DE69734283T2

DE69734283T2 - Met/fret markierte amplifikationsoligonukleotide und ihre vewendung in verfahren

Info

Publication number: DE69734283T2
Application number: DE69734283T
Authority: DE
Inventors: A. Irina NAZARENKO; K. Satish BHATNAGAR; S. Emily WINN-DEEN; J. Robert HOHMAN
Original assignee: Chemicon International Inc
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1996-07-16
Filing date: 1997-07-15
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2017-07-16
Also published as: DE69734283D1; US6090552A; AU3728597A; JP3597869B2; ATE305476T1; US6117635A; CA2260973A1; JP2003111599A; EP0912597A1; ES2248852T3; WO1998002449A1; JP2001513623A; CA2260973C; EP0912597A4; EP0912597B1

Description

1. EINLEITUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonukleotide zur Amplifizierung von Nukleinsäuren, welche mit molekularen Energietransfer(MET)-Markierungen nachweisbar markiert sind. Sie betrifft ebenfalls Verfahren zum Detektieren der Produkte einer Nukleinsäureamplifizierung unter Verwendung dieser Oligonukleotide. Sie betrifft ferner ein rasches, empfindliches und zuverlässiges Verfahren zum Nachweisen von Amplifizierungsprodukten, welches in großem Maße die Wahrscheinlichkeit einer Übertragskontaminierung mit Amplifizierungsprodukten verringert, und welches an viele Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen, einschließlich Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Triamplifikation und anderen Amplifikationssystemen, anpassbar ist.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
2.1. FLUORESZENZRESONANZ-ENERGIETRANSFER (FRET)
Molekularer Energietransfer (MET) ist ein Vorgang, durch welchen Energie nicht-strahlungsmäßig zwischen einem Donor-Molekül und einem Akzeptor-Molekül übertragen wird. Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) ist eine Form von MET. FRET kommt durch die Eigenschaften bestimmter chemischer Verbindungen zustande; bei Anregung durch Exposition an besondere Wellenlängen des Lichtes, emittieren sie Licht (d. h. sie fluoreszieren) bei einer unterschiedlichen Wellenlänge. Derartige Verbindungen werden Fluorophore genannt. Beim FRET wird Energie nicht-radiativ über eine lange Distanz (10–100 Å) zwischen einem Donormolekül, welches ein Fluorophor ist, und einem Akzeptormolekül übertragen. Der Donor absorbiert ein Photon und überträgt diese Energie nicht-radiativ an den Akzeptor (Förster, 1949, Z. Naturforsch. A4: 321–327; Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211: 353–388).
Wenn zwei Fluorophore, deren Anregungs- und Emissionsspektren überlappen, sich in enger Nachbarschaft befinden, wird die Anregung eines Fluorophors diesen dazu veranlassen, Licht bei Wellenlängen zu emittieren, welche von dem zweiten Fluorophor absorbiert werden und diesen stimulieren, was diesen seinerseits veranlasst, zu fluoreszieren. Mit anderen Worten wird die Anregungszustand-Energie des ersten (Donor-)Fluorophors durch eine Resonanz-induzierte Dipol-Dipol-Wechselwirkung auf das benachbarte zweite (Akzeptor-)Fluorophor übertragen. Als ein Ergebnis wird die Lebensdauer des Donormoleküls verringert und seine Fluoreszenz gelöscht, wohingegen die Fluoreszenzintensität des Akzeptormoleküls verstärkt und depolarisiert wird. Wenn die Anregungszustand-Energie des Donors auf einen Nicht-Fluorophor-Akzeptor übertragen wird, wird die Fluoreszenz des Donors ohne anschließende Emission von Fluoreszenz durch den Akzeptor gelöscht. In diesem Fall fungiert der Akzeptor als ein Quencher.
Paare von Molekülen, welche in einen Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) eintreten können, werden als FRET-Paare bezeichnet. Damit ein Energietransfer stattfindet, müssen die Donor- und Akzeptormoleküle typischerweise in enger Nachbarschaft (bis zu 70 bis 100 Å) vorliegen (Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211: 353–388; Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300–334) sein. Die Effizienz des Energietransfers sinkt rasch mit dem Abstand zwischen den Donor- und Akzeptormolekülen ab. Nach Förster (1949, Z. Naturforsch. A4: 321–327) ist die Effizienz des Energietransfers proportional zu D × 10^–6, wobei D der Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor ist. Effektiv bedeutet dies, dass ein FRET am wirkungsvollsten bis zu Abständen von etwa 70 A auftreten kann.
Moleküle, welche üblicherweise im FRET verwendet werden, schließen Fluorescein, 5-Carboxyfluorescein (FAM), 2'7'-Dimethoxy-4'5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), Rhodamin, 6-Carboxyrhodamin (R6G), N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 4-(4'-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure (DABCYL) und 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalin-1-sulfonsäure (EDANS) ein. Ob ein Fluorophor ein Donor oder ein Akzeptor ist, wird von seinen Anregungs- und Emissionsspektren und dem Fluorophor, mit welchem es gepaart ist, definiert. Zum Beispiel wird FAM am wirkungsvollsten durch Licht mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt und emittiert Licht mit einem Spektrum von 500 bis 650 nm und einem Emissionsmaximum von 525 nm. FAM ist ein geeignetes Donorfluorophor zur Verwendung mit JOE, TAMRA und ROX (welche alle ihr Anregungsmaximum bei 514 nm aufweisen).
In den 1970er Jahren wurden FRET-Markierungen in Immunofluoreszenz-Assays eingebunden, welche zum Nachweis spezifischer Antigene verwendet wurden (Ullman, et al., U.S.-Patente 2 998 943; 3 996 345; 4 160 016; 4174 384 und 4199 559). Später, in den frühen 1980er Jahren, wurden mehrere Patente von Heller und seinen Mitarbeitern erhalten, betreffend die Anwendung von Energietransfer für Polynukleotid-Hybridisierung (U.S.-Patente Nr. 4 996 143, 5 532 129 und 5 565 322). In der Europäischen Patentanmeldung 82303699.1 (Veröffentlichungs-Nummer EP 0 070 685 A2 mit Datum vom 26. Januar 1983) "Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radioactive energy transfer", beanspruchen die Erfinder, dass sie eine einzigartige einzelsträngige Polynukleotidsequenz mit zwei Oligo nukleotiden nachweisen können: Eines, welches das Donorfluorophor enthält, das andere, welches einen Akzeptor enthält. Wenn beide Oligonukleotide an benachbarte Fragmente der analysierten DNA in einem gewissen Abstand hybridisieren, kann ein Energietransfer nachgewiesen werden.
In der europäischen Patentanmeldung 86116652.8 (Veröffentlichungsnummer EP 0 229 943 A2 mit Datum 29. Juli 1987; "EP'943") mit dem Titel "Fluorescent Stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays" schlagen Heller et al. das gleiche Schema vor, jedoch mit spezifizierten Abständen zwischen Donor und Akzeptor für einen Maximum-FRET. Sie offenbaren ebenfalls, dass die Donor- und Akzeptormarkierungen auf derselben Sonde lokalisiert sein können (siehe z. B. EP'943: Anspruch 2 und 1).
Eine ähnliche Anwendung von Energietransfer wurde von Cardullo et al. in einem Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäurehybridisierung offenbart (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790–8794). Fluorescein (Donor) und Rhodamin (Akzeptor) werden an 5'-Enden von komplementären Oligodesoxynukleotiden angeheftet. Nach Hybridisierung kann ein FRET nachgewiesen werden. In anderen Experimenten trat ein FRET nach der Hybridisierung von zwei Fluorophor-markierten Oligonukleotiden an eine längere nicht-markierte DNA auf. Dieses System ist der Gegenstand der PCT-Anmeldung PCT/US92/1591, Veröffentlichungs-Nr. WO 92/14845 mit Datum vom 3. September 1992 ("PCT '845" mit dem Titel "Diagnosing cystic fibrosis and other genetic diseases using fluorescence resonance energy transfer"). PCT '845 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Abnormalitäten in humaner chromosomaler DNA, welche mit zystischer Fibrose assoziiert sind, durch Hybridisierung. Das in diesem Verfahren verwendete FRET-Signal wird auf eine ähnliche Weise erzeugt, wie jener, welche von Heller et al. offenbart wurde (siehe PCT '845, 1). Andere Veröffentlichungen haben die Verwendung von Energietransfer in einem Verfahren für die Abschätzung von Abständen zwischen spezifischen Stellen in DNA (Ozaki und McLaughlin, 1992, Nucl. Acids Res. 20: 5205–5214), in einem Verfahren zur Analyse der Struktur einer Vierweg-DNA-Verbindungsstelle (Clegg et al. 1992, Biochem. 31: 4846–4856) sowie in einem Verfahren zur Beobachtung der helikalen Geometrie von DNA (Clegg et al., 1993, Proc. Natl. Adac. Sci. USA 90: 2994–2998) offenbart.
2.2. ANDERE TYPEN VON MOLEKULAREM ENERGIETRANSFER (MET)
Wie im Abschnitt 2.1 beschrieben, ist Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) eine Form von molekularem Energietransfer (MET). Bei FRET ist der Energiedonor fluoreszent, aber der Energieakzeptor kann fluoreszent oder nicht-fluoreszent sein. Im Fall eines fluoreszenten Energieakzeptors führt der Energietransfer zu einer Verringerung der Emission des Donors oder zu einer Erhöhung der Emission des Akzeptors (Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211: 353–388; Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300–334; Stryer, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47: 819–846). Im Falle eines nicht-fluoreszenten Akzeptors, z. B. eines Chromophors oder eines "Quenchers", führt der Energietransfer zu einer Erhöhung der Emission des Donors (Matayoshi, et al., 1990, Science 247: 954–958; Tyagi und Kramer, 1996, Nature Biotech. 14: 303–309; Steinberg, 1991, Ann. Rev. Biochem. 40: 83–114).
In einer anderen Form von MET ist der Energiedonor nicht-fluoreszent, z. B. ein Chromophor, und der Energieakzeptor ist fluoreszent. In diesem Fall führt ein Energietransfer zu einer Erhöhung der Emission des Akzeptors (Heller, U.S.-Patente Nr. 5 532 129 und 5 565 322; Steinberg, 1991, Ann. Rev. Biochem. 40: 83–114).
In noch einer anderen Form des MET ist der Energiedonor lumineszent, z. B. biolumineszent, chemolumineszent, elektrochemolumineszent, und der Akzeptor ist fluoreszent. In diesem Fall führt ein Energietransfer zu einer Erhöhung der Emission des Akzeptors (Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300–334, Heller, Europäische Patentveröffentlichung 0070685A2, mit Datum vom 26. Januar 1993; Schutzbank und Smith, 1995, J. Clin. Microbiol. 33: 2036–2041). Ein Beispiel eines derartigen Energietransfersystems wird von Selvin (siehe oben) beschrieben, worin ein lumineszentes Lanthanid-Chelat, z. B. Terbium-Chelat oder Lanthanid-Chelat, der Donor ist, und ein organischer Farbstoff, wie Fluorescein, Rhodamin oder CY-5, der Akzeptor ist. Besonders effektive MET-Systeme unter Verwendung dieser Strategie schließen Terbium als einen Donor und Fluorescein oder Rhodamin als einen Akzeptor, sowie Europium als einen Donor und CY-5 als einen Akzeptor ein. Die umgekehrte Situation, d. h. wobei der Donor fluoreszent und der Akzeptor lumineszent ist, wird als "sensitivierte Lumineszenz" bezeichnet, und der Energietransfer führt zu einer Erhöhung der Emission des Akzeptors (Dexter, 1953, J. Chem. Physics 21: 836–850).
In einer theoretisch möglichen Form von MET kann der Energiedonor lumineszent sein und der Energieakzeptor kann nicht-fluoreszent sein. Ein Energietransfer führt zu einer Verringerung der Emission des Donors.
2.3. VERFAHREN ZUR ÜBERWACHUNG VON NUKLEINSÄUREAMPLIFIKATION
Vor der vorliegenden Erfindung ist eine Anwendung von Energietransfer auf die direkte Detektion von genetischen Amplifikationsprodukten nicht erreicht worden. In Verfahren des Stands der Technik zur Überwachung von Amplifikationsreaktionen unter Anwendung von Energietransfer wird eine Markierung nicht in das Amplifikationsprodukt eingebaut bzw. in korporiert. Als ein Ergebnis haben sich diese Verfahren auf eine indirekte Messung der Amplifikationsreaktion verlassen.
Üblicherweise angewandte Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten erfordern, dass das amplifizierte Produkt von nicht-umgesetzten Primern getrennt wird. Dies erreicht man üblicherweise entweder durch die Verwendung von Gelelektrophorese, welche das Amplifikationsprodukt von den Primern auf Grundlage eines Größenunterschiedes trennt, oder durch die Immobilisierung des Produktes, welche das Hinwegwaschen von freiem Primer gestattet. Allerdings sind drei Verfahren zur Überwachung des Amplifizierungsvorgangs ohne vorherige Abtrennung des Primers beschrieben worden. Alle von diesen basieren auf FRET, und keines von ihnen weist das amplifizierte Produkt direkt nach. Anstelle dessen detektieren alle drei Verfahren etwas von einem mit der Amplifikation zusammenhängenden Ereignis. Aus diesem Grunde werden sie von Problemen eines hohen Hintergrunds begleitet und sind nicht quantitativ, wie nachstehend erörtert wird.
Ein Verfahren, beschrieben in Wang et al. (U.S.-Patent 5 348 853; Wang et al., 1995, Anal. Chem. 67: 1197–1203; WO 95/32306) verwendet ein Energietransfersystem, in welchem der Energietransfer zwischen zwei Fluorophoren auf der Sonde auftritt. In diesem Verfahren findet die Detektion des amplifizierten Moleküls in dem Amplifizierungs-Reaktionsgefäß ohne Notwendigkeit für einen Trennungsschritt statt. Dieses Verfahren führt zu einer höheren Empfindlichkeit als Verfahren, welche auf einfach-markierten Primern beruhen.
Das Verfahren von Wang et al. verwendet ein "Energie-Ableitungs(energy-sink)"-Oligonukleotid, welches zu dem Rückwärts-Primer komplementär ist. Die "Energie-Ableitungs"- und Rückwärts-Primer-Oligonukleotide weisen Donor- bzw. Akzeptormarkierungen auf. Vor der Amplifizierung bilden die markierten Oligonukleotide einen Primer-Duplex, in welchem ein Energietransfer frei auftritt. Dann wird eine asymmetrische PCR bis zu ihrer späten Log-Phase durchgeführt, bevor einer der Zielstränge signifikant überproduziert wird.
Ein Primer-Duplex, welcher komplementär zum überproduzierten Zielstrang ist, wird zugegeben, um eine semi-verschachtelte Reaktion im Zusammenwirken mit dem überschüssigen Primer zu primen. Mit Voranschreiten der semi-verschachtelten Amplifikation beginnt der Primer-Duplex, sich zu dissoziieren, wenn die Zielsequenz dupliziert wird. Als Ergebnis werden die für den Energietransfer konfigurierten Fluorophore voneinander abgekoppelt, was verursacht, dass der Energietransferprozess, der in allen der Primer-Duplexe voreingerichtet war, für diejenigen Primer abgebrochen wird, welche an dem Amplifikationsprozess beteiligt sind. Die gemessene Fluoreszenzintensität ist proportional zur Menge des am Ende jedes Amplifikationszyklus zurückgebliebenen Primer-Duplexes. Die Verringerung der Fluores zenzintensität korreliert proportional zur anfänglichen Zieldosis und zum Ausmaß der Amplifikation.
Dieses Verfahren detektiert jedoch nicht das amplifizierte Produkt, sondern detektiert anstelle dessen die Dissoziation von Primer von dem "Energie-Ableitungs"-Oligonukleotid. Somit ist dieses Verfahren abhängig von der Detektion einer Verringerung der Emissionen; ein signifikanter Anteil an markiertem Primer muss verwendet werden, um einen zuverlässigen Unterschied zwischen den Signalen vor und nach der Reaktion zu erreichen. Dieses Problem wurde offensichtlich von Wang et al. bemerkt, die versuchten, dies durch Hinzufügen eines vorbereitenden Amplifikationsschrittes (asymmetrische PCR) zu kompensieren, von welchem angenommen wird, die anfängliche Ziel-Konzentration und folglich die Verwendung von markiertem Primer zu erhöhen, aber der das Verfahren auch kompliziert macht.
Ein zweites Verfahren für die Detektion von Amplifikationsprodukt ohne vorausgehendes Trennen von Primer und Produkt ist der 5'-Nuklease-PCR-Assay (ebenfalls bezeichnet als der TaqMan^®-Assay) (Holland et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276–7280; Lee et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21: 3761–3766). Dieser Assay detektiert die Akkumulation eines spezifischen PCR-Produkts durch Hybridisierung und Spaltung einer doppelt markierten fluorogenen Sonde (der "TaqMan"-Sonde) während der Amplifikationsreaktion. Die fluorogene Sonde besteht aus einem Oligonukleotid, welches sowohl mit einem fluoreszierenden Reporterfarbstoff als auch einem Quencher-Farbstoff markiert ist. Während der PCR wird diese Sonde durch die 5'-Exonuklease-Aktivität von DNA-Polymerase gespalten, dann und nur dann, wenn sie an das Segment, das amplifiziert wird, hybridisiert. Die Spaltung der Sonde erzeugt eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität des Reporterfarbstoffs.
In dem TaqMan-Assay sind der Donor und der Quencher vorzugsweise auf den 3'- und 5'-Enden der Sonde lokalisiert, weil die Anforderung, dass eine 5'-3'-Hydrolyse zwischen dem Fluorophor und dem Quencher durchgeführt wird, nur erfüllt werden kann, wenn diese zwei Einheiten nicht zu nahe beieinander sind (Lyamichev et al., 1993, Science 260: 778–783). Allerdings ist diese Anforderung ein ernster Nachteil des Assays, da die Effizienz des Energietransfers mit der umgekehrten 6. Potenz des Abstands zwischen dem Reporter und dem Quencher abnimmt. Mit anderen Worten ermöglicht es der TaqMan-Assay dem Quencher nicht, nah genug an dem Reporter zu sein, um die effizienteste Löschung zu erzielen. Als eine Konsequenz können die Hintergrundemissionen von nicht-hybridisierter Sonde ziemlich hoch sein.
Weiterhin misst der TaqMan-Assay nicht das Amplifikationsprodukt direkt, weil die Amplifikations-Primer nicht markiert sind. Dieser Assay misst ein mit der Amplifizierung zusam menhängendes Ereignis: die Hydrolyse der Sonde, welche an die Ziel-DNA zwischen den Primer-Sequenzen hybridisiert. Als Ergebnis wird dieses Assay-Verfahren von signifikanten Problemen begleitet.
Zum Ersten wird die Hybridisierung niemals quantitativ sein, es sei denn, das markierte Oligonukleotid ist im großen Überschuss vorhanden. Allerdings führt dies zu einem hohen Hintergrund (weil die Löschung niemals quantitativ ist). Darüber hinaus wird ein großer Überschuss an Oligonukleotid, das an die Mitte der Ziel-DNA hybridisiert ist, die PCR-Effizienz verringern. Weiterhin wird nicht die Gesamtheit der an die DNA hybridisierten Oligonukleotide Gegenstand der 5'-3'-Exonuklease-Hydrolyse sein: ein gewisser Teil wird ohne Hydrolyse verdrängt werden, was zu einem Verlust an Signal führt.
Ein anderes Verfahren zum Detektieren von Amplifikationsprodukten, welches auf der Verwendung von Energietransfer beruht, ist das "Beacon probe"- bzw. "Leuchtsignal-Sonde"-Verfahren, welches von Tyagi und Kramer beschrieben wird (1996, Nature Biotech. 14: 303–309), welches ebenfalls der Gegenstand der U.S.-Patente Nr. 5 119 801 und 5 312 728 von Lizardi et al. ist. Dieses Verfahren verwendet Oligonukleotid-Hybridisierungssonden, welche Haarnadelstrukturen ausbilden können. An einem Ende der Hybridisierungsonde (entweder dem 5'- oder 3'-Ende) liegt ein Donor-Fluorophor, und am anderen Ende eine Akzeptorkomponente vor. Im Falle des Verfahrens von Tyagi und Kramer ist diese Akzeptorkomponente ein Quencher, d. h. der Akzeptor absorbiert vom Donor abgegebene Energie, aber fluoresziert dann nicht selbst. Wenn das Leuchtsignal in der offenen Konformation vorliegt, ist daher die Fluoreszenz des Donor-Fluorophors detektierbar, wohingegen wenn das Leuchtsignal in der (geschlossenen) Haarnadel-Konformation vorliegt, die Fluoreszenz des Donor-Fluorophors gelöscht wird. Bei Verwendung in einer PCR liegt diejenige molekulare Leuchtsignal-Sonde, welche an einen der Stränge des PCR-Produkts hybridisiert, in der "offenen Konformation" vor, und eine Fluoreszenz wird detektiert, wohingegen jene, welche unhybridisiert bleiben, nicht fluoreszieren werden (Tyagi und Kramer, 1996, Nature Biotechnol. 14: 303–306). Als Ergebnis wird das Ausmaß an Fluoreszenz zunehmen, wenn die Menge an PCR-Produkt zunimmt, und kann somit als ein Maß des Voranschreitens der PCR verwendet werden.
Da dieses Verfahren jedoch auf der Hybridisierung der Sonde an die Matrize zwischen den Primersequenzen beruht, ist damit eine Reihe von Problemen assoziiert, von denen einige ähnlich zu denjenigen sind, welche obenstehend im Zusammenhang mit dem TaqMan-Verfahren beschrieben wurden. Zum Ersten ist es unwahrscheinlich, dass die Leuchtsignal-Sonden quantitativ an einen Strang von doppelsträngigem PCR-Produkt hybridisieren werden, speziell wenn das Amplifikationsprodukt viel länger als die Leuchtsignal-Sonde ist. Sogar diejenigen Sonden, welche hybridisiert sind, könnten von dem zweiten DNA-Strang über eine kurze Zeitdauer hinweg verdrängt werden; als ein Ergebnis kann dieses Verfahren nicht quantitativ sein.
Zusätzliche Beispiele von nicht-quantitativen Verfahren zur Detektion von Amplikons ohne vorherige Trennung von Primer und Produkt können gefunden werden in Cantor, Nature Biotechnology, 14: 264 (1996) und EP 601 889 A2 . Diese Bezugsstellen offenbaren die Verwendung von Oligonukleotid-Hybridisierungssonden, welchen Haarnadelstrukturen bilden können.
Bestrebungen, die Hybridisierungseffizienz durch Erhöhen der Konzentration an Leuchtsignal-Sonde zu erhöhen, werden zu einer verminderten Amplifikationseffizienz führen, da die Notwendigkeit, dass DNA-Polymerase hybridisierte Leuchtsignale während der Reaktion verdrängt, die Polymerisationsrate verlangsamen wird. Ein Überschuss an Sonde wird des Weiteren den Hintergrund erhöhen. Darüber hinaus wird sich das Verhältnis zwischen dem Amplifikationsprodukt und den Leuchtsignal-Sonden verändern, wenn die Amplifikation fortschreitet, und wird so die Effizienz der Hybridisierung ändern. Daher kann die Detektion des amplifizierten Produkts nicht quantitativ sein.
Im Hinblick auf die Mängel in den Verfahren des Stands der Technik zum Detektieren von Amplifikationsprodukten ist es deshalb klar, dass im Fachgebiet ein Bedarf für ein verbessertes Verfahren zum Detektieren von Amplifikationsprodukten auf rasche, empfindliche, zuverlässige und quantitative Weise besteht. Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch Vorsehen von Nukleinsäure-Amplifikationsprimern, welche mit Energietransfer-Markierungen nachweisbar markiert sind. Sie löst dieses Problem ebenfalls durch Vorsehen von Verfahren zum Detektieren von Amplifikationsprodukten, welche an viele Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen anpassbar sind und welche in großem Maße die Möglichkeit einer Übertrag-Kontamination mit Amplifikationsprodukten verringern.
Die Zitierung von Bezugsstellen hierin soll nicht als Eingeständnis ausgelegt werden, dass derartige Bezugsstellen Stand der Technik gegenüber der vorliegenden Erfindung sind.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonukleotide für die Amplifizierung von Nukleinsäuren, welche detektierbar mit molekularen Energietransfer(MET)-Markierungen markiert sind. Eines oder mehrere Oligonukleotide der Erfindung, welche eine Donor- und/oder Akzeptorkomponente eines MET-Paares enthalten, werden in das amplifizierte Produkt einer Amplifikationsreaktion so eingebaut, dass das amplifizierte Produkt sowohl eine Donor- als auch eine Akzeptorkomponente eines MET-Paares enthält. Wenn das amplifizierte Produkt doppelsträngig ist, kann das in das amplifizierte Produkt eingebaute MET-Paar auf demselben Strang oder, wenn die Amplifizierung eine Triamplifikation ist, auf gegenüberliegenden Strängen vorliegen. In bestimmten Fällen, worin die in der Amplifizierung verwendete Polymerase eine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität aufweist, kann eine der MET-Paar-Komponenten von wenigstens einem gewissen Teil der Population des amplifizierten Produkts durch diese Exonuklease-Aktivität abgespalten werden. Eine derartige Exonuklease-Aktivität ist nicht abträglich für die Amplifizierungsverfahren der Erfindung.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Detektieren der Produkte von Nukleinsäureamplifikation unter Verwendung dieser markierten Oligonukleotide der Erfindung. Sie betrifft ferner ein rasches, empfindliches und zuverlässiges Verfahren zum Detektieren von Amplifikationsprodukten, welches im großen Maße die Möglichkeit einer Übertrags-Kontamination mit Amplifikationsprodukten verringert und welches an viele Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen anpassbar ist, einschließlich Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Triamplifikation, und anderen Amplifikationssystemen.
Die Nukleinsäureamplifikations-Oligonukleotide der Erfindung verwenden das Prinzip des molekularen Energietransfers (MET) zwischen einer Donorkomponente und einer Akzeptorkomponente. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem MET um Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET), in welchem die Oligonukleotide mit Donor- und Akzeptorkomponenten markiert sind, wobei die Donorkomponente ein Fluorophor ist, und die Akzeptorkomponente ein Fluorophor sein kann, so dass die von der Donorkomponente emittierte Fluoreszenzenergie von der Akzeptorkomponente absorbiert wird. Die Akzeptorkomponente ist ein Quencher.
Somit ist der Amplifikationsprimer ein Haarnadel-Primer, welcher sowohl Donor- als auch Akzeptorkomponenten enthält und so konfiguriert ist, dass die Akzeptorkomponente die Fluoreszenz des Donors löscht. Wenn der Primer in das Amplifikationsprodukt eingebaut wird, verändert sich seine Konfiguration, das Löschen wird eliminiert, und die Fluoreszenz der Donorkomponente kann nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung sieht Nukleinsäure-Amplifikationsprimer vor, welche eine Haarnadelstruktur ausbilden, in welcher MET auftreten wird, wenn der Primer nicht in das Amplifikationsprodukt eingebaut ist. Somit bildet ein Primer der Erfindung eine Haarnadelstruktur, in welcher die Energie eines Donor-Fluorophors durch ein nicht-fluoreszierendes Fluorophor gelöscht wird, wenn der Primer nicht in das Amplifikationsprodukt eingebaut ist.
Die vorliegende Erfindung sieht des Weiteren ein Verfahren zum direkten Detektieren von Amplifikationsprodukten vor. Diese verbesserte Technik erfüllt zwei Hauptanforderungen. Zum Ersten gestattet sie die Detektion des Amplifikationsprodukts ohne vorherige Abtrennung von nicht-eingebauten Oligonukleotiden. Zum Zweiten gestattet sie die Detektion des Amplifikationsprodukts auf direkte Weise durch Einbauen des markierten Oligonukleotides in das Produkt.
In einer weiteren Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die direkte Detektion von Amplifikationsprodukten vor, in welchem die Detektion ohne Öffnen des Reaktionsgefäßes durchgeführt werden kann. Diese Ausführungsform, das "Geschlossenes-Gefäß"-Format, verringert in großem Maße die Möglichkeit von Übertrags-Kontamination mit Amplifikationsprodukten, welche die Akzeptanz von PCR in vielen Anwendungen verzögert hat. Das Geschlossene-Gefäß-Verfahren sieht ebenfalls einen hohen Durchsatz an Proben vor und kann vollständig automatisiert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Kits zur Detektion oder Messung von Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten. Derartige Kits können diagnostische Kits sein, wobei die Gegenwart der amplifizierten Nukleinsäure mit der Gegenwart oder Abwesenheit einer Krankheit oder Störung in Korrelation gebracht wird.
3.1. DEFINITIONEN
Wie hierin verwendet, sollen die folgenden Begriffe die aufgeführten Abkürzungen besitzen.

ARMS:: Amplifikations-Refraktorische-Mutations-System
ASP:: Allel-spezifische Polymerase-Kettenreaktion
bp:: Basenpaare
CRCA:: Kaskaden-Rolling-Circle-Amplifizierung
DAB oder DABCYL:: 4-(4'-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure
EDANS:: 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalin-1-sulfonsäure
FAM oder Flu:: 5-Carboxyfluorescein
FRET:: Fluoreszenzresonanz-Energietransfer
JOE:: 2'7'-Dimethoxy-4'5'-dichlor-6-carboxyfluorescein
HPLC:: Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
MET:: Molekularer Energietransfer
NASBA:: Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifizierung
PSA:: Prostata-spezifisches Antigen
Rhod:: Rhodamin
ROX:: 6-Carboxy-X-rhodamin
R6G:: 6-Carboxyrhodamin
SDA:: Strangverdrängungs-Amplifizierung
TAMRA:: N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin
TRAP:: Telomere-Wiederholungseinheit-Amplifizierungs-Protokoll.

4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die vorliegende Erfindung kann vollständiger unter Bezugnahme auf die nachfolgende ausführliche Beschreibung der Erfindung, Beispiele für spezifische Ausführungsformen der Erfindung und die nachfolgend beschriebenen beiliegenden Figuren verstanden werden: Die 1A–B veranschaulichen schematisch die Struktur der Haarnadel-Primer der Erfindung in den (A) geschlossenen (gelöschten) und (B) offenen (signal-emittierenden) Zuständen. o: Donor-Fluorophor; •: Quencher-Fluorophor.
Die 2 veranschaulicht schematisch die Verwendung von Haarnadel-Primern zum direkten Messen der Amplifikationsprodukte aus einer PCR, in welcher der verwendeten DNA-Polymerase 5'-3'-Exonuklease-Aktivität fehlt. Ein Energietransfersignal wird nach dem Einbau des Haarnadel-Primers in das doppelsträngige PCR-Produkt erzeugt. (a) und (b): komplementäre Stränge der zu amplifizierenden Zielsequenz; o: Donor-Fluorophor; •: Quencher; F: Vorwärts-Primer; R: Rückwärts-Primer.
Die 3 (Schritte A–D) veranschaulicht die Amplifikationsprodukte aus einer PCR, in welcher die verwendete DNA-Polymerase eine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität besitzt. (a) und (b): komplementäre Stränge der zu amplifizierenden Zielsequenz; o: Donor-Fluorophor; •: Quencher; F: Vorwärts-Primer; R: Rückwärts-Primer.
Die 4 gibt ein schematisches Beispiel einer ausgewählten Zielsequenz (SEQ ID NR.: 1), welche an eine Universal-Haarnadel (SEQ ID NR.: 2) ligiert ist. (d) ist die ausgewählte Primersequenz von 8–40 Nukleotiden, vorzugsweise ~15 Nukleotiden, welche komplementär zu der zu amplifizierenden Ziel-Nukleinsäuresequenz ist. (d') ist das kohäsive 5'-Ende der ausgewählten Primersequenz. Das kohäsive Ende beläuft sich auf 1–10 Nukleotide, vorzugsweise 3–4 Nukleotide und ist komplementär zu dem kohäsiven 5'-Ende (a') der Universal-Haarnadel. (b) ist eine Schleife auf der Universal-Haarnadel, welche lang genug ist, um einen Abstand von 15–25 Nukleotiden, vorzugsweise 20 Nukleotiden, zwischen dem Donor (F, FAM) und dem Quencher (D, DABCYL) vorzusehen, wenn die Haarnadel in der "offenen" Konfiguration vorliegt. (a) und (c) sind die zwei Stränge des Stammes der Universal-Haarnadel. Wenn die ausgewählte Primersequenz an die Universal-Haarnadel ligiert wird, wird der Quencher (DABCYL) auf einem Nukleotid lokalisiert, welches intern zum 3'-Ende liegt. Der Donor (FAM) kann auf einem Nukleotid entweder am 5'-Ende (wie gezeigt) oder intern zum 5'-Ende lokalisiert werden. Die einzige Anforderung besteht darin, dass der Donor und der Quencher nahe genug liegen, um ein Löschen zu ermöglichen, wenn die Haarnadel in der "geschlossenen" ("stillen") Konformation vorliegt.
Die 5 veranschaulicht schematisch die Verwendung eines FRET-Donor-Akzeptor-markierten Haarnadel-Primers in einer PCR; siehe Abschnitt 5.2.1 für eine ausführliche Beschreibung der Zyklen 1–4.
Die 6 veranschaulicht schematisch die Verwendung eines FRET-Donor-Akzeptor-markierten Haarnadel-Primers in der Triamplifikation. In dieser Ausführungsform einer Triamplifikation wird, anders als bei PCR, ein drittes Oligonukleotid ("Blocker") an den verlängerten Haarnadel-Primer ligiert. Das Fluoreszenzsignal wird allerdings als ein Ergebnis der Replikation erzeugt, wie es in der PCR stattfindet.
Die 7 veranschaulicht schematisch eine Triamplifikation unter Verwendung von zwei linearen Primern, welche jeweils mit einer FRET-Komponente markiert sind. BL: Blocker; R: Rückwärtsprimer; F: Vorwärtsprimer;
: eine kommerziell erhältliche 3'-modifizierende Gruppe, die zum Schützen des Oligonukleotids vor Verlängerung durch DNA-Polymerase oder Hydrolyse durch 3'-5'-Exonuklease fähig ist, auf dem 3'-Ende des Blockers; X: 2'-O-Methyl-Modifikation im Rückwärts-Primer; D: Donor-Fluorophor; Ao: Akzeptor-Fluorophor.
Die 8A–B veranschaulichen den Effekt von (A) 3'-5'-Exonuklease und (B) erhöhter Temperatur auf nicht-eingebaute FRET-markierte Primer während einer Triamplifikation. BL: Blocker: R: Rückwärts-Primer; F: Vorwärts-Primer; P: 5'-Phosphat;
: Schutzgruppe auf dem 3'-Ende des Blockers; X: 2'-O-Methyl-Modifikation im Rückwärts-Primer; D: Donor-Fluorophor; Ao: Akzeptor-Fluorophor.
