DE69733888T2

DE69733888T2 - Inkubation von biofilmen

Info

Publication number: DE69733888T2
Application number: DE69733888T
Authority: DE
Inventors: Howard Ceri; Edwin Merle OLSON; Walter Douglas MORCK; Rae Ronald READ; Gerald Andre BURET
Original assignee: University Technologies International Inc
Current assignee: University Technologies International Inc
Priority date: 1996-03-13
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2017-03-13
Also published as: US6326190B1; EP0904347A1; US6599714B1; US6410256B1; CA2248808A1; JP3886152B2; DE69733888D1; US6051423A; CA2248808C; AU724282B2; JP2000506021A; US7041470B2; AU2088797A; WO1997033972A1; ATE301183T1; US20020146809A1; EP0904347B1

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Inkubation und Analyse von Biofilmen und Analyse der Empfindlichkeit von Biofilmen gegenüber antimikrobiellen Reagenzien.
Umfangreiche Untersuchungen der Wachstumseigenschaften von Bakterien in den letzten Jahren zeigten, daß diese komplexe Schichten bilden, die an Oberflächen haften. Bekannt sind diese komplexen Bakterienformen als Biofilme oder sessile Bakterien. Biofilme können Probleme in vielfältigen Bereichen verursachen, u. a. in menschlichen und tierischen Körpern, in der Nahrungsmittelverarbeitung, in Gesundheitseinrichtungen, Metallverarbeitungsbetrieben, Molkereien und anderen Industriezweigen.
Inzwischen ist weithin bekannt, daß Bakterien in Form von Biofilmen gegenüber antimikrobiellen Reagenzien resistenter als Planktonbakterien sind. Dennoch beinhalteten Tests auf das Vorhandensein von Bakterien und Tests der Wirksamkeit von Antibiotika gegen Bakterien traditionell eine Testung auf Planktonbakterien. Dadurch kann die bakterielle Hemmkonzentration des antimikrobiellen Reagens mit dem Ergebnis unterschätzt werden, daß möglicherweise das falsche antimikrobielle Reagens oder die falsche Menge von antimikrobiellem Reagens zur Behandlung der Bakterien zum Einsatz kommt.
Eine Art von Vorrichtung zur Überwachung des Biofilmaufbaus ist im Canadian Journal of Microbiology (1981), Band 27, Seiten 910 bis 917 beschrieben, in dem McCoy et al. die Verwendung eines sogenannten Robbins-Device vorschlagen, das eine Röhre aufweist, durch die Wasser in einem Kreislauf strömen kann. Die Röhre hat mehrere Anschlüsse in ihren Wänden, die jeweils mit einem Zapfen versehen sind, der eine biobewuchsfähige Oberfläche hat und im Anschluß in fester Beziehung im Hinblick auf die Röhre so gehalten werden kann, daß die biobewuchsfähige Oberfläche Teil der Innenfläche der Röh re bildet. Die Zapfen können nach einem gewünschten Zeitintervall aus den Anschlüssen entfernt werden, und die Testflächen können durch mikroskopische Untersuchung der Oberflächen auf das Wachstum von Mikroorganismen oder durch Entfernen der Mikroorganismen von den Oberflächen und anschließendes Schätzen des Wachstumsgrads analysiert werden. Die Anzahl von Mikroorganismen läßt sich beispielsweise physikalisch oder chemisch schätzen, z. B. durch Detektion von bakteriellem ATP oder durch weiteres Kultivieren der Mikroorganismen und Analysieren der Produkte.
In einer weiteren Vorrichtung, die in der US-A-5349874 beschrieben ist, wird Biofilmwachstum in einer wasserführenden Leitung bestimmt, indem mehrere entfernbare Zapfen in der Leitung oder in einer zweiten Leitung vorgesehen sind, die parallel zur ersten ist. Die Zapfen können zur Biofilmanalyse auf den Zapfen entfernt werden. Solche Vorrichtungen wie das Robbins-Device oder andere mit entfernbaren Zapfen in einer einzelnen Leitung führen zu recht langen Verarbeitungszeiten und liefern keine schnelle Reaktionszeiten für das Testen mehrerer unterschiedlicher antimikrobieller Reagenzien.
Die US-A-2956931 offenbart ein Verfahren zum Screening antimikrobieller Agenzien mit den folgenden Schritten: Anhaftenlassen biologischer Materialien an den Oberflächen von Stiften oder Zinken und Abscheiden von Testelementen auf eine mit Wachstumsmedien präparierte Oberfläche, Abscheiden der zu testenden Proben über jeweilige Flächen und Bestimmen der Biofilme. In der FR-A-1221896 ist ein ähnliches Verfahren offenbart.
In noch einer weiteren Vorrichtung, die in "Simple Method for Measuring Antibiotic Concentration Required to Kill Adherent Bacteria", Miyake et al., Chemotherapy 1992; 38, 286–290 beschrieben ist, wurden Staphylococcus-aureus-Zellen, die am Boden einer Kunststoff-Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen hafteten, mit reihenverdünnten Antibiotikalösungen behandelt, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde anhand ihres Wachstums nach einer weiteren 24-stündigen Inkubation beurteilt. Dieses Verfahren hat den Nachteil einer inkonsi stenten Besiedlung mit sessilen Bakterien und eines Absetzens von Planktonbakterien.
Die o. g. Nachteile werden mit dem Verfahren und der Vorrichtung gemäß den Ansprüchen überwunden.
Die in der vorliegenden Patentschrift beschriebene Vorrichtung ermöglicht eine rationelle und automatisierte Bestimmung der Biofilmabtötung, die mit der Plattform mit 96 Vertiefungen von besonderem Nutzen ist, die zahlreichen diagnostischen Bestimmungssystemen gemeinsam ist.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Züchten eines Biofilms bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Inkubieren biofilmbildender Organismen auf mehreren Biofilmhaftstellen, die in mehreren Reihen mit mehreren Biofilmhaftstellen in jeder Reihe angeordnet sind, während für eine Strömung von flüssigem Wachstumsmedium über die mehreren Biofilmhaftstellen gesorgt wird.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung erfolgt eine Bestimmung einer Charakteristik der resultierenden Biofilme.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Charakteristik des Biofilms die Empfindlichkeit des Biofilms gegenüber antimikrobiellem Reagens, und das Verfahren weist vor Bestimmen des Biofilms ferner den Schritt des Behandelns der Biofilmhaftstellen mit antimikrobiellem Reagens auf.
