenheit einer Luciferase und jeglicher notwendiger Aktivatoren oxidiert wird, und Licht erzeugt. Diese Substrate werden als Luciferine bezeichnet, welche Substrate darstellen, die in einer Biolumineszenz-Reaktion eine Oxidation eingehen. Diese Biolumineszenz-Substrate schließen jegliches Luciferin oder Analogon davon oder jegliche synthetische Verbindung, mit welcher eine Luciferase wechselwirkt, um Licht zu erzeugen, ein. Bevorzugte Substrate sind diejenigen, die in Anwesenheit einer Luciferase oder eines Proteins in einer Licht erzeugenden Reaktion oxidiert werden. Daher schließen Biolumineszenz-Substrate solche Verbindungen ein, die der Fachmann als Luciferine erkennt. Luciferine schließen zum Beispiel Glühwürmchenluciferin, Cypridina [auch bekannt als Vargula] Luciferin [Coelenterazin], bakterielles Luciferin ebenso wie synthetische Analoga dieser Substrate oder Verbindungen, die in Anwesenheit einer Luciferase in einer Reaktion, welche Biolumineszenz erzeugt, oxidiert werden, ein.
Wie hierin verwendet bedeutet fähig zur Umsetzung in ein Biolumineszenz-Substrat, empfänglich für eine chemische Reaktion, wie zum Beispiel Oxidation oder Reduktion, die ein Biolumineszenz-Substrat liefert. Zum Beispiel schließt die Lumineszenz erzeugende Reaktion von biolumineszenten Bakterien die Reduktion einer Flavinmononukleotidgruppe (FMN) zum reduzierten Flavinmononukleotid (FMNH₂) durch ein Flavinreduktaseenzym ein. Das reduzierte Flavinmononukleotid [Substrat] reagiert dann mit Sauerstoff [ein Aktivator] und bakterieller Luciferase unter Ausbildung einer Peroxyflavin-Zwischenstufe, die dann eine weitere Reaktion, in Anwesenheit eine langkettigen Aldehyden, eingeht, um Licht zu erzeugen. In Bezug auf diese Reaktion sind das reduzierte Flavin und der langkettige Aldehyd Substrate.
Wie hierin verwendet, bezieht sich Biolumineszenz-System [oder Biolumineszenz erzeugendes System] auf die Zusammenstellung von Reagenzien, die für eine Biolumineszenz erzeugende Reaktion benötigt werden. Folglich bilden die jeweilige Luciferase, Luciferin und andere Substrate, Lösungsmittel und andere Reagenzien, die benötigt werden können, um eine biolumineszente Reaktion auszuführen, ein Biolumineszenz-System. Daher bezieht sich ein Biolumineszenz-System (oder gleichwertig ein Biolumineszenz erzeugendes System) auf einen Satz von Reagenzien, der unter den geeigneten Reaktionsbedingungen zu Biolumineszenz führt. Geeignete Reaktionsbedingungen beziehen sich auf die Bedingungen, die zum Ablaufen einer Biolumineszenz-Reaktion nötig sind, zum Beispiel pH-Wert, Salzkonzentrationen und Temperatur. Im Allgemeinen schließen Biolumineszenz-Systeme ein Biolumineszenz-Substrat (ein Luciferin), eine Luciferase, welche die Enzyme Luciferase und Photoproteine umfasst, und einen oder mehrere Aktivatoren ein. Ein bestimmtes Biolumineszenz-System kann durch den Bezug auf einen spezifischen Organismus, von welchem sich die Luciferase ableitet, gekennzeichnet werden; zum Beispiel das Vargula (auch Cypridina genannt) Biolumineszenz-System (oder Vargula-System) schließt eine Vargula Luciferase ein, wie wie zum Beispiel eine Luciferase isoliert aus dem Ostracoden Vargula oder hergestellt unter Verwendung rekombinanter Mittel oder Modifikationen dieser Luciferasen. Das System würde auch die jeweiligen Aktivatoren, welche notwendig sind, um die Biolumineszenz-Reaktion auszuführen, wie zum Beispiel Sauerstoff und ein Substrat, mit welchem die Luciferase in der Anwesenheit von Sauerstoff reagiert, um Licht zu erzeugen, einschließen.
Wie hierin verwendet beziehen sich ATP, AMP, NAD+ und NADH auf Adenosintriphosphat, Adenosinmonophosphat, Nicotinamid-Adenindinukleotid (oxidierte Form) beziehungsweise Nicotinamid-Adenindinukleotid (reduzierte Form).
Wie hierin verwendet bedeutet Herstellung durch rekombinante Mittel unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren, die Anwendung wohl bekannter Verfahren der Molekularbiologie zur Expression von Proteinen, die durch klonierte DNA kodiert werden.
Wie hierin verwendet bedeutet im Wesentlichen identisch zu einem Produkt ausreichend ähnlich, so dass die Eigenschaft von Interesse ausreichend unverändert bleibt, so dass das im Wesentlichen identische Produkt anstelle des Produkts verwendet werden kann.
Wie hierin verwendet bedeutet im Wesentlichen rein ausreichend homogen, um frei von leicht zu detektierbaren Verunreinigungen, wie sie durch Standardanalyseverfahren bestimmt werden können, wie zum Beispiel Dünnschichtchromatographie (engl. thin layer chromatography, TLC), Gelelektrophorese und Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (engl. high performance liquid chromatography, HPLC) bestimmt werden können, zu scheinen. Der Fachmann verwendet diese, um eine solche Reinheit, oder ausreichend rein, derart abzuschätzen, dass eine weitere Reinigung die physikalischen und chemischen Eigenschaften, wie zum Beispiel enzymatische und biologische Aktivitäten, der Substanz nicht verändern würde. Verfahren zur Reinigung der Verbindungen um im Wesentlichen chemisch reine Verbindungen herzustellen sind dem Fachmann bekannt. Eine im Wesentlichen chemisch reine Verbindung kann dennoch eine Mischung von Stereoisomeren sein. In solchen Fällen kann eine weitere Reinigung die spezifische Aktivität der Verbindung steigern.
Wie hierin verwendet bedeutet äquivalent, wenn es sich auf zwei Nukleinsäuresequenzen bezieht, dass die zwei fraglichen Sequenzen dieselbe Sequenz an Aminosäuren oder äquivalente Proteine kodieren. Wenn „äquivalent" in Bezug auf zwei Proteine oder Peptide verwendet wird, bedeutet es, dass die beiden Proteine oder Peptide im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz mit nur konservativen Aminosäuresubstitutionen [siehe z.B. Tabelle 2 unten] besitzen, die die Aktivität oder Funktion des Proteins oder des Peptids im Wesentlichen nicht ändern. Wenn „äquivalent" sich auf eine Eigenschaft bezieht, muss die Eigenschaft nicht im gleichen Ausmaß vorhanden sein [z.B. zwei Peptide können verschiedene Geschwindigkeiten desselben Typs von enzymatischer Aktivität aufweisen], aber die Aktivitäten sind vorzugsweise im Wesentlichen die gleichen. „Komplementär", wenn es sich auf zwei Nukleotidsequenzen bezieht, bedeutet, dass die beiden Sequenzen von Nukleotiden fähig sind, zu hybridisieren, vorzugsweise mit weniger als 25%, stärker bevorzugt mit weniger als 15%, noch stärker bevorzugt mit weniger als 5%, am stärksten bevorzugt mit keiner Fehlpaarung zwischen den gegenüberliegenden Nukleotiden. Vorzugsweise werden die zwei Moleküle unter Bedingungen von hoher Stringenz hybridisieren.
Wie hierin verwendet: Stringenz der Hybridisierung zur Bestimmung des Prozentsatzes an Fehlpaarung ist wie folgt:

1) hohe Stringenz: 0,1 × SSPE, 0,1% SDS, 65°C
2) mittlere Stringenz: 0,2 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C
3) niedrige Stringenz: 1,0 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C

Es ist selbstverständlich, dass äquivalente Stringenzien unter Verwendung alternativer Puffer, Salze und Temperaturen erreicht werden können.
Wie hierin verwendet bezieht sich Peptidnukleinsäure auf Nukleinsäureanaloga, in welchen das Ribose-Phosphat-Rückgrat ersetzt ist durch ein Rückgrat, welches durch Amidbindungen zusammengehalten wird.
Der Ausdruck „im Wesentlichen" variiert im Zusammenhang, wie er vom einschlägigen Fachmann verstanden wird und bedeutet im Allgemeinen wenigstens 70%, bedeutet vorzugsweise wenigstens 80%, stärker bevorzugt wenigstens 90% und am stärksten bevorzugt wenigstens 95%.
Wie hierin verwendet bezieht sich biologische Aktivitäten auf die in vivo Aktivitäten einer Verbindung oder die physiologischen Antworten, die sich nach Verabreichung einer Verbindung, Zusammensetzung oder Mischung ergeben. Biologische Aktivitäten können in in vitro Systemen, die entwickelt wurden, um solche Aktivitäten zu testen oder zu verwenden, beobachtet werden. Daher ist für die Zwecke hierin die biologische Aktivität einer Luciferase ihre Oxygenaseaktivität, wobei, folgend auf die Oxidation eines Substrats, Licht erzeugt wird.
Wie hierin verwendet bezieht sich eine Zusammensetzung auf jegliche Mischung. Es kann eine Lösung, eine Suspension, flüssig, pulverfömig, eine Paste, wässrig, nicht wässrig oder jegliche Kombination hiervon sein.
Wie hierin verwendet bezieht sich eine Kombination auf jegliche Vereinigung zwischen zwei oder unter mehreren Gegenständen.
Wie hierin verwendet bezieht sich Fluid auf jegliche Zusammensetzung, welche fließen kann. Daher umfassen Fluide Zusammensetzungen, die in Form von Semifeststoffen, Pasten, Lösungen, wässrigen Mischungen, Gelen, Lotionen, Cremen und anderen solchen Zusammensetzungen vorliegen.
Wie hierin verwendet sind Makromoleküle vorgesehen, um allgemein alle Moleküle zu umfassen, die für diagnostische Untersuchungen mit einer festen Auflage verbunden würden. Die Makromoleküle schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf: Proteine, organische Moleküle, Nukleinsäuren, Viren, virale Kapside, Phagen, Zellen oder Membranen davon oder Teile von Viren, viralen Kapsiden, Phagen, Zellen oder Membranen. Von besonderem Interesse sind hierin Makromoleküle, die spezifisch an Analyten von Interesse binden. Analyten von Interesse sind solche, die in Körperfluiden und anderen biologischen Proben anwesend sind.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein Rezeptor auf ein Molekül, das eine Affinität für einen gegebenen Liganden besitzt. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle sein. Rezeptoren können im Bereich auch als Antiliganden bezeichnet werden. Wie hierin verwendet, sind der Rezeptor und Antiligand untereinander austauschbar. Rezeptoren können in ihrem unveränderten Zustand oder als Aggregate mit anderen Arten verwendet werden. Rezeptoren können kovalent oder nicht kovalent oder in physikalischem Kontakt an ein Bindeglied entweder direkt oder indirekt über eine spezifische Bindesubstanz oder Linker befestigt werden. Beispiele für Rezeptoren schließen ein, aber sind nicht limitiert auf: Antikörper, Zellmembranrezeptoren, Oberflächenrezeptoren, internalisierende Rezeptoren, monoklonale Antikörper und Antiseren, reaktiv mit spezifischen antigenen Determinanten [wie zum Beispiel auf Viren, Zellen oder andere Materialien], Wirkstoffen, Polynukleotiden, Nukleinsäuren, Peptiden, Cofaktoren, Lecitinen, Zuckern, Polysacchariden, Zellen, zellulären Membranen und Organellen.
Beispiele für Rezeptoren und Anwendungen, die solche Rezeptoren verwenden, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf:

a) Enzyme: spezifische Transportproteine oder Enzyme, die essentiell für das Überleben von Mikroorganismen sind und welche als Zielstrukturen für antibiotische [Ligand] Selektion dienen können;
b) Antikörper: Die Identifizierung einer Ligandenbindestelle auf einem Antikörpermolekül, das mit dem Epitop eines Antigens von Interesse kombiniert, kann untersucht werden; die Bestimmung einer Sequenz, die ein antigenisches Epitop imitiert, kann zur Entwicklung von Vaccinen, von welchen das Immunogen auf einem oder mehreren von solchen Sequenzen basiert, führen oder kann zur Entwicklung von in Beziehung stehenden diagnostischen Agentien oder Verbindungen, welche in der therapeutischen Behandlung zum Beispiel von Autoimmunerkrankungen verwendbar sind, führen;
c) Nukleinsäuren: Identifizierung von Liganden-, wie zum Beispiel Protein oder RNA, bindenden Stellen;
d) Katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Polypeptide, die fähig sind, unter Einbindung der Umwandlung von einem oder mehreren Reaktanten zu einem oder mehreren Produkten eine chemische Reaktion zu fördern; solche Polypeptide schließen im Allgemeinen eine Bindestelle, die spezifisch für wenigstens einen Reaktanten oder eine Reaktionszwischenstufe ist und eine aktive Funktionalität in räumlicher Nähe zu der Bindestelle, in welcher die Funktionalität fähig ist zur chemischen Modifizierung des gebundenen Reaktanten [siehe z.B. US-Patent-Nr. 5,215,899], ein;
e) Hormonrezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, die mit hoher Affinität an einen Rezeptor binden, ist in der Enwicklung von Hormonersatztherapien wertvoll; zum Beispiel kann die Identifizierung von Liganden, die an solche Rezeptoren binden, zur Entwicklung von Wirkstoffen zur Blutdruckkontrolle führen; und
f) Opiatrezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, die an Opiatrezeptoren im Gehirn binden, ist nützlich in der Entwicklung von weniger abhängig machenden Ersatzstoffen für Morphin und ähnlichen Wirkstoffen.

Wie hierin verwendet schließt Antikörper Antikörperfragmente ein, wie zum Beispiel Fab Fragmente, welche aus einer leichten Kette und der variablen Region einer schweren Kette zusammengesetzt sind.
Wie hierin verwendet bezieht sich komplementär auf die topologische Kompatibilität oder das Zusammenpassen interagierender Oberflächen eines Ligandenmoleküls und seines Rezeptors. Folglich können der Rezeptor und sein Ligand als komplementär beschrieben werden, darüber hinaus sind die Charakteristika der Kontaktflächen komplementär zueinander.
Wie hierin verwendet bildeten sich ein Ligand-Rezeptor Paar oder Komplex aus, wenn zwei Makromoleküle sich durch molekulare Erkennung verknüpft haben, um einen Komplex zu bilden.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein Epitop auf einen Teil eines Antigenmoleküls, welches beschrieben ist durch den Bereich der Wechselwirkung mit der Unterklasse von Rezeptoren, welche als Antikörper bekannt ist.
Wie hierin verwendet, ist ein Ligand ein Molekül, das spezifisch durch einen bestimmten Rezeptor erkannt wird. Beispiele für Liganden schließen ein, aber sind nicht limitiert auf Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren, Toxine und Gifte, virale Epitope, Hormone [z.B. Steroide], Hormonrezeptoren, Opiate, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, Cofaktoren, Wirkstoffe, Lecitine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Proteine und monoklonale Antikörper.
Wie hierin verwendet, ein Antiligand (AL.sub.i): Ein Antiligand ist ein Molekül, das eine bekannte oder unbekannte Affinität für einen gegebenen Liganden besitzt und das auf einem vorbestimmten Abschnitte einer Oberfläche immobilisiert werden kann. Antiliganden können natürlich vorkommende oder künstlich geschaffene Moleküle sein. Sie können auch in ihrem unveränderten Zustand oder als Aggregate mit anderen Spezies zum Einsatz kommen. Antiliganden können reversibel, kovalent oder nichtkovalent an ein Bindeglied befestigt sein, entweder direkt oder über eine spezifische Bindesubstanz. Durch "reversibel befestigt" wird zum Ausdruck gebracht, dass die Bindung des Antiliganden (oder des spezifischen Bindeglieds oder des Liganden) reversibel ist und deshalb eine im Wesentlichen Rück- oder Loslösegeschwindigkeit ungleich Null besitzt. Solche reversiblen Befestigungen können auf nichtkovalente Wechselwirkungen zurückzuführen sein, wie zum Beispiel elektrostatische Kräfte, van der Waals Kräfte, hydrophobische (d.h. entropische) Kräfte und dergleichen. Des Weiteren können reversible Befestigungen auch auf bestimmte, aber nicht alle kovalenten Bindereaktionen zurückzuführen sein. Beispiele schließen ein, aber sind nicht limitiert auf die Befestigung durch die Bildung von Hemiacetalen, Hemiketalen, Iminen, Acetalen, Ketalen und dergleichen (siehe Morrison et al., "Organic Chemistry", 2. Ausgabe, ch. 19 (1966)). Beispiele für Antiliganden, welche in den Verfahren und Vorrichtungen hierin Anwendung finden, schließen ein, sind aber nicht (imitiert auf Zellmembran-Rezeptoren, monoklonale Antikörper und Antiseren reaktiv mit spezifischen antigenischen Determinanten (wie zum Beispiel auf Viren, Zellen oder anderen Materialien), Hormonen, Wirkstoffen, Oligonukleotiden, Peptiden, Peptidnukleinsäuren, Enzymen, Substraten, Cofaktoren, Lecitinen, Zuckern, Oligosacchariden, Zellen, zellulären Membranen und Organellen.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein Substrat auf jegliche Matrix, die entweder direkt oder einer geeigneten Derivatisierung folgend als ein fester Träger für chemische Synthesen, Untersuchungen oder andere solche Prozesse verwendet wird. Bevorzugte Substrate hierin sind Silizium-Substrate oder Silizium behandelte Substrate, die auf der Oberfläche derivatisiert sind, die für die Verknüpfung von Antiliganden und Liganden and anderen Makromolekülen, einschließlich der fluoreszierenden Proteine, Phycobiliproteine und anderen Emissions-Verschiebern, vorhergesehen ist.
Wie hierin verwendet bezieht sich eine Matrix auf jeglichen festen oder semifesten oder unlöslichen Träger, auf welchem das Molekül von Interesse, typischerweise ein biologisches Molekül, Makromolekül, organisches Molekül oder biospezifischer Ligand verknüpft ist oder in Kontakt steht. Typischerweise ist eine Matrix ein Substratmaterial, das eine starre oder semistarre Oberfläche besitzt. In vielen Ausführungsformen wird wenigstens eine Oberfläche des Substrats im Wesentlichen flach sein, auch wenn in einigen Ausführungsformen es wünschenswert sein kann, Syntheseregionen für verschiedene Polymere physikalisch zu trennen mit, zum Beispiel Vertiefungen, angehobenen Regionen, geätzten Rinnen oder jeder anderen Topologie. Matrixmaterialien schließen jegliche Materialien, die als Affinitätsmatrizen oder Träger für chemische und biologische Molekülsynthesen und Analysen verwendet werden, ein, wie zum Beispiel aber nicht limitiert auf: Polysteren, Polycarbonat, Polypropylen, Nylon, Glas, Dextran, Chitin, Sand, Bimsstein, Polytetrafluoroethylen, Agarose, Polysaccharide, Dendrimere, Buckyballs, Polyacrylamid, Kieselguhr-Polyacrylamid nicht kovalent zusammengesetzt, Polystyren-Polyacrylamid kovalent zusammengesetzt, Polystyren-PEG[Polyethylenglycol]gemisch, Silicium, Gummi und andere Materialien, die als Träger für Festphasensynthesen, Affinitätstrennungen und -reinigungen, Hybridisierungsreaktionen, Immunountersuchungen und in anderen solchen Anwendungen verwendet werden.
Wie hierin verwendet bezieht sich die Befestigungsschicht auf die Oberfläche der Chip-Vorrichtung, an welche Moleküle geknüpft werden. Typischerweise ist der Chip eine Halbleitervorrichtung, welche wenigstens zu einem Teil der Oberfläche überzogen ist, um ihn zur Verknüpfung von Molekülen geeignet zu machen und inert gegenüber jeglichen Reaktionen, welchen die Vorrichtung ausgesetzt ist, wird. Moleküle werden entweder direkt oder indirekt an die Oberfläche geknüpft, Verknüpfung kann durch Absorption oder Adsorption, durch kovalente Bindungen, ionische Wechselwirkungen oder jegliche andere Wechselwirkungen bewirkt werden. Wo es notwendig ist, wird die Befestigungsschicht angepasst, wie zum Beispiel durch Derivatisierung zum Verknüpfen der Moleküle.
B. Biolumineszenz erzeugende Systeme
Ein Biolumineszenz erzeugendes System bezieht sich auf die Komponenten, die notwendig und hinreichend sind, um Biolumineszenz zu erzeugen. Diese schließen eine Luciferase, Luciferin und jegliche notwendigen Cofaktoren oder Bedingungen ein. Fast jedes Biolumineszenz erzeugende System, welches dem Fachmann bekannt ist, wird für die Verwendung in dem Gerät, Systemen, Kombinationen und Verfahren, welche hierin bereitgestellt werden, zugänglich sein. Faktoren für die Überlegung zur der Auswahl eines Biolumineszenz erzeugenden Systems schließen ein, sind aber nicht limitiert auf: die gewünschte Untersuchung und das biologische Fluid verwendet in Kombination mit der Biolumineszenz; das Medium, in welchem die Reaktion ausgeführt wird; Stabilität der Komponenten, wie zum Beispiel Temperatur oder pH-Wert Sensitivität; Haltbarkeit der Komponenten; Nachhaltigkeit der Lichtemission, ob konstant oder periodisch; Verfügbarkeit der Komponenten; gewünschte Lichtintensität und jegliche andere solcher Faktoren.
1. Allgemeine Beschreibung
Im Allgemeinen bezieht sich Biolumineszenz auf eine Energie ergebende chemische Reaktion, in welcher ein spezifisches chemisches Substrat, ein Luciferin, eine Oxidation, katalysiert durch ein Enzym, eine Luciferase, eingeht. Biolumineszente Reaktionen werden leicht am Laufen gehalten, weil sie nur das Nachfüllen des verbrauchten Luciferins oder eines anderen Substrats oder Cofaktors oder anderen Proteins erfordern, um die Reaktion fortzuführen oder wiederzubeleben. Biolumineszenz erzeugende Reaktionen sind dem Fachmann gut bekannt und jede solcher Reaktion kann zur Verwendung in Kombination mit dem Gerät, Systemen und Verfahren, die hierin beschrieben werden, angepasst werden.
Es gibt zahlreiche Organismen und Quellen von Biolumineszenz erzeugenden Systemen und einige repräsentative Gattungen und Spezies, die Biolumineszenz aufzeigen, sind in der folgenden Tabelle dargelegt [zum Teil nachgebildet von Hastings in (1995) Cell Physiology: Source Book, N. Sperelakis (Hrsg.), Academic Press, Seiten 665–681]:
TABELLE 1 Repräsentative leuchtende Organismus
Andere biolumineszente Organismen, die hierin zur Verwendung als Quelle für Biolumineszenz erzeugende Systeme benannt werden, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Gonadostomias, Gaussia, Halisturia, Vampir-Kalmar, Glyphus, Mycotophiden (Fisch), Vinciguerria, Howella, Florenciella, Chaudiodus, Melanocostus, Paracanthus, Atolla, Pelagia, Pitilocarpus, Acanthophyra, Siphonophore, Periphylla und Seefedern (Stylata).
Es ist selbstverständlich, dass ein Biolumineszenz erzeugendes System aus natürlichen Quellen isoliert werden kann, wie zum Beispiel in der obigen Tabelle, oder auch synthetisch hergestellt werden kann. Zusätzlich brauchen die Komponenten für die Verwendungen hierin nur ausreichend rein zu sein, so dass eine Mischung davon unter geeigneten Reaktionsbedingungen ein Leuchten hervorruft. Daher wurde herausgefunden, dass in einigen Ausführungen ein Rohextrakt oder das bloße Vermahlen des Organismus ausreichend sein kann. Jedoch werde im Allgemeinen im Wesentlichen reine Komponenten verwendet, aber wo es nötig ist, kann die genaue Reinheit empirisch bestimmt werden. Komponenten können auch synthetische Komponenten sein, die nicht aus natürlichen Quellen isoliert werden. DNA, welche Luciferasen kodiert, ist erhältlich [siehe z.B. SEQ ID Nr. 1–13] und wurde modifiziert [siehe z.B. SEQ ID Nr. 3 und 10–13] und synthetische und alternative Substrate sind erdacht worden. Die hierin aufgelistete DNA ist nur repräsentativ für die DNA, welche Luciferasen kodiert, die erhältlich ist.
Jedes Biolumineszenz erzeugende System, ob synthetisch oder isoliert aus natürlichen Quellen, wie zum Beispiel die in Tabelle 1 dargelegten, an anderer Stelle hierin oder dem Fachmann bekannt, ist für die Verwendung in den Chipvorrichtungen, Kombinationen, Systemen und Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, gedacht. Chemilumineszenzsysteme per se, welche nicht auf Oxigenasen [Luciferasen] angewiesen sind, sind hierin nicht umfasst.
a. Luciferasen
Luciferasen beziehen sich auf jegliche Komponente, die in Anwesenheit üblicher notwendiger Aktivatoren, die Oxidation eines Biolumineszenzsubstrats [Luciferin] in der Anwesenheit von molekularem Sauerstoff, ob frei oder gebunden, von einem niedrigerem Energiezustand zu einem höheren Energiezustand katalysiert, so dass das Substrat infolge seiner Rückkehr zu dem niedrigeren Energiezustand Licht emittiert. Für die Zwecke hierin wird Luciferase allgemein verwendet, um Enzyme abzugrenzen, die katalytisch wirken, um Licht durch Oxidation eines Substrats zu erzeugen und auch Photoproteine, wie zum Beispiel Aequorin, die wirken, obgleich nicht strikt katalytisch [da solche Proteine in der Reaktion verbraucht werden], in Verbindung mit einem Substrat in der Anwesenheit von Sauerstoff, um Licht zu erzeugen. Diese Luciferasen, einschließlich Photoproteine, wie zum Beispiel Aequorin, sind hierin auch unter den Luciferasen mit einbezogen. Diese Reagenzien schließen die natürlich vorkommenden Luciferasen [einschließlich Photoproteine], Proteine, die durch rekombinante DNA hergestellt wurden, und mutierte oder modifizierte Varianten davon, die die Fähigkeit Licht zu erzeugen in der Anwesenheit eines geeigneten Substrats, Cofaktoren oder Aktivatoren oder jeden anderen solchen Proteins, welches als Katalysator wirkt, um ein Substrat zu oxidieren, wobei Licht erzeugt wird, beibehalten haben, ein.
Im Allgemeinen wird das Protein, das die biolumineszente Reaktion katalysiert oder initiiert, als eine Luciferase bezeichnet und das oxidierbare Substrat wird als ein Luciferin bezeichnet. Das oxidierte Reaktionsprodukt wird als Oxyluciferin bezeichnet und bestimmte Luciferinvorläufer werden als Etioluciferin bezeichnet. Somit schließt Biolumineszenz für die Zwecke hierin Licht ein, welches erzeugt wird durch die Reaktionen, die katalysiert werden durch [im Falle der Luciferasen, die enzymatisch wirken] oder initiiert werden von [im Falle der Photoproteine, wie zum Beispiel Aequorin, die in der Reaktion nicht regeneriert werden] einem biologischen Protein oder Analogon, Derivat oder Mutante davon.
Zur Übersichtlichkeit hierin, werden diese katalytischen Proteine als Luciferasen bezeichnet und schließen Enzyme, wie zum Beispiel die Luciferasen, die die Oxidation von Luciferin katalysieren, wobei Licht emittiert wird und Oxyluciferin freigesetzt wird, ein. Unter den Luciferasen sind auch Photoproteine eingeschlossen, welche die Oxidation von Luciferin, um Licht zu emittieren, katalysieren, aber die in der Reaktion verändert werden und rekonstituiert werden müssen, um erneut verwendet werden zu können. Die Luciferasen können natürlich vorkommen oder können modifiziert sein, wie zum Beispiel durch genetische Techniken, um bestimmte Eigenschaften zu verbessern oder zu ändern. So lang das sich ergebende Molekül die Fähigkeit, eine biolumineszente Reaktion zu katalysieren, beibehält, wird es hierin umfasst.

Jedes Protein, das Luciferaseaktivität besitzt [ein Protein, das die Oxidation eines Substrats in der Anwesenheit von molekularem Sauerstoff katalysiert, um Licht zu erzeugen, wie hierin bestimmt] kann hierin verwendet werden. Die bevorzugten Luciferasen sind solche, die hierin beschrieben werden oder die geringe Sequenzvariationen aufweisen. Solche geringen Sequenzvariationen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf geringe allelische oder Speziesvariationen und Insertionen oder Deletionen von Resten, insbesondere Cysteinreste. Geeignete konservative Substitutionen von Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt und können im Allgemeinen ohne Veränderung der biologischen Aktivität des sich ergebenden Moleküls ausgeführt werden. Der Fachmann erkennt an, dass im Allgemeinen einzelne Aminosäuresubstitutionen in nicht essentiellen Regionen eines Polypeptids die biologische Aktivität im Wesentlichen nicht ändern (siehe z.B. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4. Edition, 1987, the Benjamin/Cummings Pub. co., S. 224). Solche Substitutionen werden vorzugsweise in Übereinstimmung mit denen, die in Tabelle 2 dargelegt sind, wie folgt durchgeführt: TABELLE 2

Ursprünglicher Rest	konservative Substitution
Ala (A)	Gly; Ser
Arg (R)	Lys
Asn (N)	Gln; His
Cys (C)	Ser; neutrale Aminosäure
Gln (Q)	Asn
Glu (E)	Asp
Gly (G)	Ala; Pro
His (H)	Asn; Gln
Ile (I)	Leu; Val
Leu (L)	Ile; Val
Lys (K)	Arg; Gln; Glu
Met (M)	Leu; Tyr; Ile
Phe (F)	Met; Leu; Tyr
Ser (S)	Thr
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe
Val (V)	Ile; Leu

Andere Substitutionen sind auch zulässig und können empirisch oder in Übereinstimmung mit bekannten konservativen Substitutionen gemacht werden. Jede solche Modifikation des Polypeptids kann durch jedes Mittel, das der Fachmann kennt, bewirkt werden.
Die Luciferasen können kommerziell bezogen werden, aus natürlichen Quellen isoliert werden, in Wirtszellen unter Verwendung Luciferase kodierender DNA exprimiert werden oder auf jegliche andere Art und Weise, die der Fachmann kennt, erhalten werden. Für die Zwecke hierin können Rohextrakte, die durch Zermahlen ausgewählter Bezugsquellenorganismen erhalten wurden, ausreichen. Da große Mengen der Luciferase gewünscht sein können, ist die Isolierung der Luciferase aus Wirtszellen bevorzugt. DNA für solche Zwecke ist weitgehend ebenso wie die modifizierten Formen davon erhältlich.
