-
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung für das kontrollierte
Erhitzen von Reagenzien, wie sie z.B. bei biochemischen Reaktionen
verwendet wird, und Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung.
-
Die
DE-A-3132926 beschreibt Fließzellen, die
eine Thermostatfunktion aufweisen. Das kontrollierte Erhitzen von
Reaktionsgefäßen wird
oft unter Verwendung von Festblockheizern durchgeführt, die mittels
verschiedener Verfahren erhitzt und abgekühlt werden. Derzeitige Festblockheizer
werden unter anderem mittels elektrischer Elemente oder thermoelektrischer
Vorrichtungen aufgeheizt. Andere Reaktionsgefäße können durch Halogenbirnen/Luftwirbel-Einrichtungen
erhitzt werden. Die Abkühlung
der Gefäße kann
durch thermoelektrische Vorrichtungen, Kompressor-Kühlmaschinen-Techniken,
angetriebene Luft oder Kühlflüssigkeiten
erfolgen. Die Reaktionsgefäße sind
mit einer Vielzahl von Graden der Passgenauigkeit in den Blockheizer
eingepasst. Somit variiert der thermische Kontakt zwischen dem Blockheizer
und dem Reaktionsgefäß von einem Heizgerätedesign
zum anderen. Bei Reaktionen, die multiple Temperaturstufen erfordern,
kann die Temperatur des Blockheizers unter Verwendung eines programmierbaren
Kontrollelements angepasst werden, z.B. um die Durchführung von
Thermozyklen (Thermocycling) unter Verwendung der Heizer zu erlauben.
-
Dieser
Typ der Heizeranordnung ist besonders nützlich für Reaktionen, die die Durchführung von
Thermozyklen erfordern, so etwa DNA-Amplifikationsverfahren, wie
die Polymerasekettenreaktion (PCR). Die PCR ist ein Verfahren zur
Erzeugung großer
Mengen einer 293-62.199EPDE-Sn bestimmten DNA-Sequenz und basiert
auf DNA-Eigenschaften der Basenpaarung und des präzisen Kopierens
komplementärer
DNA-Stränge. Die
typische PCR beinhaltet einen zyklischen Prozess mit drei grundlegenden
Schritten.
-
Denaturierung:
Ein Gemisch, das die PCR-Reagenzien (einschließlich der zu kopierenden DNA,
der einzelnen Nukleotidbasen (A, T, G, C), geeigneten Primern und
Polymerase-Enzym) enthält, wird
auf eine vorab eingestellte Temperatur erhitzt, um die beiden Stränge der
Ziel-DNA zu trennen.
-
Annealing:
Das Gemisch wird dann auf eine andere vorab festgelegte Temperatur
abgekühlt,
und die Primer bewegen sich mit ihren komplementären Sequenzen an die DNA-Stränge und
binden an diese.
-
Extension:
Das Gemisch wird auf eine weitere vorab eingestellte Temperatur
erhitzt. Das Polymerase-Enzym (das als Katalysator wirkt) tritt
mit den freien Nukleotidbasen am Ende der Primer zusammen, um einen
neuen Strang an DNA zu bilden, der komplementär zu der Sequenz der Ziel-DNA
ist, wobei die beiden Stränge
aneinander gebunden sind.
-
Ein
Nachteil der bekannten Blockheizer ergibt sich aus der Verzögerungszeit,
die benötigt
wird, um ein Aufheizen des Heizblocks, bzw. eine Abkühlung auf
die Temperaturen zu erreichen, die von der Reaktion benötigt werden.
Somit wird die Zeit bis zur Beendigung eines jeden Reaktionszyklus
zusätzlich zur
Geschwindigkeit der Reaktion teilweise von den thermodynamischen
Eigenschaften des Heizgeräts bestimmt.
Bei Reaktionen, die zahlreiche Zyklen und multiple Temperaturstufen
beinhalten, beeinflusst diese Verzögerungszeit signifi kant die
Zeitdauer, die benötigt
wird, um die Reaktion abzuschließen. Thermocycler, die auf
solchen Blockheizern basieren, benötigen typischerweise etwa 2
Stunden, um 30 Reaktionszyklen abzuschließen.
-
Bei
vielen Anwendungen der PCR-Technik ist es erstrebenswert, die Abfolge
der Zyklen in einer möglichst
geringen Zeit abzuschließen.
Insbesondere dort, wo z.B. Atemluft, Flüssigkeiten oder Nahrung für den Verbrauch
durch den Menschen oder durch Tierbestände im Verdacht einer Kontamination
stehen, können
Verfahren der Schnelldiagnostik beträchtliches Geld sparen, die
Gesundheit oder gar Leben retten.
-
Ein
alternativer Thermocycler enthält
eine Anzahl an Kapillarreaktionsröhrchen, die in der Luft hängen. Das
Erhitzen und Abkühlen
der Reaktionsröhrchen
erfolgt unter Verwendung einer Halogenlampe und bewegter Luft von
einem Ventilator bzw. Gebläse.
