DE69733560T2

DE69733560T2 - TESTVERFAHREN UND REAGENZIEN ZUR QUANTIFIZIERUNG VON hBNP

Info

Publication number: DE69733560T2
Application number: DE69733560T
Authority: DE
Inventors: P. Ronald MISCHAK; A. Garret LIM; Marian Jan SCARDINA
Original assignee: Scios LLC
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 1996-03-04
Filing date: 1997-03-04
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2017-03-05
Also published as: JP2000507094A; ATE297950T1; EP0914344A1; DK2292662T3; CA2248140C; ES2243979T3; PT914344E; EP1557431A1; DK0914344T3; ZA971864B; US6124430A; EP2292662A3; EP2292662B1; PT2292662E; US6162902A; HK1078096A1; EP0914344B1; CA2248140A1; US6376207B1; AU1981597A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Immunoassays, genauer ausgedrückt Reagenzien und Verfahren, die nützlich für die schnelle und empfindliche Quantifizierung des Peptidhormons hBNP in einem biologischen Fluid, wie etwa Plasma oder Serum, sind.
2. Beschreibung des Standes der Technik
BNP ist ein aus dem Herzen stammendes Peptidhormon, das im Blut zirkuliert und potente kardiovaskuläre und renale Aktivitäten ausübt. BNP ist strukturell ähnlich zu zwei anderen Herz-Peptiden, dem natriuretischen Peptid des Atriums (ANP) und dem C-Typ natriuretischen Peptid (CNP). Schweine-BNP wurde aus Schweinehirn isoliert (Sudoh et al., Nature 332: 78–81, 1988); es wurde ihm daher der Name „natriuretisches Peptid des Gehirns" verliehen. Beim Menschen ist der Herzventrikel die primäre Stelle der BNP-Synthese. Die Sequenz von humanem BNP (hBNP) wurde ursprünglich durch die Isolierung und Charakterisierung von DNA-Klonen aus humanen genomischen Bibliotheken bestimmt (US-Patent 5,114,923). hBNP wird in vivo als 108 Aminosäuren großer Vorläufer synthetisiert, der enzymatisch gespalten wird, um das reife hBNP-Peptid zu erhalten. Reifes hBNP besteht aus einem 32 Aminosäuren großen Peptid mit einer 17 Aminosäuren umfassenden Ringstruktur, die durch zwei Disulfid-Bindungen gebildet wird (siehe 1).
Eine erhöhte Expression von ventrikulärer hBNP-mRNA ist bei Patienten mit kongestiver Herzschwäche im Vergleich zu normalen Kontrollen beschrieben worden. Übereinstimmend mit der Steigerung von ventrikulärer Masse und BNP-mRNA-Expression sind die hBNP-Spiegel bei Patienten mit kongestiver Herzschwäche erhöht und scheinen mit der Schwere der Erkrankung zu korrelieren. Auch Plasma-hBNP wird als wertvoller vorhersagender Marker für Herzerkrankung eingeschätzt. Erhöhtes Plasma-hBNP ist beschrieben worden bei Herzerkrankung, nach akutem Myocardinfarkt und bei symptomfreier oder subklinischer ventrikulärer Dysfunktion (Mukoyama et al., J. Clin. Invest., 87: 11402–1412, 1991) (Motwani et al., Lancet, 341: 1109–1113, 1993) (Yoshibayashi et al., New Eng. J. Med., 327: 434, 1992). Berichte von zwei wesentlichen therapeutischen Studien, der SAVE-Studie (New Eng. J. Med., 327: 669–677, 1992) und der SOLVD-Studie (New Eng. J. Med., 327: 685–691, 1992) deuten darauf hin, dass die Diagnose und geeignete Behandlung von Patienten mit asymptomatischer Dysfunktion des linken Ventrikels die Häufigkeit tödlicher und nicht-tödlicher kardiovaskulärer Ereignisse und die damit zusammenhängenden Krankenhausaufenthalte signifikant reduzieren könnten.
Für die Verwendung in einer klinischen Laboreinrichtung wäre es höchst erstrebenswert, einen diagnostischen Test für hBNP bereitzustellen, der hinreichend empfindlich ist, um klinisch relevante Titer von hBNP zu messen, hinreichend einfach, um automatisiert werden zu können, und so beschaffen, dass er nur ein Minimum an Zeit zur Fertigstellung benötigt und bevorzugt keine Verwendung von Reagenzien mit begrenzter Lagerfähigkeit erfordert. Die normalen Spiegel von hBNP im Plasma sind relativ niedrig, in der Größenordnung von 1 bis 20 pg/ml. Typischerweise werden Radioimmunoassays verwendet, um Titer in diesem Größenbereich zu messen, obwohl die Verwendung radioaktiver Reagenzien eine spezielle Handhabung erfordert, dem Test Schritte hinzufügt und die Verwendung von Material mit begrenzter Lagerfähigkeit einschließt. Ein Radioimmunoassay zur Messung von hBNP ist kommerziell erhältlich, jedoch ist dieser, zusätzlich zur Erfordernis der Verwendung radioaktiver Reagenzien, kompliziert und mühsam, erfordert einen Extraktionsschritt, Präzipitation und verschiedene Zentrifugationsschritte und benötigt mehrere Tage, bis er abgeschlossen ist. Die europäische Patentanmeldung Nr. 0 542 255 beschreibt einen Radioimmunoassay für hBNP. Die internationale Patentanmeldung Nr. WO 93/24531 beschreibt Antikörper, die spezifisch für die Aminosäuren 1–76 des N-Terminus von BNP sind, und Takeyama et al. (J. Immunol. Methods 130: 217–222 (1990)) beschreibt einen Mikro-Enzym-Immunoassay für Schweine-BNP.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien und Verfahren für die schnelle und direkte Quantifizierung von hBNP-Spiegeln in biologischen Fluiden bereit. Die hier bereitgestellten Reagenzien und Verfahren erlauben die Detektion von hBNP-Titern bei klinisch relevanten Spiegeln ohne die Verwendung radioaktiver Markierung (obwohl radioaktive Markierung verwendet werden kann, wenn dies gewünscht ist). Darüber hinaus ermöglichen sie die direkte Quantifizierung von hBNP im Plasma ohne die Notwendigkeit mühsamer Extraktionsschritte. Die hier bereitgestellten Reagenzien und Verfahren fügen sich problemlos in die automatisierten Systeme ein, die verwendet werden, um Bluttests im großen Maßstab in kommerziellen klinischen Labors durchzuführen.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden monospezifische Antikörper gegen ausgewählte Peptidepitope in dem hBNP-Molekül bereitgestellt. Bevorzugt sind diese monospezifischen Antikörper monoklonale Antikörper. Die monospezifischen Antikörper der Erfindung werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Antikörper oder einem funktionell aktiven Fragment hiervon, der oder das monospezifisch für ein Peptidepitop ist, das die Aminosäuresequenz VQGSGCFGR aus hBNP (Aminosäuren 5–13 aus 1) umfasst;
(b) einem Antikörper oder einem funktionell aktiven Fragment hiervon, der oder das monospezifisch für ein Peptidepitop ist, das die Aminosäuresequenz SPKMVQGSGC aus hBNP (Aminosäuren 1–10 aus 1) umfasst; und
(c) einem Antikörper oder einem funktionell aktiven Fragment hiervon, der oder das monospezifisch für ein Peptidepitop ist, das die Aminosäuresequenz MDRISSSSGLG aus hBNP (Aminosäuren 15–25 aus 1) umfasst;

Ein bevorzugter Antikörper der Erfindung ist ein monoklonaler Antikörper, der das Peptidepitop erkennt und bindet, welches die Aminosäuresequenz VQGSGCFGR aus hBNP (Aminosäuren 5–13 aus 1) umfasst.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Quantifizierung der Menge an hBNP in einem biologischen Fluid bereitgestellt, das die Reagenzien der Erfindung in einem Immunoassay des Sandwich-Typs verwendet. Der Immunoassay kann eine beliebige von zahlreichen Markierungstechniken verwenden, um die Immunkomplexe zu markieren und zu quantifizieren, wobei enzymatische Markierung bevorzugt ist. Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zum Quantifizieren von hBNP in einem biologischen Fluid bereit, wobei dieses Verfahren die Ausbildung eines markierten Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes umfasst, wobei dieser Komplex aus Folgendem besteht:

(a) Erstantikörper, der aus Folgenden ausgewählt ist:
(i) Antikörper oder funktionell aktives Fragment des Antikörpers, der oder das gegenüber einem hBNP-Fragment mit der Aminosäuresequenz VQGSGCFGR monospezifisch reaktiv ist;
(ii) Antikörper oder funktionell aktives Fragment des Antikörpers, der oder das gegenüber einem hBNP-Fragment mit der Aminosäuresequenz SPKMVQGSG monospezifisch reaktiv ist;
(iii) Antikörper oder funktionell aktives Fragment des Antikörpers, der oder das gegenüber einem hBNP-Fragment mit der Aminosäuresequenz MDRISSSSGLGC monospezifisch reaktiv ist;
(b) jegliches hBNP, das in dem biologischen Fluid enthalten ist;
(c) Zweitantikörper oder funktionell aktives Fragment des Antikörpers, der oder das mit hBNP immunreaktiv ist, und wobei wenigstens einer von Erst- und Zweitantikörper wenigstens einen Marker umfasst; und

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zur Quantifizierung der Menge von hBNP in einem biologischen Fluid bereitgestellt, wobei die Reagenzien der Erfindung in Immunoassays des kompetitiven Typs verwendet werden. Ein solcher Assay umfasst die folgenden Schritte:

(a) Kontaktieren einer Probe des biologischen Fluids mit:
(i) einem Antikörper, der monospezifisch für ein Peptidepitop ist, das die Aminosäuren 5–13 von hBNP (1) umfasst, oder einem funktionell aktiven Fragment von diesem; und
(ii) hBNP oder einem Fragment davon, umfassend die Aminosäuren 5–13 von hBNP (1), mit einem daran gebundenen quantifizierbaren Marker, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-hBNP-Komplexes gestatten; und
(b) Bestimmen der Menge von hBNP in der Probe durch Quantifizieren des Markers in dem Antikörper-hBNP-Komplex.