Die 9 veranschaulicht schematisch die Verwendung von Haarnadel-Primern in der Nukleinsäuresequenz-basierenden Amplifikation (NASBA). NASBA hängt von dem kontinuierlichen Zyklieren der reversen Transkriptions- und RNA-Transkriptions-Reaktionen bei einer Temperatur ab; siehe Abschnitt 5.2.3 für eine ausführliche Beschreibung der Schritte 1–9.
Die 10 veranschaulicht schematisch die Verwendung von Haarnadel-Primern in der Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA) eines doppelsträngigen DNA-Ziels. Die Primer 1 und 2 unterscheiden sich, wobei sie jeweils Vorwärts- bzw. Rückwärts-Primer sind. Die SDA hängt vom kontinuierlichen Zyklieren der Nicking- bzw. Einzelstrangbruch- und der Polymerisations/Verdrängungs-Schritte bei einer Temperatur ab; siehe Abschnitt 5.2.4 für eine aus führliche Beschreibung der Schritte 1–4. pol: Polymerase; Restriktase: Restriktionsendonuklease.
Die 11A–B veranschaulichen ein Zweikammer-Amplifikationsröhrchen im "Geschlossenen-Gefäß"-Format. Das Röhrchen kann auf den Kopf gestellt (11B) werden und verwendet werden, um 3'-5'-Exonuklease mit dem Amplifikationsprodukt nur dann zu vermischen, wenn dies gewünscht wird, ohne das Röhrchen nach Stattfinden der Amplifikation zu öffnen (siehe Abschnitt 12, Beispiel 6).
Die 12 veranschaulicht Abschnitte der zwei Stränge (oberer Strang: SEQ ID NR.: 3 und SEQ ID NR.: 4; unterer Strang: SEQ ID NR.: 8 und SEQ ID NR.: 9) der Matrize und die Oligonukleotide PSA-I (SEQ ID NR.: 5), PSA-P (SEQ ID NR.: 6), und PSA-B (SEQ ID NR.: 7), welche in der Amplifizierung von humaner Prostata-spezifisches-Antigen(PSA)-DNA verwendet wurden, wie beschrieben in allen Beispielen, außer denjenigen, welche Haarnadel-Primer einsetzen, deren Sequenzen in Abschnitt 12 angegeben sind.
13A–C. Die 13A veranschaulicht schematisch das PCR-Amplifikationsverfahren, welches in dem Experiment eingesetzt wird, das in Abschnitt 7 beschrieben ist (Beispiel 1). Der linke Abschnitt von 13A veranschaulicht eine PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Rhodamin-modifizierten Rückwärts-Primers. Der rechte Abschnitt von 13A veranschaulicht eine PCR-Amplifikation unter Verwendung eines nicht-modifizierten Rückwärts-Primers. Die Ergebnisse sind auf dem begleitenden denaturierenden 6%igen Polyacrylamidgel (13B) und Agarosegel (13C) gezeigt. Die 13B vergleicht die Größen der DNA-Stränge, welche mit [³²P]-markiertem Vorwärts-Primer amplifiziert wurden, als nicht-modifizierter Rückwärts-Primer (Spur 1) oder Rhodamin-modifizierter Rückwärts-Primer (Spur 2) verwendet wurde. Die 13C vergleicht die Mengen an doppelsträngigem PCR-Amplifikationsprodukt, welche mit nicht-modifziertem Rückwärts-Primer (Spur 1) und Rhodamin-modifiziertem Rückwärts-Primer (Spur 2) erhalten werden.
14A–B. Die 14A veranschaulicht schematisch das in Abschnitt 8 (Beispiel 2) verwendete experimentelle Vorgehen. Die Ergebnisse sind in dem begleitenden denaturierenden 6%igen Polyacrylamidgel (14B) gezeigt. Die Spur 1 des Gels repräsentiert einen Strang amplifizierter DNA mit eingebautem [³²P]- und Rhodamin-markiertem Rückwärts-Primer, wohingegen die Spur 2 einen Strang amplifizierter DNA mit eingebautem [³²P]-markiertem Vorwärts-(F)-Primer repräsentiert.
15A–B. Die 15A veranschaulicht schematisch das experimentelle Vorgehen, welches in Abschnitt 9 (Beispiel 3) angewandt wurde. Die Ergebnisse sind auf dem begleitenden denaturierenden 15%igen Polyacrylamidgel (15B) gezeigt. Die Spur 1 des Gels repräsentiert [³²P]- und Rhodamin-markierten Rückwärts-Primer. Die Spuren 2–4 repräsentieren [³²P]- und Rhodamin-markierten Rückwärts-Primer nach Inkubation mit T4-DNA-Polymerase, welche 3'-5'-Exonuklease-Aktivität aufweist, während 2 Minuten (Spur 2), 5 Minuten (Spur 3) und 15 Minuten (Spur 4).
Die 16 veranschaulicht die Detektion von Amplifikationsprodukt mittels FRET nach Nuklease-Behandlung (Abschnitt 10, Beispiel 4). Das Emissionsspektrum 1 wurde nach Triamplifikation mit DNA-Matrize und Exonuklease-Behandlung erhalten. Das Spektrum 2 wurde nach Triamplifikation ohne DNA-Matrize und Exonuklease-Behandlung (keine DNA-Kontrolle) erhalten.
Die 17A–B veranschaulichen den Effekt von erhöhten Temperaturen (75°C) auf FRET im Anschluss an Triamplifikation (A) ohne und (B) mit DNA-Matrize (Abschnitt 11, Beispiel 5).
18A–B. Die 18A zeigt die Struktur des PSA-cDNA-Stromaufwärts-Haarnadel-Primers (SEQ ID NR.: 10). Der Abschnitt der Sequenz, welcher komplementär zur Ziel-DNA ist, wird in Fettdruck gezeigt. Die 18B zeigt ein Emissionsspektrum des Fluorescein-markierten Haarnadel-Primers in Abwesenheit (1) und Gegenwart (2) einer DABCYL-Gruppe. Die aus 0,5 ml einer 40-nM-Probe an Oligonukleotid erhaltenen Spektren wurden gemessen, wie es im Abschnitt 6.4 beschrieben ist, wobei eine Anregungswellenlänge von 488 nm verwendet wurde.
Die 19 zeigt die Effizienz der Amplifikation mit den Haarnadel-Primern. Produkte der Amplifikation wurden auf einem MDE^TM-Gel (FMC Bioproducts, Rockland ME) getrennt. Ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Gel ist gezeigt. Die Spuren 1–3 zeigen die Produkte der Amplifikation von 10^–9 M PSA-cDNA mit unmarkiertem linearem Kontroll-Primer (Spur 1), FAM-Haarnadel-Primer (Spur 2) und FAM/DABCYL-Haarnadel-Primer (Spur 3). Die Spuren 4–6 zeigen die Produkte der Amplifikation von 10^–11 M PSA-cDNA mit Kontroll-Primer (Spur 4), FAM-Haarnadel-Primer (Spur 5) und FAM/DABCYL-Haarnadel-Primer (Spur 6). Die Spur M enthält einen 100-bp-Marker (Gibco BRL).
Die 20A–B veranschaulichen schematisch eine PCR-Amplifikation in Gegenwart von Haarnadel-Primern bzw. zeigt deren Ergebnisse. Die PCR-Amplifikation von PSA-cDNA wurde mit zwei Primern durchgeführt: ein stromaufwärts gelegener Haarnadel-Primer, der mit FAM und DABCYL markiert war, und ein stromabwärts gelegener Primer, welcher mit ³²P an seinem 5'-Ende markiert war (20A). Ein Stromaufwärts-Primer ohne die Haarnadel-Struktur wurde als eine Kontrolle verwendet. Die Struktur des Haarnadel-Primers wird in der 18A dargestellt, und die Sequenzen der regulären Primer werden in Abschnitt 12.3 angegeben. Die 20B ist ein Autoradiogramm, welches die Größe des synthetisierten PCR-Produkts zeigt. [³²P]-markierte Stränge der PCR-Produkte wurden synthetisiert in Gegenwart des unmarkierten linearen Kontroll-Primers (Spur 1) oder FAM/DABCYL-markierten Haarnadel-Primers (Spur 2) und auf einem 6%igen denaturierenden Polyacrylamidgel analysiert.
21A–B. Die 21A zeigt die Fluoreszenzspektren der Amplifikationsreaktionen, welche mit den Haarnadel-Primern, die mit FAM/DABCYL markiert waren, durchgeführt wurden. Die Struktur des FAM/DABCYL-markierten Haarnadel-Primers wird in der 18A präsentiert, und die Sequenz des regulären stromabwärts gelegenen Primers wird in Abschnitt 12.3 präsentiert. Die Spektren 1–6 zeigen die Fluoreszenzintensität der amplifizierten PSA-cDNA nach 0 (1), 20 (2), 25 (3), 30 (4), 35 (5) oder 40 (6) Zyklen. Die 21B zeigt die Fluoreszenzintensität der Amplifikations-Reaktionsmischungen und den Anteil der in die PCR-Produkte eingebauten [³²P]-markierten Primer, aufgetragen gegen die Anzahl an Zyklen. Der Einbau der [³²P]-markierten Primer in die PCR-Produkte wurde durch Elektrophorese auf einem 6%igen denaturierenden Gel bestimmt und unter Verwendung des "PhosphorImager" quantifiziert.
Die 22 zeigt die Empfindlichkeit von PCR mit Haarnadel-Primern. Die Spektren 1–6 zeigen die Ergebnisse der Amplifikation, wenn 0 (1), 10 (2), 10² (3), 10³ (4), 10⁴ (5), 10⁵ (6) oder 10⁶ (7) Moleküle klonierte PSA-cDNA pro Reaktion als Matrizen-DNA für die 40 Zyklen der PCR verwendet wurden. Die Struktur des FAM/DABCYL-markierten Haarnadel-Primers ist in der 18A dargestellt, und die Sequenz des regulären stromabwärts gelegenen Primers wird in Abschnitt 12.3 präsentiert.
Die 23 zeigt die sichtbare Fluoreszenz von PCR-Produkten, welche mit Haarnadel-Primern synthetisiert wurden. 10⁶ (Röhrchen 1), 10⁴ (Röhrchen 2), 10³ (Röhrchen 3) und 0 (Röhrchen 4) Moleküle der klonierten PSA-cDNA-Matrize wurden als Matrizen-DNA für die 40 Zyklen der PCR mit FAM/DABCYL-markierten Haarnadel-Primern verwendet. DNA-Fluoreszenz wurde in dünnwandigen 0,2-ml-PCR-Röhrchen unter Verwendung eines UV-Transilluminator-Bildanalysesystems visualisiert.
Die 24A–G zeigen die Fluoreszenzintensität von PSA-cDNA, welche mit verschiedenen FAM/DABCYL-markierten Haarnadel-Primern amplifiziert wurde (die 24A–G entsprechen jeweils den SEQ ID NR.: 13–18 bzw. 25). Alle Primer wiesen wenigstens eine 18-Nukleotid-Sequenz auf, welche zu dem Ziel komplementär war, die aus einer einzelsträngigen 3' primenden Sequenz, einer 3'-Stamm-Sequenz und einem Teil der Schleife bestand. Zu der Ziel-DNA komplementäre Sequenzen sind in schattierten fettgedruckten Kursiv-Lettern dargestellt. f: FAM; d: DABCYL; nucl: Nukleotidanzahl; rel. (%): prozentuale Intensität der Fluoreszenz relativ zu mit Primer A amplifizierter DNA.
Die 25 veranschaulicht schematisch die Verwendung von linearen Primern, um die Amplifikationsprodukte aus einer PCR direkt zu messen. Ein Energietransfersignal wird nach dem Einbau des Primers in das doppelsträngige PCR-Produkt erzeugt. Nach Amplifikation wird das Signal aus nicht-eingebautem Primer durch 3'-5'-Exonuklease-Hydrolyse eliminiert. D: Donorkomponente; A: Akzeptorkomponente; F: Vorwärts-Primer; R: Rückwärts-Primer.
Die 26 veranschaulicht die drei Sets an PCR-Primern, welche in den Experimenten in Abschnitt 13, Beispiel 7, verwendet wurden. Uup (SEQ ID NR.: 19) und Ud (SEQ ID NR.: 20) sind die Stromaufwärts- bzw. Stromabwärts-Primer für Sequenzen von Bisulfit-behandelter unmethylierter DNA. Mup (SEQ ID NR.: 21) und Md (SEQ ID NR.: 22) sind die Stromaufwärts- bzw. Stromabwärts-Primer für Sequenzen von Bisulfit-behandelter methylierter DNA. Wup (SEQ ID NR.: 23) und Wd (SEQ ID NR.: 24) sind die Stromaufwärts- bzw. Stromabwärts-Primer für DNA, welche nicht mit Bisulfit behandelt wurde. Einer der zwei Primer in jedem Set besitzt eine Haarnadelstruktur an seinem 5'-Ende, die mit einem FAM/DAB(DABCYL)-FRET-Paar an den gezeigten Positionen markiert ist.
Die 27 zeigt ein Beispiel der Struktur eines Haarnadelprimers, BSK38, (SEQ ID NR.: 26), welcher in der in situ-PCR einer viralen gag-Sequenz verwendet werden kann, beschrieben in Abschnitt 17, Beispiel 11.
Die 28A–B zeigen die sichtbare Fluoreszenz von PCR-Produkten, welche mit einem universellen Haarnadel-Primer, beschrieben in Abschnitt 14, Beispiel 8, synthetisiert wurden. Klonierte PSA-cDNA (A; obere Reihe) und genomische Chlamydia-DNA (B; untere Reihe) wurden als ein Ziel verwendet. Spalte (1): vollständige Reaktionsmischung. Spalte (2): Kontrolle 1, Reaktionsmischung ohne getailten Primer. Spalte (3): Kontrolle 2, Reaktionsmischung ohne DNA-Matrize.
Die 29A–B zeigen einen TRAP-Assay ("telomeric repeat amplification protocol"), welcher PCR anwendet und Zellen oder Gewebe von Interesse auf Telomeraseaktivität testet. In der 29A (Schritt 1) fügt Telomerase eine Anzahl von telomeren Wiederholungseinheiten (GGTTAG) (längste Wiederholungseinheit wird gezeigt in der unteren Zeile, und ist die SEQ ID NR.: 27) am 3'-Ende eines Substrat-Oligonukleotids (SEQ ID NR.: 28) (TS: Telomerase-Substrat) an.
In der 29B (Schritt 2) werden die verlängerten Produkte mittels PCR unter Verwendung des TS und eines Rückwärts-Primers (RP) amplifiziert, wodurch eine Leiter von Produkten mit Zuwächsen von 6 Basen, beginnend bei 50 Nukleotiden, erzeugt wird: 50, 56, 62, 68 etc.
Die 30A zeigt die Sequenz des Haarnadel-Primers (SEQ ID NR.: 37), welcher in dem TRAP-Assay verwendet wurde, der in Beispiel 9, Abschnitt 15, beschrieben wird.
Die 30B zeigt die Ergebnisse aus einem TRAP-Assay, durchgeführt unter Verwendung von TS-Primer und einem Haarnadel-RP-Primer, der in der 30A gezeigten Sequenz. Assays wurden mit Zellextrakten durchgeführt, welche äquivalent zu 10000, 1000, 100 oder 10 Zellen waren. Drei Negativkontrollen wurden ebenfalls durchgeführt. Kein Taq: Es wurde keine Taq-Polymerase in die Reaktion zugegeben (Negativkontrolle 1). CHAPS: Es wurde CHAPS-Lysispuffer anstelle von Zellextrakt in der Reaktion verwendet (Negativkontrolle 2). +H: Zellextrakt aus 10000 Zellen wurde vor dem Assay hitzebehandelt (Negativkontrolle 3). 10: TRAP-Assay mit Zellextrakt aus 10 Zellen. 100: TRAP-Assay mit Zellextrakt aus 100 Zellen. 1000: TRAP-Assay mit Zellextrakt aus 1000 Zellen. 10000: TRAP-Assay mit Zellextrakt aus 10000 Zellen.
Die 31 zeigt diagrammartig eine Kaskaden-Rolling-Circle-Amplifikation (CRCA), welche im Abschnitt 5.2.6 beschrieben wird. Q: Quencher; F: Fluorophor.
Die 32 zeigt die Rolling-Circle-(Vorwärts)-Haarnadel-Primer 1 und 2 (SEQ ID NR.: 46 bzw. 47), die Rückwärts-Haarnadel-Primer 1 und 2 (SEQ ID NR.: 48 bzw. 49), Nicht-Haarnadel-Vorwärts-(Rolling-Circle)-Primer (SEQ ID NR.: 50), Nicht-Haarnadel-Rückwärts-Primer (SEQ ID NR.: 51), wie beschrieben im Abschnitt 19, Beispiel 13. Die zu der Sonde oder Rolling-Circle-Produkten komplementären Haarnadel-Primersequenzen sind unterstrichen. Nicht-Haarnadel-(d. h. linearer)Vorwärts-Primer (SEQ ID NR.: 50) besaß eine Sequenz, welche dem unterstrichenen Abschnitt der Vorwärts-(Rolling-Circle)-Haarnadel-Primer-Sequenzen 1 und 2 entsprach. Nicht-Haarnadel-Rückwärts-Primer (SEQ ID NR.: 52) besaß eine Sequenz, entsprechend dem unterstrichenen Abschnitt der Rückwärts-Haarnadel-Primer-Sequenzen 1 und 2. Abstandhalter-Sequenzen sind in Fettdruck gezeigt. Die Nukleotide, an welchen die zwei Komponenten eines MET-Paares angeheftet sind, sind mit Sternchen (*) markiert.
Ebenfalls in der 32 abgebildet wird ein Diagramm einer zirkularisierten Sonde für CRCA, welche eine zielspezifische Sequenz (5'-TGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCT-3') (SEQ ID NR.: 52) für pUC19 und eine (generische) Abstandhaltersequenz, welche eine Ligations-Verbindungsstelle einschließt, umfasst, wie beschrieben im Abschnitt 19, Beispiel 13. Eine zielspezifische Sequenz für ras (5'-GTTGGAGCTGGTGGCGTAG-3') (SEQ ID NR.: 53) ist ebenfalls abgebildet. Die ras-spezifische Sequenz wurde als eine zielspezifische Sequenz in einem zusätzlichen Experiment verwendet, welches im Abschnitt 19, Beispiel 13 beschrieben ist. nucl: Nukleotidzahl. bp: Basenpaare. T*: T-Nukleotid mit angehefteter DABCYL-Komponente. A*: A-Nukleotid mit angehefteter FAM-Komponente.
Die 33 zeigt die Ergebnisse einer Reihe von Kaskaden-Rolling-Circle-Amplifikationen (CRCAs) mit Haarnadelprimern, wie beschrieben in Abschnitt 19, Beispiel 13. Die Anzahl von Matrizen-Zirkeln bzw. -Ringen, d. h. unter Verwendung von pUC19 als Ziel hergestellter zirkularisierter Sonde, welche in jeder Reaktion verwendet wird, ist auf der X-Achse angegeben. MET-Signale, wie gemessen in Fluoreszenzeinheiten (Y-Achse), wurden durch fluorometrische Analyse der Signalhöhen in CRCAs (plus Ligase) relativ zu Hintergrundspiegeln in Kontrollreaktionen (minus Ligase) nachgewiesen. -☐-: minus Ligase; -Δ-: plus Ligase.
Die 34 zeigt gag-positive Zellen in Lymphknotengewebe aus einem Patienten mit früher HIV-1-Infektion nach Durchführen einer in situ-PCR unter Verwendung eines linearen Primers und eines FRET-markierten Haarnadelprimers der Erfindung, wie beschrieben im Abschnitt 18, Beispiel 12.
Die 35 zeigt die gleiche Ansicht der Gewebeprobe wie in 34 bei einer höheren Vergrößerung. Die gag-positiven Zellen zeigen ein starkes Signal, und es besteht ein geringer Hintergrund in der Präparation.
Die 36 zeigt eine Gewebeprobe, welche als eine Negativkontrolle diente, in welcher Taq-Polymerase aus dem Amplifikations-Cocktail weggelassen wurde, wie beschrieben im Abschnitt 18, Beispiel 12.
Die 37 zeigt Lymphknotengewebe aus einem mit HIV-1 infizierten Patienten nach Durchführung einer in situ-PCR unter Verwendung eines linearen Primers und eines FRET-markierten Haarnadel-Primers, wie beschrieben im Abschnitt 18, Beispiel 12. Allerdings ist das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis geringer als in den 34 und 35; es besteht ein Signal in manchen Zellen, aber der cytoplasmatische Hintergrund in anderen beruht auf einem unzureichenden Waschen nach der PCR.
Die 38 zeigt ein HIV-1-positives Neuron im Zerebrum eines Patienten, der an AIDS-Demenz verstarb, nach Durchführen einer in situ-PCR unter Verwendung eines linearen Primers und eines FRET-markierten Haarnadel-Primers, wie beschrieben in Abschnitt 18, Beispiel 12. Man bemerke das gute Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis.
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonukleotide für die Amplifikation von Nukleinsäuren, welche detektierbar mit molekularen Energietransfer(MET)-Markierungen markiert sind. Ein oder mehrere Oligonukleotide der Erfindung, enthaltend eine Donor- und/oder Akzeptorkomponente eines MET-Paares, werden in das amplifizierte Produkt einer Amplifikations-Reaktion so eingebaut, dass das amplifizierte Produkt sowohl eine Donor- als auch eine Akzeptorkomponente eines MET-Paares enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zum Detektieren der Produkte von Nukleinsäure-Amplifikation unter Verwendung dieser markierten Oligonukleotide der Erfindung. Sie betrifft ferner ein rasches, empfindliches und zuverlässiges Verfahren zum Detektieren von Amplifikationsprodukten, welches im großen Maße die Möglichkeit einer Übertragskontamination mit Amplifikationsprodukten verringert und welches an viele Methoden für die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen anpassbar ist, einschließlich Polymerasekettenreaktion (PCR), Triamplifikation und anderen Amplifikations-Systemen.
Die Nukleinsäureamplifizierungs-Oligonukleotide der Erfindung verwenden das Prinzip des MET zwischen einer Donorkomponente und einer Akzeptorkomponente. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem MET um einen Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET), in welchem die Oligonukleotide mit Donor- und Akzeptorkomponenten markiert sind, wobei die Donorkomponente ein Fluorophor ist und die Akzeptorkomponente ein Fluorophor sein kann, so dass von der Donorkomponente emittierte Fluoreszenzenergie von der Akzeptorkomponente absorbiert wird.
Der Amplifikations-Primer ist ein Haarnadel-Primer, welcher sowohl Donor- als auch Akzeptorkomponenten enthält, und so konfiguriert ist, dass die Akzeptorkomponente die Fluoreszenz des Donors ablöscht. Wenn der Primer in das Amplifikationsprodukt eingebaut wird, verändert sich seine Konfiguration, das Löschen wird eliminiert, und die Fluoreszenz der Donorkomponente kann detektiert werden.
Die vorliegende Erfindung sieht Nukleinsäure-Amplifikationsprimer vor, welche eine Haarnadelstruktur ausbilden, in welcher MET auftreten wird, wenn der Primer nicht in das Amplifikationsprodukt eingebaut ist. Somit bildet ein Primer der Erfindung eine Haarnadelstruktur aus, in welcher die Energie eines Donor-Fluorophors durch ein nicht-fluoreszierendes Fluorophor gelöscht wird, wenn der Primer nicht in das Amplifikationsprodukt eingebaut ist.
Die Erfindung sieht ein Verfahren zum Detektieren oder Messen eines Produkts einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion vor, welches Folgendes umfasst: (a) Kontaktieren einer Probe, umfassend Nukleinsäuren, mit mindestens zwei Oligonukleotid-Primern, wobei die Oligonukleotid-Primer zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion angepasst sind, so dass die Primer in ein amplifiziertes Produkt der Amplifikationsreaktion eingebaut werden, wenn eine vorgewählte Zielsequenz in der Probe vorhanden ist; wobei mindestens einer der Primer ein Haarnadel-Primer der Erfindung ist; (b) Durchführen der Amplifikations-Reaktion; (c) Stimulieren der Lichtemission von der Donorkomponente und (d) Detektieren oder Messen der Energie, welche von der Donorkomponente oder Akzeptorkomponente emittiert wird.
Die Nukleinsäuren in der Probe können gereinigt oder ungereinigt sein.
In einer spezifischen Ausführungsform werden die Oligonukleotide der Erfindung in in situ-Amplifikationsreaktionen verwendet, welche an Proben von frischen oder konservierten Geweben oder Zellen durchgeführt werden. In in situ-Reaktionen, ist es vorteilhaft, Verfahren anzuwenden, welche die genaue und empfindliche Detektion des Ziels direkt nach dem Amplifikationsschritt gestatten. Im Gegensatz dazu erfordert eine herkömmliche in situ-PCR, in Paraffin-eingebettetem Gewebe, eine Detektion durch einen Hybridisierungsschritt, weil der DNA-Reparaturmechanismus, welcher unveränderlich in Gewebeproben z. B. aus dem ZNS, Lymphknoten und der Milz vorhanden ist, eine Detektion durch direkten Einbau eines Reporter-Nukleotids während des PCR-Schritts ausschließt. Typischerweise wird, wenn herkömmliche lineare Primer, welche mit Biotin- oder Digoxigenin-Resten markiert sind, in einer in situ-PCR verwendet werden, wenig oder gar keine nachweisbare Markierung während der Amplifikation eingebaut, welche Annealing- und Verlängerungsschritte umfasst. Weiterhin werden, wenn die Amplifikations-Reaktionsbedingungen modifiziert werden, um den Einbau von mit solchen Resten markierten Nukleotiden zu verstärken, unannehmbar hohe Hintergrunds- und falsche Positiv-Ergebnisse erhalten. Dies kann der Aktivität von endogenen DNA-Reparaturenzymen zugeschrieben werden, welche die markierten Nukleotide in genickte DNA in der Probe einbauen. Von anderer Seite wurde versucht, andere Typen von einfach markierten PCR-Primern zu verwenden (Nuovo, 1997, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, 3. Ausgabe, Lippincott-Raven Press, New York), wobei man aber nicht in der Lage gewesen war, eine angemessene Empfindlichkeit zu erzielen, was zu falschen nega tiven Ergebnissen führen kann. Die Anforderungen für einen Hybridisierungsschritt, an welchen sich ein Waschschritt anschließt, fügen herkömmlichen in situ-PCR-Protokollen zusätzlich Zeit und Aufwand hinzu. Es ist deshalb vorteilhaft, Verfahren anzuwenden, welche die akkurate und empfindliche Detektion des Ziels direkt nach dem Amplifikationsschritt gestatten. Derartige Verfahren werden von der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
Die von der Donorkomponente emittierte Energie, welche nach Ausführung einer Amplifikationsreaktion der Erfindung detektiert und gemessen wird, korreliert mit der Menge der vorgewählten Zielsequenz, die ursprünglich in der Probe vorhanden war, wodurch die Bestimmung der Menge der vorgewählten Zielsequenz, welche in der Ursprungsprobe vorhanden ist, ermöglicht wird. Somit können die Verfahren der Erfindung in quantitativer Weise angewandt werden, um die Anzahl von Chromosomen oder die Menge an DNA oder RNA, welche die vorgewählte Zielsequenz enthält, zu bestimmen.
Ein Paar von Primern, bestehend aus einem Vorwärts-Primer und einem Rückwärts-Primer, zur Verwendung in einer PCR- oder Strangverdrängungs-Amplifikation, besteht aus Primern, welche jeweils komplementär zu einem unterschiedlichen Strang von zwei komplementären Nukleinsäuresträngen sind, so dass, wenn ein Verlängerungsprodukt von einem Primer in der Richtung des anderen Primers durch eine Nukleinsäure-Polymerase erzeugt wird, dieses Verlängerungsprodukt als eine Matrize für die Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers dienen kann. Ein Paar von Primern, bestehend aus einem Vorwärts-Primer und einem Rückwärts-Primer, zur Verwendung in einer Triamplifikation, besteht aus Primern, welche jeweils mit einem unterschiedlichen Strang von zwei komplementären Nukleinsträngen komplementär sind, so dass, wenn ein Verlängerungs-Ligationsprodukt von einem Primer in der Richtung des anderen Primers durch eine Nukleinsäure-Polymerase und eine Nukleinsäure-Ligase erzeugt wird, dieses Verlängerungs-Ligationsprodukt als eine Matrize für die Synthese des Verlängerungs-Ligationsprodukts des anderen Primers dienen kann. Das amplifizierte Produkt in diesen Fällen besteht in jenem Inhalt einer Nukleinsäure in der Probe zwischen und einschließlich der Primersequenzen.
Wie hierin darauf Bezug genommen wird, können Nukleinsäuren, welche "komplementär" sind, perfekt oder unperfekt komplementär sein, solange die gewünschte Eigenschaft, welche aus der Komplementarität resultiert, nicht verloren geht, z. B. das Vermögen, zu hybridisieren.
Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren oder Messen eines Produkts einer Nukleinsäureamplifizierungsreaktion bereit, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Probe, die Nukleinsäuren umfasst, mit mindestens zwei Oligonukleotid-Primern, wobei die Oligonukleotid-Primer für eine Anwendung in der Amplifizierungsreaktion angepasst sind, so dass die Primer in ein amplifiziertes Produkt der Amplifizierungsreaktion eingebaut werden, wenn eine vorgewählte Zielsequenz in der Probe vorliegt; wobei mindestens einer der Oligonukleotid-Primer ein Haarnadel-Primer der Erfindung ist, welcher mit einer Donorkomponente und einer Akzeptorkomponente markiert ist; (b) Durchführen der Amplifizierungsreaktion; (c) Stimulierung der Energieemission von der Donorkomponente; und (d) Detektieren oder Messen der Energie, die von der Donorkomponente emittiert wird.
Die vorliegende Erfindung sieht des Weiteren ein Verfahren zum direkten Detektieren von Amplifikationsprodukten vor. Diese verbesserte Technik erfüllt zwei Hauptanforderungen. Zum Ersten gestattet sie die Detektion des Amplifikationsprodukts ohne vorherige Trennung von nicht-eingebauten Oligonukleotiden. Zum Zweiten gestattet sie die Detektion des Amplifikationsprodukts in direkter Weise durch Einbauen der markierten Oligonukleotid(e) in das Produkt.
In einer weiteren Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die direkte Detektion von Amplifikationsprodukten vor, in welchem die Detektion ohne Öffnen des Reaktionsgefäßes durchgeführt werden kann. Diese Ausführungsform, das "Geschlossene-Gefäß"-Format, verringert in großem Maß die Möglichkeit von Übertragskontamination mit Amplifikationsprodukten, welche die Akzeptanz von PCR in vielen Anwendungen verzögert hat. Das Geschlossene-Gefäß-Verfahren sieht auch einen hohen Durchsatz von Proben vor und kann vollständig automatisiert werden. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Kits für die Detektion oder Messung von Nukleinsäureamplifikationsprodukten. Derartige Kits können diagnostische Kits sein, wobei die Gegenwart der amplifizierten Nukleinsäure mit der Gegenwart oder Abwesenheit einer Krankheit oder Störung in Korrelation gebracht wird.
Zur Klarheit der Beschreibung, und nicht auf dem Wege einer Einschränkung, wird die ausführliche Beschreibung der Erfindung in die nachstehend dargestellten Unterabschnitte eingeteilt.
5.1. OLIGONUKLEOTIDE
Die vorliegende Erfindung sieht Oligonukleotide für die Nukleinsäureamplifizierung vor, welche in das amplifizierte Produkt eingebaut werden und welche das Prinzip des molekularen Energietransfers (MET) und bevorzugt des Fluoreszenzresonanz-Energietransfers (FRET) verwenden. Die Oligonukleotide der Erfindung sind mit einer Donor- und/oder Akzeptorkomponente, d. h. einem "MET-Paar" markiert. Die Akzeptorkomponente kann die Emission der Donorkomponente einfach löschen oder kann selbst Energie nach Anregung durch Emission von der Donorkomponente emittieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Donorkomponente ein Fluorophor und die Akzeptorkomponente kann ein Fluorophor sein oder nicht, so dass die von der Donorkomponente emittierte Fluoreszenzenergie von der Akzeptorkomponente absorbiert wird. Die markierten Oligonukleotide sind Vorwärts- und/oder Rückwärts-Primer und/oder, im Falle von Triamplifikation, ein Blocking-Oligonukleotid. Die in der Amplifizierungsreaktion verwendeten Oligonukleotide sind markiert, so dass mindestens ein MET-Paar in das amplifizierte Produkt eingebaut wird (obwohl 5'-3'-Exonuklease-Aktivität, falls vorhanden, anschließend eine Komponente von mindestens einem gewissen Anteil der amplifizierten Produkt-Population entfernen kann).
Die Akzeptorkomponente ist ein Quencher, welcher die Fluoreszenz des Donors löscht, wenn die Donor- und Akzeptorkomponenten nah genug in das Amplifizierungsprodukt eingebaut werden, damit ein MET stattfindet.
Ein Oligonukleotid-Primer wird verwendet, welcher eine Haarnadel-Struktur ausbildet, in welcher FRET auftreten wird, wenn der Primer nicht in das Amplifizierungsprodukt eingebaut wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Haarnadel-Primer mit einem Donor-Quencher-FRET-Paar markiert. Wenn der Haarnadelprimer in das Amplifizierungsprodukt eingebaut wird, verändert sich dessen Konfiguration (d. h., er wird linearisiert), das Löschen wird eliminiert, und die Fluoreszenz des Donors kann detektiert werden.
Die Oligonukleotide zur Verwendung in den Amplifizierungsreaktionen der Erfindung können von jeder geeigneten Größe sein und liegen vorzugsweise im Bereich von 10–100 oder 10–80 Nukleotiden, weiter bevorzugt 20–40 Nukleotiden.
Bei dem Oligonukleotid kann es sich um DNA oder RNA oder chimere Mischungen oder Derivate oder modifizierte Versionen davon handeln, solange es noch in der Lage ist, die gewünschte Amplifizierungsreaktion zu primen, oder, im Falle eines Blocking-Oligonukleotids, als ein Blocking-Oligonukleotid zu fungieren. Zusätzlich dazu, dass es mit einer MET-Komponente markiert ist, kann das Oligonukleotid an dem Basenrest, Zuckerrest oder Phosphat-Grundgerüst modifiziert sein und kann andere anhängige Gruppen oder Markierungen einschließen, solange es noch in der Lage ist, die gewünschte Amplifikationsreaktion zu primen oder als ein Blocking-Oligonukleotid zu fungieren, je nachdem, wie es der Fall sein mag.