Die thermodynamischen Eigenschaften dieses Systems stellen eine
beträchtliche
Verbesserung gegenüber
dem traditionellen Blockheizer-Aufbau dar, da erhitzte und abgekühlte Luft
an den Reaktionsröhrchen
entlang geleitet wird und die gewünschten Temperaturen relativ
schnell erreicht werden, wobei der Ventilator eine homogene thermische Umgebung
und eine forcierte Abkühlung
bereitstellt. Unter Verwendung dieser Vorrichtung können 30
Reaktionszyklen in etwa 15 Minuten abgeschlossen werden.
-
Ein
Nachteil dieses Thermocyclers liegt darin, dass Luft-basierte Abkühlung und
Erwärmung nicht
ohne weiteres für
eine Vorrichtung mit Mehrfach-Eingaben geeignet ist, und mit Sicherheit
ungeeignet ist, wenn eine solche Vorrichtung mobil oder tragbar
ist.
-
Die
Anmelder haben ein effizientes System für ein schnelles Erhitzen und
Abkühlen
der Reaktanten entwickelt, das besonders nützlich für thermozyklische Reaktionen
ist.
-
Dementsprechend
stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung gemäß der Definition
in Anspruch 1 und ein Verfahren gemäß der Definition in Anspruch
19 bereit. Elektrisch leitfähige
Polymere sind in der Technik bekannt und können von Caliente Systems Inc.
aus Newark, USA, bezogen werden. Andere Beispiele für solche
Polymere sind z.B. in der US-A-5106540 und der US-A-5106538 offenbart. Geeignete
leitfähige
Polymere können
Temperaturen bis zu 300°C
bereitstellen und sind somit gut geeignet, um bei PCR-Prozessen
verwendet zu werden, bei denen die typische Spanne der Temperaturen zwischen
30°C und
100°C liegt.
-
Ein
Vorteil der Erfindung gegenüber
einem konventionellen Blockheizer basiert auf dem Umstand, dass
Polymere, die Elektrizität
leiten, zu einer schnellen Aufheizung befähigt sind. Die Aufheizgeschwindigkeit
hängt von
der genauen Natur des Polymers, den Ausdehnungen des verwendeten
Polymers und der Menge an appliziertem Strom ab. Vorzugsweise besitzt
das Polymer einen hohen spezifischen Widerstand, z.B. über 1000
Ohm·cm.
Die Temperatur des Polymers kann problemlos durch Kontrollieren
der Menge des durch das Polymer geleiteten elektrischen Stroms kontrolliert
werden, was eine Aufrechterhaltung bei einer gewünschten Temperatur für die gewünschte Zeitspanne
erlaubt. Weiterhin kann die Übergangsgeschwindigkeit
zwischen Temperaturen nach der Kalibrierung problemlos kontrolliert
werden, indem ein geeigneter elektrischer Strom, z.B. unter der
Kontrolle eines Computerprogramms, zugeführt wird.
-
Weiterhin
kann eine im Vergleich zum Blockheizer schnelle Abkühlung auch
aufgrund der geringen thermischen Masse des Polymers sichergestellt werden.
Wenn es jedoch gewünscht
ist, kann das Reaktionsgefäß einer
künstlichen
Kühlung
unterzogen werden, um die Geschwindigkeit der Abkühlung weiter
zu beschleunigen.
-
Geeignete
Kühlverfahren
beinhalten die Kühlung
mit angetriebener Luft, z.B. unter Verwendung von Ventilatoren,
das Eintauchen in Eis oder Wasserbäder, etc.
-
Zusätzlich wird
es die Verwendung eines Polymers als Heizelement in einem Reaktionsgefäß im allgemeinen
erlauben, dass die Vorrichtung eine kompaktere Form erhält als existierende
Blockheizer, was nützlich
ist, wenn chemische Reaktionen unter Feldbedingungen, wie etwa an
der freien Luft, auf einem Fluss, an einem Fabrikboden oder sogar
in einem kleinen Geschäft
durchgeführt
werden.
-
Das
Reaktionsgefäß kann die
Form eines Reagenzbehälters,
wie etwa eines Glas-, Kunststoff- oder Siliziumbehälters annehmen,
wobei das elektrisch leitfähige
Polymer in enger Nachbarschaft zu dem Behälter angeordnet ist. Bei einer
Ausführungsform
des Gefäßes ist
das Polymer als Umhüllung
bereitgestellt, die sich um das Reaktionsgefäß herum anschmiegt und in thermischem
Kontakt mit dem Gefäß steht.
Die Umhüllung
kann entweder als geformtes Mantelteil bereitgestellt werden, das
dafür konzipiert
wurde, sich mit exakter Passung um ein Reaktionsgefäß zu schmiegen,
oder sie kann als Filmstreifen bereitgestellt werden, der um das
Reaktionsgefäß gewickelt
und befestigt werden kann.
