DE69734457T2

DE69734457T2 - Reaktionsgefaesse

Info

Publication number: DE69734457T2
Application number: DE69734457T
Authority: DE
Inventors: Martin Alan Salisbury LEE; Dario Leslie
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2017-11-21
Also published as: RU2177830C2; SK75199A3; TW555856B; US6436355B1; CN1115199C; PL186398B1; IL130279A0; ES2252778T3; BR9713851A; JP4044619B2; JP2001509256A; KR20000057407A; US20020028165A1; CA2273840A1; CN1245449A; IL130279A; GB9912372D0; EP1520625A2; NZ336056A; EP0942781A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung für das kontrollierte Erhitzen von Reagenzien, wie sie z.B. bei biochemischen Reaktionen verwendet wird, und Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung.
Die DE-A-3132926 beschreibt Fließzellen, die eine Thermostatfunktion aufweisen. Das kontrollierte Erhitzen von Reaktionsgefäßen wird oft unter Verwendung von Festblockheizern durchgeführt, die mittels verschiedener Verfahren erhitzt und abgekühlt werden. Derzeitige Festblockheizer werden unter anderem mittels elektrischer Elemente oder thermoelektrischer Vorrichtungen aufgeheizt. Andere Reaktionsgefäße können durch Halogenbirnen/Luftwirbel-Einrichtungen erhitzt werden. Die Abkühlung der Gefäße kann durch thermoelektrische Vorrichtungen, Kompressor-Kühlmaschinen-Techniken, angetriebene Luft oder Kühlflüssigkeiten erfolgen. Die Reaktionsgefäße sind mit einer Vielzahl von Graden der Passgenauigkeit in den Blockheizer eingepasst. Somit variiert der thermische Kontakt zwischen dem Blockheizer und dem Reaktionsgefäß von einem Heizgerätedesign zum anderen. Bei Reaktionen, die multiple Temperaturstufen erfordern, kann die Temperatur des Blockheizers unter Verwendung eines programmierbaren Kontrollelements angepasst werden, z.B. um die Durchführung von Thermozyklen (Thermocycling) unter Verwendung der Heizer zu erlauben.
Dieser Typ der Heizeranordnung ist besonders nützlich für Reaktionen, die die Durchführung von Thermozyklen erfordern, so etwa DNA-Amplifikationsverfahren, wie die Polymerasekettenreaktion (PCR). Die PCR ist ein Verfahren zur Erzeugung großer Mengen einer 293-62.199EPDE-Sn bestimmten DNA-Sequenz und basiert auf DNA-Eigenschaften der Basenpaarung und des präzisen Kopierens komplementärer DNA-Stränge. Die typische PCR beinhaltet einen zyklischen Prozess mit drei grundlegenden Schritten.
Denaturierung: Ein Gemisch, das die PCR-Reagenzien (einschließlich der zu kopierenden DNA, der einzelnen Nukleotidbasen (A, T, G, C), geeigneten Primern und Polymerase-Enzym) enthält, wird auf eine vorab eingestellte Temperatur erhitzt, um die beiden Stränge der Ziel-DNA zu trennen.
Annealing: Das Gemisch wird dann auf eine andere vorab festgelegte Temperatur abgekühlt, und die Primer bewegen sich mit ihren komplementären Sequenzen an die DNA-Stränge und binden an diese.
Extension: Das Gemisch wird auf eine weitere vorab eingestellte Temperatur erhitzt. Das Polymerase-Enzym (das als Katalysator wirkt) tritt mit den freien Nukleotidbasen am Ende der Primer zusammen, um einen neuen Strang an DNA zu bilden, der komplementär zu der Sequenz der Ziel-DNA ist, wobei die beiden Stränge aneinander gebunden sind.
Ein Nachteil der bekannten Blockheizer ergibt sich aus der Verzögerungszeit, die benötigt wird, um ein Aufheizen des Heizblocks, bzw. eine Abkühlung auf die Temperaturen zu erreichen, die von der Reaktion benötigt werden. Somit wird die Zeit bis zur Beendigung eines jeden Reaktionszyklus zusätzlich zur Geschwindigkeit der Reaktion teilweise von den thermodynamischen Eigenschaften des Heizgeräts bestimmt. Bei Reaktionen, die zahlreiche Zyklen und multiple Temperaturstufen beinhalten, beeinflusst diese Verzögerungszeit signifi kant die Zeitdauer, die benötigt wird, um die Reaktion abzuschließen. Thermocycler, die auf solchen Blockheizern basieren, benötigen typischerweise etwa 2 Stunden, um 30 Reaktionszyklen abzuschließen.
Bei vielen Anwendungen der PCR-Technik ist es erstrebenswert, die Abfolge der Zyklen in einer möglichst geringen Zeit abzuschließen. Insbesondere dort, wo z.B. Atemluft, Flüssigkeiten oder Nahrung für den Verbrauch durch den Menschen oder durch Tierbestände im Verdacht einer Kontamination stehen, können Verfahren der Schnelldiagnostik beträchtliches Geld sparen, die Gesundheit oder gar Leben retten.