Beispiele für Luciferasen schließen ein, sind aber nicht limitiert auf solche, die isoliert wurden aus den Ctenophoren Mnemiopsis (Mnemiopsin) und Beroe ovata (Berovin), jenen die isoliert werden aus den Coelenteraten Aequorae (Aequorin), Obelia (Obelin), Pelagia, die Renilla-Luciferase, die Luciferasen isoliert aus den Mollusken Pholas (Pholasin), den Luciferasen, isoliert aus den Aristostomien und Porichthys-Fisch und von den Ostracoden, wie zum Beispiel Cypridina (hierin auch bezeichnet als Vargula). Bevorzugte Luciferasen für die Verwendung hierin sind das Aequorin-Protein, Renilla-Luciferase und Cypridina [auch als Vargula bezeichnet] Luciferase [siehe z.B. SED ID Nr. 1, 2 und 4–13]. Bevorzugt sind auch die Luciferasen, welche reagieren, um rotes und/oder infrarot nahes Licht zu erzeugen. Diese schließen Luciferasen ein, die in den Arten der Aristostomias, wie zum Beispiel A. scintillans, Pachystomias, Malacosteus, wie zum Beispiel M. niger, gefunden werden.
b. Luciferine
Die Substrate für die Reaktion schließen jede(s) Molekül(e), mit dem/den Luciferase reagiert, um Licht zu erzeugen, ein. Solche Moleküle schließen die natürlich vorkommenden Substrate, modifizierte Formen davon und synthetische Substrate [siehe z.B. US-Patente Nr. 5,374,534 und 5,098,828] ein. Exemplarische Luciferine schließen die hierin beschriebenen ein, genau wie Derivate hiervon, Analoga hiervon, synthetische Substrate, wie zum Beispiel Dioxetane [siehe z.B. US-Patente Nr. 5,004,565 und 5,455,357], und andere Verbindungen, die durch eine Luciferase in einer Licht erzeugenden Reaktion oxidiert werden [siehe z.B. US-Patente Nr. 5,374,534; 5,098,828 und 4,950,588]. Solche Substrate können auch empirisch durch Auswahl von Verbindungen, die in biolumineszenten Reaktionen oxidiert werden, identifiziert werden.
c. Aktivatoren
Die Biolumineszenz erzeugenden Systeme bedürfen auch zusätzlichen Komponenten, die hierin diskutiert werden und dem Fachmann bekannt sind. Alle biolumineszenten Reaktionen benötigen molekularen Sauerstoff in der Form von gelöstem oder gebundenem Sauerstoff. Daher ist molekularer Sauerstoff, gelöst in Wasser oder in Luft oder gebunden an ein Photoprotein, der Aktivator für Biolumineszenzreaktionen. Abhängig von der Form der Komponenten schließen andere Aktivatoren ein, sind aber nicht beschränkt auf ATP [für Glühwürmchenluciferase], Flavinreduktase [bakterielle Systeme] zur Regenerierung von FMNH₂ aus FMN und Ca²⁺ oder ein anderes geeignetes Metallion [Aequorin].
Die meisten der hierin bereitgestellten Systeme werden Licht erzeugen, wenn die Luciferase und Luciferin gemischt und gegenüber Luft oder Wasser exponiert werden. Die Systeme, die Photoproteine benutzen, die Sauerstoff gebunden haben, wie zum Beispiel Aequorin, werden aber eine Exponierung gegenüber Ca²⁺ [oder einem anderen geeignetem Metallionen], welches in der Form einer wässrigen Zusammensetzung eines Calciumsalzes bereitgestellt werden kann, erfordern. Unter diesen Umständen wird die Zugabe von Ca²⁺ [oder einem anderen geeignetem Metallion] zu einer Mischung von Luciferase [Aequorin] und Luciferin [wie zum Beispiel Coelenterazin] zu der Erzeugung von Licht führen. Das Renilla-System und andere Anthazoen-Systeme benötigen auch Ca²⁺ [oder ein anderes geeignetes Metallion].
Wenn Rohpräparationen verwenden werden, wie zum Beispiel zermahlene Cypridina [Krabbe] oder zermahlene Glühwürmchen, kann es erforderlich sein, nur Wasser hinzuzfügen. In den Fällen, in denen Glühwürmchen (oder eine Glühwürmchen- oder Käferluciferase] verwendet werden, kann die Reaktion nur die Zugabe von ATP benötigen. Die genauen Komponenten im Licht der Offenbarung hierin werden dem Fachmann offensichtlich sein oder können empirisch leicht bestimmt werden.
Es ist auch selbstverständlich, dass diese Mischungen auch alle zusätzlichen Salze oder Puffer oder Ionen, die für jede Reaktion zum Ablauf notwendig sind, enthalten. Da diese Reaktionen gut charakterisiert sind, wird der Fachmann fähig sein, die genauen Verhältnisse und erforderlichen Komponenten zu bestimmen. Die Auswahl der Komponenten wird abhängig sein von der Chipvorrichtung und dem System, der auszuführenden Untersuchung und der Luciferase. Verschiedene Ausführungsformen sind hierin beschrieben und beispielhaft gezeigt; im Hinblick auf eine solche Beschreibung werden andere Ausführungsformen offensichtlich werden.
d. Reaktionen
In allen Ausführungsformen sind alle bis auf eine Komponente eines Biolumineszenz erzeugenden Systems direkt oder indirekt an die geeigneten Stellen auf dem Chip oder anderweitig immobilisiert an solchen Positionen auf dem Array, an welchen die Anwesenheit eines Analyten, vorzugsweise eines infektiösen Mittels, detektiert wird. Wenn Biolumineszenz erwünscht ist, werden die verbleibende(n) Komponente(n) zu der Oberfläche des Chips zugegeben und das Licht, welches an diesen Stellen des Arrays erzeugt wird, wird durch die Photodioden auf dem Chip detektiert.
Im Allgemeinen brauchen die genauen Verhältnisse und Mengen der Komponenten der Biolumineszenzreaktion nicht streng bestimmt oder erfüllt werden, da das Ergebnis, welches erreicht werden soll, die Herstellung von Licht ist, welches durch die Photodioden auf dem Chip oder sichtbar für das bloße Auge für die Zwecke hierin detektiert werden kann. Sie müssen ausreichend sein, um Licht zu erzeugen. Im Allgemeinen wird eine Menge an Luciferin und Luciferase verwendet, die ausreichend ist, um ein leicht detektierbares Signal oder sichtbares Glühen zu erzeugen; diese Menge kann leicht empirisch bestimmt werden und hängt vom ausgewählten System und der ausgewählten Anwendung ab.
Für die Zwecke hierin ist eine solche Menge von wenigstens den Konzentrationen und Verhältnissen, die von einem Fachmann für analytische Zwecke verwendet werden, vorzuziehen. Höhere Konzentrationen oder längere Integrationszeiten können verwendet werden, wenn das Leuchten nicht ausreichend hell ist, um durch die Photodioden auf dem Chip detektiert zu werden. Da die Bedingungen, in denen die Reaktionen verwendet werden auch keine Laborbedingungen sind und die Komponenten auch gelagert werden, können höhere Konzentrationen verwendet werden, um jedem Verlust von Aktivität entgegenzuwirken. Typischerweise sind die Mengen 1 mg, vorzugsweise 10 mg und stärker bevorzugt 100 mg einer Luciferase pro Liter Reaktionsmischung oder 1 mg, bevorzugt 10 mg, stärker bevorzugt 100 mg. Solche Luciferasen können durch Trocknen einer Zusammensetzung, welche mindestens etwa 0,01 mg/l, und typischerweise 0,1 mg/l, 1 mg/l, 10 mg/l oder mehr von jeder Komponente enthält, hergestellt werden. Die Menge an Luciferin liegt auch zwischen etwa 0,01 und 100 mg/l, vorzugsweise zwischen 0,1 und 10 mg/l, bei vielen der Reaktionen kann zusätzliches Luciferin zugegeben werden, um die Reaktion am Laufen zu halten. In Ausführungsformen, in welchen die Luciferase katalytisch wirkt und nicht regeneriert zu werden braucht, können niedrigere Mengen an Luciferase verwendet werden. In solchen Reaktionen, in welchen sie während der Reaktion verändert wird, kann sie auch regeneriert werden; typischerweise werden höhere Konzentrationen gewählt werden. Konzentrationsbereiche pro Liter [oder die Menge einer Beschichtung auf dem Substrat, die sich aus dem Kontakt mit einer solchen Zusammensetzung ergibt] von jeder Komponente liegen im Größenbereich von 0,1 bis 20 mg, vorzugsweise 0,1 bis 10 mg, stärker bevorzugt zwischen etwa 1 und 10 mg an jeder Komponente werden ausreichend sein. Wenn beschichtete Substrate, wie hierin beschrieben, hergestellt werden, können größere Mengen an bedeckenden Zusammensetzungen, die höhere Konzentrationen an Luciferase oder Luciferin enthalten, verwendet werden.
Daher werden zum Beispiel in der Anwesenheit von Calcium 5 mg Luciferin, wie zum Beispiel Coelenterazin, in einem Liter Wasser für mindestens 10 bis 20 Minuten hell leuchten, abhängig von der Temperatur des Wassers, wenn etwa 10 mg der Luciferase, wie zum Beispiel die Aequorin-Photoprotein Luciferase oder Luciferase aus Renilla, hierzu zugegeben wird. Die Erhöhung der Konzentration der Luciferase, zum Beispiel auf 100 mg/l, führt zu einer besonders hellen Lichterscheinung.
Wenn es gewünscht wird, kann das Einsetzen der biolumineszenten Reaktion durch Zugabe eines Inhibitors, zum Beispiel Magnesium, der Biolumineszenz erzeugenden Reaktion, verschoben werden. Auch wo eine Inhibierung nicht gewünscht ist, kann die Konzentration am freien Magnesium durch die Zugabe einer ausreichenden Menge eines chelatisierenden Mittels, wie zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA], reduziert werden. Die Menge an EDTA und auch an Calcium kann empirisch bestimmt werden, um Magnesium ausreichend zu chelatisieren, ohne die gewünschte Biolumineszenz zu inhibieren oder zu verhindern.
Es ist selbstverständlich, dass die zu verwendenden Konzentrationen und Mengen von der ausgewählten Luciferase, der gewünschten bakteriellen Zielstruktur, der Konzentration und Menge an Licht, welche durch den immobilisierten Antiliganden absorbiert wird, von der Größe des Photodiodenarrays abhängen und diese können einfach empirisch bestimmt werden. Die Verhältnisse, insbesondere solche, die verwendet werden, wenn eine empirische Bestimmung nicht ausgeführt wurde, sind im Allgemeinen diejenigen, welche für analytische Zwecke verwendet werden und die Mengen oder Konzentrationen sind wenigstens diese, die für analytische Zwecke verwendet werden, aber die Mengen können erhöht werden, insbesondere wenn ein länger anhaltendes oder helleres Leuchten gewünscht wird.
2. Ctenophore und coelenterate Systeme
Ctenophoren, wie zum Beispiel Mnemiopsis (Mnemiopsin) und Beroe ovata (Berovin) und Coelenteraten, wie Beispiel Aequorea (Aequorin), Obelia (Obelin) und Pelagia, erzeugen biolumineszentes Licht unter Verwendung ähnlicher Chemie [siehe z.B. Stephenson et al. (1981) Biochimica et Biophysica Acta 678: 65–75; Hart et al. (1979) Biochemistry 18: 2204–2210; Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 94/18342, welche auf der US-Anmeldung Serien Nr. 08/017,116 beruht, US-Patent Nr. 5,486,455 und anderen hierin zitierten Referenzen und Patenten]. Die Aequorin- und Renilla-Systeme sind repräsentativ und werden hierin als exemplarisch und als unter den anwesend bevorzugten Systemen beschrieben. Die Aequorin- und Renilla-Systeme können dasselbe Luciferin verwenden und erzeugen Licht unter Verwendung derselben Chemie, aber jede Luciferase ist unterschiedlich. Die Aequorin-Luciferase Aequorin, genau wie zum Beispiel die Luciferasen Mnemiopsin und Berovin, ist ein Photoprotein das gebundenen Sauerstoff und gebundenes Luciferin umfasst, Ca²⁺ [oder ein anderes geeignetes Metallion] erfordert, um die Reaktion zu starten, und das für eine wiederholte Verwendung regeneriert werden muss; wohingegen die Renilla-Luciferase als ein echtes Enzym wirkt, da es während der Reaktion unverändert bleibt und es gelösten molekularen Sauerstoff benötigt.
a. Das Aequorin-System
Das Aequorin-System ist gut bekannt [siehe z.B. Tsuji et al. (1986) „Site-specific mutagenesis of the calcium-binding photoprotein aequorin", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8107–8111; Prasher et al. (1985) „Cloning and Expression of the cDNA Coding for Aequorin, a Bioluminscent Calcium-Binding Protein", Biochemical and Biophysical Research Communications 126: 1259–1268; Prasher et al. (1986) Methods in Enzymology 133: 288–297; Prasher et al. (1987) „Sequence Comparisons of cDNAs Encoding for Aequorin Isotypes", Biochemistry 26: 1326–1332; Charbonneau et al. (1985) „Amino Acid Sequence of the Calcium-Dependent Photoprotein Aequorin", Biochemistry 24: 6762–6771; Shimomura et al. (1981) „Resistivity to denaturation of the apoprotein of aequorin and reconstitution of the luminescent photoprotein from the partially denatured apoprotein", Biochem. J. 199: 825–828; Inouye et al. (1989) J. Biochem. 105: 473–477; Inouye et al. (1986) „Expression of Apoaequorin Complementary DNA in Escherichia coli", Biochemistry 25: 8425–8429; Inouye et al. (1985) „Cloning and sequence analysis of cDNA für the luminescent protein aequorin", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3154–3158; Prendergast et al. (1978) „Chemical and Physical Properties of Aequorin and the Green Fluorescent Protein Isolated from Aequorea forskalea" J. Am. Chem. Soc. 17: 3448–3453; Europäische Patentanmeldung 0 540 064 A1, Europäische Patentanmeldung 0 226 979 A2, Europäische Patentanmeldung 0 245 093 A1 und Europäisches Patent 0 245 093 B1; US-Patent Nr. 5,093,240; US-Patent Nr. 5,360,728; US-Patent Nr. 5,139,937; US-Patent Nr. 5,422,266; US-Patent Nr. 5,023,181; US-Patent Nr. 5,162,227; und SEQ ID Nrn. 5–13, welche DNA darlegen, die das Apoprotein codiert; und eine Form beschrieben in US-Patent Nr. 5,162,227, Europäische Patentanmeldung 0 540 064 A1 und Sealite Sciences Technical Report Nr. 3 (1994), kommerziell erhältlich von Sealite, Sciences, Bogart, GA als AQUALITE^®].
Dieses System ist unter den bevorzugten Systemen zur Verwendung hierin. Wie es offensichtlich sein wird, ist es in dieser Form, da das Aequorin-Photoprotein nicht kovalent gebundenes Luciferin und molekularen Sauerstoff einschließt, zur Lagerung als lyophylisiertes Puder oder verkapselt in einem ausgewählten Abgabevehikel geeignet. Das System kann in Pellets, wie zum Beispiel Liposomen oder anderen Abgabevehikeln, verkapselt sein oder in Einzelkammern, Dual- oder Mehrfachkammerampullen gelagert sein. Wenn es verwendet wird, werden die Photoproteine an einen Antiliganden konjugiert werden, gebunden an spezifizierte Positionen in dem Array und in Berührung gebracht mit einer Zusammensetzung, sogar Leitungswasser, das Ca²⁺ [oder ein anderes geeignetes Metallion] enthält, um eine Mischung zu ergeben, die an dieser bestimmten Stelle auf dem Array leuchtet. Das Licht wird detektiert durch Photodioden in dem Chip und die Datensignale werden analysiert durch den angegliederten Computerprozessor. Dieses System ist für Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen hierin bevorzugt.
(1) Aequorin und verwandte Photoproteine
Das Photoprotein Aequorin, isoliert aus der Qualle, Aequorea, emittiert Licht auf die Zugabe von Ca²⁺ [oder einem anderen geeigneten Metallion] hin. Das Aequorin-Photoprotein, welches gebundenes Luciferin und gebundenen Sauerstoff, der durch Ca²⁺ freigegeben wird, erfordert nicht gelösten Sauerstoff. Lumineszenz wird durch Calcium ausgelöst, welches Sauerstoff freisetzt und das Luciferinsubstrat, welches Apoaqueorin erzeugt.
Das Biolumineszenz-Photoprotein Aequorin wird aus einer Anzahl von Arten der Qualle Aequorea isoliert. Es ist ein 22 Kilodalton (kD) Molekulargewichtspeptidkomplex [siehe z.B. Shimomura et al. (1962) J. Cellular and Comp. Physiol. 59: 233–238; Shimomura et al. (1969) Biochemistry 8: 3991–3997; Kohama et al. (1971) Biochemistry 10: 4149–4152 und Shimomura et al. (1972) Biochemistry 11: 1602–1608]. Das native Protein enthält Sauerstoff und eine heterocyclische Verbindung Coelenterazin, ein Luciferin [siehe unten] nicht kovalent daran gebunden. Das Protein enthält drei Calciumbindestellen. Auf die Zugabe von Spuren an Mengen Ca²⁺ [oder einem anderen geeigneten Metallion, wie zum Beispiel Strontium] zu dem Photoprotein, geht es eine konformationale Änderung ein, die die Oxidation des gebundenen Coelenterazins unter Verwendung des Protein-gebundenen Sauerstoffs katalysiert. Energie aus dieser Oxidation wird als Blitz blauen Lichts, zentriert bei 469 nm, freigesetzt. Konzentrationen an Calciumionen so niedrig wie 10^–6 M sind ausreichend, um die Oxidationsreaktion auszulösen.
Natürlich vorkommendes Apoaqueorin ist nicht eine einzelne Verbindung, sondern eher eine Mischung mikroheterogener molekularer Arten. Aequoria Quallenextrakte enthalten nicht weniger als zwölf verschiedene Varianten dieses Proteins (siehe z.B. Prasher et al. (1987) Biochemistry 26: 1326–1332; Blinks et al. (1975) Fed. Proc. 34: 474). DNA, welche für eine Vielzahl von Formen kodiert, ist isoliert worden (siehe z.B. SEQ ID Nrn. 5–9 und 13).
Das Photoprotein kann rekonstituiert werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,023,181) durch Kombination des Apoproteins, wie zum Beispiel ein Protein, welches in E. coli rekombinant hergestellt wurde, mit einem Coelenterazin, wie zum Beispiel ein synthetisches Coelenterazin, in der Anwesenheit von Sauerstoff und einem reduzierenden Mittel [siehe z.B. Shimomura et al. (1975) Nature 256: 236–238; Shimomura et al. (1981) Biochemistry J. 199: 825–828], wie zum Beispiel 2-Mercaptoethanol und auch EDTA und EGTA [Konzentrationen zwischen etwa 5 bis etwa 100 mM oder höher für die Anwendungen hierin] binden jegliches Ca²⁺, um ein Starten der Oxidationsreaktion zu verhindern, bevor es gewünscht ist. DNA, welche für eine modifizierte Form des Apoproteins, welches nicht 2-Mercaptoehtanol zur Rekonstitution benötigt, codiert ist auch erhältlich [siehe z.B. US-Patent Nr. 5,093,240]. Das rekonstituierte Photoprotein ist auch kommerziell erhältlich [verkauft z.B. unter dem Warenzeichen AQUALITE^®, welches in dem US-Patent 5,162,227 beschrieben ist].
Die Lichtreaktion wird ausgelöst durch den Zusatz von Ca²⁺ bei einer Konzentration, die ausreicht, die Effekte des Chelators zu überwinden und die 10^–6 M Konzentration zu erreichen. Da solche niedrigen Konzentrationen an Ca²⁺ die Reaktion auslösen können, können für die Anwendungen in den Verfahren hierin höhere Konzentrationen an Chelator in den Zusammensetzungen des Photoproteins eingeschlossen sein. Entsprechend werden höhere Konzentrationen an zugesetzten Ca²⁺ in Form von Calciumsalz erforderlich sein. Genaue Mengen können empirisch bestimmt werden. Für die Verwendung hierin kann es ausreichend sein, lediglich Wasser zu dem Photoprotein zuzugeben, welches sich in Form einer konzentrierten Zusammensetzung oder in lyophilisierter oder in pulvriger Form vorliegt. Für die Zwecke hierin sollte daher der Zusatz von kleinen Mengen an Ca²⁺, wie zum Beispiel die, die anwesend ist in den meisten Leitungswassern oder in phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) oder anderen geeigneten Puffern oder etwa in der Feuchte auf der Haut sind, die Biolumineszenzreaktion auslösen.
Eine Vielzahl an Isoformen des Aequorin-Apoproteins sind identifiziert und isoliert worden. DNA, welche für dieses Proteine kodiert, ist kloniert worden und die Proteine und modifizierte Formen hiervon sind unter Verwendung geeigneter Wirtszellen hergestellt worden [siehe z.B. US-Patente Nr. 5,162,227, 5,360,728, 5,093,240; siehe weiter Prasher et al. (1985) Biophys. Biochem. Res. Commun. 126: 1259–1268; Inouye et al. (1986) Biochemistry 25: 8425–8429]. US-Patent Nr. 5,093,240; US-Patent Nr. 5,360,728; US-Patent Nr. 5,139,937; US-Patent Nr. 5,288,623; US-Patent Nr. 5,422,266, US-Patent Nr. 5,162,227 und SEQ ID Nrn. 5–13; welche DNA, die für das Apoprotein kodiert, darlegen; und eine Form ist kommerziell erhältlich von Sealite, Sciences, Bogart, GA als AQUALITE^®]. DNA, welche für Apoaequorin oder Varianten davon kodiert, ist für die rekombinante Herstellung großer Mengen des Apoproteins nützlich. Das Photoprotein wird nach der Zugabe des Luciferins, Coelenterazin, vorzugsweise ein Sulfatsalzderivat davon, oder ein Analogon davon und molekularem Sauerstoff rekonstituiert [siehe z.B. US-Patent Nr. 5,023,181]. Das Apoprotein und andere Bestandteile des Photoproteins und der Biolumineszenz erzeugenden Reaktion können unter geeigneten Bedingungen gemischt werden, um das Photoprotein zu regenerieren und gleichzeitig das Photoprotein Licht erzeugen zu lassen. Rekonstitution erfordert die Anwesenheit eines reduzierenden Mittels, wie zum Beispiel Mercaptoethanol, außer für die modifizierten Formen, welche weiter unten diskutiert werden, die so konstruiert sind, dass ein reduzierendes Mittel nicht benötigt wird [siehe z.B. US-Patent Nr. 5,093,240].
Für die Verwendung hierin ist es bevorzugt, wenn Aequorin unter Verwendung von DNA, wie zum Beispiel die in SEQ ID Nrn. 5–13 dargestellte und dem Fachmann bekannte oder modifizierten Formen hiervon, erzeugt wird. Das DNA- kodierte Aequorin wird in eine Wirtszelle exprimiert, wie zum Beispiel E. coli, isoliert und rekonstituiert, um das Photoprotein zu ergeben [siehe z.B. US-Patente Nr. 5,418,155, 5,292,658, 5,360,728, 5,422,266, 5,162,227].
Von Interesse hierin sind Formen des Apoproteins, welche modifiziert wurden, so dass die biolumineszente Aktivität größer ist als in unmodifiziertem Apoaequorin [siehe z.B. US-Patent Nr. 5,360,728; SEQ ID Nrn. 10–12]. Modifizierte Formen, die eine größere biolumineszente Aktivität aufweisen als unmodifiziertes Apoaequorin, schließen Proteine ein, die Sequenzen besitzen, dargestellt in SEQ ID Nrn. 10–12, in welchen Aspartat 124 zu Serin verändert ist, Glutamat 135 zu Serin verändert bzw. Glycin 129 zu Alanin verändert ist. Andere modifizierte Formen mit gesteigerter Biolumineszenz sind auch verfügbar.
Für die Verwendung in bestimmten Ausführungsformen hierin, werden das Apoprotein und andere Komponenten des Aequorin-Biolumineszenz erzeugenden Systems verpackt oder bereitgestellt als eine Mischung, welche, wenn es gewünscht wird, den Bedingungen, unter welchen das Photoprotein aus dem Apoprotein, Luciferin und Sauerstoff rekonstituiert, unterzogen wird [siehe z.B. US-Patent Nr. 5,023,181 und US-Patent Nr. 5,093,240]. Besonders bevorzugt sind Formen des Apoproteins, die kein reduzierendes Mittel, wie zum Beispiel 2-Mercaptoethanol, zur Rekonstitution benötigen. Diese Formen, zum Beispiel beschrieben in US-Patent Nr. 5,093,240 (siehe auch Tsuji et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8107–8111], werden modifiziert durch Austausch von einem oder mehreren, bevorzugt allen drei Cysteinresten, mit zum Beispiel Serin. Der Austausch kann durch Modifikation der DNA, welche das Aequorin-Apoprotein kodiert, wie zum Beispiel in SEQ ID Nr. 5 dargelegt, ausgeführt werden und Austausch des Cysteinkodons mit Serin.
Die Photoproteine und Luciferasen von verwandten Arten, wie zum Beispiel Obelia, sind auch zur Verwendung hierin beabsichtigt. DNA, welche das Ca²⁺ aktivierte Photoprotein Obelin aus dem hydrioden Polypen Obelia longissima kodiert, ist bekannt und verfügbar [siehe z.B. Illarionov et al. (1995), Gene 153: 273–274; und Bondar et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1231: 29–32]. Dieses Photoprotein kann auch durch Mn²⁺ aktiviert werden [siehe z.B. Vysotski et al. (1995) Arch. Bioch. Biophys. 316: 92–93, Vysotski et al. (1993) J. Biolumin. Chemilumin. 8: 301–305].
Im Allgemeinen werden zur Verwendung hierin die Komponenten der Biolumineszenz verpackt oder bereitgestellt, so dass ungenügend Metallionen vorhanden sind, um die Reaktion zu starten. Wenn verwendet, werden Spuren von Mengen des startenden Metallions, insbesondere Ca²⁺, mit den anderen Komponenten in Berührung gebracht. Für ein länger anhaltendes Leuchten kann Aequorin beständig rekonstituiert werden oder kann zugesetzt werden oder kann in hohem Überschuss bereitgestellt werden.
(2) Luciferin
Das Aequorin Luciferin ist Coelenterazin und Analoga davon, welche Moleküle einschließen, die die Struktur besitzen [Formel (I)]:
in welcher R₁ CH₂C₆H₅ oder CH₃ ist; R₂ ist C₆H₅ und R₃ ist p-C₆H₄OH oder CH₃ oder andere solcher Analoga, welche Aktivität besitzen. Bevorzugtes Coelenterazin hat die Struktur, in welcher R₁ p-CH₂C₆H₄OH ist, R₂ ist C₆H₅ und R₃ ist p-C₆H₄OH, welches durch bekannte Verfahren dargestellt werden kann [siehe z.B. Inouye et al. (1975) Jap. Chem. Soc., Chemistry Lttrs. Seiten 141–144; und Halt et al. (1979) Biochemistry 18: 2204–2210]. Das bevorzugte Coelenterazin hat die Struktur (Formel (II)):
und sulfatierte Derivate davon.
Die Reaktion von Coelenterazin, wenn an das Aequorin-Photoprotein mit gebundenem Sauerstoff gebunden und in der Anwesenheit von Ca²⁺, kann wie folgt dargestellt werden:
Das Photoprotein Aequorin [welches Apoaequorin, gebunden an ein Coelenterat-Luciferin-Molekül enthält] und Renilla Luciferase, welche weiter unten diskutiert wird, können dasselbe Coelenterat-Luciferin verwenden. Das Aequorin-Photoprotein katalysiert die Oxidation von Coelenterat-Luciferin (Coelenterazin) zu Oxyluciferin (Coelenteramid) mit der einhergehenden Erzeugung von blauem Licht (lambda_max = 469 nm).
Wichtiger Weise ist das Sulfatderivat von Coelenterat-Luciferin (Lauryl-Luciferin) ziemlich stabil in Wasser und kann daher in einem Coelenterat-artigem Biolumineszenz erzeugenden System verwendet werden. In diesem System werden Adenosindiphosphat (ADP) und eine Sulpha-Kinase verwendet, um Coelenterazin zur sulfatierten Form umzuwandeln. Sulfatase wird dann verwendet, um dass Lauryl-Luciferin in das native Coelenterazin zurückzuwandeln. Deshalb wird das stabilere Lauryl-Luciferin in dem Posten verwendet, der beleuchtet werden soll, und die Luciferase kombiniert mit der Sulfatase werden zu der Luciferinmischung gegeben, wenn die Erleuchtung gewünscht ist.
Deshalb ist das Biolumineszenz erzeugende System von Aequorea im Besonderen zur Verwendung in den Verfahren und dem Gerät hierin geeignet. Die spezifischen Mengen und die Art, in welcher die Komponenten bereitgestellt werden, hängt von der ausgewählten Untersuchung, der Luciferase und dem Antiliganden ab.
Dieses System kann in lyophilisierter Form bereitgestellt werden, welches auf die Zugabe von Ca²⁺ hin leuchten wird. Es kann verkapselt sein, an Matrizen verknüpft sein, wie zum Beispiel poröses Glas, oder in Zusammensetzungen, wie zum Beispiel eine Lösung oder eine Suspension, vorzugsweise in der Anwesenheit eines ausreichend chelatisierenden Mittels, um ein Starten der Reaktion zu verhindern. Die Konzentration des Aequorin-Photoproteins wird variieren und kann empirisch bestimmt werden. Typischerweise werden Konzentrationen von wenigstens 0,1 mg/l, stärker bevorzugt von wenigstens 1 mg/l und höher ausgewählt werden. In bestimmten Ausführungsformen werden 1–10 mg Luciferin/100 mg Luciferase in ausgewählten Volumen verwendet werden und wird bei den gewünschten Konzentrationen verwendet werden.
b. Das Renilla-System
Repräsentativ für Coelenteraten-Systeme ist das Renilla-System. Renilla, auch bekannt als gemeine Seefedern, sind Mitglieder der Klasse von Coelenteraten Anthozoa, welche andere biolumineszente Gattungen einschließen, wie zum Beispiel Cavarnularia, Ptilosarcus, Stylatula, Acanthoptilum und Parazoanthus. Biolumineszente Mitglieder der Anthazoa-Gattungen enthalten Luciferasen und Luciferine, die in ihrer Struktur ähnlich sind [siehe z.B. Cormier et al. (1973) J. Cell. Physiol. 81: 291–298; siehe weiter Ward et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 2530–2534]. Die Luciferasen und Luciferine von jedem dieser Anthazoen kreuzreagieren und erzeugen eine charakteristisch blaue Lumineszenz.
Renilla Luciferase und die anderen Coelenteraten und Ctenophoren-Luciferasen, wie zum Beispiel das Aequorin-Photoprotein, verwenden Imidazopyrazinsubstrate, im Besonderen die Substrate, die im Allgemeinen Coelenterazine genannt werden [siehe Formeln (I) und (II) oben]. Andere Gattungen, die Luciferasen besitzen, welche Coelenterazn benutzen, schließen ein: Kalmar, wie zum Beispiel Chiroteuthis, Eucleoteuthis, Onychoteuthis, Watasenia; Kuttelfisch, Sepiolina; Krabbe, wie zum Beispiel Oplophorus, Sergestes und Gnathophausia; Tiefseefisch, wie zum Beispiel Argyropelecus, Yarella, Diaphus und Neoscopelus.
Jedoch besitzt Renilla-Luciferase keinen gebundenen Sauerstoff und bedarf deswegen gelösten Sauerstoffs, um Licht in der Anwesenheit eines geeigneten Luciferinsubstrats erzeugen zu können. Da Renilla-Luciferase als ein wirkliches Enzym wirkt [d.h. es muss für eine weitere Verwendung nicht rekonstituiert werden], kann die sich ergebende Lumineszenz lang anhaltend in der Anwesenheit von sättigenden Luciferin-Leveln sein. Renilla-Luciferase ist auch gegenüber Hitze relativ stabil.