Eine weitere Ausführungsform des Assays der Erfindung in einem Format des kompetitiven Typs umfasst die Schritte:

(a) Kontaktieren einer Probe des biologischen Fluids mit:
(i) einem Antikörper, der monospezifisch für ein Peptidepitop ist, das die Aminosäuren 1–10 von hBNP (1) umfasst, oder einem funktionell aktiven Fragment von diesem; und
(ii) hBNP oder einem Fragment davon, umfassend die Aminosäuren 1–10 von hBNP (1), mit einem daran gebundenen quantifizierbaren Marker, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-hBNP-Komplexes gestatten; und
(b) Bestimmen der Menge von hBNP in der Probe durch Quantifizieren des Markers in dem Antikörper-hBNP-Komplex.

(a) Kontaktieren einer Probe des biologischen Fluids mit:
(i) einem Antikörper, der monospezifisch für ein Peptidepitop ist, das die Aminosäuren 15–25 von hBNP (1) umfasst, oder einem funktionell aktiven Fragment von diesem; und
(ii) hBNP oder einem Fragment davon, umfassend die Aminosäuren 15–25 von hBNP (1), mit einem daran gebundenen quantifizierbaren Marker, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-hBNP-Komplexes gestatten; und
(b) Bestimmen der Menge von hBNP in der Probe durch Quantifizieren des Markers in dem Antikörper-hBNP-Komplex.

Bei den Sandwich-Assays und den kompetitiven Assays der Erfindung wird der Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplex (im Falle des Sandwich-Assays) oder der Antikörper-hBNP-Komplex (im Falle des kompetitiven Assays) für gewöhnlich vom Rest der biologischen Fluidprobe abgetrennt, bevor der Marker in dem Komplex quantifiziert wird. Es gibt jedoch bekannte Markierungstechniken, die eine direkte Messung des markierten Komplexes in der Probe erlauben, d.h. ohne den Komplex von der Probe abzutrennen, und solche Verfahren werden als vom Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen erachtet. Als ledigliches Beispiel für solche Verfahren kann man den Szintillations-Nähe-Assay („scintillation proximity assay", siehe Udenfriend, S. et al., Anal. Biochem., 161: 494–500, 1987) und den von Mathis, G., Clin. Chem., 41: 1391–1397, 1995, beschriebenen Assay nennen.
Ebenfalls durch diese Erfindung bereitgestellt werden Fragmente von hBNP, die als Reagenzien in einem Assay des Kompetitions-Typs der Erfindung verwendet werden können.
Bei einer Ausführungsform besitzt das hBNP-Fragment der Erfindung die Formel X¹-V-Q-G-S-G-C-F-G-R-X² (I)wobei X¹ aus der Gruppe bestehend aus
Wasserstoff,
M-,
K-M-,
P-K-M- oder
S-P-K-M ausgewählt ist,
und X² aus der Gruppe bestehend aus
Hydroxyl,
-K,
-K-M,
-K-M-D und
-K-M-D-R ausgewählt ist,
oder es ist ein retro-inverses Isomer, ein teilweise retro-inverses Isomer oder ein D-Aminosäure-Isomer davon.
Bei einer weiteren Ausführungsform besitzt das hBNP-Fragment der Erfindung die Formel S-P-K-M-V-Q-G-S-G-C-X³ (II)wobei X³ aus der Gruppe bestehend aus
Hydroxyl,
-F und
-F-G ausgewählt ist,
oder es ist ein retro-inverses Isomer, ein teilweise retro-inverses Isomer oder ein D-Aminosäure-Isomer davon.
Bei einer weiteren Ausführungsform besitzt das hBNP-Fragment der Erfindung die Formel X⁴-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-X⁵ (III)wobei X⁴ aus der Gruppe bestehend aus
Wasserstoff
K-,
R-K- und
G-R-K- ausgewählt ist,
und X⁵ aus der Gruppe bestehend aus
Hydroxyl,
-C,
-C-K,
-C-K-V,
-C-K-C-L,
-C-K-V-L-R,
-C-K-V-L-R-R und
-C-K-V-L-R-R-H ausgewählt ist
oder es ist ein retro-inverses Isomer, ein teilweise retro-inverses Isomer oder ein D-Aminosäure-Isomer davon.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Darstellung der Aminosäuresequenz der reifen Form (32 Aminosäuren) von hBNP. Die Aminosäuren sind durch den Standard-Einbuchstaben-Code dargestellt, und die durchgezogene Linie stellt eine Disulfidbindung zwischen den beiden Cysteinresten dar.
2 zeigt das Ergebnis von Versuchen, die durchgeführt wurden, um die Fähigkeit von gegen hBNP erzeugten polyklonalen Kaninchen-Antiseren, an verschiedene Fragmente von hBNP zu binden, zu untersuchen.
3 zeigt die Ergebnisse von Epitop-Kartierungsstudien bei drei monoklonalen Antikörpern, die als MAb 201.3, MAb 106.3 und MAb 8.1 bezeichnet werden.
4 ist eine Standard-Kurve für einen Enzym-gekoppelten Immunosorptions-Assay des Sandwich-Typs, der MAb 106.3 als Fang-Antikörper und einen polyklonalen Antikörper, #4024, als Zweitantikörper verwendet.
5 ist eine Standard-Kurve für einen Enzym-gekoppelten Immunosorptions-Assay des Sandwich-Typs, der MAb 201.3 als Fang-Antikörper und den polyklonalen Antikörper #4360 als Zweitantikörper verwendet.
6 ist eine Standard-Kurve für einen Enzym-gekoppelten Immunosorptions-Assay des Sandwich-Typs, der MAb 106.3 als Fang-Antikörper und einen monospezifischen Antikörper gegen Epitop 15–25 als Zweitantikörper verwendet.
7 ist eine Standard-Kurve für einen Enzym-gekoppelten Immunosorptions-Assay des Sandwich-Typs, der MAb 201.3 als Fang-Antikörper und einen monospezifischen, polyklonalen Antikörper gegen Epitop 15–25 als Zweitantikörper verwendet.
8 ist eine Standard-Kurve für einen Immunosorptions-Assay des Sandwich-Typs, der MAb 8.1 als Fang-Antikörper und biotinylierten MAb 106.3 als Zweitantikörper in einem monoklonal:monoklonal-Sandwich verwendet.
9 ist eine Standard-Kurve für einen Immunosorptions-Assay des Sandwich-Typs, der MAb 201.3 als Fang-Antikörper und biotinylierten MAb 8.1 als Zweitantikörper in einem monoklonal:monoklonal-Sandwich verwendet.
10 ist eine Standard-Kurve für einen Enzym-gekoppelten Immunosorptions-Assay des Kompetitions-Typs, der MAb 106.3 als Antikörper verwendet.
11 stellt die Ergebnisse dar, die unter Verwendung eines Enzym-gekoppelten Immunosorptions-Assays des Kompetitions-Typs erhalten wurden, um die hBNP-Spiegel im Plasma von normalen Kontrollsubjekten und Subjekten mit kongestiver Herzerkrankung zu quantifizieren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
1. Antikörper der Erfindung
Diese Erfindung stellt hochempfindliche Reagenzien bereit, die die schnelle, einfache und genaue Quantifizierung von hBNP im Bereich klinisch relevanter Titer in biologischen Fluiden, wie Plasma oder Serum, gestatten. Insbesondere haben wir drei zuvor nicht identifizierte, hochgradig immunogene Epitope innerhalb des hBNP-Moleküls identifiziert und Antikörper hergestellt, die monospezifisch für diese Regionen sind. Wenn ein Antikörper hier als „monospezifisch" für ein Epitop bezeichnet wird, so ist damit gemeint, dass der Antikörper in der Lage ist, an eine Aminosäuresequenz von hBNP zu binden, die diejenigen Aminosäuren enthält, die das Epitop umfassen, während er nicht dazu in der Lage ist, an eine Aminosäuresequenz von hBNP zu binden, der die Aminosäuren, die das Epitop ausbilden, fehlen. Die monospezifischen Antikörper der Erfindung sind bevorzugt, jedoch nicht notwendigerweise, monoklonale Antikörper.
Die drei Epitope, die von den monospezifischen Antikörpern der Erfindung erkannt werden, umfassen die Aminosäuren 1–10, 5–13 und 15–25 von hBNP (1).
Monoklonale Antikörper der Erfindung können durch Hybridomzellen hergestellt werden, die gemäß bekannter Verfahren, z.B. nach Kohler, G. und Milstein, C., Nature, 256: 495, 1975, hergestellt wurden. Im allgemeinen werden Mäuse mit einem immunogenen Konjugat aus hBNP und einem geeigneten Partner, wie etwa Rinderserum-Albumin, immunisiert. Es werden periodische Auffrischungsinjektionen verabreicht, bis gute Antikörpertiter erreicht werden. Milzzellen der immunisierten Mäuse werden dann mit Myelomazellen gemäß bekannter Verfahren (d.h. Galfre et al., Nature, 266: 550, 1977) fusioniert, um Hybridomzellen herzustellen. Die Überstände der Hybridomzellkulturen werden auf ihre Reaktivität gegenüber hBNP durchgetestet. Positiv getestete Hybridome werden erneut kloniert und ihre Überstände wiederum auf Reaktivität hin getestet. Unter Verwendung dieses Verfahrens, wie unten in größerem Detail beschrieben, erhielten wir die Hybridomzelllinie 106.3, die monoklonale Antikörper sekretiert, die spezifisch das hBNP-Fragment 5–13 (1) erkennen, die Hybridomzelllinie 201.3, die monoklonale Antikörper sekretiert, die spezifisch das hBNP-Fragment 1–10 (1) erkennen, sowie die Hybridomzelllinie 8.1, die monoklonale Antikörper sekretiert, die spezifisch das hBNP-Fragment 27–32 (1) erkennen.
