DE69733721T2

DE69733721T2 - Verbesserungen von screeningsverfahren für papillomviren

Info

Publication number: DE69733721T2
Application number: DE69733721T
Authority: DE
Inventors: John Doorbar
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1996-12-03
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2017-12-04
Also published as: GB9718745D0; DK1021722T3; JP2001509886A; EP1021722B1; EP1021722A1; CA2270995C; CA2270995A1; AU744391B2; AU5231198A; ATE299594T1; WO1998025145A1; JP4206133B2; ES2242236T3; US7135281B2; DE69733721D1; US6346377B1; US20030175682A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Durchtesten von Vorläuferläsionen, die zu Gebärmutterhalskrebs (Zervixkrebs) führen können, Verfahren zum Detektieren und Typisieren von HPV-Infektionen und Reagenzien zur Verwendung in den obigen Verfahren.
Hintergrund der Erfindung
Papillomaviren (PVs) verursachen Epitheltumore beim Menschen, die sich in Abhängigkeit von der Infektionsstelle und dem beteiligten HPV (humanem Papillomavirus)-Typ in ihrer Schwere unterscheiden (Laimins, 1993; Villiers de, 1994). Typen mit geringem Risiko, wie etwa HPV 1 oder HPV 63 (Egawa et al., 1993a; Egawa et al., 1993b) verursachen gutartige Hautwarzen, die nur selten bis zum malignen Zustand fortschreiten, während hochriskante Viren, wie etwa HPV 16 und HPV 31 Flachwarzen an Schleimhautstellen verursachen und mit hochgradiger intraepithelialer Zervix-Neoplasie (CIN) und Krebs assoziiert sind (Schneider, 1994). Man nimmt an, dass die Ausbildung eines HPV-induzierten Tumors die Infektion einer epithelialen Basalzelle benötigt, sowie die Expression früher viraler Proteine, um die Zellproliferation zu stimulieren. Die späten Stadien des viralen Lebenszyklus, die schließlich zur Produktion infektiöser Virionen führen, werden nur eingeleitet, wenn die infizierte Zelle durch die oberen, differenzierten Schichten der Epidermis wandert. Virale und zelluläre Ereignisse, die die späte HPV-Genexpression beeinflussen, sind bis vor kurzem nicht charakterisiert worden, da es kein passendes System gab, um die produktive Infektion in vitro nachzuahmen (Laimins, 1993).
Studien an natürlich vorkommenden Warzen haben gezeigt, dass das Virus drei späte Proteine codiert – L1 und L2, die Virion-Hüllproteine sind (Doorbar et al., 1987), und E1^E4, ein spätes Nicht-Strukturprotein unbekannter Funktion (Doorbar et al., 1986). Bei HPV1-induzierten Warzen wird das E1^E4-Protein zuerst in Zellen der unteren Stachelzellschicht exprimiert und baut sich zu charakteristischen zytoplasmatischen und nukleären Einschlüssen zusammen. Während der terminalen Differenzierung wird es post-transkriptional durch Phosphorylierung (Grand et al., 1989) und durch die Entfernung von Sequenzen vom N-Terminus (Doorbar et al., 1988; Roberts et al., 1994) modifiziert. Die E1^E4-Proteine hochriskanter Viren sind wenig charakterisiert worden, da angenommen wurde, dass HPV16-induzierte Läsionen nur eine geringe Anzahl produktiv infizierter Zellen enthalten, und dass diese nur geringe Mengen an E4 enthalten (Doorbar et al., 1996b; Crum et al., 1990). Ein einzelner MAb (TVG 402) gegen HPV16 E1^E4 ist verwendet worden, um das Protein dem Zytoplasma zuzuordnen, wobei jedoch berichtet wurde, dass dieser auf in Paraffin eingebettetem Archiv-Material keine gute Wirkung zeigte (Doorbar et al., 1992). Weiterhin haben polyklonale Antikörper-Studien an den E4-Proteinen von Schleimhautviren sich widersprechende Ergebnisse erbracht. Eine Studie hat die obigen Ergebnisse unterstützt (Crum et al., 1990), während eine andere angezeigt hat, dass sich dieses Protein im Zellkern befindet (Palefsky et al., 1991).
In vielen Ländern gibt es Testprogramme, um das Vorliegen von Gebärmutterhalskrebs in einem frühen Stadium zu detektieren. Allgemein laufen solche Programme über die Gewinnung von Zervix-Abstrichen bei Frauen mit potentiellem Risiko zur Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs, wobei die resultierenden Abstriche routinemäßig mittels konventioneller histopathologischer Techniken untersucht werden. Diese Techniken sind arbeitsintensiv und zeitaufwändig, erfordern beträchtliche Erfahrung, um die Ergebnisse korrekt zu interpretieren, und führen häufig zu relativ großen Prozentsätzen falsch-positiver Ergebnisse, was zu unnötigem Alarm führt. Falsch-negative Ergebnisse können auftreten, wenn der Test durch unerfahrenes Personal durchgeführt wird, was dazu führen kann, dass präkanzeröse Läsionen als normal klassifiziert werden. Es besteht daher eine Notwendigkeit für ein verbessertes Screening-Verfahren für Gebärmutterhalskrebs.
Es ist wohlbekannt, dass es eine sehr starke Korrelation zwischen HPV-Infektion und der Entwicklung des Zervixkarzinoms gibt: über 90% der Frauen mit Zervixkarzinom zeigen Anzeichen von HPV-Infektionen des Gebärmutterhalses. Entsprechend besteht eine mögliche Alternative zu der konventionellen histopathologischen Überprüfung von Zervix-Abstrichen darin, Proben auf Anzeichen von HPV-Infektion zu überprüfen. Es hat z.B. zahlreiche Vorschläge gegeben, auf Zervixkarzinom zu testen, indem man DNA-Hybridisierungstests an Proben durchführt, wobei Nukleinsäuresonden verwendet werden, die spezifisch für HPV-Sequenzen sind. Solche Hybridisierungstests werden aufgrund der problemlosen Verfügbarkeit der geeigneten Reagenzien und aufgrund ihrer hohen Spezifität im allgemeinen von Fachleuten favorisiert.
Im Gegensatz dazu ist das Durchtesten auf Zervixkarzinom mittels der Detektion der Expression von HPV-Polypeptiden im allgemeinen außer acht gelassen worden, da es wegen einer Anzahl von Gründen als ungeeignet angesehen wurde, hauptsächlich aufgrund der Schwierigkeit, geeignete Reagenzien zu erhalten, und, was noch entscheidender ist, weil viele HPVs sehr wenig Virusprotein bei Schleimhautinfektionen produzieren, was die Detektion schwierig, unsicher und unzuverlässig macht. Daher wird in Fields „Virolog" (oben zitiert) festgestellt, dass die „immunologische Detektion viraler Capsid-Antigene" von „begrenztem Wert" sei. Die Möglichkeit einer immunologischen Detektion anderer viraler Antigene wird nicht einmal in Betracht gezogen. Wenn jemand das Ziel hätte, ein Screening-Verfahren zu entwickeln, das auf der Detektion der Expression viraler Proteine basiert, würde das Ziel am wahrscheinlichsten unter denjenigen Proteinen ausgewählt, die am besten charakterisiert sind, wie etwa L1 oder L2. Die Funktion des E4-Proteins ist zurzeit unbekannt. Sein Expressionsmuster bei Läsionen des Gebärmutterhalses ist im Stand der Technik nicht schlüssig bestimmt worden, sodass das Molekül keine offensichtliche Wahl bei der Auswahl eines Ziels zur Detektion der HPV-Infektion war.
Die EP 0451550 A2 offenbart seroaktive Epitope von humanen Papillomavirus (HPV) 16-Proteinen. Die WO 91/18294 offenbart synthetische Peptide von humanen Papillomaviren, die nützlich für Immunoassays sind. Doorbar et al. (1986 EMBO, Band 5, S. 355–362) offenbart die Identifizierung von humanen Papillomavirus-1a E4-Genprodukten. Doorbar et al. (1992 Virology, Band 187, S. 353–359) offenbart Epitop-kartierte monoklonale Antikörper gegen das HPV16 E1^E4-Protein.
Zusammenfassung der Erfindung
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist nun gezeigt worden, dass eine HPV-Infektion in einer von einem Patienten entnommenen Probe detektiert werden kann, indem man Moleküle verwendet, die spezifisch an das Protein E4 von HPVs binden. Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, um Proben auf präkanzeröse Gebärmutterhals-Läsionen hin durchzutesten, wobei Moleküle verwendet werden, die spezifisch an das HPV E4-Protein binden.
Die vorliegenden Studien haben klar gezeigt, dass HPV16 E4-Protein zytoplasmatisch ist und in Zellen produziert wird, die die vegetative virale DNA-Replikation unterstützen.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Detektion einer Papillomavirus-Infektion in einem Organismus bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Gewinnen einer Probe von Zellen des Organismus von der Stelle der potentiellen Papillomavirus-Infektion; Inkontaktbringen der Zellen mit einem Molekül, das spezifisch an Papillomavirus E4-Protein bindet; und Überwachen der Bindung.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zum Testen auf präkanzeröse Gebärmutterhals-Läsionen bereit, umfassend die folgenden Schritte: Gewinnen einer Probe von Gebärmutterhalszellen eines Subjekts; Inkontaktbringen der Zellen mit einem Molekül, das spezifisch an Papillomavirus-E4-Protein bindet; und Überwachen der Bindung.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zum Durchtesten präkanzeröser Gebärmutterhals-Läsionen bereit, umfassend die folgenden Schritte: Gewinnen einer Probe von Gebärmutterhalszellen eines Subjekts; Inkontaktbringen der Zellen mit einem Molekül, das spezifisch an das HPV E4-Protein bindet; und Überwachen der Bindung.
Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Typs/der Typen der HPV-Infektion in einem Patienten bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Gewinnen einer Probe aus Patientenzellen von der Stelle der HPV-Infektion; Inkontaktbringen der Zellen mit einem Molekül, das spezifisch an eine Untergruppe von HPV E4-Proteinen bindet; und Überwachen der Bindung.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Antikörper-Molekül oder eine Antigen-bindende Variante hiervon bereit, die spezifisch an HPV E4-Protein in der Region der Aminosäurereste RPIPKPSPWAPKKHRRLSSDQDSQTP von HPV16 E4-Protein oder an eine entsprechende hydrophile Säure/Base-reiche Region anderer HPV E4-Proteine bindet.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus die Verwendung von Molekülen, die befähigt sind, an E4 zu binden, um antivirale Mittel, die in der Lage sind, Papillomaviren und/oder Zellen, die mit Papillomaviren infiziert sind, zu zerstören, auf ihr Ziel zu lenken. Solche Moleküle können Antikörper oder Peptide gemäß obiger Beschreibung und hier vorliegender beispielhafter Darstellung sein, die optional mit Antikrebs- oder Antivirusmitteln konjugiert sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A zeigt die Aminosäuresequenz von HPV16 E4-Protein und die Bindungsstellen verschiedener Antikörpermoleküle oder E4-spezifischer, Antigen-bindender Fragmente von Antikörpern;
1B zeigt die Sequenz des E4-Proteins aus HPV16 (obere Reihe), HPV1 (untere Reihe) und einer Konsensussequenz (mittlere Reihe), sowie die Bindungsstellen verschiedener Antikörper oder Antigen-bindender Varianten von Antikörpern;
2A–2D zeigen vier Sensogramme (willkürliche Antworteinheiten gegen die Zeit in Sekunden), erhalten unter Verwendung eines Oberflächenplasmonresonanz-Gerätes;
3–8 sind Mikrografen, die unterschiedlich angefärbte Proben zeigen, wie dies im Text erklärt wird; und
9 ist eine Aminosäuresequenz-Gegenüberstellung (Alignment) eines Teils der HPV E4-Proteine.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt die Detektion, Identifizierung und Diagnose von Papillomaviren und Papillomavirus-Infektionen bei Organismen, die für solche Infektionen empfänglich sind.
Solche Organismen sind bevorzugt Säuger, und, am meisten bevorzugt, Menschen. Wenn der Organismus ein humaner Organismus ist, so kann das Papillomavirus einen Typ oder Typen humaner Papillomaviren (HPV) darstellen.
Die Probe aus den Patientenzellen kann Hautzellen umfassen (z.B. im Fall von Warzen, Verruca und dergleichen, hervorgerufen durch Hautinfektion mit HPV). Hautverletzungen, wie etwa solche, die durch die HPV-Typen 5, 8, 14, 17, 20 ausgelöst werden, sind klinisch schwer zu beherrschen und stehen oft mit malignen Erkrankungen bei immungeschwächten Patienten in Zusammenhang (Benton et al., 1992 Papillomavirus Reports 3, 23–26). Alternativ kann die Probe Schleimhautzellen, insbesondere Gebärmutterhalszellen umfassen, im Fall von HPV-Infektionen somit Zellen des Urogenitaltrakts. Verfahren für die Gewinnung und Vorbereitung solcher Proben zur Verwendung bei dem Verfahren der Erfindung sind Fachleuten bekannt oder werden aus der vorliegenden Offenbarung ersichtlich.
Der Begriff „präkanzeröse Zervix-Läsionen" soll sich auf diejenigen Anomalien beziehen, die klinisch als prämaligne Zustände beschrieben werden können, und die ohne Behandlung zu vollständigen malignen Erkrankungen fortschreiten können. Wie oben dargelegt, werden solche Läsionen routinemäßig z.B. bei Zervixabstrich-Tests durchgetestet. Die vorliegende Erfindung erlaubt es, Zellen, die aus Patienten durch Verfahren, wie etwa Gebärmutterhalsabstriche, gewonnen werden, genauer und schneller auf HPV-Infektion zu testen.
Bevorzugt umfasst das Molekül, das spezifisch an E4-Protein bindet, ein Antikörpermolekül oder eine Antigen-bindende Variante hiervon, wie etwa ein Fab, Fv, scFv, einen „Diabody", und dergleichen. Das Molekül kann monoklonale oder polyklonale Antikörper umfassen, oder Antigen-bindende Anteile von Antikörpern, die mittels Screening aus Bibliotheken (z.B. unter Verwendung der Phage Display-Technik) herausgesucht werden. Alternativ kann das Molekül irgendein anderes Polypeptid, Peptid, eine synthetische Verbindung oder ein RNA- oder DNA-Aptamer sein, das durch ein Verfahren, wie etwa SELEX, erzeugt wird. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Molekül eine Markierungsgruppierung, wie etwa ein Fluorophor, Chromophor, Enzym oder eine Radio-Markierung, um so die Überwachung der Bindung des Moleküls an das E4-Protein zu erleichtern. Solche Markierungen sind Fachleuten wohlbekannt und beinhalten z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), β-Galactosidase, Meerrettich-Peroxidase, Streptavidin, Biotin, ³⁵S oder ¹²⁵I. Weitere Beispiele werden Fachleuten bekannt sein. Die Markierung kann unter gewissen Umständen mit dem Antikörper oder der Antigen-bindenden Variante konjugiert sein, oder kann (wenn die Markierung ein Peptid oder Polypeptid ist) als Fusionsprotein vorliegen.
Vorzugsweise binden die Moleküle, die für das Verfahren der Erfindung verwendet werden, selektiv an das E4-Protein eines bestimmten HPV-Typs oder bestimmter HPV-Typen, nicht jedoch an das E4-Protein anderer HPV-Typen. Dementsprechend kann die Erfindung bei einer Ausführungsform dafür verwendet werden, den Typ oder die Typen von HPV zu bestimmen, die einen Patienten infizieren. Dies ist von hoher Signifikanz, da das Fortschreiten zu einer malignen Erkrankung (und somit die klinische Prognose) stark von dem HPV-Typ abhängt. Dementsprechend stellt die Erfindung in einem zweiten Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung des Typs/der Typen von HPV-Infektion(en) bei einem Patienten bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Gewinnen einer Probe aus den Patientenzellen von der Stelle der HPV-Infektion; Inkontaktbringen der Zellen mit einem Molekül, das spezifisch an ein Motiv der HPV E4-Proteine bindet, und Überwachen der Bindung.
Bei dem Verfahren des zweiten Aspekts der Erfindung kann die Untergruppe der E4-Proteine, an die das Molekül bindet, aus dem E4-Protein eines einzelnen HPV-Typs bestehen, oder sie kann aus einer Vielzahl von E4-Proteinen verschiedener Typen bestehen, ohne dabei jedoch die E4-Proteine aller bekannten HPV-Typen zu umfassen, sodass die Bindung oder Nicht-Bindung (wie es geeignet ist) des Moleküls an das E4-Protein, das in der Zellprobe vorliegt, es dem Untersuchenden ermöglichen wird, sichere Schlussfolgerungen über die Identität des HPV-Typs bzw. der HPV-Typen zu ziehen, die den Patienten infizieren.
In der Praxis kann es vorteilhaft sein, eine Vielzahl verschiedener Moleküle zu verwenden, die an verschiedene Untergruppen der E4-Proteine binden. Dies kann nötig sein, um zweifelsfrei den Typ, bzw. die Typen von HPV zu identifizieren, die den Patienten infizieren, obwohl dies möglicherweise als prognostischer Indikator nicht essentiell ist. Beispielsweise kann die Fähigkeit, den/die infizierenden HPV-Typ(en) auf eine bestimmte Untergruppe zu begrenzen (oder eine solche Gruppe auszuschließen) hinreichend sein. Es ist beispielsweise bekannt, dass die Schleimhaut-HPV-Typen 6, 11, 42, 43 und 44 mit äußeren Genitalpapillomen (Condylomata accuminata) assoziiert sind, die ein niedriges Risiko der Progression zum Krebs besitzen, die jedoch schwer zu entfernen sind, und sich störend auf das Leben der Patienten auswirken. Die risikoreicheren Mukosatypen (31, 33, 35, 51, 52, 58, 61 und 16, 18, 45, 56) verursachen asymptomatische Flachwarzen (flache Concyloma), die zu hochgradiger intraepithelialer Zervix-Neoplasie (CIN) und Krebs fortschreiten können. Das höchste Risiko der Progression zur Malignität ist mit Läsionen assoziiert, die durch die HPV-Typen 16, 18, 45 und 56 verursacht werden.
