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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Zusammensetzungen
und Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen von
Hohlorganen („body
passageways") und
spezieller auf Zusammensetzungen, die therapeutische Agenzien umfassen,
die an die äußeren Wände von
Hohlorganen abgegeben werden können.
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Hintergrund der Erfindung
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Es
gibt viele Hohlorgane im Körper,
die den Durchfluss essentieller Stoffe ermöglichen. Diese schließen zum
Beispiel Arterien und Venen, die Speiseröhre, Magen, Dünn- und
Dickdarm, Gallenwege, Harnleiter, Blase, Harnröhre, nasale Passagewege, Luftröhre und
andere Luftwege und den männlichen
und weiblichen Genitaltrakt ein. Eine Verletzung, verschiedene chirurgische
Behandlungsmethoden oder eine Erkrankung können zur Verengung, Schwächung und/oder
Verlegung solcher Hohlorgane führen,
was gravierende Komplikationen und/oder auch den Tod zur Folge hat.
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Zum
Beispiel können
viele Arten von Tumoren (sowohl gutartige als auch bösartige)
zur Schädigung der
Wand eines Hohlorgans oder zur Verlegung des Lumens führen und
damit den Durchfluss von Stoffen durch das Hohlorgan verlangsamen
oder verhindern. Es wurde geschätzt,
dass es allein im Jahr 1996 in den Vereinigten Staaten über 11.200
Todesfälle
aufgrund von Speiseröhrenkrebs
geben würde, über 51.000
Todesfälle
aufgrund von Dick- und Dünndarmkrebs
und nahezu 17.000 Todesfälle
aufgrund von Enddarmkrebs. Verlegungen von Hohlorganen, die von
Krebs befallen sind, sind nicht nur an sich lebensbedrohlich, sie schränken auch
die Lebensqualität
des Patienten ein.
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Die
primäre
Therapie für
die Mehrzahl der Tumore, die eine neoplastische Verlegung verursachen,
besteht in der chirurgischen Entfernung und/oder der Chemotherapie,
der Strahlentherapie oder der Lasertherapie. Unglücklicherweise
ist ein Tumor zu dem Zeitpunkt, an dem er eine Verlegung eines Hohlorgans
verursacht, häufig
inoperabel und wird im Allgemeinen nicht auf traditionelle Therapien
ansprechen. Ein Versuch zur Lö sung
dieses Problems bestand darin, endoluminale Stents einzusetzen.
In Kürze
sind Stents Vorrichtungen, die in das Lumen eines Hohlorgans eingebracht
werden, um ein Hohlorgan, das durch einen Tumor oder andere Gewebe
oder Substanzen blockiert wurde, physikalisch offen zu halten. Typische
Beispiele von häufig eingesetzten
Stents schließen
den Wallstent, Stecker-Stent, Gianturco-Stent und Palmaz-Stent ein
(siehe z.B. U.S. Patente Nr. 5.102.417, 5.195.984, 5.176.626, 5.147.370,
5.141.516, 4.776.337). Ein erheblicher Nachteil bei der Verwendung
von Stents bei neoplastischer Blockierung ist jedoch, dass der Tumor
oft durch die Zwischenräume
des Stents in das Lumen hinein wachsen kann. Zusätzlich kann die Anwesenheit
eines Stents im Lumen das Einwachsen von reaktivem oder inflammatorischem
Gewebe (z.B. Blutgefäße, Fibroblasten
oder weiße
Blutkörperchen)
auf die Oberfläche
des Stents hervorrufen. Wenn dieses Einwachsen (bestehend aus Tumorzellen
und/oder inflammatorischen Zellen) die innere Oberfläche des
Stents erreicht und das Lumen beeinträchtigt, ist eine erneute Blockierung
des Hohlorgans, zu dessen Korrektur der Stent eingesetzt wurde,
das Ergebnis.
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Andere
Erkrankungen, die, obwohl sie nicht neoplastisch sind, dennoch eine
Proliferation mit sich bringen, können gleichermaßen Hohlorgane
blockieren. Zum Beispiel ist die Verengung der prostatischen Harnröhre aufgrund
einer benignen Prostatahyperplasie ein ernstes Problem, das 60%
aller Männer,
die älter
als 60 Jahre sind, betrifft und 100% aller Männer, die älter als 80 Jahre sind. Die
derzeitigen pharmakologischen Therapien wie zum Beispiel 5-Alphareduktase-Hemmer
(z.B. Finasterid) oder alphaadrenerge Blocker (z.B. Terazosin) sind
im Allgemeinen nur bei einer begrenzten Patientenpopulation wirksam.
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Darüber hinaus
resultieren aus den chirurgischen Verfahren, die durchgeführt werden
können
(z.B. transurethrale Resektion der Prostata (TURP), offene Prostatektomie
oder endo-urologische Verfahren wie zum Beispiel Laser-Prostatektomie,
Verwendung von Mikrowellen, Hypothermie, Kryochirurgie oder Stent-Implantation),
typischerweise zahlreiche Komplikationen wie zum Beispiel Blutung,
Infektion, Inkontinenz, Impotenz und rezidivierende Erkrankung.
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Zusätzlich zu
neoplastischen oder proliferativen Erkrankungen können andere
Krankheiten wie zum Beispiel eine Gefäßerkrankung zur Verengung,
Schwächung
und/oder Verlegung von Hohlorganen führen. Nach Schätzungen
von 1993 (Quelle: Homepage der U.S. Heart and Stroke Foundation)
hatten über
60 Millionen Amerikaner eine oder mehrere Formen einer Herzkreislauferkrankung.
Im selben Jahr forderten diese Krankheiten 954.138 Menschenleben
(41% aller Todesfälle
in den Vereinigten Staaten).
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Die
Ballonangioplastie (mit oder ohne Stent-Implantation) ist eine der
am verbreitetsten eingesetzten Behandlungsmethoden für eine Gefäßerkrankung;
es sind auch andere Optionen wie zum Beispiel die Laser-Angioplastie
verfügbar.
Obwohl dies in vielen Fällen
einer gravierenden Gefäßverengung
die Therapie der Wahl ist, hat etwa ein Drittel der Patienten, die
sich einer Ballonangioplastie unterziehen (Quelle: Homepage der
Heart and Stroke Foundation), eine erneute Verengung (Restenose)
der behandelten Arterien innerhalb von 6 Monaten nach der ursprünglichen
Maßnahme,
oft ernst genug, um weitere Interventionen erforderlich zu machen.
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Solche
Gefäßerkrankungen
(einschließlich
zum Beispiel Restenose) sind zumindest teilweise auf eine Verdickung
der Intima, bedingt durch die Einwanderung von glatten Gefäßmuskelzellen
(VSMC), die Proliferation der VSMC und die Ablagerung von extrazellulärer Matrix,
zurückzuführen. In
Kürze agiert
das Gefäßendothel
als eine nicht-thrombogene
Oberfläche, über die
das Blut gleichmäßig fließen kann,
und als eine Schranke, welche die Blutkomponenten von den Geweben,
die die Gefäßwand umfassen,
trennt. Endothelzellen setzen auch Heparinsulfat, Prostacyclin,
EDRF und andere Faktoren frei, welche die Adhäsion von Plättchen und weißen Blutkörperchen,
die Kontraktion der VSMC, das Einwandern von VSMC und die Proliferation von
VSCM hemmen. Jeglicher Verlust und jegliche Schädigung an Endothel, wie es
zum Beispiel bei einer Ballonangioplastie, Atherektomie oder Stent-Implantation
auftritt, kann zu einer Plättchen-Adhäsion, einer
Plättchen-Aggregation
und zur Thrombusbildung führen.
Aktivierte Plättchen
können
Substanzen freisetzen, die eine Vasokonstriktion auslösen (Serotonin
und Thromboxan) und/oder das Einwandern und die Proliferation von
VSMC fördern
(PDGF, epidermaler Wachstumsfaktor, TGF-β und Heparinase). Gewebsfaktoren, die
von den Arterien freigesetzt werden, stimulieren die Bildung von
Gerinnseln, was zu einer Fibrin-Matrix führt, in die glatte Muskelzellen
einwandern und proliferieren können.
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Diese
Kaskade von Ereignissen führt
zur Transformation von glatten Gefäßmuskelzellen von einem kontraktilen
zu einem sekretorischen Phänotyp.
Von Angioplastie verursachte Zelllyse und Matrixdestruktion führt zu einer
lokalen Freisetzung von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF),
der wiederum die VSMC-Proliferation direkt und indirekt durch die
Induktion der PDGF-Produktion stimuliert. VSMC-Proliferation wird
auch durch von Plättchen
freisetzten EGF und Insulin-Wachstumsfaktor 1 stimuliert.
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Glatte
Gefäßmuskelzellen
werden auch dazu angeregt, in die Media und Intima des Gefäßes einzuwandern.
Dies wird durch die Freisetzung und Aktivierung von Matrix-Metalloproteasen
ermöglicht,
die für
die VSMC einen Weg durch die extrazelluläre Matrix und die innere elastische
Schicht der Gefäßwand bahnen. Nach
dem Einwandern und der Proliferation lagern die glatten Gefäßmuskelzellen
dann eine extrazelluläre
Matrix ab, die aus Glykosaminoglykanen, Elastin und Kollagen besteht,
was den größten Teil
der Verdickung der Intima umfasst. Ein wesentlicher Teil des Prozesses
der Restenosierung kann auf eine Umgestaltung der Gefäßwand zurückzuführen sein,
die zu Änderungen
der Gesamtgröße der Arterie
führt,
wovon zumindest ein Teil durch die Proliferation innerhalb der Adventitia
(zusätzlich
zur Media) bedingt ist. Das Nettoergebnis dieser Abläufe ist
ein erneutes Auftreten der Verengung der Gefäßwand, die oft schwerwiegend
genug ist, um eine erneute Intervention zu erfordern.
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Zusammenfassend
wird nahezu jede energische Manipulation im Lumen eines Blutgefäßes seine
Endothelschicht beschädigen
oder denudieren. Somit bleiben Behandlungsoptionen für Gefäßerkrankungen selbst
und für
Restenosierungen nach therapeutischen Interventionen Probleme in
Hinblick auf die Langzeitergebnisse für solche Erkrankungen.
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Es
gibt zusätzlich
zu neoplastischen Obstruktionen und Gefäßerkrankungen auch etliche
akute und chronische entzündliche
Erkrankungen, die zur Verlegung von Körperpassagen führen. Diese
schließen
zum Beispiel Vaskulitis, Erkrankungen des Gastrointesti naltraktes
(z.B. Morbus Crohn, Colitis ulcerosa) und Erkrankungen der Atemwege
(z.B. Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung) ein.
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Jede
dieser Erkrankungen kann mit unterschiedlichen Erfolgsraten mit
Medikamenten wie zum Beispiel Entzündungshemmern oder Immunsuppressiva
behandelt werden. Derzeitige Behandlungsregime bewirken jedoch oft
keine Verlangsamung des Fortschreitens der Erkrankung und können zu
systemischen toxischen Effekten und unerwünschten Nebenwirkungen führen. Es
können
auch chirurgische Verfahren anstelle von oder zusätzlich zu
medikamentösen
Therapien eingesetzt werden. Solche chirurgischen Verfahren haben aber
eine hohe Rate von Lokalrezidiven aufgrund von Narbenbildung und
können
unter bestimmten Umständen
(z.B. durch die Verwendung von Ballonkathetern) zu einem gutartigen,
reaktiven übermäßigen Wachstum führen.
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Andere
Erkrankungen, die auch Hohlorgane verlegen können, schließen Infektionskrankheiten
ein. In Kürze
gibt es etliche akute und chronische infektiöse Prozesse, die zur Obstruktion
von Hohlorganen führen können, einschließlich zum
Beispiel Urethritis, Prostatitis und andere Erkrankungen des männlichen
Genitaltrakts, verschiedene Erkrankungen des weiblichen Genitaltrakts,
Zystitis und Urethritis (Erkrankungen des Harntrakts), chronische
Bronchitis, Tuberkulose und andere Infektionen durch Mykobakterien
und andere respiratorische Probleme und bestimmte kardiovaskuläre Erkrankungen.
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Solche
Erkrankungen werden derzeit entweder mit einer Vielzahl von verschiedenen
medikamentösen Therapien
und/oder mit chirurgischen Verfahren behandelt. Jedoch weisen, wie
oben erwähnt,
solche medikamentösen
Therapien die Problematik von assoziierten systemischen toxischen
Effekten auf, die zu unerwünschten
Nebenwirkungen führen
können.
Weiterhin können,
wie oben erwähnt,
chirurgische Verfahren aufgrund von Narbenbildung zu Lokalrezidiven
führen
und können
bei bestimmten Verfahren (z.B. Implantation kommerziell verfügbarer Stents)
ein gutartiges, reaktives, übermäßiges Wachstum
zur Folge haben.
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Die
vorhandenen Behandlungsmöglichkeiten
für die
obigen Krankheiten und Erkrankungen teilen zum größten Teil
dieselben Einschränkungen.
Die Verwendung therapeutischer Agenzien hat nicht zu einer Heilung dieser
Erkrankungen geführt
und immer, wenn eine Intervention zur Behandlung der Erkrankungen
eingesetzt wird, besteht für
den Patienten ein Risiko als Resultat der Reaktion des Körpers auf
die Intervention. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen
und Verfahren bereit, die zur Behandlung dieser oben im Allgemeinen
behandelten Erkrankungen und Krankheiten geeignet sind. Diese Zusammensetzungen
und Verfahren gehen auf die mit den vorhandenen Verfahren verbundenen
Probleme ein, bieten im Vergleich mit den vorhandenen Verfahren
wesentliche Vorteile und bieten zusätzlich weitere, ähnliche
Vorzüge.
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WOA/9319739
bezieht sich auf polymere Träger
für Medikamente.
USA/3797485 bezieht sich auf die Abgabe von Medikamenten in zirkulierendes
Blut.
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Reimer
Riessen et al., J Am Coll Cardiol. Vol. 23, Nr. 5, 1994 1234–1244 ist
eine Übersichtsarbeit über Mechanismen
der Abgabe von Medikamenten.
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WOA/9503036
bezieht sich auf die Verwendung von Paclitaxel zur Behandlung von
Restenosen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Paclitaxel
oder einem Analogon oder Derivat davon zur Herstellung eines Medikaments
zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen von Hohlorganen
oder von Erkrankungen, die mit der Verlegung oder Verengung von
Hohlorganen verbunden sind, wobei das Medikament an einen äußeren Teil
des besagten Hohlorgans abgegeben werden soll.
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Weitere
Ausführungsformen
der Erfindung werden in den Ansprüchen beschrieben.
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Die
Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen von Hohlorganen,
wofür die
Erfindung dienlich ist, umfassen den Schritt, den therapeutischen
Wirkstoff an die glatten Muskelzellen des besagten Hohlorgans über die
Adventitia abzugeben. In dem die therapeutische Verbindung lokal
an die Stelle der Erkrankung abgegeben wird, können systemische und unerwünschte Nebenwirkungen
vermieden werden und die Gesamtdosierungen können möglicherweise verringert werden.
Eine quadrantenweise oder ringförmige Abgabe
um das erkrankte Hohlorgan vermeidet auch viele der Nachteile einer
endoluminalen Manipulation, einschließlich einer Schädigung der
Endothelschicht des Gewebes. Zum Beispiel kann eine Schädigung des Endothels
zu einer Thrombose führen,
zu Änderungen
im laminaren Flussverhalten und/oder zu einer Fremdkörperreaktion
auf eine endoluminale Vorrichtung, von denen jede einzelne die Kaskade
der Restenosierung in Gang setzen kann. Im Falle einer Erkrankung
der Prostata kann die Vermeidung von Manipulationen mit Instrumenten
in der Harnröhre
die Wahrscheinlichkeit von Strikturen vermindern und Kontinenz und
Potenz erhalten.
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In
bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung können
die therapeutischen Wirkstoffe weiterhin ein Polymer umfassen, wie
zum Beispiel Poly(ethylenvinylacetat) (40% quervernetzt), Copolymere
von Milchsäure und
Glycolsäure,
Poly(caprolacton), Poly(milchsäure),
Copolymere von Poly(milchsäure)
und Poly(caprolacton), Gelatine, Hyaluronsäure, Kollagen-Matrices und
Albumin. Andere Träger
(z.B. Liposomen) können
gleichermaßen
dazu eingesetzt werden, einen oder mehrere therapeutische Wirkstoffe
aufzunehmen und/oder abzugeben.
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Die
therapeutischen Wirkstoffe können
eingesetzt werden, um eine Vielzahl von Krankheiten zu behandeln
oder zu verhindern, einschließlich
zum Beispiel Gefäßkrankheiten,
neoplastische Obstruktionen, Entzündungskrankheiten und infektiöse Erkrankungen.
Typische Hohlorgane, die behandelt werden können, schließen zum
Beispiel Arterien, die Speiseröhre,
den Magen, das Duodenum, den Dünndarm,
den Dickdarm, Gallenwege, den Harnleiter, die Blase, die Harnröhre, die
Prostata, Tränengänge, die
Luftröhre,
Bronchien, Bronchiolen, nasale Luftwege, Eustachische Röhren, den äußeren Gehörgang, Uterus
und Eileiter ein.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird der therapeutische Wirkstoff einer Arterie durch
direkte Injektion über
eine äußere Wand
der Arterie in die Adventitia zugeführt.
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Lediglich
zu Illustrationszwecken sind bestimmte Ausführungsformen, für die die
Erfindung von Nutzen ist, Verfahren zur Behandlung von Gefäßkrankheiten
(z.B. Stenose), von gastrointestinalen Erkrankungen, von Erkrankungen
des Urogenitaltrakts (z.B. benigne Prostatahyperplasie oder Prostatakrebs)
und von Lungenkrankheiten (spezifische Beispiele von allen oben
genannten werden unten ausführlich
behandelt) durch die Verabreichung von Paclitaxel oder Analoga oder
Derivaten davon auf Hohlorgane, die von der Erkrankung betroffen
sind.
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Diese
und andere Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung werden unter
Bezugnahme auf die folgende ausführliche
Beschreibung und die beigefügten
Abbildungen klar werden.
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Kurze Beschreibung der
Abbildungen
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1 ist
ein Diagramm, das die Auswirkung der Opsonierung polymerer Mikrosphären mit
Plasma auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (20 mg/ml
Mikrosphären
in 0,5 ml Zellen (Konzentration 5 × 106 Zellen/ml))
auf PCL-Mikrosphären
zeigt.
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2 ist
ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit Plasma
+/–2%
Pluronic F127 auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf PCL-Mikrosphären zeigt.
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3 ist
ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit Plasma
+/–2%
Pluronic F127 auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf PMMA-Mikrosphären zeigt.
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4 ist
ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit Plasma
+/–2%
Pluronic F127 auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf PLA-Mikrosphären zeigt.
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5 ist
ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit Plasma
+/–2%
Pluronic F127 auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf EVA:PLA-Mikrosphären zeigt.
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6 ist
ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit IgG (2
mg/ml) oder mit 2% Pluronic F127 und anschließend mit IgG (2 mg/ml) auf
die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml)
auf PCL-Mikrosphären
zeigt.
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7 ist
ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit IgG (2
mg/ml) oder mit 2% Pluronic F127 und anschließend mit IgG (2 mg/ml) auf
die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml)
auf PMMA-Mikrosphären
zeigt.
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8 ist
ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit IgG (2
mg/ml) oder mit 2% Pluronic F127 und anschließend mit IgG (2 mg/ml) auf
die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml)
auf PVA-Mikrosphären
zeigt.
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9 ist
ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit IgG (2
mg/ml) oder mit 2% Pluronic F127 und anschließend mit IgG (2 mg/ml) auf
die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml)
auf EVA:PLA-Mikrosphären
zeigt.
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10A ist ein Diagramm, das die Auswirkung des EVA:PLA
Polymer-Mischungsverhältnisses
auf die Aggregation von Mikrosphären
zeigt. 10B ist eine rasterelektronenmikroskopische
Aufnahme, welche die Größe "kleiner" Mikrosphären zeigt. 10C (die eine Ausschnittvergrößerung – mit "10C-inset" gekennzeichnet – enthält) ist eine rasterelektronenmikroskopische
Aufnahme, welche die Größe "großer" Mikrosphären zeigt. 10D ist ein Diagramm, das den zeitlichen Verlauf
der in vitro Paclitaxel-Freisetzung aus mit 0,6% (Gew./Vol.) Paclitaxel
beladenen Mikrosphären
einer 50:50 EVA:PLA Polymer-Mischung in Phosphat-gepufferte Salzlösung (pH
7,4) bei 37°C
darstellt. Offene Kreise sind "kleine" Mikrosphären und
geschlossene Kreise sind "große" Mikrosphären. 10E ist eine Photographie einer CAM, welche die
Resultate der Paclitaxel-Freisetzung durch Mikrosphären ("MS") zeigt. 10F ist eine Photographie ähnlich wie 10E, aber mit einer höheren Vergrößerug.
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11A ist ein Diagramm, das die Profile der Freisetzungsraten
aus Polycaprolacton-Mikrosphären, die
1%, 2%, 5% oder 10% Paclitaxel enthalten, in Phosphat-gepufferte
Salzlösung
bei 37°C
zeigt. 11B ist eine Photographie,
die eine mit Kontroll-Mikrosphären behandelte
CAM zeigt. 11C ist eine Photographie, die
eine CAM zeigt, die mit Mikrosphären,
welche mit 5% Paclitaxel beladen wurden, behandelt wurde.
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Die 12A beziehungsweise 12B sind
zwei Diagramme, die die Freisetzung von Paclitaxel aus EVA Filmen
und den Prozentsatz des in denselben Filmen verbleibenden Paclitaxels über die
Zeit zeigen. 12C ist ein Diagramm, das die
Quellung von EVA/F127 Filmen ohne Paclitaxel über die Zeit zeigt. 12D ist ein Diagramm, das die Quellung von EVA/Span
80 Filmen ohne Paclitaxel über
die Zeit zeigt. 12E ist ein Diagramm, das Spannungs-Dehnungs-Kurven
für verschiedene
EVA/F127 Mischungen zeigt.
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Die 13A und 13B sind
zwei Diagramme, die den Schmelzpunkt von PCL/MePEG-Polymer-Mischungen
als Funktion des Prozentanteils von MePEG in der Formulierung (13A) und den Prozentsatz der zusätzlichen
Zeit, die benötigt
wird, damit sich PCL-Paste ausgehend von 60°C verfestigt, als Funktion der
MePEG-Menge in der Formulierung (13B)
zeigen. 13C ist ein Diagramm, das die
Weichheit verschiedener PCL/MePEG-Polymer-Mischungen zeigt. 13D ist ein Diagramm, das für Polymer-Mischungen mit verschiedenen
MePEG-Konzentrationen die prozentuale Gewichtsänderung über die Zeit zeigt. 13E ist ein Diagramm, das die Rate der Freisetzung
von Paclitaxel aus verschiedenen Polymer-Mischungen, die mit 1%
Paclitaxel beladen sind, über
die Zeit zeigt. Die 13F und 13G sind
Diagramme, die Auswirkungen verschiedener Paclitaxel-Anteile auf
die Gesamtmenge des aus einer 20% MePEG/PCL-Mischung freigesetzten
Paclitaxels zeigen. 13H ist ein Diagramm, das die
Auswirkungen von MePEG auf die Reißfestigkeit eines MePEG/PCL-Polymers
zeigt.
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14 ist ein Diagramm, das die Freisetzung von Paclitaxel
aus verschiedenen polymeren Formulierungen zeigt.
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15 ist ein Diagramm, das die Freisetzung von Paclitaxel
aus PCL-Pasten in PBS bei 37°C über den
Zeitverlauf zeigt. Die PCL-Pasten enthalten Mikropartikel aus Paclitaxel
und verschiedenen Zusätzen,
die unter Verwendung der Maschengröße #140 hergestellt wurden.
Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Proben dar.
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16 ist ein Diagramm, das die Zeitverläufe der
Freisetzung von Paclitaxel aus Pasten aus Paclitaxel, Gelatine und
PCL in PBS bei 37°C
zeigt. Dieses Diagramm zeigt die Auswirkungen der Gelatine-Konzentration
(Maschengröße #140)
und der Größe der Mikropartikel
aus Paclitaxel und Gelatine (1:1), die unter Verwendung der Maschengröße #140
oder der Maschengröße #60 hergestellt
wurden. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Proben
dar.
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Die 17A und 17B sind
Diagramme, welche die Auswirkungen von Zusätzen (17A;
Maschengröße #140)
und der Größe der Mikropartikel
(17B; Maschengröße #140
oder #60) und des Anteils des Zusatzstoffes (Maschengröße #140)
auf das Quellungsverhalten von PCL-Pasten, die 20% Paclitaxel enthalten,
nach Suspension in destilliertem Wasser bei 37°C zeigen. Die Messungen für die Paste,
die mit 270 μm-Mikropartikeln in
Paclitaxel und Gelatine hergestellt worden war, und für die Paste,
die 30% Gelatine enthielt, wurden nach 4 Stunden aufgrund des Aufbrechens
der Matrix abgebrochen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung
von 3 Proben dar.
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Die 18A, 18B, 18C und 18D sind
typische rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Pasten aus
Paclitaxel, Gelatine und PCL (20:20:60) vor (18A)
und nach (18B) dem Suspendieren in destilliertem
Wasser bei 37°C
für 6 Stunden.
Die Mikroaufnahmen 18C und 18D sind
höhere Vergrößerungen
von 18B, welche die enge Verbindung
von Paclitaxel (stabförmig)
und der Gelatine-Matrx zeigen.
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Die 19A und 19B sind
typische mikroskopische Aufnahmen von CAM, die mit Pasten aus Gelatine
und PCL (19A) und aus Paclitaxel, Gelatine
und PCL (20:20:60; 19B) behandelt wurden und gefäßfreie Zonen
in der mit Paclitaxel behandelten CAM zeigen.
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20 ist eine Tabelle, welche die Auswirkung einer
um den Tumor herum erfolgenden Injektion einer Paste aus Paclitaxel,
Gelatine und PCL in Mäuse
mit gesicherten Tumoren zeigt.
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21 ist eine Tabelle, welche die Schmelztemperatur,
die Enthalpie, das Molekulargewicht, die Polydispersität und die
intrinsische Viskosität
von PDLLA-PEG-PDLLA-Zusammensetzungen
zeigt.
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22 ist ein Diagramm, das DSC-Thermogramme von
PDLLA-PEG-PDLLA und von PEG zeigt. Die Aufheizgeschwindigkeit betrug
10°C/min.
Schmelzpunkte und Enthalpien siehe 21.
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23 ist ein Diagramm, das die kumulative Freisetzung
von Paclitaxel aus mit 20% Paclitaxel beladenen PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern
in PBS-Albumin-Puffer bei 37°C
zeigt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 4 Proben
dar. Bei Zylindern mit 40% PEG wurde infolge von Auflösung nach
4 Tagen abgebrochen.
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Die 24A, 24B und 24C sind Diagramme, welche die Veränderungen
der Dimensionen Länge
(A), Durchmesser (B) und Nassgewicht (C) von mit 20% Paclitaxel
beladenen PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern während der in vitro Freisetzung
von Paclitaxel bei 37°C
zeigen.
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25 ist ein Diagramm, das Gelpermeations-Chromatographien
von mit 20% Paclitaxel beladenen PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern (20%
PEG, 1 mm Durchmesser) während
der Freisetzung in PBS-Albumin-Puffer bei 37°C zeigt.
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26 ist eine Tabelle, die den Verlust an Masse
und die Veränderungen
der Polymer-Zusammensetzung
von PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern (beladen mit 20% Paclitaxel) während der
Freisetzung in PBS-Albumin-Puffer bei 37°C zeigt.
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Die 27A, 27B, 27C und 27D sind
SEM von getrockneten PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern (beladen mit 20% Paclitaxel,
1 mm im Durchmesser) vor und während
der Freisetzung von Paclitaxel. A: 20% PEG, Tag 0; B: 30% PEG, Tag
0; C: 20% PEG, Tag 69; D: 30% PEG, Tag 69.
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28 ist ein Diagramm, das die kumulative Freisetzung
von Paclitaxel aus mit 20% Paclitaxel beladenen PDLLA:PCL-Mischungen
und PCL in PBS-Albumin-Puffer bei 37°C zeigt. Die Fehlerbalken stellen
die Standardabweichung von 4 Proben dar.
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29 ist eine Tabelle, welche die Wirksamkeit von
mit Paclitaxel beladenen Formulierungen einer chirurgischen Paste,
die lokal auf subcutane Tumore in Mäusen appliziert wird, zeigt.
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30 ist ein Diagramm, das die Auswirkungen einer
Bestrahlung auf die Freisetzung von Paclitaxel zeigt.
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31 ist ein Diagramm, das den Bereich der Partikelgrößen für Kontroll-Mikrosphären (PLLA:GA – 85:15)
zeigt.
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32 ist ein Diagramm, das den Bereich der Partikelgrößen für mit 20%
Paclitaxel beladene Mikrosphären
(PLLA:GA – 85:15)
zeigt.
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33 ist ein Diagramm, das den Bereich der Partikelgrößen für Kontroll-Mikrosphären (PLLA:GA – 85-15)
zeigt.
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34 ist ein Diagramm, das den Bereich der Partikelgrößen für mit 20%
Paclitaxel beladene Mikrosphären
(PLLA:GA – 85-15)
zeigt.
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Die 35A, 35B und 35C sind Diagramme, die den Bereich der Partikelgrößen für verschiedene
Verhältnisse
von PLLA und GA zeigen.
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Die 36A und 36B sind
Diagramme, die den Bereich der Partikelgrößen für verschiedene Verhältnisse
von PLLA und GA zeigen.
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Die 37A, 37B und 37C sind Diagramme, die den Bereich der Partikelgrößen für verschiedene
Verhältnisse
von PLLA und GA zeigen.
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Die 38A und 38B sind
Diagramme, die den Bereich der Partikelgrößen für verschiedene Verhältnisse
von PLLA und GA zeigen.
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39 ist eine Tabelle, welche die Molekulargewichte,
CMC und die maximalen Beladungen mit Paclitaxel von ausgewählten Diblock-Copolymeren
zeigt.
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Die 40A und 40B sind
Diagramme, welche die Fähigkeit
der Copolymere und von Cremophor EL, Paclitaxel-Kristalle in Wasser
(37°C) löslich zu
machen, zeigen. 40A; Wirkung der Konzentration
des Copolymers auf Cremophor (20 Stunden Inkubation); 40B; Wirkung der Zeit (Konzentration von Copolymer
oder Cremophor 0,5%).
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Die 41A und 41B sind
Diagramme, welche die Trübung
(UV-vis-Absorption bei 450 nm) von mizellenhaltigen Paclitaxel-Lösungen bei
Raumtemperatur (22°C)
zeigen. Die Paclitaxel-Konzentration war 2 mg/ml in Wasser. Die
Beladung mit Paclitaxel betrug 10% außer MePEG 5000-30/70, wo die
Beladung 5% war.
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42 ist ein Diagramm, das die Freisetzung von Paclitaxel
aus Paclitaxel-Nylon-Mikrokapseln
zeigt.
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43A ist ein Diagramm, das die Auswirkung von Paclitaxel/PCL
auf das Tumorwachstum zeigt. Die 43B und 43C sind zwei Photographien, welche die Auswirkungen
von Kontroll-Thermopaste und von mit 10% und mit 20% Paclitaxel
beladener Thermopaste auf das Tumorwachstum zeigen.
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44 ist ein Balkendiagramm, das die Größenverteilung
von Mikrosphären
nach Anzahl (5% Poly(ethylenvinylacetat) mit 10 mg Natrium-Suramin
in 5% PVA) zeigt.
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45 ist ein Balkendiagramm, das die Größenverteilung
von Mikrosphären
nach Gewicht (5% Poly(ethylenvinylacetat) mit 10 mg Natrium-Suramin
in 5% PVA) zeigt.
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46 ist ein Diagramm, welches das Gewicht der Verkapselung
von Natrium-Suramin in 50 mg Poly(ethylenvinylacetat) zeigt.
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47 ist ein Diagramm, das den Prozentsatz der Verkapselung
von Natrium-Suramin in 50 mg Poly(ethylenvinylacetat) zeigt.
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48 ist ein Balkendiagramm, das die Größenverteilung
nach Gewicht von 5% ELVAX-Mikrosphären, die 10 mg Natrium-Suramin
enthalten, hergestellt in 5% PVA mit 10% NaCl, zeigt.
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49 ist ein Balkendiagramm, das die Größenverteilung
nach Gewicht von 5% Mikrosphären,
die 10 mg Natrium-Suramin enthalten, hergestellt in 5% PVA mit 10%
NaCl, zeigt.
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50 ist ein Balkendiagramm, das die Größenverteilung
nach Anzahl von 5% Mikrosphären,
die 10 mg Natrium-Suramin enthalten, hergestellt in 5% PVA mit 10%
NaCl, zeigt.
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51A ist eine Photographie von Suramin und Cortisonacetat
auf einer CAM (Vergrößerung =
8×). In
Kürze zeigt
dieses Bild eine gefäßfreie Zone,
die mit 20 μg
Suramin und 70 μg
Cortisonacetat in 0,5% Methylcellulose behandelt wurde. Man beachte
die Blutgefäße in der
Peripherie der gefäßfreien
Zone, die von der Arzneimittelquelle weg abgelenkt sind. 51B ist eine Photographie, die den Gefäßausschnitt
der betroffenen Region bei höherer
Vergrößerung (Vergrößerung =
20×) zeigt.
Man beachte die gefäßfreien
Bereiche und den typischen "Abbieg-Effekt" der Blutgefäße, die
an die gefäßfreie Zone
angrenzen.
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Die 52A, B, C, D und E zeigen die Wirkung der Freisetzung
von MTX über
die Zeit.
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53 ist eine Photographie von mit 10% Methotrexat
beladenen Mikrosphären,
die aus PLA:GA (50:50), inhärente
Viskosität "IV" = 0,78, hergestellt
sind.
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54 ist ein Diagramm, das die Freisetzung aus mit
10% Vanadylsulfat beladenem PCL zeigt.
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55 ist eine Photographie von Mikrosphären aus
Hyaluronsäure,
die Vanadiumsulfat enthalten.
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56 ist ein Diagramm, das die Freisetzung
von organischem Vanadat aus PCL darstellt. 56B zeigt
den Prozentsatz von organischem Vanadat, der über den Zeitverlauf zurückbleibt.
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57 ist eine Photographie, die Mikrosphären aus
Poly(D,L)milchsäure
zeigen, welche organisches Vanadat enthalten.
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Die
58A und
58B sind
Diagramme, die den Zeitverlauf der Freisetzung von BMOV aus PCL (150
mg Scheiben) zeigen. (A) μg
freigesetztes Arzneimittel oder (B)% des in der Scheibe verbleibenden
Arzneimittels. Der anfängliche
BMOV-Gehalt in PCL ist angegeben mit (o) 5%; (•) 10%; (Δ) 15%; (
)
20%; ( ) 30% und (∇)
35%.
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Die
59A und
59B sind
Diagramme, die den Zeitverlauf der Freisetzung von BMOV aus 150 mg
Scheiben von PCL:MEPEG (80:20, Gew./Gew.) zeigen, angegeben als:
(A) μg freigesetztes
Arzneimittel oder (B)% des in der Scheibe verbleibenden Arzneimittels.
Der anfängliche
BMOV-Gehalt in PCL:MEPEG ist angegeben mit (O) 5%; (•) 10%; (Δ) 15%; (
)
20%.
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Die 60A, 60B und 60C sind rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen
von (60A: oben) BMOV-Kristallen;
(60B: Mitte) Oberflächenmorphologie der PCL-Scheibe
mit 20% BMOV zu Beginn der Untersuchung zur Arzneimittelfreisetzung
und (60C: un ten) Oberflächenmorphologie
der PCL-Scheibe mit 20% BMOV am Ende der Untersuchung zur Arzneimittelfreisetzung
(72 Tage in PBS).
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Die
61A und
61B sind
zwei Diagramme, welche die Auswirkung einer Erhöhung der Konzentration des
BMOV auf das Überleben
der Zellen unter Verwendung einer Einwirkzeit des BMOV auf die Zellen von
einer Stunde (
61A) oder einer kontinuierlichen
BMOV-Einwirkung (
61B) zeigen. Die Zellen werden
bezeichnet mit: (o) HAT-29 Colonzellen; (•) MCF-7 Brustzellen; (Δ) Skmes-1
nicht kleinzellige Lungenzellen und (
)
normale Knochenmarkzellen.
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62 ist eine Tabelle, welche die Auswirkungen von
mit BMOV beladener Paste auf die Gewichte von MDAY-D2 Tumoren, die
in Mäusen
angezogen wurden, zeigt. In Kürze
wurde PCL-Paste (150 mg) mit entweder 25%, 30% oder 35% BMOV Mäusen, die
MDAY-2 Tumore trugen, subcutan injiziert. Die Gewichte der Tumore
wurden nach 10 Tagen Behandlung ermittelt. Diese Tabelle zeigt die
Ergebnisse von 2 separaten Untersuchungen, bei denen (obere Tabelle)
25% BMOV und (untere Tabelle) 30% oder 35% BMOV verwendet wurde. "Kontrolle" beschreibt Mäuse, die
mit PCL, das kein BMOV enthielt, behandelt wurden.
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63 ist eine Tabelle, welche die Auswirkungen von
mit BMOV beladener PCL:MePEG-Paste auf die Gewichte von RIF-1 Tumoren,
die in Mäusen
angezogen wurden, zeigt. In Kürze
wurden RIF-1 Tumore für 5
Tage in Mäusen
angezogen, wonach 90% des Tumors chirurgisch entfernt und die Resektionsstelle
mit 150 mg PCL:MePEG-Paste (80:20, Gew./Gew.), die entweder kein
BMOV (Kontrolle) oder 5% BMOV enthielt, behandelt wurden. Das Nachwachsen
des Tumors wurde an den Tagen 4, 5 und 6 nach dieser Behandlung
bestimmt.
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Die 64A und 64B sind
zwei Diagramme. 64A zeigt die Wirkung einer
gesteigerten Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit BEMOV
auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten BEMOV. 64B zeigt auch die Wirkung einer gesteigerten
Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit BEMOV auf den Zeitverlauf
des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten BEMOV. Die Arzneimittelfreisetzung wird
als Prozentsatz des im Pellet verbleibenden BEMOV ausgedrückt.
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Die 65A und 65B sind
zwei Diagramme. 65A zeigt die Wirkung einer
gesteigerten Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit V5
auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten V5. 65B zeigt auch die Wirkung einer gesteigerten
Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit V5 auf den Zeitverlauf
des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten V5. Die Arzneimittelfreisetzung
wird als Prozentsatz des im Pellet verbleibenden V5 ausgedrückt.
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Die 66A und 66B sind
zwei Diagramme. 66A zeigt die Wirkung einer
gesteigerten Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit PRC-V
auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten PRC-V. 66B zeigt auch die Wirkung einer gesteigerten
Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit PCR-V auf den Zeitverlauf
des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten PRC-V. Die Arzneimittelfreisetzung
wird als Prozentsatz des im Pellet verbleibenden PRC-V ausgedrückt.
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Die 67A, 67B, 67C und 67D sind
eine Reihe von Diagrammen, welche die Wirkung der Beladung von PCL-Thermopaste
(150 mg Pellet) mit verschiedenen Konzentrationen von MePEG auf
den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten BMOV zeigen,
mit 5% BMOV (67A), 10% BMOV (67B), 15% BMOV (67C)
und 20% BMOV (67D).
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Die 68A, 68B, 68C und 68D sind
eine Reihe von Diagrammen, welche die Wirkung der Beladung von PCL-Thermopaste
(150 mg Pellet) mit verschiedenen Konzentrationen von MePEG auf
den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten BMOV zeigen;
mit 0% MePEG (68A), 5% MePEG (68B), 10% MePEG (68C)
und 15% MePEG (68D). Die Arzneimittelfreisetzung
wird als Prozentsatz des im Pellet verbleibenden BMOV ausgedrückt.