Ein alternativer Thermocycler enthält eine Anzahl an Kapillarreaktionsröhrchen, die in der Luft hängen. Das Erhitzen und Abkühlen der Reaktionsröhrchen erfolgt unter Verwendung einer Halogenlampe und bewegter Luft von einem Ventilator bzw. Gebläse. Die thermodynamischen Eigenschaften dieses Systems stellen eine beträchtliche Verbesserung gegenüber dem traditionellen Blockheizer-Aufbau dar, da erhitzte und abgekühlte Luft an den Reaktionsröhrchen entlang geleitet wird und die gewünschten Temperaturen relativ schnell erreicht werden, wobei der Ventilator eine homogene thermische Umgebung und eine forcierte Abkühlung bereitstellt. Unter Verwendung dieser Vorrichtung können 30 Reaktionszyklen in etwa 15 Minuten abgeschlossen werden.
Ein Nachteil dieses Thermocyclers liegt darin, dass Luft-basierte Abkühlung und Erwärmung nicht ohne weiteres für eine Vorrichtung mit Mehrfach-Eingaben geeignet ist, und mit Sicherheit ungeeignet ist, wenn eine solche Vorrichtung mobil oder tragbar ist.
Die Anmelder haben ein effizientes System für ein schnelles Erhitzen und Abkühlen der Reaktanten entwickelt, das besonders nützlich für thermozyklische Reaktionen ist.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung gemäß der Definition in Anspruch 1 und ein Verfahren gemäß der Definition in Anspruch 19 bereit. Elektrisch leitfähige Polymere sind in der Technik bekannt und können von Caliente Systems Inc. aus Newark, USA, bezogen werden. Andere Beispiele für solche Polymere sind z.B. in der US-A-5106540 und der US-A-5106538 offenbart. Geeignete leitfähige Polymere können Temperaturen bis zu 300°C bereitstellen und sind somit gut geeignet, um bei PCR-Prozessen verwendet zu werden, bei denen die typische Spanne der Temperaturen zwischen 30°C und 100°C liegt.
Ein Vorteil der Erfindung gegenüber einem konventionellen Blockheizer basiert auf dem Umstand, dass Polymere, die Elektrizität leiten, zu einer schnellen Aufheizung befähigt sind. Die Aufheizgeschwindigkeit hängt von der genauen Natur des Polymers, den Ausdehnungen des verwendeten Polymers und der Menge an appliziertem Strom ab. Vorzugsweise besitzt das Polymer einen hohen spezifischen Widerstand, z.B. über 1000 Ohm·cm. Die Temperatur des Polymers kann problemlos durch Kontrollieren der Menge des durch das Polymer geleiteten elektrischen Stroms kontrolliert werden, was eine Aufrechterhaltung bei einer gewünschten Temperatur für die gewünschte Zeitspanne erlaubt. Weiterhin kann die Übergangsgeschwindigkeit zwischen Temperaturen nach der Kalibrierung problemlos kontrolliert werden, indem ein geeigneter elektrischer Strom, z.B. unter der Kontrolle eines Computerprogramms, zugeführt wird.
Weiterhin kann eine im Vergleich zum Blockheizer schnelle Abkühlung auch aufgrund der geringen thermischen Masse des Polymers sichergestellt werden. Wenn es jedoch gewünscht ist, kann das Reaktionsgefäß einer künstlichen Kühlung unterzogen werden, um die Geschwindigkeit der Abkühlung weiter zu beschleunigen.
Geeignete Kühlverfahren beinhalten die Kühlung mit angetriebener Luft, z.B. unter Verwendung von Ventilatoren, das Eintauchen in Eis oder Wasserbäder, etc.
Zusätzlich wird es die Verwendung eines Polymers als Heizelement in einem Reaktionsgefäß im allgemeinen erlauben, dass die Vorrichtung eine kompaktere Form erhält als existierende Blockheizer, was nützlich ist, wenn chemische Reaktionen unter Feldbedingungen, wie etwa an der freien Luft, auf einem Fluss, an einem Fabrikboden oder sogar in einem kleinen Geschäft durchgeführt werden.
Das Reaktionsgefäß kann die Form eines Reagenzbehälters, wie etwa eines Glas-, Kunststoff- oder Siliziumbehälters annehmen, wobei das elektrisch leitfähige Polymer in enger Nachbarschaft zu dem Behälter angeordnet ist. Bei einer Ausführungsform des Gefäßes ist das Polymer als Umhüllung bereitgestellt, die sich um das Reaktionsgefäß herum anschmiegt und in thermischem Kontakt mit dem Gefäß steht. Die Umhüllung kann entweder als geformtes Mantelteil bereitgestellt werden, das dafür konzipiert wurde, sich mit exakter Passung um ein Reaktionsgefäß zu schmiegen, oder sie kann als Filmstreifen bereitgestellt werden, der um das Reaktionsgefäß gewickelt und befestigt werden kann.
Diese Anordnung der Polymer-Umhüllung bedeutet, dass ein enger thermischer Kontakt zwischen der Umhüllung und dem Reaktionsgefäß erreichbar ist. Dies stellt sicher, dass das Gefäß rasch die gewünschte Temperatur erreicht, ohne dass es zu der üblichen Verzögerungszeit kommt, die aus der isolierenden Wirkung der Luftschicht zwischen dem Reaktionsgefäß und dem Heizer resultiert. Weiterhin kann eine Polymer-Umhüllung dazu verwendet werden, um eine Vorrichtung mit bereits bestehenden Reaktionsgefäßen anzupassen. Insbesondere kann ein Streifen aus elastischem Polymerfilm um Reaktionsgefäße diverser unterschiedlicher Größen und Formen herumgewickelt werden.