-
Diese
Anordnung der Polymer-Umhüllung bedeutet,
dass ein enger thermischer Kontakt zwischen der Umhüllung und
dem Reaktionsgefäß erreichbar
ist. Dies stellt sicher, dass das Gefäß rasch die gewünschte Temperatur
erreicht, ohne dass es zu der üblichen
Verzögerungszeit
kommt, die aus der isolierenden Wirkung der Luftschicht zwischen
dem Reaktionsgefäß und dem
Heizer resultiert. Weiterhin kann eine Polymer-Umhüllung dazu
verwendet werden, um eine Vorrichtung mit bereits bestehenden Reaktionsgefäßen anzupassen.
Insbesondere kann ein Streifen aus elastischem Polymerfilm um Reaktionsgefäße diverser
unterschiedlicher Größen und Formen
herumgewickelt werden.
-
Wenn
eine Umhüllung
verwendet wird, kann es für
diese vorteilhaft sein, perforiert oder in gewisser Weise mit Netzmuster
versehen zu sein. Dies kann die Flexibilität des Polymers verstärken und kann
sogar einen schnelleren Zutritt durch ein Kühlmedium erlauben, sofern das
Polymer nicht selbst dafür
verwendet wird, die Kühlung
zu bewirken.
-
Bei
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird das Polymer als integraler Bestandteil des Reaktionsgefäßes bereitgestellt.
Das Reaktionsgefäß kann durch
Extrusion, Spritzgießen
oder ähnliche
Techniken aus dem Polymer hergestellt werden. Alternativ kann das
Reaktionsgefäß unter
Verwendung einer zusammengesetzten Konstruktion hergestellt werden,
bei der eine Schicht des leitfähigen
Polymers zwischen Schichten desjenigen Materials angeordnet ist,
aus dem das Gefäß hergestellt
wird, oder einer Konstruktion, bei der die Innen- oder Außenoberflächen des
Reaktionsgefäßes mit
dem Polymer beschichtet sind, oder wiederum in der Form, dass das
Gefäß im wesentlichen
aus dem Polymer besteht, aber mit einem dünnen Schichtstoff eines PCR-kompatiblen
Materials beschichtet ist. Die Herstellung solcher Gefäße kann
entweder durch Aufeinanderschichten und/oder Ablagerung, wie etwa durch
Techniken der chemischen oder elektrochemischen Ablagerung, wie
diese in der Technik gebräuchlich
sind, erfolgen.
-
Gefäße, die
das Polymer als integralen Bestandteil enthalten, können besonders
kompakte Strukturen bereitstellen.
-
Wenn
mehrere Reaktionsgefäße für eine bestimmte
Reaktion benötigt
werden, so können
alle elektrischen Verbindungspunkte so positioniert sein, dass eine
einzige Energiezuleitung mit sämtlichen Reaktionsgefäßen oder
Reaktionsröhrchen
verbunden werden kann. Die Reaktionsgefäße können in einem Array angeordnet
sein.
-
Alternativ
kann jedes Reaktionsgefäß oder jede
Gruppe von Reaktionsgefäßen sein/ihr
eigenes Heizprofil besitzen, dass durch Anpassen des dem Gefäß oder der
Gruppe von Gefäßen zugeführten Stroms
eingestellt wird. Dies stellt einen weiteren und besonders wichtigen
Vorteil der erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße mit Polymer
gegenüber
Festblockheizern oder Wirbelluftheizern bereit, da einzelne Gefäße unabhängig voneinander
mit ihrem eigenen thermischen Profil kontrolliert werden können. Dies bedeutet,
dass ein relativ kleines Gerät
dafür verwendet
werden kann, eine Vielzahl von PCR-Assays zur selben Zeit auszuführen, ungeachtet
dessen, dass jeder Assay eine unterschiedliche Betriebstemperatur
benötigt.
Beispielsweise können
PCR-Tests zur Detektion einer angemessenen Vielfalt von Organismen
in einer Probe gleichzeitig durchgeführt werden, obwohl die für den jeweiligen
Organismus charakteristische Nukleotidsequenz jeweils bei einer
unterschiedlichen PCR-Betriebstemperatur amplifiziert wird.
-
Das
Polymer kann geeigneter Weise in Form eines Blattmaterials oder
Films, z.B. von 0,01 mm bis 10 mm, so etwa z.B. von 1 bis 10 mm,
und bevorzugt mit einer Dicke von 0,1 bis 0,3 mm, bereitgestellt
werden. Durch die Verwendung dünner
Filme wird das Volumen an Polymer, das benötigt wird, um ein bestimmtes
Reaktionsgefäß oder eine
Oberfläche
zu bedecken, minimiert. Dies vermindert die Zeit, die benötigt wird,
um das Polymer auf die erforderliche Temperatur zu erhitzen, da
die Wärme,
die dadurch produziert wird, dass Strom durch das Polymer geleitet
wird, nicht über
ein großes
Volumen an Polymermaterial verteilt werden muss.