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Die 69A und 69B sind
Photographien von mit Fibronectin beschichteten PLLA-Mikrosphären auf
Blasengewebe (69A) und von Poly(L-lysin)-Mikrosphären auf
Blasengewebe.
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Die 70A und 70B sind
zwei Photographien von CAM, die einen mit Kontroll-Thermopaste (unbeladen)
behandelten Tumor haben. In Kürze
ist in 70A die zentrale weiße Masse
das Tumorgewebe. Man beachte die Menge der Blutgefäße, die
aus der CAM aus allen Richtungen in den Tumor eindringen. Durch
die Produktion "angiogener
Faktoren" ruft der
Tumor das Einsprossen des Gefäßsystems
aus dem Wirt hervor. Das Tumorgewebe dehnt sich distal entlang der
Blutgefäße, die
es versorgen, aus. 70B ist eine Ansicht der in 70A gezeigten CAM von unten. In Kürze zeigt
diese Ansicht das strahlenförmige
Erscheinungsbild der Blutgefäße, die
wie die Speichen eines Rades in den Tumor eindringen. Man beachte,
dass die Dichte der Blutgefäße in der
Nachbarschaft des Tumors höher
ist als im umgebenden normalen Gewebe der CAM. Die 70C und 70D sind
zwei Photographien von CAM, die einen mit Thermopaste, die mit 20% Paclitaxel
beladen ist, behandelten Tumor haben. In Kürze ist in Figur 70C die zentrale weiße Masse das Tumorgewebe. Man
beachte den Mangel an Blutgefäßen in der
Nachbarschaft des Tumorgewebes. Die anhaltende Freisetzung eines
Hemmstoffs der Angiogenese kann den vom Tumor produzierten angiogenen
Stimulus überwinden.
Der Tumor selbst ist schlecht vaskularisiert und nimmt fortschreitend
an Größe ab. 70D ist von der Unterseite der in 70C gezeigten CAM aus aufgenommen und zeigt im
Vergleich zu Gewebe aus den Kontroll-Tumoren eine Unterbrechung
des Blutflusses in den Tumor. Man beachte, dass die Dichte der Blutgefäße in der
Nachbarschaft des Tumors vermindert und spärlicher ist als die des normalen, umgebenden
Gewebes der CAM.
-
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
-
Vor
der Darstellung der Erfindung kann es zu deren Verständnis hilfreich
sein, Definitionen bestimmter, hier nachstehend verwendeter Begriffe
darzulegen.
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Hohlorgan" bezieht sich hier
auf alle Passagewege, Schläuche,
Röhren,
Gänge,
Kanäle,
Sinus und Leitungen, die ein inneres Lumen haben und den Durchfluss
von Stoffen im Körper
ermöglichen.
Typische Beispiele von Hohlorganen beinhalten Arterien und Venen,
Tränengänge, die
Luftröhre,
Bronchien, Bronchiolen, Nasengänge
(einschließlich
der Nebenhöhlen)
und andere Luftwege, Eustachische Röhren, den äußeren Gehörgang, Mundhöhlen, die
Speiseröhre,
den Magen, den Zwölffingerdarm,
den Dünndarm,
den Dickdarm, die Gallenwege, den Harnleiter, die Blase, die Harnröhre, die
Eileiter, den Uterus, die Vagina und andere Hohlorgane des weiblichen
Genitaltrakts, den Samenleiter und andere Hohlorgane des männlichen
Genitaltrakts und das Ventrikelsystem (Cerebrospinalflüssigkeit)
des Gehirns und des Rückenmarks.
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„Therapeutischer
Wirkstoff" bezieht
sich hier auf Paclitaxel oder Analoga oder Derivate davon.
-
Wie
oben erwähnt
stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Paclitaxel zur
Herstellung eines Medikaments für
Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen von Hohlorganen
bereit, umfassend den Schritt, einem äußeren Teil des Hohlorgans (d.h.
einer nicht-luminalen Oberfläche)
ein Medikament zuzuführen,
das Paclitaxel oder Analoga oder Derivate davon umfasst und im Rahmen
von bevorzugten Ausführungsformen
eine Zusammensetzung, die Paclitaxel oder Analoga oder Derivate
davon und einen polymeren Träger
umfasst. In Kürze
umgeht die Zuführung
eines therapeutischen Wirkstoffs zu einem äußeren Teil eines Hohlorgans
(z.B. quadrantenweise oder ringförmig)
viele Nachteile der herkömmlichen
Zugänge,
die mit einer endoluminalen Manipulation einhergehen. Weiterhin
ermöglicht
die Zuführung
eines therapeutischen Wirkstoffes wie hier beschrieben die Verabreichung
größerer Mengen
des therapeutischen Wirkstoffs mit geringerer Einschränkung des
zuzuführenden
Volumens.
-
Wie
unten ausführlicher
erörtert
können
die therapeutischen Wirkstoffe entweder mit oder ohne Trägermittel
(z.B. polymer) äußeren Teilen
von Hohlorganen zugeführt
werden, um eine Erkrankung, die mit dem Hohlorgan zusammenhängt, zu
behandeln oder zu verhindern. Jeder dieser Aspekte wird unten ausführlicher erörtert.
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Therapeutische Wirkstoffe
-
In
der Erfindung ist der therapeutische Wirkstoff Paclitaxel, eine
Verbindung, welche die Anordnung der Mikrotubuli unterbricht, indem
sie an Tubulin bindet, um abnorme Mitosespindeln zu bilden. In Kürze handelt
es sich bei Paclitaxel um ein hoch derivatisiertes Diterpenoid (Wani
et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 2325, 1971), welches aus der abgeschälten und
getrockneten Rinde von Taxus brevifolia (Pazifische Eibe) und aus Taxomyces
Andreanae und endophytischen Pilzen der pazifischen Eibe gewonnen
worden ist (Stierle et al., Science 60: 214–216, 1993). „Paclitaxel
(was hier einschließlich
von Propharmaka, Analoga und Derivaten wie zum Beispiel TAXOL®,
TAXOTERE®,
10-Desacetyl-Analoga von Paclitaxel und 3'N-Desbenzoyl-3'N-t-butoxycarbonyl-Analoga von Paclitaxel
zu verstehen ist) kann unter Einsatz von Methoden, die den Fachleuten
bekannt sind, leicht hergestellt werden (siehe WO 94/07882, WO 94/07881,
WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076, WO 94/00156,
WO 93/24476, EP 590267, WO 94/20089; U.S. Patente Nr. 5.294.637,
5.283.253, 5.279.949, 5.274.137, 5.202.448, 5.200.534, 5.229.529,
5.254.580, 5.412.092, 5.395.850, 5.380.751, 5.350.866, 4.857.653,
5.272.171, 5.411.984, 5.248.796, 5.248.796, 5.422.364, 5.300.638,
5.294.637, 5.362.831, 5.440.056, 4.814.470, 5.278.324, 5.352.805,
5.411.984, 5.059.699, 4.942.184; Tetrahedron Letters 35 (52): 9709–9712, 1994;
J. Med. Chem. 35: 4230–4237,
1992; J. Med. Chem. 34: 992–998,
1991; J. Natural Prod. 57 (10): 1404–1410, 1994; J. Natural Prod.
57 (11): 1580–1583,
1994; J. Am. Chem. Soc. 110: 6558–6560, 1988) oder von einer
Reihe kommerzieller Quellen bezogen werden, einschließlich zum
Beispiel Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri (T7402 – aus Taxus
brevifolia).
-
Typische
Beispiele solcher Derivate oder Analoga von Paclitaxel beinhalten
7-Deoxydocetaxol, 7,8-Cyclopropataxane, N-substituierte 2-Azetidone,
6,7-Epoxypaclitaxele, 6,7-modifizierte Paclitaxele, 10-Desacetoxytaxol,
10-Deacetyltaxol (aus 10-Deacetylbaccatin III), Phosphonooxy- und
Carbonat-Derivate von Taxol, Taxol-2',7-di(natrium 1,2-benzendicarboxylat,
10-Desacetoxy-11,12-dihydrotaxol-10,12(18)-dien-Derivate, 10-Desacetoxytaxol,
Protaxol(2'- und/oder
7-O-Ester-Derivate), (2'-
und/oder 7-O-Carbonat-Derivate), asymmetrische Synthese der Taxol-Seitenkette,
Fluoro-Taxole, 9-Deoxotaxan, (13-Acetyl-9-deoxobaccatin III, 9-Deoxotaxol,
7-Deoxy-9-deoxotaxol, 10-Des acetoxy-7-deoxy-9-deoxotaxol, Derivate,
die Wasserstoff oder eine Acetylgruppe und ein Hydroxy und Tert-butoxycarbonylamino
enthalten, sulfurierte 2'-Acryloyltaxol-
und sulfurierte 2'-O-Acylsäure-Taxol-Derivate,
Succinyltaxol, 2'-γ-Aminobutyryltaxol-formiat,
2'-Acetyltaxol, 7-Acetyltaxol,
7-Glycin-carbamat-taxol, 2'-OH-7-PEG(5000)-Carbamat-taxol,
2'-Benzoyl- und
2',7-Dibenzoyl-taxol-Derivate,
andere Prophannaka (2'-Acetyltaxol;
2',7-Diacetyltaxol; 2'Succinyltaxol; 2'-(Beta-alanyl)-taxol);
2'Gamma-aminobutyryltaxolformiat;
Ethylenglycoi-Derivate von 2'-Succinyltaxol;
2'-Glutaryltaxol; 2'-(N,N-Dimethylglycyl)taxol;
2'-[2-(N,N-Dimethylamino)propionyl]taxol;
2'Orthocarboxybenzoyltaxol;
2'-aliphatische Carbonsöurederivate
von Taxol, Propharmaka {2'(N,N-Diethylaminopropionyl)taxol,
2'(N,N-Dimethylglycyl)taxol,
7(N,N-Dimethylglycyl)taxol, 2',7-Di-(N,N-Dimethylglycyl)taxol,
7(N,N-Diethylaminopropionyl)taxol, 2',7-Di(N,N-Diethylaminopropionyl)taxol,
2'-(L-Glycyl)taxol,
7-(L-Glycyl)taxol, 2',7-Di(L-Glycyl)taxol,
2'-(L-Alanyl)taxol,
7-(L-Alanyl)taxol, 2',7-Di(L-Alanyl)taxol,
2'-(L-Leucyl)taxol,
7-(L-Leucyl)taxol, 2',7-Di(L-Leucyl)taxol, 2'-(L-Isoleucyl)taxol,
7-(L-Isoleucyl)taxol, 2',7-Di(L-Isoleucyl)taxol,
2'-(L-Valyl)taxol, 7-(L-Valyl)taxol, 2'7-Di(L-Valyl)taxol,
2'-(L-Phenylalanyl)taxol,
7-(L-Phenylalanyl)taxol, 2',7-Di(L-Phenylalanyl)taxol,
2'-(L-Prolyl)taxol,
7-(L-Prolyl)taxol, 2',7-Di(L-Prolyl)taxol, 2'-(L-Lysyl)taxol,
7-(L-Lysyl)taxol, 2',7-Di(L-Lysyl)taxol, 2'-(L-Glutamyl)taxol,
7-(L-Glutamyl)taxol, 2',7-Di(L-Glutamyl)taxol,
2'-(L-Arginyl)taxol,
7-(L-Arginyl)taxol, 2',7-Di(L-Arginyl)taxol),
Taxol-Analoga mit modifizierten Phenylisoserin-Seitenketten, Taxoter,
(N-Debenzoyl-N-tert-(butoxycaronyl)-10-deacetyltaxol und Taxane
(z.B. Baccatin III, Cephalomannin, 10-Deacetylbaccatin III, Brevifoliol,
Yunantaxusin und Taxusin).
-
Paclitaxel
sollte nicht nur als auf die übliche
chemisch verfügbare
Form des Paclitaxels bezogen aufgefasst werden, sondern auch auf
Analoga (z.B. Taxoter, wie oben erwähnt) und Paclitaxel-Konjugate
(z.B. Paclitaxel-PEG, Paclitaxel-Dextran oder Paclitaxel-Xylose).
Zudem können
mehrere als ein Wirkstoff gleichzeitig (d.h. in Kombination) eingesetzt
oder nacheinander zugeführt
werden.
-
Polymere
-
Wie
oben erwähnt
können
therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zusätzlich ein
Polymer umfassen. Eine Vielzahl von Polymeren kann zur Aufnahme
oder Zuführung
eines oder mehrerer der oben behandelten therapeutischen Wirk stoffe
eingesetzt werden, einschließlich
zum Beispiel sowohl biologisch abbaubarer als auch nicht biologisch
abbaubarer Zusammensetzungen. Typische Beispiele biologisch abbaubarer
Zusammensetzungen beinhalten Albumin, Kollagen, Gelatine, Stärke, Cellulose
(Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose,
Carboxymethylcellulose, Celluloseacetatphthalat, Celluloseacetatsuccinat,
Hydroxypropylmethylcellulosephthalat), Casein, Dextrane, Polysaccharide,
Fibrinogen, Poly(D,L-lactid), Poly(D,L-lactid-co-glycolid), Poly(glycolid),
Poly(hydroxybutyrat), Poly(alkylcarbonat) und Poly(orthoester),
Polyester, Poly(hydroxyvaleriansäure),
Polydioxanon, Poly(ethylenterephthalat), Poly(apfelsäure), Poly(tartronsäure), Polyanhydride,
Polyphosphazene, Poly(aminosäuren)
und ihre Copolymere (siehe allgemein Illum, L., Davids, S. S. (Hrsg.) "Polymers in controlled
Drug Delivery" Wright,
Bristol, 1987; Arshady, J. Controlled Release 17: 1–22, 1991;
Pitt, Int. J. Phar. 59: 173–196,
1990; Holland et al., J. Controlled Release 4: 155–0180, 1986).
Typische Beispiele nicht abbaubarer Polymere beinhalten EVA-Copolymere,
Silikongummi, Acrylpolymere (Polyacrylsäure, Polymethylacrylsäure, Polymethylmethacrylat,
Polyalkylcyanoacrylat), Polyethylen, Polypropylen, Polyamide (Nylon
6,6), Polyurethan, Poly(ester-urethane), Poly(ether-urethane), Poly(ester-harnstoff),
Polyether (Poly(ethylenoxid), Poly(propylenoxid), Pluronics, Poly(tetramethylen-glycol)),
Silikongummis und Vinylpolymere [Polyvinylpyrrolidon, Poly(vinylalkohol),
Poly(vinylacetatphthalat). Es können
auch Polymere entwickelt werden, die entweder anionisch (z.B. Alginat,
Carrageenin, Carboxymethylcellulose und Poly(acrylsäure), oder
kationisch (z.B. Chitosan, Poly-L-Lysin, Polyethylenimin und Poly(allylamin))
sind (siehe allgemein Dunn et al., J. Applied Polymer Sci. 50: 353–365, 1993;
Cascone et al., J. Materials Sci.: Materials in Medicine 5: 770–774, 1994;
Shiraishi et al., Biol. Pharm. Bull. 16 (11): 1164–1168, 1993;
Thacharodi und Rao, Int'I
J. Pharm. 120: 115–118,
1995; Miyazaki et al., Int'I
J. Pharm. 118: 257–263,
1995). Besonders bevorzugte polymere Trägermittel beinhalten Poly(ethylenvinylacetat)
(40% quervernetzt), Oligomere und Polymere der Poly(D,L-milchsäure), Oligomere
und Polymere der Poly(L-milchsäure),
Poly(glycolsäure),
Copolymere von Milchsäure
und Glycolsäure,
Poly(caprolacton), Poly(valerolacton), Polyanhydride, Copolymere
von Poly(caprolacton) oder Poly(milchsäure) mit Polyethylenglycol
und Mischungen davon.
-
Polymere
Trägermittel
können
in verschiedenen Formen gestaltet werden, mit erwünschten
Freisetzungscharakteristika und/oder mit spezifischen erwünschten
Eigenschaften. Zum Beispiel können
polymere Trägermittel
so gestaltet werden, dass sie einen Wirkstoff nach Eintreten eines
bestimmten, auslösenden
Ereignisses wie zum Beispiel pH freisetzen (siehe z.B. Heller et
al., "Chemically
Self-Regulated Drug Delivery Systems," in Polymers in Medicine III, Elsevier
Science Publishers B. V., Amsterdam, 1988, pp. 175–188; Kang et
al., J. Applied Polymer Sci. 48: 343–354, 1993; Dong et al., J.
Controlled Release 19: 171–178,
1992; Dong und Hoffman, J. Controlled Release 15: 141–152, 1991;
Kim et al., J. Controlled Release 28: 143–152, 1994; Cornejo-Bravo et
al., J. Controlled Release 33:223–229, 1995; Wu und Lee, Pharm.
Res. 10 (10): 1544–1547, 1993;
Serres et al., Pharm. Res. 13 (2): 196–201, 1996; Peppas, "Fundamentals of pH-
and Temperature-Sensitive Delivery Systems," in Gurny et al. (Hrsg.), Pulsatile
Drug Delivery, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart,
1993, pp. 41–55;
Doelker, "Cellulose
Derivatives," 1993,
in Peppas und Larger (Hrsg.), Biopolymers I, Springer-Verlag, Berlin).
Typische Beispiele pH-sensitiver Polymere beinhalten Poly(acrylsäure) und ihre
Derivate (einschließlich
zum Beispiel Nomopolymere wie Poly(aminosäure); Poly(acrylsäure); Poly(methylacrylsäure)), Copolymere
solcher Nomopolymere und Copolymere von Poly(acrylsäure) und
Acrylmonomere wie zum Beispiel die oben erwähnten. Andere pH-sensitive
Polymere beinhalten Polysaccharide wie zum Beispiel Celluloseacetatphthalat;
Hydroxypropylmethylcellulosephthalat; Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat;
Celluloseacetattrimellitat und Chitosan. Weitere pH-sensitive Polymere
beinhalten jede Mischung aus einem pH-sensitiven Polymer und einem
wasserlöslichen
Polymer.
-
Es
können
ebenso polymere Trägermittel
hergestellt werden, die temperatursensitiv sind (siehe zum Beispiel
Chen et al., "Novel
Hydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadhesive
Polyacrylic Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery," in Proceed. Intern.
Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22:167-168, Controlled Release
Society, Inc., 1995; Okano, "Molecular
Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for Temporal Controlled Drug
Delivery," in Proceed.
Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22: 111–112, Controlled
Release Society, Inc., 1995; Johnston et al., Pharm. Res. 9 (3):
425–433,
1992; Tung, Int'J
J. Pharm. 107: 85–90,
1994; Harsh und Gehrke, J. Controlled Release 17: 175–186, 1991;
Bae et al., Pharm. Res. 8 (4): 531–537, 1991; Dinarvand und D'Emanuele, J. Controlled
Release 36: 221–227,
1995; Yu und Grainger, "Novel
Thermosensitive Amphiphilic Gels: Poly N-isopropylacrylamide-co-sodium
acrylate-co-n-N-alkylacrylamide Network
Synthesis and Physicochemical Characterization," Dept. of Chemical & Biological Sci., Oregon Graduate
Institute of Science & Technology,
Beaverton, OR, pp. 820–821;
Zhou und Smid, "Physical
Hydrogels of Associative Star Polymers," Polymer Research Institute, Dept. of
Chemistry, College of Environmental Science and Forestry, State
Univ. of New York, Syracuse, NY, pp. 822–823; Hoffman et al., "Characterizing Pore
Sizes and Water 'Structure' in Stimuli-Responsive
Hydrogels," Center
for Bioengineering, Univ. of Washington, Seattle, WA, p. 828; Yu
und Grainger, "Thermo-sensitive
Swelling Behavior in Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks:
Cationic, Anionic and Ampholytic Hydrogels," Dept. of Chemical & Biological Sci., Oregon Graduate Institute
of Science & Technology,
Beaverton, OR, pp. 829–830;
Kim et al., Pharm. Res. 9 (3): 283–290, 1992; Bae et al., Pharm.
Res. 8 (5): 624–628,
1991; Kono et al., J. Controlled Release 30: 69–75, 1994; Yoshida et al.,
J. Controlled Release 32: 97–102,
1994; Okano et al., J. Controlled Release 36: 125–133, 1995;
Chun und Kim, J. Controlled Release 38: 39–47, 1996; D'Emanuele und Dinarvand,
Int'I J. Pharm.
118: 237–242,
1995; Katono et al., J. Controlled Release 16:215–228, 1991;
Hoffman, "Thermally
Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species," in Migliaresi et
al. (Hrsg.), Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers B.
V., Amsterdam, 1988, pp. 161–167;
Hoffman, "Applications
of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and
Diagnostics," in
Third International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems,
Salt Lake City, UT, Feb. 24–27,
1987, pp. 297–305;
Gutowska et al., J. Controlled Release 22: 95–104, 1992; Palasis und Gehrke,
J. Controlled Release 18: 1–12,
1992; Paavola et al., Pharm. Res. 35 12 (12): 1997–2002, 1995).
-
Typische
Beispiele von Polymeren, die unter Wärmeeinwirkung gelieren und
ihre Entmischungstemperaturen (LCST(°C)) umfassen Homopolymere wie
zum Beispiel Poly(N-methyl-N-n-propylacrylamid),
19,8; Poly(N-n-propylacrylamid), 21,5; Poly(N-methyl-N-isopropylacrylamid),
22,3; Poly(N-n-propylmethacrylamid), 28,0; Poly(N-isopropylacrylamid),
30,9; Poly(N,n-diethylacrylamid), 32,0; Poly(N-isopropylmethacrylamid), 44,0;
Poly(N-cyclopropylacrylamid), 45,5; Poly(N-ethylmethyacrylamid),
50,0; Poly(N- methyl-N-ethylacrylamid),
56,0; Poly(N-cyclopropylmethacrylamid), 59,0; Poly(N-ethylacrylamid),
72,0. Ferner können
Polymere, die unter Wärmeeinwirkung
gelieren, durch Zubereitung von Copolymeren zwischen (aus) Monomeren
der oben genannten oder durch Kombination solcher Homopolymere mit
anderen wasserlöslichen
Polymeren wie zum Beispiel Acrylmonomeren (z.B. Acrylsäure und
Derivaten davon wie zum Beispiel Methylacrylsäure, Acrylat und Derivaten
davon wie zum Beispiel Butylmethacrylat, Acrylamid und N-n-Butylacrylamid)
hergestellt werden.
-
Weitere
typische Beispiele von Polymeren, die unter Wärmeeinwirkung gelieren, umfassen
Celluloseether-Derivate wie zum Beispiel Hydroxypropylceliulose,
41°C; Methylcellulose,
55°C; Hydroxypropylmethylcellulose,
66°C; Ethylhydroxyethylcellulose
und Pluronics wie zum Beispiel F-127, 10–15°C; L-122, 19°C; L-92, 26°C; L-81, 20°C; und L-61, 24°C.
-
Von
den polymeren Trägermitteln,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann eine Vielzahl
von Formen gebildet werden, einschließlich beispielsweise stabförmige Einheiten,
Pellets, Platten oder Kapseln (siehe zum Beispiel Goodell et al.,
Am. J. Hosp. Pharm. 43: 1454–1461,
1986; Langer et al., "Controlled
release of macromolecules from polymers", in Biomedical polymers, Polymeric
materials and pharmaceuticals for biomedical use, Goldberg, E. P.,
Nakagim, A. (Hrsg.) Academic Press, pp. 113–137, 1980; Rhine et al., J.
Pharm. Sci. 69: 265–270,
1980; Brown et al., J Pharm. Sci. 72: 1181–1185, 1983; und Bawa et al., J.
Controlled Release 1:259–267,
1985). Therapeutische Wirkstoffe können durch Einschluss in die
Matrices des Polymers gekoppelt sein, durch kovalente Bindungen
gebunden sein oder in Mikrokapseln verkapselt sein. In bestimmten
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung werden therapeutische Zusammensetzungen in nicht-kapsulären Formulierungen
wie zum Beispiel Mikrosphären
(in einem Größenbereich
von Nanometern bis Mikrometern), Pasten, Fasern verschiedener Größe, Filmen
und Sprays bereitgestellt.
-
Vorzugsweise
werden die therapeutischen Zusammensetzungen in einer der beabsichtigten
Verwendung angemessenen Art hergestellt. In bestimmten Gesichtspunkten
der vorliegenden Erfindung sollte die therapeutische Zusammensetzung
biokompatibel sein und einen oder mehrere therapeutische Wirkstoffe über einen
Zeitraum von mehreren Tagen bis Monaten freisetzen. Zum Beispiel
werden "schnell
freisetzende" oder "burst"-Therapeutica bereitgestellt, die mehr
als 10%, 20% oder 25% (Gew./Vol.) eines therapeutischen Wirkstoffes
(z.B. Paclitaxel) über
einen Zeitraum von 7 bis 10 Tagen freisetzen. Solche "schnell freisetzenden" Zusammensetzungen
sollten in bestimmten Ausführungsformen
in der Lage sein, chemotherapeutische Spiegel (wo anwendbar) eines
gewünschten
Wirkstoffes freizusetzen. In anderen Ausführungsformen werden "langsam freisetzende" therapeutische Zusammensetzungen,
die weniger als 1% (Gew./Vol.) eines therapeutischen Wirkstoffes über einen
Zeitraum vom 7 bis 10 Tagen freisetzen, bereitgestellt. Weiterhin
sollten therapeutische Zusammensetzungen vorzugsweise mehrere Monate
lang haltbar sein und unter sterilen Bedingungen hergestellt und
aufbewahrt werden können.
-
In
bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung können therapeutische Zusammensetzungen
abhängig
von der jeweiligen Verwendung in jeder Größe zwischen 50 nm und 500 μm hergestellt
werden. Alternativ können
solche Zusammensetzungen auch leicht als "Spray", das sich zu einem Film oder einer
Beschichtung verdichtet, angewandt werden. Solche Sprays können aus
Mikrosphären
mit einem breiten Größenspektrum
einschließlich
zum Beispiel von 0,1 μm
bis 3 μm,
von 10 μm
bis 30 μm
und von 30 μm
bis 100 μm
aufbereitet werden.
-
Therapeutische
Zusammensetzungen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt
werden, können
auch in einer Reihe von "Pasten" oder Gelformen hergestellt
werden. Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform der Erfindung therapeutische
Zusammensetzungen bereitgestellt, die bei einer Temperatur (z.B. Temperatur über 37°C, wie zum
Beispiel 40°C,
45°C, 50°C, 55°C oder 60°C) flüssig sind
und bei einer anderen Temperatur (z.B. Umgebungstemperatur des Körpers oder
jede Temperatur unter 37°C)
fest oder halbfest sind. Solche "Thermopasten" können in
Anbetracht der hier bereitgestellten Offenlegung leicht hergestellt
werden.
-
In
wieder anderen Aspekten der Erfindung können die therapeutischen Zusammensetzungen
als ein Film ausgebildet sein. Vorzugsweise sind solche Filme im
Allgemeinen weniger als 5, 4, 3, 2 oder 1 mm dick, bevorzugter weniger
als 0,75 mm oder 0,5 mm dick und am meisten zu bevorzugen weniger
als 500 μm
bis 100 μm
dick. Solche Filme sind vorzugsweise biegsam mit einer guten Reißfestigkeit
(z.B. mehr als 50, vorzugsweise mehr als 100 und bevorzugter mehr
als 150 oder 200 N/cm2), guten Adhäsionseigenschaften
(d.h. haften leicht an feuchten oder nassen Oberflächen an)
und haben eine kontrollierte Permeabilität.
-
In
bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung können
die therapeutischen Zusammensetzungen auch zusätzliche Bestandteile wie zum
Beispiel Tenside (z.B. Pluronics wie zum Beispiel F-127, L-122,
L-92, L-81 und L-61) umfassen.
-
In
weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung werden polymere Trägermittel
verwendet, die geeignet sind, eine hydrophobe Verbindung zu enthalten
und freizusetzen, wobei das Trägermittel
die hydrophobe Verbindung in Kombination mit einem Kohlenhydrat,
Protein oder Polypeptid enthält.
In bestimmten Ausführungsformen
enthält
oder umfasst das polymere Trägermittel
Regionen, Taschen oder Granula einer oder mehrerer hydrophober Verbindungen.
Zum Beispiel können
in einer Ausführungsform
der Erfindung hydrophobe Verbindungen in einer Matrix, die die hydrophobe
Verbindung enthält,
eingeschlossen werden, gefolgt von der Aufnahme der Matrix in das
polymere Trägermittel.
In diesem Zusammenhang kann eine Reihe von Matrices verwendet werden
einschließlich
zum Beispiel Kohlenhydrate und Polysaccharide wie zum Beispiel Stärke, Cellulose,
Dextran, Methylcellulose und Hyaluronsäure, Proteine oder Polypeptide
wie zum Beispiel Albumin, Kollagen und Gelatine. In alternativen
Ausführungsformen
können
hydrophobe Verbindungen in einem hydrophoben Kern enthalten sein
und dieser Kern kann in einer hydrophilen Hülle enthalten sein. Zum Beispiel
kann, wie in den Beispielen beschrieben, Paclitaxel in einen hydrophoben
Kern (z.B. von Poly-D,L-Milchsäure-PEG oder
MePEG-Aggregat), der eine hydrophile Hülle hat, aufgenommen werden.
-
Es
kann eine Vielzahl hydrophober Verbindungen aus den oben beschriebenen
polymeren Trägermitteln
freigesetzt werden einschließlich
zum Beispiel: bestimmte hydrophobe Verbindungen, die die Funktion
der Mikrotubuli beeinträchtigen,
wie zum Beispiel Paclitaxel und Estramustin; hydrophobe Proteine
wie zum Beispiel basisches Myelin-Protein, Proteolipid-Proteine
des ZNS-Myelins, hydrophobes Zellwandprotein, Porine, Membranproteine
(EMBO J. 12 (9): 3409–3415,
1993), Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein ("MOG")
(Biochem. and Mol. Biol. Int. 30 (5): 945–958, 1993), P27 Cancer Res.
53 (17): 4096–4101,
1993, Bacterioopsin, humanes Surfactant Protein ("HSB"; J. Biol. Chem.
268 (15): 11160–11166,
1993) und SP-B oder SP-C (Biochimica et Biophysica Acta 1105 (1):
161–169,
1992).
-
Typische
Beispiele der Aufnahme therapeutischer Wirkstoffe wie zum Beispiel
der oben beschriebenen in polymere Trägermittel zur Bildung einer
therapeutischen Zusammensetzung werden unten in den Beispielen ausführlicher
beschrieben.
-
Andere Trägermittel
-
Andere
Trägermittel,
die gleichermaßen
zur Aufnahme und/oder Freisetzung der hier beschriebenen therapeutischen
Wirkstoffe verwendet werden können,
beinhalten: Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
(Cserhati und Hollo, Int. J. Pharm. 108: 69–75, 1994), Liposomen (siehe
z.B. Sharma et al., Cancer Res. 53: 5877–5881, 1993; Sharma und Straubinger,
Pharm. Res. 11 (60): 889–896,1994;
WO 93/18751; U.S. Patent Nr. 5.242.073); Liposom/Gel (WO 94/26254),
Nanokapseln (Bartoli et al., J. Microencapsulation 7 (2): 191–197, 1990),
Mizellen (Alkan-Onyuksel et al., Pharm. Res. 11 (2): 206–212, 1994),
Implantate (Jampel et al., Invest. Ophthalm. Vis. Science 34 (11):
3076–3083,
1993; Walter et al., Cancer Res. 54: 2207–2212, 1994), Nanopartikel
(Violante und Lanzafame PAACR), Nanopartikel – modifiziert (U.S. Patent
Nr. 5.145.684), Nanopartikel (Oberfläche modifiziert) (U.S. Patent
Nr. 5.399.363), Taxol-Emulsion/Lösung
(U.S. Patent Nr. 5.407.683), Micelle (Tensid) (U.S. Patent Nr. 5.403.858),
synthetische Phospholipid-Verbindungen
(U.S. Patent Nr. 4.534.899), Gasdispersion (U.S. Patent Nr. 5.301.664),
flüssige
Emulsionen, Schaumspray, Gel, Lotion, Creme, Salbe, dispergierte
Bläschen,
Teilchen oder Tröpfchen,
Fest- oder Flüssigaerosole,
Mikroemulsionen (U.S. Patent Nr. 5.330.756), polymere Hüllen (Nano-
und Mikrokapseln) (U.S. Patent Nr. 5.439.686), Zu sammensetzungen
auf der Basis von Taxoiden in einem oberflächenaktiven Wirkstoff (U.S.
Patent Nr. 5.438.072), Emulsion (Tarr et al., Pharm Res. 4: 162–165, 1987)
Nanosphären
(Hagan et al., Proc. Intern. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 22,
1995; Kwon et al., Pharm Res. 12 (2): 192–195; Kwon et al., Pharm Res.
10 (7): 970–974;
Yokoyama et al., J. Contr. Rel. 32: 269–277, 1994; Gref et al., Science
263: 1600–1603,
1994; Bazile et al., J. Pharm. Sci. 84: 493–498, 1994) und Implantate
(U.S. Patent Nr. 4.882.168).
-
Wie
unten ausführlicher
erörtert
wird, können
therapeutische Wirkstoffe, die in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden und zur Bildung einer therapeutischen Zusammensetzung optional
in eines der hier beschriebenen Trägermittel aufgenommen werden,
zur Behandlung und Verhinderung einer Vielzahl vom Erkrankungen
hergestellt und eingesetzt werden.
-
Krankheitsbehandlung oder
-vorbeugung
-
Wie
oben erwähnt
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Paclitaxel
und Analogen und Derivaten zur Herstellung eines Medikaments zur
Behandlung oder Vorbeugung einer Vielzahl von Erkrankungen, die
mit der Verlegung von Hohlorganen in Verbindung stehen, einschließlich zum
Beispiel Gefäßkrankheiten,
neoplastische Obstruktionen, Entzündungskrankheiten und infektiöse Erkrankungen.
-
Zum
Beispiel können
in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung die therapeutischen Zusammensetzungen,
wie sie hier beschrieben sind, eingesetzt werden, um Gefäßkrankheiten,
die Obstruktionen des Gefäßsystems
verursachen, zu behandeln. Typische Beispiele solcher Erkrankungen
schließen
Atherosklerose aller Gefäße (um jede
Arterie, Vene oder jedes Transplantat) ein, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf: die Koronararterien, Aorta, Beckenschlagadern, Halsschlagadern,
Oberschenkelarterien, oberflächliche
Oberschenkelarterien, Arterien der Kniekehle und an der Stelle der
Anastomose eines Transplantats; Vasospasmen (z.B. koronare Vasospasmen
und Morbus Raynaud); Restenose (Verlegung eines Gefäßes an der
Stelle einer früheren
Intervention wie zum Beispiel Ballonangioplastie, Bypass-Chirurgie,
Stent-Implantation und Implantation eines Transplantats); entzündliche
Krankheiten und Autoimmunerkrankungen (z.B. Arteriitis temporalis, Vaskulitis).
-
In
Kürze haften
bei Gefäßerkrankungen
wie zum Beispiel der Atherosklerose weiße Blutkörperchen, besonders Monocyten
und T-Lymphocyten an Endothelzellen an, besonders an den Stellen,
wo sich Arterien verzweigen. Nach dem Anhaften an das Endothel wandern
die Leukocyten als Antwort auf chemotaktische Stimuli durch die
Endothelzellschicht und sammeln sich zusammen mit glatten Muskelzellen
in der Intima der Arterienwand an. Diese anfängliche Läsion in der Entwicklung von
Atherosklerose ist als „Fettstreifen" bekannt. Monocyten
im Fettstreifen differenzieren sich zu Makrophagen aus; und die
Makrophagen und glatten Muskelzellen nehmen zunehmend Lipide und
Lipoproteine auf, um sich zu Schaumzellen zu entwickeln.
-
Mit
der Akkumulation von Makrophagen wird das darüber liegende Endothel mechanisch
gesprengt und chemisch durch oxidiertes Lipid, Sauerstoffradikale
und Proteasen, die von den Makrophagen freigesetzt werden, verändert. Schaumzellen
fressen sich durch das oberflächliche
Endothel und verursachen Mikroläsionen
der Gefäßwand. Der
Kontakt von potenziell thrombogenem subendothelialen Gewebe (wie
zum Beispiel von Kollagen und anderen Proteinen) mit Komponenten
des Blutstroms führt
zum Anhaften von Plättchen
im Bereichen des unterbrochenen Endothels. Das Anhaften von Plättchen und
andere Ereignisse lösen
die Herstellung und Freisetzung von Wachstumsfaktoren in diese Umgebung
aus, einschließlich
des Plättchen-Wachstumsfaktors
(PDGF), Plättchen-aktivierenden
Faktors (PAF) und der Interleukine 1 und 6 (IL-1, IL-6). Es wird
vermutet, dass diese parakrinen Faktoren das Einwandern und die
Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen
(VSMC) stimulieren.
-
In
der normalen (nicht erkrankten) Blutgefäßwand besitzen die glatten
Gefäßmuskelzellen
einen kontraktilen Phänotyp
und haben eine geringe Mitoseaktivität. Unter dem Einfluss von Zytokinen
und Wachstumsfaktoren, die von Blutplättchen, Makrophagen und Endothelzellen
freigesetzt werden, durchlaufen die VSMC jedoch eine Änderung
des Phänotyps
von reifen, kontraktilen Zellen zu unreifen, sekretorischen Zellen.
Die transformierten VSMC proliferieren in der Media der Blutgefäßwand, wandern
in die Intima, proliferieren in der Intima weiter und sondern große Mengen
von extrazellulärer
Matrix ab. Dies wandelt die sich entwickelnde Gefäßläsion in
eine fibröse
Plaque um. Die von sekretorischen VSMC abgesonderte extrazelluläre Matrix
schließt Kollagen,
Elastin, Glykoprotein und Glykosaminoglykane ein, wobei Kollagen
die hauptsächliche
Komponente der extrazellulären
Matrix der atherosklerotischen Plaque umfasst. Elastin und Glykosaminoglykane
binden Lipoproteine und tragen auch zur Größenzunahme der Läsion bei.
Die fibröse
Plaque besteht aus einer fibrösen Abdeckung
aus dichtem Bindegewebe unterschiedlicher Dicke, die glatte Muskelzellen
und aufliegende Makrophagen, T-Zellen und extrazelluläres Material
enthält.
-
Zusätzlich zu
PDGF, IL-1 und IL-6 werden von den Zellen, die die Gefäßwand infiltrieren,
weitere mitogene Faktoren produziert, einschließlich: transformierender Wachstumsfaktor
beta (TGF-β),
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Thrombospondin, Serotonin, Thromboxan
A2, Noradrenalin und Angiotensin II. Die führt zur Rekrutierung weiterer
Zellen, Absonderung von weiterer extrazellulärer Matrix und zur Ansammlung
von zusätzlichem
Lipid. Dies vergrößert die
atherosklerotische Läsion
zunehmend, bis sie erheblich auf das Gefäßlumen übergreift. Zunächst verursacht
behinderter Blutfluss durch die Gefäßröhre nur dann eine Ischämie des
Gewebes distal der atherosklerotischen Plaque, wenn ein erhöhter Fluss
benötigt
wird – später, wenn
die Läsion
die Arterie zunehmend blockiert, tritt Ischämie in Ruhe auf.
