DE69734063T2

DE69734063T2 - Herstellung und verwendung von normalisierten dna-bibliotheken

Info

Publication number: DE69734063T2
Application number: DE69734063T
Authority: DE
Inventors: M. Jay SHORT; J. Eric MATHUR
Original assignee: Diversa Corp
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 1996-06-18
Filing date: 1997-06-18
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2017-06-19
Also published as: EP0923598B1; CA2258175A1; US6001574A; US5763239A; DK0923598T3; EP0923598A1; US6444426B1; EP1528067A3; DE69734063D1; AU3406697A; ES2248851T3; EP0923598A4; JP4227196B2; ATE302788T1; US20030104440A1; WO1997048717A1; JP2000513933A; AU718573B2; EP1528067A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung und Durchmusterung von Gen-Banken und insbesondere die Bildung und Durchmusterung von normierten genomischen DNA-Banken von gemischten Organismenpopulationen von Mikroben und/oder anderen Organismen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es hat einen zunehmenden Bedarf in der mit Forschungsreagenzien, diagnostischen Reagenzien und chemischen Verfahrensbefassten Industrie, für auf Proteinen basierende Katalysatoren gegeben, die neue Fähigkeiten besitzen. Zurzeit wird dieser Bedarf weitgehend unter Verwendung von Enzymen angegangen, die von einer Vielzahl an gezüchteten Bakterien oder Pilzen gereinigt werden. Da jedoch weniger als 1% der natürlich vorkommenden Mikroben in reiner Kultur gezüchtet werden können (Amann, 1995), müssen alternative Methoden entwickelt werden, um die volle Breite mikrobieller Mannigfaltigkeit auf potentiell wertvolle neue Produkte hin auszunützen.

Fast alle im Handel erhältlichen Enzyme, die jetzt verwendet werden, sind aus gezüchteten Organismen gekommen. Die meisten dieser Organismen sind Bakterien oder Pilze. Amann et al. (Amann, 1995) haben die gezüchteten Organismen aus der Umwelt wie folgt bestimmt.

Lebensraum	Züchtbarkeit (%)
Meerwasser	0,001–0,1
Süßwasser	0,25
Mesotropischer See	0,01–1,0
Unverschmutztes Brackwasser	0,1–3,0
Belebter Schlamm	1,0–15,0
Sedimente	0,25
Erde	0,3

Diese Daten wurden von veröffentlichter Information hinsichtlich der Zahl an gezüchteten Mikroorganismen bestimmt, die von den verschiedenen bezeichneten Habitaten stammten.
Andere Untersuchungen haben auch gezeigt, dass gezüchtete Organismen nur einen kleinen Anteil der Biomasse ausmachen, die in der Umwelt vorhanden ist. Zum Beispiel hat eine Arbeitsgruppe vor kurzem von der Sammlung von Wasser- und Sedimentproben vom „Obsidian Pool" im Yellowstone Nationalpark (Barns, 1994) berichtet, wo sie Zellen gefunden haben, die in 55% der 75 Anreicherungskulturen an Archaea-spezifische Sonden hybridisierten. Amplifizierung und Clonierung der die 16S rRNA codierenden Sequenzen offenbarte hauptsächlich einmalige Sequenzen mit geringer oder keiner Vertretung der Organismen, die vorher von diesem Pool gezüchtet worden waren, was auf das Vorhandensein einer beträchtlichen Vielfalt von Archaea mit bis jetzt unbekannten morphologischen, physiologischen und biochemischen Merkmalen hindeutet. Eine andere Gruppe führte ähnliche Untersuchungen an der Matte von Cyanobakterien von Octopus Spring im Yellowstone Park durch und kam zum gleichen Schluss, nämlich, dass eine enorme nicht-gezüchtete Vielfalt besteht (Ward, 1990). Giovannoni et al. (1990) und Torsvik et al. (1990a) haben unter Verwendung von Bakterienplankton, das in der Sargasso See bzw. in Bodenproben gewonnen wurde, von ähnliche Ergebnisse berichtet. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die ausschließliche Verwendung von gezüchteten Organismen beim Durchmustern auf nützliche enzymatische oder andere Bioaktivitäten die Probennahme der vorhandenen möglichen Vielfalt einschränkt.

Stein (1996), J. Bacteriology 178, 591–599 beschreibt die Herstellung einer Genbank von einer Planktonprobe und die Isolierung und Analyse von einem 40 kb-Genomfragment von einem Meeresplankton-Archaeon von dieser Genbank.
Soares (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 9228–9232 und Patanjali (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 1943–1947 beschreiben die Herstellung einer normierten cDNA-Bank vom Gehirn von Kleinkindern bzw. dem Thymus von Erwachsenen.

Das Durchmustern von Genbanken von gezüchteten Proben hat sich schon als wertvoll erwiesen. Es wurde jedoch kürzlich klargestellt, dass die ausschließliche Verwendung von gezüchteten Organismen für die Herstellung von Genbanken den Zugang zur Vielfalt der Natur einschränkt. Die in der Umwelt vorhandenen nicht gezüchteten Organismen und/oder Enzyme oder andere davon abgeleitete Bioaktivitäten können in industriellen Verfahren nützlich sein. Die Züchtung jedes in einer bestimmten Probe aus der Umwelt vorhandenen Organismus würde ein beträchtliche Zeit und Aufwand benötigen. Es ist geschätzt worden, dass in einer ergiebigen Bodenprobe mehr als 10.000 verschiedene Arten vorhanden sein können. Es ist offensichtlich, dass der Versuch jede dieser Arten einzeln zu züchten, ein mühsamer Prozess ist. Neue Verfahren zur effizienten Überprüfung der in der Umwelt vorhanden Vielfalt sind daher sehr wünschenswert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung geht auf dieses Bedürfnis ein, indem sie Verfahren zur Isolierung von DNA von einer Vielfalt an Quellen bereitstellt, einschließlich isolierten Organismen, Konsortien von Mikroorganismen, primäre Anreicherungen und Proben aus der Umwelt, zur Herstellung von Genbanken, die im Vertretensein ihrer genomischen Populationen in den Originalproben „normiert" worden sind, sowie zur Durchmusterung dieser Genbanken auf Enzyme und andere Bioaktivitäten.
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen rekombinanten Ansatz zur Herstellung und Durchmusterung von DNA-Banken dar, die von gemischten Mikrobenpopulationen aus nicht gezüchteten (oder „Umwelt"-) Proben konstruiert wurden. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Genbanken mit gleicher Vertretung an Genomen von Mikroben hergestellt und durchmustert, die sich in der Häufigkeit in natürlichen Populationen gewaltig unterscheiden können. Dieser „Normierungs"-Ansatz verringert die Redundanz von Clonen von häufigen Arten und erhöht das Vertretensein der Clone von seltenen Arten. Diese normierten Genbanken ermöglichen eine höhere Durchmusterungseffizienz und resultieren in der Isolierung von Genen, die neue biologische Katalysatoren codieren.
Die Durchmusterung von gemischten Organismenpopulationen wurde aufgrund der Verfügbarkeit der hierin beschriebenen Methoden als ein rationaler Ansatz durchgeführt, wohingegen frühere Versuche der Durchmusterung von gemischten Populationen aufgrund von benötigten mühsamen Arbeitsvorgängen vermieden wurden.
Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Herstellung einer normierten genomischen DNA-Bank von einer Probe aus der Umwelt bereit, umfassend eine gemischte Organismenpopulation, welches die Schritte umfasst:

(a) Isolieren einer genomischen DNA-Population aus der gemischten Organismenpopulation in der Probe aus der Umwelt;
(b) Fraktionieren der isolierten genomischen DNA-Population vor der Normierung, wobei die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass DNA von weniger vorkommenden Arten aus dem Pool der als Probe verwendeten Organismen cloniert wird, wobei das Fraktionieren eine Dichtezentrifugationstechnik umfasst, wobei gleiche Mengen an A₂₆₀-Einheiten von jedem Peak entfernt werden und die Nucleinsäure amplifiziert wird;
(c) Herstellen einer normierten genomischen DNA-Bank aus der Probe aus der Umwelt.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts umfasst das Verfahren den Schritt der Gewinnung einer Fraktion der isolierten genomischen DNA, die ein gewünschtes Merkmal aufweist.
Die Amplifizierung der Nucleinsäure in Schritt (b) des Verfahrens umfasst den Schritt der Amplifizierung der Kopienzahl der auf diese Weise isolierten DNA-Population.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts geht der Schritt der Amplifizierung der genomischen DNA dem Normierungsschritt voran.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts umfasst das Verfahren die beiden Schritte von (i) Amplifizierung der Kopienzahl der auf diese Weise isolierten DNA-Population (ii) Gewinnung einer Fraktion der isolierten genomischen DNA, welche das gewünschte Merkmal aufweist.
Ein anderer Aspekt der Beschreibung stellt eine normierte genomische DNA-Bank bereit, die von einer Probe aus der Umwelt und durch ein Verfahren gebildet wurde, umfassend die Schritte (a) Isolieren einer genomischen DNA-Population von der Probe aus der Umwelt; (b) Analysieren der Komplexität der auf diese Weise isolierten genomischen DNA-Population; (c) mindestens eines von (i) Amplifizieren der Kopienzahl der auf diese Weise isolierten DNA-Population und (ii) Gewinnung einer Fraktion der isolierten genomischen DNA, die ein gewünschtes Merkmal aufweist; und (d) Normierung des Vertretenseins der verschiedenen DNAs innerhalb der genomischen DNA-Population, um auf diese Weise eine normierte Genbank der genomischen DNA aus der Probe aus der Umwelt zu bilden. Die verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen, die in Bezug auf den vorstehend beschriebenen Verfahrensaspekt der Erfindung beschrieben wurden, sind in Bezug auf diesen Aspekt der Beschreibung ebenfalls anwendbar.
Die Beschreibung stellt auch ein Verfahren zur Bildung einer normierten genomischen DNA-Bank von einer Probe aus der Umwelt bereit, durch (a) Isolieren einer genomischen DNA-Population von der Probe aus der Umwelt; (b) Analysieren der Komplexität der auf diese Weise isolierten genomischen DNA-Population; (c) mindestens eines von (i) Amplifizieren der Kopienzahl der auf diese Weise isolierten DNA-Population (ii) Gewinnen einer Fraktion der isolierten genomischen DNA, welche ein gewünschtes Merkmal aufweist; und (d) Normieren des Vertretenseins der verschiedenen DNAs innerhalb der genomischen DNA-Population, um auf diese Weise eine normierte Genbank der genomischen DNA von der Probe aus der Umwelt zu bilden.
Eine normierte genomische DNA-Bank, die von einer Probe aus der Umwelt gebildet wird, kann durch ein Verfahren hergestellt werden, umfassend die Schritte von (a) Isolieren einer genomischen DNA-Population von der Probe aus der Umwelt; (b) Analysieren der Komplexität der auf diese Weise isolierten genomischen DNA-Population; (c) mindestens eines von (i) Amplifizieren der Kopienzahl der auf diese Weise isolierten DNA-Population (ii) Gewinnen einer Fraktion der isolierten genomischen DNA, welche ein gewünschtes Merkmal aufweist; und (d) Normieren des Vertretenseins der verschiedenen DNAs innerhalb der genomischen DNA-Population, um auf diese Weise eine normierte Genbank der genomischen DNA von der Probe aus der Umwelt zu bilden. Die verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen, die in Bezug auf den vorstehend beschriebenen Verfahrensaspekt der Erfindung beschrieben wurden, sind in Bezug auf die normierte genomische DNA-Bank ebenfalls anwendbar, vorzugsweise kann eine normierte genomische DNA-Bank durch das Verfahren erhalten werden, wie es in den anderen Ansprüchen charakterisiert wurde.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung des Prozentsatzes des Gesamtgehalts an DNA, dargestellt durch G + C in den verschiedenen genomischen DNA-Isolaten, die wie in Beispiel 2 beschrieben, getestet wurden.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
DNA-ISOLIERUNG:
Ein wichtiger Schritt in der Herstellung einer normierten DNA-Bank von einer Probe aus der Umwelt ist die Herstellung von Nucleinsäure aus der Probe. DNA kann unter Verwendung verschiedener im Fachgebiet gut bekannter Methoden von Proben isoliert werden (Nucleic Acids in the Environment Methods & Applications, J. T. Trevors, D. D. van Elsas, Springer Laboratory, 1995). Vorzugsweise wird die erhaltene DNA von großem Ausmaß und frei von Enzyminhibitoren und anderen Verunreinigungen sein. Die DNA kann direkt aus der Probe aus der Umwelt (direkte Lyse) isoliert werden, oder die Zellen können von der Probe vor der DNA-Gewinnung geerntet werden (Zellabtrennung). Verfahren mit direkter Lyse haben mehrere Vorteile gegenüber Vorgehensweisen, die auf Zellabtrennung basieren. Die Technik der direkten Lyse stellt mehr DNA mit einem generellen höhern Vertretensein der mikrobiellen Gemeinschaft bereit, welche jedoch manchmal von geringerer Größe ist und eher Enzyminhibitoren enthält, als DNA, die unter Verwendung der Zellabtrennungstechnik gewonnen wurde. In letzter Zeit wurden sehr nützliche Techniken für die direkte Lyse beschrieben, die DNA von hohem Molekulargewicht und großer Reinheit bereitstellen (Barns, 1994; Holben, 1994). Wenn Inhibitoren vorhanden sind, gibt es mehrere Vorgehensweisen, welche Zellisolation nutzen, die angewandt werden können (Holben, 1994). Außerdem kann eine Fraktionierungstechnik, wie zum Beispiel die nachstehend beschriebene Bisbenzimid-Isolierung (Cäsium-chloridisolierung) verwendet werden, um die Reinheit der DNA zu erhöhen.
ANALYSE DER KOMPLEXITÄT:
Es kann wichtig sein, die Analyse der Komplexität der von den Proben aus der Umwelt gewonnenen Nucleinsäure während der Isolierungs- und Normierungsverfahren zu überwachen. 16S rRNA-Analyse ist eine Technik, die verwendet werden kann, um die Komplexität der von den Proben aus der Umwelt gewonnenen DNA zu analysieren (Reysenbach, 1992; DeLong, 1992; Barns, 1994). Es sind Primer für die spezifische Amplifizierung von 16S rRNA-Genen von jeder der drei beschriebenen Domänen beschrieben worden.
FRAKTIONIERUNG:
Fraktionierung der DNA-Proben vor der Normierung erhöht die Wahrscheinlichkeit, DNA von wenig vorkommenden Arten aus dem Pool der verwendeten Organismen zu clonieren. In der vorliegenden Erfindung wird die DNA vorzugsweise unter Verwendung einer Dichtezentrifugationstechnik fraktioniert. Ein Beispiel einer solchen Technik ist ein Cäsiumchloridgradient. Vorzugsweise wird die Technik in der Anwesenheit eines in die Nucleinsäure interkalierenden Agens durchgeführt, das an Bereiche der DNA binden, und eine Veränderung in der Schwebedichte der Nucleinsäure bewirken wird. Stärker bevorzugt ist das interkalierende Agens ein Farbstoff, wie zum Beispiel Bisbenzimid, der vorzugsweise Bereiche der DNA binden wird (AT im Fall von Bisbenzimid) (Muller, 1975; Manuelidis, 1977). Die Nucleinsäure wird fraktioniert, wenn Nucleinsäure, die mit einem interkalierendem Agens wie zum Beispiel Bisbenzimid komplexiert ist, in einem geeigneten Cäsiumchloridgradienten aufgetrennt wird. Wenn das interkalierende Agens vorzugsweise an Bereiche der DNA, wie zum Beispiel GC- oder AT-Bereiche, bindet, wird die Nucleinsäure basierend auf dem relativen Basengehalt der DNA aufgetrennt. Nucleinsäuren von vielen Organismen können auf diese Weise aufgetrennt werden.
Dichtegradienten werden zurzeit für die Fraktionierung von Nucleinsäuren angewandt. Zum Beispiel ist die Verwendung von Bisbenzimid-Dichtegradienten für die Auftrennung von mikrobiellen Nucleinsäuren für die Verwendung bei Typisierung des Bodens und der biologischen Sanierung beschrieben worden. In diesen Experimenten evaluiert man die relative Häufigkeit von A₂₆₀-Peaks innerhalb bestimmter Benzimid-Gradienten vor und nach dem biologischen Sanierungsverfahren, um zu überprüfen, wie die Bakterienpopulationen beeinflusst wurden. Diese Technik beruht auf der Voraussetzung, dass im Durchschnitt der GC-Gehalt einer Art relativ konstant ist. Diese Technik wird in der vorliegenden Erfindung angewandt, um komplexe Gemische von Genomen zu fraktionieren. Die von einer Probe stammenden Nucleinsäuren werden einer Ultrazentrifugation unterzogen und, wie in den veröffentlichten Verfahren, während der A₂₆₀-Messung fraktioniert.
In der vorliegenden Erfindung werden gleiche A₂₆₀-Einheiten von jedem Peak entfernt, die Nucleinsäure wird unter Verwendung einer Vielzahl von im Fachgebiet bekannten Amplifizierungsprotokollen, einschließlich jenen hierin nachstehend beschriebenen, amplifiziert und es werden Genbanken hergestellt. Alternativ werden gleiche A₂₆₀-Einheiten von jedem Peak entfernt und Genbanken direkt von diesen Nucleinsäuren erzeugt. Auf diese Weise werden Genbanken aus einer Kombination an gleichen Mengen der DNA von jedem Peak erzeugt. Diese Strategie ermöglicht den Zugriff auf Gene von Organismen, die innerhalb der Proben und Anreicherungen aus der Umwelt weniger oft vorkommen, deren Genome sonst nicht vertreten wären oder aufgrund der Tatsache, dass die Organismen in einer so geringen Quantität vorliegen, sogar verloren gehen könnten, wenn eine Genbank von der gesamten nicht-fraktionierten DNA-Probe konstruiert werden würde. Alternativ kann die DNA anschließend an die Fraktionierung unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Techniken normiert werden. DNA-Banken können dann von dieser fraktionierten/normierten DNA hergestellt werden.
Die Zusammensetzung von mehrfachen Fraktionen der fraktionierten Nucleinsäure kann unter Verwendung im Fachgebiet gut bekannter PCR-ähnlicher Amplifizierungsverfahren der Klassifizierung, bestimmt werden.
NORMIERUNG:
Frühere Normierungsprotokolle sind für die Konstruktion normierter cDNA-Banken entworfen worden (WO 95/08647, WO 95/11986). Diese Protokolle wurden ursprünglich für die Clonierung und Isolierung von seltenen cDNAs entwickelt, die von mRNA abgeleitet sind. Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von normierten genomischen DNA-Genbanken von nicht gezüchteten Proben oder Proben aus der Umwelt.
Nucleinsäureproben, die direkt von Umweltproben oder von primären Anreicherungskulturen isoliert werden, enthalten üblicherweise Genome von einer großen Zahl an Mikroorganismen. Diese komplexen Gemeinschaften an Organismen können durch die absolute Zahl an Arten beschrieben werden, die in einer Population vorhanden sind und durch die relative Häufigkeit jedes Organismus innerhalb der Probe. Die gesamte Normierung von jedem Organismus innerhalb einer Probe ist sehr schwer zu erreichen. Auftrennungstechniken wie zum Beispiel optische Pinzetten können verwendet werden, um morphologisch ausgeprägte Mitglieder mit einer Probe zu entnehmen. Die Zellen von jedem Mitglied können dann in gleichen Zahlen kombiniert werden oder es können reine Kulturen von jedem Mitglied innerhalb einer Probe hergestellt werden und gleiche Zellzahlen von jeder reinen Kultur können vereinigt werden, um Normierung zu erzielen. In der Praxis ist das sehr schwer durchzuführen, besonders in einer Methode mit hohem Durchsatz.
Die vorliegende Erfindung schließt die Verwendung von Techniken zur Erreichung der Normierung der Genome ein, die in der Probe aus der Umwelt vorliegen sowie die Herstellung einer DNA-Bank von der normierten Nucleinsäure und Durchmustern der Genbank auf eine Aktivität von Interesse.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird DNA von der Probe isoliert und fraktioniert. Die Nucleinsäurestränge werden dann geschmolzen und es wird ihnen die selektive Wiederaneinanderlagerung unter festgelegten Bedingungen (C_ot getriebene Hybridisierung) ermöglicht. Alternativ wird die DNA vor diesem Schmelzvorgang nicht fraktioniert. Wenn eine Mischung von Nucleinsäurefragmenten geschmolzen wird und unter stringenten Bedingungen eine Wiederaneinanderlagerung ermöglicht wird, finden die häufigen Sequenzen ihre komplementären Stränge schneller als die seltenen Sequenzen. Nach einem fakultativen Isolierungsschritt für einzelsträngige Nucleinsäure, wird die einzelsträngige Nucleinsäure, welche eine Anreicherung seltener Sequenzen darstellt, amplifiziert und verwendet, um die Genbanken zu erzeugen. Dieses Verfahren führt zur Amplifizierung von seltenen oder in geringer Menge vorliegenden Nucleinsäuremolekülen. Diese Moleküle werden dann verwendet, um eine Genbank herzustellen. Während alle DNA gewonnen wird, kann die Identifizierung des Organismus, welcher die DNA ursprünglich enthält, verloren gehen. Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit DNA von „nicht-clonierbaren Quellen" zu gewinnen.
Nucleinsäureproben, die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Technik erlangt wurden, werden amplifiziert, um den Normierungsvorgang abzuschließen.
Zum Beispiel können Proben unter Verwendung von PCR-Amplifizierungsprotokollen amplifiziert werden, wie jenen, die durch Ko et al. (Ko, 1990b; Ko 1990a, Takahashi, 1994) beschrieben wurden, oder stärker bevorzugt lange PCR-Protokolle, wie jene, die zum Beispiel durch Barnes (1994) oder Cheng (1994) beschrieben wurden.
Die Normierung kann direkt durchgeführt werden oder es können auch Maßnahmen ergriffen werden, um die Komplexität der Nucleinsäurepools vor dem Normierungsverfahren zu reduzieren. Eine solche Reduktion der Komplexität kann bei der Gewinnung der Nucleinsäure von den schwach vertretenen Organismen hilfreich sein.
Die Mikroorganismen, von welchen die Genbanken hergestellt werden können, schließen prokaryontische Mikroorganismen wie zum Beispiel Eubakterien und Archaebakterien, und niedrige eukaryontische Mikroorganismen, wie zum Beispiel Pilze, manche Algen und Einzeller ein. Die Mikroorganismen können gezüchtete oder nicht-gezüchtete Mikroorganismen sein, die von Proben aus der Umwelt erhalten werden und solche Mikroorganismen können Extremophile, wie zum Beispiel Thermophile, Psychrophile, Psychrotorphe, usw. sein.
Wie vorstehend angegeben, kann die Genbank von Proben aus der Umwelt hergestellt werden, in welchem Fall DNA ohne Züchtung eines Organismus gewonnen werden kann oder die DNA kann von einem gezüchteten Organismus gewonnen werden.
Von Quellen an Mikroorganismen-DNA als eine Startmaterial-Bank, von welcher die Ziel-DNA erhalten wird, wird besonders erwogen, dass sie Proben aus der Umwelt, wie zum Beispiel mikrobielle Proben vom arktischen oder antarktischen Eis, Wasser oder Permafrostquellen, Materialien von vulkanischem Ursprung, Materialien von Boden- oder Pflanzenquellen in tropischen Gebieten usw., einschließen. Zum Beispiel kann daher genomische DNA entweder von einem züchtbaren oder nicht-züchtbaren Organismus gewonnen werden und zur Herstellung einer geeigneten rekombinanten Genbank, für die anschließende Bestimmung der Enzymaktivität, eingesetzt werden.
Bakterien und viele Eukaryonten weisen einen Koordinationsmechanismus zur Regulation von Genen auf, deren Produkte an verwandten Vorgängen beteiligt sind. Diese Gene sind, auf einem einzelnen Chromosom in Strukturen gruppiert, die als „Gencluster" bezeichnet werden, und werden gemeinsam unter der Kontrolle einer einzelnen regulatorischen Sequenz, einschließlich eines einzelnen Promotors, der die Transkription des gesamten Clusters initiiert, transkribiert. Der Gencluster, der Promotor und zusätzliche Sequenzen, die zusammen in der Regulation wirken, werden als ein „Operon" bezeichnet und können bis zu 20 oder mehr Gene einschließen, üblicherweise von 2 bis 6 Gene. Ein Gencluster ist somit eine Gruppe von nebeneinander liegenden Genen, die üblicherweise was ihre Funktion betrifft, entweder identisch oder verwandt sind.
Manche Genfamilien bestehen aus identischen Mitgliedern. Das Clustering ist eine Voraussetzung dafür, die Gleichheit zwischen den Genen zu erhalten, obwohl gruppierte Gene nicht notwendigerweise identisch sind. Gencluster reichen von Extremen, wo eine Verdoppelung von nebeneinander liegenden verwandten Genen erzeugt wird, bis zu Fällen, in welchen hunderte von identischen Genen in einer Tandemanordnung vorliegen. Manchmal ist keine Bedeutung einer Wiederholung eines bestimmten Gens erkennbar. Ein Hauptbeispiel davon sind die exprimierten duplizierten Insulingene in manchen Arten, wobei ein einzelnes Insulingen in anderen Säugerarten ausreichend ist.
Es ist wichtig, Gencluster weiter zu untersuchen und das Ausmaß, in dem die gesamte Länge des Genclusters für die Expression der daraus resultierenden Proteine nötig ist. Ferner machen die Gencluster eine fortwährende Neuorganisation durch, die Fähigkeit heterologe Genbanken von Genclustern, zum Beispiel von Bakterien oder anderen Einzellerquellen, zu erzeugen ist daher in der Bestimmung von Quellen neuer Proteine wertvoll, besonders einschließlich Enzymen wie zum Beispiel der Polyketid-Synthasen, die für Synthese von Polyketiden verantwortlich sind und eine riesige Gruppe von nützlichen Aktivitäten aufweisen. Andere Arten von Proteinen, die (ein) Produkte) von Genclustern sind, werden auch genannt, einschließlich zum Beispiel Antibiotika, antivirale Arzneimittel, Antitumormittel und regulatorische Proteine wie zum Beispiel Insulin.
Polyketide sind Moleküle, die eine sehr reiche Quelle von Bioaktivitäten darstellen, einschließlich Antibiotika (wie zum Beispiel Tetracycline und Erythromycin), Anti-Krebsmittel (Daunomycin), Immunsuppressiva (FK506 und Rapamycin) und Veterinärprodukte (Monensin). Viele Polyketide (produziert durch Polyketide-Syntheasen) sind als Arzneimittel wertvoll. Polyketid-Syntheasen sind multifunktionelle Enzyme, welche die Biosythese einer enormen Vielzahl an Kohlenstoffketten katalysieren, die sich in Länge, Funktionalitätsmuster und Cyclisierung unterscheiden. Polyketidsynthase-Gene fallen in Gencluster und mindestens ein Typ (bezeichnet als Typ I) der Polyketidsynthease haben Gene und Enzyme von umfangreicher Größe, das erschwert die genetische Manipulation und in vitro-Studien dieser Gene/Proteine.
Die Fähigkeit, gewünschte Komponenten von einer Genbank an Polyketiden und Postpolyketid-Biosynthesegene für die Herstellung neuer Polyketide zur Untersuchung auszuwählen und zu kombinieren, ist reizvoll. Die (das) Verfahren der vorliegenden Erfindung machen die Clonierung von neuen Polyketid-Syntheasen möglich und erleichtern sie, da man Genbanken mit Clonen herstellen kann, die große Inserts haben (besonders wenn man auf f-Faktor basierende Vektoren verwendet), welche die Clonierung von Genclustern erleichtern.
Vorzugsweise wird die Gencluster-DNA in einen Vektor ligiert, insbesondere wobei ein Vektor ferner regulatorische Expressionssequenzen umfasst, welche die Produktion eines nachweisbaren Proteins oder einer Protein-verwandten Arrayaktivität vom ligierten Gencluster kontrollieren und regulieren können. Die Verwendung von Vektoren, die eine außergewöhnlich hohe Kapazität für die Einführung exogener DNA aufweisen, sind besonders für die Verwendung mit solchen Genclustern geeignet und werden hierin mittels Beispielen beschrieben, um den f-Faktor (oder Fertilitätsfaktor) von E. coli einzuschließen. Dieser f-Faktor von E. coli ist ein Plasmid, welches seinen eigenen Hochfrequenztransfer während der Konjugation bestimmt und ideal ist, um große DNA-Fragmente, wie zum Beispiel Gencluster von gemischten mikrobiellen Proben, zu erzielen und stabil zu vermehren.
GENBANK-DURCHMUSTERUNG:
Nachdem normierte Genbanken hergestellt worden sind, können einzigartige enzymatische Aktivitäten unter Verwendung einer Vielzahl an Fest- oder Flüssigphasen-Durchmusterungstests, in einer Vielzahl von Ausführungen entdeckt werden, einschließlich einer hierin beschriebenen Roboterausführung mit hohem Durchsatz. Die Normierung der DNA, die verwendet wird, um die Genbanken zu konstruieren, ist ein Hauptbestandteil in dem Verfahren. Die Normierung wird das Vertretensein von wichtigen Organismen erhöhen, einschließlich jener, die in der Probe in geringeren Mengen vorhanden sind.
Beispiel 1
DNA-Isolierung