-
Bei
der Anwendung ist die Polymer-Komponente des Reaktionsgefäßes so angeordnet,
dass ein elektrischer Strom in dem Polymer erzeugt werden kann.
Dies kann entweder erreicht werden, indem das Polymer mit Verbindungspunkten
für die Verbindung
mit einer elektrischen Stromquelle versehen wird, oder indem ein
elektrischer Strom im Polymer induziert wird, z.B. indem man das
Polymer geeigneten elektrischen oder magnetischen Feldern aussetzt.
-
Der
enge thermische Kontakt zwischen dem Polymer und den Reagenzien
oder dem Reagenzbehälter,
der bei den Reaktionsgefäßen der
Erfindung verwirklicht werden kann, vermindert oder beseitigt die
isolierende Wirkung der Luftschicht zwischen dem Heizelement und
dem Reaktionsgefäß.
-
Bei
einer Ausführungsform
der Erfindung beinhaltet das Gefäß ein Kapillarröhrchen.
Die Wärmeübertragung
von einem Kapillarröhr chen
an darin enthaltene Reagenzien ist schneller als sie unter Verwendung
konventioneller Reagenzgefäße erreicht würde, da
das Verhältnis
zwischen Oberfläche
und dem Volumen der Reagenzien in dem Kapillarröhrchen größer ist als bei einem konventionellen
Reagenzgefäß.
-
Alternativ
kann das Gefäß eine flache
Trägerplatte
beinhalten, wie etwa bei einem zweidimensionalen Array, insbesondere
einen Chip, wie etwa einen Siliziumwaferchip, oder einen Probenträger bzw.
Objektträger,
insbesondere einen mikroskopischen Objektträger, auf dem die Reagenzien
gehalten werden können.
Die Platte kann aus dem Polymer hergestellt sein, oder das Polymer
kann als integraler Bestandteil der Platte bereitgestellt sein,
entweder als Beschichtung auf einer Seite der Platte oder als Polymerschicht
innerhalb einer zusammengesetzten Konstruktion gemäß vorheriger
Beschreibung. Da, wo es passend ist, und insbesondere da, wo die
Platte ein Chip ist, kann das Polymer im bevorzugten Format auf
dem Chip abgelagert und/oder eingeätzt sein, indem z.B. Leiterplatten
(printed circuit board, PCB)-Technik verwendet wird.
-
Gefäße dieses
Typs können
besonders nützlich
zur Durchführung
der in situ-PCR, z.B. an Gewebeproben, sein.
-
Andere
geeignete Reaktionsgefäße sind Röhrchen und
Küvetten,
die in der Technik bekannt sind.
-
Bei
Vorrichtungen gemäß der Erfindung
für Reaktionen,
die multiple Temperaturstufen erfordern, weist die Vorrichtung ein
Reaktionsgefäß gemäß obiger
Beschreibung, ein Mittel zum Erzeugen eines elektrischen Stroms
in dem Polymer und eine Steuereinrichtung zum Re gulieren der Menge
an elektrischem Strom, die durch das Polymer geleitet wird, um so
dessen Temperatur zu kontrollieren, auf Die Steuereinrichtung ist
geeigneter Weise eine automatische Kontrolleinrichtung, wie etwa
eine Computer-kontrollierte Interface-Anordnung. Durch die Verwendung eines
programmierbaren Kontrollelements für den elektrischen Stromkreis,
der mit dem Polymer verbunden ist, kann ein definierter Heizablauf,
z.B. eine definierte Zyklenzahl mit vorab festgelegten Temperaturstufen über vorab
festgelegte Zeitintervalle und periodische Aussetzzeiten unter Verwendung dieser
Vorrichtung vorprogrammiert werden, einschließlich der Anwendung unterschiedlicher
Temperatur- und Zeitprofile bei verschiedenen Reaktionsgefäßen in derselben
Vorrichtung zur selben Zeit.
-
Die
Steuereinrichtung kann eine Vorrichtung zur Temperaturüberwachung,
wie etwa ein Thermoelement, beinhalten, welche die Temperatur des
Reaktionsgefäßes überwacht
und diese Information in das Kontrollsystem einspeist, so dass der
gewünschte Ablaufplan
des Erhitzens und/oder Abkühlens
eingehalten wird.
-
Alternativ
kann die Temperatur des Polymers direkt überwacht werden, indem dessen
spezifischer Widerstand gemessen wird, z.B. durch Anordnen des Polymer-Heizelements
als Widerstand bei einer Wheatstone-Brücken-Schaltkreisanordnung.
Dies macht die Verwendung anderer Temperaturmessvorrichtungen, wie
etwa von Thermoelementen, verzichtbar.
