DE69736290T2

DE69736290T2 - Hemmung des wachstums der chronischen myelogenen leukämischen zellen durch antisens-oligonukleotide die an grb2 zielgerichtet sind

Info

Publication number: DE69736290T2
Application number: DE69736290T
Authority: DE
Inventors: Gabriel Bellaire LOPEZ-BERESTEIN; Ana M. Houston TARI; B. Ralph Bellaire ARLINGHAUS
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1996-07-08
Filing date: 1997-07-08
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2017-07-09
Also published as: EP0912729B1; DE69736290D1; AU740289B2; AU3569497A; CA2259144C; ATE383422T1; US20030153526A1; US20070238686A1; ATE332369T1; EP1234876A1; JP2000514438A; CA2741501A1; US7309692B1; DE69738459D1; DE69738459T2; US7220853B2; ES2299536T3; EP1234876B1; ES2268731T3; US7923548B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
A. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Krebstherapie, insbesondere die Behandlung von chronischer, myelogener Leukämie. Im Besonderen beinhalten diese Behandlungen die Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden und liposomale Formulierungen damit.
B. Stand der Technik
Chronische myelogene Leukämie (CML) ist eine hämatologische Malignität, bei der eine unkontrollierte Proliferation von Granulozytzellen auftritt. Sie ist oft durch eine reziproke Translokation der Chromosomen 9 und 22, die das Ableson (abl) Proto-Onkogen an das 3'-Ende der Breakpoint-Cluster-Region (bcr) verschiebt, charakterisiert. Dies erzeugt ein chimäres bcr-abl Gen, welches ein p210^bcr-abl Fusionsprotein kodiert, das tumorerzeugend und für das Wachstum von CML-Zellen notwendig ist (Szczylik et al., 1991; Skorski et al., 1994; Tari et al., 1994; McGahon et at., 1994; Bedi et al., 1994).
Das bcr-abl-Protein kann an der 177-Tyrosin-Aminosäure, die im ersten Exon von bcr gefunden werden kann, autophosphorylieren. Wenn phosphoryliert bindet die bcr-Domäne des bcr-abl-Proteins an die SH2-Domäne des Wachstumsfaktors, des Rezeptor-gebundenen Protein-2-(Grb2)-Adaptorproteins. Über die SH3-Domäne bindet Grb2 an den menschliche „Son of sevenless 1-(hSosl)" GDP/GTP-Austauschfaktor, was zu einer ras-Proteinaktivierung führt. Das bcr-abl-Protein kann auch die 177-Tyrosin Aminosäure, die innerhalb des normalen bcr-Proteins gefunden wird, transphosphorylieren. Es wird vermutet, dass wenn das normale bcr-Protein an der Aminosäure 177 Tyrosin-phosporyliert wird, es auch mit Grb2 komplexieren wird. Wenn das bcr-abl-Protein exprimiert wird werden die p46- und p52-Shc (Puil et al., 1994) auch Tyrosin-phosphoryliert. Es hat sich auch gezeigt, dass diese Shc-Proteine stabile Komplexe mit Grb2 bilden. Aus diesem Grund scheint Grb2 eine sehr wichtige Rolle bei der durch bcr-abl-Protein vermittelten Tumorerzeugung zu spielen (Puil et al., 1994; Pendergast et al., 1993).
Bei einem weiterem Adaptorprotein, „Crk-like" (Crkl) wurde auch gefunden, dass es an bcr-abl bindet. Anders als Grb2, bindet Crkl über die abl-Domäne an bcr-abl. Über seine SH3-Domäne kann Crkl auch an hSosl binden, was wiederum zu einer Ras-Proteinaktivierung führt (ten Hoeve et al., 1994a and 1994b). Deshalb ist über die Grb2- und Crkl-Adaptorproteine das bcr-abl-Protein mit der ras Aktivierung in Verbindung gebracht worden, die bekanntermaßen zu einer Tumorerzeugung führt. Wenn die Expression des ras-Proteins inhibiert wird, wird auch die Proliferation von CML-Zellen inhibiert. Aus diesem Grund ist einer der Hauptwege, in denen das bcr-abl-Protein die Proliferation von CML fördert, über die Aktivierung von ras-Protein (Skorski et al., 1994; 1995).
Liposomale Antisense-Formulierungen, die auf bcr-abl zielen, reduzieren die Proliferation von CML-Zellen. Nach maximaler Inhibierung (75 % Wachstumsinhibierung und 90 % Proteininhibierung) können sich die CML-Zellen noch erholen und wachsen, wenn die liposomalen Antisense-Oligonucleotide aus dem Kulturmedium entfernt werden. Dies wird wahrscheinlich durch die unvollständige Inhibierung der bcr-abl-Proteinsynthese verursacht (Tari et al., 1994). Deshalb besteht trotz der Fähigkeit von Antisense-Oligonucleotiden die Proliferation von CML-Zellen zu inhibieren, ein Bedarf nach noch effektiveren Zusammensetzungen und Behandlungen gegen diese Form des Krebses.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wurde entwickelt, um die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden, indem verbesserte Zusammensetzungen und Verfahren für die Behandlung von CML bereitgestellt werden. Im Besonderen macht die vorliegende Erfindung Gebrauch von neuen Antisense-Oligonucleotiden, um auf spezifische Nukleinsäuren in den Zellen von CML-Patienten zu zielen.
