DE69733020T2 - Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die ein immunmodulierendes Molekül (IMM) umfassen, das ein an ein Polynucleotid, das zumindest ein immunstimulierendes Oligonucleotid enthält oder daraus besteht (ISS-PN), konjugiertes Antigen umfasst. Außerdem betrifft sie Verfahren zur Modulation der Immunantwort eines Wirbeltierwirts auf ein Antigen.
  • ENTWICKLUNG VERWANDTER GEBIETE
  • Herkömmlicherweise wird die Immunisierung eines Wirts gegen ein Antigen erreicht, indem der Wirt wiederholt mit dem Antigen geimpft wird. Während die meisten derzeitigen Vakzinen angemessene Antikörperreaktionen hervorrufen, sind zelluläre Reaktionen (insbesondere in Bezug auf durch Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC-)Klasse-I-restringierte zytotoxische T-Zellen) im Allgemeinen nicht vorhanden oder schwach. Bei vielen Infektionserkrankungen, wie beispielsweise Tuberkulose und Malaria, haben humorale Reaktionen nur geringe Schutzwirkung gegen Infektionen.
  • Angesichts der schwachen Immunantwort auf Proteinantigene ist eine Modulation der Immunantworten auf diese Antigene von großer Bedeutung. Die Fähigkeit, Immunantworten auf Protein- oder Peptidantigene zu modifizieren, hat Bedeutung für Tumortherapien, die Behandlung von Allergien und die Behandlung anderer Zustände, die durch die Auslösung einer starken zellulären Immunantwort erzeugt werden können.
  • Die WO96/02555 beschreibt immunmodulierende Oligonucleotide, die nichtmethylierte CpG-Dinucleotide enthalten und aufgrund ihrer Fähigkeit, eine Immunantwort zu stimulieren, therapeutischen Nutzen aufweisen.
  • Raz et al., Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of USA, Bd. 93, 5141–5145, beschreiben die bevorzugte Auslösung einer Th1-Immunantwort und Inhibition spezifischer IgE-Antikörperbildung durch Plasmid-DNA-Immunisierung.
  • Raz et al., Arthritis & Rheumatism, Bd. 39, Nr. 9, S. 615, beschreiben die mögliche Rolle von immunstimulierenden DNA-Sequenzen (ISS) bei genetischer Immunisierung und Autoimmunität.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die ein ISS-PN umfassen, das an ein IMM (das ein Antigen umfasst) konjugiert ist, um ISS-PN/IMM-Konjugate zu bilden. Die ISS-PN/IMM-Konjugate der Erfindung sind Immunmodulatoren ("biological response modifiers") in dem Sinne, dass sie die humorale und zelluläre Immunantwort eines Wirts auf ein Antigen modifizieren.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine immunmodulierende Zusammensetzung bereit, die ein immunmodulierendes Molekül umfasst, worin dieses immunmodulierende Molekül ein Antigen umfasst, worin das Antigen an ein immunstimulierendes Polynucleotid (ISS-PN) konjugiert ist, wobei dieses ISS-PN zumindest eine immunstimulierende Sequenz (ISS) umfasst, welche die nichtmethylierte Sequenz 5'-Cytosin, Guanin-3' umfasst, worin die ISS zumindest sechs Nucleotide lang ist, worin dieses ISS-PN eine Länge von 6 bis etwa 200 Nucleotiden aufweist und worin das Antigen aus einem Tumorantigen, einem viralen Antigen, einem Allergen oder einem infektiösen Mikroorganismus ausgewählt ist.
  • Ferner stellt die Erfindung die Verwendung einer immunmodulierenden Zusammensetzung, die ein immunmodulierendes Molekül umfasst, worin das immunmodulierende Molekül ein Antigen umfasst, worin das Antigen an ein immunstimulierendes Polynucleotid (ISS-PN) konjugiert ist, wobei dieses ISS-PN zumindest eine immunstimulierende Sequenz (ISS) umfasst, welche die nichtmethylierte Sequenz 5'-Cytosin, Guanin-3' umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zum Boosten einer Th1-Reaktion und/oder zur Unterdrückung einer Th2-Reaktion auf das Antigen und/oder zur Reduktion von Antigen-stimulierter IgE-Produktion bereit.
  • Nachstehend und in den beiliegenden Ansprüchen sind bevorzugte Aspekte der Erfindung erläutert.
  • Die ISS-PN- und IMM-Komponenten des ISS-PN/IMM-Konjugats boosten synergistisch das Ausmaß der Immunantwort des Wirts auf ein Antigen auf einen Wert, der größer ist als die Immunantwort auf entweder ein IMM, Antigen oder ISS-PN alleine. Die ISS-PN/IMM-Konjugate verlagern außerdem die zelluläre Immunantwort weg vom Helfer-T-Lymphozyten-Typ-2-(Th2-)Phänotyp zu einem Helfer-T-Lymphozyten-Typ-1-(Th1-)Phänotyp. Diese Reaktionen auf ISS-PN/IMM-Konjugate sind vor allem während der wichtigen frühen Phase der Immunantwort eines Wirts auf ein Antigen akut.
  • Zu diesem Zweck werden PN/IMM-Konjugate über jeden Pfad abgegeben, bei dem antigensensibilisierte Wirtsgewebe mit dem PN/IMM-Konjugat in Kontakt gebracht werden. ISS-PN/IMM-Konjugate, die auf diese Weise verabreicht werden, boosten sowohl humorale (Antikörper) als auch zelluläre (Th1-Typ) Immunantworten des Wirts. Somit wird durch die Verwendung des Verfahrens zum Boosten der Immunreaktionsfähigkeit eines Wirts bei einer darauf folgenden Exposition mit einem Sensibilisierungsantigen ohne Immunisierung das Risiko einer Th2-vermittelten, durch Immunisierung ausgelösten Anaphylaxie durch Unterdrückung von IgE-Produktion als Reaktion auf die Antigenexposition verhindert. Eine insbesondere bevorzugte Verwendung in Bezug auf diesen Aspekt der Erfindung ist die Behandlung von lokalisierten allergischen Reaktionen in Zielgewebe, über das Allergene in den Körper eindringen, wie beispielsweise Haut und Schleimhaut.
  • Eine Unterdrückung des Th2-Phänotyps gemäß der Erfindung ist auch bei der Reduzierung von antigenstimulierter IL-4- und IL-5-Produktion nützlich. Somit umfasst die Erfindung die Verabreichung eines ISS-PN/IMM-Konjugats an einen Wirt, um den Th2-Phänotyp zu unterdrücken, der mit herkömmlicher Antigenimmunisierung assoziiert wird (z.B. für Impfungen oder Immuntherapie gegen Allergien).
  • Die Verlagerung zu einem Th1-Phänotyp, die gemäß der Erfindung erreicht wird, wird von einer erhöhten Sekretion von IFN-α, -β und -γ sowie von IL-12 und IL-18 begleitet. Jedes dieser Cytokine fördert die Immunabwehr des Wirts gegen intrazelluläre Pathogene, wie beispielsweise Viren. Somit umfasst die Erfindung auch die Verwendung von ISS-PN/IMM-Konjugaten zur Verabreichung an einen Wirt, um pathogene Infektionen zu bekämpfen.
  • Auch die Angiogenese wird im Th1-Phänotyp gefördert (anscheinend durch die Stimulierung durch IL-12). Somit umfasst die Erfindung auch die Verabreichung von ISS-PN/IMM-Konjugaten an einen Wirt, um therapeutische Angiogenese zu stimulieren und so Zustände zu behandeln, bei denen lokalisierter Blutfluss eine wichtige ätiologische Rolle spielt, wie beispielsweise bei Retinopathien.
  • Zu den Zusammensetzungen, die ISS-PN/IMM-Konjugaten umfassen, gehören ein an ein Polynucleotid, das zumindest eine immunstimulierende Oligonucleotid-(ISS-ODN-)Gruppierung enthält oder daraus besteht, konjugiertes IMM. Die ISS-ODN-Gruppierung ist ein einzel- oder doppelsträngiges DNA- oder RNA-Oligonucleotid mit zumindest 6 Nucleotidbasen, das ein modifiziertes Oligonucleosid oder eine Sequenz aus modifizierten Nucleosiden umfassen oder daraus bestehen kann.
  • Die ISS-ODN-Gruppierungen umfassen eine CpG-hältige Nucleotidsequenz oder einen p(IC)-Nucleotidsequenz, die ein Palindrom sein kann, oder sind von solch einer flankiert. Wenn die Oligonucleotidgruppierung eine CpG-Sequenz umfasst, kann sie eine Hexamerstruktur enthalten, die aus Folgendem besteht: 5'-Purin, Purin, CG, Pyrimidin, Pyrimidin-3'. Beispiele für solche Hexamerstrukturen sind AACGTT, AGCGTT, GACGTT, GGCGTT, AACGTC und AGCGTC.
  • In einem Aspekt der Erfindung besteht das ISS-PN aus einem ISS-ODN. Alternativ dazu kann das ISS-PN ein ISS-ODN umfassen.
  • In einem Aspekt der Erfindung besteht der IMM-Konjugatpartner des ISS-PN aus einem Antigen. Solche Antigene sind aus der Gruppe aus Antigenen, die aus Proteinen, Peptiden, Glykoproteinen, Polysacchariden und Gangliosiden besteht, ausgewählt.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst der IMM-Konjugatpartner ein Antigen und außerdem ein immunstimulierendes Molekül, das aus der Gruppe aus solchen Molekülen, die aus Adjuvanzien, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Chemokinen, Targeting-Proteinliganden und trans-aktivierenden Faktoren besteht, ausgewählt ist.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist das ISS-PN/IMM-Konjugat für eine gezielte Verabreichung, beispielsweise durch Anhaftung an einen monoklonalen Antikörper, einen Rezeptorliganden und/oder Liposom, modifiziert.
  • Pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen aus ISS-PN/IMM-Konjugaten zur Verwendung bei der Umsetzung der Erfindung werden bereitgestellt. Wenn es für den beabsichtigten Therapieverlauf passend ist, können die ISS-PN/IMM-Konjugate zusammen mit entzündungshemmenden oder immuntherapeutischen Wirkstoffen verabreicht werden. Somit ist eine zur Verwendung bei der Umsetzung des Verfahrens der Erfindung besonders nützliche Zusammensetzung eine, bei der ein entzündungshemmender Wirkstoff (z.B. ein Glucocorticoid) mit einem ISS-PN/IMM-Konjugat vermischt oder weiter an ein solches konjugiert ist.
  • Die ISS-PN/IMM-Konjugate können auch in Form eines Sets bereitgestellt sein, das ISS-PN/IMM-Konjugate und beliebige weitere Medikamente sowie eine Vorrichtung zur Verabreichung der ISS-PN/IMM-Konjugate an Wirtsgewebe und Reagenzien zur Bestimmung der biologischen Wirkung der ISS-PN/IMM-Konjugate auf einen behandelten Wirt enthält.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Diagramm, das die starke Immunantwort vom Th1-Typ (gemessen durch die Produktion von IgG2a gegenüber einem IMM-Antigen), die durch ISS-PN/IMM (Verhältnis 1:5) stimuliert wird, im Vergleich zu den Werten von Th2-ähnlichen Reaktionen, die durch ein ISS-hältiges, für eine Antigen kodierendes Plasmid (pACB-Z) stimuliert werden; zum Antigen alleine (β-gal); zum Antigen, das mit einer ISS vermischt ist (Verhältnis 1:5); zum Antigen, das an ein nichtstimulierendes PN konjugiert ist (mISS-Konj.; Verhältnis 1:5); zum Antigen in einem Adjuvans (Alaun); und, als Bezugswert, zu den IgG2a-Wertert in naiven (nicht exponierten) Mäusen zeigt. Die horizontale Achse zeigt die Menge (Einheiten/ml) des Antikörpers; die vertikale Achse zeigt die Anzahl an Wochen, die der primären Antigenexposition folgen.