-
Optional
kann die Vorrichtung des weiteren künstliche Kühleinrichtungen, wie etwa einen
oder mehrere Ventilatoren, aufweisen.
-
Die
Vorrichtung kann eine Vielzahl von Behältern aufweisen. Das Polymer
kann als integraler Bestandteil jedes Behälters vorliegen, als Umhüllung um
jeden Behälter,
oder es kann so angeordnet sein, dass eine Schicht des Polymers
zwischen benachbarte Behälter
zwischengeschaltet ist. Alle elektrischen Verbindungspunkte an dem
Polymer können mit
einer einzigen elektrischen Energiezuleitung verbunden sein, wenn
eine Anzahl von Reaktionen, die dieselben Temperaturstufen benötigen, durchgeführt wird.
-
Jedoch
ist die Vorrichtung bei einer bevorzugten Ausführungsform so angeordnet, dass
das Polymer, das mit einem Behälter
oder mit einer Gruppe von Behältern
in Kontakt steht (oder diese(n) ausbildet), jeweils mit einer individuellen
Energiezuleitung verbunden ist, wobei verschiedene Behälter oder
verschiedene Gruppen von Behältern
mit verschiedenen, unabhängig
kontrollierten elektrischen Zuleitungen verbunden sind. Mit dieser
Anordnung kann eine Anzahl verschiedener Reaktionen, die unterschiedliche
Temperaturstufen benötigen,
zur selben Zeit durchgeführt
werden, da jeder Behälter
oder jede Gruppe von Behältern
sein/ihr eigenes Heizelement besitzt. Diese Anordnung erlaubt es
Benutzern, eine Anzahl von Reaktionen kleinerer Chargenzahl unter
Verwendung einer einzigen Vorrichtung durchzuführen, was bei der Verwendung
existierender Gerätschaften
nicht möglich
gewesen ist. Die einzigen Vorrichtungen, die bisher für diese
Art von Verwendung verfügbar
waren, sind bestimmte Ausgestaltungen von Blockheizern, die zwischen
2 und 4 Segmenten aufweisen, die unabhängig voneinander beheizt und
abgekühlt
werden können.
Jedoch ist eine solche Vorrichtung auf die Verwendung für 2 bis
4 Reaktionschargen begrenzt und hat den Nachteil der zuvor beschriebenen
langsamen Zykluszeiten.
-
Da,
wo das Reaktionsgefäß einen
Objektträger
oder Chip beinhaltet, kann die Vorrichtung den Objektträger oder
Chip, eine elektrische Versorgungseinheit bzw. elektrische Zuleitung,
Mittel zur Verbindung der elektrischen Zuleitung mit dem Objektträger oder
Chip zum Induzieren eines elektrischen Stroms in dem Polymer und
ein Mittel zum Kontrollieren des durch die Polymerschicht in dem Objektträger oder
Chip fließenden
Stroms beinhalten.
-
Die
Reaktionsgefäße und die
Vorrichtung der Erfindung können
bei einer Vielzahl von Situationen verwendet werden, bei denen es
notwendig ist, dass chemische oder biochemische Reaktionen durchgeführt werden.
Somit stellt die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Durchführung einer
Reaktion, wie etwa einer chemischen oder biochemischen Reaktion
bereit, wobei dieses Verfahren das Erhitzen von Reagenzien in einem
Reaktionsgefäß gemäß obiger
Definition umfasst.
-
Ebenso
wie für
Amplifikationsreaktionen, wie die bereits oben erwähnten PCR-Reaktionen,
können
die Gefäße und die
Vorrichtung der Erfindung für Zwecke
der Nukleinsäuresequenzierung,
sowie für enzymkinetische
Studien verwendet werden, bei denen man die Aktivität von Enzymen
bei verschiedenen Temperaturen untersucht, und ebenso bei anderen
Reaktionen, insbesondere solchen unter Beteiligung von Enzymaktivität, bei denen
exakte Temperaturen aufrecht erhalten werden müssen. Die Reaktionsgefäße der Erfindung
erlauben das Erreichen und die Aufrechterhaltung exakter Temperaturen
für geeignete
Zeitspannen, und dann, nach Wunsch, einen schnellen Wechsel, sogar
bei einer mobilen oder tragbaren Vorrichtung in Übereinstimmung mit einigen
Ausführungsformen
der Erfindung.
-
Bei
PCR-Reaktionen werden die Temperaturbedingungen, die erforderlich
sind, um Denaturierung, Anhybridisieren, bzw. Extension zu erreichen, und
die Zeit, die erforderlich ist, um diese Stufen zu erreichen, in
Abhängigkeit
von verschiedenen Faktoren variieren, wie dies in der Technik verstanden
wird. Beispiele für
solche Faktoren beinhalten die Natur und Länge des amplifizierten Nukleotids,
die Natur der verwendeten Primer und das verwendete Enzym. Die optimalen
Bedingungen können
in jedem Fall durch den Fachmann bestimmt werden. Typische Denaturierungstemperaturen
liegen in der Größenordnung
von 95°C,
typische Annealing-Temperaturen in der Größenordnung von 55°C, und Extensionstemperaturen
von 72°C
sind allgemein in der richtigen Größenordnung. Wenn die Reaktionsgefäße und die Vorrichtung
der Erfindung verwendet werden, können diese Temperaturen rasch
erreicht werden, und die Übergangsgeschwindigkeit
zwischen den Temperaturen lässt
sich problemlos kontrollieren.