-
Makrophagen
in der sich vergrößernden
atherosklerotischen Plaque setzen oxidiertes Lipid, freie Radikale,
Elastasen und Kollagenasen frei, die eine Zellschädigung und
Nekrose benachbarter Gewebe verursachen. Die Läsion entwickelt einen nekrotischen
Kern und wird in eine komplexe Plaque umgewandelt. Komplexe Plaques
sind instabile Läsionen,
die aufbrechen und eine Embolisierung verursachen können; oder
eine lokale Blutung (infolge einer Ruptur der Vasa vasorum, die
die Plaque versorgen, was zu einer Verlegung des Lumens durch die
schnelle Ausbreitung der Läsion
führt);
oder eine Ulceration und Bildung einer Fissur (dies bringt den thrombogenen
nekrotischen Kern mit dem Blutstrom in Verbindung und erzeugt eine
lokale Thrombose oder eine distale Embolisierung). Auch wenn keine
der oben genannten Folgeerscheinungen auftreten sollte, kann sich
der adhärente
Thrombus organisieren und in die Plaque aufgenommen werden und somit
ihr Wachstum beschleunigen. Weiterhin wird mit der Erhöhung der
lokalen Konzentrationen von Fibrinogen und Thrombin die Proliferation
glatter Gefäß muskelzellen
in der Media und Intima stimuliert; ein Prozess, der schließlich auch
zu einer zusätzlichen
Verengung des Gefäßes führt.
-
Die
Intima und die Media normaler Arterien werden aus dem Lumen der
Arterie oder von den Vasa vasorum in der Adventitia mit Sauerstoff
und Nährstoffen
versorgt. Mit der Entwicklung einer atherosklerotischen Plaque sprossen
Mikrogefäße, die
aus den adventitiellen Vasa vasorum entspringen, in die verdickte Intima
und Media ein. Dieses Gefäßgeflecht
wird mit einer Verschlimmerung der Plaque weitreichender und verkleinert
sich mit einem Rückgang
der Plaque.
-
Eine
Blutung aus diesen Mikrogefäßen kann
eine plötzliche
Ausdehnung und Ruptur der Plaque in Verbindung mit einer Dissektion
der Arterie, einer Ulceration oder einer Thrombose herbeiführen. Es
wurde auch postuliert, dass das Austreten von Plasmaproteinen aus
diesen Mikrogefäßen entzündliche
Infiltrate in diese Bereiche zieht und dass diese entzündlichen
Zellen zum schnellen Wachstum der atherosklerotischen Plaque und
den damit verbundenen Komplikationen beitragen (durch lokales Ödem und
Entzündung).
-
In
anderen Gesichtspunkten der Erfindung werden Paclitaxel und Analoga
oder Derivate eingesetzt, um neoplastische Obstruktionen zu behandeln.
In Kürze
sollte, wie hier verwendet, eine neoplastische Obstruktion" so aufgefasst werden,
dass sie jegliche neoplastische (benigne oder maligne) Verstopfung
einer Röhre im
Körper
einschließt,
ungeachtet der Lokalisation der Röhre oder des histologischen
Typs des vorliegenden malignen Tumors. Typische Beispiele beinhalten
gastrointestinale Erkrankungen (z.B. oropharyngeales Karzinom (Adenokarzinom), Ösophaguskarzinom
(squamöses
Karzinom, Adenokarzinom, Lymphom, Melanom), Magenkarzinom (Adenokarzinom,
Linitis plastica, Lymphom, Leiomyosarkom), Dünndarmtumore (Adenome, Leiomyome,
Lipome, Adenokarzinome, Lymphome, Karzinoi-Tumore), Dickdarmkrebs
(Adenokarzinom) und anorektales Karzinom; Gallenwegserkrankungen
(z.B. Neoplasmen, die zum Verschluß von Gallenwegen führen, wie
zum Beispiel Pankreaskarzinom (duktales Adenokarzinom, Inselzelltumore,
Cystadenokarzinom), Cholangiokarzinom und hepatozelluläres Karzinom);
Lungenerkrankungen (z.B. Karzinome der Lunge und/oder der trachea len/bronchialen
Hohlorgane (kleinzelliger Lungenkrebs, nicht kleinzelliger Lungenkrebs); Erkrankung
des weiblichen Genitaltrakts (z.B. bösartige Tumore der Eileiter,
Gebärmutterkrebs,
Gebärmutterhalskrebs,
Scheidenkrebs); Erkrankungen des männlichen Genitaltrakts (z.B.
Hodenkrebs, Krebs der Nebenhoden, Tumore des Samenleiters, Prostatakrebs,
benigne Prostatahyperplasie); und Erkrankungen des Harntrakts (z.B.
Nierenzellkarzinom, Nierenbeckentumore, Tumore des Harnableitungssystems
wie zum Beispiel Übergangszellkarzinom,
Blasenkarzinom und Verlegungen der Harnröhre aufgrund von benignen Strikturen oder
malignen Tumoren).
-
Als
Beispiel ist die benigne Prostatahyperplasie (BPH) eine als Reaktion
auf eine verlängerte
androgene Stimulation auftretende Vergrößerung der Prostata, besonders
des zentralen Teils der Drüse,
die die Harnröhre
umgibt. Sie betrifft mehr als 80% der Männer in einem Alter über 50 Jahre.
Diese Vergrößerung kann zur
Kompression des Teils der Harnröhre
führen,
der durch die Prostata verläuft,
was zu einer Verlegung des Blasenausflusstraktes führt, d.h.
es ist ein unnormal hoher Blasendruck erforderlich, um einen Urinfluss
hervorzurufen. 1980 wurden in den Vereinigten Staaten 367.000 transurethrale
Resektionen der Prostata als Behandlung von BPH vorgenommen. Andere
Therapien schließen
medikamentöse
Behandlung, transurethrale Sphinkterotomie, transurethrale Laser-
oder Mikrowellenanwendung, transurethrale Hyperthermie, transurethralen
Ultraschall, transrektale Mikrowellenanwendung, transrektale Hyperthermie,
transrektalen Ultraschall und chirurgische Entfernung ein. Alle
haben Nachteile einschließlich
einer Unterbrechung des Sphinktermechanismus, was zu Inkontinenz
und zur Bildung von Strikturen führt.
-
Um
neoplastische Erkrankungen wie zum Beispiel die oben erörterten
zu behandeln kann eine Vielzahl therapeutischer Wirkstoffe (entweder
mit oder ohne polymeres Trägermittel)
an den äußeren Teil
des Hohlorgans oder an glatte Muskelzellen über die Adventitia des Hohlorgans
abgegeben werden. In dieser Hinsicht besonders bevorzugte therapeutische
Wirkstoffe schließen
oben erörterte
antiangiogene, antiproliferative oder antineoplastische Wirkstoffe
ein, einschließlich
zum Beispiel Verbindungen, die die Funktion der Mikrotubuli stören, wie
zum Beispiel Paclitaxel und Derivate oder Analoga davon.
-
Zum
Beispiel wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Nadel oder
ein Katheter Ultraschall-gesteuert über den transrektalen Zugang
(oder alternativ transperineal) in die an die Harnröhre angrenzende
Prostata gelenkt und durch diese wird ein therapeutischer Wirkstoff
vorzugsweise in mehrere Quadranten der Drüse, besonders um die Harnröhre, abgegeben.
Die Nadel oder der Katheter kann auch unter direkter Palpation oder
endoskopisch, fluoroskopisch, CT- oder MRI-gesteuert platziert werden
und in Intervallen verabreicht werden. Als Alternative kann auch
ein Einbringen von Pellets über
einen Katheter oder Trokar durchgeführt werden. Die obigen Verfahren
können
allein oder in Verbindung mit einem in die prostatische Urethra
eingelegten Stent durchgeführt
werden. Dadurch, dass Manipulation mit Instrumenten in der Urethra
oder eine Schädigung
der Urethra vermieden werden, würde
der Sphinktermechanismus intakt gelassen und Inkontinenz vermieden
werden und eine Striktur ist weniger wahrscheinlich.
-
In
anderen Gesichtspunkten ist die Erfindung zur Vorbeugung oder Behandlung
entzündlicher
Erkrankungen, die die Obstruktion eines Hohlorgans verursachen,
nützlich.
Entzündliche
Erkrankungen schließen
sowohl akute als auch chronische Entzündung, die zur Obstruktion
einer Reihe von Körperröhren führen, ein.
Typische Beispiele beinhalten Vaskulitis (z.B. Riesenzellarterütis (Arteriitis
temporalis, Takayasu-Arteriitis), Polyarteriitis nodosa, allergische
Angiitis und Granulomatose (Churg-Strauss-Syndrom), Polyangütis-Overlap-Syndrom,
Hypersensitivität-Vaskulitis
(Purpura Schoenlein-Henoch),
Serumkrankheit, Arzneimittel-induzierte Vaskulitis, infektiöse Vaskulitis,
neoplastische Vaskulitis, Vaskulitis in Verbindung mit Erkrankungen
des Bindegewebes, Vaskulitis in Verbindung mit angeborenen Defekten
des Komplementsystem), Wegener'sche
Granulomatose, Kawasaki-Syndrom, Vaskulitis des Zentralnervensystems,
Buerger-Syndrom und systemische Sklerose); Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes
(z.B. Pankreatitis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Proctitis ulcerosa,
primär
sklerosierende Cholangitis, benigne Strikturen jeglicher, einschließlich idiopathischer
Ursache (z.B. Strikturen der Gallengänge, des Ösophagus, des Duodenums, des
Dünndarms
oder des Colons)); Krankheiten des Respirationstraktes (z.B. Asthma,
Hypersensitivitäts-Pneumonie,
Asbestose, Silikose und andere Formen der Pneumokoniose, chronische
Bronchitis und chronisch obstruktive Atemwegserkrankung); Erkrankungen
des Ductus nasolacrimalis (z.B. Strikturen aus allen, einschließlich idiopathischen
Ursachen); und Erkrankungen der Tuba Eustachii (z.B. Strikturen
aus allen, einschließlich
idiopathischen Ursachen).
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In
wieder anderen Gesichtspunkten ist die Erfindung zur Vorbeugung
oder Behandlung von Infektionskrankheiten, die mit der Obstruktion
eines Hohlorgans in Verbindung stehen oder sie verursachen, nützlich.
In Kürze
schließen
Infektionskrankheiten verschiedene akute und chronische infektiöse Prozesse
ein, die zur Obstruktion von Hohlorganen führen können, einschließlich zum
Beispiel Obstruktionen des männlichen
Genitaltrakts (z.B. Strikturen aufgrund von Urethritis, Epididymitis,
Prostatitis); Obstruktionen des weiblichen Genitaltrakts (z.B. Vaginitis,
Cervicitis, entzündliche
Beckenerkrankungen (z.B. Tuberkulose, Gonokokken, Chlamydien, Enterokokken
und Syphilis); Obstruktionen des Harntrakts (z.B. Zystitis, Urethritis);
Obstruktionen des Respirationstraktes (z.B. chronische Bronchitis,
Tuberkulose, andere Infektionen durch Mykobakterien, (MAI etc.),
anaerobe Infektionen, Pilzinfektionen und parasitäre Infektionen)
und cardiovasculärer
Obstruktionen (z.B. mykotische Aneurysmen und infektiöse Endocarditits).
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Um
Infektionskrankheiten wie zum Beispiel die oben erörterten
zu behandeln kann eine Vielzahl therapeutischer Wirkstoffe (entweder
mit oder ohne Trägermittel)
an den äußeren Teil
des Hohlorgans oder an glatte Muskelzellen über die Adventitia des Hohlorgans
abgegeben werden.
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Formulierung und Verabreichung
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Wie
oben erwähnt
können
von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte therapeutische Zusammensetzungen
in einer Reihe von Arten (z.B. Mikrosphären, Pasten, Filme oder Sprays)
formuliert werden. Weiterhin können
die Zusammensetzungen so formuliert werden, dass sie mehrere therapeutische
Wirkstoffe enthalten, dass sie eine Reihe zusätzlicher Verbindungen enthalten,
dass sie bestimmte physikalische Eigenschaften haben (z.B. Elastizität, einen
besonderen Schmelzpunkt oder eine vorgegebene Freisetzungsrate).
In bestimmten Ausführungsformen
können
Zusammensetzungen kombiniert werden, um einen erwünschten
Effekt zu erzielen (z.B. können
verschiedene Mikrosphären-Aufbereitungen
kombiniert werden, um sowohl eine schnelle als auch eine langsame oder
anhaltende Freisetzung von einem oder mehreren antiangiogenen Faktoren
zu erreichen).
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Die
von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten therapeutischen
Wirkstoffe und Zusammensetzungen können entweder allein oder in
Kombination mit pharmazeutisch oder physiologisch akzeptablen Trägem, Vehikeln
oder Verdünnungsmitteln
verabreicht werden. Generell sollten solche Träger in den verabreichten Dosierungen
und Konzentrationen für
die Empfänger
nicht toxisch sein. Gewöhnlich
ist die Herstellung solcher Zusammensetzungen mit Kombinationen
des therapeutischen Wirkstoffs mit Puffern, Antioxidantien wie zum
Beispiel Ascorbinsäure,
Polypeptiden mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10
Reste), Proteinen, Aminosäuren,
Kohlenhydraten einschließlich
Glucose, Saccharose oder Dextrinen, Chelatbildnern wie zum Beispiel
EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Vehikeln verbunden.
Neutral gepufferte Salzlösung
oder mit unspezifischem Serumalbumin gemischte Salzlösung sind
beispielhaft geeignete Verdünnungsmittel.
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Wie
oben erwähnt
können
die hier bereitgestellten therapeutischen Wirkstoffe, therapeutischen
oder pharmazeutischen Zusammensetzungen so zubereitet werden, dass
sie über
eine Reihe von verschiedenen Wegen verabreicht werden können, einschließlich zum
Beispiel unmittelbar an ein Hohlorgan unter direkter Sicht (z.B.
bei der Operation oder über
endoskopische Verfahren) oder über
perkutane Arzneimittelzufuhr zur äußeren (adventitiellen) Oberfläche des
Hohlorgans (z.B. perivaskuläre
Zufuhr). Andere typische Wege zur Verabreichung beinhalten Gastroskopie,
ERCP und Coloskopie, die keine vollständigen operativen Maßnahmen
und keine Hospitalisierung erfordern, aber die Anwesenheit von medizinischem
Personal voraussetzen können.
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In
Kürze ist
eine perivaskuläre
Arzneimittelzufuhr mit einer perkutanen Verabreichung von lokal
wirkenden (oft in Retardform) therapeutischen Formulierungen unter
Verwendung einer Nadel oder eines Katheters, die über Ultraschall-,
CT-, fluoroskopische, MRI- oder
endoskopische Steuerung zur erkrankten Stelle dirigiert werden,
verbunden. Alternativ kann die Maßnahme intraoperativ unter
direkter Sicht oder mit zusätzlicher
Steuerung durch Bildgebung vorgenommen werden. Solch eine Maßnahme kann
auch im Zu sammenhang mit endovaskulären Verfahren wie zum Beispiel
einer Angioplastie, Atherektomie oder dem Einbringen von Stents
oder in Verbindung mit einem arteriellen Operationsverfahren wie
zum Beispiel einer Endarteriektomie, einer Gefäß- oder Transplantatkonektur
oder einer Implantation eines Transplantats vorgenommen werden.
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Zum
Beispiel können
in einer Ausführungsform
polymere Paclitaxel-Formulierungen in die Gefäßwand injiziert oder auf die
adventitielle Oberfläche
aufgebracht werden, womit höchste
Arzneimittelkonzentrationen dort ermöglicht werden, wo die biologische
Aktivität
am meisten benötigt
wird. Dies hat das Potenzial, den lokalen „Auswascheftekt" des Arzneimittels
zu verringern, der durch den dauernden Blutfluss über die
Oberfläche
einer endovaskulären
Vorrichtung zur Arzneimittelabgabe (wie zum Beispiel ein Arzneimittelbeschichteter Stent)
zur Geltung kommen kann. Die Verabreichung wirksamer therapeutischer
Wirkstoffe an die äußere Oberfläche einer
Gefäßröhre kann
die Obstruktion der Röhre
vermindern und das Risiko von Komplikationen, die mit intravaskulären Maßnahmen
verbunden sind (wie zum Beispiel Restenose, Embolisierung, Thrombose, Plaque-Ruptur und systemische
Toxizität
des Arzneimittels), verringern.
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Zum
Beispiel würde
bei einem Patienten mit einer Verengung der Arteria femoralis superficialis
eine Ballonangioplastie auf die herkömmliche Art durchgeführt werden
(d.h. Durchfahren der Arterie mit einem Katheter zur Ballonangioplastie über einen
Führungsdraht
und Aufpumpen des Ballons über
der Läsion).
Vor, während
und nach der Angioplastie würde
eine Nadel Ultraschall-, fluoroskopisch oder CT-gesteuert durch
die Haut eingeführt
und ein therapeutischer Wirkstoff (z.B. in ein langsam freisetzendes
Polymer imprägniertes
Paclitaxel) würde
durch die Nadel oder den Katheter ringförmig direkt um den Bereich
der Einengung der Arterie infiltriert werden. Dies könnte um
jede Arterie, jede Vene oder jedes Transplantat herum durchgeführt werden, aber
ideale Kandidaten für
diese Intervention schließen
Erkrankungen der Halsschlagadern, der Koronarien, der Arteriae iliacae,
femorales communes, femorales superficiales, popliteae und die Stellen
einer Transplantatanastomose ein. Folgenchtige venöse Anwendungsstellen
schließen
eine Infiltration um Venen, in die Verweilkatheter eingelegt sind,
ein.
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Die
hier bereitgestellten therapeutischen Wirkstoffe, therapeutischen
und pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusammen mit Verpackungsmaterial,
das Anweisungen für
den Gebrauch solcher Materialien bereitstellt, in Behältern untergebracht
werden. Im Allgemeinen beinhalten solche Anweisungen eine konkrete
Aussage über
die Konzentration der Reagenzien und in bestimmten Ausführungsformen
auch über die
jeweiligen Mengen von Vehikel-Bestandteilen oder Verdünnungsmitteln
(z.B. Wasser, Salzlösung
oder PBS), die zur Rekonstitution des antiangiogenen Faktors, der
antiangiogenen Zusammensetzung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung
erforderlich sein können.
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Die
folgenden Beispiele werden als Veranschaulichung aufgeführt, nicht
als Einschränkung.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Herstellung von „Pasten"
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Wie
oben erwähnt
verwendet die vorliegende Erfindung eine Reihe von Arzneimittelzusammensetzungen,
die Polymere enthalten und in einer Reihe von klinischen Situationen
eingesetzt werden können.
Zum Beispiel können
Zusammensetzungen hergestellt werden: (1) als „Thermopaste", die als Flüssigkeit
auf eine gewünschte
Stelle appliziert wird und sich bei einer bestimmten Temperatur
(z.B. Körpertemperatur)
zu einem Feststoff der gewünschten
Form verfestigt; (2) als Spray (d.h. „Nanospray"), das entweder direkt oder durch eine
spezialisierte Apparatur (z.B. Endoskopie) an eine gewünschte Stelle
zugeführt
werden kann und welches sich nachfolgend zu einem Feststoff verfestigt,
der an dem Gewebe, auf das er appliziert wurde, anhaftet; (3) als
anhaftender, biegsamer, elastischer, arzneimittelbeladener Polymerfilm,
der entweder direkt oder durch eine spezialisierte Apparatur auf
eine gewünschte
Stelle appliziert wird und der vorzugsweise an der Stelle, auf die
er appliziert wurde, anhaftet, und (4) als Flüssigkeit, die sich aus einer
Suspension von Mikrosphären in
einem geeigneten Trägermedium
zusammensetzt und entweder direkt oder durch eine spezialisierte
Apparatur auf eine gewünschte
Stelle appliziert wird und eine Schicht von Mikrosphären auf
der Applikati onsstelle zurücklässt. Typische
Beispiele einer jeder der oben genannten Ausführungsformen werden unten ausführlicher
dargelegt.
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A. Verfahren zur Herstellung
einer Thermopaste
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Die
im Rahmen dieser Experimente eingesetzten Reagenzien und Geräte beinhalten
eine sterile Glasspritze (1 ml), einen Coming Heizplattenrührer, ein
20 ml Szintillationsgefäß aus Glas,
Gussformen (z.B. einen 50 μl
DSC-Tiegel oder den inneren Teil des Deckels von einem 50 ml Zentrifugenröhrchen),
Skalpell und Pinzette, Polycaprolacton ("PCL" – Molekulargewicht
10.000 bis 20.000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania USA) und
Paclitaxel (Sigma, Qualität
mindestens 95% Reinheit).
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Man
wiege 5,00 g PCL direkt in ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas
ein. Man gebe das Gefäß in einen
600 ml Becher mit 50 ml Wasser. Man erhitze den Becher behutsam
auf 65°C
und halte ihn für
20 Minuten bei dieser Temperatur. Dies ermöglicht es dem Polymer zu schmelzen.
Man mische ein bekanntes Gewicht von Paclitaxel oder von einem anderen
Hemmstoff der Angiogenese gründlich
bei 65°C
in das geschmolzene Polymer ein. Man gieße das geschmolzene Polymer
in eine vorgewärmte
(60°C-Ofen)
Gussform. Man verwende einen Spatel, um den Vorgang des Gießens zu
unterstützen.
Man lasse die Gussform abkühlen,
so dass das Polymer fest wird. Man schneide oder breche das Polymer
in kleine Stücke
(ungefähr
in einer Größe von 2
mm mal 2 mm). Diese Stücke
müssen
in eine 1 ml Glasspritze passen. Man entferne den Kolben aus der
1 ml Glasspritze (man entferne nicht die Abdeckkappe von der Spitze)
und lege sie auf eine Waage. Man setze die Waage auf Null.
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Man
wiege 0,5 g der Stücke
direkt in das offene Ende der Spritze. Man stelle die Spritze aufrecht
(mit der abgedeckten Spitze nach unten) in ein 500 ml Becherglas
mit destilliertem Wasser bei 65°C
(Coming Heizplattenrührer),
so dass kein Wasser in das Gebinde eindringt. Das Polymer schmilzt
innerhalb von 10 Minuten in dieser Apparatur vollständig. Wenn
die Polymerstücke
geschmolzen sind, entferne man das Gebinde aus dem Wasserbad, halte
es horizontal und entferne die Abdeckkappe. Man führe den
Kolben in das Gebinde ein und presse das geschmolzene Polymer zu
einer klebrigen Masse an der Spitze des Gebindes zusammen. Man verschließe die Spritze
und lasse sie auf Raumtemperatur abkühlen.
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Zur
Anwendung kann die Spritze erneut auf 60°C erhitzt und als Flüssigkeit,
die sich bei Abkühlung auf
Körpertemperatur
verfestigt, verabreicht werden.
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B. Verfahren zur Herstellung
eines Nanosprays
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Nanospray
ist eine Suspension kleiner Mikrosphären in Salzlösung. Wenn
die Mikrosphären
sehr klein sind (d.h. unter 1 μm
Durchmesser), bilden sie ein Kolloid, so dass die Suspension unter
Schwerkraft nicht sedimentiert. Wie unten detaillierter beschrieben
kann eine Suspension von 0,1 μm
bis 1 μm
Mikropartikeln hergestellt werden, die zur Ablagerung auf Gewebe
durch ein handgepumptes Aerosol geeignet ist. Materialien und Geräte, die
zur Herstellung von Nanospray eingesetzt werden können, beinhalten
einen 200 ml wasserummantelten Becher (Kimax oder Pyrex), ein zirkulierendes
Wasserbad von Haake, ein Rührwerk
und einen Regler mit 2 Inch Durchmesser (4-Blatt-Propeller-Typ-Rührer aus
rostfreiem Stahl; Marke Fisher), ein 500 ml Becherglas, einen Heizplattenrührer (Marke
Corning), 4 × 50
ml Polypropylen Zentrifugenröhrchen
(Nalgene), Szintillationsgefäße aus Glas
mit Plastikeinsatzdeckeln, eine Tischzentrifuge (Beckman), eine
Hochgeschwindigkeits-Standzentrifuge (JS 21 von Beckman), eine Analysenwaage
von Mettler (AJ 100, 0,1 mg), eine von oben zu beladende Digitalwaage
von Mettler (AE 163, 0,01 mg), ein automatisches Pipettiergerät (Gilson),
sterile Pipettenspitzen, einen 20 ml Handzerstäuber (Pfeiffer pharmaceuticals),
eine Abzugshaube mit Laminarfluss, Polycaprolacton ("PCL" – Molekulargewicht 10.000 bis
20.000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania USA), "gewaschenes" (siehe oben) Ethylenvinylacetat
("EVA"), Poly(DL)milchsäure ("PLA" Molekulargewicht 15.000
bis 25.000; Polysciences), Polyvinylalkohol ("PVA" – Molekulargewicht
124.000 bis 186.000, 99% hydrolysiert; Aldrich Chemical Co., Milwaukee,
WI USA), Dichlormethan ("DCM" oder "Methylenchlorid"; HPLC-Qualität, Fisher
scientific), destilliertes Wasser, sterile Salzlösung (Becton and Dickenson
oder gleichwertig).
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1. Zubereitung von 5%
(Gew./Vol.) Polymerlösungen
-
Abhängig von
der Polymerlösung,
die hergestellt wird, wiege man entweder 1,00 g PCL oder PLA oder jeweils
0,50 g PLA und gewaschenes EVA direkt in ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas
ein. Unter Verwendung eines Messzylinders füge man 20 ml DCM zu und verschließe das Gefäß dicht.
Man belasse das Gefäß für eine Stunde
oder solange, bis sich das gesamte Polymer aufgelöst hat (gelegentliches
Schütteln
mit der Hand kann angewendet werden), bei Raumtemperatur (25°C). Die Auflösung des
Polymers kann durch visuelle Überprüfung festgestellt
werden; die Lösung
sollte klar sein. Man kennzeichne das Gefäß mit dem Namen der Lösung und
dem Datum, an dem sie hergestellt wurde. Man bewahre die Lösungen bei
Raumtemperatur auf und verwende sie innerhalb von zwei Wochen.
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2. Zubereitung einer 3,5%
(Gew./Vol.) PVA-Stammlösung
-
Die
Lösung
kann zubereitet werden, indem der unten angegebene Ablauf nachvollzogen
wird oder indem die 5% (Gew./Vol.) PVA-Stammlösung, die für die Herstellung von Mikrosphären zubereitet
wurde (siehe Beispiel 2), verdünnt
wird. In Kürze
werden 17,5 g PVA direkt in ein 600 ml Becherglas eingewogen und
500 ml destilliertes Wasser werden zugegeben. Man gebe einen 3 Inch
Rührstab,
der mit Teflon beschichtet ist, in den Becher. Man bedecke den Becher
mit einem Abdeckglas, um Verluste durch Verdunstung zu reduzieren. Man
platziere den Becher in ein 2000 ml Becherglas, das 300 ml Wasser
enthält.
Dies wird als Wasserbad wirken. Man rühre den PVA mit 300 Upm bei
85°C (Corning
Heizplattenrührer)
für 2 Stunden
oder solange, bis er vollständig
aufgelöst
ist. Die Auflösung
des PVA kann durch visuelle Überprüfung festgestellt
werden; die Lösung
sollte klar sein. Man verwende eine Pipette, um die Lösung in
einen verschraubbaren Vorratsbehälter aus
Glas zu überführen und
bewahre sie für
maximal zwei Monate bei 4°C
auf. Diese Lösung
sollte vor Verwendung oder Verdünnung
auf Raumtemperatur erwärmt
werden.
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3. Verfahren zur Herstellung
von Nanospray
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Man
stelle den Rühr-Aufbau
unter eine Abzugshaube. Man gebe 100 ml der 3,5% PVA-Lösung in den 200 ml wasserummantelten
Becher. Man schließe
das Haake-Wasserbad an den Becher an und lasse den Inhalt bei 27°C (+/–1°C) 10 Minuten äquilibrieren.
Man stelle die Startgeschwindigkeit des Rührwerks auf 3.000 Upm (+/–200 Upm)
ein. Man platziere das Blatt des Rührwerks in Höhe der Mitte
der PVA-Lösung
und starte das Rührwerk.
Man lasse unter Verwendung eines automatischen 5 ml Pipettiergeräts 10 ml
der Polymerlösung
(die verwendete Polymerlösung
basierend auf der Art des Nanosprays, das hergestellt wird) über einen Zeitraum
von 2 Minuten in den gerührt
werdenden PVA eintropfen. Nach 3 Minuten verstelle man die Rührgeschwindigkeit
auf 2.500 Upm (+/–200
Upm) und belasse den Aufbau für
2,5 Stunden. Nach 2,5 Stunden entferne man das Rührblatt aus dem Nanospray-Ansatz
und spüle
es mit 10 ml destillierten Wassers ab. Man lasse die Spüllösung in
den Nanospray-Ansatz fließen.
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Man
gieße
den Mikrosphären-Ansatz
in einen 500 ml Becher. Man spüle
das ummantelte Wasserbad mit 70 ml destillierten Wassers. Man lasse
die 70 ml Spüllösung in
den Mikrosphären-Ansatz
fließen.
Man rühre den
180 ml Mikrosphären-Ansatz
mit einem Glasstab und gieße
gleiche Mengen davon in vier 50 ml Polypropylen Zentrifugenröhrchen.
Man verschließe
die Röhrchen.
Man zentrifugiere die verschlossenen Röhrchen bei 10.000 g (+/–1.000 g)
für 10
Minuten. Man ziehe unter Verwendung eines automatischen 5 ml Pipettiergeräts oder
einer Vakuum-Saugung 45 ml der PVA-Lösung von jedem Mikrosphären-Pellet
ab und verwerfe sie. Man gebe 5 ml destilliertes Wasser in jedes
Zentnfugenröhrchen
zu und verwende einen Vortex, um die Mikrosphären in jedem Röhrchen zu
resuspendieren. Unter Verwendung von 20 ml destillierten Wassers
vereinige man die vier Mikrosphären-Suspensionen
in einem Zentrifugenröhrchen.
Zum Waschen der Mikrosphären zentrifugiere
man den Nanospray-Ansatz für
10 Minuten bei 10.000 g (+/–1.000
g). Man ziehe den Überstand vom
Mikrosphären-Pellet
ab. Man gebe 40 ml destilliertes Wasser hinzu und verwende einen
Vortex, um die Mikrosphären
zu resuspendieren. Man wiederhole diesen Vorgang zweimal zu insgesamt
drei Waschgängen. Man
führe einen
vierten Waschgang durch, verwende aber nur 10 ml (nicht 40 ml) destilliertes
Wasser, um die Mikrosphären
zu resuspendieren. Nach dem vierten Waschgang fülle man den Mikrosphären-Ansatz
in ein vorgewogenes Szintillationsgefäß aus Glas um.
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Man
verschließe
das Gefäß und lasse
es für
1 Stunde bei Raumtemperatur (25°C)
ruhen, um die Mikrosphären
von 2 μm
und 3 μm
Durchmesser unter Schwerkraft sedimen tieren zu lassen. Nach 1 Stunde
ziehe man unter Verwendung eines automatischen 5 ml Pipettiergeräts 9 ml
der Suspension ab. Man gebe die 9 ml in ein steriles, verschlossenes
50 ml Zentrifugenröhrchen.
Man zentrifugiere die Suspension für 10 Minuten bei 10.000 g (+/–1.000 g).
Man verwerte den Überstand
und resuspendiere das Pellet in 20 ml steriler Salzlösung. Man
zentrifugiere die Suspension für
10 Minuten bei 10.000 g (+/–1.000
g). Man verwerte den Überstand
und resuspendiere das Pellet in steriler Salzlösung. Die Menge der verwendeten
Salzlösung
hängt von
der endgültig
erforderlichen Konzentration (üblicherweise
10% Gew./Vol.) der Suspension ab. Man spüle die Aerosol-Ausrüstung gründlich in
steriler Salzlösung
und gebe die Nanospray-Suspension zu dem Aerosol.
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C. Herstellung eines mit
Paclitaxel beladenen Nanosprays
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Zur
Herstellung von Nanospray, das Paclitaxel enthält, verwende man Paclitaxel
(Sigma Qualität
95% Reinheit). Zur Zubereitung einer Polymer-Arzneimittel-Stammlösung wiege
man die angemessene Menge Paclitaxel direkt in ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas
ein. Die angemessene Menge wird auf Basis des Prozentsatzes Paclitaxel,
der im Nanospray vorliegen soll, bestimmt. Zum Beispiel würde, wenn
ein Nanospray, das 5% Paclitaxel enthält, benötigt würde, die Menge des abgewogenen
Paclitaxels 25 mg betragen, weil die Menge des zugegebenen Polymers
10 ml einer 5%-Polymer-in-DCM-Lösung (siehe
nächster
Schritt) beträgt.
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Man
gebe 10 ml der geeigneten 5% Polymerlösung in das Gefäß, das das
Paclitaxel enthält.
Man verschließe
das Gefäß und vortexe
es oder mische es manuell, um das Paclitaxel aufzulösen (visuelle Überprüfung, um
sicherzustellen, dass das Paclitaxel aufgelöst wurde). Man kennzeichne
das Gefäß mit dem
Herstellungsdatum. Dies soll an dem Tag, an dem es hergestellt wird,
verwendet werden.
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Man
vollziehe man die oben beschriebenen Abläufe nach, mit der Ausnahme,
dass die Polymerlösung durch
die Polymer-Arzneimittel-Stammlösung
(z.B. Paclitaxel) ersetzt wird.
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D. Verfahren zur Herstellung
eines Films
-
Der
Begriff Film bezieht sich auf ein Polymer, das in einer von vielen
geometrischen Formen ausgebildet ist. Der Film kann eine dünne, elastische
Polymerbahn sein oder eine 2 mm dicke Polymerscheibe. Der Film ist
dazu vorgesehen, auf offenes Gewebe aufgebracht zu werden, so dass
jedes eingeschlossene Arzneimittel aus dem Polymer über eine
lange Zeitspanne gewebsseitig freigesetzt wird. Die Filme können in
verschiedenen Verfahren hergestellt werden, einschließlich zum
Beispiel durch Guss oder Aufsprühen.
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In
der Gusstechnik wird das Polymer entweder geschmolzen und in eine
Form gegossen oder in Dichlormethan gelöst und in eine Form gegossen.
Das Polymer erstarrt jeweils dann, wenn es entweder abkühlt oder
wenn das Lösungsmittel
verdunstet. In der Aufsprühtechnik
wird das Polymer in einem Lösungsmittel
gelöst
und auf Glas aufgesprüht.
Mit dem Verdunsten des Lösungsmittels
verfestigt sich das Polymer auf dem Glas. Wiederholtes Aufsprühen ermöglicht den
Aufbau des Polymers zu einem Film, der vom Glas abgezogen werden
kann.
-
Die
im Rahmen dieser Experimente eingesetzten Reagenzien und Geräte beinhalten
einen kleinen Becher, einen Heizplattenrührer von Corning, Gussformen
(z.B. Deckel von 50 ml Zentrifugenröhrchen) und einen Halteapparat
für die
Gussformen, 20 ml Szintillationsgefäße aus Glas mit Deckel (Kunststoffeinsatz-Typ),
TLC Vernebler, einen Stickstoffbehälter, Polycaprolacton ("PCL" – Molekulargewicht 10.000 bis 20.000;
Polysciences), Paclitaxel (Sigma, Reinheit 95%), Ethanol, "gewaschenes" (siehe oben) Ethylenvinylacetat
("EVA"), Poly(DL)milchsäure ("PLA" – Molekulargewicht 15.000 bis
25.000; Polysciences), Dichlormethan (HPLC-Qualität, Fisher
Scientific).
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1. Verfahren zur Herstellung
von Filmen – Gießen in Schmelze
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Man
wiege ein bekanntes Gewicht von PCL direkt in ein kleines Becherglas
ein. Man platziere den Becher in einen größeren Becher, der Wasser enthält (um als
Wasserbad zu wirken) und stelle es bei 70°C für 15 Minuten oder solange,
bis das Polymer komplett geschmolzen ist, auf die Heizplatte. Man
gebe ein bekanntes Gewicht des Arzneimittels zum geschmolzenen Polymer
und rühre
die Mischung gründlich.
Um die Dispersion des Arzneimittels im geschmolzenen PCL zu fördern, kann
das Arzneimittel in einem kleinen Volumen (< 10% des Volumens des geschmolzenen
PCL) von 100% Ethanol suspendiert/gelöst werden. Diese Ethanol-Suspension
wird dann in das geschmolzene Polymer gemischt. Man gieße das geschmolzene
Polymer in eine Form und lasse es abkühlen. Nach dem Abkühlen bewahre
man den Film in einem Behälter
auf.
-
2. Verfahren zur Herstellung
von Filmen – Gießen in Lösungsmittel
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Man
wiege ein bekanntes Gewicht von PCL direkt in ein 20 ml – Szintillationsgefäß aus Glas
ein und gebe ausreichend DCM hinzu, um eine 10%-Lösung (Gew./Vol.)
zu erreichen. Man verschließe
das Gefäß und mische
die Lösung.
Man gebe soviel Paclitaxel in die Lösung, wie erforderlich ist,
um die gewünschte
Endkonzentration von Paclitaxel zu erreichen. Man verwende manuelles
Schütteln
oder Vortexen zum Auflösen
des Paclitaxels in der Lösung.
Man lasse die Lösung
eine Stunde lang ruhen (um die vorhandenen Luftblasen zu reduzieren)
und gieße
sie dann langsam in eine Gussform. Die verwendete Gussform beruht
auf der erforderlichen Form. Man lege die Gussform über Nacht
unter eine Abzugshaube. Dies wird die Verdunstung des DCM ermöglichen.
Man lasse den Film zur Lagerung entweder in der Gussform oder ziehe
ihn ab und bewahre ihn in einem abgedichteten Behälter auf.
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3. Verfahren zur Herstellung
von Filmen – gesprüht
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Man
wiege ausreichend Polymer direkt in ein 20 ml – Szintillationsgefäß aus Glas
ein und gebe ausreichend DCM hinzu, um eine 2%-Lösung (Gew./Vol.) zu erreichen.
Man verschließe
das Gefäß und mische die
Lösung,
um das Polymer aufzulösen
(manuelles Schütteln).
Man montiere Formen in eine geeignete Apparatur zum Halten von Formen
in der Abzugshaube. Man positioniere die Apparatur zum Halten der
Formen 6 bis 12 Inches über
dem Boden der Abzugshaube auf einer geeigneten Unterlage (z.B. ein
umgedrehtes 2000 ml Becherglas), um ein horizontales Sprühen zu ermöglichen.
Man fülle
unter Verwendung einer automatischen Pipette ein geeignetes Volumen
(mindestens 5 ml) der 2% Polymerlösung in ein separates 20 ml – Szintillationsgefäß aus Glas
um. Man gebe ausreichend Paclitaxel zur Lösung hinzu und löse es durch
manuelles Schütteln
des verschlossenen Gefäßes auf.
Zum Vorbereiten auf das Sprühen
entferne man den Verschluß von
diesem Gefäß und tauche
(nur) das Rohr eines TLC Verneblers in die Polymerlösung ein.
Beachte: Das Reservoir des Verneblers wird bei diesem Verfahren
nicht benutzt – das
20 ml – Szintillationsgefäß aus Glas agiert
als Reservoir.
-
Man
schließe
den Stickstoffbehälter
an die Gaszuleitung des Verneblers an. Man erhöhe allmählich den Druck, bis die Zerstäubung und
das Sprühen
beginnt. Man registriere den Druck und verwende diesen Druck während der
Prozedur. Zum Besprühen
der Formen wende man oszillierende Sprühstöße von 5 Sekunden mit einer
Zeit zum Trocknen von 15 Sekunden zwischen den Sprühstößen an.
Während
der Zeit zum Trocknen knicke man die Gasleitung mit den Fingern
ab, um eine Vergeudung des Sprays zu verhindern. Das Sprühen wird
fortgesetzt, bis eine geeignete Dicke des Polymers auf der Form
abgelagert ist. Die Dicke beruht auf den Anforderungen. Man lasse
die aufgesprühten
Filme auf den Formen und bewahre sie in abgedichteten Behältern auf.