Wenn eine Umhüllung verwendet wird, kann es für diese vorteilhaft sein, perforiert oder in gewisser Weise mit Netzmuster versehen zu sein. Dies kann die Flexibilität des Polymers verstärken und kann sogar einen schnelleren Zutritt durch ein Kühlmedium erlauben, sofern das Polymer nicht selbst dafür verwendet wird, die Kühlung zu bewirken.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Polymer als integraler Bestandteil des Reaktionsgefäßes bereitgestellt. Das Reaktionsgefäß kann durch Extrusion, Spritzgießen oder ähnliche Techniken aus dem Polymer hergestellt werden. Alternativ kann das Reaktionsgefäß unter Verwendung einer zusammengesetzten Konstruktion hergestellt werden, bei der eine Schicht des leitfähigen Polymers zwischen Schichten desjenigen Materials angeordnet ist, aus dem das Gefäß hergestellt wird, oder einer Konstruktion, bei der die Innen- oder Außenoberflächen des Reaktionsgefäßes mit dem Polymer beschichtet sind, oder wiederum in der Form, dass das Gefäß im wesentlichen aus dem Polymer besteht, aber mit einem dünnen Schichtstoff eines PCR-kompatiblen Materials beschichtet ist. Die Herstellung solcher Gefäße kann entweder durch Aufeinanderschichten und/oder Ablagerung, wie etwa durch Techniken der chemischen oder elektrochemischen Ablagerung, wie diese in der Technik gebräuchlich sind, erfolgen.
Gefäße, die das Polymer als integralen Bestandteil enthalten, können besonders kompakte Strukturen bereitstellen.
Wenn mehrere Reaktionsgefäße für eine bestimmte Reaktion benötigt werden, so können alle elektrischen Verbindungspunkte so positioniert sein, dass eine einzige Energiezuleitung mit sämtlichen Reaktionsgefäßen oder Reaktionsröhrchen verbunden werden kann. Die Reaktionsgefäße können in einem Array angeordnet sein.
Alternativ kann jedes Reaktionsgefäß oder jede Gruppe von Reaktionsgefäßen sein/ihr eigenes Heizprofil besitzen, dass durch Anpassen des dem Gefäß oder der Gruppe von Gefäßen zugeführten Stroms eingestellt wird. Dies stellt einen weiteren und besonders wichtigen Vorteil der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße mit Polymer gegenüber Festblockheizern oder Wirbelluftheizern bereit, da einzelne Gefäße unabhängig voneinander mit ihrem eigenen thermischen Profil kontrolliert werden können. Dies bedeutet, dass ein relativ kleines Gerät dafür verwendet werden kann, eine Vielzahl von PCR-Assays zur selben Zeit auszuführen, ungeachtet dessen, dass jeder Assay eine unterschiedliche Betriebstemperatur benötigt. Beispielsweise können PCR-Tests zur Detektion einer angemessenen Vielfalt von Organismen in einer Probe gleichzeitig durchgeführt werden, obwohl die für den jeweiligen Organismus charakteristische Nukleotidsequenz jeweils bei einer unterschiedlichen PCR-Betriebstemperatur amplifiziert wird.
Das Polymer kann geeigneter Weise in Form eines Blattmaterials oder Films, z.B. von 0,01 mm bis 10 mm, so etwa z.B. von 1 bis 10 mm, und bevorzugt mit einer Dicke von 0,1 bis 0,3 mm, bereitgestellt werden. Durch die Verwendung dünner Filme wird das Volumen an Polymer, das benötigt wird, um ein bestimmtes Reaktionsgefäß oder eine Oberfläche zu bedecken, minimiert. Dies vermindert die Zeit, die benötigt wird, um das Polymer auf die erforderliche Temperatur zu erhitzen, da die Wärme, die dadurch produziert wird, dass Strom durch das Polymer geleitet wird, nicht über ein großes Volumen an Polymermaterial verteilt werden muss.
Bei der Anwendung ist die Polymer-Komponente des Reaktionsgefäßes so angeordnet, dass ein elektrischer Strom in dem Polymer erzeugt werden kann. Dies kann entweder erreicht werden, indem das Polymer mit Verbindungspunkten für die Verbindung mit einer elektrischen Stromquelle versehen wird, oder indem ein elektrischer Strom im Polymer induziert wird, z.B. indem man das Polymer geeigneten elektrischen oder magnetischen Feldern aussetzt.
Der enge thermische Kontakt zwischen dem Polymer und den Reagenzien oder dem Reagenzbehälter, der bei den Reaktionsgefäßen der Erfindung verwirklicht werden kann, vermindert oder beseitigt die isolierende Wirkung der Luftschicht zwischen dem Heizelement und dem Reaktionsgefäß.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung beinhaltet das Gefäß ein Kapillarröhrchen. Die Wärmeübertragung von einem Kapillarröhr chen an darin enthaltene Reagenzien ist schneller als sie unter Verwendung konventioneller Reagenzgefäße erreicht würde, da das Verhältnis zwischen Oberfläche und dem Volumen der Reagenzien in dem Kapillarröhrchen größer ist als bei einem konventionellen Reagenzgefäß.