-
Generische,
in die DNA interkalierende Farbstoffe und strangspezifische Gensonden-Assays, z.B.
Tagman®-Assays
gemäß der Beschreibung
in der US-A-5,538,848 und Assays auf die vollständige interne Reflexions-Fluoreszenz
(TIRF-Assays), wie etwa solche, die in der WO-A-93/06241 beschrieben sind, können selbstverständlich bei
vielen Ausführungsformen
der Erfindung verwendet werden. Bei solchen Assays wird ein Signal
von der Probe, wie etwa ein Fluoreszenzsignal oder ein verlöschendes Signal
unter Verwendung einer Fluoreszenzüberwachungsvorrichtung detektiert.
Wenn diese Art von Prozess durchgeführt wird, muss die Fluoreszenzüberwachungsvorrichtung
so angeordnet sein, dass sie in der Lage ist, von der Probe ausgehende
Signale zu detektieren. In einigen Fällen kann es hilfreich sein, wenn
wenigstens ein Teil des Gefäßes, z.B.
ein Ende, dort wo das Gefäß ein erfindungsgemäßes Röhrchen ist,
optisch durchsichtig ist, sodass die Messungen hierdurch erfolgen
können.
Alternativ kann das Gefäß mit Mitteln
ausgestattet sein, um ein Signal der Probe an die Überwachungsvorrichtung zu übertragen,
z.B. mit einer optischen Faser oder einem Wellenleiter mit herabgesetzter
kritischer Frequenz.
-
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden nun beispielhaft und unter Bezugnahme
auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, von denen
-
1 einen
Reaktionsgefäß-Heizer
zeigt, der eine Umhüllung
aus elektrisch leitfähigem
Polymer aufweist, die so angeordnet ist, dass sie um ein Reaktionsröhrchen herum
passt;
-
2 einen
Reaktions-Objektträger
zeigt, der eine Beschichtung mit dem elektrisch leitfähigen Polymer
auf einer seiner Oberflächen
zeigt;
-
3 einen
Reaktions-Objektträger
zeigt, der eine Schicht des elektrisch leitfähigen Polymers in einer zusammengesetzten
Konstruktion aufweist;
-
4 eine
Vorrichtung zur Durchführung von
Reaktionen zeigt, die multiple Temperaturstufen beinhalten, wobei
ein Streifen des elektrisch leitfähigen Polymers verwendet wird,
um ein als Reaktionsgefäß dienendes
Kapillarröhrchen
zu erhitzen;
-
5 ein
Diagramm der Vorrichtung gemäß der Erfindung
zur Durchführung
einer PCR-Reaktion zeigt;
-
6 ein
thermozyklisches Profil zeigt, das für die Vorrichtung aus 5 verwendet
wird;
-
7 ein
schematisches Diagramm eines tragbaren PCR-Multidetektors ist;
und
-
7a ein
Diagramm eines Detektorelements zur Verwendung in der Vorrichtung
aus 7 ist.
-
Bezugnehmend
auf 1 ist eine Umhüllung
aus einem elektrisch leitfähigen
Polymer 2 mit elektrischen Verbindungspunkten 3 für die Verbindung
mit einer elektrischen Stromzufuhr versehen. Die Größe und Form
der Umhüllung 2 wird
bestimmt von den Abmessungen und der Form eines Reaktionsgefäßes 1,
um das herum die Umhüllung
angebracht ist.
-
Bei
Gebrauch wird die Umhüllung 2 um
das Reaktionsgefäß rherum
und in engem thermischen Kontakt mit diesem angeordnet. Die Verbindungspunkte 3 werden
dann mit einer elektrischen Stromzufuhr (nicht dargestellt) verbunden,
und Strom wird durch die Polymerumhüllung 2 geleitet,
wodurch diese und jedes Reagenz im Inneren des Reaktionsgefäßes 1 erhitzt
werden.
-
Bezugnehmend
auf 2 wird ein Objektträger 1 auf einer Seite
mit einem elektrisch leitfähigen Polymer 2 beschichtet.
Die elektrischen Verbindungspunkte 3 werden an jedem der
beiden Enden des Objektträgers 1 und
in elektrischem Kontakt mit der Polymerschicht 2 angebracht.