Die Moleküle, die an die gewünschten HPV-Typen, jedoch nicht an die unerwünschten HPV-Typen binden, können z.B. durch Zufallssynthese und Selektionstechniken erzeugt werden. Diese beinhalten Phage-Display und andere Techniken, die für die Darbietung von Antikörpern oder anderen Polypeptiden geeignet sind, sowie Verfahren für die Erzeugung Nukleinsäure-bindender Moleküle, z.B. RNA-Aptamere, wie etwa SELEX. Diese Prozeduren sind Durchschnittsfachleuten wohlbekannt und sind unten zum Zwecke der beispielhaften Darstellung beschrieben. Die Erfindung stellt dementsprechend HPV-bindende Moleküle bereit, die zielgerichtet zu dem HPV E4-Protein gelenkt werden, und die für die hier beschriebenen Verfahren nützlich sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden E4-bindende Moleküle vorzugsweise zu extrazellulären Abschnitten des E4-Polypeptids geleitet. Solche Abschnitte neigen dazu, in ihrem Charakter hydrophil zu sein. Vorzugsweise binden die E4-bindenden Moleküle gemäß der Erfindung daher spezifisch an die hydrophilen Bereiche des HPV E4-Proteins.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine bestimmte Region des E4-Proteins bereit, an die Moleküle (insbesondere Antikörpermoleküle oder Varianten hiervon) mit beträchtlicher Spezifität binden können. Obwohl bei allen HPV E4-Proteinen homologe Regionen exstieren, variiert die Region hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz zwischen HPVs verschiedener Typen. Die Region entspricht einem Peak der Hydrophilität in dem E4-Protein und ist wahrscheinlich der Oberfläche zugewandt. Die Region ist hochgradig geladen (Säure/Base-reich). Bei HPV Typ 16 ist die Aminosäuresequenz der Region (vom N-Terminus zum C-Terminus) RPIPKPSPWAPKKHRRLSSDQDSQTP. Natürlich wird die Aminosäuresequenz der E4-Proteine anderer HPV-Typen nicht notwendigerweise identisch zu der von Typ 16 sein, jedoch kann durch den Nutzen der vorliegenden Offenbarung (z.B. 9) die korrespondierende Region in anderen E4-Proteinen durch Fachleute unter Verwendung von konventionellem Alignment und von Computerprogrammen zum Sequenzvergleich problemlos identifiziert werden (etwa 65 der etwa 70 bekannten HPV-Genome sind kloniert und sequenziert worden).
Somit stellt die Erfindung in einem dritten Aspekt ein Antikörpermolekül oder eine Antigen-bindende Variante hiervon bereit, das/die spezifisch an das HPV E4-Protein in der Region der Aminosäurereste RPIPKPSPWAPKKHRRLSSDQDSQTP des HPV16 E4-Proteins oder an die entsprechende hydrophile Säure/Base-reiche Region anderer HPV E4-Proteine bindet, und zwar bevorzugt andere als den Antikörper TVG 402^–, der von Doorbar et al., (1992 Virology 187, 353–359) identifiziert wurde.
Darüber hinaus stellt die Erfindung die Verwendung eines Antikörpermoleküls oder einer Antigen-bindenden Variante hiervon bereit, das/die in der Region der Aminosäurereste RPIPKPSPWAPKKHRRLSSDQDSQTP des HPV16 E4-Proteins oder in der entsprechenden hydrophilen, Säure/Base-reichen Region anderer HPV E4-Proteine spezifisch an ein HPV E4-Protein bindet, für die Detektion von HPV-Infektionen gemäß der vorliegenden Beschreibung.
Die entsprechenden hydrophilen Säure/Base-reichen Regionen einer großen Anzahl verschiedener HPV-Typen sind in 9 dargestellt. 9 zeigt eine Konsensus-Typ-Aminosäuresequenz („am wahrscheinlichsten") in der oberen Reihe, wobei die Sequenz des HPV E4-Proteins unten angegeben ist. Die Punkte zeigen Lücken an, die eingeführt wurden, um das Alignment zu erleichtern, die Striche Aminosäurereste, die mit der Konsensussequenz übereinstimmen. Die Nummerierung auf der rechten Seite der Figur zeigt die Anzahl der Aminosäurereste ab der tatsächlichen oder vorhergesagten E1^E4-Spleißstelle an. Es wird Fachleuten aus dem Alignment ersichtlich sein, dass trotz der konservierten Hydrophilität der Region unter den verschiedenen HPV-Typen die tatsächliche Aminosäuresequenz recht stark variiert, sodass zu erwarten ist, dass Reagenzien, die an diese Region binden, hochgradig spezifisch für den HPV-Typ sind.
Bevorzugt besitzt der Antikörper der Erfindung eine Bindungsstelle innerhalb der Region RRIPKPSPWAPKKHR (oder der korrespondierenden Aminosäuresequenz anderer HPV-Typen), wie diese durch das SPOTS Epitop-Kartierungssystem identifiziert wird. Ein besonders bevorzugtes Molekül ist das Fab-Fragment TVG405, das weiter unten beschrieben ist, das mit extrem hoher Affinität an das Epitop PKPSPWAPKKH(R) bindet und von besonderem Nutzen für die oben definierten Verfahren der Erfindung ist.
Die in Klammern angezeigten Argininreste am C-Terminus des TVG405-Epitops sind für die hochaffine Bindung nicht essentiell.
Das Fab-Fragment TVG405 wurde durch den vorliegenden Erfinder unter Verwendung von Phage Display-Technik gemäß unten stehender Beschreibung isoliert. Fachleute werden verstehen, dass verschiedene Antikörper oder Fab-Fragmente problemlos erhalten werden können, indem man ähnliche Phage Display-Techniken (und das Durchtesten mit E4-Proteinen oder Teilen davon) anwendet, oder durch die Verwendung konventionellerer Immunisierungstechniken (z.B. Immunisierung von Mäusen, Kaninchen, Ratten oder dergleichen mit E4-Protein oder Peptiden, die Teilen des E4-Proteins entsprechen), um polyklonale Antiseren oder monoklonale Antikörper (unter Verwendung wohlbekannter Hybridomtechniken von Milstein et al.) zu erhalten. Die Herstellung vollständiger Antikörpermoleküle erfolgt problemlos aus den Fab-codierenden Sequenzen (z.B. isoliert durch Phage Display-Techniken) unter Verwendung von Standardtechniken der DNA-Manipulation, wie sie von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) beschrieben wurden, um geeignete DNA-Sequenzen zusammenzufügen.
Entsprechend können Standardtechniken der DNA-Manipulation verwendet werden, um DNA-Sequenzen, die für anti-E4-Antikörper oder Antigen-bindende Varianten hiervon codieren, zu modifizieren. Insbesondere kann positionsspezifische Mutagenese oder PCR verwendet werden, um die codierenden Sequenzen zu modifizieren, um modifizierte anti-E4-Antikörper mit verschiedenen Bindungsspezifitäten oder Affinitäten herzustellen. Alternativ können Fusionsproteine hergestellt werden, die die E4-Bindungsstelle eines Fab, Fv oder Antikörpers und dergleichen beinhalten.
Moleküle, die zur Bindung von E4 befähigt sind, können als Antivirus- oder Antikrebsmittel oder als Bestandteile solcher Mittel verwendet werden. Beispielsweise können Antikörpermoleküle oder das oben beschriebene E4-bindende Peptid für diesen Zweck verwendet werden. Bevorzugt jedoch können das E4-Protein und/oder Moleküle, die zur Bindung daran befähigt sind, verwendet werden, um E4-bindende Moleküle, bevorzugt kleine Moleküle, mittels rationalen Arzneimitteldesigns zu entwerfen.
Ein solcher Prozess beinhaltet bevorzugt die Kristallisation von E4 oder eines Moleküls, das befähigt ist, daran zu binden. Bevorzugter beinhaltet ein solcher Prozess die Co-Kristallisation von E4 und einem daran bindenden Mittel. Eine solche Prozedur erbringt Informationen bezüglich der Interaktion zwischen E4 und dem Bindemolekül, die verwendet werden können, um kleine Moleküle zu entwerten, die befähigt sind, die Bindeinteraktion nachzuahmen.
Die Kristallisation beinhaltet die Herstellung eines Kristallisationspuffers, z.B. durch das Mischen einer Lösung des Peptids oder Peptidkomplexes mit einem „Reservoir-Puffer", bevorzugt in einem Verhältnis von 1:1, wobei zunächst eine niedrigere Konzentration des Fällungsmittels für die Kristallbildung erforderlich ist. Für die Kristallbildung wird die Konzentration des Fällungsmittels erhöht, z.B. durch Zugabe eines Fällungsmittels, z.B. durch Titration oder dadurch, dass man die Konzentrierung des Fällungsmittels bis zum Gleichgewicht durch die Diffusion zwischen dem Kristallisationspuffer und dem Reservoir-Puffer ermöglicht. Unter geeigneten Bedingungen erfolgt eine derartige Diffusion des Fällungsmittels entlang dem Gradienten des Fällungsmittels, z.B. aus dem Reservoirpuffer, der eine höhere Konzentration an Fällungsmittel besitzt, in den Kristallisationspuffer mit einer niedrigeren Konzentration des Fällungsmittels. Die Diffusion kann z.B. durch Dampfdiffusionstechniken erreicht werden, die eine Diffusion in der gemeinsamen Gasphase erlauben. Bekannte Techniken sind z.B. Dampfdiffusionsverfahren, wie etwa das Verfahren des „hängenden Tropfens" oder des „sitzenden Tropfens". Bei dem Dampfdiffusionsverfahren hängt ein Tropfen des Kristallisationspuffers, der das Protein enthält, über bzw. sitzt neben einem viel größeren Pool des Reservoirpuffers. Alternativ kann das Ausgleichen des Fällungsmittels über eine semipermeable Membran erreicht werden, die den Kristallisationspuffer von dem Reservoirpuffer trennt und die Verdünnung des Proteins in den Reservoirpuffer verhindert.
In dem Kristallisationspuffer besitzt das Peptid oder der Peptid/Bindungspartner-Komplex bevorzugt eine Konzentration von bis zu 30 mg/ml, bevorzugt von etwa 2 mg/ml bis etwa 4 mg/ml.
Die Ausbildung von Kristallen kann unter verschiedenen Bedingungen erreicht werden, die im wesentlichen durch die folgenden Parameter bestimmt werden: pH, Anwesenheit von Salzen und Zusätzen, Fällungsmittel, Proteinkonzentration und Temperatur. Der pH kann von etwa 4,0 bis 9,0 reichen. Die Konzentration und der Typ des Puffers sind recht unerheblich und daher variabel, z.B. in Abhängigkeit von dem gewünschten pH. Geeignete Puffersysteme beinhalten Phosphat-, Acetat-, Citrat-, Tris-, MES- und HEPES-Puffer. Nützliche Salze und Zusätze beinhalten z.B. Chloride, Sulfate und weitere Salze, die in Beispiel 1 spezifiziert sind. Der Puffer enthält ein Fällungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, bevorzugt Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 20000, bevorzugt zwischen 4000 und 10000, oder einem geeigneten Salz, wie etwa Sulfaten, insbesondere Ammoniumsulfat, einem Chlorid, einem Citrat oder einem Tartrat.