Zu einem weiteren Aspekt der Erfindung gehören nach Behandeln der Biofilmhaftstellen mit antimikrobiellem Reagens auch die Schritte des Lösens des Biofilms von den Biofilmhaftstellen und des weiteren Inkubierens des Biofilms. Zum Lösen des Biofilms von den Biofilmhaftstellen kann das Lösen des Biofilms von jeder Biofilmhaftstelle in eine separate Vertiefung einer Mikrotiterplatte gehören.
Sind die Biofilmhaftstellen in Reihen ausgebildet, kann das Behandeln der Biofilmhaftstellen die folgenden Schritte aufweisen: Behandeln jeder Reihe von Biofilmhaftstellen mit einem unterschiedlichen antimikrobiellen Reagens und Behandeln jeder der Biofilmhaftstellen in einer Reihe mit einer unterschiedlichen Konzentration von antimikrobiellem Reagens.
In einem weiteren Aspekt des Verfahrens der Erfindung werden unterschiedliche Biofilmhaftstellen mit unterschiedlichen antimikrobiellen Reagenzien behandelt, z. B. unterschiedlichen Kombinationen antimikrobieller Reagenzien, die beim Testen der Wirksamkeit verschiedener Modifikationen eines einzelnen antimikrobiellen Reagens verwendet werden könnten.
Vorzugsweise wird die Strömungsrichtung des flüssigen Wachstumsmediums wiederholt umgekehrt. In diesem Aspekt der Erfindung kann das flüssige Wachstumsmedium in Kanälen eines Behälters strömen, und die Strömungsrichtung des flüssigen Wachstumsmediums wird durch Schaukeln des Behälters umgekehrt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung sind die Biofilmhaftstellen Vorsprünge von einem Deckel, und das Inkubieren des Biofilms weist den Schritt des Herabhängenlassens der Vorsprünge in flüssigem Wachstumsmedium in den Kanälen auf, während das Gefäß geschaukelt wird, um so für Scherkräfte am Biofilm während des Wachstums des Biofilms zu sorgen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist ferner eine Vorrichtung zum Analysieren von Biofilmen bereitgestellt, wobei die Vorrichtung einen Behälter mit mindestens einem Kanal zur Strömung von flüssigem Wachstumsmedium aufweist. Mehrere Biofilmhaftstellen sind in mindestens einer Reihe angeordnet und haben eine Stütze zum Stützen der mehreren Biofilmhaftstellen im Kanal.
Gemäß einem weiteren Aspekt der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist eine Einrichtung zum Strömenlassen von flüssigem Wachstumsmedium entlang jedem Kanal, vorzugsweise in unterschiedlichen Richtungen, über die mehreren Biofilmhaftstellen bereitgestellt.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Vorrichtung der Erfindung ist eine Einrichtung bereitgestellt, um Kontamination des Inneren des Behälters zu vermeiden.
Vorzugsweise sind die mehreren Biofilmhaftstellen in mehreren Reihen mit mehreren Stellen in jeder Reihe ausgebildet, und der Behälter weist mehrere Kanäle mit einem Kanal für jede Reihe mehrerer Biofilmhaftstellen auf.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung bildet die Stütze für die mehreren Biofilmhaftstellen einen Deckel für den Behälter.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung ist die Einrichtung zum Strömenlassen von flüssigem Wachstumsmedium über die mehreren Biofilmhaftstellen ein Kipptisch.
Diese und weitere Aspekte der Erfindung werden in der nachfolgenden Beschreibung und den Ansprüchen verdeutlicht.
Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung als Veranschaulichung anhand der Zeichnungen beschrieben, in denen gleiche Bezugszahlen gleiche Elemente bezeichnen. Es zeigen:
1 eine Untersicht auf mehrere Biofilmhaftstellen auf einem Deckel eines Behälters;
2 eine Draufsicht auf einen Behälter zum Aufnehmen der mehreren Biofilmhaftstellen von 1;
3 eine teilweise weggebrochene Seitenansicht des Deckels und Behälters von 1 und 2;
4 eine schematische Seitenansicht einer Deckel-Behälter-Kombination gemäß 3 auf einem Kipptisch;
5 eine Draufsicht auf eine Platte mit 96 Vertiefungen (96er Platte) zur Verwendung mit der Erfindung; und
6 einen Seitenschnitt eines Hohlvorsprungs zur Verwendung mit der Erfindung, die zeigt, wie er abgedichtet werden kann.
Wie 1, 2 und 3 am speziellsten zeigen, verfügt die Biofilm-Bestimmungsvorrichtung über einen Biofilmdeckel 10, der sich aus Kunststoff oder anderem geeigneten Material (z. B. rostfreier Stahl, Titan) in ELISA-Güte zusammensetzt, mit Vorsprüngen 12 vom Deckel 10. Die Vorsprünge 12 bilden Biofilmhaftstellen, an denen ein Biofilm haften kann. Vorzugsweise sind die Vorsprünge 12 in mindestens acht Reihen 14 aus jeweils mindestens zwölf Vorsprüngen ausgebildet. Andere Anzahlen von Reihen oder Anzahlen von Vorsprüngen in einer Reihe können verwendet werden, aber dies sind zweckmäßige Anzahlen, da sie den 96er Platten entsprechen, die in biomedizinischen Vorrichtung gewöhnlich zum Einsatz kommen. Zusätzliche Vorsprünge wie gezeigt können dazu dienen, die Anfangs biofilmkonzentration nach Inkubation zu bestimmen. Die gezeigten exemplarischen Vorsprünge 12 sind etwa 1,5 cm lang und 2 mm breit.
Außerdem verfügt die Biofilm-Bestimmungsvorrichtung über einen Behälter 20, der ein Flüssigkeitsrückhaltebecken 22 aufweist, das in mehrere Kanäle (Rinnen) 24 durch geformte Stege 26 unterteilt ist. Die Kanäle 24 sind ausreichend breit, um die Vorsprünge 12 aufzunehmen. Es sollte ein Kanal 24 für jeden Vorsprung 12 einer bestimmten Reihe 14 vorhanden sein. Der Deckel 10 bildet eine Stütze für die Vorsprünge 12 zum Stützen der Biofilmhaftstellen in den Kanälen 24. Der Deckel 10 hat eine umgebende Lippe 16, die sich dicht über eine umgebende Wand 28 des Behälters 20 aufpaßt, um Kontamination des Inneren des Behälters während der Inkubation zu vermeiden.