  • 2 ist ein Diagramm, das die Werte der Th2-Typ-Immunantworten (gemessen durch die Produktion von IgG1 gegenüber einem IMM-Antigen), die durch ein ISS-hältiges, für ein Antigen kodierendes Plasmid (pACB-Z) stimuliert werden; des Antigens alleine (β-gal); des Antigens, das mit einer ISS vermischt ist (Verhältnis 1:5); des Antigens, das an ein nichtstimulierendes PN konjugiert ist (mISS-Konj.; Verhältnis 1:5); des Antigens in einem Adjuvans (Alaun); und, als Bezugswert, die IgG1-Werte in naiven (nicht exponierten) Mäusen zeigt, alle im Vergleich zur starken Th1-Typ-Immunantwort, die in mit ISS-PN/IMM immunisierten Mäusen auftritt (Verhältnis 1:5). Die horizontale Achse zeigt die Werte (Einheiten/ml) des Antikörpers; die vertikale Achse zeigt die Anzahl an Wochen nach der primären Antigenverabreichung.
  • 3 ist ein Diagramm, das die starke Immunantwort vom Th1-Typ (gemessen durch die Produktion von IgG2a gegenüber einem IMM-Antigen), die durch ISS-PN/IMM stimuliert wird, im Vergleich zu den Werten von Th2-ähnlichen Reaktionen, die durch das Antigen alleine (AgE) und ein Antigen, das an ein nichtstimulierendes PN konjugiert ist (mISS-Konj.), stimuliert werden. Das Verhältnis zwischen Antigen und PN beträgt immer 1:5. Die horizontale Achse zeigt die Werte (Einheiten/ml) des Antikörpers; die vertikale Achse zeigt die Werte 4 Wochen nach der primären Antigenexposition (schraffierte Balken) und 2 Wochen nach der sekundären Antigenexposition (schwarze Balken).
  • 4 ist ein Diagramm, das die Werte von Immunantworten vom Th2-Typ (gemessen durch die Produktion von IgG1 gegenüber einem IMM-Antigen), die durch das Antigen alleine (AgE) und ein Antigen, das an ein nichtstimulierendes PN konjugiert ist (mISS-Konj.), stimuliert werden, im Vergleich zur starken Immunantwort vom Th1-Typ, die in ISS-PN/IMM-immunisierten Mäusen stimuliert werden, zeigt. Das Verhältnis zwischen Antigen und PN beträgt immer 1:5. Die horizontale Achse zeigt die Werte (Einheiten/ml) des Antikörper; die vertikale Achse zeigt die Werte 4 Wochen nach der primären Antigenexposition (schraffierte Balken) und 2 Wochen nach der sekundären Antigenexposition (schwarze Balken).
  • 5 ist ein Diagramm, das die Werte der Unterdrückung von Th2-assoziierter Anti-Antigen-(AgE-)IgE-Produktion durch ISS-PN/IMM im Vergleich zu den Werten der IgE-Produktion zeigt, die durch das Antigen alleine (AgE) und das Antigen, das an ein nichtstimulierendes PN konjugiert ist (mISS-Konj.), stimuliert wird. Das Verhältnis zwischen Antigen und PN beträgt immer 1:5. Die horizontale Achse zeigt die Werte (Counts pro Minute; cpm) des Antikörper; die vertikale Achse zeigt die Werte 4 Wochen nach der primären Antigenexposition (schraffierte Balken) und 2 Wochen nach der sekundären Antigenexposition (schwarze Balken).
  • 6 ist ein Diagramm, das die hohen Werte von Th1-assoziierter Interferon-γ-(IFNg-)Produktion, die durch ISS-PN/IMM stimuliert wird, im Vergleich zu den relativ niedrigen Werten des Th1-Cytokins, das durch ein ISS-hältiges, für ein Antigen kodierendes Plasmid (pACB-Z) stimuliert wird; zum Antigen alleine (β-gal); zu dem mit einem ISS vermischten Antigen; zu einem an ein nichtstimulierendes PN konjugierten Antigen (mISS-Konj.); zum Antigen in einem Adjuvans (Alaun); und, als Bezugswert, zu den IFNg-Werten in naiven (nicht exponierten) Mäusen zeigt. Das Verhältnis Antigen zu PN beträgt immer 1:5. Die horizontale Achse zeigt die Werte (ng/ml) des Cytokins; die vertikale Achse zeigt die Werte des Cytokins 4 Wochen nach der primären Antigenexposition (schraffierte Balken).
  • 7 ist ein Diagramm, das die starke antigenspezifische zytotoxische T-Lymphozyten-(CTL-)Antwort, die durch ISS-PN/IMM stimuliert wird, im Vergleich zu den Werten der CTL-Produktion, die durch ein ISS-hältiges, für ein Antigen kodierendes Plasmid (pACB-Z) stimuliert werden; zum Antigen alleine (β-gal); zu dem mit einem ISS vermischten Antigen; zu dem mit einem nichtstimulierenden PN konjugierten Antigen (mISS-Konj.); zum Antigen in einem Adjuvans (Alaun); und, als Bezugswert, zu den CTL-Werten in naiven (nicht beeinflussten) Mäusen zeigt. Das Verhältnis zwischen Antigen und PN beträgt immer 1:5. Die horizontale Achse zeigt die Werte der erhaltenen antigenspezifischen Zelllyse (als Prozentsatz der Kontrolle; kein Antigen); die vertikale Achse zeigt die CTL-Werte, die bei verschiedenen Effektor-(Antigen-)Ziel-Verhältnissen von 0:1 bis 10:1 detektiert wurden. In der Legende ist angegeben, wie die einzelnen Zellpopulationen behandelt wurden.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • A. Biologische Aktivität der ISS-PN/IMM-Konjugate
  • Die durch die ISS-PN/IMM-Konjugate der Erfindung stimulierte Immunantwort unterscheidet sich von der Immunantwort von Wirbeltieren auf herkömmliche Vakzinationen sowohl in ihrem Ausmaß als auch in ihrer Natur. In Bezug auf Ersteres wird die Immunantwort eines Wirts auf ein Antigen auf einen höheren Wert geboostet als bei Verabreichung eines ISS-PN oder Antigens alleine oder zusammen in unkonjugierter Form. Somit besteht ein überraschender Aspekt der Erfindung darin, dass die Konjugation eines ISS-PN an ein antigenhältiges IMM zu einem Synergismus zwischen der immunstimulierenden Aktivität des ISS-PN und der immunmodulierenden Aktivität des IMM führt, welche den Wirt wirksamer gegen das Antigen immunisiert als erwartet.
  • Vorteilhafterweise unterscheidet sich die gemäß der Erfindung stimulierte Immunantwort von der Immunantwort von Wirbeltieren auf herkömmliche Vakzination darin, dass Letztere zur Bildung eines Th2-Phänotyps führt, während bei Ersterer ein Th1-Phänotyp gebildet wird. In diesem Zusammenhang ist es nützlich, daran zu erinnern, dass CD4+-Lymphozyten im Allgemeinen zu einer von zwei unterschiedlichen Untergruppen gehören; d.h. den Th1- und Th2-Zellen. Th1-Zellen sekretieren hauptsächlich IL-2, IFNγ und TNFβ (die letzten beiden vermitteln Makrophagenaktivierung und verzögerte Hyperempfindlichkeit), während Th2-Zellen hauptsächlich IL-4 (das die Produktion von IgE-Antikörpern stimuliert), IL-5 (das Granulozyteninfiltration von Gewebe stimuliert), IL-6 und IL-10 sekretieren. Diese CD4+-Untergruppen wirken sich negativ aufeinander aus; d.h. die Sekretion von Th1-Lymphokinen hemmt die Sekretion von Th2-Lymphokinen und umgekehrt.
  • Faktoren, die wahrscheinlich eine Th1-Aktivierung bevorzugen, ähneln jenen, die durch eine Virusinfektion hervorgerufen werden, und umfassen intrazelluläre Pathogene, Exposition gegenüber IFN-β, IFN-α, IFNγ, IL-12 und IL-18 und die Exposition gegenüber geringen Antigendosen. Die Immunantworten vom TH1-Typ überwiegen auch bei einer Autoimmunerkrankung. Faktoren, die wahrscheinlich Th2-Aktivierung bevorzugen, umfassen die Exposition gegenüber IL-4 und IL-10, APC-Aktivität vonseiten von B-Lymphozyten und hohen Antigendosen.
  • Aktive Th1-(IFNγ-)Zellen fördern zelluläre Immunität und sind daher von großem Wert bei der Reaktion auf intrazelluläre Infektionen, während aktive Th2-Zellen Antikörperproduktion fördern und somit bei der Reaktion auf extrazelluläre Infektionen von Wert sind (mit dem Risiko von anaphylaktischen Ereignissen, die mit IL-4-stimulierter IgE-Antikörperproduktion assoziiert sind). Deshalb weist die Fähigkeit, Immunantworten von Wirten vom Th1- zum Th2-Repertoire und umgekehrt zu verlagern, wesentliche klinische Bedeutung bei der Regelung der Immunität eines Wirts gegen eine Antigenexposition auf (z.B. bei Infektionen oder allergischen Zuständen).
  • Zu diesem Zweck wird mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung die Immunantwort eines Wirts auf ein sensibilisierendes Antigen zu einem Th1-Phänotyp verschoben (Beispiel I). Folglich werden Th2-assoziierte Cytokinproduktion und antigenstimulierte Produktion von IgE (Beispiele II und III) unterdrückt, wodurch das Risiko anhaltender allergischer Entzündungen beim Wirt verringert und das Risiko von antigenvermittelter Anaphylaxie minimiert werden. CTL-Produktion wird ebenfalls bei Tieren in höherem Ausmaß stimuliert, die gemäß der Erfindung behandelt wurden. Da CTL-Produktion mit dem Antigenprocessing in Klasse-I-MHC-Pfaden zusammenhängt, kann eine erhöhte CTL-Produktion aus nichtimmunstimulierendem PN/IMM als auch aus ISS-PN/IMM hergestellt werden (Beispiel IV).
  • Obwohl die Erfindung nicht auf einen bestimmten Wirkungsmechanismus eingeschränkt ist, ist erkennbar, dass PN die Aufnahme eines exogenen Antigens durch antigenpräsentierende Zellen zur Präsentation durch Wirts-MHC-Klasse-I-Processingpfade vereinfacht, die normalerweise nicht durch ein lösliches Antigen stimuliert werden. Somit tragen ISS-PN/IMM ein Antigen in die MHC-Klasse-I-Processingpfade (was auch durch PN/IMM ohne ISS-Aktivität erreicht werden kann) und stimulieren dann eine Cytokinkaskade in einem Th1-Phänotyp (als Ergebnisse von ISS-Aktivität). Egal wie der Wirkungsmechanismus aussieht, durch die Verwendung von ISS-PN/IMM zum Boosten der Reaktionsbereitschaft des Wirts gegenüber einem sensibilisierenden Antigen und die Verlagerung zu einem Th1-Phänotyp wird das Risiko einer durch Immunisierung vermittelten Anaphylaxie vermieden, IgE-Produktion als Reaktion auf ein sensibilisierendes Antigen unterdrückt und die Notwendigkeit, das sensibilisierende Antigen zur Verwendung bei einer Immunisierung zu identifizieren, aufgehoben.