Sobald ein hochgradig immunogenes Epitop identifiziert worden ist, können nicht-monoklonale, monospezifische Antikörper aus polyklonalen Antiseren hergestellt werden. Polyklonales Antiserum wird gemäß bekannten Techniken hergestellt. Ein geeignetes Tier, wie etwa ein Kaninchen, wird mit einem immunogenen Konjugat aus hBNP und einem geeigneten Partner immunisiert. Es werden periodische Auffrischungsinjektionen verabreicht, bis gute Antikörpertiter erreicht werden. Durch das Testen der so erhaltenen Antiseren auf ihre Immunreaktivität gegen verschiedene Peptidfragmente von hBNP werden geeignete Epitope identifiziert. Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir das Peptidfragment hBNP 15–25 (1) als hochgradig immunogenes Epitop von hBNP identifiziert. Monospezifische Antikörper gegen das identifizierte Epitop können durch Affinitätsreinigung von polyklonalem Serum an einer Affinitätssäule erhalten werden, wobei bei dieser Säule ein Peptidfragment, das nur dieses Epitop und keines der anderen, bei der Epitop-Kartierung identifizierten Epitope enthält, an einen festen Träger gebunden wird. Unter Verwendung dieser allgemeinen Prozedur, wie unten in größerem Detail beschrieben, haben wir nicht-monoklonale, monospezifische Antikörper produziert, die spezifisch das hBNP-Fragment 15–25 (1) erkennen.
Es wird jedoch erkennbar sein, dass monoklonale Antikörper gegen dieses Epitop auch unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden können.
Funktionell aktive Fragmente der monospezifischen Antikörper der Erfindung können auch in Assays auf hBNP verwendet werden. Ein funktionelles Fragment ist ein Fragment, das die immunologische Spezifität des Antikörpers beibehält, obwohl die Avidität und/oder Affinität quantitativ nicht identisch sein können. Einbezogen in die funktionell aktiven Fragmente sind solche Immunglobulinfragmente, wie etwa Fab, F(ab')₂ und Fab'. Die Fragmente können durch bekannte Verfahren, wie etwa durch die enzymatische Spaltung der monospezifischen Antikörper (siehe z.B. Mariani, M et al., Mol. Immunol., 28: 69–77, 1991; Ishikawa, E. et al., J. Immunoassay, 4: 209–327, 1983), hergestellt werden.
Die Aminosäuren von hBNP, auf die hier im Folgenden Bezug genommen wird, entsprechen denjenigen der hBNP-Sequenz aus 1.
II. Peptidfragmente von hBNP, die für Immunoassays nützlich sind
Um einen Immunoassay in einem Format des kompetitiven Typs durchzuführen, ist es notwendig ein markiertes Peptid einzusetzen, das in der Lage ist, mit dem hBNP in der biologischen Fluidprobe, die auf Bindung an den im Assay verwendeten Antikörper getestet wird, zu konkurrieren. Das markierte Peptid kann markiertes hBNP 1–32 sein. Bei der Verwendung der monospezifischen Antikörper dieser Erfindung ist es jedoch nicht notwendig, intaktes hBNP 1–32 als das kompetitive Reagenz zu verwenden. Vielmehr können auch neuartige hBNP-Peptidfragmente der Formeln I–III, oben, verwendet werden. In den Formeln I–III werden die Aminosäuren durch ihre Standardabkürzungen in Einbuchstabenform dargestellt. Die Angabe, dass X¹ oder X⁴ Wasserstoff darstellt, bedeutet, dass dies den Amino-Terminus des Peptidfragments darstellt. Die Angabe, dass X², X³ oder X⁵ Hydroxyl darstellt, bedeutet, das dies den Carboxy-Terminus des Peptidfragments darstellt.
Insbesondere können Peptidfragmente der Formel I, die die Aminosäuren 5–13 der hBNP-Sequenz beinhalten, als Reagenzien verwendet werden, um mit dem hBNP in der Testprobe auf Bindung an einen Antikörper der Erfindung zu konkurrieren, der monospezifisch für das Epitop ist, das die Aminosäuren 5–13 beinhaltet. Peptidfragmente der Formel I, bei denen X¹ S-P-K-M ist, können als Reagenzien in einem kompetitiven Assay verwendet werden, der einen Antikörper der Erfindung verwendet, der monospezifisch für das Epitop ist, das die Aminosäuren 1–10 umfasst.
Peptidfragmente der Formel II, die die Aminosäuren 1–10 von hBNP beinhalten, können als Reagenzien verwendet werden, um mit dem hBNP in der Testprobe auf Bindung an einen Antikörper der Erfindung zu konkurrieren, der monospezifisch für das Epitop ist, das die Aminosäuren 1–10 beinhaltet.
Peptidfragmente der Formel III, die die Aminosäuren 15–25 von hBNP beinhalten, können als Reagenzien verwendet werden, um mit dem hBNP in der Testprobe auf Bindung an einen Antikörper der Erfindung zu konkurrieren, der monospezifisch für das Epitop ist, das die Aminosäuren 15–25 beinhaltet.
Zusätzlich kann man für dieselben Zwecke Peptide verwenden, die den Peptiden der Formeln I–III entsprechen, bei denen jedoch alle Aminosäuren durch die korrespondierenden D-Aminosäuren ausgetauscht wurden (hier im Folgenden als „D-Aminosäure-Isomere" bezeichnet), oder man kann retro-inverse Isomere oder teilweise modifizierte retro-inverse Isomere der Peptide der Formeln I–III verwenden. Retro-inverse Isomere sind Isomere, bei denen die Richtung der Sequenz umgekehrt ist und bei denen die Chiralität jedes Aminosäurerestes invertiert ist. Teilweise modifizierte retro-inverse Isomere sind Isomere, bei denen nur einige der Peptidbindungen umgekehrt sind und bei denen die Chiralität der Aminosäurereste in dem umgekehrten Teil invertiert ist. Retro-inverse Isomere und teilweise modifizierte retro-inverse Isomere sind von Chorev, M. und Goodman, M., TIBTECH, Band 13: 438–444, 1995, beschrieben worden. Für diese Isomere ist gezeigt worden, dass sie mit ihren Elternpeptiden immunologisch kreuz-reaktiv sind.
Die Peptidfragmente der Erfindung können durch Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind, wie z.B. durch Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung des Verfahrens von Merrifield et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3449–3453, 1955). Die retro-inversen Derivate können durch das Verfahren von Briand et al., J. Biol. Chem., 270: 20686–20691, 1995, hergestellt werden.
III. Immunoassays der Erfindung
Die Reagenzien der Erfindung können verwendet werden, um Immunoassays durchzuführen, um hBNP-Spiegel in biologischen Fluiden, wie etwa Plasma, Serum und Vollblut, zu quantifizieren. Die Assays können entweder in einem Format des Sandwich-Typs oder in einem kompetitiven Format durchgeführt werden. Wenn die hBNP-Spiegel in Blut bestimmt werden, so ist das biologische Fluid bevorzugt Plasma oder Serum, das unter Verwendung bekannter Verfahren aus Vollblut hergestellt werden kann.
Bei einem Assay des Sandwich-Typs werden zwei verschiedene Antikörper verwendet, um das hBNP in der biologischen Fluidprobe abzutrennen und zu quantifizieren. Die beiden Antikörper binden an das hBNP und bilden dabei ein(en) Immunkomplex oder Sandwich. Im allgemeinen wird einer der Antikörper dazu verwendet, um das hBNP in der Probe einzufangen, und ein Zweitantikörper wird dafür verwendet, um eine quantifizierbare Markierung an das Sandwich zu binden. Vorzugsweise werden die zur Durchführung des Sandwich-Typ-Assays gewählten Antikörper so ausgesucht, dass der Erstantikörper, der mit der hBNP-enthaltenden Probe in Kontakt gebracht wird, nicht das gesamte oder einen Teil desjenigen Epitops bindet, das von dem Zweitantikörper erkannt wird, was signifikant in die Fähigkeit des Zweitantikörpers, an hBNP zu binden, eingreifen würde. Folglich sollte man, wenn ein Sandwich-Typ-Format gewählt wird, vorzugsweise keinen Antikörper, der für hBNP 5–13 monospezifisch ist, in Kombination mit einem für hBNP 1–10 monospezifischen Antikörper verwenden, da die Epitope, die von diesen Antikörpern erkannt werden, überlappen. Wir haben jedoch herausgefunden, dass ein exzellenter Assay durchgeführt werden kann, indem man einen monospezifischen Antikörper als den Erstantikörper verwendet, der in Kontakt mit der hBNP-enthaltenden Probe gebracht wird, sowie einen hochgradig affinen polyklonalen Antikörper für hBNP 1–32 als den Zweitantikörper. Insbesondere haben wir einen Sandwich-Typ-Assay hergestellt, der im Bereich klinisch relevanter hBNP-Titer sensitiv ist, dies unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der das Epitop hBNP 5–13 erkennt, als „Fang-Antikörper", sowie eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen hBNP als Zweitantikörper (siehe Beispiele 9 und 10).
Die Fluidprobe kann mit dem ersten und dem zweiten Antikörper gleichzeitig oder aufeinander folgend in Kontakt gebracht werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Sandwich-Assays der Erfindung wird die hBNP enthaltende biologische Fluidprobe zunächst mit einem ersten, für ein bestimmtes Epitop monospezifischen Antikörper unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Bildung eines Antikörper-hBNP-Komplexes erlauben. Vorzugsweise wird der Erstantikörper an einen festen Träger gebunden, um die schließliche Abtrennung des Sandwich-Komplexes von der Fluid-Probe zu erleichtern. Die festen Träger, die verwendet werden können, sind Fachleuten wohlbekannt, und können z.B. polymere Materialien in Form von Wells, Röhren oder Beads sein. Der Antikörper kann durch Adsorption an den festen Träger gebunden werden, oder durch kovalente Bindung unter Verwendung eines chemischen Kopplungsmittels, unter der Voraussetzung, dass das verwendete Kopplungsmittel nicht störend in die Fähigkeit des Antikörpers, an hBNP zu binden, eingreift. Die polymeren Trägermaterialien können derivatisiert werden, um Reaktivität mit verschiedenen funktionellen Gruppen an dem Antikörper zu erlauben. Typischer Weise verwendete Kopplungsmittel beinhalten Maleinsäureanhydrid, N- Hydroxysuccinimid und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. Bei einem Assay des Sandwich-Typs, wird der Antikörper normalerweise in Mengen verwendet, die im wesentlichen einem molaren Überschuss der maximal in der Probe erwarteten Menge an hBNP entsprechen. Vorzugsweise werden etwa 0,01 nM bis etwa 1,0 nM an Antikörper pro ml unverdünntem Plasma verwendet. In der Praxis kann man die biologische Fluidprobe in einem geeigneten physiologischen Puffer verdünnen, um ein akzeptables molares Verhältnis von Antikörper zu hBNP zu erreichen.