Werden existierende Vorrichtungen zur Durchführung der Erfindung verwendet, so sollten sie zum Gebrauch mit der Erfindung abgewandelt sein. Beim Falcon-System, bei dem Vorsprünge in entfernbare Streifen eingepaßt sind, sollten die Streifen abgedichtet sein, z. B. durch Verwendung einer über den Streifen plazierten Kunststoffbahn. Im Falcon-System ist auch eine Rinnensperre vorhanden, die sich über den gesamten Behälter erstreckt. Diese isoliert einen Kanal, und ist die Falcon-Vorrichtung zu verwenden, sollte sie entfernt oder abgewandelt sein, um wie einer der Stege 26 zu enden.
Bei Einsatz des NUNC-Systems, das Hohlvorsprünge z. B. gemäß 6 nutzt, sollte auch eine Bahn verwendet werden, um die Vorsprünge abzudecken, falls sie abbrechen. So ist gemäß 6 der Vorsprung 12a mit einer Bahn 13 abgedeckt, um Kontamination des Inneren des Behälters zu verhindern. Zudem erfordert die NUNC-Vorrichtung eine Abwandlung der Verbindung des Deckels mit dem Behälter, um Kontamination des Inneren des Behälters zu vermeiden, z. B. durch Anheben einer Innensperre, damit sie am Deckel abdichtet.
Der Biofilm-Inkubationsbehälter 20 erfüllt zwei wichtige Funktionen zur Biofilmentwicklung. Die erste ist die als Reservoir für flüssiges Wachstumsmedium, das die biofilmbildenden Organismen enthält, die einen Biofilm auf den Vorsprüngen 12 des Biofilmdeckels 10 bilden. Die zweite Funktion besteht darin, Scherkraft über die Vorsprünge zu erzeugen, was optimale Biofilmerzeugung auf den Vorsprüngen ermöglicht. Die biofilmbildenden Organismen können beispielsweise Bakterien, Hefe und Pilze sein, z. B. fädige Pilze.
Wie 4 zeigt, wird Scherkraft an den Vorsprüngen 12 durch Schaukeln des Behälters 20 mit dem Deckel 10 auf einem Kipptisch 30 erzeugt. Die Vorsprünge 12 sitzen in den Kanälen 24 so abgehängt, daß die Spitzen der Vorsprünge 12 in flüssiges Wachstumsmedium eingetaucht sein können, das in den Kanälen 24 strömt. Die Stege 26 kanalisieren das flüssige Wachstumsmedium entlang den Kanälen 24 an den Vorsprüngen 12 vorbei und über sie hinweg und erzeugen so eine Scherkraft über die Vorsprünge. Durch Schaukeln des Behälters 20 erfolgt eine wiederholte Strömungsrichtungsänderung, in diesem Fall eine wiederholte Strömungsumkehr von flüssigem Wachstumsmedium, über die Vorsprünge 12, was dazu beiträgt, einen Biofilm gleicher Proportion auf jedem der Vorsprünge 12 des Deckels 10 zu gewährleisten. Während es möglich ist, Biofilm mit nur einer Strömungsrichtung von flüssigem Wachstumsmedium zu züchten, erschwert der Gebrauch einer Anordnung von Vorsprüngen 12, die in mehreren Kanälen abgehängt sind, den Aufbau der Anordnung, da dann ein gewisses Verfahren ermittelt werden müßte, Flüssigkeit von einem Ende jedes Kanals zum anderen Ende umlaufen zu lassen. Durch Schaukeln des Behälters, wobei Flüssigkeit entlang den Kanälen hin- und herströmt, ergibt sich eine ausgezeichnete Umgebung für das Biofilmwachstum, die natürlich auftretende Bedingungen turbulenter Strömung simuliert.
Jeder Vorsprung 12 und jeder Kanal 24 sollten im wesentlichen die gleiche Form (innerhalb von Herstellungstoleranzen) haben, um Gleichmäßigkeit von Scherströmung über die Vorsprünge während der Biofilmbildung zu gewährleisten. Zusätzlich sollten die gleichmäßigen Kanäle 24 alle verbunden sein, so daß sie denselben flüssigen Nährstoff und dieselbe flüssige Mischung gemeinsam benutzen, die das Becken 22 füllt. mit der gemeinsamen Benutzung derselben biofilmbildenden Brühe und der identischen Kanalkonfiguration für jeden Kanal werden Biofilme an jedem Vorsprung erzeugt, die für den Zweck der Testung antimikrobieller Reagenzien äquivalent sind. Auf diese Weise lassen sich unterschiedliche Konzentrationen unterschiedlicher Antibiotika ohne Rücksicht auf Positionsstreuung der Vorsprünge miteinander vergleichen. So hergestellte Biofilme gelten als gleichmäßig. Ergebnisse innerhalb von P < 0,05 wurden für zufällig ausgewählte Vorsprünge auf der Platte erhalten.
Die Empfindlichkeit eines Biofilms gegenüber einem Antibiotikum oder Biozid, in diesem Patent gemeinsam "antimikrobielles Reagens" genannt, wird gemessen, indem die Biofilmhaftstellen mit einem antimikrobiellen Reagens behandelt werden und dann der Biofilm bestimmt wird. Erreichen läßt sich dies durch Plazieren des Deckels 10, der mit einem bakteriellen Biofilm in einem Inkubationsbehälter 20 besiedelt wurde, in eine herkömmliche 96er Platte 40, z. B. gemäß 5, wobei die Anzahl von Vertiefungen 42 durch die Anzahl von Vorsprüngen 12 bestimmt ist, in die Wachstumsmedium, das Antibiotika- oder Biozidverdünnungen enthält, abgegeben wurde. Der Deckel 10 und die Platte 40 passen so zusammen, daß keine bakterielle Kontamination von außen in die Platte stattfinden kann. Vorsprünge 12, die im selben Kanal 24 des Behälters 20 inkubiert wurden, sollten jeweils mit einem unterschiedlichen antimikrobiellen Reagens behandelt werden. Auf diese Weise lassen sich konsistente Ergebnisse erhalten, da die Wachstumsbedingungen in jedem einzelnen Kanal entlang dem gesamten Kanal und dadurch für jeden in diesem Kanal abgehängten Vorsprung 12 sehr ähnlich sind. Dies hilft, die Zuverlässigkeit der Behandlung unterschiedlicher Vorsprünge 12 mit unterschiedlichen antimikrobiellen Reagenzien zu verbessern.