Alternativ kann das Gefäß eine flache Trägerplatte beinhalten, wie etwa bei einem zweidimensionalen Array, insbesondere einen Chip, wie etwa einen Siliziumwaferchip, oder einen Probenträger bzw. Objektträger, insbesondere einen mikroskopischen Objektträger, auf dem die Reagenzien gehalten werden können. Die Platte kann aus dem Polymer hergestellt sein, oder das Polymer kann als integraler Bestandteil der Platte bereitgestellt sein, entweder als Beschichtung auf einer Seite der Platte oder als Polymerschicht innerhalb einer zusammengesetzten Konstruktion gemäß vorheriger Beschreibung. Da, wo es passend ist, und insbesondere da, wo die Platte ein Chip ist, kann das Polymer im bevorzugten Format auf dem Chip abgelagert und/oder eingeätzt sein, indem z.B. Leiterplatten (printed circuit board, PCB)-Technik verwendet wird.
Gefäße dieses Typs können besonders nützlich zur Durchführung der in situ-PCR, z.B. an Gewebeproben, sein.
Andere geeignete Reaktionsgefäße sind Röhrchen und Küvetten, die in der Technik bekannt sind.
Bei Vorrichtungen gemäß der Erfindung für Reaktionen, die multiple Temperaturstufen erfordern, weist die Vorrichtung ein Reaktionsgefäß gemäß obiger Beschreibung, ein Mittel zum Erzeugen eines elektrischen Stroms in dem Polymer und eine Steuereinrichtung zum Re gulieren der Menge an elektrischem Strom, die durch das Polymer geleitet wird, um so dessen Temperatur zu kontrollieren, auf Die Steuereinrichtung ist geeigneter Weise eine automatische Kontrolleinrichtung, wie etwa eine Computer-kontrollierte Interface-Anordnung. Durch die Verwendung eines programmierbaren Kontrollelements für den elektrischen Stromkreis, der mit dem Polymer verbunden ist, kann ein definierter Heizablauf, z.B. eine definierte Zyklenzahl mit vorab festgelegten Temperaturstufen über vorab festgelegte Zeitintervalle und periodische Aussetzzeiten unter Verwendung dieser Vorrichtung vorprogrammiert werden, einschließlich der Anwendung unterschiedlicher Temperatur- und Zeitprofile bei verschiedenen Reaktionsgefäßen in derselben Vorrichtung zur selben Zeit.
Die Steuereinrichtung kann eine Vorrichtung zur Temperaturüberwachung, wie etwa ein Thermoelement, beinhalten, welche die Temperatur des Reaktionsgefäßes überwacht und diese Information in das Kontrollsystem einspeist, so dass der gewünschte Ablaufplan des Erhitzens und/oder Abkühlens eingehalten wird.
Alternativ kann die Temperatur des Polymers direkt überwacht werden, indem dessen spezifischer Widerstand gemessen wird, z.B. durch Anordnen des Polymer-Heizelements als Widerstand bei einer Wheatstone-Brücken-Schaltkreisanordnung. Dies macht die Verwendung anderer Temperaturmessvorrichtungen, wie etwa von Thermoelementen, verzichtbar.
Optional kann die Vorrichtung des weiteren künstliche Kühleinrichtungen, wie etwa einen oder mehrere Ventilatoren, aufweisen.
Die Vorrichtung kann eine Vielzahl von Behältern aufweisen. Das Polymer kann als integraler Bestandteil jedes Behälters vorliegen, als Umhüllung um jeden Behälter, oder es kann so angeordnet sein, dass eine Schicht des Polymers zwischen benachbarte Behälter zwischengeschaltet ist. Alle elektrischen Verbindungspunkte an dem Polymer können mit einer einzigen elektrischen Energiezuleitung verbunden sein, wenn eine Anzahl von Reaktionen, die dieselben Temperaturstufen benötigen, durchgeführt wird.
Jedoch ist die Vorrichtung bei einer bevorzugten Ausführungsform so angeordnet, dass das Polymer, das mit einem Behälter oder mit einer Gruppe von Behältern in Kontakt steht (oder diese(n) ausbildet), jeweils mit einer individuellen Energiezuleitung verbunden ist, wobei verschiedene Behälter oder verschiedene Gruppen von Behältern mit verschiedenen, unabhängig kontrollierten elektrischen Zuleitungen verbunden sind. Mit dieser Anordnung kann eine Anzahl verschiedener Reaktionen, die unterschiedliche Temperaturstufen benötigen, zur selben Zeit durchgeführt werden, da jeder Behälter oder jede Gruppe von Behältern sein/ihr eigenes Heizelement besitzt. Diese Anordnung erlaubt es Benutzern, eine Anzahl von Reaktionen kleinerer Chargenzahl unter Verwendung einer einzigen Vorrichtung durchzuführen, was bei der Verwendung existierender Gerätschaften nicht möglich gewesen ist. Die einzigen Vorrichtungen, die bisher für diese Art von Verwendung verfügbar waren, sind bestimmte Ausgestaltungen von Blockheizern, die zwischen 2 und 4 Segmenten aufweisen, die unabhängig voneinander beheizt und abgekühlt werden können. Jedoch ist eine solche Vorrichtung auf die Verwendung für 2 bis 4 Reaktionschargen begrenzt und hat den Nachteil der zuvor beschriebenen langsamen Zykluszeiten.