-
Bei 3 beinhaltet
das Gefäß einen
Objektträger 1 mit
zusammengesetzter Bauweise, sodass eine Schicht des elektrisch leitfähigen Polymers 2 zwischen
den Schichten des gewöhnlich
zur Herstellung solcher Träger
verwendeten Materials, z.B. Glas, eingeschoben ist. Die elektrischen
Verbindungspunkte 3 sind an den beiden Enden des Trägers 1 angebracht
und stehen dabei in elektrischem Kontakt mit der Polymerschicht 2.
-
Bei
der Verwendung wird eine elektrische Stromzufuhr (nicht dargestellt)
mit den elektrischen Verbindungspunkten 3 an dem in den 2 und 3 dargestellten
Träger
verbunden, und es wird Strom durch die Polymerschicht 2 geleitet,
wodurch der Träger 1 und
jedes auf dem Träger 1 aufgebrachte
Reagenz erhitzt werden.
-
Bezugnehmend
auf 4 ist ein Streifen des elektrisch leitfähigen Polymerfilms 2 um
ein Kapillarröhrchen 1 herumgewickelt
und befestigt. Der Polymerfilmstreifen ist mit elektrischen
Verbindungspunkten 3 versehen, an die die elektrische Stromzufuhr 5 über Verbindungsklemmen 4 angeschlossen ist.
-
Bei
Gebrauch wird Strom durch den Polymerfilm 2 geleitet, wodurch
das Kapillarröhrchen 1 und
jedes im Inneren des Kapillarröhrchens 1 befindliche
Reagenz erhitzt werden.
-
Die
Vorrichtung aus 5 wurde konstruiert, um PCR-Detektionen
durchzuführen.
Ein Kapillarröhrchen 6 mit
einem Innendurchmesser von 1,12 mm und einem Außendurchmesser von 1,47 mm wurde
als Reaktionsgefäß verwendet.
Ein Streifen aus elektrisch leitfähigem Polymer 7 wurde
um das Röhrchen
herum gewickelt und befestigt, sodass dieser relativ dicht an der
Außenoberfläche des
Röhrchens gehalten
wurde. Das Beheizen erfolgt daher von allen Seiten des Röhrchens 6 aus,
sodass der durch eine Probe im Röhrchen 6 verlaufende
Temperaturgradient minimiert wird.
-
Das
Aufheizen wurde durch eine elektrische Energiequelle 8 ermöglicht,
die über
ein Interface 9 mit einem Computer 10 verbunden
war, um eine automatische Kontrolle der Heizzyklen zu erlauben.
Ein Gebläsekühler 11 wurde
so angeordnet, dass er Luft auf das Polymer 7 leitet. Ein
Infrarot-Thermoelement 12 wurde an der Außenseite
des Polymers 7 bereitgestellt, um die Temperatur zu überwachen.
-
Zum
Zweck einer Bestimmung der Geräteleistung
vor der Benutzung wurde ein K-Typ-Thermoelement verwendet, um die
Temperatur im Inneren des Röhrchens 6 zu überwachen.
Die inneren und äußeren Temperaturen
wurden dann verwendet, um die Ablesungen der Außentemperatur im Hinblick auf die
vorhergesagte Probentemperatur zu linearisieren.
-
Das
Heizpolymer ist mit der Stromquelle 8 verbunden, und der
Schaltkreis wird unter Verwendung des Interface 9 und der
Software geschlossen. Ein Schalter 14, der dafür angeordnet
ist, den Schaltkreis zu schließen,
war ein schnelles optisches Relais, das alle 10 ms umschalten kann.
Ein zweiter Schaltkreis wurde verwendet, um die zwei kleinen elektrischen
Gebläse 11 zu
kontrollieren, die eine auf angetriebener Luft basierende Kühlung der
Reaktionsprobe bereitstellen und kontinuierlich betrieben werden.
Die Kontroll-Software war LabView, das ein benutzerfreundliches
graphisches Interface sowohl bei der Programmierung als auch für den Betrieb
bereitstellt. Der Strom wurde anfänglich mit relativ hoher Frequenz
zugeführt,
um die erforderliche Temperatur schneller zu erreichen. Wenn die vorgesehene Betriebstemperatur
erreicht war, wurde der Strom mit geringerer Frequenz zugeführt, die
erforderlich war, um die vorgesehene Betriebstemperatur für die vorab
festgelegte Dauer aufrecht zu erhalten.
-
Die
in 7 dargestellte Vorrichtung weist eine mit Deckel
versehene Box 70 mit einer isolierenden Unterteilung auf,
die eine Vielzahl an Detektorelement-Aufnahmeöffnungen 71 definiert.
Die Box 70 ist derart dargestellt, dass sie über eine
Interface-Einheit 72 elektrisch mit einer Stromquelle 73 und
einem Computer 74 verbunden ist. Die Verbindung ist so, dass
sie unterschiedliche Energiezuleitungen zu jeder der Aufnahmeöffnungen 71 ermöglicht.