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D. Verfahren zur Herstellung
einer Nanopaste
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Nanopaste
ist eine Suspension von Mikrosphären,
die in einem hydrophilen Gel suspendiert sind. In einem Aspekt der
Erfindung kann das Gel oder die Paste als Methode, mit Arzneimittel
beladene Mikrosphären an
das Zielgewebe heranzubringen, auf Gewebe aufgetragen werden. Da
sie auf Wasser basiert, wird die Paste schnell mit Körperflüssigkeiten
verdünnt
werden, was eine Verringerung der Klebrigkeit der Paste und einen Hang
der Mikrosphären,
auf dem benachbarten Gewebe abgelagert zu werden, verursacht. Damit
wird ein Vorrat von in Mikrosphären
verkapseltem Arzneimittel nahe am Zielgewebe abgelagert.
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Die
im Rahmen dieser Experimente eingesetzten Reagenzien und Geräte beinhalten
Bechergläser, Carbopol
925 (pharmazeutische Qualität,
Goodyear Chemical Co.), destilliertes Wasser, Natrumhydroxid (1
M) in wässrger
Lösung,
Natriumhydroxid (5 M) in wässriger
Lösung,
Mikrosphären
in der Größe von 0,1 μm bis 3 μm, die mit
20% (Gew./Vol.) in Wasser suspendiert sind (siehe oben).
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1. Zubereitung von 5%
(Gew./Vol.) Carbopol Gel
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Man
gebe eine ausreichende Menge Carbopol zu 1 M Natriumhydroxid, um
eine 5% (Gew./Vol.) Lösung
zu erreichen. Um das Carbopol im 1 M Natriumhydroxid aufzulösen, lasse
man die Mischung für
etwa eine Stunde ruhen. Während
dieser Zeitperiode rühre
man die Mischung mit einem Glasstab. Nach einer Stunde messe man
den pH-Wert der Mischung. Ein niedriger pH-Wert zeigt an, dass das
Carbopol nicht vollständig gelöst ist.
Der pH-Wert, den man erreichen will, ist 7,4. Man verwende 5 M Natriumhydroxid,
um den pH-Wert einzustellen. Dies wird bewerkstelligt, indem man
langsam Tropfen von 5 M Natriumhydroxid zu der Mischung gibt, die
Mischung rührt
und den pH-Wert der Mischung misst. Es dauert üblicherweise ungefähr eine
Stunde, um pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Wenn ein pH-Wert von 7,4
erst einmal erreicht ist, bedecke man das Gel und lasse es für 2 bis
3 Stunden ruhen. Nach dieser Zeitperiode prüfe man den pH-Wert, um sicherzustellen,
dass er noch 7,4 beträgt.
Wenn er sich geändert
hat, stelle man ihn unter Verwendung von 5 M Natriumhydroxid wieder
auf 7,4 ein. Man lasse das Gel für
einige Stunden ruhen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert stabil bei
7,4 bleibt. Man wiederhole den Arbeitsschritt bis der gewünschte pH-Wert
erreicht und stabil ist. Man kennzeichne den Behälter mit dem Namen des Gels
und dem Datum. Das Gel ist innerhalb der nächsten Woche zur Herstellung
von Nanopaste zu verwenden.
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2. Verfahren zur Herstellung
einer Nanopaste
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Man
gebe ausreichend Mikrosphären
von 0,1 μm
bis 3 μm
zu Wasser, um eine 20% Suspension der Mikrosphären herzustellen. Man gebe
8 ml des 5% (Gew./Vol.) Carbopol-Gels in ein Becherglas. Man gebe
2 ml der 20% Mikrosphären-Suspension
in den Becher zu. Man rühre
die Mischung unter Verwendung eines Glasstabes oder eines Rührspatels,
um die Mikrosphären
gründlich
im Gel zu verteilen. Dies dauert üblicherweise 30 Minuten. Wenn
die Mikrosphären
erst einmal im Gel verteilt sind, fülle man die Mischung in ein
Vorratsgefäß. Man lagere
das Vorratsgefäß bei 4°C. Es muss
innerhalb einer Periode von einem Monat verwendet werden.
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Beispiel 2
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Herstellung von Mikrosphären
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Die
für die
unten beschriebene Herstellung von Mikrosphären bevorzugte Ausrüstung beinhaltet:
einen 200 ml wasserummantelten Becher (Kimax oder Pyrex), ein zirkulierendes
Wasserbad von Haake, ein Rührwerk
und einen Regler mit 2 Inch Durchmesser (4-Blätter, Propeller-Typ-Rührer aus
rostfreiem Stahl – Marke Fisher),
ein 500 ml Be cherglas, einen Heizplattenrührer (Marke Coming), 4 × 50 ml
Polypropylen Zentrifugenröhrchen
(Nalgene), Szintillationsgefäße aus Glas
mit Plastikeinsatzdeckeln, eine Tischzentrifuge (GPR Beckman), eine
Hochgeschwindigkeits-Standzentrifuge (JS 21 von Beckman), eine Analysenwaage
von Mettler (AJ 100, 0,1 mg), eine von oben zu beladende Digitalwaage
von Mettler (AE 163, 0,01 mg), ein automatisches Pipettiergerät (Gilson).
Reagenzien beinhalten Polycaprolacton ("PCL" – Molekulargewicht
10.000 bis 20.000; Polysciences Warrington, Pennsylvania; USA), "gewaschenes" (Verfahren des "Waschens" siehe unten) Ethylenvinylacetat
("EVA"), Poly(DL)milchsäure ("PLA" – Molekulargewicht 15.000 bis
25.000; Polysciences), Polyvinylalkohol ("PVA" – Molekulargewicht
124.000 bis 186.000; 99% hydrolysiert; Aldrich Chemical Co., Milwaukee
WI, USA), Dichlormethan ("DCM" oder "Methylenchlorid"; HPLC-Qualität, Fisher
scientific) und destilliertes Wasser.
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A. Herstellung von 5%
(Gew./Vol.) Polymerlösungen
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Abhängig von
der Polymerlösung,
die hergestellt wird, werden entweder 1,00 g PCL oder PLA oder jeweils
0,50 g PLA und gewaschenes EVA direkt in ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas
eingewogen. Dann werden 20 ml DCM zugegeben und das Gefäß wird dicht
verschlossen. Das Gefäß wird für eine Stunde
(gelegentliches Schütteln
kann angewendet werden) oder solange, bis sich das gesamte Polymer
aufgelöst
hat (die Lösung
sollte klar sein), bei Raumtemperatur (25°C) gelagert. Die Lösung kann
für mindestens
zwei Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
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A. Herstellung einer 5%
(Gew./Vol.) PVA-Stammlösung
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Fünfundzwanzig
Gramm PVA werden direkt in ein 600 ml Becherglas eingewogen. Fünfhundert
Milliliter destilliertes Wasser werden zugegeben, zusammen mit einem
3 Inch Rührstab,
der mit Teflon beschichtet ist. Der Becher wird mit Glas abgedeckt,
um Verluste durch Verdunstung zu reduzieren, und in ein 2000 ml Becherglas,
das 300 ml Wasser (welches als Wasserbad wirkt) enthält, gestellt.
Der PVA wird mit 300 Upm bei 85°C
(Coming Heizplattenrührer)
für 2 Stunden
oder solange, bis er vollständig
aufgelöst
ist, gerührt.
Die Auflösung
des PVA kann durch visuelle Überprüfung festgestellt
werden; die Lösung
sollte klar sein. Die Lösung wird
dann in einen verschraubbaren Vorratsbehälter aus Glas umgefüllt und
bei 4°C
für maximal
zwei Monate aufbewahrt.
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Diese
Lösung
sollte jedoch vor Verwendung oder Verdünnung auf Raumtemperatur erwärmt werden.
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C. Verfahren zur Herstellung
von Mikrosphären
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Basierend
auf der Größe der Mikrosphären, die
hergestellt werden (siehe Tabelle 1), werden 100 ml der PVA-Lösung (Konzentration
in Tabelle 1 angegeben) in den 200 ml wasserummantelten Becher gegeben. Das
zirkulierende Wasserbad von Haake wird an diesen Becher angeschlossen
und man lässt
den Inhalt bei 27°C
(+/–1°C) für 10 Minuten äquilibrieren.
Basierend auf der Größe der Mikrosphären, die
hergestellt werden (siehe Tabelle 1), wird die Startgeschwindigkeit
des Rührwerks
eingestellt und das Blatt des Rührwerks
wird in Höhe
der Mitte der PVA-Lösung
platziert. Das Rührwerk
wird dann gestartet und unter Verwendung eines automatischen 5 ml
Pipettiergeräts
lässt man
dann 10 ml der Polymerlösung
(die verwendete Polymerlösung
basierend auf der Art der Mikrosphären, die hergestellt werden) über einen
Zeitraum von 2 Minuten in den gerührt werdenden PVA eintropfen.
Nach 3 Minuten wird die Rührgeschwindigkeit
angepasst (siehe Tabelle 1) und die Lösung wird für weitere 2,5 Stunden gerührt. Das
Rührblatt
wird dann aus dem Mikrosphären-Ansatz
entfernt und mit 10 ml destillierten Wassers abgewaschen, so dass
die Spüllösung in
den Mikrosphären-Ansatz
läuft. Der
Mikrosphären-Ansatz
wird dann in einen 500 ml Becher gegossen und das ummantelte Wasserbad
wird mit 70 ml destillierten Wassers, die man auch in den Mikrosphären-Ansatz
fließen
lässt,
gespült.
Der 180 ml Mikrosphären-Ansatz
wird dann mit einem Glasstab gerührt
und gleiche Mengen werden in vier 50 ml Polypropylen Zentrifugenröhrchen gefüllt. Die
Röhrchen
werden dann verschlossen und für
10 Minuten zentrifugiert (Kraft in Tabelle 1 angegeben). Es wird
dann ein automatisches 5 ml Pipettiergerät oder eine Vakuum-Saugung eingesetzt,
um 45 ml der PVA-Lösung
von jedem Mikrosphären-Pellet
abzuziehen.
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Tabelle
I Anforderungen
an PVA-Konzentrationen, Rührgeschwindigkeiten
und Zentrifugalkräfte
für jeden
Bereich der Mikrosphären-Durchmesser
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Fünf Milliliter
destillierten Wassers werden dann in jedes Zentrifugenröhrchen zugegeben,
die dann gevortext werden, um die Mikrosphären zu resuspendieren. Die
vier Mikrosphären-Suspensionen
werden dann mit 20 ml destillierten Wassers in einem Zentrifugenröhrchen vereinigt
und für
weitere 10 Minuten zentrifugiert (Kraft in Tabelle 1 angegeben).
Dieser Vorgang wird noch zweimal zu insgesamt drei Waschgängen wiederholt.
Die Mikrosphären
werden dann ein letztes Mal zentrifugiert und in 10 ml destillierten
Wassers resuspendiert. Nach dem letzten Waschgang wird der Mikrosphären-Ansatz in ein vorgewogenes
Szintillationsgefäß aus Glas
umgefüllt.
Das Gefäß wird verschlossen
und man lässt
es über
Nacht bei Raumtemperatur (25°C) ruhen,
um die Mikrosphären
unter Schwerkraft sedimentieren zu lassen. Mikrosphären, die
in den Größenbereich
von 0,1 μm
bis 3 μm
fallen, sedimentieren nicht unter Schwerkraft, so verbleiben sie
in den 10 ml Suspension.
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D. Trocknung von Mikrosphären mit
einem Durchmesser von 10 μm
bis 30 μm
oder von 30 μm
bis 100 μm
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Nachdem
sich die Mikrosphären
bei Raumtemperatur über
Nacht gesetzt haben, wird ein automatisches 5 ml Pipettiergerät oder eine
Vakuum-Saugung verwendet, um den Überstand von den sedimentierten Mikrosphären abzuziehen.
Man lässt
die Mikrosphären
im unverschlossenen Gefäß in einem
Schubfach für die
Dauer einer Woche oder solange, bis sie völlig trocken sind (konstantes
Gewicht des Gefäßes), trocknen. Eine
schnellere Trocknung kann bewerkstelligt werden, indem das unverschlossene
Gefäß in der
Abzugshaube unter einem langsamen Fluss von Stickstoff (Fluss etwa
10 ml/min) gelassen wird. Nach vollständiger Trocknung (konstantes
Gewicht des Gefäßes) wird
das Gefäß gewogen
und verschlossen. Das gekennzeichnete und verschlossene Gefäß wird bei
Raumtemperatur in einem Schubfach aufbewahrt. Mikrosphären werden
normalerweise nicht länger
als 3 Monate aufbewahrt.
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E. Trocknung von Mikrosphären mit
einem Durchmesser von 0,1 μm
bis 3 μm
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Mikrosphären dieses
Größenbereichs
werden nicht sedimentieren, somit bleiben sie bei 4°C für maximal
vier Wochen in Suspension. Um die Mikrosphären-Konzentration in den 10
ml Suspension festzustellen, wird eine Probe von 200 μl der Suspension
in ein vorgewogenes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. Das Röhrchen wird
dann bei 10.000 g zentrifugiert (Eppendorf Tisch-Mikrozentrifuge),
der Überstand
wird entfernt und man lässt
das Röhrchen
bei 50°C über Nacht
trocknen. Das Röhrchen
wird dann erneut gewogen, um das Gewicht der getrockneten Mikrosphären im Röhrchen zu
bestimmen.
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F. Herstellung von Mikrosphären, die
mit Paclitaxel beladen sind
-
Um
Mikrosphären,
die Paclitaxel enthalten, herzustellen, wird eine angemessene Menge
abgewogenen Paclitaxels (basierend auf dem Prozentsatz von Paclitaxel,
das verkapselt werden soll) direkt in ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas
gegeben. Zehn Milliliter einer geeigneten Polymerlösung werden
in das das Paclitaxel enthaltende Gefäß zugegeben, welches dann gevortext
wird, bis das Paclitaxel aufgelöst
ist.
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Mikrosphären, die
Paclitaxel enthalten, können
dann im Wesentlichen so hergestellt werden, wie es oben in den Schritten
(C) bis (E) beschrieben ist.
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Beispiel 3
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Tensid-beschichtete Mikrosphären
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A. Materialien und Methoden
-
Mikrosphären wurden
im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben aus Poly(DL)milchsäure (PLA), Polymethylmethacrylat
(PMMA), Polycaprolacton (PCL) und 50:50 Ethylenvinylacetat (EVA):PLA
hergestellt. Die Größe reichte
von 10 bis 100 μm
mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 45 μm.
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Menschliches
Blut wurde von gesunden Freiwilligen gewonnen. Neutrophile (weiße Blutkörperchen) wurden
unter Verwendung von Dextran-Sedimentierung und Ficoll-Hypaque-Zentrifugationstechniken
aus dem Blut abgesondert. Neutrophile wurden mit 5 Millionen Zellen
pro ml in Hanks Buffered Salt Solution ("HBSS")
suspendiert.
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Die
Aktivierungsgrade der Neutrophilen wurden anhand der Generierung
reaktiver Sauerstoffarten, wie sie durch Chemilumineszenz nachgewiesen
wurden, bestimmt. Insbesondere wurde Chemilumineszenz durch Verwendung
eines LKB Luminometers mit 1 μM
Luminol-Verstärker
bestimmt. Die Plasma-Vorbeschichtung (oder Opsonierung) vom Mikrosphären wurde
durchgeführt,
indem 10 mg Mikrosphären
in 0,5 ml Plasma suspendiert und bei 37°C für 30 min gemischt wurden.
-
Die
Mikrosphären
wurden dann in 1 ml HBSS gewaschen und das zentrifugierte Mikrosphären-Pellet wurde
bei 37°C
zum Zeitpunkt t = 0 zur Neutrophilen-Suspension zugegeben. Die Oberflächen der
Mikrosphären
wurden unter Verwendung eines Tensids mit der Bezeichnung Pluronic
F127 (BASF) modifiziert, indem 10 mg der Mikrosphären in 0,5
ml einer 2% Gew./Gew.-Lösung
von F127 in HBSS für
30 min bei 37°C
suspendiert wurden. Die Mikrosphären
wurden dann zweimal in 1 ml HBSS gewaschen, bevor sie zu den Neutrophilen
oder zu Plasma zum weiteren Vorbeschichten gegeben wurden.
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B. Ergebnisse
-
1 zeigt,
dass die unbehandelten Mikrosphären
Chemilumineszenz-Werte von weniger als 50 mV ergeben. Diese Werte
repräsentieren
niedrige Grade der Aktivierung von Neutrophilen. Zum Vergleich können inflammatorische
Mikrokristalle Werte nahe bei 1000 mV ergeben, lösliche chemische Aktivatoren
können Werte
nahe bei 5000 mV ergeben. Wenn die Mikrosphären jedoch mit Plasma vorbeschichtet
sind, werden alle Chemilumineszenz-Werte in den Bereich von 100
bis 300 mV verstärkt
(siehe 1). Diese Grade der Neutrophilen-Reaktion
oder -Aktivierung können
als leicht entzündlich
betrachtet werden. PMMA ergab die größte Reaktion und könnte als
am meisten entzündlich
betrachtet werden. Nach Plasma-Vorbehandlung (oder Opsonierung)
zeigten sowohl PLA als auch PCL eine drei- bis viermal stärkere Aktivierung
von Neutrophilen, aber es gibt in dieser Hinsicht keinen großen Unterschied
zwischen den beiden Polymeren. EVA:PLA wird in Angiogenese-Formulierungen
wahrscheinlich nicht verwendet, weil die Mikrosphären schwierig
getrocknet und in wässrigem
Puffer resuspendiert werden können.
Dieser Effekt des Plasmas wird als Opsonierung bezeichnet und ist
das Ergebnis der Adsorption von Antikörpern oder Komplement-Molekülen auf
der Oberfläche.
Die adsorbierten Arten interagieren mit Rezeptoren auf den weißen Blutkörperchen
und verursachen eine verstärkte Zellaktivierung.
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Die 2–5 beschreiben
jeweils die Auswirkungen der Plasma-Vorbeschichtung von PCL, PMMA,
PLA und EVA:PLA und zeigen auch die Auswirkung einer Pluronic-F127-Vorbeschichtung vor
der Plasma-Vorbeschichtung der Mikrosphären. Diese Figuren zeigen alle
die gleiche Auswirkung: (1) Plasma-Vorbeschichtung verstärkt die
Reaktion; (2) Pluronic-F127-Vorbeschichtung hat allein keine Auswirkung;
(3) die durch Plasma-Vorbeschichtung
hervorgerufene verstärkte
Reaktion der Neutrophilen kann durch Vorbehandlung der Oberfläche der
Mikrosphären
mit 2% Pluronic F127 stark inhibiert werden.
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Die
Natur der adsorbierten Proteinart wurde auch durch Elektrophorese
untersucht. Unter Verwendung dieser Methode wurde gezeigt, dass
die Vorbehandlung der polymeren Oberfläche mit Pluronic F127 die Adsorption
von Antikörpern
an die polymere Oberfläche
hemmte.
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Die 6–9 zeigen
ebenso die Auswirkungen der Vorbeschichtung von PCL-, PMMA-, PLA-
oder EVA:PLA-Mikrosphären
(jeweils) entweder mit IgG (2 mg/ml) oder mit 2% Pluronic F127 und
anschließend
IgG (2 mg/ml). Wie man aus diesen Figuren ersehen kann, kann die
durch das Vorbeschichten der Mikrosphären mit IgG verursachte verstärkte Reaktion
durch eine Behandlung mit Pluronic F127 gehemmt werden.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass durch die Vorbehandlung der polymeren Oberfläche aller
vier Mikrosphären-Arten
mit Pluronic F127 die "inflammatorische" Reaktion von Neutrophilen
auf Mikrosphären
gehemmt werden kann.
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Beispiel 4
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Verkapselung von Paclitaxel
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Fünfhundert
Mikrogramm von entweder Paclitaxel oder Baccatin (ein Paclitaxel-Analogon, erhältlich bei
Inflazyme Pharmaceuticals Inc., Vancouver, British Columbia, Canada)
werden in 1 ml einer 50:50 ELVAX:Poly-L-Milchsäure-Mischung in dcm gelöst. Anschließend werden
Mikrosphären
in einer Dissolutionssapparatur (sechs-Spindel-Dissolutionstester, VanderKamp, Van
Kell Industries Inc., U.S.A.) dreifach bei 200 Upm, 42°C, über 3 Stunden
hergestellt. Die so hergestellten Mikrosphären werden zweimal in Wasser
gewaschen und ihre Größe wird
mit dem Mikroskop bestimmt.
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Die
Bestimmung der Paclitaxel-Verkapselung erfolgt in einem UV/vis-Test
(UV/vis lambda max. bei 237 nm, Fluoreszenz-Test bei Excitation
237, Emission bei 325 nm; Fluoreszenz-Ergebnisse werden in eckigen
Klammem [ ] dargestellt). Unter Einsatz der oben beschriebenen Verfahren
können
von insgesamt 500 μg Ausgangsmaterial
58 μg (+/–12 μg) [75 μg (+/–25 μg)] Paclitaxel
verkapselt werden. Dies stellt 12% (+/–2,4%) [15% (+/–5%)] des
Originalgewichts oder 1,2% (+/–0,25%)
[1,5% (+/–0,5%)]
des Polymer-Gewichts
dar. Nach 18-stündigem
Rotieren in einem Ofen bei 37°C
wurden 10,3% (+/–10%)
[6% (+/–5,6%)]
des gesamten Paclitaxels aus den Mikrosphären freigesetzt.
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Bei
Baccatin können
von insgesamt 500 μg
Ausgangsmaterial 100 +/– 15 μg [83 +/– 23 μg] Baccatin verkapselt
werden. Dies stellt 20% (+/–3%)
[17% (+/–5%)]
des Origi nalgewichts von Baccatin und 2% (+/–0,3%) [1,7% (+/–0,5%)]
des Polymer-Gewichts dar. Nach 18-stündigem Rotieren in einem Ofen
bei 37°C wurden
55% (+/–13%)
[60% (+/–23%))
des Baccatins aus den Mikrosphären
freigesetzt.
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Beispiel 5
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Kontrollierte Abgabe von
Paclitaxel aus Mikrosphären,
die sich aus einer Mischung aus Ethylenvinylacetat-Copolymer und
Poly(D,L-milchsäure)
zusammensetzen. In vivo Untersuchung der Mikrosphären im CAM-Test.
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Herstellung von mit Paclitaxel beladenen
Mikrosphären,
die sich aus einer Mischung aus einem biologisch abbaubaren Poly(D,L-milchsäure)-Polymer (PLA) und
einem nicht abbaubaren Ethylenvinylacetat-Copolymer (EVA) zusammensetzen.
Weiterhin werden die in vitro Freisetzungsrate und die antiangiogene
Aktivität
von Paclitaxel, das aus Mikrosphären,
die auf eine CAM aufgebracht wurden, freigesetzt wird, gezeigt.
-
Die
Reagenzien, die in diesen Experimenten eingesetzt wurden, beinhalten
Paclitaxel, welches von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen
wird; PLA (Molekulargewicht 15.000–25.000) und EVA (60% Vinylacetat)
(bezogen von Polysciences (Warrington, PA)); Polyvinylalkohol (PVA)
(Molekulargewicht 124.000–186.000,
99% hydrolysiert, bezogen von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI))
und Dichlormethan (DCM) (HPLC-Qualität, erworben
bei Fisher Scientific Co.). Es wird durchgehend destilliertes Wasser
verwendet.
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A. Herstellung von Mikrosphären
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Mikrosphären werden
im Wesentlichen unter Verwendung der Lösungsmittel-Verdunstungs-Methode wie in Beispiel
2 beschrieben hergestellt. In Kürze
werden 5% (Gew./Vol.) Polymerlösungen
in 20 ml DCM hergestellt, wobei EVA:PLA-Mischungsverhältnisse zwischen 35:65 und
90:10 verwendet werden. Zu 5 ml von 2,5% (Gew./Vol.) PVA in Wasser
in einem 20 ml Glasgefäß wird tropfenweise
unter Rühren
1 ml der Polymerlösung
zugegeben. Sechs ähnliche
Gefäße werden
in ein Sechsplatz-Rührwerk,
Dissolutionstester (Vanderkamp), gestellt und bei 200 Upm gerührt. Die
Temperatur der Gefäße wird über 15 min
von Raumtemperatur auf 40°C
angehoben und für
2 Stunden bei 40°C
gehalten. Die Gefäße werden
mit 500 × g
zentrifugiert und die Mikrosphären
werden dreimal in Wasser gewaschen. Bei manchen EVA:PLA Polymer-Mischungen aggregierten
die Mikrosphären-Proben
während
der Waschphase infolge der Entfernung des dispergierenden oder emulgierenden
Wirkstoffs, PVA. Dieser Aggregationseffekt könnte semiquantitativ ausgewertet
werden, da sich die aggregierten Mikrosphären verbanden und die verbundene
Polymermasse auf der Oberfläche
des Waschwassers trieb. Diese Polymerschicht auf der Oberfläche wird
während
der Waschbehandlungen verworfen und die verbleibenden, pelletierten
Mikrosphären
werden gewogen.
-
Der
Prozentsatz der Aggregation wird berechnet aus:
-
-
Mit
Paclitaxel beladene Mikrosphären
(0,6% (Gew./Gew.) Paclitaxel) werden hergestellt, indem das Paclitaxel
in der 5% (Gew./Vol.) Polymerlösung
in DCM gelöst
wird. Das verwendete Polymer-Mischungsverhältnis beträgt 50:50 EVA:PLA. Es wird jeweils
eine Mikrosphären-Fraktion
mit "großen" und mit "kleinen" Größen hergestellt,
indem die Paclitaxel/Polymerlösung
tropfenweise zu 2,5% (Gew./Vol.) PVA beziehungsweise zu 5% (Gew./Vol.)
PVA zugegeben wird. Die Dispersionen werden bei 40°C mit 200
Upm für
2 Stunden gerührt, zentrifugiert
und 3 mal in Wasser gewaschen, wie oben beschrieben. Die Mikrosphären werden
luftgetrocknet und die Größe von Proben
wird unter Verwendung eines optischen Mikroskops mit einem Mikrometer
bestimmt. Pro Probe werden mehr als 300 Mikrosphären betrachtet. Es werden Kontroll-Mikrosphären (ohne
Paclitaxel) wie oben beschrieben hergestellt und ihre Größe wird
gemessen.
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B. Effizienz der Verkapselung
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Bekannte
Gewichte Paclitaxel-beladener Mikrosphären werden in 1 ml DCM gelöst, 20 ml
40% Acetonitril in Wasser werden bei 50°C zugegeben und gevortext, bis
das DCM verdunstet ist. Die Paclitaxel-Konzentration im 40% Acetonitril
wird durch HPLC unter Verwendung einer mobilen Phase von Wasser:Methanol:Acetonitril
(37:5:58) bei einer Flussrate von 1 ml/min (isokratische Pumpe von
Beckman), einer C8 reverse-Phase-Säule (Beckman)
und von UV-Detektion bei 232 nm bestimmt. Um die Wiedergewinnungseffizienz
dieser Extraktionsprozedur zu bestimmen, werden bekannte Gewichte
Paclitaxel von 100–1000 μg in 1 ml DCM
gelöst
und dreifach derselben Extraktionsprozedur wie oben beschrieben
unterzogen. Die Wiedergewinnungsraten sind immer höher als
85% und die Werte der Effizienz der Verkapselung werden entsprechend
korrigiert.
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C. Untersuchungen zur
Arzneimittel-Freisetzung
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In
15 ml Glasröhrchen
mit Schraubverschluss werden 10 ml einer 10 mM Phosphatgepufferten
Salzlösung
(PBS), pH 7,4 und 35 mg mit Paclitaxel beladene Mikrosphären gegeben.
Diese Röhrchen
werden bei 37°C
gemischt und in vorgegebenen Zeitintervallen bei 1500 × g für fünf Minuten
zentrifugiert und der Überstand
wird zur Untersuchung aufbewahrt. Die Mikrosphären-Pellets werden in frischer
PBS(10 ml) resuspendiert und wieder inkubiert. Die Paclitaxel-Konzentrationen
werden durch Extraktion in 1 ml DCM mit nachfolgender Verdunstung
bis zur Trockenheit unter einem Stickstoffstrom, Rekonstitution
in 1 ml 40% Acetonitril in Wasser und Analyse unter HPLC-Verwendung
wie oben beschrieben bestimmt.
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D. Rasterelektronenmikroskopie
(SEM)
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Mikrosphären werden
auf Objektträger
gegeben, mit Gold bedampft und es werden unter Verwendung eines
bei 15 kV arbeitenden Philips 501B SEM mikroskopische Aufnahmen
angefertigt.
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E. CAM-Untersuchungen
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Befruchtete
Hühnerembryonen
werden vor der schalenlosen Kultivierung für 4 Tage inkubiert. Der Inhalt
der Eier wird bei 90% relativer Feuchtigkeit und 3% CO2 für 2 Tage
inkubiert. Am Tag 6 der Inkubation werden 1 mg-Aliquots von mit
0,6% Paclitaxel beladenen Mikrosphären oder von Kontroll-Mikrosphären (frei
von Paclitaxel) direkt auf die CAM-Oberfläche aufgetragen. Nach einer
Einwirkzeit von 2 Tagen wird das Gefäßnetz unter Verwendung eines
Stereomikroskops, das an eine Videokamera angeschlossen ist, untersucht;
die Videosignale werden dann auf einem Computer angezeigt und ausgedruckt.
-
F. Ergebnisse
-
Mikrosphären, die
aus 100% EVA hergestellt wurden, werden frei in PVA-Lösungen suspendiert,
aber bei dem folgenden Waschen in Wasser, um den PVA zu entfernen,
aggregierten sie in beträchtlichem
Umfang, verbanden sich oder verschmolzen miteinander. Ein Mischen
des EVA mit einem zunehmenden Anteil von PLA ergab Mikrosphären, die,
wenn sie in Wasser gewaschen wurden, eine verminderte Tendenz dazu
zeigten, zu aggregieren und sich zu verbinden, wie in 10A beschrieben. Eine 50:50 Mischung von EVA:PIA
bildete Mikrosphären
mit einer guten physikalischen Stabilität, das heißt, die Mikrosphären blieben
voneinander getrennt und gut suspendiert mit einer vernachlässigbaren
Aggregation und Verbindung.
-
Der
Größenbereich
für die
Mikrosphären-Fraktion
der "kleinen" Größe wird
so festgelegt, dass > 95% der
Mikrosphären-Probe
(nach Gewicht) zwischen 10–30
mm sind und für
die Mikrosphären-Fraktion
der "großen" Größe so, dass > 95% der Probe (nach
Gewicht) zwischen 30–100
mm sind. Typische rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von mit
Paclitaxel beladenen 50:50 EVA:PLA Mikrosphären sind in den 10B beziehungsweise 10C dargestellt.
Die Mikrosphären
sind kugelförmig
mit einer glatten Oberfläche
und zeigen keinen Anhalt für
festes Arzneimittel auf der Oberfläche der Mikrosphären. Die
Effizienz der Beladung von 50:50 EVA:PIA Mikrosphären mit
Paclitaxel ist zwischen 95–100%
bei initialen Paclitaxel-Konzentrationen zwischen 100–1000 mg
Paclitaxel pro 50 mg Polymer. Es gibt keinen signifikanten Unterschied
(Student t-Test, p < 0,05)
zwischen der Effizienz der Verkapselung von "kleinen" und "großen" Mikrosphären.
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Der
Zeitverlauf der Freisetzung von Paclitaxel aus mit 0,6% (Gew./Vol.)
beladenen 50:50 EVA:PLA Mikrosphären
wird in 10D für "kleine" (offene Kreise) und für "große" (geschlossene Kreise)
Mikrosphären dargestellt.
Die Untersuchungen zur Freisetzungsrate werden in dreifachen Röhrchen in
drei gesonderten Experimenten vorgenommen. Die Freisetzungsprofile
sind biphasisch mit einer anfänglichen
schnellen Pacli taxel-Freisetzung oder "burst"-Phase, die in den ersten 4 Tagen aus
Mikrosphären
von beiden Größenbereichen auftritt.
Dem folgt eine Phase von wesentlich langsamerer Freisetzung nach.
Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Freisetzungsraten
aus "kleinen" oder "großen" Mikrosphären. Zwischen
10–13%
des gesamten Paclitaxel-Gehalts der Mikrosphären werden in 50 Tagen freigesetzt.
-
Die
mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären (0,6% Gew./Vol. Beladung)
werden mit einem CAM-Test untersucht und die Ergebnisse werden in 10E dargestellt. Die Paclitaxel-Mikrosphären setzten
ausreichend Arzneimittel frei, um eine gefäßfreie Zone im umgebenden Gewebe
zu erzeugen (10F). Man beachte, dass es
in unmittelbarer Nachbarschaft der Mikrosphären ("MS" in
den 10E und 10F)
einen Bereich gibt, in dem Blutgefäße vollständig fehlen (Zone 1); weiter
von den Mikrosphären
entfernt gibt es einen Bereich mit unterbrochenen, nicht funktionierenden
Kapillaren (Zone 2); es ist nur ein Abstand von etwa 6 mm von den
Mikrosphären,
bis die Kapillaren wieder normal werden. In CAM, die mit Kontroll-Mikrosphären (ohne Paclitaxel)
behandelt wurden, liegt eine normale Architektur des Kapillarnetzes
vor (Figur nicht gezeigt).
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Diskussion
-
Die
peritubuläre
Verabreichung von Arzneimitteln ist eine leicht invasive chirurgische
Technik. Daher würde
Idealerweise eine perivaskuläre
Formulierung eines antiproliferativen Arzneimittels wie zum Beispiel Paclitaxel
das Arzneimittel an der Stelle eines Tumors oder einer Erkrankung
in einer für
eine Aktivität
ausreichenden Konzentration für
eine verlängerte
Zeitperiode in der Größenordnung
einiger Monate freisetzen. EVA ist ein gewebeverträgliches,
nicht abbaubares Polymer, das in beträchtlichem Umfang zur kontrollierten
Abgabe von Makromolekülen über lange
Zeitperioden (> 100
Tage) verwendet werden ist.
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EVA
wurde initial als polymeres Biomaterial zur Herstellung von Mikrosphären mit
in der Polymermatrix verteiltem Paclitaxel ausgewählt. Jedoch
aggregierten und verklumpten Mikrosphären, die aus 100% EVA hergestellt
worden waren, während
des Waschvorganges nahezu vollständig.
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Polymere
und Copolymere, die auf Milchsäure
und Glycolsäure
basieren, sind physiologisch inert und biokompatibel und werden
durch Hydrolyse zu toxikologisch akzeptablen Produkten abgebaut.
Copolymere der Milchsäure
und von Glycolsäuren
haben schnellere Abbauraten als PLA und mit Arzneimitteln beladene Mikrosphären, die
unter Verwendung dieser Copolymere hergestellt wurden, sind für eine verlängerte,
kontrollierte Freisetzung über
mehrere Monate nicht geeignet.
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10A zeigt, dass ein ansteigender Anteil von PLA
in einer EVA:PLA-Mischung das Ausmaß der Aggregation der Mikrosphären-Suspensionen
reduzierte. Zumischungen von 50% oder weniger EVA in der EVA:PLA-Matrix
ergaben physikalisch stabile Mikrosphären-Suspensionen in Wasser
oder PBS. Es wird für alle
nachfolgenden Untersuchungen ein Mischungsverhältnis von 50:50 EVA:PLA gewählt.
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Es
konnten durch Veränderung
der Konzentration des Emulgators, PVA, in der wässrigen Phase Fraktionen von
Mikrosphären
mit unterschiedlichen Größenbereichen
hergestellt werden. "Kleine" Mikrosphären werden
bei der höheren
PVA-Konzentration von 5% Gew./Vol. hergestellt, wohingegen "große" Mikrosphären bei
2,5% Gew./Vol. PVA hergestellt werden. Alle anderen Variablen bei
der Herstellung sind dieselben für
beide Mikrosphären-Größenfraktionen.
Die höhere
Konzentration des Emulgators ergab ein visköseres wässriges Dispersionsmedium und
produzierte kleinere Polymer/Paclitaxel/DCM-Tröpfchen,
die in der wässrigen
Phase emulgiert waren, und somit kleinere Mikrosphären. Die
mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären enthielten zwischen 95–100% des
ursprünglichen
Paclitaxels, das zur organischen Phase zugegeben worden war, in
den festen Mikrosphären
verkapselt. Die geringe Wasserlöslichkeit
von Paclitaxel sprach für
eine Aufteilung in eine organische Phase, die das Polymer enthielt.
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Die
Freisetzungsraten von Paclitaxel aus 50:50 EVA:PtA Mikrosphären sind
sehr langsam, wobei weniger als 15% des Paclitaxels, mit dem beladen
wurde, in 50 Tagen freigesetzt werden. Die anfängliche "burst-Phase" der Arzneimittelfreisetzung kann auf
Diffusion des Arzneimittels aus dem oberflächlichen Bereich der Mikrosphären (nahe
der Oberfläche
der Mikrosphären)
zurückzuführen sein.
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Es
wird vermutet, dass der Mechanismus der Arzneimittelfreisetzung
aus nicht abbaubaren polymeren Matrices wie zum Beispiel EVA die
Diffusion von Wasser durch die verteilte Arzneimittelphase im Polymer,
die Auflösung
des Arzneimittels und die Diffusion der Lösung durch eine Reihe verbindender,
flüssigkeitsgefüllter Poren
einbezieht. Es wurde gezeigt, dass Mischungen aus EVA und PLA in
einem Bereich von 30 bis 70% EVA in PLA nicht mischbar oder bikontinuierlich
sind. In Degradationsuntersuchungen wurde PLA in PBS-Puffer bei
37°C nach
einer Induktions- oder Verzögerungsperiode
hydrolytisch abgebaut und aus der Matrix der EVA:PLA-Polymer-Mischung
ausgewaschen, wobei sie ein inaktives, schwammähnliches Skelett hinterließ. Obwohl
die Induktionsperiode und die Rate des PLA-Abbaus und des Auswaschens
aus den gemischten Matrices von dem PLA-Anteil in der Matrix und
der Geschichte des Vorgangs abhängig
war, gibt es durchweg wenig oder keinen PLA-Verlust innerhalb von
40–50
Tagen.
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Obwohl
eine gewisse PLA-Erosion aus den 50:50 EVA:PLA Mikrosphären innerhalb
der 50 Tage der Untersuchung der in vitro Freisetzungsrate (10C) aufgetreten sein kann, ist es wahrscheinlich,
dass der primäre
Mechanismus der Arzneimittelfreisetzung aus der Polymer-Mischung
in der Diffusion einer Lösung durch
ein Porennetz in der Polyrnermatrix besteht.
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Zum
Abschluss der Untersuchung der Freisetzungsrate werden die Mikrosphären auf
die Menge des verbleibenden Arzneimittels hin untersucht. Die Werte
für die
Prozentsätze
des nach 50 Tagen Inkubation in den Mikrosphären-Proben verbleibenden Paclitaxels
betragen 94% +/– 9%
und 89% +/– 12%
für die
Mikrosphärenfraktionen
der "kleinen" beziehungsweise
der "großen" Größe.
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Mikrosphären, die
mit 6 mg pro mg Polymer (0,6%) beladen waren, ergaben eine ausgedehnte
Hemmung der Angiogenese, wenn sie auf die CAM des Hühnerembryos
aufgebracht wurden (10E und 10F).
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Beispiel 6
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Verkapselung von therapeutischem
Wirkstoff in Poly(ε-caprolacton)
Mikrosphären.
Hemmung der Angiogenese im CAM-Test durch mit Paclitaxel beladene
Mikrosphären.
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Dieses
Beispiel untersucht das Profil der in vitro Freisetzungsrate von
Paclitaxel aus biologisch abbaubaren Mikrosphären aus Poly(ε-caprolacton)
und zeigt die in vivo antiangiogene Aktivität von Paclitaxel, welches aus
diesen Mikrosphären
freigesetzt wird, wenn sie auf CAM aufgebracht werden.