Ein Kristall von E4 selbst, von einem von E4 abgeleiteten Peptid, oder von einem E4-(Peptid)/Bindungspartner-Komplex gemäß der Erfindung kann chemisch modifiziert werden, z.B. durch Schweratom-Derivatisierung. Kurz dargestellt ist eine solche Derivatisierung erreichbar durch das Tränken eines Kristalls in einer Lösung, die Schwermetallatomsalze oder organometallische Verbindungen enthält, z.B. Bleichlorid, Goldthiomalat, Thimerosal- oder Uranylacetat, welche befähigt sind, durch den Kristall zu diffundieren und an die Oberfläche des Proteins zu binden. Die Position(en) des/der gebundenen Schwermetallatoms/atome kann durch Röntgendiffraktionsanalyse des voll gesogenen Kristalls bestimmt werden, wobei diese Information z.B. verwendet werden kann, um ein dreidimensionales Modell des Peptids zu konstruieren.
Ein dreidimensionales Modell lässt sich z.B. aus einem Schweratomderivat eines Kristalls und/oder aus sämtlichen oder einem Teil der Strukturdaten, die durch die Kristallisation bereitgestellt werden, erhalten. Bevorzugt beinhaltet die Erstellung eines solchen Modells Homologie-Modellkonstruktion und/oder molekularen Austausch.
Das vorläufige Homologiemodell kann durch eine Kombination des Sequenz-Alignments mit einem beliebigen der E4-Proteine, dessen Sequenz bekannt ist, durch Sekundärstrukturvorhersage und Durchtesten von Strukturbibliotheken erstellt werden. Beispielsweise können die Sequenzen von HSV 16 und 34 E4, wie hier dargestellt, gegeneinander gehalten werden.
Es kann außerdem Computersoftware verwendet werden, um die Sekundärstruktur von E4-Peptiden oder Peptid-Komplexen vorherzusagen. Die Peptidsequenz kann in die E4-Struktur einbezogen werden. Nicht übereinstimmende Strukturen, z.B. Strukturfragmente um Insertionen/Deletionen können modelliert werden, indem man eine Strukturbibliothek auf Peptide der gewünschten Länge und mit einer geeigneten Konformation durchtestet. Zur Vorhersage der Konformation der Seitenkette kann eine Seitenketten-Rotamer-Bibliothek verwendet werden.
Das endgültige Homologiemodell wird verwendet, um die Kristallstruktur von E4 oder Peptiden hiervon durch molekularen Austausch unter Verwendung geeigneter Computersoftware zu lösen. Das Homologiemodell wird gemäß den Ergebnissen des molekularen Austauschs positioniert und einer weiteren Verfeinerung unterzogen, umfassend Berechnungen der Moleküldynamik und Modellieren des zur Kristallisation verwendeten Inhibitors in die Elektronendichte.
Ähnliche Ansätze können verwendet werden, um E4-bindende Polypeptide, einschließlich Antikörpern und Antikörperfragmenten, z.B. jenen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, zu kristallisieren und deren Struktur zu bestimmen.
Es ist überraschender Weise herausgefunden worden, dass die E4-Expression stark mit der vegetativen DNA-Replikation in HPV-infizierten Zellen korreliert, was die Detektion der E4-Expression zu einem besonders geeigneten Indikator für die HPV-Infektion macht und somit von besonderem Nutzen für das Durchtesten präkanzeröser Zervix-Läsionen ist.
Die derzeit verfügbaren Verfahren der Gebärmutterhalsuntersuchung mittels HPV-Detektion basieren auf DNA-Hybridisierung. Sie beinhalten Zelllyse oder Durchlässigmachen und werden in einem ELISA-Typ 96 Well-Format durchgeführt. Die Hybridisierung wird schließlich als Farbwechsel in einem der Wells sichtbar gemacht.
Obwohl die Antikörper der vorliegenden Erfindung in einer ähnlichen Weise verwendet werden können (z.B. nach der Zelllyse), sind sie einer schnelleren Prozedur zugänglich, die durch histopathologische Labors schneller routinemäßig durchgeführt werden kann. Proben, die Gebärmutterhalszellen enthalten, können wie gewöhnlich entnommen werden. Sie werden z.B. auf einem mikroskopischen Objektträger oder einem anderen Träger unter Verwendung in der Technik bekannter Techniken ausgebreitet, z.B. so, wie hier beispielhaft dargestellt, und z.B. mit einem anti-E4-Fab angefärbt. Die Detektion kann mittels eines sekundären Antikörper-Enzymkonjugats (Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase) durchgeführt werden, oder das Fab kann direkt z.B. mit einem Fluorophor wie etwa FITC, konjugiert werden. Dieser Ansatz kann an die Verwendung mit Systemen angepasst werden, die derzeit zur Steigerung der Empfindlichkeit der Antikörperdetektion verfügbar sind. Derzeit werden Gebärmutterhalsabstriche routinemäßig durch Mikroskopie untersucht. Der vorgeschlagene Ansatz würde keine neuen Gerätschaften erfordern und könnte problemlos bei bestehenden Verfahren eingepasst werden.
Es ist beabsichtigt, dass das Standardverfahren der Detektion modifiziert werden kann. Die Antikörperbindung kann durchgeführt werden, während sich die Zellen in Suspension befinden, wobei die Zellen vor der Analyse abzentrifugiert werden. Dies würde die Qualität des Tests verbessern.
Bei der Diagnose wird beträchtliche Anstrengung auf die Automatisierung der Testverfahren gerichtet. Die Verwendung von Antikörpern oder Antigen-bindenden Varianten hiervon für die HPV-Detektion erleichtert dies stark.
Zusammenfassend wurde folgendes gezeigt:

1. Das E4-Protein kann in produktiv infizierten HPV-induzierten Läsionen, sowie bei geringfügiger und hochgradiger Zervix-Neoplasie detektiert werden, selbst wenn die Differenzierung der infizierten Keratinozyte unzureichend ist, um die Produktion von Capsid-Proteinen und den Zusammenbau von Virionen der Infektion zu unterstützen.
2. Die E4-Expression korreliert eng mit der vegetativen viralen DNA-Replikation, was anzeigt, dass die Detektion des E4-Proteins ebenso effizient wie die Detektion der viralen DNA-Replikation für die Detektion der Virus-Infektion ist.
3. Das E4-Protein kommt in den oberen Schichten des infizierten Gewebes reichlich vor und ist somit in Zellen detektierbar, die bei Routine-Abstrichtests entnommen wurden.

Die Erfindung wird nun mittels veranschaulichender Beispiele erklärt.
Beispiel 1
Präparation monoklonaler und polyklonaler Anti-E4-Immunglobuline
Obwohl MAbs bereits zuvor gegen HPV16 E1^E4 beschrieben wurden (TVG401, 402, 403; Doorbar et al., 1992) erkennen diese Reagenzien ein einziges überlappendes Epitop an der wesentlichen antigenen Stelle von E4 und wurden derart beschrieben, dass sie das Protein in archivierten Gewebebiopsien nicht detektierten (Doorbar et al., 1992).
Obwohl diese Ergebnisse nahe legen, dass E4 kein Kandidat für die immunologische Detektion von HPV ist, werden weitere Antikörper erzeugt, die auf den N-Terminus und C-Terminus von HPV16 E4 abzielen.
Die Erzeugung weiterer MAbs durch Standard-Hybridomtechnik resultiert in der Isolierung von TVG404, einem IgM, das ein Epitop ganz am C-Terminus des Proteins erkennt.
Um dieses Reagenz zu vervollständigen, wird polyklonales Antiserum gegen den N-Terminus des Proteins gegen ein N-terminales synthetisches Peptid (E4 N-Term) erzeugt. Polyklonale Antikörper (gegen die Proteine HPV16 E4 und HPV63 E4) werden durch die Immunisierung von Kaninchen mit Maltose-bindendem Protein/E4-Fusionsprotein (MBP-E4) erzeugt. Die Antikörpertiter werden mittels ELISA überwacht, wobei hierfür gereinigtes Glutathion S-Transferase/E4-Fusionsprotein (GST-E4) verwendet wird.
Antikörper gegen den N-Terminus des Proteins werden gegen das synthetische Peptid MADPAAATKYPLC nach dessen Konjugation mit Thyroglobulin oder Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin über den C-terminalen Cysteinrest erzeugt. Die Konjugation erfolgt unter Verwendung von m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) gemäß der Beschreibung von Green et al. (1982).
Die Antikörperspezifitäten werden durch Epitop-Kartierung wie folgt bestätigt: das HPV16 E4-Protein wird als Serie von 85 überlappenden Oktameren (Überlappung einer einzigen Aminosäure) mittels Festphasen-Fmoc-Chemie synthetisiert und unter Verwendung des SPOTS Epitop-Kartierungssystem (Genosys Biotechnologies, Cambridge, UK) charakterisiert. Die Genauigkeit der Synthese wird bestätigt unter Verwendung des monoklonalen TVG402 von HPV16 E1^E4, das an die wesentliche antigene Stelle des Proteins (Doorbar et al., 1992) bindet. Die Filter wurden gemäß der Herstellerbeschreibung regeneriert, und die Antikörperbindung wurde mittels ECL (Amersham, Little Chalfont, UK) sichtbar gemacht. Das polyklonale Serum wird mit einer Verdünnung von 1/250 verwendet, die gereinigten Fabs mit etwa 1g/ml und der Hybridom-Überstand bei einer 1/10-Verdünnung.