1. Die Proben werden direkt im folgenden Puffer resuspendiert: 500 mM Tris-HCl, pH 8,0 100 mM NaCl 1 mM Natriumcitrat 100 μg/ml Polyadenosin 5 mg/ml Lysozym
2. Inkubieren bei 37°C für 1 Stunde, mit gelegentlichem Schütteln.
3. Verdauen mit 2 mg/ml Proteinase K-Enzym (Boehringer Mannheim) bei 37°C für 30 Minuten.
4. Zugeben von 8 ml Lysepuffer [200 mM Tris-HCl, pH 8,0/100 mM NaCl/4% (Gew./Vol.) SDS/10% (Gew./Vol.) 4-Aminosalicylat] und behutsames Mischen durch Umdrehen.
5. Durchführen von drei Einfrierzyklen in einem Trockeneis-Ethanolbad und Auftauen in einem 65°C Wasserbad, um die Nucleinsäuren freizusetzen.
6. Extrahieren des Gemisches mit Phenol und dann Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol.
7. Zugeben von 4 Gramm an säuregewaschenem Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) zu der wässrigen Phase und Inkubation für 30 Minuten bei 37°C, um organische Verunreinigungen zu entfernen.
8. Pelletieren von PVPP und Filtrieren des Überstands durch eine 0,45 μm Membran zur Entfernung des überschüssigen PVPP.
9. Ausfällen der Nucleinsäuren mit Isopropylalkohol.
10. Resuspendieren des Niederschlags in 500 μl TE (Tris-HCl, pH 8,0/1,0 mM EDTA).
11. Zugeben von 0,1 g Ammoniumacetat und Zentrifugieren des Gemischs bei 4°C für 30 Minuten.
12. Ausfällen der Nucleinsäuren mit Isopropylalkohol.

