DE69735998T2

DE69735998T2 - Zusammensetzungen zur behandlung und wiederherstellung von knorpeldefekten mit funktioneller sperrschicht

Info

Publication number: DE69735998T2
Application number: DE69735998T
Authority: DE
Inventors: B. Ernst HUNZIKER
Original assignee: Shaw, Robert Francis, Greenbrae
Current assignee: SHAW, ROBERT FRANCIS, GREENBRAE, CALIF., US
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1997-06-24
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2017-06-25
Also published as: DE69735998D1; ES2267145T3; IL127550A; NO986083D0; BR9710088A; CN1321681C; EP0912204A2; NO320089B1; WO1998000183A2; EP0912204B1; NZ333452A; JP2000513721A; AU3581597A; WO1998000183A3; HK1017276A1; NO986083L; KR20000022182A; IL127550A0; CN1226839A; ATE327781T1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Behandlung und Reparatur von Defekten oder Läsionen im Knorpel und von Gelenkknorpeldefekten („full thickness defects in cartilage"). Spezifischer betrifft diese Erfindung Arzneimittel zur Behandlung von Defekten im Knorpel und Knorpelreparatur-Zusammensetzungen, die eine Matrix umfassen, welche ein anti-angiogenes Mittel als eine „funktionelle Sperrschicht" enthält, um das Einwachsen von Blutgefäßen aus dem darunter liegenden Knochengewebe in das neue Knorpelgewebe zu verhindern. Die Knorpelreparatur-Zusammensetzung kann auch ein oder mehrere Proliferationsmittel sowie einen Transformationsfaktor enthalten, um die Proliferation und die Transformation von Knorpelreparaturzellen zu fördern, um neues stabiles Knorpelgewebe zu bilden. Die Zusammensetzungen dieser Erfindung sind besonders nützlich bei der Behandlung von Gelenkknorpeldefekten, die sich bei schwerer Osteoarthritis und bei anderen Krankheiten und Verletzungen finden, bei denen Knorpelverletzungen gebildet werden.
HINTERGRUND DES FACHGEBIETS
Gelenke sind eine der bekannten Weisen, durch die Knochen im Skelett miteinander verbunden werden. Die Enden der normalen, durch Gelenke verbundenen Knochen sind von Gelenkknorpelgewebe bedeckt, das eine praktisch reibungsfreie Bewegung der Knochen gegeneinander erlaubt [L. Weiss, Hrsg., Cell and Tissue Biology (München, Urban und Schwarzenburg, 1988) S. 247].
Der Gelenkknorpel ist durch eine besondere strukturelle Organisation gekennzeichnet. Er besteht aus spezialisierten Zellen (Chondrocyten), die in einem interzellulären Material (das in der Literatur oft als „Knorpelmatrix" bezeichnet wird) eingebettet sind, das reich an Proteoglykanen, Kollagenfibrillen, die vorwiegend dem Typ II angehören, anderen Proteinen und Wasser ist [Buckwalter et al., „Articular Cartilage: Injury and Repair", in: Injury and Repair of the Musculoskeletal Soft Tissues (Park Ridge, III.: American Academy of Orthopaedic Surgeons Symposium, 1987) S. 465]. Das Knorpelgewebe ist weder innerviert, noch wird es von dem Gefäß- oder dem Lymphsystem durchdrungen. In den reifen Gelenken von Erwachsenen ist das darunter liegende subchondrale Knochengewebe, das eine enge, kontinuierliche Platte zwischen dem Knochengewebe und dem Knorpel bildet, jedoch innerviert und mit Gefäßen versorgt. Unter dieser Knochenplatte bildet das Knochengewebe Trabekel, die das Mark enthalten. Bei unreifen Gelenken liegen unter dem Gelenkknorpel nur die primären Knochentrabekel. Ein Teil des Meniskusgewebes in den Gelenken besteht ebenfalls aus Knorpel, dessen Zusammensetzung ähnlich der des Gelenkknorpels ist [Beaupre, A. et al., Clin. Orthop. Rel. Res., S.72-76, (1986)].
Es werden zwei Arten von Defekten der Gelenkoberflächen unterschieden, d. h. Gelenkknorpeldefekte und oberflächliche Defekte. Diese Defekte unterscheiden sich nicht nur in dem Ausmaß des physischen Schadens an dem Knorpel, sondern auch in der Natur der Reparaturantwortreaktion, die jede Art von Läsion hervorrufen kann.
Gelenkknorpeldefekte einer Gelenkoberfläche umfassen Schäden an dem hyalinen Knorpel, der verkalkten Knorpelschicht und dem subchondralen Knochengewebe mit seinen Blutgefäßen und dem Knochenmark. Die Schäden an dem Knochengewebe können von einem Sprung oder einem Riss bis zu einer vergrößerten Lücke in dem Knochengewebe reichen. Gelenkknorpeldefekte können starke Schmerzen verursachen, da die Knochenplatte sensorische Nervenendigungen enthält. Solche Defekte entstehen im Allgemeinen aus schweren Verletzungen oder im Verlauf der letzten Stadien einer degenerativen Gelenkerkrankung wie z. B. der Osteoarthritis. Gelenkknorpeldefekte können gelegentlich zu Blutungen führen und zur Induktion einer Reparaturantwortreaktion aus dem subchondralen Knochen [Buckwalter et al., „Articular Cartilage: Composition, Structure, Response to Injury and Methods of Facilitating Repair", in: Articular Cartilage and Knee Joint Function: Basic Science and Arthroscopy (New York, Rauen Press, 1990) S.19-56]. Das gebildete Reparaturgewebe ist eine mit Gefäßen versorgte, fibröse Art des Knorpels mit nicht ausreichenden biomechanischen Eigenschaften und bleibt nicht über einen längeren Zeitraum bestehen [Buckwalter et al. (1990), vorstehend].
Oberflächliche Defekte in dem Gelenkknorpelgewebe sind auf das Knorpelgewebe selber beschränkt. Solche Defekte sind berüchtigt, weil sie nicht heilen und keine Neigung zu Reparaturreaktionen zeigen.
Oberflächliche Defekte können als Risse, Rasen oder Spalten in der Oberfläche des Knorpels auftreten, oder sie können ein „Krabbenfleisch-" Erscheinungsbild in dem betroffenen Gewebe aufweisen. Sie enthalten keine blutenden Gefäße (Blutflecken), wie man sie bei Gelenkknorpeldefekten beobachtet. Oberflächliche Defekte können keine bekannte Ursache haben, aber oft sind sie das Ergebnis mechanischer Fehlstellungen, die zu einer Abnutzung des Knorpelgewebes führen. Mechanische Fehlstellungen können durch Verletzungen des Gelenks verursacht sein, wie z. B. durch eine Verlagerung von gerissenem Meniskusgewebe in das Gelenk, durch eine Meniskusentfernung, durch eine Luxation des Gelenks aufgrund eines gerissenen Ligaments, durch eine Fehlstellung von Gelenken oder durch einen Knochenbruch oder durch Erbkrankheiten. Oberflächliche Defekte sind ebenfalls für die frühen Stadien degenerativer Gelenkserkrankungen charakteristisch, wie z. B. der Osteoarthritis. Da das Knorpelgewebe nicht innerviert Ham's Histology (9. Ausgabe, Philadelphia, J.B. Lippincott Co., 1987), S. 266-272] oder mit Gefäßen versorgt ist, sind oberflächliche Defekte nicht schmerzhaft. Obwohl sie keine Schmerzen verursachen, heilen oberflächliche Defekte jedoch nicht und degenerieren oft zu Gelenkknorpeldefekten.
Man nimmt allgemein an, dass, weil dem Gelenkknorpel eine Gefäßversorgung fehlt, das verletzte Knorpelgewebe keine ausreichenden oder keine geeigneten Reize erhält, so dass eine Reparaturantwortreaktion hervorgerufen wird [Webber et al., „Intrinsic Repair Capabilities of Rabbit Meniscal Fibrocartilage: A Cell Culture Model", (30. Ann. Orthop. Res. Soc., Atlanta, Feb. 1984); Webber et al., J. Orthop. Res. 3, S. 36-42 (1985)]. Man nimmt an, dass die Chondrocyten in dem Knorpelgewebe ausreichenden Mengen an Reparatur-stimulierenden Agenzien normalerweise nicht ausgesetzt sind, wie z. B. Wachstumsfaktoren und Fibringerinnseln, die typischerweise in beschädigtem, mit Gefäßen versorgtem Gewebe vorhanden sind.
Ein Ansatz, der dazu verwendet wurde, beschädigtes Knorpelgewebe Reparaturreizen auszusetzen, umfasst das Einbohren oder das Abschaben durch den Knorpel in den subchondralen Knochen, um eine Blutung zu verursachen [Buckwalter et al. (1990), vorstehend]. Unglücklicherweise ist die Reparaturantwortreaktion des Gewebes auf eine solche chirurgische Verletzung in der Regel mit derjenigen vergleichbar, deren Auftreten man bei Gelenkknorpeldefekten, die Blutungen verursachen, natürlicherweise beobachtet, nämlich die Bildung eines fibrösen Typs an Knorpel, der nicht ausreichende biomechanische Eigenschaften aufweist, und der nicht über einen längeren Zeitraum bestehen bleibt [Buckwalter et al. (1990), vorstehend].
Es ist eine Reihe an Wachstumsfaktoren isoliert worden, und diese sind nun für die Forschung und für biomedizinische Anwendungen verfügbar [vergleiche z. B. mit Rizzino, A., Dev. Biol. 130, S. 411-422 (1988)]. Von einigen dieser Wachstumsfaktoren wie z. B. von dem transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-β) wurde berichtet, dass sie die Bildung von knorpelspezifischen Molekülen wie z. B. Typ II-Kollagen und knorpelspezifischen Proteoglykanen in embryonalen Ratten-Mesenchymzellen in vitro fördern [vergleiche z. B. mit Seyedin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, S. 2267-2271 (1985); Seyedin et al., J. Biol. Chem. 261, S. 5693-5695 (1986); Seyedin et al., J. Biol. Chem. 262, S. 1946-1949 (1987)].
Des Weiteren wurde eine Reihe von Proteinfaktoren identifiziert, die offensichtlich die Bildung des Knochens stimulieren. Solche osteogenen Faktoren umfassen die Knochen-morphogenetischen Proteine, Osteogenin, das Knochenosteogene Protein (BOP), die TGF-βs und rekombinante Knochen-induzierende Proteine.
Bei Millionen von Patienten wurde eine Osteoarthritis diagnostiziert, d. h. sie weisen degenerative Defekte oder Läsionen in ihrem Gelenkknorpel auf. Obwohl verschiedene Verfahren beanspruchen, eine Reparaturantwortreaktion in beschädigtem Knorpel hervorrufen zu können, erfuhr keines dieser Behandlungsverfahren eine wesentliche Anwendung [Buckwalter et al. (1990), vorstehend; Knutson et al., J. Bone and Joint Surg. 68-B, S. 795 (1986); Knutson et al., J. Bone and Joint Surg. 67-B, S. 47 (1985); Knutson et al., Clin. Orthop. 191, S. 202 (1984); Marquet, Clin. Orthop. 146, S. 102 (1980)]. Und solche Behandlungen haben im Allgemeinen nur vorübergehend Erleichterung gebracht. Die systemische Verwendung von „chondroprotektiven Mitteln" wurde ebenfalls vorgeschlagen, um das Voranschreiten einer Osteoarthritis anzuhalten und eine Erleichterung der Schmerzen zu induzieren. Von solchen Mitteln wurde jedoch nicht gezeigt, dass sie die Reparatur von Läsionen oder Defekten in dem Knorpelgewebe fördern.
Bis heute war die Behandlung von Patienten, die unter einer Osteoarthritis leiden, größtenteils auf eine symptomatische Erleichterung durch die Verwendung von Schmerzmitteln und entzündungshemmenden Mitteln gerichtet. Ohne eine Behandlung, die eine Reparatur der oberflächlichen Defekte in dem Knorpelgewebe hervorruft, nutzt sich der Knorpel häufig bis auf die subchondrale Knochenplatte ab. Zu diesem Zeitpunkt der Erkrankung, d. h. bei einer schweren Osteoarthritis, diktiert die unablässige Natur des Schmerzes und die signifikante Beeinträchtigung der Funktion oft, dass das ganze Gelenk herausgenommen und durch ein künstliches Gelenk aus Metall und/oder Plastik ersetzt wird. Etwa eine halbe Million Behandlungen, die eine Resektion des Gelenks und den Ersatz durch ein künstliches Gelenk umfassen, werden derzeit an Knien und Hüften jedes Jahr durchgeführt [vergleiche z. B. mit Graves, E. J., „1988 Zusammenfassung; National Hospital Discharge Survey", Advanced Data From Vital and Health Statistics, 185, S. 1-12, (19. Juni 1990)].
WO 9213565 offenbart eine Matrix, die einen Wachstumsfaktor enthält, für die Behandlung von Knorpelläsionen. US 5382514 offenbart in vivo-Angiogenese-Testansätze, die Matrigel und angiogene oder anti-angiogene Verbindungen verwenden.
Daher besteht ein Bedarf an einem verlässlichen Behandlungsverfahren für das Knorpelgewebe bei oberflächlichen Knorpeldefekten und für Knorpel- und Knochengewebe bei Gelenkknorpeldefekten, wie sie z. B. bei Fällen schwerer Osteoarthritis vorliegen.