Zum Beispiel kann das Oligonukleotid mindestens einen modifizierten Basenrest umfassen, welcher gewählt wird aus der Gruppe, die, ohne darauf eingeschränkt zu sein, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethyl aminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin einschließt.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid mindestens einen modifizierten Zuckerrest, gewählt aus der Gruppe, welche, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose einschließt.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid mindestens ein modifiziertes Phosphat-Grundgerüst, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphorthioat, einem Phosphordithioat, einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phosphordiamidat, einem Methylphosphonat, einem Alkylphosphotriester und einem Formacetal oder Analog davon.
Oligonukleotide der Erfindung können durch im Fachgebiet bekannte Standardverfahren synthetisiert werden, z. B. durch Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers (wie sie kommerziell von Biosearch, Applied Biosystems, etc. erhältlich sind). Als Beispiele können Phosphorthioat-Oligonukleotide mittels der Methode von Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209) synthetisiert werden, und Methylphosphonat-Oligonukleotide können durch die Verwendung von Glaspolymer-Trägern mit kontrollierten Poren hergestellt werden (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7448–7451) etc.
Die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung können durch im Fachgebiet bekannte Standardverfahren abgeleitet werden, z. B. durch die "de novo" chemische Synthese von Polynukleotiden unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers (wie er kommerziell von Biosearch, Applied Biosystems, etc. erhältlich ist) und standardmäßiger Phosphoramidit-Chemie; oder durch Spaltung eines größeren Nukleinsäurefragments unter Verwendung von nicht-spezifischen Nukleinsäure-spaltenden Chemikalien oder Enzymen oder ortsspezifischen Restriktionsendonukleasen.
Ein zu bevorzugendes Verfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotiden wird unter Anwendung eines automatischen DNA-Synthesizers durch im Fachgebiet bekannte Verfahren durchgeführt. Als Beispiele können Phosphorthioat-Oligonukleotide mittels des Verfahrens von Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209–3221) synthetisiert werden, Methylphosphonat-Oligonukleotide können durch Verwendung von Glas-Polymer-Trägern mit kontrollierten Poren (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7448–7451) hergestellt werden, etc. Sobald das gewünschte Oligonukleotid synthetisiert ist, wird es von dem festen Träger abgespalten, auf welchem es synthetisiert worden war, und mittels im Fachgebiet bekannten Verfahren behandelt, um jedwede vorhandenen Schutzgruppen zu entfernen. Das Oligonukleotid kann dann durch jegliches im Fachgebiet bekannte Verfahren, einschließlich Extraktion und Gel-Reinigung, gereinigt werden. Die Konzentration und Reinheit des Oligonukleotids können durch Untersuchen des Oligonukleotids, welches auf einem Acrylamidgel getrennt worden ist, oder durch Messen der optischen Dichte bei 260 nm in einem Spektrophotometer bestimmt werden.
Oligonukleotide der Erfindung können mit Donor- und Akzeptorkomponenten während der chemischen Synthese markiert werden, oder die Markierung kann nach der Synthese durch im Fachgebiet bekannte Verfahren angeheftet werden. In einer spezifischen Ausführungsform werden die folgenden Donor- und Akzeptor-MET-Paare verwendet: ein lumineszentes Lanthanidchelat, z. B. Terbiumchelat oder Lanthanidchelat, wird als der Donor verwendet, und ein organischer Farbstoff, wie Fluorescein, Rhodamin oder CY-5, wird als der Akzeptor verwendet. Vorzugsweise wird Terbium als ein Donor und Fluorescein oder Rhodamin als ein Akzeptor verwendet, oder Europium wird als ein Donor verwendet und CY-5 als ein Akzeptor. In einer anderen spezifischen Ausführungsform ist der Donor fluoreszent, z. B. Fluorescein, Rhodamin oder CY-5, und der Akzeptor ist lumineszent, z. B. ein Lanthanidchelat. In noch einer anderen Ausführungsform ist der Energie-Donor lumineszent, z. B. ein Lanthanidchelat, und der Energie-Akzeptor kann nicht-fluoreszierend sein. Ein Energietransfer führt zu einer Verringerung der Emission des Donors.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform ist die Donorkomponente ein Fluorophor. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform sind sowohl Donor- als auch Akzeptorkomponenten Fluorophore. Geeignete Komponenten, welche als Donor oder Akzeptoren in FRET-Paaren gewählt werden können, sind in der Tabelle 1 dargestellt.
Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet kann ohne Weiteres unter Anwendung von fachbekannten Techniken der Spektrophotometrie bestimmen, welche Fluorophore geeignete Donor-Akzeptor-FRET-Paare bilden werden. Zum Beispiel ist FAM (welches ein Emissionsmaximum von 525 nm aufweist) ein geeigneter Donor für TAMRA, ROX und R6G (welche alle ein Anregungsmaximum von 514 nm aufweisen) in einem FRET-Paar. Primer werden vorzugsweise während der Synthese modifiziert, so dass eine modifizierte T-Base in eine vorgesehene Position durch die Verwendung von Amino-Modifizierer C6 dT (Glen Research) eingeführt wird, und eine primäre Aminogruppe auf der modifizierten T-Base eingebaut wird, wie beschrieben von Ju et al. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4347–4351). Diese Mo difikationen können für den anschließenden Einbau von fluoreszierenden Farbstoffen in vorgesehene Positionen der Oligonukleotide verwendet werden.
Der optimale Abstand zwischen den Donor- und Akzeptorkomponenten wird diejenige Distanz sein, bei welcher die Emissionen der Donorkomponente von der Akzeptorkomponente absorbiert werden. Diese optimale Distanz variiert mit den verwendeten spezifischen Komponenten und kann vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ohne Weiteres unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken bestimmt werden. Für einen Energietransfer, bei welchem es gewünscht wird, dass die Akzeptorkomponente ein Fluorophor ist, welches zu detektierende Energie emittiert, werden die Donor- und Akzeptor-Fluorophore bevorzugt von einer Distanz von bis zu 30 Nukleotiden, weiter bevorzugt von 3–20 Nukleotiden und noch weiter bevorzugt von 6–12 Nukleotiden getrennt. Für einen Energietransfer, bei welchem es gewünscht wird, dass die Akzeptorkomponente die Emissionen des Donors löscht, werden die Donor- und Akzeptorkomponenten vorzugsweise durch eine Distanz von weniger als einem Nukleotid getrennt (z. B. auf dem entgegenliegenden Strang, komplementäre Nukleotide einer Duplexstruktur), obwohl auch eine Distanz von 5 Nukleotiden (eine helikale Windung) für die Verwendung vorteilhaft ist.
In noch einer anderen Ausführungsform können die Oligonukleotide ferner mit jedwedem sonstigem im Fachgebiet bekannten detektierbaren Marker markiert sein, einschließlich radioaktiven Markierungen wie ³²P, ³⁵S, ³H und dergleichen oder mit enzymatischen Markern, welche detektierbare Signale erzeugen, wenn eine jeweilige chemische Reaktion durchgeführt wird, wie alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase. Derartige enzymatische Marker sind vorzugsweise wärmestabil, so dass sie die Denaturierungsschritte des Amplifizierungsverfahrens überleben.
Oligonukleotide können auch indirekt durch Einbauen eines Nukleotids markiert werden, welches an ein Hapten oder ein Molekül, wie Biotin, an welches ein markiertes Avidinmolekül gebunden werden kann, oder Digoxygenin, an welches ein markierter Anti-Digoxygenin-Antikörper gebunden werden kann, kovalent verknüpft ist. Oligonukleotide können während der chemischen Synthese ergänzend markiert werden, oder die Ergänzungsmarkierung kann nach der Synthese durch im Fachgebiet bekannte Verfahren angeheftet werden.
Die Oligonukleotide der Erfindung finden Anwendung in Nukleinsäureamplifikationsreaktionen, als Primer, zur Detektion oder Messung eines Nukleinsäureprodukts der Amplifikation, wodurch eine Zielnukleinsäure in einer Probe detektiert oder gemessen wird, welche komplementär zu einer 3'-Primer-Sequenz ist. Folglich können die Oligonukleotide der Erfindung in Diagnose-Verfahren eingesetzt werden, worin eine 3'-Primersequenz komplementär zu einer Sequenz (z. B. genomisch) eines infektiösen Krankheitsagens ist, z. B. einer humanen Krankheit, einschließlich, aber ohne darauf eingeschränkt zu sein, Viren, Bakterien, Parasiten und Pilzen, wodurch das Vorhandensein des infektiösen Agens in einer Probe von Nukleinsäure aus einem Patienten diagnostiziert wird. Die Ziel-Nukleinsäure kann genomisch oder cDNA oder mRNA oder synthetisch, menschlich oder tierisch oder von einem Mikroorganismus etc. sein. In einer anderen Ausführungsform, welche in der Diagnose oder Prognose einer Krankheit oder Störung verwendet werden kann, ist die Zielsequenz eine humane genomische Wildtyp- oder RNA- oder cDNA-Sequenz, deren Mutation in Gegenwart einer humanen Krankheit oder Störung impliziert wird, oder kann alternativ dazu die mutierte Sequenz sein. In einer derartigen Ausführungsform kann die Amplifikationsreaktion gegebenenfalls für die gleiche Probe mit unterschiedlichen Sätzen an Primern wiederholt werden, welche, jeweilig, die Wildtyp-Sequenz oder die mutierte Version amplifizieren. Als Beispiel kann die Mutation eine Insertion, Substitution und/oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden oder eine Translokation sein.
HAARNADEL-PRIMER
Die vorliegende Erfindung sieht Oligonukleotid-Primer vor, welche eine Haarnadelstruktur ausbilden, in welcher ein MET auftreten wird, wenn der Primer nicht in das Amplifikationsprodukt eingebaut ist.
Folglich sieht die Erfindung insbesondere vor:
ein Oligonukleotid, umfassend die folgenden benachbarten Sequenzen in 5'- zu 3'-Reihenfolge:

(a) eine erste Nukleotidsequenz mit 6 bis 30 Nukleotiden, wobei ein Nukleotid innerhalb dieser ersten Nukleotidsequenz mit einer ersten Komponente, ausgewählt aus einer Donorkomponente und einer Akzeptorkomponente eines molekularen Energietransfer-Paares, markiert ist, wobei die Donorkomponente Fluoreszenz bei einer oder mehreren bestimmten Wellenlängen emittiert, wenn sie angeregt ist, und die Akzeptorkomponente diese Fluoreszenz, die von der Donorkomponente emittiert wird, absorbiert und löscht,
(b) eine zweite einzelsträngige Nukleotidsequenz mit 3–20 Nukleotiden,
(c) eine dritte Nukleotidsequenz mit 6–30 Nukleotiden, wobei ein Nukleotid innerhalb dieser dritten Nukleotidsequenz mit einer zweiten Komponente, ausgewählt aus der Donorkomponente und der Akzeptorkomponente, markiert ist und diese zweite Komponente ein Mitglied dieser Gruppe, welches nicht die erste Nukleotidsequenz markiert, darstellt, wobei die dritte Nukleotidsequenz in umgekehrter Reihenfolge zur ersten Nukleotidsequenz komplementär ist, so dass sich ein Duplex zwischen der ersten Nukleotidsequenz und der dritten Nukleotidsequenz bilden kann, so dass die erste und zweite Komponente in Nähe sind, so dass, wenn die Donorkomponente angeregt ist und Fluoreszenz emittiert, die Akzeptorkomponente die Fluoreszenz, die von der Donorkomponente emittiert wird, absorbiert und löscht; und
(d) am 3'-Ende des Oligonukleotids eine vierte einzelsträngige Nukleotidsequenz mit 8 bis 40 Nukleotiden, die an ihrem 3'-Ende eine Sequenz umfasst, die zu einer vorgewählten Zielsequenz komplementär ist und fähig ist, die Synthese einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einem Nukleinsäurestrang, der die Zielsequenz umfasst, durch eine Nukleinsäurepolymerase zu primen;

In einer spezifischen Ausführungsform, worin die Donor- und Akzeptorkomponenten ein FRET-Paar sind, wird eine Trennung der ersten und zweiten Komponente durch einen Abstand, welcher FRET verhindert, durch das Versagen der zweiten Komponente, die Fluoreszenz der ersten Komponente zu löschen (wenn die zweite Komponente ein Quencher ist) oder das Versagen der zweiten Komponente die Fluoreszenz der ersten Komponente zu absorbieren und dann selbst zu fluoreszieren (wenn die zweite Komponente ein Fluorophor ist) beobachtet.
In einer spezifischen Ausführungsform enthält die zweite Nukleotidsequenz (die Schleifen-Struktur) und/oder die erste Nukleotidsequenz (von dem Duplex) und/oder dritte Nukleotidsequenz (von dem Duplex) keine Sequenz, die komplementär zur Zielsequenz ist. Alternativ dazu kann die zweite Nukleotidsequenz und/oder die erste Nukleotidsequenz und/oder die dritte Nukleotidsequenz oder jedweder Abschnitt der vorgenannten Sequenzen auch eine zur Zielsequenz komplementäre Sequenz enthalten.
Somit bildet ein Primer der Erfindung eine Haarnadelstruktur, in welcher die Energie eines Donor-Fluorophors durch eine nicht-fluoreszierende Akzeptorkomponente gelöscht wird, wenn der Primer nicht in das Amplifikationsprodukt eingebaut ist. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet kann leicht, aus den bekannten Strukturen und Hydrophobizitäten eines gegebenen FRET-Paares, die sterische Anordnung bestimmen, welche das Paar für einen MET in die engste Nähe bringen wird.
Der Haarnadel-Primer umfasst vier Teile (1): Teil (d) ist eine 3'-terminale Sequenz und umfasst eine zur Zielsequenz komplementäre Sequenz; er ist ein Primer für DNA-Polymerase. Teil (c) ist eine erste Stammsequenz auf dem 5'-Ende der Primer-Sequenz. Teil (b) bildet eine einzelsträngige Schleife von Nukleotiden. Teil (a) ist eine zweite Stamm-Sequenz, welche komplementär zur ersten Stammsequenz ist. Die Teile (a), (b) und (c) oder Abschnitte davon können zu der Ziel-DNA, welche amplifiziert werden soll, komplementär sein, oder nicht. Teil (d) ist vorzugsweise 8–30 Nukleotide lang; Teil (c) ist vorzugsweise 6–30 Nukleotide lang; Teil (b) ist vorzugsweise 3–20 Nukleotide lang und am stärksten bevorzugt 4–6 Nukleotide lang.
Die erste Stammsequenz, Teil (c), enthält das Donor-Fluorophor, und die zweite Stammsequenz, Teil (a), enthält den Quencher, oder es kann umgekehrt sein. In einem nicht-inkorporierten Haarnadel-Primer wird die Emission des Donors auf den Akzeptor transferiert, da die zwei Komponenten zueinander in enger Nähe sein werden, wenn die zwei Stammsequenzen im Duplex vorliegen.
Die Donor- und Akzeptorkomponenten können entweder auf terminalen Nukleotiden des Haarnadelstammes (Duplex-Region) lokalisiert sein oder intern lokalisiert sein. Somit sind, in einer Ausführungsform der Erfindung, die Donor- und Quencher-Komponenten jeweils auf dem 5'-Ende der Haarnadel-Primersequenz, welches komplementär zu dem Ziel ist, und auf dem komplementären Nukleotidrest auf dem Haarnadelstamm lokalisiert (1), oder umgekehrt. Jede Komponente kann alternativ auf einem Nukleotid lokalisiert sein, welches innerhalb einer komplementären Stamm-Sequenz intern liegt. Alternativ dazu kann eine der Komponenten auf einem internen Nukleotid lokalisiert sein, und die andere auf dem terminalen Nukleotid am 5'-Ende. Eine oder beide der Komponenten können alternativ dazu an dem anderen Ende der Duplex-Region lokalisiert sein.
Vorzugsweise sind Donor- und Akzeptorkomponenten an den komplementären Strängen des Stamms angeheftet, eine Komponente am 5'-Ende und die andere Komponente 5 bp entfernt auf dem komplementären Strang. Zum Beispiel können die zwei Komponenten um eine 5'-bp-Windung (180°) der Doppelhelix, welche von den zwei komplementären Strängen des Stamms gebildet wird, versetzt sein und werden deshalb sterisch in der engsten Nähe sein, und die Emission des Donors wird auf den Akzeptor transferiert und von diesem gelöscht werden.
Alternativ dazu können die zwei Komponenten auf komplementären Strängen des Stamms vorliegen, welche von einem Abstand von weniger als 1 Nukleotid (3,4 Å) getrennt sind, wenn die Haarnadel in der geschlossenen Konfiguration vorliegt. Am stärksten bevorzugt sind die zwei Komponenten auf komplementären Nukleotiden auf dem Stamm, direkt einander gegenüberliegend, wenn die Haarnadel in der geschlossenen Konfiguration vorliegt.
Wenn ein Haarnadel-Primer linearisiert wird, muss die Donorkomponente von der Quencher-Komponente durch eine dazwischenliegende Sequenz getrennt sein, welche lang genug ist, um MET im Wesentlichen zu verhindern. Wo ein FRET-Paar verwendet wird, welches aus Donor- und Akzeptor-Fluorophoren besteht, werden die zwei FRET-Komponenten durch eine dazwischenliegende Sequenz getrennt, umfassend (a) mindestens einen Abschnitt der ersten Stammsequenz, (b) die Schleife und (c) mindestens einen Abschnitt der zweiten Stammsequenz; wobei die dazwischenliegende Sequenz vorzugsweise 15–25 Nukleotide Länge und weiter bevorzugt 20 Nukleotide Länge aufweist.
Die Akzeptorkomponente ist ein Quencher und absorbiert die von dem Donor emittierte Energie ohne zu fluoreszieren. Die Fluoreszenz des Donors kann nur detektiert werden, wenn der Primer in dem linearisierten offenen Zustand vorliegt, d. h. in ein doppelsträngiges Amplifikationsprodukt eingebaut ist. Der Energietransfer in diesem Zustand wird minimal sein, und das starke Emissionssignal von dem Donor wird detektiert werden.
Ein kritischer Aspekt der Erfindung besteht darin, dass der Übergang von dem geschlossenen zu dem offenen Zustand nur während der Amplifikation stattfindet. Die 2 und 3 veranschaulichen schematisch die Verwendung der Haarnadel-Primer der vorliegenden Erfindung in der PCR. In 2 fehlt der in der PCR verwendeten DNA-Polymerase 5'-3'-Exonuklease-Aktivität, wohingegen sie in der 3 eine 5'-3'-Aktivität besitzt. Für PCR können entweder einer oder beide PCR-Primer ein Haarnadel-Primer sein.
In den 2 und 3 sind (a) und (b) zwei komplementäre Stränge der zu amplifizierenden Zielsequenz, und "R" und "F" sind die Rückwärts- bzw. Vorwärts-Primer für die PCR-Amplifikation. Als Beispiel und nicht zur Einschränkung ist der Rückwärts-Haarnadel-Primer so entworfen, dass in ihm ein Donor-Fluorophor und Quencher inkorporiert sind. Bei Rückwärts-Haarnadel-Primer, welcher nicht in das PCR-Produkt eingebaut ist, werden das Fluorophor und der Quencher in enger Nachbarschaft vorliegen; somit wird die Fluoreszenz aus dem freien Rückwärts-Primer abgelöscht werden; siehe untenstehenden Abschnitt 5.2.1 für Verfahren zur Anwendung von Haarnadelprimern in einer PCR.
UNIVERSELLE HAARNADELN UND HAARNADELPRIMER
In einer Ausführungsform kann das Oligonukleotid der Erfindung unter Verwendung einer "universellen" Haarnadel erhalten werden, welche entweder chemisch (z. B. unter Verwendung von Cyanogenbromid) oder enzymatisch (z. B. unter Verwendung von Ligase) an eine beliebige gewählte Primersequenz ligiert und verwendet werden kann, um eine Ziel-Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren, welche das Komplement der Primersequenz enthält. Die Erfindung betrifft daher eine "universelle" Haarnadel, welche ein Oligonukleotid ist, dessen Nukleotidsequenz aus den folgenden benachbarten Sequenzen in 5'- zu 3'-Reihenfolge besteht:

(a) einer ersten einzelsträngigen Nukleotidsequenz mit 1 bis 10 Nukleotiden;
(b) einer zweiten Nukleotidsequenz mit 2 bis 30 Nukleotiden, wobei ein Nukleotid innerhalb der ersten Nukleotidsequenz oder der zweiten Nukleotidsequenz mit einer ersten Komponente, ausgewählt aus einer Donorkomponente und einer Akzeptorkomponente eines molekularen Energietransfer-Paares, markiert ist, wobei die Donorkomponente Fluoreszenz bei einer oder mehreren bestimmten Wellenlängen emittiert, wenn sie angeregt ist, und die Akzeptorkomponente diese Fluoreszenz, die von der Donorkomponente emittiert wird, absorbiert und löscht;
(c) einer dritten einzelsträngigen Nukleotidsequenz mit 3 bis 20 Nukleotiden; und
(d) einer vierten Nukleotidsequenz mit 2 bis 30 Nukleotiden, wobei ein Nukleotid innerhalb dieser vierten Nukleotidsequenz mit einer zweiten Komponente markiert ist, ausgewählt aus der Donorkomponente und der Akzeptorkomponente, und wobei diese zweite Komponente ein Mitglied der Gruppe, welches nicht die erste oder zweite Nukleotidsequenz markiert, darstellt, wobei die vierte Nukleotidsequenz in umgekehrter Reihenfolge zu der zweiten Nukleotidsequenz komplementär ist, so dass sich ein Duplex zwischen der zweiten Nukleotidsequenz und der vierten Nukleotidsequenz bilden kann, so dass die erste Komponente und die zweite Komponente in Nähe sind, so dass, wenn die Donorkomponente angeregt ist und Energie emittiert, die Akzeptorkomponente die Fluoreszenz, die von der Donorkomponente emittiert wird, absorbiert und löscht.

Ein Beispiel einer Universal-Haarnadel ist in der 4 gezeigt. Die universelle Haarnadel der Erfindung umfasst eine erste Stammsequenz am 3'-Ende (2–30 Nukleotide lang, vor zugsweise 4–6 Nukleotide lang), eine Schleife (3–20 Nukleotide lang, vorzugsweise 4–6 Nukleotide lang), eine zweite Stammsequenz, welche im Wesentlichen komplementär zu der ersten Stammsequenz ist (2–30 Nukleotide lang, vorzugsweise 4–6 Nukleotide lang) und eine 5'-gelegene einzelsträngige kohäsive ("klebrige") Endsequenz (z. B. 1–10 Nukleotide lang, vorzugsweise 3–4 Nukleotide lang). In einer spezifischen Ausführungsform handelt es sich bei der "klebrigen" Endsequenz um 5'GGC-3'.
Ausgewählte Primersequenzen, welche komplementär zu einer Ziel-DNA-Sequenz sind und welche geeignet für eine Ligation an die universelle Haarnadel sind, können durch im Fachgebiet bekannte Standardverfahren abgeleitet werden, z. B. chemische de novo Synthese von Polynukleotiden unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers und standardmäßiger Phosphoramidit-Chemie; oder durch Spaltung eines größeren Nukleinsäurefragments unter Verwendung nicht-spezifischer Nukleinsäure-spaltender Chemikalien oder Enzyme oder ortsspezifischer Restriktionsendonukleasen.
Um eine universelle Haarnadel an die gewählte Primersequenz zu verknüpfen, sollte die gewählte Primersequenz eine kohäsive Sequenz am 5'-Ende enthalten, welche im Wesentlichen komplementär zu der kohäsiven Sequenz der universellen Haarnadel ist (4). In einer Ausführungsform wird das 5' gelegene kohäsive Ende auf der gewählten Primersequenz chemisch synthetisiert, um komplementär zu dem kohäsiven 5'-Ende auf der universellen Haarnadel zu sein. In einer anderen Ausführungsform wird das kohäsive 5'-Ende auf der gewählten Primersequenz durch den gestaffelten Schnitt einer Restriktionsendonuklease erzeugt.
Eine Markierungseinheit auf der universellen Haarnadel darf nicht so gelegen sein, dass sie die anschließende Ligation an deren 3'-Ende an die gewählte Primersequenz wesentlich stört. Somit ist eine Markierungseinheit vorzugsweise nicht auf dem 3'-terminalen Nukleotid der universellen Haarnadel lokalisiert (4). An dem 5'-Ende der Haarnadel kann eine Markierungseinheit entweder auf dem terminalen Nukleotid am 5'-Ende (wie gezeigt in 4) oder auf einem zum 5'-Ende intern liegenden Nukleotid lokalisiert sein.
Die Donor- (fluoreszent) und Akzeptor(Quencher)-Komponenten einer universellen Haarnadel, wie gezeigt in der 4, müssen so durch einen Abstand getrennt sein, dass die Emissionen der Donorkomponente von der Akzeptorkomponente gelöscht werden. Vorzugsweise werden die Donor- und Akzeptorkomponenten von einem Abstand von weniger als 1 Nukleotid (3,4 Å) getrennt, wenn die Haarnadel in der geschlossenen Konfiguration vorliegt.
In einer Ausführungsform werden die zwei FRET-Komponenten durch eine dazwischenliegende Sequenz, umfassend einen Abschnitt der ersten Stammsequenz, die Schleife und einen Abschnitt der zweiten Stammsequenz, getrennt, welche vorzugsweise eine Länge von 15–25 Nukleotiden aufweist. Weiter bevorzugt ist die Schleife auf der universellen Haarnadel lang genug, um einen Abstand von 20 Nukleotiden zwischen einem Donor (z. B. FAM) und einem Quencher (z. B. DABCYL) vorzusehen, wenn die Haarnadel in der "offenen" Konfiguration vorliegt.
Die 4 gibt ein schematisches Beispiel einer ausgewählten Zielsequenz (8–40 Nukleotide, vorzugsweise ~15 Nukleotide) und einer universellen Haarnadel, vor deren Ligation aneinander.
In einer anderen Ausführungsform wird ein universeller Haarnadel-Primer der Erfindung verwendet, welcher eine 3'-Sequenz enthält, welche, anstelle zu einer vorgewählten Zielnukleinsäuresequenz, die amplifiziert werden soll, komplementär zu sein, zu der 5' gelegenen einzelsträngigen Sequenz eines anderen Primers, welcher in der Amplifizierungsreaktion verwendet wird, identisch ist. Die 3'-Sequenz des anderen Primers ist komplementär zu der Zielnukleinsäuresequenz, wohingegen seine 5' gelegene identische Sequenz nicht komplementär zu der Zielnukleinsäuresequenz ist (siehe zum Beispiel 5 und Abschnitt 5.2.1).
5.2. VERFAHREN ZUR DETEKTION VON AMPLIFIKATIONSPRODUKTEN UNTER VERWENDUNG VON HAARNADEL-PRIMERN
In einer spezifischen Ausführungsform eines Haarnadel-Primers der Erfindung ist die Akzeptorkomponente ein Fluorophor oder Quencher, welcher(s) die von der Donorkomponente übermittelte Energie absorbiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Akzeptorkomponente ein Quencher; der Primer ist so konfiguriert, dass die Akzeptorkomponente auf freiem Primer die Fluoreszenz von dem Donor löscht. Wenn der Primer in das Amplifizierungsprodukt eingebaut ist, ändert sich seine Konfiguration, das Löschen wird eliminiert, und die Fluoreszenz der Donorkomponente wird detektiert.
Das Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung kann auf jedwedes Amplifikationssystem angewandt werden, in welchem ein Oligonukleotid in ein Amplifikationsprodukt eingebaut wird, z. B. Polymerasekettenreaktion(PCR)-Systeme (U.S.-Patent Nr. 4 683 195 und 4 683 202), Triamplifikationssysteme (TriAmp^TM, Oncor Inc.), eingereicht am 5. Juni 1995; internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94 17206A1 mit Datum vom 4. August 1994; internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94 17210A1 mit Datum vom 4. August 1994), Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikations(NASBA)-Systeme (U.S.-Patent Nr. 5 409 818; Compton, 1991, Nature 350: 91–92) und Strangverdrängungs-Amplifikations(SDA)-Systeme (Walker et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691–1696). Als ein Ergebnis der Amplifikation werden die Haarnadel-Primer in die doppelsträngigen Polynukleotid-Amplifikationsprodukte eingebaut.
In einer spezifischen Ausführungsform werden die Haarnadel-Primer verwendet, um eine Amplifikation in situ auf Proben von konservierten oder frischen Zellen oder Geweben zu primen (siehe z. B. Nuovo, 1997, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Dritte Ausgabe, Lippincott-Raven Press, New York).
Obwohl verschiedene spezifische Ausführungsformen, welche ein FRET-Paar beinhalten, hierin nachstehend als ein bevorzugtes, aus einer Donor-Fluorophor-Komponente und einer Quencher-Akzeptorkomponente bestehendes, FRET-Paar beinhaltend beschrieben sind, versteht es sich, dass derartige Ausführungsformen ebenfalls in Hinsicht darauf beschrieben werden könnten, dass die Akzeptorkomponente eher ein Fluorophor anstatt ein Quencher ist.
5.2.1. VERFAHREN ZUR VERWENDUNG VON HAARNADEL-PRIMERN IN DER POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR)
In einer Ausführungsform werden die Haarnadel-Primer der Erfindung verwendet, um eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu primen, wodurch sie in das Amplifikationsprodukt eingebaut werden (Beispiele werden in den 2 und 3A–D veranschaulicht).
Die PCR-Primer enthalten Haarnadel-Strukturen auf ihren 5'-Enden, wobei FRET-Donor- und Akzeptorkomponenten in enger Nähe (30 Nukleotide oder weniger) auf dem Haarnadelstamm lokalisiert sind. Die Primer werden in einer derartigen Weise entworfen, dass ein fluoreszierendes Signal von der Donorkomponente nur erzeugt wird, wenn die Primer in ein Amplifikationsprodukt eingebaut sind. Die modifizierten Haarnadel-Primer stören nicht die Aktivität von DNA-Polymerase, und in einem bevorzugten Aspekt kann thermostabile Pfu-Polymerase oder Taq-Polymerase verwendet werden. Die Vorwärts- und/oder Rückwärts-Primer können Haarnadel-Primer sein.
In dem in 3 gezeigten Beispiel besitzt der Haarnadel-Primer einen Quencher auf seinem 5'-terminalen Nukleotid und enthält ein Donor-Fluorophor auf dem gegenüberliegenden Strang seines Duplex, wobei das Fluorophor und der Quencher ein FRET-Paar sind. Im ersten Zyklus der PCR (3B) werden beide Primer an die jeweiligen Zielstränge hybridisieren und werden von DNA-Polymerase verlängert. Im zweiten Zyklus (3C) wird das verlängerte Produkt von dem Rückwärts-Primer eine Matrize für den Vorwärts-Primer werden, und das verlängerte Produkt von dem Vorwärts-Primer wird zu einer Matrize für den Rückwärts-Primer werden. Wenn der Vorwärts-Primer bis zum 5'-Ende der Haarnadel-Struktur verlängert wird, kann es zu einem von zwei Ereignissen kommen, abhängig von der verwendeten DNA-Polymerase: entweder wird die 5'-3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase die 5'-Nukleotide mit dem Quencher hydrolysieren und/oder die DNA-Polymerase wird das 5'-Ende der Haarnadel verdrängen und die Matrize kopieren. In beiden Fällen werden der Quencher und das Fluorophor voneinander getrennt, und ein Signal wird erzeugt werden (3D).
Haarnadel-Primer können in jedwedem Amplifikationsverfahren verwendet werden, in welchem der Haarnadel-Primer nicht komplementär zu irgendeinem anderen Oligonukleotid, das in der Reaktionsmischung verwendet wird, ist, und worin der Haarnadel-Primer in ein doppelsträngiges DNA-Amplifizierungsprodukt eingebaut wird, z. B. PCR, Triamplifikation, Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA) und Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA) (siehe untenstehend). So ist beispielsweise in einer Triamplifikation, welche die Verwendung eines Haarnadel-Primers beinhaltet, der andere Nicht-Haarnadel-Primer komplementär zu dem Blocking-Oligonukleotid.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform (5) wird ein universeller Haarnadel-Primer, zusammen mit zwei gewählten linearen Primern, Primer 1 und Primer 2, verwendet, um eine PCR zu primen. In diesem Fall wird der universelle Haarnadel-Primer in das Amplifikationsprodukt eingebaut und wird nicht an eine der zwei linearen Primersequenzen ligiert. In dieser Ausführungsform ist die 3'-Sequenz des universellen Haarnadel-Primers identisch zur 5'-Sequenz von einem aus dem Paar der linearen Vorwärts- und Rückwärts-Primer, die in der Amplifikation verwendet werden, und diese 5'-Sequenz (Sequenz "A" auf Primer 2 in 5) darf nicht komplementär zu der Zielsequenz sein.
Während des ersten Zyklus der PCR wird der Primer 1, welcher komplementär zu einem Ziel-DNA(+)-Strang ist, verlängert. Der Primer 2 besitzt einen 3'-Abschnitt, der eine Sequenz aufweist, die zu dem Ziel(–)-Strang komplementär ist, und einen 5'-Abschnitt, der in der 5 als "A" bezeichnet wird, welcher eine Sequenz aufweist, welche nicht komplementär zu dem Ziel ist. Die Sequenz A ist vorzugsweise 10–25 Nukleotide und stärker bevorzugt 12–15 Nukleotide lang.
Während des zweiten Zyklus wird das Produkt der Verlängerung von Primer 2 (gezeigt durch den Pfeil) zu einer Matrize für Primer 1. Der Primer 1 wird verlängert, und das Amplifizierungsprodukt schließt nun eine als "A'" bezeichnete Sequenz ein, die zur Sequenz A komplementär ist.
Während des dritten Zyklus annealt die A-Sequenz des Haarnadel-Primers an die A'-Sequenz des Amplifikationsprodukts aus dem vorhergehenden Zyklus.
Während des vierten Zyklus wird der verlängerte Haarnadel-Primer zu einer Matrize für Primer 1. Während der Verlängerung von Primer 1 entfaltet sich die Haarnadel, der Quencher und das Fluorophor werden getrennt, und ein Fluoreszenzsignal wird von dem Amplifizierungsprodukt emittiert. In einer ähnlichen Weise kann das Verfahren auf Triamplifikation angewandt werden. In diesem Fall ist der Haarnadel-Primer der Primer, der nicht zu dem Blocker komplementär ist.