Renilla-Luciferase, DNA, die Renilla-Luciferase kodiert und die Verwendung von DNA, um rekombinante Luciferase herzustellen, wie auch DNA, die Luciferase aus anderen Coelenteraten kodiert, sind gut bekannt und verfügbar (siehe z.B. SEQ ID Nr. 1, US-Patente Nr. 5,418,155 und 5,292,658; siehe auch Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Re. Commun. 126: 1259–1268; Cormier (1981) „Renilla and Aequorea bioluminescence" in Bioluminescence and Chemiluminescence, Seiten 225–233; Charbonneau et al. (1979) J. Biol. Chem. 254: 769–780; Ward et al. (1979) J. Biol. Chem. 254: 781–788; Lorenz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 4438–4442; Hori et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 4285–4287; Hori et al. (1975) Biochemistry 14: 2371–2376; Hori et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 4285–4287; Inouye et al. (1975) Jap. Soc. Chem. Lett. 141–144 und Matthews et al. (1979) Biochemistry 16: 85–91]. Die DNA, die Renilla-Luciferase kodiert, und Wirtszellen, die solche DNA enthalten, stellen ein praktisches Mittel zur Herstellung großer Mengen des Enzyms dar [siehe z.B. US-Patente Nr. 5,418,155 und 5,292,658, welche die rekombinante Herstellung von Renilla-Luciferase beschreiben und die Verwendung der DNA, um DNA, welche andere Luciferasen kodiert, zu isolieren, insbesondere solche von verwandten Organismen]. Eine modifizierte Version eines Verfahrens [US-Patente Nr. 5,418,155 und 5,292,658] zur rekombinanten Erzeugung von Renilla-Luciferase, die ein höheres Level an Expression des rekombinanten Proteins ergibt, wird in den BEISPIELEN hierin aufgezeigt.
Wenn hierin verwendet, kann die Renilla-Luciferase in lyophilisierter Form verpackt sein, verkapselt in einem Vehikel, entweder an sich selbst oder in Kombination mit dem Luciferinsubstrat. Vor der Verwendung wird die Mischung mit einer wässrigen Zusammensetzung, vorzugsweise einer phosphatgepufferten Salzlösung oder einem anderen geeigneten Puffer, wie zum Beispiel einem Tris-basierten Puffer [wie z.B. 0,1 mm Tris, 0,1 mm EDTA] pH 7–8, vorzugsweise etwa pH 8, in Berührung gebracht; gelöster O₂ wird die Reaktion aktivieren. Die Zugabe von Glycerin [etwa 1%] steigert die Lichtintensität. Die Endkonzentrationen an Luciferase in der leuchtenden Mischung werden im Bereich von 0,01 bis 1 mg/l oder mehr liegen. Die Konzentrationen an Luciferin werden wenigstens etwa bei 10^–8 M liegen, aber 1 bis 100 oder mehr Größenordnungen höher, um eine lang andauernde Biolumineszenz zu erzeugen.
In bestimmten Ausführungsformen hierin werden etwa 1–10 mg, oder vorzugsweise 2–5 mg, stärker bevorzugt etwa 3 mg Coelenterazin mit etwa 100 mg Renilla-Luciferase verwendet werden. Die genauen Mengen können selbstverständlich empirisch ermittelt werden und werden auch zu einem gewissen Maße von der endgültigen Konzentration und der Verwendung abhängen. Insbesondere waren auf die Zugabe von etwa 0,25 ml eines Rohextrakts aus Bakterien, die Renilla exprimieren, zu 100 ml eines geeigneten Assay-Puffers und etwa 0,005 μg waren ausreichend, um ein sichtbares und andauerndes Leuchten zu erzeugen [siehe US-Patente Nr. 5,418,155 und 5,292,658, welche die rekombinante Herstellung von Renilla-Luciferase beschreiben].
Lyophilisierte Mischungen und Zusammensetzungen, die die Renilla-Luciferase enthalten, werden auch bereitgestellt. Die Luciferase oder Mischungen der Luciferase und Luciferins können auch in ein geeignetes Abgabevehikel verkapselt werden, wie zum Beispiel ein Liposom, Glaspartikel, Röhrchen, Wirkstoff abgebende Vehikel, Gelatine, über die Zeit freisetzende Beschichtung oder andere solche Vehikel. Kits, die diese Mischungen, Kompositionen oder Vehikel und auch eine Chipvorrichtung und Reagenzien zum Anheften der biologischen Moleküle an die Oberfläche des Chips beinhalten, werden auch bereitgestellt. Die Luciferase kann auch über chemische oder rekombinante Mittel an einen Antiliganden für die Verwendung in den Verfahren hierin geknüpft werden.
Rekombinante Herstellung von Renilla reniformis Luciferase
Das Phagemid pTZ18R (Pharmacia) ist ein Vielzweck-DNA-Vektor, der für in vitro Transkriptionen hergestellt wurde und auch für die Expression von rekombinanten Proteinen in bakteriellen Wirten verwendbar ist. Der Vektor enthält das bla-Gen, welches die Selektion von Transformanten durch Resistenz gegenüber Ampicillin erlaubt, und eine Polylinker-Site, benachbart zu dem lacZ'-Gen. Das heterologe Gen von Interesse wird in den Polylinker insertiert und vom lac-Promotor aus durch Induktion transkribiert, zum Beispiel mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG).
Die DNA, die Renilla reniformis Luciferase kodiert, ist kloniert worden (siehe z.B. US-Patente Nr. 5,292,658 und 5,418,155). Das Plasmid pTZRLuc-1 kodiert die Renilla-Luciferase auf einem 2,2 Kbp EcoRI zu SstI DNA-Fragment insertiert in die EcoRI und SstI Stellen von pTZ18R (die Plasmidkonstruktion ist beschrieben in den US-Patenten Nr. 5,292,658 und 5,418,155; siehe auch Lorenz et al. (1991) Isolation and Expression of the cDNA encoding Renilla reniformis Luciferase, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 4438–4442). Die Initiation der Transkription der Renilla-Luciferase cDNA steht unter der Kontrolle des lacZ'-Promotors. E. coli-Stämme, welche über das Plasmid pTZRLuc-1 verfügen, exprimieren Renilla-Luciferase, die in Biolumineszenz-Assays funktionsfähig ist und die Eigenschaften des nativen Enzyms beibehält (siehe z.B. US-Patente Nr. 5,292,658 und 5,418,155).
Ein Derivat von pTZRLuc-1, pTZRLuc-3.6, erzeugt etwa 7 fach höhere Level an rekombinanter Renilla-Luciferase als pTZRLuc-1, wenn es in denselben E. coli-Wirt transformiert wird. Der kompetente E. coli-Stamm XL-1 wurde unter Verwendung von gereinigten pTZRLuc-3.6 gemäß der vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen transformiert (XL-1 Supercompetent cells and protocol; Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Transfektanten wurden durch Ausplattieren auf Luria Broth (LB)-Platten supplementiert mit 100 μg/ml Ampicillin, ausgewählt.
Einzelne Ampicillin resistente Kolonien wurden in LB-Medium, supplementiert mit 100 μg/ml Ampicillin, bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln aufgezogen, bis das Zellwachstum die mid-log-Phase erreichte (d.h. die Zellkultur erreicht ein O.D._600nm = 0,6–0,8 Einheiten). Die Transkription vom lac-Promotor aus wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert und die Zellkultur wurde bei Raumtemperatur für weitere 8 Stunden geschüttelt.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 10000 × g geerntet und bei –20°C eingefroren. Das Zellpellet wurde aufgetaut und bei einem Verhältnis von 1:5 (w/w) in einer Lösung von 10 mM EDTA, pH 8,0, welche 4 mg/ml Lysozym (Sigma Chemical Corp.) enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden in einem 25°C Wasserbad für 30 Minuten platziert und dann für eine Stunde auf Eis überführt. Die Zellen wurden durch Sonifikation bei 0°C unter Verwendung eines 1 Minuten Pulses von einem Ultrasonics, Unc. Zelldisruptor lysiert.
Die lysierten Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 30 000 × g für 3 Stunden entfernt und der Überstand wurde dekantiert und zurückbehalten. Das Pellet wurde bei einem 1:5 Verhältnis in den oben beschriebenen Lösungen resuspendiert und die nachfolgenden Inkubationen, Lyse- und Zentrifugationsschritte wurden wiederholt. Die zwei Überstände wurden vereinigt und bei –70°C gelagert. Das sich ergebende „geklärte Lysat" wurde als eine Quelle rekombinanter Luciferase verwendet. Alternativ kann das Lysat zusätzlichen Reinigungsschritten unterzogen werden (z.B. Ionenaustauscherchromatographie oder Immunoaffinitätschromatographie), um das Lysat weiter anzureichern oder um eine homogene Quelle des gereinigten Enzyms bereitzustellen (siehe z.B. US-Patente Nr. 5,292,658 und 5,418,155).
3. Crustaceen, insbesondere Cyrpidina-Systeme
Die Ostracroden, wie zum Beispiel Vargula serratta, Hilgendorfii und Noctiluca sind kleine Meerescrustaceen, manchmal als Seeglühwürmchen bezeichnet. Diese Seeglühwürmchen werden in den Gewässern vor der Küste Japans gefunden und emittieren Licht durch Spritzen von Luciferin und Luciferase in das Wasser, wo die Reaktion, welche eine hellblau leuchtende Wolke erzeugt, abläuft. Die Reaktion umfasst nur Luciferin, Luciferase und molekularen Sauerstoff und ist deshalb für die Anwendung hierin sehr geeignet.
Diese Systeme, wie zum Beispiel das Vargula Biolumineszenz erzeugende System sind hierin besonders bevorzugt, da die Komponenten bei Raumtemperatur stabil sind, wenn sie getrocknet und pulvrig sind und werden fortfahren zu reagieren, auch wenn sie verunreinigt sind. Weiterhin benötigt die biolumineszente Reaktion die Luciferin/Luciferase-Komponenten nur in Konzentrationen so niedrig wie 1:40 Teile pro Milliarde bis 1:100 Teilchen pro Milliarde, Wasser und molekularen Sauerstoff, um abzulaufen. Ein erschöpftes System kann durch die Zugabe von Luciferin erneuert werden.
a. Vargula Luciferase
Vargula Luciferase ist ein 555-Aminosäurenpolypeptid, das durch die Isolation aus Vargula und auch unter Verwendung rekombinanter Technologie zur Expression der DNA in geeigneten bakteriellen Säugerwirtszellen hergestellt wurde [siehe z.B. Thompson et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6567–6571; Inouye et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 9584–9587; Johnson et al. (1978) Methods in Enzymology LVII: 331–349; Tsuji et al. (1978) Methods Enzymol. 57: 364–72; Tsuji (1974) Biochemistry 13: 5204–5209; Japanische Patentanmeldung Nr. JP 3-30678 Osaka und Europäische Patentanmeldung Nr. EP 0 387 355 A1 ].
(1) Reinigung aus Cypridina
Verfahren zur Reinigung von Vargula (Cypridina) Luciferase sind gut bekannt. Zum Beispiel können Rohextrakte, welche das Aktive enthalten, einfach durch Zermahlen oder Zerstoßen der Vargula-Krabbe hergestellt werden. In anderen Ausführungsformen kann eine Präparation an Cypridina hilgendorfii Luciferase durch Eintauchen gefroren gelagerter C. hilgendorfii in destilliertes Wasser, welches 0,5–5 M Salz, vorzugsweise 0,5–2 M Natrium- oder Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, bei 0–30°C, vorzugsweise 0–10°C, für 1–48 h, vorzugsweise 10–24 h, präpariert werden zur Extraktion gefolgt von hydrophobischer Chromatographie und dann Ionenaustausch- oder Affinitätschromatographie (TORAY IND INC, Japanische Patentanmeldung JP 4258288 , veröffentlicht 14. September 1999; siehe auch Tsuji et al. (1978) Methods Enzymol. 57: 364–72 für andere Verfahren].
Das Luciferin kann aus den zermahlenen trockenen Vargula durch Erhitzen des Extrakts, welches die Luciferase zerstört, aber das Luciferin intakt lässt, isoliert werden [siehe z.B. US-Patent Nr. 4,853,327].
(2) Präparation durch rekombinante Verfahren
Die Luciferase wird vorzugsweise durch Expression klonierter DNA, welche die Luciferase kodiert, hergestellt [Europäische Patentanmeldung Nr. 0 387 355 A1; Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 90/01542; siehe auch SEQ ID Nr. 5, welche die Sequenzen der japanischen Patentanmeldung Nr. JP 3-30678 darstellt und Thompson et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6567–6571]. DNA, die die Luciferase oder Varianten davon kodiert, wird in E. coli unter Verwendung geeigneter Vektoren eingeführt und unter Verwendung von Standardverfahren isoliert.
b. Vargula Luciferin
Das natürliche Luciferin in einem substituierten Imidazopyrazin-Kern, wie eine Verbindung der Formel (III):
Analoga hiervon oder andere Komponenten, die mit der Luciferase in einer Licht erzeugenden Reaktion reagieren, können auch verwendet werden.
Andere biolumineszente Organismen, die Luciferasen besitzen, die mit dem Vargula Luciferin reagieren können, schließen ein die Gattungen Apogon, Parapriacanthus und Porichthys.
c. Reaktion
Das Luciferin bildet auf die Reaktion mit Sauerstoff eine Dioxoetanon-Zwischenstufe [welche ein cyclisches Peroxid, ähnlich der Glühwürmchen-Peroxidmolekül-Zwischenstufe, einschließt]. Im letzten Schritt der biolumineszenten Reaktion zerfällt das Peroxid unter Bildung von CO₂ und einem angeregten Carbonyl. Das angeregte Molekül emittiert dann ein blaues bis blaugrünes Licht.
Der optimale pH-Wert für diese Reaktion ist etwa 7. Für die Zwecke hierin kann jeglicher pH-Wert, bei welchem die Reaktion stattfindet, verwendet werden. Die Konzentrationen für Reagenzien sind die, die normalerweise für analytische Reaktionen verwendet werden oder höher [siehe z.B. Thompson et al. (1990) Gene 96: 257–262]. Typischerweise werden Konzentrationen der Luciferase zwischen 0,1 und 10 mg/l, vorzugsweise 0,5 bis 2,5 mg/l verwendet werden. Ähnliche Konzentrationen oder höhere Konzentrationen an Luciferin können verwendet werden.
4. Biolumineszenz erzeugende Systeme aus Insekten einschließlich Glühwürmchen-, Schnellkäfer- und andere Insekten-Systeme
Die Biochemie der Glühwürmchen-Biolumineszenz war das erste Biolumineszenz erzeugende System, welches charakterisiert wurde [siehe z.B. Wienhausen et al. (1985) Photochemistry and Photobiology 42: 609–611; McElroy et al. (1966) in Molecular Architecture in Cell Physiology, Hayashi et al., Hrsg. Prentice Hall, Inc., Englewood Cliffs, NJ, pp. 63–80) und es ist kommerziell erhältlich [z.B. von Promega Corporation, Madison, WI, siehe z.B. Leach et al. (1986) Methods in Enzymology 133: 51–70, insbesondere Tabelle 1]. Luciferasen aus verschiedenen Arten der Glühwürmchen sind antigenisch ähnlich. Diese Arten schließen Mitglieder der Gattungen Photinus, Photurins und Luciola ein. Ferner erzeugt die biolumineszente Reaktion bei 30°C mehr Licht als bei 20°C, die Luciferase wird durch kleine Mengen an Rinderalbuminserum stabilisiert und die Reaktion kann durch Tricin gepuffert werden.
a. Luciferase
DNA-Klone, die Luciferasen aus verschiedenen Insekten kodieren, und die Verwendung, um die kodierten Luciferasen herzustellen, sind wohl bekannt. Zum Beispiel sind DNA-Klone, die die Luciferase aus Photinus pyralis, Luciola cruciata kodieren, verfügbar [siehe z.B. de Wet et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 7870–7873; de We et al. (1986) Methods in Enzymology 133: 3; US-Patent Nr. 4,968,613, siehe auch SEQ ID Nr. 3]. Die DNA wurde auch in Saccharomyces und in Tabak exprimiert [siehe z.B. Japanische Patentanmeldung Nr. JP 63317079 , veröffentlicht 26. Dezember 1988, KIKKOMAN CORP].
Zusätzlich zu den Wildtyp-Luciferasen wurden modifizierte Insekten-Luciferasen hergestellt. Zum Beispiel sind hitzestabile Luciferase-Mutanten, DNA, welche die Mutanten kodiert, Vektoren und transformierte Zellen zur Herstellung der Luciferasen erhältlich. Ein Protein mit 60% Aminosäuresequenzhomologie zu den Luciferasen aus Photinus pyralis, Luciola mingrelica, L. cruciata oder L. lateralis und welches Luciferase-Aktivität besitzt, ist erhältlich [siehe z.B. Internationale PCT-Anmeldung WO 95/25798]. Es ist über 30°C stabiler als die natürlich vorkommenden Insekten-Luciferasen und kann auch bei 37°C oder darüber mit höherer Ausbeute hergestellt werden.
Modifizierte Luciferasen, die [verglichen mit natürlicher Luciferase] Licht bei verschiedenen Wellenlängen, erzeugen, können deshalb wegen ihrer Licht erzeugenden Eigenschaften ausgewählt werden. Zum Beispiel ist/sind synthetische Mutantenkäfer-Luciferase(n) und DNA, die solche Luciferasen kodiert, die Biolumineszenz bei einer Wellenlänge, die unterschiedlich von Wildtyp-Luciferase ist, erzeugen, bekannt. [Promega Corp.; Internationale PCT-Anmeldung WO 95/18853, welche auf der US-Anmeldung Serien-Nr. 08/177,081 1/3/94 beruht]. Die Mutantenkäfer-Luciferase besitzt eine Aminosäuresequenz, die sich von der korrespondierenden Wildtyp Luciola cruciata durch Substitutionen) an ein oder zwei Positionen unterscheidet [siehe z.B. US-Patente Nr. 5,182,202; 5,219,737; 5,352,598, siehe auch SEQ ID Nr. 3]. Die Mutanten-Luciferase erzeugt Biolumineszenz von einer Wellenlänge der Peak-Intensität, die sich wenigstens 1 nm von der durch Wildtyp-Luciferasen erzeugten unterscheidet.
Andere Mutanten-Luciferase ist auch hergestellt worden. Mutanten-Luciferasen mit der Aminosäuresequenz der Wildtyp-Luciferase, aber mit wenigstens einer Mutation, durch welche Valin durch Isoleucin an der Aminosäure Nr. 233 ersetzt wird, Valin durch Isoleucin an 239, Serin durch Asparagin an 286, Glycin durch Serin an 326, Histidin durch Tyrosin an 433 oder Prolin durch Serin an 452 sind bekannt [siehe z.B. US-Patente Nrn. 5,219,737 und 5,330,906]. Die Luciferasen werden durch Expression von DNA, die jede Mutanten-Luciferase kodiert, in E. coli und Isolation des Proteins hergestellt. Diese Luciferasen erzeugen Licht mit Farben, das sich vom Wildtyp unterscheidet. Die Mutanten-Luciferasen katalysieren Luciferin, um rotes [λ 609 nm und 612 nm], orangenes [λ 595 nm und 607 nm] oder grünes [λ 558 nm] Licht zu erzeugen. Die anderen physikalischen und chemischen Eigenschaften von Mutanten-Luciferase sind im Wesentlichen identisch mit nativer Wildtyp-Luciferase. Die Mutanten-Luciferase hat die Aminosäuresequenz von Luciola cruciata Luciferase mit einer Änderung ausgewählt aus Ser 286 ersetzt durch Asn, Gly 326 ersetzt durch Ser, His 433 ersetzt durch Tyr oder Pro 452 ersetzt durch Ser. Thermostabile Luciferasen sind auch verfügbar [siehe z.B. US-Patent Nr. 5,229,285; siehe auch Internationale PCT-Anmeldung Nr. 25798, welche Photinus Luciferase bereistellt, in welcher das Glutamat an Position 354 durch Lysin ersetzt ist und Luciola Luciferase, in welcher das Glutamat an Position 356 durch Lysin ersetzt ist].
Diese Mutanten-Luciferasen sind ebenso wie die Wildtyp-Luciferasen unter denen die hierin bevorzugt sind, insbesondere unter Umständen, wenn eine Auswahl an Farben gewünscht ist oder wenn Stabilität bei höheren Temperaturen gewünscht ist. Es ist auch nennenswert, dass Glühwürmchen-Luciferasen ein alkalisches pH-Optimum besitzen [7,5–9,5] und daher zur Verwendung in diagnostischen Untersuchungen, die bei alkalischem pH ausgeführt werden, verwendbar sind.
b. Luciferin
Das Glühwürmchen-Luciferin ist ein Benzothiazol:
Analoga dieses Luciferins und synthetische Glühwürmchen-Luciferine sind dem Fachmann wohl bekannt [siehe z.B. US-Patente Nrn. 5,374,534 und 5,098,828]. Diese schließen Verbindungen der Formel (IV) ein [siehe US-Patent Nr. 5,098,828]:
in welcher:
R¹ ist Hydroxy, Amino, linear oder verzweigt C₁-C₂₀-Alkoxy, C₁-C₂₀-Alkenyloxy, ein L-Aminosäure-Rest gebunden über die α-Aminogrupppe, ein Oligopeptid-Rest mit bis zu zehn L-Aminosäureeinheiten verknüpft mittels der α-Aminogrupppe der terminalen Einheit;
R² ist Wasserstoff, H₂PO₃, HSO₃, unsubstituiertes oder Phenyl-substituiertes lineares oder verzweigtes C₁-C₂₀-Alkyl oder C₂-C₂₀-Alkenyl, Aryl, welches 6 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, oder R³-C(O)-; und
R³ ist ein unsubstituiertes oder Phenyl-substituiertes lineares oder verzweigtes C₁-C₂₀-Alkyl oder C₂-C₂₀-Alkenyl, Aryl, welches 6 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, ein Nukleotid-Rest mit 1 bis 3 Phosphatgruppen, oder ein glycosidisch angefügtes Mono- oder Disaccharid, außer wenn Formel (IV) ein D-Luciferin oder ein D-Luciferinmethylester ist.
c. Reaktion
Die Reaktion, welche durch Glühwürmchen-Luciferasen und verwandte Insekten-Luciferasen katalysiert wird, erfordert ATP, Mg²⁺ genauso wie molekularen Sauerstoff. Luciferin muss exogen zugegeben werden. Glühwürmchen-Luciferase katalysiert die Glühwürmchen-Luciferin-Aktivierung und die nachfolgenden Schritte, welche zum angeregten Produkt führen. Das Luciferin reagiert mit ATP unter Ausbildung einer Luciferyl-Adenylat-Zwischenstufe. Diese Zwischenstufe reagiert dann mit Sauerstoff unter Ausbildung einer cyclischen Luciferyl-Peroxy-Spezies, ähnlich zu der coelenteraten cyclischen Peroxid-Zwischenstufe, welche unter Abgabe von CO₂ und einem angeregten Zustand des Carbonylprodukts zerfällt. Das angeregte Molekül emittiert dann ein gelbes Licht; jedoch ist die Farbe eine Funktion des pH-Werts. Während der pH-Wert erniedrigt wird, ändert sich die Farbe der Biolumineszenz von gelb-grün zu rot.
Verschiedene Arten von Glühwürmchen emittieren verschiedene Farben von Biolumineszenz, so dass die Farbe der Reaktion von der Art, von welcher die Luciferase bezogen ist, abhängen wird. Zusätzlich ist die Reaktion bei pH 7,8 optimiert.
Die Zugabe von ATP und Luciferin zu einer Reaktion, die erschöpft ist, erzeugt zusätzliche Lichtemission. Daher wird das System, einmal etabliert, relativ leicht aufrecht erhalten. Deshalb ist es äußerst geeignet für die Verwendung in Ausführungsformen hierin, in welchen ein anhaltendes Leuchten gewünscht wird, oder die Wiederverwendung des Elements in Erwägung gezogen wird. Daher können die Komponenten eines Glühwürmchen-Systems mit dem Chip zusammengepackt werden.
5. Bakterielle Systeme
Lumineszierende Bakterien emittieren typischerweise ein kontinuierliches Licht, gewöhnlich blaugrün. Bei starker Expression kann ein einzelnes Bakterium 10⁴ bis 10⁵ Photonen pro Sekunde emittieren. Bakterielle Biolumineszenz-Systeme schließen ein, unter anderm, die Systeme, die in den biolumineszenten Spezies der Gattungen Photobacterium, Vibrio und Xenorhabdus gefunden werden. Dieses Systeme sind gut bekannt und gut charakterisiert [siehe z.B. Baldwin et al. (1984) Biochemistry 23: 3663–3667; Nicoli et al. (1974) J. Biol. Chem. 249: 2393–2396; Welches et al. (1981) Biochemistry 20: 512–517; Engebrecht et al. (1986) Methods in Enzymology 133: 83–99; Frackman et al. (1990) J. Of Bacteriology 172: 5767–5773; Miyamoto et al. (1986) Methods in Enzymology 133: 70; US-Patent Nr. 4,581,335].
a. Luciferasen
Bakterielle Luciferase, wie beispielhaft erläutert durch die Luciferase abgeleitet aus Vibrio harveyi [EC 1.14.14.3, Alkanol-reduziertes-FMN-Sauerstoff Oxidoreduktase 1-hydroxylierend, lumineszierend] ist eine Oxidase mit gemischter Funktion, welche durch die Assoziation von zwei verschiedenen Proteinuntereinheiten α und β gebildet wird. Die α-Untereinheit hat ein offenbares Molekulargewicht von etwa 42 000 kD und die β-Untereinheit hat ein offenbares Molekulargewicht von etwa 37 000 kD [siehe z.B. Cohn et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 102–123]. Diese Untereinheiten assoziieren unter Ausbildung eines 2-Kettenkomplex-Luciferase-Enzyms, welches die lichtemittierende Reaktion biolumineszenter Bakterien, wie zum Beispiel Vibrio harveyi [US-Patent Nr. 4,581,335; Belas et al. (1982) Science 218: 791–793], Vibrio fischeri [Engebrecht et al. (1983) Cell 32: 773–781; Engebrecht et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 4154–4158] und anderer Meeresbakterien katalysiert.
Bakterielle Luciferase-Gene wurden kloniert [siehe z.B. US-Patent Nr. 5,221,623; US-Patent Nr. 4,581,335; Europäische Patentanmeldung EP 386 691 A ]. Plasmide zur Expression bakterieller Luciferase, wie zum Beispiel Vibrio harveyi schließen ein pFIT001 (NRRL B-18080), pPALE001 (NRRL B-18082) und pMR19 (NRRL B-18081) sind bekannt. Zum Beispiel wurde die Sequenz des vollständigen lux Regulons aus Vibrio fischeri bestimmt [Baldwin et al. (1984) Biochemistry 23: 3663–3667; Baldwin et al. (1981) Biochem. 20: 512–517; Baldwin et al. (1984) Biochem. 23: 3663–3667; siehe auch z.B. US-Patente Nrn. 5,196,318, 5,221,623 und 4,581,335].
Dieses Regulon schließt ein das luxI-Gen, welches ein Protein kodiert, welches für die autoinduzierte Synthese benötigt wird [siehe z.B. Engebrecht et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 4154–4158], die luxC-, luxD- und luxE-Gene, welche für Enzyme kodieren, welche die Luciferase mit einem Aldehydsubstrat versorgen, und die luxA- und luxB-Gene, welche die α- und β-Untereinheiten der Luciferase kodieren.
Lux-Gene von anderen Bakterien wurden auch kloniert und sind verfügbar [siehe z.B. Cohn et al. (1985) J. Biol. Chem. 260: 6139–6146; US-Patent Nr. 5,196,524. welches eine Fusion der luxA- und luxB-Gene von Vibrio harveyi bereistellt]. Daher steht Luciferase α- und β-Untereinheiten kodierende DNA zur Verfügung und kann verwendet werden, um die Luciferase zu erzeugen. DNA, welche die α- [1065 bp] und die β- [984 bp] Untereinheiten kodiert, DNA, welche ein Luciferase-Gen von 2124 bp kodiert, welches die alpha- und beta-Untereinheiten kodiert, ein rekombinanter Vektor, der DNA enthält, die beide Untereinheiten kodiert, und ein transformierter E. coli und andere bakterielle Wirte zur Expression und Produktion der kodierten Luciferase sind erhältlich. Zusätzlich sind bakterielle Luciferasen kommerziell erhältlich.
b. Luciferine
Bakterielle Luciferine schließen ein:
R ist zum Beispiel
in welchen das Tetradecanal mit reduziertem Flavin-Mononukleotid als Luciferin in Betracht kommen, da beide während der Licht emittierenden Reaktion oxidiert werden.
c. Reaktionen
Das bakterielle System erfordert zusätzlich zu reduziertem Flavin fünf Polypeptide, um die biolumineszente Reaktion auszuführen: zwei Untereinheiten, α und β, von bakteriellem Luciferin und drei Einheiten eines Fettsäurereduktase-Systemkomplexes, welcher das Tetradecanal-Aldehyd zur Verfügung stellt. Beispiele für bakterielle Biolumineszenz erzeugende Systeme, die in dem Gerät und den Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, anwendbar sind, schließen die ein, die aus Vibrio fischeri und Vibrio harveyi abgeleitet sind. Ein Vorteil dieses Systems besteht in der Fähigkeit bei kalten Temperaturen zu arbeiten. Es wird daher besonders empfänglich für Verfahren zur Verwendung des Chips zur Detektion und Beobachtung der antibiotischen Sensitivität von psychrophilen Organismen sein. Alle Komponenten eines bakteriellen Systems können in Eis eingefroren werden oder können in Lösungen eingebracht werden, welche unter 0°C gelagert werden. Nach Inkubation bei Temperaturen nahe 0°C kann der Chip zu wärmeren Temperaturen überführt werden und die Reaktion wird ablaufen und dabei ein anhaltendes Leuchten liefern.
Bakterielle Luciferase katalysiert die Flavin-vermittelte Hydroxylierung eines langkettigen Aldehyden, um eine Carbonsäure und ein angeregtes Flavin zu ergeben; das Flavin geht mit einer gleichzeitigen Emission von blaugrünem Licht in den Grundzustand über [λ_max = 490 nm; siehe z.B. Legocki et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 9080; siehe US-Patent Nr. 5,196,524]:
Die Reaktion kann durch in Kontakt bringen von reduziertem Flavin-Mononukleotid [FMNH₂] mit einer Mischung aus der bakteriellen Luciferase, Sauerstoff und einem langkettigen Aldehyden, normalerweise ein n-Decylaldehyd, gestartet werden.
DNA, die Luciferase aus dem fluoreszierenden Bakterium Alteromonas hanedai kodiert, ist bekannt [CHISSO CORP; siehe auch Japanische Anmeldung JP 7222590 , veröffentlicht 22. August 1995]. Das reduzierte Flavin-Mononukleotid [FMNH₂; Luciferin] reagiert mit Sauerstoff in der Anwesenheit von bakterieller Luciferase, um eine Peroxiflavin-Zwischenstufe zu ergeben. Diese Zwischenstufe reagiert mit einem langekettigen Aldehyden [Tetradecanal], um die Säure und das Luciferase-gebundene Hydroxyflavin in seinem angeregten Zustand zu ergeben. Das angeregte Luciferase- gebundene Hydroxyflavin emittiert dann Licht und dissoziiert dann von der Luciferase als das oxidierte Flavin-Mononukleotid (FMN] und Wasser. In vivo wird FMN wieder reduziert und wiederverwendet und das Aldehyd wird aus der Säure wieder regeneriert.
Flavinreduktasen sind kloniert worden [siehe z.B. US-Patent Nr. 5,484,723; siehe SEQ ID Nr. 14 als eine repräsentative Sequenz aus diesem Patent]. Diese können genauso gut wie NAD(P)H in die Reaktion einbezogen werden, um FMNH₂ für die Reaktion mit der bakteriellen Luciferase und dem langkettigen Aldehyden zu regenerieren. Die Flavinreduktase katalysiert die Reaktion von FMN, welches die Luciferasereaktion ist, zu FMNH₂; daher ist es möglich, wenn Luciferase und die Reduktase in dem Reaktionssystem einbezogen sind, die biolumineszente Reaktion aufrecht zu erhalten. Und zwar, da die bakterielle Luciferase zu vielen Umsätzen fähig ist, hält die Biolumineszenz so lange an, wie ein langkettiger Aldehyd in dem Reaktionssystem vorhanden ist.
Die Farbe des Lichts, welches durch biolumineszente Bakterien erzeugt wird, ergibt sich auch aus der Beteiligung von einem blau fluoreszierenden Protein [BFP] in der Biolumineszenzreaktion. Dieses Protein, welches gut bekannt ist [siehe z.B. Lee at al. (1978) Methods in Enzymology LVII: 226–234], kann auch zu bakteriellen Biolumineszenzreaktionen hinzugefügt werden, um eine Verschiebung in der Farbe zu bewirken.