Neben Defekten des Knorpelgewebes gibt es andere Defekte, für die ein verbessertes Behandlungsverfahren erforderlich ist. Ein Bereich, in dem verbesserte Behandlungsverfahren benötigt werden, ist bei der periodontalen Reparatur und Regeneration. Derzeit werden physikalische, in der Regel auf Membranen basierende Sperren verwendet, um das unerwünschte Einwachsen des Gewebes zwischen den Kompartimenten zu verhindern, wie zum Beispiel bei Fällen schwerer Parodontitis. [Vergleiche z. B. mit Robert, P.M. und Frank, R.M., „Peridontal guided tissue regeneration with a new resorbable polylactic acid membrane", J. Periodonto. 65.5, S. 414-422 (1994)]. Physikalische Membranen werden auch bei gesteuerten orthopädischen Geweberegenerationen verwendet. [Vergleiche z. B. mit Farso, R. et al., „Guided tissue regeneration in long bone defects in rabbits", Acta Orthop. 63, S. 66-69 (1992)]. Diese Verfahren sind jedoch nicht wünschenswert, da die Membranen gewöhnlich nicht biologisch abbaubar sind und daher ein zweiter chirurgischer Eingriff erforderlich ist. Darüber hinaus sind die physikalischen Membranen, die biologisch abbaubar sind, oft mit lang andauernden gegenteiligen Wirkungen verbunden, einschließlich Entzündungen und chronischen Fremdkörper-Abwehrreaktionen, weil die Abbauprodukte der Membran zu lokalen chronischen Entzündungsreaktionen und in Verbindung damit, zu einer Hemmung der Differenzierungsvorgänge in dem umgebenden Gewebe führen. Daher besteht ein Bedarf an einem verbesserten Verfahren, das bei der Regenerierung des Knochens bei periodontalen und orthopädischen Reparaturen behilflich ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung löst die Probleme, auf die vorstehend Bezug genommen wurde, durch die Bereitstellung wirksamer therapeutischer Zusammensetzungen, um die Reparatur von Läsionen im Knorpel des Menschen und anderer Tiere zu induzieren. Die Verwendung der Zusammensetzungen dieser Erfindung fördert auch die Heilung von verletzungsbedingten Läsionen und Formen der Osteoarthritis, die andernfalls zu dem Verlust der wirksamen Funktion des Gelenks führen würden, was wahrscheinlich zur Resektion und zum Austausch des Gelenks führen würde.
In einer allgemeinen Übersicht umfassen die Zusammensetzungen dieser Erfindung für die Behandlung von oberflächlichen Knorpeldefekten oder des Knorpelanteils bei Gelenkknorpeldefekten das Auffüllen des Knorpelanteils des Defekts mit einer Knorpel-Reparaturmatrix, die ein anti-angiogenes Mittel zur Hemmung des Einwachsens von Gefäßen enthält, wie z. B. einen anti-invasiven Faktor, einen Metallprotease-Inhibitor oder Antikörper gegen die Angiogenese induzierende Faktoren. Die Knorpel-Reparaturmatrix wird in das tierische Gewebe eingebaut und ist im Allgemeinen biologisch abbaubar; sie kann auch ein Proliferationsmittel und einen Transformationsfaktor enthalten. Die Knorpel-Reparaturmatrices dieser Erfindung sind besonders für die Behandlung von Gelenkknorpeldefekten und offensichtlichen oberflächlichen Knorpeldefekten nützlich, bei denen die Möglichkeit eines Risses oder einer Spalte in dem darunter liegenden Knochen besteht.
In einer anderen Ausführungsform sollen die Zusammensetzungen dieser Erfindung bei Verfahren verwendet werden, die eine Hitzebehandlung in den Bereichen eines Gelenkknorpeldefekts umfassen, in denen eine Blutung aufgetreten ist, um eine transiente Gewebesperre zu erzeugen, und dann erfolgt die Auffüllung des Defekts mit der Knorpel-Reparaturmatrix.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung für die Reparatur von Gelenkknorpeldefekten in Gelenken umfassen ebenfalls, sofern es aufgrund einer umfangreichen Knochenverletzung notwendig oder wünschenswert ist, das Auffüllen des Defekts in dem Knochenanteil eines Gelenkknorpeldefekts bis zur Höhe der Knochen-Knorpel-Grenze mit einer Matrix, die in das tierische Gewebe eingebaut wird und die in der Regel biologisch abbaubar ist. Die Knochen-Reparaturmatrix kann angiogene und osteogene Faktoren enthalten. Der verbleibende Knorpelanteil des Defekts wird bis zur Höhe der Knorpeloberfläche mit der Knorpel-Reparaturmatrix aufgefüllt, die ein anti-angiogenes Mittel zur Hemmung des Einwachsens von Blutgefäßen enthält. Die Knorpel-Reparaturmatrix kann auch ein Proliferationsmittel und einen Transformationsfaktor enthalten.
Die Behandlung von oberflächlichen Defekten und von Gelenkknorpeldefekten kann während arthroskopischen, offen chirurgischen oder percutanen Verfahren unter Verwendung der Zusammensetzungen dieser Erfindung erfolgen. Gemäß bestimmten Verwendungen dieser Erfindung ist nach der Identifizierung eines Gelenkknorpeldefekts der Defekt durch die folgenden Schritte zu behandeln: (1) das Auffüllen des Knochenanteils des Defekts mit einer Zusammensetzung, die eine Matrix umfasst, welche einen angiogenen Faktor und einen osteogenen Faktor enthält, der in einem geeigneten Zuführungssystem verpackt ist, wie z. B. in Liposomen, und (2) das Auffüllen des Knorpelanteils des Defekts mit einer Zusammensetzung, die eine Matrix enthält, die bevorzugt biologisch abbaubar ist, und die ein anti-angiogenes Mittel und einen Transformationsfaktor enthält, der in einem geeigneten Zuführungssystem verpackt ist. Bei diesem zweiten Schritt kann die Matrix an die Oberfläche des Knorpelanteils des Gelenkknorpeldefekts gebunden werden, zum Beispiel unter Verwendung eines die Adhäsion fördernden Faktors wie z. B. einer Transglutaminase.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Damit die Erfindung besser verstanden werden kann, wird die folgende genaue Beschreibung bereitgestellt. In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet.
Angiogener Faktor – wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein beliebiges Peptid, Polypeptid, Protein oder eine beliebige andere Verbindung oder Zusammensetzung, das/die die Bildung von Blutgefäßen und assoziierten Zellen (wie z. B. endotheliale, perivaskuläre, mesenchymale und glatte Muskel-Zellen) sowie der mit den Blutgefäßen assoziierten Basalmembranen stimuliert. In vivo- und in vitro-Testansätze für angiogene Faktoren sind im Fachgebiet wohlbekannt [z. B. Gimbrone, M.A. et al., J. Natl. Cancer Inst. 52, S. 413-419 (1974); Klagsbrun, M. et al., Cancer Res. 36, S. 110-113 (1976); Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80, S. 2623-2627 (1983); Gospodarowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 73, S. 4120-4124 (1976); Folkman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, S. 5217-5221 (1979); Zetter, B.R., Nature (London), 285, S. 41-43 (1980); Azizkhan, R.G. et al., J. Exp. Med. 152, S. 931-944 (1980)].
Anti-angiogenes Mittel – wie hierin verwendet, bezieht sich auf jede beliebige Verbindung oder Zusammensetzung mit einer biologischer Aktivität, die das Einwachsen von Blutgefäßen aus dem darunter liegenden Knochengewebe in das Knorpelgewebe verhindert, wie z. B. anti-invasive Faktoren, aus dem Knorpel stammende Angiogenese-Inhibitoren, Angiostatin, Metallprotease-Inhibitoren, Antikörper gegen die Angiogenese induzierende Faktoren (einschließlich bFGF und der die Endothelzellen stimulierende angiogene Faktor (ESAF)), Suramin (Germanin^®, Bayer Co., Deutschland), Fumagillin, Fumagillin-Analoga und AGM-1470 [Peacok, D.J. et al., Cellular Immunology 160, S. 178-184 (1995)]. In vivo- und in vitro-Testansätze für die Bestimmung anti-angiogener Mittel sind im Fachgebiet wohlbekannt [vergleiche z. B. mit Moses, M.A., Clinical & Exptl. Rheumatology 11 (Erg. 8), S. 567-569 (1993); Moses, M.A. et al., J. Cell Biol. 119 (2), S. 475-482 (1992); Moses, M.A., et al., Science 248, S. 1408-1410 (1990); Ingber, D. et al., Nature 348 (6), S. 555-557 (1990)].
Anti-Gewebefaktoren – wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung mit einer biologischer Aktivität, die das unerwünschte Wachstum von bestimmten Geweben selektiv verhindert. Zum Beispiel umfassen anti-epitheliale Faktoren zur selektiven Hemmung der Epithelbildung anti-epitheliale Antikörper, Vitamin-A-Inhibitoren, anti-Retinol-, anti-Baselmembran-Antikörper, Inhibitoren des epidermalen Wachstumsfaktors, Matrices, die mit Fibronectin angereichert sind, und beliebige andere Faktoren, die die Proliferation, das Wachstum oder die Differenzierung von Epithelzellen oder die Epithelbildung hemmen. [Vergleiche z. B. mit Adams, J.C. und Watt, F.M., „Fibronectin inhibits the terminal differentiation of human keratinocytes", Nature 340, S. 307-309 (1989)]. Anti-Bindegewebsfaktoren zur selektiven Hemmung der Bildung von Bindegewebe umfassen anti-Bindegewebe-Antikörper, Antikörper gegen Bindegewebe-spezifische Wachstumsfaktoren, Antikörper gegen mesenchymale Zelloberflächenproteine und Faktoren, die die Proliferation mesenchymaler Zellen hemmen. Anti-Knochen-Faktoren für die selektive Hemmung der Bildung von Knochengewebe umfassen anti-angiogene Faktoren und monoclonale oder polyclonale Antikörper oder Kombinationen davon, die gegen Mitglieder der TGF-β-Superfamilie gerichtet sind.
Arthroskopie – wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Verwendung eines Arthroskops zur Untersuchung oder zur Operation eines Gelenks.
Knochen – wie hierin verwendet, bezieht sich auf verkalktes Bindegewebe, das vorwiegend aus einem Netzwerk von abgelagertem Calcium und Phosphat in der Form von Hydroxyapatit, aus Kollagen (überwiegend Typ I-Kollagen) und Knochenzellen besteht, wie z. B. aus Osteoblasten und Osteoklasten.
Knochen-Reparaturzelle – wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Zelle, die, wenn sie einem geeigneten Reiz ausgesetzt wird, sich differenziert und in eine Knochenzelle umwandelt, wie z. B. in einen Osteoblasten oder eine Osteocyte, welche den Knochen bildet. Knochen-Reparaturzellen umfassen perivaskuläre Zellen, mesenchymale Zellen, Fibroblasten, Fibroblasten-ähnliche Zellen und dedifferenzierte Chondrocyten.
Knorpel – wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Art von Bindegewebe, das Chondrocyten enthält, die in einem interzellulären Material (oft als „Knorpelmatrix" bezeichnet) eingebettet sind, das Kollagenfasern (vorwiegend Typ II-Kollagen zusammen mit anderen, in geringeren Mengen vorkommenden Kollagentypen, wie z. B. den Typen IX und XI), verschiedene Proteoglykane (z. B. Chondroitinsulfat-, Keratansulfat- und Dermatansulfat-Proteoglykane), andere Proteine sowie Wasser enthält. Knorpel, wie hierin verwendet, umfasst Gelenk- und Meniskus-Knorpel. Gelenkknorpel bedeckt die Oberflächen der Knochenanteile in den Gelenken und erlaubt die Bewegung der Gelenke ohne einen direkten Knochen-zu-Knochen-Kontakt, wodurch die Abnutzung und Schäden an den gegenüberliegenden Knochenoberflächen verhindert werden. Meistens wird der normale und gesunde Gelenkknorpel auch als „hyalin" beschrieben, d. h. er besitzt ein charakteristisches Erscheinungsbild wie mattiertes Glas. Meniskusknorpel wird gewöhnlich in Gelenken gefunden, die sowohl Erschütterungen als auch Bewegungen ausgesetzt sind. Solche Orte von Meniskusknorpel umfassen die temporo-mandibularen, die sterno-clavicularen und die acromio-clavicularen Gelenke sowie Hand- und Kniegelenke Gray's Anatomy (New York, Bounty Books, 1977)].
Knorpel-Reparaturzelle – wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Zelle, die, wenn sie einem geeigneten Reiz ausgesetzt wird, sich differenziert und in eine Chondrocyte umwandelt. Knorpel-Reparaturzellen umfassen mesenchymale Zellen, Fibroblasten, Fibroblasten-ähnliche Zellen, Makrophagen und dedifferenzierte Chondrocyten.
Zelladhäsion fördernder Faktor – wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung einschließlich Fibronectin und anderen Peptiden, so klein wie Tetrapeptide, die das Tripeptid Arg-Gly-Asp enthalten, das die Adhäsion von Zellen an das extrazelluläre Material vermittelt [Ruoslathi et al., Cell 44, S. 517-518 (1986)].
Chemotaktisches Mittel – wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, einschließlich Peptiden, Proteinen, Glykoproteinen und Glycosaminglykan-Ketten, die in der Lage ist, Zellen bei chemotaktischen Standard-in vitro-Testansätzen anzulocken [z. B. Wahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, S. 5788-5792 (1987); Postlewaite et al., J. Exp. Med., 165, S. 251-256 (1987); Moore et al., Int. J. Tiss. Reac. XI, S. 301-307 (1989)].
Chondrocyten – wie hierin verwendet, beziehen sich auf Zellen, die in der Lage sind, Bestandteile des Knorpelgewebes herzustellen, wie z. B. Knorpelfibrillen und -fasern des Typs II sowie Proteoglykane.
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) – ist ein beliebiges Mitglied der Familie der FGF-Polypeptide [Gimenez-Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 135, S. 541-548 (1986); Thomas et al., Trends Biochem. Sci. 11, S. 81-84 (1986)] oder Derivate davon, die aus natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Quellen erhalten werden können, wobei der Faktor die Fähigkeit aufweist, die DNA-Synthese und die Zellteilung in vitro zu stimulieren [hinsichtlich Testansätzen vergleiche z. B. mit Gimenez-Gallego et al., 1986, vorstehend; Canalis et al., J. Clin. Invest. 81, S. 1572-1577 (1988)], und zwar in einer Reihe von Zellen, einschließlich primären Fibroblasten, Chondrocyten, vasculären und cornealen Endothelzellen, Osteoblasten, Muskelzellen, glatten Muskel- und Glia-Zellen [Thomas et al., 1986, vorstehend]. Die FGFs können als saurer (aFGF) oder als basischer (bFGF) FGF in Abhängigkeit von ihrem isoelektrischen Punkt (pl) klassifiziert werden.