Da, wo das Reaktionsgefäß einen Objektträger oder Chip beinhaltet, kann die Vorrichtung den Objektträger oder Chip, eine elektrische Versorgungseinheit bzw. elektrische Zuleitung, Mittel zur Verbindung der elektrischen Zuleitung mit dem Objektträger oder Chip zum Induzieren eines elektrischen Stroms in dem Polymer und ein Mittel zum Kontrollieren des durch die Polymerschicht in dem Objektträger oder Chip fließenden Stroms beinhalten.
Die Reaktionsgefäße und die Vorrichtung der Erfindung können bei einer Vielzahl von Situationen verwendet werden, bei denen es notwendig ist, dass chemische oder biochemische Reaktionen durchgeführt werden. Somit stellt die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Durchführung einer Reaktion, wie etwa einer chemischen oder biochemischen Reaktion bereit, wobei dieses Verfahren das Erhitzen von Reagenzien in einem Reaktionsgefäß gemäß obiger Definition umfasst.
Ebenso wie für Amplifikationsreaktionen, wie die bereits oben erwähnten PCR-Reaktionen, können die Gefäße und die Vorrichtung der Erfindung für Zwecke der Nukleinsäuresequenzierung, sowie für enzymkinetische Studien verwendet werden, bei denen man die Aktivität von Enzymen bei verschiedenen Temperaturen untersucht, und ebenso bei anderen Reaktionen, insbesondere solchen unter Beteiligung von Enzymaktivität, bei denen exakte Temperaturen aufrecht erhalten werden müssen. Die Reaktionsgefäße der Erfindung erlauben das Erreichen und die Aufrechterhaltung exakter Temperaturen für geeignete Zeitspannen, und dann, nach Wunsch, einen schnellen Wechsel, sogar bei einer mobilen oder tragbaren Vorrichtung in Übereinstimmung mit einigen Ausführungsformen der Erfindung.
Bei PCR-Reaktionen werden die Temperaturbedingungen, die erforderlich sind, um Denaturierung, Anhybridisieren, bzw. Extension zu erreichen, und die Zeit, die erforderlich ist, um diese Stufen zu erreichen, in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren variieren, wie dies in der Technik verstanden wird. Beispiele für solche Faktoren beinhalten die Natur und Länge des amplifizierten Nukleotids, die Natur der verwendeten Primer und das verwendete Enzym. Die optimalen Bedingungen können in jedem Fall durch den Fachmann bestimmt werden. Typische Denaturierungstemperaturen liegen in der Größenordnung von 95°C, typische Annealing-Temperaturen in der Größenordnung von 55°C, und Extensionstemperaturen von 72°C sind allgemein in der richtigen Größenordnung. Wenn die Reaktionsgefäße und die Vorrichtung der Erfindung verwendet werden, können diese Temperaturen rasch erreicht werden, und die Übergangsgeschwindigkeit zwischen den Temperaturen lässt sich problemlos kontrollieren.
Generische, in die DNA interkalierende Farbstoffe und strangspezifische Gensonden-Assays, z.B. Tagman^®-Assays gemäß der Beschreibung in der US-A-5,538,848 und Assays auf die vollständige interne Reflexions-Fluoreszenz (TIRF-Assays), wie etwa solche, die in der WO-A-93/06241 beschrieben sind, können selbstverständlich bei vielen Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden. Bei solchen Assays wird ein Signal von der Probe, wie etwa ein Fluoreszenzsignal oder ein verlöschendes Signal unter Verwendung einer Fluoreszenzüberwachungsvorrichtung detektiert. Wenn diese Art von Prozess durchgeführt wird, muss die Fluoreszenzüberwachungsvorrichtung so angeordnet sein, dass sie in der Lage ist, von der Probe ausgehende Signale zu detektieren. In einigen Fällen kann es hilfreich sein, wenn wenigstens ein Teil des Gefäßes, z.B. ein Ende, dort wo das Gefäß ein erfindungsgemäßes Röhrchen ist, optisch durchsichtig ist, sodass die Messungen hierdurch erfolgen können. Alternativ kann das Gefäß mit Mitteln ausgestattet sein, um ein Signal der Probe an die Überwachungsvorrichtung zu übertragen, z.B. mit einer optischen Faser oder einem Wellenleiter mit herabgesetzter kritischer Frequenz.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun beispielhaft und unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, von denen
1 einen Reaktionsgefäß-Heizer zeigt, der eine Umhüllung aus elektrisch leitfähigem Polymer aufweist, die so angeordnet ist, dass sie um ein Reaktionsröhrchen herum passt;
2 einen Reaktions-Objektträger zeigt, der eine Beschichtung mit dem elektrisch leitfähigen Polymer auf einer seiner Oberflächen zeigt;
3 einen Reaktions-Objektträger zeigt, der eine Schicht des elektrisch leitfähigen Polymers in einer zusammengesetzten Konstruktion aufweist;
4 eine Vorrichtung zur Durchführung von Reaktionen zeigt, die multiple Temperaturstufen beinhalten, wobei ein Streifen des elektrisch leitfähigen Polymers verwendet wird, um ein als Reaktionsgefäß dienendes Kapillarröhrchen zu erhitzen;
5 ein Diagramm der Vorrichtung gemäß der Erfindung zur Durchführung einer PCR-Reaktion zeigt;
6 ein thermozyklisches Profil zeigt, das für die Vorrichtung aus 5 verwendet wird;
7 ein schematisches Diagramm eines tragbaren PCR-Multidetektors ist;
und
7a ein Diagramm eines Detektorelements zur Verwendung in der Vorrichtung aus 7 ist.