Außerdem ist für den Schritt des Inkubierens des Biofilms nach Behandlung mit einem antimikrobiellen Reagens eine herkömmliche Abdeckung (nicht gezeigt) erforderlich, die aus dem gleichen Kunststoff wie die 96er Platte 40 hergestellt ist, um Kontamination der 96er Platte 40 während der Inkubation zu verhindern und um ein sehr niedriges Profil mit der Platte 40 zu bilden, damit die abgedeckte Platte für standardmäßige ELISA-Plattenleser zugänglich ist. Für jede Be stimmung sind zwei 96er Platten 40 und Plattenabdeckungen notwendig, um die traditionelle minimale Hemmkonzentration (MIC) und die minimale Biofilmeliminierungskonzentration (MBEC) zu liefern.
Verfahrensablauf
Für jeden Organismus sollte eine Biofilm-Wachstumskurve bestimmt werden, um zu gewährleisten, daß der Biofilm eine zufriedenstellende Proportion erreicht hat, um auf Antibiotika-/Biozidempfindlichkeit getestet zu werden.
Tag 1 – Ausgewählte Bakterien in einem geeigneten Wachstumsmedium, das tryptische Sojanährlösung bzw. -brühe (TSB) sein kann, unter Schütteln bei einer geeigneten Inkubationstemperatur unter optimaler Sauerstoffspannung übernacht inkubieren. In jedem Inkubationsfall, der in dieser Patentoffenbarung beschrieben ist, kann die Temperatur 37°C betragen.
Tag 2 – Behälter 20 des Biofilm-Bestimmungsgerätesystems mit 20 ml einer 2%igen Übernachtkultur füllen, die in frischem Wachstumsmedium (z. B. TSB) suspendiert ist; mit vorsprungbedecktem Deckel 10 abdecken und auf einer Schaukelplattform (Bellco Rocker Platform) z. B. bei Einstellung 3 in einem 37°C-Inkubator inkubieren. Zwei Vorsprünge je Stunde aseptisch entfernen, beginnend bei Stunde 2 der Wachstumskurve und für weitere 7 Stunden. Jeder Vorsprung wird durch vorsichtiges Eintauchen in sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann in 1 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung gegeben und 5 min mit einem Ultraschallreiniger DoALL mit 21 kc beschallt, um den Biofilm zu lösen. Das Sonikat wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung reihenverdünnt (10^–1 bis 10^–6) und tüpfelbeprobt, um die Biofilmzählung zu bestimmen.
Tag 3 – Platten werden gezählt, um die Besiedelungsgeschwindigkeit zu bestimmen und die Inkubationszeit zu berechnen, die zum Erreichen eines Biofilms mit etwa 10⁵ koloniebildenden Einheiten (CFU)/Vorsprung erforderlich ist, was eine optimale Biofilmdicke zur Messung der Abtötung durch Antibiotika/Biozide ist.
MBEC-Bestimmung
Tag 1 – Wachstumsmedium (z. B. TSB) mit Bakterien beimpfen und übernacht z. B. bei 37°C unter Schütteln züchten.
Tag 2: (1) 20 ml einer 2%igen Übernachtkultur, die in frischem Wachstumsmedium (z. B. TSB) verdünnt ist, in den Behälter 20 des Biofilm-Bestimmungsgerätesystems geben, mit dem Biofilmdeckel 10 abdecken und auf der Schaukelplattform 30 z. B. bei 37°C für die Zeit inkubieren, die zum Erreichen eines Biofilms von etwa 10⁵ CFU je Vorsprung 12 erforderlich ist. Strömungsrichtungsänderung von flüssigem Wachstumsmedium, hervorgerufen durch das Schaukeln des Kipptischs 30, verstärkt das Wachstum eines Biofilms.

(2) Während der Biofilm inkubiert, in einer sterilen Haube Antibiotika-Stammlösungen mit 5 mg/ml in sterilem doppelt destilliertem Wasser (ddw) oder Biozid nach Herstelleranweisungen vorbereiten und Antibiotika-/Biozidverdünnungen in Wachstumsmedium (z. B. TSB) in einer 96er Platte vorbereiten. Bis zu acht unterschiedliche Antibiotika oder Biozide können mit Hilfe einer Reihe (A bis H) für jedes antimikrobielle Reagens getestet werden. Die Platten werden wie folgt präpariert:
Reihen A bis H enthalten jeweils ein spezifisches Antibiotikum/Biozid. Vertiefungen in jeder Reihe erhalten unterschiedliche Konzentrationen von antimikrobiellem Reagens wie folgt:

Vertiefung Nr. 1	TSB kein Antibiotikum
Vertiefung Nr. 2	TSB plus 1 mg/ml Antibiotikum
Vertiefung Nr. 3	TSB plus 2^–2 mg/ml Antibiotikum
Vertiefung Nr. 4	TSB plus 2^–3 mg/ml Antibiotikum
Vertiefung Nr. 5	TSB plus 2^–4 mg/mlAntibiotikum
Vertiefung Nr. 6	TSB plus 2^–5 mg/mlAntibiotikum
Vertiefung Nr. 7	TSB plus 2^–6 mg/mlAntibiotikum
Vertiefung Nr. 8	TSB plus 2^–7 mg/mlAntibiotikum
Vertiefung Nr. 9	TSB plus 2^–8 mg/mlAntibiotikum
Vertiefung Nr. 10	TSB plus 2^–9 mg/mlAntibiotikum
Vertiefung Nr. 11	TSB plus 2^–10 mg/mlAntibiotikum
Vertiefung Nr. 12	TSB plus 2^–11 mg/mlAntibiotikum

(3) Nach der Inkubationsperiode zwei Vorsprünge 12 (von einer Fläche des Deckels 10, die in der Antibiotikabestimmung nicht verwendet wird, d. h. einer unbenutzten Reihe) abbrechen, in PBS spülen und beschallen, verdünnen und auf Platten tüpfeln, um die Anfangsbiofilmkonzentration zu bestimmen (genau wie bei der Wachstumskurve). Die übrigen Vorsprünge in PBS mit Hilfe eines Rinnenbehälters 20 spülen und die besiedelten Vorsprünge in die 96er Antibiotikaplatte geben und übernacht bei 37°C inkubieren.