Matrix – wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen porösen, zusammengesetzten, festen oder halbfesten Stoff, der Poren oder Räume enthält, die ausreichend groß sind, um Zellen zu ermöglichen, die Matrix zu besiedeln. Der Begriff Matrix umfasst Matrix-bildende Materialien, d. h. Materialien, die Matrices innerhalb einer defekten Stelle in Knorpel oder in Knochen bilden können. Matrix-bildende Materialien können die Hinzufügung eines polymerisierenden Mittels erfordern, um die Matrix zu bilden, wie z. B. die Zugabe von Thrombin zu einer Lösung, die Fibrinogen enthält, um eine Fibrinmatrix zu bilden. Andere Matrix-Materialien umfassen Kollagen, Kombinationen von Kollagen und Fibrin, Agarose (z. B. Sepharose^®) und Gelatine. Calciumphosphate wie z. B. tri-Calciumphosphat, Hydroxyapatit oder andere Calciumsalze, die feste Matrices bilden, können alleine oder in Kombination mit anderen Matrixmaterialien bei der Behandlung von Defekten in Knochen verwendet werden.
Membran – wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein beliebiges Material, das zwischen den Anteil des Knochendefekts und den Anteil des Knorpeldefekts bei einem Gelenkknorpeldefekt platziert werden kann und das die Einwanderung von Zellen und die Infiltration von Blutgefäßen aus dem Knochendefektanteil in den Knorpeldefektanteil des Gelenkknorpeldefekts verhindern kann. Die Membranen, die bei den Zusammensetzungen dieser Erfindung für die Reparatur von Gelenkknorpeldefekten verwendet werden, sind bevorzugt biologisch abbaubar.
Osteogener Faktor – wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein beliebiges Peptid, Polypeptid, Protein oder jede beliebige andere Verbindung oder Zusammensetzung, das/die die Knochenbildung induziert oder stimuliert. Der osteogene Faktor induziert die Differenzierung von Knochen-Reparaturzellen zu Knochenzellen wie z. B. zu Osteoblasten oder Osteocyten. Dieser Vorgang kann durch einen Übergangszustand des Knorpelgewebes erreicht werden. Das aus den Knochenzellen gebildete Knochengewebe enthält Knochen-spezifische Stoffe wie z. B. Typ I-Kollagenfibrillen, Hydroxapatit-Mineralien und verschiedene Glykoproteine sowie kleine Mengen an Knochen-Proteoglykanen.
Proliferationsmittel (mitogenes Mittel) – wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, einschließlich Peptiden, Proteinen und Glykoproteinen, das/die in der Lage ist, die Proliferation von Zellen in vitro zu stimulieren. In vitro-Testansätze zur Bestimmung der Proliferationsaktivität (mitogenen Aktivität) von Peptiden, Polypeptiden und anderen Verbindungen sind im Fachgebiet wohlbekannt [vergleiche z. B. mit Canalis et al., J. Clin. Invest., S. 1572-1577 (1988); Gimenez-Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 135, S. 541- 548 (1986); Rizzino, „Soff Agar Growth Assays for Transforming Growth Factors and Mitogenic Polypeptides", in: Methods Enzymol. 146A (New York, Academic Press, 1987), S. 341-352; Dickson et al., „Assay of Mitogen-Induced Effects on Cellular Incorporation of Precursors for Scavengers, de Novo, and Net DNA Synthesis", in: Methods Enzymol. 146A (New York, Academic Press, 1987), S. 329-340]. Ein Standardverfahren zur Bestimmung der Proliferationsaktivität (mitogenen Aktivität) einer Verbindung oder einer Zusammensetzung besteht darin, sie auf ihre Fähigkeit, das von einer Verankerung unabhängige Wachstum von nicht transformierten Zellen in Weichagar in vitro zu untersuchen [vergleiche z. B. mit Rizzino, 1987, vorstehend]. Es sind auch andere Testsysteme für die mitogene Aktivität bekannt [z. B. Gimenez-Gallego et al., 1986, vorstehend; Canalis et al., 1988, vorstehend; Dickson et al., 1987, vorstehend]. Die mitogenen Wirkungen der Mittel sind häufig stark konzentrationsabhängig und ihre Wirkungen können sich bei niedrigeren oder bei höheren Konzentrationen unter bzw. über dem optimalen Konzentrationsbereich für eine mitogene Wirksamkeit ins Gegenteil umkehren.
Transformationsfaktor – wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein beliebiges Peptid, Polypeptid, Protein oder eine beliebige andere Verbindung oder Zusammensetzung, das/die die Differenzierung einer Knorpel-Reparaturzelle zu einer Chondrocyte induziert. Die Fähigkeit der Verbindung oder der Zusammensetzung, die Produktion von Knorpel-spezifischen Proteoglykanen und Typ II-Kollagen durch die Zellen zu induzieren oder zu stimulieren, kann durch in vitro-Testansätze bestimmt werden, die im Fachgebiet bekannt sind [Seyedin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, S. 2267-2271 (1985); Seyedin et al., Path. Immunol. Res. 7, S. 38-42 (1987)].
Transformierender Wachstumsfaktor Beta (TGF-β) – ist ein beliebiges Mitglied der TGF-β-Polypeptidfamilie [Derynck, R. et al., Nature 316, S. 701-705 (1985); Roberts et al., „The transforming growth factor-β's", in: Peptide growth factors and their receptors I (Berlin, Springer Verlag, 1990), S. 419)] oder Derivate davon, die aus natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Quellen erhalten werden können, wobei der Faktor die charakteristische Fähigkeit von TGF-β aufweist, normale Ratten-Nierenzellen (NRK) zum Wachstum und zur Koloniebildung in einem Weichagar-Testansatz zu stimulieren [Roberts et al., „Purification of Type β Transforming Growth Factors From Nonneoplastic Tissues", in: Methods for the Preparation of Media, Supplements, and Substrata for Serum-free Animal Cell Culture (New York, Alan R. Liss, Inc., 1984)], und der in der Lage ist, die Transformation von Knorpel-Reparaturzellen zu Chondrocyten zu induzieren, wie dies durch die Fähigkeit zur Induktion oder zur Stimulierung der Produktion von Knorpel-spezifischen Proteoglykanen und Typ II-Kollagen durch die Zellen in vitro bewiesen werden kann [Seyedin et al., 1985, vorstehend].
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen für die Behandlung von Defekten oder Läsionen im Knorpel und im Knochen. Die Zusammensetzungen dieser Erfindung umfassen Matrices, die Poren besitzen, welche ausreichend groß sind, um Zellen zu erlauben, die Matrices zu besiedeln.
Für die Verwendung bei der Reparatur von Knorpel wie bei oberflächlichen Defekten oder der Knorpelschicht bei einem Gelenkknorpeldefekt enthält die Matrix ein anti-angiogenes Mittel, das die biologische Aktivität aufweist, das Einwachsen von Blutgefäßen in das Knorpelgewebe zu verhindern, wodurch die Knochenbildung und eine ungemäße Reparatur des Knorpelgewebes verhindert werden. Die Matrix kann auch ein Proliferationsmittel enthalten, um die Proliferation von Knorpel-Reparaturzellen in der Matrix zu stimulieren. Das Proliferationsmittel dient bevorzugt auch als chemotaktisches Mittel zur Anlockung von Knorpel-Reparaturzellen in die Matrix. Alternativ kann die Matrix ein chemotaktisches Mittel neben dem Proliferationsmittel enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung enthält die Matrix ebenfalls eine geeignete Konzentration eines Transformationsfaktors, wobei der Transformationsfaktor innerhalb oder in Verbindung mit einem Zuführungssystem vorliegt, das die Freisetzung des Transformationsfaktors zu einem geeigneten Zeitpunkt bewirkt, um die proliferierten Knorpel-Reparaturzellen in der Matrix in Chondrocyten umzuwandeln, die stabiles Knorpelgewebe herstellen. Die Matrix kann ebenfalls einen die Zelladhäsion fördernden Faktor enthalten.
Bei Knorpel-Reparatur-Matrices, die bei der Reparatur von Gelenkknorpeldefekten verwendet werden, kann ein chemotaktisches oder ein Proliferationsmittel nicht erforderlich sein, und es kann nicht erforderlich sein, die Freisetzung des Transformationsfaktors wesentlich zu verzögern. Bei Gelenkknorpeldefekten besteht ein ausreichender Zugang für die Reparaturzellen in dem darunter liegenden Knochen, und daher ist es nicht nötig, für diesen Zweck Synovialzellen zu rekrutieren. Die Reparaturzellen aus dem Knochenbereich werden rasch in die Stelle des Knorpeldefekts einwandern. Wenn gewünscht, können jedoch Proliferationsmittel und chemotaktische Faktoren hinzugefügt werden, insbesondere, wenn die Fläche des Defekts groß ist. Da die Reparaturzellen die Defektstelle rasch besiedeln, ist eine deutlich verzögerte Aussetzung gegenüber dem Transformationsfaktor nicht so von Bedeutung wie bei oberflächlichen Defekten, bei denen mehr Zeit zur Anlockung und zur Proliferation der Reparaturzellen erforderlich ist. Wenn die Defektfläche jedoch groß ist, kann der Transformationsfaktor sequestriert werden, um eine ausreichende Proliferation der Reparaturzellen über den gesamten Defektbereich vor der Aussetzung gegenüber dem Transformationsfaktor abzusichern. Darüber hinaus können bei der Behandlung von Gelenkknorpeldefekten das anti-angiogene Mittel und der Transformationsfaktor in der Matrix sowohl in freier Form als auch in Verbindung mit einem Zuführungssystem enthalten sein, um anhaltende Konzentrationen über die Zeit aufrechtzuerhalten.
Im Falle von Gelenkknorpeldefekten, die sich signifikant in den darunter liegenden Knochen ausdehnen, wird der Knochenanteil des Defekts bevorzugt mit einer Knochen-Reparaturmatrix aufgefüllt, bevor der Knorpelanteil des Defekts mit der Knorpel-Reparaturmatrix dieser Erfindung gefüllt wird.
Die Matrixmaterialien, die in den Zusammensetzungen dieser Erfindung für das Auffüllen oder auf andere Weise Bekleiden des Knorpel- oder des Knochendefekts nützlich sind, umfassen Fibrinogen (das mit Thrombin aktiviert wurde, um in dem Defekt oder der Läsion Fibrin zu bilden), Kollagen, Agarose, Gelatine und jedes beliebige andere biologisch abbaubare Material, die eine Matrix mit Poren bilden können, die ausreichend groß sind, um Knorpel- oder Knochen-Reparaturzellen zu erlauben, die Matrix zu besiedeln und sich innerhalb ihr zu teilen, und die abgebaut und durch Knorpel oder durch Knochen im Verlauf des Reparaturvorganges ersetzt werden können. In einigen Fällen können Calciumphosphat enthaltende Verbindungen wie z. B. tri-Calciumphosphat und Hydroxyapatit sowie andere Calciumsalze, die feste Matrices bilden, alleine oder in Kombination mit anderen biologisch abbaubaren Matrixmaterialien bei der Behandlung von Knochendefekten verwendet werden.
Die Matrices, die in den Zusammensetzungen dieser Erfindung nützlich sind, können vorgeformt sein oder können in situ gebildet werden, wie z. B. durch die Polymerisierung von Verbindungen und Zusammensetzungen wie Fibrinogen, um eine Fibrinmatrix zu bilden. Matrices, die vorgeformt werden können, umfassen Kollagen (z. B. Kollagen-Schwämme und Kollagen-Vlies), chemisch modifiziertes Kollagen, Gelatine-Kügelchen oder -Schwämme, einen Gel-bildenden Stoff wie z. B. Agarose und beliebige andere Gel-bildende oder zusammengesetzte Stoffe, die aus einem Matrixmaterial bestehen, das den Defekt auffüllt und das den Knorpel- oder den Knochen-Reparaturzellen erlaubt, die Matrix zu besiedeln, oder Kombinationen der vorstehenden Materialien.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung wird die Matrix unter Verwendung einer Lösung aus Fibrinogen gebildet, zu der Thrombin hinzugegeben wird, um die Polymerisation kurz vor der Verwendung zu starten. Es kann eine Fibrinogen-Konzentration von 0,5-5 mg/ml in einer wässrigen Pufferlösung verwendet werden. Bevorzugt wird eine Fibrinogen-Lösung von 1 mg/ml in einer wässrigen Pufferlösung verwendet. Die Polymerisierung dieser Fibrinogen-Lösung in dem Defektbereich ergibt eine Matrix mit einer ausreichend großen Porengröße (z. B. etwa 50-200 μm), so dass die Knorpel- oder die Knochen-Reparaturzellen frei sind, die Matrix zu besiedeln und sich zu teilen, um das Volumen des Defekts auszufüllen, das die Matrix einnimmt. Bevorzugt wird der Fibrinogen-Lösung eine ausreichende Menge an Thrombin kurz vor der Anwendung hinzugefügt, um dem Chirurgen genügend Zeit zu lassen, das Material in dem Defektbereich vor dem Ende der Polymerisierung abzulagern. Typischerweise sollte die Thrombin-Konzentration so sein, dass eine Polymerisierung innerhalb von einigen wenigen bis mehreren (2-4) Minuten erfolgt, da gezeigt wurde, dass die Aussetzung des Knorpels gegenüber der Luft über längere Zeiträume Schäden verursacht [Mitchell et al., J. Bone Joint Surg. 71A, S. 89-95 (1989)]. Es sollten keine übermäßigen Mengen an Thrombin verwendet werden, da Thrombin die Fähigkeit besitzt, Wachstumsfaktor-Moleküle zu spalten und sie zu inaktivieren. Thrombin-Lösungen von 10-500 Einheiten pro ml und bevorzugt von 100 Einheiten pro ml in einer wässrigen Pufferlösung können für die Zugabe zu der Fibrinogen-Lösung hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden etwa 20 μl Thrombin (100 E/ml) mit jedem ml einer Fibrinogen-Lösung (1 mg/ml) etwa 200 Sekunden vor dem Auffüllen des Defekts gemischt. Die Polymerisierung wird langsamer erfolgen, wenn eine niedrigere Konzentration an Thrombin zugegeben wird. Man wird wissen, dass die Menge an Thrombin-Lösung, die benötigt wird, um die Polymerisierung von Fibrin in 2-4 Minuten zu erreichen, nur annähernd angegeben werden kann, da sie von der Umgebungstemperatur, der Temperatur der Thrombin-Lösung, der Temperatur der Fibrinogen-Lösung, usw. abhängig ist. Wo es angemessen erscheint, kann alternativ das Thrombin hinzugefügt werden, indem es auf die obere Seite der Matrixlösung platziert wird, nachdem die Lösung in die Defektstelle platziert wurde, und man es durch die Lösung diffundieren läßt. Die Polymerisierung der durch Thrombin aktivierten Matrix, die den Defekt auffüllt, kann leicht durch die Beobachtung der durch Thrombin induzierten Polymerisierung einer externen Probe der Fibrinogen-Lösung überwacht werden. In den Zusammensetzungen dieser Erfindung werden die Fibrin-Matrices bevorzugt durch autologe Fibrinogen-Moleküle gebildet, d. h. durch Fibrinogen-Moleküle, die aus dem Blut der gleichen Säugerart stammen wie die Art, die behandelt werden soll. Nicht immunogenes Fibrinogen aus anderen Arten kann ebenfalls verwendet werden.