5.2.1.1. VERFAHREN ZUR ANWENDUNG VON HAARNADEL-PRIMERN IN EINER ALLEL-SPEZIFISCHEN PCR (ASP)
In einer anderen Ausführungsform werden Primer der Erfindung verwendet, um eine allelspezifische PCR (ASP) zu primen. In dieser Ausführungsform können einer oder beide Amplifikationsprimer Haarnadel-Primer sein. In der ASP wird eine Ziel-DNA präferenziell amplifiziert, wenn sie vollständig komplementär zu dem 3'-Ende eines PCR-Amplifikationsprimers ist. Das 3'-Ende des Haarnadel-Primers sollte bei oder innerhalb einer oder 2 Basen einer bekannten Mutationsstelle in einem Gen (Ziel-DNA), zu welchem es eine komplementäre Sequenz aufweist, endigen. Unter den passenden Reaktionsbedingungen wird die Ziel-DNA nicht amplifiziert, wenn eine Basen-Fehlpaarung (z. B. eine Nukleotidsubstitution, verursacht durch eine Mutation) oder eine kleine Deletion oder Insertion an dem 3'-Ende des Primers vorliegt (Okayama et al., 1989, J. Lab. Clin. Med. 114: 105–113; Sommer et al., 1992, Bio-Techniques 12: 82–87). Somit kann ASP verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von mindestens einer einzelnen Fehlpaarung zwischen der Haarnadel-Sequenz, welche komplementär zu der vorgewählten Zielsequenz ist, und einer Nukleinsäure in der Probe zu detektieren; eine Amplifikation zeigt die Abwesenheit einer derartigen einzelnen Fehlpaarung an.
5.2.2. VERFAHREN ZUR VERWENDUNG VON HAARNADEL-PRIMERN IN DER TRIAMPLIFIKATION
5.2.2.1. ALLGEMEINE SCHRITTE IN TRIAMPLIFIKATIONS-REAKTIONEN
Haarnadel-Primer der Erfindung können in Triamplifikationsreaktionen verwendet werden.
Eine Triamplifikationsreaktion basiert auf drei Oligonukleotiden: zwei Primern und einem Blocking-Oligonukleotid (Blocker). Ein Beispiel wird in der 6 gezeigt. Die zwei Primer, ein Vorwärts- und ein Rückwärts-"Verlängerungs"-Primer, sind komplementär zu den zwei Strängen einer gewählten Ziel(Matrizen)-DNA. Ein drittes Oligonukleotid, ein Blocker, ist partiell komplementär zu einem der zwei Verlängerungs-Primer. Eine Triamplifikation verwendet zwei thermostabile Enzyme: DNA-Polymerase und DNA-Ligase. Während der wiederholten Schritte der Polymerisation und Ligation wird einer der verlängerten Primer an den Blocker ligiert.
In einer Version der Triamplifikation (der "gap"-Version) ist das Vorwärts-Oligonukleotid ein Primer, der zu einem ersten Segment an einem ersten Ende der zu amplifizierenden Zielsequenz im Wesentlichen komplementär ist. Das Rückwärts-Oligonukleotid ist ein Primer, welcher zu einem zweiten Segment an einem zweiten Ende der Zielnukleinsäuresequenz auf einem unterschiedlichen Strang der Zielnukleinsäure im Wesentlichen komplementär ist. Das dritte Oligonukleotid (der "Blocker" oder das "Blocking-Oligonukleotid") ist zu wenigstens einem Abschnitt des Vorwärts- oder Rückwärts-Primers im Wesentlichen komplementär.
Eine schematische Veranschaulichung der gap-Triamplifikation, welche aus der wiederholten Verlängerung und Ligation des Amplifikationsprodukts besteht, wird in der 7 gezeigt. Blocker kann bei der gleichen oder einer höheren Konzentration als der Konzentration an Vorwärts- und Rückwärts-Primern verwendet werden. Vorzugsweise wird Blocker bei einer 1,2- bis 2-fach höheren Konzentration als der Konzentration an Vorwärts- und Rückwärts-Primern verwendet. Der zu dem Blocker komplementäre Primer ist vorzugsweise modifiziert, um eine Strangverdrängung während der Amplifikation zu verhindern; in einer bevorzugten Ausführungsform enthält dieser Primer 2'-O-Methyl an der zum 5'-Ende des Blockers komplementären Position, um Strangverdrängung zu verhindern.
Eine alternative Version der Triamplifikation, die "Nicht-gap"-Version, ist im Wesentlichen ähnlich zu der obenstehend beschriebenen gap-Version, mit dem Unterschied, dass das 5'-Ende des Vorwärts-Primers zum 3'-Ende des Rückwärts-Primers angrenzend ist.
5.2.2.2. VERWENDUNG VON HAARNADEL-PRIMERN IN TRIAMPLIFIKATIONSREAKTIONEN
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Haarnadel-Primer verwendet, um eine Triamplifikationsreaktion zu primen, wodurch sie in das Amplifizierungsprodukt eingebaut werden. Bei der Verwendung von Haarnadel-Primern in einer Triamplifikation ist die Haarnadel-Struktur ein Teil von irgendeinem Primer, entweder dem Vorwärts- oder dem Rückwärts-Primer, welcher nicht komplementär zu dem Blocker ist (6). Sie kann nicht auf dem zu dem Blocker komplementären Primer verwendet werden, weil der Blocker in diesem Fall die Bildung der Haarnadel auf dem Primer, der nicht in das Amplifizierungsprodukt eingebaut ist, stören wird.
Der Haarnadel-Primer ist vorzugsweise mit einem FRET-Donor-Akzeptor-Paar auf seinem Stamm markiert. Während des ersten Zyklus der Triamplifikation wird der Haarnadel-Primer verlängert und an den Blocker ligiert. Während des zweiten Zyklus wird der verlängerte Haarnadel-Primer eine Matrize für den zweiten Primer werden. Im Verlauf der Verlängerung des zweiten Primers wird sich die Haarnadel öffnen, der Quencher wird von dem Fluorophor getrennt werden, und der Donor wird ein Fluoreszenzsignal emittieren.
5.2.3. VERFAHREN ZUR VERWENDUNG VON HAARNADEL-PRIMERN IN DER NUKLEINSÄURESEQUENZ-BASIERENDEN AMPLIFIKATION (NASBA)
Die Primer der Erfindung können verwendet werden, um eine Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifizierung (NASBA) zu primen, für welche ein Beispiel in der 9 gezeigt ist. NASBA verwendet das kontinuierliche Zyklieren von Reversen-Transkriptions- und RNA-Transkriptions-Reaktionen und wird bei einer Temperatur durchgeführt. Sie verwendet drei Enzyme (Reverse Transkriptase, RNase H und T7-RNA-Polymerase). In einer Ausführungsform verwendet das Verfahren zwei Primer, von denen einer ein Haarnadel-Primer der Erfindung ist, welcher mit FRET-Donor- und Akzeptor(z. B. Quencher)-Komponenten markiert ist. In einer alternativen Ausführungsform sind beide Primer Haarnadel-Primer der Erfindung.
Der Primer 1 weist vorzugsweise etwa 20 Basen an seinem 3'-Ende, welche komplementär zu einer Ziel-RNA sind, und eine Promotorsequenz 5' zur Ziel-komplementären Sequenz, welche von T7-RNA-Polymerase erkannt wird, auf. Primer 2 ist ein Haarnadel-Primer der Erfindung, welcher komplementär zu der RNA(–)-Sequenz ist und eine Haarnadel-Struktur an seinem 5'-Ende aufweist, die mit Energietransferkomponenten markiert ist, wie es als Beispiel in 9 veranschaulicht wird.
Die nicht-zyklierende NASBA-Phase geht wie folgend vor sich (9). Im Schritt 1 lagert sich der Primer 1 an die RNA-Zielsequenz an. Die reverse Transkriptase verwendet dNTPs, um das 3'-Ende des Primers 1 zu verlängern, wobei ein RNA/DNA-Hybrid gebildet wird. In Schritt 2 hydrolysiert RNase H den RNA-Strang des Hybrids. In Schritt 3 lagert sich der Haarnadelprimer 2 an den einzelnen, von dem Hybrid verbleibenden DNA-Strang an. Reverse Transkriptase synthetisiert den zweiten DNA-Strang, wobei die Promotorregion doppelsträngig gemacht wird. In Schritt 4 bindet das dritte Enzym in der Mischung, T7-RNA-Polymerase, an die Promotorsequenz und erzeugt bis zu 100 RNA-Kopien von jedem Matrizenmolekül.
Die zyklierende NASBA-Phase geht dann wie folgend vonstatten. In Schritt 5 bindet der Haarnadelprimer 2 über seine am 3'-Ende gelegene primende Sequenz an die RNA-Matrize, und reverse Transkriptase verlängert ihn und erzeugt ein RNA/DNA-Hybrid. Das 5'-Ende der Haarnadel wird verdrängt und als ein Ergebnis der Replikation kopiert. Der Quencher und das Fluorophor sind nun weit genug auseinander, damit das Fluorophor nicht länger gelöscht wird, und seine Fluoreszenz wird nachweisbar sein. In Schritt 6 hydrolysiert RNase H den RNA-Strang. Die resultierende einzelsträngige DNA ist nun "still" (Fluoreszenz wird gelöscht), weil erneut die Haarnadelstruktur gebildet wird. In Schritt 7 bindet Primer 1 an die einzelsträngige DNA. Reverse Transkriptase bindet an die 3'-Enden sowohl des Primers als auch der DNA-Matrize. In Schritt 8 wird das 3'-Ende der einzelsträngigen DNA verlängert, wodurch ein doppelsträngiger transkriptionell aktiver Promotor erhalten wird. Gleichzeitig wird das 3'-Ende von Primer 1 verlängert. Das 5'-Ende der Haarnadel wird verdrängt und als Ergebnis der Replikation kopiert. Der Quencher und das Fluorophor sind nun weit genug voneinander getrennt, damit das Fluorophor nicht länger gelöscht wird, und seine Fluoreszenz wird detektierbar sein. Im Schritt 9 erzeugt T7-RNA-Polymerase mehrere RNA-Kopien von jedem Matrizenmolekül.
Somit wird in dieser Ausführungsform bei den Amplifikationsprodukten der Schritte 5 und 8 der FRET-markierte Haarnadelprimer eingebaut sein und ein fluoreszentes Signal während der zyklischen Phase abgeben.
In dem obenstehenden Beispiel wird ein Haarnadelprimer in dem NASBA-Verfahren, wie beschrieben von Compton (1991, Nature 350: 91–92) verwendet. Wenn jedoch Polymerase-spezifische 5'-3'-Exonukleaseaktivität zusätzlich zur reversen Transkriptase, T7-RNA-Polymerase und RNase H vorhanden ist, wird das 5'-Ende des Haarnadelprimers während der Replikation hydrolysiert werden. Ein Fluoreszenzsignal wird nicht nur an den Schritten 5 und 8, sondern auch an den Schritten 6 und 7 erzeugt werden, da kein an die DNA-Matrize angehefteter Quencher vorhanden sein wird.
5.2.4. VERFAHREN ZUR VERWENDUNG VON HAARNADELPRIMERN IN DER STRANGVERDRÄNGUNGS-AMPLIFIKATION (SDA)
Die Haarnadelprimer der Erfindung können in einer Strangverdrängungsamplifikation (SDA) eines doppelsträngigen DNA-Ziels verwendet werden. Die Vorwärts- und/oder Rückwärts-Primer können Haarnadelprimer sein. Eine SDA hängt von dem kontinuierlichen Zyklieren von Nicking- und Polymerisation/Verdrängungs-Schritten ab und wird bei einer Temperatur durchgeführt.
In einer spezifischen Ausführungsform (10) sind sowohl Primer 1 als auch Primer 2 beide Haarnadelprimer der Erfindung. Jeder besitzt eine einzelsträngige primende Sequenz auf dem 3'-Ende, eine Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease und eine FRET-markierte Haarnadelstruktur am 5'-Ende.
Die SDA geht wie folgend vonstatten. In Schritt 1 wird die Ziel-DNA denaturiert, und Primer 1 und Primer 2 annealen über ihre 3'-Sequenzen. In Schritt 2: Die 3'-Enden der Primer werden unter Verwendung von dNTPs verlängert, von denen eines ein 5'-[α-Thio]triphosphat ist. Eine doppelsträngige Restriktionsstelle wird mit einem modifizierten Strang gebildet (der Thio-modifizierte Strang ist resistent gegen Endonuklease-Hydrolyse). Zur gleichen Zeit wird das 5'-Ende des Haarnadelprimers als Ergebnis der Replikation verdrängt und kopiert. Der Quencher und das Fluorophor sind nun weit genug voneinander getrennt, dass das Fluorophor nicht länger gelöscht wird, und seine Fluoreszenz nachweisbar sein wird. In Schritt 3 wird der nicht-modifizierte Strang der doppelsträngigen DNA durch die Restriktionsendonuklease genickt. In Schritt 4 verlängert DNA-Polymerase, der eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität fehlt, vorzugsweise Bst-DNA-Polymerase-"Large Fragment" ("Bst-LF-Polymerase"), das 3'-Ende des Nicks, wobei das einzelsträngige DNA-Ziel verdrängt wird, welches erneut durch den gleichen Zyklus laufen wird.
In dieser Ausführungsform wird somit bei den Amplifikationsprodukten der Schritte 2, 3 und 4 der FRET-markierte Haarnadelprimer eingebaut sein und ein fluoreszentes Signal abgeben.
5.2.5. VERFAHREN ZUR VERWENDUNG VON HAARNADELPRIMERN IN "TELOMERE-WIEDERHOLUNGSEINHEITEN"-AMPLIFIKATIONSPROTOKOLLEN (TRAPs)
Telomere sind spezifische Strukturen, welche an den Enden von Chromosomen in Eukaryoten gefunden werden. In menschlichen Chromosomen bestehen die Telomere aus Tausenden von Kopien von 6-Basen-Wiederholungseinheiten (TTAGGG) (Blackburn und Szostak, 1984, Ann. Rev. Biochem. 53: 163; Blackburn, 1991, Nature 350: 569; Zakitan, 1989, Ann. Rev. Genet. 23: 579). Die Telomere stabilisieren die Chromosomenenden. Gebrochene Chromosomen, denen die Telomere fehlen, erleiden Fusion, Rearrangement und Translokation (Blackburn, 1991, Nature 350: 569). In somatischen Zellen wird die Telomer-Länge fortschreitend mit jeder Zellteilung sowohl in vivo als auch in vitro (Harley et al., Nature 345: 458; Hastie et al., 1990, Nature 346: 866, Lindsey et al., 1991, Mutat. Res. 256: 45; Counter et al., EMBO J. 11: 1921) aufgrund des Unvermögens des DNA-Polymerase-Komplexes, das eigentliche 5'-Ende des rückläufigen Stranges zu replizieren, verkürzt.
Telomerase ist ein Riboprotein, welches die telomeren Wiederholungseinheiten auf das 3'-Ende von existierenden Telomeren synthetisiert und steuert, wobei sie ihre RNA-Komponente als Matrize verwendet. Telomeraseaktivität wird gezeigtermaßen spezifisch in unsterblichen Zellen, Krebs- und Keimzellen exprimiert (Kim et al., 1994, Science 266: 2011; Shay und Wright, 1996, Current Opinion in Cancer 8: 66–71), wo sie die Telomerverkürzung während der DNA-Replikation kompensiert und somit die Telomerlänge stabilisiert. Diese Beobachtungen haben zu der Hypothese geführt, dass die Telomerlänge als eine "Mitotische Uhr" fungieren kann, um die Zellalterung zu erfühlen und letztendlich eine replikative Seneszenz oder den programmierten Zelltod zu signalisieren (Shay und Wright, 1996, Current Opinion in Cancer 8: 66–71; Harley, 1991, Mutat. Res 256: 271; Greider, 1990, BioEssays 12: 363; Piatyszek et al., Methods in Cell Science 17: 1).
Der TRAP-Assay (telomeric repeat amplification protocol) ist ein hochempfindliches in-vitro-System, welches PCR anwendet und für die Detektion für Telomeraseaktivität verwendet wird. Telomerase-positive Zellen können durch Verwenden der Haarnadelprimer der Erfindung mit einem TRAP-Assay, z. B. einem TRAP-eze^TM-Assay (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD), detektiert werden.
Ein TRAP-Assay wird vorzugsweise unter Befolgung der Anweisungen durchgeführt, welche mit dem TRAP-eze^TM-Kit (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD) bereitgestellt werden. Der TRAP-eze^TM-Assay ist ein PCR anwendendes System mit einem Puffer und zwei Enzymen. Wie jedoch offensichtlich sein wird, können Telomerase-Assays ebenfalls unter Anwendung von Amplifizierungsverfahren, die von PCR verschieden sind, durchgeführt werden, obwohl nachstehend eine Beschreibung hinsichtlich PCR angegeben ist. Im ersten Schritt einer TRAP-eze^TM-Reaktion fügt die Telomerase eine Anzahl von telomeren Wiederholungseinheiten (GGTTAG) an das 3'-Ende eines Substrat-Oligonukleotides (TS, Telomerase-Substrat) an (31).
Eine spezifische Sequenz, z. B. AGAGTT oder TTAGGG am 3'-Ende eines Oligomers ist kritisch, damit das Oligomer als ein TS dient (siehe Morin, 1991, Nature 353: 454–456). Vorzugsweise ist die Sequenz 5–6 Nukleotide lang, obwohl kürzere Sequenzen, z. B. 4 Nukleotide, ebenfalls verwendet werden können.
Im zweiten Schritt werden die verlängerten Produkte mittels PCR unter Verwendung des TS und eines Rückwärts-Primers (RP) amplifiziert, welcher eine Sequenz umfasst, komplementär zu der Sequenz der telomeren Wiederholungseinheiten des TS-Telomerase-Verlängerungsprodukts, wodurch eine Leiter von Produkten mit 6-Basen-Zuwächsen, beginnend bei 50 Nukleotiden erzeugt wird: 50, 56, 62, 68 etc. Somit findet eine PCR-Amplifizierung dieser Leiter-Banden nur statt, wenn Telomerase in den Proben vorhanden ist, da die Reaktionsprodukte von aktiver Telomerase als Matrizen für die PCR-Amplifizierung dienen. Der Spiegel an Telomerase-Aktivität wird durch Messen der Menge an PCR-Produkten bewertet.
In einem bevorzugten Aspekt ist der RP ein Haarnadelprimer der Erfindung. In einer spezifischen Ausführungsform wird ein 17 bp langes Nukleotid, welches mit einem MET-Paar markiert ist, 5'-ACGCAATGTATGCGT*GG-3' (SEQ ID NR.: 29) an das 5'-Ende eines linearen RP-Primers angefügt, wodurch ein Haarnadelprimer der Erfindung zur Verwendung als ein RP gebildet wird (siehe Beispiel 15, 30A). Als Beispiel kann eine Donorkomponente an das 5'-Ende des Oligomers angeheftet werden, und eine Akzeptorkomponente an den T-Rest angeheftet werden.
Durch Optimieren der Reaktionsbedingungen kann ein sehr geringer Spiegel an Telomerase-Aktivität detektiert werden; die Empfindlichkeit des Assays ist mit jenen von herkömmlichen Assays vergleichbar, welche Polyacrylamid-Gelelektrophorese von PR-Produkten anwenden (30B).
In einer anderen Ausführungsform kann die Stamm-Schleife-Haarnadel-Struktur an das 5'-Ende des TS-Primers angeheftet werden. Das modifizierte TS-Oligomer dient daher nicht nur als ein Primer für PCR-Amplifikation, sondern auch als ein Substrat für die Telomerase. Dem ist so, weil die Substratspezifität der Telomerase durch die Nukleotidsequenzen am 3'-Ende des TS-Oligomers bestimmt zu werden scheint.
In noch einer anderen Ausführungsform können Telomerase-positive Zellen in Gewebeschnitten unter Verwendung von TRAP in situ in Gewebeschnitten und durch Verwenden eines Haarnadelprimers der Erfindung, z. B. von dem in 30A gezeigten Primer, als einen Primer für das TRAP detektiert werden. Das hierin beschriebene Verfahren kann für die Detektion einzelner Zellen mit Telomerase-Aktivität angewandt werden. Ein derartig empfindlicher Nachweisspiegel ist durch herkömmliche Im-Gefäß-TRAP-Assays von Gewebeproben schwierig zu erreichen.
Obgleich der PCR-basierende TRAP-Assay empfindlich genug ist, um kleine Mengen an Telomerase-Aktivität in Zell/Gewebe-Extrakt nachzuweisen (d. h. Telomerase-Aktivität, welche in 1% der Zellpopulation vorhanden ist, wird detektiert werden), ist es unmöglich, individuelle Telomerase-positive Zellen in der heterogenen Population zu identifizieren und Zell/Gewebe-Morphologie mit Telomerase-Expression zu korrelieren. Im Gegensatz dazu erlaubt die Identifikation von Telomerase-positiven Zellen unter Verwendung herkömmlicher Fluoreszenz-Mikroskopie in einem in-situ-TRAP-Assay die Untersuchung sowohl der Telomerase-Expression als auch des pathophysiologischen Zustands einer einzelnen Zelle.
Wie ein Im-Gefäß-TRAP-Assay erfordert ein in situ-TRAP-Assay (siehe Abschnitt 15.1, Experiment 2) enzymatisch aktive Telomerase. Der in situ-TRAP-Assay detektiert Telomerase-Aktivität mittels Amplifizierung der Telomerase-verlängerten Produkte, welche als die DNA-Matrizen für die Amplifizierungsreaktion, vorzugsweise PCR, dienen.
Um PCR-Produkte in einem standardmäßigen Im-Gefäß-TRAP-Assay zu detektieren, sind mehrere Vorgehensweisen möglich. In einer Ausführungsform kann zum Beispiel markierte Sonde für ein Gen-Ziel von Interesse an die PCR-Produkte hybridisiert werden, gefolgt von Antikörper-Detektion der gebundenen Sonde. Alternativ dazu kann ein Einbau einer Markierung in das PCR-Produkt durch einen Antikörper detektiert werden.
Im Gegensatz dazu elimiert die Verwendung der Haarnadelprimer der Erfindung für einen in situ-TRAP-Assay den obenstehend beschriebenen Detektionsschritt. Wie in einem Im-Gefäß-TRAP-Assay kann ein in situ-TRAP-Assay einen Haarnadelprimer entweder als den TS- oder RP-Primer verwenden. Da nur Haarnadelprimer, welche in die resultierenden PCR-Produkte eingebaut sind, nach der Amplifizierung fluoreszieren, können die Objektträger direkt unter einem Fluoreszenzmikroskop ohne Detektions/Waschschritte nach der PCR-Amplifizierung betrachtet werden. Zellen werden nur fluoreszieren, wenn das Gen-Ziel von Interesse amplifiziert ist.
Die Verwendung von Haarnadelprimern in in situ-TRAP-Assays besitzt große Vorteile gegenüber anderen Verfahren. Zum Ersten eliminiert sie den Detektionsschritt. Eines der technischen Probleme der in situ-PCR-Methodik ist die Diffusion der PCR-Produkte, welche die Identifizierung der nativen Stelle der amplifizierten Produkte äußerst schwierig macht. Die Eliminierung des Detektionsschrittes minimiert dieses Problem. Ferner ermöglicht die Eliminierung sowohl der Detektions- als auch der Waschschritte, dass die Morphologie der Gewebe aufrechterhalten bleibt.
Zum Zweiten kann eine interne Kontrolle eingebunden werden. Die Heterogenität der Objektträger-Präparationen und mögliche Gegenwart von PCR-Amplifikations-Inhibitoren können zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Die Einbindung einer internen Positiv-Kontrolle für die PCR-Amplifizierung wird dieses Problem umgehen. Die interne Kontrolle besteht aus einem Paar von Primern und einer DNA-Matrize und wird in die TRAP-Reaktionsmischung zugesetzt. Einer der zwei Primer der internen Kontrolle ist ein MET-Paar-markierter Haarnadelprimer der Erfindung, z. B. ein Rhodamin/DABCYL-markierter Haarnadelprimer, welcher einen FRET vollführt. Die Verwendung dieser zweiten fluoreszierenden Markierung (z. B. Rhodamin) mit einem Emissionsprofil, welches von der fluoreszenten Markierung auf dem Nicht-Kontroll-Haarnadelprimer verschieden ist, gestattet die gleichzeitige Identifizierung von zwei unterschiedlichen Amplifikationsprodukten: z. B. dem Telomerase-Produkt, welches mit FAM markiert ist, und der internen Kontrolle, welche mit Rhodamin markiert ist. Durch Betrachten der Probe in einem Fluoreszenzmikroskop durch unterschiedliche Filter, die für FAM bzw. für Rhodamin passend sind, kann man bewerten, ob eine Amplifizierung der Kontrolle stattgefunden hat.
Die Amplifizierung der internen Kontrolle ist unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von Telomerase-Aktivität in der Probe. Die Gegenwart von PCR-Inhibition kann durch das Ausbleiben oder merkliche Absinken der Amplifizierung der internen Kontrolle auf den Probenobjektträgern überprüft werden. Wenn eine Probe keine Telomerase-Produkte zeigt, aber eine Amplifizierung der internen Kontrolle zeigt, kann deshalb das Ergebnis so interpretiert werden, dass es anzeigt, dass die Probe wahrhaftig Telomerase-negativ ist, und dass es sich nicht um ein falsch-negatives Ergebnis handelt, welches durch PCR-Inhibition verursacht wird. Somit wird die Zuverlässigkeit der Methodik in großem Maße gesteigert.
Schließlich ist eines der größten Hindernisse beim Ansetzen von TRAP-Assays in einer klinischen Laboratoriums-Umgebung, dass der Assay extrem anfällig gegenüber PCR-Übertrags-Kontamination ist. Das Geschlossene-Gefäß-Format des obenstehend beschriebenen TRAP-Assays, welcher die Haarnadelprimer der Erfindung anstatt herkömmlicher PCR-Primer verwendet, wird große Nützlichkeit in klinischen Laboratorien besitzen.
5.2.6. VERFAHREN ZUR VERWENDUNG VON HAARNADELPRIMERN IN DER KASKADEN-ROLLING-CIRCLE-AMPLIFIKATION (CRCA)
Haarnadelprimer der Erfindung können in der Kaskaden-Rolling-Circle-Amplifikation (CRCA) (Lizardi und Caplan, Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/19193, veröffentlicht am 29. Mai 1997) verwendet werden (31). Wie in der PCR, wird die CRCA von zwei Primern gelenkt. In einer Ausführungsform der Erfindung unter Anwendung von CRCA ist einer oder beide der Primer ein mit einem MET-Paar markierter Haarnadelprimer, und vorzugsweise ist nur ein Haarnadelprimer mit einem MET-Paar markiert. Der Haarnadelprimer wird nur ein MET-Signal erzeugen, wenn er in die Kaskaden-Reaktionsprodukte eingebaut ist. Anders als bei PCR erfordert die Reaktion jedoch nicht wiederholte Zyklen der Wärmedenaturierung und ist somit isothermisch. In diesem Verfahren hybridisiert ein erster Vorwärts-Primer an eine zirkularisierte Sonden-Matrize und wird von einer DNA-Polymerase, z. B. Bst-DNA-Polymerase "Large Fragment" ("Bst LF-Polymerase"), um den Ring bzw. Zir kel herum verlängert und verdrängt schließlich das Primer-Ende unter Bildung eines langen 5'-Schwanzes. Ein zweiter Rückwärts-Primer initiiert eine Strangverdrängungssynthese auf dem Schwanz, welcher aus der Erst-Primer-Synthese verdrängt wird.
Es resultiert eine CRCA, in welcher beide Primer kontinuierlich zykliert werden, um die Synthese auf dem verdrängten Strang aus der vorhergehenden Syntheserunde zu initiieren. Die Verwendung eines Haarnadelprimers der Erfindung, entweder als der Vorwärts- oder der Rückwärts-Primer, macht eine direkte Detektion von CRCA-Produkten in einem geschlossenen System möglich. Wenn sie mit einer anfänglichen, in hohem Maße diskriminatorischen Ligationsreaktion (siehe nachstehend) gekoppelt wird, um eine divalente lineare Sonde an einer Zielstelle zu zirkularisieren, kann eine CRCA-Reaktion unter Verwendung der Haarnadelprimer der Erfindung als ein äußerst empfindliches und einfaches System zum Nachweis von infektiösen Agentien, zur Allotypisierung und zur Detektion seltener Ereignisse, wie in der Krebsdiagnose, dienen.
Damit eine CRCA beginnt, muss eine Ligation einer linearen Sonde (vorzugsweise mit einer Länge von ungefähr 90 Basen) an eine Zielsequenz stattfinden. Diese wird von einer thermophilen Ligase, z. B. Ampligase (Epicentre Technologies, Madison, WI) katalysiert. Der Vorwärts-Primer wird zugegeben und lagert sich an die zirkularisierte Sonde an. Die CRCA wird nach Zugabe einer Polymerase mit einer starken Strangverdrängungsaktivität, vorzugsweise Bst-DNA-Polymerase, "Large Fragment" (8 Einheiten), initiiert. Dieses thermophile Enzym erzeugt ein getailtes Produkt von mehreren Kilobasen Länge und erzeugt viele Tandem-Wiederholungseinheiten der Zielsequenz und daher viele Bindungsstellen für den Rückwärts-Primer.
Sowohl die Vorwärts- als auch Rückwärts-Primer, von denen einer oder beide ein mit einem MET-Paar markierter Haarnadelprimer sein können, aber vorzugsweise nur einer mit einem MET-Paar markiert ist, sind vorzugsweise im Überschuss (1 μM) vorhanden, um eine rasche Bindung an Matrizen-DNA zu gewährleisten. Wenn jeder Primer verlängert wird, verdrängt die Polymerase den wachsenden Strang, welcher vor ihr liegt, wodurch ein neuer Satz von einzelsträngigen Schwänzen mit Bindungsstellen für den anderen Primer erzeugt wird (31).
Dieser Prozess setzt sich über viele Zyklen hinweg fort und kann, aus einigen wenigen 100 Kopien des ursprünglichen Zirkels, mehrere Mikrogramm doppelsträngiges Amplifikationsprodukt, welches eingebaute Haarnadelprimer enthält, erzeugen. Bei Absenken der Temperatur zur Messung einer MET-Emission werden jedwede nicht-eingebauten Haarnadelprimer zu einer Haarnadel-Konfiguration zurückkehren. Wenn das MET-Paar ein Donor- Quencher-FRET-Paar ist, wird dieses Zurückkehren zur Haarnadel-Konfiguration das fluroreszente Signal löschen. Somit sollte, bei Verwendung mit Haarnadelprimern, welche mit Donor-Quencher-FRET-Paaren markiert sind, kein Signal über das Hintergrundrauschen hinaus in Proben erhalten werden, in denen keine Ligation oder Kaskaden-Reaktion stattgefunden hat.
Da CRCA bei einer Temperatur stattfindet, im Allgemeinen ungefähr 60–65°C, müssen die Primer lang genug sein (18-mere oder länger), um bei diesen Temperaturen effektiv zu binden. Es werden vorzugsweise Haarnadelprimer gewählt, welche eine starke Haarnadel bei Umgebungstemperaturen bilden können, jedoch bei 60–65°C relativ unstabil sind, so dass die Haarnadel die Strangverdrängungs-Synthese nicht inhibiert (32). Die Haarnadel kann mit den Primerbindungssequenzen partiell überlappen, was die Haarnadel während der Synthese weiter destabilisieren wird, oder kann durch eine Spacer-Region von der Primerbindungsstelle getrennt sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform einer CRCA unter Verwendung der Haarnadelprimer der Erfindung schließen andere Reaktionskomponenten 200 μM dNTPs, 2 mM MgSO₄, 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄ und 0,1% Triton X-100 ein. Die Ligations- und Kaskadenreaktionen können im selben Röhrchen und bei der gleichen Temperatur stattfinden, wobei die Ligase zuerst, in Gegenwart von NAD+ (0,5 mM), zugesetzt und 10 Minuten inkubiert wird, bevor die Zugabe der Polymerase erfolgt.
5.3. VERFAHREN ZUR DETEKTION VON AMPLIFIZIERUNGSPRODUKTEN UNTER VERWENDUNG VON 3'-5'-EXONUKLEASE UND/ODER ERHÖHTER TEMPERATUR
Da die Verwendung von Haarnadelprimern gestattet, zwischen amplifizierten Produkten und nicht-eingebauten Primern auf Basis des Typs des detektierten Signals zu unterscheiden, ist eine Exonuklease-Behandlung oder Hitze nicht notwendig zur Verwendung in Vorgehensweisen, welche die Haarnadelprimer der Erfindung einsetzen.
5.3.1. VERWENDUNG VON 3'-5'-EXONUKLEASE IN AMPLIFIKATIONSREAKTIONEN
Wie in manchen der Ausführungsformen beschrieben, kann, nachdem eine Amplifizierungsreaktion vollständig ist, 3'-5'-Exonuklease in das Reaktionsgefäß eingebracht werden, um sämtlichen freien Primer zu spalten. Dann wird die Donor-Markierung mit Licht der passenden Wellenlänge stimuliert. Wenn die Akzeptorkomponente ein Fluorophor ist, ist die einzige Akzeptor-Markierung, welche emittieren wird, diejenige, welche auf dem nicht-gespaltenen Primer verbleibt, der in das amplifizierte Produkt eingebaut worden ist, wodurch eine Anzeige des Ausmaßes der Amplifikation abgegeben wird. Je weiter die Amplifikation vorangeschritten ist, desto größer wird das Signal sein.
In einer Ausführungsform, worin Triamplifikation angewandt wird, wird eine einzelstrangspezifische 3'-5'-Exonuklease in das Amplifikationsgefäß zugesetzt, nachdem die Amplifizierung vollständig ist. Wie gezeigt in 8, hydrolysiert eine 3'-5'-Exonuklease-Behandlung das nicht-basengepaarte Ende des Rückwärts-Primers. Das 3'-Ende des Blockers ist geschützt und bleibt unversehrt.
Die Wechselwirkung der FRET-Fluorophore innerhalb des amplifizierten Produkts wird durch diese Behandlung aus zwei Gründen nicht beeinflusst werden. Zum Ersten wird das 3'-Ende des amplifizierten Produktes basengepaart sein und wird somit kein gutes Substrat für die Exonuklease sein. Zum Zweiten wird der Primer, welcher in das Amplifizierungsprodukt eingebaut ist, auf seinem 3'-Ende verlängert und sein markierter Nukleotidrest wird relativ weit von dem ungeschützten 3'-Hydroxyl liegen. Deshalb wird es für die Nuklease viel länger dauern, den modifizierten Rest zu erreichen. Als Ergebnis wird das einzige detektierbare FRET-Signal aus dem amplifizierten Produkt stammen und frei von Hintergrund sein. Vorzugsweise sollte der Donor auf dem Vorwärts-Primer vorliegen, und der Akzeptor auf dem Blocker, aber der umgekehrte Fall ist ebenfalls möglich.