In 1A werden die Sequenzen der 85 überlappenden, synthetischen E4-Peptide oben in der Figur gezeigt, und die Ergebnisse der Epitop-Kartierungsversuche sind darunter dargestellt. Die dunklen Flecken stellen die Bindung des Antikörpers an das darüber gezeigte synthetische Peptid dar. Es ist nur derjenige Abschnitt des Filters gezeigt, der Peptide enthält, die jeweils mit dem Antikörper reagieren.
In 1B sind die Positionen der Epitope in der E1^E4-Aminosäuresequenz oberhalb der HPV16-Sequenz zusammengefasst. Das Alignment mit einer Konsensus E4-Sequenz, die durch den Vergleich von 70 putativen E1^E4-Sequenzen (Doorbar und Myers, 1996b) erstellt wurde, ist unterhalb der Sequenz von HPV16 E1^E4 dargestellt, und die Sequenz des HPV1 E1^E4-Proteins ist darunter gezeigt. Die Bindungsstellen der existierenden HPV1 E1^E4-MAbs (Doorbar et al., 1988) sind unterhalb der HPV1-Sequenz dargestellt. Die proteolytischen Spaltstellen, die zu den 16K- und 10/11K-Genprodukten in dem E1^E4-Protein von HPV1 führen (Doorbar et al., 1988; Roberts et al., 1994) sind unterhalb der HPV1-Sequenz angezeigt, was die Vorhersage der putativen Stellen in der E1^E4-Sequenz von HPV16 erlaubt.
Beispiel 2
Herstellung synthetischer Immunglobuline
Fabs werden gemäß der unten stehenden Beschreibung aus einem synthetischen Antikörper isoliert, der auf dem fd-Bakteriophagen präsentiert wird (Griffiths et al., 1994). Immunröhrchen (Life Technologies, Paisely, UK) werden über Nacht bei 4°C entweder mit MBP-E4 oder mit GST-E4 bei einer Konzentration von 0,1 g/ml beschichtet. Nachfolgend werden diese bei 37°C für 1 Stunde in PBS/2% marvel^TM geblockt, bevor die Inkubation in Gegenwart von 10¹¹ Phagen auf einem Blutröhrchen-Rotiergerät (bei 37°C) erfolgt. Die nicht gebundenen Phagen werden abgeschüttet, und die Röhrchen werden 10x mit PBS/0,1 % Tween 20 gewaschen. Die gebundenen Phagen werden mit 100 mM Triethylamin pH 11,0 (1 ml) eluiert und umgehend mit 1M Tris (pH 8,0) neutralisiert, bevor sie erneut in E. coli TG1-Zellen eingeschleust werden. Die angereicherte Bibliothek wird herangezüchtet und das Selektionsverfahren drei weitere Male wiederholt.
Die Phagen-Selektionen erfolgen abwechselnd gegen GST 16 E1^E4 und MBP 16 E1^E4, um die Isolierung von Antikörpern gegen MBP- oder GST-Protein zu verhindern, wobei ein Repertoire von 6,5 × 10¹⁰ verwendet wird (Griffiths et al., 1994).
MBP 16 E4 wird auf einem höheren Niveau exprimiert (> 50 mg/Liter an Bakterien) als die GST-Fusion (etwa 5 mg/Liter an Bakterien), jedoch erfordert die Antikörper-Isolierung in jedem Fall nur 1 g an Antigen (Hawkins et al., 1992). Phagen, die Antikörper mit Affinität für E4 präsentieren, werden mittels ELISA (gegen GST-E4, MBP-E4, GST und MBP) identifiziert, und die Aktivität wird durch Phagen-Western Blot bestätigt. Die Immunglobulin-Gene werden aus dem isolierten Phagen in den bakteriellen Expressionsvektor pUC119.His.myc (Griffiths et al., 1994) übertragen und lösliche Fabs werden aus dem periplasmatischen Raum induzierter Bakterien mittels Nickel-NTA Chromatographie (Qiagen, Crawley UK) gereinigt. Die Antikörperfiter werden mittels ELISA bestimmt.
Nach vier Selektionsrunden werden einzelne Klone auf ihre Fähigkeit hin getestet, entweder E1^E4, unfusioniertes GST oder MBP, oder Rinderserum-Albumin (BSA) zu binden. 47 Klone (von 100) sind in der Lage, MBP 16 E1^E4 zu binden, wovon 39 auch GST 16 E4 binden können. Keiner dieser Klone interagierte mit BSA, GST oder MBP. BstNI-Fingerprinting (Marks et al., 1992; Nissim et al., 1994) zeigte drei getrennte Fabs unter diesen Klonen, und deren Immunglobulin-Gene wurden in den prokaryotischen Expressionsvektor pUC119His.6myc subkloniert, um die Produktion löslicher anti-E4-Fabs (Griffiths et al., 1994) zu erlauben. Etwa 5 mg (pro Liter Bakterien) an anti-E4-Fab (TVG 405, 406 und 407) können aus dem periplasmatischen Raum induzierter Bakterien extrahiert werden, und für alle wird ermittelt, dass sie in spezifischer Weise E1^E4 bei ELISA und Western Blot detektieren. Fab TVG 407 bindet ein Epitop, das identisch zu demjenigen ist, das durch den Hybridom-abgeleiteten Mab TVG 409 erkannt wird (1). Die verbleibenden synthetischen Fabs erkennen neue Epitope stromaufwärts (TVG 405) oder stromabwärts (TVG 407) dieser Hauptantigen-Region von E4. Die entsprechenden Ergebnisse sind in der 1 zusammengefasst.
Es wurde herausgefunden, dass die Aminosäuresequenz der CDR3-Schleifen der Fabs TVG 405 und TVG 407 wie folgt ist:

TVG 405 Schwere Kette, CDR3-Sequenz: LLRGAFDY Leichte Kette, CDR3-Sequenz: NSRDSSGGNAV

TVG 407 Schwere Kette, CDR3-Sequenz: LVQGSFDY Leichte Kette, CDR3-Sequenz: QADSSTHV
Messung der Antikörper-Affinität
Die Affinitäten der synthetischen Fabs (TVG 405, TVG 406 und TVG 407) und der von den Hybridomen stammenden Fabs (TVG 402) werden mittels Oberflächenplasmonresonanz unter Verwendung eines BIAcore 2000-Instruments (Pharmacia Biosensor, St. Albans, UK) gemäß Herstellerbeschreibung analysiert. Die MBP-E4-Aggregate werden unter reduzierenden Bedingungen in 0,5% SDS, 1 mM β-Mercaptoethanol, 50 mM Na₂CO₃/NaHCO₃ (pH 8,5) dissoziiert und biotinyliert, wobei hierfür NHS-LC-Biotin (Sigma, St Louis, USA; 25 mg/ml in DMSO) mit einem molaren Verhältnis von Biotin:Protein von 6:1 (Johnson et al., 1991) verwendet wird. Das monomere MBP-E4 wird durch FPLC-Chromatographie unter Verwendung einer Superdex S200 HR10/30-Säule gewonnen, die man mit 6 M Harnstoff/1 mM β-Mercaptoethanol/PBS/0,2 mM EDTA (pH 7,2) laufen lässt, bevor die Bindung an einen Streptavidin-beschichteten Sensorchip und eine „Rückfaltung" in vitro in PBS/0,2 mM EDTA/0,1 mg/ml proteasefreiem BSA (Sigma) erfolgte. Die Fabs werden aus dem gereinigten TVG 402 unter Verwendung eines Immunopure Fab-Kits (Pierce, Rockford, USA) isoliert, und monomere Präparationen werden mittels FPLC-Gelchromatographie (Superdex S200 HR10/30-Säule, die man mit PBS/0,2 mM EDTA (pH 7,2) laufen lässt) gewonnen. Die Sensorchip-Oberflächen werden unter Verwendung von 6M Harnstoff-Säulenpuffer (oben beschrieben) regeneriert. Die „An" und „Ab" -Verhältnisse werden durch nicht-lineare Kurvenanpassung unter Verwendung der firmeneigenen „BIAanalysis"-Software abgeleitet.
Die Bindungsaktivitäten liegen in der Größenordnung von 20% der Gesamtproteinniveaus für die Antikörper bakterieller Herkunft und bei 50% für die Fabs, die aus Hybridom-Kulturüberständen stammen. Die Affinitäten von TVG 405 und TVG 402 werden anhand der An- und Ab-Verhältnisse berechnet, die durch nicht-lineare Kurvenanpassung bei den Sets der BIAcore-Bindungskurven erhalten wurden.
2A zeigt eine Aufeinanderlegung von Bindungskurven (Sensogrammen), die erhalten werden, nachdem man Fab TVG405 über einen BIAcore Chip leitet, der mit MBP-E4-Fusionsprotein, wie oben beschrieben, beschichtet ist. Die Fab-Konzentrationen reichen über 5 Zwischenverdünnungen von 10 mM (unterste Kurve) bis zu 300 nM (obere Kurve). Das Ausmaß der Bindung wird in Resonanzeinheiten auf der X-Achse angegeben, gegen die Zeit in Sekunden auf der Y-Achse. Das gereinigte Fab wird bei etwa 100 Sekunden eingespritzt, und das Waschen wird bei 700 Sekunden gestartet. Die Affinität (K_d) von TVG405 wird durch die Analyse der Assoziations- und Dissoziationskurven unter Verwendung der Software BIAevaluation (Pharmacia, UK) mit 0,3 bis 1,25 nM berechnet.
2B zeigt eine Aufeinanderlegung von Bindungskurven (gemäß obiger Beschreibung) für das Hybridom-abgeleitete Fab TVG402 über einen Konzentrationsbereich von 100 nM bis 1M. Die K_d wird auf 70 nM eingeschätzt.