6. Andere Systeme
a. Dinoflagellate Biolumineszenz erzeugende Systeme
In Dinoflagellaten vollzieht sich Biolumineszenz in Organellen, die als Scintillone bezeichnet werden. Diese Organellen sind Ausstülpungen des Zytoplasmas in die Zellvacuole. Die Scintillone enthalten nur Dinoflagellaten-Luciferase und Luciferin [mit seinem bindenden Protein], andere cytoplasmatische Komponenten werden auf irgendeine Weise ausgeschlossen. Das Dinoflagellaten-Luciferin ist ein Tetrapyrrol, welches mit dem Chlorophyll verwandt ist:
oder ein Analogon hiervon.
Die Luciferase ist ein 135 kD einzelkettiges Protein, das bei pH-Wert 6,5 aktiv ist, aber inaktiv bei pH-Wert 8 [siehe z.B. Hastings (1981) Bioluminescence and Chemiluminescence, DeLuca et al., Hrsg. Academic Press NY, Seiten 343–360]. Lumineszente Aktivität kann in Extrakten, die bei pH 8 hergestellt wurden, durch Verschieben des pH von 8 nach 6 erhalten werden. Dies geschieht in löslichen und partikulären Fraktionen. Innerhalb des intakten Scintillons findet der lumineszente Blitz für etwa 100 ms statt, welches der Dauer des Blitzes in vivo entspricht. In Lösung sind die Kinetiken von der Verdünnung abhängig, wie in jeder enzymatischen Reaktion. Bei pH 8 ist das Luciferin an ein Protein gebunden [Luciferin-bindendes Protein], welches die Reaktion des Luciferins mit der Luciferase verhindert. Bei pH 6 wird Luciferin jedoch freigesetzt und ist frei, um mit dem Enzym zu reagieren.
b. Systeme aus Mollusken, wie z.B. Latia und Pholas
Die Mollusken Latia neritoides und Arten von Pholas sind biolumineszente Tiere. Das Luciferin besitzt die Struktur:
und ist sythetisiert worden [siehe z.B. Shimomura et al. (1968) Biochemistry 7: 1734–1738; Shimomura et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 69: 2086–2089]. Zusätzlich zu einer Luciferase und Luciferin besitzt die Reaktion eine dritte Komponente, ein „purpurnes Protein". Die Reaktion, welche durch ein exogenes reduzierendes Mittel initiiert werden kann, wird durch das folgende Schema dargestellt:
XH₂ ist ein reduzierendes Mittel.
Deshalb wird für die Ausübung hierin die Reaktion das purpune Protein genauso wie ein reduzierendes Mittel erfordern.
c. Regenwürmer und andere Anneliden
Regenwürmerarten, wie zum Beispiel Diplocardia longa, Chaetopterus und Harmothoe, zeigen Biolumineszenz. Das Luciferin besitzt die Struktur:
Die Reaktion erfordert Wasserstoffperoxid zusätzlich zu Luciferin und Luciferase. Die Luciferase ist ein Photoprotein.
d. Glühwürmer
Das Luciferase/Luciferin-System aus den Glühwürmern, die in neuseeländischen Höhlen, Australien und denen die in Großbritannien gefunden werden, sind auch für die Verwendung hierin vorgesehen.
e. Meerespolycheate Wurmsysteme
Meerespolycheate Wurm Biolumineszenz erzeugende Systeme, wie zum Beispiel Phyxotrix und Chaetopterus, werden auch für die Verwendung hierin in Erwägung gezogen.
f. Südamerikanischer Railway Beetle
Das Biolumineszenz erzeugende System aus dem südamerikanischen Railway Beetle (phengodes hieronymi) ist auch für die Verwendung hierin vorgesehen.
g. Fisch
Von Interesse hierin sind Luciferasen und Biolumineszenz erzeugende Systeme, die rotes Licht erzeugen. Diese schließen Luciferasen ein, die in den Arten von Aristostomias, wie zum Beispiel A. scintillans [siehe z.B. O'Day et al. (1974) Vision Res. 14: 545–550], Pachystomias, Malacosteus, wie zum Beispiel M. niger, gefunden werden.
7. Fluoreszierende Proteine
a. Grün und blau fluoreszierende Proteine
Wie hierin beschrieben, wird blaues Licht durch die Verwendung von Renilla Luciferase oder dem Aequorea Photoprotein in der Anwesenheit von Ca²⁺ und dem Coelenterazin-Luciferin oder Analoga hiervon erzeugt. Dieses Licht kann in eine grünes Licht umgewandelt werden, wenn ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) der Reaktion hinzugefügt wird. Grün fluoreszierende Proteine, welche aufgereinigt [siehe z.B. Prasher et al. (1992) Gene 111: 229–233] und auch kloniert wurden [siehe z.B. Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 95/07463, welche auf der US-Anmeldung Serien-Nr. 08/119,678 und US-Anmeldung Serien-Nr. 08/192,274 basiert], werden von Cnidaria als Energietransferakzeptoren verwendet. GFPs fluoreszieren in vivo nach der Aufnahme von Energie von einem Luciferase-Oxyluciferin-Komplex im angeregten Zustand oder einem Ca²⁺ aktivierten Photoprotein. Der Chromophor ist modifiziert Aminosäurereste innerhalb des Polypeptids. Die am besten charakterisierten GFPs sind die aus Aequorea und Renilla [siehe z.B. Prasher et al. (1992) Gene 111: 229–233; Hart et al. (1979) Biochemistry 18: 2204–2210]. Zum Beispiel enthält ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) aus Aequorea victoria 238 Aminosäuren, absorbiert blaues Licht und emittiert grünes Licht. Daher kann die Einbeziehung dieses Proteins in eine Zusammensetzung, die das Aequorin-Photoprotein, angereichert mit Coelenterazin und Sauerstoff, enthält, in Anwesenheit von Calcium zur Erzeugung von grünem Licht führen. Daher wird es in Betracht gezogen, dass GFPs in die Biolumineszenz erzeugenden Reaktionen mit eingeschlossen werden können, die Aequorin- oder Renilla-Luciferasen oder andere geeignete Luciferasen verwenden, um die Farbe der resultierenden Biolumineszenz zu verstärken oder zu verändern.
GFPs werden durch blaues Licht aktiviert, um grünes Licht zu emittieren und können daher in der Abwesenheit von Luciferasen und in Verbindung mit einer externen Lichtquelle als neues Element, wie hierin beschrieben, benutzt werden. Auf die gleiche Weise können blau fluoreszierende Proteine (BFPs), wie zum Beispiel aus Vibrio fischeri, Vibrio harveyi oder Photobacetrium phosphoreum in Verbindung mit einer externen Lichtquelle von geeigneter Wellenlänge verwendet werden, um blaues Licht zu erzeugen (siehe z.B. Karatani et al., „A blue fluorescent protein from a yellowemitting luminous bacterium", Photochem. Photobiol. 55(2): 293–299 (1992); Lee et al. „Purification of a blue-fluorescent protein from the bioluminescent bacterium Photobacterium phosphoreum" Methods Enzymol. (Biolumin. Chemilumin.) 57: 226–234 (1978) und Gast et al. „Separation of a blue fluorescence protein from bacterial luciferase" Biochem. Biophys. Res. Commun. 80(1): 14–21 (1978)). GFPs und/oder BFPs oder andere solche fluoreszierende Proteine können insbesondere in den Verfahren, die hierin zur Verfügung gestellt werden, verwendet werden zur Detektion von infektiösen Mitteln durch Bindung eines Analyten an einen oder mehrere Antiligand-GFP-Konjugat(e) an einer Vielzahl von Stellen und Erleuchten des Chips mit Licht einer geeigneten Wellenlänge, um das Fluoreszenzprotein zum fluoreszieren zu bringen, wobei die emittierte Fluoreszenz durch die Photodioden in dem Chip detektiert wird.
GFPs und/oder BFPs oder andere solche fluoreszierende Proteine können in Verbindung mit einem jeglichen der Chips oder Vorrichtungen, wie hierin beschrieben, verwendet werden. Diese fluoreszierenden Proteine können auch allein oder in Kombination mit Biolumineszenz erzeugenden Systemen verwendet werden, um eine Reihe an Farben herzustellen. Sie können in Kombinationen verwendet werden, so dass zum Beispiel die Farbe des emittierten Lichts abgeändert werden kann, um die Menge an Licht, welches für die Detektion durch die Photodioden auf dem Chip verfügbar ist, zu maximieren.
b. Phycobiliproteine
Phycobiliproteine sind wasserlösliche, fluoreszierende Proteine, abgeleitet von Cyanobakterien und eukaryotischen Algen [siehe z.B. Apt et al. (1995) J. Mol. Biol. 238: 79–96; Glazer (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36: 173–198; und Fairchild et al. (1994) J. of Biol. Chem. 269: 8686–8694]. Diese Proteine sind als Fluoreszenzmarkierung in Immunountersuchungen verwendet worden [siehe Kronick (1986) J. of Immunolog. Meth. 92: 1–13], die Proteine sind isoliert worden und DNA, welche sie kodiert, ist auch verfügbar [siehe z.B. Pilot et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 81: 6983–6987: Lui et al. (1993) Plant Physiol 103: 293–294; und Houmard et al. (1988) J. Bacteriol. 170: 5512–5521; die Proteine sind kommerziell erhältlich, zum Beispiel von ProZyme, Inc. San Leandro, CA].
In diesen Organismen sind die Phycobiliproteine in subzellulären Strukturen, die Phycobilisome genannt werden, angeordnet und wirken als zusätzliche Pigmente, die an den photosynthetischen Reaktionen durch die Absorption von sichtbarem Licht und Übertrag der erlangten Energie an Chlorophyll durch einen direkten Fluoreszenzenergietransfer-Mechanismus beteiligt sind.
Zwei Klassen von Phycobiliproteinen sind bezogen auf ihre Farbe bekannt: Phycoerythrine (rot) und Phycocyanine (blau), welche beschriebene Absorptionsmaxima zwischen 490 und 570 nm bzw. zwischen 610 und 665 nm besitzen. Phycoerythrine und Phycocyanine sind heterogene Komplexe, zusammengesetzt aus verschiedenen Verhältnissen von alpha- und beta-Monomeren, an welche eine oder mehrere Gruppen von linearen Tetrapyrrolchromophoren kovalent gebunden sind. Bestimmte Phycobiliproteine können auch eine dritte γ-Untereinheit enthalten, welche oft mit (αβ)₆ Aggregatproteinen assoziiert ist.
Alle Phycobiliproteine enthalten Phycothrombilin oder Phycoerythobilin Chromophore und können auch andere Biline enthalten, wie zum Beispiel Phycourobilin, Cryptoviolin oder ein 697 nm Bilin. Die γ-Untereinheit ist kovalent gebunden mit Phycourobilin, was sich in dem 495–500 nm Absorptionspeak von B- und R-Phycoerythrine widerspiegelt. Daher können die spektralen Eigenschaften von Phycobiliproteinen durch die Kombination von verschiednenen Chromophoren, die Zusammensetzung der Untereinheiten der Apo-Phycobiliproteine und/oder die örtliche Umgebung, die auf die Tertiär- und Quartärstruktur der Phycobiliproteine einwirkt, beeinflusst werden.
Wie oben für GFPs und BFPs beschrieben, können auch Phycobiliproteine durch sichtbares Licht der geeigneten Wellenlänge aktiviert werden und können deshalb in der Abwesenheit einer Luciferase und in Verbindung mit einer externen Lichtquelle verwendet werden, um das Phycobiliprotein, welches an den Chip an Stellen gebunden ist, wo ein Analyt detektiert worden ist, zu erleuchten. Insbesondere können Phycobiliproteine kovalent an einen oder mehrere Antiliganden spezifisch für die die Zielstruktur gerichteten Analyten gebunden werden und erleuchtet werden mit Licht einer geeigneten Wellenlänge, um das fluoreszente Protein zu veranlassen, zu fluoreszieren, und die Fluoreszenz wird gemessen durch die Photodioden auf dem Chip an der Stelle auf dem Array. Die Datensignale werden an einen Computerprozessor gesendet und analysiert. Wie oben bemerkt, können diese Proteine in Kombination mit anderen fluoreszenten Proteinen und/oder Biolumineszenz erzeugenden Systemen verwendet werden, um eine Reihe von Farben zu erzeugen oder um verschiedene Farben über eine Zeit, die durch die Photodioden des Chip detektiert werden kann, zu liefern.
Die Befestigung von Phycobiliproteinen an feste Trägermatrizen ist bekannt (z.B. siehe US-Patente Nrn. 4,714,682; 4,767,206; 4,774,189 und 4,867,908). Deshalb können Phycobiliproteine an Mikroträger gekoppelt werden, gekoppelt an eine oder mehrere Komponenten der biolumineszenten Reaktion, vorzugsweise eine Luciferase, um die Wellenlänge des Lichts erzeugt durch die biolumineszente Reaktion umzuformen. Mikroträger, gekoppelt an ein oder mehrere Phycobiliproteine, können verwendet werden, wenn sie mit dem Antiliganden oder irgenetwas der Chips, welche in den Verfahren hierin verwendet werden, verknüpft sind.
C. Bauweise, Fabrikation und Verwendung von Chips
Chips zur Verwendung als diagnostische Vorrichtungen werden hierin bereitgestellt. Die Chips können nicht selbstansteuerbar oder selbstansteuerbar und sind typischerweise in der Form eines Arrays, wie zum Beispiel ein 96-Element oder höherer Dichte Array oder jeder von denen, die hierin beschrieben sind.
1. Nicht selbstansteuerbare Chips
Bezugnehmend auf 1, eine nicht selbstansteuerbare mikroelektronische Vorrichtung 100 zur Detektion und Identifikation von Analyten in einer biologischen Probe unter Verwendung von Biolumineszenz schließt einen Ansteuerregelkreis 102, einen Photodetektorarray 104, einen analogen Mehrfachkoppler 106, einen Vergleicher 108, einen Referenzschaltkreis 110, eine Rückkopplungskontrollschaltung 112 und eine Ausgangskontrollschaltung 114 ein. Ansteuerregelkreis 102 erhält ein Takteingabesignal 116 von einem externen Oszillator und Ausgangskontrollschaltung 114 erzeugt Augabedatensignale 118. Vorrichtung 100 schließt auch die elektrischen Anschlüsse 120 und 122 zum Empfangen elektrischer Leistung bzw. zur Erdung von einer externen Stromquelle (z.B. ein Wechselstrom-Gleichstrom-Wandler) ein. Daher benötigt Vorrichtung 100 nur vier elektrische Anschlüsse: Takteingabesignal 116; Datenausgabesignale 118; Leistung 120 und Erdung 122.
Ansteuerregelkreis 102 erhält ein Takteingabesignal 116 und erzeugt in Antwort darauf Ansteuersignale auf den Bussen 124–128, welche nacheinander folgend jedes Pixelelement innerhalb des Arrays 104 ansteuern. Jedes Pixelelement hat eine Zeilen- und eine Spaltenadresse, welche verwendet werden um das Pixel anzusteuern. Ansteuerregelkreis 102 steuert nacheinander folgend jede Reihe von Pixelelementen innerhalb des Arrays 104 unter Verwendung Reihen-Ansteuersignalen, die auf Bus 124 angelegt sind, an. Für jede Reihe erzeugt Ansteuerregelkreis 102 Ansteuersignale auf Bus 126, die durch einen analogen Mehrfachkoppler 106 als Wahlsignale verwendet werden, und er erzeugt auch Ansteuersignale auf Bus 128, die durch die Rückkopplungskontrollschaltung 112 verwendet werden, um Rückkopplungssignale für die Pixelemente wie unten beschrieben zu erzeugen. Ansteuerregelkreis 102 erzeugt binäre Ansteuersignale dekodiert in einzelne Reihen- und Spalten-Ansteuerfreigabesignale durch eine oder mehrere Ansteuerdekodierschaltungen, welche sich Ansteuerregelkreis 102, Array 104, Mehrfachkoppler 106 und/oder Rückkopplungskontrollschaltung 112 befinden. Das Ansteuern eines Arrays in elektronischen Schaltungen ist dem Fachmann wohlbekannt.
Array 104 erhält Reihen-Ansteuersignale 124 von Ansteuerregelkreis 102 und Rückkopplungssignale 130 von Rückkopplungskontrollschaltung 112. Jedes Element in Array 104 schließt einen Photodetektor ein, der Lichtphotonen von einer chemischen Reaktion, die optisch mit dem Photodetektor gekoppelt ist, erhält. Basierend auf diesen Eingaben erzeugt Array 104 analoge Spalten-Ausgabesignale 132, die an einem analogen Mehrfachkoppler 106 angelegt werden. Array 104 verwendet Reihen-Ansteuersignale 124, um jede Reihe von Pixelelementen anzusteuern, verwendet Rückkoplungssignale 130, wenn er eine delta-sigma analog zu digital (A/D) Konversion an jedem Pixelelement, wie unten beschrieben, durchführt und erzeugt Spaltenausgabesignale 132, die auch in der delta-sigma A/D Konversion verwendet werden.
Analog Mehrfachkoppler 106 verwendet Ansteuersignale 126, um die Spaltenausgabesignale 132 in gebündelte analoge Ausgabesignale 134 zu bündeln. Vergleicher 108 vergleicht die gebündelten Ausgabesignale 134 mit einem Referenzsignal 136 (z.B. einem Referenzstrom), erzeugt durch eine Referenzschaltung 110 und erzeugt basierend auf den Ergebnissen des Vergleichs quantisierte Ausgabesignale 138. Quantisierte Ausgabesignale 138 und Ansteuersignale 128 werden durch Rückkopplungskontrollschaltung 112 verwendet, um Rückkopplungssignale 130 zu erzeugen, die wie unten beschrieben auf Array 104 angelegt werden. Quantisierte Ausgabesignale 138, die indikativ für Lichtphotonen sind, die an jedem Element in Array 104 detektiert werden, werden auch durch die Ausgangskontrollschaltung 114 verwendet, um Ausgabedatensignale 118 zu erzeugen.
In einer Ausführungsform formatiert Ausgangskontrollschaltung 114 quantisierte Ausgabensignale 138 in einen RS-232 seriellen Datenstrom, indikativ für das Licht, welches an an jedem Pixelelement in Array 104 detektiert wird. Um einem externen Instrument oder Computer zu erlauben den erhaltenen RS-232 seriellen Datenstrom mit bestimmten Pixelelementen in Array 104 zu korrelieren, überträgt die Ausgangskontrollschaltung 114 den seriellen Datenstrom in Frames, die durch ein Synchronisierungssignal (sync) getrennt sind. Jeder Frame enthält ein Ausgabedatensignal für jedes Pixelelement in Array 104 und das sync-Signal ist ein willkürlicher Wert (z.B. ein Byte, welches einen Wert von dezimal 255 besitzt), der als Kontrollsignal verwendet wird, um den Beginn jedes Datenframes zu anzuzeigen. Der externe Computer wartet auf das sync-Signal bevor er die empfangenen Frame-Daten mit den entsprechenden Pixelelementen in Array 104 korreliert. Alternativ kann die Ausgangskontrollschaltung 114 Kennungen in den seriellen Datenstrom, der die Pixelelemente identifiziert, einfügen. Eine parallele Daten-Schnistelle kann auch verwendet werden.
Wie es aus der Beschreibung weiter unten klar werden wird, schließt Array 104 Pixelelemente ein, die bei einem Array von Mikrostellen auf der Oberfläche des Halbleitersubstrats, welches für Vorrichtung 100 verwendet wird, lokalisiert sind, ein. Jedes Element schließt einen Photodetektor zum Empfang von Lichtphotonen, die bei einer chemischen Reaktion emittiert werden, optisch gekoppelt an der entsprechenden Mikrostelle und zum Umwandeln der empfangenen Photonen in eine elektrische Ladung ein. Jedes Element schließt auch eine Pixel-Elementarzellen-Schaltung mit einem kapazitiven Schaltkreis zum Integrieren der elektrischen Ladung ein. Die integrierte Ladung wird unter Verwendung von delta-sigma A/D-Konversionstechniken quantisiert und das digitalisierte Signal wird in einen seriellen Datenausgabestrom gebündelt, welcher an einen externen Computer angeschlossen ist. Der Computer führt ein Kontrollprogramm aus, um das delta-sigma digitale Signal über einen gewünschten Integrationszeitraum, der abhängig von der Auflösung von Sekunden bis zu Stunden reicht, zu integrieren. In einer Ausführungsform ist die delta-sigma A/D Konversion getaktet für eine 56 kBaud Schnittstelle, um eine 12-Bit Auflösung in einem Integrationszeitspanne von etwa 10 Sekunden und eine 16-Bit Auflösung in einer Zeitspanne von etwa 3 Minuten zu erreichen.
Bezugnehmend auf 2 schließt Vorrichtung 100 ein Halbleitersubstrat oder ein Plättchen 140 ein, besitzend Array 104, festgelegt auf einer Oberfläche hiervon. Array 104 schließt einen Array von Mikrostellen 142 und einen unabhängigen Photodetektor 144, optisch gekoppelt mit jeder Mikrostelle, ein. (Zur Übersichtlichkeit sind nur die Mikrostelle 142 und der Photodetektor 144 in jeder Reihe ganz links in 2 benannt.) Array 104 schließt drei sub-Arrays 146, 148 und 150 ein, die drei verschiedene Größen von Mikrostellen 142 besitzen. Sub-Array 146 schließt ein 4 × 16 Array von 50 Quadratmikrometer Pixel ein, sub-Array 148 schließt ein 2 × 8 Array von 100 Quadratmikrometer Pixel ein und sub-Array 150 schließt ein 1 × 4 Array von 200 Quadratmikrometer Pixel ein. Die Photodetektoren 144 befinden sich auf einem Anteil der Oberfläche von Plättchen 140 an jeder Mikrostelle 142. Der Anteil, der vom Photodetektor 144 eingenommen wird, schließt etwa 90% der Oberfläche für größere Pixelelemente und etwa 50% für kleinere Pixelelemente ein. In einer Ausführungsform sind die Photodetektoren 144 Siliziumphotodioden, die Lichtphotonen, die auf ihre Oberfläche treffen, in einen Photostrom umwandeln. Der Quantenwirkungsgrad dieser Umwandlung liegt für eine Wellenlänge von 500–800 nm bei etwa 40% (d.h. ein Photostrom von 40 Elektronen wird für jede erhaltenen 100 Lichtphotonen erzeugt). Die Photodioden 144 können daher niedrige Photonenlevel in meßbare Signale umwandeln. Die Oberfläche von Substrat 140 hat eine leichte Senke (z.B. 1 Mikrometer) an jeder Mikrostelle 142, um das Aufnehmen der fluiden Probe, die der Vorrichtung 100 zugeführt wurde, zu unterstützen.
Array 104 ist auf einem relativ kleinen Plättchen 140 (z.B. 2.4 × 2.4 mm) ausgestaltet, um eine preiswerte Herstellung von Vorrichtung 100 zu erlauben. Plättchen 140 besitzt auch das elektronische Schaltschema von Vorrichtung 100, welches darauf ausgestaltet ist (nicht gezeigt in 2) und der äußere Umfang von Plättchen 140 schließt Verbindungsfelder 152 ein, die es durch Spuren, welche auf dem Plättchen ausgestaltet sind, mit dem elektronischen Schaltschema verbinden. Die Felder 152 sind durch Bonddrähte oder andere Leitungen mit externen Anschlüssen oder Leitungen der mikroelektronischen Baugruppe für das Plättchen 140, wie in 3 gezeigt, verbunden. Feld 152 schließt Felder für das Takteingabesignal 116, Datenausgabesignal 118, elektrische Leistung 120, Erdung 122 und verschiedene Testsignale je nach Wunsch ein. In einer Ausführungsform ist die mikroelektronische Vorrichtung 100 eine integrierte Schaltvorrichtung, welche unter Verwendung eines marktgängigen CMOS Verfahrens, welches dem Fachmann wohlbekannt ist, hergestellt wird.
Die größeren Pixelelemente (z.B. 200 um) in Array 104 besitzen eine höhere Empfindlichkeit, um niedrigere Konzentrationen an Analyten zu detektieren als die kleineren Pixelelemente (z.B. 50 um), da eine größere Zahl von Rezeptorantikörpern an ihren größeren Oberflächen gebunden werden kann, so dass wie hierin erklärt mehr Lichtphotonen emittiert werden, wenn eine chemische Reaktion an der entsprechenden Mikrostelle stattfindet. Die kleineren Pixel können verwendet werden, um eine größere Matrix auf einer gegebenen Plättchengröße zu bilden, um es zu erlauben, eine größere Anzahl von Untersuchungen gleichzeitig durchzuführen. Die optimale Pixelgröße zur Detektion eines bestimmten Analyten kann empirisch bestimmt werden. Die Verwendung von verschieden großen Pixelelementen auf Vorrichtung 100 hat zwei Vorteile. Erstens können größere Pixelelemente verwendet werden, um Analyten zu detektieren, die höhere Empfindlichkeiten erfordern, während kleinere Pixelelemente verwendet werden können, um die Zahl der Pixelelemente in der Matrix für Analyten, welche niedrigere Empfindlichkeiten besitzen, zu erhöhen. Zweitens können verschiedene Größen verwendet werden, um zu helfen die optimale Größe für einen bestimmten Analyten durch empirisches Testen zu bestimmen, wobei die optimale Größe in anderen Ausführungsformen von Array 104 verwendet wird.
Alternative Anordnungen von Array 104 werden dem Durchschnittsfachmann ersichtlich werden. Zum Beispiel kann Array 104 Subarrays von Pixelelementen einschließen, die unterschiedliche Größen besitzen (wie in 2), oder einen Array, der nur eine einzige Pixelgröße besitzt (z.B. ein 12 × 16 Array von 50 Mikrometerpixel). Die Größe von jedem Pixel (z.B. 50, 100, 200 Mikrometer in 2) kann abgewandelt werden (z.B. ein 400 Mikrometerpixel kann verwendet werden). Auch die Anzahl der Pixel in dem Array oder Subarray (z.B. 4 × 16, 2 × 8 oder 1 × 16 in 2) kann geändert werden, um einen n × m Array oder einen Subarray, der n Zeilen und m Spalten, mit n und m gleich ganzen Zahlen, einzuschließen. Ferner können Formen anders als Quadrate für jedes Pixelelement verwendet werden (z.B. Rechtecke oder Kreise). Die Größe des Plättchens 140 kann abgeändert werden, um die verschiedenen Anordnungen von Array 104 aufzunehmen, obgleich die Verwendung eines größeren Plättchens die Kosten der Vorrichtung 100 steigern kann. Plättchen 140 kann auch mehrere oder weniger Verbindungsfelder 152 einschließen, vorausgesetzt es gibt getrennte Anschlußfelder für Takteingabesignal 116, Augabedatensignale 118, elektrische Leistung 120 und Erdung 122 (1).
Bezugnehmend auf die 3 und 3A, ist Plättchen 140 in einer keramischen Doppelreihenbaugruppe (engl. dual in-line package; DIP) 154 mit 40 Kontaktstiften oder Leitstiften 156 verpackt. Vier Kontaktstifte 156 sind bestimmt für Takteingabesignal 116, Augabedatensignale 118, elektrische Leistung 120 und Erdung 122. Die anderen Kontaktstifte 156 werden für Testsignale verwendet. Andere mikroelektronische Baugruppen können auch verwendet werden, wie zum Beispiel Plastik-Baugruppen, die mehrere oder weniger stromführende Verbindungen besitzen, einschließlich der vier erforderlichen stromführenden Leitungen.
Baugruppe 154 besitzt eine Decklage 158, welche eine obere Fläche 160, eine mittlere Schicht 162, welche eine obere Fläche 164 besitzt, und eine untere Schicht 166, welche eine obere Fläche 168 besitzt. Die Schichten 158 und 162 sind aus einem nicht-leitfähigem Dielektrikum (z.B. Keramik) hergestellt und die untere Schicht 166 bildet eine leitfähige Erdungsplatte 170, die elektrisch mit dem Kontaktstift für die Erdung 156 der Baugruppe 154 gekoppelt ist. Die obere Fläche 160 der Decklage 158 besitzt einen ersten quadratischen Durchbruch 172, der darin gestaltet ist. Eine Erdleiterspur 174, ausgestaltet auf der oberen Fläche 160, umgibt den Durchbruch 172 und ist elektrisch zum Boden gekoppelt durch eine Erdungsspur 176, die auch auf der oberen Fläche 160 ausgestaltet ist und die durch eine Öffnung 180, welche in dem äußeren Umfang der Baugruppe 154 ausgestaltet ist, durchtritt und an die Erdungsplatte 170 anschließt. Durchbruch 172 legt einen quadratischen Teil der mittleren Schicht 162 offen, welche einen zweiten quadratischen Durchbruch 182 besitzt, der darin gestaltet ist. Die Abmessungen des zweiten Durchbruchs 182 sind kleiner als die Abmessungen des ersten Durchbruchs 172, so dass ein Teil der oberen Fläche 164 der mittleren Schicht 162 vom Oberteil der Baugruppe 154 aus sichtbar ist. Der sichtbare Teil der oberen Fläche 164 besitzt darauf ausgestaltete leitfähige Felder 184, die es durch Spuren mit den Kontaktstiften 156 der Baugruppe 154 (nur teilweise gezeigt), die zwischen den Schichten 158 und 162 durchlaufen, elektrisch verbinden. Durchbruch 182 legt einen quadratischen Teil der Erdungsplatte 170 offen, die Plättchen 140, welches daran durch geeignete Haftmittel 186 befestigt ist, hat. Jedes Verbindungsfeld 152 des Plättchens 140 ist durch einen Bond-Draht 188 elektrisch verbunden mit einem leitfähigen Feld 184. Die Bond-Drähte 188 sind beschichtet mit einem Material (z.B. Epoxydharz), welches undurchlässig für die zu analysierende fluide Probe ist. Die anderen leitfähigen Komponenten der Baugruppe 154, ausser den Kontaktstiften 156, können auch mit dem Material beschichtet sein, um einen direkten Kontakt mit der fluiden Probe zu verhindern. Die Kontaktstifte 156 der Baugruppe 154 sind nicht beschichtet mit dem Material, so dass die Kontaktstifte 156 einen elektrischen Kontakt mit einem externen Computer oder Instrument herstellen werden, wenn die Baugruppe 154 dadurch ausgelesen wird.
Wenn eine Untersuchung durchgeführt wird, wird die zu analysierende fluide Probe durch die Durchbrüche 172 und 182 zu der Oberfläche des Plättchens 140 (und den darauf gestalteten Mikrostellen 142), enthalten in der Baugruppe 154, zugeführt. Die fluide Probe kann durch Pipettieren der fluiden Probe in die Testvertiefung, die durch die Durchbrüche 172 und 182 gestaltet ist oder einfach durch Eintauchen der Baugruppe 154 in einen Behälter (nicht gezeigt), der mit der Probe gefüllt ist, zugeführt werden. Die elektrischen Komponenten der Vorrichtung 100 sind vor der Probe durch die Materialien der Baugruppe 154 selbst oder durch die Epoxydharzbeschichtung geschützt. Nachdem die fluide Probe zugeführt ist, werden die verbleibenden Komponenten, die benötigt werden, um die lichtemittierenden Reaktionen auszulösen, die mit den Mikrostellen 142 optisch gekoppelt sind, auch durch die Durchbrüche 172 und 182 der Oberfläche des Plättchens 140 zugeführt. Die sich ergebenden lichtemittierenden Reaktionen werden dann, wie unten in Verbindung mit 4 beschrieben, durch die Photodetektoren 144 detektiert.