Bezugnehmend auf 1 ist eine Umhüllung aus einem elektrisch leitfähigen Polymer 2 mit elektrischen Verbindungspunkten 3 für die Verbindung mit einer elektrischen Stromzufuhr versehen. Die Größe und Form der Umhüllung 2 wird bestimmt von den Abmessungen und der Form eines Reaktionsgefäßes 1, um das herum die Umhüllung angebracht ist.
Bei Gebrauch wird die Umhüllung 2 um das Reaktionsgefäß rherum und in engem thermischen Kontakt mit diesem angeordnet. Die Verbindungspunkte 3 werden dann mit einer elektrischen Stromzufuhr (nicht dargestellt) verbunden, und Strom wird durch die Polymerumhüllung 2 geleitet, wodurch diese und jedes Reagenz im Inneren des Reaktionsgefäßes 1 erhitzt werden.
Bezugnehmend auf 2 wird ein Objektträger 1 auf einer Seite mit einem elektrisch leitfähigen Polymer 2 beschichtet. Die elektrischen Verbindungspunkte 3 werden an jedem der beiden Enden des Objektträgers 1 und in elektrischem Kontakt mit der Polymerschicht 2 angebracht.
Bei 3 beinhaltet das Gefäß einen Objektträger 1 mit zusammengesetzter Bauweise, sodass eine Schicht des elektrisch leitfähigen Polymers 2 zwischen den Schichten des gewöhnlich zur Herstellung solcher Träger verwendeten Materials, z.B. Glas, eingeschoben ist. Die elektrischen Verbindungspunkte 3 sind an den beiden Enden des Trägers 1 angebracht und stehen dabei in elektrischem Kontakt mit der Polymerschicht 2.
Bei der Verwendung wird eine elektrische Stromzufuhr (nicht dargestellt) mit den elektrischen Verbindungspunkten 3 an dem in den 2 und 3 dargestellten Träger verbunden, und es wird Strom durch die Polymerschicht 2 geleitet, wodurch der Träger 1 und jedes auf dem Träger 1 aufgebrachte Reagenz erhitzt werden.
Bezugnehmend auf 4 ist ein Streifen des elektrisch leitfähigen Polymerfilms 2 um ein Kapillarröhrchen 1 herumgewickelt und befestigt. Der Polymerfilmstreifen ist mit elektrischen Verbindungspunkten 3 versehen, an die die elektrische Stromzufuhr 5 über Verbindungsklemmen 4 angeschlossen ist.
Bei Gebrauch wird Strom durch den Polymerfilm 2 geleitet, wodurch das Kapillarröhrchen 1 und jedes im Inneren des Kapillarröhrchens 1 befindliche Reagenz erhitzt werden.
Die Vorrichtung aus 5 wurde konstruiert, um PCR-Detektionen durchzuführen. Ein Kapillarröhrchen 6 mit einem Innendurchmesser von 1,12 mm und einem Außendurchmesser von 1,47 mm wurde als Reaktionsgefäß verwendet. Ein Streifen aus elektrisch leitfähigem Polymer 7 wurde um das Röhrchen herum gewickelt und befestigt, sodass dieser relativ dicht an der Außenoberfläche des Röhrchens gehalten wurde. Das Beheizen erfolgt daher von allen Seiten des Röhrchens 6 aus, sodass der durch eine Probe im Röhrchen 6 verlaufende Temperaturgradient minimiert wird.
Das Aufheizen wurde durch eine elektrische Energiequelle 8 ermöglicht, die über ein Interface 9 mit einem Computer 10 verbunden war, um eine automatische Kontrolle der Heizzyklen zu erlauben. Ein Gebläsekühler 11 wurde so angeordnet, dass er Luft auf das Polymer 7 leitet. Ein Infrarot-Thermoelement 12 wurde an der Außenseite des Polymers 7 bereitgestellt, um die Temperatur zu überwachen.
Zum Zweck einer Bestimmung der Geräteleistung vor der Benutzung wurde ein K-Typ-Thermoelement verwendet, um die Temperatur im Inneren des Röhrchens 6 zu überwachen. Die inneren und äußeren Temperaturen wurden dann verwendet, um die Ablesungen der Außentemperatur im Hinblick auf die vorhergesagte Probentemperatur zu linearisieren.