Jede Aufnahmeöffnung
enthält
ein Thermoelement (nicht dargestellt) für die Überwachung der darin vorliegenden Temperatur.
-
Das
in 7a gezeigte Detektorelement weist ein Reaktionsröhrchen 75 auf,
das von einer Umhüllung 76 umgeben
ist. Die Umhüllung 76 besteht
aus einem Heizpolymer und ist mit den Versorgungsenden 77 und 78 verbunden.
-
Nachdem
ein Röhrchen 75 gefüllt und
verschlossen wurde, kann es in eine geeignete Aufnahmeöffnung 71 eingesetzt
werden, solange bis die Enden 77 und 78 an passende
Empfängerenden
in den Aufnahmeöffnungen
(nicht dargestellt) festgeklemmt sind. Die Vorrichtung ist so ausgelegt,
dass sie bei vollständigem
Anschluss eine Anzeige des Verbindungsstatus für jedes Röhrchen 75 auf dem
Computerbildschirm erlaubt.
-
Das
Verschließen
des Deckels an der Box 70 vervollständigt die Isolierung jeder
Aufnahmeöffnung und
die Befestigung jedes Röhrchens 75 in
seiner Aufnahmeöffnung.
-
Das
Computerprogramm ist auf die separate Identifizierung desjenigen
Moleküls
ausgelegt, nach dem in dem jeweiligen Röhrchen 75 gesucht
wird, was bedeutet, dass es für
die Kontrolle des geeigneten PCR-Temperaturzyklus ausgelegt ist,
um das Molekül,
wenn es vorhanden ist, zu amplifizieren. Wenn die Zyklen abgeschlossen
sind, kann der Inhalt des Röhrchens
geeigneten Gensonden-Detektoren ausgesetzt werden, um zu bestimmen,
ob das Molekül,
nach dem gesucht wurde, tatsächlich
anwesend war.
-
Natürlich kann
das Prinzip der in Bezug auf die 7 und 7a beschriebenen
Vorrichtung auf einer Vielzahl von Wegen verwirklicht werden. Sie kann
eher mobil als tragbar sein und für die Aufnahme von Detektorelementen
ausgelegt sein, die in einer anderen Form vorliegen als bei der
eines Röhrchens,
einschließlich
der eines Objektträgers.
Typischerweise ist die Vorrichtung so angeordnet, dass sie 96 oder
192 Detektorelemente aufweist.
-
Das
folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung.
-
Beispiel
-
Amplifikation
von DNA
-
Unter
Verwendung der Vorrichtung aus 5 (Thermoelement
des K-Typs weggelassen) wurde die folgende PCR-Reaktion durchgeführt.
-
Es
wurde ein 100 bp-Amplikon aus einem klonierten Yersinia pestis-Fragment amplifiziert.
Die Reaktionsbedingungen waren zuvor unter Verwendung des Idaho
RapidCyclerTM optimiert worden und Proben
desselben Reaktionsgemischs wurden als Kontrollreaktionen in dem
Idaho RapidCyclerTM amplifiziert.
-
Das
in Röhrchen 6 eingebrachte
Reaktionsgemisch enthält
folgendes:
50 mM Tris HCl pH 8,3
3 mM MgCl2
2,5
mg/ml Rinderserum-Albumin
je 200 μM dATP, dTTP, dCTP und dGTP
10 μg/ml bei
jedem der FCR-Primer
25 Units/ml an Taq-Polymerase
-
Das
thermozyklische Profi wurde programmiert mit 95°C für null Sekunden, 55°C für null Sekunden,
72°C für null Sekunden,
wie in 6 dargestellt. Zum Vergleich wurde ein entsprechendes
thermozyklisches Profil in den Idaho RapidCyclerTM einprogrammiert.
Die Reaktionsvolumina von 50 μl
wurden sowohl für
das Polymerbeschichtete Kapillargefäß 6 als auch für den Idaho
RapidCyclerTM verwendet.
-
In
diesem Zusammenhang bedeutet „null Sekunden", dass das Programm
das Induzieren der nächsten
Temperatur bewirkt, sobald die Zieltemperatur erreicht ist. Die
exakte Zeit, bei der die Reaktion auf der Zieltemperatur gehalten
wird, hängt
daher von den Parametern und Eigenschaften des verwendeten Geräts ab. Im
allgemeinen wird diese jedoch weniger als 1 Sekunde betragen.
-
Nach
40 Zyklen in dem Kapillargefäß wurde eine
50 μl-Probe
des PCR-Produkts von jedem der Reaktionsansätze durch Agarosegelelektrophorese auf
einem 2% Gel in 1 × TAE-Puffer
im Hinblick auf die Größe aufgetrennt.
Die DNA wurde mittels Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht. Die
Probe lief benachbart zu einer Probe aus dem Idaho RapidCyclerTM (25 Zyklen), und es wurde ein entsprechendes Amplikon
korrekter Größe detektiert.