Matrices, die Fibrin und Kollagen oder die noch bevorzugter Fibrin und Gelatine enthalten, können in den Zusammensetzungen dieser Erfindung ebenfalls verwendet werden. Es können ebenfalls kollagenöse Matrices für die Reparatur von Knorpeldefekten verwendet werden, einschließlich Gelenkknorpeldefekten. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden noch festere Matrices verwendet, wie z. B. solche, die Hydroxyapatit oder tri-Calciumphosphat enthalten, um den Knochenanteil eines tiefen Gelenkknorpeldefekts zu reparieren.
Wenn Kollagen als Matrixmaterial verwendet wird, können ausreichend viskose Lösungen hergestellt werden, z. B. unter Verwendung von Collagen-Vliess^® („Vlies"), Spongostan^® oder Gelatine-Blut-Gemischen, und es ist nicht nötig, ein Polymerisationsmittel zuzufügen. Kollagen-Matrices können auch mit einer Fibrinogen-Lösung verwendet werden, die mit einem Polymerisationsmittel aktiviert wird, so dass eine kombinierte Matrix entsteht.
Es kann auch sein, dass Polymerisationsmittel nicht notwendig sind, wenn andere biologisch abbaubare Verbindungen verwendet werden, um die Matrix zu bilden. So können zum Beispiel Sepharose^®-Lösungen gewählt werden, die bei 39-42°C flüssige Matrixlösungen darstellen und bei 35-38°C fest (d. h. gelartig) werden. Die Sepharose sollte ebenfalls in solchen Konzentrationen vorliegen, so dass das Gel, das den Defekt auffüllt, eine Netzgröße besitzt, die es den Knochen- oder den Knorpel-Reparaturzellen erlaubt, die Matrix und den Defektbereich frei zu besiedeln.
In den Zusammensetzungen dieser Erfindung, die zur Knorpelreparatur verwendet werden, werden ein oder mehrere anti-angiogene Mittel der Matrixlösung in einem geeigneten Konzentrationsbereich hinzugefügt, um das Einwachsen von Blutgefäßen in das Knorpelgewebe zu verhindern. Anti-angiogene Mittel, die verwendet werden können, umfassen jedes beliebige Mittel mit einer biologischen Aktivität, die das Einwachsen von Blutgefäßen aus dem darunter liegenden Knochengewebe in das Knorpelgewebe verhindert. Einige Beispiele für anti-angiogene Mittel, die für diese Erfindung nützlich sein können, wurden vorstehend angeführt. Das anti-angiogene Mittel sollte frei verfügbar sein, um eine sofortige Aktivität in der Matrix bereitzustellen, und es kann auch in einer lang anhaltenden Freisetzungs-Form für eine verlängerte Aktivität vorliegen, wie z. B. in Verbindung mit einem Zuführungssystem, das nachstehend beschrieben wird.
Eines oder mehrere Proliferationsmittel (mitogene Mittel) können den Matrixlösungen, die bei der Knorpelreparatur verwendet werden, ebenfalls zugegeben werden. Das oder die Proliferationsmittel sollten in einem geeigneten Konzentrationsbereich vorliegen, um eine proliferative Wirkung auf die Knorpel-Reparaturzellen in der Matrix zu besitzen, die den Defekt auffüllt. Das gleiche Mittel sollte bevorzugt ebenfalls eine chemotaktische Wirkung auf die Zellen haben (wie im Falle von TGF-β); es kann jedoch auch ein Faktor verwendet werden, der ausschließlich eine proliferative Wirkung besitzt. Alternativ können, um eine chemotaktische Einwanderung der Zellen zu bewirken, der eine Induktion der Zellproliferation folgt, zwei unterschiedliche Mittel verwendet werden, wobei jeweils eines gerade eine dieser spezifischen Wirkungen aufweist (entweder chemotaktisch oder proliferativ).
Proliferationsmittel (mitogene Mittel), die in den Zusammensetzungen dieser Erfindung für die Stimulierung der Proliferation von Knorpel-Reparaturzellen nützlich sind, umfassen transformierende Wachstumsfaktoren („TGFs") wie z. B. TGF-αs und TGF-βs; den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor („IGF I"); saure oder basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren („FGFs"); den von Thrombocyten stammenden Wachstumsfaktor („PDGF"); den epidermalen Wachstumsfaktor („EGF"); hämatopoietische Wachstumsfaktoren wie z. B. Interleukin 3 („IL-3") und Knochenmorphogenetische Proteine („BMPs") wie z. B. das Knochen-morphogenetische Protein-2 („BMP-2") [Rizzino, 1987, vorstehend; Canalis et al., 1988, vorstehend; Growth factors in biology and medicine, Ciba Foundation Symposium 116 (New York, John Wiley & Sons, 1985); Baserga, R., Hrsg., Cell growth and division (Oxford, IRL Press, 1985); Sporn, M.A. und Roberts, A.B., Hrsg., Peptide growth factors and their receptors, Bde. I und II (Berlin, Springer-Verlag, 1990)]. Diese besonderen Beispiele sind jedoch nicht einschränkend. Jede Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, die Proliferation von Zellen zu stimulieren, wie durch einen in vitro-Testansatz für die Zellproliferation gezeigt werden kann, ist als Proliferationsmittel in dieser Erfindung nützlich. Solche Testansätze sind im Fachgebiet bekannt [z. B. Canalis et al., 1988, vorstehend; Gimenez-Gallego et al., 1986, vorstehend; Dickson et al., 1987, vorstehend; Rizzino, 1987, vorstehend].
Chemotaktische Mittel, die in den Zusammensetzungen und den Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, um Knorpel-Reparaturzellen zu dem Knorpeldefekt anzulocken, umfassen zum Beispiel TGF-βs, FGFs (sauer oder basisch), PDGF, Tumornekrosefaktoren (z. B. TNF-α, TNF-β) und Proteoglykan-Abbauprodukte wie z. B. Glycosaminoglykan-Ketten [Roberts et al., 1990, vorstehend; Growth factors in biology and medicine, Ciba Foundation Symposium 116 (New York, John Wiley & Sons, 1985); R. Baserga, Hrsg., Cell growth and division (Oxford, IRL Press, 1985)]. Testansätze zur Bestimmung der chemotaktischen Fähigkeit von Polypeptiden und anderen Verbindungen sind im Fachgebiet bekannt [z. B. Postlewaite et al., 1987, vorstehend; Wahl et al., 1987, vorstehend; Moore et al., 1989, vorstehend].
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung enthält die Matrix, die bei der Knorpelreparatur verwendet wird, TGF-β als Proliferationsmittel und als chemotaktisches Mittel. Insbesondere können der TGF-βI oder der TGF-βII als Proliferations- und als chemotaktisches Mittel verwendet werden. Andere Formen des TGF-β (z. B. TGF-βIII, TGF-βIV, TGF-βV usw.) oder Polypeptide, die eine TGF-β-Aktivität besitzen [vergleiche mit Roberts, 1990, vorstehend], können für diesen Zweck ebenfalls nützlich sein, sowie andere Formen dieses Stoffes, die in der Zukunft entdeckt werden, und andere Wachstumsfaktoren. Für die Verwendung als Proliferationsmittel und als chemotaktisches Mittel werden die TGF-β-Moleküle in der Matrix in einer Konzentration von vorzugsweise 2-50 ng/ml Matrixlösung und am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von 2-10 ng/ml Matrixlösung gelöst oder suspendiert. Alternativ kann das BMP-2 in einer Konzentration von weniger als 1 ng/ml als Proliferationsmittel verwendet werden. Man wird sich bewusst sein, dass die bevorzugte Konzentration des TGF-β oder des BMP-2, die die Proliferation von Knorpel-Reparaturzellen stimuliert, in Abhängigkeit von dem bestimmten Tier, das behandelt werden soll, variieren kann.
In der Matrixlösung, die bei der Knorpelreparatur verwendet wird, können ebenfalls ein Transformationsfaktor oder -faktoren vorhanden sein, so dass, nachdem die Knorpel-Reparaturzellen die Matrix besiedelt haben, der Transformationsfaktor in die Defektstelle in einer Konzentration freigesetzt wird, die ausreicht, um die Differenzierung (d. h. Transformation) der Knorpel-Reparaturzellen zu Chondrocyten zu fördern, die neues stabiles Knorpelgewebe bilden. Eine genaue Kontrolle des Zeitpunkts der Freisetzung des Transformationsfaktors ist besonders wichtig, wenn der Transformationsfaktor die Wirksamkeit des Proliferationsmittels hemmen oder beeinträchtigen kann [vergleiche mit Roberts, 1990, vorstehend].
Transformationsfaktoren, die in den Zusammensetzungen dieser Erfindung nützlich sind, um die Knorpelreparatur zu fördern, umfassen jedes beliebige Peptid, Polypeptid, Protein oder jede beliebige andere Verbindung oder Zusammensetzung, das/die die Differenzierung von Knorpel-Reparaturzellen zu Chondrocyten, die Knorpel-spezifischen Proteoglykane und Typ II-Kollagen herstellen, induziert. Die Fähigkeit einer Verbindung oder einer Zusammensetzung, die Bildung von Knorpelspezifischen Proteoglykanen und Typ II-Kollagen in den Zellen zu induzieren oder zu stimulieren, kann unter Verwendung von Testansätzen bestimmt werden, die im Fachgebiet bekannt sind [z. B. Seyedin et al., 1985, vorstehend, Seyedin et al., 1987, vorstehend]. Transformationsfaktoren, die in den Zusammensetzungen dieser Erfindung nützlich sind, umfassen zum Beispiel TGF-βs, TGF-αs, FGFs (sauer oder basisch) und BMPs, einschließlich BMP-2. Diese Transformationsfaktoren können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Dimere und Multimere dieser Faktoren können ebenfalls verwendet werden. Darüber hinaus kann der TGF-β in Kombination mit dem EGF verwendet werden.
Wenn nötig, kann der genaue Zeitpunkt der Freisetzung des Transformationsfaktors durch die Verpackung des Transformationsfaktors in oder mit einem geeigneten Zuführungssystem erreicht werden. Zuführungssysteme, die bei den Zusammensetzungen dieser Erfindung nützlich sind, umfassen Liposomen, bioerodierbare Polymere, auf Kohlenhydraten basierende Korpuskel, Wasser-Öl-Emulsionen, Fasern wie z. B. Kollagen, die chemisch mit Heparinsulfat-Proteoglykanen oder mit anderen solchen Molekülen, an die die Transformationsfaktoren spontan binden, verknüpft werden können, sowie osmotische Pumpen. Zuführungssysteme wie z. B. Liposomen, bioerodierbare Polymere, Fasern mit gebundenen Transformationsfaktoren und auf Kohlenhydraten basierende Korpuskel, die das Transformationsmittel enthalten, können mit der Matrixlösung, die zum Auffüllen des Defekts verwendet wird, vermischt werden. Diese Systeme sind bekannt und im Fachgebiet verfügbar (vergleiche mit P. Johnson und J.G. Lloyd-Jones, Hrsg. Drug Delivery Systems (Chichester, England, Ellis Horwood Ltd., 1987)]. Liposomen können gemäß dem Verfahren von Kim et al., Biochem. Biophys. Acta 728, S. 339-348 (1983) hergestellt werden. Andere Verfahren zur Herstellung von Liposomen können ebenfalls verwendet werden. Es können zusätzliche Faktoren mit dem Transformationsfaktor in das Zuführungssystem mit eingeschlossen werden, um Chondrocyten zu stimulieren, die Bestandteile des Knorpelgewebes zu synthetisieren. Der Zeitpunkt der Verfügbarkeit des Transformationsfaktors sollte mit der Geschwindigkeit, mit der die Reparaturzellen proliferieren und die Defektstelle, die behandelt werden soll, auffüllen, koordiniert werden. Wenn eine deutliche Verzögerung der Freisetzung des Transformationsfaktors nicht erforderlich ist, kann der Transformationsfaktor in die Matrix sowohl in einer frei verfügbaren Form als auch mit einem Zuführungssystem verbunden mit eingeschlossen werden, um eine lang anhaltende Freisetzung in der geeigneten Konzentration bereitzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung enthält die Matrix, die bei der Knorpelreparatur verwendet wird, ein anti-angiogenes Mittel, den TGF-β oder das BMP als Proliferations- und als chemotaktisches Mittel und den TGF-β oder das BMP in einem Zuführungssystem verpackt als Transformationsfaktor. Insbesondere der TGF-βI oder der TGF-βII oder das BMP-2 können als Proliferations- und als chemotaktisches Mittel sowie als Transformationsfaktor verwendet werden. Andere Formen des TGF-β (z. B. TGF-βIII, TGF-βIV, TGF-βV oder irgendein anderes Mitglied der TGF-β-Superfamilie) oder Polypeptide, die eine TGF-β-Aktivität besitzen (vergleiche mit Roberts, 1990, vorstehend), können für diesen Zweck ebenfalls nützlich sein, sowie andere Formen dieses Stoffes, die in der Zukunft entdeckt werden, und andere Wachstumsfaktoren. Das anti-angiogene Mittel ist vorzugsweise in dem Zuführungssystem, das die transformierende Konzentration des TGF-β oder des BMP enthält, sowie in freier Form in der Matrix enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform für die Knorpelreparatur wird eine TGF-β-Konzentration von bevorzugt 2-50 ng/ml Matrixlösung und am stärksten bevorzugt von 2-10 ng/ml Matrixlösung als Proliferationsmittel und als chemotaktisches Mittel verwendet. Eine wesentlich höhere Konzentration an TGF-β als Transformationsfaktor liegt ebenfalls in einer anschließend freisetzbaren Form in der Matrixzusammensetzung vor. Vorzugsweise ist die anschließende Konzentration an TGF-β höher als 200 ng/ml Matrix und am stärksten bevorzugt ist sie größer oder gleich 500 ng/ml Matrix. Alternativ kann das BMP als Transformationsfaktor in einer bevorzugten Konzentration von 100-2000 ng pro ml verwendet werden. Es wird erkannt werden, dass die bevorzugte Konzentration des TGF-β oder des BMP für die Induktion der Differenzierung der Knorpel-Reparaturzellen in Abhängigkeit von dem bestimmten Tier, das behandelt werden soll, variieren kann.