Beispiel 2
Bisbenzimid-Auftrennung von DNA
Proben, die aus genomischer DNA von Clostridium perfringens (27% G + C), Escherichia coli (49% G + C) und Micrococcus lysodictium (72% G + C) zusammengesetzt sind, wurden auf einem Cäsiumchloridgradienten gereinigt. Die Cäsiumchloridlösung (Rf = 1,3980) wurde durch einen 0,2 μm Filter gefiltert und 15 ml wurden in ein 35 ml OptiSeal-Röhrchen (Beckman) gegeben. Die DNA wurde hinzugefügt und gründlich gemischt. Zehn Mikrogramm Bisbenzimid (Sigma; Hoechst 33258) wurden hinzugefügt und gründlich gemischt. Das Röhrchen wurde dann mit der gefilterten Cäsiumchloridlösung gefüllt und in einem VTi50 Rotor in einer Beckman L8-70 Ultrazentrifuge bei 33.000 UpM für 72 Stunden zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde eine Spritzenpumpe und ein Fraktioniergerät (Brandel Modell 186) verwendet, um den Gradienten durch einen ISCO UA-5 UV Absorptionsdetektor zu leiten, der auf 280 nm eingestellt war. Drei Peaks, welche die DNA von 3 verschiedenen Organismen darstellen, wurden erhalten. PCR-Amplifizierung der DNA, die rRNA codiert, wurde mit den folgenden Primern von einer 10-fachen Verdünnung des E.coli-Peaks durchgeführt, um eubakterielle Sequenzen zu amplifizieren:
Vorwärts-Primer: (27F)