Bezugnehmend auf 4 schließt der Photodetektor 144 jedes Pixelelements in Array 104 eine Pixel-Elementarzellen-Schaltung 200 ein, die damit assoziiert ist. Jeder Photodetektor 144 ist vorzugsweise eine Photodiode, die als Antwort auf Lichtphotonen 202, die auf ihre Oberfläche stoßen, abgetastete Signale erzeugt (z.B. Photoströme). Jede Pixel-Elementarzellen-Schaltung 200 integriert dieses abgetastete Signal und quantisiert das integrierte Signal unter Verwendung von delta-sigma A/D Konversionstechniken. Schaltung 200 schließt fünf MOSFET Transistoren T₁–T₅, die durch die Ziffern 204–212 bezeichnet werden, ein, wobei jeder einen Gate-Anschluß G, einen Source-Anschluß S (mit einem Pfeil der in Richtung der Oxidschicht weist), einen Drain-Anschluß D und einen Basis-Anschluß (unbenannt) besitzt. An Transistor T₁ ist dessen Gate G mit einem Reihe freigebenden Eingabesignal R_en, bezeichnet mit 214, verbunden, dessen Source S ist verbunden mit einer Netzspannung V_DD und dessen Drain ist verbunden mit Source S von T₂. An Transistor T₂ ist dessen Gate G mit einem Rückkopplung freigebenden Signal F_en, bezeichnet mit 216, verbunden, dessen Source S ist verbunden mit Drain D von T₁, und Drain D ist verbunden mit Source S von T₃ an Leitungsknoten 3. An Transistor T₃ ist dessen Gate G mit einem weiteren Reihe freigebenden Eingabesignal R_en1, bezeichnet mit 218, verbunden, dessen Source S ist verbunden mit Leitungsknoten 3 und Drain D ist verbunden mit Gate G von T₄ an Leitungsknoten 1. Die Kathode der Photodiode 144 ist auch mit Leitungsknoten 1 verbunden und ihre Anode ist mit der Erdung verbunden. An Transistor T₄ ist dessen Gate G mit Leitungsknoten 1 verbunden, Source S ist verbunden mit V_DD und Drain D ist verbunden mit Source S von T₅ an Leitungsknoten 2. An Transistor T₅ ist dessen Gate G verbunden mit R_en (214), dessen Source S ist verbunden mit Leitungsknoten 2 und dessen Drain D ist verbunden mit der Ausgangsklemme 220. Die Basis jedes Transistors T₁–T₅ ist mit V_DD verknüpft. Transistor T₂ verwendet eine zweite Schicht Polysilizium für sein Gate G, um einen etwas kleineren Abstand zwischen den Transistoren zu erlauben, während die Transistoren T₁ und T₃–T₅ nur eine erste Schicht Polysilizium verwenden.
Der Stromfluß durch die Photodiode 144 ist mit I_D bezeichnet und schließt zwei Komponenten ein. Die erste Komponente ist ein Fehlerstrom, der durch die Photodiode 144 fließt und der einen konstanten Wert hat. Die zweite Komponente ist der Stromfluß, verursacht durch Photonen 202, die wegen der lichtemittierenden chemischen Reaktion, wenn eine stattfindet, auf die Photodiode 144, die optisch gekoppelt mit der entsprechenden Mikrostelle 142 ist, treffen – unter Berücksichtigung des Quantenwirkungsgrads der Photodiode. Strom I_D entlädt Leitungsknoten 1 in Richtung Erdung mit einer Geschwindigkeit, die vom Fehlerstrom und der Zahl der Photonen, die auf die Photodiode 144 treffen, abhängt. Leitungsknoten 1 wird relativ schnell entladen werden, wenn eine große Menge an Licht erhalten wird, und relativ langsam, wenn wenig oder kein Licht vorhanden ist. Auch wenn kein Licht vorhanden ist, wird Leitungsknoten 1 wegen der Fehler-Komponente von I_D noch immer entladen. Die Photostromkomponente von I_D kann von der Fehlerstromkomponente vereinzelt werden durch Aufnahme von Messungen im Dunkeln, wenn die lichtemittierenden Reaktionen nicht stattfinden, Aufnahme von Testmessungen, wenn die Reaktionen stattfinden und korregieren der Testmessungen unter Verwendung der Messungen im Dunkeln (d.h. durch Subtraktion der Messungen im Dunkeln von den Testmessungen). Die Messungen im Dunkeln können entweder bevor, nachdem, oder beides bevor und nachdem der tatsächliche Test stattfindet, aufgenommen werden.
Für einen Augenblick auf 1 zurückverweisend, die Ausgangsströme, die von der Ausgangsklemme 220 fließen, bezeichnet mit I_OUT, sind die Spalten-Ausgabesignale 132, die durch den analogen Mehrfachkoppler 106 gebündelt werden, um eine gebündelt Ausgabesignale 134 bilden, die in Vergleicher 108 eingegeben werden. Vergleicher 108 hält I_OUT bei einer konstanten Spannung, da das abgetastete Signal ein Strom ist und erzeugt quantisierte Ausgabesignale 138, basierend auf Vergleichen zwischen den Signalen 134 und dem Referenzstrom 136.
Rückkopllungskontrollschaltung 112 erzeugt Rückkopplungssignale 130, die die aktivierenden Signale F_en (216) bilden, basierend auf den quantisierten Ausgabesignalen 138 und den Ansteuersignalen 128. F_en für jedes Pixelelement wird während dem Zeitraum erzeugt, wenn das nächste Pixelelement angesteuert wird. Wenn Ansteuerregelkreis 102 die nächste Reihe von Pixelelementen ansteuert, bewirkend, dass R_en (214) für diese Reihe angelegt wird, wird das die nächste Reihe aktivierende Signal R_en1 (218) auch angelegt für die vorhergehende Reihe von Pixelelementen unter Verwendung von Ansteuerdekodierungsschaltungen wie sie im Fach gut bekannt sind.
Zurückkehrend zu 4, Pixelelementarzellenschaltung 200 arbeitet wie folgt. Photonen 202, welche auf die Photodiode 144 auftreffen, erzeugen Strom I_D, der den Leitungsknoten 1 mit einer Geschwindigkeit abhängig von der Zahl der aufgenommenen Lichtphotonen, dem Quantenwirkungsgrad der Photodiode und dem konstanten Fehlerstrom entläd. Wenn das Pixelelement durch den Ansteuerregelkreis 102 angesteuert wird (d.h. R_en ist aktiviert), werden die Transistoren T₁ und T₅ freigegeben (d.h. werden leitfähig). Wenn T₅ leitfähig ist und Ausgangsklemme 220 bei einer konstanten Spannung weniger als V_DD durch den Vergleicher 108 gehalten wird, erzeugt Transistor T₄ einen Strom proportional zu der Differenz zwischen V_DD–V_T und der Spannung an Leitungsknoten 1. V_T ist die Transistorschwellenspannung (z.B. etwa 1 V). Dieser Strom fließt durch Transistor T₅ als I_OUT. Nach dem Durchlauf durch Mehrfachkoppler 106 wird I_OUT mit dem Referenzstrom 136 durch den Vergleicher 108, welcher einen Differenzstromverstärker umfasst, verglichen. Das quantisierte Ausgabesignal 138 wird durch den Vergleicher 108 zurück auf 0 gesetzt, wenn I_OUT geringer als der Referenzstrom 136 ist und wird 1 gesetzt, wenn I_OUT größer als der Referenzstrom 136 ist.
Wenn I_OUT geringer als der Referenzstrom 136 ist (d.h. das quantisierte Ausgabensignal 138 = 0), deaktiviert Rückkopplungskontrollschaltung 112 Rückkopplungssignal 130 (d.h. F_en = 0), um Transistor T₂ in einem nicht-leitfähigen Zustand zu halten. Daher ist die Spannung am Leitungsknoten 3 nicht betroffen und I_D fährt fort, Leitungsknoten 1 zu entladen. Wenn I_OUT Referenzstrom 136 überschreitet (d.h. quantisiertes Ausgabesignal 138 = 1), gibt die Rückkopplungskontrollschaltung 112 das Rückkopplungssignal 130 frei (d.h. F_en = 1), um T₂ zu schalten, während T₁ noch immer durch R_en aktiviert ist. Dies setzt die Kapazität (d.h. die inhärente Source und Drain zu der Volumen-Kapazität der MOFSET Transistoren) an Leitungsknoten 3 = V_DD. Es wird kein nennenswerter Spannungsabfall über T₁ oder T₂ stattfinden, da diese Transistoren in ihren linearen Bereichen angeschalten sind und kein Strom fließt. Wenn die nächste Reihe angesteuert wird (auslösend das R_en1 gleich 1 gesetzt wird), wird die Ladung an der Kapazitätsschaltung, transferiert zu Leitungsknoten 1, um die Spannung an Leitungsknoten 1 zu erhöhen. Daher wird die Kapazitätsschaltung auf eine anfängliche Ladung zurückgesetzt, wann immer I_OUT die Referenzspannung 136 übersteigt. Dieser Ladungsübertrag ist Standard in geschalteten Kondensatoren und ist dem Fachmann gut bekannt. Da I_D die Kapazität für einen Zeitraum entläd, bevor die Entladung von Leitungsknoten 1 ausreichend ist, um Vergleicher 108 zu aktivieren, integriert die Kapazität effektiv I_D, der durch Photodiode 144 fließt.
Nachdem sie auf ihren anfänglichen Wert zurückgesetzt wurde, wird die Kapazität an Leitungsknoten 1 wieder durch Photodiode 144 mit einer Geschwindigkeit abhängig von der Größe von I_D entladen bis I_OUT wieder die Referenzspannung 136 übersteigt, zu welcher Zeit Leitungsknoten 1 wieder aufgeladen wird. Daher wird Leitungsknoten 1 bei einer Spannung gehalten nahe dem Spannungswert, der für T₄ erforderlich ist, um Referenzstrom 136 zu erzeugen. Die Anzahl der Häufigkeit, mit der Vergleicher 108 den überschreitenden Referenzstrom 136 abtastet (d.h. „Vergleicher positive Übergänge") ist proportional zur Gesamtladung, die durch Photodiode 144 floss. Wie vorher ausgeführt, ist I_D die Summe des konstanten Fehlerstroms und des Stroms aufgrund der abgetasteten Photonen 202. Daher kann die Anzahl der Vergleicher positiven Übergänge über einen Zeitraum verwendet werden, um die emittierende Reaktion zu beschleunigen, nachdem die Zahl für den Fehlerstrom, welcher durch Photodiode 144 fließt, durch Subtraktion der Messungen im Dunkeln eingestellt ist. Quantisierte Ausgabensignale 138 werden, wie oben dargelegt, in einen RS-232 seriellen Datenstrom formatiert, welcher an einen externen Computer als Datenausgabensignale 118 übertragen wird.
Bezug nehmend auf 5 werden die Spannungen an Leitungspunkten 1, 2, und 3 während dem Betrieb von Vorrichtung 100 gezeigt. Die Spannungen an Leitungspunkten 1, 2 und 3 sind bezeichnet durch Kurven 222, 224 bzw. 226. Die x-Achse stellt die Zeit dar (ms) und die y-Achse stellt die Spannung (V) dar. Die Spannungen an den Leitungspunkten 1 und 3 sind im Wesentlichen gleich, während dem Großteil der abwärts fallenden Teile der Kurven 222, 226, und weichen ab wie in 5 gezeigt. Am Beginn eines jeden Turnus (d.h. bei jedem positiven Vergleicherübergang, der geschieht bei jeder großen Spannungsspitze an Leitungspunkt 3) wird die Spannung an Leitungspunkt 1 neu auf ihren anfänglichen Wert aufgeladen, wenn Leitungspunkt 3 gleich V_DD gesetzt wird. Dann wird Leitungspunkt 1 durch I_D entladen mit einer Geschwindigkeit abhängig von der Menge an Licht, die durch Photodiode 144 detektiert wird. Ein Ereignis, welches die Steigung der Kurve 222 vermindert, vollzieht sich, wenn Photodiode 144 eine relativ große Menge an Licht erhält, während eine allmähliche Abnahme der Steigung stattfindet, wenn die Photodiode 144 relativ wenig oder kein Licht erhält. Strom I_OUT, verursacht durch die Differenz zwischen V_DD–V_T und der Spannung an Leitungspunkt 1, wird verglichen mit Referenzsstrom 136, wenn immer das Pixel angesteuert wird (etwa jede 0,1 ms). Wenn I_OUT geringer als Referenzstrom 136 ist, integriert Schaltung 200 das abgetastete Signal von Photodiode 144 durch Fortfahren der Entladung von Leitungspunkt 1 und die Spannung an Leitungspunkt 1 sinkt wie durch Kurve 222 gezeigt. Wenn I_OUT die Referenzspannung 136 übersteigt, verursacht F_en, dass die Kapazität an Leitungpunkt 3 auf V_DD zurückgesetzt wird. Dann, wenn die nächste Reihe angesteuert wird (d.h. bewirkend das R_en1 festgelegt wird), wird die Ladung an dieser Kapazitätsschaltung auf Leitungspunkt 1 übertragen, dabei wird die Spannung an Leitungspunkt 1 erhöht. Der Turnus wiederholt sich während des Integrationszeitraums. Der externe Computer zählt die Anzahl der Vergleicher positiven Übergänge, die während des Integrationszeitraums stattfinden unter Verwendung des Ausgabedatensignals 118. Nachdem die Integration vollständig ist, korrigiert der Computer unter Berücksichtung des Fehlerstroms unter Verwendung der Messungen im Dunkeln. Die korrigierte Anzahl an Zählungen ist proportional zu der Konzentration des Analyten in der fluiden Probe.
Bezug nehmend auf 6 schließt ein System 300 zur Detektion und Identifizierung von Analyten in einer fluiden Probe unter Verwendung Licht emittierender Reaktionen eine Anschlussbaugruppenschaltung 302, einen Computer 304, eine Eingabevorrichtung 306 und eine Ausgabevorrichtung 308 ein. Das System 300 bildet ein Testinstrument. Die Baugruppe schließt einen Nullkraftsockel (engl. zero-insertion force, ZIF) ein (nicht gezeigt) zur Aufnahme von Vorrichtung 100, aufgenommen in Baugruppe 154, nachdem sie in die fluide Probe, welche zu analysieren ist, eingetaucht wurde und dann gegenüber den verbleibenden Komponenten der Licht emittierenden chemischen Reaktionen exponiert wurde. Baugruppe 302 schließt auch ein, eine Oszillatorschaltung 310 zur Erzeugung des Takteingabesignals 116 und einen Gleichstrom-Wechselstrom Netzanschluss 312 zur Aufnahme von Wechselstromleistung von einem externen Wechselstrom-Kraftanschluss 314 und zur Erzeugung eines Gleichstrom elektrischen Leistungssignals 120 davon. Ein RS-232 serielles Datenkabel 316 trägt die seriellen Datenausgabensignale 118 von Baugruppe 302 zu Computer 304.
Computer 304 schließt eine verarbeitende Schaltung 318, einen Datenspeicher 302 und eine serielle Eingabeschnittstelle 322 ein. Die verarbeitende Schaltung 318 schließt eine zentral verarbeitende Einheit, wie zum Beispiel einen Mikroprozessor oder einen Mikrokontroller ein, der die Eingabesignale 324 von einer Eingabevorrichtung 306 erhält, und die Ausgabensignal 326 zu einer Ausgabevorrichtung 308 über Eingabe/Ausgabe-Schnittstellenschaltungen überträgt (nicht gezeigt). Datenspeicher 320 schließt drei Speicherbereiche 328–332 ein, einschließlich flüchtiger und nicht flüchtiger Speicher. Speicherbereich 328 speichert das Kontrollprogramm, ausgeführt durch die verarbeitende Schaltung 318, und die festen und variablen Daten (wie z.B. Kalibrierungs- oder empirische Testdaten), welche während der Ausführung benötigt werden. Der optionale Speicherbereich 330 speichert ein Analytenabbild, welches durch die verarbeitende Schaltung 318 verwendet wird, um den bestimmten Analyten auf den an jeder Mikrostelle 142 in Array 104 getestet wird, zu identifizieren. Wenn das Abbild vorhanden ist, kann die verarbeitende Schaltung 318 programmiert werden, um Analyten, detektiert in der fluiden Probe, durch Korrelation der empfangenen Ausgabedatensignale 118 mit den Analyten, identifiziert in dem Abbild, zu identifizieren und um Ausgabesignale 326 zu erzeugen, um den detektierten Analyten an Ausgabevorrichtung 308 zu identifizieren. Speicherbereich 332 speichert einen Datenerfassungsarray, verwendet durch die weiterverarbeitende Schaltung 318, um die Vergleicher positiven Übergänge für jedes Pixelelement während des Integrationszeitraums anzusammeln. Die Zahl der Vergleicher positiven Übergänge, erhalten während dieser Periode, ist Indikativ für die Menge an Licht, welche durch den Photodetektor 144 an jedem Pixelelement erhalten wurde.
Eingabevorrichtung 306 schließt zum Beispiel eine Tastatur, eine Maus, einen Touchscreen oder eine andere Eingabevorrichtung zur Erzeugung von Eingabesignalen 324, die verwendet werden, um den Betrieb von System 300 zu kontrollieren, ein. Eingabesignale 324 von Vorrichtung 306 erlauben es dem Verwender zum Beispiel den Betrieb von System 300 zu starten und zu stoppen, Analytenabbilddaten einzugeben, einen gewünschten Integrationszeitraum einzugeben und jegliche anderen Daten oder Kommandos, welche von der verarbeitenden Schaltung 318 benötigt werden, um Analyten in der zu untersuchenden fluiden Probe zu detektierten und zu identifizieren, einzugeben. Die Eingabesignale 324 können auch verwendet werden, um den Computer 304 zu konfigurieren, eine spezielle Vorrichtung 100, welche eine vorbestimmte Anordnung von Array 104 besitzt, auszulesen. Die Ausgabevorrichtung 308 kann eine elektronische Anzeige zum Anzeigen der Anwesenheit und/oder Konzentration von Analyten in der fluiden Probe, welche analysiert wird, als Antwort auf Ausgabensignale 326 einschließen. Die Ausgabevorrichtung 308 kann auch einen Drucker zum Anzeigen solcher Daten einschließen.
In einer Ausgabeform gibt der Anwender unter Verwendung von Eingabevorrichtung 306 eine gewünschte Integrationszeitspanne in den Computer 304 ein, bevor er einen Test startet. Zum Beispiel kann der Benutzer eine Dauer von 10 Sekunden für eine 12 Bit Auflösung eingeben oder 3 Minuten für eine 16 Bit Auflösung. Der Benutzer führt dann die zu analysierende fluide Probe der Vorrichtung 100 zu (z.B. durch Eintauchen von Baugruppe 154 in einen Behälter, der die Probe enthält), gibt die verbleibenden Komponenten der Licht emittierenden Reaktion dazu und setzt Baugruppe 154 in den ZIF-Sockel auf Baugruppe 302 ein. Die Vorrichtung 100 wird dann beginnen, Datenframes durch Kabel 316 an den Computer 304 zu übertragen. Jeder Frame schließt quantisierte delta-sigma A/D Konversionsdaten für jedes Pixelelement in Array 104 ein. Die verarbeitende Schaltung 318 wartet auf das sync byte, um den Beginn eines Datenframes zu bestimmen. Sobald ein Frame beginnt, korreliert die verarbeitende Schaltung 318 die in jedem Frame erhaltenen Daten mit den Mikrostellen 142 in Array 104 (basierend auf der bekannten Anordnung in Array 104) und integriert die Ausgabendatensignale 118, welche korreliert sind mit jeder Mikrolokation 142, durch Ansammlung der Vergleicher positiver Übergänge in den entsprechenden Speicherstellen in Datenertassungsarray 323. Die Übergänge werden angesammelt für die Dauer des gewünschten Integrationszeitraums. Nachdem die Integrationsdauer vollständig ist, korregiert die verarbeitende Schaltung 318 die integrierten Daten, um den Fehlerstrom durch Photodetektoren 144, basierend auf zuvor aufgenommenen Messungen im Dunkeln, zu korrigieren (z.B. durch Einsetzen von Baugruppe 154 in Baugruppe 302 vor dem Beginn der Licht emittierenden Reaktionen). An diesem Punkt werden die korregierten Daten an jeder Stelle auf Array 323 mit der Anwesenheit von Analyten in der fluiden Probe, auf der getestet wurde, in Beziehung gesetzt. Die verarbeitende Schaltung 318 erzeugt dann Ausgabensignale 326, die, wenn sie auf die Ausgabevorrichtung 308 angelegt werden, die Ausgabevorrichtung 308 veranlassen, die korregierten Daten anzuzeigen. Die korregierten Daten stehen in Bezug zur Anwesenheit und/oder Konzentration von jedem Analyten, auf welchen getestet wurde, durch Beziehungen, welche empirisch unter Verwendung bekannter Konzentrationen an Analyten bestimmt wurden.
In einer anderen Ausführungsform wurde das optionale Analytenabbild im Speicherbereich 330 mit den Identitäten der Analyten, auf die an jeder Mikrostelle 142 in Array 104 getestet wird, vorprogrammiert, bevor der Test gestartet wird (eventuell unter Verwendung von Eingabevorrichtung 306). Dann, anstelle einer einfachen Ausgabe der korregierten Daten zur Anzeige an Ausgabevorrichtung 308, führt die verarbeitende Schaltung 318 den zusätzlichen Schritt der Korrelation der Stellen im Datenerfassungsarray 332 mit dem Analytenabbild aus, um die Analyten zu identifizieren, und erzeugt Ausgabensignale 326, um die Analyten zu identifizieren, die durch die korregierten Daten dargestellt werden.
In noch einer anderen Ausführungsform schließen die Daten, gespeichert in Speicherbereich 328, Grenzwertdaten, die Indikativ für die Anwesenheit von jedem Analyten in der zu analysierenden fluiden Probe sind, ein. Die Grenzwertdaten für jeden Analyten können durch empirisches Testen unter Verwendung einer fluiden Probe, welche eine bekannte Minimumkonzentration an Analyten besitzt, durchgeführt werden oder können einfach als Abstand zu den Messungen im Dunkeln gespeichert werden. Die verarbeitende Schaltung 318 vergleicht dann die korregierten Daten mit den Grenzwertdaten (oder die unkorrigierten Daten mit den Messungen im Dunkeln, wenn Abstände verwendet werden), um zu bestimmen, welche Analyten in der zu analysierenden fluiden Probe anwesend sind. Die Ausgabesignale 326 werden dann erzeugt, so dass die Analyten, anwesend in der fluiden Probe, angezeigt oder ausgedruckt werden. Diese Ausführungsform kann auch die Verwendung des Analytenabbilds einschließen, um der verarbeitenden Schaltung 318 zu erlauben, die Analyten zu identifizieren, deren Anwesenheit im Probenfluid detektiert ist.
In noch einer weiteren Ausführungsform schließen die Daten innerhalb des Speicherbereichs 328 empirisch bestimmte Gleichungen, Kurven oder Tabellen, welche die Beziehungen zwischen den korrigierten Daten und den Konzentrationen der Analyten, auf welche getestet wird, darstellen, ein. Verfahren zur Bestimmung solcher Gleichungen, Kurven oder Tabellen sind dem Fachmann wohl bekannt und können Computerkurven-Anpassungstechniken einschließen. Die verarbeitende Schaltung 318 verwendet die korrigierten Daten als Eingabedaten für die Gleichungen, Kurven oder Tabellen, um die Konzentration von jedem Analyten in der Probe zu bestimmen. Ausgabensignale 326 werden erzeugt, so dass die Konzentration von Analyten, die in der Probe anwesend sind, angezeigt oder ausgedruckt wird. Diese Ausführungsform kann wieder das Analytenabbild einschließen, um der verarbeitenden Schaltung 318 zu erlauben, die Analyten zu identifizieren, deren Konzentration in dem Probenfluid bestimmt worden ist.
System 300 bietet eine Ausrüstung, die zum Auswerten von Vorrichtung 100 verwendbar ist. Das System erfordert vom Benutzer, Baugruppe 154 direkt zu bedienen, was zu mechanischen Schaden an den Kontaktstiften 156 oder zu elektrostatischen Entladungsschaden an Schaltung 100 führen kann. Um die Notwendigkeit eines direkten Bedienens durch den Benutzer zu vermeiden, kann Vorrichtung 100 auf einer Einwegtestschaltungsplatte 400, wie in 7 gezeigt, montiert sein. Die Vorrichtung 100 kann wiederum in einer keramischen DIP-Baugruppe 154 verpackt sein oder kann alternativ verpackt sein in einer anderen Ausführungsform der mikroelektronischen Baugruppe 402 (z.B. ein führungsfreier Chipträger), die auf Platte 400 monitert ist. Variationen an mikroelektronischen Baugruppen sind dem Fachmann wohl bekannt. Baugruppe 402 wird an Platte 400 festgehalten (z.B. gelötet), so dass der Benutzer nur Platte 400 bedienen muss und nicht Baugruppe 402 direkt bedienen muss.
Baugruppe 402 schließt Leiter- oder Kontaktstifte 156 ein, die elektrisch gekoppelt sind mit den Spuren 116–122, ausgebildet auf Platte 400, für das Takteingabesignal, Ausgabedatensignal, elektrische Leistung bzw. Erdung. Baugruppe 402 kann nur diese vier Kontaktstifte besitzen, um die Kosten in Großserienanwendungen zu reduzieren. Die Spuren 116–122 sind elektrisch gekoppelt mit einem Kabel 404, das an einen Stecker 406 anschließt, welcher anschließt an einen Gegenstecker an dem Testinstrument oder Computer. Die Leiterbahnen von Baugruppe 402, die Spuren 116–122 und die Oberfläche von Platte 400 sind vor der zu analysierenden fluiden Probe mit einem Epoxydharzüberzug 408 geschützt. Der Überzug 408 wird nicht angewendet auf die Durchbrüche 172 und 182 oder das Plättchen 140, um der fluiden Probe und den verbleibenden Komponenten der Licht emittierenden Reaktionen zu erlauben, der Vorrichtung 100 zugeführt zu werden.
Wahlweise sind Chips mit vielen Vertiefungen aus drei Schichten [siehe z.B. 8–11] zusammengesetzt. Die untere Schicht formt den unteren Bereich jeder Vertiefung und schließt eine Halbleiterschicht, eine Photodiode am Fuß jeder Vertiefung und eine Anodenelektrode, d.h. ein Metalldraht, welcher jede Vertiefung umgibt, ein. Die mittlere Schicht passt in Furchen in der unteren Schicht und ist aus einer reflektierenden Metallschicht, einer isolierenden Schicht, vorzugsweise derivatisiertes Plastik oder Silicium, wie zum Beispiel MYLAR (gerichtetes Polyethylenterephthalat ist gewerblich erhältlich bei der E. I. Du Pont de Nemours & Co., Inc.), in welcher der spezifische Antikörper oder Ligand für jede Vertiefung befestigt wird [z.B. Antikörper befestigt an MYLAR; siehe 10]. Die obere Aufsatzschicht bildet den verbleibenden oberen Teil jeder Vertiefung und enthält auch die Kathodenelektrode. Analyten oder Reaktanten können innerhalb oder zwischen den Vertiefungen durch freie Feldelektrophorese durch Anlegen eines direkten Stroms transportiert werden oder durch Invertieren der Polarität des Stroms durch die obere Kathode und untere Anode [z.B. siehe 11].
Wenn er verwendet wird, wird der Chip mit einer Probe in Berühung gebracht und sorgfältig gewaschen. Puffer oder andere geeignete Zusammensetzungen wird zu jeder Vertiefung zugegeben, bis der Spiegel über der Kathodenposition liegt. Der Chip wird dann in Berührung gebracht mit einer Zusammensetzung, welche ein Luciferin enthält oder vorzugsweise eine Luciferase, konjugiert oder fusioniert oder andersweitig verknüpft mit einem Antikörper oder einem Antikörper bindenden Anteil davon oder einer Vielzahl von solchen Fusionen. Die Antikörper oder Anteile davon sind spezifisch für die Antigene von Interesse. Die verbleibenden Komponenten des Biolumineszenz erzeugenden Systems werden zugegeben und der Chip wird an eine Stromquelle durch ein Kabelnetz angeschlossen [siehe z.B. siehe 11 Ende]. Erzeugtes Licht wird aufgenommen innerhalb jeder Vertiefung und wird detektiert durch die Photodiode, die am Boden jeder Vertiefung lokalisiert ist. Die reflektierende Oberfläche wird das Signal verstärken. Das detektierte Signal wird weitergegeben zu einer Computer verarbeitenden Einheit, im Wesentlichen wie oben beschrieben, und der Computer identifiziert die detektierte Vertiefung und zeigt dann das detektierte spezifische infektiöse Mittel auf einem begleitenden Monitor oder Ausdruck an [siehe z.B. 20].
2. Selbstansteuerbare Chips
Die selbstansteuerbaren Chips [siehe z.B. 12–16] schließen ein, eine Matrix, eine isolierende Schicht, eine Metallschicht, an welcher eine Befestigungsschicht und eine Permeationsschicht befestigt sind. Der Chip schließt auch Photodioden, die das emittierte Licht detektieren, ein.
a. Matrixmaterialien
Jede Matrix oder Chip kann als Trägermaterial zur Herstellung der hierin bereitgestellten Vorrichtungen zum Einsatz gelangen. Das Trägermaterial kann biologisch, nicht biologisch, organisch, anorganisch oder eine Kombination von jedem dieser sein, bestehend als Teilchen, Fäden, Präzipitaten, Gelen, Blättern, Röhren, Kugeln, Gebinden, Kapillaren, Kissen, Scheiben, Filmen, Blechen, Folien etc. Das Trägermaterial kann jede geeignete Form, wie zum Beispiel eine Scheibe, ein Quadrat, eine Kugel und einen Kreis besitzen. Das Trägermaterial und seine Oberfläche bilden vorzugsweise eine steife Auflage, auf welcher die hierin beschriebenen Reaktionen ausgeführt werden. Das Trägermaterial und seine Oberfläche sollte auch so ausgewählt werden, um geeignete Licht absorbierende Eigenschaften zu bieten. Die Trägersubstanz kann zum Beispiel polymerisierter Langmuir Blodgett Film, funktionalisiertes Glas, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO₂, SiN₄, modifiziertes Silizium oder jedes andere von einer breit gefächerten Auswahl von Polymeren, wie zum Beispiel (Poly)tetrafluorethylen, (Poly)vinylidendifluorid oder Kombinationen davon. Andere Trägermaterialien werden dem Fachmann im Licht der Offenbarung hierin leicht ersichtlich sein. Anwesend bevorzugt sind Siliciumdioxid-Trägermaterialien, verwendet in der Herstellung von mikroelektronischen Chipvorrichtungen.
b. Herstellungsverfahren
i. Mikrolithographie
Die Internationale Patentanmeldung Publikations-Nrn. WO 95/12808 und WO 96/07917 beschreiben allgemeine mikrolithographische oder photolitographische Techniken, die zur Herstellung der komplexen Chipausführungsvorrichtung, welche eine große Zahl von kleinen Mikrostellen besitzt, verwendet werden können. Obwohl die Herstellung von Vorrichtungen nicht die komplexe Photolitographie fordert, bedarf die Auswahl der Materialien und die Anforderung, dass eine elektronische Vorrichtung aktiv in wässriger Lösung funktioniert, keiner speziellen Überlegungen.
Die 64 Mikrostellenvorrichtung, gezeigt in 14 aus WO 95/12808, kann unter Verwendung einer relativ einfachen Schablonenausführung und Standardmikrolithographischen Techniken hergestellt werden. Im Allgemeinen würde das Grundwerkstoffträgermaterial eine 1 bis 2 Zentimeter quadratische Siliciumscheibe oder ein Chip mit etwa 0,5 mm in der Dicke sein. Der Chip wird zuerst mit einem 1 bis 2 μm dicken Siliciumdioxid (SiO₂)-Isolationsüberzug überzogen, welcher durch Plasma verstärkte chemische Aufdampfung (engl. Plasma enhanced chemical vapor depositions, PECVD) aufgetragen wird.