Es ist nötig, die Aussetzung der Knorpel-Reparaturzellen in die beiden Konzentrationsbereiche des TFG-β zu staffeln, da der TGF-β bei relativ hohen Konzentrationen (z. B. höher als 200 ng/ml Matrixlösung) nicht nur die Knorpel-Reparaturzellen zu Chondrocyten umwandeln kann, sondern auch die chemotaktische Anlockung der Knorpel-Reparaturzellen hemmen kann; wohingegen bei relativ niedrigen Konzentrationen (z. B. 2-10 ng/ml) der TGF-β die Knorpel-Reparaturzellen anlockt und ihre Proliferation stimuliert, jedoch nicht die Transformation der Knorpel-Reparaturzellen zu Chondrocyten induziert, die Knorpelgewebe herstellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung, bei der es nötig ist, die Reihenfolge von Chemotaxis und Proliferation, gefolgt von der Transformation einzuhalten, liegt der TGF-β sowohl in einer freien, nicht verkapselten Form als auch in einer verkapselten oder auf andere Weise sequestrierten Form in der Matrix vor. Bevorzugt werden zum Zweck der Anlockung und der Induktion der Proliferation der Knorpel-Reparaturzellen in der Matrix und in dem Defektbereich die TGF-β-Moleküle in der Matrix in einer Konzentration von 2-10 ng/ml Matrixlösung gelöst oder suspendiert. Um die Transformation der Knorpel-Reparaturzellen in der Matrix zu Chondrocyten zu fördern, liegen die TGF-β-Moleküle in der Matrix ebenfalls in multivesikulären Liposomen gemäß dem Verfahren nach Kim et al., 1983, vorstehend, sequestriert vor, und zwar in einer Konzentration von mehr als 200 ng/ml Matrixlösung und bevorzugt in einer Konzentration von 500-800 ng/ml. Die mit dem TGF-β beladenen Liposomen werden aufgebrochen, wenn die angelockten Knorpel-Reparaturzellen die Matrix besiedelt haben und begonnen haben, die Matrix abzubauen. Im Verlauf des Abbaus der Matrix nehmen die Knorpel-Reparaturzellen die Liposomen auf und/oder bauen sie ab, was zu der Freisetzung des TGF-β in Konzentrationen führt, die ausreichen, um die Transformation von Knorpel-Reparaturzellen zu Chondrocyten zu induzieren.
Die erforderliche Zwei-Schritt-Zuführung von chemotaktischen und proliferierenden gegenüber transformierenden Konzentrationen des TGF-β kann auch durch die Kombination transformierender Konzentrationen des TGF-β mit einem bioerodierbaren Polymer erreicht werden. Alternativ kann eine Pumpe und bevorzugt eine implantierte osmotische Pumpe verwendet werden, um die Konzentration an TGF-β in dem Defekt und in der Matrix zu kontrollieren. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kontrolliert die Pumpe die Konzentration an TGF-β in der Matrix, d. h. die Pumpe kann den TGF-β in einer anfänglichen, die Chemotaxis und die Proliferation stimulierenden Konzentration und anschließend in einer transformierenden Konzentration freisetzen. Bevorzugt wird die transformierende Konzentration des TGF-β durch die Pumpe etwa 1 bis 2 Wochen nach der Operation zugeführt. Die Zuführung des Transformationsfaktors in das Defektvolumen ist bevorzugt in der Matrix in der Defektstelle lokalisiert.
Die Proliferationsmittel, und wenn verwendet, die Transformationsfaktoren in den Zusammensetzungen dieser Erfindung werden in der Defektstelle innerhalb der Matrix angewendet. Daher ist ihre Anwesenheit auf eine sehr lokale Stelle begrenzt. Dies erfolgt, um ihre freie Injektion oder Infusion in den Gelenkraum zu vermeiden. Eine solche freie Infusion kann die gegenteilige Wirkung haben, nämlich die Zellen der Synovialmembran dazu stimulieren, um Gelenksergüsse zu produzieren.
Bei bestimmten Ausführungsformen dieser Erfindung für die Behandlung von Gelenkknorpeldefekten ist eine verzögerte Aussetzung gegenüber dem Transformationsfaktor nicht nötig. Bei vielen Gelenkknorpeldefekten besteht ein ausreichender Zugang zu den Reparaturzellen, und eine verzögerte Aussetzung gegenüber dem Transformationsfaktor ist weniger kritisch als bei oberflächlichen Defekten, bei denen mehr Zeit erforderlich ist, um die Reparaturzellen anzulocken und zu proliferieren. Bei tiefen Defekten kann es jedoch wünschenswert sein, die Aussetzung gegenüber dem Transformationsfaktor zu verzögern, um den Reparaturzellen zu ermöglichen, die gesamte Defektstelle zu besiedeln.
Bei den Zusammensetzungen dieser Erfindung, die für die Knochenreparatur bei Gelenksknorpeldefekten verwendet werden, können ein oder mehrere angiogene Faktoren der Matrixlösung zugefügt werden, um die Bildung und das Einwachsen von Blutgefäßen und assoziierten Zellen (z. B. endotheliale, perivaskuläre, mesenchymale und glatte Muskel-Zellen) und von Basalmembranen in dem Bereich des Knochendefekts zu stimulieren. Angiogene Faktoren, die in den Zusammensetzungen dieser Erfindung für die Stimulierung der Vesikularisierung in der abgelagerten Matrix in dem Bereich des Knochendefekts nützlich sind, umfassen bFGF, TGF-β, PDGF, TNF-α, Angiogenin oder Angiotropin. Von Heparinsulfat wurde herausgefunden, dass es die angiogene Aktivität des bFGF steigert. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird bFGF in einer Matrix gelöst, suspendiert oder gebunden und zwar in einer Konzentration von 5-10 ng/ml Matrixlösung zusammen mit einer Menge an Heparinsulfat, die ausreicht, um die angiogene Aktivität des bFGF zu steigern. Die bevorzugten Konzentrationen für andere angiogene Faktoren sind: 5 ng/ml Matrixlösung für den TGF-β, 10 ng/ml Matrixlösung für den TNF-α und 10 ng/ml Matrixlösung für den PDGF. Der bFGF in Kombination mit Heparinsulfat ist jedoch der am stärksten bevorzugte angiogene Faktor unter den vorstehend erwähnten angiogenen Faktoren.
Ein osteogener Faktor kann in der Matrixlösung, die für die Knochenreparatur verwendet wird, ebenfalls vorhanden sein, so dass, nachdem die Blutgefäße und die assoziierten Zellen die Matrix besiedelt haben, der osteogene Faktor in die Knochendefektstelle freigesetzt wird, wenn die Matrix degradiert wird, und zwar in einer Konzentration, die ausreicht, um einen Vorgang zu fördern, der schließlich zu der Entwicklung von Osteoblasten und Osteocyten führt. Der osteogene Faktor wird in einem geeigneten Zuführungssystem innerhalb der Matrix sequestriert oder verpackt und wird freigesetzt, wenn die Matrix degradiert wird. Die Zuführungssysteme, die bei den Knorpelreparatur-Zusammensetzungen verwendet werden, sind bei den Knochenreparatur-Zusammensetzungen dieser Erfindung nützlich, wie z. B. Liposomen oder auf Kohlenhydraten basierende Korpuskel (vergleiche mit dem Vorstehenden). In einer Ausführungsform dieser Erfindung enthält die Matrix, die für die Knochenreparatur verwendet wird, TGF-β als osteogenen Faktor, der in ein Zuführungssystem verpackt ist, in einer bevorzugten Konzentration von 100 ng/ml Matrixlösung. Es können höhere oder niedrigere Konzentrationen des TGF-β verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform enthält die Matrix, die für die Knochenreparatur verwendet wird, BMP-2, das in ein Zuführungssystem verpackt ist, als osteogenen Faktor in einer bevorzugten Konzentration von 100-2000 ng/ml Matrixlösung. In einer noch anderen Ausführungsform enthält die Matrix den FGF in einer geeigneten Konzentration, der in das Zuführungssystem verpackt ist, als osteogenen Faktor.
Die osteogenen Faktoren, die in den Knochenreparatur-Zusammensetzungen dieser Erfindung nützlich sind, umfassen jedes beliebige Peptid, Polypeptid oder Protein oder jede beliebige andere Verbindung oder Zusammensetzung, das/die die Differenzierung von Knochen-Reparaturzellen zu Knochenzellen wie z. B. zu Osteoblasten und Osteocyten, die Knochengewebe herstellen, induziert. Die osteogenen Faktoren, die in dieser Erfindung nützlich sind, umfassen Proteine wie z. B. den TGF-β [Sampath, T.R. et al., J. Biol. Chem. 265 (22), S. 13198-13205 (1990)], Osteogenin [Luyten, F.P. et al., J. Biol. Chem. 264 (15), S. 13377-13380 (1989)], das Knochen-morphogenetische Protein (BMP) [Wang, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, S. 2220-2224 (1990)], den FGF und den TGF-β kombiniert mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF).
Die Differenzierung von mesenchymalen Zellen, die durch einen osteogenen Faktor induziert wurde, kann die Bildung von intermediärem Gewebe wie z. B. von fibrösem, hyalinem und verkalktem Knorpel sowie die endochondrale Ossifikation umfassen, die zur Bildung von verwobenem Knochengewebe führt, das umgestaltet und zu reifem lamellärem Knochengewebe umgewandelt wird. In einigen Fällen kann der Knochen direkt aus mesenchymalen Zellen ohne das Erscheinen eines intermediären Gewebes gebildet werden. Innerhalb der Matrix erfolgt der Vorgang der Bildung des Knochengewebes gewöhnlich 3 bis 4 Wochen, nachdem sich die Blutgefäße gebildet und die Matrix als Antwortreaktion auf den angiogenen Faktor, der in der Matrix vorliegt, infiltriert haben. Obwohl der Knochen in die Knochendefektstelle bei Abwesenheit von zugefügtem angiogenen und osteogenen Faktoren einwächst (bei großen Defekten ist zumindest die Verwendung eines Matrixmaterials wünschenswert), beschleunigt die Verwendung solcher Faktoren den Reparaturvorgang wesentlich.
Fibronectin oder jede beliebige andere Verbindung, einschließlich Peptiden, die so klein wie Tetrapeptide sein können, die die Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp enthalten, können als die Zelladhäsion fördernde Faktoren verwendet werden [Ruoslathi et al., Cell 44, S. 517-518 (1986)], um die anfängliche Adhäsion der Knorpel- oder der Knochen-Reparaturzellen an die Matrix, die in einer defekten Stelle abgelagert wurde, zu steigern. Fibrin und bestimmte Kollagen-Matrices enthalten diese Sequenz bereits [Ruoshlati et al., 1986, vorstehend]. Wenn andere biologisch abbaubare Matrices verwendet werden, können solche die Zelladhäsion fördernde Faktoren mit dem Matrixmaterial vermischt werden, bevor die Matrix verwendet wird, um den Defekt zu füllen oder zu bekleiden. Peptide, die Arg-Gly-Asp enthalten, können auch chemisch an das Matrixmaterial gekoppelt werden (z. B. an seine Fasern oder Netze) oder an eine Verbindung, die der Matrix hinzugefügt wird, wie z. B. Albumin.
Die Zusammensetzungen, die hierin vorstehend beschrieben wurden, sind bei den Verfahren zur Induktion der Knorpel- oder der Knochenbildung an einer ausgewählten Stelle eines Defekts in dem Knorpel- oder dem Knochengewebe eines Tieres nützlich.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung ermöglichen die Behandlung von Knorpel- und Knochendefekten in Tieren, einschließlich des Menschen, die einfach in der Verabreichung ist und die örtlich auf einen betroffenen Bereich des Gelenks beschränkt ist. Die gesamte Behandlung kann durch arthroskopische, offen chirurgische oder durch percutane Verfahren durchgeführt werden.
Um die Zusammensetzungen für die Behandlung von Defekten oder Läsionen im Knorpel gemäß dieser Erfindung zu verwenden, wird ein Defekt oder eine Läsion identifiziert, präpariert und mit den Matrix-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung gefüllt.
Bei der Knorpelreparatur enthält die Matrix-Zusammensetzung ein antiangiogenes Mittel, um das Einwachsen von Blutgefäßen zu verhindern. Ein Proliferationsmittel (mitogenes Mittel) kann in der Matrix-Zusammensetzung ebenfalls in einer geeigneten Konzentration vorhanden sein, um die Proliferation von Knorpel-Reparaturzellen in der Matrix und in dem Defekt oder in der Läsion zu stimulieren. Das gleiche Mittel kann in dieser Konzentration auch als chemotaktisches Mittel dienen, um Knorpel-Reparaturzellen anzulocken, vorausgesetzt dass der verwendete Faktor eine kombinierte Wirkung bezüglich der Zellproliferation und der Chemotaxis aufweist (wie dies z. B. der TGF-β bei 2-10 ng/ml Matrix tut). Alternativ können zwei unterschiedliche Mittel in der Matrix vorliegen, eines mit einer spezifischen proliferativen Wirkung und das andere mit einer spezifischen chemotaktischen Wirkung. In einer alternativen Ausführungsform können, nachdem der Defektbereich mit der Matrix bekleidet wurde, das antiangiogene und, wenn gewünscht, das Proliferationsmittel und ein chemotaktisches Mittel direkt in den mit der Matrix aufgefüllten Defektbereich injiziert werden. Die Injektion sollte auf die Matrix und auf den aufgefüllten Defektbereich beschränkt sein, um eine Aussetzung der Zellen der Synovialmembran gegenüber Wachstumsfaktoren zu vermeiden, die zur Zellproliferation und Gelenkserguß führen könnten.
Nachdem die defekte Stelle mit der Matrix-Zusammensetzung bekleidet wurde (und im Falle von Fibrin-Matrices, nachdem sich die Matrix verfestigt hat), und, wenn erforderlich, das anti-angiogene Mittel oder das Proliferationsmittel in die mit der Matrix aufgefüllte Defektstelle injiziert wurden, können die Gelenkkapsel und die Einschnitte in der Haut verschlossen werden und die Arthroskopie oder die offene Operation beendet werden.