Nachdem die hBNP-enthaltende Probe in Kontakt mit dem monospezifischen Erstantikörper gebracht wurde, wird die Probe inkubiert, um die Bildung eines Erstantikörper-hBNP-Komplexes zu erlauben. Im allgemeinen wird die Inkubation bei oder nahe dem physiologischen pH durchgeführt, z.B. bei pH 6,0 bis pH 8,0, bei einer Temperatur von etwa 4°C bis etwa 37°C. Die Inkubationszeit beträgt wenigstens etwa 2 Minuten, obwohl die Inkubation sogar für 18 Stunden durchgeführt werden kann.
Der Erstantikörper-hBNP-Komplex wird mit dem Zweitantikörper unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Bildung eines Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes erlauben. Typischerweise beinhaltet dies eine Inkubation unter Bedingungen, die denjenigen ähnlich sind, die oben für die Bildung des Erstantikörper-hBNP-Komplexes dargestellt wurden. Vor, gleichzeitig mit oder nach der Bildung des Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes wird eine quantifizierbare Markierung an den Zweitantikörper gebunden. Hierbei kann jede der bekannten Markierungen, die üblicherweise bei Immunoassays verwendet werden, eingesetzt werden. Dies können z.B. radioaktive Marker, wie etwa ¹²⁵I, Enzymmarker, wie etwa Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase, chemilumineszierende Marker, wie etwa Acridiniumester, biolumineszierende Marker, Fluoreszenzmarker, thermometrische Marker, Marker der Immunpolymerasekettenreaktion, oder andere Marker sein. Für eine Übersicht über einige der empfindlicheren Markierungen, die bei den Assays der Erfindung verwendet werden können, verweisen wir auf Kricka, L. J., Clin. Chem., 40(3): 347–357, 1994 und Kricka, L. J., Clin. Biochem., 26: 325–331, 1993. Die Markierung kann direkt oder über ein Kopplungsmittel an den Antikörper gebunden werden. Beispielsweise kann im Fall der Meerrettichperoxidase der Zweitantikörper unter Verwendung bekannter Techniken an Biotin gebunden werden. Nach der Bildung des Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes kann der Komplex mit Avidin-Meerrettichperoxidase in Kontakt gebracht werden, die durch das Biotin fest an den Zweitantikörper gebunden wird. Ein alternatives Verfahren zur Bindung der Markierung an den Zweitantikörper beinhaltet das Kontaktieren des Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes mit einem Antikörper, der die F_C-Region des Zweitantikörpers erkennt und bindet, und der die Markierung angekoppelt trägt. Weitere Verfahren zur Bindung der Markierung an den Zweitantikörper werden Fachleuten problemlos erkennbar sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplex vor der Quantifizierung der Markierung vom Rest der biologischen Fluidprobe abgetrennt. Wenn der Erstantikörper an einen festen Träger, wie etwa ein Well oder ein Bead, gebunden ist, so erfolgt die Abtrennung einfach dadurch, dass das Fluid dem Kontakt mit dem festen Träger entzogen wird. Beispielsweise kann der Erstantikörper, der an einen festen Träger gebunden ist, mit der hBNP-enthaltenden Probe inkubiert werden, um einen Erstantikörper-hBNP-Komplex auszubilden, und die Fluidprobe kann dann dem Kontakt mit dem festen Träger entzogen werden, bevor das Kontaktieren des Erstantikörper-hBNP-Komplexes mit dem Zweitantikörper erfolgt. Alternativ kann der an einen festen Träger gebundene Erstantikörper gleichzeitig mit der hBNP-enthaltenden Probe und dem Zweitantikörper in Kontakt gebracht werden, um einen Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplex auszubilden, gefolgt von der Aufhebung des Kontakts zwischen dem biologischen Fluid und dem festen Träger.
Nach der Bildung des markierten Antikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes und der Abtrennung des Komplexes vom Rest der biologischen Fluidprobe wird die Menge der Markierung in dem Komplex unter Verwendung bekannter Verfahren quantifiziert. Beispielsweise wird der markierte Komplex im Falle einer enzymatischen Markierung mit einem Substrat für die Markierung umgesetzt, was eine quantifizierbare Reaktion, wie etwa eine Farbentwicklung, ergibt. Dort, wo die enzymatische Markierung Meerrettichperoxidase ist, wird der markierte Komplex z.B. mit Tetramethylbenzidin (TMB) umgesetzt, was eine Reaktion ergibt, die durch Messung einer Farbentwicklung quantifiziert werden kann. Dort, wo die Markierung eine radioaktive Markierung ist, wird die Markierung unter Verwendung eines Szintillationszählers quantifiziert. Es sind zahlreiche andere Verfahren zur Quantifizierung der verschiedenen Typen von Markierungen, die in den Assays der Erfindung verwendet werden können, wohlbekannt. Wenn die Menge an Markierung in dem Komplex quantifiziert worden ist, wird die Konzentration an hBNP in der biologischen Fluidprobe mittels einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung serieller Verdünnungen von hBNP bekannter Konzentration erzeugt wurde.
Der Assay der Erfindung kann auch in einem kompetitiven Format durchgeführt werden. Bei diesem Format wird ein Aliquot an markiertem hBNP oder eines geeigneten Fragments davon, das eine bekannte Konzentration besitzt, dazu verwendet, um mit dem hBNP in dem biologischen Fluid im Hinblick auf die Bindung an den hBNP-monospezifischen Antikörper zu konkurrieren. Bei dem Kompetitions-Assay kann der immobilisierte Antikörper gleichzeitig oder sequenziell mit der biologischen Fluidprobe und dem markierten hBNP oder hBNP-Fragment in Kontakt gebracht werden. Das markierte hBNP oder hBNP-Fragment, die Fluidprobe und der Antikörper werden unter Bedingungen inkubiert, die ähnlich denjenigen sind, die oben bei der Beschreibung des Sandwich-Typ-Assays angegeben sind. Es werden folglich zwei Arten von Antikörper-hBNP-Komplexen gebildet, wovon eine markiert und die andere unmarkiert ist. Die Menge an Markierung in dem Antikörper-hBNP-Komplex wird quantifiziert. Die Konzentration an hBNP in der biologischen Fluidprobe kann dann bestimmt werden, indem man die Menge an Markierung in dem Antikörper-hBNP-Komplex mit einer Standard-Kurve vergleicht, die unter Verwendung serieller Verdünnungen von hBNP bekannter Konzentration erzeugt wurde. Vorzugsweise wird der Antikörper-hBNP-Komplex vor der Quantifizierung der Markierung in dem Komplex von dem Rest der biologischen Fluidprobe abgetrennt.
Die Markierungen, die bei dem kompetitiven Format verwendet werden können, beinhalten diejenigen, die zuvor als nützlich bei einem Assay des Sandwich-Typs angegeben wurden. Die Markierung wird unter Verwendung bekannter Techniken kovalent an hBNP oder das hBNP-Fragment gebunden. Üblicherweise verwendete Techniken beinhalten die Verwendung heterobifunktionaler, quervernetzender Reagenzien, die mit primären Aminen, Sulfhydrylen oder Carboxylgruppen reagieren. Beispielsweise kann Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat verwendet werden, um Glucoseoxidase, Meerrettichperoxidase, β-Galactosidase oder alkalische Phosphatase an Peptide zu binden, die freie Sulfhydrylgruppen enthalten. Biotin kann unter Verwendung von BMCC an freie Sulfhydrylgruppen, unter Verwendung von Biotin-Hydrazid an Carboxylgruppen, oder unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid an Aminogruppen konjugiert werden. Die Abtrennung des Antikörper-hBNP-Komplexes kann in praktischer Weise durch die Bindung des Antikörpers an einen festen Träger durchgeführt werden, so etwa an solche, wie sie zuvor in Verbindung mit dem Sandwich-Assay-Format genannt wurden. Der Antikörper-hBNP-Komplex wird dann praktischer Weise abgetrennt, indem der Rest der biologischen Fluidprobe dem Kontakt mit dem festen Träger entzogen wird.
Das markierte Peptid, das verwendet wird, um mit dem hBNP in der Probe hinsichtlich der Bindung an den monospezifischen Antikörper zu konkurrieren, kann intaktes hBNP 1–32 oder ein beliebiges Peptidfragment davon sein, vorausgesetzt, dass das Fragment wenigstens diejenige Aminosäuresequenz enthält, die dem Epitop entspricht, das von dem monospezifischen Antikörper erkannt wird. Wenn der verwendete Antikörper monospezifisch für das Epitop ist, das die Aminsäuren 1–10 von hBNP umfasst, kann das markierte Peptidfragment folglich jedwedes Fragment sein, das wenigstens die Aminosäuren 1–10 enthält, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Peptide der Formel II und die Peptide der Formel I, bei denen X¹ S-P-K-M- ist. Wenn der verwendete Antikörper monospezifisch für das Epitop ist, das die Aminosäuren 5–13 von hBNP umfasst, so kann das markierte Peptidfragment jedwedes Fragment sein, das wenigstens die Aminosäuren 5–13 umfasst, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Peptide der Formel I. Wenn der verwendete Antikörper monospezifisch für das Epitop ist, das die Aminosäuren 15–25 von hBNP umfasst, so kann das markierte Peptidfragment jedwedes Fragment sein, das wenigstens die Aminosäuren 15–25 umfasst, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die Peptide der Formel III.