Das Heizpolymer ist mit der Stromquelle 8 verbunden, und der Schaltkreis wird unter Verwendung des Interface 9 und der Software geschlossen. Ein Schalter 14, der dafür angeordnet ist, den Schaltkreis zu schließen, war ein schnelles optisches Relais, das alle 10 ms umschalten kann. Ein zweiter Schaltkreis wurde verwendet, um die zwei kleinen elektrischen Gebläse 11 zu kontrollieren, die eine auf angetriebener Luft basierende Kühlung der Reaktionsprobe bereitstellen und kontinuierlich betrieben werden. Die Kontroll-Software war LabView, das ein benutzerfreundliches graphisches Interface sowohl bei der Programmierung als auch für den Betrieb bereitstellt. Der Strom wurde anfänglich mit relativ hoher Frequenz zugeführt, um die erforderliche Temperatur schneller zu erreichen. Wenn die vorgesehene Betriebstemperatur erreicht war, wurde der Strom mit geringerer Frequenz zugeführt, die erforderlich war, um die vorgesehene Betriebstemperatur für die vorab festgelegte Dauer aufrecht zu erhalten.
Die in 7 dargestellte Vorrichtung weist eine mit Deckel versehene Box 70 mit einer isolierenden Unterteilung auf, die eine Vielzahl an Detektorelement-Aufnahmeöffnungen 71 definiert. Die Box 70 ist derart dargestellt, dass sie über eine Interface-Einheit 72 elektrisch mit einer Stromquelle 73 und einem Computer 74 verbunden ist. Die Verbindung ist so, dass sie unterschiedliche Energiezuleitungen zu jeder der Aufnahmeöffnungen 71 ermöglicht. Jede Aufnahmeöffnung enthält ein Thermoelement (nicht dargestellt) für die Überwachung der darin vorliegenden Temperatur.
Das in 7a gezeigte Detektorelement weist ein Reaktionsröhrchen 75 auf, das von einer Umhüllung 76 umgeben ist. Die Umhüllung 76 besteht aus einem Heizpolymer und ist mit den Versorgungsenden 77 und 78 verbunden.
Nachdem ein Röhrchen 75 gefüllt und verschlossen wurde, kann es in eine geeignete Aufnahmeöffnung 71 eingesetzt werden, solange bis die Enden 77 und 78 an passende Empfängerenden in den Aufnahmeöffnungen (nicht dargestellt) festgeklemmt sind. Die Vorrichtung ist so ausgelegt, dass sie bei vollständigem Anschluss eine Anzeige des Verbindungsstatus für jedes Röhrchen 75 auf dem Computerbildschirm erlaubt.
Das Verschließen des Deckels an der Box 70 vervollständigt die Isolierung jeder Aufnahmeöffnung und die Befestigung jedes Röhrchens 75 in seiner Aufnahmeöffnung.
Das Computerprogramm ist auf die separate Identifizierung desjenigen Moleküls ausgelegt, nach dem in dem jeweiligen Röhrchen 75 gesucht wird, was bedeutet, dass es für die Kontrolle des geeigneten PCR-Temperaturzyklus ausgelegt ist, um das Molekül, wenn es vorhanden ist, zu amplifizieren. Wenn die Zyklen abgeschlossen sind, kann der Inhalt des Röhrchens geeigneten Gensonden-Detektoren ausgesetzt werden, um zu bestimmen, ob das Molekül, nach dem gesucht wurde, tatsächlich anwesend war.
Natürlich kann das Prinzip der in Bezug auf die 7 und 7a beschriebenen Vorrichtung auf einer Vielzahl von Wegen verwirklicht werden. Sie kann eher mobil als tragbar sein und für die Aufnahme von Detektorelementen ausgelegt sein, die in einer anderen Form vorliegen als bei der eines Röhrchens, einschließlich der eines Objektträgers. Typischerweise ist die Vorrichtung so angeordnet, dass sie 96 oder 192 Detektorelemente aufweist.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung.
Beispiel
Amplifikation von DNA
Unter Verwendung der Vorrichtung aus 5 (Thermoelement des K-Typs weggelassen) wurde die folgende PCR-Reaktion durchgeführt.
Es wurde ein 100 bp-Amplikon aus einem klonierten Yersinia pestis-Fragment amplifiziert. Die Reaktionsbedingungen waren zuvor unter Verwendung des Idaho RapidCycler^TM optimiert worden und Proben desselben Reaktionsgemischs wurden als Kontrollreaktionen in dem Idaho RapidCycler^TM amplifiziert.
Das in Röhrchen 6 eingebrachte Reaktionsgemisch enthält folgendes:
50 mM Tris HCl pH 8,3
3 mM MgCl₂
2,5 mg/ml Rinderserum-Albumin
je 200 μM dATP, dTTP, dCTP und dGTP
10 μg/ml bei jedem der FCR-Primer
25 Units/ml an Taq-Polymerase
Das thermozyklische Profi wurde programmiert mit 95°C für null Sekunden, 55°C für null Sekunden, 72°C für null Sekunden, wie in 6 dargestellt. Zum Vergleich wurde ein entsprechendes thermozyklisches Profil in den Idaho RapidCycler^TM einprogrammiert. Die Reaktionsvolumina von 50 μl wurden sowohl für das Polymerbeschichtete Kapillargefäß 6 als auch für den Idaho RapidCycler^TM verwendet.