Die Chips sind vorzugsweise so gestaltet, dass sie Detektorelemente enthalten, z.B. Photodioden, die in die Halbleiterschicht inkorporiert sind und durch Strahlengänge, wie zum Beispiel durch Hohlleiter oder andere Mittel, mit den anderen Strahlengängen des Chips gekoppelt sind. In bevorzugten Ausführungsformen besteht das Detektorelement aus einen linearen Array von Photodioden mit einer ungefähren Auflösung von 1–5 μm, vorzugsweise 1–2 μm. Unter Verwendung eines Detektors, der auf dem Chip positioniert ist, kann die Identifikation einer Zielstruktur in einer Testprobe an der Stelle der Befestigung des biologischen Moleküls oder Antiligandens erreicht werden.
Im nächsten Schritt wird eine 0,2 bis 0,5 μm Metallschicht (z.B. Aluminium) durch Vakuumverdampfung aufgetragen. Zusätzlich zum Aluminium schließen für das Schaltschema geeignete Metalle Gold, Silber, Zinn, Kupfer, Platin, Palladium und Kohlenstoff und verschiedene Metallkombinationen ein. Spezielle Techniken zum Absichern einer angemessenen Anhaftung an die isolierenden Substrat-Trägermaterialien (SiO₂) werden für verschiedene Metalle verwendet.
Als nächstes wird der Chip mit einem positiven Photolack (Shiplex, Microposit AZ 1350 J) überzogen, mit dem Schaltkreismuster abgedeckt (Lichtfeld), exponiert und entwickelt. Der photoaufgelöste Photolack wird entfernt und das exponierte Aluminium wird weggeäzt. Die Photolackinsel wird nun entfernt, wobei das Aluminiumschaltkreismuster auf dem Chip zurückbleibt. Dies schließt ein einen äußeren Umfang mit Metallkontaktgliedern, den verbindenden Schaltkreis (Drähte) und den Mittelarray von Mikroelektroden, die als eine zugrunde liegende Basis für die ansteuerbaren Mikrostellen dienen.
Verwendet man PECVD, wird der Chip zuerst mit einer 0,2 bis 0,4 μm Schicht von SiO₂ überzogen und dann mit einer 0,1 bis 0,2 μm Schicht von Siliciumnitrid (Si₃N₄). Der Chip wird dann mit einem positiv Photolack überzogen, abgedeckt für Kontaktanschlussfelder und Mikroelektrodenstellen, exponiert und entwickelt. Photoaufgelöster Photolack wird entfernt und die SiO₂- und Si₃N₄-Schichten werden weggeäzt, um die Aluminium-Kontaktanschlussfelder und Mikroelektroden bloßzulegen. Der umgebende Inselphotolack wird dann entfernt, die verbindende Verdrahtung zwischen den Kontaktanschlussfeldern und den Mikroelektroden verbleibt isoliert durch die SiO₂- und Si₃N₄-Schichten.
Die SiO₂- und Si₃N₄-Schichten bieten wichtige Eigenschaften für das Funktionieren der Vorrichtung. Erstens besitzt die zweite SiO₂-Schicht einen besseren Kontakt und eine verbesserte Versiegelung mit dem Aluminiumschaltkreis. Es ist auch möglich, Widerstand leistende Materialien zum Isolieren und Versiegeln zu verwenden. Dies verhindert die Unterspülung des Schaltkreises infolge von Elektrolyseeffekten, wenn die Mikroelektroden in Betrieb sind. Der abschließende Oberflächenschichtüberzug mit Si₃N₄ wird verwendet, da dieses eine viel geringere Reaktivität mit den nachfolgenden Reagenzien, welche verwendet werden, um die Oberfläche der Mikroelektrode für das Befestigen von spezifischen Bindeeinheiten zu modifizieren, besitzt.
An diesem Punkt werden die Mikroelektrodenstellen auf der Vorrichtung mit einer spezialisierten Permeations- und Befestigungsschicht modifiziert, welches ein ausschlaggebende Element, das für das aktive Funktionieren der Vorrichtung erfordert wird, ist. Die Aufgabe ist es, auf der Mikroelektrode eine dazwischen liegende Permeationsschicht mit selektiven Diffusionseigenschaften und eine Befestigungsoberflächenschicht mit optimalen Bindungseigenschaften zu erschaffen. Die Befestigungsschicht sollte vorzugsweise von 10⁵ bis 10⁷ funktionalisierte Stellen pro Quadratmikrometer (μm²) für das optimale Befestigen von spezifischen Bindeeinheiten besitzten. Das Befestigen von spezifischen Bindeeinheiten darf nicht die Oberfläche überdecken oder isolieren, um so die unten liegende Mikroelektrode vom Funktionieren abzuhalten. Eine funktionierende Vorrichtung erfordert einen gewissen Anteil (etwa 5 bis 25%) der eigentlichen Metallelektrodenoberfläche, um für Lösungsmittel (N₂O) Moleküle zugänglich zu bleiben und um zu ermöglichen, dass die Diffusion von Gegenionen (z.B. Na⁺ und Cl^–) und Elektrolysegasen (z.B. O₂ und H₂) stattfindet.
Die dazwischen liegende Permeationsschicht muss auch erlauben, dass Diffusion stattfinden kann. Zusätzlich sollte die Permeationsschicht eine Porenlimiteigenschaft besitzten, die die größeren Bindeeinheiten, Reaktanten und Analyten bezüglich physikalischem Kontakt mit der Mikroelektrodenoberfläche hemmt oder verhindert. Die Permeationsschicht hält die aktive Mikroelektrodenoberfläche physikalisch getrennt von der Bindeeinheitsschicht der Mikrostelle.
Bezüglich der primären Vorrichtungsfunktion erlaubt diese Ausführung, dass die Elektrolysereaktionen benötigt für den elektrophoretischen Transport an der Mikroelektrodenoberfläche stattfinden, aber verhindert nachteilige elektrochemische Effekte gegenüber den Bindeeinheiten, Reaktanten und Analyten.
Ein bevorzugtes Verfahren der Derivatisierung der Metallmikroelektrodenoberfläche verwendet Aminopropyltriethoxysilan (APS). APS reagiert leicht mit dem Oxid und/oder Hydroxylgruppen auf Metall- und Siliciumoberflächen. APS sorgt für eine kombinierte Permeationsschicht und Befestigungsschicht mit primären Aminogruppen für das nachfolgende kovalente Koppeln von Bindeeinheiten. Bezüglich der Oberflächenbindeeinheiten erzeugt APS einen relativ hohen Grad an Funktionalisierung (d.h. eine große Zahl von primären Aminogruppen) auf leicht oxidierten Aluminiumoberflächen, einen mittleren Grad an Funktionalisierung auf SiO₂-Oberflächen und sehr limitierte Funktionalisierung auf Si₃N₄-Oberflächen.
Die APS-Reaktion wird ausgeführt durch Behandlung der ganzen Vorrichtungs- (z.B. einem Chip) Oberfläche mit einer 10%igen Lösung von APS in Toluol bei 50°C für 30 Minuten. Der Chip wird dann in Toluol und Ethanol gewaschen und dann für eine Stunde bei 50°C getrocknet. Die Mikroelektrodenmetalloberfläche wird funktionalisiert mit einer großen Anzahl von primären Aminogruppen (10⁵ bis 10⁶ pro Quadratmikrometer). Bindeeinheiten können jetzt kovalent an die derivatisierte Mikroelektrodenoberfläche gebunden werden.
ii. Mikrobearbeitung
Die Internationalen Patentanmeldung Publikationsnummern WO 95/12808 und WO 96/07917 beschreiben Mikrobearbeitungstechniken (z.B. Bohren, Fräsen etc.) und nicht-lithographische Techniken, um Vorrichtungen herzustellen. Im Allgemeinen besitzen die sich ergebenden Vorrichtungen relativ größere Mikrostellen (> 100 μm) als jene hergestellt durch Mikrolithographie. Diese Vorrichtungen könnten für analytische Anwendungen ebenso wie für Anwendungen präparativen Typs, wie zum Beispiel Biopolymersynthese, verwendet werden. Große ansteuerbare Stellen können in dreidimensionalen Formen (z.B. Röhren oder Zylindern) fabriziert werden, um so eine große Zahl an Bindeeinheiten zu tragen. Solche Vorrichtungen können hergestellt werden unter Verwendung einer Vielfalt von Materialien einschließlich aber nicht limitiert auf Plastik, Gummi, Silicium, Glas (z.B: mikrokanalisiert, mikrokapillar etc.) oder Keramik. Im Fall von mikrobearbeiteten Vorrichtungen können verbindende Schaltungen und große Elektrodenstrukturen unter Verwendung von Standardschaltplatten-Drucktechniken, die dem Fachmann bekannt sind, auf Materialien aufgedruckt werden.
In der vorliegenden Anmeldung werden die Chips vorzugsweise so konstruiert, dass sie Detektorelemente enthalten, z.B. Photodioden, die in die Halbleiterschicht inkorporiert sind, und Strahlengänge, zum Beispiel durch Hohlleiter oder andere Mittel, die mit den anderen Strahlengängen des Chips gekoppelt sind. In bevorzugten Ausführungsformen besteht das Detektorelement aus einem linearen Array von Photodioden mit einer ungefähren Auflösung von 1–5 Mikrometer, vorzugsweise 1–2 Mikrometer. Unter Verwendung eines Detektors, lokalisiert auf dem Chip, kann die Identifikation einer Zielstruktur in einer Testprobe an der Stelle der Befestigung des biologischen Moleküls oder Antiliganden erreicht werden.
Ansteuerbare Mikrostellenvorrichtungen können relativ leicht unter Verwendung von Mikrobearbeitungstechniken hergestellt werden. 15 von WO 95/12808 zeigt ein Schema von einer repräsentativen Vorrichtung mit 96 Mikrostellen. Diese Mikrostellenvorrichtung wird hergestellt aus einem geeigneten Materialbestand (2 cm × 4 cm × 1 cm) durch Bohren von 96 entsprechenden gleichmäßig verteilten Löchern (1 mm im Durchmesser) durch das Material. Eine Elektrodenschaltplatte wird auf einem dünnen Blatt aus einem Plastikmaterialbestand gebildet, welcher präzise über das obere Ende der Mikrostellenkomponente passt. Die Unterseite der Schaltplatte enthält die einzelnen Drähte (gedruckter Schaltkreis) zu jeder Mikrostelle. Kurze Platinelektrodenstrukturen (~3–34 mm) sind vorgesehen, um sich nach unten die einzelnen Mikrostellenkammern zu erstrecken. Die gedruckte Schaltkreisverdrahtung ist überzogen mit einem geeigneten wasserfesten isolierenden Material. Die gedruckte Schaltkreisverdrahtung nähert sich einem Anschluss, welcher die Verbindung zu einer Mehrfachschalter-Kontrollschaltung und einer Gleichstromelektroversorgung erlaubt. Die Vorrichtung ist teilweise eingetaucht und arbeitet in einem allgemeinen Puffersammelbehälter.
Während die primäre Funktion der Mikrolokationen in den Vorrichtungen, hergestellt durch Mikrobearbeitung und Mikrolithographietechniken, die gleiche ist, sind ihre Ausführungsformen unterschiedlich. In Vorrichtungen, hergestellt durch Mikrolithographie, sind die Permeations- und Befestigungsschichten direkt auf der zu Grunde liegenden Metall-Mikroelektrode ausgestaltet. In Vorrichtungen, hergestellt durch Mikrobearbeitungstechniken, sind die Permeations- und Befestigungsschichten physikalisch von ihrer individuellen Metallelektrodenstruktur durch eine Pufferlösung in dem individuellen Sammelbehälter-Kammern getrennt. In mikrobearbeitenden Vorrichtungen können die Permeations- und Befestigungsschichten unter Verwendung funktionalisierter hydrophiler Gele, Membranen oder anderer geeigneter poröser Materialien ausgestaltet sein.
Im Allgemeinen reicht die Dicke der kombinierten Permeations- und Befestigungsschichten von 10 μm bis 10 mm. Zum Beispiel kann ein modifiziertes hydrophiles Gel von 26% bis 35% Polyacrylamid (mit 0,1% Polylysin) verwendet werden, um jede der individuellen Mikrostellenkammern in der Vorrichtung teilweise zu füllen (~0,5 mm). Diese Gelkonzentration bildet eine ideale Permeationsschicht mit einem Porenlimit von 2 nm bis 3 nm. Das Polylysin inkorporiert in das Gel, stellt primäre aminfunktionelle Gruppen für die nachfolgende Befestigung von spezifischen Bindeeinheiten zur Verfügung. Diese Art von Gel-Permeationsschicht ermöglicht den Elektroden, aktiv in der Gleichstrombetriebsart zu arbeiten. Wenn die Elektrode aktiviert wird, ermöglicht die Gel-Permeationsschicht kleinen Gegenionen durch sie hindurch zu passieren, aber die großen spezifischen Bindeeinheit-Moleküle werden auf der äußeren Oberfläche konzentriert. Hier werden sie kovalent an die äußere Schicht von primären Aminen gebunden, welche wirksamerweise die Befestigungsschicht wird.
Eine alternative Technik für die Bildung der Permeations- und Befestigungsschichten ist es, in den Boden jeder Mikrostellenkammer poröses Membranmaterial zu inkorporieren. Die äußere Oberfläche der Membran wird dann mit chemischen funktionellen Gruppen derivatisiert, um die Befestigungsschicht zu bilden. Geeignete Techniken und Materialienausführungen dieses Ansatzes sind dem Fachmann bekannt.
Die obige Beschreibung für die Ausführungsform und Herstellung einer Vorrichtung sollte nicht als Beschränkung für andere Variationen oder Formen der Basisvorrichtung erachtet werden. Viele Variationen der Vorrichtung mit einer größeren oder kleineren Zahl von ansteuerbaren Mikrostellen sind vorgesehen für verschiedene analytische und präparative Anwendungen. Variationen der Vorrichtung mit größeren ansteuerbaren Stellen sind vorgesehen für präparative Biopolymersyntheseanwendungen. Variationen werden auch als elektronisch ansteuerbare und regulierbare Reagenzienverteiler für die Verwendung mit anderen Vorrichtungen, einschließlich solcher hergestellt durch Mikrolithographietechniken, in Erwägung gezogen.
c. Selbstansteuerung von Chips
Die Chips und Vorrichtungen, beschrieben in den internationalen Patentanmeldung-Veröffentlichungs-Nrn. WO 95/12808 und WO 96/07917 sind fähig, jede Mikrostelle mit einer spezifischen Bindeeinheit elektronisch selbst anzusteuern. Die Vorrichtung selbst wirkt direkt ein oder verursacht den Transport und das Befestigen von spezifischen Bindeeinheiten an spezifischen Mikrostellen. Die Vorrichtung setzt sich selbst zusammen, in dem Sinn, dass von außen kein Verfahren, Mechanismus oder Ausrüstung benötigt wird, um eine spezifische Bindeeinheit an eine spezifische Mikrostelle zu leiten, zu positionieren oder zu platzieren. Dieser selbst zusammenbauende Prozess ist schnell und spezifisch und kann entweder in einer seriellen oder parallelen Art ausgeführt werden.
Eine Vorrichtung kann seriell angesteuert sein mit spezifischen Bindeeinheiten durch Beibehalten der gewählten Mikrostelle in einer Gleichstrombetriebsart und bei der gegenteiligen Ladung (Potenzial) zu der einer spezifischen Bindeeinheit. Alle anderen Mikrostellen werden bei der gleichen Ladung wie die spezifische Bindeeinheit gehalten. In Fällen, in denen die Bindeeinheit nicht im Überschuss der Befestigungsstellen an den Mirkostellen vorliegt, ist es nötig, nur eine andere Mikroelektrode zu aktivieren, um den elektrophoretischen Transport zu der spezifischen Mikrostelle zu bewirken. Die spezifische Bindeeinheit wird schnell durch die Lösung transportiert (in wenigen Sekunden oder vorzugsweise weniger als einer Sekunde) und direkt an der spezifischen Mikrostelle konzentriert, wo sie sofort kovalent an die spezielle Oberfläche gebunden wird. Die Fähigkeit, elektronisch Reaktanten oder Analyten (70) an einer spezifischen Mikrostelle (72) zu konzentrieren, ist in 7 des Patents gezeigt. Alle anderen Mikrostellen bleiben durch diese spezifische Bindeeinheit unbeeinflußt. Jede nicht abreagierte Bindeeinheit wird durch Reversierung der Polarität dieser spezifischen Mikrostelle entfernt und Elektrophorese erfolgt zu einer Ablagerungsstelle. Der Zyklus wird wiederholt, bis alle gewünschten Mikrostellen mit den spezifischen Bindeeinheiten angesteuert sind. 8 des Patents zeigt das serielle Verfahren zum Ansteuern spezifischer Mikrostellen (81, 83, 85) mit spezifischen Oligonukleotid-Bindeeinheiten (82, 84, 86).
Das parallele Verfahren zum Ansteuern von Mikrostellen schließt einfach das gleichzeitige Aktivieren einer großen Zahl (insbesondere einer Gruppe oder Linie) von Mikroelektroden ein, so dass dieselbe spezifische Bindeeinheit transportiert wird, konzentriert wird und mit mehr als einer spezifischen Mikrostelle reagiert.
Wenn er verwendet wird, wird der Chip mit einer Probe, wie zum Beispiel einer Körperflüssigkeit, insbesondere Urin, Sputum oder Blut, in Berührung gebracht. Der Chip wird dann mit einer Zusammensetzung in Berührung gebracht, die ein Luciferin, oder vorzugsweise eine Luciferase, konjugiert oder verknüpft oder fusioniert mit einem Antikörper oder einem Antikörper bindenden Anteil davon oder einer Vielzahl von solchen Fusionen in Kontakt gebracht. Die Antikörper oder Teile davon sind spezifisch für die Antigene von Interesse. Die Detektion wird bewirkt durch Reaktion des Chips mit einem Biolumineszenz erzeugenden System, das Licht erzeugt, welches durch die Photodioden detektiert wird.
3. Befestigung von biologischen Molekülen an die Oberfläche von Chips
Eine große Bandbreite von Verfahren zum Befestigen von biologischen Molekülen einschließlich Proteinen, Nukleinsäuren und Peptidnukleinsäuren an feste Träger sind bekannt [siehe z.B. Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B. Methods in Enzymol. Vol. 34, Hrsg. W B. Jakoby, M. Wilchek, Acad. Press, N.Y. (1974) and Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography, Advances in Experimental Medicine and Biology, vol. 42, Hrsg. R. Dunlap, Plenum Press, N.Y. (1974); US-Patent Nr. 5,451,683, siehe auch US-Patente Nrn. 5,624,711, 5,412,087, 5,679,773, 5,143,854], insbesondere Siliciumchips sind bekannt.
Diese Verfahren schließen typischerweise die Derivatisierung des festen Trägers ein, um eine gleichmäßige Schicht von reaktiven Gruppen auf der Trägeroberfläche zu ausbilden und umfassen die nachfolgende Befestigung der biologischen Moleküle an die derivatisierte Oberfläche über eine kovalente Bindung zwischen der reaktiven Gruppe und einem reaktiven Rest vorhanden an dem biologischen Molekül. Anwesend bevorzugte Verfahren sind die, die geeignet sind für die Derivatisierung und Befestigung von biologischen Molekülen an Siliciumdioxidsubstraten, insbesondere Verfahren für die Derivatisierung der Siliciumdioxidoberfläche von mikroelektronischen Chipvorrichtungen.
a. Derivatisierung von Siliciumdioxid-Trägermaterial
Zahlreiche Verfahren zur Derivatisierung von Siliciumdioxidoberflächen oder zum Überzug von Oberflächen mit Siliciumdioxid und anschließende Derivatisierung der Oberfläche sind bekannt. Eine Vielzahl von Reagenzien kann verwendet werden, um die Oberfläche eines Siliciumdioxid-Trägermaterial zu derivatisieren. Zum Beispiel beschreibt US-Patent Nr. 4,681,870 ein Verfahren zur Einführung freier Amino- oder Carboxylgruppen an eine Siliciumdioxidmatrix. Alternativ kann eine Schicht von freien Aminogruppen oder Carboxylgruppen unter Verwendung von Amino- und Carboxymethylsilanderivaten, wie z.B. 3-Aminopropyltriethoxysilan, 3-Aminopropyltrimethoxysilan, 4-Aminobutyltriethoxysilan, (Aminoethylaminomethyl)phenetyltrimethoxysilan, 2-(Carbomethoxy)ethyltrichlorsilan, (10-Carbomethoxydecyl)dimethylchlorsilan und 2-(Carbomethoxy)ethylmethyldichlorsilan (z.B. siehe Hulls Catalog) eingeführt werden.
Die Siliciumdioxidoberfläche kann auch derivatisiert werden, um eine Schicht von Hydroxylgruppen unter Verwendung von Alkyl- und Alkoxyalkyl halogenierten Silanderivaten einzuführen. Die Alkoxygruppen der Trialkoxysilane werden hydrolysiert zu ihren korrespondierenden Silanolspezies, welche während der formalen Präparation von wässrigen Lösungen oder der Reaktion des Silans mit absorbierter Feuchtigkeit auf dem Siliciumdioxidsubstrat stattfinden können. Die Silanole kondensieren normalerweise mit sich selbst oder Alkoxysilanen, um Siloxane zu bilden. Die Silanol-haltigen Spezies sind hoch reaktive Zwischenstufen, die mit den Hydroxylgruppen auf der Oberfläche des Siliciumdioxid reagieren [z.B. siehe Mohsen et al. (1995) J. Oral Rehabil. 22: 213–220]. Ferner kann eine Siliciumdioxidmatrix auch durch Behandlung mit einem Cyanhalogen unter alkalischen Bedingungen aktiviert werden. Nach Zugabe zu der aktivierten Oberfläche wird der Antiligand kovalent an der Oberfläche befestigt.
Die Auswahl und Verwendung eines geeigneten derivatisierenden Reagenzes liegt in den Fähigkeiten des Fachmanns. Zum Beispiel kann die Auswahl eines geeigneten Silanderivats durch empirische Beurteilung von Silanen innerhalb der vorhergesagten Kategorien erfolgen. Bei der Herstellung dieser Siliciumdioxid-Trägermaterialien kann die ganze Oberfläche des Trägermaterials mit den geeigneten Silanderivaten derivatisiert werden oder die Oberfläche kann nur an der Mehrzahl der Stellen derivatisiert werden, um einen diskreten Array zu bilden. Die Reagenzien und Lösungen, welche die biologischen Moleküle enthalten, können zu der Oberfläche des Siliciumdioxids manuell hinzugefügt werden oder unter Verwendung eines zustopfenden Werkzeugs oder jedem anderen Werkzeug, welches dem Fachmann zu diesem Zweck bekannt ist.
b. Befestigung von biologischen Molekülen
Die Befestigung von biologischen Molekülen an die Oberfläche von Siliciumdioxid-Trägermaterialien kann unter Verwendung der Verfahren und Techniken, welche im Fachbereich bekannt sind, die hierin beschrieben sind, erreicht werden. Die Befestigung von einem biologischen Molekül kann auch in Abwesenheit oder Anwesenheit eines Linkerrests (z.B. siehe Abschnitt D1 unten) erreicht werden. Jeder Linker, der dem Fachmann bekannt ist, kann hierin verwendet werden.
Derivatisierte Siliciumdioxid-Trägermaterialien, welche eine Schicht von freien Amino- oder Carboxylgruppen oder anderen geeigneten Gruppen enthalten, können nachfolgend kovalent verknüpft werden mit einer freien Carboxyl- oder Aminogruppe an einem Linker oder einem biologischen Molekül, wie zum Beispiel ein Protein, eine Proteinnukleinsäure oder andere Antiliganden in Anwesenheit von Carbodiimid. Die Verwendung von Carbodiimiden [z.B. N-Ethyl-N'-(γ-dimethylaminopropylcarbodiimid] als Kopplungsagenzien ist dem Fachmann gut bekannt [siehe z.B. Bodansky et al. in „The Practice of Peptide Synthesis", Springer Verlag Berlin (1984)].
Ein anderes Verfahren zur Befestigung von biologischen Molekülen schließt ein die Modifizierung einer Siliciumdioxidoberfläche durch die sukzessive Auftragung von mehreren Schichten an Biotin, Avidin und Füllstoffen mit ein [siehe z.B. US-Patent Nr. 4,282,287]; andere Verfahren schließen Photoaktivierung mit ein, in welcher eine Polypeptidkette an ein festes Trägermaterial befestigt wird durch Inkorporierung einer lichtsensitiven nicht natürlichen Aminosäuregruppe in die Polypeptidkette und Exponierung des Produkts gegenüber Niedrigenergie-Ultraviolettlicht [siehe z.B. US-Patent Nr. 4,762,881]. Oligonukleotide wurden auch befestigt unter Verwendung photochemisch aktiver Reagenzien, wie zum Beispiel eine Psoralenkomponente und eines Kopplungsagenzs, welches das Photoreagenz an dem Trägermaterial befestigt [siehe z.B. US-Patent Nr. 4,542,102 und US-Patent Nr. 4,562,157]. Ähnliche Verfahren sind auch auf Peptidnukleinsäuren anwendbar. Die Photoaktivierung des Photoreagenz bindet ein Nukleinsäuremolekül oder ein Peptidnukleinsäuremolekül an das Trägermaterial, um eine oberflächengebundene Probe zu ergeben. In bestimmten Ausführungsformen kann die Photoaktivierung in situ durch Auswahl eines geeigneten Biolumineszenz erzeugenden Systems mit einer geeigneten Emissionswellenlänge, welche ausreichend ist die Nukleinsäure zu photoaktivieren und zu immobilisieren, erfolgen.
Weiterhin beschreibt US-Pat. Nr. 5,451,683 eine Technik zur Befestigung biochemischer Liganden an Oberflächen von Matrizen durch Befestigung eines photoaktivierbaren Biotinderivats. Photolytische Aktivierung der Biotinderivate für Biotinanaloga besitzend einer starken Bindeaffinität für Avidin oder Streptavidin. Die biotinylierten Liganden werden immobilisiert an aktivierten Abschnitten, die zuvor mit Avidin oder Streptavidin behandelt wurden.
Die Befestigung von Antiliganden an ein Matrixmaterial kann auch elektronisch erreicht werden. Selbstansteuerbare, selbstzusammenbauende mikroelektronische Systeme und Vorrichtungen für die elektronische Überwachung des Transports und das Binden von spezifischen Bindeeinheiten an spezifische Mikrostellen auf einer Matrix [siehe z.B. Internationale Patentanmeldung Veröftentlichungs-Nrn. WO 95/12808; WO 96/01836 und WO 96/07917, US-Patent Nr. 5,632,957, 5,605,662]. Die elektronische Überwachung der einzelnen Mikrostellen kann bewirkt werden, wonach Spannung oder Strom überwacht wird. Wenn ein Aspekt gesetzt ist, kann der andere überwacht werden. Zum Beispiel wenn die Spannung gesetzt ist, kann der Strom überwacht werden. Alternativ wenn die Spannung gesetzt ist, kann der Strom überwacht werden. Die Spannung und/oder der Strom können in einer direkten Strombetriebsweise angelegt werden oder können mit der Zeit variieren.
Die räumliche Ansteuerbarkeit, ermöglicht durch diese Verfahren, erlaubt die Bildung von gemusterten Oberflächen, welche vorgewählte Reaktivitäten besitzen. Zum Beispiel kann unter Verwendung von litographischen Techniken, wie sie in der Halbleiterindustrie bekannt werden, Licht direkt zu relativ kleinen und genau bekannten Stellen auf der Oberfläche geleitet werden. Es ist daher möglich, diskrete vorbestimmte Stellen auf der Oberfläche für die Befestigung von Antiliganden zu aktivieren. Die sich ergebende Oberfläche wird breit gefächerte Anwendungen besitzen. Zum Beispiel können direkt Bindungsuntersuchungen ausgeführt werden, in denen Liganden gleichzeitig auf Affinität zu verschiedenen Antiliganden, die an der Oberfläche befestigt sind, getestet werden können.
Zum Beispiel schließt die Befestigung von biologischen Molekülen an eine Siliciumdioxidoberfläche eines nicht selbstansteuerbaren Chips unter Verwendung von Alkoxysilanen typischerweise die Prehydrolyse der Oberfläche mit ein. Alle der nachfolgenden Arbeitsschritte sollten in einer laminaren Strömungsabzugs-haube sauberen Umgebung durchgeführt werden, um eine Kontaminierung mit Staub, organischen Partikeln und anderen Teilchen zu vermeiden. Typischerweise wird das geeignete Alkoxysilan in einer 3:1 Ethanol-Wasserlösung bei Raumtemperatur für 12 Stunden gelöst. Der Chip wird behandelt durch Überflutung eines ausgewählten Bereichs auf dem Chip wiederholend unter Verwendung von frischen Aliquoten der Silan-Alkohollösung. Nach dieser Behandlung wird der Chip unter Verwendung großer Mengen von absolutem Ethanol gewaschen, gefolgt durch Waschungen in THF oder Dioxan, Hexan (ultrapur) und letztlich Pentan, welches unter einem Strom von trockenem Stickstoff verdampft wird.
Die Effizienz der Derivatisierung der Oberfläche des Chips kann durch Kopplung eines geeigneten fluoreszierenden Amins (Carboxyl derivatisiert) oder fluoreszierender Carboxylsäure (Amino derivatisiert) an die Oberfläche des Chips durch Anregung der Fluoreszenz der gebundenen Moleküle unter Verwendung eines Lasers der geeigneten Wellenlänge bestimmt werden. Geeignete Komponenten für diesen Zweck können Amino-, Carboxyl- oder andere reaktive Derivate von Fluorescein, Rhodamin oder Texas Red sein, welche dem Fachmann bekannt sind und auch kommerziell erhältlich sind (z.B. siehe Molecular Probes, Inc.).
Die Isothiocyanate von Fluorescein, Rhodamin und Texas Red reagieren zum Beispiel in einer irreversiblen und kovalenten Weise mit jeglichen freien Aminogruppen auf der Siliciumdioxidoberfläche. Eine Lösung mit einer effektiven Konzentration von Fluorescein (etwa 10 mM) Isothiocyanat (gemischte Isomere) in Aceton oder Dioxan wird auf dem Amin-derivatisierten Siliciumdioxid des Chips für eine ausreichend lange Zeit platziert, typischerweise etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur. Um alles nicht abreagierte Material zu entfernen, wird der Chip mit heißen (d.h. 60°C) Lösungen von Aceton, Hexan und Pentan oder anderen geeigneten Lösungsmitteln gewaschen. Ein Abschnitt auf demselben Chip, der nicht chemisch derivatisiert wurde, wird als Kontrolle in gleicher Weise mit dem Fluorescein-Isothiocyanat behandelt. In einem kleinen Ausmaß ist eine direkte kovalente Reaktion mit dem Glas möglich und daher sollte die Kontrolle ausgeführt werden, um Hintergrundniveaus anzuzeigen. Die Fluoreszenz des gebundenen Fluorescein kann unter Verwendung geeignetet Quellen, wie zum Beispiel ei Argon-Ionenlaser (z.B. 488 nm), vorzugsweise unter Verwendung einer 45° Winkelgeometrie, angeregt werden. Der Argon-Laser kann ferner einen Photomultiplier, ausgestattet mit einem 10 nm Bandpassfilter, zur Detektion der emittierten Fluoreszenzsignale bei etwa 520 nm enthalten. Die Menge an detektierter Fluoreszenz ist eine Funktion des Ausmaßes und der Effizienz der Derivatisierung.
In einer anderen Ausführungsform, die hierin vorgesehen ist, kann eine reflektierende Oberfläche, z.B. MYLAR, wie oben beschrieben so derivatisiert werden, dass ein Antiligand direkt an die schützende, aktivierende äußere Oberfläche, welche die reflektierende Metallschicht überlagert, wie zum Beispiel eine derivatisierte Silanschicht, immobilisiert werden kann. Da die Photodioden durch gebundene Antiliganden nicht verdeckt sind, wird in dieser Ausführungsform Licht, welches durch das Biolumineszenz erzeugende System erzeugt wird, durch den Antiliganden nicht gestreut oder absorbiert werden.