5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

Reverser-Primer: (1492R)

5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

Beispiel 3
DNA-Probe die vom Kiemengewebe einer Venusmuschel erhalten wurde, welche einen Endosymbionten beherbergt, der physisch nicht von seinem Wirt getrennt werden kann

1. Reinigen der DNA auf einem Cäsiumchloridgradienten gemäß den veröffentlichten Protokollen (Sambrook, 1989).
2. Erzeugen einer zweiten Cäsiumchloridlösung; (Rf = 1,3980) Filtern durch einen 0,2 μm Filter und Einbringen in ein 35 ml OptiSeal-Röhrchen (Beckman).
3. Zugeben von 10 μg Bisbenzimid (Sigma; Hoechst 33258) und Mischen. 4. Zugeben von 50 μg gereinigter DNA und gründliches Mischen.
5. Zentrifugieren in einem VTi50-Rotor in einer Beckman L8-70-Ultrazentrifuge bei 33.000 UpM für 72 Stunden.
6. Verwenden einer Spritzenpumpe und eines Fraktioniergeräts (Brandel Modell 186), um den Gradienten durch einen ISCO UA-5 UV-Absorptionsdetektor zu leiten, der auf 280 nm eingestellt ist.

Beispiel 4
Komplexitätsanalyse

1. 16S rRNA-Analyse wird verwendet, um die Komplexität der von den Proben aus der Umwelt gewonnenen DNA (Reysenbach, 1992; DeLong, 1992; Barns, 1994) gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren zu analysieren.
2. Eubakterielle Sequenzen werden unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: Vorwärts: 5'-AGAGTTTGATCGTGCCTCAG-3' Revers: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' Archaeale Sequenzen werden mit den folgenden Primern amplifiziert: Vorwärts: 5'-GCGGATCCGCGGCCGCTGCACAYCTGGTYGATYCTGCC-3' Revers: 5'-GACGGGCGGTGTGTRCA-3' (R = Purin, Y = Pyrimidin)
3. Fortfahren mit der Amplifizierungsreaktion wie veröffentlicht. Der in der Amplifikation der Archaealsequenzen verwendete Reaktionspuffer schließt 5% Acetamid (Barns, 1994) ein.
4. Die Produkte der Amplifikationsreaktionen wurden durch Inkubation mit Pfu-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen.
5. In der Anwesenheit der Srfl-Restriktionsendonuclease wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers (Stratagene Cloning Systems) eine Ligierung mit glatten Enden in das pCR-Script-Plasmid durchgeführt.
6. Proben werden unter Verwendung von Standard-Sequenzierungsprotokollen (Literaturnachweis) sequenziert und die Zahl der verschiedenen in der Probe vorhandenen Sequenzen wird bestimmt.