In einem anschließenden Schritt der Knorpelreparatur werden die Knorpel-Reparaturzellen in der Matrix gegenüber einem Transformationsfaktor zu einer geeigneten Zeit und in einer Konzentration exponiert, die ausreicht, um die Knorpel-Reparaturzellen in Chondrocyten umzuwandeln, die stabiles Knorpelgewebe herstellen. Dies kann durch das Einbringen eines geeigneten Zuführungssystems durchgeführt werden, das den Transformationsfaktor in der Matrix-Zusammensetzung enthält, wie vorstehend beschrieben wurde. Alternativ kann das Transformationsmittel direkt durch eine Injektion oder durch eine osmotische Pumpe in den mit der Matrix aufgefüllten Defektbereich zu einem geeigneten Zeitpunkt angeliefert werden. Bei einem oberflächlichen Knorpeldefekt, bei dem kein Zugang für Reparaturzellen aus dem Knochengewebe besteht, sollte die transformierende Konzentration den Zellen etwa 1 bis 2 Wochen nach der anfänglichen Implantation der Matrix in den Defektbereich verfügbar gemacht werden. Bei einem Gelenkknorpeldefekt kann der Transformationsfaktor in Abhängigkeit von der Größe des Defekts früher verfügbar gemacht werden. Es können zusätzliche Faktoren dem Zuführungssystem hinzugefügt oder direkt injiziert werden, um die Synthese der Bestandteile der Knorpelmatrix zu diesem Zeitpunkt besser zu fördern. Es kann zusätzlich auch ein anti-angiogenes Mittel in das Zuführungssystem mit einbezogen oder direkt injiziert werden.
Knorpel- oder Knochendefekte bei Tieren können während einer arthroskopischen Untersuchung des Gelenks oder im Verlauf einer einfachen Untersuchung der Läsion oder des Defekts während einer offenen Operation leicht identifiziert werden. Knorpel- oder Knochendefekte können auch unter Verwendung einer Computer-unterstützen Tomographie (CAT-Scanning), einer Röntgen-Untersuchung oder einer Magnetresonanz-Bildgebungs- (MRI) Analyse der Gelenksflüssigkeit oder der Serummarker oder durch irgendein anderes im Fachgebiet bekanntes Verfahren identifiziert werden.
Nachdem ein Defekt identifiziert wurde, kann der Chirurg es vorziehen, den Defekt operativ zu modifizieren, um die Fähigkeit des Defekts zu erhöhen, die Lösungen und das Matrixmaterial, die den hierin beschriebenen Zusammensetzungen hinzugefügt wurden, physisch zurückhalten zu können. Vorzugsweise, statt eine flache oder eine schwach konkave Geometrie zu besitzen, hat oder wird der Defekt so geformt, dass er vertikale Kanten aufweist, oder er wird unterschnitten, um die Lösungen und die Matrix-Materialien, die den hierin beschriebenen Zusammensetzungen zugefügt wurden, besser zurückhalten zu können.
Gemäß den Verwendungen dieser Erfindung kann die Knochendefektstelle eines Gelenkknorpeldefekts bis zu der verkalkten Knorpellage an der Knochen-Knorpel-Grenze mit einer Knochen-Reparaturmatrix-Zusammensetzung aufgefüllt werden, so dass eine flache Ebene gebildet wird. Das Auffüllen des Knochendefekts mit einer Knochen-Reparaturmatrix ist besonders nützlich bei Defekten, die mehrere Millimeter oder tiefer sind. Die Knochen-Reparaturmatrix-Zusammensetzung kann einen angiogenen Faktor und einen osteogenen Faktor enthalten, die in einem geeigneten Zuführungssystem verpackt sind.
Der verbleibende Knorpelanteil des Defekts wird mit einer Matrix-Zusammensetzung vollständig aufgefüllt, die verwendet wird, um die Reparatur des Knorpels zu stimulieren. Die Zusammensetzung für die Knorpelreparatur umfasst ein Matrixmaterial, das ein anti-angiogenes Mittel und, wenn gewünscht, ein Proliferationsmittel und ein chemotaktisches Mittel enthält. Anti-angiogene Mittel, die in den Zusammensetzungen dieser Erfindung nützlich sind, umfassen alle Mittel mit einer biologischen Aktivität, die in der Lage ist, die Gefäßneubildung zu hemmen. Diese Erfindung zieht in Betracht, dass das anti-angiogene Mittel ein oder mehrere Moleküle umfasst, die in der Lage sind, die Angiogenese zu hemmen. Die Zusammensetzung, die bei diesem Schritt verwendet wird, kann auch einen Transformationsfaktor enthalten, der in einem Zuführungssystem verpackt ist, und, wenn geeignet, ebenfalls in freier Form vorliegen kann. In der am stärksten bevorzugten Zusammensetzung der Erfindung für die Knorpelreparatur enthält die Matrix einen anti-angiogenen Faktor (in freier Form und in ein Zuführungssystem verpackt oder für eine anhaltende Freisetzung mit einem Zuführungssystem verbunden), ein Proliferationsmittel, ein chemotaktisches Mittel (das mit dem Proliferationsmittel identisch sein kann) und einen Transformationsfaktor, der in ein Zuführungssystem verpackt oder mit ihm assoziiert ist, welches den Transformationsfaktor zu einem Zeitpunkt freisetzt, an dem die Reparaturzellen, die die Matrix besiedeln, mit der Umgestaltung der interzellulären Substanz begonnen haben. Bevorzugte Zusammensetzungen wurden vorstehend beschrieben.
Wie in dem US-Patent Nr. 5,270,300 beschrieben, kann die Knochen-Knorpel-Grenze eines Gelenkknorpeldefekts durch eine physikalische Membran, vorzugsweise eine biologisch abbaubare Membran, die für Zellen undurchlässig ist (z. B. mit einer Porengröße unter 5 μm), vor dem Auffüllen des Knorpelanteils eines Gelenkknorpeldefekts getrennt werden. Die Membran wird über den mit der Matrix gefüllten Knochendefekt platziert, und die Kanten der Membran müssen auf der Peripherie des Defekts in dem Bereich der Knorpel-Knochen-Verbindung versiegelt werden, um das Einwachsen von Gefäßen in den Bereich des Knorpeldefekts zu verhindern. Bei diesem Verfahren sind die Reparaturzellen aus dem Bereich des Knochens nicht leicht verfügbar, um den Knorpeldefektbereich zu besiedeln, und daher ist ein Proliferationsmittel und/oder ein chemotaktisches Mittel in der Knorpel-Reparaturmatrix nötig, um Reparaturzellen aus dem Synovium anzulocken und die Proliferation zu stimulieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung für die Behandlung von Gelenkknorpeldefekten wird an der Knochen-Knorpel-Grenze keine Membran platziert. Der Knochenanteil des Defekts kann mit einer Knochenreparatur-Zusammensetzung gefüllt werden oder auch nicht, je nachdem wie es gewünscht wird. Der Knorpelanteil des Defekts wird mit einer Matrix-Zusammensetzung gefüllt, die ein anti-angiogenes Mittel und einen Transformationsfaktor und, wenn gewünscht, ein Proliferationsmittel und/oder ein chemotaktisches Mittel enthält, wie vorstehend diskutiert wurde. Das anti-angiogene Mittel in der Knorpel-Reparaturmatrix-Zusammensetzung wirkt als eine funktionelle Sperre, um das Einwachsen von Blutgefäßen und die Knochenbildung in dem Knorpelbereich zu verhindern, wodurch die Notwendigkeit für eine physikalische Membran vermieden und die Einwanderung von Reparaturzellen aus dem Knochenbereich ermöglicht wird.
In einer anderen Ausführungsform sind die Zusammensetzungen dieser Erfindung bei Verfahren für die Behandlung von Gelenkknorpeldefekten zu verwenden, bei denen die Knochen-Knorpel-Grenze durch eine transiente biologische Membran getrennt wird, die an der Knochen-Knorpel-Grenze durch ein erhitztes Instrument erzeugt wird. Ein erhitztes Instrument kann an den Stellen von Blutungen angewendet werden, um das Blut gerinnen zu lassen und um eine Schicht aus präzipitiertem Protein zu bilden, was somit zu einer biologischen physikalischen Sperre führt, die das Einwachsen von Blutgefäßen und die Bildung von Knochengewebe in der Defektstelle verhindert. Beispiele für erhitzte Instrumente umfassen eine erhitzte Skalpellklinge, erhitzte Scheren oder erhitzte Pinzetten, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Das Instrument sollte auf eine Temperatur von etwa 200°C erhitzt werden. Das erhitzte Instrument sollte an der Basis des Gelenkknorpeldefekts angewendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Hitze durch einen CO₂-, N₂- oder einen Neodym-Yag-Laser bereitgestellt werden. Diese durch Hitze erzeugte transiente biologische Membran an der Knochen-Knorpel-Grenze kann zusätzlich oder anstelle der Einbeziehung eines antiangiogenen Mittels in der Knorpel-Reparaturmatrix angewendet werden. Wenn das erhitzte Instrument verwendet wird, sollte ein Proliferationsmittel und/oder ein chemotaktisches Mittel in die Knorpel-Reparaturmatrix mit eingeschlossen werden.
Die Adhäsion der Matrix kann durch chemische Maßnahmen gesteigert werden. Solche Maßnahmen umfassen den Abbau der oberflächlichen Schichten der Knorpel-Proteoglykane auf der Defektoberfläche, um die Kollegenfibrillen des Knorpels zu exponieren, so dass sie mit den Kollegenfibrillen der Matrix (wenn eine Kollegenmatrix verwendet wird) oder mit den Fibrinfibrillen der Matrix (wenn eine Fibrinmatrix verwendet wird) in Wechselwirkung treten können. Die Proteoglykane auf der Oberfläche des Knorpels tendieren nicht nur dazu, die Anheftung einer Fibrin- oder einer anderen biologisch abbaubaren Matrix an den Knorpel zu beeinträchtigen, sondern hemmen auch die Thrombin-Aktivität lokal. Vorteilhafterweise können die Proteoglykan-Abbauprodukte auch eine chemotaktische Wirkung auf die Reparaturzellen haben [Moore, A.R. et al., Int. J. Tiss. Reac. XI (6), S. 301-307 (1989)].
Gemäß einer Ausführungsform der Anwendungen dieser Erfindung wird die Oberfläche des Defekts durch Abtupfen der Fläche unter Verwendung eines sterilen, absorbierenden Gewebetuchs getrocknet, und das Defektvolumen wird mit einer sterilen Enzymlösung über einen Zeitraum von 2-10 Minuten gefüllt, um die Proteoglykane, die auf der Oberfläche des Knorpels und lokal innerhalb von etwa 1 bis 2 μm Tiefe von der Oberfläche des Defekts vorhanden sind, abzubauen. Es können verschiedene Enzyme, einzeln oder in Kombination, in sterilen gepufferten wässrigen Lösungen verwendet werden, um die Proteoglykane abzubauen. Der pH-Wert der Lösung sollte so eingestellt werden, dass die Enzymaktivität optimiert wird.
Enzyme, die nützlich sind, um die Proteoglykane bei den Anwendungen dieser Erfindung abzubauen, umfassen Chondroitinase ABC, Chondroitinase AC, Hyaluronidase, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Pronase, Stromelysin und Staph.-V8-Protease. Die geeignete Konzentration eines bestimmten Enzyms oder einer Kombination von Enzymen wird von der Aktivität der Enzymlösung abhängen.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird der Defekt mit einer sterilen Lösung von Chondroitinase AC in einer Konzentration von 1 E/ml gefüllt, und der Verdau erfolgt über 4 Minuten. Die bevorzugte Konzentration an Chondroitinase AC wird durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren bestimmt. Jedes andere verwendete Enzym sollte in einer Konzentration und über einen Zeitraum angewendet werden, so dass nur die oberflächlichen Proteoglykane bis zu einer Tiefe von etwa 1-2 μm abgebaut werden.
Der Zeitraum, über den die Enzymlösung angewendet wird, sollte auf ein Minimum beschränkt werden, um den Abbau der Proteoglykane vorwiegend in dem Reparaturbereich zu bewirken. Bei der Chondroitinase ABC oder AC in einer Konzentration von 1 E/ml kann eine Verdauzeit von über 10 Minuten zum unnötigen und möglicherweise schädigenden Abbau der Proteoglykane außerhalb des Defektbereichs führen. Darüber hinaus tragen Verdauzeiten von über 10 Minuten zu stark zur Gesamtzeit der Prozedur bei. Die Gesamtzeit für die Prozedur sollte auf ein Minimum beschränkt werden, insbesondere bei einer offenen Arthrotomie, da der Knorpel durch die Aussetzung gegenüber der Luft beschädigt werden kann [Mitchell et al., (1989), vorstehend]. Aus diesen Gründen werden in den Ausführungsformen der Anwendungen dieser Erfindung, die den Schritt des Abbaus der Proteoglykane durch einen enzymatischen Verdau umfassen, Verdauzeiten von weniger als 10 Minuten bevorzugt, und Verdauzeiten von unter 5 Minuten werden am stärksten bevorzugt.
Gemäß den Anwendungen dieser Erfindung sollte, nachdem das Enzym die Proteoglykane von der Oberfläche des Defekts abgebaut hat, die Enzymlösung aus dem Defektbereich entfernt werden. Die Entfernung der Enzymlösung kann durch eine Absaugvorrichtung, die mit einer feinen Absaugspitze ausgerüstet ist, gefolgt von einer Abtupfung mit einem Schwamm aus Cottonoid erfolgen. Alternativ kann die Enzymlösung durch Abtupfen mit Cottonoid alleine entfernt werden.
Nach der Entfernung der Enzymlösung sollte der Defekt ausgiebig mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (z. B. 0,15 M NaCl) abgespült werden, vorzugsweise dreimal. Dann sollte die abgespülte Defektstelle getrocknet werden. Es kann sterile Gaze oder Cottonoid verwendet werden, um die Defektstelle abzutrocknen.