IV. Beispiele
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, die Durchführung der Erfindung weiter zu veranschaulichen; dabei sind sie nicht dazu geschaffen, den Schutzbereich der Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
1. Herstellung von BNP-Konjugaten für die Antikörper-Erzeugung
hBNP 1–32 und die Fragmente hBNP 1–10 und hBNP 26–32 wurden durch Festphasensynthese hergestellt. Diese Peptide wurden durch ein Carbodiimid-Kopplungsverfahren oder durch die Verwendung des heterobifunktionalen, quervernetzenden Reagenz N-Maleimido-L-aminocaproylester von 1-Hydroxysuccinimid-2-nitro-4-benzolsulfonsäure (mal-sac-HNSA) gemäß dem Verfahren von Aldwin und Nitecki (Anal. Biochem., 164: 494–501, 1987) an Rinderserum-Albumin (BSA)-Trägerprotein gekoppelt. BSA (1 mg) wurde mit 0,5 mg des mal-sac-HNSA-Quervernetzers in 250 μl Phosphat-gepufferter Saline (PBS) pH 7,5 für 40 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Das aktivierte BSA wurde über einer G-25 Sephadex-Säule mit 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,0 gereinigt und mit etwa 1 mg der Cystein enthaltenden Peptide hBNP 1–10 (SPKMVQGSGC) und hBNP 26–32 (CKVLRRH) zusammengebracht. Man ließ das Gemisch für 4 Stunden bei Raumtemperatur reagieren und dialysierte es über Nacht bei 4°C gegen PBS. Eine erfolgreiche Konjugation wurde durch die Gegenwart eines Proteins in einem Bereich angezeigt, der 75 Kd bis 90 Kd auf einem 12% Polyacrylamidgel entsprach.
Die BNP 1–32-BSA-Konjugate wurden hergestellt, indem man etwa 1 mg BNP in 450 μl an 1 mM HCl löste und 2,8 mg an 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) hinzufügte. Man setzte das Gemisch für 30 Minuten auf Eis um und gab 1,47 mg BSA in 300 μl 5 mM NaOH hinzu. Nach 4 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung bei 4°C gegen PBS dialysiert.
Die hBNP 1–32-Konjugate für die Herstellung von polyklonalen Kaninchenantikörpern wurden hergestellt, indem man 100 μg an methyliertem BSA (MeBSA) mit 100 μg hBNP 1–32 in 100 μl PBS, pH 7,4 mischte.
2. Immunisierungen
Für die Herstellung monoklonaler Antikörper wurden Mäuse mit Emulsionen von Peptidkonjugaten, die unter Verwendung des „RIBI Adjuvant Systems" (RIBI Immunochemical Research Inc.) hergestellt worden waren, immunisiert. Dabei wurden etwa 700 μg an synthetischem Trehalose-Dicorynomycolat und etwa 650 μg an Monophosphoryl-Lipid A von S. Minnesota R595, gelöst in 4:1 Chloroform:Methanol, in einem kleinen Glas-Homogenisator getrocknet. Es wurden 60 μl Squalen hinzugegeben und dies zu einer Paste gemischt. Das Peptidkonjugat wurde dann unter kontinuierlichem Rühren hinzugegeben, und es wurden weiterhin 1,5 ml an 0,2% Tween 80 in Wasser unter Rühren hinzugegeben, um eine fertige Emulsion zu erzeugen, die etwa 1 mg/ml an Protein enthielt. Die Emulsion wurde bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. Weibliche Balb/c-Mäuse (4 bis 6 Wochen alt) erhielten intraperitoneale Injektionen mit etwa 125 bis 150 μg des Peptidkonjugats. Die Mäuse erhielten einmal alle drei Wochen intraperitoneale Auffrischungsinjektionen, bis gute Titer etabliert waren. Vier Tage vor den Milzzell-Fusionen erhielten die Mäuse eine abschließende Auffrischungsimpfung.
Für die Produktion polyklonalen Antikörper wurden Kaninchen mit hBNP 1–32 MeBSA-Konjugaten immunisiert. Es wurden Emulsionen hergestellt, indem man 100 μl des Peptidkonjugats gründlich mit 200 μl Freunds vollständigem Adjuvans (FCA) oder Freunds unvollständigem Adjuvans (FIA) mischte. Dreihundert μl der FCA-Emulsion wurden in die inguinalen Lymphknoten injiziert, wobei man dem Verfahren von Mojsov et μl. (J. Biol. Chem., 261: 11880–11889) folgte. In FIA emulgiertes Peptid wurde für zusätzliche Auffrischungsimpfungen in den Wochen 2 und 3 verwendet. Man testete die Tiere und ließ sie ausbluten, wenn die Titer hinreichend waren. Die polyklonalen Antikörper von zwei Tieren, identifiziert als #4024 und #4360, wurden in mehreren der unten beschriebenen Assays verwendet.
3. Milzzell-Fusionen
Milzzellen wurden gemäß einem gegenüber Galfre et al., Nature, 266: 550, 1977 modifizierten Verfahren mit dem Myeloma-Partner FOX-NY (ATCC CRL-1732) fusioniert. Die Milzen wurden in steriler Weise entnommen, und es wurden Einzelzell-Suspensionen in serumfreiem Medium durch Homogenisieren in einem 7 ml Glas-Homogenisator hergestellt. Die Milzzellen wurden zweimal gewaschen, bevor sie mit den Myeloma-Partnerzellen gemischt wurden. Die FOX-NY-Myeloma-Zellen wurden in der logarithmischen Wachstumsphase geerntet, gewaschen und in einem Verhältnis von Milz:Myeloma von 5:1 mit den Milzzellen kombiniert. Die Zellen wurden zentrifugiert, das Medium wurde entfernt und das Zellpellet wurde durch Klopfen gelöst. Ein ml 50% Polyethylenglykol (PEG) wurde hinzugegeben, und es wurde für etwa 2 Minuten bei 37°C sanft gerührt. Die Zellen wurden langsam mit 10 ml an serumfreiem Medium verdünnt, bei 400 × g zentrifugiert und in Hybridom-Selektionsmedium (RPMI-1640 Hybridom-Medium; 10 mM Hepes, 20% fetales Rinderserum, 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 75 μM Adenin, 0,8 μM Aminopterin und 16 μM Thymidin) resuspendiert. Die Zellen wurden auf einen T-150-Kulturkolben übertragen und über Nacht inkubiert, bevor sie in 96-Well-Platten (etwa 10⁵ Zellen pro Well) ausplattiert wurden. Die Kulturen wurden bei 37°C, 7% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator gehalten. Die Zellen wurden 6 Tage nach der Fusion erneut gefüttert und das konditionierte Medium wurde an Tag 10 auf Antikörper hin getestet.
4. Durchtesten und Selektion
Die Hybridom-Überstände wurden auf ihre Reaktivität gegenüber hBNP 1–32 oder gegenüber verschiedenen hBNP-Peptiden mittels eines Standard-ELISA-Verfahrens getestet. Die Peptide, 0,1–0,5 μg/100 μl/Well in PBS wurden über Nacht bei 4°C an Mikrotiterplatten adsorbiert. Die Wells wurden mit PBS/Tween (PBS enthaltend 0,05% Tween-20) gewaschen und mit 0,1% Gelatine für 1 Stunde bei 37°C geblockt. Die unverdünnten Hybridom-Überstände (100 μl/Well) wurden für 2 Stunden bei 37°C zu den Peptid-beschichteten Wells hinzugegeben. Die Wells wurden gewaschen und mit einem Ziege-anti-Maus IgG Meerrettichperoxidase-Konjugat, verdünnt in PBS/Tween/Ovalbumin (0,1% Ovalbumin in PBS/Tween), für 2 weitere Stunden inkubiert. Auf einen weiteren Waschschritt folgte die Zugabe von Substrat (0,5 mg/ml O-Phenylendiamin, 0,012% Wasserstoffperoxid in 100 mM Zitrat/Phosphatpuffer pH 5,0). Die Farbreaktion wurde mit 5 M Schwefelsäure abgestoppt und die Extinktion bei 490 nm abgelesen. Ein O. D.-Wert, der größer als das Zweifache des Hintergrundes war, wurde als positive Reaktion gewertet.
Positiv getestete Hybridome wurden durch begrenzende Verdünnung erneut kloniert und ihre Überstände erneut auf spezifische Reaktivität hin getestet. Hybridome und sekretorische Stabilität wurden ermittelt, indem man das Wachstum und die Merkmale der Antikörperproduktion über mehrere Passagen testete. Dieser Prozess resultierte in der Etablierung der Hybridomzelllinie 106.3 und von MAb 106.3, der in spezifischer Weise das hBNP-Peptidfragment 5–13 erkennt, der Hybridomzelllinie 201.3 und von MAb 201.3, der in spezifischer Weise das hBNP-Peptidfragment 1–10 erkennt, sowie der Hybridomzelllinie 8.1 und von MAb 8.1, der in spezifischer Weise das hBNP-Peptidfragment 27–32 erkennt. Die Hybridomzelllinie 106.3 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md. am 14. Februar 1996 hinterlegt und besitzt die Zugangsnummer HB 12044. Die Hybridomzelllinie 201.3 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md. am 14. Februar 1996 hinterlegt und besitzt die Zugangsnummer HB 12045. Die Hybridomzelllinie 8.1 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md. am 21. Februar 1996 hinterlegt und besitzt die Zugangsnummer HB 12050.
5. Charakterisierung der Antikörper
Es wurde ein Mikrotiterplatten-ELISA verwendet, um die Klasse/Subklasse der monoklonalen Antikörper zu identifizieren. Es wurde Maus-Antikörper zu Mikrotiterplatten hinzugegeben, die vorab mit hBNP beschichtet worden waren. Die für die Subklasse spezifischen Zweitantikörper, die mit Meerrettichperoxidase konjugiert waren, wurden hinzugegeben, um den gebundenen monoklonalen Mausantikörper zu detektieren. Mehrere Waschschritte, gefolgt von der Zugabe von TMB-Substrat, ergaben spezifische Subklassen-Reaktivitäten für die drei monoklonalen Antikörper. Es wurde festgestellt, dass MAb 106.3 ein IgG_1κ-Antikörper ist, MAb 201.3 wurde als zu der Subklasse IgG_2aκ zugehörig ermittelt, und für MAb 8.1 wurde gezeigt, dass er zu der Subklasse IgG_1κ gehört.