  • In Bezug auf die Erfindung wird das "Boosten der Immunreaktionsbereitschaft in einem Th1-Phänotyp" in einem ISS-PN/IMM-behandelten Wirt wie folgt nachgewiesen:
    • (1) Verringerung der IL-4-Werte, die vor und nach einer Antigenexposition gemessen werden; oder Detektion von geringeren (oder fehlenden) IL-4-Mengen in ei nem behandelten Wirt im Vergleich zu einer antigengeprimten, oder geprimten und provozierten, Kontrolle;
    • (2) Erhöhung der Menge von IL-12, IL-18 und/oder IFN (α, β oder γ) vor und nach einer Antigenexposition; oder Detektion von höheren Werten von IL-12, IL-18 und/oder IFN (α, β oder γ) in einem ISS-PN/IMM-behandelten Wirt im Vergleich zu einer antigengeprimten, oder geprimten und provozierten, Kontrolle;
    • (3) IgG2a-Antikörperproduktion in einem behandelten Wirt; oder
    • (4) Verringerung der Werte von antigenspezifischem IgE, gemessen vor und nach einer Antigenexposition; oder Detektion von geringeren (oder fehlenden) Mengen von antigenspezifischem IgE in einem ISS-PN/IMM-behandelten Wirt im Vergleich zu einer antigengeprimten, oder geprimten und provozierten, Kontrolle.
  • Beispiele für Verfahren zur Bestimmung solcher Werte sind in den Beispielen genauer erläutert.
  • Somit stellen die ISS-PN/IMM-Konjugate der Erfindung relativ sichere, wirksame Mittel zur Stimulierung einer starken Immunantwort eines Wirbeltiers gegenüber einem beliebigen Antigen bereit.
  • B. ISS-PN/IMM-Konjugate: Struktur und Herstellung
  • 1. ISS-PN-Wurzelstruktur
  • Die ISS-ODN-Basis des ISS-PN/IMM-Konjugats der Erfindung umfasst ein Oligonucleotid, das Teil eines größeren Nucleotidkonstrukts, wie beispielsweise eines Plasmids, sein kann. Der Begriff "Polynucleotid" umfasst somit Oligonucleotide, modifizierte Oligonucleotide und Oligonucleoside, und zwar alleine oder als Teil eines größeren Konstrukts. Das Polynucleotid kann einzelsträngige DNA (ssDNA), dop pelsträngige DNA (dsDNA), einzelsträngige RNA (ssRNA) oder doppelsträngige RNA (dsRNA) sein.
  • Der Polynucleotidteil kann linear oder ringförmig konfiguriert sein, oder der Oligonucleotidteil kann sowohl lineare als auch ringförmige Segmente enthalten. Modifikationen von Oligonucleotiden umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Modifikationen der 3'OH- oder 5'OH-Gruppe, Modifikationen der Nucleotidbase, Modifikationen der Zuckerkomponente und Modifikationen der Phosphatgruppe.
  • Die Oligonucleotidbase von ISS-PN/IMM-Konjugaten kann Ribonucleotide (die Ribose als einzige oder wichtigste Zuckerkomponente enthalten) oder Desoxyribonucleotide (die Desoxyribose als wichtigste Zuckerkomponente enthalten) umfassen, oder es können, in Übereinstimmung mit dem Stand der Technik, modifizierte Zucker oder Zuckeranaloga in das Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung inkorporiert sein. Somit kann die Zuckergruppierung neben Ribose und Desoxyribose auch Pentose, Desoxypentose, Hexose, Desoxyhexose, Glucose, Arabinose, Xylose, Lyxose und eine zucker"analoge" Cyclopentylgruppe sein. Der Zucker kann in Pyranosyl- oder in Furanosylform vorliegen. In den modifizierten Oligonucleotiden der vorliegenden Erfindung ist die Zuckergruppierung vorzugsweise das Furanosid von Ribose, Desoxyribose, Arabinose oder 2'-0-Methylribose, und der Zucker kann an die entsprechenden heterocyclischen Basen gebunden sein, entweder in I- oder J-anomerer Konfiguration. Die Herstellung dieser Zucker oder Zuckeranaloga und der entsprechenden "Nucleoside", worin Zucker oder Analoga an eine heterocyclische Base (Nucleinsäurebase) per se gebunden sind, ist bekannt und bedarf hierin keiner Erläuterung, mit Ausnahme des Ausmaßes der Herstellung in Bezug auf spezifische Beispiele.
  • Das Phosphorderivat (oder die modifizierte Phosphatgruppe), die an die Zucker- oder Zuckeranalogongruppierung in den modifizierten Oligonucleotiden der vorliegenden Erfindung gebunden sein kann, kann ein Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, Alkylphosphat, Alkanphosphat, Thiophosphat, Dithiophosphat oder dergleichen sein. Die Herstellung der oben genannten Phosphatanaloga und ihre In korporation in Nucleotide, modifizierte Nucleotide und Oligonucleotide an sich ist ebenfalls bekannt und bedarf hierin keiner Erläuterung.
  • Die heterocyclischen Basen oder Nucleinsäurebasen, die in die Oligonucleotidbase der ISS-PN/IMM-Konjugate inkorporiert sind, können die natürlich vorkommenden Purin- und Pyrimidinhauptbasen (nämlich Uracil oder Thymin, Cytosin, Adenin und Guanin, wie oben erwähnt) sowie natürlich vorkommende und synthetische Modifikationen dieser Hauptbasen sein. Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wird offensichtlich sein, dass nach dem Stand der Technik eine große Zahl an "synthetischen", nichtnatürlichen Nucleosiden, die verschiedene heterocyclische Basen und verschiedene Zuckergruppierungen (und Zuckeranaloga) umfassen, verfügbar ist, sodass die Oligonucleotidbase der ISS-PN/IMM-Konjugate eine oder mehrere andere heterocyclische Basen umfassen kann als die fünf Hauptbasenkomponenten der natürlich vorkommenden Nucleinsäuren. Vorzugsweise ist die heterocyclische Base in der Oligonucleotidbase der ISS-PN/IMM-Konjugate jedoch aus Uracil-5-yl-, Cytosin-5-yl-, Adenin-7-yl-, Adenin-8-yl-, Guanin-7-yl-, Guanin-8-yl-, 4-Aminopyrrolo[2.3-d]pyrimidin-5-yl-, 2-Amino-4-oxopyrrolo[2.3-d]pyrimidin-5-yl- und 2-Amino-4-oxopyrrolo[2.3-d]pyrimidin-4-ylgruppen ausgewählt, worin die Purine über die Position 9 an die Zuckergruppierung der Oligonucleotide gebunden sind, die Pyrimidine über die Position 1, die Pyrrolopyrimidine über die Position 7 und die Pyrazolopyrimidine über die Position 1.
  • Strukturell gesehen ist das Wurzeloligonucleotid der ISS-PN-Komponente von ISS-PN/IMM eine nichtkodierende Sequenz, die zumindest ein unmethyliertes CpG-Motiv enthalten kann. Die relative Position einer CpG-Sequenz in einem ISS-PN mit immunstimulierender Aktivität in bestimmten Säugetierspezies (z.B. Nagetieren) ist 5'-CG-3' (d.h. das C liegt an der 5'-Position in Bezug auf das G in der 3'-Position). PN/IMM kann praktischerweise durch Substitution des Cytosins im CpG-Dinucleotid mit einem anderen Nucleotid erhalten werden; eine insbesondere nützliche Substitution ist eine mit einem Guanin, um ein GpG-Dinucleotid-hältiges PN zu bilden.
  • Bekannt sind mehrere Oligonucleotid-ISS (ISS-ODN). In solch einem ISS-ODN ist das CpG-Motiv von zumindest zwei Purinnucleotiden (z.B. GA oder AA) und zumindest zwei Pyrimidinnucleotiden (5'-Purin-Purin-[C]-[G]-Pyrimidin-Pyrimidin-3') flankiert. Es wird angenommen, dass ein CpG-Motiv enthaltendes ISS-ODN B-Lymphozyten-Proliferation stimuliert (siehe beispielsweise Krieg et al., Nature 374, 546–549 (1995)).
  • Die Hexamer-Kernstruktur des oben genannten ISS-PN kann stromauf und/oder stromab von einer beliebigen Anzahl oder Zusammensetzung von Nucleotiden oder Nucleosiden flankiert sein. ISS-PN sind jedoch zumindest 6 Basen lang, vorzugsweise zwischen 6 und 200 Basen lang, um die Aufnahme des ISS-PN/IMM in Zielgewebe zu fördern. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sind mit beschriebenen Nucleotidsequenzen bekannter ISS-ODN zur Herstellung von ISS-PN vertraut oder können diese leicht identifizieren. Die folgenden Quellen sind in diesem Zusammenhang besonders hilfreich:
    Yamamoto et al., Microbiol. Immunol. 36, 983 (1992)
    Ballas et al., J. Immunol. 157, 1840 (1996)
    Klinman et al., J. Immunol. 158, 3635 (1997)
    Sato et al., Science 273, 352 (1996)
  • Alle diese Artikel veranschaulichen den Stand des Wissens auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf die Nucleotidzusammensetzung von bekannten ISS-ODN.
  • Genauer gesagt umfasst für die Erfindung nützliche ISS-PN und PN solche mit den folgenden hexameren Nucleotidsequenzen:
    • 1. In Bezug auf ISS-PN Hexamere mit "CpG"-Motiven oder in Bezug auf PN Hexamere mit XpY-Motiven, worin X nicht C sein kann, wenn Y G ist und umgekehrt; und
    • 2. Inosin- und/oder Uracilsubstitutionen für Nucleotide in den oben genannten Hexamersequenzen zur Verwendung als RNA-ISS-ODN.
  • Auf DNA basierende ISS-PN, die für die Erfindung nützlich sind, umfassen solche mit den folgenden hexameren Nucleotidsequenzen:
    AACGTT, AGCGTC, GACGTT, GGCGTT, AACGTC,
    GACGTC, GGCGTC, AACGCC, AGCGCC, GACGCC,
    GGCGCC, AGCGCT, GACGCT, GGCGCT, TTCGAA.
  • Auf RNA basierende ISS-PN, die für die Erfindung nützlich sind, umfassen solche mit den folgenden hexameren Nucleotidsequenzen:
    AACGUU, AACGpI, AACGpC, AGCGUC, AGCGpI, AGCGpC,
    GACGCU, GACGCpI, GACGCpC, GACGUU, GACGpI,
    GACGpC, GACGUC, GACGpI, GACGpC und Poly(I·C).
  • Die ISS-PN können Palindromregionen enthalten oder nicht. Falls vorhanden, kann sich ein Palindrom nur bis zu einem CpG-Motiv, falls vorhanden, in der Hexamer-Kernsequenz erstrecken, oder es kann mehrere der Hexamersequenzen sowie flankierende Nucleotidsequenzen umfassen.