Die Adhäsion der Matrix an den Knorpel des Defekts kann auch durch die Verwendung von Fibrin-Leim (d. h. Blut-Faktor XIII oder Fibrin-stabilisierender Faktor) erhöht werden, um die chemische Bindung (Kreuzvernetzung) der Fibrillen der Matrix mit den Knorpel-Kollagenfibrillen der Defektoberfläche zu fördern [vergleiche mit Gibble et al., Transfusion 30 (8), S. 741-747 (1990)]. Das Enzym Transglutaminase kann für die gleiche Wirkung verwendet werden [vergleiche z. B. mit Ichinose et al., J. Biol. Chem. 265 (23), S. 13411-13414 (1990); „Transglutaminase", Hrsg.: V.A. Najjar und L. Lorand, Martinus Nijhoff Publishers (Boston, 1984)]. Es können auch andere Verbindungen verwendet werden, die die Adhäsion von extrazellulären Materialien fördern können.
Damit die hierin beschriebene Erfindung besser verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele angeführt. Es sollte klar sein, dass diese Beispiele nur erläuternden Zwecken dienen und nicht gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
Einige Beispiele wurden nur für Referenzzwecke mit aufgenommen und fallen nicht in den Rahmen der Ansprüche.
BEISPIEL 1
Austesten des Enzyms für die Entfernung von Proteoglykanen
Um die Anheftung der Matrix entlang der oberflächlichen Defektoberflächen aus Gelenkknorpelgewebe zu fördern und zu verbessern, können die Proteoglykan-Moleküle in der oberflächlichen Knorpelmatrix enzymatisch entfernt werden, um das fibrilläre Kollagen-Netzwerk gegenüber extern aufgetragenen Matrices und einwandernden Reparaturzellen zu exponieren. Für diesen Zweck sind verschiedene Proteasen und Glycosaminoglykane abbauende Enzyme geeignet, aber die pH-Bedingungen sollten kontrolliert werden, um für jedes Enzym die maximale Aktivität bereitzustellen.
In diesem Beispiel untersuchten wir Chondroitinase ABC (0,5-5 E/ml) und Trypsin (0,5-4 %) auf ihre Fähigkeit, die Entfernung von Proteoglykanen zu bewirken. Es wurden die Kniegelenke von frisch geschlachteten Kaninchen verwendet, die von einem örtlichen Schlachter bezogen wurden. Mechanische erzeugte oberflächliche Knorpeldefekte wurden den Enzymlösungen über einen Zeitraum von 4 Minuten ausgesetzt. Dann wurden die Lösungen mit absorbierenden Gewebetüchern entfernt und die Defektstellen ausgiebig mit physiologischer Kochsalzlösung abgespült. Nach dieser Prozedur wurde das Knorpelgewebe sofort in 2 % (Gew./Vol.) Glutaraldehyd-Lösung (gepuffert mit 0,05 M Natriumcacodylat, pH 7,4), die 0,7 % (Gew./Vol.) Rutheniumhexamintrichlorid (RHT) enthielt, für die histologische Untersuchung fixiert. Das Post-Fixierungsmedium bestand aus einer 1 %-igen RHT-Osmiumtetroxid-Lösung (gepuffert mit 0,1 M Natriumcacodylat). Das Gewebe wurde in einer abgestuften Reihe Ethanol dehydriert und in Epon 812 eingebettet. Es wurden dünne Schnitte angefertigt, mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und in einem Elektronenmikroskop untersucht. In diesen Schnitten erschienen die mit RHT fixierten (d. h. präzipitierten) Proteoglykane als dunkel gefärbte Granula. Enzymkonzentrationen, die die oberflächliche Schicht aus Proteoglykanen um nicht mehr als 1-2 μm Dicke entfernten, wurden als optimal definiert (ein tieferes Eindringen der Enzyme könnte die darunter liegenden Chondrocyten beeinträchtigen). Es wurde herausgefunden, dass die Chondroitinase ABC in einer Konzentration von etwa 1 E/ml optimal aktiv ist. Von Trypsin wurde herausgefunden, dass es bei einer Konzentration von etwa 2,5 % optimal aktiv ist. Der optimale Aktivitätsbereich für andere Glycosaminoglycanasen oder Proteasen kann auf ähnliche Weise bestimmt werden. Es kann jeder beliebige Puffer in Verbindung mit dem Enzym verwendet werden, vorausgesetzt, dass er nicht toxisch ist und dass seine maximale Pufferkapazität nahe bei dem pH-Wert auftritt, der für eine maximale Enzymaktivität erforderlich ist.
BESPIEL 2
Die Anheftung der Matrix an oberflächliche Defekte
Es wurde die Möglichkeit untersucht, ob die Adhäsion der Matrix entlang Defektoberflächen durch einen kontrollierten enzymatischen Verdau der oberflächlichen Knorpel-Proteoglykane gefördert werden kann. Durch Schnitte mit einem Hobel-Messer wurde in den Kniegelenken von drei erwachsenen Kaninchen Defekte erzeugt. Diese Defekte wurden nicht mit einem Enzym behandelt. Die Defekte wurden mit einer Fibrin-Matrix gefüllt, die durch Vermischen von 20 μl einer Thrombin-Lösung (100 E/ml wässrigem Puffer) mit jeweils einem ml Fibrinogen-Lösung (1 mg/ml wässrigem Puffer) etwa 200 Sekunden vor dem Auffüllen des Defekts hergestellt wurde. Die Kaninchen wurden nach 1 Monat getötet, und die Kniegelenke wurden untersucht, um das Ausmaß zu bestimmen, in dem die Fibrin-Matrix sich an die Defektstelle angeheftet hatte. Die Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen, die bei Kaninchen erhalten wurden, deren Defekte mit Chondroitinase ABC (1 E/ml über 4 Minuten) behandelt worden waren, bevor der Defekt mit der Fibrin-Matrix aufgefüllt wurde (vergleiche mit den Beispielen 3, 4 und 5).
Die Fibrin-Matrices, die in die Defektstellen abgelagert wurden, die nicht mit einem Enzym behandelt worden waren, wiesen eine niedrige Affinität für eine Anheftung an die, Defektoberfläche auf. Nach einer Enzymbehandlung war die Klebekapazität der Fibrin-Matrices (die indirekt durch eine Messung der mechanischen Stärke der Anheftung bestimmt wurde, d. h. durch Austesten der Leichtigkeit, mit der die Matrix manuell mit einer Pinzettenspitze weggeschoben werden konnte, und indirekt durch Zählung der Anzahl von Defekten, bei denen die Matrix im Verlauf des Experiments erfolgreich kleben blieb) signifikant erhöht. Die niedrige Affinität der Matrices für die Defektoberflächen bei Abwesenheit der Enzymbehandlung wurde wahrscheinlich durch eine lokale Hemmung der Matrix-Anheftung durch Proteoglykan-Moleküle und eine Hemmung der Fibrin-Polymerisierung verursacht. Beide dieser Wirkungen werden durch die enzymatische Entfernung der oberflächlichen Proteoglykane entlang des Bereichs der Defektoberfläche verhindert.
BEISPIEL 3
Anwendung von Wachstumsfaktoren an den Defektstellen um eine chemotaktische Stimulierung der Einwanderung von Reparaturzellen in die Defektbereiche und die Induktion der Proliferation der Reparaturzellen bereitzustellen
Es wurden verschiedene Wachstumsfaktoren auf ihre Nützlichkeit hin untersucht, die chemotaktische Einwanderung von Reparaturzellen in den Defektbereich zu stimulieren, um eine Heilung des Defekts zu erreichen.
Die verwendeten Wachstumsfaktoren umfassten a) den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), b) den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), c) den Insulin-ähnlichen Faktor I (IGF I), d) das menschliche Wachstumshormon (hGH) und e) den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) in Konzentrationen zwischen 5-10 ng/ml.
Jeder dieser Faktoren wurde lokal bei Defekten, die in dem Knie erzeugt worden waren, nach einer Behandlung mit Chondroitinase ABC und dem Abspülen, wie in Beispiel 2 beschrieben, appliziert. Es wurden insgesamt zehn Tiere (zwei pro Wachstumsfaktor) verwendet. Jeder Wachstumsfaktor war in der Lage, Reparaturzellen zu den Defekt-Oberflächen chemotaktisch anzulocken oder ihre Proliferation lokal ausreichend zu stimulieren, so dass die Defektoberflächen vollständig bedeckt waren. Die Zellen waren jedoch nur auf den Oberflächen der Defekte vorhanden, und in keinem Fall war die Proliferation der Reparaturzellen ausreichend, um das Defektvolumen auszufüllen.
(Man nimmt an, dass die Proteoglykan-Abbauprodukte selber, d. h. ohne Hinzufügung irgendwelcher anderer Mittel, eine ausreichende chemotaktische Wirkung ausüben, um die Reparaturzellen zu dem Defekt anzulocken. Moore, A.R. et al. [Int. J. Tiss. Reac. XI(b), S. 301-307, 1989] haben gezeigt, dass die Proteoglykan-Abbauprodukte chemotaktische Wirkungen per se besitzen).
BEISPIEL 4
Anwendung von Wachstumsfaktoren, die in biologisch abbaubaren Matrices eingeschlossen wurden, an Defektstellen, um eine chemotaktische Stimulierung der Einwanderung von Reparaturzellen in die Defektbereiche und die Induktion der
Proliferation der Reparaturzellen bereitzustellen
Da eine lokale Anwendung eines Wachstumsfaktors unter den Bedingungen des Beispiels 3 in keinem Fall eine Proliferation der Reparaturzellen induzierte, die ausreichte, das Defektvolumen aufzufüllen, wurde das Experiment unter Verwendung der gleichen Wachstumsfaktoren wiederholt, aber dieses Mal wurden die Wachstumsfaktoren in biologisch abbaubaren Matrices eingeschlossen. Die verwendeten biologisch abbaubaren Matrices waren Fibrin, Kollagen und Sepharose. Es wurden ausreichende Mengen der Matrices angewendet, welche den Wachstumsfaktor enthielten, um die Defektvolumina vollständig zu füllen.
Die Fibrin-Matrices wurden durch die Vermischung von 20 μl einer Thrombinlösung (100 E/ml in einer wässrigen Pufferlösung: Veronal-Acetat-Puffer, pH 7,0) mit jeweils einem ml Fibrinogen-Lösung (1 mg/ml in einer wässrigen Pufferlösung: 0,05 M Tris, pH 7,4, 0,1 M NaCl) etwa 200 Sekunden vor dem Füllen des Defekts gebildet. Bei Kollagen-Matrices wurden ausreichend viskose Lösungen unter Verwendung von Collagen-Vliess^® oder von Gelatine-Blut-Gemischen hergestellt. Bei Sepharose-Matrices wurden die Defekte mit flüssigen Lösungen von Sepharose bei 39-42°C gefüllt. Beim Abkühlen (35-38°C) bildete sich eine Sepharose-Matrix in dem Defekt.
Bei diesem Experiment wurden 30 Kaninchen (jeweils 2 für jeden Matrixtyp und Wachstumsfaktor) verwendet. In allen Fällen, in denen die abgelagerte Matrix an den Defekt angeheftet blieb, wurde sie vollständig von Fibroblasten-ähnlichen Reparaturzellen besiedelt. Es wurde herausgefunden, dass diese Situation so früh wie 8 bis 10 Tage nach der Operation vorlag. In der strukturellen Organisation des Reparaturgewebes traten bis zu vier Wochen nach der Operation keine weiteren Veränderungen auf, mit der Ausnahme, dass die biologisch abbaubaren Matrices durch die Reparaturzellen umgebaut und durch einen lockeren, bindegewebeartigen Typ einer extrazellulären Matrix ersetzt wurden.
Eine Transformation dieses Gewebes zu Knorpelgewebe erfolgte nicht.
BEISPIEL 5
Anwendung von Wachstumsfaktoren, die in biologisch abbaubaren Matrices eingeschlossen wurden, an Defektstellen, um eine chemotaktische Stimulierung der Einwanderung der Reparaturzellen in die Defektbereiche und die Induktion der Proliferation der Reparaturzellen bereitzustellen, gefolgt von einer zeitlich festgesetzten lokalen Freisetzung eines Transformationsfaktors in einem zweiten Schritt, um die Umwandlung der Defektstelle zu hyalinem Knorpel bereitzustellen
Die Beobachtung, dass die Matrices innerhalb des Defektvolumens mit Reparaturzellen nach der Anwendung eines Wachstumsfaktors vollständig gefüllt waren und dass diese Zellen in der Lage waren, die abgelagerte Matrix umzugestalten (vergleiche mit Beispiel 4), veranlasste die Untersuchung der Wirkungen der Einbringung eines Transformationsfaktors (wie z. B. TGF-β) in einer verkapselten Form (z. B. in Liposomen), aus der der Transformationsfaktor freigesetzt werden würde, wenn die Matrix mit Reparaturzellen, die begonnen haben, die intrazelluläre Struktur umzugestalten, vollständig besiedelt ist.
Der TGF-β wurde mit der Fibrinogen-Lösung (1 mg/ml) in einer niedrigen Konzentration (z. B. 2-10 ng/ml) zum Zwecke der Förderung der anfänglichen chemotaktischen und proliferativen Wirkungen vermischt. Der TGF-β wurde ebenfalls in Liposomen gemäß dem Verfahren von Kim et al. (1983), vorstehend, eingekapselt. Diese den TGF-β enthaltenden Liposomen wurden der gleichen Fibrinogen-Lösung in einer Konzentration hinzugefügt, die, wenn die Liposomen aufgebrochen werden und der TGF-β freigesetzt wird, ausreicht, um eine höhere Konzentration von 100-1000 ng TGF-β pro ml Fibrinogen bereitzustellen, und zwar für den Zweck der Förderung der Transformation der Reparaturzellen zu Chondrocyten und der Umwandlung des mit der Matrix gefüllten Defekts zu Knorpel in einem zweiten Stadium, wenn die Reparaturzellen, die die Fibrin-Matrix besiedelt haben, begonnen haben, die interzelluläre Substanz umzugestalten.
Zehn erwachsene Kaninchen, bei denen die oberflächlichen Defekte des Kniegelenk-Gelenkknorpels wie in Beispiel 2 erzeugt worden waren, wurden durch die Anwendung dieses Gemisches aus Fibrinogen, das freien und in Liposomen verkapselten TGF-β enthielt, an der Defektstelle behandelt. Bei den verschiedenen Experimenten in dieser Reihe von Experimenten wurde die Konzentration des freien TGF-β im Bereich von 2-10 ng/ml Fibrinogen gehalten, während die Konzentration des eingekapselten TGF-β variiert wurde, um (nach der Freisetzung des TGF-β aus den Liposomen) eine Konzentration zwischen 100 und 1000 ng TGF-β/ml Fibrinogen in 100 ng-Schritten bereitzustellen. Die Bildung von hyalinem Knorpelgewebe fand an den behandelten Stellen in allen Fällen statt. Die am besten reproduzierbaren Ergebnisse wurden bei Konzentrationen von über 200 ng verkapseltem TGF-β/ml Fibrinogen-Lösung erhalten und bevorzugt bei über 500 ng TGF-β/ml Fibrinogen-Lösung.