Der polyklonale Kaninchen-Antikörper wurde auf seine Reaktivität gegenüber hBNP 1–32 ebenso wie gegenüber einer Vielzahl von hBNP-Fragmenten hin getestet. Mikrotiterplatten wurden mit 100 ng der verschiedenen Peptide/Well in 200 μl 0,1 M Bicarbonatpuffer, pH 8–9, beschichtet. Die Platten wurden für 30 Minuten bei 37°C mit 0,1% Gelatine geblockt. Das Kaninchenserum wurde 1:1000 verdünnt, gefolgt von fünf 3-fachen Verdünnungen in einem Tris/Tween/BSA-Puffer (0,05 M Tris, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 1% BSA; 0,1% Tween-20). Es wurden 100 μl der Antikörper-Verdünnungsreihen zu den Mikrotiter-Wells hinzugegeben, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation bei 4°C. Ein Waschschritt mit Tris/Tween/BSA-Puffer wurde gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation mit Ziege-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase. Die Wells wurden 4-mal mit Puffer gewaschen, und es wurden 200 μl TMB-Substrat hinzugegeben. Nach einer 30–45 Minuten dauernden Inkubation wurde die Reaktion mit 2,5 M Schwefelsäure abgestoppt, und die O. D. wurde bei 450 nm abgelesen. Die Reaktivität gegenüber den verschiedenen Peptiden ist in 2 dargestellt. Das Kaninchen-Antiserum zeigte spezifische Reaktivitäten bei vier hBNP-Peptidfragmenten, 1–10, 5–13, 15–25 und 27–32, und ebenso eine starke Reaktivität gegenüber hBNP 1–32.
6. Antikörper-Produktion und Reinigung
Die Hybridomzellen wurden in Roller-Flaschen bei einer Konzentration von 300.000 Zellen/ml in RPMI 1640 Gewebekulturmedium, supplementiert mit 5% „Fetal Clone" (Hyclone), angeimpft und bis zu einer Dichte von etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml herangezogen. Das Medium wurde durch serumfreies Hybridom-SFM-Medium ersetzt und die Inkubation für weitere 3 bis 5 Tage fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 400 × g von dem Kulturmedium abgetrennt, und das Medium wurde durch Filtration durch einen 0,2 μ-Filter gereinigt. Das Medium wurde auf eine Prosep Protein-A Affinitätssäule (Bioprocessing Inc.) geladen, die zuvor mit Bindepuffer bei pH 8,6 (1 M Glycin, 0,15 M NaCl) äquilibriert worden war. Nachdem die Auftragung des Kulturmediums abgeschlossen war, wurde die Säule mit Bindepuffer gewaschen, bis die bei 280 nm abgelesenen O. D.-Werte zu dem Niveau der Basislinie zurückgekehrt waren. Der Antikörper wurde unter Verwendung von 100 mM Zitronensäure pH 3,0 eluiert, in einem Centriprep 10-Konzentrator auf etwa 1 mg/ml konzentriert und über Nacht bei 4°C gegen PBS, pH 7,5, dialysiert. Das Kaninchen-Antiserum wurde vor der Säulenreinigung des polyklonalen IgG von Lipiden gereinigt. Jeweils 1,5 Teile Serum wurden mit 1 Teil SeroClear Reagenz (Calbiochem) gemischt, für etwa 1 Minute gevortext und zentrifugiert, um die Lipidphase und die wässrige Phase voneinander zu trennen. Das gereinigte Serum wurde dann mit einer Perfusionspumpe direkt auf die Säule geladen und in derselben Weise gereinigt wie das Fluid des Gewebekulturüberstandes.
Kaninchen-Antikörper, der monospezifisch für das hBNP-Epitop ist, das die Aminosäuren 15–25 umfasst, wurde unter Verwendung einer Diaminodipropylamin-Affinitätssäule (DADPA), an der das synthetische hBNP-Fragment 15–27 befestigt war, aus den polyklonalen IgG isoliert. Das DADPA-Gel wurde für die Kopplung präpariert, indem es mit 5 ml Wasser gewaschen wurde, gefolgt von 5 ml 0,1 MES-Puffer (2-(N-morpholino)ethansulfonsäure). 0.9% NaCl, pH 4,7 und hBNP 15–27 (2 mg) wurden in 2 ml MES-Puffer gelöst und mit dem Gel gemischt. EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid), gelöst in MES-Puffer, wurde zu dem Gel hinzugegeben, wonach unter Rühren für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Säule wurde mehrere Male mit 1 M NaCl gewaschen, um nicht gebundenes Peptid zu entfernen und mit 0,1% Ovalbumin geblockt. Vor der Auftragung des Kaninchen-IgG wurde die Säule mit 5 Säulenvolumina PBS, pH 7,5 gewaschen. Man ließ das Kaninchen-IgG in fünf Zyklen über die Säule laufen, gefolgt von 5 Waschschritten mit PBS-Puffer. Die an hBNP 15–27 gebundenen Antikörper wurden mit 0,1 M Glycin HCl, pH 2,5 eluiert, mit 2 M Tris-Puffer auf pH 7,5 gebracht und in einer Centriprep 10 konzentriert.
7. Präparation der biotinylierten MAbs 106.3, 201.3 und 8.1
Die monoklonalen Antikörper wurden gegen 0,1 M Natriumboratpuffer, pH 8,8, dialysiert und auf eine Endkonzentration von 1 bis 3 mg/ml gebracht. Amino-hexanoyl-biotin-N-hydroxysuccinimid wurde in Dimethylsulfoxid bei einer Konzentration von 10 mg/ml hergestellt und in einem Mengenverhältnis von 200 μg des Biotinesters/mg MAb zu den Antikörpern hinzugegeben. Die Konjugation wurde für 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nicht gekoppeltes Material wurde mittels Dialyse gegen Phosphat-gepufferte Saline aus dem konjugierten Antikörper entfernt.
8. Epitop-Analyse
hBNP-Epitope, die mit MAb 201.3, MAb 106.3 und MAb 8.1 reagieren, wurden unter Verwendung eines Inhibitions-ELISA bestimmt. hBNP, das während der Festphasensynthese mit einem einzelnen Biotin an der N-terminalen Aminosäure biotinyliert worden war, wurde als Indikator für die Kompetitions-Studien mit MAb 106.3 und MAb 8.1 verwendet. hBNP, das an den beiden Cysteinresten 10 und 26 biotinyliert worden war, wurde durch Kopplung mit dem Sulfhydryl-reaktiven Biotinylierungs-Reagenz Biotin-BMCC hergestellt. Dieses Reagenz war erforderlich, um die Inhibitionsstudien mit MAb 201.3 abzuschließen.
Mikrotiterplatten wurden mit Ziege-anti-Maus-IgG (F_C-spezifisch) (0,5 μg/100 μl/Well in Bicarbonatpuffer, pH 9 für 2 Stunden bei 37°C) beschichtet. Die Wells wurden 4-mal mit Waschpuffer (0,05 M Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20) gewaschen. Die gereinigten monoklonalen Antikörper 106.3, 201.3 und 8.1 wurden in Assay-Puffer (0,05 M Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween-20 und 1% BSA) verdünnt, und es wurden 180 pg/100 μl/Well für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Wells wurden mit Waschpuffer gewaschen. Diverse verschiedene hBNP-Peptidfragmente wurden in Assay-Puffer bei einem molaren Verhältnis von 100:1 Peptidfragment:Biotin-hBNP mit biotinyliertem hBNP 1–32 gemischt, den Mikrotiter-Wells hinzugegeben und für 1,5 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Wells wurden einmal mit Waschpuffer ausgewaschen, es wurde dann Streptavidin-Meerrettichperoxidase in 100 μl Assay-Puffer hinzugegeben, gefolgt von 20 Minuten Inkubation bei 4°C. Die Platten wurden 4-mal mit Waschpuffer gewaschen, und es wurden 200 μl TMB-Substrat hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Die Farbentwicklung wurde mit 2,5 M Schwefelsäure abgestoppt, und die O. D.-Werte wurden bei 450 nm abgelesen.
Die Ergebnisse der Epitop-Analyse für MAb 106.3, MAb 201.3 und MAb 8.1 sind in 3 dargestellt. Die Bindung von Biotin-hBNP 1–32 wurde signifikant durch die hBNP-Fragmente inhibiert, die mit den monoklonalen Antikörpern spezifisch reaktiv waren. Bei MAb 106.3 war das kleinste hBNP-Fragment, welches zur Erzeugung einer dem hBNP 1–32 der vollen Länge vergleichbaren Inhibition befähigt war, das Peptidfragment hBNP 5–13. Bei MAb 201.3 war das kleinste hBNP-Peptidfragment, das eine Inhibition ergab, die derjenigen von hBNP 1–32 vergleichbar war, das hBNP-Fragment hBNP 1–10. Bei MAb 8.1 war das kleinste hBNP-Peptidfragment, das eine Inhibition ergab, die derjenigen von hBNP 1–32 vergleichbar war, das Fragment hBNP 27–32. Somit stellen die hBNP-Fragmente 1–10, 5–13 und 27–32 die hBNP-Epitope dar, die spezifisch von MAb 201.3, MAb 106.3, bzw. MAb 8.1 erkannt werden. Diese Daten zeigen auch an, dass geeignete hBNP-Fragmente bei der Verwendung in einem Kompetitions-Assay mit dem geeigneten Antikörper ein alternatives Reagenz zu der hBNP-Sonde voller Länge als Indikator der Inhibition bereitstellen können.
9. Assay für hBNP unter Verwendung von MAb 106.3 in einem Monoklonal:Polyklonal-Sandwich
Mikrotiterplatten wurden mit MAb 106.3 bei 100 ng/200 μl/Well in Bicarbonatpuffer, pH 9, beschichtet, wobei die Adsorption für 2 Stunden bei 37°C erfolgte. hBNP wurde mit 12,8 ng/ml in Assay-Puffer verdünnt, und es wurden 2-fache serielle Verdünnungen hergestellt, um eine Standardkurve zu erzeugen, die bis auf 12,5 pg/ml herunterging. Der Puffer wurde von den Platten entfernt, und es wurden 100 μl-Aliquots der hBNP-Verdünnungsreihen zu den Wells hinzugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert, einmal mit Waschpuffer gewaschen und mit 200 μl einer 1:2.500-Verdünnung des Kaninchen-Antiserums, das polyklonale Antikörper gegen hBNP enthielt, inkubiert. Die Platten wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, 4-mal mit Waschpuffer gewaschen, und 200 μl/Well an Ziege-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase wurden hinzugegeben. Die Inkubation wurde bei 37°C für weitere 2 Stunden fortgesetzt. Die Platten wurden 4-mal mit Waschpuffer gewaschen, es wurden 200 μl an TMB-Substrat hinzugegeben, und die Inkubation wurde für 5 bis 30 Minuten fortgesetzt. Die Farbentwicklung wurde mit 100 μl 2,5 M Schwefelsäure abgestoppt und die O. D. bei 450 nm gemessen. Es wurde eine Standardkurve erstellt, indem man die O. D. gegen die pg/Well an hBNP auftrug. Die Standardkurve ist in 4 dargestellt.