  • Außerdem können Rückgratphosphatgruppenmodifikationen (beispielsweise Methylphosphonat-, Thiophosphat-, Phosphoramidat- und Dithiophosphat-Internucleotidbindungen) den ISS-PN antimikrobielle Aktivität verleihen und ihre Stabilität in vivo erhöhen, wodurch sie für therapeutische Anwendungen besonders geeignet sind. Eine insbesonders nützliche Phosphatgruppenmodifikation ist die Überführung in die Thiophosphat- oder Dithiophosphatformen von ISS-PN. Neben ihren potentiell antimikrobiellen Eigenschaften weisen Thiophosphate und Dithiophosphate auch höhere Resistenz gegenüber Abbau in vivo auf als ihre unmodifizierten Oligonucleotid-Gegenstücke, wodurch die ISS-PN/IMM der Erfindung für den Wirt stärker verfügbar sind.
  • 2. IMM-Konjugatpartner
  • Die Oligonucleotidbase des ISS-PN/IMM-Konjugats ist an ein IMM konjugiert, das ein Antigen umfasst und außerdem einen immunmodulierenden Wirkstoff enthalten kann. Ein "Antigen" ist eine Substanz, die erkannt und spezifisch von einem Antikörper oder einem T-Zell-Antigenrezeptor gebunden wird. Antigene können Peptide, Proteine, Glykoproteine und Polysaccharide umfassen, einschließlich Teilen und Kombinationen davon. Die Antigene können natürlich vorkommende oder synthetische sein.
  • Der Begriff "immunmodulatorisch" umfasst hierin immunstimulierende sowie immunsuppressive Wirkungen. Immunstimulierende Wirkungen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, solche, die zelluläre oder humorale Immunantworten direkt oder indirekt fördern. Beispiele für immunstimulierende Wirkungen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, erhöhte antigenspezifische Antikörperproduktion; Aktivierung oder Proliferation einer Lymphozytenpopulation, wie z.B. NK-Zellen, CD4+-T-Lymphozyten, CD8+-T-Lymphozyten, Makrophagen und dergleichen; sowie erhöhte Synthese von Th1-assoziierten immunstimulierenden Cytokinen, einschließlich, nicht jedoch ausschließlich, IL-6, IL-12, IL-18, IFN-α, -β und -γ, TNF-α und dergleichen. Immunsuppressive Wirkungen umfassen solche, die zelluläre oder humorale Immunantworten direkt oder indirekt verringern.
  • Beispiele für immunsuppressive Wirkungen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine Verringerung der antigenspezifischen Antikörperproduktion, wie z.B. verringerte IgE-Produktion; Aktivierung von Lymphozyten- oder anderen Zellpopulationen, die immunsuppressive Wirkung aufweisen, wie beispielsweise solche, die zu Immuntoleranz führen; und erhöhte Synthese von Cytokinen, die suppressive Wirkung gegenüber bestimmten Zellfunktionen aufweisen. Ein Beispiel dafür ist IFN-γ, das IL-4-induzierte Klassenwechsel zu IgE und IgG1 blockieren kann, wodurch die Anzahl dieser Antikörperklassen verringert wird.
  • Somit kann ein "immunmodulierender Wirkstoff", der zur Verwendung als Konjugatpartner für ISS-PN/IMM geeignet ist, ein Peptid, wie z.B. ein Antigen oder Cytokin, sein. Wenn der ISS-PN/IMM-Konjugatpartner ein Peptid ist, umfassen geeignete Peptide gereinigte native Peptide, synthetische Peptide, rekombinante Proteine, Rohproteinextrakte, abgeschwächte oder inaktivierte Viren, Zellen, Mikroorganismen oder Fragmente solcher Peptide.
  • Proteinantigene, die als IMM-Konjugatpartner dienen können, umfassen Antigene von unterschiedlichsten Quellen, einschließlich Allergenen wie z.B. Pflanzenpollen, Staubmilbenproteine, tierischen Hautschuppen, Speichel und Pilzsporen sowie infektiösen Mikroorganismen. Beispiele für Letztere umfassen abgeschwächte oder inaktivierte Viren, wie beispielsweise HIV-1, HIV-2, Hepatitis, Herpes simplex, Rotavirus, Poliovirus, Masernvirus, menschlichen und Rinder-Papillomavirus und langsame Hirnviren ("slow brain viruses"). Um eine Immunisierung gegen Tumorbildung bereitzustellen, kann das Konjugat Tumorzellen (lebende oder bestrahlte), Tumorzellextrakte oder Proteinuntereinheiten von Tumorantigenen enthalten. Vakzinen für immunbasierte Empfängnisverhütung können durch Aufnahme von Spermaproteinen als Peptidteil des Konjugats gebildet werden.
  • Zu den Cytokinen, die zur Verwendung als Komponenten von IMM-Konjugatpartnern geeignet sind, gehören Interleukine (IL-1, IL-2, IL-3 usw.), Interferone (z.B. IFN-α, IFN-β, IFN-γ), Erythropoietin, Koloniewachstum stimulierende Faktoren (z.B. G-CSF, M-CSF, GM-CSF) und TNF-α.
  • IMM-Konjugatpartner können auch Aminosäuresequenzen umfassen, die Proteinbindung an einen spezifischen Rezeptor vermitteln oder Targeting an einen spezifischen Zelltyp oder Gewebe vermitteln. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Antikörper und Antikörperfragmente; Peptidhormone, wie beispielsweise das menschliche Wachstumshormon; und Enzyme. Costimulierende Moleküle, wie beispielsweise B7 (CD80), trans-aktivierende Proteine, wie beispielsweise Transkriptionsfaktoren, Chemokine, wie beispielsweise das Makrophagen-chemotaktische Peptid (MCP), und andere chemische Attraktantien oder chemotaktische Peptide sind ebenfalls nützliche Konjugatpartner auf Peptidbasis.
  • Genauer gesagt umfassen geeignete Antigene für die Verwendung als ISS-PN/IMM-Konjugatpartner alle Moleküle, die an ein Oligonucleotid konjugiert werden können und eine B-Zell- oder T-Zell-antigenspezifische Antwort auslösen können. Vorzugsweise lösen Antigene eine für das Antigen spezifische Antikörperreaktion aus. Antigene können verschiedenste Moleküle sein. Diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Zucker, Lipide, Autacoide und Hormone sowie Makromoleküle, wie beispielsweise komplexe Kohlenhydrate, und Phospholipide. Kleine Moleküle müssen eventuell haptenisiert werden, um sie antigen zu machen.
  • Die Antigene sind vorzugsweise Peptide, Polysaccharide (wie beispielsweise das kapselförmige Polysaccharid, das in Haemophilus-influenza-Vakzinen verwendet wird), Ganglioside und Glykoproteine. Das Antigen kann ein intaktes Antigen oder ein oder mehrere T-Zell-Epitope eines Antigens sein. Diese können durch verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren erhalten werden, einschließlich Isolation und Synthese unter Verwendung von chemischen und enzymatischen Verfahren. In bestimmten Fällen, wie beispielsweise bei vielen Sterinfettsäuren und Phospholipiden, sind die antigenen Teile im Handel erhältlich.
  • Viele antigene Peptide und Proteine sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und verfügbar; andere können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren identifiziert werden. Beispiele für bekannte Antigene umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf:
    • a. Allergene, wie beispielsweise die reaktiven Hauptallergene der Staubmilbe Der pI und Der pII (siehe Chua et al., J. Exp. Med. 167, 175–182 (1988); und Chua et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91, 124–129 (1990)), T-Zell-Epitoppeptide des Der-pII-Allergens (siehe Joost van Neerven et al., J. Immunol. 151, 2326–2335 (1993)), das in großen Mengen vorkommende Antigen-E-(Amb-aI-)Ambrosiepollenallergen (siehe Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266, 1229–1236 (1991)), Phospholipase- A2-(Bienengift-)Allergen und T-Zell-Epitope darin (siehe Dhillon et al., J. Allergy Clin. Immunol. 90, 42–51 (1992)), Weißbirkenpollen (Betvl) (siehe Breitenender et al., EMBO 8, 1935–1938 (1989)), das Fel-dI-Hauptallergen der Hauskatze (siehe Rogers et al., Mol. Immunol. 30, 559–568 (1993)), Baumpollen (siehe Elsayed et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204, 17–31 (1991)) und Gräserpollen (siehe Malley, J. Reprod. Immunol. 16, 173–86 (1989)).
    • b. Lebende, abgeschwächte und inaktivierte Mikroorganismen, wie beispielsweise ein inaktiviertes Poliovirus (Jiang et al., J. Biol. Stand. 14, 103–9 (1986)), abgeschwächte Stämme des Hepatitis-A-Virus (Bradley et al., J. Med. Virol. 14, 373–86 (1984)), ein abgeschwächtes Masernvirus (James et al., N. Engl. J. Med. 332, 1262–6 (1995)) und Epitope des Pertussisvirus (z.B. ACEL-IMUNE®, azelluläres DTP, Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics).
    • c. Empfängnisverhütende Antigene, wie beispielsweise ein menschliches Spermaprotein (Lea et al., Biochim. Biophys. Acta 1307, 263 (1996)).
  • Die veröffentlichten Sequenzdaten und Verfahren zur Isolation und Synthese der Antigene, die in diesen Artikeln beschrieben sind, fassen das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf nützliche Antigenquellen zusammen. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden die Identität von anderen Antigenen, die zur Verwendung als ISS-PN/IMM-Konjugatpartner nützlich sind, kennen oder können diese leicht bestimmen.
  • Besonders nützliche immunstimulierende Peptide zur Aufnahme in IMM sind solche, die Th1-Immunantworten stimulieren, wie beispielsweise IL-12 (Bliss et al., J. Immunol. 156, 887–894 (1996)), IL-18, INF-α, -β oder -γ oder TGF-α. Die Konjugation von Adjuvantien (wie beispielsweise Schlüssellochschnecke-Hämocyanin, KLH) an das ISS-PN/IMM-Konjugat kann die Aktivität der ISS-PN/IMM-Konjugate der Erfindung weiter fördern.
  • Andere nützliche Adjuvantien umfassen Cholera-Toxin, Procholeragenoid, die Cholera-Toxin-B-Untereinheit und Pilzpolysaccharide, einschließlich, nicht jedoch eingeschränkt auf, Schizophyllan, Muramyldipeptid, Muramyldipeptidderivate, Phorbolester, Mikrokügelchen, Nicht-Helicobacter-pylori-Bakterienlysate, labiles Toxin von Escherichia coli, Blockpolymere, Saponine und ISCOMs. Für weitere Adjuvantien können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung in beispielsweise Azuma, I., "Synthetic Immunoadjuvants: Application to Non-Specific Host Stimulation and Potentiation of Vaccine Immunogenicity", Vaccine, Bd. 10, 1000 (1992); Pockley, A. G., & Montgomery, P. C., "In vivo Adjuvant Effect of Interleukins 5 and 6 on Rat Tear IgA Antibody Responses", Immunology, Bd. 73, 19–23 (1991); Adam, A., & Lederer, E., "Muramyl peptides as Immunomodulators", ISI ATLAS OF SCIENCE 205 (1988); Clements, J. D., et al., "Adjuvant Activity of Escherichia coli Heat-labile Enterotoxin and Effect on the Induction of Oral Tolerance in Mice to Unrelated Protein Antigens", Vaccine, Bd. 6, 269 (1988); Ben Ahmeida, E. T. S., et al., "Immunopotentiation of Local and Systemic Humoral Immune Responses by ISCOMs, Liposomes and FCA: Role in Protection Against Influenza in Mice", Vaccine, Bd. 11, 1302 (1993); und Gupta, R. K., et al., "Adjuvants – A Balance Between Toxicity and Adjuvanticity", Vaccine, Bd. 11, 290–308 (1993), nachschlagen.
  • Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden erkennten, dass die oben beschriebenen Nichtantigenkomponenten von IMM auch in unkonjugierter Form mit einem ISS-PN/IMM-Konjugat (nur Antigen) verabreicht werden können. Somit umfasst die Erfindung auch die gemeinsame Verabreichung solcher Komponenten.
  • C. Synthese von Polynucleotidkonjugaten
  • 1. Polynucleotidteil
  • ISS-PN können unter Verwendung von Verfahren und Nucleinsäuresynthesegeräten synthetisiert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind. Siehe in diesem Zusammenhang beispielsweise Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Kap. 2 und 4, Wiley Interscience (1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., New York (1982); US-Patent Nr. 4.458.066 und US-Patent Nr. 4.650.675. Wenn sie enzymatisch angeordnet werden, können die einzelnen Einheiten mit einer Ligase, wie beispielsweise T4-DNA- oder -RNA-Ligase, ligiert werden, wie es beispielsweise im US-Patent 5.124.246 beschrieben ist. Oligonucleotidabbau könnte erreicht werden, indem ein Oligonucleotid einer Nuclease ausgesetzt wird, wie etwa im US-Patent Nr. 4.650.675 beschrieben ist. In diesen Quellen wird das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf die Herstellung von synthetischen Polynucleotiden aufgezeigt. Da das ISS-PN nichtkodierend ist, muss während der Synthese nicht darauf geachtet werden, ein offenes Leseraster beizubehalten.
  • Alternativ dazu können ISS-PN auch unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Verfahren, wie beispielsweise Nucleinsäurehybridisierung, aus Mikrobenspezies (insbesondere Mycobakterien) isoliert werden. Vorzugsweise werden solche isolierten ISS-PN bis zu einem im Wesentlichen reinen Zustand gereinigt, d.h. bis sie frei von endogenen Verunreinigungen, wie z.B. Lipopolysacchariden, sind. ISS-PN, die als Teil eines größeren Polynucleotids isoliert wurden, können durch auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannte Verfahren, wie beispielsweise durch Endonucleasenverdauung, auf die gewünschte Länge reduziert werden. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden Verfahren kennen, die zur Isolation, Reinigung und Verdauung von Polynucleotiden geeignet sind, um ISS-PN zu erhalten, die möglicherweise zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, oder können diese leicht in Erfahrung bringen.
  • Ringförmige ISS-PN können isoliert, durch Rekombinationsverfahren synthetisiert oder chemisch synthetisiert werden. Wenn die ringförmigen ISS-PN durch Isolation oder Rekombinationsverfahren erhalten werden, ist das ISS-PN vorzugsweise ein Plasmid. Die chemische Synthese von kleineren Oligonucleotiden kann unter Verwendung von in der Literatur beschriebenen Verfahren durchgeführt werden (Gao et al., Nucleic Acids Res. 23, 2025–9 (1995); Wang et al., Nucleic Acids Res. 22, 2326–33 (1994)).
  • Die ISS-PN können auch modifizierte Oligonucleotide enthalten. Diese modifizierten Oligonucleotide können unter Verwendung von herkömmlichen chemischen Transformationen synthetisiert werden. Die effiziente, auf einem festen Träger basierende Konstruktion von Methylphosphonaten wurde in der Literatur beschrieben. Agrawal et al., (19) Tet. Lett. 28, 3539–3542. Auch die Synthese von anderen auf Phosphor basierenden modifizierten Oligonucleotiden, wie beispielsweise Phosphotriestern (Miller et al, JACS 93, 6657–6665), Phosphoramidaten (Jager et al., Biochemistry 27, 7247–7246) und Dithiophosphaten (US-Patent Nr. 5.453.496), wurde beschrieben. Aber auch andere, nicht auf Phosphor basierende modifizierte Oligonucleotide können verwendet werden (Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17, 6129–6141).
  • Die Herstellung von basenmodifizierten Nucleosiden und die Synthese von modifizierten Oligonucleotiden unter Verwendung der basenmodifizierten Nucleoside als Vorläufer wurde beispielsweise in den US-Patenten 4.910.300, 4.948.882 und 5.093.232 beschrieben. Diese basenmodifizierten Nucleoside wurden so konzipiert, dass sie durch chemische Synthese in entweder terminale oder interne Positionen eines Oligonucleotids inkorporiert werden können. Solche basenmodifizierten Nucleoside, die an entweder terminalen oder internen Positionen eines Oligonucleotids vorhanden sind, können als Anbindungsstellen für ein Peptid oder anderes Antigen dienen. Nucleoside, die in ihrer Zuckergruppierung modifiziert wurden, sind ebenfalls in der Literatur beschrieben (z.B. US-Patente 4.849.513, 5.015.733, 5.188.800, 5.118.802) und können auf ähnliche Weise verwendet werden.
  • Die Verfahren zur Durchführung von Phosphatgruppenmodifikationen an Oligonucleotiden sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und bedürfen hierin keiner Erläuterung. Bei einem dieser geeigneten Verfahren wird beispielsweise ein Phosphattriester-Zwischenprodukt für das gewünschte Oligonucleotidprodukt hergestellt und mit wässrigem Iod oder mit anderen Mitteln, wie z.B. wasserfreien Aminen, zum natürlich vorkommenden Phosphattriester oxidiert. Die resultierenden Oligonucleotidphosphoramidate können mit Schwefel behandelt werden, um Thiophosphate zu erhalten. Ein im Wesentlichen gleiches Verfahren (mit Ausnahme des Schwefelbehandlungsschritts) kann durchgeführt werden, um Methylphosphoamidite aus Me thylphosphonaten zu erhalten. Für weitere Details zu Phosphatgruppenmodifikationsverfahren sollten Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung die US-Patente Nr. 4.425.732; 4.458.066; 5.218.103 und 5.453.496 sowie Tetrahedron Lett. 21, 4149 (1995), 7, 5575 (1986), 25, 1437 (1984), und Journal Am. Chem. Soc. 93, 6657 (1987), zu Rate ziehen, deren Offenbarungen den Wissenstand auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf die Herstellung dieser Verbindung widerspiegeln.
  • 2. Bindung der PN-Komponente an die IMM-Komponente
  • Die ISS-PN-Komponente kann auf verschiedene Arten an den IMM-Teil des Konjugats gebunden werden. Die Bindung kann am 3'- oder 5'-Ende des ISS-PN oder an einer auf geeignete Weise modifizierten Base an einer internen Position im PN stattfinden. Wenn das Peptid eine geeignete reaktive Gruppe enthält (z.B. einen N-Hydroxysuccinimidester), kann es direkt mit der N4-Aminogruppe von Cytosinresten umgesetzt werden. Je nach Anzahl und Position von Cytosinresten im ISS-PN kann eine spezifische Markierung an einem oder mehreren Resten erreicht werden.
  • Alternativ dazu können auch modifizierte Oligonucleoside, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, an einem der Enden des oder an internen Positionen im ISS-PN inkorporiert werden. Diese können blockierte funktionelle Gruppen enthalten, die, wenn sie entblockiert werden, mit verschiedenen funktionellen Gruppen reaktiv sind, die auf einem Peptid von Interesse vorhanden sein oder daran gebunden sein können.
  • Der IMM-Teil des Konjugats kann durch auf trägergebundene Chemie an das 3'-Ende des ISS-PN gebunden werden. Beispielsweise kann der ISS-PN-Teil zu einem Polypeptidteil zugesetzt werden, der auf einem Träger vorsynthetisiert wurde (Haralambidis et al., Nucleic Acids Res. 18, 493–99 (1990); Haralambidis et al., Nucleic Acids Res. 18, 501–505 (1990)). Alternativ dazu kann das PN so synthetisiert werden, dass es durch einen spaltbaren Linker, der sich vom 3'-Ende aus erstreckt, an einen festen Träger gebunden ist. Bei chemischer Spaltung des ISS-PN vom Träger verbleibt eine terminale Thiolgruppe am 3'-Ende des ISS-PN (Zuckermann et al., Nucleic Acids Res. 15, 5305–5321 (1987); Corey et al., Science 238, 1401–1403 (1987)), oder eine terminate Amingruppe verbleibt am 3'-Ende des PN (Nelson et al., Nucleic Acids Res. 17, 1781–94 (1989)). Die Konjugation des aminomodifizierten PN an Aminogruppen des Peptids kann wie in Benoit et al. Neuromethods 6, 43–72 (1987), beschrieben durchgeführt werden. Die Konjugation des thiolmodifizierten ISS-PN an Carboxylgruppen des Peptids kann wie in Sinah et al., Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press (1991), beschrieben durchgeführt werden.
  • Der IMM-Teil des Konjugats kann durch eine Amin-, Thiol- oder Carboxylgruppe, die während seiner Synthese in das ISS-PN inkorporiert wurde, an das 5'-Ende des ISS-PN gebunden werden. Vorzugsweise ist, während das ISS-PN an den festen Träger fixiert ist, eine Linkergruppe, die an einem Ende ein geschütztes Amin, Thiol oder Carboxyl und am anderen Ende ein Phosphoramidit umfasst, kovalent an das 5'-Hydroxyl gebunden (Agrawal et al., Nucleic Acids Res. 14, 6227–6245 (1986); Connolly, Nucleic Acids Res. 13, 4485–4502 (1985); Coull et al., Tetrahedron Lett. 27, 3991–3994 (1986); Kremsky et al., Nucleic Acids Res. 15, 2891–2909 (1987); Connolly, Nucleic Acids Res. 15, 3131–3139 (1987); Bischoff et al., Anal. Biochem. 164, 336–344 (1987); Blanks et al., Nucleic Acids Res. 16, 10283–10299 (1988); US-Patente Nr. 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800 und 5.118.802). Nach dem Entschützen können die latenten Amin-, Thiol- und Carboxylfunktionalitäten verwendet werden, um das PN kovalent an ein Peptid zu binden (Benoit et al., Neuromethods 6, 43–72 (1987); Sinah et al., Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press (1991)).
  • Ein Peptidteil kann an jeder beliebigen Position im ISS-PN an ein modifiziertes Cytosin oder Uracil gebunden werden. Die Inkorporation eines "Linkerarms", der eine latente reaktive Funktionalität aufweist, wie beispielsweise eine Amin- oder Carboxylgruppe, am C-5 der modifizierten Base stellt einen Henkel für die Peptidbindung dar (Ruth, 4th Annual Congress for Recombinant DNA Research, S. 123).
  • Die Bindung des ISS-PN an ein Peptid kann auch durch nichtkovalente Wechselwirkung mit hoher Affinität, wie beispielsweise einen Biotin-Streptavidin-Komplex, erreicht werden. Eine Biotinylgruppe kann beispielsweise an eine modifizierte Base eines Oligonucleotids gebunden werden (Roget et al., Nucleic Acids Res. 17, 7643–7651 (1989)). Die Inkorporation einer Streptavidingruppierung in den Peptidteil ermöglicht die Bildung eines nicht kovalent gebundenen Komplexes aus dem streptavidinkonjugierten Peptid und dem biotinylierten PN.
  • Die Bindung des ISS-PN an ein Lipid kann unter Verwendung von Standardverfahren erreicht werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Synthese von Oligonucleotid-Phospholipid-Konjugaten (Yanagawa et al., Nucleic Acids Symp. Ser. 19, 189–92 (1988), Oligonucleotid-Fettsäure-Konjugaten (Grabarek et al., Anal. Biochem. 185, 131–35 (1990); Staros et al., Anal. Biochem. 156, 220–22 (1986)) und Oligonucleotid-Sterin-Konjugaten (Boujrad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5728–31 (1993).