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Reagenzien,
die in diesen Experimenten eingesetzt wurden, beinhalten: Poly(ε-caprolacton) ("PCL") (Molekulargewicht
35.000–45.000;
bezogen von Polysciences (Warrington, PA)); Dichlormethan ("DCM") von Fisher Scientific
Co., Canada; Polyvinylalkohol (PVP) (Molekulargewicht 12.000–18.000,
99% hydrolysiert) von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.) und
Paclitaxel von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Soweit nicht
anders angegeben werden alle Chemikalien und Reagenzien so benutzt,
wie sie geliefert wurden. Es wird durchgehend destilliertes Wasser
verwendet.
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A. Herstellung von Mikrosphären
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Mikrosphären werden
im Wesentlichen unter Verwendung der Lösungsmittel-Verdunstungs-Methode wie in Beispiel
2 beschrieben hergestellt. In Kürze
werden mit 5% (Gew./Gew.) Paclitaxel beladene Mikrosphären hergestellt,
indem 10 mg Paclitaxel und 190 mg PCL in 2 ml DCM aufgelöst werden,
zu 100 ml einer wässrigen
1% PVP-Lösung zugegeben
und mit 1000 Upm bei 25°C
für 2 Stunden
gerührt
werden. Die Mikrosphären-Suspension
wird mit 1000 × g
für 10
Minuten (Beckman GPR) zentrifugiert, der Überstand wird verworfen und
die Mikrosphären
werden dreimal mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Mikrosphären werden über Nacht
luftgetrocknet und bei Raumtemperatur aufbewahrt. Kontroll-Mikrosphären (ohne
Paclitaxel) werden wie oben beschrieben hergestellt. Es werden auch
Mikrosphären,
die 1% und 2% Paclitaxel enthalten, hergestellt. Die Größe der Mikrosphären wird
unter Verwendung eines optischen Mikroskops mit Mikrometer bestimmt.
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B. Effizienz der Verkapselung
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Ein
bekanntes Gewicht von mit Arzneimittel beladenen Mikrosphären (etwa
5 mg) wird in 8 ml Acetonitril gelöst und 2 ml destilliertes Wasser
werden zugegeben, um das Polymer auszufällen. Die Mischung wird bei
1000 g für
10 Minuten zentrifugiert und die Menge des verkapselten Paclitaxels
wird aus der Absorption des Überstandes,
die in einem UV-Spectrophotometer (Hewlett-Packard 8452A Diode Array
Spectrophotometer) bei 232 nm gemessen wird, berechnet.
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C. Untersuchungen zur
Arzneimittelfreisetzung
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Etwa
10 mg mit Paclitaxel beladene Mikrosphären werden in 20 ml einer 10
mM Phosphat-gepufferten Salzlösung,
pH 7,4 (PBS) in Röhrchen
mit Schraubverschlüssen
suspendiert. Die Röhrchen
werden bei 37°C über ihre
Enden geschwenkt und zu vorgegebenen Zeitintervallen werden 19,5
ml Überstand
abgenommen (nachdem man den Mikrosphären Gelegenheit gegeben hat,
sich am Boden abzusetzen), durch einen 0,45 μm Membranfilter gefiltert und
zur Paclitaxel-Analyse zurückbehalten.
Ein gleiches Volumen PBS wird ersatzweise in jedes Röhrchen nachgefüllt, um
die Sinkbedingungen während
der Untersuchung beizubehalten. Die Filtrate werden mit 3 × 1 ml DCM
extrahiert, die DCM-Extrakte unter einem Stickstoffstrom bis zur
Trockenheit evaporisiert, wieder in 1 ml Acetonitril gelöst und mit
HPLC unter Verwendung einer mobilen Phase von Wasser:Methanol:Acetonitril
(37:5:58) bei einer Flussrate von 1 ml min–1 (isokratische
Pumpe von Beckman), einer C8 reverse-Phase-Säule (Beckman) und von UV-Detektion
(Shimadzu SPD A) bei 232 nm untersucht.
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D. CAM-Untersuchungen
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Befruchtete
Hühnerembryonen
werden vor der schalenlosen Kultivierung für 4 Tage inkubiert. Am Tag 6
der Inkubation werden 1 mg-Aliquots von mit 5% Paclitaxel beladenen
Mikrosphären
oder von Kontroll-Mikrosphären
(frei von Paclitaxel) direkt auf die CAM-Oberfläche aufgetragen. Nach einer
Einwirkzeit von 2 Tagen wird das Gefäßnetz unter Verwendung eines
Stereomikroskops, das an eine Videokamera angeschlossen ist, untersucht;
die Videosignale werden dann auf einem Computer angezeigt und ausgedruckt.
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E. Rasterelektronenmikroskopie
-
Mikrosphären werden
auf Objektträger
gegeben, mit Gold bedampft und dann in ein bei 15 kV arbeitendes
Philips 501B Rasterelektronenmikroskop gegeben.
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F. Ergebnisse
-
Der
Größenbereich
der Mikrosphären
liegt zwischen 30–100 μm, obwohl
es Anzeichen dafür
gibt, dass es in allen mit Paclitaxel beladenen oder Kontroll-Mikrosphären-Präparationen
einige Mikrosphären
gibt, die aus diesem Rahmen fallen. Die Effizienz der Beladung von
PCL-Mikrosphären
mit Paclitaxel ist immer höher als
95% für
alle untersuchten Arzneimittelbeladungen. Die Rasterelektranenmikroskopie
zeigte, dass alle Mikrosphären
kugelförmig
sind und dass viele eine raue oder zerklüftete Oberflächenmorphologie
zeigten. Es gab keine Anhaltspunkte für festes Arzneimittel auf der
Oberfläche
der Mikrosphären.
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Der
Zeitverlauf der Paclitaxel-Freisetzung aus mit 1%, 2% und 5% beladenen
PCL-Mikrosphären ist in 11A dargestellt. Die Profile der Freisetzungsraten
sind biphasisch. Es gibt bei allen Arzneimittelbeladungen eine anfängliche
schnelle Paclitaxel-Freisetzung
oder "burst-Phase". Die burst-Phase
trat bei den 1%-und 2%-Paclitaxel-Beladungen über 1–2 Tage und bei den mit 5%
beladenen Mikrosphären über 3–4 Tage auf.
Der anfänglichen
Phase einer schnellen Freisetzung folgt eine Phase einer signifikant
langsameren Arzneimittelfreisetzung. Bei Mikrosphären, die
1% oder 2% Paclitaxel enthalten, gibt es nach 21 Tagen keine weitere
Paclitaxel-Freisetzung. Bei einer Beladung mit 5% Paclitaxel hatten
die Mikrosphären
nach 21 Tagen etwa 20% des gesamten Arzneimittelgehalts freigesetzt.
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11B zeigt CAM, die mit Kontroll-PCL-Mikrosphären behandelt
wurden, und 11C zeigt die Behandlung mit
Mikrosphären,
die mit 5% Paclitaxel beladen waren. Die CAM mit den Kontroll-Mikrosphären zeigt
eine normale Architektur des Kapillarnetzes. Die mit Paclitaxel-PCL-Mikrosphären behandelte
CAM zeigt einen deutlichen Gefäßrückgang und
Zonen, in denen das Kapillarnetz fehlt.
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G. Diskussion
-
Die
Lösungsmittel-Verdunstungs-Methode
zur Herstellung von mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären ergab
sehr hohe Effizienzen der Paclitaxel-Verkapselung von zwischen 95–100%. Dies
ist auf die schlechte Wasserlöslichkeit
von Paclitaxel und seine hydrophobe Natur zurückzuführen, was für eine Aufteilung in eine organische
Lösungsmittelphase,
die das Polymer enthält,
spricht.
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Das
biphasische Freisetzungsprofil für
Paclitaxel ist für
das Freisetzungsmuster für
viele Arzneimittel aus biologisch abbaubaren Polymer-Matrices typisch.
Poly(ε-caprolacton)
ist ein aliphatischer Polyester, der unter physiologischen Bedingungen
durch Hydrolyse abgebaut werden kann und nicht toxisch und gewebskompatibel
ist. Der Abbau von PCL ist signifikant langsamer als der von umfassend
untersuchten Polymeren und Copolymeren von Milch- und Glycolsäuren und
ist daher zur Entwicklung von Systemen zur lange anhaltenden peritubulären Abgabe
von Arzneimitteln geeignet. Man nimmt an, dass die anfängliche
schnelle oder burst-Phase der Freisetzung von Paclitaxel auf Freisetzung
des Arzneimittels aufgrund von Diffusion aus dem oberflächlichen
Bereich der Mikrosphären
(nahe der Oberfläche
der Mikrosphären)
zurückzuführen ist.
Es ist nicht wahrscheinlich, dass die Freisetzung von Paclitaxel
in der zweiten (langsameren) Phase der Freisetzungsprofile auf den
Abbau oder das Auswaschen von PCL zurückzuführen ist, weil Untersuchungen
gezeigt haben, dass es unter in vitro Bedingungen in Wasser über einen
Zeitraum von 7,5 Wochen keinen signifikanten Gewichtsverlust und
keine Oberflächenerosion
von PCL gibt. Die langsamere Phase der Freisetzung von Paclitaxel
ist wahrscheinlich auf die Auflösung
des Arzneimittels in flüssigkeitsgefüllten Poren
in der Polymermatrix und auf Diffusion durch die Poren zurückzuführen. Die
höhere
Freisetzungsrate bei einer höheren
Beladung mit Paclitaxel ist wahrscheinlich das Ergebnis eines weiter
verzweigten Porennetzes in der Polymermatrix.
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Es
wurde gezeigt, dass Paclitaxel-Mikrosphären mit einer 5% Beladung ausreichend
Arzneimittel freisetzen, um eine ausgedehnte Hemmung der Angiogenese
hervorzurufen, wenn sie auf die CAM aufgebracht werden. Die Hemmung
des Wachstums der Blutgefäße führte zu
einer gefäßfreien
Zone wie in 11C gezeigt.
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Beispiel 7
-
Mit therapeutischem Wirkstoff
beladene peritubuläre
polymere Filme, die aus Ethylenvinylacetat und einem Tensid bestehen.
-
Zwei
Arten von Filmen werden in diesem Beispiel untersucht: reine EVA
Filme, die mit Paclitaxel beladen sind, und Filme aus EVA/Tensid-Mischungen,
die mit Paclitaxel beladen sind.
-
Die
Tenside, die untersucht werden, sind zwei hydrophobe Tenside (Span
80 und Pluronic L101) und ein hydrophiles Tensid (Pluronic F127).
Die Pluronic-Tenside sind selbst Polymere, was eine attraktive Eigenschaft
darstellt, weil sie mit EVA gemischt werden können, um die verschiedenen
Eigenschaften der Abgabe von Arzneimitteln zu optimieren. Span 80
ist ein kleineres Molekül,
das auf gewisse Art in der Polymermatrix verteilt ist und keine
Mischung bildet.
-
Tenside
sind nützlich,
um die Freisetzungsraten von Paclitaxel aus den Filmen zu modulieren
und bestimmte physikalische Parameter der Filme zu optimieren. Ein
Aspekt der mit Tensid gemischten Filme, der anzeigt, dass die Freisetzungsraten
von Arzneimitteln gesteuert werden können, ist die Fähigkeit,
die Geschwindigkeit und das Ausmaß, in dem die Verbindung in
Wasser quellen wird, zu verändern.
Die Diffusion von Wasser in eine Polymer-Arzneimittel-Matrix ist
entscheidend für
die Freisetzung des Arzneimittels aus dem Träger. Die 12C und 12D zeigen
den Grad der Quellung der Filme in Abhängigkeit von Änderungen des
Tensidgehalts in der Mischung. In mehr als zwei Monaten quellen
reine EVA Filme in keinem wesentlichen Maß auf. Indem jedoch die Menge
des dem EVA zugegebenen Tensids gesteigert wird, ist es möglich, den Grad
der Quellung der Verbindung zu steigern und auch durch Steigerung
der hydrophilen Eigenschaften kann die Quellung gesteigert werden.
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Die
Ergebnisse der Experimente mit diesen Filmen sind unten in den 12A–E
dargestellt. In Kürze zeigt 12A die Freisetzung von Paclitaxel (in mg) aus
reinen EVA Filmen in Abhängigkeit
von der Zeit. 12B zeigt den Prozentsatz des
verbleibenden Arzneimittels für
dieselben Filme. Wie aus diesen beiden Figuren ersehen werden kann,
steigen die Freisetzungsraten des Arzneimittels mit der Steigerung
der Bela dung mit Paclitaxel (d.h. mit Erhöhung des Paclitaxel-Prozentsatzes
nach Gewicht), was die erwartete Abhängigkeit von der Konzentration
zeigt. Mit der Steigerung der Beladung mit Paclitaxel steigt auch
der Prozentsatz des im Film verbleibenden Paclitaxels, was darauf
hinweist, dass eine höhere
Beladung attraktiver für
Formulierungen für
eine lang anhaltende Freisetzung sein kann.
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Die
physikalische Festigkeit und Elastizität der Filme werden in 12E bewertet. In Kürze zeigt 12E Spannungs-Dehnungs-Kurven für reine
EVA-Filme und für
Filme aus EVA-Tensid-Mischungen. Diese grobe Dehnungsmessung zeigt,
dass die Elastizität
der Filme mit der Zugabe von Pluronic F127 gesteigert wird und dass
die Zugfestigkeit (Spannung beim Bruch) mit der Zugabe von Pluronic
F127 konzentrationsabhängig steigt.
Elastizität
und Festigkeit sind wichtige Gesichtspunkte beim Entwickeln eines
Films, der zu besonderen peritubulären klinischen Anwendungen
gehandhabt werden kann ohne eine dauernde Deformierung der Verbindung
zu verursachen.
-
Die
obigen Daten zeigen die Fähigkeit
bestimmter Tensidzusätze,
die Freisetzungsraten von Arzneimitteln zu regulieren und die physikalischen
Eigenschaften des Vehikels zu ändern.
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Beispiel 8
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Integration von Methoxypolyethylenglycol
350 (MePEG) in Poly(ε-caprolacton),
um eine Formulierung zur kontrollierten Abgabe von therapeutischen
Wirkstoffen aus einer Paste zu entwickeln.
-
Reagenzien
und Ausrüstung,
die in diesen Experimenten eingesetzt wurden, umfassen Methoxypolyethylenglycol
350 ("MePEG" – Union Carbide, Danbury, CT).
MePEG ist bei Raumtemperatur flüssig
und hat einen Gefrierpunkt von 10°C
bis –5°C.
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A. Herstellung einer MePEG/PCL-Paste,
die Paclitaxel enthält
-
MePEG/PCL-Paste
wird hergestellt, indem man zunächst
eine Menge Paclitaxel in MePEG auflöst und dies dann in geschmolzenes
PCL integriert. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass kein DCM benötigt wird.
-
B. Analyse des Schmelzpunkts
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Die
Schmelzpunkte von PCL/MePEG-Polymer-Mischungen können durch dynamische Differenzkalorimetrie
von 30°C
bis 70°C
bei einer Aufheizgeschwindigkeit von 2,5°C pro Minute bestimmt werden.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in den 13A und 13B gezeigt.
In Kürze
wird, wie in 13A gezeigt, der Schmelzpunkt
der Polymer-Mischung (wie durch die thermische Analyse bestimmt)
konzentrationsabhängig
erniedrigt. Die Schmelzpunkte der Polymer-Mischungen sind in 13A als Funktion der MePEG-Konzentration aufgetragen.
Dieser niedrigere Schmelzpunkt wirkt sich auch als eine verlängerte Zeit, die
das Polymer benötigt,
um ausgehend von der Schmelze zu erstarren, aus, wie in 13B gezeigt. Eine 30:70 Mischung von MePEG:PCL
braucht mehr als doppelt solange wie PCL allein, um ausgehend von
der flüssigen
Schmelze zu erstarren.
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C. Messung der Sprödigkeit
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Die
Aufnahme von MePEG in PCL scheint einen Feststoff von geringerer
Sprödigkeit,
verglichen mit PCL allein, zu produzieren. Als "grober" Weg, dies zu quantifizieren, lässt man
eine beschwerte Nadel aus gleicher Höhe auf Polymer-Mischungen,
die von 0% bis 30% MePEG enthalten, fallen und misst dann die Strecke, über die
die Nadel in den Feststoff eindringt. Das sich hieraus ergebende
Diagramm ist in 13C abgebildet. Die Punkte
sind als Durchschnitt +/–1
Std.Abw. aus vier Messungen angegeben.
-
Zum
Vergleich wurde auch eine Probe aus Paraffinwachs untersucht und
in diese drang die Nadel über eine
Strecke von 7,25 mm +/– 0,3
mm ein.
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D. Messung der Freisetzung
von Paclitaxel
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Pellets
des Polymers (PCL enthaltend 0%, 5%, 10% oder 20% MePEG) werden
in Phosphat-gepufferter Salzlösung
(PBS, pH 7,4) bei 37°C
inkubiert und die prozentuale Änderung
des Polymer-Gewichts wird über
die Zeit gemessen. Wie aus 13D ersehen
werden kann, steigt das Maß des
Gewichtsverlustes mit der Konzentration des ursprünglich in
der Mischung vorliegenden MePEG an. Es ist wahrscheinlich, dass
dieser Gewichtsverlust auf eine Freisetzung von MePEG aus der Polymermatnx
in die Inkubationsflüssigkeit
zurückzuführen ist.
Dies würde
darauf hindeuten, dass Paclitaxel leicht aus einer MePEG/PCL-Mischung
freigesetzt werden wird, weil Paclitaxel vor der Aufnahme in PCL
erst im MePEG gelöst
wird.
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E. Auswirkungen von Änderungen
der MePEG-Anteile auf die Freisetzung von Paclitaxel
-
Es
werden Thermopasten, die zwischen 0,3% und 20% MePEG in PCL enthalten,
hergestellt. Diese werden mit 1% Paclitaxel beladen. Die Freisetzung
von Paclitaxel aus 10 mg Pellets in PBS bei 37°C über die Zeit wird unter Verwendung
von HPLC überwacht.
Wie in 13E gezeigt wird, beeinflußt die Menge
von MePEG in der Formulierung nicht die Menge des Paclitaxels, das
freigesetzt wird.
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F. Auswirkungen von Änderungen
der Paclitaxel-Anteile auf die Gesamtmenge von Paclitaxel, die aus
einer 20% MePEG/PCL-Mischung freigesetzt wird.
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Es
werden Thermopasten, die 20% MePEG in PCL enthalten, hergestellt
und mit Paclitaxel zwischen 0,2% und 10% beladen. Die Freisetzung
von Paclitaxel wird wie oben beschreiben gemessen. Wie in 13F gezeigt wird, steigt die über die Zeit freigesetzte Paclitaxel-Menge
mit einer erhöhten
Beladung mit Paclitaxel an. Wenn dies als freigesetzter Prozentsatz
des gesamten Paclitaxels aufgetragen wird, wird diese Reihenfolge
jedoch umgekehrt (13G). Dies gibt Auskunft über das
in der Paste verbleibende restliche Paclitaxel und erlaubt eine
Vorhersage der Zeitdauer, über
die Paclitaxel aus der 20% MePEG Thermopaste freigesetzt werden
kann.
-
G. Festigkeitsmessung
verschiedener MePEG/PCL-Mischungen
-
Es
wird ein CT-40 Testgerät
für mechanische
Festigkeit verwendet, um die Festigkeit von festen Polymer-"Tabletten" mit einem Durchmesser
von 0,88 cm und einer durchschnittlichen Dicke von 0,560 cm zu messen.
Die Polymer-Tabletten sind Mischungen von MePEG bei Konzentrationen
von 0%, 5%, 10% oder 20% in PCL.
-
Die
Ergebnisse dieser Untersuchung sind in 13H gezeigt,
in der sowohl die Reißfestigkeit
als auch die Zeit bis zum Zerreißen als Funktion der Prozentanteils
von MePEG in der Mischung aufgetragen sind. Eine ANOVA mit einer
Variablen zeigte, dass sich die Dicken der Tabletten innerhalb jeder
Gruppe nicht unterscheiden. Wie aus 13H ersehen
werden kann, verringerte die Zugabe von MePEG in PCL die Härte des
resultierenden Feststoffes.
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H. Auswirkungen von γ-Bestrahlung
auf die Freisetzung von Paclitaxel
-
Mit
20% Paclitaxel beladene PCL:MePEG (80:20) Paste wurde γ-bestrahlt
und auf die Freisetzung von Paclitaxel über die Zeit hin untersucht.
Die Ergebnisse sind in 30 wiedergegeben.
-
Zusammenfassend
kann auf Basis der obigen Versuche die Schlußfolgerung gezogen werden,
dass die Zugabe von MePEG das Polymer weniger spröde und wachsähnlicher
macht, den Schmelzpunkt erniedrigt und die Verfestigungszeit des
Polymers erhöht.
Alle diese Faktoren verbessern die Anwendungseigenschaften der Paste.
Bei geringen Konzentrationen (20%) hat MePEG keine Auswirkungen
auf die Freisetzung von Paclitaxel aus PCL. Gamma-Bestrahlung scheint
wenig Einfluß auf
die Freisetzung von Paclitaxel zu haben.
-
Beispiel 9
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Änderung der Freisetzung von
therapeutischem Wirkstoff aus Thermopaste durch Verwendung von Poly(D,L-milchsäure) mit
niedrigem Molekulargewicht
-
Wie
oben erörtert
können
abhängig
vom gewünschten
therapeutischen Effekt polymere Träger mit entweder schneller
oder langsamer Freisetzung gewünscht
werden. Zum Beispiel ergeben Polycaprolacton (PCL) und Mischungen
von PCL mit Poly(ethylenglycol) (PEG) Zusammensetzungen, die Paclitaxel über einen
Zeitraum von mehreren Monaten freisetzen. Insbesondere die Diffusion
von Paclitaxel in den Polymeren ist aufgrund seiner großen Molekülgröße und seinen
extrem hydrophoben Eigenschaften sehr langsam.
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Andererseits
ergibt Poly(D,L-milchsäure)
(PDLLA) mit niedrigem Molekulargewicht einen schnellen Abbau, der
abhängig
von ihrem ursprünglichen
Molekulargewicht von einem Tag bis zu mehreren Monaten dauert. In
diesem Fall wird die Freisetzung von Paclitaxel vom Abbau des Polymers
dominiert. Ein anderes Charakteritstikum von PDLLA mit niedrigem
Molekulargewicht ist ihr niedriger Schmelzpunkt (d.h. 40°C–60°C), der sie
zu ei nem geeigneten Material zur Herstellung von Thermopaste macht.
Wie unten ausführlicher
beschrieben können
mehrere verschiedene Verfahren eingesetzt werden, um die Abbaurate
des Polymers zu steuern, einschließlich zum Beispiel durch Änderung
des Molekulargewichts der PDLLA und/oder durch Mischen mit PCL,
PDLLA oder Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA) mit hohem Molekulargewicht.
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A. Materialien für die Experimente
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D,L-Milchsäure wurde
von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO erworben. PCL (Molekulargewicht 10–20.000)
wurde von Polysciences, Warrington, PA bezogen. PDLLA mit hohem
Molekulargewicht (intrinsische Viskosität 0,60 dl/g) und PLGA waren
von Birmingham Polymers.
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B. Synthese von PDLLA
mit niedrigem Molekulargwicht
-
PDLLA
mit niedrigem Molekulargewicht wurde aus D,L-Milchsäure durch
Polykondensation synthetisiert. In Kürze wurde D,L-Milchsäure in einem
Becherglas bei 200°C
mit Stickstoffspülung
und magnetischem Rühren
für eine
gewünschte
Zeit erhitzt. Die Viskosität
erhöhte
sich während
der Polymerisation infolge des Ansteigens des Molekulargewichts.
Mit unterschiedlichen Polymerisationszeiten wurden drei Arten herstellt, d.h.
40 min (Molekulargewicht 800), 120 min, 160 min.
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C. Formulierung von Paclitaxel-Thermopasten
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Folgende
Materialien wurden durch manuelles Mischen bei einer Temperatur
von etwa 60°C
zu 20% mit Paclitaxel beladen:
- 1. PDLLA mit
niedrigem Molekulargewicht, mit einer Polymerisationszeit von 40
min.
- 2. PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, mit einer Polymerisationszeit
von 120 min.
- 3. PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, mit einer Polymerisationszeit
von 160 min.
- 4. Eine Mischung aus 50:50 PDLLA mit hohem Molekulargewicht
und PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min.
- 5. Eine Mischung aus 50:50 PLGA mit hohem Molekulargewicht und
PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min.
- 6. Mischungen aus PCL mit hohem Molekulargewicht und PDLLA mit
niedrigem Molekulargewicht, 40 min, mit PCL:PDLLA von 10:90, 20:80,
40:60, 60:40 und 20:80.
-
Mischungen
aus PDLLA oder PLGA mit hohem Molekulargewicht und PDLLA mit niedrigem
Molekulargewicht werden durch Auflösen der Materialien in Aceton
mit nachfolgendem Trocknen hergestellt.
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D. Untersuchung der Freisetzung
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Die
Freisetzung von Paclitaxel in PBS Albumin-Puffer bei 37°C wurde wie
oben beschrieben mit HPLC zu verschiedenen Zeiten gemessen.
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E. Ergebnisse
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PDLLA
mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min, war ein weiches Material
von hellgelber Farbe. Die Farbe ist vielleicht auf die Oxidation
während
der Polykondensation zurückzuführen. PDLLA
mit niedrigem Molekulargewicht, 120 min (gelb) und 160 min (braun)
waren bei Raumtemperatur spröde
Feststoffe. Bei 60°C wurden
alle geschmolzen. Mischungen von 50:50 aus PDLLA oder PLGA mit hohem
Molekulargewicht und PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min,
schmolzen auch bei 60°C.
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Während der
Freisetzung zerbrachen PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40
min und 120 min, innerhalb eines Tages in Fragmente, andere Materialien
waren bis zu dieser Niederschrift (3 Tage) intakt.
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Die
Freisetzung von Paclitaxel aus den Formulierungen 2–5 ist in 14 dargestellt. PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht,
40 min und 120 min, ergaben die schnellste Freisetzung infolge des
Zerbrechens der Paste. Die Freisetzung war möglicherweise löslichkeitslimitiert.
PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 160 min, ergab auch eine schnelle
Freisetzung, behielt aber noch ein intaktes Pellet bei. Zum Beispiel
wurden 10% des Paclitaxels, mit dem beladen worden war, an einem
Tag freigesetzt. Die Mischungen von 50:50 aus PDLLA oder PLGA mit
hohem Molekulargewicht und PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht,
40 min, waren langsamer, d.h. 3,4% und 2,2% Freisetzung an einem
Tag.
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Obwohl
oben nicht ausdrücklich
dargelegt, kann eine Vielzahl anderer polymerer Träger hergestellt werden,
einschließlich
(1) Poly(D,L-milchsäure),
Poly(L-milchsäure),
Poly(glycolsäure),
Poly(6-hydroxycapronsäure),
Poly(5-hydroxyvaleriansäure),
Poly(4-hydroxybuttersäure) mit
niedrigem (500–10.000)
Molekulargewicht und ihre Copolymere; (2) Mischungen aus den obigen
(#1); (3) Mischungen aus den obigen (#1) mit Poly(D,L-milchsäure), Poly(L-milchsäure), Poly(glycolsäure), Poly(6-hydroxycapronsäure), Poly(5-hydroxyvalenansäure), Poly(4-hydroxybuttersäure) mit
hohem Molekulargewicht und ihren Copolymeren; und (4) Copolymeren
von Poly(ethylenglycol) und Pluronics mit Poly(D,L-milchsäure), Poly(L-milchsäure), Poly(glycolsäure), Poly(6-hydroxycapronsäure), Poly(5-hydroxyvaleriansäure), Poly(4-hydroxybuttersäure) und
ihren Copolymeren.
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Beispiel 10
-
Herstellung von polymeren
Zusammensetzungen, die wasserlösliche
Zusätze
und Paclitaxel enthalten.
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A. Herstellung von polymeren
Zusammensetzungen
-
Es
wurden Mikropartikel von Copräzipitaten
von Paclitaxel/Zusatz hergestellt und anschließend zu PCL gegeben, um Pasten
zu bilden. In Kürze
wurde Paclitaxel (100 mg) in 0,5 ml Ethanol (95%) gelöst und mit
dem Zusatz (100 mg), der vorher in 1 ml destillierten Wassers gelöst oder
dispergiert worden war, gemischt. Die Mischung wurde zerrieben,
bis sich eine glatte Paste bildete. Die Paste wurde auf einer Petrischale
verteilt und über
Nacht bei 37°C
luftgetrocknet. Die getrocknete Masse wurde unter Verwendung eines
Mörsers
und eines Stößels pulverisiert
und durch ein Sieb (Endecotts Test Sieves Ltd, London, England)
mit Maschengröße #140
(106 μm)
gedrückt.
Die Mikropartikel (40%) wurden dann bei 65°C in geschmolzenes PCL (60%)
integriert, entsprechend einer 20% Beladung mit Paclitaxel. Die
in der Untersuchung verwendeten Zusätze waren Gelatine (Type B,
100 bloom, Fisher Scientific), Methylcellulose (British Drug Houses),
Dextran, T500 (Pharmacia, Schweden), Albumin (Fisher Scientific)
und Natriumchlorid (Fisher Scientific). Mikropartikel aus Paclitaxel
und Gelatine oder Albumin wurden wie oben beschrieben hergestellt,
aber durch ein Sieb (Endecotts Test Sieves Ltd, London, England)
mit Maschengröße # 60
(270 μm)
gedrückt,
um die Auswirkungen der Größe der Mikropartikel
auf die Freisetzung von Paclitaxel aus der Paste zu untersuchen.
Es wurden auch Pasten mit 10, 20 oder 30% Gelatine und 20% Paclitaxel
und PCL hergestellt, um die Auswirkungen des Anteils des Zusatzes auf
die Freisetzung des Arzneimittels zu untersuchen. Soweit nicht anders
angegeben, wurden Pasten, die 20%, Paclitaxel in PCL dispergiert
enthielten, hergestellt um als Kontrollen für die Untersuchungen der Freisetzungsraten
zu dienen.
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B. Untersuchungen der
Freisetzung von Arzneimittel
-
Etwa
2,5 mg Pellet einer mit Paclitaxel beladenen Paste wurden in 50
ml einer 10 mM Phosphat-gepufferten Salzlösung, pH 7,4 (PBS) in Röhrchen mit
Schraubverschlüssen
suspendiert. Die Röhrchen
wurden bei 37°C über ihre
Enden geschwenkt und zu vorgegebenen Zeitintervallen wurden 49,5
ml des Überstandes entfernt,
durch einen 0,45 μm
Membranfilter gefiltert und für
die Paclitaxel-Untersuchung aufbewahrt. Ein gleiches Volumen PBS
wurde ersatzweise in jedes Röhrchen
nachgefüllt,
um die Sinkbedingungen während
der Untersuchung beizubehalten. Zur Untersuchung wurden die Filtrate
mit 3 × 1
ml Dichlormethan (DCM) extrahiert, die DCM-Extrakte wurden unter
einem Stickstoffstrom bis zur Trockenheit evaporisiert und wieder
in 1 ml Acetonitril gelöst.
Die Untersuchung erfolgte durch HPLC unter Verwendung einer mobilen
Phase von Wasser:Methanol:Acetonitril (37:5:58) bei einer Flussrate
von 1 ml min–1 (isokratische
Pumpe von Beckman), einer C18 reverse-Phase-Säule (Beckman) und durch UV-Detektion
(Shimadzu SPD A) bei 232 nm.
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C. Untersuchungen der
Quellung
-
Paclitaxel/Zusatz/PCL-Pasten,
die unter Verwendung von Paclitaxel/Zusatz-Mikropartikeln der Maschengröße # 140
(und #60 nur für
Gelatine) hergestellt worden waren, wurden extrudiert, um Zylinder
zu bilden, Stücke
davon wurden abgeschnitten, gewogen und der Durchmesser und die
Länge eines
jeden Stückes wurden
unter Verwendung eines Mikrometers (Mitutoyo Digimatic) gemessen.
Die Stücke
wurden in destilliertem Wasser (10 ml) bei 37°C suspendiert und zu vorbestimmten
Intervallen wurde das Wasser verworfen und der Durchmesser und die
Länge der
zylindrischen Teile wurden gemessen und die Proben wurden gewogen. Die
Morphologie der Proben (vor und nach dem Suspendieren in Wasser)
wurde unter Verwendung der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) (Hitachi
F-2300) untersucht. Die Proben wurden unter Verwendung eines Hummer
Instruments (Technics, USA) mit 60% Au und 40% Pd beschichtet (Dicke
10–15
nm).
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D. Untersuchungen an der
Hühnerembryo-Chorioallantois-Membran
(CAM)
-
Befruchtete
Hühnerembryonen
wurden vor der schalenlosen Kultivierung für 4 Tage inkubiert. Der Inhalt
der Eier wurde bei 90% relativer Feuchtigkeit und 3% CO2 inkubiert
und am Tag 6 der Inkubation wurden 1 mg-Stücke von mit Paclitaxel beladener
Paste (enthaltend 6% Paclitaxel, 24% Gelatine und 70% PCL) oder von
Kontrollpaste (30% Gelatine in PCL) direkt auf die CAM-Oberfläche aufgetragen.
Nach einer Einwirkzeit von 2 Tagen wurde das Gefäßnetz unter Verwendung eines
Stereomikroskops, das an eine Videokamera angeschlossen war, untersucht;
die Videosignale wurden dann auf einem Computer angezeigt und ausgedruckt.
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E. In vivo Anti-Tumor-Aktivität
-
Wie
oben beschrieben hergestellte (unter Verwendung der Maschengröße-140-Fraktionen der Paclitaxel-Gelatine-Mikropartikel)
Pasten, die 20% Paclitaxel, 20% Gelatine und 60% PCL enthielten,
wurden in 8 × 1
ml Spritzen (BD Insulinspritze, ½ cc) gefüllt, wobei jede Spritze 150
mg der Paste enthielt (entsprechend 30 mg Paclitaxel). Zehn Wochen
alte weibliche DBA/2j-Mäuse
(16), die 18–20
g wogen, wurden für
4 Tage nach Eintreffen akklimatisiert und am Tag 1 wurden jeder
Maus in die posterolaterale Flanke MDAY-D2-Tumorzellen (10 × 106 ml–1) in Phosphat-gepufferter
Salzlösung
injiziert. Am Tag 6 wurden die Mäuse
in zwei Gruppen von acht aufgeteilt, die Stelle des Tumors wurde
unter Narkose eröffnet
und 150 mg der Paste, die vorher auf etwa 60°C erhitzt worden war, wurden
an der Stelle des Tumors aus der Spritze gedrückt und die Wunde wurde verschlossen.
Einer Gruppe wurde die mit Paclitaxel beladene Paste implantiert
und der anderen Gruppe die Kontrollpaste, die nur Gelatine und PCL
enthielt. Am Tag 16 wurden die Tiere getötet und das Gewicht der Mäuse und
des excidierten Tumors wurde gemessen.
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F. Ergebnisse und Diskussion
-
Mikropartikel
aus copräzipitiertem
Paclitaxel und Gelatine oder Albumin waren hart und spröde und waren
leicht in PCL zu integrieren, während
die anderen Zusätze
weiche Partikel, die eine Tendenz zum Aufbrechen während der
Herstellung der Paste zeigten, produzierten.
-
15 zeigt die Zeitverläufe der Freisetzung von Paclitaxel
aus Pasten, die 20% Paclitaxel in PCL oder 20% Paclitaxel, 20% Zusatz
und 60% PCL enthielten. Die Freisetzung von Paclitaxel aus PCL mit
oder ohne Zusätze
folgte einem biphasischen Freisetzungsmuster; es gab anfänglich eine
schnellere Freisetzungsgeschwindigkeit des Arzneimittels gefolgt
von einer langsameren Freisetzung des Arzneimittels. Es wurde angenommen,
dass die anfängliche
Periode einer schnelleren Freisetzungsgeschwindigkeit von Paclitaxel
aus den Pasten auf die Auflösung
von auf der Oberfläche
befindlichem Paclitaxel oder auf Diffusion von Paclitaxel aus den
oberflächlichen
Bereichen der Paste zurückzuführen war.
Die nachfolgende langsamere Phase der Freisetzungsprofile kann einer
Abnahme der effektiven, mit dem Lösungsmittel in Kontakt befindlichen
Oberfläche
der Arzneimittelpartikel, einem langsamen Einstrom des Lösungsmittels
in die Polymermatrix oder einer Verlängerung der durchschnittlichen
Diffusionswege des Arzneimittels durch die Polymermatrix zuzuschreiben sein.
-
Beide
Phasen der Freisetzungsprofile von Paclitaxel aus PCL steigerten
sich in Anwesenheit hydrophiler Zusatzstoffe, wobei Gelatine, Albumin
und Methylcellulose den höchsten
Anstieg der Freisetzungsraten des Arzneimittels ergaben (15). Es gab einen weiteren Anstieg der Freisetzung
von Paclitaxel aus der Polymermatrix, wenn im Vergleich zu kleineren
Partikeln (106 μm)
aus Paclitaxel und Zusatz größere Partikel (270 μm) aus Paclitaxel
und Zusatz zur Herstellung der Paste verwendet wurden (16). Erhöhungen
der Menge des Zusatzstoffes (z.B. Gelatine) ergaben eine entsprechende
Steigerung der Freisetzung des Arzneimittels (16). 17A zeigt
das Quellungsverhalten von Pasten, die 20% Paclitaxel, 20% Zusatz
und 60% PCL enthalten. Die Quellungsgeschwindigkeit folgte der Reihenfolge
Gelatine > Albumin > Methylcellulose > Dextran > Natriumchlorid. Weiterhin
stieg die Quellungsgeschwindigkeit, wenn der Paste ein höherer Anteil des
wasserlöslichen
Polymers zugegeben wurde (17B).
Die Pasten, die Gelatine oder Albumin enthielten, quollen innerhalb
der ersten 8–10
Stunden schnell auf und anschließend verlangsamte sich die
Quellungsgeschwindigkeit, wenn die Änderung des Volumens der Probe
mehr als 40% betrug. Die Paste, die unter Verwendung der größeren (270 μm) Partikel
aus Paclitaxel und Gelatine hergestellt worden war, quoll schneller auf
als die, die mit den kleineren (106 μm) Partikeln aus Paclitaxel
und Gelatine hergestellt worden war. Alle Pasten bröckelten
auseinander, wenn die Volumenvermehrung mehr als 50% betrug. Die
rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen zeigten, dass das
Aufquellen der Pasten mit einem Aufbrechen der Matrix verbunden
war (18). Bei hohen Vergrößerungen
(18C und 18D)
ergaben sich nach der Quellung Anhaltspunkte für nadel- oder stabförmige Paclitaxel-Kristalle
auf der Oberfläche
der Paste und in enger Verbindung mit Gelatine (18C und 18D).
-
Osmotische
oder quellungsfähige
hydrophile Agenzien, die als gesonderte Partikel in das hydrophobe Polymer
eingebettet sind, führen
durch eine Kombination von Erosion der Matrix, von Diffusion des
Arzneimittels durch die Polymermatrix und/oder von Diffusion und/oder
konvektivem Fluss durch die Poren, die in der Matrix durch die Auflösung der
wasserlöslichen
Zusatzstoffe geschaffen wurden, zur Freisetzung von Arzneimittel.