Die Verwendung von 3'-5'-Exonuklease in Nukleinsäureamplifikationen unter Verwendung von linearen Primern eliminiert die Notwendigkeit zur Abtrennung des Amplifikationsprodukts von den nicht-eingebauten Oligonukleotiden nach der Reaktion. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung in dem Gefäß ausgeführt werden, in welchem die Amplifikationsreaktion vor sich geht, ohne das Gefäß zu öffnen, um eine Trennung von Amplifizierungsprodukt zu gestatten. Polymerase und Exonuklease können während der Amplifikation mechanisch getrennt sein, beispielsweise in einem Zwei-Kammer-Reaktionsröhrchen, wie es in der 11A gezeigt ist. Nach der Amplifikation wird das Reaktionsröhrchen auf den Kopf gestellt, wie in 11B, wodurch der Exonuklease erlaubt wird, sich mit der Amplifikationsmischung zu vermischen, was zu einer Hydrolyse von nicht-umgesetztem markiertem Primer führt. Dies sieht eine im großen Maße verringerte Wahrscheinlichkeit einer Übertragskontamination und folglich weniger falsche positive Ergebnisse in klinischen Untersuchungen vor. Dieses "Geschlossenes-Gefäß"-Format ist auch leicht einer Automatisierung zuführbar.
In einer anderen Ausführungsform kann eine Triamplifikation oder PCR-Amplifikation durchgeführt werden, z. B. wie beschrieben in Abschnitt 6, mit der Ausnahme, dass thermo stabile DNA-Polymerase als Kombination zweier Enzyme, mit und ohne 3'-5'-Exonuklease-Aktivität, vorhanden ist. Das Verhältnis von Polymerase zu Exonuklease kann so eingestellt werden, dass die Polymerisation während der Amplifikationszyklen überwiegt. Nach der Amplifikation, wenn das Zyklieren vorüber ist, wird einzelsträngige Matrize, an welche Primer binden können, nicht länger erzeugt werden. Somit wird es keinen Matrize/Primer-Komplex für DNA-Polymerase geben, an dem für einen dNTP-Einbau zu binden wäre. Deshalb wird die DNA-Polymerase eine Gelegenheit finden, die nicht-umgesetzten Primer zu binden und unter Verwendung ihrer 3'-5'-Exonuklease-Aktivität zu verdauen.
5.32. VERWENDUNG VON TEMPERATURERHÖHUNG IN AMPLIFIZIERUNGSREAKTIONEN
Die Hintergrund-Fluoreszenz einer Amplifizierungsreaktion, wie einer Triamplifikationsreaktion, kann durch Erhöhen der Temperatur des Amplifikationsgefäßes, als Alternative zur Verwendung von Exonuklease, stark verringert werden. Während der Detektion wird die Temperatur in dem Gefäß ausreichend hoch genug angehoben, um zu verursachen, dass der kurze Duplex, welcher zwischen dem nicht-verwendeten Blocker und dem Rückwärtsprimer gebildet wird, dissoziiert, um FRET zu verhindern. Zur gleichen Zeit bleibt das viel längere Amplifizierungsprodukt doppelsträngig und erzeugt ein FRET-Signal (siehe z. B. Beispiel 5). In dieser Ausführungsform wird die Detektion vorzugsweise unter Verwendung einer thermostabilen Küvette oder eines Plattenlesegerät-Fluorimeters durchgeführt werden. Diese Ausführungsform besitzt ebenfalls den Vorteil, dass eine Trennung des Amplifikationsprodukts von nicht-verwendetem Primer nicht erforderlich ist. Wie in der vorangehenden Ausführungsform, welche eine Exonuklease-Behandlung einsetzt, können Amplifizierungsprodukte somit direkt, ohne Öffnung des Reaktionsgefäßes, detektiert werden.
5.5. VERFAHREN ZUR VERWENDUNG VON HAARNADEL-PRIMERN IN MULTIPLEX-ASSAYS
Durch die Verwendung von mehreren spezifischen Sätzen an Primern kann die Amplifikation mehrerer Nukleinsäureziele in derselben Reaktionsmischung durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können ein oder beide Primer für jedes Ziel Haarnadel-Primer sein, welche mit einer fluoreszierenden Komponente und einer Quenching-Komponente, welche einen FRET vollführen können, markiert sind. Die Amplifizierung von mehreren Nukleinsäurezielen erfordert, dass eine verschiedene fluoreszente Akzeptor-Komponente, mit einer unterschiedlichen Emissionswellenlänge, verwendet wird, um jeden Satz an Primern zu markieren.
Während der Detektion und Analyse nach einer Amplifizierung wird die Reaktionsmischung beleuchtet und bei jeder der spezifischen Wellenlängen abgelesen, welche für jeden der in der Reaktion verwendeten Primer-Sätze charakteristisch ist. Es kann somit festgestellt werden, welche spezifischen Ziel-DNAs in der Mischung amplifiziert und markiert wurden. In einer spezifischen Ausführungsform werden zwei oder mehr Primerpaare für die Amplifizierung von unterschiedlichen jeweiligen Zielsequenzen verwendet.
5.6. ASSAY BEZÜGLICH DES METHYLIERUNGSSTATUS VON DNA UNTER ANWENDUNG VON AMPLIFIZIERUNGSREAKTIONEN DER ERFINDUNG
Die Methylierung von Cytosin, welches 5' zu Guanosin lokalisiert ist, besitzt bekanntermaßen tiefgreifende Effekte auf die Expression von mehreren eukaryotischen Genen (Bird, 1992, Cell 70: 5–8). In normalen Zellen tritt Methylierung vorwiegend in CG-armen Regionen auf, wohingegen CG-reiche Bereiche, welche "CpG-Inseln" genannt werden, unmethyliert bleiben. Die Ausnahme ist die umfangreiche Methylierung von CpG-Inseln, welche mit der transkriptionellen Inaktivierung von regulatorischen Regionen von durch Imprinting geprägten Genen (Li et al., 1993, Nature 366: 362–365) und mit gesamten Genen auf dem inaktiven X-Chromosom von Frauen (Pfeifer et al., 1989, Science 246: 810–813) assoziiert ist.
Eine irrtümliche Methylierung von normalerweise unmethylierten CpG-Inseln ist als ein verhältnismäßig häufiges Ereignis in immortalisierten und transformierten Zellen (Antequera et al., 1990, Cell 62: 503–514) dokumentiert worden und ist mit einer transkriptionellen Inaktivierung von definierten Tumorsuppressor-Genen bei Krebsarten des Menschen assoziiert worden (Herman et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93: 9821–9826). Die empfindliche Detektion der CpG-Insel-Methylierung besitzt das Potenzial, Tumorsuppressor-Gen-Funktion zu bestimmen und sieht eine neue Strategie für die frühe Tumordetektion vor.
Methylierungs-spezifische PCR ist ein empfindliches Nachweisverfahren für abnormale Gen-Methylierung in kleinen DNA-Proben (Herman et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93: 9821–9826). Die Methylierungs-spezifische PCR verwendet eine anfängliche Bisulfit-Reaktion, um DNA zu modifizieren. Alle unmethylierten Cytosine werden in einer Bisulfit-Reaktion dominiert und in Uracile umgewandelt. Methylierte Cytosine werden von der Bisulfit-Reaktion nicht betroffen. Folglich wird sich eine Sequenz von DNA, welche methyliert ist, hinsichtlich der Sequenz nach einer Bisulfit-Behandlung von einer identischen Sequenz, welche unmethyliert ist, unterscheiden. Somit können verschiedene Sätze an Primern entworfen werden, um jede dieser Sequenzen spezifisch zu amplifizieren (z. B. werden bei einem Paar von Primern zur Amplifizierung unmethylierter Bisulfit-behandelter DNA ein oder mehrere G-Reste durch einen A-Rest ersetzt sein (um komplementär zu den Nukleotiden zu sein, wel che früher unmethylierte Cytosine waren) bzw. ein oder mehrere C-Reste werden durch einen T-Rest ersetzt sein, für die zwei Primer des Paares, relativ zu dem Primerpaar für die methylierte oder unbehandelte DNA).
Wie in jeder anderen PCR-basierenden Technik ist dieses Verfahren sehr empfindlich. Jedwede Übertragskontamination aus zu der PCR externen Quellen wird falsche positive Ergebnisse erzeugen. Die Verwendung der MET-markierten Haarnadel-Primer der vorliegenden Erfindung eliminiert das Risiko einer Übertragskontamination, da die Reaktion in einem Geschlossenen-Gefäß-Format durchgeführt und (falls notwendig in Echtzeit) überwacht werden kann.
Die Anwendung der Bisulfitbehandlung in den Verfahren der Erfindung ist nicht auf diejenigen Verfahren eingeschränkt, welche PCR anwenden; andere Amplifizierungsverfahren können alternativ angewandt werden. Die Erfindung sieht somit ein Verfahren zum Assay des Methylierungsstatus von DNA unter Verwendung einer Amplifizierungsreaktion der Erfindung mit Haarnadel- oder linearen Primern vor. Das Verfahren umfasst: vor der Durchführung einer Amplifizierungsreaktion, In-Kontakt-bringen einer Probe, welche gereinigte Nukleinsäuren enthält, mit einer Bisulfitmenge, die ausreicht, um unmethylierte Cytosine in der Probe in Uracil umzuwandeln; und Ausführen der Amplifikationsreaktion in Gegenwart eines Primerpaars, welches für vorgewählte Zielsequenzen spezifisch ist, z. B. Fragiles-X-Gen, Prader-Willi-Syndrom-Region, Angelman-Syndrom-Region, p15-Gen, p16-Gen, E-Cadherin-Gen und von-Hippel-Lindau-Syndrom-Gen. Paare von Primern, welche in getrennten Reaktionsbehältern verwendet werden, sind vorzugsweise spezifisch für Bisulfit-behandelte methylierte, Bisulfit-behandelte unmethylierte bzw. nicht-Bisulfit-behandelte (Wildtyp-)Nukleinsäuren. Rückschlüsse über den Methylierungsstatus der Nukleinsäuren in der Probe können abhängig davon getroffen werden, welche Primerpaar(e) ein Amplifizierungsprodukt ergeben. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Amplifizierungsreaktion um PCR unter Verwendung von einem oder mehreren Haarnadel-Primern.
Kits wie auch Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsstatus von DNA werden ebenfalls bereitgestellt. In spezifischen Ausführungsformen umfassen derartige Kits, in einem oder mehreren Behältern, ein oder mehrere Oligonukleotide der Erfindung zur Durchführung der Amplifizierungen und Natriumbisulfit (gegebenenfalls in Kombination mit Hydrochinon-Pulver). Gegebenenfalls umfassen derartige Kits zusätzlich in getrennten Behältern eines oder mehreres der Folgenden: Mineralöl, DNA-Bindungsmatrix, NaI-Lösung, Glycogen, Amplifizierungspuffer, unmethylierte Kontroll-DNA und methylierte Kontroll-DNA.
5.7. KITS FÜR DIE AMPLIFIZIERUNG UND DETEKTION VON GEWÄHLTEN ZIEL-DNA-SEQUENZEN
Ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Kits für die Detektion oder Messung von Nukleinsäure-Amplifizierungsprodukten. In spezifischen Ausführungsformen umfassen die Kits ein oder mehrere Haarnadelprimer-Oligonukleotide der Erfindung in einem oder mehreren Behältern. Das Kit kann ferner zusätzliche Komponenten für die Ausführung der Amplifizierungsreaktionen der Erfindung umfassen. Falls die Zielnukleinsäure-Sequenz, die amplifiziert wird, eine solche ist, welche mit einer Krankheit oder Störung zusammenhängt, können die Kits zur Diagnose oder Prognose verwendet werden. In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Kit vorgesehen, welches, in einem oder mehreren Behältern, Vorwärts- und Rückwärts-Primer der Erfindung zur Ausführung einer Amplifizierung und gegebenenfalls eine DNA-Polymerase oder zwei DNA-Polymerasen, jeweils mit bzw. ohne Exonuklease-Aktivität, umfasst. Ein Kit für Triamplifikation kann ferner, in einem oder mehreren Behältern, ein Blocking-Oligonukleotid und gegebenenfalls DNA-Ligase umfassen.
Oligonukleotide in Behältern können in jedweder Form vorliegen, z. B. lyophilisiert oder in Lösung (z. B. eine destillierte Wasser- oder gepufferte Lösung) etc. Anwendungsbereite Oligonukleotide in derselben Amplifizierungsreaktion können in einem einzelnen Behälter kombiniert werden oder können in getrennten Behältern vorliegen. Es werden ebenfalls Multiplex-Kits vorgesehen, die mehr als ein Paar von (Vorwärts- und Rückwärts-)Amplifizierungs-Primern enthalten, wobei das Signal, welches von jedem amplifizierten Produkt detektiert wird, eine unterschiedliche Wellenlänge aufweist, wobei z. B. die Donor-Komponente jedes Primer-Paars bei einer unterschiedlichen Wellenlänge fluoresziert. Derartige Multiplex-Kits enthalten mindestens zwei derartige Paare von Primern.
In einer spezifischen Ausführungsform umfasst ein Kit, in einem oder mehreren Behältern, ein Paar von Primern, vorzugsweise im Bereich von 10–100 oder 10–80 Nukleotiden, und weiter bevorzugt im Bereich von 20–40 Nukleotiden, welche fähig sind, eine Amplifizierung [z. B. durch Polymerasekettenreaktion (siehe z. B. Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), zum Beispiel kompetitive PCR und kompetitive Reverse-Transkriptase-PCR (Clementi et al., 1994, Genet. Anal. Tech. Appl. 11 (1): 1–6; Siebert et al., 1992, Nature 359: 557–558); Triamplifikation, NASBA, Strangverdrängung oder andere fachbekannte Verfahren], unter geeigneten Reaktionsbedingungen, von wenigstens einem Teil einer gewählten Zielnukleinsäure zu primen.
In einer anderen Ausführungsform umfasst ein Kit für die Detektion einer gewählten Ziel-DNA-Zielsequenz in einem oder mehreren Behältern (a) PCR-Primer, von denen einer oder beide Haarnadel-Primer sind, welche mit fluoreszenten und löschenden Komponenten markiert sind, die einen MET vollführen können; und gegebenenfalls: (b) eine Kontroll-DNA-Zielsequenz; (c) einen optimierten Puffer für die Amplifizierung; (d) passende Enzyme für das in Betracht gezogene Verfahren der Amplifikation, z. B. eine DNA-Polymerase für PCR oder Triamplifikation oder SDA, eine reverse Transkriptase für NASBA; (d) eine Liste von Anweisungen zur Durchführung der Amplifizierung, welche z. B. die optimalen Bedingungen, z. B. Temperatur, Zahl der Zyklen für die Amplifikation, beschreibt. Gegebenenfalls sieht das Kit (e) Mittel zum Stimulieren und Detektieren von Fluoreszenz-Lichtemissionen vor, z. B. eine Fluoreszenz-Platten-Lesevorrichtung oder eine Kombinations-Thermozykler-Platten-Lesevorrichtung, um die Analyse durchzuführen.
In noch einer anderen Ausführungsform wird ein Kit für Triamplifikation vorgesehen. Das Kit umfasst Vorwärts- und Rückwärts-Verlängerungsprimer und ein Blocking-Oligonukleotid. Entweder der Vorwärts- oder Rückwärts-Primer ist mit einer Komponente eines Paares von MET-Komponenten markiert, und das Blocking-Oligonukleotid ist mit der anderen MET-Komponente des Paares markiert. Eine Ausführungsform eines solchen Kits umfasst, in einem oder mehreren Behältern: (a) ein erstes Oligonukleotid; (b) ein zweites Oligonukleotid, wobei die ersten und zweiten Oligonukleotide lineare Primer zur Verwendung in einer Triamplifizierungsreaktion sind; (c) ein drittes Oligonukleotid, welches ein Blocking-Oligonukleotid ist, das eine Sequenz umfasst, welche komplementär und hybridisierbar an eine Sequenz des ersten Oligonukleotides ist, wobei die ersten und dritten Oligonukleotide jeweilig mit einer ersten bzw. zweiten Komponente markiert sind, welche Mitglieder eines aus einer Donor-Komponente und einer Akzeptor-Komponente bestehenden molekularen Energietransfer-Paares sind, so dass, wenn das erste und dritte Oligonukleotid miteinander hybridisiert werden, und die Donor-Komponente angeregt wird und Energie emittiert, die Akzeptor-Komponente die von der Donor-Komponente emittierte Energie absorbiert; und (d) in einem getrennten Behälter eine Nukleinsäure-Ligase.
Ein Kit zum Ausführen einer Reaktion, wie derjenigen, welche in der 5 gezeigt ist, umfasst in einem oder mehreren Behältern: (a) einen ersten Oligonukleotid-Primer; (b) einen zweiten Oligonukleotid-Primer, wobei die ersten und zweiten Oligonukleotid-Primer Vorwärts- und Rückwärts-Primer für die DNA-Synthese in einer Amplifikationsreaktion sind, um eine Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren, und wobei der zweite Oligonukleotid-Primer (i) eine 5'-Sequenz, welche nicht komplementär zu einer vorgewählten Zielsequenz in der Nukleinsäuresequenz ist, und (ii) eine 3'-Sequenz, welche komplementär zu der vorgewählten Zielsequenz ist, umfasst; und (c) einen dritten Oligonukleotid-Primer, welcher ein Haarnadel-Primer der Erfindung ist, in welchem die vierte Nukleotidsequenz 10–25 Nukleotide lang ist, und welcher an seinem 3'-Ende eine Sequenz umfasst, die identisch zu der 5'-Sequenz des zweiten Oligonukleotid-Primers ist. Falls ein solches Kit für eine Triamplifizierung eingesetzt wird, kann auch ein Blocking-Oligonukleotid bereitgestellt werden.
Ein anderes Kit der Erfindung umfasst in einem oder mehreren Behältern: (a) ein erstes Oligonukleotid; (b) ein zweites Oligonukleotid, welches ein Haarnadel-Primer der Erfindung ist, und (c) in einem getrennten Behälter eine Nukleinsäure-Ligase.
6. BEISPIELE: ALLGEMEINE EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Die folgenden experimentellen Verfahren wurden für alle der Experimente eingesetzt, welche nachstehend ausführlich in den Beispielen, Abschnitte 7–13 dargelegt sind, es sei denn, es ist abweichend angemerkt. In allen der Beispiele wurden die Experimente entweder unter Anwendung von Triamplifizierung oder PCR ausgeführt.
6.1. OLIGONLTKLEOTIDSEQUENZEN: SYNTHESE UND MODIFIKATION
Drei Oligodesoxynukleotide, welche komplementär zu Segmenten der humanen "Prostata-spezifisches-Antigen"(PSA)-DNA waren, wurden synthetisiert (12). Der Rückwärts-Primer enthielt eine 2'-O-Methyleinheit an einer Position, welche komplementär zu dem 5'-Ende des Blockers war. Diese Modifikation war essentiell zur Verhinderung einer Strangverdrängung während des Amplifizierungsvorgangs (siehe Abschnitt 5.2.2.1). Der Blocker wies Biotin auf seinem 3'-Ende auf, um ihn vor 3'-5'-Exonuklease-Hydrolyse und vor einer unerwünschten Verlängerung während der Amplifizierung zu schützen. Während der Synthese von Blocker und Vorwärts-Primer wurde die primäre Aminogruppe auf der modifizierten T-Base (Amino-Modifizierer C6 dT) eingebaut, wie es von Ju et al. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4347–4351) beschrieben wurde. Diese Modifikationen wurden für einen anschließenden Einbau von fluoreszenten Farbstoffen in vorgesehene Positionen der Oligonukleotide verwendet. Die synthetisierten Oligonukleotide wurden entsalzt, und FAM (als ein Donor) und Rhodamin (als ein Akzeptor) wurden an einen modifizierten Thymidinrest des Rückwärts-Primers bzw. des Blockers mittels des Verfahrens angeheftet, welches von Ju et al. veröffentlicht wurde (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4347–4351). Die markierten Oligonukleotide wurden auf einem 15%igen denaturierenden Polyacrylamidgel gereinigt.
Die Absorptionsspektren der Primer wurden auf einem Hewlett Packard 8452A-Dioden-Array-Spektrophotometer gemessen, und die Fluoreszenz-Emissionsspektren wurden auf einem Shimadzu RF-500-Spektrofluorophotometer (Columbia, MD) erfasst.
6.2. AMPLIFIZIERUNG VON "PROSTATA-SPEZIFISCHES ANTIGEN"(PSA)-ZIEL-DNA
Eine Triamplifizierung wurde in 120 μl 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1 mg/ml BSA, 2 mM NAD, 0,1% Triton X100, 2 mM MgCl₂, 200 μM von jedem dNTP, 10^–11 M Matrize, 250 nM Vorwärts-Primer, 250 nM Rückwärts-Primer, markiert mit FAM, 500 nM Blocker, markiert mit Rhod, 6 Units Pfu-exo^–-DNA-Polymerase (Polymerase ohne 3'-5'-Exonuklease-Aktivität; Stratagene) und 30 Units Ampligase^TM-DNA-Ligase (Epicentre Technologies, Madison, WI) durchgeführt. Eine PCR-Amplifizierung wurde unter Anwendung der gleichen Bedingungen durchgeführt, außer dass Blocker und Ligase aus der PCR-Reaktionsmischung weggelassen wurden.
Ein Thermozyklieren wurde unter Verwendung einer Denaturierung während 5 Minuten bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen von 30 Sekunden bei 95°C und 2 Minuten 60°C durchgeführt. Die PCR wurde mit einer abschließenden Verlängerung für 6-Minuten bei 60°C vervollständigt.
Als eine erste Kontrolle wurde eine ähnliche Triamplifizierungsreaktion in Abwesenheit von DNA-Matrize durchgeführt. Als eine zweite Kontrolle wurde die Reaktionsmischung nicht in dem Thermozykler inkubiert.
6.3. 3'-5'-EXONUKLEASE-BEHANDLUNG
Vier Units T4-DNA-Polymerase, welche 3'-5'-Exonuklease-Aktivität besaß, wurden zu der amplifizierten DNA oder Kontrollsonde in 120 μl des Amplifizierungspuffers zugegeben und 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert, es sei denn, es ist abweichend angegeben.
6.4. ENERGIETRANSFER-MESSUNGEN
Energietransfermessungen wurden auf einem Shimadzu RF-5000-Spektrofluorophotometer vorgenommen. Die Anregungswellenlänge war 488 nm, und die Emissionsspektren wurden zwischen 500 und 650 nm erfasst.
7. BEISPIEL 1: DNA-POLYMERASE KOPIERT EINE DNA-MATRIZE MIT RHODAMIN-MODIFIKATION
Dieses Experiment (13A) wurde durchgeführt, um die Effekte einer Modifikation einer DNA-Matrize mit Rhodamin auf die Aktivität von DNA-Polymerase zu bestimmen. Wenn die Rhodamin-Markierung des Rückwärts-Primers den dNTP-Einbau blockieren würde, würde die Verlängerung des Vorwärts-Primers an der zur Modifikation gegenüberliegenden Base anhalten. In diesem Fall würden die zwei Stränge des amplifizierten Produkts von unterschiedlichen Größen sein: derjenige mit dem eingebauten Vorwärts-Primer wäre kürzer.
Eine PCR-Amplifizierung (13A) wurde unter Anwendung der Bedingungen für Triamplifikation, welche in Abschnitt 6 beschrieben wurden, jedoch ohne Verwenden von Blocker durchgeführt. Wie in der 13B veranschaulicht, waren die in Gegenwart von modifiziertem und unmodifiziertem Rückwärts-Primer synthetisierten Stränge von der gleichen Größe, was anzeigt, dass die Rhodamin-Markierung die Amplifikation nicht störte.
Die Effekte der Rhodamin-Markierung auf die Ausbeute der Amplifizierungsreaktion wurden ebenfalls eingeschätzt. Eine PCR-Amplifikation wurde durchgeführt, und als eine Kontrolle wurde unmodifizierter Rückwärts-Primer verwendet. Wie auf dem Agarosegel von 13C gezeigt, war die Menge an Produkt ähnlich, als Rhodamin-Rückwärts-Primer oder nicht-modifizierter Rückwärts-Primer vorhanden war.
Diese Ergebnisse führen zu der Schlussfolgerung, dass die Modifikationen in der DNA-Matrize die von DNA-Polymerase katalysierte Verlängerungsreaktion nicht beeinflussen.
8. BEISPIEL 2: MODIFIKATION EINES RÜCKWÄRTS-PRIMERS BEEINFLUSST NICHT DIE VON DNA-LIGASE KATALYSIERTE REAKTION
Da Triamplifikation eine thermostabile DNA-Ligase zur Amplifizierung verwendet, war es wichtig zu bestimmen, ob die Modifikation von Primern die Ligationseffizienz beeinflusst. Eine Triamplifikation wurde, wie beschrieben in Abschnitt 6, mit Rhodamin-markiertem Rückwärts-Primer durchgeführt. Wie gezeigt in der 14A, hatte der Blocker vier Nukleotide plus Biotin auf seinem 3'-Ende, welche diesen über die Rückwärts-Primer-Sequenz hinaus erweiterten.
In Fällen, in denen der verlängerte Vorwärts-Primer an den Blocker ligiert wurde, würde erwartet werden, dass der resultierende Strang ungefähr 4 Nukleotide länger als der entgegengesetzte Strang ist, bei welchem der verlängerte Rückwärts-Primer eingebaut ist. Wenn keine Ligation stattfände und anstelle dessen der Blocker verdrängt werden würde, dann würde man erwarten, dass beide Stränge von der gleichen Länge sind. Durch Verwenden von [³²P]-markiertem Vorärts- oder Rückwärts-Primer in parallelen Experimenten wurde die Effizienz der Ligation abgeschätzt.
Wie in der 14B gezeigt, war der Großteil des Produkts mit markiertem Vorwärts-Primer länger als der Strang mit markiertem Rückwärts-Primer, was anzeigt, dass es keine signifikante Auswirkung der Modifikation auf die Ligationsreaktion gab.
9. BEISPIEL 3: EXONUKLEASE KANN EINEN MIT RHODAMIN MARKIERTEN NUKLEOTIDREST ENTFERNEN
Exonuklease-Hydrolyse eines [³²P]-markierten Rückwärts-Primers, der mit Rhodamin markiert war, (15A), wurde in einer Amplifizierungsreaktionsmischung in einer PCR-Amplifikation unter Anwendung der in Abschnitt 6 beschriebenen Verfahren durchgeführt. T4-DNA-Polymerase mit 3'-5'-Exonuklease-Aktivität wurde verwendet. Die Produkte der Hydrolyse wurden auf einem 15-prozentigen denaturierenden Polyacrylamidgel analysiert. Die in der 15B präsentierten Ergebnisse zeigen die nahezu quantitative Hydrolyse des modifizierten Oligonukleotids nach 5 Minuten. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, als ein [³²P]-markierter Rückwärts-Primer, der mit Rhodamin markiert war, im Komplex mit Blocker vorlag.
10. BEISPIEL 4: DETEKTION VON AMPLIFIKATIONSPRODUKT DURCH ENERGIETRANSFER NACH NUKLEASE-BEHANDLUNG
Um das Triamplifikationsprodukt mittels FRET zwischen dem mit FAM markierten Rückwärts-Primer und dem mit Rhodamin markierten Blocker zu detektieren, wurden die Triamplifikationen und die anschließende Exonuklease-Behandlung durchgeführt, wie in Abschnitt 6 beschrieben. Als eine Kontrolle wurde die Triamplifikationsreaktion auch in Abwesenheit von DNA-Matrize durchgeführt.
Die Emissionsspektren sind in der 16 präsentiert. Das FRET-Signal bei 605 nm wurde von dem doppelsträngigen Amplifizierungsprodukt emittiert (16, Spektrumn 1), wohingegen kein FRET-Signal aus der Kontrollreaktion emittiert wurde, welche ohne DNA-Matrize durchgeführt wurde (16, Spektrum 2).
11. BEISPIEL 5: DETEKTION VON AMPLIFIKATIONSPRODUKT, BASIEREND AUF UNTERSCHIEDLICHER THERMOSTABILITÄT DES AMPLIFIZIERTEN PRODUKTS UND DES BLOCKER/RÜCKWÄRTS-PRIMER-KOMPLEXES
Das Ziel dieses Experiments bestand darin, zu bestimmen, ob eine spezifische Temperatur gefunden werden konnte, bei der freier Blocker und Rückwärts-Primer nicht länger im Duplex vorlagen, sodass kein Energietransfer zwischen ihnen auftreten konnte. Bei dieser Temperatur würde jedoch das doppelsträngige Triamplifikationsprodukt noch im Duplex bleiben, so dass die in selbiges eingebauten Primer ein FRET-Signal erzeugen würden.
Triamplifikation wurde durchgeführt, wie beschrieben in Abschnitt 6. Eine Kontrollreaktion wurde in Abwesenheit von DNA-Matrize laufen gelassen. Nach der Amplifikation wurden die Reaktionsmischungen auf 75°C erwärmt, und Emissionsspektren wurden erfasst. Die Ergebnisse zeigen, dass bei dieser Temperatur kein Signal aus nicht-amplifizierten Primern vorkam (17A–B). Allerdings konnte die Emission von Rhodamin bei 605 nm (d. h. ein FRET-Signal) aus dem amplifizierten Produkt deutlich detektiert werden.
12. BEISPIEL 6: GESCHLOSSENES-GEFÄSS-FORMAT UNTER VERWENDUNG VON HAARNADELPRIMERN ZUR AMPLIFIZIERUNG UND DETEKTION VON DNA AUF BASIS VON ENERGIETRANSFER
12.1. ZUSAMMENFASSUNG
Ein neues Verfahren für die direkte Detektion von PCR-amplifizierter DNA in einem geschlossenen System wird beschrieben. Das Verfahren basiert auf dem Einbau von Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-markierten Primern in das Amplifikationsprodukt. Die PCR-Primer enthalten Haarnadel-Strukturen auf ihren 5'-Enden, wobei Donor- und Akzeptor-Komponenten in enger Nähe auf dem Haarnadel-Stamm lokalisiert sind. Die Primer sind auf eine solche Weise entworfen, dass ein Fluoreszenz-Signal nur erzeugt wird, wenn die Primer in ein Amplifizierungsprodukt eingebaut sind. Ein Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis von 35:1 wurde unter Verwendung der Haarnadel-Primer, welche mit FAM als einem Donor und DABCYL als einem Quencher markiert waren, erhalten. Die modifizierten Haarnadel-Primer stören nicht die Aktivität von DNA-Polymerase, und sowohl thermostabile Pfu- als auch Taq-Polymerase können verwendet werden. Dieses Verfahren wurde auf die Detektion von cDNA für Prostata-spezifisches Antigen angewandt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Fluoreszenzintensität des amplifizierten Produkts mit der Menge an eingebauten Primern korreliert, und das so wenig wie zehn Moleküle der anfänglichen Matrize detektiert werden können. Diese Technologie eliminiert die Gefahr von Übertragskontamination, vereinfacht den Amplifikations-Assay und eröffnet neue Möglichkeiten für die Echtzeit-Quantifizierung der amplifizierten DNA über einen extrem weiten dynamischen Bereich.
12.2. EINLEITUNG
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und andere Nukleinsäureamplifizierungs-Techniken sehen ein Werkzeug für die geometrische Amplifizierung von winzigen Mengen an anfängli chen Zielsequenzen vor (übersichtsmäßig zusammengefasst in Mullis und Faloona, 1987, Methods in Enzymology 155: 335–350; Landegren, 1993, Trends Genet. 9: 199–204). Die extreme Empfindlichkeit von DNA/RNA-Amplifizierungsverfahren hat die Entwicklung von Diagnostika für die frühe Detektion von Krebs und infektiösen Agenzien angetrieben. Allerdings schließen Nachteile für die klinische Anwendung von Nukleinsäureamplifizierung die Möglichkeit von falsch-positiven Ergebnissen aufgrund von Übertragkontamination und falsch-negativen Ergebnissen, verursacht durch erfolglose Reaktionen und/oder nicht-standardisierte Reaktionsbedingungen, ein (Orrego, 1990, in Innis et al. (Hrsg.), PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press, San Diego, CA, S. 447–454).
Eine hauptsächliche Quelle für Übertragkontamination sind Amplifikationsprodukte aus früheren Amplifizierungsreaktionen. Aufgrund der extremen Empfindlichkeit von PCR kann sogar eine minimale Kontamination ein falsches positives Ergebnis erzeugen, und folglich sind mehrere Vorgehen entwickelt worden, um mit diesem Problem umzugehen. Diese beinhalten den Einbau von dUTP mit anschließender Behandlung mit Uracil-N-Glycosylase (Longo et al., 1990, Gene 93: 125–128), den Einbau von Ribonukleotiden in die PCR-Primer, gefolgt von Basenbehandlung (Walder et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21: 4339–4343) oder die Verwendung von Isopsoralen-Derivaten, welche bei Exposition an UV-Licht eine Cycloadditionsreaktion mit Thymidin-Resten durchlaufen (Cimino et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 88–107). Allerdings wäre eine einfachere und sicherere Lösung für das Problem ein geschlossenes System, wobei sowohl die Amplifizierungsreaktion als auch der Detektionsschritt im selben Gefäß stattfinden, so dass das Reaktionsröhrchen nach der Amplifikation niemals geöffnet wird. Darüber hinaus vereinfacht das "Geschlossene-Gefäß"-Format signifikant das Detektionsverfahren, wobei die Notwendigkeit für eine Nach-Amplifikations-Analyse durch derartige Verfahren wie Gelelektrophorese oder Dot-Blot-Analyse eliminiert wird.
Das nachstehend beschriebene Verfahren ist ausgelegt, um amplifizierte DNA direkt durch Einbau von markierten Oligonukleotid-Primern in das Reaktionsprodukt zu messen. Die konformationellen Übergänge, welche die Primer durchlaufen, dienen als Schalter für einen Energietransfer zwischen zwei Markierungen. In diesem Verfahren sind die Donor- und Akzeptor(Quencher)-Komponenten beide an eine Haarnadelstruktur auf dem 5'-Ende des Amplifizierungs-Primers angeheftet. Die Primer sind auf eine derartige Weise entworfen, dass das Fluoreszenzsignal nur erzeugt wird, wenn die markierten Oligonukleotide in das doppelsträngige Amplifikationsprodukt eingebaut sind. Dieses hochempfindliche Verfahren kann angewandt werden, um quantitative oder qualitative Ergebnisse zu erhalten. Anwendungen für dieses System auf die Detektion einer spezifischen DNA-Sequenz schließen, zusätzlich zur PCR, Triamplifikation, Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA) und Strangverdrängungs-Amplifikation ein.