Beispiel 5
Normierung
Gereinigte DNA wird gemäß dem Bisbenzimid-Protokoll von Beispiel (2) durchgeführt und die gewonnene DNA wird geschert oder enzymatisch in 3–6 kb-Fragmente gespalten. „Lone-Linker"-Primer werden ligiert und die DNA wird größenselektiert. Die nach Größe selektierte DNA wird, falls nötig, durch PCR amplifiziert.
Die Normierung wird dann wie folgt durchgeführt:

1. Eine doppelsträngige DNA-Probe wird in Hybridisierungspuffer (0,12 M NaH₂PO₄, pH 6,8/0,82 M NaCl/1 mM EDTA/0,1% SDS) resuspendiert.
2. Die Probe wird mit Mineralöl überschichtet und durch Kochen für 10 Minuten denaturiert.
3. Die Probe wird bei 68°C für 12–36 Stunden inkubiert.
4. Doppelsträngige DNA wird von einzelsträngiger DNA gemäß den Standardprotokollen (Sambrook, 1989) auf Hydroxyapatit bei 60°C getrennt.
5. Die einzelsträngige DNA-Fraktion wird entsalzt und durch PCR amplifiziert.
6. Der Vorgang wird für etliche weitere Runden (bis zu 5 oder mehr) wiederholt.

Beispiel 6
Genbankkonstruktion

1. In TE-Puffer gelöste genomische DNA wird energisch durch eine 25-Gauge „double-hubbed"-Nadel durchgedrückt bis die gescherten Fragmente im gewünschten Größenbereich vorliegen.
2. DNA-Enden werden „geglättet" oder mit Mung-Bean-Nuclease in glatte Enden überführt.
3. EcoRI-Restriktionsstellen in der Ziel-DNA werden mit EcoRI-Methylase geschützt.
4. EcoRI-Linker [GGAATTCC] werden unter Verwendung eines sehr hohen molekularen Verhältnisses von Linker zu Ziel-DNA an die glatte/geschützte DNA ligiert.
5. Linker werden wieder mit EcoRI-Restriktionsendonuclease gespalten und die DNA wird unter Verwendung von Saccharosegradienten größenfraktioniert.
6. Ziel-DNA wird an den λZAPII-Vektor ligiert, unter Verwendung von in vitro Lambda-Verpackungsextrakten verpackt und in der geeigneten E.coli XLI-Blue-Wirtszelle gezüchtet.