In diesem Zusammenhang bedeutet „null Sekunden", dass das Programm das Induzieren der nächsten Temperatur bewirkt, sobald die Zieltemperatur erreicht ist. Die exakte Zeit, bei der die Reaktion auf der Zieltemperatur gehalten wird, hängt daher von den Parametern und Eigenschaften des verwendeten Geräts ab. Im allgemeinen wird diese jedoch weniger als 1 Sekunde betragen.
Nach 40 Zyklen in dem Kapillargefäß wurde eine 50 μl-Probe des PCR-Produkts von jedem der Reaktionsansätze durch Agarosegelelektrophorese auf einem 2% Gel in 1 × TAE-Puffer im Hinblick auf die Größe aufgetrennt. Die DNA wurde mittels Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Die Probe lief benachbart zu einer Probe aus dem Idaho RapidCycler^TM (25 Zyklen), und es wurde ein entsprechendes Amplikon korrekter Größe detektiert.

Claims

Vorrichtung zur Durchführung von Reaktionen, wobei diese Vorrichtung folgendes aufweist: ein Reaktionsgefäß (1, 6, 75), welches zum Aufnehmen von Reagenzien geeignet ist und ein elektrisch leitfähiges Polymer (2, 7, 76) aufweist, das Wärme abgibt, wenn ein elektrischer Strom durch dieses Polymer hindurch geleitet wird; und eine Steuereinrichtung (10, 74) zum Steuern der Stromzufuhr zu dem Polymer, wobei die Steuereinrichtung (10, 74) so ausgelegt ist, dass sie elektrischen Strom liefert, um dadurch eine Abfolge verschiedener Temperaturen in den Reagenzien zu erzeugen, die sich in dem Reaktionsgefäß befinden, wobei das Polymer über die Steuereinrichtung mit einer elektrischen Versorgungseinrichtung (5, 8, 73) verbunden werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1, die eine Mehrzahl an Reaktionsgefäßen (1, 6, 75) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei verschiedene Stromstärken zugeführt werden können, um jedes Gefäß (1, 6, 75) oder eine Gruppe von Gefäßen zu beheizen.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Steuereinrichtung (10, 74) so ausgelegt ist, dass sie Strom für eine jeweils unterschiedliche Temperatur und/oder ein jeweils unterschiedliches Zeitprofil für jedes der Reaktionsgefäße liefert.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei jedes Reaktionsgefäß (1, 6, 75) einen Behälter für Reaktanten aufweist und das Heizer-Polymer (2, 7, 76) an diesen Behälter angrenzt.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei das Heizer-Polymer eine Umhüllung (2, 7, 76) um den Behälter bildet.
Vorrichtung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei das Heizer-Polymer (2) in Form eines Films vorliegt.
Vorrichtung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, wobei die Umhüllung integral in den Behälter eingebaut ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das Heizer-Polymer perforiert oder mit einem Netzmuster versehen ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Heizer-Polymer einen Behälter für die Reaktanten bildet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Reaktionsgefäß einen Behälter für Reaktanten aufweist, wobei eine der Oberflächen des Behälters (1) mit dem Heizer-Polymer (2) beschichtet ist.
Vorrichtung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei das oder jedes Reaktionsgefäß ein Kapillarröhrchen (1, 6) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das oder jedes Reaktionsgefäß einen Objektträger (1) aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Reaktionsgefäß einen Chip aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 14, die eine Mehrzahl von Reaktionsgefäßen in einem Array aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei die Steuereinrichtung (10, 74) so ausgelegt ist, dass sie elektrischen Strom gemäiß einem vorab festgelegten Zeit-/Temperaturprofil liefert, um so Reaktionen durchzuführen, die multiple Temperaturstufen innerhalb der Reaktionsgefäße erfordern.
Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Steuereinrichtung (10, 74) programmiert ist, sodass mehrere Zyklen der Reaktion automatisch durchgeführt werden können.
Vorrichtung nach einem der vorigen Ansprüche, weiterhin aufweisend eine Einrichtung zur Detektion eines Signals einer Probe in einem Reaktionsgefäß.
Verfahren zur Durchführung einer chemischen oder biochemischen Reaktion, die multiple Temperaturstufen erfordert, wobei bei diesem Verfahren Reagenzien, die für die Reaktion benötigt werden, in ein Reaktionsgefäß eingebracht werden, das ein elektrisch leitfähiges Polymer aufweist, welches Wärme abgibt, wenn ein elektrischer Strom durch dieses Polymer hindurch geleitet wird; Strom zu dem Polymer zugeführt wird, um so die Reagenzien auf eine erste gewünschte Temperatur zu erhitzen; und danach der Strom angepasst wird, um so die nachfolgenden Temperaturstufen zu erzeugen, die für die Reaktion benötigt werden.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Reaktion ein DNA-Amplifikationsverfahren ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Amplifikationsverfahren eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei Reagenzien für eine Mehrzahl von Reaktionen jeweils in ein Reaktionsgefäß eingebracht und gleichzeitig erhitzt werden.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei jedes Reaktionsgefäß individuell auf die Temperatur erhitzt wird, die für die in dem Gefäß stattfindende Reaktion benötigt wird.