In einem hydrophoben Polymer dispergierte osmotische Agenzien und
quellungsfähige
Polymere würden
Wasser in sich aufnehmen (als aufsaugende Agenzien wirkend), sich
auflösen
oder quellen und einen Spannungsdruck ausüben, der die Septen (die Polymer-Schicht)
zwischen benachbarten Partikeln sprengen und Mikrokanäle schaffen
und so das Entweichen von Arzneimittelmolekülen in das umgebende Medium
durch Diffusion oder konvektiven Fluss ermöglichen könnte. Das Aufquellen und Aufbrechen
der Matrix der Paste (18) führte wahrscheinlich
zur Bildung von Mikrokanälen
durch das Innere der Matrix. Die unterschiedlichen Geschwindigkeiten
und Ausmaße
des Aufquellens der Polymere (17)
können
die Unterschiede, die bei den Freisetzungsraten von Paclitaxel beobachtet
wurden (15 und 16),
erklären.
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19 zeigt CAM, die mit Kontrollpaste aus
Gelatine und PCL (19A) und mit Paste aus 20%
Paclitaxel, Gelatine und PCL (19B)
behandelt wurden. Die Paste auf der Oberfläche der CAM wird durch die Pfeile
in den Figuren angezeigt. Die CAM mit der Kontrollpaste zeigt eine
normale Architektur des Kapillarnetzes. Die mit Paste aus Paclitaxel
und PCL behandelten CAM zeigten durchgehend einen Gefäßrückgang und Zonen,
in denen das Kapillarnetz fehlte. Die Aufnahme von Zusatzstoffen
in die Paste erhöhte
den Durchmesser der gefäßfreien
Zonen deutlich (19).
-
Die
Ergebnisse der in vivo Untersuchung sind in 20 gezeigt.
In Kürze
zeigte eine um den Tumor herum erfolgende Injektion von Paste aus
Paclitaxel, Gelatine und PCL in Mäuse mit gesicherten und palpablen
Tumoren, dass dieses Präparat
eine durchschnittliche Reduktion der Tumormasse von 63% im Vergleich mit
Kontrollen ergab. Weiterhin gab es keine signifikante Auswirkung
auf das Gewicht der Mäuse
nach der Behandlung. Pasten aus Paclitaxel und PCL (ohne Zusatzstoffe)
ergaben keine signifikante Reduktion der Tumormasse.
-
Diese
Untersuchung zeigte, dass die in vitro Freisetzung von Paclitaxel
aus PCL durch die Aufnahme von Mikropartikeln aus Paclitaxel und
hydrophilem Polymer in die PCL-Matrix
verstärkt
werden konnte. in vivo Untersuchungen, welche die Wirksamkeit der
Formulierung bei der Behandlung subcutaner Tumore bei Mäusen beurteilten,
zeigten auch, dass die Paste aus Paclitaxel, Gelatine und PCL die
Tumormasse signifikant reduzierte. Es wurde gezeigt, dass Faktoren
wie zum Beispiel die Art des wasserlöslichen Agens, die Größe der Mikropartikel
und der Anteil der Zusatzstoffe die Freisetzungscharakteristika
des Arzneimittels beeinflussten.
-
Die
peritubuläre
Injektion einer chemotherapeutischen Paste in die Adventitia eines
Gefäßes, das durch
das Wachstums eines Malignoms eingeengt ist, kann die Größe des lokalen
Tumors reduzieren und die Symptome der Obstruktion ohne invasive
chirurgische Verfahren lindern.
-
Beispiel 11
-
Modifikation der Freisetzung
von Paclitaxel aus Thermopaste unter Verwendung von PDLLA-PEG-PDLLA
und von Poly(D,L-milchsäure)
mit niedrigem Molekulargewicht.
-
A. Herstellung von PDLLA-PEG-PDLLA
und von PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht.
-
DL-Lactid
wurde bei Aldrich erworben. Polyethylenglycol (PEG) mit einem Molekulargewicht
von 8.000, Zinn-Octoat und DL-Milchsäure wurden von Sigma bezogen.
Poly-ε-caprolacton (PCL)
mit einem Molekulargewicht von 20.000 wurde von Birmingham Polymers
(Birmingham, AL) bezogen. Paclitaxel wurde bei Hauser Chemicals
(Boulder, CO) erworben. Polystyren-Standards mit schmalen Verteilungen
des Molekulargewichts wurden von Polysciences (Warrington, PA) erworben.
Acetonitril und Methylenchlorid waren von HPLC-Qualität (Fisher
Scientific).
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Das
Triblock-Copolymer von PDLLA-PEG-PDLLA wurde durch eine Ringöffnungspolymerisation
synthetisiert. Monomere von DL-Lactid und PEG wurden in unterschiedlichen
Verhältnissen
vermischt und 0,5 Gew.-% Zinn-Octoat wurden zugegeben. Die Polymerisation
wurde bei 150°C über 3,5
Stunden vorgenommen. PDLLA mit niedrigem Molekuiargewicht wurde
durch Polykondensation von DL-Milchsäure synthetisiert. Die Reaktion
wurde in einem Glaskolben unter den Bedingungen einer sanften Stickstoffspülung, mechanischem
Rühren
und Erhitzen auf 180°C über 1,5
Stunden vorgenommen. Das Molekulargewicht der PDLLA war etwa 800,
gemessen durch Titration der Carbonsäure- Endgruppen.
-
B. Herstellung von Pasten-Formulierungen
-
Paclitaxel
wurde zu Beladungen mit 20% oder 30% gründlich entweder in die PDLLA-PEG-PDLLA-Copolymere
oder in bei etwa 60°C
geschmolzene Mischungen von PDLLA:PCL von 90:10, 80:20 und 70:30
eingemischt. Die mit Paclitaxel beladenen Pasten wurden in 1 ml
Spritzen eingewogen und bei 4°C
gelagert.
-
C. Charakterisierung von
PDLLA-PEG-PDLLA und den Pasten-Mischungen
-
Die
Molekulargewichte und die Verteilungen der PDLLA-PEG-PDLLA-Copolymere
wurden bei Raumtemperatur durch GPC unter Verwendung einer Shimadzu
LC-10AD HPLC Pumpe und eines Shimadzu RID-6A Refraktionsindexdetektors
(Kyoto, Japan), der an eine 104 Å Hewlett
Packard PLgel Säule
angeschlossen war, bestimmt. Die mobile Phase war Chloroform mit
einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/min. Das Injektionsvolumen der
Probe betrug 20 μl
bei einer Konzentration des Polymers von 0,2% (Gew./Vol.). Die Molekulargewichte
der Polymere wurden in Relation zu Polystyren-Standards bestimmt. Die intrinsische
Viskosität von
PDLLA-PEG-PDLLA in CHCl3 bei 25°C wurde mit
einem Cannon-Fenske-Viscometer bestimmt.
-
Die
thermische Analyse der Copolymere wurde durch dynamische Differenzkalorimetrie
(DSC) unter Verwendung eines TA Instruments 2000 Steuergeräts und DuPont
910S DSC (Newcastle, Delaware) vorgenommen. Die Aufheizgeschwindigkeit
betrug 10°C/min
und die Proben des Copolymers und der Paclitaxel-Copolymer-Matrix
wurden in gewellte offene Aluminium-Proben-Tiegel eingewogen (3–5 mg).
-
1H kernmagnetische Resonanz (NMR) wurde eingesetzt,
um die chemische Zusammensetzung des Polymers zu bestimmen. 1H NMR Spektren von mit Paclitaxel beladener
PDLLA-PEG-PDLLA wurden in CDCl3 unter Verwendung
eines NMR Instruments (Bruker, AC-200E) bei 200 MHz aufgenommen.
Die Konzentration des Polymers betrug 1–2%.
-
Die
Morphologie der Paste aus Paclitaxel und PDLLA-PEG-PDLLA wurde mit
Rasterelektronenmikroskopie (SEM) (Hitachi F-2300) untersucht. Die
Probe wurde mit 60% Au und 40% Pd (Dicke 10–15 nm) unter Verwendung eines
Hummer Instruments (Technics, USA) beschichtet.
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D. In vitro Freisetzung
von Paclitaxel
-
Ein
kleines Pellet von mit 20% Paclitaxel beladener Paste aus PDLLA:PCL
(etwa 2 mg) oder ein Zylinder (hergestellt durch Herausdrücken von
geschmolzener Paste aus einer Spritze ohne Nadel) von mit 20% Paclitaxel
beladener Paste aus PDLLA-PEG-PDLLA wurde in verschlossene 14 ml
Glasröhrchen,
die 10 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, pH 7,4) mit 0,4
g/L Albumin enthielten, gegeben. Das Röhrchen wurde bei 37°C unter sanftem
rotierenden Mischen inkubiert. Der Überstand wurde regelmäßig zur
Paclitaxel-Analyse abgezogen und mit frischem PBS/Albumin-Puffer
ersetzt. Der Überstand
(10 ml) wurde mit 1 ml Methylenchlorid extrahiert. Die Wasserphase
wurde dekantiert und die Methylenchloridphase wurde unter einem
Stickstoffstrom bei 60°C
getrocknet. Der getrocknete Rest wurde in einer 40:60 Wasser:Acetonitril-Mischung
rekonstituiert und bei 10.000 g für etwa 1 min zentrifugiert.
Die Menge des Paclitaxels im Überstand
wurde dann mit HPLC bestimmt. Die HPLC-Untersuchung wurde unter
Verwendung einer 110A Pumpe und einer C-8 Ultrasphärensäule (Beckman)
und eines SPD-6A UV-Detektor-Sets
bei 232 nm, eines SIL-9A Autoinjektors und eines C-R3A Integrators
(Shimadzu) vorgenommen. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl und die
Flussrate betrug 1 ml/min. Die mobile Phase war 58% Acetonitril,
5% Methanol und 37% destilliertes Wasser.
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E. In vivo Tierstudien
-
Zehn
Wochen alte weibliche DBA/2j-Mäuse
wurden für
3–4 Tage
nach Eintreffen akklimatisiert. Jeder Maus wurden am Tag 1 in die
posterolaterale Flanke 10 × 105 MDAY-D2-Tumorzellen
in 100 μl
PBS subcutan injiziert. Am Tag 6 wurden die Mäuse in zwei Gruppen randomisiert.
Der Gruppe 1 wurde nur Paste (Kontrolle) implantiert, der Gruppe
2 wurde mit Paclitaxel beladene Paste implantiert. Unter Narkose
wurde nahe dem Tumor chirurgisch eine subcutane Tasche gebildet
und etwa 100 mg der geschmolzenen Paste (auf 50°C–60°C erwärmt) wurden in die Tasche gegeben
und die Wunde wurde verschlossen. Am Tag 16 wurden die Mäuse getötet und
die Tumore wurden entfernt und gewogen. Tag 16 wurde gewählt, um
es dem Tumor zu ermöglichen,
innerhalb der ethischen Grenzen zu einer leicht messbaren Größe heranzuwachsen.
-
F. Ergebnisse und Diskussion
-
Das
Molekulargewicht und die Molekulargewichtsverteilung von PDLLA-PEG-PDLLA
in Relation zu Polystyren-Standards wurden mit GPC (21) gemessen. Die intrinsische Viskosität des Copolymers
in CHCl3 bei 25°C wurde unter Verwendung eines
Canon-Fenske Viscometers bestimmt. Das Molekulargewicht und die
intrinsische Viskosität nahmen
mit steigendem PEG-Gehalt ab. Die Polydispersitäten von PDLLA-PEG-PDLLA mit
PEG-Anteilen von 10%–40%
reichten von 2,4 bis 3,5. Jedoch hatte das Copolymer mit 70% PEG
eine schmale Verteilung der Molekulargewichte mit einer Polydispersität von 1,21.
Dies könnte
darauf zurückzuführen sein,
dass ein hoher PEG-Gehalt die Wahrscheinlichkeit von Nebenreaktionen
reduzierte, wie zum Beispiel einer Umesterung, die zu einer breiten
Verteilung der Molekulargewichte des Polymers führt. Alternativ kann eine gewundene
Struktur der hydrophob-hydrophilen Block-Copolymere zu einem artifiziell niedrigen
Wert der Polydispersität
führen.
-
DSC-Untersuchungen
von reinen PEG- und PDLLA-PEG-PDLLA-Copolymeren werden in den 21 und 22 gezeigt.
PEG und PDLLA-PEG-PDLLA mit PEG-Anteilen von 70% und 40% zeigten
bei abnehmendem PEG-Gehalt des Copolymers endotherme Spitzen mit
abnehmender Enthalpie und Temperatur. Die endothermen Spitzen in
den Copolymeren mit 40% und 70% PEG waren wahrscheinlich auf das
Schmelzen der PEG-Region zurückzuführen, was
auf das Auftreten einer Phasenseparation hinweist. Während reines PEG
einen scharfen Schmelzpeak hatte, zeigten sowohl die 70%- als auch
die 40%-PEG-Copolymere breite Peaks mit einer deutlichen Schulter
im Fall von 70% PEG. Die breiten Schmelzpeaks können ihre Ursache in der Interferenz
von PDLLA mit der Kristallisation von PEG haben. Die Schulter im
Fall von 70% PEG kann den Glasübergang
der PDLLA-Region darstellen. In den Copolymeren mit PEG-Anteilen
von 10%, 20% und 30% kam es zu keinen thermischen Veränderungen
in einem Temperaturbereich von 10–250°C, was darauf hinweist, dass
es zu keiner signifikanten Kristallisation (daher kann die Phasenseparation
kommen) gekommen war.
-
DSC-Thermogramme
von PDLLA:PCL (70:30, 80:20, 90:10) Mischungen ohne Paclitaxel oder
mit 20% Paclitaxel zeigten eine endotherme Spitze bei etwa 60°C, die auf
das Schmelzen des PCL zurückzuführen war.
Aufgrund der amorphen Natur von PDLLA und ihres niedrigen Molekulargewichts
(800) wurden Schmelzen und Glasübergänge von
PDLLA nicht beobachtet. Es wurden keine thermischen Änderungen
infolge von Rekristallisation oder Schmelzen von Paclitaxel beobachtet.
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PDLLA-PEG-PDLLA-Copolymere
mit einem PEG-Gehalt von 20% und 30% wurden aus folgenden Gründen als
optimale Materialien zur Formulierung der Paste ausgewählt. PDLLA-PEG-PDLLA
mit 10% PEG konnten bei einer Temperatur von etwa 60°C nicht geschmolzen
werden. Die Copolymere mit 40% und 70% PEG wurden leicht bei 60°C geschmolzen
und die Copolymere mit 20% und 30% PEG wurden zwischen 50°C bis 60°C zu einer
viskösen
Flüssigkeit.
Die Quellung der Copolymere mit 40% und 70% PEG in Wasser war sehr
hoch, was zu einer schnellen Dispersion der Pasten in Wasser führte.
-
Die
in vitro Freisetzungsprofile von Paclitaxel aus PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern
sind in 23 dargestellt. Das Experiment
zum Messen der Freisetzung aus den Zylindern mit 40% PEG wurde abgebrochen, weil
die Zylinder einen hohen Quellungsgrad hatten (etwa 200% Wasseraufnahme
an einem Tag) und in wenigen Tagen auseinander brachen. Der freigesetzte
Anteil von Paclitaxel aus den Zylindern mit 30% PEG stieg über 70 Tage
allmählich
an. Der freigesetzte Anteil aus den Zylindern mit 20% PEG stieg
bis zu 30 Tagen langsam an und erhöhte sich dann abrupt, gefolgt
von einer weiteren Periode eines langsamen Anstiegs. Es gab einen
signifikanten Unterschied in dem Ausmaß, zu dem jeder einzelne Zylinder
(20% PEG-Anteil) die abrupte Änderung
der Freisetzung von Paclitaxel zeigte. Vor dem abrupten Anstieg
war der freigesetzte Anteil von Paclitaxel für Copolymere mit niedrigerem
PEG-Gehalt bei gleichem Durchmesser der Zylinder (1 mm) niedriger. Die
Zylinder mit 40% und mit 30% PEG zeigten viel höhere Freisetzungsraten für Paclitaxel
als die Zylinder mit 20% PEG. Zum Beispiel setzte der Zylinder mit
30% PEG 17% Paclitaxel in 30 Tagen frei gegenüber einer Freisetzung von 2%
aus dem Zylinder mit 20% PEG. Die Zylinder mit kleineren Durchmessern
führten
zu schnelleren Freisetzungsraten, d.h. in 30 Tagen setzten die Zylinder
mit 30% PEG und Durchmessern von 0,65 mm und 1 mm 26% beziehungsweise
17% Paclitaxel frei (23).
-
Die
obigen Beobachtungen können
mit dem Freisetzungsmechanismus von Paclitaxel aus den Zylindern
erklärt
werden. Es wurde durch optische Mikroskopie beobachtet, dass Paclitaxel
in Form von Kristallen im Polymer dispergiert war. Die Kristalle
begannen bei 170°C,
sich in der Copolymer-Matrix aufzulösen und lösten sich bei 180°C voll ständig auf,
wie im Heißphasen-Mikroskop
beobachtet wurde. DSC-Thermogramme von mit 20% Paclitaxel beladener
PDLLA-PEG-PDLLA-Paste (30% PEG) zeigten eine kleine Rekristallisations-Exotherme
(16 J/g, 190°C)
und eine Schmelz-Endotherme (6 J/g, 212°C) für Paclitaxel (21), was die Rekristallisation von Paclitaxel
aus der Copolymer-Schmelze jenseits von 180°C anzeigt. Bei diesem Typ einer Arzneimittel-Polymermatrix könnte Paclitaxel über Diffusion
und/oder Erosion des Polymers freigesetzt werden.
-
Im
diffusionsgesteuerten Fall kann das Arzneimittel durch molekulare
Diffusion im Polymer und/oder durch offene Kanäle, die von verbundenen Arzneimittelteilchen
gebildet werden, freigesetzt werden. Daher wurden bei der Beladung
mit 20% einige Paclitaxel-Partikel
isoliert und Paclitaxel kann durch Auflösung im Copolymer gefolgt von
Diffusion freigesetzt werden. Andere Paclitaxel-Partikel könnten Haufen
bilden, die Kontakt zur Oberfläche
gewinnen und durch Diffusion durch Kanäle freigesetzt werden. In beiden
Fällen
ergaben die kleiner dimensionierten Zylinder eine schnellere Freisetzung
des Arzneimittels infolge des kürzeren
Diffusionsweges (23).
-
Die
Dimensionsänderungen
und die Wasseraufnahme der Zylinder wurden während der Freisetzung aufgezeichnet
(24). Die Änderungen der Länge, des
Durchmessers und des Nassgewichtes der Zylinder mit 30% PEG stiegen
innerhalb von 2 Tagen schnell auf ein Maximum, blieben für etwa 15
Tage unverändert und
fielen dann allmählich
ab. Der anfängliche
Durchmesser des Zylinders hatte keinen Einfluss auf das Quellungsverhalten.
Beim Zylinder mit 20% PEG nahm die Länge an einem Tag um 10% ab
und pegelte sich ein, während
der Durchmesser und die Wasseraufnahme mit der Zeit allmählich zunahmen.
Da mehr PEG im Copolymer mehr Wasser aufnahm, um die Diffusion von
Paclitaxel zu erleichtern, wurde eine schnellere Freisetzung beobachtet
(23).
-
Die
Abnahme des Molekulargewichts von PDLLA-PEG-PDLLA-Paste wurde mit
GPC überwacht.
Für den
Zylinder mit 20% PEG stieg das Elutionsvolumen an der Position des
Peaks mit der Zeit an, was ein vermindertes Molekulargewicht des
Polymers während
des Verlaufs des Freisetzungsexperiments anzeigte (25). Am Tag 69 wurde eine biphasische Verteilung
des Molekulargewichts des Polymers beobachtet. Das Molekulargewicht
des Polymers wurde auch bei den Zylindern mit 30% PEG (1 mm und
0,65 mm) reduziert. Es wurde jedoch keine biphasische Verteilung
beobachtet.
-
NMR
Spektren zeigten einen PEG-Peak bei 3,6 ppm und PDLLA-Peaks bei
1,65 ppm und 5,1 ppm. Die Peak-Flächen von PEG nahmen im Vergleich
zu PDLLA im Copolymer nach 69 Tagen signifikant ab (26), was auf die Auflösung des PEG nach seiner Dissoziation
aus PDLLA hinweist. Der Trockengewichtsverlust der Zylinder wurde
ebenfalls aufgezeichnet (26)
und zeigt eine Abbaurate, die in der Reihenfolge 30%PEG-0,65 mm > 30°1°PEG-1 mm > 20%PEG-1 mm > abnimmt.
-
Die
morphologischen Veränderungen
der getrockneten Zylinder vor und während der Freisetzung von Paclitaxel
wurden mit SEM (27) beobachtet. In
Kürze wurden
vor der Freisetzung feste Paclitaxel-Kristalle und nicht poröse Polymer-Matrices
gesehen (27A und 27B).
Nach 69 Tagen Freisetzung wurden keine Paclitaxel-Kristalle beobachtet
und die Matrices enthielten viele Poren infolge des Abbaus des Polymers und
der Wasseraufnahme (27C und 27D).
-
Die
Zylinder mit 30% PEG zeigten nach nur zwei Tagen im Wasser eine
beträchtliche
Quellung (24) und daher wurde die
Diffusionshemmung des abgelösten
wasserlöslichen
PEG-Blocks und der abgebauten PDLLA (d.h. DL-Milchsäure-Oligomere)
vermindert. Da der Verlust an Masse und der Abbau der Zylinder mit
30%PEG kontinuierlich waren, stieg der Anteil der Erosion an der
Freisetzung allmählich
an, was zu einer anhaltenden Freisetzung von Paclitaxel ohne jede
abrupte Änderung
führte
(23). Bei den Zylindern mit 20% PEG war die Quellung
anfänglich
gering (24), was zu einer langsamen
Diffusion der Abbauprodukte führte.
Daher werden die Abbauprodukte im inneren Bereich anfänglich zurückgehalten,
während
es infolge des kurzen Diffusionswegs im äußeren Bereich viel weniger
Abbauprodukte gibt. Die Abbauprodukte beschleunigten die Abbaugeschwindigkeit,
weil die Carbonsäure-Endgruppen
der Oligomere den hydrolytischen Abbau katalysierten. Dies führt zu einer
Hülle mit
hohem Molekulargewicht und einem inneren Bereich mit niedrigem Molekulargewicht,
wie durch die biphasische Verteilung der Molekulargewichte des Copolymers
angezeigt wird (25, Tag 69). Da das Aufbrechen
der Hülle
von Faktoren wie Festigkeit, Dicke und Schäden der Hülle und inneren Abbauprodukten
abhing, waren das Einsetzen und das Ausmaß des Verlusts von inneren
Abbauprodukten sehr variabel. Weil das Aufbrechen der Hülle nicht
einheitlich ist und weil das Arzneimittel im Polymer nicht mikroskopisch
homogen ist, waren die Zeitpunkte des Ausbruchs der Freisetzung
und das Ausmaß des
Ausbruchs für
die 4 untersuchten Proben unterschiedlich (23).
-
Die
Freisetzung von Paclitaxel aus Mischungen von PDLLA und PDA und
aus reinem PCL ist in 28 dargestellt. In Kürze stieg
der freigesetzte Anteil mit dem Gehalt von PDLLA in der Mischung
an. Zum Beispiel wurden innerhalb von 10 Tagen aus 80:20, 70:30
und 0:100 PDLLA:PCL jeweils 17%, 11% und 6% Paclitaxel freigesetzt.
Nach einem anfänglichen
Ausbruch an einem Tag erfolgte eine annähernd konstante Freisetzung
aus der 80:20 PDLLA:PCL-Paste. Es wurde kein signifikantes Ausmaß einer
Quellung während der
Freisetzung beobachtet. Bei den PDLLA:PCL-Mischungen wurde PDLLA,
weil sie ein sehr niedriges Molekulargewicht von etwa 800 hatte,
ohne eine lange Verzögerung
des Verlustes an Masse schnell in wasserlösliche Produkte hydrolysiert.
PCL diente als „haltendes" Material, um die
Paste vor einer schnellen Auflösung zu
bewahren. Daher stieg die Geschwindigkeit der Freisetzung mit dem
Gehalt von PDLLA in der Mischung infolge des verstärken Abbaus
an. Die kontinuierliche Erosion der PDLLA steuerte die Freisetzung
von Paclitaxel und führte
zu einer konstanten Freisetzung. Die Freisetzung von Paclitaxel
aus reinem PCL war infolge der langsamen Geschwindigkeit des Abbaus
von PCL (in 1–2
Jahren) wahrscheinlich diffusionsgesteuert.
-
Bei
der Untersuchung der Freisetzung für mit 20% Paclitaxel beladene
90:10 PDLLA:PCL-Paste kam es infolge der Auflösung des Pellets der Paste
innerhalb von 24 Stunden Inkubation zu Schwierigkeiten. In Kürze wurden
während
der ersten 12 Stunden der Inkubation zu jeder Stunde Proben genommen,
um die Sinkbedingungen für
die Freisetzung von Paclitaxel zu sichern. Aus der 90:10-Paste wurden
innerhalb vom 10 Stunden 25–35%
Paclitaxel freigesetzt.
-
Es
wurde die Wirksamkeit der Pasten-Formulierungen beim Zurückdrängen von
Tumorwachstum in Mäusen
untersucht (29). In Kürze bestanden die untersuchten
Pas ten aus PCL ± 20%
Paclitaxel, 80:20 PDLLA:PCL ±20%
Paclitaxel, 90:10 PDLLA:PCL ±20%
Paclitaxel und PDLLA-PEG-PDLLA (30% PEG) ±20% Paclitaxel. Die Pasten-Formulierungen 90:10
PDLLA:PCL und PDLLA-PEG-PDLLA mit Paclitaxel reduzierten das Tumorwachstum
in vivo um 54 beziehungsweise 40%. Im Gegensatz dazu hatten die
Pasten-Formulierungen PCL und 80:20 PDLLA:PCL mit Paclitaxel wenig
oder keine Auswirkungen auf das Tumorwachstum. Alle Kontrollpasten
(ohne Arzneimittel) hatten keine signifikante Auswirkung auf das
Tumorwachstum. Die Pasten-Formulierungen mit schnelleren Freisetzungsgeschwindigkeiten
waren auch bei der Reduktion des Tumorwachstums wirksamer, was nahelegt,
dass eine kritische lokale Paclitaxel-Konzentration an der Stelle
des Tumors für
eine Hemmung des Tumorwachstums erforderlich ist. Pasten-Formulierungen,
die Paclitaxel langsam freisetzen, wie zum Beispiel PCL und 80:20
PDLLA:PCL waren nicht wirksam. Alle untersuchten Pasten-Formulierungen
hatten keine signifikante Wirkung auf das Körpergewicht der Mäuse, was
anzeigt, dass die mit Paclitaxel beladene Paste in vivo gut vertragen
wurde.
-
Diese
Daten deuten darauf hin, dass die lokale Anwendung von Paclitaxel
an der Stelle eines Tumors eine wirksame Behandlungsstrategie zur
Hemmung des lokalen Tumorwachstums ohne eine Erhöhung der systemischen Toxizität ist. Das
Unvermögen
von mit Paclitaxel beladenen Formulierungen, das Tumorwachstum komplett
zu hemmen, ist höchstwahrscheinlich
auf die unzureichende Freisetzung von Paclitaxel aus dem Polymer
und auf das schnelle Tumorwachstum von MDAY-D2 Tumoren zurückzuführen. Die
Leistungsfähigkeit von
90:10 PDLLA:PCL-Paste mit 30% Paclitaxel, die mehr Paclitaxel als
90:10 PDLLA:PCL-Paste mit 20% Paclitaxel freisetzte und das Tumorwachstum
wirksamer hemmte, ist in dieser Hinsicht folgerichtig. Somit ist
die Modulation der Freisetzungsgeschwindigkeit von Paclitaxel, die
von den Eigenschaften des Polymers und der chemotherapeutischen
Wirkstoffe reguliert wird, ebenso wie die Stelle der Anwendung ein
wichtiger Schritt bei der Entwicklung einer lokalen Therapie zur
Hemmung des Tumorwachstums.
-
Beispiel 12
-
Herstellung von PCL-Mikrosphären: Untersuchungen
zur Vergrößerung
-
Es
wurden Mikrosphären
(50 g) unter Verwendung von PCL (nominales Molekulargewicht 80.000)
unter Einsatz der unten beschriebenen Lösungsmittel-Verdunstungs-Methode hergestellt.
-
A. Methode
-
Ein
Ansatz von 500 ml 10% PCL in Methylenchlorid und 4000 ml 1% PVA-Lösung (Molekulargewicht 13.000–23.000;
99% hydrolysiert) wurden unter Verwendung eines mit einem Regelwiderstand
bei Einstellung 40 gesteuerfen Homo Mixers über 10 Stunden emulgierf. Die
Mischung wurde unter Verwendung eines Siebes #140 gesiebt, bis sich
die Mikrosphären
am Boden absetzten, anschließend
wurde der Überstand
dekantiert. Der Ansatz wurde dann 3× mit destilliertem Wasser
gewaschen (unter Einsatz der Sedimentation gefolgt von der Methode
des Dekantierens) und dann in 250 ml destillierten Wassers resuspendiert
und gefiltert. Die Mikrosphären
wurden über
Nacht bei 37°C
luftgetrocknet.
-
B. Ergebnisse
-
Die
Mikrosphären-Ausbeuten
waren wie folgt:
Ursprüngliches
Gewicht des PCL | =
50,1 g |
Gewicht
der erhaltenen Mikrosphären | =
41,2 g |
%
Ausbeute | =
(43,2/50.0) × 100
=
86,4 |
Ausbeute
(10–50 μm) etwa 72% | |
-
Durchschnittsgröße 21,4 μm, Median
22,0 μm
Modus 24,7 μm.
-
Schmalere
Größenbereiche
(20–40 μm) können durch
Sieben oder durch Separation unter Einsatz der Sedimentationsmethode
erreicht werden.
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Beispiel 13
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Herstellung von PLGA-Mikrosphären
-
Es
wurden Mikrosphären
aus Copolymeren von (PLLA) Milchsäure – Glycolsäure (GA) hergestellt.
-
A. Methode:
-
Es
wurden unter Einsatz von Standardmethoden (Polymer wurde in Dichlormethan
gelöst
und unter Rühren
in einer Polyvinylalkohol-Lösung
emulgiert wie oben bei den Methoden für die Herstellung von PCL- oder
PDLLA-Mikrosphären
beschrieben) Mikrosphären
in den Größenbereichen
0,5 bis 10 μm,
10–20 μm und 30–100 μm hergestellt.
Verschiedene Verhältnisse
von PLLA zu GA wurden als Polymere mit unterschiedlichen Molekulargewichten
[angegeben als intrinsische Viskosität (I.V.)] verwendet.
-
B. Ergebnis:
-
Aus
den folgenden Ausgangspolymeren wurden erfolgreich Mikrosphären hergestellt:
-
-
In
all diese Mikrosphären
wurde Paclitaxel erfolgreich zu 10% oder 20% Beladungen integriert.
Beispiele der Größenverteilungen
für ein
Ausgangspolymer (85:15, IV = 0,56) sind in den 31–34 wiedergegeben.
Es wurden Experimente zur Freisetzung von Paclitaxel unter Verwendung
von Mikrosphären
verschiedener Größen und
verschiedener Zusammensetzungen durchgeführt. Die Freisetzungsgeschwindigkeiten
werden in den 35–38 gezeigt.
-
Beispiel 14
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Diblock-Copolymere
-
Es
wurden Diblock-Copolymere aus Poly(DL-lactid)-Block-Methoxypolyethylenglycol
(PDLLA-MePEG), Polycaprolacton-Block-Methoxypolyethylenglycol (PCL-MePEG)
und Poly(DL-lactid-co-caprolacton)-Block-Methoxypolyethylenglycol
(PDLLACL-MePEG) unter Einsatz eines Massen-Schmelz-PolymerisationsverFahrens
synthetisiert. In Kürze
wurden gegebene Mengen von Monomeren, DL-Lactid, Caprolacton und
Methoxypolyethylenglycol mit unterschiedlichen Molekulargewichten
erhitzt (130°C),
um unter Stickstoff-Begasung und Rühren zu schmelzen. Zinn-Octoat
(0,2% Gew./Gew.) wurde als Katalysator zu den geschmolzenen Monomeren
gegeben. Die Polymerisation wurde für etwa 4 Stunden durchgeführt. Die
Molekulargewichte, kritischen Mizellen-Konzentrationen und die maximalen Beladungen
mit Paclitaxel wurden jeweils mit GPC, Fluoreszenz und Solubilisationstestung
untersucht (39). Es wurden hohe Aufnahmekapazitäten für Paclitaxel
erzielt. Die Fähigkeit,
Paclitaxel löslich
zu machen, hängt
von den Zusammensetzungen und Konzentrationen der Copolymere ab
(39 und 40). PDLLA-MePEG
ergab das stabilste lösliche
Paclitaxel (40 und 41).
-
Beispiel 15
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Verkapselung von Paclitaxel
in Nylon-Mikrokapseln
-
A. Herstellung von mit
Paclitaxel beladenen Mikrokapseln
-
Paclitaxel
wurde unter Einsatz der Grenzflächen-Polymerisationstechniken
in Nylon-Mikrokapseln
verkapselt. In Kürze
wurden 100 mg Paclitaxel und 100 mg Pluronic F-127 in 1 ml Dichlormethan
(DCM) gelöst und
0,4 ml (etwa 500 mg) Adipoylchlorid (ADC) wurden zugegeben. Diese
Lösung
wurde in eine 2% PVA-Lösung
für 15
Sekunden unter Verwendung eines Polytron Homogenisators (Einstellung
1) homogenisiert. Während
der Homogenisierung wurde eine Lösung
von 1,6-Hexandiamin (HMD) in 5 ml destillierten Wassers tropfenweise
zugegeben. Nach der Zugabe von HMD-Lösung wurde die Mischung für weitere
10 Sekunden homogenisiert. Die Mischung wurde in einen Becher umgefüllt und
mit einem magnetischen Rührer
für 3 Stunden gerührt. Die
Mischung wurde zentrifugiert, gesammelt und in 1 ml destillierten
Wassers resuspendiert.
-
B. Effizienz der Verkapselung/Beladung
mit Paclitaxel
-
Etwa
0,5 ml der Suspension wurden gefiltert und die Mikrosphären wurden
getrocknet. Etwa 2,5 mg der Mikrosphären wurden abgewogen und in
10 ml Acetonitril für
24 Stunden suspendiert. Der Überstand
wurde auf Paclitaxel analysiert und das Ergebnis wurde als Prozentsatz
von Paclitaxel ausgedrückt.
Vorbereitende Untersuchungen haben gezeigt, dass Paclitaxel mit
einer hohen Beladung (bis zu 60%) und einer hohen Effizienz der
Verkapselung (mehr als 80%) in Nylon-Mikrokapseln verkapselt werden
kann.
-
C. Untersuchungen der
Freisetzung von Paclitaxel
-
Etwa
2,5 mg der Paclitaxel-Nylon-Mikrosphären wurden in 50 ml Wasser,
das jeweils 1 M Natriumchlorid und Harnstoff enthielt, suspendiert
und regelmäßig untersucht.
Die Freisetzung von Paclitaxel aus den Mikrokapseln erfolgte schnell,
wobei mehr als 95% des Arzneimittels nach 72 Stunden freigesetzt
wurden (42).
-
Beispiel 16
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Paclitaxel in Polymer-Mizellen
-
PDLLA-MePEG
ist ein Block-Copolymer mit hydrophoben (PDLLA) und hydrophilen
(MePEG) Regionen. Bei geeigneten Molekulargewichten und chemischer
Zusammensetzung bilden sie Mizellen mit hydrophobem PDLLA Kern und
hydrophiler MePEG Hülle.
Paclitaxel kann in den hydrophoben Kern geladen werden, womit Paclitaxel
mit einer erhöhten "Löslichkeit" bereitgestellt wird.
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A. Synthese von Diblock-Copolymer
von PDLLA-MePEG
-
Monomere
von Methoxypolyethylenglycol (z.B. M. W. 2000, 150 g) und DL-Lactid
(100 g) werden in einen Kolben mit rundem Boden gegeben und die
Temperatur wird auf 130–150°C erhöht. Nach
dem Schmelzen der Monomere werden 0,6 g Zinn-Octoat als Katalysator
zugegeben. Die Polymerisation ist innerhalb von 0 Stunden beendet.
Die Reaktion erfolgt unter N2-Schutz und
Rühren.
-
B. Herstellung von Paclitaxel
in Mizellen
-
Das
PDLLA-MePEG-Copolymer wird in Acetonitril oder 50:50 Ethanol:Aceton
(Polymerkonzentration < 40%)
gelöst.
Die Polymerlösung
wird für
5 min zentrifugiert (14000 Upm). Der Überstand (unlösliches
Polymer verworfen) wird in ein Teströhrchen aus Glas umgefüllt. Paclitaxel
wird in Acetonitril oder 50:50 Ethanol:Aceton gelöst und wird
zu der gereinigten Polymerlösung
gegeben. Nach Vortex-Mischung wird das Lösungsmittel bei 60°C unter einem
Stickstoffstrom evaporisiert (dauert normalerweise für eine typische
Paclitaxel-Portion von 40 mg 2 Stunden). Das restliche Lösungsmittel
kann durch Anwendung von Vakuum und Hitze entfernt werden. Die Matrix
wird auf etwa 60°C
erhitzt, bis sie zu einem transparenten Gel wird. Dann wird ein bestimmtes
Volumen von Wasser (> 4
mal das Gewicht der Matrix) zur Matrix zugegeben. Dem folgt unmittelbar
eine Vortex-Mischung nach, bis die Paclitaxel-Polymermatrix löslich gemacht
ist. Die Formulierungen sind in Tabelle II angegeben.
-
Tabelle
II. Formulierungen von Paclitaxel/PDLLA-MePEG*
-
C. Herstellung von Systemen
zur Abgabe von Paclitaxel aus Mizellen/von Polymeren, die unter
Wärmeeinwirkung
gelieren.
-
Ein
Polymer, das unter Wärmeeinwirkung
geliert, wie zum Beispiel Poly(N-isopropylacrylamid) wird in destilliertem
Wasser gelöst.
Getrennt wird Wasser zu einer mizellenartigen Paclitaxel-Polymermatrix,
z.B. mit 10% Paclitaxel beladendes PDLLA-MePEG 2000-40/60, gegeben, um eine Lösung von
Paclitaxel in Mizellen zu bilden. Bei de Lösungen werden gekühlt (z.B.
4°C) und
gemischt, um das unter Wärmeeinwirkung
gelierende System zur Abgabe zu bilden.
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Beispiel 17
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Untersuchung der Freisetzung
des Arzneimittels
-
Ein
bekanntes Gewicht des Polymers (typischerweise ein 2,5 mg Pellet)
wird in ein 15 ml Teströhrchen, das
14 ml eines Puffers mit 10 mM Na2HPO4-NaH2PO4,
0,145 M NaCl und 0,4 g/l Rinderserumalbumin enthält, gegeben. Die Röhrchen werden
verschlossen und bei 37°C
geschwenkt. Zu bestimmten Zeiten werden die gesamten 14 ml des flüssigen Puffers
entfernt und mit frischem flüssigen
Puffer ersetzt.
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Der
flüssige
Puffer wird zu 1 Milliliter Methylenchlorid gegeben und für 1 Minute
geschüttelt,
um das gesamte Paclitaxel in das Methylenchlorid zu extrahieren.
Die wässrige
Phase wird dann entfernt und die Methylenchlorid-Phase wird unter
Stickstoff getrocknet. Der Rest wird dann in 60% Acetonitril: 40%
Wasser gelöst und
die Lösung
wird unter Einhaltung der folgenden Bedingungen auf ein HPLC-System
gegeben: C8 Säule (Beckman
Instruments USA), mobile Phase von 58%:5%:37% Acetonitril:Methanol:Wasser
bei einer Flussrate von 1 Minute pro Minute.
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Der
gesammelte Puffer wird dann bei 232 nm auf Paclitaxel untersucht.