TVG405 besitzt eine Konstante der Assoziationsgeschwindigkeit (k_on) von 1,8 × 10⁶ M^–1s^–1 und eine Abdissoziations-Geschwindigkeit (k_off) von 2 × 10³ s^–1, was eine molare Dissoziationskonstante (K_d) von etwa 1 nM anzeigt. Der beste Hybridom-abgeleitete Antikörper – TVG402 – besitzt eine Affinität von nur 70 nM und hatte eine k_on von 4,2 × 10⁴ M^–1s^–1 und einen k_off-Wert von 3 × 10³ s^–1. TVG 406 und 407 zeigen schnelle Kinetiken und werden daher durch eine Scatchard-Analyse der Gleichgewichts-Bindedaten untersucht, wie dies für TVG407 gezeigt ist.
2C zeigt die Gleichgewichts-Bindekurve von Fab TVG407, das eine schnelle Kinetik zeigt. 2D zeigt die Scatchard-Analyse der in 2C präsentierten Daten unter Verwendung der BIAevaluation Software. Die Gleichgewichtswerte werden bei massiven Änderungen des Brechungsindex korrigiert, indem man die Werte einer mit Biotin geblockten Oberfläche von den in 2C gezeigten Werten abzieht. In der dargestellten Auftragung ist die Steigung –K_d und die Y-Achsen-Grenze ist „R_max", d.h. das Bindungsniveau bei Sättigung mit Fab. Die unkorrigierten K_d-Werte für TVG407 und TVG406 sind 250 nM und 140 nM, die, wenn die Aktivität der Fab-Präparation berücksichtigt wird, tatsächliche Affinitäten von 50 nM und 28 nM anzeigen.
TVG407 besitzt eine Affinität (K_d) von 50 nM nach der Korrektur für biologische Aktivität, und TVG406 besitzt eine Affinität (F_d) von 28 nM. Die Aminosäuresequenz der CDR3-Schleifen der schweren und leichten Kette werden durch DNA-Sequenzierung ermittelt, was wiederum bestätigt, dass die drei Antikörper verschieden sind.
Beispiel 3
Präparation von Anti-E4-Peptiden
Ein kommerziell erhältliches Zwei-Hybrid-Screening-Kit wird von ClonTech erworben und verwendet, um natürlich vorkommende E4-bindende Peptide zu identifizieren, wobei gemäß den Herstelleranweisungen vorgegangen wird. Eine HeLa-cDNA-Bibliothek, erhalten vom selben Hersteller, wird durchgetestet. Mittels dieses Verfahrens werden sieben DNA-Sequenzen isoliert, die für E4-bindende Polypeptide codieren, wovon drei nach der Sequenzierung identifiziert werden.
Das erste Peptid ist Ferritin.
Das zweite Peptid ist ein Keratinfilament-bindendes Protein, das die Sequenz besitzt, die in der SEQ ID No. 2 angegeben ist.
Das dritte Polypeptid ist ein neues Polypeptid, das als Mitglied der DEAD-Box-Familie der Proteine erkannt wird, und das das charakteristische Sequenzmotiv DEAD enthält. Die Sequenz des dritten Polypeptids ist in der SEQ ID No. 3 gezeigt.
Um die Stelle der Interaktion zwischen diesen Polypeptiden und E4 zu identifizieren, wird eine Reihe überlappender Peptide mit 10 bis 20 Aminosäuren Länge durch PCR erzeugt und gemäß obiger Beschreibung auf Phagen präsentiert. Die bindenden Moleküle werden nachfolgend als Test-Agenzien verwendet, um HPV16 in Schleimhautläsionen zu identifizieren.
Beispiel 4
Präparation von Anti-E4-RNA-Oligonukleotiden
RNA-Oligonukleotide, bekannt als Aptamere, die zu spezifischer Bindung an Zielmoleküle befähigt sind, können durch Selektionsverfahren, wie etwa SELEX, erzeugt werden. Das SELEX-Verfahren beinhaltet die Selektion von Nukleinsäure-Aptameren, einzelsträngigen Nukleinsäuren, die zur Bindung an ein gewünschtes Ziel befähigt sind, aus einer Bibliothek von Oligonukleotiden. Ausgehend von einer Bibliothek der Nukleinsäuren, diese bevorzugt umfassend Segmente zufallsgemäß erzeugter Sequenz, beinhaltet das SELEX-Verfahren die Schritte des Inkontaktbringens der Bibliothek mit dem Ziel unter Bedingungen, die für eine Bindung günstig sind, das Abtrennen nicht gebundener Nukleinsäuren von denjenigen Nukleinsäuren, die spezifisch an die Zielmoleküle gebunden haben, das Dissoziieren der Nukleinsäure-Ziel-Komplexe, die Amplifikation der Nukleinsäuren, die von den Nukleinsäure-Ziel-Komplexen abdissoziiert sind, um eine Liganden-angereicherte Bibliothek von Nukleinsäuren zu erhalten, dann das Wiederholen der Schritte der Bindung, Abtrennung, Dissoziation und Amplifikation über so viele Zyklen wie gewünscht, um hochspezifische, hochaffine Nukleinsäureliganden für das Zielmolekül zu erhalten.
DNA-Oligonukleotid-Bibliothek
DNA-Oligonukleotide mit einer Länge von 73 Basen, die einen Zufallsabschnitt von 26 Basen aufweisen, werden für die Entwicklung eines Aptamers verwendet, das befähigt ist, an E4 zu binden. Es wird eine Bibliothek synthetischer RNA-Oligonukleotide mit der folgenden Struktur hergestellt:
5' CCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA (26N) TTGAGCGTTTATTCTTGTCTCCC
wobei N für eine beliebige Base in der Zufallsregion steht. Die Zufallsregion wird unter Verwendung eines Gemischs aller vier Nukleotide (Verhältnis 6:5:5:4 für A:C:G:T, um Unterschiede bei der Kopplungseffizienz zu ermöglichen) bei der Synthese aller Nukleotide in diesem Abschnitt der Oligonukleotidbibliothek hergestellt. Die resultierende Komplexität beträgt theoretisch 4²⁶ Moleküle. Die Synthesestufe (0,1 μmol), gefolgt von der Gelreinigung, erbrachte 8,8 nmol, was eine absolute Obergrenze von etwa 5 × 10¹⁵ bei der Anzahl der tatsächlich vorliegenden verschiedenen Moleküle setzt.
Die PCR-Amplifikation mit einem 5'-Primer, der die Erkennungsstelle für T7-RNA-Polymerase (5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA-3') einführt, sowie mit einem 3'-Primer (5'-GCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGAA-3') resultiert in der folgenden Matrize für die Transkription:
5' TAATAGCACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA (26N) TTCGACAGGAGGCTCACAACAGGC 3'
Das RNA-Transkript selbst besitzt die folgende Sequenz:
5' GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAA (26N) UUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC 3'
Anti-E4-Aptamere werden unter Verwendung einer konventionellen SELEX-Prozedur gemäß der Beschreibung im US-Patent 5,270,163 selektiert. Jede Runde besteht aus den folgenden Schritten:

1) Selektion. Die RNA und das E4-Protein werden gemischt, bei 37°C inkubiert, mittels eines Nitrozellulosefilters gewaschen, und die RNA wird von den Filtern eluiert.
2) Amplifikation. Die von den Filtern eluierte RNA wird mittels reverser AMV-Transkriptase in Gegenwart von 50 Picomol an 3'-Primer in einer 50 μl-Reaktion unter Bedingungen verlängert, wie sie in Gauss et al. (1987) beschrieben sind. Zu der resultierenden cDNA-Synthese werden 50 Picomol an 5'-Primer hinzugegeben, und es wird in einem Reaktionsvolumen von 100 μl mittels Taq DNA-Polymerase gemäß der Beschreibung von Innis (1988) für 30 Zyklen amplifiziert.
3) Transkription. Die in vitro-Transkription wird an den ausgewählten amplifizierten Matrizen gemäß der Beschreibung von Milligan et al. (1987) durchgeführt, wonach DNase I zugegeben wird, um die DNA-Matrize zu entfernen. Die resultierenden selektierten RNA-Transkripte werden dann in Schritt 1 der nächsten Runde verwendet. Es wird nur ein zwanzigstel der Produkte, die bei dem jeweiligen Schritt des Zyklus erzeugt werden, in den nachfolgenden Zyklen verwendet, sodass der Ablauf der Selektion nachverfolgt werden kann. Der Fortschritt des Selektionsverfahrens wird durch Filterbindungstests markierter Transkripte aus jeder PCR-Reaktion überwacht. Nach der vierten Runde der Selektion und Amplifikation erbringen die markierten, selektierten RNA-Produkte eine Bindung an E4. Die bindenden Moleküle werden für die Detektion von HPV in Zellen, die aus Zervix-Abstrichen stammen, verwendet.

Beispiel 5
Detektion von HPV in Haut- und Schleimhautläsionen
Alle synthetischen Fabs detektieren das HPV16 E1^E4-Protein in Formalin-fixiertem, mit Paraffin eingebettetem Gewebe, obwohl TVG405 durchgehend das höchste Maß an Färbung zeigt (3).
3 zeigt die Verwendung von synthetischen Fabs zur Lokalisierung von HPV16 E4-Protein in vivo durch die Immunanfärbung einer HPV16 CIN I niedrigen Grades mit dem Fab NIP-C11 (Griffiths et al., 1994), das keine Reaktivität gegenüber HPV16 E4 besitzt (3A) und mit dem E4-spezifischen Fab TVG405, das hier beschrieben ist (3B, C, D). Die Fabs werden unter Verwendung von 9E10 als sekundärem Antikörper, gefolgt von anti-Maus-FITC-Konjugat, detektiert. E4 ist in den oberen Schichten der Epidermis detektierbar, jedoch mit stark abweichenden Niveaus zwischen den verschiedenen Läsionen, wo oft nur einige wenige positive Zellen erkennbar sind (C, D). Die Position der Basalschicht ist in C und D mittels Pfeil markiert. Die Vergrößerung ist 200fach.