12.3. MATERIALIEN UND METHODEN
Oligonukleotid-Primer
Die folgenden Oligodesoxynukleotide, komplementär zum 172-bp-Segment von humaner Prostata-spezifisches-Antigen(PSA)-cDNA wurden chemisch synthetisiert: 5'-CCCTCAGAAGGTGACCAAGTTCAT (SEQ ID Nr.: 11), als ein Stromaufwärts-Primer, und 5'-GGTGTACAGGGAAGGCCTTTCGGGAC (SEQ ID Nr.: 12) als ein Stromabwärts-Primer. Die Strukturen der Stromaufwärts-Haarnadelprimer mit Energietransfermarkierungen sind in den 24A–G gezeigt. FAM wurde in das 5'-Ende von Haarnadelprimern durch Verwendung von FAM-Phosphoramidit im letzten Schritt der chemischen Synthese eingebaut. Eine modifizierte T-Base wurde in eine vorgesehene Position durch die Verwendung von Amino-Modifizierer C6 dT (Glen Research) eingeführt, und das DABCYL wurde an die primäre Aminogruppe angeheftet, wie beschrieben von Ju et al. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4347–4351). Markierte Oligonukleotide wurden durch HPLC gereinigt.
Herstellung von PSA-cDNA
Die humane PSA-exprimierende Zelllinie LNCaP (American Type Culture Collection) wurde in den Experimenten verwendet. LNCaP-Zellen wurden mit Lymphozyten, welche aus Vollblut isoliert worden waren, bei Verhältnissen im Bereich von 1 LNCaP-Zelle zu 10² Lymphozyten bis zu 1 LNCaP-Zelle zu 10⁶ Lymphozyten verdünnt. Messenger-RNA wurde unter Verwendung des Dynal-Reinigungs-Kits isoliert. cDNA wurde aus der isolierten mRNA unter Verwendung von reverser Transkriptase (Appligene) und oligo-dT_12-18-Primern (Pharmacia) gemäß dem empfohlenen Protokoll synthetisiert.
PCR-Bedingungen
Die Amplifikation der PSA-cDNA wurde in 100 μl von 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 200 μM von jedem dNTP, jeweils 500 nM der Stromaufwärts- und der Stromabwärts-Primer und 5 Units der Pfu^exo–-DNA-Polymerase (welcher 3'-5'-Exonuklease-Aktivität fehlt; Stratagene) durchgeführt. Das Thermozyklieren wurde mit einer 5 Minuten langen Denaturierung bei 94°C, gefolgt von 20–40 Zyklen von 30 Sekunden bei 95°C, 45 Sekunden bei 60°C und 1,5 Minuten bei 72°C, durchgeführt und mit einer abschließenden 5-minütigen Verlängerung bei 72°C beendet.
Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des QIAquick-Spin-PCR-Reinigungs-Kits (Qiagen) gereinigt und in pUC19-Plasmid kloniert. MDE^TM-Gele (FMC BioProducts) wurden für die Gel-basierende Detektion der PCR-Produkte verwendet. Eine Elektrophorese in einem 6%igen Polyacrylamidgel mit 7 M Harnstoff und eine anschließende Quantifizierung auf einem PhosphorImager-SP (Molecular Dynamics) wurden eingesetzt, um die Menge an in das Amplifikationsprodukt eingebautem Primer abzuschätzen.
Fluoreszenz-Detektion
Ein RF-5000-Spektrofluorophotometer von Shimadzu wurde verwendet, um die Fluoreszenzspektren der individuellen Proben zu messen. Die 100-μl-Reaktionsmischung wurde mit 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, 50 mM NaCl und 2 mM MgCl₂ auf 500 μl verdünnt und in eine '10 × 3'-Küvette (NSG Precision Cells, Inc.) bei Raumtemperatur eingebracht. Für das FAM/DABCYL(4-(4'-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure)-FRET-Paar wurde eine Anregungswellenlänge von 488 nm verwendet, und ein Spektrum wurde zwischen 500 und 650 nm erfasst. Das fluoreszente PCR-Produkt wurde auch visualisiert, indem das Röhrchen direkt gegen ein UV-Transilluminator-Bildanalysesystem (Appligene) gehalten und mit einer montierten Kamera unter Verwendung eines D540/40-Filters (Chroma Technology) fotografiert wurde.
12.4. ERGEBNISSE
Experimentelle Auslegung von PCR mit Haarnadel-Primern
In diesem Verfahren ist eine Haarnadel-Struktur auf dem 5'-Ende von einem (oder beiden) der PCR-Primer vorhanden (1). Die Sequenz von Haarnadel-Stamm und -Schleife können partiell komplementär zu der Ziel-DNA-Sequenz sein, aber dies ist nicht notwendig. Es gibt zwei Komponenten, welche an die Stammsequenz der Haarnadel angeheftet sind: einen Quencher auf dem 5'-Ende der Haarnadel und ein Fluorophor auf der entgegenliegenden Seite des Haarnadel-Stamms. Die Positionen des Fluorophors und des Quenchers können, abhängig von der Verfügbarkeit der kommerziellen Vorläufer dieser Komponenten, vertauscht werden. DABCYL ist ein nicht-fluoreszentes Chromophor, dessen Absorptionsspektrum mit dem Emissionsspektrum von FAM überlappt. Bei Stimulation durch Licht mit einer Peak-Wellenlänge von 488 nm emittiert FAM eine Fluoreszenz bei einer Peak-Wellenlänge von 516 nm. Wenn jedoch DABCYL ausreichend nah an dem Donor-Fluorophor lokalisiert ist, kann die Energie auf DABCYL übertragen und als Wärme zerstreut werden. Wenn der modifizierte Primer in einer "geschlossenen" Konfiguration (Haarnadel) vorliegt, befinden sich deswegen das FAM und DABCYL in enger Nähe, und die Emission des Fluoresceins wird durch DABCYL gelöscht.
Während des ersten Zyklus der PCR (2) werden die Primer verlängert und werden zu Matrizen währen des zweiten Zyklus. Da die Haarnadel-Strukturen sehr stabil sind (Varani, 1995, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 379–404), ist es unwahrscheinlich, dass die Stämme während des Annealing-Schrittes der PCR auf jedem Zielmolekül aufgeschmolzen werden. Wenn in diesem Fall die DNA-Polymerase, welcher 5'-3'-Exonuklease-Aktivität fehlt, das 5'-Ende des Haarnadel-Stamms erreicht, wird sie selbiges verdrängen und die Sequenz kopieren. Somit wird der Haarnadel-Primer durch Einbau in die doppelsträngige helikale Struktur während der PCR linearisiert werden, der Donor und Akzeptor werden ungefähr 20 Nukleotide (~70 Å) auseinander liegen, was dazu führt, dass kein signifikanter Energietransfer zwischen ihnen vorliegt (Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300–334), und die Fluoreszenz aus dem FAM wird merklich verstärkt werden.
Sequenz und spektroskopische Eigenschaften des Haarnadel-Primers
Die Struktur des Haarnadel-Primers für die Amplifikation von cDNA für Prostata-spezifisches Antigen (PSA) ist in der 18A gezeigt (SEQ ID Nr.: 10). Der Primer besteht aus einer 12 Nukleotide langen, einzelsträngigen primenden Sequenz, einem 7-bp-Stamm und einer 6-Nukleotid-Schleife. Die fluoreszente Komponente (FAM) ist auf dem 5'-Ende des Primers lokalisiert, und ein Quencher (DABCYL) liegt gegenüber dem FAM auf dem gegenüberliegenden Strang der Stammsequenz vor. Die 18B präsentiert die Emissionsspektren des FAM-markierten Haarnadel-Primers vor und nach dem Einbau von DABCYL. Wenn kein Quencher vorhanden ist, emittiert FAM, welches bei einer Wellenlänge von 488 nm angeregt wird, eine Peak-Wellenlänge von 516 nm. Wenn dasselbe Oligonukleotid ebenfalls mit DABCYL markiert ist, wird die Fluoreszenz-Energie auf den Quencher transferiert und ein viel niedrigerer Peak wird bei 516 nm detektiert. Die restliche Fluoreszenz des FAM/DABCYL-markierten Oligonukleotids wird partiell durch die Gegenwart von kleinen Mengen an Oligonukleotiden, die mit FAM allein markiert sind, verursacht. Deshalb war eine gründliche HPLC-Reinigung der markierten Oligonukleotide sehr wichtig für den niedrigen Hintergrund in den nachfolgenden Experimenten.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit Rhodamin als einem Quencher erhalten (Daten nicht gezeigt). Als ein Quencher besitzt DABCYL jedoch den Vorteil, dass es ein nicht-fluoreszentes Chromophor ist: Es absorbiert die Energie des Fluoresceins, ohne selbst Licht zu emittieren. Als ein Ergebnis kann die Emission des Fluoresceins genauer, ohne Störung durch die Emission des Akzeptors, detektiert werden.
Verwendung von Haarnadel-Oligonukleotiden als PCR-Primer
Eine PCR des Fragments von PSA-cDNA wurde unter Verwendung von thermostabiler Pfu^exo–-DNA-Polymerase durchgeführt. Gesamt-cDNA aus menschlichen PSA-exprimierenden LNCaP-Zellen, die mit Lymphozyten gemischt waren, wurde für die Amplifikation verwendet. Die vorbereitenden Experimente unter Verwendung von Ethidiumbromid-gefärbten Gelen für den Assay zeigten, dass eine PSA-Zelle pro 10⁵ Lymphozyten nachgewiesen werden konnte. Zu Quantifizierungs-Zwecken wurde das PCR-Produkt kloniert und verwendet, um die Effizienz der Amplifikation in Gegenwart des Haarnadel-Primers mit derjenigen für den Kontroll-Primer, welchem die Haarnadel-Struktur und Modifikationen fehlen, zu vergleichen. Die 19 zeigt, dass die Menge an amplifiziertem Produkt für den Kontroll-Primer, den Haarnadel-Primer, welcher FAM allein enthielt, und den Haarnadel-Primer, welcher mit dem FAM/DABCYL-FRET-Paar markiert war, ähnlich war.
Eine entscheidende Anforderung für das Verfahren ist die Linearisierung des Haarnadel-Primers während der Amplifikation. Deshalb muss DNA-Polymerase in der Lage sein, den zum Haarnadel-Primer komplementären Strang über die gesamte Strecke über die Haarnadel hinweg bis zu ihrem 5'-Ende zu synthetisieren. Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob Modifikationen der Struktur des Haarnadel-Primers die anschließende Synthese des Volllängen-PCR-Produkts beeinflussen. Eine PCR-Amplifikation von PSA-cDNA wurde mit zwei Primern durchgeführt: einem stromaufwärts gelegenen FAM/DABCYL-markierten Haarnadel-Primer und einem Stromabwärts-Primer, der mit ³²P auf seinem 5'-Ende markiert war (20A). Ein Stromaufwärts-Primer ohne die Haarnadelstruktur wurde als eine Kontrolle verwendet.
Wenn die Struktur und/oder die Modifikationen des Haarnadel-Primers ein Hindernis für DNA-Polymerase erzeugen, wird dieser Primer nicht über die gesamte Strecke hinweg bis zu seinem 5'-Ende kopiert werden, und der [³²P]-markierte Strang wird kürzer als der entsprechende Strang sein, der in Gegenwart des Kontrollprimers synthetisiert wird.
Um die Länge der individuellen Stränge abzuschätzen, wurde eine denaturierende Gel-Elektrophorese durchgeführt. Wie durch die Ergebnisse in 20B veranschaulicht, war der [³²P]-markierte Strang, welcher in Gegenwart des Haarnadel-Primers synthetisiert wurde, länger als der entsprechende Strang, welcher mit dem Kontroll-Primer hergestellt wurde, was anzeigt, dass DNA-Polymrase in der Lage war, durch die Haarnadelstruktur hindurch zu lesen und ein Volllängen-Produkt zu synthetisieren.
Ein anderer wichtiger Aspekt dieses Verfahrens ist die Thermostabilität des Haarnadel-Primers. Wenn die Oligonukleotid-Phosphodiester-Bindungen oder die Linkerarme, durch welche Donor und/oder Akzeptor an das Oligonukleotid geheftet sind, als Ergebnis hoher Temperatur gespalten werden, wird der Quencher von dem Fluorophor getrennt werden und der Hintergrund wird zunehmen. Tatsächlich stieg, als 50 pmol des Haarnadel-Primers in einer 100-μl-Reaktion während 40 Zyklen inkubiert wurden, das Hintergrundsignal von 3,8 Units auf 12 Units der Fluoreszenzintensität. Allerdings war der beobachtete Hintergrund immer noch sehr niedrig: Er umfasste lediglich 6% der Fluoreszenz, welche von 50 pmol Fluorescein-markierten Oligonukleotiden (200 Units) emittiert wurde, was die in den Assays verwendete Menge war.
Überwachung von PCR mit Haarnadel-Primern
Um aufzuzeigen, dass die Fluoreszenz des PCR-Produkts verwendet werden könnte, um die Reaktion zu verfolgen, wurde Gesamt-cDNA aus der Mischung von 1 humane PSA exprimierende LNCaP-Zelle pro 10⁴ Lymphozyten mit dem FAM/DABCYL-markierten Haarnadel-Primer amplifiziert. Nach unterschiedlichen Anzahlen an Zyklen wurde die Fluoreszenzintensität des amplifizierten Produkts unter Verwendung eines Spektrofluorophotometers bestimmt (21A). Die Ergebnisse zeigen, dass nach lediglich 20 Zyklen die Fluoreszenzintenstität fünfmal im Vergleich zu der nicht-amplifizierten Reaktionsmischung anstieg, und ein 35-facher Anstieg wurde nach 40 Zyklen der Amplifizierung detektiert. Die gleichen Proben wurden ebenfalls durch denaturierende Gelelektrophorese mit anschließender Quantifizierung auf dem PhosphorImager analysiert, um die Fraktion an [³²P]-markierten Primern, welche in das Produkt eingebaut worden war, zu bestimmen. Die Ergebnisse in der 21B demonstrieren, dass die Fluoreszenzintensität der Reaktionsmischung mit der Menge an in das Produkt eingebauten Primern korreliert.
In einem anderen Experiment wurde die Empfindlichkeit dieses Verfahrens untersucht. Für Quantifizierungszwecke wurde klonierte PSA-cDNA als eine Matrize verwendet. 40 Zyklen PCR wurden mit 0, 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵ oder 10⁶ Molekülen klonierter PSA-cDNA pro Reaktion durchgeführt. Die Ergebnisse in der 22 demonstrieren, dass das Verfahren empfindlich genug ist, um 10 Moleküle der anfänglichen DNA-Matrize mit einem Spektrofluorophotometer zu detektieren. Das fluoreszente PCR-Produkt wurde auch durch Plazieren des Röhrchens direkt auf einem UV-Transilluminator, welcher mit einer montierten Kamera und einem D540/40-Filter ausgestattet war, visualisiert. Dieser Filter gestattet die Detektion der Emission in einem engen Wellenlängenfenster: zwischen 515 und 560 nm. Wie in der 23 gezeigt wird, konnte die Fluoreszenz der PCR-Reaktion, welche mit 10⁴, 10⁵ und 10⁶ Mo lekülen der anfänglichen Matrize durchgeführt worden war, ohne Weiteres durch visuelle Inspektion der Röhrchen detektiert werden.
Effekt der Struktur von markiertem Haarnadel-Primer auf die Amplifikation und Detektion
Mehrere Haarnadel-Primer mit variierenden Größen von Stamm, Schleife und 3'-Einzelstrang-Sequenzen wurden synthetisiert, um abzuschätzen, wie diese Parameter die Effizienz der PCR und das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis beeinflussen könnten. Die Strukturen und die relativen Fluoreszenzintensitäten sind in den 24A–G dargestellt. Alle getesteten Primer hatten mindestens eine 18-Nukleotid-Sequenz, welche zum Ziel komplementär war, die eine 3'-einzelsträngige primende Sequenz, eine 3'-Stammsequenz und einen Teil der Schleife umfasste (in Fettdruck hervorgehoben in den 24A–G).
Die Länge der einzelsträngigen primenden 3'-Sequenz wurde als sehr bedeutsam für die Effizienz der Haarnadel-Primer in der PCR-Reaktion festgestellt. Es wurde fast kein Produkt detektiert, als die Länge der primenden Sequenz von zwölf Nukleotiden in Struktur A auf sechs Nukleotide in Struktur G vermindert wurde (24). Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis besteht darin, dass die Haarnadel-Struktur die bevorzugte Konformation dieses Oligonukleotids, sogar bei der Annealing-Temperatur von 60°C, ist, und dass die Nukleotide in dem Stamm und der Schleife der Haarnadel nicht für eine Hybridisierung an die Ziel-DNA verfügbar sind. In diesem Fall ist der einzige Teil des Moleküls, der nicht an der Sekundärstruktur beteiligt ist, die 3'-Einzelstrang-Sequenz; jedoch ist die 6-Nukleotid-Sequenz auf dem 3'-Ende von Struktur G nicht lang genug, um ein effizienter PCR-Primer zu sein.
Nur kleinere Variationen in der Menge von erzeugtem Produkt wurden festgestellt, als die Größen von Stamm und Schleife geringfügig verändert wurden. Die PCR war geringfügig weniger effizient, wenn die Länge des Stammes größer als 7 bp war. Die Stabilisierung des Stamms durch Ersetzen eines AT-Basenpaars am 3'-Ende durch GC erhöhte das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis um 10%.
12.5 DISKUSSION
Das Verfahren zur Detektion von Amplifizierungsprodukten in einem "Geschlossenes-Gefäß"-Format ist ein wichtiger Schritt in Richtung auf ein PCR-basierendes automatisches Diagnose-System, da es nicht nur die Komplexität der Reaktion verringert, sondern auch die Wahrscheinlichkeiten einer Übertragskontamination eliminiert und folglich die Wahrscheinlichkeiten von falsch-positiven Ergebnissen minimiert. Der Amplifikationsprimer enthält eine Haarnadel-Struktur mit zwei Markierungen auf ihrem Stanzen, welche einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer eingehen können. Eine Markierung ist ein Fluorophor-Donor und eine andere ist ein Quencher, welcher die von dem Fluorophor emittierte Energie absorbieren kann. Eine 35-fache Löschung der Fluoreszenz wurde beobachtet, als die Oligonukleotid-Primer in der Haarnadel-Konformation vorlagen, so dass weniger als 3% der Maximum-Fluoreszenz detektiert wird, wenn die Primer nicht in das Produkt eingebaut sind. Das Umschalten von der Haarnadel- in die linearisierte Konformation tritt als ein Ergebnis der Replikation auf: Das 5'-Ende des Stamms wird durch DNA-Polymerase verdrängt, ein komplementärer Strang wird synthetisiert, und die Haarnadel kann nicht länger ausgebildet werden. In den eingebauten Primern ist der Abstand zwischen dem Fluorophor und dem Quencher ungefähr 20 Basenpaare groß, was 70 Å nahekommt, dem Abstand, bei welcher ein Energietransfer vernachlässigbar ist (Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300–334), und so kann die quantitative Emission des Fluorophors detektiert werden.
Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist die Erzeugung des fluoreszenten Signals durch das Produkt selbst anstatt durch die hybridisierte Sonde, wie in früheren Verfahren (Holland et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276–7280; Lee et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21: 3761–3766; Tyagi und Kramer, 1996, Nature Biotechnol. 14: 303–309). Dies hält den Hintergrund niedrig und gestattet die Echtzeit-Quantifizierung der amplifizierten DNA über einen extrem weiten dynamischen Bereich. Darüber hinaus erfordert die Detektion keine speziellen Puffer- oder Temperaturbedingungen, welche für Methoden notwendig sind, die Hybridisierung beinhalten. Die Unterscheidung zwischen einem langen doppelsträngigen DNA-Produkt und dem kurzen Haarnadel-Primer ist so effizient, dass das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis über einen weiten Temperaturbereich hinweg unter einer Vielfalt von Reaktionsbedingungen gleich sein wird.
Dieses Verfahren kann auf viele Amplifizierungssysteme angewandt werden, in welchen ein einzelsträngiges Oligonukleotid in das doppelsträngige Produkt eingebaut wird, und ist mit jedweder thermostabilen DNA-Polymerase kompatibel. Das vorliegende Beispiel verwendete Pfu^exo–-DNA-Polymerase, ein Enzym ohne 5'-3'- und 3'-5'-Exonuklease-Aktivität. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Taq-Polymerase erhalten, welche 5'-3'-Exonuklease-Aktivität aufweist (Daten nicht gezeigt). 5'-3'-Exonuklease-Aktivität ist ein Teil der Exzisions-Reparatur-Funktion von manchen DNA-Polymerasen, und wird einen freien Primer nicht angreifen. Wenn jedoch der verlängerte Haarnadel-Primer noch seine Haarnadel-Konfiguration beibehält, wenn er an die Matrizen-DNA annealt ist, dann wird DNA-Polymerase das 5'-Ende des Haarnadel-Stammes hydrolysieren, und das 5'-Nukleotid mit dem angehefteten Donor oder Akzeptor wird in die Lösung freigesetzt werden. In jedem Fall, Replikation oder Hydrolyse, wird das Donor-Fluorophor von dem Akzeptor getrennt werden, das Löschen wird eliminiert werden und das Fluoreszenzsignal aus dem Amplifikationsprodukt wird nachgewiesen werden, was gestattet, dass jedwede thermostabile DNA-Polymerase für das vorgeschlagene Amplifizierungs/Detektions-Verfahren verwendet werden kann.
Das in diesem Beispiel präsentierte 35-fache Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis kann wahrscheinlich noch weiter erhöht werden. Veröffentlichte Daten legen nahe, dass, wenn das Fluorophor und der Quencher kovalent aneinander verknüpft sind, eine 200-fache Löschung erzielt werden kann (Wang et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31: 6493–6496). Dies impliziert, dass das Plazieren von FRET-Markierungen in dichterer Nähe zueinander auf der Stammstruktur die Effizienz des Löschens erhöhen wird. Dieses Ziel kann durch mehrere Vorgehensweisen erzielt werden, wie Variation der Linker-Arme, Verändern der Positionen der Markierungen oder Verwendung von FRET-Paaren, in welchen der Donor und Akzeptor eine gewisse Affinität füreinander aufweisen. Ein anderer Weg zur Verbesserung des Systems besteht darin, die Thermostabilität der FRET-markierten Oligonukleotide zu erhöhen, um eine Erhöhung des Hintergrunds während der Amplifikation aufgrund der spontanen Freisetzung der Markierungen in die Lösung zu verhindern.
Das in diesem Beispiel präsentierte, beschriebene Verfahren kann auf jedwedes diagnostische Vorgehen angewandt werden, in welchem die Gegenwart der Ziel-Nukleinsäure entweder qualitativ oder quantitativ detektiert werden soll. Es kann auf die Detektion von Erregern von infektiösen Krankheiten und Mikroorganismus-Kontamination von Nahrungsmitteln oder Wasser sowie auf die Detektion mancher Formen von Krebs angewandt werden. Ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von jedweder Anwendung dieses Verfahrens ist die Optimierung der Struktur der Primer und der Zyklierungs-Bedingungen, da jedes Nebenprodukt ein Signal ergeben kann. Jedoch wird die Optimierung durch die Tatsache erleichtert, dass die Größe und Reinheit des Produkts mittels Gelelektrophorese bestätigt werden können, da die mit den markierten Haarnadelprimern amplifizierte DNA durch ein beliebiges der herkömmlichen Verfahren analysiert werden kann.
Das vorliegende Beispiel zeigt die Nützlichkeit dieses Verfahrens für die Detektion von cDNA von Prostata-spezifischem Antigen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Spezifität und die Empfindlichkeit der Detektion vergleichbar zu denjenigen von anderen amplifikationsbasierenden Verfahren sind: So wenig wie zehn Moleküle des Anfangsziels können detektiert werden. Dieses Verfahren kann auch für eine "Multiplex"-Analyse eingesetzt werden, in welcher mehrere Ziele in der gleichen Reaktion amplifiziert werden. Für diesen Zweck können mit unterschiedlichen Fluorophoren markierte Haarnadel-Primer verwendet werden. Für klinische Anwendungen, in welchen eine große Anzahl von Proben getestet werden soll, könnte eine Fluoreszenz-Platten-Lesevorrichtung verwendet werden, um die Assay-Ergebnisse abzulesen, und zwar entweder separat oder gekoppelt mit der PCR-Maschine.
13. BEISPIEL 7: ASSAY BEZÜGLICH DES METHYLIERUNGSSTATUS VON CpG-INSELN UNTER VERWENDUNG VON PCR MIT HAARNADEL-PRIMERN
13.1. MATERIALIEN UND METHODEN
Genomische DNA wurde aus den Zelllinien OH3 (unmethylierte P16-DNA) und HN 12 (methylierte P16-DNA) (bezogen von Drs. S. B. Baylin und D. Sidransky, The Johns Hopkins Medical Institutions) erhalten und mit Bisulfit behandelt (Herman et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821–9826).
Drei Sätze von PCR-Primern (26), welche jeweils Bisulfit-behandelte unmethylierte DNA (Uup und Ud (SEQ ID Nr.: 19 bzw. 20)), Bisulfit-behandelte methylierte DNA (Mup und Md) (SEQ ID Nr.: 21 bzw. 22) und die DNA, welche nicht mit Bisulfit behandelt wurde, (Wildtyp, WT) (Wup und Wd) (SEQ ID Nr.: 23 bzw. 24) amplifizieren, wurden chemisch synthetisiert. Einer der zwei Primer in jedem Satz wies eine Haarnadel-Struktur an seinem 5'-Ende, die mit FAM/DABCYL markiert war, auf.
Die PCR wurde in 40 μl von 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0,25 mM von jedem dNTP, 0,5 μM jedes Primers, 100 ng der entsprechenden DNA-Matrize und 1 Unit AmpliTaq Gold^TM-Polymerase (Perkin Elmer) durchgeführt. Das Thermozyklieren wurde unter Anwendung von Denaturierung während 12 Minuten bei 94°C (diese Bedingungen wurden auch für die Aktivierung der AmpliTaq Gold^TM-Polymerase erfordert), worauf 35 Zyklen von 45 Sekunden bei 95°C, 45 Sekunden bei 65°C und 1 Minute bei 72°C folgten, durchgeführt. Die PCR wurde mit einer abschließenden 5 Minuten langen Verlängerung bei 72°C beendet.
13.2. ERGEBNISSE
Die Reaktionsprodukte wurden analysiert, wie beschrieben im Abschnitt 6. Nach PCR-Amplifizierung wurden die Fluoreszenzintensitäten der Reaktionsmischungen gemessen. Die Fluoreszenzintensität der in Gegenwart von DNA-Matrize (+) amplifizierten Reaktionsmischung unterschied sich signifikant von der Fluoreszenzintensität der Reaktionsmischung, welche in Abwesenheit von DNA-Matrize (–) amplifiziert wurde (Tabelle 2). Als zum Beispiel ein U-Primer-Set (zur Amplifikation einer Sequenz von U-DNA (Bisulfit-behandelt, unmethyliert), siehe Tabelle 2) mit U-DNA verwendet wurde, wurde diese amplifiziert, und die Intensität des Signals unterschied sich signifikant von der Intensität der Reaktionsmischung ohne Matrize. In ähnlicher Weise führte die Verwendung eines M-Primer-Sets zu einer Amplifizierung von M-DNA (Bisulfit-behandelt, methyliert), und die Verwendung eines W-Primer-Sets führte zur Amplifizierung von W-DNA (Wildtyp, chemisch unmodifiziert).
13.3. SCHLUSSFOLGERUNG
Die Ergebnisse zeigen, dass MET-markierte Haarnadel-Primer in einer Amplifikationsreaktion verwendet werden können, um zuverlässig und empfindlich methylierte oder unmethylierte DNA zu detektieren.
14. BEISPIEL 8: PCR-AMPLIFIKATION UNTER VERWENDUNG EINES UNIVERSELLEN HAARNADEL-PRIMERS
14.1. EINLEITUNG
Dieses Beispiel präsentiert Experimente, in welchen ein universeller Haarnadel-Primer, zusammen mit zwei gewählten linearen Primern, Primer 1 und dem "getailten" Primer 2, verwendet wurde, um eine PCR-Amplifikation zu primen (siehe Abschnitt 5.2.1). Der universelle Haarnadel-Primer wurde in das Amplifikationsprodukt eingebaut und wurde nicht an eine der zwei linearen Primer-Sequenzen ligiert. Die 3'-Sequenz des universellen Haarnadel-Primers war identisch zur 5'-Sequenz von einem aus dem Paar von linearen Vorwärts- und Rückwärts-Primern, welche in der Amplifikation verwendet wurden, und diese 5'-Sequenz (Sequenz "A" auf Primer 2 in 5) war nicht komplementär zu der Zielsequenz.
Während des ersten Zyklus der PCR wurde der Primer 1 (5), welcher komplementär zu einem Ziel-DNA-(+)-Strang war, verlängert. Primer 2 (5) hatte einen 3'-Abschnitt, der eine zum Zielsequenz-(–)-Strang komplementäre Sequenz aufwies, und einen in 5 als "A" bezeichneten 5'-Abschnitt, welcher eine Sequenz aufwies, die nicht komplementär zur Zielsequenz war. (Die Sequenzen für Primer 1 und Primer 2 erscheinen nachstehend in Abschnitt 14.2.). Die Sequenz A war 15 Nukleotide lang.
Während des zweiten Zyklus wurde das Produkt der Verlängerung von Primer 2 (gezeigt durch den Pfeil in 5) eine Matrize für Primer 1. Der Primer 1 wurde verlängert und das Amplifikationsprodukt erlangte eine als "A'" bezeichnete Sequenz, welche komplementär zur Sequenz A war.
Während des dritten Zyklus annealte die A-Sequenz des universellen Haarnadel-Primers an die A'-Sequenz des Amplifikationsprodukts aus dem vorhergehenden Zyklus. Das 3'-Ende der Matrize wurde verlängert, der universelle Haarnadel-Primer wurde entfaltet und kopiert, der Quencher und das Fluorophor wurden getrennt, und ein Fluoreszenzsignal wurde von dem Amplifikationsprodukt emittiert.
Während des vierten Zyklus wurde der verlängerte universelle Haarnadel-Primer eine Matrize für Primer 1. Während der Verlängerung von Primer 1 entfaltete sich die Haarnadel und wurde kopiert, der Quencher und das Fluorophor wurden getrennt, und ein Fluoreszenzsignal wurde von dem Amplifikationsprodukt emittiert.
Die Bedingungen der Reaktion und die Konzentrationen der Primer wurden so optimiert, dass > 80% des PCR-Produkts eingebauten universellen Primer enthielten und durch Fluoreszenzdetektion nachweisbar waren.
14.2. MATERIALIEN UND METHODEN
PCR-Bedingungen.
In einem Satz von Experimenten (siehe Tabelle 3, untenstehend) wurde die Amplifikation von in pUC19-Plasmid klonierter Prostata-spezifisches-Antigen(PSA)-cDNA, genomischer Chlamydia-DNA und dem im humanen Gesamt-Genom vorhandenen P16-Gen unter Verwendung von PCR-Amplifikation mit einem universellen Haarnadel-Primer, der mit Flu/DABCYL markiert war (siehe "Sequenz des universellen Haarnadel-Primers", untenstehend), und drei Paaren von linearem Primer 1 und linearem getailten Primer 2, welche für PSA, Chlamydia bzw. P16 spezifisch waren, durchgeführt. 10⁶ Moleküle an PSA- und Chlamydia-Sequenzen und 100 ng humane DNA wurden pro Reaktion verwendet.
Die Amplifikationen wurden in 20 μl 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% Gelatine, 200 μM von jedem dNTP, 0,5 μM Primer 1, 0,1 μM Primer 2, 0,5 μM des mit Flu/DABCYL markierten universellen Haarnadel-Primers und 1 Unit Taq DNA-Polymerase (Takara, Shiga, Japan) durchgeführt. Für die Amplifikation des P16-Gens wurde jedoch eine Hot Start^TM-Amplifikation ausgeführt, wobei AmpliTaq Gold^TM-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) anstelle von Taq verwendet wurde. Für optimale Amplifikationsbedingungen wurde die Konzentration des getailten Primers (Primer 2) niedrig gehalten, um einen Großteil an PCR-Amplifikationsprodukt mit eingebautem universellem Haarnadel-Primer zu erhalten.
Das Thermozyklieren wurde mit 5 Minuten Denaturierung bei 94°C, gefolgt von 20–40 Zyklen: 20 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C durchgeführt und mit einer abschließenden 5-minütigen Verlängerung bei 72°C beendet. Die erforderliche Anzahl an Zyklen hängt von der Konzentration des anfänglichen Ziels ab. Eine PCR-Reaktion mit einem universellen Haarnadel-Primer erfordert üblicherweise 3–5 Zyklen mehr als eine reguläre PCR, um eine vergleichbare Menge an Produkt zu erhalten. Das Einbauen des universellen Haarnadel-Primers beginnt erst ab Zyklus 3 (5), und es besteht des Weiteren die Kompetition durch den getailten Primer während der gesamten Amplifikation.
Zwei Kontrollreaktionen wurden für jedes DNA-Ziel ausgeführt. Die Kontrolle 1 enthielt keinen getailten Primer in der Reaktionsmischung. In diesem Falle würde kein Produkt erwartet werden, wenn der universelle Haarnadel-Primer lediglich spezifisch für die Sequenz wäre, welche komplementär zu der Tail-Sequenz ist, und nicht an irgendeine andere Sequenz des DNA-Ziels hybridisieren könnte.
Die Kontrolle 2 enthielt kein DNA-Ziel in der Reaktionsmischung.
In einer zweiten Gruppe von Experimenten (siehe Tabelle 4), wurde ein Satz von PCR-Amplifikationen unter Verwendung variierender Konzentrationen des PSA-cDNA-Ziels und des PSA-spezifischen Primers 1 und des getailten Primers 2 und des universellen Haarnadel-Primers durchgeführt. Ein anderer Satz an (herkömmlichen) PCR-Amplifikationen wurde unter Verwendung von PSA-spezifischem Primer 1 und ungetailtem Primer 2 ausgeführt.
Die PCR in dieser zweiten Gruppe von Experimenten wurde in 40 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0,25 mM von jedem dNTP, 0,5 μm jedes Primers, 100 ng der entsprechenden DNA-Matrize und 1 Unit AmpliTaq Gold^TM-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) durchgeführt. Das Thermozyklieren wurde unter Verwendung von Denaturierung während 12 Minuten bei 94°C durchgeführt. Diese Bedingungen wurden auch für die Aktivierung der AmpliTaq Gold^TM-DNA-Polymerase angewandt, und an sie schlossen sich 35 Zyklen von 45 Sekunden bei 95°C, 45 Sekunden bei 65°C und 1 Minute bei 72°C an. Die PCR wurde mit einer abschließenden 5-minütigen Verlängerung bei 72°C beendet.