Beispiel 7
Genbank-Durchmusterung
Das Folgende ist ein repräsentatives Beispiel für ein Verfahren zur Durchmusterung einer Expressionsbank, die gemäß Beispiel 6 hergestellt wurde.
Die allgemeinen Verfahren zur Überprüfung von verschiedenen chemischen Merkmalen sind üblicherweise auf andere Substrate als jene anwendbar, die in diesem Beispiel speziell erwähnt sind.
Durchmusterung auf Aktivität. Platten der wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellten Genbank werden verwendet, um eine einzelne Platte mehrfach zu inokulieren, die in jeder Vertiefung 200 μl LB- Amp/Meth, Glycerin enthält. Dieser Schritt wird unter Verwendung des „High-Density-Replicating-Tool" (HDRT) von der Beckman Biomek mit 1% Bleiche, Wasser, Isopropanol und Lufttrocknungs-Sterilisationszyklus zwischen jeder Inokulation durchgeführt. Die einzelne Platte wird für 2 Stunden bei 37°C gezüchtet und wird dann verwendet, um zwei weiße Dynatech Mikrotiter-Tochterplatten mit 96 Vertiefungen zu inokulieren, die 250 μl LB-Amp/Meth, Glyzerin pro Vertiefung enthalten. Die ursprüngliche einzelne Platte wurde bei 37°C für 18 Stunden inkubiert, dann bei –80°C gelagert. Die beiden kondensierten Tochterplatten wurden auch für 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Die kondensierten Tochterplatten wurden dann für 45 Minuten auf 70°C erhitzt, um die Zellen zu töten und die E.coli-Wirtsenzyme zu inaktivieren. Eine Stammlösung von 5 mg/ml Morphoharnstoff-phenylalanyl-7-amino-4-trifluormethyl-coumarin (MuPheAFC, das „Substrat") in DMSO wird mit 50 mM Hepes-Puffer pH 7,5, der 0,6 mg/ml des Detergens Dodecylmaltosid enthält, auf 600 μM verdünnt.
MuPheAFC
Fünfzig μl der 600 μM MuPheAFC-Lösung werden zu jeder der Vertiefungen der weißen kondensierten Platten, mit einem 100 μl Mischzyklus unter Verwendung der Biomek hinzugefügt, um eine Endkonzentration an Substrat von –100 μM zu ergeben. Die Fluoreszenzwerte (Anregung = 400 nm, Emission = 505 nm) werden auf einem Fluorometer zum Lesen der Platten sofort nach Zugabe des Substrats (t = 0) aufgezeichnet. Die Platte wird für 100 Minuten bei 70°C inkubiert, dann wird für weitere 15 Minuten Abkühlung auf Raumtemperatur ermöglicht. Die Fluoreszenzwerte werden wieder aufgezeichnet (t = 100). Die Werte bei t = 0 werden von den Werten bei t = 100 subtrahiert, um festzustellen, ob ein aktiver Clon vorhanden ist.
Die Daten werden anzeigen, ob einer der Clone in einer bestimmten Vertiefung das Substrat hydrolysiert. Um den einzelnen Clon zu bestimmen, der die Aktivität trägt, werden die ursprünglichen Genbankplatten aufgetaut und die einzelnen Clone verwendet, um einzeln eine neue Platte zu inokulieren, die LB-Amp/Meth, Glycerin enthält. Wie vorstehend beschrieben, wird die Platte bei 37°C inkubiert, um die Zellen zu züchten, auf 70°C erhitzt, um die Wirtsenzyme zu inaktivieren und 50 μl 600 μM MuPheAFC werden unter Verwendung der Biomek hinzugefügt. Außerdem werden drei andere Substrate getestet. Diese sind Methylumbelliferonheptanoat, das CBZ-Arginin-Rhodamin-Derivat und Fluorescein-konjugiertes Casein (~3,2 Mol Fluorescein pro Mol Casein).
Umbelliferon und Rhodamin werden als 600 μM Stammlösungen in 50 μl Hepes-Puffer hinzugefügt. Das mit Fluorescein konjugierte Casein wird auch in 50 μl bei einer Stammkonzentration von 20 und 200 mg/ml hinzugefügt. Nach Zugabe der Substrate werden die Fluoreszenzwerte bei t = 0 aufgezeichnet, die Platte wird bei 70°C inkubiert und die t = 100-Minutenwerte werden wie vorstehend aufgezeichnet.
Diese Daten zeigen an, in welcher Platte sich der aktive Clon befindet, wo das Arginin-Rhodamin-Derivat auch durch diese Aktivität umgesetzt wurde, das Lipasesubstrat, Methylumbelliferonheptanoat und Protein, Fluorescein-konjugiertes Casein aber nicht als Substrate wirken.
Chirale Aminoester können zumindest unter Verwendung der folgenden Substrate bestimmt werden:
Für jedes Substrat, das umgesetzt wird, wird gemäß der nachstehenden Gleichung der Enantioselektivitätswert E bestimmt:
wobei ee_p = der enantiomere Überschuss (ee) des hydrolysierten Produktes ist und c = die Umsetzung der Reaktion in Prozent. Siehe Wong und Whitesides, Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, 1994, Elsevier, Tarrytown, New York, Seiten 9–12.
Der enantiomere Überschuss wird entweder durch chirale Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder chirale Kapillarelektrophorese (CE) durchgeführt. Tests werden wie folgt durchgeführt: 200 μl des geeigneten Puffers werden zu jeder Vertiefung einer weißen Mikrotiterplatte mit 96-Vertiefungen hinzugefügt, gefolgt von 50 μl teilweise oder vollständig gereinigter Enzymlösung; 50 μl Substrat werden hinzugefügt und die Erhöhung der Fluoreszenz wird gegen die Zeit überwacht, bis 50% des Substrates verbraucht sind oder die Reaktion zum Stillstand kommt, was auch immer zuerst eintritt.
Beispiel 8
Konstruktion einer stabilen genomischen DNA-Bank von Pikoplankton mit einer großen Insertion
Ernten der Zellen und Herstellung der DNA. Agarose-Plugs, die konzentrierte Pikoplanktonzellen enthalten, wurden von Proben hergestellt, die auf einer ozeanographischen Schiffsreise von Newport Oregon nach Honolulu, Hawaii gesammelt wurden. Meerwasser (30 Liter) wurde in Niskin-Flaschen gesammelt, durch 10 μm Nitex gesiebt und mittels Hohlfaserfiltration (Amicon DC10) durch Polyfulfonfilter mit einer Molekulargewichtsobergrenze von 30.000 MW, konzentriert. Die konzentrierten Bakterienplanktonzellen wurden auf einem 0,22 μm, 47 mm Durapore-Filter gesammelt und in 1 ml 2 × STE-Puffer (1 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, pH 8,0) bis auf eine endgültige Dichte von ungefähr 1 × 10¹⁰ Zellen pro ml resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit einem Volumen an 1 % geschmolzener Seaplaque LMP-Agarose (FMC) verdünnt, auf 40°C abgekühlt und dann sofort in einer 1 ml Spritze aufgezogen. Die Spritze wurde mit Parafilm versiegelt und für 10 Minuten auf Eis gestellt. Der die Zellen enthaltende Agarose-Plug wurde in 10 ml Lysepuffer extrudiert (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 0,1 M EDTA, 1% Sarkosyl, 0,2% Natriumdesoxycholat, 1 mg/ml Lysozym) und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Der Agarose-Plug wurde dann in 40 ml ESP-Puffer (1% Sarkosyl, 1 mg/ml Proteinase K, in 0,5 M EDTA) transferiert und bei 55°C für 16 Stunden inkubiert. Die Lösung wurde abgegossen und mit frischem ESP-Puffer ersetzt und bei 55°C für eine weitere Stunde inkubiert. Die Agarose-Plugs wurden dann in 50 mM EDTA platziert und bei 4°C an Bord des Schiffes für die Dauer der ozeanographischen Schiffsreise gelagert.
Eine Scheibe eines Agarose-Plugs (72 μl), der von einer Probe erzeugt wurde, die vor der Küste Oregons gesammelt worden war, wurde über Nacht bei 4°C gegen 1 mL an Puffer A (100 mM NaCl, 10 mM Bis-Trispropan-HCl, 100 μg/ml acetyliertes BSA: pH 7,0 bei 25°C), in einem 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen dialysiert. Die Lösung wurde mit 250 μl eines frischen Puffers A ersetzt, der 10 mM MgCl₂ und 1 mM DTT enthielt, und wurde auf einer Schwingplattform für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde dann auf 250 μl des gleichen Puffers ausgetauscht, der 4 Einheiten Sau3A1 (NEB) enthielt, in einem Wasserbad auf 37°C eingestellt und dann auf einer Schwingplattform in einem 37°C Inkubator für 45 Minuten inkubiert. Der Plug wurde in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen transferiert und bei 68°C für 30 Minuten inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren und die Agarose zu schmelzen. Die Agarose wurde verdaut und die DNA unter Verwendung von Gelase bzw. HK-Phosphatase (Epicentre) gemäß den Empfehlungen des Herstellers dephosphoryliert. Das Protein wurde durch behutsame Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt und die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt, pelletiert und dann mit 70% Ethanol gewaschen. Diese teilweise gespaltene DNA wurde in sterilem H₂O bei einer Konzentration von 2,5 ng/μl für die Ligierung in den pFOS1-Vektor resuspendiert.
PCR-Amplifikationsergebnisse von mehreren Agarose-Plugs (Daten nicht gezeigt) deuten auf die Anwesenheit von erheblichen Mengen an archaealer DNA hin. Quantitative Hybridisierungsexperimente unter Verwendung von rRNA, die von einer Probe extrahiert wurde, die auf 200 Meter Tiefe vor der Küste Oregons gesammelt worden war, deuten darauf hin, dass Archaea aus Plankton in dieser Ernte ungefähr 4,7% der gesamten Pikoplankton-Biomasse umfasste (diese Probe entspricht „PACI"-200 m in der Tabelle 1 von DeLong et al., High Abundance of Archaea in Antarctic Marine Picoplankton, Nature, 371: 695–698, 1994). Ergebnisse von PCR-Amplifikationen von rDNA, die hauptsächlich aus Archaealen stammt, durchgeführt an den Lysaten der Agarose-Plug, bestätigte die Anwesenheit relativ großer Mengen an archaealer DNA in dieser Probe. Agarose-Plugs, die von dieser Pikoplanktonprobe hergestellt wurden, sind für die anschließende Erzeugung von Fosmidbanken ausgewählt worden. Jeder 1 ml Agarose-Plug von diesem Standort enthielt ungefähr 7,5 × 10⁵ Zellen, daher waren etwa 5,4 × 10⁵ Zellen in der 72 μl-Scheibe vorhanden, die in der Erzeugung der teilweise gespaltenen DNA verwendet wurde.
Die Vektorarme wurden wie beschrieben (Kim et al., Stable Propagation of Casmidsized Human DNA Inserts in an F-factor based Vector, Nucl. Acids Res., 20: 10832–10835, 1992) von pFOS1 erzeugt. Kurz gesagt wurde das Plasmid ganz mit AstII gespalten, mit HK-Phosphatase dephosphoryliert und dann mit BamHI gespalten, um zwei Arme zu erzeugen, von denen jeder eine cos-Stelle in der richtigen Orientierung für Clonierung und Verpackung der ligierten DNA zwischen 35–45 kbp enthielt. Die teilweise gespaltenen Pikoplankton-DNA wurde über Nacht in einer 15 μl-Ligationsreaktion, die jeweils 25 ng Vektor und Insert enthielt und 1 Einheit T4 DNA-Ligase (Boehringer Mannheim), an die pFOS1-Arme ligiert. Die ligierte DNA, in 4 Mikroliter dieser Reaktion, wurde in vitro unter Verwendung des Gigapack-XL-Packagingsystems (Stratagene) verpackt, die Fosmidpartikel wurden in den E.coli-Stamm DH10B (BRL) transfiziert und die Zellen auf LB_cm15-Platten ausgestrichen. Die sich daraus ergebenden Fosmid-Clone wurden in Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen eingebracht, welche LB_cm15 ergänzt mit 7% Glycerin enthielten. Rekombinante Fosmide, von welchen jedes etwa 40 kb eines Pikoplankton-DNA-Inserts enthielt, ergaben eine Genbank aus 3552 Fosmidclonen, die ungefähr 1,4 × 10⁸ Basenpaare an clonierter DNA enthielten. Alle untersuchten Clone enthielten Inserts, die zwischen 38 und 42 kbp lagen. Diese Genbank wurde, eingefroren bei –80°C, für spätere Analysen aufbewahrt.
Zitierte Literatur