Die Epitop-Freilegung durch Mikrowellenbehandlung verstärkt die Empfindlichkeit der E4-Detektion und erlaubt sogar eine Anfärbung unter Verwendung von TVG402 (Doorbar et al., 1992). Das Ausmaß der E4-Expression variiert stark zwischen den verschiedenen Läsionen (es wurden 8 HPV16-assoziierte CIN1-Biopsien untersucht), reichend von der Expression nur in wenigen, über die Biopsie verstreuten Zellen (3) bis zu einer weit ausgedehnten Verteilung über die meisten differenzierten Schichten der Epidermis (4), vergleichbar der Verteilung von E4 in Hautwarzen, die von HPV1 und HPV63 verursacht werden, wo die Produktion der infektiösen Virionen ebenfalls hoch ist (4). Bei niedrig-gradiger intraepithelialer Zervix-Neoplasie (CIN 1), die durch HPV16 verursacht wird, werden die Spiegel von E4 und L1 außerdem als stark korrelierend ermittelt, obwohl die Expression der beiden Proteine nicht gleichzeitig erfolgt (wie zuvor angenommen (Brown et al., 1994)). Die E4-Expression geht der Synthese des Haupt-Capsid-Proteins um mehrere Zellschichten voraus (wie durch Doppelfärbung gezeigt, siehe 4), und bei hochgradigen Zervix-Läsionen (CIN 2/CIN 3) ist E4 oft überreichlich vorhanden, obwohl die Expression von L1 nicht länger unterstützt wird (4). Diese Zeitverzögerung zwischen dem Beginn der E4-Synthese und dem Zusammenbau infektiöser Virionen ist am auffälligsten bei HPV63, wo die E4-Expression mit der Migration einer infizierten Basalzelle in die parabasalen Schichten zusammenfällt, während die Expression von L1 auf einen schmalen Zellstreifen in der oberen Körnerzellschicht begrenzt ist.
4 zeigt, dass die Synthese von E4 bei hoch- und niedrig-gradigen HPV16-Läsionen und gutartigen Warzen nicht direkt mit der Expression der Capsid-Proteine verbunden ist. 4 zeigt die Ergebnisse einer Dreifachfärbung unter Verwendung von anti-L1-Antiserum (4A, D, G), dem HPV16 E4 Fab TVG405 (4B und 4E), polyklonalem Antiserum gegen HPV63 E4 (4H) und mit DAPI (4C, F, I). A, B und C stellen eine niedrig-gradige HPV16-induzierte Läsion (CIN I) dar. D, E und F stellen eine hochgradige HPV16-induzierte Läsion (CIN II/III) dar. G, H und I stellen einen Schnitt durch eine Warze dar, die von HPV63 verursacht wurde. In allen Fällen geht die E4-Expression der L1-Expression voraus, bei CIN I allerdings nur um einige wenige Zellschichten (A, B). Bei CIN II/III nehmen wir an, dass die terminale Differenzierung unzureichend ist, um die Synthese von Virion-Strukturproteinen zu unterstützen (D), obwohl die Expression von E4 überreich ist (E). Der Kontrast zwischen dem Einsetzen der E4-Expression und der Detektion der viralen Strukturproteine ist am besten bei den von HPV63 verursachten Hautwarzen erkennbar (G, H). Die Basalschicht ist durch einen Pfeil an den DAPI-gefärbten Bildern angezeigt. Die Vergrößerung ist 100fach.
Das Einsetzen der vegetativen viralen DNA-Replikation und die E4-Expression fallen zeitlich zusammen
Es wurde herausgefunden, dass die vegetative virale DNA-Replikation in den Zellen der mittleren Stachelzellschicht beginnt und exakt mit dem Einsetzen der E4-Expression korreliert (5).
5 zeigt, dass das Einsetzen der vegetativen viralen DNA-Replikation bei niedrig-gradigen HPV16-Läsionen und bei gutartigen Hautwarzen mit der E4-Expression zusammenfällt. Die Figur zeigt eine dreifache Färbung unter Verwendung der HPV16 E4-Antikörper TVG402, 405 und 406 (5A) und der HPV1 E4-Antikörper 4.37 und 9.95 (5D), biotinylierter DNA-Sonde (5B: HPV16, 5E: HPV1) oder DAPI (5C und F). A, B und C stellen einen Schnitt durch eine HPV16-induzierte CIN I dar, und D, E und F stellen einen Schnitt durch eine HPV1-induzierte Warze dar. Bei der HPV16 CIN I korrelieren die vegetative virale DNA-Replikation und die E4-Synthese in den mittleren bis oberen Schichten der Epidermis (A, B). Bei den Hautläsionen werden die beiden Ereignisse initiiert, sobald die infizierte Zelle die Basalschicht verlässt (D, E). Die Basalzellen sind in dem mit DAPI gegengefärbten Bild gezeigt (F). Die Vergrößerung ist 200fach.
Bei den durch HPV-1 induzierten Warzen beginnen die vegetative virale DNA-Replikation und die E4-Synthese viel früher und sind unmittelbar nach dem Wandern der infizierten Basalzelle in die oberflächlichen Schichten erkennbar (5). Nur ein Teil der sich differenzierenden Zellen ist für die vegetative virale DNA-Replikation permissiv, und nur in diesen Zellen ist E4 detektierbar.
Die benachbarten Zellen zeigten weder eine späte Genexpression noch eine vegetative virale DNA-Replikation, was nahelegt, dass das Einsetzen dieser beiden Ereignisse eng miteinander verbunden ist. Obwohl die Empfindlichkeit der DNA- und E4-Detektion nicht festgestellt worden ist, so sind diese „normalen" Zellen wahrscheinlich entweder nicht permissiv für die virale Replikation oder uninfiziert. Die genaue Korrelation zwischen der E4-Expression und dem Einsetzen der vegetativen viralen DNA-Replikation ist auch bei Hautwarzen zu sehen, die durch HPV63 und 65 verursacht werden, sowie bei gewöhnlichen Warzen, die durch HPV2 verursacht werden.
Zellen, die die späte Genexpression durchmachen, zeigen ein anormales Muster der terminalen Differenzierung im Vergleich zu nicht-permissiven oder uninfizierten Zellen
Zellen, die die späten Stadien der HPV-Infektion unterstützen, können somit durch Immunanfärbung mit dem Fab TVG405 (für HPV16), Mab 4.37 (für HPV1) oder polyklonalem Antiserum gegen E4 (HPV63) identifiziert werden. Bei Warzen, die durch HPV1 verursacht werden, fehlen den E4-positiven Zellen detektierbare Spiegel an Filaggrin oder Involucrin (6(i)). Nicht-permissive (oder uninfizierte) Zellen in derselben Läsion, die weder E4-Expression noch vegetative virale DNA-Replikation zeigen, exprimieren Filaggrin und Loricrin auf Niveaus, die von denen der umgebenden Epidermis nicht unterscheidbar sind. Die Korrelation der E4-Synthese mit den Differenzierungs-spezifischen Keratinen K4 und K13 offenbart ein identisches Inhibitionsmuster. Die Intensität der K4- und K13-Färbung ist bei E4-positiven Zellen immer niedriger als bei benachbarten Zellen, die E4 nicht exprimieren (6(ii)). K5 und 14, die in den basalen und unteren Parabasal-Zellen vorkommen, sind unbeeinflusst. Das Eingreifen in die Detektion der Expression der Differenzierungs-spezifischen Keratine (K1 und K10 in der der Haut) ist auch bei Hautwarzen erkennbar, die durch HPV1 verursacht werden (6(ii)), während sie bei Warzen, die durch HPV63 verursacht werden, nicht offenkundig ist (6(ii)). Das E4-Protein von HPV63 ist am engsten mit dem von HPV1 verwandt.
6 zeigt, dass die produktive Infektion in die normale terminale Epitheldifferenzierung bei niedrig-gradigen HPV16-Läsionen und gutartigen Hautwarzen eingreift. 6(i) (Keratinexpression) zeigt eine dreifache Färbung unter Verwendung der HPV16 E4-Fabs TVG405/TVG406 (6(i)A), der HPV1 E4 MAbs 4.37/9.95 (D) und der gegen HPV63 E4 gerichteten polyklonalen Antikörper (G) in Verbindung mit Antikörpern gegen die Differenzierungs-spezifischen Schleimhautkeratine 4 und 13 (B) oder die Hautkeratine 1 und 10 (E, H). Die 6(i) C, F und I zeigen die Gegenfärbung mit DAPI. A, B und C stellen einen Schnitt durch eine HPV16-induzierte CIN I dar. D, E und F zeigen einen Schnitt durch den Rand einer durch HPV1 induzierten Warze, während die 6(i) G, H und I einen Schnitt durch eine HPV63-induzierte Warze zeigen. Bei HPV16- und HPV1-induzierten Läsionen sind Differenzierungs-spezifische Keratine in E4-positiven Zellen weniger erkennbar als bei den benachbarten Zellen (A, B, D, E), obwohl dies bei HPV63 nicht der Fall ist (G, H). Die nukleäre Degeneration (sichtbar gemacht durch Gegenfärben mit DAPI) ist bei den E4-exprimierenden Zellen retardiert (A, C, D, F). Die Vergrößerung ist 200fach.