  • Die Bindung des ISS-PN an ein Oligosaccharid kann unter Verwendung von bekannten Standardverfahren erreicht werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Synthese von Oligonucleotid-Oligosaccharid-Konjugaten, worin das Oligosaccharid eine Gruppierung eines Immunglobulins ist (O'Shannessy et al., J. Applied Biochem. 7, 347–55 (1985)).
  • Adjuvantien und Cytokine können auch genetisch oder chemisch an die ISS-PN-Konjugate gebunden werden. Beispiele für diese Art von Fusionspeptiden sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und finden sich auch in Czerkinsky et al., Infect. Immun. 57, 1072–77 (1989); Nashar et al., Vaccine 11, 235–40 (1993); und Dertzbaugh und Elson, Infect. Immun. 61, 48–55 (1993).
  • Die Bindung eines ringförmigen ISS-PN an ein IMM kann auf verschiedene Weisen erreicht werden. Wenn das ringförmige PN unter Verwendung von Rekombinations- oder chemischen Verfahren synthetisiert wird, ein modifiziertes Nucleosid (Ruth, in Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press (1991)). Her kömmliche Bindeverfahren können dann verwendet werden, um das ringförmige ISS-PN an das Antigen oder immunstimulierende Peptid zu binden (Goodchild, Bioconjugate Chem. 1, 165 (1990)). Wenn das ringförmige ISS-PN isoliert oder unter Verwendung von Rekombinations- oder chemischen Verfahren synthetisiert wird, kann die Bindung durch chemische Aktivierung oder Photoaktivierung oder eine reaktive Gruppe (z.B. Carben, Radikal), die in das Antigen oder immunstimulierende Peptid inkorporiert wurde, gebildet werden.
  • Weitere Verfahren für die Bindung von Peptiden und anderen Molekülen an ISS-PNs finden sich in C. Kessler: Nonradioactive labeling methods for nucleic acids, in: L. J. Kricka (Hrsg.), "Nonisotopic DNA Probe Techniques", Academic Press (1992), und in Geoghegan und Stroh, Bioconjug. Chem. 3, 138–146 (1992).
  • D. Verfahren und Pfade zur Verabreichung von ISS-PN/IMM an einen Wirt
  • 1. Arzneimittelverabreichung
  • Die ISS-PN/IMM der Erfindung werden unter Verwendung eines beliebigen bekannten Verfahrens und beliebige Pfade, die zur Arzneimittelverabreichung geeignet sind, an den Wirt verabreicht, einschließlich Ex-vivo-Verfahren (z.B. Verabreichung von mit einem ISS-PN/IMM inkubierten oder transfizierten Zellen) sowie systemischen oder örtlich festgelegten Pfaden. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden jedoch erkennen, dass Verfahren und örtlich festgelegte Pfade, bei denen das ISS-PN/IMM in antigensensibilisiertes Gewebe gesteuert wird, in den meisten Fällen gegenüber systemischen Verabreichungswegen bevorzugt sind, sowohl im Hinblick auf die Unmittelbarkeit der therapeutischen Wirkung als auch auf die Vermeidung von In-vivo-Abbau.
  • Der Eintrittspunkt für viele exogene Antigene in einen Wirt verläuft über die Haut oder Schleimhaut. Somit sind Verabreichungsverfahren und -pfade, die auf die Haut (z.B. bei kutanen oder subkutanen Anomalien) oder Schleimhaut (z.B. bei respiratorischen, Okularen, lingualen oder genitalen Leiden) abzielen, besonders nützlich.
  • Fachleute auf dem Gebiet der Medizin werden mit Mitteln zur Arzneimittelverabreichung in die Haut und Schleimhaut vertraut sein oder können diese leicht in Erfahrung bringen. Um einen Überblick zu geben, sind jedoch nachstehend Beispiele für Verfahren und Pfade zur Verabreichung von Arzneimitteln angeführt, die in Zusammenhang mit der Erfindung von Nutzen sind.
  • Intranasale Verabreichungsmittel sind insbesonders nützlich bei der Behandlung von Atemwegsentzündungen, vor allem bei Entzündungen, die durch Antigene vermittelt werden, die durch die Nase in die Trachea oder Bronchiolen gelangen. Solche Mittel umfassen die Inhalation von Aerosolsuspensionen oder die Insufflation der Polynucleotidzusammensetzungen der Erfindung. Verneblervorrichtungen, die zur Verabreichung von Polynucleotidzusammensetzungen in die Nasenschleimhaut, Trachea oder Bronchiolen geeignet sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und werden daher hierin nicht näher erläutert. Einen allgemeinen Überblick über intranasale Arzneimittelverabreichung für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung bietet Chien, Novel Drug Delivery Systems, Kap. 5, Marcel Dekker (1992).
  • Dermale Verabreichungswege sowie subkutane Injektionen sind nützlich bei der Behandlung von allergischen Reaktionen und Entzündungen der Haut. Beispiele für Mittel zur Verabreichung von Arzneimitteln in die Haut sind topisches Auftragen eines geeigneten pharmazeutischen Präparats, transdermale Transmission, Injektion und epidermale Verabreichung.
  • Bei transdermaler Transmission sind die Verwendung von Absorptionspromotoren und Iontophorese geeignete Verfahren. Einen Überblick über solche Verfahren für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung bietet Chien, w.o., Kap. 7. Iontophoretische Transmission kann unter Verwendung von allgemein erhältlichen "Pflastern" erreicht werden, die ihr Produkt durch elektrische Impulse durch heile Haut kontinuierlich über einen Zeitraum von mehreren Tagen oder länger abgeben. Die Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht eine kontrollierte Transmission von pharmazeutischen Zusammensetzungen in relativ großen Konzentrationen, die Infusion von Kombinationsarzneimitteln und die gleichzeitige Verwendung eines Absorptionspromotors.
  • Ein Beispiel für ein Pflasterprodukt, das für dieses Verfahren geeignet ist, ist das markengeschützte LECTRO PATCH von General Medical Company, Los Angeles, CA, USA. Diese Produkt hält Reservoirelektroden elektronisch bei einem neutralen pH und kann so angepasst werden, dass Dosen mit unterschiedlichen Konzentrationen bereitgestellt werden, um so kontinuierlich und/oder periodisch zu dosieren. Die Herstellung und Verwendung des Pflasters sollte gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt werden, die dem LECTRO PATCH beiliegen; diese Anleitungen sind durch Verweis hierin aufgenommen.
  • Die epidermale Verabreichung umfasst im Wesentlichen eine mechanische oder chemische Irritation der äußersten Epidermisschicht, die ausreicht, um eine Immunantwort auf das Reizmittel zu erzeugen. Ein Beispiel für eine Vorrichtung zur Verwendung bei epidermaler Verabreichung umfasst mehrere kurze Spitzen mit äußerst geringem Durchmesser, die verwendet werden können, um auf den Spitzen aufgetragenes ISS-PN/IMM in die Haut zu ritzen. Die Vorrichtung, die dem MONO-VACC-Alttuberculintest von Pasteur Merieux, Lyon, Frankreich, beiliegt, ist zur Verwendung bei der epidermalen Verabreichung von ISS-PN/IMM geeignet. Die Verwendung der Vorrichtung sollte gemäß den Anleitungen des Herstellers erfolgen, die dem Produkt beiliegen; diese Anleitungen in Bezug auf Verwendung und Verabreichung veranschaulichen die herkömmliche Verwendung dieser Vorrichtung. Ähnliche Vorrichtungen, die ebenfalls in dieser Ausführungsform der Erfindung verwendet werden können, sind solche, die derzeit zur Durchführung von Allergietests eingesetzt werden.
  • Ophthalmische Verabreichung (z.B. zur Behandlung von allergischer Bindehautentzündung) umfasst eine invasive oder topische Anwendung eines pharmazeutischen Präparats am Auge. Augentropfen, topische Cremen und injizierbare Flüssigkeiten sind Beispiele für geeignete Milieus zur Verabreichung von Arzneimitteln ins Auge.
  • Systemische Verabreichung umfasst invasive oder systemisch absorbierte topische Verabreichung von pharmazeutischen Präparaten. Topische Anwendungen sowie intravenöse und intramuskuläre Injektionen sind Beispiele für herkömmliche Mittel zur systemischen Verabreichung von Arzneimitteln.
  • 2. Dosierungsparameter
  • Ein besonderer Vorteil des ISS-PN/IMM der Erfindung besteht in seiner Fähigkeit, auch bei relativ kleinen Dosen immunmodulierende Aktivität auszuüben. Obwohl die verwendete Dosis je nach klinischem Ziel, das erreicht werden soll, variiert, ist ein geeigneter Dosisbereich einer, der in einer einzelnen Dosis etwa 1–1000 μg ISS-PN/IMM/ml Träger bereitstellt. Alternativ dazu kann die gewünschte Dosis von ISS-PN/IMM auch etwa 1–10 μM in einer Blutprobe des Wirts betragen, die innerhalb der ersten 24–48 Stunden nach der Verabreichung von ISS-PN/IMM gezogen wurde. Aufgrund derzeitiger Untersuchungen wird angenommen, dass ISS-PN/IMM bei diesen Dosierungen geringe oder keine Toxizität aufweisen.
  • In diesem Zusammenhang sollte darauf hingewiesen werden, dass die entzündungshemmende und immuntherapeutische Aktivität von ISS-PN/IMM der Erfindung im Wesentlichen von der Dosis abhängt. Daher wird, um die ISS-PN/IMM-Wirksamkeit zu verdoppeln, die Konzentration jeder einzelnen Dosis verdoppelt. Klinisch gesehen mag es ratsam sein, ISS-PN/IMM in geringer Dosis zu verabreichen (z.B. etwa 1 μg/ml bis etwa 50 μg/ml) und dann die Dosis je nach Bedarf zu erhöhen, um das gewünschte therapeutische Ziel zu erreichen.
  • In Bezug auf die in dieser Offenbarung bereitgestellten Lehren werden Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung mit geeigneten Parametern für die Verabreichung von ISS-PN/IMM gemäß der Erfindung vertraut sein oder können diese leicht bestimmen.
  • 3. ISS-PN/IMM-Zusammensetzungen
  • ISS-PN/IMM wird in einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung zur Verabreichung an einen Wirt hergestellt. Pharmazeutisch annehmbare Träger, die zur Verwendung mit ISS-PN/IMM der Erfindung bevorzugt sind, können sterile wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen umfassen. Beispiele für nichtwässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie z.B. Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie z.B. Ethyloleat.
  • Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösungen und gepufferte Medien. Parenterale Vehikel umfassen Natriumchloridlösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, laktierte Ringer-Lösung und gehärtete Öle. Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeits- und Nährstoffauffrischungslösungen, Elektrolytauftrischungslösungen (wie beispielsweise solche, die auf Ringer-Dextrose basieren) und dergleichen. Konservierungsmittel und andere Additive können ebenfalls vorhanden sein, wie beispielsweise antimikrobielle Stoffe, Antioxidantien, Chelatbildner, Inertgase und dergleichen. Eine Zusammensetzung von ISS-PN/IMM kann auch unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannten Mitteln gefriergetrocknet werden, um danach wieder zur ursprünglichen Konzentration gelöst und gemäß der Erfindung verwendet zu werden.