Tag 3: Je nach der Technologie, die zum Bestimmen des inkubierten und behandelten Biofilms zum Einsatz kommt, kann der Biofilm an Ort und Stelle ohne Lösen bestimmt oder kann von den Vorsprüngen gelöst und dann bestimmt oder kann gelöst, weiter inkubiert und danach bestimmt werden. Die folgenden Schritte zeigen ein Beispiel, in dem der Biofilm gelöst, inkubiert und bestimmt wird.

(1) In einer sterilen Haube den Biofilmdeckel 10 von der 96er Antibiotikaplatte entfernen (Platte nicht entsorgen), die Vorsprünge in einer sterile PBS enthaltenden 96er Platte spülen, dann den Deckel 10 in eine frische 96er Platte geben, die frische TSB enthält (0,25 ml je Vertiefung), und den gesamten Biofilmdeckel 10 beschallen, um die überlebenden Biofilmbakterien zu lösen, wobei der Biofilm von jedem einzelnen Vorsprung 12 in eine separate Vertiefung der 96er Platte gelöst wird. Wiederum in der Haube den Biofilmdeckel 10 entfernen und durch eine flache Abdeckung ersetzen.
(2) Die Antibiotikaplatte bei 490 nm auf Anzeige von überlebendem Plankton messen oder ein anderes Verfahren, z. B. ein im Stand der Technik bekanntes, zur Bestimmung von überlebendem Plankton verwenden.
(3) Von der frisch beschallten Platte 0,02 ml des Mediums aus jeder Vertiefung entnehmen und Platte sauber betüpfeln; und 0,025 ml aus jeder Vertiefung, um eine Reihenverdünnung (10^–1 bis 10^–6) herzustellen, und Platte mit 0,02 ml betüpfeln (Verdünnungen können in Mikrotiterplatten erfolgen, eine für jedes Antibiotikum). Die das restliche Medium und Bakterien enthaltende Platte bei 37°C übernacht inkubieren lassen.

Tag 4: Sessile Überlebensrate bestimmen, z. B. durch Ablesen der übernacht inkubierten Platte bei 490 nm oder durch Zählen der Kolonien auf den Platten, um die Ist-Anzahl überlebender Bakterien zu bestimmen, oder durch ein anderes technisch bekanntes Verfahren.
Zum Zählen der Bakterien können mehrere unterschiedliche herkömmliche Verfahren zum Einsatz kommen. Dies kann geschehen durch Inkubieren der beschallten Bakterien, Reihenverdünnen und visuelles Zählen der koloniebildenden Einheiten, oder es können automatisierte Verfahren verwendet werden, z. B. mit Hilfe eines optischen Lesers, um die optische Dichte zu bestimmen. Festgestellt wurde aber, daß der optische Trübungsleser zur praktischen Anwendung zu ungenau ist, und bevorzugt ist die Anwendung von Vitalfarbstofftechnologie zum Automatisieren der Lebensfähigkeitsmessung durch Behandeln des Biofilms mit einem Vitalfarbstoff und Messen der vom gefärbten Biofilm abgegebenen Lichtstärke. Bei Verwendung von Vitalfarbstofftechnologie braucht der Biofilm nicht weiter inkubiert zu werden. In einer weiteren Ausführungsform läßt sich die Bestimmung durchführen durch Beschallen der Zellen, bis sie lysieren und ATP freisetzen, und anschließendes Zugeben von Luciferase, um eine mechanisch lesbare Lichtausgabe zu erzeugen. In noch einer weiteren Ausführungsform kann die Bestimmung direkt am Biofilm auf den Vorsprüngen mittels eines konfokalen Mikroskops durchgeführt werden, obwohl berücksichtigt werden sollte, daß dies schwer zu automatisieren ist. In den nachfolgenden Beispielen werden die Ergebnisse anhand einer manuellen Zählung nach Reihenverdünnung erhalten. Beispiele sind so gegeben, daß sie einen Vergleich zwischen Zählungen von Planktonbakterien und Zählungen von sessilen Bakterien für die gleichen Wachstumsbedingungen zeigen.
Beispiel 1
Tabelle 1 zeigt die Inkubationsergebnisse von Staphylococcus-epidermis-Biofilm auf Vorsprüngen 12 in Kanälen 24 bei Schaukeln des Behälters 20, gefolgt von Behandlung mit Antibiotika A (Ancef, Cefazolin), B (Orbenin-2000, Cloxacillin), C (Primaxin, Imipenem und Cilastatin), D (Vancomycin), E (Dalacin, Clindamycin) und F (Tazadine, Ceftazidin) in Verdopp lungsverdünnungen. Das Antibiotikum wurde auf die Vertiefungen 2 bis 12 in den Reihen A bis F einer 96er Platte wie folgt aufgebracht: Vertiefung 2: kein Antibiotikum, Vertiefung 3: 1000 μg/ml, Vertiefung 4: 500 μg/ml ... Vertiefung 12: 2 μg/ml. In Tabelle 1 sind Ergebnisse im Hinblick auf CFU/Vorsprung anhand einer manuellen Ablesung angegeben.
TABELLE 1
Tabelle 2 zeigt die optischen Dichtewerte der Trübung des gleichen Staphylococcus-epidermis-Biofilms, der auf die gleiche Weise wie die Proben von Tabelle 1 behandelt wurde, um einen Vergleich zwischen den manuell gezählten CFU und der automatisierten Ablesung zu zeigen.
TABELLE 2
Tabelle 3 zeigt die optischen Dichtewerte der Trübung von Staphylococcus-epidermis-Planktonbakterien, die unter den gleichen Bedingungen wie für die Ergebnisse gemäß Tabelle 1 inkubiert und mit antimikrobiellem Reagens behandelt wurden. Diese Tabelle zeigt deutlich, wie die Bestimmung von Planktonbakterien vielfach eine geringere Zählung als die Bestimmung sessiler Bakterien liefert, die unter den gleichen Bedingungen inkubiert und behandelt wurden.