BEISPIEL 6
Bestimmung des Zeitpunkts der Gewebetransformation
Bei diesem Experiment wurde eine Gruppe von 6 erwachsenen Kaninchen einer Knieoperation unterzogen, um oberflächliche Defekte wie in Beispiel 2 herzustellen. Es wurde ein vollständiges Behandlungsprotokoll für die Reparatur oberflächlicher Defekte angewendet, d. h. die Behandlung mit Chondroitinase ABC (1 E/ml über 4 Minuten), gefolgt von dem Auffüllen der Defektstelle mit Fibrinmatrix (1 mg/ml Fibrinogen-Lösung, 20 μl 100 E/ml Thrombin-Lösung pro ml Fibrinogen-Lösung), die freien TGF-β (ca. 2-10 ng/ml) und in Liposomen eingekapselten TGF-β (ca. 800 ng/ml) enthielt. Drei Kaninchen wurden 8, 10 und 12 Tage nach der Operation getötet und die verbleibenden drei nach 20, 24 und 28 Tagen. Die Transformation des primitiven Fibroblasten-ähnlichen Reparaturzellgewebes zu hyalinem Knorpelgewebe erfolgte in diesem Tiermodell zwischen den Tagen 12 und 20. Dies wurde auf Grundlage einer histologischen Untersuchung bestimmt. An den Tagen 8 bis 12 war immer noch lockeres fibröses Reparaturgewebe vorhanden (die aufgetragene Fibrinmatrix war teilweise oder vollständig umgestaltet), wohingegen am Tag 20 und an den folgenden der Defektraum teilweise oder vollständig mit hyalinem Knorpelgewebe gefüllt war.
BEISPIEL 7
Anwendung der Knorpel-Reparaturverfahren in einem Minischwein-Modell
Die experimentellen Verfahren, die bei dem vorstehenden Kaninchen-Modell verwendet worden waren, wurden auf ein Modell mit einem größeren Tier, dem Minischwein, angewendet. Oberflächliche Defekte (0,6 mm breit, 0,6 mm tief und etwa 10-15 mm lang) wurden in vier erwachsenen Minischweinen (2-4 Jahre alt, 80-110 Pfund) durch Schneiden mit einem Hobel-Messer in der Kniescheibenfurche und auf dem medialen Gelenkkopf erzeugt. Dann wurden die Defekte mit Chondroitinase ABC behandelt (1 E/ml über 4 Minuten, wie für die Kaninchen, vorstehend, verwendet). Die Enzymlösung wurde entfernt, der Defekt wurde getrocknet, mit physiologischer Kochsalzlösung abgespült und dann erneut getrocknet. Dann wurden die Defektstellen mit der Fibrinogen-Matrixlösung gefüllt. Die bei diesem Experiment verwendete Fibrinogen-Matrixlösung enthielt 2-6 ng freien TGF-β pro ml und 1500-2000 ng in Liposomen eingekapselten TGF-β pro ml Fibrinogenlösung. Vor dem Auffüllen der Defekte wurde der Matrixlösung Thrombin hinzugefügt, wie vorstehend bei den Experimenten an Kaninchen beschrieben wurde.
Die Minischweine wurden 6 Wochen nach der Operation getötet und die Stellen der mit der Matrix gefüllten Defekte wurden histologisch untersucht. Alle Stellen zeigten Heilung, d. h. die Bildung von hyalinem Knorpelgewebe an der Behandlungsstelle.
BEISPIEL 8
Reparatur von Gelenkknorpeldefekten im Gelenkknorpel unter Verwendung antiangiogener Mittel
Gelenkknorpeldefekte, 1 mm tief und 10 mm breit, wurden in den medialen Gelenkköpfen und den Kniescheibenfurchen von Kniegelenken erwachsener Minischweine erzeugt. In jeweils zwei Tieren wurden fünf Läsionen unter Verwendung eines Hobel-Instruments erzeugt. In jeder Kniescheibenfurche wurden zwei Defekte in der cranialen Region, zwei Defekte in der caudalen Region und ein Defekt in dem medialen fermoralen Gelenkkopf hergestellt. Die vertikale Ausdehnung jeder Läsion in den subchondralen Knochen (der Blutgefäße und Knochenmarkszellen enthält) wurde makroskopisch durch das Auftreten einer Blutung kontrolliert, um abzusichern, dass eine Gelenkknorpel-Läsion in dem Gelenk erzeugt worden war. Dann wurden die Defekte mit Chondroitinase AC (1 E/ml über 4 Minuten) behandelt. Die Enzymlösung wurde entfernt, der Defekt wurde getrocknet, mit physiologischer Kochsalzlösung gespült und erneut getrocknet. Dann wurden die Defektstellen mit der Knorpelreparatur-Matrixlösung gefüllt. Die bei diesem Experiment verwendete Matrixlösung bestand aus einem Copolymer von Gelatine (Gelfoam, Upjohn) (verwendet in 100 mg pro ml) und Fibrinogen (verwendet in 20 mg pro ml). Es wurde Thrombin (verwendet in 50 IE) zu der Oberfläche des Defekts hinzugefügt, nachdem die Matrix in den Defekt platziert worden war, und es wurde ihm erlaubt in die Matrix zu diffundieren.
Die Knorpelreparaturmatrix enthielt ein freies Proliferationsmittel, den Insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-1), in einer Konzentration von etwa 40 ng/ml Matrixvolumen als Transformationsfaktor und in Liposomen verkapselten TGF-β1 in einer Konzentration von 500 ng/ml Matrixvolumen als Transformationsfaktor. Zusätzlich wurde freies Suramin in einer Konzentration von 10 millimolar Matrixvolumen und in Liposomen verkapseltes Suramin in einer Konzentration von 10 millimolar Matrixvolumen in den gleichen Liposomen, die auch den TGF-β1 enthielten, hinzugefügt. Bei Kontrollläsionen wurden die Defekte in der gleichen Weise behandelt, mit der Ausnahme, dass Suramin nicht hinzu gegeben wurde.
Etwa 8 Wochen nach der Operation und der Behandlung wurden die Tiere getötet und die Stellen der mit der Matrix gefüllten Defekte histologisch untersucht. Der Teil des Defektraums, der dem Gelenkknorpelgewebe benachbart lag, d. h. die Region, die mit der Matrixzusammensetzung, die Suramin enthielt, gefüllt worden war, war mit Gelenkknorpelgewebe gefüllt. Der gleiche Teil des Defektraums bei den Kontrollläsionen, d. h. denjenigen, die ohne Suramin behandelt worden waren, war mit neu gebildetem Knochengewebe gefüllt.
Das vorstehende Experiment wurde wiederholt, wobei der TGF-β1 durch BMP-2 in einer Konzentration von 1000 ng/ml Matrixvolumen ausgetauscht wurde. Es wurden die gleichen Ergebnisse erhalten.
BEISPIEL 9
Reparatur von Gelenkknorpeldefekten im Gelenkknorpel unter Verwendung einer Hitzebehandlung
Es wurden Gelenkknorpeldefekte, 1 mm tief und 10 mm breit, in den medialen Gelenkköpfen und den Kniescheibenfurchen von erwachsenen Minischweinen erzeugt. In jedem Kniegelenk von zwei Minischweinen wurden 5 Läsionen erzeugt. An jedem Ort, an dem eine Blutung auftrat, wurde die Gerinnung durch die Anwendung eines erhitzten Instruments am Grunde der Defekte induziert, um eine biologische physikalische Sperre zu bilden. Wir verwendeten eine erhitzte Skalpellklinge (erhitzt auf 220 °C), um die transiente Gewebesperre zu erzeugen.
Bei einem Minischwein wurden die Gelenkknorpeldefekte in einem Gelenk mit einer Knorpel-Reparaturmatrix gefüllt, die den IGF-I in einer Konzentration von etwa 40 ng/ml Matrixvolumen und den in Liposomen verkapselten TGF-β3 in einer Konzentration von 500 ng/ml Matrixvolumen enthielt. Bei den Defekten des anderen Gelenks wurde Suramin in die Matrix mit eingeschlossen, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Bei dem zweiten Minischwein wurden die Defekte des einen Gelenks mit einer Knorpel-Reparaturmatrix gefüllt, die den IGF-1 in einer Konzentration von etwa 40 ng/ml Matrixvolumen und das in Liposomen eingekapselte BMP-2 in einer Konzentration von 1000 ng/ml Matrixvolumen enthielt. Bei den Defekten des anderen Gelenks des zweiten Minischweins wurde Suramin in die Matrix mit eingeschlossen, wie in Beispiel 8 beschrieben.
Wie bei dem vorangegangenen Experiment wurden die Tiere acht Wochen nach der Operation und der Behandlung getötet und untersucht. In keinem Tier hatte sich Knochengewebe in dem Defektraum gebildet, der dem Gelenkknorpelgewebe benachbart lag. Statt dessen waren die Defekträume mit Gelenkknorpelgewebe gefüllt.
BEISPIEL 10
Reparatur von tiefen Gelenkknorpeldefekten im Gelenkknorpel unter Verwendung eines anti-angiogenen Mittels
Es können sehr tiefe Gelenkknorpeldefekte mit einer Tiefe von bis zu 5 mm in den medialen Gelenkköpfen und in den Kniescheibenfurchen der Kniegelenke erwachsener Minischweine erzeugt werden. Die Läsionen können in Tieren, die unter einer allgemeinen Anästhesie gehalten werden, unter Verwendung eines Hobel-Instruments hergestellt werden. Der Knochenanteil des Defekts kann mit einer Knochen-Reparaturmatrix-Zusammensetzung gefüllt werden, wie z. B. einer solchen, die vorstehend beschrieben wurde. Der Knochenanteil des Defekts sollte mit der Matrix bis zu der Knorpel-Knochen-Grenze aufgefüllt werden. Der Gelenkknorpeldefektraum kann mit einer Knorpel-Reparaturmatrix gefüllt werden, die einen anti-angiogenen Faktor enthält, wie z. B. diejenigen, die vorstehend beschrieben wurden, z. B. in den Beispielen 8 und 9.

Claims

Verwendung einer Matrix, die ein anti-angiogenes Mittel enthält, um das Einwachsen von Blutgefäßen in Knorpel zu verhindern; wobei die Matix gegebenenfalls ein oder mehrere Mitglieder der Gruppe enthält, die besteht aus: (a) einem Transformationsfaktor, der Reparaturzellen in Chondrocyten verwandelt; (b) einem Proliferationmittel, das die Proliferation von Zellen stimuliert; und (c) einem Proliferationsmittel und einem chemotaktischen Mittel, um Reparaturzellen anzulocken, für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Gelenkknorpeldefekten in Tieren, wobei der Knorpelanteil des Defektes mit der Matrix gefüllt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei während der Behandlung ein Transformationsfaktor zum Matrix-gefüllten Defekt gebracht wird zu einem Zeitpunkt, wenn die Reparaturzellen die Matrix besiedelt haben, um die Reparaturzellen in Chondrocyten zu verwandeln.
Verwendung einer Matrix, die ein anti-angiogenes Mittel enthält, um das Einwachsen von Blutgefäßen in Knorpel zu verhindern, und einen Transformationsfaktor, der verbunden ist mit einem Zuführungssystem, das den Transformationsfaktor freisetzt, um Reparaturzellen in Chondrocyten zu verwandeln; wobei die Matrix gegebenenfalls eines oder mehrere Mitglieder der Gruppe enthält, die besteht aus: (a) einem Proliferationmittel, das die Proliferation von Zellen stimuliert; und (b) einem Proliferationsmittel und einem chemotaktischen Mittel, um Reparaturzellen anzulocken, für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Gelenkknorpeldefekten in Tieren, wobei die Orte von Blutungen hitzebehandelt werden sollen, um eine transiente biologische Membran zu erzeugen, und der Knorpelanteil des Defekts mit der Matrix gefüllt werden soll.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Kombination mit der Verwendung einer zweiten Matrix, wobei die zweite Matrix gegebenenfalls ein oder mehrere Mitglieder der Gruppe enthält, die besteht aus (a) einem angiogenen Faktor, um die Bildung und das Einwachsen von Blutgefäßen mit assoziierten Zellen zu fördern; und (b) einem osteogenen Faktor, der verbunden ist mit einem Zuführungssystem, das den osteogenen Faktor freisetzt bei einer Konzentration, die ausreicht, um die Differenzierung der Knochenreparaturzellen in Knochenzellen auszulösen, die Knochen bilden, wobei der Knochenanteil des Defekts mit der zweiten Matrix gefüllt wird.
Verwendung einer Matrix, enthaltend ein anti-angiogenes Mittel, um das Einwachsen von Blutgefäßen in Knorpel zu verhindern, ein chemotaktisches Mittel, um Reparaturzellen anzulocken, ein Proliferationsmittel, um die Proliferation von Reparaturzellen anzuregen, und einen Transformationsfaktor, der verbunden ist mit einem Zuführungssystem, das den Transformationsfaktor freisetzt, um Reparaturzellen in Chondrocyten zu verwandeln, für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Knorpeldefekten in Tieren, wobei der Defekt mit der Matrix gefüllt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei während der Behandlung die Defektstelle mit einer sterilen Lösung eines Mittels behandelt werden soll, das Proteoglykane von der Oberfläche des Defekts abbaut, die vor der Füllung des Defekts mit der Matrix entfernt wird.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Mittel um Proteoglykane abzubauen Chondroitinase AC ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Matrix ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fibrin, Kollagen, Gelatine, Agarose und Kombinationen daraus.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das anti-angiogene Mittel Suramin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Transformationsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TGF-β und BMP.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 10, bei der das Zuführungssystem zur Verteilung des Transformationsfaktors und/oder des anti-angiogenen Mittels ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Liposomen, bio-erodierbaren Polymeren, Kollagenfasern, Kohlenhydrat-basierenden Korpuskeln und Wasser-Öl-Emulsionen.