Amann, R. I., Ludwig, W. und Schleifer, K-H (1995) Microbiological Reviews, 59: 143–169
Barnes, W. M. (1994) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 91: 2216–2220
Barns, S. M., Fundyga, R. E., Jeffries, M. W. und Pace, N. R. (1994) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 91: 1609–1613
Chan, M. K., Mukund, S., Kletzin, A., Adams, M.W.W. und Rees, D. C. (1995) Science, 267: 1463–1469
Cheng, S., Fockler, C., Barnes, W. und Higuchi, R. (1994) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91: 5695–5699
Cline, J., Braman; J. und Kretz, K. (1995) Strategies in Molecular Biology (im Druck) Danson, M. J. (1989) Canadian Journal of Microbiology, 35: 58–64
DeLong, E. F. (1992) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 89: 5685–5689
Enzyme Nomenclature, Academic Press: NY, 1992
Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L. und Field, K. G. (1990) Nature, 345: 60–63
Holben, W. E. (1994) Methods of Soil Analysis, Part 2, Microbiological and Biochemical Properties 727–751
Holben, W. E. und Harris D. (1995) Molecular Ecology
Ko, M.S.H. (1990a) Nucleic Acids Research, 18: 5705–5711
Ko, M.S.H., Ko, S.B.H., Takahashi, N., Nishiguchi, K. und Abe, K. (1990b) Nucleic Acids Research, 18: 4293–4294
Lundberg, K. S., Shoemaker, D. D., Adams, M.W.W., Short, J. M., Sorge, J. A. und Mathur, E. J. (1991) Gene, 108: 1–6
Manuelidis, L. (1977) Analytical Biochemistry, 78: 561–568
Muller, W. und Gautier, F. (1975) European Journal of Biochemistry, 54: 385–394
Nielson, K., Scott, B. und Kretz, K. (1994) Strategies in Molecular Biology, 7: 64–65
Reysenbach, A-L., Giver, L. J., Wickham, G. S. und Pace, N. R. (1992) Applied and Environmental Microbiology, 58: 3417–3418
Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. und Erlich, H. A. (1988) Science, 239: 487–491
Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Press, Cold Spring Habor, NY
Short, J. M. und Sorge, J. A. (1991) Methods in Enzymology, 216: 495–516
Short, J. M., Fernandez J. M., Sorge, J. A. und Huse, W. D. (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583–7600
Smith, C. R., Kukert, H., Wheatcroft, R. A., Jumars, P. A. und Deming, J. W. (1989) Nature, 341: 27–28
Starnes, et al. (1990) Presented at the 5th international Symposium on Cyclodextrins, Paris, France
Takahashi, N. und Ko, M.S.H. (1994) Genomics, 23: 202–210
Torsvik, V., Goksoyr, J. und Daae, F. L. (1990a) Applied and Environmental Microbiology, 56: 782–787
Torsvik, V., Salte, K., Sorheim, R. und Goksoyr, J. (1990b) Applied and Environmental Microbiology, 56: 776–781
Trotter, P. C. (1990) Tappi Journal, 73: 198–244
Ward, D. M., Weller, Rund Bateson, M. M. (1990) Nature, 345: 63–65
Zamost, B. L., Brantley, Q. I., Elm, D. D. und Beck, C. M. (1990) Journal of Industrial Microbiology, 5: 303–312
Zamost, B. L., Nielson, H. K. und Starnes, R. L. (1991) Journal of Industrial Microbiology, 8: 71–81

SEQUENZPROTOKOLL
Tabelle 1
TABELLE 2
TABELLE 3
TABELLE 4

Claims

Verfahren zur Herstellung einer normierten genomischen DNA-Bank einer Probe aus der Umwelt, die eine gemischte Organismenpopulation enthält, das folgende Schritte umfasst: (a) Isolieren einer genomischen DNA-Population aus der gemischten Organismenpopulation in der Probe aus der Umwelt; (b) Fraktionieren der isolierten genomischen DNA-Population vor der Normierung, wobei die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass DNA von wenig vorkommenden Arten aus dem Pool der als Probe verwendeten Organismen cloniert werden, wobei das Fraktionieren eine Dichtezentrifugationstechnik umfasst, wobei gleiche Mengen an A₂₆₀-Einheiten von jedem Peak entfernt werden und die Nucleinsäure amplifiziert wird; (c) Herstellen einer normierten genomischen DNA-Bank aus der Probe aus der Umwelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die genomische DNA-Population Gencluster enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Isolierschritt eine direkte Lyse der Zellen aus der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Isolierschritt das Ernten von Zellen aus der Probe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Dichtezentrifugationstechnik einen Caesiumchloridgradienten und ein interkalierendes Agens umfasst, wobei die Nucleinsäuren von vielen Arten getrennt werden können.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) das Schmelzen von Nucleinsäuresträngen umfasst und das Zulassen, dass sich die Stränge unter festen Bedingungen selektiv wieder aneinanderlagern.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) umfasst: (a) Schmelzen eines Gemisches aus Nucleinsäurefragmenten; (b) Ermöglichen, dass sich die Fragmente unter festen Bedingungen wieder aneinanderlagern; (c) Gewinnen einzelsträngiger Nucleinsäuren aus Schritt (b); (d) Amplifizieren der aus Schritt (c) gewonnenen einzelsträngigen Nucleinsäuren; und (e) Erzeugen einer Genbank aus den amplifizierten Nucleinsäuren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) das Vertretensein von seltenen Arten in der Probe erhöht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (c) das Vertretensein von reichlich vorhandenen Arten in der Probe verringert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Organismen prokaryontische Mikroorganismen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Organismen nicht gezüchtete Mikroorganismen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Organismen Extremophile umfassen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Extremophile Thermophile, Hyperthermophile, Psychrophile und Psychrotrophe umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe aus der Umwelt von Arktischem Eis, Antarktischem Eis, Wasser, Permafrostquellen, Materialien vulkanischen Ursprungs, Materialien aus Erde oder von Pflanzenquellen in tropischen Gebieten stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend das Analysieren der Komplexität der Nucleinsäure, die vor dem Erstellen einer normierten Bank aus der Probe aus der Umwelt gewonnen wurde.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Analysieren eine 16s-rRNA-Analyse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend das Herstellen einer Expressionsbank aus der nomierten genomischen DNA.