TABELLE 3
Beispiel 2
Tabelle 4 zeigt die Inkubationsergebnisse von Staphylococcus-aureus-Biofilm auf Vorsprüngen 12 in Kanälen 24 bei Schaukeln des Behälters 20, gefolgt von Behandlung mit Antibiotika A (Ancef, Cefazolin), B (Orbenin-2000, Cloxacillin), C (Primaxin, Imipenem und Cilastatin), D (Vancomycin), E (Dalacin, Clindamycin), F (Tazadine, Ceftazidin) und G (Ciprofloxacin) in Verdopplungsverdünnungen. Das Antibiotikum wurde auf die Vertiefungen 2 bis 12 in den Reihen A bis G einer 96er Platte wie folgt aufgebracht: Vertiefung 2: kein Antibiotikum, Vertiefung 3: 1000 μg/ml, Vertiefung 4: 500 μg/ml ... Vertiefung 12: 2 μg/ml.
TABELLE 4
Tabelle 5 zeigt die optischen Dichtewerte der Trübung des gleichen Staphylococcus-aureus-Biofilms, der auf die gleiche Weise wie die Proben von Tabelle 4 behandelt wurde, um einen Vergleich zwischen den manuell gezählten CFU und der automatisierten Ablesung zu zeigen.
TABELLE 5
Tabelle 6 zeigt die optischen Dichtewerte der Trübung von Staphylococcus-aureus-Planktonbakterien, die unter den gleichen Bedingungen wie für die Ergebnisse gemäß Tabelle 4 inkubiert und mit antimikrobiellem Reagens behandelt wurden.
Diese Tabelle zeigt deutlich, wie die Bestimmung von Planktonbakterien vielfach eine geringere Zählung als die Bestimmung sessiler Bakterien liefert, die unter den gleichen Bedingungen inkubiert und behandelt wurden.
TABELLE 6
Beispiel 3
Tabelle 7 zeigt die Inkubationsergebnisse von Escherichia-coli-Biofilm auf Vorsprüngen 12 in Kanälen 24 bei Schaukeln des Behälters 20, gefolgt von Behandlung mit Antibiotika A (Ticarcillin, Sigma T-5639), B (Carbenicillin, Sigma C-1389), C (Tobramycin, Sigma T-4014), D (Gentamicinsulphat, Sigma G-3632), E (Ampicillin, Sigma A-9518), F (Tazadine, Ceftazidim), G (Primaxin, Imipenem und Cilastatin) und H (Ciprofloxacin) in Verdoppelungsverdünnungen. Gestartet wurden die Escherichia coli mit einem Inokulum von 2% Übernachtwachstum in frischer TSB. 20 ml wurden in das Hauptbecken des Behälters 20 (Kanäle 2 bis 12) mit 1,5 ml im Kanal 1 gegeben, um für eine Beprobung der Anfangsbesiedlung auf den Vorsprüngen der ersten Reihe zu sorgen. Die Anfangsbiofilmbesiedlung erfolgte vier Stunden lang. Das Antibiotikum wurde auf die Vertiefungen 2 bis 12 in den Reihen A bis H einer 96er Platte wie folgt aufgebracht: Vertiefung 2: kein Antibiotikum, Vertiefung 3: 1000 μg/ml, Vertiefung 4: 500 μg/ml ... Vertiefung 12: 2 μg/ml. 250 μl Endvolumen von verdünntem Antibiotikum wurde auf die Vertiefungen aufgebracht.
TABELLE 7
Tabelle 8 zeigt die optischen Dichtewerte der Trübung des gleichen Escherichia-coli-Biofilms, der auf die gleiche Weise wie die Proben von Tabelle 7 behandelt wurde, um einen Vergleich zwischen den manuell gezählten CFU und der automatisierten Ablesung zu zeigen.
TABELLE 8
Tabelle 9 zeigt die optischen Dichtewerte der Trübung von Escherichia-coli-Planktonbakterien, die unter den gleichen Bedingungen wie für die Ergebnisse gemäß Tabelle 7 inkubiert und mit antimikrobiellem Reagens behandelt wurden. Diese Tabelle zeigt deutlich, wie die Bestimmung von Planktonbakterien vielfach eine geringere Zählung als die Bestimmung sessiler Bakterien liefert, die unter den gleichen Bedingungen inkubiert und behandelt wurden.
TABELLE 9
Die Konzentration (MBEC) von antimikrobiellem Reagens, bei der die Überlebensrate von Bakterien auf null fällt, läßt sich anhand der Bestimmung leicht bewerten. Gleichermaßen kann auch die MIC aus dem Assay bestimmt werden.
Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß sich in einigen Fällen kein Biofilm ohne Einschluß von Wirtskomponenten im Biofilm bildet. Daher können Wirtskomponenten dem Wachstumsmedium im Behälter während der Inkubation der Bakterien oder anderen biofilmbildenden Organismen zugegeben werden, um den Biofilm zu bilden. Zu Wirtskomponenten, die zugegeben werden können, gehören Serumprotein und Zellen aus einem Wirtsorganismus. Für die Testung der Wirkung unterschiedlicher Wirtszellen und -komponenten können die Enden 25 der Kanäle 24 durch Wände abgedichtet sein, um Wachstumsmedium in einem Kanal daran zu hindern, in einen anderen zu strömen, was das Biofilmwachstum in jedem Kanal von anderen Kanälen isoliert.
Die so beschriebene Vorrichtung kann auch verwendet werden, um Beschichtungen zu testen, die zum Hemmen von Biofilmwachstum verwendet werden, und um Beschichtungen zu testen, die Biofilmbildung verstärken können. In einem Anfangsschritt können die Vorsprünge 12 mit einer zu testenden Beschichtung beschichtet und dann der Biofilm auf den Vorsprüngen gezüchtet werden. Anschließend kann der Biofilm bestimmt oder mit antimikrobiellem Reagens behandelt und dann bestimmt werden. Die Bestimmung kann in situ oder nach Lösen des Biofilms erfolgen. Unterschiedliche Beschichtungen können auf unterschiedlichen Stiftreihen getestet werden. Verstärkte Biofilmbildung kann dazu dienen, größere lebensfähige Biofilme zur Biofermentation unter variierenden Wachstumsbedingungen an unterschiedlichen Stellen zu erzeugen. In diesem Fall ist der Bestimmungsschritt nicht erforderlich, außer zur bedarfsweisen Bestimmung des Fermentationsprodukts, und der Biofilm wird in den Vertiefungen z. B. einer 96er Platte als Mikroreaktorbehälter inkubiert. Im allgemeinen kann das offenbarte Biofilminkubationssystem immer dann verwendet werden, wenn schnelles und gleichmäßiges Biofilmwachstum an mehreren Stellen erwünscht ist.