10. Assay für hBNP unter Verwendung von MAb 201.3 in einem Monoklonal:Polyklonal-Sandwich
Die Platten wurden über Nacht bei 4°C mit 400 ng/Well an MAb 201.3 in Bicarbonatpuffer beschichtet. Die Platten wurden mit Waschpuffer gewaschen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Assay-Puffer geblockt. Das hBNP wurde mit einer Konzentration von 10 ng/ml in Assay-Puffer verdünnt, und es wurden 4-fache serielle Verdünnungen hergestellt, um eine Standardkurve zu erzeugen, die bis auf 10 pg/ml herunterging. Die Platten wurden geleert, und es wurden 100 μl-Aliquots der Verdünnungsreihen zu den Wells hinzugegeben. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden fortgesetzt. Die Platten wurden einmal mit Waschpuffer gewaschen. Das Kaninchen-Antiserum, das die polyklonalen Antikörper gegen hBNP enthielt, wurde 1:1.000 in Assay-Puffer verdünnt, es wurden 100 μl zu den Wells hinzugegeben und bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Nach drei Waschschritten mit Waschpuffer wurden 100 μl/Well an Ziege-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase hinzugegeben, und die Inkubation wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Platten wurden 3-mal mit Waschpuffer gewaschen, es wurde TMB-Substrat hinzugegeben, und man erlaubte eine 20-minütige Farbentwicklung. Diese Reaktion wurde mit 100 μl 2,5 M Schwefelsäure abgestoppt, und die O. D. wurde bei 450 nm gemessen. Die anhand dieser seriellen Verdünnungen von hBNP gewonnene Standard-Kurve ist in 5 dargestellt.
11. Sandwich-Assay unter Verwendung von MAb 106.3 und monospezifischer polyklonaler Antikörper, die hBNP 15–25 erkennen
Die Mikrotiterplatten wurden mit MAb 106.3 mit 100 ng/100 μl/Well in Bicarbonatpuffer, pH 9, über Nacht bei 4°C beschichtet. Das hBNP wurde in Assay-Puffer auf 10 ng/ml verdünnt, und es wurden 2-fache serielle Verdünnungen verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen, die bis auf 10 pg/ml herunterging. Die Platten wurden gewaschen und für 1 Stunde mit Assay-Puffer geblockt. Es wurden 100 μl-Aliquots der hBNP-Verdünnungsreihen zu den Wells hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Die Wells wurden 4-mal mit Waschpuffer gewaschen, und es wurden 100 μl einer 1:50-Verdünnung von Kaninchen-IgG, das für hBNP 15–25 monospezifisch war, hinzugegeben. Die Platten wurden für 2 Stunden inkubiert, 4-mal mit Waschpuffer gewaschen, und 200 μl/Well an Ziege-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase wurden hinzugegeben. Die Inkubation wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Die Platten wurden 4-mal mit Waschpuffer gewaschen, es wurden 200 μl an TMB-Substrat hinzugegeben, wonach man eine 10-minütige Farbentwicklung gestattete. Die Farbentwicklung wurde mit 100 μl 2,5 M Schwefelsäure abgestoppt und die O. D. bei 450 nm gemessen. Eine Standardkurve wurde erstellt, indem man die O. D. gegen die pg/Well an hBNP auftrug. Die Standardkurve ist in 6 dargestellt.
12. Sandwich-Assay unter Verwendung von MAb 201.3 und monospezifischer polyklonaler Antikörper, die hBNP 15–25 erkennen
Die Mikrotiterplatten wurden mit MAb 201.3 bei 400 ng/100 μl/Well in Bicarbonatpuffer, pH 9, über Nacht bei 4°C beschichtet. hBNP wurde in Assay-Puffer auf 10 ng/ml verdünnt, und es wurden 2-fache serielle Verdünnungen verwendet, um eine Standardkurve herzustellen, die bis auf 10 pg/ml herunterging. Die Platten wurden gewaschen und für 1 Stunde mit Assay-Puffer geblockt. 100 μl-Aliquots der hBNP-Verdünnungsreihen wurden zu den Wells hinzugegeben, gefolgt von 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur. Die Wells wurden 4-mal mit Waschpuffer gewaschen, und es wurden 100 μl einer 1:50-Verdünnung von Kaninchen-IgG, das für hBNP 15–25 monospezifisch war, hinzugegeben. Die Platten wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, 4-mal mit Waschpuffer gewaschen, und 200 μl/Well an Ziege-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase wurden hinzugegeben. Die Inkubation wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Die Platten wurden 4-mal mit Waschpuffer gewaschen, es wurde TMB-Substrat hinzugegeben und eine 10-minütige Farbentwicklung gestattet. Die Farbentwicklung wurde mit 100 μl 2,5 M Schwefelsäure abgestoppt und die O. D. bei 450 nm gemessen. Eine Standardkurve wurde hergestellt, indem man die O. D. gegen die pg/Well an hBNP auftrug. Die Standardkurve ist in 7 dargestellt.
13. Sandwich-Assay für hBNP unter Verwendung von MAb 8.1 und MAb 106.3
Die Mikrotiterplatten-Wells wurden über Nacht bei 4°C mit 100 ng/Well an MAb 8.1 in 200 μl Bicarbonatpuffer beschichtet. Die Wells wurden mit Waschpuffer gewaschen und für 1 Stunde bei 4°C geblockt. Das hBNP wurde in Assay-Puffer auf 10 ng/ml verdünnt, und es wurden 2-fache Standardverdünnungen hergestellt, um eine Standardkurve zu erzeugen, die bis auf etwa 10 pg/ml herunterging. Der Puffer wurde aus den Wells entfernt, und es wurden 100 μl-Aliquots der hBNP-Standard-Verdünnungsreihen und 100 μl Assay-Puffer mit 10 ng biotinyliertem MAb 106.3 hinzugegeben. Die Platten wurden für 1,5 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden 3-mal mit Waschpuffer gewaschen, und es wurden 200 μl einer 1:3.000-Verdünnung von Streptavidin-Meerrettichperoxidase zu jedem Well hinzugegeben. Die Inkubation wurde für eine weitere Stunde bei 4°C fortgesetzt. Die Wells wurden 4-mal mit Waschpuffer gewaschen, es wurden 200 μl TMB-Substrat hinzugegeben und die Inkubation für 5 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Farbentwicklung wurde mit 100 μl 2,5 M Schwefelsäure abgestoppt, und die O. D. wurde bei 450 nm gemessen. Eine Standardkurve wurde erstellt, indem man die O. D. gegen die pg/Well an hBNP auftrug. Die Standardkurve ist in 8 dargestellt.
14. Sandwich-Assay für hBNP unter Verwendung von MAb 201.3 und MAb 8.1
Die Mikrotiterplatten-Wells wurden über Nacht bei 4°C mit 400 ng/Well an MAb 201.3 in 200 μl Bicarbonatpuffer beschichtet. Die Wells wurden 3-mal mit Waschpuffer gewaschen und für 1 Stunde geblockt. hBNP wurde in Assay-Puffer auf 100 ng/ml und 10 ng/ml verdünnt, und serielle 4-fach-Verdünnungen wurden hergestellt, um eine Standardkurve zu erzeugen, die bis auf etwa 10 pg/ml herunterging. Der Puffer wurde aus den Wells entfernt, und es wurden 100 μl-Aliquots der hBNP-Standard-Verdünnungsreihen hinzugegeben. Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden. Die Platten wurden 3-mal mit Waschpuffer gewaschen, und 100 μl Assay-Puffer mit 10 ng biotinyliertem MAb 8.1 wurden zu jedem Well hinzugegeben. Die Inkubation wurde für weitere 1,5 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Wells wurden 3-mal mit Waschpuffer gewaschen, und es wurden 100 μl einer 1:3.000-Verdünnung an Streptavidin-Meerrettichperoxidase zu jedem Well hinzugegeben. Die Inkubation wurde für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Wells wurden 3-mal mit Waschpuffer gewaschen. TMB-Substrat (200 μl) wurde hinzugegeben, wonach für 5 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Farbentwicklung wurde mit 100 μl 2,5 M Schwefelsäure abgestoppt und die O. D. bei 450 nm gemessen. Es wurde eine Standardkurve erstellt, indem man die O. D. gegen die pg/Well an hBNP auftrug. Die Standardkurve ist in 9 dargestellt.