Für MTX
wird der gesammelte Puffer ohne die Notwendigkeit einer Extraktion
in Methylenchlorid direkt auf die HPLC Säule gegeben. Es wird bei 302
nm auf MTX untersucht. Auf Verbindungen, die Vanadium enthalten,
wird der flüssige
Puffer unter Verwendung eines UV/VIS Spektrometers im Bereich von
200 bis 300 nm direkt untersucht.
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Beispiel 18
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Auswirkung von mit Paclitaxel
beladener Thermopaste auf Tumorwachstum und Tumor-Angiogenese in
vivo
-
Befruchtete
Hühnerembryonen
werden 3 Tage, bevor ihre Schalen entfernt werden, inkubiert. Die
Inhalte der Eier werden entleert, indem man die Schale, die sich
um die Luftkammer herum befindet, entfernt, die innere Membran der
Schale ablöst,
das gegenüber
liegende Ende der Schale perforiert und den Inhalt des Eis sanft
aus dem stumpfen Ende herausgleiten lässt. Die Inhalte werden in
sterilisierte Glasschalen mit runden Böden entleert, mit Deckeln von
Petrischalen abgedeckt und bei 90% relativer Feuchtigkeit und 3%
Kohlendioxid inkubiert.
-
MDAY-D2-Zellen
(ein lymphatischer Tumor der Maus) werden Mäusen injiziert und man lässt sie
zu Tumoren, die 0,5–1,0
g wiegen, heranwachsen. Die Mäuse
werden getötet,
die Stellen der Tumore mit Alkohol abgewischt, excidiert, in sterile
Kulturmedien gegeben und unter einer Abzugshaube mit Laminarfluss
in Würfel von
1 mm geschnitten. Bevor die präparierten
Tumore auf die 9 Tage alten Hühnerembryonen
aufgebracht werden, werden die CAM-Oberflächen leicht mit einer 30-Gauge-Nadel
geritzt, um die Implantation des Tumors sicherzustellen. Die Tumore
werden dann nach 8 Tagen Inkubation (4 Tage nach dem Entfernen der Schale)
auf die CAM aufgebracht und man lässt sie auf der CAM für vier Tage
wachsen, damit sich eine Gefäßversorgung
bilden kann. Vier Embryonen werden unter Einsatz dieser Methode
präpariert,
wobei jeder Embryo drei Tumore erhält. Bei diesen Embryonen erhält ein Tumor
mit 20% Paclitaxel beladene Thermopaste, der zweite Tumor nicht
beladene Thermopaste und der dritte Tumor keine Behandlung. Die
Behandlungen werden vor der Aufzeichnung der Ergebnisse für zwei Tage
fortgeführt.
-
Die
explantierten MDAY-D2 Tumore sezernieren angiogene Faktoren, die
das Einsprossen von Kapillaren (von der CAM stammend) in die Tumormasse
induzieren und ihr erlauben, weiter an Größe zuzunehmen. Da sich alle
Gefäße des Tumors
von der CAM herleiten, während
alle Tumorzellen von dem explantierten Gewebe stammen, ist es möglich, die
Auswirkungen therapeutischer Interventionen auf diese beiden Prozesse voneinander
unabhängig
zu beurteilen. Dieser Test wurde verwendet, um die Wirksamkeit von
mit Paclitaxel beladener Thermopaste auf (a) die Hemmung der Gefäßversorgung
des Tumors und (b) die Hemmung des Wachstums der Tumorzellen selbst
zu prüfen.
-
Direkte
stereomikroskopische Untersuchung in vivo und histologische Untersuchen
der fixierten Gewebe aus dieser Untersuchung ergaben Folgendes:
In den Tumoren, die mit Thermopaste, die mit 20% Paclitaxel beladen
war, behandelt worden waren, gab es im Vergleich zu Kontrolltumoren
(70A und 70B) einen
Rückgang
der Zahl der den Tumor versorgenden Blutgefäße (siehe 70C und 70D),
einen Rückgang
der Zahl der Gefäße im Tumor
und einen Rückgang
der Zahl der Blutgefäße in der
Peripherie des Tumors (dem Bereich, der in einem festen Tumor typischerweise
der am höchsten
vaskularisierte ist). Die Tumoren begannen, während der zwei Tage, an denen
die Untersuchung durchgeführt
wurde, an Größe und Masse
abzunehmen. Zusätzlich
sah man, dass zahlreiche Endothelzellen in der Zellteilung arretiert
waren, was darauf hinweist, dass die Proliferation der Endothelzellen
beeinträchtigt
worden war. Es wurden auch häufig
in der Mitose arretierte Tumorzellen gesehen. Alle 4 Embryonen zeigten
ein einheitliches Muster mit einer Suppression der Gefäßversorgung
des Tumors durch die mit 20% Paclitaxel beladene Thermopaste, während die
nicht beladene Thermopaste keine Wirkung hatte.
-
Im
Vergleich waren auf CAM, die mit nicht beladener Thermopaste behandelt
worden waren, die Tumore gut vaskularisiert mit einem Anstieg der
Zahl und Dichte von Gefäßen im Vergleich
zum normalen umgebenden Gewebe und mit drastisch mehr Gefäßen als
in Tumoren, die mit Paste, die mit Paclitaxel beladen war, behandelt
worden waren, beobachtet wurden. Die neu gebildeten Gefäße drangen
von allen Winkeln, erscheinend wie Speichen, die in der Mitte eines
Rades befestigt sind, in den Tumor ein (siehe 70A und 70B).
Die Kontrolltumore nahmen während
des Verlaufs der Studie weiter an Größe und Masse zu. Histologisch
sah man zahlreiche dilatierte dünnwandige
Kapillaren in der Peripherie des Tumors und wenige Endothelien in
der Zellteilung. Das Tumorgewebe war gut vaskularisiert und durchweg
lebensfähig.
-
Zum
Beispiel wurden von zwei Tumoren mit ähnlicher Größe (anfänglich, zum Zeitpunkt der Explantation),
die auf dieselbe CAM aufgebracht worden waren, folgende Daten erhalten:
Beim Tumor, der mit Thermopaste, die 20% Paclitaxel beladen war,
behandelt worden war, maß der
Tumor 330 mm × 597
mm; die unmittelbare Peripherie des Tumors hat 14 Blutgefäße, während die
Tumormasse nur 3–4
kleine Kapillaren hat. Beim Tumor, der mit nicht beladender Thermopaste
behandelt worden war, war die Tumorgröße 623 mm × 678 mm; die unmittelbare
Peripherie des Tumors hat 54 Blutgefäße, während die Tumormasse 12–14 kleine
Blutgefäße hat.
Zusätzlich
enthielt die umgeben de CAM selbst viel mehr Blutgefäße als vergleichsweise
der Bereich, der den mit Paclitaxel behandelten Tumor umgab.
-
Diese
Untersuchung zeigt, dass die Thermopaste ausreichende Mengen eines
antiproliferativen Wirkstoffes (in diesem Fall Paclitaxel) freisetzt,
um die pathologische Angiogenese, die mit dem Wachstum und der Entwicklung
eines Tumors einhergeht, zu hemmen. Unter diesen Bedingungen wird
die Angiogenese maximal von den Tumorzellen stimuliert, welche angiogene
Faktoren, die das Einsprossen von Kapillaren aus dem umgebenden
Gewebe in die Tumormasse hervorrufen können, produzieren. Die mit
20% Paclitaxel beladene Thermopaste kann diesen Prozess blockieren
und Fähigkeit
des Tumorgewebes eine ausreichende Blutversorgung aufrechtzuerhalten
limitieren. Dies führt
sowohl durch eine cytotoxische Wirkung auf die Tumorzellen selbst
als auch dadurch, dass dem Gewebe die zu Wachstum und Ausbreitung
benötigten
Nährstoffe
vorenthalten werden, zu einer Abnahme der Tumormasse.
-
Beispiel 19
-
Auswirkung von mit therapeutischem
Wirkstoff beladener Thermopaste auf das Tumorwachstum in vivo in
einem Tumormodell bei der Maus
-
Das
MDAY-D2 Tumormodell bei der Maus kann eingesetzt werden, um die
Wirkung von lokaler langsamer Freisetzung einer antiproliferativen
Verbindung wie zum Beispiel Paclitaxel auf das Tumorwachstum, die
Metastasierung des Tumors und das Überleben des Tieres zu untersuchen.
In Kürze
wird die MDAY-D2 Tumorzelllinie in einer Zellsuspension, die aus
5% fetalem Kälberserum
in alpha-MEM Medium besteht, angezogen. Die Zellen werden bei 37°C in befeuchteter
Atmosphäre,
die mit 5% Kohlendioxid angereichert ist, inkubiert und alle 3 Tage
um das 15fache verdünnt,
bis eine ausreichende Zahl von Zellen erreicht wird. Nach der Inkubationsperiode
werden die Zellen lichtmikroskopisch auf Lebensfähigkeit hin untersucht und
dann bei 1500 Upm für
5 Minuten zentrifugiert. PBS wird zu den Zellen zugegeben, um eine
Verdünnung
von 1.000.000 Zellen pro ml zu erzielen.
-
Zehn
Wochen alte weibliche DBA/2j-Mäuse
werden für
3–4 Tage
nach Eintreffen akklimatisiert. Jeder Maus werden dann in die posterolaterale
Flanke 100.000 MDAY-D2- Zellen
in 100 ml PBS subcutan injiziert. Vorhergehende Untersuchungen haben
gezeigt, dass dies innerhalb von 3–4 Tagen an der Injektionsstelle
einen sichtbaren Tumor erzeugt, der innerhalb von 14 Tagen eine
Größe von 1,0–1,7 g erreicht,
und 19–25
Tage nach der Injektion in der Leber sichtbare Metastasen produziert.
Abhängig
vom Ziel der Untersuchung kann zu jedem Punkt des Fortschreitens
der Erkrankung eine therapeutische Intervention unternommen werden.
-
Unter
Verwendung des obigen Tiermodells werden 20 Mäusen 140.000 MDAY-D2 Zellen
s.c. injiziert und man lässt
die Tumore wachsen. Am Tag 5 wurden die Mäuse in Gruppen von 5 aufgeteilt.
Die Stelle des Tumors wurde unter Narkose chirurgisch eröffnet, der
lokale Bereich wurde mit der mit Arzneimittel beladenen Thermopaste
oder mit der Kontroll-Thermopaste behandelt, ohne das vorhandene
Tumorgewebe zu kompromittieren, und die Wunde wurde verschlossen.
Die Gruppen von 5 erhielten entweder keine Behandlung (Wunde lediglich
verschlossen), Polymer (PCL) allein, mit 10% Paclitaxel beladene
Thermopaste oder mit 20% Paclitaxel beladene Thermopaste (nur 4
Tieren injiziert) nahe der Stelle des Tumors eingesetzt. Am Tag
16 wurden die Mäuse
getötet,
die Tumore wurden präpariert,
und (makroskopisch und histologisch) auf Tumorwachstum, Tumormetastasierung,
lokale und systemische Toxizität
als Ergebnis der Behandlung, Wirkung auf die Wundheilung, Wirkung
auf die Gefäßversorgung
der Tumore, und auf die Verfassung der an der Incisionsstelle verbliebenen
Paste hin untersucht.
-
Der
Gewichte der Tumore sind für
jedes Tier in Tabelle IV unten angegeben.
-
Tabelle
IV Tumorgewichte
(g)
-
Mit
20% Paclitaxel beladene Thermopaste reduzierte das Tumorwachstum
um mehr als 85% (Durchschnittsgewicht 0,105) im Vergleich zu Kontrolltieren
(Durchschnittsgewicht 0,681). Tiere, die nur mit Thermopaste oder
mit Thermopaste, die 10% Paclitaxel enthielt, behandelt worden waren,
hatten nur geringe Auswirkungen auf das Tumorwachstum; die Tumorgewichte
wurden um nur 10% beziehungsweise 35% (43A) verringert.
Daher war die Thermopaste, die 20% Paclitaxel enthielt, bei der
Reduktion des Tumorwachstums wirksamer als Thermopaste, die 10%
Paclitaxel enthielt (siehe 43C,
siehe auch 43B).
-
Bei
einigen Tieren wurde Thermopaste an der Stelle der Verabreichung
gefunden. Bei 8 von 15 Mäusen
wurde Polymer, dessen Gewicht zwischen 0,026 g bis 0,078 g variierte,
nachgewiesen. Jedes Tier in der Gruppe mit Thermopaste, die mit
20% Paclitaxel beladen war, enthielt einiges an verbleibendem Polymer,
was nahe legt, dass es weniger anfällig für Auflösung war. Histologisch enthielten
die Tumore, die mit Thermopaste, die mit Paclitaxel beladen war,
behandelt worden waren, weniger Zellgehalt und mehr Ge websnekrose
als Kontrolltumore. Das Gefäßnetz war
reduziert und man sah oft, dass Endothelzellen in der Zellteilung
arretiert waren. Die mit Paclitaxel beladene Thermopaste schien
keine Auswirkungen auf die Integrität und den Zellgehalt der Haut
oder der den Tumor umgebenden Gewebe zu haben. Grob betrachtet war
die Wundheilung unbeeinflusst.
-
Beispiel 20
-
Verwendung von mit Paclitaxel
beladener chirurgischer Paste, um das Nachwachsen von teilweise
resezierten RIF-1 Tumoren in Mäusen
zu verzögern.
-
Es
wurde die Wirksamkeit einer Formulierung von Paclitaxel in einer
biologisch abbaubaren, polymeren, chirurgischen Paste in Retardform
auf das Verzögern
des Nachwachsens von teilweise resezierten RIF-1 Tumoren in C3H/HeJ-Mäusen untersucht.
-
A. Methoden
-
Paclitaxel
(20%) wurde in eine 4:1 Mischung von Poly(ε-caprolacton) und Methoxypolyethylenglycol integriert.
Das in vitro Freisetzungsprofil für diese Formulierung in Phosphat-gepufferter
Salzlösung
mit Albumin (0,5 mg/ml) bei 37° wurde
unter Verwendung eines HPLC-Tests für Paclitaxel untersucht. In
Kürze wurden siebzehn
Mäusen
100 μl einer
RIF-1 Zellsuspension (1,0 × 106 Zellen) in Hanks Puffer injiziert. Man
ließ die Tumore
für 5 Tage
wachsen, wonach mehr als 70% eines jeden Tumors chirurgisch reseziert
und die verbliebene Tumormasse unbehandelt gelassen oder mit 20–30 μl von entweder
20% Paclitaxel in chirurgischer Paste oder von chirurgischer Paste
allein (kein Arzneimittel) beschichtet wurde. Dies war Tag 0. Die
Dimensionen der sichtbaren Tumormasse unter der Haut wurden an den
Tagen 4 bis 7 und am Tag 9 gemessen. Es wurde gezeigt, dass die
Fläche
dieser sichtbaren zylindrischen Oberfläche des Tumors mit dem Volumen
des Tumors korrelierte (r = 0,812).
-
B. Ergebnisse
-
Die
in vitro Freisetzungskurve von Paclitaxel wurde durch eine anfängliche
Ausbruchsphase von 1 Tag gefolgt von einer langen Periode einer
langsamen, anhaltenden Freisetzung charakterisiert. Die Flächen der sichtbaren
zylindrischen Oberflächen
der Tumore jeder Maus von den Tagen 4 bis 9 sind in Tabelle V dargestellt.
In den beiden Grup pen, die kein Paclitaxel erhielten, zeigten alle
Mäuse mit
Ausnahme von einer ein beträchtliches
Nachwachsen des Tumors am Tag 4. Eine Maus, die Polymer allein erhalten
hatte, zeigte ein verzögertes
Nachwachsen des Tumors, während
eine Maus, die keine Therapie erhalten hatte, kein Nachwachsen zeigte.
Im Gegensatz dazu zeigten alle Mäuse,
die mit chirurgischer Paste mit Paclitaxel behandelt worden waren,
bis auf eine bis mindestens Tag 5 kein Nachwachsen des Tumors, und
zwei Mäuse
zeigten bis zum Tag 6 noch kein Nachwachsen.
-
C. Schlussfolgerung
-
Mit
Paclitaxel beladene Paste hemmte das Nachwachsen des Tumors zwischen
den Tagen 1 bis 5 signifikant. Nach Tag 6 trat infolge der Aggressivität der Zellline
ein Nachwachsen auf. Tabelle
V Größe von RIF-1
Zelltumoren (dargestellt als Fläche
der durch die Haut sichtbaren Tumormasse in mm
2),
gemessen an Tagen nach der chirurgischen Tumorresektion
- * Tumor nicht gemessen oder Tier bereits
getötet
-
Vergleichsbeispiel 21
-
Verkapselung von Suramin
-
Ein
Milliliter von 5% ELVAX (Poly(ethylenvinylacetat) mit 5% Vinylacetat
quervernetzt) in Dichlormethan ("DCM") wird mit einem
festgesetzten Gewicht von im Submicron-Bereich gemahlenen Natrium-Suramin gemischt.
Diese Mischung wird in 5 ml 5% Polyvinylalkohol ("PVA") in Wasser in einem
30 ml Teströhrchen
mit flachem Boden injiziert. Röhrchen
mit unterschiedlichen Gewichten des Arzneimittels werden dann in
einem Multiprobenwasserbad bei 40°C
für 90
Minuten mit automatisiertem Rühren
suspendiert. Die Mischungen werden entnommen und Proben der Mikrosphären werden
für die
Größenbestimmung
abgenommen. Die Röhrchen
werden bei 1000g für
5 min zentrifugiert. Der PVA Überstand
wird entfernt und zur Untersuchung (nicht verkapseltes Arzneimittel)
aufbewahrt. Die Mikrosphären
werden dann in 5 ml Wasser gewaschen (gevortext) und erneut zentrifugiert.
Die 5 ml Waschlösung
werden zur Untersuchung (oberflächengebundenes
Arzneimittel) aufbewahrt. Die Mikrosphären werden dann in 50 μl Methanol
angefeuchtet und in 1 ml DCM gevortext, um das ELVAX zu lösen. Die
Mikrosphären
werden dann auf 40°C
erwärmt,
und 5 ml von Wasser von 50°C werden
langsam unter Rühren
zugegeben. Dieser Arbeitsschritt führt zur sofortigen Verdunstung
von DCM, was dadurch die Freisetzung des Natrium-Suramins in die
5 ml Wasser bewirkt.
-
Alle
Proben wurden durch Fluoreszenzquantifizierung auf ihren Arzneimittelgehalt
hin untersucht. In Kürze
absorbiert Natrium-Suramin UV/vis mit lambda max von 312 nm. Diese
Absorption ist sowohl in Wasser als auch in 5% PVA im Bereich von
0 bis 100 mg/ml linear. Natrium-Suramin fluoresziert auch stark
mit einem Excitationsmaximum bei 312 nm und einem Emissionsmaximum
bei 400 nm. Diese Fluoreszenz ist im Bereich von 0 bis 25 μg/ml quantifizierbar.
-
Die
Ergebnisse dieser Experimente werden in den 44–50 gezeigt.
In Kürze
scheint die Größenverteilung
der Mikrosphären
nach Anzahl (44) oder nach Gewicht (45) durch den Einschluss des Arzneimittels in
das DCM nicht beeinflusst zu werden. Es können gute Ausbeuten von Mikrosphären im Bereich
von 20 bis 60 μm
erzielt werden.
-
Die
Verkapselung von Suramin ist sehr gering (< 1%) (siehe 47).
Jedoch erhöhte
sich die Gesamtmenge des verkapselten Arzneimittels mit der Steigerung
des Gewichts des Arzneimittels im DCM, obwohl der Prozentsatz der
Verkapselung absank. Wie in 46 gezeigt
wird, können
50 μg des
Arzneimittels in 50 mg ELVAX verkapselt wer den. Die Verkapselung
von Natrium-Suramin in 2,5% PVA mit 10% NaCl wird in 48 (Größenverteilung
nach Gewicht) gezeigt. Die Verkapselung von Natrium-Suramin in 5%
PVA mit 10% NaCl wird in den 49 und 50 (Größenverteilung
jeweils nach Gewicht und Anzahl) gezeigt.
-
Um
Suramin und Cortisonacetat als potenzielle antiangiogene Wirkstoffe
zu beurteilen wurde jeder Wirkstoff mit 0,5% Methylcellulose gemischt
und die getrockneten Scheiben mit dem Arzneimittel wurden auf die
sich entwickelnden Blutgefäße der 6
Tage alten CAM aufgebracht. Eine Kombinationsbehandlung aus Suramin
(70 μg)
mit Cortisonacetat (20 μg)
war in einem 48-Stunden-Test auf der CAM bei der Hemmung der Angiogenese
erfolgreich. Die sich hieraus ergebende gefäßfreie Zone maß 6 mm im
Durchmesser und zeigte einen fehlenden Blutstrom und das Auftreten
von verstreuten Blutinseln (51A und 51B).
-
Vergleichsbeispiel 22
-
Mit Methotrexat beladene
Paste
-
A. Herstellung von mit
Methotrexat beladener Paste
-
Methotrexat
("MTX"; Sigma Chemical
Co.) wird mit Stößel und
Mörser
gemahlen, um die Partikelgröße auf unter
5 Micron zu reduzieren. Es wird dann als trockenes Pulver mit Polycaprolacton
(Molekulargewicht 18000 Birmingham Polymers, AL USA) gemischt. Die
Mischung wird für
5 Minuten auf 65°C
erhitzt und die geschmolzene Mischung Polymer-Methotrexat wird für 5 Minuten
zu einer glatten Paste gerührt.
Die geschmolzene Paste wird dann in eine 1 ml Spritze gegeben und
nach Bedarf herausgedrückt.
-
B. Ergebnisse
-
Die
Ergebnisse sind in den 52A–E gezeigt.
In Kürze
zeigt 52A die Freisetzung von MTX
aus PCL-Scheiben, die 20% MePEG und verschiedene Konzentrationen
von MTX enthalten. 52B zeigt ein ähnliches
Experiment mit Paste, die kein MePEG enthält. Die 52C,
D und E zeigen die Menge von MTX, die in den Scheiben verbleibt.
-
Wie
aus den obigen Resultaten ersehen werden kann, können beträchtliche Mengen MTX aus dem Polymer
freigesetzt werden, wenn hohe MePEG-Konzentrationen eingesetzt werden.
-
Vergleichsbeispiel 23
-
Herstellung von Mikrosphären, die
Methotrexat enthalten
-
A. Mikrosphären mit
Methotrexat allein
-
Methotrexat
(Sigma) wurde mit Stößel und
Mörser
gemahlen, um die Partikelgröße auf unter
5 Micron zu reduzieren. Einhundert Milliliter von 2,5% PVA (Gew./Vol.)
(Aldrich oder Sigma) in Wasser wurde für 15 Minuten mit 500 mg von
ungemahlenem MTX bei 25°C
gerührt,
um die Lösung
mit MTX zu sättigen.
Diese Lösung
wurde bei 2000 Upm zentrifugiert, um ungelöstes MTX zu entfernen und der Überstand
wurde zur Herstellung von Mikrosphären verwendet.
-
In
Kürze wurden
10 ml einer 5% (Gew./Vol.) Lösung
von Poly(DL)milchsäure
(Molekulargewicht 500.000; Polysciences), Polymilch-:glycolsäure (50:50
IV 0,78 Polysciences) oder Polycaprolacton (Molekulargewicht 18.000,
BPI) mit 10:90 (Gew./Gew.) MTX(gemahlen):POLYMER langsam und tropfenweise
unter Rühren
bei 600 Upm in 100 ml der mit MTX gesättigten 2,5% (Gew./Vol.) PVA-Lösung gegeben.
Die Mischung wurde bei 25°C
für 2 Stunden
gerührt
und die sich daraus ergebenden Mikrosphären wurden gewaschen und getrocknet.
-
Mit
Einsatz dieser Methode können
reproduzierbar mit MTX beladene Mikrosphären im Bereich von 30 bis 160
Micron (siehe 53) hergestellt werden.
-
B. Mikrosphären mit
MTX und Hyaluronsäure
-
Mit
MTX beladene Mikrosphären
können
wie unten im Wesentlichen beschrieben unter Verwendung von Hyaluronsäure ("HA") als Träger durch
ein Herstellungsverfahren mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt werden.
In Kürze
werden 50 ml Paraffinöl
(Leichtöl;
Fisher Scientific) unter Rühren
bei 200 Upm auf 60°C erhitzt.
5 ml einer Natriumhyaluronat-Lösung
(20/ml); Herkunft = Hahnenkamm; Sigma) in Wasser, die verschiedene
Mengen MTX enthält,
werden dem Paraffinöl
tropfenweise zugegeben. Die Mischung wird bei 200 Upm für 5 Stunden
gerührt
und bei 500 × g
für 5 Minuten
gerührt.
Die sich hieraus ergebenden Mikrosphären werden viermal in Hexan
gewaschen und man lässt
sie trocknen.
-
Vergleichsbeispiel 24
-
Herstellung von polymeren
Zusammensetzungen, die Vanadiumverbindungen enthalten
-
A. Polymere Paste, die
Vanadylsulfat enthält
-
Vanadylsulfat
(Fisher Scientific) wird zunächst
mit Stößel und
Mörser
gemahlen, um die Partikelgröße zu verringern
und wird dann in geschmolzenes PCL dispergiert, wie oben für MTX beschrieben.
Es wird dann in eine Spritze aufgenommen, um fest zu werden, und
ist gebrauchsfertig.
-
Die
Freisetzung des Arzneimittels wurde im Wesentlichen wie oben in
Beispiel 31 beschrieben ermittelt, mit den Ausnahmen, dass ein Pellet
von 65 mg von 10% (Gew./Gew.) VOSO4:PCL
in 10 ml Wasser suspendiert wurde und dass der Überstand unter Einsatz der
UV/Vis-Absorptionsspektroskopie des Peaks im Bereich von 200 bis
300 nm auf freigesetztes Vanadylsulfat untersucht wurde.
-
Die
Ergebnisse sind in 54 gezeigt. In Kürze wurden
aus einer polymeren Zusammensetzung, die 10% VOSO4 enthielt,
in 6 Stunden 1 mg VOSO4 freigesetzt, 3 mg
nach 2 Tagen und 5 mg am Tag 6.
-
B. Polymere Mikrosphären, die
Vanadylsulfat enthalten
-
Vanadylsulfat
wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 23 beschrieben in Mikrosphären aus
Polymilchsäure
oder Hyaluronsäure
integriert. Die Ergebnisse sind in 55 dargestellt.
-
C. Polymere Paste, die
organisches Vanadat enthält
-
Organisches
Vanadat wird einer PCL-Paste im Wesentlichen wie oben in Beispiel
22 beschrieben zugeführt.
Die Freisetzung von Vanadat aus den Mikrosphären wurde wie oben beschrieben
ermittelt. Die Ergebnisse sind in den 56A und 56B gezeigt.
-
D. Mikrosphären, die
organisches Vanadat enthalten
-
Organisches
Vanadat kann auch Mikrosphären
im Wesentlichen wie in Beispiel 23 beschrieben zugeführt werden.
Solche Mikrosphären
sind in 57 für Poly(D,L)milchsäure (M.
W. 500.000; Polysciences) abgebildet.
-
Vergleichsbeispiel 25
-
Polymere Zusammensetzung,
die Bis(maltolato)oxovanadium (BMOV) enthält
-
A. Herstellung einer mit
Bis(maltolato)oxovanadium beladenen Paste
-
Poly(ε-caprolacton)
(Molekulargewicht 20000) (BPI Birmingham AL) und BMOV wurden in
angemessenen Verhältnissen
direkt in ein Becherglas eingewogen. In einigen Formulierungen wurde
auch Methoxypolyethylenglycol (MEPEG) (Molekulargewicht 350) (Union
Carbide, Danbury CT.) zu PCL und BMOV zugegeben. Becher und Inhalt
wurden unter leichtem Rühren
für 5 Minuten
auf 55°C
erwärmt,
bis das BMOV gründlich im
geschmolzenen Polymer dispergiert war. Die geschmolzene Mischung
wurde dann in eine vorgewärmte Spritze
aufgezogen und bei 4°C
bis zur Verwendung gelagert.
-
B. Untersuchungen zur
Arzneimittelfreisetzung
-
Zu
Röhrchen,
die 15 ml einer 10 mM Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS pH 7,4) und 100 μg/ml Rinderserumalbumin
(Fraktion 5 Boehringer Mannheim, Deutschland) enthielten, wurden
150 mg scheibenförmiger
Platten aus PCL-BMOV-Paste gegeben. Die Röhrchen wurden verschlossen
und mit 30 Upm bei 37°C über ihre
Enden geschwenkt. Zu angebrachten Zeiten ließ man die PCL-BMOV-Platte unter
Schwerkraft für
5 Minuten absinken und entfernte den gesamten Überstand. In den Überständen wurde
die Konzentration von BMOV durch Messung der Absorption bei 256
nm (A256) und bei 276 nm (A276) ermittelt. Der Überstand wurde mit 15 ml frischer
PBL ersetzt und die Röhrchen
wurden erneut geschwenkt. Durch Verwendung von BMOV-Standards im
Bereich von 0 bis 25 μg/ml
erhielt man eine lineare Kalibrationskurve von BMOC-Konzentration vs.
A256 oder A276. Es wurde gezeigt, dass die Absorptionswerte dieser Standards
bei 256 nm oder bei 276 nm durch die Lagerung in verschlossenen
Röhrchen
bei 37°C
für 2–3 Tage
(dieselben Bedingungen wie bei den Untersuchungen zur Arzneimittelfreisetzung)
nicht beeinflusst wurden.
-
Am
Ende der Untersuchungen zur Arzneimittelfreisetzung wurden Proben
der PCL-BMOV-Matrix
auf ihren Gehalt an verbliebenem Arzneimittel hin untersucht, indem
ein bekanntes Trockengewicht der Matrix in 0,5 ml Dichlormethan
(DCM) (Fisher) gelöst
wurde. Zu dieser Lösung
wurden unter Mischen 50 ml warmen (50°C) Wassers gegeben, um das DCM
verdunsten zu lassen, wodurch das BMOV zur spektrophotometischen Untersuchung
(A256) in Wasser zurückgelassen
wurde.
-
C. Rasterelektronenmikroskopie
(SEM)
-
Proben
der PCL-BMOV-Matrix, die in den 2 Monate dauernden Experimenten
zur Arzneimittelfreisetzung verwendet worden waren, wurden mit SEM
untersucht. Diese Proben wurden mit frisch hergestellten Kontrollproben
verglichen. Polymerproben wurden beschichtet (60:40 Gold:Palladium)
(Hummer instruments, Technics, USA) und mit einem Hitachi (Modell
F-2300) Rasterelektronenmikroskop mit einem IBM-Datenerfassungssystem untersucht.
-
D. Ergebnisse
-
Die
Freisetzung von BMOV aus der PCL-Matrix wird in den 58A und 58B gezeigt.
Eine Steigerung der Beladung mit BMOV von 5% auf 35% in der PCL-Matrix
steigerte die Geschwindigkeit der Freisetzung des Arzneimittels über die
Periode von zwei Monaten (58A).
Bei einer Beladung mit 35% BMOV stieg die Freisetzungsgeschwindigkeit
drastisch. Die Freisetzungsprofile für Beladungen mit 20% bis 30% BMOV
zeigten eine anfänglich
schnellere Phase der Arzneimittelfreisetzung an den ersten beiden
Tagen, gefolgt von einer geregelten, nahezu linearen Freisetzung über die
nächsten
2 Monate.
-
Die
Profile der Arzneimittelfreisetzung werden auch als Prozentsatz
des im Pellet verbleibenden Arzneimittels ausgedrückt (58B). In Kürze
war der Prozentsatz des in der PCL-Matrix verbleibenden BMOV zu
allen Zeitpunkten für
alle Beladungen mit BMOV bis zu (und einschließlich) 30% fast identisch,
so dass nach zwei Monaten zwischen 65% und 80% des ursprünglichen
BMOV noch in der Matrix vorhanden waren. (Zur Übersichtlichkeit werden nur
die Daten für
die Beladungen mit 25% und 30% BMOV in 58B gezeigt).
Der Prozentsatz des in der Matrix verbleibenden Arzneimittels nahm
bei einer Beladung mit 35% BMOV schneller ab, so dass nach einem
Monat wenig mehr als 50% des ursprünglichen BMOV in der Matrix
vorhanden war. Um die Daten der kumulativen Arzneimittelfreisetzung
zu verifizieren, wurden Proben der PCL-BMOV-Matrix am Ende eines jeden Experiments
zur Arzneimittelfreisetzung auf den Gehalt an verbliebenem Arzneimittel
hin untersucht. Der Prozentsatz des Arzneimittels, der nach 70 Tagen
verblieben war, war dieser Restuntersuchung zufolge wie folgt: 67%
+/– 10%
(5% BMOV), 56% +/– 10%
(10% BMOV), 80% +/– 20%
(15% BMOV), 84% +/– 20%
(20% BMOV), 85% +/– 12%
(25% BMOV), 77% +/– 14%
(30% BMOV) und 57% +/– 15%
(35% BMOV).
-
Die 59A und 59B zeigen
die Wirkung des Zugebens von 20% MEPEG zur PCL-Matrix auf die Profile der Arzneimittelfreisetzung
für verschiedene
Konzentrationen der Beladung mit BMOV. Die Zugabe von MEPEG zur
Matrix erhöht
die Freisetzungsrate von BMOV im Vergleich mit der Freisetzung von
BMOV aus dem PCL allein drastisch (58).
Mehr als 50% des BMOV wurden aus der Polymermatrix innerhalb von 7
Tagen 1 Woche bei allen Konzentrationen der Beladung mit BMOV freigesetzt.
Die Restuntersuchung der PCL-BMOV-MEPEG-Pellets ergab die folgenden
Werte für
den Prozentsatz von nach 7 Tagen in den Pellets verbliebenem BMOV:
24% (+/–9%),
5% BMOV; 25% (+/–8%),
10% BMOV; 22% (+/–4%),
15% BMOV; 27% (+/–7%),
20% BMOV.
-
60A zeigt die Morphologie der BMOV-Kristalle unter
hoher Vergrößerung.
Die 60B und 60C zeigen
die Morphologie der Polymer-Arzneimittel-Matrices sowohl vor als
auch nach der zwei Monate dauernden Untersuchung zur Arzneimittelfreisetzung
in wässrigem
Puffer. Vor der Untersuchung der Freisetzung waren die PCL-BMOV-Matrices bei Beladungen
mit 15%, 20% und 30% BMOV typischenroeise auf ihren äußeren Oberflächen glatt
und eine typische SEM ist in 60B abgebildet.
Nach der Inkubation für
zwei Monate in wässrigem
Puffer waren die äußeren Oberflächen rau
und zerklüftet.
-
E. Diskussion
-
Es
wurde festgestellt, dass diese Verbindung sehr langsam mit Freisetzungscharakteristika,
die für
die Aufrechterhaltung nachhaltiger Vanadium-Konzentrationen nahezu
ideal sind, aus der PCL-Matrix freigesetzt wird. Diese Charakteristika
beinhalteten nur einen kleinen Ausbruchseffekt der Arzneimittelfreisetzung
in den ersten paar Tagen gefolgt von annähernd linearen Freisetzungskinetiken
bei den meisten Arzneimittelbeladungen (58).
BMOV ist weniger wasserlöslich
als Vanadylsulfat oder Natriumorthovanadat und die Hydrophobizität des Moleküls erhöht wahrscheinlich
der Affinität
der BMOV Moleküle
zur hydrophoben PCL-Matrix und erniedrigt die Freisetzungsrate des
Arzneimittels in ein wässriges
Inkubationsmedium.
-
Es
wurde gezeigt, dass die Zugabe von 20% MEPEG zu PCL die thermischen
Flusseigenschaften der Paste verbessert, indem die Viskosität der Matrix
und die Temperatur, bei der das Polymer fest wird, erniedrigt werden.
Diese Eigenschaften sind bei der Anwendung der Paste auf eine peritubuläre Tumorlokalisation
wichtig, weil unter diesen Bedingungen eine bessere Abdeckung der
Stelle erzielt wird. Es wurde gezeigt, dass im Vergleich zu den
Freisetzungsraten von BMOV-PCL (kein MEPEG) (58)
die Zugabe von MEPEG zur BMOV-PCL-Matrix der Paste die Freisetzungsraten
von BMOV in vitro (59) bei allen Konzentrationen
(5% bis 20%) der Beladung mit BMOV steigert. Es wurde gezeigt, dass
die mit 5% BMOV beladene PCL-MEPEG-Paste zwischen 500 und 1000 μg BMOV pro
Tag freisetzt (was der Freisetzungsrate von mit 35% BMOV beladenem
PCL ähnlich
war).
-
Vergleichsbeispiel 26
-
In vitro und in vivo Wirksamkeit
von mit Bis(maltolato)oxovanadium beladener Thermopaste
-
Mit
BMOV beladene polymere PCL-Thermopaste wurde wie oben beschrieben
hergestellt und auf ihre Wirksamkeit gegen Tumorzelllinien sowohl
in vitro als auch in vivo untersucht.
-
A. Menschliche Tumorzelllinien
-
Die
menschlichen Tumorzelllinien HT-29 Colon-, MCF-7 Brust- und SKMES1
nicht kleinzelliger Lungentumor wurden von der American Type Culture
Collection bezogen. Die HAT-29 Colon-Zellline wurde in RPMI 1640
mit 10% hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (HIFBS) kultiviert,
die MCF-7 Brust-Zellline in Iscove's modifiziertem Eagles Medium mit 5%
HIFBS plus 10–9
M Insulin und die SKMES1 Lungen-Zelllinie in Eagle's minimalem essentiellen
Medium mit 10% nicht hitzeinaktiviertem FBS.
-
B. Normale menschliche
Knochenmarkzellen
-
Normales
menschliches Knochenmark (auf Tumorzellen histologisch negativ)
wurde von Patienten erhalten, die wegen ihrer soliden Tumore eine
Knochenmarktransplantation erhalten sollten, aber starben, bevor das
Mark verwendet wurde. Nach Zentrifugation wurde der buffy coat entfernt
und die Zellen wurden mit Lysepuffer behandelt und zweimal mit RPMI
1640 mit 20% HIFBS gewaschen und dann darin resuspendiert. Die Zellen
wurden durch eine 25 g-Nadel gezogen und gezählt.
-
C. Radiometrisches (Bactec)
System
-
Das
Bactec System (Johnston Laboratories, Towson, MD) basiert auf einem
klinischen Instrument, das entwickelt wurde, um Bakterien in Blutkulturen
zu ermitteln und verwendet wurde, um nach neuen antineoplastischen
Wirkstoffen zu suchen. Das radiometrische System ist ein schnelles,
semiautomatisiertes System, das die Hemmung der Umwandlung von 14C-Glucose zu 14CO2 als Index der Cytotoxizität einsetzt.
Die Bactec-Maschine
entleert das 14CO2 automatisch
in eine Ionenkammer, wo das Signal des radioaktiv markierten CO2 in ein proportionales elektrisches Signal
oder einen Wachstumsindexwert auf einer Skala von 1 bis 1000 umgewandelt
wird. Zur kontinuierlichen Einwirkung wurden die Tumorzellen oder
normalen Knochenmarkzellen zu 2 ml von geeignetem Wachstumsmedium,
das 2 μC
von 14C-Glucose plus BMOV mit endgültigen Konzentrationen
von 0,01, 0,1, 1, 10, 25 und 50 μM
enthielt, gegeben und in 20 ml Serumgefäße mit Gummistopfen injiziert,
welche eine Mischung aus 5% CO2 und Luft
enthielten, und bei 37°C
für 24
Tage inkubiert. Zu einer Einwirkung von einer weiteren Stunde wurden
die Zellen und BMOV in gleichen Endkonzentrationen in 15 ml konischen
Gefäßen aus
Polypropylen in einem 37°C
Wasserbad für
eine Stunde inkubiert. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und
in Medium gewaschen, dann in 2 ml des geeigneten Wachstumsmediums,
das 2 μC
von 14C-Glucose enthielt, resuspendiert
und in 20 ml Serumgefäße mit Gummistopfen
injiziert, welche eine Mischung aus 5% CO2 und
Luft enthielten, und bei 37°C
für 24
Tage inkubiert. An den Tagen 6, 9 und 12 bei den Tumorzelllinien
und an den Tagen 6, 15 und 24 bei den Knochenmarkzellen wurden die
Gefäße entfernt
und zur Ermittlung der Menge von 14CO2, die von den Zellen durch die Metabolisierung
der 14C-Glucose produziert worden war, in
das Bactec-Instrument eingelegt. Die Wachstumsindexwerte der mit
BMOV behandelten Zellen wurden mit den Wachstumsindexwerten von
unbehandelten Zellen verglichen und es wurde der Prozentsatz des Überlebens
im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen berechnet.