6(ii) betrifft die Expression von Filaggrin. Die Figur zeigt eine dreifache Färbung, wie oben beschrieben, mit dem Unterschied, dass die 6(ii) B und E Filaggrin-Anfärbung zeigen. Die E4-Färbung ist in den 6(ii) A und D gezeigt, und die DAPI-Gegenfärbung ist in den 6(ii) C und F gezeigt. A, B und C stellen den Rand einer HPV63-induzierten Warze dar, wo die normale Haut (linke Seite der Figur) auf den gutartigen Tumor trifft (rechte Seite der Figur). D, E und F zeigen die Körnerzellschicht einer HPV1-induzierten Warze. Die E4-positiven Zellen exprimieren keine detektierbaren Niveaus des Differenzierungs-spezifischen Markers Filaggrin, und zeigen eine merkliche nukleäre Erhaltung im Vergleich zu den benachbarten uninfizierten oder nicht-permissiven Zellen. Die Vergrößerung ist 200fach.
Die intrazelluläre Verteilung der HPV16 E4-Proteine unterscheidet sich von der Verteilung von E4 in Hautläsionen, die durch HPV1 und HPV63 hervorgerufen werden
Das E1^E4-Protein von HPV1 ist vornehmlich zytoplasmatisch und baut sich zu Einschlüssen zusammen, die verschmelzen und in ihrer Größe zunehmen, wenn die Zelle zur Oberfläche der Haut wandert. Für das E1^E4-Protein von HPV63 wurde herausgefunden, dass es eine faserige und granuläre Verteilung besitzt. Im Gegensatz dazu besitzt HPV16 E4 eine filamentöse und perinukleäre Verteilung in Zellen der unteren epidermalen Schichten (7), und es wird nur in den stärker differenzierten Zellschichten zu hervorstechenden Strukturen zusammengebaut. Diese „Einschlüsse" finden sich stets einzeln pro Zelle (vergleiche mehrfache Einschlüsse bei den meisten Hautläsionen), dabei angrenzend an den Zellkern und fast immer auf derjenigen Seite des Zellkerns detektiert, die der Oberfläche der Epidermis am nächsten ist. Obwohl sie in ihrer Erscheinung den E4/Intermediärfilament-Bündeln ähneln, die sich nach der Expression des HPV16 E1^E4-Proteins in Epithelzellen in vitro bilden, haben wir die Anwesenheit von Keratinen in diesen Strukturen in vivo nicht detektiert. Antikörper gegen den äußeren N-Terminus von HPV16 E1^E4 färbten die Strukturen viel weniger rasch als Antikörper gegen die C-terminalen Epitope (TVG404, TVG405, TVG406), was nahelegt, dass die N-terminale Region entweder verborgen oder verloren gegangen sein könnte.
7 zeigt die Assoziation der HPV16 E4-Proteine mit perinukleären Bündeln und filamentösen Strukturen in vivo, insbesondere die Detektion der HPV16 E4-Proteine in den oberen Schichten (7A, B) und unteren Schichten (7C, D) einer HPV16 CIN I unter Verwendung eines Gemischs der Fabs TVG405 und TVG406. In den oberen Schichten befindet sich E4 diffus über das Zytoplasma verteilt, jedoch mit einem vorherrschend perinukleären Muster. Die Konzentration von E4 auf diese perinukleären Bündel (pfeilmarkiert in 7B) ist bei diesen Zellen zu erkennen. In den unteren Schichten besitzt E4 ein vorherrschend perinukleäres und filamentöses Erscheinungsbild (7C, D), ist jedoch nicht in perinukleären Bündeln konzentriert. Die Vergrößerung für die 7A und C ist 200fach, die für B und D ist 400fach.
Konfokale Abbildungen offenbarten, dass die N-terminalen Antikörper sich primär am Rand der E4-Strukturen anordneten, während die Anti-C-terminale Färbung im Zentrum am stärksten ist (Daten nicht gezeigt). Im Vergleich zu der Verteilung, die für TVG405 und TVG406 zu sehen ist, zeigte das Anti-N-terminale Reagenz, dass HPV16 E1^E4 eine diffusere Verteilung in der Zelle besitzt (8). Es ist kein signifikanter Unterschied zwischen dem Färbemuster von TVG 405, 406, 407 und dem C-terminalen Antikörper erkennbar.
8 liefert den Beweis für die Prozessierung der HPV16 E4-Proteine in vivo und zeigt eine dreifache Färbung in den oberen Schichten einer HPV16 CIN unter Verwendung des HPV16 E4 Fab TVG406, das ein Epitop in der C-terminalen Hälfte des E4-Proteins erkennt (8A), eines Antikörpers gegen die N-terminalen 12 Aminosäuren des HPV16 E1^E4-Proteins (8B) und DAPI (8C). TVG402, 403, 404, 405 und 407 ergaben Färbemuster, die sich nicht signifikant von demjenigen von TVG 406 unterscheiden. Die Anti-N-terminalen Antikörper führten nicht zu einer effektiven Anfärbung der perinukleären Bündel (8B), die bei TVG406 sichtbar werden (pfeilmarkiert in 8A), was nahelegt, dass, wie bei HPV1, verschiedene Formen des Proteins unterschiedliche intrazelluläre Positionen besitzen. Die Vergrößerung ist 400fach.
Beispiel 6
Detektion von HSV in Zellen, die aus Zervix-Läsionen isoliert wurden
Objektträger, die für die Abbildung von Zellen geeignet sind, werden aus Zervix-Abstrichen erhalten, die unter Verwendung von anti-E4-Antikörpern angefärbt werden; dabei wird für die Präparation gemäß dem in der US 5,346,831 beschriebenen Verfahren vorgegangen. Die Zellen werden gemäß konventionellen Verfahren aus dem Patienten isoliert und in 10 ml Alkohol/Saline-Puffer suspendiert. Die Probe wird für die Zentrifugation vorbereitet, indem man die Zellklumpen oder Zellcluster in dem Probengefäß durch Vortexen disaggregiert. Nach der Disaggregation wird die Probe vollständig abgelassen und über einem Dichtegradienten in einem konischen 12 ml-Röhrchen aufgeschichtet, wobei der Dichtegradient mit einem Plasmaexpander-Material aufgebaut wird, das 6% Betastärke-Lösung und 0,9% physiologische Saline enthält, auch bekannt unter dem Handelsnamen „Hespan", hergestellt von NPBI, Emmer-Compascuum, Niederlande.
Die konischen 12 ml-Röhrchen, die den Dichtegradienten und die Probenzellen enthalten, werden in Zentrifugenbecher gestellt, austariert und für 5 Minuten bei einer Stärke von etwa 6000 zentrifugiert. Die Flüssigkeit wird dann bis zu der 5 ml-Marke an dem konischen Röhrchen abgesogen. Die Zentrifugenbecher werden entfernt, und die konischen 12 ml-Röhrchen mit der verbleibenden Flüssigkeit werden für 10 Minuten bei 8000 zentrifugiert. Die Röhrchen werden von dem Überstand geleert, wobei in einem Winkel von 45 Grad 2- oder 3-mal leicht geklopft wird. Die Röhrchen enthalten nun variierende Volumina gepackter Zellen. Nach dem Mischen bis zur Homogenität enthalten die Pellets im allgemeinen die gleiche Konzentration an Zellen pro Einheitsvolumen an Flüssigkeit.
Es werden 50 μl deionisiertes Wasser zugegeben, und die Probe wird gemischt, indem man sie über eine 0,042 Inch-Spitze 5mal durch eine Spritze zieht. Nach Vollendung des Mischens werden 150 μl Probe, gefolgt von 500 μl deionisiertem Wasser, in ein Sedimentationsgefäß dispensiert, das an einem Objektträger angebracht ist, der in konventioneller Weise mit Poly-L-Lysin (1 % Sigma) beschichtet wurde. Die überführte Probe lässt man sich dann für etwa 10 Minuten in dem Gefäß absetzen. Der Probenüberschuss wird abgesogen, und die Kammer wird mit 2 ml deionisiertem Wasser zweimal gespült (zwischen den Zugaben jeweils Absaugen).
Die FITC-markierten Fabs werden dann gemäß bekannten Verfahren auf die Zellen gegeben und die Bindung mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.
Literaturstellen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Feststellen einer präkanzerösen Läsion, die von einer Schleimhautpapillomvirus-Infektion in einem Organismus herrührt, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: Inkontaktbringen in vitro einer Probe der Zellen des Organismus von der Stelle einer möglichen Infektion mit einem Molekül, das spezifisch an Schleimhautpapillomvirus-E4-Protein bindet, und Überwachen der Bindung.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Organismus ein Säuger ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Organismus ein Mensch ist und das Papillomvirus humanes Papillomvirus (HPV) ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die Stelle einer möglichen Infektion die Zervix ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das humane Papillomvirus aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus den HPV-Typen 16, 18, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 58 und 61.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches weiterhin das Bestimmen des Typs/der Typen der HPV-Infektion in dem Organismus umfaßt, wobei die Bestimmung die folgenden Stufen umfaßt: Inkontaktbringen der Zellen mit einem Molekül, das spezifisch an eine Untergruppe von HPV-E4-Proteinen bindet, und Überwachen der Bindung.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Molekül, welches an das Papillomvirus-E4-Protein binden kann, in der Lage ist, innerhalb eines hydrophilen Bereichs der E4-Sequenz zu binden.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der hydrophile Bereich der Bereich ist, welcher die Sequenz RPIPKPSPWAPKKHRRLSSDQDSQTP in HPV16 oder deren Homologe in anderen Papillomviren aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der hydrophile Bereich der Bereich ist, welcher die Sequenz RRIPKPSPWAPKKHR in HPV16 oder deren Homologe in anderen Papillomviren aufweist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der hydrophile Bereich der Bereich ist, welcher die Sequenz PKPSPWAPKKHR in HPV16 oder deren Homologe in anderen Papillomviren aufweist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Molekül, welches in der Lage ist, an ein Papillomvirus-E4-Protein zu binden, ein Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon ist.