Während die bevorzugte Technik darin besteht, Strömung des flüssigen Wachstumsmediums umzukehren, könnte die Anordnung eine in einer Richtung verlaufende Flüssigkeitsströmung mit Flüssigkeitsrückführung von einem Ende jedes Kanals zum anderen Ende desselben Kanals haben, was aber die Anordnung kompliziert macht.
Das Verfahren der Erfindung kann verwendet werden, potentielle antimikrobielle Kandidaten auf Wirksamkeit zu screenen. Nach Inkubation des Biofilms kann jede Biofilmhaftstelle mit einem unterschiedlichen antimikrobiellen Reagens oder einer unterschiedlichen Kombination antimikrobieller Reagenzien behandelt werden. Zum Beispiel können die unterschiedlichen Reagenzien Modifikationen eines einzelnen Reagens sein, die z. B. in der rekombinatorischen Entwicklung von Antibiotika erzeugt werden. In einer Platte mit 340 Stiften können 340 unterschiedliche Kombinationen antimikrobieller Reagenzien getestet werden.

Claims

Verfahren zum Züchten eines Biofilms, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Inkubieren biofilmbildender Organismen auf mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A), die in mehreren Reihen (14) mit mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A) in jeder Reihe angeordnet sind, während eine Strömung von flüssigem Wachstumsmedium über jede der mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A) bereitgestellt wird, um dadurch einen Biofilm an jeder der mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A) zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner mit dem Schritt des Bestimmens des Biofilms an den mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A), um eine Charakteristik des Biofilms zu analysieren.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Bereitstellen einer Strömung von flüssigem Wachstumsmedium den Schritt des Hin- und Herströmenlassens von flüssigem Wachstumsmedium entlang von gleichmäßigen Kanälen (24) eines Behälters (20) aufweist, um einen gleichmäßigen Biofilm an jeder Biofilmhaftstelle (12, 12A) zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Charakteristik des Biofilms die Empfindlichkeit des Biofilms gegenüber antimikrobiellem Reagens ist und das Verfahren vor dem Bestimmen des Biofilms ferner den Schritt des Behandelns der Biofilmhaftstellen (12, 12A) mit antimikrobiellem Reagens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, ferner mit dem folgenden Schritt: nach Behandeln der Biofilmhaftstellen (12, 12A) mit antimikrobiellem Reagens erfolgendes Lösen des Biofilms von den Biofilmhaftstellen (12, 12A) vor Bestimmen des Biofilms.
Verfahren nach Anspruch 5, ferner mit dem Schritt des nach Lösen des Biofilms erfolgenden weiteren Inkubierens des Biofilms.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Lösen des Biofilms von den Biofilmhaftstellen (12, 12A) den folgenden Schritt aufweist: Lösen des Biofilms von jeder Biofilmhaftstelle (12, 12A) in eine separate Vertiefung (42) einer Platte (40) mit Vertiefungen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Biofilmhaftstellen (12, 12A) in Reihen (14) ausgebildet sind.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Behandeln der Biofilmhaftstellen (12, 12A) mit einem antimikrobiellen Reagens den Schritt des Behandelns jeder Reihe (14) von Biofilmhaftstellen (12, 12A) mit einem unterschiedlichen antimikrobiellen Reagens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 9, ferner mit dem folgenden Schritt: Behandeln jeder Biofilmhaftstelle (12, 12A) in einer Reihe (14) mit einer unterschiedlichen Konzentration von antimikrobiellem Reagens.
Verfahren nach Anspruch 1, 4, 9 oder 10, wobei die Strömungsrichtung des flüssigen Wachstumsmediums wiederholt umgekehrt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 11, wobei das flüssige Wachstumsmedium in Kanälen (24) eines Behälters (20) strömt und die Strömungsrichtung des flüssigen Wachstumsmediums durch Schaukeln des Behälters (20) umgekehrt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Biofilmhaftstellen (12, 12A) Vorsprünge von einem Deckel (10) sind und das Inkubieren des Biofilms den folgenden Schritt aufweist: Herabhängenlassen der Vorsprünge (12, 12A) in flüssigem Wachstumsmedium in den Kanälen (24) unter Schaukeln des Behälters (20), um für Scherkräfte auf dem Biofilm während des Wachstums des Biofilms zu sorgen.
Verfahren nach Anspruch 2, ferner mit dem Schritt des Behandelns jeder der Biofilmhaftstellen (12, 12A) mit einer unterschiedlichen Konzentration von antimikrobiellem Reagens.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 14, ferner mit dem folgenden Schritt: vor Inkubieren biofilmbildender Organismen auf mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A) erfolgendes Auftragen einer biofilmbeständigen Beschichtung auf die mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A).
Verfahren nach Anspruch 15, ferner mit dem Schritt des Auftragens unterschiedlicher Beschichtungen auf unterschiedliche Biofilmhaftstellen (12, 12A).
Verfahren nach Anspruch 1, ferner mit dem folgenden Schritt: Inkubieren der biofilmbildenden Organismen in Gegenwart von Wirtsmaterial im flüssigen Wachstumsmedium.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner mit dem folgenden Schritt: nach anfänglichem Inkubieren der biofilmbil denden Organismen auf mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A), um einen Biofilm zu erzeugen, erfolgendes anschließendes Inkubieren der biofilmbildenden Organismen in separaten Mikroreaktoren.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei unterschiedliche Biofilmhaftstellen (12, 12A) mit unterschiedlichen antimikrobiellen Reagenzien behandelt werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Bestimmen des Biofilms den folgenden Schritt aufweist: Auftragen eines Vitalfarbstoffs auf den Biofilm und automatisches Messen der durch den gefärbten Biofilm abgegebenen Lichtstärke.