D. Bildung von Luciferase-Konjugaten
1. Linker
Die Konjugation einer Luciferase an einen Antiliganden, z.B. einen Antikörper, ein Oligonukleotid oder eine Peptidnukleinsäure, kann in der Abwesenheit oder Anwesenheit einer Linkersequenz unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, erreicht werden. Jeder Linker, der dem Fachmann bekannt ist, kann hierin verwendet werden. Verfahren zur Verknüpfung einer Luciferase mit einem Antikörper werden in den US-Patenten 4,657,853; 5,486,455 und der Internationalen Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 96/07100 beschrieben.
Andere Linker sind geeignet für die Inkorporation in chemisch verknüpfte Proteine. Solche Linker schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Disulfidbindungen, Thioetherbindungen, beeinträchtigte Disulfidbindungen und kovalente Bindungen zwischen freien reaktiven Gruppen, wie zum Beispiel Amin- und Thiolgruppen. Die Bindungen werden hergestellt unter Verwendung heterobifunktionaler Reagenzien, um reaktive Thiolgruppen an einem oder beiden der Polypeptide zu erzeugen und dann Umsetzung der Thiolgruppen an einem Polypeptid mit reaktiven Thiolgruppen oder Amingruppen, an welche reaktive Maleimidgruppen oder Thiolgruppen angeheftet werden können an das andere. Andere Linker schließen säurespaltbare Linker ein, wie zum Beispiel Bismaleimidethoxypropan; Cross-Linker, welche infolge von Exposition gegenüber UV- oder sichtbarem Licht gespalten werden. In einigen Ausführungsformen können mehrere Linker eingeschlossen sein, um den Vorteil der gewünschten Eigenschaften jedes Linkers zu nutzen.
Chemische Linker und Peptidlinker können durch kovalentes Koppeln des Linkers an den Antiliganden und an die Oberfläche des Chips insertiert werden. Die heterobifunktionellen Mittel, welche unten beschrieben werden, können verwendet werden, um solches kovalentes Koppeln zu bewirken. Peptidlinker können auch durch Expression von DNA, welche den Linker und den Antiliganden, z.B. ein Antikörper, kodiert, als ein Fusionsprotein verknüpft werden.
Eine Vielzahl von heterobifunktionalen Crosslink-Reagenzien, die verwendet werden, um kovalente Bindungen zwischen Aminogruppen und Thiolgruppen auszubilden und um Thiolgruppen in Proteine einzuführen, sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. PIERCE CATALOG, Immuno Technology Catalog & Handbook, 1992–1993, welches die Herstellung und die Verwendung von solchen Reagenzien beschreibt und kommerzielle Quelle für solche Reagenzien bietet; siehe auch z.B. Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3: 397–401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47: 5924–5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 308–312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2: 191–197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 723–737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 163–170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66: 361–366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584–589). Diese Reagenzien können auch verwendet werden, um kovalente Bindungen zwischen dem Antiliganden und den Luciferasemolekülen zu bilden. Diese Reagenzien schließen ein, sind aber nicht limitiert auf: N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP; Disulfidlinker); Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamid]hexanoat (Sulfo-LC-SPDP); Succinimidyl-oxycarbonyl-α-methylbenzylthiosulfat (SMBT, beeinträchtigter DisulfatLinker); Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamid]hexanoat (LC-SPDP); Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC); Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)butyrat (SPDB; beeinträchtigter Disulfid-Bindungslinker); Sulfosuccinimidyl 2-(7-azido-4-methylcumarin-3-acetamid)ethyl-1-3'-dithiopropyonat (SAED); Sulfosuccinimidyl 7-azido-4-methyl-cumarin-3-acetat (SAMOA); Sulfosuccinimidyl 6-[apha-methyl-alpha-(2-pyridyldithio)toluolamid]hexanoat (Sulfo-LC-SMPT); 1,4-di-[3'-(2'-pyridyldithio)propionamid]butan (DPDPB); 4-succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridylthio)toluol (SMPT, beeinträchtigter Disulfatlinker); Sulfosuccinimidyl-6-(α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluolamid]hexanoat (Sulfo-LC-SMPT); m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS); m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimidester (Sulfo-MBS); N-succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat (STAB; ThioetherLinker); Sulfosuccinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat (sulfo-SIAB; Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB); Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (sulfo-SMPB); Azidobenzylhydrazid (ABH).
Säurespaltbare Linker, photospaltbare und hitzesensitive Linker können auch verwendet werden, insbesondere wo es nötig sein kann, dass auf die Zielstruktur gerichtete Mittel zu spalten, um ihm zu erlauben, für die Reaktion leichter zugänglich zu sein. Säurespaltbare Linker schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Bismaleimidethoxypropan und Adipinsäuredihydrazid-Linker (siehe z.B. Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584–589).
2. Luciferase-Fusionsproteine
Zusätzlich zu den Antikörper-Luciferase-Konjugaten wird zur Verwendung hierin auch die Fusion eines rekombinanten Luciferase-Proteins mit einem Antiliganden, z.B. einem Antikörper oder einem F(Ab)₂-Antigen bindendem Fragment davon, betrachtet. DNA, welche für einen monoklonalen Antikörper kodiert, kann zum Beispiel mit einer DNA, welche für eine Luciferase kodiert, ligiert werden oder die Luciferase kann mit einem Antikörper verknüpft werden [siehe z.B. US-Patent 4,478,817, welches Antikörper/Luciferase-Konjugate und die Verwendung hiervon beschreibt].
3. Nukleinsäure- und Peptidnukleinsäure-Konjugate
Die hierin beschriebenen Luciferase-Moleküle können auch mit Nukleinsäuren oder Peptidnukleinsäuren konjugiert werden. Die Kopplung kann auch in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Linkers erreicht werden. Verfahren zum Konjugieren von Nukleinsäuren an den 5'-Enden, 3'-Enden und anderswo mit den Amino- und Carboxyltermini und anderen Stellen in Proteinen sind dem Fachmann bekannt (für eine Übersicht siehe z.B. Goodchild (1993) in: Perspectives in Bioconjugate Chemistry, Means Hrsg., American Chemical Society Washington, D. C. Seiten 77–99. Proteine wurden zum Beispiel mit Nukleinsäuren unter Verwendung ultravioletter Strahlung (Sperling et al. (1978) Nucleic Acids Res. 5: 2755–2773; Fisher et al. (1975) FEBS Lett. 52: 281–283), bifunktioneller Chemikalien (Bäumen et al. (1978) Eur. J. Biochem. 89: 353–359; und Oste et al. (1979) Mol. Gen. Genet. 168: 81–86) und photochemischem Crosslinken (Vanin et al. (1981) FEBS Lett. 124: 89–92; Rinke et al. (1980) J. Mol. Biol. 137: 301–314; Millon et al. (1980) Eur. J. Biochem. 110: 485–454) verknüpft.
Zusätzlich kann der Carboxylterminus von Luciferase unter Verwendung von Standard-Carbodiimidpeptidchemie mit einer der freien Aminogruppen von Peptidnukleinsäuren konjugiert werden [z.B. siehe Nielsen et al. (1990) Science 254: 1497–1500; Pfeffer et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 10648–10652].
Zusätzliche Stellen für die Konjugation können auch durch chemische Modifikation von einer oder mehrerer Positionen in das Nukleinsäuremolekül eingeführt werden oder durch die Einführung einer kleinen antigenischen Determinante, welche kovalent an das 5'- oder 3'-Ende des Moleküls gekoppelt ist. Eine breit gefächerte Auswahl von kleinen antigenischen Determinanten (d.h. His Tags, flg Antigene, S-Tags, Dioxigenin und dgl.) sind dem Fachmann bekannt und auch kommerziell erhältlich [z.B. Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; Novagen, Inc., Madison WI]. Modifizierte Nukleinsäure- und Peptidnukleinsäure-Analoga können auch durch direkte chemische Synthese unter Verwendung von Standard-Phosphoroamididchemie und kommerziell erhältlichen modifizierten Nukleosidtriphosphaten-Analoga (z.B. 5'-thioliertes Nukleosidtriphosphat und Oligonukleotide) synthetisiert werden. 5'- und 3'-thiolierte Oligonukleotide sind auch kommerziell erhältlich [z.B. Operon Technologies, Alameda, CA].
E. Radiolaria und Kieselalgen zur Auftragung von Siliciumdioxid auf Matrizen
Ein Verfahren zur Anwendung von Biomineralisierung, um Siliciumdioxid auf einem Matrixmaterial abzuscheiden, befindet sich hierin auch. Das Verfahren verwendet Kieselalgen- und Radiolaria-Enzyme und Zellwandproteine, um die Polymerisierung von Siliciumdioxid entlang der Schnittstellenregion der Matrix abzuscheiden, wobei eine Matrix-Siliciumdioxid-Mesostruktur gebildet wird. Dieses Verfahren kann in der Halbleiterindustrie zur Herstellung von Siliciumdioxidchips, die breit gefächerte Endnutzeranwendungen besitzen, verwendet werden.
Organismen, wie Kieselalgen und Radiolaria, synthetisieren ausgeklügelt biomineralische auf Siliciumdioxid basierende Zellwände, auch als Frustulum/Frustles oder Exoskelette bezeichnet, welche hierarchische Strukturen zeigen, ausgestaltet in Größen von weniger als einem Mikrometer bis zu Millimetern [z.B. siehe im Allgemeinen Anderson (1983) in Radiolaria, Springer-Verlag, N.Y.; Sullivan (1986) Ciba Dound. Symp. 121: 59–89]. Die zwei Grundprinzipien der Architektur in Kieselalgenzellwänden sind Zellwände mit radialer Symmetrie (zentrische Kieselalgen: z.B. Cylindrotheca crypta) und solche mit bilateraler Symmetrie (gefiederte Kieselalgen; z.B. Navicula peliculosa und C. fusiformis).
Die Kieselalgenzellwand umfasst zwei Teile, das Epitheca und das Hypotheca. Jedes Theca ist zusammengesetzt aus einer Röhre und mehreren Siliciumdioxidstreifen, Gürtelbändern, welche zusammengesetzt sind aus amorphen, hydratisierten Siliciumdioxid und anderen organischen Komponenten [z.B. siehe Volcani (1981) in Silicon and Siliceous Strucutres in Biological Systems, Simpson and Volcani, eds, Seiten 157–200, Springer-Verlag; Kroger et al. (1996) EMBO 13: 4676–4683]. Der hauptsächliche organische Proteinanteil dieser Zellwände ist eine Familie von Proteinen, bekannt als Frustuline [siehe z.B. Kroger et al. (1996) Eur. J. Biochem. 239: 259–264]. In Meereskieselalgen werden nach der Zellteilung und Cytokinese des Mutterprotoplasten neue Röhren hergestellt. Der sich ergebende Tochterprotoplast erzeugt eine neue Röhre in einer spezialisierten intrazellulären Organelle, dem Siliciumdioxid-Ablagerungsvesikel. Siliciumdioxid wird in das Siliciumdioxid-Lemma transportiert, wo sich Keimbildung und epitaxiales Wachstum von Si-Monomeren an einer Matrize vollzieht oder eine Komplexpolymerisierung von Siliciumdioxid vollzieht sich innerhalb der Vesikel [siehe z.B. Pickett-Heaps et al. (1979) Bio. Cell. 35: 199–203; Sullivan (1986) Ciba Found. Symp. 121: 59–89; Pickett-Heaps et al. (1990) Prog. Phycol. Res. 7: 1–186].
In Radiolaria ist die Ausscheidung des Silicatskeletts verbunden mit einer zytoplasmatischen Hülle, die das Skelett, welches „Cytokalymma" genannt wird, umfasst, gestaltet und ausscheidet. Die Dicke des Skeletts kann durch den physiologischen Zustand des Organismus beeinflusst sein. Das Cytokalymma kann in analoger Weise wie das Silicalemma in der Siliciumdioxidabscheidung in Kieselalgen wirken.
Künstliche anorganische Anordnungen, die Kieselalge oder Radiolaria-Exoskelette nachahmen, sind beschrieben worden [z.B. siehe Oliver et al. (1995) Nature 378: 47–50; US-Pat. Nrn. 5,057,296, 5,108,725 und 5,364,797). Einige Morphologien von Mesophasen können ausgebildet werden, z.B. lammelar, hexagonal und kubische Mesostrukturen – abhängig von den gewählten Ausgangsmaterialien und verwendeten Bedingungen. Diese kristallinen Mesostrukturen können jedoch nur bei höheren Temperaturen gebildet werden, was für die Verwendung mit bestimmten Matrixmaterialien ungeeignet sein kann.
Es wurden Modelle vorgeschlagen, um den Biomineralisierungsprozess und auch die Bildung und Morphologie dieser oberflächenaktiven Silicatmesostrukturen zu erklären [siehe z.B. Sullivan Monnier et al. Science 261: 1299–1303]. Es wird zum Beispiel postuliert, dass die Kontrolle über die Silicatwanddicke zum Doppelschichtpotenzial in Beziehung steht: Silicat-Arten speichern nur an der Oberflächengrenzfläche, welche die Wand verstärken oder amorphes loses Siliciumdioxid erzeugen würde, das geschieht nicht wegen der starken elektrostatischen Abstoßung, erzeugt durch die hohe negative Ladung auf den Silicatarten bei den hohen pH-Werten, bei welchen diese gebildet werden, z.B. pH 12 und darüber [z.B. Ilier (1979) in The Chemistry of Silica, S. 182, Wiley, New York].
Künstliche Anordnungen von mesoporösem kristallinem Material, welches M41S enthält, ist in Sensorvorrichtungen eingearbeitet worden, einschließlich Biosensoren [siehe z.B. US-Pat. Nr. 5,346,797]. In Biosensoren wird einer von beiden biologischen Analyten von jedem Paar an dem kristallinen Trägermaterial mit übergroßen Poren durch kovalentes Binden von Silanolen in das kristalline Material befestigt [z.B. Harlow et al. Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laborstory (1988)]. Der Analyt, z.B. ein Antikörper, wird befestigt und die Wechselwirkung zwischen dem befestigten Analyten und der Testprobe wird überwacht.
Die auf Siliciumdioxid basierenden Zellwände der Kieselalge entsprechen in ihrer Struktur den oben beschriebenen künstlichen Anordnungen. Daher können dieses Siliciumdioxid-Ablagerungen eine ähnliche Morphologie und optische Eigenschaften wie die Glasfaser-Sensoren in den M41S künstlichen Anordnungen, welche in Biosensoren und anderen molekularen biologischen Geräten verwendbar sind [siehe z.B. U.S. Pat. Nr. 5,364,797], besitzen.
Ein Verfahren zur Verwendung von Biomineralisierung unter Verwendung von Enzymen und Zellwandproteinen des Silicalemma und/oder Siliciumdioxid- abscheidenden Vesikeln aus Kieselagen, um Siliciumdioxid auf der Oberfläche eines Matrixmaterials eines Chips abzuscheiden, wird hierin zur Verfügung gestellt. Siliciumdioxid kann auf einem Matrixmaterial, das mit einem gleichmäßigen Überzug von einer Si Formatvorlage verknüpft wurde, unter Verwendung eines Silicalemma, welches aus einer Kieselalge isoliert wurde, abgeschieden werden. Das abgeschiedene Siliciumdioxid kann an der Matrix durch einen anderen geeigneten Linker, wie zum Beispiel Zucker oder andere Diol-enthaltende Komponenten, befestigt werden. Alternativ können die Komponenten des Silicalemma unter Verwendung von Verfahren wie sie dem Fachmann in der Proteinchemie bekannt sind weiter aufgereinigt werden.
F. Verfahren zur Verwendung
1. Immunountersuchungen
Die hierin beschriebenen Chips können in diagnostischen Untersuchungen verwendet werden. Die Chips werden zum Beispiel in einer Immunosandwich-Untersuchung zur Detektion infektiöser Mittel unter Verwendung von Antikörpern, gerichtet gegen infektiöse Mikroorganismen, z.B. Bakterien, Viren, Protozoa und andere niedere eukaryotische Organismen, verwendet. 20 erläutert ein Verfahren worin ein spezifischer monoklonaler Antikörper gegen E. coli (Unterart) 518 in eine leere Testvertiefung 520 eingebracht wird. Eine Urintestprobe wird in die Testvertiefung eingebracht, inkubiert und gespült um E. coli Bakterien, die an den Antikörper 522 fixiert sind, zu erzeugen. Eine Mischung von vielen verschiedenen Antikörpern, welche spezifisch für viele Typen von Bakterien (nicht nur E. coli) sind, wird zugegeben. Nur der E. coli Antikörper wird anhaften werden. Die Antikörper sind eigens mit einem Luciferase Licht-erzeugendem Protein hergestellt, welches an diese anhaftet. Dann fusioniert die Luciferase-Region 524 mit dem Antikörper 526 an der Fusionsstelle 528.
Die Mischung wird abermals abgespült und Luciferin wird zugegeben, um Licht zu erzeugen. Das Licht trifft den CCD Chip Photodetektor, um ein Signal zu erzeugen, welches an einen Computer verschickt wird. Eine Vielzahl von Antiliganden, z.B. Antikörper, ist verknüpft mit jeder Stelle oder Mikrostelle auf dem Chip oder ist befestigt an einer geeigneter Schicht der reflektierenden mittleren Schicht eines Chips mit mehreren Vertiefungen, wobei ein Panel von Antikörpern erstellt wird, welche gegen einen speziellen Mikroorganismen gerichtet sind. Der Chip mit gebunden Antikörpern wird direkt in einer Probe eines Körperfluids, welches von einem Patienten erhalten wird, z.B. Urin, Sputum oder Blut, plaziert.
Genügend Zeit wird gewährt, um Antikörper-Antigen-Komplexe auszubilden und der Chip wird entfernt und sorgfältig gespült. Eine Lösung, die eine Vielzahl von Zweitantikörpern enthält, welche gegen ein Panel von bekannten Pathogenen, konjugiert mit einer Luciferase oder einem Luciferaseprotein, gerichtet sind, wird zugegeben, welche gegen dasselbe Antigen oder ein anderes Antigen, welches auf der angezielten Spezies anwesend ist, gerichtet sein kann. Wahlweise kann ein Phage oder Virus, der genetisch manipuliert wurde, um DNA, welche für eine Luciferase codiert zu enthalten, zum Einsatz kommen. Vorzugsweise besitzt der Virus oder Phage eine breite Spezifität.
Der Chip oder die einzelne Vertiefung wird gewaschen und die verbleibenden Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden Systems, z.B. ein Luciferin und jede notwendigen Aktivatoren, werden zugegeben. Wenn ein Antigen detektiert worden ist, wird Licht von der gebundenen Luciferase emittiert, welches wiederum durch die Photodioden, die innerhalb der Halbleiterschicht in dem angeschlossenen Chip lokalisiert sind, detektiert wird. In dem Chip-System mit vielen Vertiefungen, wird das Ausgabesignal der biolumineszenten Reaktion verstärkt durch Detektion von Licht, das von der Reaktion gerichtet emittiert wird, ebenso wie Licht, das von der mittleren Schicht abreflektiert wird [z.B. siehe 10 & 11]. Das Ausgabedatensignal kann wahlweise verstärkt und/oder gebündelt werden, bevor es an eine verarbeitende Einheit eines Computer zur Datenanalyse verschickt wird.
Die Untersuchung kann durch Zugabe einer bekannten Menge von Luciferin zu der Vertiefung und durch Messung der Geschwindigkeit der Verwendung des Luciferins quantitativ verwendet werden (d.h. eine Abnahme in der Lichterzeugung über die Zeit ist proportional zu der Menge anwesend in der Probe wie im Vergleich zu Kontrollen).
2. Nukleinsäure-Hybridisierungsuntersuchungen
Die hierin beschriebenen Chips können auch in Nukleinsäure-Hybridisierungsuntersuchungen verwendet werden. Zum Beispiel ist eine gewünschte Nukleinsäure oder Peptid-Nukleinsäureprobe oder eine Nukleinsäure, die mit einem Peptid verküpft ist, direkt oder über eine Linkergruppe kovalent an die derivatisierte Siliziumdioxidoberfläche des Chips gekoppelt. Die Nukleinsäuren können an die vollständige Oberfläche gekoppelt sein, oder der Chip kann zu einer oder mehreren Mikrostellen auf dem Chip in dem Array-Format hinzugefügt werden.
Die infektiösen Mittel, die in der biologischen Probe anwesend sind, werden unter Verwendung chemischer, enzymatischer oder physikalischer Mittel lysiert und die Nukleinsäuren, vorzugsweise DNA, werde aus der Probe unter Verwendung von Standardverfahren, welche dem Fachmann bekannt sind, isoliert [z.B. siehe Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. Wahlweise kann die Probe ohne Reinigung der Nukleinsäurearten analysiert werden.
Die Nukleinsäure wird im Hybridisierungspuffer resuspendiert und die Probe wird auf die Oberfläche des Chips aufgebracht und bei der gewünschten Hybridisierungstemperatur inkubiert. Nach dem Gewähren einer ausreichenden Zeit zur Hybridisierung, wird der Chip sorgfältig gewaschen und dann unter den geeigneten Stringenz-Bedingungen, wie sie hierin beschrieben sind, d.h. Hoch- oder Niedrigmedium, gewaschen. Die komplementäre Nukleinsäure, welche auf dem Chip immobilisiert ist, wird durch die Zugabe eines Antiliganden detektiert, der mit einer Komponente eines Biolumineszenz erzeugenden Systems konjugiert ist, vorzugsweise einer Luciferase. Bevorzugte Antiliganden sind anwesend Antikörper oder F(Ab)₂ Fragmente davon, die vorzugsweise doppelsträngige Nukleinsäuren erkennen oder die assoziierte kleine antigenische Determinante. Antikörper, die doppelsträngige DNA erkennen, sind mit einer Anzahl von Autoimmun-Erkrankungen assoziiert [z.B. siehe Tsuzaka et al. (1996) Clin. Exp. Immunol. 106: 504–508; Kanda et al. (1997) Arthritis Rhem. 40: 1703–1711].
Der Chip oder die einzelne Vertiefung wird gewaschen um ungebundenes Antikörper-Luciferase-Konjugat zu entfernen und dann werden die verbleibenden Komponenten des Biolumineszenz-erzeugenden Systems, z.B. ein Luciferin und beliebige notwendige Aktivatoren, werden zugegeben. Wenn eine komplementäre Nukleinsäure oder Peptid-Nukleinsäure detektiert worden ist, wird Licht von der gebundenen Luciferase emittiert, welches wiederum durch die Photodioden, lokalisiert innerhalb der Halbleiterschicht in dem angeschlossenen Chip, detektiert wird.
Die Untersuchung kann durch Zugabe einer bekannten Menge von Luciferin zu der Vertiefung und durch Messung der Geschwindigkeit der Verwendung des Luciferins quantitativ verwendet werden (d.h. eine Abnahme in der Lichterzeugung über die Zeit ist proportional zu der Menge anwesend in der Probe wie im Vergleich zu Kontrollen).
3. Detektion von antibiotischer Sensitivität
Unter anderen Verwendungen für den Chip ist das Testen auf Sensitivität eines klinischen Isolats gegenüber bekannten Antibiotika oder als eine Vorrichtung um auf antibakterielle Mittel zu überprüfen. Zum Beispiel kann nach der Detektion von Lichtemission aus einer als Zielstruktur gesetzten Vertiefung ein Isolat direkt in der Vertiefung über eine kurze Dauer durch die Zugabe eines geeigneten Wachstumsmediums [z.B. L-Broth oder anderes undefiniertes Medium], gefolgt von einer Inkubation unter geeigneten umfeldbedingten Bedingungen, wie zum Beispiel Temperaturen von 20°C bis 42°C unter aeroben oder anaeroben Atmosphären, angezogen werden.
Die wachsenden Bakterien werden dann mit einem Bakteriophagen infiziert, wie zum Beispiel lambda oder P22 für Enterobakterien, der genetisch manipuliert worden ist, um für Glühwürmchen Luciferase zu codieren, welche verfügbares ATP als einen Cofaktor erfordert [siehe z.B. Abschnitt B.4]. Die Expression intrazellulärer Luciferase in diesen Bakterien, in Anwesenheit von ATP, führt zu der Erzeugung von Licht.
Die Wirksamkeit einer antibotischen Therapie kann in diesem System durch Inkubation einer wirksamen Konzentration eines Antibiotikums und Beobachtung der anschließenden Lichtemission direkt überwacht werden. Wenn das Antibiotikum zu Zelltod führt, wird der intrazelluläre ATP Pool erschöpft werden und dadurch die biolumineszente Reaktion hemmen. Die Lichtabnahme deutet an, dass das spezielle Antibiotikum oder die Komponente wirksam ist. In anderen Ausführungen werden die Bakterien mit Testkomponenten inkubiert und die anitbakterielle Aktivität der Testkomponente wird festgestellt.
4. Synthetische Synapse
Versionen der Chips, die hierin vorgesehen sind, können auch verwendet werden, um eine synthetische neuronale Synapse erzeugt werden. 17 zeigt eine Silizium-Synapse 500 zur Bereitstellung einer neuronalen Eingabe an eine Schnittstelle mit einem Computer zum Zweck der Umgehung von Rückenmark-Läsionen, so dass eine eingeschränkte motorische Kontrolle zu den Muskeln distal zur spinalen Läsion gebracht werden kann. In einem molekularen Maßstab schließt die Silizium-Synapse ein AChE-Fusionsprotein 502, einen Mikroanschluß 504 zum Freigeben von Ephitel-Wachstumsfaktoren und Nerven-Wachstumsfaktoren, einen CCD Chipdetektor 506 und einen LED Laser 508 ein. Ein parabolischer Spiegel 510 reflektiert Laserlicht zurück zu dem CCD-Detektor. In einem gröberen Maßstab können mehrere Silizium-Synapse-Einsätze in absteigende motorische Einheiten in das Rückenmark 512 eingesetzt werden. In einem einzelnen neuronalem Maßstab wird ein Axon 514 eines motorischen Neurons 516 mit der Silizium-Synapse 500 gekoppelt. Ein geeignetes Enzym, vorzugsweise eine Acetylcholinesterase wird mit einer Luciferase fusioniert, wie zum Beispiel durch rekombinante Expression. Die Luciferase ist entweder in einer inaktiven oder aktiven Konformation. Geeignete Mutationen in jedem Protein können ausgewählt werden, um sicherzustellen, dass sich die Luciferase geeigneten konformationellen Änderungen wie hierin beschrieben unterziehen kann. Die sich ergebende Fusion wird an einem Chip befestigt, wie zum Beispiel ein Chip der hierin vorgesehen ist. Das Neuron oder Fibrillenbündel oder Neuronen wird in enger Nähe zu dem Fusionsprotein gehalten, verknüpft mit dem Chip durch Bereitstellung neuronaler Wachstumsfaktoren, z.B. EGF oder NGF, nahe der Platzierung des Chips durch einen Mikroanschluß um einen örtlichen Axon-Auswuchs zu begünstigen und aufrechtzuerhalten [siehe 17].
Die Silizium-Synapsen-Elektroden können in einen betroffenen Patienten durch Insertion in die geeigneten stereotaktischen Stellen im Rückenmark durch Kernspinresonanz-Lokalisierung permanent implantiert werden. 19 zeigt die Platzierung von Silizium-Synapsen-Elektroden. Die Platzierung der Elektroden in die richtigen stereotaktischen Stellen kann durch Kernspinresonanz-Lokalisierung erreicht werden. Laser-Mikrolöcher können durch einen geeigneten CO₂ Laser oder anderen Laser in das Rückenmark gebohrt werden. Die Plazierung würde variieren von oberflächlich bis tief entlang der bekannten Bahnen and dort könnten mehrere Leitungen, die zum Computer führen, sein, z.B. rechts/links/lateral; medial/lateral oder dorsal. Zu Beginn können zwei Kanäle auf jeder Seite verwendet werden, aber viele mehr können plaziert werden. Muskelbewegungen können durch die Insertion von permanenten Elektroden in verschiedene Muskelbündel initiiert werden. Der Patient wird die Leistung durch daran denken kontrollieren und dadurch die motorischen Fähigkeiten, wie zum Beispiel Laufen, wieder erlernen. Um die Elektroden zu implantieren werden Mikrolöcher in das Rückenmark unter Verwendung eines geeigneten Lasers, wie zum Beispiel ein CO₂ Laser, gebohrt und die Elektrode wird in räumlicher Nähe zu einer bekannten Nervenfaser oder einem -bündel platziert. Die Platzierung der Silizium-Synapse kann innerhalb des Rückenmarks entlang der bekannten neuronalen Bahnen von oberflächlich bis tief reichen. Eine genaue Überwachung des entsprechenden Neurons ist bevorzugt, wenn auch nicht essentiell, da das menschliche Gehirn sich selbst neu programmieren wird um das Signal entlang dieser Neuronen, die das passende Signal übertragen, zu senden.
Die Übertragung von neuronalen Impulsen bezieht verschiedene Neurotransmitter, wie zum Beispiel Acetylcholin, welche in die Synapse freigesetzt werden, mit ein. Nach dem Binden des Liganden an das Enzyme, wie zum Beispiel dem Binden von Acetylcholin an die Esterase, wird die verknüpfte Luciferase, wenn zuvor inaktiv, durch das Binden aktiviert, oder wird, wenn zuvor aktiv, durch das Binden inaktiviert. 18 zeigt eine detallierte Ansicht eines Acetylcholinesterasefluoreszenten Proteins, welches mit einer Silizium-Synapse verwendet werden kann. Der Nerv muss in der üblichen Weise Acetylcholin für das neuronale Axon freisetzen, um ein Signal zu der Silizium-Synapse zu übermitteln. Das Acetylcholin muss in enger räumlicher Nähe zu dem Fusionsprotein sein. Wachstumshormone können langsam durch einen Mikroanschluß in den Bereich abgegeben werden, um das Neuron in Verbindung mit der Silizium-Synapse zu halten. Eine Elektrode ist in der Nähe, welche die Ursache dafür ist, dass das Neuron die künstliche Synapse durch die Eingabe von schwachen und kleinen elektrischen Strömen "fühlt". Eine "Rohversion" der Synapse verfügt über keinen Laser, sondern nur einen CCD- und einen Luciferin-Anschluss. Eine "elegante" Version verwendet einen Laser um das Fusionsprotein anzuregen zu fluoreszieren wenn Acetylcholin anwesend ist. Das Fusionsprotein vollzieht eine konformationelle Änderung, um aktiv zu werden, wenn ACh anwesend ist. Das Fusionsprotein ist nicht antigenisch und es ist stabil, so dass es nicht gewechselt werden muß. In Anwesenheit der verbleibenden Komponenten eines Bioluminszenzerzeugenden Systems wird Licht erzeugt (oder wird gequenched), welche Veränderung durch die Photodioden, die verbunden mit dem Chip sind, detektiert wird. Dies detektiert eines oder mehrere elektrische- oder Daten-Signale, welches) durch einen oder mehrere Leitungsdrähte an einen Computer verschickt wird/werden, wie zum Beispiel ein Miniatur-Computer, der an einem Gürtel befestigt ist, welcher die Information verarbeitet. Die verarbeitete Information wird durch geeignete Mittel, wie zum Beispiel eine Faser, zu einer oder mehreren Elektroden, welche an jegliche gewünschte Vorrichtung oder einen Effektor befestigt sind, vorzugsweise einen Muskel, übertragen. Auf Erhalt des Signals hin, vollzieht sich Arbeit, wie zum Beispiel ein Muskelzucken, und Körperbewegungen können angeregt werden. Die Vorrichtungen werden in einer Weise eingesetzt, die den Läsionsbereich des Rückenmarks überbrückt [siehe z.B. 17].