  • Absorptionspromotoren, Detergentien und chemische Reizmittel (z.B. keritinolytische Mittel) können die Transmission einer ISS-PN/IMM-Zusammensetzung in ein Zielgewebe fördern. Hinsichtlich der allgemeinen Prinzipien in Bezug auf Absorptionspromotoren und Detergentien, die mit Erfolg bei der Schleimhautverabreichung von organischen und auf Peptiden basierenden Arzneimitteln verwendet wurden, siehe Chien, Novel Drug Delivery System, Kap. 4, Marcel Dekker (1992).
  • Beispiele für geeignete nasale Absorptionspromotoren sind in Chien, w.o., Kap. 5, Tabelle 2 und 3, angeführt; mildere Stoffe sind bevorzugt. Geeignete Mittel zur Verwendung beim Verfahren dieser Erfindung zur Verabreichung über die Schleimhaut oder die Nase sind auch in Chang et al., Nasal Drug Delivery, "Treatise on Controlled Drug Delivery", Kap. 9, Marcel Dekker (1992), und in Tabelle 3–4B davon beschrieben. Geeignete Mittel, die bekannterweise die Absorption von Arzneimitteln durch die Haut fördern, sind in Sloan, Use of Solubility Parameters from Regular Solution Theory to Describe Partitioning-Driven Processes, Kap. 5, "Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery", Marcel Dekker (1992), und in anderen Teilen des Texts zu finden. Alle diese Verweise spiegeln den Wissenstand und die Fertigkeiten auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf Arzneimittelverabreichungsverfahren wider.
  • Ein kolloidales Dispersionssystem kann auch zur gezielten Verabreichung von ISS-PN/IMM an ein spezifisches Gewebe verwendet werden. Kolloidale Dispersionssysteme umfassen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen, Kügelchen und auf Lipiden basierende Systeme, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, Mizellengemische und Liposome. Das in dieser Erfindung bevorzugte kolloidale System ist ein Liposom.
  • Liposome sind künstliche Membranvesikel, die als Verabreichungsvehikel in vitro und in vivo nützlich sind. Es wurde gezeigt, dass große einschichtige Vesikel (LUV), deren Größe von 0,2–4,0 μm reicht, einen wesentlichen Prozentsatz eines wässrigen Puffers einkapseln kann, der große Makromoleküle enthält. RNA, DNA und intakte Virionen können im wässrigen Inneren eingekapselt und in biologisch aktiver Form zu den Zellen transportiert werden (Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6, 77 (1981)). Zusätzlich zu Säugetierzellen wurden Liposome zur Verabreichung von Polynucleotiden an Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen verwendet. Damit ein Liposom ein effizientes Gentransfervehikel darstellt, sollten die folgenden Anforderungen erfüllt sein: (1) Einkapselung der Gene, die für die Antisense-Polynucleotide kodieren, mit hoher Effizienz, ohne jedoch ihre biologische Aktivität zu beeinträchtigen; (2) bevorzugte und feste Bindung an eine Zielzelle im Vergleich zu Nichtzielzellen; (3) Abgabe des wässrigen Gehalts des Vesikels an das Zielzellenzytoplasma mit hoher Effizienz; und (4) genaue und effektive Expression der genetischen Information (Mannino et al., Biotechniques 6, 682 (1988)).
  • Die Zusammensetzung des Liposoms besteht üblicherweise aus einer Kombination von Phospholipiden, insbesondere Phospholipide, mit hoher Phasenübergangstemperatur, die normalerweise in Kombination mit Steroiden, insbesondere Cholesterin, vorliegen. Andere Phospholipide oder andere Lipide können auch verwendet werden. Die physikalischen Eigenschaften von Liposomen hängen vom pH, von der Ionenstärke und von der Gegenwart von zweiwertigen Kationen ab.
  • Beispiele für Lipide, die bei der Liposomproduktion nützlich sind, umfassen Phosphatidylverbindungen, wie z.B. Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside. Insbesonders nützlich sind Diacylphosphatidylglycerine, worin die Lipidgruppierung 14–18 Kohlenstoffatome, insbesondere 16–18 Kohlenstoffatome, enthält und gesättigt ist. Veranschaulichende Phospholipide umfassen Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.
  • Das Targeting von Liposomen kann basierend auf anatomischen und mechanistischen Faktoren klassifiziert werden. Eine anatomische Klassifikation basiert auf dem Wert der Selektivität, beispielsweise organspezifisch, zellspezifisch und organellenspezifisch. Mechanistisches Targeting kann dadurch unterschieden werden, ob es passiv oder aktiv stattfindet. Passives Targeting nutzt die natürliche Tendenz von Liposomen, sich zu Zellen des Retikuloendothelialsystems (RES) in Organen auszubreiten, die sinusoide Kapillaren enthalten. Aktives Targeting, auf der anderen Seite, umfasst eine Veränderung des Liposoms durch Kupplung des Liposoms an einen spezifischen Liganden, wie beispielsweise einen monoklonalen Antikörper, Zucker, ein Glykolipid oder ein Protein, oder durch Veränderung der Zusammensetzung oder Größe des Liposoms, um ein Targeting an Organe und Zelltypen zu erreichen, die sich von den natürlich vorkommenden Lokalisierungsstellen unterscheiden.
  • Die Oberfläche des gewünschten bestimmten Abgabesytems kann auf verschiedene Weisen modifiziert werden. Im Falle eines liposomalen bestimmten Abgabesystems können Lipidgruppen in die Lipiddoppelschicht des Liposoms inkorporiert werden, um den Targeting-Liganden in stabiler Verbindung mit der liposomalen Doppelschicht zu halten. Unterschiedliche, allgemein bekannte Bindungsgruppen können verwendet werden, um die Lipidketten an den bestimmten Liganden zu binden (siehe z.B. Yanagawa et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 19, 189 (1988); Grabarek et al., Anal. Biochem. 185, 131 (1990); Staros et al., Anal. Biochem. 156, 220 (1986), und Boujrad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5728 (1993), deren Offenbarungen den Wissensstand auf dem Gebiet der Konjugation von PNs an Lipide repräsentieren). Die gezielte Abgabe von ISS-PN/IMM kann auch durch Konjugation des ISS-PN/IMM an die Oberfläche von viralen und nichtviralen rekombinanten Expressionsvektoren, an ein Antigen oder einen anderen Liganden, an einen monoklonalen Antikörper oder an ein beliebiges Molekül, das die gewünschte Bindungsspezifität aufweist, erreicht werden.
  • Die gleichzeitige Verabreichung eines Peptidarzneimittels mit einem ISS-PN/IMM gemäß der Erfindung kann auch erreicht werden, indem das ISS-PN/IMM in cis oder in trans in einen rekombinanten Expressionsvektor (Plasmid, Cosmid, Virus oder Retrovirus) inkorporiert wird, der für ein beliebiges therapeutisch vorteilhaftes Protein kodiert, das durch einen rekombinanten Expressionsvektor bereitgestellt werden kann. Wenn die Inkorporation eines ISS-PN/IMM in einen Expressionsvektor zur Verwendung bei der Umsetzung der Erfindung erwünscht ist, kann eine solche Inkorporation unter Verwendung herkömmlicher Verfahren erreicht werden, die für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sind. Eine Zusammenfassung für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung findet sich in Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, w.o.
  • D. Screenen auf aktive ISS-PN/IMM
  • Die Bestätigung, dass eine bestimmte Verbindung die Eigenschaften eines ISS-PN/IMM aufweist, die für die Erfindung nützlich sind, kann erhalten werden, indem bewertet wird, ob das ISS-PN/IMM sich auf die Cytokinsekretion und die IgG-Antikörperisotypproduktion, wie in Abschnitt A.I beschrieben ist, auswirkt. Details in Bezug auf In-vitro-Verfahren, die bei der Durchführung einer solchen Bewertung von Nutzen sind, sind in den Beispielen zu finden; Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden auch mit weiteren Verfahren zur Messung der Cytokinsekretion und Antikörperproduktion gemäß den hierin angeführten Parametern vertraut sein oder können diese leicht in Erfahrung bringen.
  • E. Sets zur Verwendung bei der Umsetzung der Verfahren der Erfindung
  • Die Erfindung stellt auch Sets zur Verwendung in den oben beschriebenen Verfahren bereit. Solche Sets können eine oder alle der folgenden Elemente umfassen: ISS-PN/IMM (konjugiert oder unkonjugiert); einen pharmazeutisch annehmbaren Träger (der mit dem ISS-PN/IMM vorgemischt sein kann) oder eine Suspensionsbasis, um gefriergetrocknete ISS-PN/IMM wieder zur ursprünglichen Konzentration zu lösen; weitere Medikamente; eine sterile Phiole für jedes ISS-PN/IMM und jedes weitere Medikament oder eine einzige Phiole für Gemische daraus; eine oder mehrere Vorrichtungen zur Verwendung bei der Verabreichung von ISS-PN/IMM an einen Wirt; Testreagenzien zur Detektion von Indizien, dass die erwünschte entzündungshemmende und/oder immunstimulierende Wirkung in behandelten Tieren erreicht wurde, und eine geeignete Testvorrichtung.
  • Beispiele zur Veranschaulichung der Umsetzung der Erfindung sind nachstehend angeführt. Die Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung der Erfindung, die durch die beiliegenden Ansprüche definiert ist. Alle Abkürzungen und Begriffe, die in den Beispielen verwendet werden, werden, sofern nicht anders angeführt, gemäß ihrer herkömmlichen Bedeutung verwendet.
  • BEISPIEL I
  • SELEKTIVE AUSLÖSUNG EINER Th1-REAKTION IN EINEM WIRT NACH VERABREICHUNG EINES ISS-PN/IMM
  • Bei Mäusen sind IgG-2A-Antikörper serologische Marker für eine Immunantwort vom Th1-Typ, während IgG-1-Antikörper auf eine Immunantwort vom Th2-Typ hinweisen. Th2-Reaktionen umfassen die allergieassoziierte IgE-Antikörperklasse; lösliche Proteinantigene neigen dazu, relativ starke Th2-Reaktionen zu stimulieren. Im Gegensatz dazu werden Th1-Reaktionen durch Antigenbindung an Makrophagen und dendritische Zellen ausgelöst.
  • Um zu bestimmen, welche Reaktion, falls vorhanden, in Mäusen auftritt, die ein ISS-PN/IMM gemäß der Erfindung erhielten, wurden acht Gruppen Balb/c-Mäuse mit 10 μg β-Galactosidaseprotein (an Avidin konjugiert; Sigma, St. Louis, MO, USA) immunisiert, um ein Allergiephänotypmodell zu erhalten. Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist, erhielten einige der Mäuse nur ein Antigen, einige erhielten ein Antigen-ISS-PN-Konjugat oder ein Konjugat mit einer nichtstimulierenden PN- Mutante als Konjugat für das Antigen, und wieder andere erhielten das Antigen in einem unkonjugierten Gemisch mit einem ISS-PN. Naive Mäuse sind als Bezug angeführt.
  • Figure 00350001
  • DY1018 weist die folgende Nucleotidsequenz auf:
    5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' mit einem Thiophosphat-Rückgrat
    und DY1019 weist die folgende Nucleotidsequenz auf:
    5'-TGACTGTGAAGGTTGGAGATGA-3' mit einem Thiophosphat-Rückgrat.
  • In Abständen von 2 Wochen wurden alle IgG 2a und IgG 1 gegen β-Galactosidase, die im Serum der einzelnen Mäuse vorhanden sind, mithilfe einer enzymgekoppelten Immunabsorptionsbestimmung (unter Verwendung von für die IgG-1- und IgG-2A-Subklassen spezifischen Antikörpern) auf Mikrotiterplatten, die mit dem Enzym beschichtet waren, gemessen.