Die Produkte der Amplifikation unter Verwendung der linearen unmarkierten Primer wurden auf mit Ethidiumbromid gefärbten Gelen sichtbar gemacht.
Fluoreszenz-Detektion.
Ein Shimadzu RF-5000-Spektrofluorophotometer wurde verwendet, um die Fluoreszenzspektren der individuellen Proben zu messen. Ein 5-μl-Aliquot der Reaktionsmischung wurde mit 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂ auf 600 μl verdünnt und in eine 10 × 3-mm-Küvette (NSG Precision Cells, Inc., Farmingdale, NY) bei Raumtemperatur eingebracht. Für das Fluorescein/4-(4'-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure(DABCYL)-FRET-Paar wurde eine Anregungswellenlänge von 488 nm verwendet, und ein Spektrum wurde zwischen 500 und 650 nm erfasst.
Die Fluoreszenzintensitäten wurden nach Subtrahieren des Hintergrunds bestimmt. Der Hintergrund wurde als die Fluoreszenz des universellen Haarnadel-Primers in der Reaktionsmischung, bevor die PCR-Amplifizierungsreaktion ausgeführt wurde, definiert.
Wenn die Menge des anfänglichen Ziels nicht zu niedrig war (1000 Moleküle oder mehr), wurde das fluoreszente PCR-Amplifikationsprodukt auch durch Plazieren des Röhrchens direkt gegen ein UV-Transilluminator-Bild-Analysesystem (Appligene, Straßburg, Frankreich) visualisiert und mit einer montierten Kamera unter Verwendung eines D540/40-Grünfilters (Chroma Technology, Brattleboro, VT) fotografiert.
Alternativ dazu kann, zum Erhalten quantitativer Ergebnisse, ein fluorometrisches Plattenlesegerät verwendet werden. In diesem Fall kann die Reaktion in einer verschlossenen 96-Loch-PCR-Platte ausgeführt werden. Die gleiche Platte wird dann in das Plattenlesegerät überführt, und die von der Oberseite der Platte emittierte Fluoreszenz wird gemessen. Die Messung kann nach der gewünschten Zahl an Zyklen vorgenommen werden. Wenn das Signal nicht stark genug sein wird, kann dieselbe Platte zurück in die PCR-Maschine überführt werden, und weitere Zyklen können nach dem kurzen (1–2 Minuten) Vorwärmschritt durchgeführt werden. Um die exakte Menge des Anfangsziels zu bestimmen, sollte die richtige interne Kontrolle eingeschlossen werden. Ein Haarnadel-Primer einer unterschiedlichen Farbe sollte als die interne Kontrolle verwendet werden. Die Quantifizierung des anfänglichen Ziels kann erleich tert werden, wenn eine Echtzeit-Detektions-PCR-Maschine eingesetzt wird, z. B. ein Idaho Light-Cycler (Idaho Technology, Inc., Idaho Falls, ID).
Sequenz des universellen Haarnadel-Primers.
Die in Fettdruck dargestellte Sequenz ist identisch zu dem "Tail" auf den spezifischen Primern.
Sequenzen von spezifischen linearen Primern.
In jeder Sequenz erscheint die Tail-Sequenz von Primer 2 in fett gedruckten Kleinbuchstaben.
PSA: Primer 1:
Primer 2:
Genomische Chlamydia-DNA Primer 1:
Primer 2:
P16 Primer 1:
Primer 2:
14.3. ERGEBNISSE
Wie in der Tabelle 3 gezeigt, kann ein universeller Haarnadel-Primer in einer PCR-Amplifikationsreaktion verwendet werden, um drei verschiedene Ziele spezifisch zu detektieren. Alle drei genomischen Sequenzen, PSA, genomische Chlamydia-DNA und P16, wurden amplifiziert: und ihre Amplifikationsprodukte wurden durch Messen der Fluoreszenzspektren der Amplifikationsreaktionen mit einem Spektrofluorophorometer detektiert.
Darüber hinaus wurden die Produkte der Amplifikation von PSA und Chlamydia durch Plazieren der Röhrchen auf einem Transilluminator und Fotografieren derselben durch einen Grünfilter visualisiert. Die Ergebnisse sind in den 28A–B präsentiert. Die Fluoreszenz war nach der Amplifikation, verglichen mit den Kontrollen, signifikant erhöht, was anzeigt, dass die DNA-Ziele amplifiziert worden waren.
Die Empfindlichkeit von PCR-Amplifikationen unter Verwendung von Primer 1, getailtem Primer 2 und dem universellen Haarnadel-Primer wurde mit derjenigen von herkömmlichen PCR-Amplifikationen verglichen, welche Primer 1 und ungetailten Primer 2 verwendeten. Wie in der Tabelle 4 (nachstehend) demonstriert, ist die Empfindlichkeit einer PCR-Reaktion unter Verwendung von Primer 1, getailtem Primer 2 und dem universellen Haarnadel-Primer vergleichbar zu derjenigen, welche in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von Primer 1 und ungetailtem Primer 2 erhalten wird. Unter optimierten Bedingungen und Konzentrationen der Primer, wie beschrieben in Abschnit 14.2, konnten so wenig wie 10 Moleküle des PSA-Ziels detektiert werden, wobei entweder der universelle Haarnadel-Primer oder die herkömmlichen linearen (ungetailten) sequenzspezifischen Primer verwendet wurden. Die Fluoreszenz intensität wurde nach Subtraktion des Hintergrunds, welcher vorhanden war, bevor die PCR-Amplifizierungsreaktion durchgeführt wurde, bestimmt.
14.4 DISKUSSION
Die in diesem Beispiel präsentierten Ergebnisse demonstrieren, dass es mehrere verschiedene Vorteile der Verwendung von universellen Haarnadel-Primern anstatt der herkömmlichen linearen PCR-Primer in einer PCR-Amplifizierung gibt.
Zum Ersten kann ein universeller Haarnadel-Primer für eine Amplifikation mit jedwedem früher optimierten Set von PCR-Primern verwendet werden. Zum Zweiten erlaubt die Verwendung des universellen Haarnadel-Primers ein Geschlossenes-Gefäß-Format; Amplifikation und Detektion werden im gleichen Röhrchen durchgeführt, ohne es jemals zu öffnen. Dies gewährleistet, dass es keine Übertragskontamination mit Amplikon (Amplifikationsprodukte aus früheren Reaktionen) und folglich keine falschen positiven Ergebnisse geben wird. Eine derartige Minimierung von Übertragskontamination ist besonders bedeutsam, wenn große Zahlen von klinischen Proben analysiert werden. In der Vergangenheit ist eine Kontamination im Allgemeinen schwierig zu vermeiden gewesen, wenn große Zahlen von klinischen Proben analysiert wurden und falsche positive Ergebnisse sind schädlich. Die Verwendung der universellen Haarnadel-Primer der Erfindung in 'Geschlossenes-Gefäß'-PCR-Amplifikationen vermeidet die Möglichkeit einer derartigen Kontamination. Unter Vervendung dieses ,Geschlossenes-Gefäß'-Formats und der Haarnadel-Primer der Erfindung in einem PCR- basierenden Assay können mindestens drei unterschiedliche Ziele in einem Assay spezifisch detektiert werden.
Zum Dritten können durch Verwenden der universellen Haarnadel-Primer der Erfindung in einer PCR-Amplifikation quantitative Ergebnisse erhalten werden. Man kann die Menge an Amplifikationsprodukt z. B. unter Verwendung eines fluorimetrischen Plattenlesegeräts quantifizieren, vorausgesetzt, dass geeignete interne Kontrollen, z. B. eine bekannte Anzahl von Molekülen einer zweiten bekannten Zielsequenz und die entsprechenden Primer für dieses Ziel, verwendet werden.
Zum Vierten muss man durch Verwenden der universellen Haarnadel-Primer der Erfindung in einer PCR-Amplifikation keine zeitaufwendige Nach-Amplifikations-Analyse, wie Gelelektrophorese oder Dot-Blot, durchführen. Durch Weglassen dieses Schrittes spart man 2–3 Stunden bei jedem Satz von Amplifikationsreaktionen ein.
Schließlich zeigen die hier präsentierten Ergebnisse, dass der universelle Haarnadel-Primer verwendet werden kann, um das P16-Gen zu amplifizieren. Somit ist ein universeller Haarnadel-Primer geeignet zur Einbringung in ein Kit für die Detektion des Methylierungsstatus des P16-Gens, welches ein Tumorsuppressor ist.
15. BEISPIEL 9: VERWENDUNG VON HAARNADEL-PRIMERN IN EINEM "TELOMERIC REPEAT AMPLIFICATION"-PROTOKOLL(TRAP)-ASSAY FÜR DIE DETEKTION VON TELOMERASE-POSITIVEN ZELLEN
Das vorliegende Beispiel demonstriert die Detektion von Telomerase-positiven Zellen, in welcher ein TRAP-Assay mit einem Haarnadel-Primer der Erfindung verwendet wird.
15.1. METHODEN UND ERGEBNISSE
Experiment 1.
Ein 17 bp langes Nukleotid, 5'-ACGCAATGTATGCGT*GG-3' (SEQ ID Nr.: 29) wurde an das 5'-Ende eines RP-Primers angefügt (30A). FAM wurde an das 5'-Ende des Oligomers angeheftet, und DABCYL wurde an den T*-Rest angeheftet. Als sich die Intra-Ketten-Stamm-Schleife des Haarnadel-Primers ausbildete, wurden die FAM- und DABCYL-Reste einander gegenüberliegend positioniert (30A). In dieser Konfiguration war die Fluoreszenzemission des 5'-FAM im nicht-eingebauten Oligomer aufgrund des FRET zwischen FAM und DABCYL minimal.
Eine Reihe von TRAP-Assays unter Verwendung dieses Haarnadel-RP-Primers demonstrierte, dass die 5'-Modifikation des RP die Effizienz des TRAP-Assays nicht signifikant veränderte (30B). TRAP-Assays wurden unter Verwendung von TS-Primer und der RP-Primer-Sequenz (SEQ ID Nr.: 37), welche in 30A gezeigt sind, mit Zellextrakt, äquivalent zu 10000, 1000, 100 oder 10 Zellen durchgeführt. Es wurden auch drei Negativkontrollen durchgeführt (30B): "keine Taq", in welcher keine Taq-Polymerase in die Reaktion zugesetzt wurde (Negativkontrolle 1); "CHAPS", in welcher CHAPS-Lysispuffer anstelle von Zellextrakt in der Reaktion verwendet wurde (Negativkontrolle 2); "+H", Zellextrakt aus 10000 Zellen wurde vor dem Assay hitzebehandelt (Negativkontrolle 3). Vier Reaktionsröhrchen (0,05 ml pro Röhrchen) wurden für jeden Extrakt oder jede Kontrolle angesetzt, und eine PCR-Amplifikation in einem Thermozykler (Zyklus-Bedingungen: 94°C während 30 Sekunden und 55°C während 30 Sekunden) wurde während der in 30B angegebenen Zahl von Zyklen ausgeführt. Am Ende der Zyklen wurden die Röhrchen aus dem Heizblock des Thermozyklers entfernt und im Dunklen bis zur Messung hinsichtlich der Fluoreszenz aufbewahrt. Um Fluoreszenzmessungen auszuführen, wurden 0,02 ml der Reaktionsmischung mit 0,60 ml Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂) gemischt, und die Emission bei 516 nm, welche durch Licht von 488 nm angeregt wurde, wurde mit einem Shimadzu RF5000U-Spektrofluorophotometer gemessen.
Durch Optimieren der Reaktionsbedingungen wurde ein sehr niedriger Spiegel an Telomeraseaktivität detektiert; die Empfindlichkeit des Assays ist vergleichbar zu derjenigen von herkömmlichen Assays, welche eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese von PR-Produkten anwenden (30B).
Experiment 2.
Im ersten Schritt eines in situ-TRAP-Assays wird ein Objektträger von ausgewählten Geweben oder Zellen von Interesse hergestellt. Unfixierte Gewebe werden rasch in flüssigem Stickstoff eingefroren, und Gefrierschnitte werden durch Mikrotom-Schneiden angefertigt. Einzelzell-Ausstriche werden durch Zentrifugation von Zellsuspensionen unter Verwendung von z. B. Cytospin^TM (Shandon Lipshaw Inc., Pittsburgh, PA) hergestellt. Die präparierten Objektträger werden dann mit einer Lösung behandelt, welche RNase-freie DNase in 40 mM Tris-HCl, pH 7,4, 6 mM MgCl₂ und 2 mM CaCl₂ enthielt, während 5–15 Stunden behandelt.
Ein Objektträger-Versiegelungssystem, Probe-Clips (GraceBio-Labs, Pontiac, MI) wird verwendet. Probe-Clips werden auf den Objektträgern angebracht, und die Proben werden mit der DNA-Lösung bedeckt und 5–15 Stunden lang inkubiert. Die Probe-Clips, welche eine versiegelte Kammer um die Probe herum ohne die Verwendung von Klebstoffen oder anderen toxischen Lösungsmitteln bilden, können auch in der TRAP-Verlängerungs-Amplifikationsreaktion verwendet werden.
Der TRAP-Assay wird an den Proben auf den präparierten Objektträgern unter Befolgung der Anweisungen durchgeführt, welche mit dem TRAP-eze^TM-Kit bereitgestellt werden. Die experimentellen Bedingungen für standardmäßige Im-Gefäß-TRAP-Assays können mit geringfügiger Abwandlung verwendet werden. Nach der Amplifikation werden die Objektträger direkt unter einem Fluoreszenzmikroskop ohne Detektions-/Waschsschritte nach der PCR-Amplifikation betrachtet. Die Zellen werden nur fluoreszieren, wenn das Gen-Ziel von Interesse amplifiziert ist.
16. BEISPIEL 10: VERWENDUNG VON HAARNADEL-PRIMERN IN EINEM "AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION SYSTEM"(ARMS)-ASSAY
16.1. EINLEITUNG
Eine Allel-spezifische PCR wurde unter Verwendung von Haarnadel-Primern durchgeführt, um die normale Sequenz und die W64R-Mutation des Gens für beta-3-adrenergen Rezeptor (B3AR) zu amplifizieren. Das normale Produkt des Gens ist ein G-Protein-verknüpfter Rezeptor, welcher vorwiegend in viszeralem Fett exprimiert wird. Man nimmt an, dass er ein Regulator der Ruhezustand-Stoffwechselrate und der Lipolyse ist, und die W64R-Mutation ist mit Fettleibigkeit in Verbindung gebracht worden (Clement et al., 1995, New Engl. J. Med. 333: 352–354).
16.2. METHODEN
Der Amplifikations-"Refractory"-Mutations-System(ARMS)-Assay (Newton et al., 1989, Nucl. Acids Res. 17: 2503–2516) wurde für Allel-spezifische PCR angewandt. Die stromaufwärts gelegenen allelischen Primer in dem ARMS-Assay besaßen ein Haarnadel-Format und verwendeten einen gemeinsamen Stromabwärts-Primer. Der ARMS-Assay ist so ausgelegt, dass es eine Fehlpaarung am 3'-Ende des Primers gibt, wenn der Primer an das unkorrekte Allel gepaart ist.
Die Sequenz des B3AR-Gens und die allelischen Primer sind in der Tabelle 5 (nachstehend) gezeigt. Fettdruck-Buchstaben sind verwendet worden, um das Codon 64 der B3AR-Sequenz hervorzuheben, und die unterstrichenen Sequenzen geben den Bereich an, für welchen die Allel-spezifischen Primer entworfen wurden. Haarnadel-Primer wurden an einem internen Thymin, wie angezeigt in der Tabelle 5, unter Verwendung von DABCYL als dem Quencher, und auf dem 5'-Ende mit FAM als dem Fluorophor modifiziert.
Der ARMS-Assay wurde in 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, ausgeführt, welcher 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 400 μM jeweilig dATP, dCTP, dTTP und dGTP und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) enthielt. Die Primer wurden bei einer Konzentration von jeweils 1 μM und Taq-Polymerase (Takara, Shiga, Japan) bei 1,5 U pro 20 μl-Reaktion verwendet. Die 20-μl-PCR-Reaktionen wurden auf einem PE-2400-Thermozykler (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) während 4 Minuten bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 30 Sekunden bei 72°C, gefolgt von einer 10 Minuten langen Inkubation bei 72°C und Halten bei 4°C durchgeführt.
16.3. ERGEBNISSE
Unter Verwendung der obenstehend beschriebenen Reaktionsbedingungen wurden klonierte normale (W64) und mutante (R64) Matrizen hinsichtlich der Amplifikationsspezifität und -Ausbeute getestet. Eine Negativ-Kontrolle ohne Ziel wurde ebenfalls mit jeder Reaktion ausgeführt. Nach der PCR wurden 3 μl jeder PCR-Reaktion auf einem Gel laufen gelassen und mit Ethidiumbromid gefärbt. Unter Verwendung des obenstehend beschriebenen PCR-Systems ergab das normale (W64)-Ziel nur eine sichtbare Bande, wenn der normale Primer vorhanden war, und das mutante Ziel (R64) ergab nur eine sichtbare Bande, wenn das mutante Ziel vorhanden war. Es wurden keine Hintergrund-PCR-Artefakte in der Negativkontrolle oder in den PCR-Reaktionen, welche mit dem fehlgepaarten Ziel durchgeführt wurden, beobachtet. Jede PCR-Reaktion wurde auch hinsichtlich der Fluoreszenz-Ausbeute durch Verdünnen von 5 μl aus jeder Reaktion in 0,6 ml Puffer aus 15 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl und 2 mM MgCl₂ getestet. Die Fluoreszenz jeder Reaktion wurde auf einem Shimadzu RF-5000U-Spektrofluorophotometer unter Anwendung einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 516 nm gemessen.
Nach Subtrahieren der Hintergrund-Fluoreszenz der Negativkontrolle von jeder Probe wies die PCR, welche mit dem normalen (W64) allelischen Primer und der normalen (W64) Ziel-DNA durchgeführt worden war, eine relative Fluoreszenz von 37 auf, wohingegen die Fluoreszenz aus der PCR, welche mit dem normalen (W64) allelischen Primer und dem mutanten Ziel (R64) durchgeführt worden war, gleich wie die der Negativkontrolle war. Die PCR, welche mit dem mutanten (R64) allelischen Primer und der normalen (W64) Ziel-DNA durchgeführt worden war, wies eine relative Fluoreszenz von 2 auf, und die PCR, welche mit dem mutanten (R64) allelischen Primer und dem mutanten Ziel (R64) durchgeführt worden war, wies eine relative Fluoreszenz von 19 auf. Diese Ergebnisse zeigen eine gute PCR-Produkt- und Fluereszenz-Ausbeute aus einer Allel-spezifischen PCR unter Verwendung von Haarnadel-Primern mit einer ARMS-Auslegung, und das Vermögen zur Unterscheidung von norma len und mutanten Allelen lediglich auf Basis von Fluoreszenz, ohne die Notwendigkeit, eine Gelelektrophorese durchzuführen.
17. BEISPIEL 11: ASSAY BEZÜGLICH DER gag-REGION DES VIRALEN HIV-1-GENOMS UNTER VERWENDUNG VON INSITU-PCR MIT HAARNADEL-PRIMERN
17.1. EINLEITUNG
HIV-1-Provirus ist sehr schwierig mit standardmäßiger in situ-Hybridisierung zu detektieren, kann jedoch routinemäßig und zuverlässig nach einer in situ-PCR detektiert werden, jedoch mit dem zusätzlichen Zeit- und Kostenaufwand von Hybridisierungs- und Waschschritten. Das vorliegende Beispiel beschreibt Verfahren der Erfindung, welche die akkurate und empfindliche Detektion des Ziels direkt nach dem Amplifikationsschritt gestatten.
Die folgenden Verfahren werden angewandt, um ein HIV-1-DNA-Ziel zu detektieren und verwenden FRET-markierte Haarnadel-Primer in einer in situ-PCR. Diese Verfahren vermeiden den Hybridisierungsschritt und werden nicht zu falschen positiven Ergebnissen aufgrund von DNA-Reparatur führen. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass die Erzeugung des Fluoreszenzsignals durch das Produkt selbst anstatt durch die hybridisierte Sonde erfolgt, wie in früheren in situ-PCR-Verfahren. Die hauptsächliche Anwendung von in situ-PCR ist gegenwärtig die Detektion von viraler DNA oder RNA. Eine Verbesserung der Empfindlichkeit, wie sie durch Verwendung der markierten Primer der Erfindung bereitgestellt wird, wird breitere Anwendungen, wie Detektion von kleinen Gen-Deletionen oder Mutationsdetektion, durch Allel-spezifische in situ-PCR gestatten.
17.2. MATERIALIEN UND METHODEN
Gewebe, welche einen weiten Bereich von potenziell HIV-1-infizierten Zellen umfassen, einschließlich denjenigen aus dem Zentralnervensystem, Lymphknoten und Milz, werden hinsichtlich HIV-1-DNA in einem Assay untersucht, wobei die FRET-markierten Primer der Erfindung und standardmäßige, üblicherweise im Fachgebiet bekannte in situ-PCR-Verfahren angewandt werden (siehe z. B. Nuovo und Bloch, U.S.-Patent Nr. 5 538 871; Bagasra und Seshamma, 1994, Protocol: In situ amplification and hybridization, Zweite Ausgabe, John Wiley and Sons, Somerset, NJ).
Ein Paar von Stromaufwärts- und Stromabwärts-PCR-Primern (SEQ ID Nr.: 43–44, siehe nachstehend) wird chemisch synthetisiert und verwendet, um einen Abschnitt einer Sequenz aus der gag-Region einer HIV-1-Virengenom-DNA zu amplifizieren. Einer oder beide Oligonukleotid-PCR-Primer, welche verwendet werden, kann/können eine Haarnadel-Struktur an dem 3'-Ende aufweisen, welche mit einem MET-Paar, z. B. FAM/DABCYL, markiert ist.
Zum Beispiel kann ein Haarnadel-Primer verwendet werden, in welchem die einzelsträngige Nukleotidsequenz an seinem 3'-Ende die Sequenz von SEQ ID Nr.: 43 oder SEQ ID Nr.: 44 umfasst, so dass er in der Lage ist, eine Synthese einer Nukleotidsequenz, welche komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, der die gag-Zielsequenz umfasst, durch eine Nukleinsäure-Polymerase zu primen.
Ein Beispiel eines derartigen Haarnadel-Primers, BSK38 (SEQ ID Nr.: 26) wird in der 27 gezeigt. Der Primer bildet eine Haarnadel-Struktur aus, in welcher MET auftreten wird, wenn der Primer nicht in das Amplifikationsprodukt eingebaut ist. Wenn er in das Amplifikationsprodukt eingebaut ist, verändert sich seine Konfiguration (d. h. er wird linearisiert) und, im Falle eines FAM/DABCYL-FRET-Paares, wird das Löschen eliminiert, und die Fluoreszenz des Donors wird detektiert.
Alternativ dazu kann es sich bei dem Paar von Primern um MET-markierte lineare Primer handeln, welche keine Haarnadel-Konfiguration ausbilden (siehe Abschnitt 5.4).
Wenn einer oder beide Primer lineare Primer sind, können sie die folgenden Sequenzen aufweisen, welche komplementär zu der gag-Sequenz sind:
Primer SK 38:
Primer SK 39:
In Kontrollexperimenten wird eine herkömmliche in situ-PCR (z. B. Nuovo, 1997, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Dritte Ausgabe, Lippincott-Raven Press, New York) unter Verwendung von zwei linearen Primern durchgeführt, welche komplementär zur gag-Sequenz sind, z. B. SK 38 (SEQ ID Nr.: 43) und SK 39 (SEQ ID Nr.: 44). Die Amplifikationsprodukte werden durch einen in situ-Hybridisierungsschritt unter Verwendung der SK 19-Sequenz als Sonde detektiert.
SK 19 (Hybridisierungs-Sonde):
Eine in situ-PCR unter Verwendung der FRET-markierten Primer der Erfindung wird durch Ausführen der folgenden Schritte durchgeführt. Zuerst wird eine Probe auf einen Glas-Mikroskop-Objektträger gebracht und dann mittels Standardverfahren fixiert. Übliche Fixiermittel schließen z. B. Ethanol, Methanol, Methanol:Essigsäure, Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd oder jedwedes sonstige im Fachgebiet bekannte Fixiermittel ein.
Die Probe wird gegebenenfalls mit einer Protease, z. B. Proteinase K, vorbehandelt, um das Eindringen von Amplifizierungsreagenzien zu unterstützen. Die Konzentration an Protease und die Behandlungszeit wird für jede Probe empirisch bestimmt.
Ein Amplifizierungscocktail, welcher aus Nukleotiden, Haarnadel-(oder linearen)Primern der Erfindung, einem Amplifikationspuffer und einer thermostabilen DNA-Polymerase, z. B. Taq-Polymerase, besteht, wird danach zugesetzt. Ein Deckgläschen oder eine andere geeignete Lösungs-Umschließungsvorrichtung wird angebracht, um die Konzentration des Cocktails während der anschließenden Thermozyklierungsschritte konsistent zu halten (für allgemeine Verfahren und Pufferzusammensetzungen für in situ-PCR siehe z. B. Nuovo, 1997, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Dritte Ausgabe, Lippincott-Raven Press, New York; Nuovo et al., U.S.-Patent Nr. 5 538 871).
Eine in situ-Amplifikation wird dann in einem Thermozykler z. B. für 30–40 Zyklen ausgeführt, wobei Bedingungen für das Annealing und die Verlängerung verwendet werden, welche zuvor durch Lösungs-PCR etabliert wurden, z. B. erster thermischer Zyklus, Denaturierung für 3 Minuten bei 94°C, und Annealing/Verlängerung für 2 Minuten bei 55°C; wobei die restlichen 39 Zyklen aus 1 Minute Denaturierung bei 94°C und 2 Minuten Annealing/Verlängerung bestehen.
Da die nicht-eingebauten Haarnadel-Primer kein Signal nach der Amplifizierung erzeugen, werden Waschschritte verringert oder eliminiert. Dies verbessert die Empfindlichkeit der Detektion, weil kein Amplifizierungsprodukt während Waschschritten nach der Amplifikation verloren geht.
Nach der PCR-Amplifizierung werden die MET-Signalintensitäten der Reaktionsmischungen unter Verwendung z. B. eines Fluoreszenz-Mikroskopes gemessen. Zellen, welche hinsichtlich der HIV-gag-Matrize positiv sind, sollten ein Signal, z. B. Fluoreszenz, zeigen; Zellen, welche hinsichtlich gag negativ sind, sollten kein Signal zeigen.
18. BEISPIEL 12: CHARAKTERISIERUNG DER gag-REGION DES HIV-1-VIRENGENOMS UNTER VERWENDUNG VON IN SITU-PCR MIT HAARNADEL-PRIMERN
18.1. EINLEITUNG
In diesem Beispiel wurde eine Reihe von HIV-1-infizierten Geweben aus der Milz, dem Lymphknoten, dem Gehirn und dem Gebärmutterhals hinsichtlich der gag-Region des HIV-1-Virengenoms unter Anwendung von in situ-PCR mit Haarnadelprimern getestet.
18.2. MATERIALIEN UND METHODEN
Ein Haarnadel-Primer und ein linearer Primer wurden chemisch synthetisiert und verwendet, um einen Abschnitt einer Sequenz aus der gag-Region einer HIV-1-Virengenom-DNA zu amplifizieren.
Der verwendete lineare Primer war SK 39 (SEQ ID Nr.: 44).
Der verwendete Haarnadel-Primer BSK38 (SEQ ID Nr.: 26) wird in der 27 gezeigt (siehe auch den obenstehenden Abschnitt 17). Die einzelsträngige Nukleotidsequenz des Haarnadel-Primers umfasste, an ihrem 3'-Ende, einen 3'-Abschnitt der Sequenz von SK 38 (SEQ ID Nr.: 43). Der 5'-Abschnitt des Primers umfasste eine mit einem FAM/DABCYL-MET-Paar markierte Haarnadel. Da die einzelsträngige 3'-Sequenz komplementär zu der gag-Sequenz war, diente sie als ein Primer.
Der Primer bildet eine Haarnadel-Struktur, in welcher MET auftreten wird, wenn der Primer nicht in das Amplifikationsprodukt eingebaut ist. Wenn er in das Amplifikationsprodukt eingebaut ist, verändert sich seine Konfiguration (d. h. er wird linearisiert), und im Falle eines FAM/DABCYL-FRET-Paars wird das Löschen eliminiert, und die Fluoreszenz des Donors wird detektiert.
In Kontrollexperimenten wurde eine herkömmliche in situ-PCR (Nuovo, 1997, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Dritte Ausgabe, Lippincott-Raven Press, New York) durchgeführt, wobei zwei lineare Primer, SK 38 (SEQ ID Nr.: 43) und SK 39 (SEQ ID Nr.: 44), welche zu der gag-Sequenz komplementär waren, in dem Amplifikationscocktail verwendet wurden (siehe untenstehend). Die Amplifikationsprodukte wurden durch einen in situ-Hybridisierungsschritt unter Verwendung der SK 19-Sequenz (SEQ ID Nr.: 45) als Sonde detektiert.
Eine in situ-PCR unter Verwendung des linearen Primers und des FRET-markierten Haarnadel-Primers der Erfindung wurde, im Wesentlichen wie beschrieben in Abschnitt 17, mit einigen wenigen Modifikationen durchgeführt. Gewebeschnitte wurden an Silan-beschichtete Glasmikroskop-Objektträger angebracht und eine Woche lang in 10-prozentigem neutral gepuffertem Formalin fixiert und dann in einem Paraffin-Einbettungsmedium eingebettet, wobei im Fachgebiet bekannte Standardverfahren angewandt wurden. Die Schnitte wurden (durch 5 Minuten langes Inkubieren mit Xylol, gefolgt von 100% Ethanol während 5 Minuten) deparaffinisiert. Die Probe wurde mit 2 mg/ml Pepsin während 30 Minuten vorbehandelt. 10–20 μl je Probe von einem Amplifikationscocktail wurden dann zu dem Objektträger zugesetzt, welcher dann mit einem autoklavierten Polypropylen-Deckgläschen abgedeckt und mit vorgewärmtem Mineralöl überschichtet wurde.
Der Amplifikationscocktail bestand aus den folgenden Reagenzien pro 50 μl Cocktail:
5 μl PCR-Puffer II (Perkin-Elmer)
9 μl MgCl₂ (Endkonzentration 4,5 mM)
8 μl dNTP (Endkonzentration je 200 μM)
1,5 μl 2% BSA
2 μl modifiziertes SK 38-Oligonukleotid (Endkonzentration von 0,2 μM)
2 μl SK39-Oligonukleotid (Endkonzentration 0,2 μM)
21,5 μl DEPC-behandeltes Wasser
1 μl Taq-Polymerase (Perkin-Elmer 5 U/μl)
Die in situ-Amplifikation wurde dann in einem Thermozykler während 35 Zyklen unter Verwendung eines "Hot Start"-Protokolls ausgeführt. Taq-Polymerase wurde aus dem Amplifikationscocktail weggelassen, bis der Block 55°C erreichte, dann wurde die DNA-Probe anfänglich durch 3 Minuten langes Erhitzen bei 94°C denaturiert, wonach das Zyklieren begann, mit Denaturierung während 1 Minute bei 94°C, und Annealing/Verlängerung während 1,5 Minuten bei 60°C.
Nach der PCR-Amplifikation wurde eine Hochstringenz-Waschung durchgeführt (60°C in 15 mM Salz und 2% BSA während 10 Minuten nach der PCR). Die MET-Signalintensitäten von Zellen in den Proben wurden dann unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops gemessen.
18.3. ERGEBNISSE
Die 34 zeigt die gag-positiven Zellen in Lymphknotengewebe aus einem Patienten mit früher HIV-1-Infektion nach Durchführung einer in situ-PCR unter Verwendung des linearen Primers und des FRET-markierten Haarnadelprimers der Erfindung.
Die 35 zeigt dieselbe Ansicht der Gewebeprobe bei einer höheren Vergrößerung. Die gag-positiven Zellen zeigen ein starkes Signal, und es besteht ein niedriger Hintergrund in dem Präparat.
Die 36 ist eine Negativkontrolle, in welcher Taq-Polymerase aus dem Amplifikationscocktail weggelassen wurde. Es wurden keine gag-positiven Zellen beobachtet.
Die 37 zeigt ebenfalls Lymphknotengewebe aus einem HIV-1-infizierten Patienten nach Durchführung einer in situ-PCR unter Verwendung eines linearen Primers und eines FRET-markierten Haarnadelprimers. gag-positive Zellen sind ersichtlich. Allerdings ist das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis geringer als in den 34 und 35; in einigen Zellen gibt es ein Signal, aber der zytoplasmatische Hintergrund in anderen beruht auf einer ungenügenden Waschung nach der PCR.
Die 38 zeigt ein HIV-1-positives Neuron im Gehirn eines Patienten, der an AIDS-Demenz verstarb, nach Durchführung von in situ-PCR unter Verwendung eines linearen Primers und eines FRET-markierten Haarnadel-Primers. Man bemerke, das gute Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis.
18.4. DISKUSSION
Zellen aus HIV-infizierten Patienten, welche somit bekanntermaßen positiv hinsichtlich der HIV-gag-Matrize sind, zeigten ein Fluoreszenzsignal, wohingegen Zellen, von denen erwartet wurde, negativ hinsichtlich gag zu sein, kein Signal zeigten.
19. BEISPIEL 13: VERWENDUNG VON HAARNADEL-PRIMERN IN EINEM KASKADEN-ROLLING-CIRCLE-AMPLIFIKATIONS(CRCA)-ASSAY
19.1. METHODEN UND ERGEBNISSE
Eine Kaskaden-Rolling-Circle-Amplifikation (CRCA), durchgeführt mit einem Haarnadel-(MET)-Primer und einem Nicht-Haarnadel-Primer, wurde angewandt, um eine Padlock-Sonde zu amplifizieren, welche durch Ligation mit DNA-Ligase nach Hybridisierung an eine Modell-Zielsequenz (Nilsson et al., 1994, Science 265: 2085–2088), pUC19, zirkularisiert wurde, und hohe Verhältnisse von Signal zu Hintergrund sowie eine Empfindlichkeit hinab bis zu ~10 Matrizen-Zirkeln erreichte. Wenn entweder Rolling-Circle(Vorwärts)-Haarnadelprimer 1 oder 2 (SEQ ID Nr.: 46–47) oder ein Rückwärts-Haarnadelprimer 1 oder 2 (SEQ ID Nr.: 48– 49) mit einem FAM/DABCYL-MET-Paar markiert wurde (siehe 32), wurden normale Kaskaden-Produkte mittels Agarosegel-Analyse beobachtet, als 8 Units Bst-DNA-Polymerase, "large fragment", in der Amplifizierungsreaktion verwendet wurden.