Alternativ kann die Acetylcholin bindende Region von Acetylcholinesterase mit einem Fluorochrom oder Phycobiliprotein fusioniert werden und in Verbindung mit einem Laser verwendet werden. In dieser Ausführungsform wird monochromatisches Licht einer bekannten Wellenlänge durch einen Laser erzeugt, um einen Fluorophor anzuregen und die emittierte Fluoreszenz wird durch einen parabolischen Spiegel zu der Photodiodenoberfläche des Chips gelenkt [siehe z.B. 17 & 18] und das emittierte Licht wird detektiert und eingesetzt wie für die Biolumineszenz beschrieben.
Da Modifizierungen für den Fachmann offensichtlich sein werden, ist es bestimmungsgemäß, dass diese Erfindung nicht nur auf den Anwendungsbereichs der angefügten Ansprüche beschränkt ist.
Zusammenfassung von Sequenzen von repräsentativen Luciferasen und der Reduktase dargelegt in der Sequenzauflistung

1. SEQ ID Nr. 1 Renilla reinformis Luciferase [U.S. Patent Nr. 5,418,155]
2. SEQ ID Nr. 2 Cypridina hilgendorfii Luciferase [ EP 0 387 355 ]
3. SEQ ID Nr. 3 Modifizierte Luciola cruciata Luciferase [Glühwürmchen; U.S. Patent Nr. 4,968,613]
4. SEQ ID Nr. 4 Vargula (Cypridina) Luciferase [Thompson et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6567–6571 und von JP 3-30678 Osaka]
5. SEQ ID Nr. 5 Apoaequorin codierendes Gen [U.S. Patent Nr. 5,093,240, pAQ440]
6. SED ID Nr. 6 Rekombinantes Aequorin AEQ1 [Prasher et al. (1987) "Sequence Comparisions of cDNAs Encoding for Aequorin Isotypes", Biochemistry 26: 1326–1332]
7. SEQ ID Nr. 7 Rekombinantes Aequorin AEQ2 [Prasher et al. (1987)]
8. SEQ ID Nr. 8 Rekombinantes Aequorin AEQ3 [Prasher et al. (1987)]
9. SEQ ID Nr. 9 Aequorin Photoprotein [Charbonneau et al. (1985) "Amino Acid Sequence of the Calcium-Dependent Photoprotein Aequorin", Biochemistry 24: 6762–6771]
10. SEQ ID Nr. 10 Aequorin Mutante mit gesteigerter Biolumineszenz-Aktivität [U.S. Patent Nr. 5,360,728; Asp 124 ausgetauscht zu Ser]
11. SEQ ID Nr. 11 Aequorin Mutante mit gesteigerter Biolumineszenz-Aktivität [U.S. Patent Nr. 5,360,728; Glu 135 ausgetauscht zu Ser]
12. SEQ ID Nr. 12 Aequorin Mutante mit gesteigerter Biolumineszenz-Aktivität [U.S. Patent Nr. 5,360,728; Gly 129 ausgetauscht zu Ser]
13. SEQ ID Nr. 13 Rekombinantes Apoaequorin [verkauft durch Sealite, Sciences, Bogart, GA wie AQUALITE^®, wenn rekonstituiert um Aequorin zu bilden]
14. SEQ ID Nr. 14 Vibrio fisheri Flavin Reduktase [U.S. Patent Nr. 5,484,723]

Sequenz-Auflistung:

Claims

Mikroelektronische Vorrichtung (100), umfassend: ein Substrat (140); eine Vielzahl von Mikrostellen (142) festgelegt auf dem Substrat (140), wobei jede Mikrostelle (142) zum Koppeln eines Makromoleküls vorgesehen ist; ein unabhängiger Photodetektor (144), optisch mit jeder Mikrostelle (142) gekoppelt, wobei jeder Photodetektor (144) konfiguriert ist, um ein abgetastetes Signal in Reaktion auf Lichtphotonen (202), die an der korrespondierenden Mikrostelle (142)), wenn eine lichtemittierende chemische Reaktion an der Mikrostelle (142) stattfindet, emittiert werden, wobei jeder Photodetektor (144) unabhängig ist von den Photodetektoren, die an andere Mikrostellen (142) optisch gekoppelt sind; und ein elektronischer Schaltkreis (100–138), der an jeden Photodetektor (144) gekoppelt ist und der konfiguriert ist, um das abgetastete Signal, welches durch jeden Photodetektor (144) erzeugt wird, zu lesen und davon Ausgabedaten-Signale zu erzeugen, welche das Licht, das an jeder Mikrostelle (142) durch die lichtemmitierenden chemischen Reaktionen emittiert wird, anzeigen, wobei die Vorrichtung (100) Lichtphotonen (202) detektiert, die durch lichtemittierende chemische Reaktionen emittiert werden, worin: das Substrat (140) eine Oberfläche umfasst, wobei jede Mikrostelle (142) festgelegt ist als ein Teil der Oberfläche, und jeder Photodetektor (144), einbegriffen einer Photodiode, an dem Teil der Oberfläche an der entsprechenden Mikrostelle (142) angeordnet ist, wobei die Photodiode Lichtphotonen (202), die durch die chemische Reaktion an der Mikrostelle (142) emittiert werden, in einen Photostrom umwandelt, die das abgetastete Signal angibt.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin die Mikrostellen (142) zum Koppeln von Proteinen, Nukleinsäuren oder organischen Molekülen derivatisiert sind.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, die ferner gekoppelte Makromoleküle umfasst.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin die Mikrostellen (142), die auf dem Substrat (140) festgelegt sind, jede einen chemischen Reaktanten umfasst, der Lichtphotonen emittiert (202), wenn eine Reaktion an dieser Mikrostelle (142) stattfindet.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 4, worin der chemische Reaktant eine Komponente eines Biolumineszenz erzeugenden Systems ist.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin das Substrat (140) ein Halbleiter-Substrat ist, das eine Oberfläche umfasst, die zum Koppeln von Makromolekülen geeignet ist, wobei jede Mikrostelle (142) durch einen Anteil der Oberfläche (140) festgelegt ist, der geeignet ist dem einzelnen chemischen Reaktanten an der Mikrostelle (142) eine Kopplung zu ermöglichen.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 6, worin die Oberfläche (140) mit einem inerten Material beschichtet ist, das zum Koppeln von Makromolekülen derivatisiert ist.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, ferner umfassend eine Schicht eines reflektierenden Materials auf dem gesamten oder einem Teil der Oberfläche (140) der Vorrichtung (100) oder über der Oberfläche der Vorrichtung (100), wobei das erzeugte Licht reflektiert wird und so das Lichtsignal, welches durch den Photodetektor (144) detektiert wird, verstärkt wird.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 8, worin das Material gerichtetes Polyethylen-Teraphtalat ist.
Eine mikroelektronische Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Mikrostellen (142), die auf dem Substrat (140) festgelegt sind, auch für die Aufnahme einer flüssigen Probe zur Analyse geeignet sind; und jede Mikrostelle (142) eine Befestigungsschicht umfasst, an welche Makromoleküle gekoppelt sind.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 10, ferner umfassend: ein Makromolekül, welches über die Befestigungsschicht an eine oder mehrere der Mikrostellen (142) gekoppelt ist, worin das Makromolekül selektiv an Analyten bindet, der in der flüssigen Probe, welche durch die Vorrichtung aufgenommen wird, enthalten ist; und jeder Photodetektor (144) konfiguriert ist, um ein abgetastetes Signal in Reaktion auf Lichtphotonen (202) zu erzeugen, wenn der ausgewählte Analyt, der an diese Mikrostelle gebunden ist, einem zweiten Makromolekül ausgesetzt wird, das an das erste Makromolekül oder an den Analyten bindet, gekoppelt mit einer oder mehreren Komponenten einer lichtemittierenden Reaktion in Gegenwart der verbleibenden Komponenten der lichtemittierenden Reaktion.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 11, worin jedes Makromolekül ein Antikörper ist und der Analyt ein Antigen ist.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 10, worin ein Array von Mikrostellen (142) auf dem Substrat (140) zur Aufnahme der zu analysierenden fluiden Probe aus Vertiefungen in der Oberfläche der Vorrichtung (100) festgelegt ist.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 13, worin eine oder eine Vielzahl der Vertiefungen ein reflektierendes Material, angeordnet um die Ränder hiervon oder über die Vertiefung frei hängend, umfasst, wodurch Licht zum Photodetektor (144) reflektiert wird.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 10 oder 11, ferner umfassend eine Schicht von reflektierendem Material auf allen oder einem Teil der probenaufnehmenden Mittel.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 15, worin das reflektierende Material gerichtetes Polyethylen-Teraphthalat ist.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 11, worin die lichtemittierende Reaktion Lumineszenz ist.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 17, worin die Lumineszenz Biolumineszenz ist.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 10 oder 11, ferner umfassend wenigstens eine Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems in jeder Mikrostelle (142), die ein Makromolekül umfasst.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1, 10 oder 11, worin der Photodetektor (144), der optisch an jede Mikrostelle (142) gekoppelt ist, konfiguriert ist, um ein abgetastetes Signal in Reaktion auf Biolumineszenz, welche an der korrespondierenden Mikrostelle (142) emittiert wird, zu erzeugen.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 5 oder einem der Ansprüche 18 bis 20, worin das Biolumineszenz-erzeugende System eine Luciferase und/oder Luciferin umfasst.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 21, worin die Luciferase ein Photoprotein ist.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 21, worin das Biolumineszenz-erzeugende System ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Aequorea-, Vargula-, Renilla-, Obelin-, Porichthys-, Odontosyllis-, Aristostomias-, Pachystomias-, Gonadostomias-, Gaussia-, Halisturia-, Vampir-Kalmar-, Glyphus-, Mycotophiden- (Fisch-), Vinciguerria-, Howella-, Florenciella-, Chaudiodus-, Melanocostus-, Paracanthus-, Atolla-, Pelagia-, Pitilocarpus-, Acanthophyra-, Siphonophore-, Periphylla- Cavamularia-, Ptilosarcus-, Stylatula-, Acanthoptilum-, Parazoanthus- und Seefedern- (Stylata-), Chiroteuthis-, Eucleoteuthis-, Onychoteuthis-, Watasenia-, Kuttelfisch-, Sepiolina-, Krabbe-, Hochseefisch-, Glühwürmchen- und bakteriellen Systemen.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 10 oder 11, worin das Vorrichtung eine Vielzahl von unterschiedlichen Makromolekülen, ein jedes spezifisch für einen unterschiedlichen Analyten, umfasst, wobei jedes unterschiedliche Makromolekül an einer unterschiedlichen Mikrostelle (142) gegenwärtig ist.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 10, worin die Mikrostellen (142) in der Form eines Arrays (104) sind; der Array der Mikrostellen schließt ein erstes und ein zweites Array von Pixel-Elementen ein, umfassend einer ersten beziehungsweise einer zweiten Größe, wobei die erste und zweite Größe unterschiedlich sind.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 25, worin ein Rezeptor Antikörper, der an der Befestigungsschicht des ersten Pixel-Element Arrays angebracht ist, spezifisch ist, um einen ersten gewählten Analyten zu binden und ein Rezeptor-Antikörper, der an der Befestigungsschicht des zweiten Pixel-Element Arrays angebracht ist, spezifisch ist, um einen zweiten gewählten Analyten, der verschieden von dem ersten gewählten Analyten ist, zu binden.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 10 oder 11, worin jede Mikrostelle (142) auf der Oberfläche eines Halbleiter-Substrates (140) angeordnet ist, wobei die Oberfläche an jeder Mikrostelle (142) die Befestigungsschicht für diese Mikrostelle festlegt.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 27, worin die Oberfläche des Halbleiter-Substrats (140) derivatisiert ist, um die Anhaftung eines Rezeptor-Antikörpers an die Befestigungsschicht an jeder Mikrostelle (142) zu verstärken.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 28, worin jeder Photodetektor (144) eine Photodiode, welche auf der Oberfläche der entsprechenden Mikrostelle (142) angebracht ist, einschließt und die Reaktion Lichtphotonen (202) erzeugt, welche durch die Photodiode in einen Photostrom umgewandelt werden, wenn der gewählte Analyt in der Probe gegenwärtig ist, wobei der Photostrom das abgetastete Signal ist, welches durch die Photodiode erzeugt wird.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 7 oder Anspruch 29, worin die elektronische Schaltung eine Pixel-Elementarzellen-Schaltung (200) einschließt, die mit jeder Photodiode und einer delta-sigma A/D Konversionsschaltung verbunden ist, wobei jede Pixel-Elementarzellen-Schaltung (200) konfiguriert ist, um das abgetastete Signal der entsprechenden Photodiode zu integrieren und die A/D Konversionsschaltung konfiguriert ist, um die integrierten abgetasteten Signale zu quantifizieren.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 30, worin jede Pixel-Elementarzelle ansteuerbar ist und die elektronische Schaltung ferner einen Ansteuerregelkreis (102) zum aufeinanderfolgenden Ansteuern jeder Pixel-Elementarzelle einschließt und worin die A/D Konversionsschaltung das integrierte abgetastete Signal der Pixel-Elementarzellen-Schaltung (200), angesteuert durch den Ansteuerregelkreis (102), quantifiziert.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 31, worin jede Photodiode Lichtphotonen (202), emittiert von der chemischen Reaktion, in einen Photostrom umwandelt, umfassend einer Größe, die von der Zahl der Photonen abhängig ist, und jede Pixel-Elementarzellen-Schaltung (200) einen kapazitiven Schaltkreis einschließt, umfassend einer Ladung die mit einer von der Größe des Photostroms abhängigen Geschwindigkeit wechselt, wobei das abgetastete Signal durch den kapazitiven Schaltkreis integriert wird.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 32, worin jede Photodiode Lichtphotonen (202), die durch die chemische Reaktion emittiert werden, in einen Photostrom umwandelt, umfassend einer Größe, die von der Konzentration des gewählten Analyten in einer Probe, die jeder Mikrostelle (142) zugeführt wird, abhängig ist.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 32 oder 33, worin jede Pixel-Elementarzellen-Schaltung (200) einen Ausgangsstrom erzeugt, der von der Ladung des kapazitiven Schaltkreises abhängt, wenn die Pixel-Elementarzellen-Schaltung (200) angesteuert wird, wobei die elektronische Schaltung auch eine Vergleichsschaltung (108) zum Vergleichen des Ausgangsstroms der angesteuerten Pixel-Elementarzellen-Schaltung gegenüber einem Referenzstrom (136) einschließt, um ein Rückkopplungssignal zu erzeugen, welches verwendet wird um die kapazitive Schaltung auf eine anfängliche Ladung zurückzusetzen, wenn die Ausgangsstromübertragung in Bezug auf den Referenzstrom.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 34, worin die elektronische Schaltung ferner eine Ausgangskontrollschaltung (114) umfasst, die das Rückkopplungssignal von jeder angesteuerten Pixel-Elementarzellen-Schaltung erhält und die die Ausgangsdaten-Signale als einen seriellen Datenstrom, der auf den Rückkopplungssignalen beruht, erzeugt, wobei die Geschwindigkeit der Rückkopplungssignal Übertragungen mit jeder Mikrostelle (142) korreliert und so die an dieser Mikrostelle emittierte Biolumineszenz anzeigt.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–24 und 27–34, worin die Mikrostellen (142) als ein Array bereitgestellt werden.
Verfahren zur Detektion und Identifikation von Analyten in einer biologischen Probe, welches die Schritte umfasst: Bereitstellung einer mikroelektronischen Vorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 1–36; Anbringen eines Makromoleküls oder einer Vielzahl verschiedener Makromoleküle auf der Oberfläche an jeder Mikrostelle (142) auf der Vorrichtung (100), worin das Makromolekül spezifisch ist zur Bindung des gewählten Analyten, der gegenwärtig in der biologischen Probe ist; Kontaktieren der Probe mit der Oberfläche der mikroelektronischen Vorrichtung (100), wobei jeder der gewählten Analyten, die in der Probe gegenwärtig sind, an das Makromolekül, welches an der Oberfläche jeder Mikrostelle (142) angebracht ist, bindet; Exponieren der Oberfläche der mikroelektronischen Vorrichtung gegenüber einem zweiten Makromolekül oder einer Vielzahl davon, gebunden an den gewählten Analyten, der bereits an das erste Makromolekül an jeder Mikrostelle gebunden ist, wobei das zweite Makromolekül eine Komponente einer Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion umfasst; Initiieren der Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion durch in Berührung bringen der Oberfläche der Vorrichtung (100) mit den verbleibenden Komponenten der Biolumineszenz-erzeugenden Reaktion; Detektieren von Lichtphotonen (202), die durch die Biolumineszenz-Reaktion emittiert werden, unter Verwendung eines Photodetektors (144), der optisch mit jeder Mikrostelle (142) gekoppelt ist, wobei jeder Photodetektor (144), die Biolumineszenz-Erzeugung an der entsprechenden Mikrostelle (142) darstellend, ein abgetastetes Signal erzeugt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 37, ferner umfassend das Lesen des durch jeden Photodetektor (144) erzeugten abgetasteten Signals und die Erzeugung von Ausgangsdatensignalen hiervon, die die Biolumineszenz anzeigen, die an jeder Mikrostelle (142) durch die Luciferase-Luciferin Reaktion emittiert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 37, ferner umfassend, zwischen den Berührungs- und Exponierungssschritten, das Waschen der Probe von der Oberfläche des mikroelektronischen Vorrichtung (100) nach dem Abwarten einer ausreichenden Zeitspanne für den gewählten, in der Probe gegenwärtigen, Analyten um an das Makromolekül, welches an der Oberfläche an jeder Mikrostelle (142) angebracht ist, zu binden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 37, worin die Makromoleküle Antikörper sind.
Das Verfahren gemäß Anspruch 37, worin der Anbringungsschritt das Anbringen einer Vielzahl unterschiedlicher Rezeptor Antikörper an eine Vielzahl unterschiedlicher Mikrostellen (142) einschließt, wobei jeder der unterschiedlichen Antikörper spezifisch ist um einen unterschiedlichen gewählten Analyten, gegenwärtig in der biologischen Probe, zu binden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 37, worin der Anbringungsschritt das Eintauchen der mikroelektronischen Vorrichtung (100) in ein fluides Volumen der biologischen Probe hinein einschließt.
System (300) zur Detektion und Identifizierung von Analyten in einer biologischen Probe unter Verwendung von Luciferase-Luciferin Biolumineszenz, umfassend: eine mikroelektronische Vorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 1–36; ein verarbeitendes Instrument einschließlich: einem Eingabeschnittstellen Schaltkreis (322), der zum Empfang der Ausgabedatensignale (118), hinweisend auf jegliche Biolumineszenz, die durch jede Mikrostelle (142) emittiert wurde, mit der mikroelektronischen Vorrichtung (100) gekoppelt ist; einem Datenspeicher (320) zum Speichern eines Datenerfassungsarrays umfassend einer Ortsangabe zugehörig zu jeder Mikrostelle (142); eine Ausgabevorrichtung (308) zum Erzeugen sichtbarer Anzeigen in Antwort auf ein Ausgabevorrichtungssignal (326); und einem verarbeitenden Schaltkreis (318), gekoppelt an den Eingabeschnittstellen Schaltkreis (322), den Datenspeicher (320), und die Ausgabevorrichtung (308), wobei der verarbeitende Schaltkreis (318) konfiguriert ist, um die Ausgabedatensignale (118), die durch den Eingabeschnittstellen Schaltkreis (322) erhalten werden, zu lesen, um die Ausgabedatensignale (118) mit den korrespondierenden Mikrostellen (142) zu korrelieren, um die Ausgabedatensignale (118), die mit jeder Mikrostelle (142) korreliert sind, über einen gewünschten Zeitraum durch Aufspeicherung der Ausgabedatensignale (118) in einem Datenerfassungsarray (332) zu integrieren, und um das Ausgabevorrichtungssignal (326) zu erzeugen welches, wenn es auf die Ausgabevorrichtung (308) angelegt wird, die Ausgabevorrichtung veranlasst sichtbaren Anzeigen, welche in Beziehung zur Gegenwart der gewählten Analyten in der Probe steht, zu erzeugen.
Das System gemäß Anspruch 43, worin die mikroelektronische Vorrichtung (100) umfasst: einen Array von Mikrostellen (142) zur Aufnahme der zu analysierenden biologischen Probe, jede Mikrostelle (142) umfassend eine Befestigungsschicht; ein separater Antikörper, der an die Befestigungsschicht jeder Mikrostelle angebracht ist, wobei jeder Antikörper spezifisch zum Binden eines gewählten Analyten, gegenwärtig in der biologischen Probe, die durch den Array aufgenommen wurde, ist; ein Photodetektor (144), optisch gekoppelt an jede Mikrostelle (142), jeder Photodetektor (144) konfigurierit um ein abgetastetes Signal (118) in Reaktion auf Biolumineszenz, die an der korrespondierenden Mikrostelle (142) emittiert wird, zu erzeugen; und eine elektronische Schaltung (322), gekoppelt an jeden Photodetektor (144), und konfiguriert, um das abgetastete Signal, welches durch jeden Photodetektor (144) erzeugt wird, zu lesen und um Ausgabedatensignale (326) davon zu erzeugen, die Indikativ für die Biolumineszenz sind, welche an jeder Mikrostelle (142) durch die Luciferase-Luciferin Reaktion emittiert wird.
Das System gemäß Anspruch 44, worin: jede Mikrostelle (142) auf der mikroelektronischen Vorrichtung (100) sich auf einer Oberfläche eines Halbleitersubstrates (140) befindet und jeder Photodetektor (144) eine Photodiode einschließt, die sich auf der Oberfläche bei der entsprechenden Mikrostelle (142) befindet, die Biolumineszenz erzeugende Reaktion Lichtphotonen (202) herstellt, die durch die Photodiode in einen Photostrom umgewandelt werden, wenn der ausgewählte Analyt gegenwärtig ist; und der Photostrom ein abgetastetes Signal ist, welches durch die Photodiode erzeugt wird.
Das System gemäß Anspruch 44, worin die elektronische Schaltung der mikroelektronischen Vorrichtung (100) eine Ausgangskontrollschaltung einschließt, die einen seriellen Datenstrom, der die Ausgabedatensignale (118) umfasst, erzeugt und der Eingabeschnittstellen Schaltkreis (322) des verarbeitenden Instruments eine serielle Eingabeschnittstelle umfasst, die konfiguriert ist, um den seriellen Datenstrom von der mikroelektronischen Vorrichtung (100) zu empfangen.
Das System gemäß Anspruch 44, worin der serielle Datenstrom gebündelte Daten, die Biolumineszenz darstellend, die an jeder Mikrostelle durch die Luciferase-Luciferin Reaktion emittiert wird, einschließt.
Das System gemäß Anspruch 44, worin die Ausgabevorrichtung (308) eine elektronische Anzeige einschließt, und die sichtbare Anzeige Licht, welches durch die Anzeige emittiert wird, einschließt.
Das System gemäß Anspruch 44, worin der Speicher (320) auch ein Analyten-Abbild (330) speichert, welches den gewählten Analyten an jeder Mikrostelle (142) identifiziert, und die verarbeitende Schaltung (318) die integrierten Ausgabedatensignale im Datenerfassungsarray (332) mit dem Analyten-Abbild (330) korreliert, um die gewählten Analyten gegenwärtig in der Probe zu identifizieren, wobei das Ausgabevorrichtungssignal (326) in der Weise erzeugt wird, das die sichtbare Anzeige die gewählten Analyten, gegenwärtig in der Probe, identifiziert.
Das System gemäß Anspruch 44, worin das verarbeitende Instrument ferner eine Eingabevorrichtung (306) umfasst, welche an die verarbeitende Schaltung (318) gekoppelt ist, um Sollwert Integrationszeitraum-Signale zu erzeugen, die von der verarbeitenden Schaltung (318) benutzt werden, um den Sollwert Integrationszeitraum für die Ausgabedatensignale zu bestimmen.
Das System gemäß Anspruch 44, worin das Biolumineszenz-erzeugende System ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus denjenigen isoliert aus den Anthozoen, Ctenophoren, Coelenteraten, Mollusken, Fisch, Ostracoden, Insekten, Bakterien, einem Crustacea, Anneliden und Regenwürmern.
Kit umfassend ein diagnostisches System zur Detektion infektiöser Mittel, umfassend: (a) die mikroelektronische Vorrichtung (100) nach einem der Ansprüche 1–36; (b) einen anti-Liganden (c) eine erste Zusammensetzung umfassend ein Konjugat, welches eine Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems und einen anti-Liganden, worin der anti-Ligand spezifisch an ein Epitop auf der Oberfläche des infektiösen Mittels bindet, umfasst; und (d) eine zweite Zusammensetzung umfassend einer anderen Komponente des Biolumineszenz erzeugenden Systems.
Der Kit gemäß Anspruch 52, worin die Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems eine Luciferase und/oder Luciferin ist.
Der Kit gemäß Anspruch 52, worin das Biolumineszenz-erzeugende System ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus denjenigen isoliert aus den Ctenophoren, Coelenteraten, Mollusken, Fisch, Ostracoden, Insekten, Bakterien, einem Crustacea, Anneliden, Anthozoen und Regenwürmern.
Der Kit gemäß Anspruch 53, worin die Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Aequorea, Vargula-, Renilla-, Obelin-, Porichthys-, Odontosyllis-, Aristostomias-, Pachystomias-, Gonadostomias-, Gaussia-, Halisturia-, Vampir-Kalmar-, Glyphus-, Mycotophiden- (Fisch-), Vinciguerria-, Howella-, Florenciella-, Chaudiodus-, Melanocostus-, Paracanthus-, Atolla-, Pelagia-, Pitilocarpus-, Acanthophyra-, Siphonophore-, Periphylla-, Cavamularia-, Ptilosarcus-, Stylatula-, Acanthoptilum-, Parazoanthus- und Seefedern- (Stylata-), Chiroteuthis-, Eucleoteuthis-, Onychoteuthis-, Watasenia-, Kuttelfisch-, Sepiolina-, Krabbe-, Hochseefisch-, Glühwürmchen- und bakteriellen Systemen.
Ein Kit gemäß einem der Ansprüche 52 bis 55, ferner umfassend eine Zusammensetzung umfassend ein fluoreszierendes Protein, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus grün fluoreszierendem Protein (GFP), blau fluoreszierendem Protein (BFP) und einem Phycobiliprotein.
Die Methode gemäß Anspruch 37, worin die Analyten, die detektiert oder identifiziert werden, infektiöse Mittel sind.
Die Methode gemäß Anspruch 37, worin das Biolumineszenz erzeugende System ferner umfasst ein fluoreszierendes Protein, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus grün fluoreszierendem Protein (GFP), blau fluoreszierendem Protein (BFP) oder einem Phycobiliprotein.
Kit umfassend ein diagnostisches System zur Detektion infektiöser Mittel, umfassend: (a) eine mikroelektronische Vorrichtung (100) nach einem der Ansprüche 1–36; (b) einen oder mehrere von anti-Liganden, die auf einer Oberfläche der mikroelektronischen Vorrichtung immobilisiert sind, worin jeder anti-Ligand spezifisch an ein unterschiedliches infektiöses Mittel bindet; (c) eine erste Zusammensetzung umfassend ein Konjugat oder mehrere hiervon, worin jedes eine Komponente eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems umfasst, welches mit einem zweiten anti-Liganden, der spezifisch an Epitope auf der Oberfläche eines infektiösen Mittels bindet, verknüpft ist.
Der Kit gemäß Anspruch 59, ferner umfassend (d) eine zweite Zusammensetzung, umfassend die verbleibenden Komponenten eines Biolumineszenz-erzeugenden Systems.
Das System gemäß Anspruch 44, worin der Antikörper, der an der Befestigungschicht an einer ersten Mikrostelle (142) angebracht ist, spezifisch zum Binden eines ersten gewählten Analyten ist und der Antikörper, der an der Befestigungschicht an einer zweiten Mikrostelle (142) angebracht ist, spezifisch zum Binden eines zweiten ausgewählten Analyten, unterschiedlich zum ersten gewählten Analyten, ist.
Die Methode gemäß Anspruch 37, welche ein in einem der Ansprüche 21, 22 oder 23 beanspruchtes Merkmal umfasst.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 5, worin das Biolumineszenz-erzeugende System ferner umfasst ein fluoreszierendes Protein, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus grün fluoreszierendem Protein (GFP), blau fluoreszierendem Protein (BFP) und einem Phycobiliprotein.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1–22 und 24–36, worin eine Komponente des Biolumineszenz erzeugenden Systems ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bakteriellen, Pilz-, dinoflagellaten, coelenteraten, ctenophoren, anneliden, crustacea, ostracoden, copepoden, Insekt-, oleopterid, diptera, echinodermen, chordaten, tunicaten und Fisch-Biolumineszenz-erzeugenden Systemen.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 64, worin eine Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Schlangenstern-, Seegurke-, knorpeliger, knochiger Fisch-, Ponyfisch-, Blitzlichtfisch-, Seeteufel-, Bootsmanfisch-, pelagischer Fisch-, Meeres-Polychaeten-, syllider Feuerwurm-, Qualle-, Hydroide-, gemeiner Seefeder-, Regenwurm-, Mollusken-, Napfschnecke-, Hochseefisch-, Muschel-, Glühwürmchen-, Schnellkäfer-, Federleuchtkäfer- und Kalmar-Biolumineszenz-erzeugenden Systemen.
Die mikroelektronische Vorrichtung gemäß Anspruch 65, worin eine Komponente des Biolumineszenz-erzeugenden Systems ausgewählt ist aus der Gruppe betsehend aus Aequorea, Vargula, Renilla, Obelin, Porichthys, Odontosyllis, Aristostomias, Pachystomias, Gonadostomias, Gaussia, Halisturia, Vampir-Kalmar, Glyphus, Mycotophiden, Vinciguerria, Howella, Florenciella, Chaudiodus, Melanocostus, Paracanthus, Atolla, Pelagia, Pitilocarpus, Acanthophyra, Siphonophore, Periphylla, Cavamularia, Ptilosarcus, Stylatula, Acanthoptilum, Parazoanthus und Seefedern, Chiroteuthis, Eucleoteuthis, Onychoteuthis, Watasenia, Kuttelfisch und Sepiolina.
Der Kit gemäß einem der Ansprüche 52–54 und 56, worin die Luciferase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bakteriellen, Pilz-, dinoflagellaten, coelenteraten, ctenophoren, anneliden, crustacea, ostracoden, copepoden, Insekt-, oleopterid, diptera, echinodermen, chordaten, tunicaten und Fisch-Luciferasen.
Der Kit gemäß Anspruch 67, worin die Luciferase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Schlangenstern-, Seegurke-, knorpeliger, knochiger Fisch-, Ponyfisch-, Blitzlichtfisch-, Seeteufel-, Bootsmanfisch-, pelagischer Fisch-, Meeres-Polychaeten-, syllider Feuerwurm-, Qualle-, Hydroide-, gemeiner Seefeder-, Regenwurm-, Mollusken-, Napfschnecke-, Hochseefisch-, Muschel-, Glühwürmchen-, Schnellkäfer-, Federleuchtkäfer- und Kalmar-Luciferasen.
Der Kit gemäß Anspruch 68, worin die Luciferase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aequorea-, Vargula-, Renilla-, Obelin-, Porichthys-, Odontosyllis-, Aristostomias-, Pachystomias-, Gonadostomias-, Gaussia-, Halisturia-, Vampir-Kalmar-, Glyphus-, Mycotophiden-, Vinciguerria-, Howella-, Florenciella-, Chaudiodus-, Melanocostus-, Paracanthus-, Atolla-, Pelagia-, Pitilocarpus-, Acanthophyra-, Siphonophore-, Periphylla-, Cavamularia-, Ptilosarcus-, Stylatula-, Acanthoptilum-, Parazoanthus- und Seefedern-, Chiroteuthis-, Eucleoteuthis-, Onychoteuthis-, Watasenia-, Kuttelfisch- und Sepiolina-Luciferasen.