-
D. Tumorresektionsstudien
-
Für diese
Untersuchungen wurden sieben Wochen alte, männliche C3H/HeJ Mäuse verwendet.
RIF-1 (Strahlungsinduziertes Fibrosarkom der Maus) Zellen wurden
in alpha-MEM-Medien
mit 10% FBS (Gibco Canada) kultiviert. Die Zellen wurden in 1% Hanks
gepufferter Salzlösung
(HESS pH 7,4) (Gibco Canada) bei einer Konzentration von 1 × 107 Zellen/ml suspendiert. Einhundert Mikroliter
dieser Zellen(1 × 106 Zellen) wurden in die rechte Flanke einer
jeden Maus injiziert. Man ließ die
Tumore für
5 Tage wachsen (zu dieser Zeit maßen die Tumore zwischen 6 und
8 mm im Durchmesser). Am Tag 5 wurden die Mäuse mit einer Kombination Ketamin:Rompom
(70 mg/kg:10 mg/kg) anästhesiert
(0,02 ml/g). 5 mm vom Tumorrand entfernt wurde eine Inzision gesetzt
und etwa 90% von jedem Tumor wurden entfernt und 150 mg von geschmolzenem
(50°C) PCL-BMOV oder PCL allein
(Kontrolle) wurden aus einer 500 μl-Spritze
auf die gesamte Oberfläche
der resezierten Tumorstelle herausgedrückt. Das PCL wurde innerhalb
von 30 Sekunden fest und der Bereich wurde mit 5–0 Prolenenähten verschlossen. Die Mäuse wurden
an den Tagen 4, 5, 6 und 7 untersucht. An jedem Tag wurden die Tumore
gemessen (langer und kurzer Durchmesser) und es wurden Bilder aufgenommen.
Sobald die Tumore einen Maximaldurchmesser von 9 mm erreichten,
wurden die Mäuse
getötet
und der Bereich mit dem Tumor wurde für weitere histologische Untersuchungen
excidiert.
-
Die
Ergebnisse werden in 63 dargestellt.
-
E. Tumorhemmungsstudien
-
Die
MDAY-D2 hämatopoetische
Zellline (erhalten von Dr. J Dennis, Mount Sinai Hospital, Toronto)
wurde ausplattiert oder in Suspension in DMEM mit 5% FBS (Gibco
Canada) angezogen. Jeder Maus wurden auf der posterolateralen Seite
4 × 105 Zellen in 100 μl PBS subcutan injiziert. Nach
5 Tagen Tumorwachstum wurden 150 mg der geschmolzenen PCL- oder
PCL-BMOV-Paste in einen der Tumorlokalisation jeder Maus benachbarten
Bereich implantiert. Nach 15 Tagen wurden die Mäuse getötet, gewogen und die Tumore
wurden präpariert
und gewogen. Die Ergebnisse sind in 62 dargestellt.
-
F. Ergebnisse und Diskussion
-
Gegen
die normalen menschlichen Knochenmarkzellen hatte die einstündige Einwirkung
von BMOV auch wenig Wirkung, auch bei einer Konzentration von 50 μM. Bei einer
kontinuierlichen Einwirkung war die Wirkung des BMOV auf die Markzellen
noch nicht sehr ausgeprägt,
wobei eine Sensitivität
(49% Überleben) nur
bei der Konzentration von 50 μM
beobachtet wurde. Somit schien die BMOV-Verbindung bei den untersuchten
Konzentrationen und Einwirkzeiten nicht sehr myelosuppressiv zu
sein.
-
In
dieser Untersuchung wurde die antineoplastische Wirkung von BMOV
in vitro gegen drei menschliche Krebszelllinien unter Bedingungen,
die einen kontinuierlichen Kontakt zu dem Arzneimittel gewährleisten, gezeigt.
in vivo kann jedoch die Wirksamkeit vom kontinuierlichen Kontakt
der Tumorzellen zum BMOV abhängen.
Das Hauptziel dieser Untersuchung war es, ein biologisch abbuubares,
polymeres Freisetzungssystem zu entwerfen und zu testen (in vivo),
das eine kontinuierliche Zufuhr von Vanadium (BMOV-Form) in niedrigen Konzentrationen
bereitstellen kann.
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In
vivo Untersuchungen zeigten, dass eine Einzelverabreichung von PCL-BMOV-Paste
subcutan das Tumorwachstum von MDAY D2 hemmte. 62 zeigt die Daten für Tumorgewichte von Kontrollmäusen (PCL – kein BMOV)
und von Mäusen,
die mit PCL, das mit 25%, 30% und 35% BMOV beladen war, behandelt
wurden. Es gab eine Hemmung von 54% des Tumorwachstums bei mit 25%
BMOV beladenem PCL (signifikant mit p < 0,05). Die Beladungen mit 30% und
35% BMOV ergaben eine Hemmung des Tu morwachstums von 76% beziehungsweise
80% und eine der sechs Mäuse
in der Gruppe mit 35% BMOV zeigte eine vollständige Eradikation des Tumors.
-
Interessanterweise
zeigten die in vivo Freisetzungsprofile des Arzneimittels, dass
Paste, die aus 25% und 30% BMOV bestand, etwa 500 μg BMOV pro
Tag freisetzte, was eine vorher gezeigte Wirksamkeit hat. Jedoch
setzte mit 35% BMOV beladene PCL-Paste, die bei der Reduktion des
Tumorwachstums am wirksamsten war, etwa das Doppelte dieser Arzneimittelmenge
in vitro frei. Diese Daten veranschaulichen, dass die anhaltende
Freisetzung geringer Mengen von Vanadiumverbindungen im Vergleich
zu einem Regime mit täglicher
Verabreichung von Vanadium ein gleich wirksames oder wirksameres
Therapieregime sein wird.
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Obwohl
PCL-BMOV-Paste bei der Hemmung des Tumorwachstums gleich wirksam
war, zeigten die Mäuse
keine Zeichen von Stress oder Gewichtsverlust. Vermehrter Stress
und Gewichtsverlust, was üblicherweise
bei täglichen
Injektionen hoher Dosen von Vanadat beobachtet wird, stehen höchstwahrscheinlich
in Beziehung zu einer Toxizität,
die von den hohen Vanadat-Spiegeln im Plasma unmittelbar nach der
Verabreichung hervorgerufen wird. Die Verwendung von PCL-BMOV-Paste
zum Bereitstellen einer anhaltenden Freisetzung von Vanadat über lange
Zeiträume
kann große
Fluktuationen der Konzentrationen von Vanadat im Plasma reduzieren
und eine von Vanadat verursachte Toxizität verhindern. Diese Daten stehen
in Einklang mit unserer Hypothese, dass eine langsame, anhaltende
Freisetzung von BMOV bei der Reduktion von Tumorwachstum gleich
wirksam oder wirksamer ist und von Vanadat verursachte Toxizität verhindert.
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Vergleichsbeispiel 27
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Wirkung von BMOV-Mikrosphären auf
das Tumorwachstum in Mäusen
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Das
Ziel dieser Untersuchung war es, die Fähigkeit von mit BMOV beladenen
PLLA-Mikrosphären (20%),
das Tumorwachstum in Mäusen
zu reduzieren, zu untersuchen.
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Zwanzig
von vierundzwanzig Mäusen
wurden subcutan 100 ml MDAY-D2 Zellen mit einer Dichte von 10 × 106/ml injiziert. Am Tag 6 wurden die Mäuse in 6
Gruppen aufgeteilt. Gruppe 1: Leerkontrolle, Gruppe 2: Tumorkontrolle,
der Gruppe 3 wurden 0,25 mg/100 μl
BMOV zweimal am Tag injiziert. Der Gruppe 4 wurden 20 mg PLLA-Mikrosphären, die
5 mg BMOV enthielten, IP injiziert. Der Gruppe 5 wurden 10 mg BMOV-Mikrosphären jeweils
am Tag 6 und am Tag 9 IP injiziert. Der Gruppe 6 wurden 10 mg BMOV-Mikrosphären am Tag 6
und am Tag 9 intramuskulär
injiziert. Am Tag 16 wurden die Mäuse getötet und die Tumore wurden präpariert.
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Die
Ergebnisse dieser Untersuchungen werden in den Tabellen VI und VII
unten gezeigt.
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Tabelle
VI Körpergewichte
von Mäusen
in Kontroll- und Therapiegruppen
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Tabelle
VII Tumorgewichte
in Kontroll- und Therapiegruppen
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Vergleichsbeispiel 28
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Polymeres Arzneimittelabgabesystem
mit gesteuerter Freisetzung: Vergleichsstudie der in vitro Arzneimittel-Freisetzungsprofile
von organischen Vanadium-Komplexen aus Poly(ε-caprolacton) (PCL) Thermopasten und
aus PCL-Methoxypolyethylenglycol
(PCL-MePEG) Thermopasten
-
Diese
Studie wurde durchgeführt,
um die Verkapselung und die in vitro Freisetzungskinetiken der vier organischen
Komplexformen des Vanadiums (BMOV, BEMOV, V5, PRC-V) in Poly(ε-caprolacton)
(PCL) Thermopasten und/oder PCL-Methoxypolyethylenglycol
(PCL-MePEG) Thermopasten zu erforschen.
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A. Methode
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Es
wurden quantitative Analysen (UV/VIS spektrophotometische Analysen)
mit verschiedenen Konzentrationen von Vanadium-Lösungen vorgenommen, um die
Wellenlängen
der Peak-Absorptionen und die Kalibrationsgleichungen zu erhalten.
Die Löslichkeit
des Vanadiums wurde in 10 mM Phosphat-gepufferter Salzlösung mit
Albumin (PBS/ALB) (pH 7,4) untersucht. 1%, 5%, 10% und 20% (% Vanadium-Komplex
in PCL) jeder organischen Komplexform des Vanadiums wurden in bisologisch
abbaubares polymeres PCL und/oder in Mischungen von PCL mit MePEG
(MW 350) verkapselt, um ein polymeres Produkt zur Arzneimittelfreisetzung, "Thermopaste" genannt, herzustellen.
Untersuchungen zur Freisetzung der verschiedenen Formen des Vanadiums
aus Thermopasten wurden in vitro bei 37°C in PBS/ALB vorgenommen, wobei
die Freisetzung von Vanadium mit UV/VIS Absorptionsspektroskopie
gemessen wurde.
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B. Ergebnisse
-
Die
Ergebnisse sind in den 64 bis 68 dargestellt. In Kürze trat die Peak-Absorption von BMOV, BEMOV
und V5 bei 276 nm auf und die von PRC-V war bei 266 nm. Die Rate
und das Ausmaß der
Löslichkeit jeder
Form des Vanadiums folgten der Reihenfolge von V5 > BMOV & BEMOV > PRC-V. In vitro Freisetzungsuntersuchungen
zeigten, dass der Anteil des aus den Thermopasten freigesetzten
Arzneimittels mit (1) steigender Löslichkeit des Arzneimittels,
(2) steigender Konzentration des Arzneimittels und (3) steigender
Menge des in die Thermopasten integrierten MePEG anstieg.
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C. Schlussfolgerung
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Eine
kontrollierte Dosis von Vanadium kann aus PCL-Thermopasten freigesetzt
werden, indem eine unterschiedliche Form des Vanadiums verwendet
wird (als Arzneimittel), indem der Prozentsatz der Beladung des
PCL mit der jeweiligen Form des Vanadiums geändert wird oder indem MePEG
in das PCL eingelagert wird. Während
eine Änderung
des Prozentsatzes der Beladung mit einer bestimmten Form des Vanadiums
die Freisetzungsrate kurzfristig steuern kann, kann die Abgabe einer
kontrollierten Dosis die Implantation eines großen (und möglicherweise toxischen) Depots
des Arzneimittels (in PCL) in das Tier bedingen. Daher können die
Verwendung einer anderen Form des Vanadiums oder die Einlagerung
von MePEG in das PCL eine alternative Methode zur Freisetzung einer
kontrollierten Dosis von Vanadium bieten.
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Vergleichsbeispiel 29
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Verkapselung von Camptothecin
in PCL-Thermopaste und Untersuchung auf antiangiogene Eigenschaften
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A. Einlagerung von Camptothecin
in PCL
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Camptothecin
wurde mit Stößel und
Mörser
gemahlen, um die Partikelgröße auf unter
5 Micron zu reduzieren. Es wurde dann als trockenes Pulver mit Polycaprolacton
(Molekulargewicht 18.000 Birmingham Polymers, AL USA) gemischt.
Die Mischung wurde für
5 Minuten auf 65°C
erhitzt und die geschmolzene Mischung Polymer-Wirkstoff wurde für 5 Minuten
zu einer glatten Paste gerührt.
Die geschmolzene Paste wurde dann in eine 1 ml Spritze gegeben und
herausgedrückt,
um Pellets von 3 mg zu bilden. Diese Pellets wurden dann auf die
CAM aufgebracht, um ihre antiangiogenen Eigenschaften zu bewerten.
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B. Ergebnisse
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Mit
Camptothecin beladene Thermopaste war bei der Hemmung der Angiogenese
im Vergleich zu Kontroll-PCL-Pellets wirksam. Bei einer Beladung
mit 5% Arzneimittel zeigten 4/5 der untersuchten CAM eine starke
Hemmung der Angiogenese. Weiterhin zeigten bei einer Beladung von
jeweils 1% und 0,25% 2/3 beziehungsweise ¾ der CAM eine Hemmung der
Angiogenese. Es ist daher aus diesen Ergebnissen offenkundig, dass
Camptothecin ausreichend aus der PCL-Thermopaste freigesetzt wurde
und dass es eine therapeutische antiangiogene Wirkung hat.
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Vergleichsbeispiel 30
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Herstellung von mit S-Phosphonat
beladender Thermopaste
-
In
dieser Untersuchung zeigten wir, dass S-Phosphonat, ein Etherlipid
mit antineoplastischer Aktivität, erfolgreich
in PCL-Thermopaste integriert wurde und im CAM-Test Wirksamkeit
zeigte.
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A. Herstellung von mit
S-Phosphonat beladender Paste
-
Polycaprolacton
(Birmingham Polymers, Birmingham, AL) und S-Phosphonat wurden in
geeigneten Verhältnissen
bei 55°C
für 2 Minuten
verrieben. Die geschmolzene Mi schung wurde dann zu halbkugelförmigen Pellets
von 3 mg pipettiert und man ließ sie
bei 4°C
aushärten.
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B. CAM-Biotest
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Befruchtete
Hühnerembryonen
(Fitzsimmons Consulting & Research
Services Ltd., B. C.) wurden für 4
Tage inkubiert und dann gefenstert. In Kürze wurde ein kleines Loch
(etwa 2 cm im Durchmesser messend) gebildet, indem die Schale und
die innere Schalenmembran vom stumpfen Ende des Eis (Stelle des
Luftraums) entfernt wurden und dann wurde die offene Stelle mit
sterilisiertem Parafilm-Wachs verschlossen. Das Ei wurde dann bei
37°C für weitere
2 Tage mit dem Fenster aufrecht in einen Inkubator gelegt. Am Tag
6 der Inkubation wurden 3-mg-Pellets von mit S-Phosphonat beladenem
Polymer oder Kontrollpolymer (kein Arzneimittel) auf der Oberfläche der
wachsenden CAM-Gefäße aufgebracht.
Nach 2 Tagen Einwirkzeit (Tag 8 der Inkubation) wurde das Gefäßsystem
unter Verwendung eines Stereomikroskops, das mit einem Contax Kamerasystem
ausgerüstet
war, untersucht. Um den Kontrast der Gefäße zu erhöhen und jegliche Hintergrundinformation auszublenden,
wurde der CAM vor den Aufnahmen 1 ml Intralipid-Lösung (Abbott
Laboratories) injiziert.
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C. Ergebnisse
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PCL-Pellets,
die mit 0%, 1%, 2%, 4% und 8% S-Phosphonat beladen waren, verursachten
eine dosisabhängige
antiangiogene Reaktion in der CAM. Die antiangiogene Reaktion wird
durch die Abwesenheit von Blutgefäßen in der Region direkt unter
dem mit S-Phosphonat
beladenen Pellet charakterisiert. Das normale Wachstum eines dichten
Kapillarnetzes, das bei Kontroll-CAM beobachtet wird, wurde bei
den mit S-Phosphonat behandelten CAM offensichtlich gehemmt. Bei
höheren
Konzentrationen (4% und 8%) wurden die behandelten CAM in der Nachbarschaft
des Arzneimittel-Polymer-Pellets strukturell verändert. Diese Veränderung beinhaltete
eine deutliche Verdickung der unmittelbar an das S-Phosphonat-Polymer-Pellet
angrenzenden CAM und eine Verdünnung
der Membran unter dem Pellet. In allen CAM, die mit S-Phosphonat
behandelt worden waren, war nach einer Einwirkzeit von zwei Tagen
eine gefäßfreie Zone
sichtbar; dies war als ein Bereich frei von einem Kapillarnetz mit
einer Fläche
von etwa 3 mm2 definiert.
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Vergleichsbeispiel 31
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Verkapselung von Tyrosinkinase-Hemmern
in PCL-Thermopaste und Untersuchung unter Verwendung des CAM-Tests
-
Tyrosinkinase-Hemmer
wurden mit Stößel und
Mörser
gemahlen, um die Partikelgröße auf unter
5 Micron zu reduzieren. Sie wurden dann als trockenes Pulver mit
Polycaprolacton (Molekulargewicht 18.000 Birmingham Polymers, AL
USA) gemischt. Die Mischung wird für 5 Minuten auf 65°C erhitzt
und die geschmolzene Mischung Polymer-Wirkstoff wird für 5 Minuten zu einer glatten
Paste gerührt.
Die geschmolzene Paste wird dann in eine 1 ml Spritze gegeben und
herausgedrückt,
um Pellets von 3 mg zu bilden. Diese Pellets wurden dann im CAM-Test
untersucht. Die Tyrosinkinase-Hemmer, die im CAM-Test untersucht
wurden, beinhalten Lavendustin C, Erbstatin, Herbimycin und Genistein.
Beim Vergleich der Wirkungen der antiangiogenen Hemmung dieser Wirkstoffe
war Herbimycin (2% in PCL) der am stärksten wirksame, welcher eine
gefäßfreie Zone
bei 4/4 der untersuchten CAM herbeiführte.
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Vergleichsbeispiel 32
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Verkapselung von Vinca-Alkaloiden
in PCL-Thermopaste und
-
Untersuchung unter Verwendung
des CAM-Tests
-
A. Integration der Hemmstoffe
in PCL-Thermopaste
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Vinca-Alkaloide
(Vinblastin und Vincristin) und wurden mit Stößel und Mörser gemahlen, um die Partikelgröße auf unter
5 Micron zu reduzieren. Sie wurden dann als trockenes Pulver mit
Polycaprolacton (Molekulargewicht 18.000 Birmingham Polymers, AL
USA) gemischt. Die Mischung wird für 5 Minuten auf 65°C erhitzt
und die geschmolzene Mischung Polymer-Wirkstoff wird für 5 Minuten
zu einer glatten Paste gerührt.
Die geschmolzene Paste wird dann in eine 1 ml Spritze gegeben und
herausgedrückt,
um Pellets von 3 mg zu bilden. Diese Pellets wurden dann im CAM-Test
untersucht.
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B. Ergebnisse
-
Als
die Formulierungen auf der CAM untersucht wurden, war es klar, dass
die Wirkstoffe in ausreichenden Mengen aus dem PCL-Pellet freigesetzt
werden, um eine biologische Wirkung hervorzurufen. Sowohl Vinblastin
als auch Vincristin führten
im Vergleich zu Kontrollpellets aus PCL-Thermopaste antiangiogene
Wirkungen im CAM-Test herbei.
-
Bei
Konzentrationen einer Beladung mit 0,5% und 0,1% Arzneimittel rief
Vincristin eine Hemmung der Angiogenese auf allen untersuchten CAM
hervor. Wenn Konzentrationen, die 2% überschritten, getestet wurden,
wurden toxische Arzneimittelspiegel erreicht und es kam zum unerwarteten
Tod der Embryonen.
-
Auch
Vinblastin war bei der Hemmung der Angiogenese auf der CAM bei Konzentrationen
von 0,25%, 0,5% und 1% wirksam. Jedoch war auch Vinblastin bei Konzentrationen,
die 2% überschritten,
für den
Embryo toxisch.
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Beispiel 33
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Bioadhäsive Mikrosphären
-
A. Herstellung von bioadhäsiven Mikrosphären
-
Es
wurden aus 100 k g/mol PLLA Mikrosphären mit einem Bereich des Partikeldurchmessers
von 10–60 μm hergestellt.
Die Mikrosphären
wurden in Natriumhydroxid-Lösung
inkubiert, um auf der Oberfläche des
Polyesters durch Hydrolyse Karbonsäuregruppen zu produzieren.
Die Reaktion wurde hinsichtlich der Natriumhydroxid-Konzentration
und der Inkubationszeit durch Messung der Oberflächenladung charakterisiert. Die
Reaktion war nach 45 Minuten Inkubation in 0,1 M Natriumhydroxid
abgeschlossen. Nach der Basenbehandlung wurden die Mikrosphären mit
Dimethylaminopropylcarbodiimid (DEC), einem quervernetzenden Wirkstoff,
beschichtet, indem die Mikrosphären
in einer alkoholischen Lösung
von DEC suspendiert wurden und man die Mischung zu einen streubaren
Pulver trocknen ließ.
Das Gewichtsverhältnis
von Mikrosphären
zu DEC war 9:1. Nachdem die Mikrosphären getrocknet waren, wurden
sie unter Rühren
in eine 2% (Gew./Vol.) Lösung
von Poly(acrylsäure)
dispergiert und man ließ das
DEC mit PAA reagieren, um ein wasserunlösliches Netz von quervernetzter
PAA auf den Oberflächen
der Mikrosphären
zu erzeugen. Es wurde Rasterelektronenmikroskopie eingesetzt, um
das Vorhandensein von PAA auf den Oberflächen der Mikrosphären zu bestätigen.
-
Dynamische
Differenzkalorimetrie der Mikrosphären vor und nach der Behandlung
mit Base zeigte, dass keine Änderungen
im Großteil
der thermischen Eigenschaften (TG, Schmelzen und Grad der Kristallinität) mit Rasterelektronenmikroskopie
beobachtet wurden
-
B. In vitro Freisetzungsraten
von Paclitaxel
-
Es
wurden mit Paclitaxel beladene Mikrosphären (Beladungen 10% und 30%
Gew./Gew.) mit demselben Größenbereich
des Partikeldurchmessers hergestellt und in vitro Freisetzungsprofile
für eine
Freisetzung von 10 Tagen in Phosphat-gepufterte Salzlösung bestimmt.
Die Freisetzung war proportional zur Beladung mit Arzneimittel,
wobei 400 μg
Paclitaxel aus 5 mg der mit 30% beladenen Mikrosphären in 10
Tagen freigesetzt wurden und 150 μg
aus mit 10% beladenen Mikrosphären
in derselben Periode freigesetzt wurden. Die Effizienz der Verkapselung
betrug etwa 80%. Die mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären wurden
für 45
Minuten in 0,1 M Natriumhydroxid inkubiert und das Zeta-Potenzial
wurde vor und nach der Inkubation in Natriumhydroxid gemessen. Sowohl
vor als auch nach der Behandlung mit Base war die Oberflächenladung
von mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären niedriger als die von Mikrosphären ohne
Paclitaxel.
-
C. Herstellung und in
vitro Beurteilung von entweder mit Poly-lysin oder mit Fibronectin
beschichteter PLLA
-
Es
wurden PLLA-Mikrosphären
hergestellt, die 1% Sudanschwarz (um die Mikrosphären anzufärben) enthielten.
Diese Sphären
wurden in einer 2% (Gew./Volumen) Lösung von entweder Poly-lysin
(Sigma chemicals – Hydrobromell
Form) oder Fibronectin (Sigma) für
10 Minuten suspendiert. Die Mikrosphären wurden einmal in Puffer
gewaschen und auf die inneren Oberflächen von frisch präparierten
Blasen von Ratten aufgebracht. Die Blase wurde für 10 Minuten belassen und dann
dreimal in Puffer gewaschen. Es waren nach dem Vorgang verbleibende
(gebundene) Mikrosphären
an der Blasenwand vorhanden, was daher zeigt, dass sowohl bei mit
Fibronectin als auch bei mit Poly-I-lysin beschichteten Mikrosphären eine
Bioadhäsion
aufgetreten war (69A und 69B).
-
Beispiel 34
-
Synthese von Poly(N-isopropylacrylamid)
-
Polyacrylamid
und seine Derivate können
leicht durch die Polymerisation freier Radikale und strahlungsinduzierte
Polymerisation synthetisiert werden. Das Folgende ist ein Beispiel
des Synthetisierens von Poly(N-isopropylacrylamid), wobei das Monomer
N-Isopropylacrylamid
durch Rekristallisation aus einem organischen Lösungsmittel wie zum Beispiel
Hexan und Toluol gereinigt wird.
-
In
Kürze wird
N-Isopropylacrylamid bei einer Temperatur von zum Beispiel 60°C in Toluol
gelöst.
Diese Lösung
wird auf eine niedrigere Temperatur (z.B. 4°C) heruntergekühlt, um
die Rekristallisation des Monomers zu ermöglichen. Das Monomer wird dann
durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet. Zur Synthese
wird das gereinigte Monomer (20 g) in destilliertem Wasser (180
ml) in einem Kolben mit rundem Boden gelöst. Die Lösung wird für 30 Minuten mit Stickstoff
gereinigt, um gelösten
Sauerstoff zu verdrängen.
Die Temperatur wird dann auf 65°C
erhöht
und eine kleine Menge (0,1 g) eines Starters wie zum Beispiel Ammoniumpersulfat
und 2,2'-Azobisisobutyronitril
wird zugegeben, um die Polymerisation einzuleiten. Die Polymerisation wird
innerhalb von 10 Stunden abgeschlossen und findet unter Stickstoffschutz
und Rühren
statt. Schließlich wird
Poly(N-isopropylacrylamid) durch Zugabe von Ethanol gefällt. Das
Polymer wird getrocknet und aufbewahrt.
-
Beispiel 35
-
Synthese von Poly(acrylsäure)-Derivaten
-
Poly(acrylsäure) und
ihre Derivate können
durch die Polymerisation freier Radikale und strahlungsinduzierte
Polymerisation synthetisiert werden. Das Folgende ist ein Beispiel
des Synthetisierens von Poly(acrylsäure), wobei das Monomer Acrylsäure durch
Destillation (z.B. 40°C)
unter erniedrigtem Druck (z.B. 10 mmHg) gereinigt wird.
-
In
Kürze wird
das gereinigte Monomer (20 g) in Dioxan (180 ml) in einem Kolben
mit rundem Boden gelöst.
Die Lösung
wird für
30 Minuten mit Stickstoff gereinigt, um gelösten Sauerstoff zu verdrängen. Die
Temperatur wird dann auf 65°C
erhöht
und eine kleine Menge (0,1 g) des Starters 2,2'-Azobis-isobutyronitril wird zugegeben,
um die Polymerisation einzuleiten Die Polymerisation wird innerhalb
von 24 Stunden abgeschlossen und findet unter Stickstoffschutz und
Rühren
statt. Schließlich
wird Poly(acrylsäure)
durch Zugabe von n-Hexan gefällt.
Das Polymer wird getrocknet und aufbewahrt.
-
Beispiel 36
-
Perivasculäre Verabreichung
von Paclitaxel
-
WISTAR-Ratten,
die 250–300
g wiegen, werden durch intramuskuläre Injektion von Innovar (0,33 ml/kg)
betäubt.
Nachdem sie einmal sediert sind, werden sie unter eine Halothan-Narkose
gesetzt. Nachdem die Vollnarkose eingeleitet ist, wird das Fell über der
Halsregion abrasiert, die Haut gespannt und mit Betadin betupft. Über der
linken Arteria carotis wird ein vertikaler Schnitt gesetzt und die
Arteria carotis externa wird dargestellt. Um die Arteria carotis
externa werden zwei Ligaturen gelegt und es wird eine quere Arteriotomie angelegt.
Ein Nummer 2 FRENCH FOGART Ballonkatheter wird dann in die Arteria
carotis eingeführt
und in die linke Arteria carotis communis vorgeschoben und der Ballon
wird mit Salzlösung
aufgepumpt. Der Katheter wird dreimal durch die Arteria carotis
hin- und hergeschoben. Der Katheter wird dann entfernt und die Ligatur wird
auf der linken Arteria carotis externa verknotet.
-
Es
wird dann in zehn Ratten Paclitaxel (33%) in Ethylenvinylacetat
(EVA) ringförmig
um die Arteria carotis communis injiziert. In zehn weitere Ratten
wird nur EVA um die Arteria carotis communis injiziert. Fünf Ratten
aus jeder Gruppe werden nach 14 Tagen und die letzten fünf nach
28 Tagen getötet.
Die Ratten werden auf Gewichtsverlust oder andere Anzeichen einer
systemischen Erkrankung hin beobachtet. Nach 14 oder 28 Tagen werden
die Tiere betäubt
und die linke Arteria carotis wird in der Weise des anfänglichen
Experiments freigelegt. Die Arteria carotis wird abgetrennt, in
10% gepufferten Formaldehyd fixiert und histologisch untersucht.
-
Beispiel 37
-
Behandlung von Atherosklerose
-
A. Atherosklerose
-
Atherosklerotische
Läsionen
werden bei weißen
Neuseeland-Kaninchen nur durch die Emährungsweise geschaffen. In
Kürze werden
weiße
Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von etwa 1,6 kg auf gepulvertes
und mit 0,25% Cholesterin nach Gewicht ange reichertes Futter gesetzt.
Das Gesamtcholesterin im Plasma wird wöchentlich gemessen, indem nach
einer Injektion von Innovar (0,1 ml/kg), um die Blutgefäße zu erweitern,
Proben aus einer marginalen Ohrvene entnommen werden. Die Proben
werden mit EDTA gemischt, um eine Konzentration von 15% in der Probe
zu erreichen und bis zur Plasmaseparation durch Zentrifugation bei
niedriger Geschwindigkeit auf Eis gelegt.
-
Eine
Woche nach Beginn der vollen Cholesterin-Ernährung werden die Tiere in 3
Gruppen von 10 randomisiert. Nach Narkoseeinleitung mit Ketamin
35 mg/kg und Xylazin 7 mg/kg und dann Allgemeinnarkose über Intubation
wird über
dem Abdomen das Fell abrasiert und die Haut sterilisiert. Es wird
eine Laparotomie vorgenommen und die Aorta abdominalis isoliert.
Unter Verwendung einer 22 g Nadel werden Ethylenvinylacetat-Paste, Ethylenvinylacetat-Paste,
die 5% Paclitaxel enthält,
oder Ethylenvinylacetat-Paste,
die 33% Paclitaxel enthält,
ringförmig
um die proximale Hälfte
der infrarenalen Aorta abdominalis aufgetragen. Die sich bis zur
Bifurkation der Aorta erstreckende distale Hälfte der Aorta wird nicht behandelt.
Bei 10 Kontroll-Kaninchen wird die infrarenale Aorta abdominalis
isoliert, aber es wird nichts um sie herum injiziert.
-
Das
atherogene Futter wird für
24 Wochen weiter gegeben. Zu diesem Zeitpunkt werden die Tiere mit einer
Injektion von Ketamin (350 mg/kg) und Xylazin (7 mg/kg) intramuskulär narkotisiert
und dann mit einer intravenösen Überdosis
von Euthanol (240 mg/ml, 2 ml/4,5 kg) getötet. Die Tiere werden dann über den
linken Ventrikel bei 100 mm Quecksilber perfusionsfixiert, indem
man sie mit Hank's
balancierter Salzlösung
mit 0,15 mmol/Liter N-2-hydroxyethylpaparazin-N'-2-ethansulfonsäure (pH 7,4), die Heparin (1
IU/ml) enthält,
für zehn Minuten
perfundiert, gefolgt von verdünnter
Fixierlösung
nach Karnovsky für
15 Minuten. Die Aorta thoracica, die Aorta abdominalis und die Arteriae
iliacae werden en bloc entfernt und für weitere 30 Minuten in eine ähnliche
Lösung
gelegt.
-
Es
werden dann fortlaufende Dünnschnitte
durch die Aorta thoracica und besonders durch die infrarenale Aorta
abdominalis durchgeführt.
Movat-, H&E-
und Masson-Färbungen
werden durchgeführt
und histologische Untersuchungen vorgenommen, um den Grad der Beeinträchtigung
des Lumens, den Entwicklungsgrad der atheroskleroti schen Läsion und
jegliche periluminare Reaktion auf die zirkumferenzielle arterielle
Medikation zu untersuchen.
-
Beispiel 38
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Behandlung von Restenose
-
WISTAR-Ratten,
die 250–300
g wiegen, werden durch intramuskuläre Injektion von Innovar (0,33 ml/kg)
betäubt.
Nachdem sie einmal sediert sind, werden sie unter eine Halothan-Narkose
gesetzt. Nachdem die Vollnarkose eingeleitet ist, wird das Fell über der
Halsregion abrasiert und die Haut mit Betadin gereinigt. Über der
linken Arteria carotis wird ein vertikaler Schnitt gesetzt und die
Arteria carotis externa wird dargestellt. Um die Arteria carotis
externa werden zwei Ligaturen gelegt und es wird eine quere Arteriotomie
zwischen ihnen angelegt. Ein 2 Fr Fogarty Ballonkatheter wird in
die Arteria carotis externa eingeführt und in die linke Arteria
carotis communis vorgeschoben und der Ballon wird mit Salzlösung aufgepumpt.
Der Katheter wird dreimal durch die Arteria carotis hin- und hergeschoben,
um das Endothel zu denudieren. Der Katheter wird entfernt und die
Ligaturen werden auf der linken Arteria carotis externa verknotet.
-
Die
Tiere werden in Gruppen von 5 randomisiert. Die Subgruppen von 5
Ratten sind Kontrolle, Träger-Polymer
allein, Träger-Polymer
plus 1, 5, 10, 20 und 33% von Paclitaxel, das abgegeben wird. Es
sind zwei Träger-Polymere
zu untersuchen: EVA und eine Mischung aus EVA und PLA. Die Polymer-Mischung
wird ringförmig
um die Arteria carotis aufgetragen. Die Wunde wird dann verschlossen.
In jeder Gruppe werden nach 14 und nach 28 Tagen Ratten getötet. In
der Zwischenzeit werden die Ratten werden auf Gewichtsverlust oder andere
systemische Anzeichen hin beobachtet. Nach 14 oder 28 Tagen werden
die Tiere durch initiale Sedierung mit Innovar intramuskulär (0,33
ml/kg) getötet.
Die Arterien werden dann histologisch untersucht.
-
Beispiel 39
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Intimahyperplasie, die
Transplantat-Stenosen verursacht
-
A. Tierversuche
-
Es
wird beim Hausschwein eine Allgemeinnarkose eingeleitet. Die Halsregion
wird rasiert und mit Reinigungslösung
sterilisiert. Auf jeder Seite des Halses werden vertikale Schnitte
gesetzt und die Arteria carotis wird dargestellt. Es wird ein 8
mm PTFE-Transplantat
durch 2 End-zu-Seit-Anastomosen implantiert, bilateral mit der proximalen
Anastomose an der Arteria carotis communis und der distalen Anastomose
an der Arteria carotis interna. Die dazwischen liegende überbrückte Arterie
wird ligiert. Die Tiere werden in Gruppen von 10 Schweinen, die
nur auf der linken Seite in Nähe
einer jeden chirurgisch geschaffenen Anastomose Träger-Polymer
allein erhalten, von 10 Schweinen, die Träger-Polymer plus 5% Paclitaxel
erhalten und von 10 Schweinen, die Träger-Polymer plus 33% Paclitaxel erhalten,
randomisiert. Die rechtsseitigen Transplantate werden in jedem Tier
als Kontrolle dienen. Die Wunden werden verschlossen und man lässt die
Tiere sich erholen.
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Es
wird eine zweite Gruppe von Schweinen untersucht. Die Transplantate
werden in ähnlicher
Weise angelegt. Zum Zeitpunkt der Operation wird kein vasoaktiver
Wirkstoff in der Nähe
der Anastomosenstellen aufgebracht. Man lässt die Tiere sich erholen.
Zwei Wochen, nachdem die Transplantation durchgeführt wurde, wird
eine zweite Allgemeinnarkose eingeleitet und die linke Arteria carotis
wird erneut exploriert. Nahe an den proximalen und distalen Anastomosen
erhalten 10 Tiere jeweils Träger
allein, Träger-Polymer plus 5% Paclitaxel
und Träger-Polymer
plus 33% Paclitaxel ringförmig
in der Nähe
sowohl der proximalen als auch der distalen Anastomosen. Die Wunden
werden verschlossen und man lässt
die Tiere sich erholen. Gegenüber
dient das rechtsseitige Transplantat als Kontrolle.
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Nach
3 Monaten erhalten alle Tiere eine Allgemeinnarkose. Es wird ein
Schnitt auf der Femoralarterie angelegt und ein Pigtail-Katheter
wird unter fluoroskopischer Führung
in die Aorta ascendens eingelegt. Es wird eine Injektion in den
Bogen mit Darstellung des Gefäßsystems
der Carotiden vorgenommen. Besonders wird der Grad der Stenosen
der proximalen und distalen Transplantate und der Arterie unmittelbar
distal der distalen Anastomose gemessen und der Prozentsatz der
Stenose wird berechnet. Falls nötig,
werden selektive Injektionen in die Arteriae carotis communes vorgenommen.
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In
jeder Gruppe werden fünf
Schweine getötet.
Die Tiere werden dann über
den linken Ventrikel bei 100 mm Quecksilber perfusionsfixiert, indem
man sie mit Hank's
balancier ter Salzlösung
mit 0,15 mmol/Liter N-2-hydroxyethylpaparazin-N'-2-ethansulfonsäure (pH 7,4), die Heparin (1
IU/ml) enthält,
für zehn
Minuten perfundiert, gefolgt von verdünnter Fixierlösung nach
Karnovsky für
15 Minuten. Die Aorta thoracica, die Aorta abdominalis und die Arteriae
carotis werden en bloc entfernt und für weitere 30 Minuten in eine ähnliche
Lösung
gelegt.
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Es
werden histologische Schnitte durch die Arteria carotis unmittelbar
proximal der proximalen Anastomose, an der proximalen Anastomose,
an der distalen Anastomose und durch die Arteria carotis unmittelbar distal
der distalen Anastomose angefertigt. Die Schnitte werden mit Movat-
und H&E- und
Masson-Farbstoffen gefärbt.
Es werden histologische Untersuchungen der Reaktionen der Intima
und der Adventitia wie auch der perivaskulären Reaktion vermerkt. Es wird
eine morphometrische Analyse mit dem Grad der Lumeneinengung berechnet.
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Die
verbleibenden Schweine werden nach 6 Monaten untersucht und eine ähnliche
Tötungsprozedur zur
Angiographie wird durchgeführt.