  • Wie in 1 zu sehen ist, produzierten nur die Mäuse, die das ISS-PN/IMM erhielten, hohe Titer von IgG-2A-Antikörpern, deren Zahl über einen Zeitraum von 8 Wochen zunahm. Wie in 2 zu sehen ist, führte eine Immunisierung der Mäuse mit dem Antigen selbst oder mit dem PN/IMM zu Produktion von relativ hohen Titern von IgG-1-Antikörpern. Die in den Figuren angeführten Daten umfassen Mittelwerte der Werte, die in den einzelnen Gruppen von Mäusen erhalten wurden.
  • Um die Wirkung der Behandlung in einem Wirt vor und nach einer sekundären Antigenexposition zu bewerten, wurden 3 Gruppen von Balb/c-Mäusen mit 10 μg Antigen E (AgE) in Alaun immunisiert, um ein Allergiephänotypmodell bereitzustellen, und 5 Wochen nach dem Primen erneut mit dem Antigen, ISS-PN/IMM oder einer (nichtstimulierenden) PN/IMM-Mutante provoziert. Ein ELISA für IgG1- und IgG2a-Antikörper wurde wie beschrieben 4 Wochen nach dem Primen (eine Woche vor der sekundären Antikörperexposition) und erneut 7 Wochen danach (2 Wochen nach der sekundären Exposition) durchgeführt.
  • Wieder wiesen die Mäuse, die das ISS-PN/IMM erhielten, im Vergleich zu den antigenimmunisierten und mit PN/IMM-Mutanten immunisierten Mäusen eine starke Reaktion vom Th1-Typ auf das Antigen (IMM) auf (3), während für dieselben Mäuse in Bezug auf die Reaktion vom Th2-Typ das Gegenteil zutraf (4).
  • Diese Daten zeigen, dass durch die Verabreichung eines ISS-PN/IMM gemäß der Erfindung sowohl an einen antigengeprimten (Prä-Antigen-Exposition) als auch an einen antigenprovozierten Wirt eine selektive Th1-Reaktion ausgelöst wird.
  • BEISPIEL II
  • UNTERDRÜCKUNG DER IgE-ANTIKÖRPER-REAKTION AUF EIN ANTIGEN DURCH IMMUNISIERUNG MIT ISS-PN/IMM
  • Um die IgE-Unterdrückung, die durch eine gegenüber einer zellulären Immunantwort vom Th2-Typ bevorzugten Stimulation einer zellulären Immunantwort vom Th1-Typ erreicht wird, wurden fünf bis acht Wochen alte Balb/c-Mäuse wie im vorigen Beispiel beschrieben mit AgE immunisiert.
  • IgE-Anti-AgE wurden unter Verwendung eines Festphasen-Radioimmunoassays (RAST) in einer 96 Wells aufweisenden Polyvinylplatte (eine radioisotopische Modifikation des ELISA-Verfahrens, die in Coligan, "Current Protocols in Immunology", 7.12.4, Bd. 1, Wiley & Sons (1994), beschrieben ist) detektiert, mit der Ausnahme, dass anstelle von für menschlichen Fab spezifischen Antikörpern gereinigte polyklonale Ziegenantikörper verwendet wurden, die für Mäuse-∈-Antikörper spezifisch waren. Um Anti-AgE-IgE zu detektieren, wurden die Platten mit AgE (10 μg/ml) beschichtet. Die niedrigste IgE-Konzentration, die durch den verwendeten Test gemessen werden konnte, betrug 0,4 ng IgE/ml.
  • Eine spezifische Messung der Anti-Antigenreaktion der einzelnen Mäusegruppen zeigte, wie in 5 zu sehen ist, dass die Anti-AgE-IgE-Werte in ISS-PN/IMM-immunisierten Mäusen vor und nach dem Boosten durchwegs niedrig waren, während die Mäuse, denen das Protein und die ISS-PN/IMM-Mutante injiziert worden waren, nach einer Antigenexposition höhere Anti-AgE-Werte erreichten.
  • Diese Daten zeigen, dass die ISS-PN/IMM-immunisierten Mäuse eine antigenspezifischen Th1-Reaktion auf das Antigen entwickelten (und die Th2-IgE-Reaktion unterdrückten).
  • BEISPIEL III
  • INFγ-WERTE IN MÄUSEN NACH VERABREICHUNG VON ISS-PN/IMM
  • BALB/c-Mäuse wurden wie in Beispiel I beschrieben mit βgal immunisiert und 24 Stunden später getötet. Aus jeder Maus wurden Splenocyten entnommen.
  • 96-Well-Mikrotiterplatten wurden mit einem Anti-CD3-Antikörper (Pharmingen, La Jolla, CA, USA) in einer Konzentration von 1 μg/ml Salzlösung überzogen. Der Anti-CD3-Antikörper stimuliert T-Zellen durch die Abgabe eines chemischen Signals, das die Wirkungen der Bindung an den T-Zell-Rezeptor-(TCR-)Komplex nachahmt. Die Platten wurden gewaschen, und Splenocyten wurden in einem Medium von RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum zu jedem Well (4 × 105/Well) zugesetzt. Überstände wurden am Tag 1, 2 und 3 erhalten.
  • Die Th1-Cytokin-(INFγ-)Werte wurden mithilfe eines Anti-INFγ-Mäuseantikörpertests bestimmt (siehe Coligan, "Current Protocols in Immunology", 6.9.5, Bd. 1, Wiley & Sons (1994)). In Mäusen mit einem Th2-Phänotyp wären relativ niedrige INF-γ-Wert zu erwarten, während in Mäusen mit einem Th1-Phänotyp relativ hohe INF-γ-Werte zu erwarten wären.
  • Wie in 5 zu sehen ist, wurden die Werte von Th1-stimulierter IFN-γ-Sekretion in den ISS-PN/IMM-behandelten Mäusen deutlich erhöht, in anderen Mäusegruppen jedoch stark verringert (im Vergleich zur Kontrolle), was auf die Entwicklung eines Phänotyps vom Th2-Typ in letzteren Mäusen und eines Th1-Phänotyps in den ISS-PN/IMM-behandelten Mäusen hinweist.
  • BEISPIEL IV
  • BOOSTEN VON CTL-REAKTIONEN DURCH ISS-PN/IMM
  • Ein Gemisch aus Lymphozyten wurde erhalten und mit βgal-Antigen alleine oder als Teil der in Beispiel 1 beschriebenen Konstrukte und Gemische kontaktiert. Wie in 6 zu sehen ist, war die CTL-Produktion als Reaktion auf ISS-PN/IMM anhaltend höher als die Reaktion auf ein Antigen, das in anderen Formen verabreicht wurde; sie war sogar zweimal so hoch wie in Tieren, die mit einem unkonjugierten Gemisch aus ISS-PN und IMM-Antigen behandelt wurden.
  • In dem Experiment sind die im Vergleich zu den auf herkömmliche Weise immunisierten Mäusen höheren Werte der mit M-ISS-PN/IMM behandelten Mäuse nach einer Antigenexposition wahrscheinlich auf die Antigenträgereigenschaften von DY1019 zurückzuführen.
  • Eine Behandlung gemäß der Erfindung führt somit zu einer längerfristigen, durch zelluläre Immunantworten vermittelten Immunität.

Claims (23)

  1. Immunmodulierende Zusammensetzung, die ein immunmodulierendes Molekül umfasst, worin dieses immunmodulierende Molekül ein Antigen umfasst, worin das Antigen an ein immunstimulierendes Polynucleotid (ISS-PN) konjugiert ist, wobei dieses ISS-PN zumindest eine immunstimulierende Sequenz (ISS) umfasst, welche die nichtmethylierte Sequenz 5'-Cytosin, Guanin-3' umfasst, worin die ISS zumindest sechs Nucleotide lang ist, worin dieses ISS-PN eine Länge von 6 bis etwa 200 Nucleotiden aufweist und worin das Antigen aus einem Tumorantigen, einem viralen Antigen, einem Allergen oder einem infektiösen Mikroorganismus ausgewählt ist.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Allergen aus der aus Pflanzenpollen-Allergenen, Staubmilbenproteinen, tierischen Hautschuppen-Allergenen, Speichel-Allergenen und Pilzsporen-Allergenen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Allergen Antigen E Amb aI-Ambrosienpollen-Antigen oder ein Baumpollen-Antigen ist.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das virale Antigen ein Antigen von einem Virus ist, der aus HIV-1, HIV-2, Hepatitis-Viren, Herpes-simplex-Viren, Rotaviren, Polioviren, Masernviren und menschlichen Papilloma-Viren ausgewählt ist.
  5. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die ISS eine Palindromsequenz umfasst.
  6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die ISS die Sequenz 5'-Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin-3' umfasst.
  7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die ISS eine Sequenz, ausgewählt aus der aus AACGTT, AGCGTT, GACGTT, GGCGTT, AACGTC, AGCGTC, GACGTC, GGCGTC, AACGCC, AGCGCC, GACGCC, GGCGCC, AACGCT, AGCGCT, GACGCT, GGCGCT und TTCCGA bestehenden Gruppe, umfasst.
  8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die ISS eine Sequenz, ausgewählt aus der aus AACGTT, AGCGTT, GACGTT, GGCGTT, AACGTC, AGCGTC, GACGTC, GGCGTC, AACGCC, AGCGCC, GACGCC, GGCGCC, AACGCT, AGCGCT, GACGCT, GGCGCT und TTCCGA bestehenden Gruppe, umfasst, die durch eine Uracil-Substitution geändert ist.
  9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die ISS die Sequenz TGACTGTGAACGTTCGAGATGA umfasst.
  10. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Polynucleotid weiters eine Phosphat-Hauptkettenmodifikation umfasst.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin die Phosphat-Hauptkettenmodifikation Thiophosphat oder Dithiophosphat ist.
  12. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Polynucleotid weiters zumindest ein modifiziertes Nucleotid umfasst.
  13. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung weiters ein immunstimulierendes Molekül, ausgewählt aus der aus Adjuvanzien, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Chemokinen, Targeting-Proteinliganden und trans-aktivierenden Faktoren bestehenden Gruppe, umfasst.
  14. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die weiters ein entzündungshemmendes Mittel umfasst.
  15. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Polynucleotid linear ist.
  16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das Polynucleotid ringförmig ist.
  17. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Antigen nichtkovalent an das Polynucleotid konjugiert ist.
  18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin das Antigen über einen Linker-Arm an das C-5 einer modifizierten Cytosin- oder Uracil-Base des Polynucleotids konjugiert ist.
  19. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das immunmodulierende Molekül an einen monoklonalen Antikörper gebunden ist.
  20. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren.
  21. Verwendung einer immunmodulierenden Zusammensetzung, die ein immunmodulierendes Molekül umfasst, worin das immunmodulierende Molekül ein Antigen umfasst, worin das Antigen an ein immunstimulierendes Polynucleotid (ISS-PN) konjugiert ist, wobei dieses ISS-PN zumindest eine immunstimulierende Sequenz (ISS) umfasst, welche die nichtmethylierte Sequenz 5'-Cytosin, Guanin-3' umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zum Boosten einer Th1-Reaktion und/oder zur Unterdrückung einer Th2-Reaktion auf das Antigen und/oder zur Reduktion von Antigen-stimulierter IgE-Produktion.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, worin das immunmodulierende Molekül wie in einem der Ansprüche 1 bis 19 definiert ist.
  23. Set, umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
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