15. Kompetitions-Assay unter Verwendung von MAb 106.3
Die bei diesem Assay verwendeten Reagenzien beinhalteten MAb 106.3, biotinyliertes hBNP 1–32 als kompetitives Reagenz und ein Plasma-Verdünnungsmittel, das in der Lage war, die Interferenz der Patientenprobe zu kontrollieren. Das Plasma-Verdünnungsmittel kann aus vereintem humanem Plasma oder vereintem humanem Serum hergestellt werden. Die Präparation von Plasma beinhaltet die Induzierung der Gerinnung durch die Zugabe von 2 mg/ml an Calciumchlorid, eine Inkubation bei Raumtemperatur, um die Gerinnung zu unterstützen und endogenes hBNP abzubauen, eine Dialyse unter Verwendung von Dialyseschläuchen mit einer Ausschlussgrenze von 15.000 MW gegen 0,001 M Phosphatpuffer mit 0,15 M NaCl, die Entfernung von geronnenem Material, die Zugabe von EDTA bei einer Konzentration von 1,5 mg/ml und die Filtration durch einen 0,2 μ-Filter. Aufgrund der Empfindlichkeit von hBNP gegenüber proteolytischem Abbau ist es wichtig, einen Proteaseinhibitor, wie etwa 4-(2-Aminoethyl)-benzolsulfonyl-fluorid, HCl (1 mM zu dem Plasma-Verdünnungsmittel und Assay-Puffer) hinzu zu geben. Die Mikrotiterplatten wurden vorbereitet, indem man 200 μl/Well an Ziege-anti-Maus-Antikörper (F_C-spezifisch, etwa 0,5 μg/Well) in Bicarbonatpuffer, pH 9, hinzu gab und für 2 Stunden bei 37°C inkubierte. Die Platten wurden 4-mal mit Waschpuffer gewaschen. MAb 106.3 wurde in Assay-Puffer verdünnt, und es wurden 100 μl (90 pg/Well) zu den Mikrotiter-Wells hinzugegeben. Die Inkubation wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Platten wurden geleert, und es wurden 200 μl/Well an Assay-Puffer hinzugegeben. hBNP 1–32 wurde direkt in dem Plasma-Verdünnungsmittel verdünnt, wobei 2-fache Verdünnungen verwendet wurden, um eine Standardkurve zu erzeugen, die von 320 pg/ml bis 5 pg/ml reichte. Es wurden 100 μl-Proben zu den Wells, die 200 μl Assay-Puffer enthielten, hinzugegeben, die Platten wurden bedeckt und über Nacht bei 2–8°C auf einem Orbitalschüttler inkubiert. Die Plasmaproben der Patienten wurden im allgemeinen wenigsten 1:2 in Plasma-Verdünnungsmittel verdünnt, bevor sie zu den Wells hinzugegeben wurden. Bei Patienten mit hohen Spiegeln an hBNP wurden alle weiteren Probenverdünnungen in Plasma-Verdünnungsmittel vorgenommen. Nach der Übernacht-Inkubation wurden die Wells geleert und einmal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen. Biotin-hBNP wurde in Assay-Puffer verdünnt, und es wurden 200 μl/Well (125 pg/Well) hinzugegeben. Die Inkubation erfolgte für 1 Stunde bei 1–8°C auf einem Orbitalschüttler. Der jeweilige Inhalt wurde aus den Wells entfernt, 200 μl Streptavidin-Meerrettichperoxidase wurden hinzugegeben, und die Inkubation wurde für 30 Minuten bei 2–8°C fortgesetzt. Die Platten wurden 4–5mal mit 200 μl/Well an Waschpuffer gewaschen, wonach 200 μl TMB zugegeben wurden. Man setzte die Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten bis 1 Stunde fort. Die Farbentwicklung wurde abgestoppt, indem man 100 μl 2,5 M Schwefelsäure zu den Wells hinzu gab, und die O. D.-Messungen erfolgten bei 450 nm. Die O. D.-Werte wurden in B/B₀-Werte umgewandelt, und eine Standardkurve wurde erstellt, indem man B/B₀ gegen die pg/ml an hBNP auftrug. Die Standardkurve ist in 10 dargestellt. Die Standardkurve bietet einen Arbeitsbereich von 510 bis 200 pg/ml. Die hBNP-Spiegel in den Patientenproben wurden durch Extrapolation aus der Standardkurve bestimmt. Die Plasma-hBNP-Spiegel, die bei 15 Kontroll-Subjekten und bei 15 Patienten mit kongestiver Herzerkrankung bestimmt wurden, sind in 11 dargestellt.

Claims

Antikörper oder funktionell aktives Fragment davon, der oder das monospezifisch für ein Peptidepitop, umfassend die Aminosäuresequenz VQGSGCFGR des natriuretischen Peptids aus dem menschlichen Gehirn (hBNP), ist.
Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei es sich um einen monoklonalen Antikörper, der durch die Hybridomzelllinie 106.3, ATCC HB 12044, hergestellt ist, handelt.
Antikörper oder funktionell aktives Fragment davon, der oder das monospezifisch für ein Peptidepitop, umfassend die Aminosäuresequenz SPKMVQGSGC des hBNP, ist.
Antikörper gemäß Anspruch 3, wobei es sich um einen monoklonalen Antikörper, der durch die Hybridomzelllinie 201.3, ATCC HB 12045, hergestellt ist, handelt.
Antikörper oder funktionell aktives Fragment davon, der oder das monospezifisch für ein Peptidepitop, umfassend die Aminosäuresequenz MDRISSSSGLG des hBNP, ist.
Verfahren zum Quantifizieren der Menge von hBNP in einem biologischen Fluid, umfassend: (a) Kontaktieren einer Probe des biologischen Fluids mit: (i) einem Antikörper gemäß einem der vorstehenden Ansprüche; und (ii) hBNP oder einem Fragment davon, umfassend das Peptidepitop, für das der Antikörper monospezifisch ist, mit einem daran gebundenen quantifizierbaren Marker, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-hBNP-Komplexes gestatten; und (b) Bestimmen der Menge von hBNP in der Probe durch Quantifizieren des Markers in dem Antikörper-hBNP-Komplex.
Verfahren gemäß Anspruch 6 ferner umfassend den Schritt des Abtrennens des Antikörper-hBNP-Komplexes von der restlichen Probe des biologischen Fluids vor dem Quantifizieren des Markers in dem Antikörper-hBNP-Komplex.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Abtrennen des Antikörper-hBNP-Komplexes von der restlichen Probe des biologischen Fluids durch Binden des Antikörpers an einen festen Träger und Entfernen der Probe des biologischen Fluids vom Kontakt mit dem festen Träger nach der Bildung des Antikörper-hBNP-Komplexes bewirkt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6, 7 oder 8, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Verfahren zum Quantifizieren von hBNP in einem biologischen Fluid, wobei das Verfahren das Bilden eines markierten Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes umfasst, wobei der Komplex aus Folgendem besteht: (a) Erstantikörper, der aus Folgenden ausgewählt ist: (i) Antikörper oder funktionell aktives Fragment des Antikörpers, der oder das gegenüber einem hBNP-Fragment mit der Aminosäuresequenz VQGSGCFGR monospezifisch reaktiv ist; (ii) Antikörper oder funktionell aktives Fragment des Antikörpers, der oder das gegenüber einem hBNP-Fragment mit der Aminosäuresequenz SPKMVQGSG monospezifisch reaktiv ist; (iii) Antikörper oder funktionell aktives Fragment des Antikörpers, der oder das gegenüber einem hBNP-Fragment mit der Aminosäuresequenz MDRISSSSGLG monospezifisch reaktiv ist; (b) jegliches hBNP, das in dem biologischen Fluid enthalten ist; (c) Zweitantikörper oder funktionell aktives Fragment des Antikörpers, der oder das mit hBNP immunreaktiv ist, und wobei wenigstens einer des Erst- und Zweitantikörpers wenigstens einen Marker umfasst; und Bestimmen der Menge von hBNP in der Probe durch Quantifizieren des Markers in dem Komplex.
Verfahren gemäß Anspruch 10 ferner umfassend den Schritt des Abtrennens des Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes von der restlichen Probe des biologischen Fluids vor dem Quantifizieren des Markers in dem Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplex.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Abtrennen des Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes von der restlichen Probe des biologischen Fluids durch Binden des Erst- oder Zweitantikörpers an einen festen Träger und Entfernen der restlichen Probe des biologischen Fluids vom Kontakt mit dem festen Träger nach der Bildung des Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes bewirkt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 10, 11 oder 12, wobei es sich bei dem Marker um einen radioaktiven Marker, einen Enzymmarker, einen Fluoreszenzmarker, einen thermometrischen Marker oder einen Immunpolymerasekettenreaktions-Marker handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei es sich bei dem Marker um einen Enzymmarker, der Meerrettichperoxidase ist, handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei der quantifizierbare Marker an den Erst- oder Zweitantikörper nach der Bildung des Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes gebunden wird.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Erst- oder Zweitantikörper nach der Bildung des Erstantikörper-hBNP-Zweitantikörper-Komplexes durch Kontaktieren des Komplexes mit einem markierten Antikörper, der an den Erst- oder Zweitantikörper ohne Verdrängen des Erst- oder Zweitantikörpers aus dem Komplex bindet, markiert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei es sich bei dem biologischen Fluid um Plasma handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 17, wobei es sich bei dem Erstantikörper um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei es sich bei dem Erstantikörper um einen monoklonalen Antikörper, der ein Peptidepitop, umfassend die Aminosäuresequenz VQGSGCFGR des hBNP, erkennt, handelt.
Peptidfragment von hBNP, verwendbar als Reagenz in einem Immunassay zum Quantifizieren von hBNP, mit der Formel X¹-V-Q-G-S-G-C-F-G-R-X² wobei X¹ aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, M-, K-M-, P-K-M- oder S-P-K-M- ausgewählt ist, und X² aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, -K, -K-M, -K-M-D und -K-M-D-R ausgewählt ist, oder ein retro-inverses Isomer, ein teilweise retro-inverses Isomer oder ein D-Aminosäure-Isomer davon.
Peptidfragment von hBNP, verwendbar als Reagenz in einem Immunassay zum Quantifizieren von hBNP, mit der Formel S-P-K-M-V-Q-G-S-G-C-X³, wobei X³ aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, -F und -F-G ausgewählt ist, oder ein retro-inverses Isomer, ein teilweise retro-inverses Isomer oder ein D-Aminosäure-Isomer davon.
Peptidfragment von hBNP, verwendbar als Reagenz in einem Immunassay zum Quantifizieren von hBNP, mit der Formel X⁴-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-X⁵ wobei X⁴ aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, K-, R-K- und G-R-K- ausgewählt ist, und X⁵ aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, -C, -C-K, -C-K-V, -C-K-V-L, -C-K-V-L-R, -C-K-V-L-R-R und -C-K-V-L-R-R-H ausgewählt ist, oder ein retro-inverses Isomer, ein teilweise retro-inverses Isomer oder ein D-Aminosäure-Isomer davon.
Peptidfragment gemäß Anspruch 20, 21 oder 22 mit einem daran gebundenen quantifizierbaren Marker.