CRCA-Reaktionen wurden mit den folgenden Primer-Paaren durchgeführt (siehe 32): MET-markierter Haarnadel-Vorwärts(Rolling Circle)-Primer 1 (SEQ ID Nr.: 46) und Nicht-Haarnadel-Rückwärts-Primer (SEQ ID Nr.: 51); MET-markierter Haarnadel-Vorwärts-Primer 2 (SEQ ID Nr.: 47) und Nicht-Haarnadel-Rückwärts-Primer (SEQ ID Nr.: 51); Nicht-Haarnadel-Vorwärts(Rolling Circle)-Primer (SEQ ID Nr.: 50) und MET-markierter Haarnadel-Rückwärts-Primer 1 (SEQ ID Nr.: 48); und Nicht-Haarnadel-Vorwärts(Rolling Circle)-Primer (SEQ ID Nr.: 50) und MET-markierter Haarnadel-Rückwärts-Primer 2 (SEQ ID Nr.: 49).
Mehrere Mikrogramm doppelsträngiges DNA-Produkt wurden in einer 25-μl-Reaktion in 1 Stunde bei 64°C erzeugt. Starke MET-Signale wurden durch die fluorometrische Analyse relativ zu Hintergrundspiegeln in Kontrollreaktionen (ohne Ligase) detektiert. Fluoreszente Produkte wurden auch durch direkte Visualisierung der Reaktionsröhrchen auf einem Transilluminator beobachtet.
Wie in der 33 dargestellt, wurden MET-Signale oberhalb des Hintergrunds mit so wenig wie 10 Matrizen-Zirkeln deutlich beobachtet (+ Ligase). Die in der 33 gezeigte CRCA wurde unter Verwendung von unmarkiertem Nicht-Haarnadel-Vorwärts(Rolling Circle)-Primer 1 (SEQ ID Nr.: 46) und MET-markiertem Haarnadel-Rückwärts-Primer 1 (SEQ ID Nr.: 48) durchgeführt. Bei den Matrizen-Zirkeln handelte es sich um zirkularisierte Sonde, welche unter Verwendung von pUC19 als Ziel hergestellt wurde. 8 Units Bst-Polymerase, 'Large Fragment', wurden eingesetzt, und die CRCA-Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 64°C durchgeführt. Signale aus Proben wurden dann in einem Spektrofluorophormeter gemessen. Die Signale blieben in Abwesenheit von Ligase bei allen Sondenkonzentrationen niedrig, was demonstriert, dass eine zirkularisierte Matrize für CRCA erforderlich ist, und dass nicht-spezifische Reaktionen, worin Haarnadelprimer potenziell eingebaut werden könnten, unterdrückt werden.
Darüber hinaus wurden die CRCA-Produkte mit einer Restriktionsendonuklease, HaeIII verdaut, welche nur an der Ligationsverbindungsstelle der Ursprungs-Sonde schneidet. Dieser Verdau ergab doppelsträngige Produkte, welche die Einheits-Längengröße der Sonde aufwiesen, was demonstriert, dass die amplifizierten Produkte echte CRCA-Produkte waren.
Es wurde ebenfalls eine CRCA durchgeführt, in welcher der Rückwärts-Primer ein Haarnadelprimer war, der mit einem FAM/DABCYL-MET-Paar markiert war (entweder Haarnadel-Rückwärts-Primer 1 oder 2, wie gezeigt in der 32), während der Vorwärts-Primer ein unmodifizierter Haarnadelprimer war (identisch entweder zum Vorwärts-Haarnadel-Primer 1 oder 2, wie gezeigt in der 32, ohne die MET-Komponenten). Ähnlich zu den obenstehend beschriebenen Ergebnissen unter Verwendung eines Haarnadel-Vorwärts-Primers und eines Nicht-Haarnadel-Rückwärts-Primers, wurden MET-Signale oberhalb des Hintergrunds deutlich beobachtet, und es wurden normale niedrige Hintergrundsignale beobachtet. Die Verwendung von zwei Haarnadelprimern kann die Spezifität verbessern und den Hintergrund mit anderen Zielsystemen durch Verhindern von nicht-spezifischen Wechselwirkungen zwischen Ziel- und/oder genomischer DNA und den Primern verringern.
Eine CRCA unter Verwendung eines Nicht-Haarnadel-Vorwärts(Rolling Circle)-Primers (SEQ ID Nr.: 50), eines MET-markierten Haarnadel-Rückwärts-Primers 1 (SEQ ID Nr.: 48) und einer ras-zielspezifischen Sequenz (SEQ ID Nr.: 53) wurde durchgeführt, um ras-Mutanten- und -Wildtyp-Sequenzen zu detektieren. Ligationsreaktionen wurden durchgeführt, in welchen die Ligationsverbindungsstelle korrekte oder unkorrekte Basenpaare am Codon 12 der ras-Sequenz (SEQ ID Nr.: 53) enthielt. MET-Signale wurden detektiert, als eine korrekt gepaarte A•T-Ligationsreaktion bis zu ~10⁴ Eingangs-Zielmolekülen hinab verdünnt wurde, wohingegen 10⁸ Moleküle einer fehlgepaarten A•G-Reaktion für eine Detektion erfordert wurden, was eine ungefähr 10 000-fache Unterscheidung zwischen korrekten und unkorrekten Basenpaaren demonstriert.
Die vorliegende Erfindung soll hinsichtlich des Umfangs nicht durch die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen eingeschränkt sein.

Claims

Ein Oligonukleotid, umfassend die folgenden benachbarten Sequenzen in 5'- zu 3'-Reihenfolge: (a) eine erste Nukleotidsequenz mit 6 bis 30 Nukleotiden, wobei ein Nukleotid innerhalb dieser ersten Nukleotidsequenz mit einer ersten Komponente, ausgewählt aus einer Donorkomponente und einer Akzeptorkomponente eines molekularen Energietransfer-Paares, markiert ist, wobei die Donorkomponente Fluoreszenz an einer oder mehreren bestimmten Wellenlängen emittiert, wenn sie angeregt ist, und die Akzeptorkomponente diese Fluoreszenz, die von der Donorkomponente emittiert wird, absorbiert und löscht, (b) eine zweite Einzelstrang-Nukleotidsequenz mit 3 bis 20 Nukleotiden, (c) eine dritte Nukleotidsequenz mit 6 bis 30 Nukleotiden, wobei ein Nukleotid innerhalb dieser dritten Nukleotidsequenz mit einer zweiten Komponente, ausgewählt aus der Donorkomponente und der Akzeptorkomponente, markiert ist und diese zweite Komponente ein Mitglied dieser Gruppe, welches nicht die erste Nukleotidsequenz markiert, darstellt, wobei die dritte Nukleotidsequenz in umgekehrter Reihenfolge zur ersten Nukleotidsequenz komplementär ist, so dass sich ein Duplex zwischen der ersten Nukleotidsequenz und der dritten Nukleotidsequenz bilden kann, so dass die erste und zweite Komponente in der Nähe liegen, so dass, wenn die Donorkomponente angeregt ist und Fluoreszenz emittiert, die Akzeptorkomponente die Fluoreszenz, die von der Donorkomponente emittiert wird, absorbiert und löscht und (d) am 3'-Ende des Oligonukleotids eine vierte Einzelstrang-Nukleotidsequenz mit 8 bis 40 Nukleotiden, die an deren 3'-Ende eine Sequenz umfasst, die zu einer vorgewählten Zielsequenz komplementär ist und fähig ist, die Synthese einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einem Nukleinsäurestrang, der die Zielsequenz umfasst, durch eine Nukleinsäurepolymerase zu primen, wobei, wenn der Duplex nicht gebildet ist, die erste Komponente und die zweite Komponente durch einen Abstand voneinander getrennt sind, der einen molekularen Energietransfer zwischen der ersten Komponente und der zweiten Komponente verhindert.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei der Abstand im Bereich von 15 bis 25 Nukleotiden liegt.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 2, wobei der Abstand 20 Nukleotide beträgt.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der Donorkomponente um ein Fluorophor handelt.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der vorgewählten Zielsequenz um eine genomische Sequenz oder eine mRNA-Sequenz handelt.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, 2 oder 5, wobei es sich bei der vorgewählten Zielsequenz um eine humane genomische Sequenz, cDNA- oder mRNA-Sequenz handelt.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der vorgewählten Zielsequenz um eine genomische Sequenz eines Infektionskrankheitsmittels handelt.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der vorgewählten Zielsequenz um eine humane genomische Wildtyp-Sequenz handelt, deren Mutation am Auftreten einer humanen Krankheit oder Störung beteiligt ist.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 4, wobei die Donorkomponente und die Akzeptorkomponente ausgewählt sind aus 5-Carboxyfluorescein (FAM), 2'7'-Dimethoxy-4'5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), Rhodamin, 6-Carboxyrhodamin (R6G), N,N,N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalin-1-sulfonsäure (EDANS), Anthranilamid, Cumarin, Terbiumchelat-Derivaten, Malachitgrün, Reaktivrot 4, DABCYL, Tetramethylrhodamin, Pyrenbutyrat, Eosin, Nitrotyrosin, Ethidium und Texasrot.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die Donorkomponente ausgewählt ist aus Fluorescein, 5-Carboxyfluorescein (FAM), Rhodamin, 5-(2'-Aminoethyl)-aminonaphthalen-1-sulfonsäure (EDANS), Anthranilamid, Cumarin, Terbiumchelat-Derivaten, Malachitgrün und Reaktivrot 4, und die Akzeptorkomponente ausgewählt ist aus DABCYL, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Pyrenbutyrat, Eosin, Nitrotyrosin, Ethidium und Texasrot.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der Donorkomponente um Fluorescein oder ein Derivat davon handelt, und bei der Akzeptorkomponente um DABCYL handelt.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 oder 4, das ein Oligodeoxynukleotid darstellt.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die vierte Nukleotidsequenz zusätzlich eine Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle umfasst.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, deren Sequenz aus den Nukleotidsequenzen (a) bis (d) besteht.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die erste Komponente und die zweite Komponente auf komplementären Nukleotiden angeordnet sind, die im Duplex einander gegenüberstehen.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die erste Komponente und die zweite Komponente auf gegenüberliegenden Strangnukleotiden angeordnet sind, die im Duplex 5 Nukleotide voneinander entfernt sind.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die vierte Einzelstrang-Nukleotidsequenz (d) 10 bis 25 Nukleotide umfasst.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 17, wobei es sich bei der Donorkomponente und der Akzeptorkomponente um ein FRET-Paar handelt.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die zweite Einzelstrang-Nukleotidsequenz aus 4 bis 6 Nukleotiden besteht.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, das gereinigt ist.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der ersten Komponente um die Donorkomponente handelt und bei der zweiten Komponente um die Akzeptorkomponente handelt.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotidhaarnadelprimers, umfassend: A. Hybridisieren eines ersten Oligonukleotids, dessen Nukleotidsequenz aus den folgenden benachbarten Sequenzen in 5'- zu 3'-Reihenfolge besteht: (a) einer ersten Einzelstrang-Nukleotidsequenz mit 1 bis 10 Nukleotiden; (b) einer zweiten Nukleotidsequenz mit 2 bis 30 Nukleotiden, wobei ein Nukleotid innerhalb dieser ersten Nukleotidsequenz oder dieser zweiten Nukleotidsequenz mit einer ersten Komponente, ausgewählt aus einer Donorkomponente und einer Akzeptorkomponente eines molekularen Energietransfer-Paares, markiert ist, wobei die Donorkomponente Fluoreszenz an einer oder mehreren bestimmten Wellenlängen emittiert, wenn sie angeregt ist, und die Akzeptorkomponente diese Fluoreszenz, die von der Donorkomponente emittiert wird, absorbiert und löscht; (c) einer dritten Einzelstrang-Nukleotidsequenz mit 3 bis 20 Nukleotiden, und (d) einer vierten Nukleotidsequenz mit 2 bis 30 Nukleotiden, wobei ein Nukleotid innerhalb dieser vierten Nukleotidsequenz mit einer zweiten Komponente markiert ist, ausgewählt aus der Donorkomponente und der Akzeptorkomponente, und wobei diese zweite Komponente ein Mitglied dieser Gruppe, welches nicht die erste oder zweite Nukleotidsequenz markiert, darstellt, wobei die vierte Nukleotidsequenz in umgekehrter Reihenfolge zu der zweiten Nukleotidsequenz komplementär ist, so dass sich ein Duplex zwischen der zweiten Nukleotidsequenz und der vierten Nukleotidsequenz bilden kann, so dass die erste Komponente und die zweite Komponente in Nähe sind, so dass, wenn die Donorkomponente angeregt ist und Fluoreszenz emittiert, die Akzeptorkomponente die Fluoreszenz, die von der Donorkomponente emittiert wird, absorbiert und löscht, an ein zweites Oligonukleotid, wobei das zweite Oligonukleotid umfasst: (i) eine 5'-Sequenz, die zur ersten Einzelstrang-Nukleotidsequenz (a) des ersten Oligonukleotids komplementär und daran hybridisierbar ist, und (ii) eine 3'-Sequenz mit 8 bis 40 Nukleotiden, die zu einer vorgewählten Zielsequenz komplementär ist, so dass sie fähig ist, eine Nukleinsequenz, die komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, der die Zielsequenz umfasst, durch eine Nukleinsäurepolymerase zu primen und B. Ligieren des 5'-Endes der 5'-Sequenz an den 3'-Terminus der vierten Nukleotidsequenz (d) des ersten Oligonukleotids.
Das Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die erste Nukleotidsequenz (a) des ersten Oligonukleotids im Bereich von 3 bis 4 Nukleotiden liegt, die zweite Nukleotidsequenz (b) des ersten Oligonukleotids im Bereich von 4 bis 6 Nukleotiden liegt, die dritte Nukleotidsequenz (c) des ersten Oligonukleotids im Bereich von 4 bis 6 Nukleotiden liegt und die vierte Nukleotidsequenz (d) des ersten Oligonukleotids im Bereich von 4 bis 6 Nukleotiden liegt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei es sich bei der ersten Nukleotidsequenz um 5'-GGC-3' handelt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei es sich bei der Donorkomponente um ein Fluorophor handelt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei die Donorkomponente ausgewählt ist aus Fluorescein, 5-Carboxyfluorescein (FAM), Rhodamin, 5-(2'-Aminoethyl)-aminonaphthalen-1-sulfonsäure (EDANS), Anthranilamid, Cumarin, Terbiumchelat-Derivaten, Malachitgrün und Reaktivrot 4, und die Akzeptorkomponente ausgewählt ist aus DABCYL, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Pyrenbutyrat, Eosin, Nitrotyrosin, Ethidium und Texasrot.
Das Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei es sich bei dem ersten Oligonukleotid um ein Oligodeoxynukleotid handelt.
Ein Kit umfassend das Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 in einem Behälter.
Ein Kit gemäß Anspruch 28, umfassend das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1.
Ein Kit gemäß Anspruch 28, umfassend das Oligonukleotid gemäß Anspruch 12.
Ein Kit gemäß Anspruch 28, umfassend das Oligonukleotid gemäß Anspruch 17 oder 18.
Ein Kit gemäß Anspruch 31, umfassend in einem oder mehreren Behältern: (a) ein erstes Oligonukleotid gemäß Anspruch 17, und (b) ein zweites Oligonukleotid, wobei die vierte Einzelstrang-Nukleotidsequenz des ersten Oligonukleotids gemäß Anspruch 17 auch am 5'-Ende des zweiten Oligonukleotids vorliegt.
Ein Kit gemäß Anspruch 28, umfassend zusätzlich zu dem Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 ein weiteres Oligonukleotid, wobei das Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 und das zusätzliche Oligonukleotid Primer für eine Anwendung in einer Nukleinsäureamplifizierungsreaktion darstellen, um eine vorgewählte Zielnukleinsäuresequenz zu amplifizieren, und in einem oder mehreren Behältern enthalten sind.
Das Kit gemäß Anspruch 33, wobei es sich sowohl bei dem ersten als auch bei dem zweiten Oligonukleotid um Oligonukleotide gemäß Anspruch 1 handelt.
Das Kit gemäß Anspruch 33, das zusätzlich ein drittes Oligonukleotid umfasst, das partiell komplementär ist zu einem der ersten und zweiten Oligonukleotide.
Das Kit gemäß Anspruch 35, das zusätzlich in einem oder mehreren Behältern enthält: (c) eine DNA-Polymerase und (d) eine DNA-Ligase.
Das Kit gemäß Anspruch 33, das zusätzlich in einem oder mehreren Behältern enthält: (c) einen Puffer für die Amplifizierungsreaktion, (d) eine Kontrollnukleinsäure, die die vorgewählte Zielsequenz enthält, und (e) eine DNA-Polymerase.
Das Kit gemäß Anspruch 37, das zusätzlich umfasst: (f) ein Set von Anweisungen zur Durchführung der Amplifizierungsreaktion.
Das Kit gemäß Anspruch 38, das zusätzlich Mittel zum Stimulieren und Detektieren von Fluoreszenzlicht-Emissionen umfasst.
Das Kit gemäß Anspruch 33, das zusätzlich in dem einen oder mehreren Behältern folgendes umfasst: ein drittes Oligonukleotid und ein viertes Oligonukleotid, wobei es sich bei dem dritten und dem vierten Oligonukleotid um Primer zur Anwendung in der Nukleinsäureamplifizierungsreaktion zur Amplifizierung einer zweiten vorgewählten Zielsequenz handelt, und wobei mindestens eines von dem dritten und vierten Oligonukleotid ein Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 ist, und wobei die Donorkomponente des ersten oder zweiten Oligonukleotids Fluoreszenzlicht einer anderen Wellenlänge als die Donorkomponente des dritten oder vierten Oligonukleotids emittiert.
Das Kit gemäß Anspruch 33, wobei es sich bei dem ersten und zweiten Oligonukleotid um Oligodeoxynukleotide handelt.
Ein Kit gemäß Anspruch 28, umfassend in einem oder mehreren Behältern: (A) einen ersten Oligonukleotid-Primer, (B) einen zweiten Oligonukleotid-Primer, wobei die ersten und zweigen Oligonukleotid-Primer forward- und reverse-Primer zur DNA-Synthese in einer Amplifizierungsreaktion zur Amplifizierung einer Nukleinsäuresequenz sind, und wobei der zweite Oligonukleotid-Primer umfasst: (i) eine 5'-Sequenz, die nicht komplementär zu einer vorgewählten Zielsequenz in der Nukleinsäuresequenz ist, und (ii) eine 3'-Sequenz, die komplementär ist zu dieser vorgewählten Zielsequenz, und (C) einen dritten Oligonukleotid-Primer, wobei es sich bei dem dritten Oligonukleotid-Primer um ein Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 handelt, wobei in dem Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 die vierte Einzelstrang-Nukleotidsequenz (d) des Oligonukleotids gemäß Anspruch 1 eine Sequenz mit 10 bis 25 Nukleotiden ist, die an deren 3' eine Sequenz umfasst, die identisch ist zu der 5'-Sequenz des zweiten Oligonukleotid-Primers von (B).
Das Kit gemäß Anspruch 42, wobei die vorgewählte Zielsequenz aus einer Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus fragilem X-Gen, Prader-Willi-Syndrom-Region, Angelman-Syndrom-Region, p15-Gen, p16-Gen, E-Cadherin-Gen und von Hippel-Lindau-Syndrom-Gen, stammt.
Das Kit gemäß Anspruch 33, wobei es sich bei dem ersten Oligonukleotid um das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 handelt, und wobei das Kit zusätzlich ein blockierendes Oligonukleotid umfasst, das eine Sequenz umfasst, die komplementär zu und hybridisierbar an eine Sequenz des zweiten Oligonukleotids ist, und gegebenenfalls zusätzlich in einem getrennten Behälter DNA-Ligase umfasst.
Das Kit gemäß Anspruch 33, wobei es sich bei der Amplifizierungsreaktion um eine Polymerasekettenreaktion handelt.
Das Kit gemäß Anspruch 36, wobei die Amplifizierungsreaktion wiederholte Schritte von Polymerisation und Ligation umfasst, so dass eines von dem ersten und zweiten Oligonukleotid an das dritte Oligonukleotid ligiert wird.
Das Kit gemäß einem der Ansprüche 28 bis 46, wobei das Oligonukleotid in destilliertem Wasser oder einer gepufferten Lösung vorliegt.
Das Kit gemäß einem der Ansprüche 28 bis 47, der zusätzlich in einem getrennten Behälter Natriumbisulfit umfasst.
Das Kit gemäß Anspruch 48, das zusätzlich in einem oder mehreren Behältern einen Puffer für eine Nukleinsäureamplifizierungsreaktion umfasst.
Das Kit gemäß einem der Ansprüche 28 bis 49, das zusätzlich in getrennten Behältern umfasst: eine Mischung aus Natriumbisulfit und Hydrochinonpulver, Mineralöl, DNA-Bindungsmatrix, NaI-Lösung, Glycogen, Amplifizierungspuffer, unmethylierte Kontroll-DNA und methylierte Kontroll-DNA.
Eine Methode gemäß Anspruch 27, wobei das erste Oligonukleotid besteht aus: (a) SEQ ID Nr. 1, gegebenenfalls mit Fluorescein oder einem Derivat davon, gebunden am 5' G, und DABCYL, gebunden am T der Nukleotidzahl 22; (b) SEQ ID Nr. 13, gegebenenfalls mit Fluorescein oder einem Derivat davon, gebunden am 5' A, und DABCYL, gebunden am T der Nukleotidzahl 20; (c) SEQ ID Nr. 14, gegebenenfalls mit Fluorescein oder einem Derivat davon, gebunden am 5' A, und DABCYL, gebunden am T der Nukleotidzahl 24; (d) SEQ ID Nr. 15, gegebenenfalls mit Fluorescein oder einem Derivat davon, gebunden am 5' A, und DABCYL, gebunden am T der Nukleotidzahl 24; (e) SEQ ID Nr. 16, gegebenenfalls mit Fluorescein oder einem Derivat davon, gebunden am 5' A, und DABCYL, gebunden am T der Nukleotidzahl 22; (f) SEQ ID Nr. 17, gegebenenfalls mit Fluorescein oder einem Derivat davon, gebunden am 5' A, und DABCYL, gebunden am T der Nukleotidzahl 22; oder (g) SEQ ID Nr. 18, gegebenenfalls mit Fluorescein oder einem Derivat davon, gebunden am 5' C, und DABCYL, gebunden am T der Nukleotidzahl 20.
Eine Methode zum Detektieren oder Messen eines Produkts aus einer Nukleinsäureamplifizierungsreaktion, umfassend: (a) in Kontaktbringen einer Probe, die Nukleinsäuren enthält, mit mindestens zwei Oligonukleotid-Primern, wobei die Oligonukleotid-Primer für eine Anwendung in der Amplifizierungsreaktion geeignet sind, so dass die Primer in ein amplifiziertes Produkt der Amplifizierungsreaktion inkorporiert werden, wenn eine vorgewählte Zielsequenz in der Probe vorliegt, wobei mindestens einer der Oligonukleotid-Primer das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 ist; (b) Durchführen der Amplifizierungsreaktion, (c) Stimulierung der Fluoreszenzemission der Donorkomponente, und (d) Detektieren oder Messen der Fluoreszenz, die von der Donorkomponente emittiert wird.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei es sich bei der Donorkomponente um ein Fluorophor handelt.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei es sich bei der vorgewählten Zielsequenz um eine genomische Sequenz handelt.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei es sich bei der vorgewählten Zielsequenz um eine humane genomische Sequenz handelt.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei es sich bei der vorgewählten Zielsequenz um eine genomische Sequenz eines Infektionskrankheitsmittels handelt.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei es sich bei der vorgewählten Zielsequenz um eine humane genomische Wildtyp-Sequenz handelt, deren Mutation am Auftreten einer humanen Krankheit oder Störung beteiligt ist.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei die Donorkomponente und die Akzeptorkomponente ausgewählt sind aus 5-Carboxyfluorescein (FAM), 2'7'-Dimethoxy-4'5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), Rhodamin, 6-Carboxyrhodamin (R6G), N,N,N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalin-1-sulfonsäure (EDANS), Anthranilamid, Cumarin, Terbiumchelat-Derivaten, Malachitgrün, Reaktivrot 4, DABCYL, Tetramethylrhodamin, Pyrenbutyrat, Eosin, Nitrotyrosin, Ethidium und Texasrot.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei die Donorkomponente ausgewählt ist aus Fluorescein, 5-Carboxyfluorescein (FAM), Rhodamin, 5-(2'-Aminoethyl)-aminonaphthalin-1-sulfonsäure (EDANS), Anthranilamid, Cumarin, Terbiumchelat-Derivaten, Malachitgrün und Reaktivrot 4, und die Akzeptorkomponente ausgewählt ist aus DABCYL, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Pyrenbutyrat, Eosin, Nitrotyrosin, Ethidium und Texasrot.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei es sich bei der Donorkomponente um Fluorescein oder ein Derivat davon handelt, und bei der Akzeptorkomponente um DABCYL handelt.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei das Oligonukleotid ein Oligodeoxynukleotid darstellt.
Die Methode gemäß Anspruch 53, wobei das Oligonukleotid ein Oligodeoxynukleotid darstellt.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei die vierte Nukleotidsequenz zusätzlich eine Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle umfasst.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei die Nukleotidsequenz des Oligonukleotids gemäß Anspruch 1 aus den Nukleotidsequenzen (a) bis (d) besteht.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei die erste Komponente und die zweite Komponente auf komplementären Nukleotiden angeordnet sind, die im Duplex aneinander gegenüberstehen.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei die erste Komponente und die zweite Komponente auf gegenüberliegenden Strangnukleotiden angeordnet sind, die im Duplex 5 Nukleotide voneinander entfernt sind.
Die Methode gemäß Anspruch 52 oder 53, wobei die Oligonukleotid-Primer eine Vielzahl von unterschiedlichen Oligonukleotiden gemäß Anspruch 1 umfassen, wobei jedes Oligonukleotid an dessen 3'-Ende eine Sequenz enthält, die komplementär zu einer anderen vorgewählten Zielsequenz ist, wodurch die unterschiedlichen Oligonukleotide in unterschiedliche amplifizierte Produkte inkorporiert werden, wenn jede beliebige Zielsequenz in der Probe vorliegt, wobei jedes Oligonukleotid mit einer Donorkomponente markiert ist, die Fluoreszenzlicht einer anderen Wellenlänge als jene, die von den anderen Donorkomponenten emittiert wird, emittiert.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei es sich bei der Amplifizierungsreaktion um eine Polymerasekettenreaktion handelt.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei die Amplifizierungsreaktion eine Allel-spezifische Polymerasekettenreaktion ist.
Die Methode gemäß Anspruch 52 oder 53, wobei der Schritt (a) in Gegenwart einer DNA-Polymerase und einer DNA-Ligase abläuft, und wobei die Amplifizierungsreaktion wiederholte Schritte von Polymerisation und Ligation umfasst, so dass einer der Oligonukleotid-Primer an ein drittes Oligonukleotid ligiert wird, das zu einem der Oligonukleotid-Primer partiell komplementär ist.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei es sich bei der Amplifizierungsreaktion um ein Strang-Displacement handelt.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei es sich bei der Amplifizierungsreaktion um eine NASBA-Amplifizierung handelt.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei es sich bei der Amplifizierungsreaktion um eine Triamplifizierung handelt, und die mindestens zwei Oligonukleotid-Primer einen forward-Primer zum Primen der DNA-Synthese und einen reverse-Primer zum Primen der DNA-Synthese umfassen, und der Schritt des in Kontaktbringens auch das in Kontaktbringen der Probe mit einem Blocking-Oligonukleotid umfasst.
Die Methode gemäß Anspruch 52 oder 53, wobei das Amplifizierungsprodukt nicht von den nicht-inkorporierten Oligonukleotid-Primern nach Durchführung der Amplifizierungsreaktion und vor den Stimulierungs- und Detektionsschritten abgetrennt wird.
Eine Methode gemäß Anspruch 52, wobei der Schritt (a) umfasst: in Kontaktbringen einer Probe, die Nukleinsäuren enthält, mit einem ersten Oligonukleotid, einem zweiten Oligonukleotid und einem dritten Oligonukleotid, wobei es sich bei dem ersten Oligonukleotid um das Oligonukleotid gemäß Anspruch 17 handelt, das zweite und das dritte Oligonukleotid Primer darstellen, die für eine Anwendung in einer Nukleinsäureamplifizierungsreaktion geeignet sind, so dass die Primer in ein amplifiziertes Produkt aus der Amplifizierungsreaktion inkorporiert werden, wenn eine vorgewählte Zielsequenz in der Probe vorliegt, wobei die vierte vorbestimmte Einzelstrang-Nukleotidsequenz des ersten Oligonukleotids auch am 5'-Ende des zweiten Oligonukleotids vorliegt, und wobei die vierte vorbestimmte Einzelstrang-Nukleotidsequenz nicht zu der vorgewählten Zielsequenz komplementär ist.
Die Methode gemäß Anspruch 75, wobei es sich bei der Donorkomponente und der Akzeptorkomponente um ein FRET-Paar handelt.
Die Methode gemäß Anspruch 52, wobei die Energie, die von der Donorkomponente oder Akzeptorkomponente emittiert wird, im Schritt (d) gemessen wird, und wobei die Menge der gemessenen Energie mit der Menge an vorgewählter Zielsequenz, die in der Probe vorlag, korreliert, wodurch die Bestimmung der Menge der vorgewählten Zielsequenz, die in der Probe vorlag, ermöglicht wird.
Die Methode gemäß Anspruch 77, wobei die Menge an DNA, die die vorgewählte Zielsequenz enthält, in der Probe bestimmt wird.
Die Methode gemäß Anspruch 77, wobei die Menge an RNA, die die vorgewählte Zielsequenz enthält, in der Probe bestimmt wird.
Die Methode gemäß Anspruch 77, wobei die Anzahl von Chromosomen, die die vorgewählte Zielsequenz enthalten, in der Probe bestimmt wird.
Die Methode gemäß einem der Ansprüche 52 bis 80, wobei die Amplifizierungsreaktion in situ durchgeführt wird.
Die Methode gemäß einem der Ansprüche 52 bis 81, wobei es sich bei der Amplifizierungsreaktion um eine Kaskaden-Rolling-Circle-Amplifizierung handelt.
Eine Methode zum Bestimmen des Methylierungsstatus von DNA, umfassend die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge: (a) in Kontaktbringen einer Probe, die Nukleinsäuren umfasst, mit einer Bisulfitmenge, die ausreicht, um unmethylierte Cytosine in der Probe in Uracil umzuwandeln; (b) in Kontaktbringen der Probe mit einem ersten Oligonukleotid, einem zweiten Oligonukleotid und einem dritten Oligonukleotid, wobei es sich bei dem ersten Oligonukleotid um das Oligonukleotid gemäß Anspruch 17 handelt, das zweite und dritte Oligonukleotid Primer darstellen, die für eine Anwendung in einer Nukleinsäureamplifizierungsreaktion geeignet sind, so dass die Primer in ein amplifiziertes Produkt aus der Amplifizierungsreaktion inkorporiert werden, wenn eine vorgewählte Zielsequenz in der Probe vorliegt, wobei die vierte vorbestimmte Einzelstrang-Nukleotidsequenz des ersten Oligonukleotids auch am 5'-Ende des zweiten Oligonukleotids vorliegt, und wobei die vierte vorbestimmte Einzelstrang-Nukleotidsequenz nicht zu der vorgewählten Zielsequenz komplementär ist, (c) Durchführen der Amplifizierungsreaktion, (d) Stimulierung der Fluoreszenzemission der Donorkomponente des ersten Oligonukleotids, und (e) Detektieren oder Messen der Fluoreszenz, die durch die Donorkomponente emittiert wurde, wobei die detektierte oder gemessene Menge an Fluoreszenz das Vorliegen oder die Menge von dem amplifizierten Produkt anzeigt, wobei das Vorliegen oder die Menge von dem amplifizierten Produkt den Methylierungsstatus der vorgewählten Zielsequenz in der Probe anzeigt.
Die Methode gemäß Anspruch 83, wobei die vorgewählte Zielsequenz aus einer Nukleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus fragilem X-Gen, Prader-Willi-Syndrom-Region, Angelman-Syndrom-Region, p15-Gen, p16-Gen, E-Cadherin-Gen und von Hippel-Lindau-Syndrom-Gen, stammt.
Eine Methode zum Detektieren der Telomerase-Aktivität, umfassend: (a) in Kontaktbringen einer Probe, bei der der Verdacht besteht, eine Telomerase-Aktivität aufzuweisen, mit mindestens zwei Oligonukleotid-Primern, umfassend einen ersten Primer und einen zweiten Primer, worin entweder: (i) der erste Primer eine Sequenz an dessen 3'-Ende umfasst, bei der es sich um ein Substrat für eine Telomerase handelt, und der zweite Primer das Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 ist, wobei die vorgewählte Zielsequenz, zu der die vierte Einzelstrang-Nukleotidsequenz des zweiten Primers komplementär ist, telomere Wiederholungseinheiten umfasst, die aus der Aktivität der Telomerase stammen; oder (ii) der erste Primer ein Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 ist, das an dessen 3'-Ende eine Sequenz umfasst, die ein Substrat für eine Telomerase ist, und wobei der zweite Primer an dessen 3'-Ende eine Sequenz umfasst, die fähig ist, an die telomeren Wiederholungseinheiten zu hybridisieren, welche aus der Aktivität der Telomerase stammen, (b) Aussetzen der Probe gegenüber Bedingungen, die für eine Telomerase-Aktivität geeignet sind, (c) Durchführen einer Nukleinsäureamplifizierungsreaktion unter Bedingungen, die für den ersten und den zweiten Primer geeignet sind, eine DNA-Synthese zu primen, (d) Stimulieren der Fluoreszenzemission der Donorkomponente, und (e) Detektieren oder Messen der Fluoreszenz, die von der Donorkomponente emittiert wird, wobei das Vorliegen oder die Menge der Fluoreszenz das Vorliegen oder die Menge von Telomeraseaktivität anzeigt.
Die Methode gemäß Anspruch 85, wobei die Amplifizierungsreaktion in situ durchgeführt wird.