Vorrichtung zum Analysieren von Biofilmen, wobei die Vorrichtung aufweist: einen Behälter (20) mit mindestens einem Kanal (24) zur Strömung von flüssigem Wachstumsmedium; mehrere Biofilmhaftstellen (12, 12A) mit einer Stütze zum Stützen der mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A) im Kanal (24); und eine Einrichtung (30) zum Strömenlassen von flüssigem Wachstumsmedium entlang jedem Kanal (24) in unterschiedlichen Richtungen über die mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A).
Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei: die mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A) in mehreren Reihen (14) mit mehr als einer Biofilmhaftstelle (12, 12A) in jeder Reihe (14) ausgebildet sind; der Behälter (20) mehrere Kanäle (24) mit im wesentlichen der gleichen Form aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 21, ferner mit: einer Einrichtung, um Kontamination des Inneren des Behälters (20) während der Inkubation zu vermeiden.
Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei jeder Kanal (24) im wesentlichen die gleiche Form hat.
Vorrichtung nach Anspruch 22 oder 24, wobei jede Biofilmhaftstelle (12, 12A) im wesentlichen die gleiche Form hat.
Vorrichtung nach Anspruch 25, ferner mit: einer Einrichtung, um flüssiges Wachstumsmedium entlang jedem Kanal (24) über mehrere Biofilmhaftstellen (12, 12A) strömen zu lassen, die im Kanal (24) abgestützt sind.
Vorrichtung nach Anspruch 25 oder 26, wobei: die Stütze für die mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A) einen Deckel (10) für den Behälter (20) bildet.
Vorrichtung nach Anspruch 27, wobei die mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A) Vorsprünge vom Deckel (10) sind.
Vorrichtung nach Anspruch 21, 22, 25 oder 26, wobei die Einrichtung, um flüssiges Wachstumsmedium über die mehreren Biofilmhaftstellen (12, 12A) strömen zu lassen, ein Kipptisch (30) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das flüssige Wachstumsmedium in mehreren Kanälen (24) strömt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 und 30, wobei jeder der Biofilme äquivalent ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 und 30, ferner mit dem Schritt der Zugabe von Wirtskomponenten zum Wachstumsmedium im Behälter während der Inkubation der Bakterien oder anderen biofilmbildenden Organismen, um den Biofilm zu bilden, wobei die Wirtskomponente ein Serumprotein oder eine Zelle aus einem Wirtsorganismus aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, wobei die Biofilmhaftstellen (12, 12A) Vorsprünge sind, die sich in die mehreren Kanäle (24) erstrecken.
Vorrichtung nach Anspruch 21, ferner mit: einem Deckel (10), der eine Abdeckung für den Behälter (20) bildet, wobei der Deckel (10) mehrere Vorsprünge aufweist, die Biofilmhaftstellen (12, 12A) bilden, die so angeordnet sind, daß sie in den mehreren Kanälen (24) aufgenommen werden.
Vorrichtung nach Anspruch 34, ferner mit einem Kipptisch (30) für den Behälter (20), der bewirkt, daß das flüssige Wachstumsmedium in den Kanälen (24) strömt.
Vorrichtung nach Anspruch 34 oder 35, wobei die Vorsprünge (12, 12A) in mehreren Reihen angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 34 bis 36, wobei die mehreren Kanäle (24) im wesentlichen die gleiche Form haben.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 34 bis 37, wobei der Deckel (10) eine umgebende Lippe (16) aufweist, die sich dicht über eine umgebende Wand (28) des Behälters (20) zum Verhindern von Kontamination eines Innenabschnitts des Behälters (20) aufpaßt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 34 bis 38, ferner mit einer Beschichtung auf den mehreren Vorsprüngen (12, 12A).
Vorrichtung nach Anspruch 39, wobei die Beschichtung Biofilmwachstum hemmt oder verstärkt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 und 30 bis 33, ferner mit den folgenden Schritten: Bereitstellen eines Behälters (20) mit mehreren Kanälen (24) und eines Deckels (10) des Behälters (20), der mehrere vorstehende Biofilmhaftstellen (12, 12A) hat; und Bereitstellen eines strömenden flüssigen Wachstumsmediums in den Kanälen (24) des Behälters (20).
Verfahren nach Anspruch 41, wobei das flüssige Wachstumsmedium veranlaßt wird zu strömen, indem der Behälter (20) auf einem Kipptisch (30) plaziert wird.
Verfahren nach Anspruch 41 oder 42, ferner mit einem Schritt des Lösens des Biofilms von den Biofilmhaftstellen (12, 12A).
Verfahren nach einem der Ansprüche 41 bis 43, wobei die vorstehenden Biofilmhaftstellen (12, 12A) Vorsprünge sind, die im flüssigen Wachstumsmedium in den Kanälen (24) abgehängt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, 30 bis 33 und 41 bis 44, ferner mit den folgenden Schritten: In-Kontakt-bringen der Biofilme mit mindestens einem antimikrobiellen Agens; und Bestimmen der Empfindlichkeit der Biofilme gegenüber den antimikrobiellen Agenzien.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Biofilme durch ein Verfahren mit den folgenden Schritten gebildet werden: Bereitstellen eines Behälters (20) mit einem Deckel (10) des Behälters (20), der mehrere vorstehende Biofilmhaftstellen (12, 12A) hat, und Bereitstellen eines strömenden flüssigen Wachstumsmediums, wobei das flüssige Wachstumsmedium in mehreren Kanälen (24) im Behälter (20) strömt; und Inkubieren von Bakterien auf den Biofilmhaftstellen (12, 12A) unter Strömenlassen des flüssigen Wachstumsmediums über die Biofilmhaftstellen (12, 12A).
Verfahren nach Anspruch 45 oder 46, ferner mit einem Schritt des Lösens der Biofilme von den Biofilmhaftstellen (12, 12A) vor dem Bestimmen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 47, wobei der Bestimmungsschritt an Biofilmen auf den Biofilmhaftstellen (12, 12A) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 48, wobei mehrere identische Biofilme gebildet werden und mindestens einer der Biofilme mit einem unterschiedlichen antimikrobiellen Agens oder einer unterschiedlichen Konzentration von antimikrobiellem Agens als der andere der Biofilme in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 49, wobei jeder der Biofilme mit einem unterschiedlichen antimikrobiellem Agens oder einer unterschiedlichen Konzentration von antimikrobiellem Agens in Kontakt gebracht wird.