Deshalb wird in einer Ausführungsform eine Zusammensetzung, enthaltend ein Polynucleotid, das an ein Grb2-kodierendes Polynucleotid hybridisiert, wie in Anspruch 1 definiert, bereitgestellt. Eine Zusammensetzung wird offenbart, die ein Polynucleotid enthält, das an ein Crkl-kodierendes Polynucleotid hybridisiert. Diese Polynucleotide können Oligonucleotide mit einer Länge von 8–50 Basen sein. Das Polynucleotid hybridisiert an die die Translationsinitiationsstelle der Grb2-mRNA oder der Crkl-mRNA. In speziellen Ausführungsformen ist das Polynucleotid ein Oligonucleotid mit der Sequenz ATATTTGGCGATGGCTTC oder GTCGAACCGGCGGAGGA. In einer anderen Ausführungsform ist das Polynucleotid in einem Liposom verkapselt. Das Liposom kann vorteilhaft aus dem Lipid Dioleoylphosphatidylcholin bestehen.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Zusammensetzung weiter ein Polynucleotid enthalten, das an ein bcr-abl-kodierendes Polynucleotid hybridisiert.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung, umfassend ein Expressionskonstrukt, welches ein erstes Polynucleotid kodiert, das an ein Grb2-kodierendes Polynucleotid hybridisiert, wobei besagtes erstes Polynucleotid unter der Kontrolle eines Promotors steht, der in eukaryotischen Zellen aktiv ist, bereitgestellt. Gleichzeitig wird eine Zusammensetzung offenbart, umfassend ein Expressionskonstrukt, welches ein erstes Polynucleotid kodiert, welches an ein Crkl-kodierendes Polynucleotid hybridisiert, wobei das besagte erste Polynucleotid unter der Kontrolle eines Promotors steht, der in eukaryotischen Zellen aktiv ist.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Inhibierung der Proliferation einer Krebszelle, bei dem besagte Krebszelle mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird, bereitgestellt. Die Polynucleotide können Oligonucleotide mit einer Länge von 8–50 Basen sein. Das Verfahren kann weiter das In-Kontakt-Bringen der Krebszelle mit einer Zusammensetzung, umfassend ein Polynucleotid, das an eine bcr-abl-Nukleinsäure hybridisiert, umfassen.
Das obige Verfahren kann vorteilhaft bei einer Krebszelle angewandt werden, die eine Leukämiezelle ist oder spezifischer eine chronische myelogene Leukämiezelle ist. Die Zusammensetzung kann ein Liposom umfassen, in dem das Polynucleotid verkapselt ist. In einer speziellen Ausführungsform findet das In-Kontakt-Bringen in einem Patienten statt. Der Patient kann ein Mensch sein. Die Zusammensetzung kann vorteilhaft an den Menschen in einem Volumen von 0,50–10,0 ml pro Dosis oder in einer Menge von 5–30 mg Polynucleotid pro m² abgegeben werden. In einem besonderen Regime wird die Zusammensetzung dreimal pro Woche für acht Wochen verabreicht.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende, detaillierte Beschreibung offensichtlich. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele, die bevorzugte Ausführungsformen anzeigen, nur zum Zwecke der Illustration gegeben werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung und sind mit aufgenommen worden, um zusätzlich bestimmte Aspekte der Erfindung zu zeigen. Die Erfindung kann unter Verweis auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen) in Kombination mit der detaillierten Beschreibung, der hier präsentierten spezifischen Ausführungsformen, besser verstanden werden:
1: Wirkungen von liposomalen Antisense-Oligonucleotiden, die spezifisch für Grb2 sind, auf das Wachstum von Leukämiezellen. BV173-, K562- und HL60-Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen an liposomalen Antisense-Oligonucleotiden, die spezifisch für Grb2 sind, inkubiert. Nach drei Tagen der Inkubation wurde ein alamarBlue-Assay durchgeführt, um die wachstumshemmende Wirkung dieser Oligonucleotide auf die Leukämiezellen zu bestimmen. Die Lebensfähigkeit wurde als Prozentsatz an unbehandelten Zellen, der über (Absorption von behandelten Zellen/Absorption von unbehandelten Zellen) × 100 bestimmt wurde.
2: Wirkungen von liposomalen Antisense-Oligonucleotiden. die spezifisch für Crkl sind, auf das Wachstum von Leukämiezellen. BV173-, K562- und HL60-Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen an liposomalen Antisense-Oligonucleotiden, die spezifisch für Crkl sind, inkubiert. Nach drei Tagen der Inkubation wurde ein alamarBlue-Assay durchgeführt, um die wachstumshemmende Wirkung dieser Oligonucleotide auf die Leukämiezellen zu bestimmen. Die Lebensfähigkeit wurde als Prozentsatz an unbehandelten Zellen, der über (Absorption von behandelten Zellen/Absorption von unbehandelten Zellen) × 100 bestimmt wurde.
3: Wirkungen von liposomalen Kontroll-Oligonucleotiden auf das Wachstum von Leukämiezellen. BV173-, K562- und HL60-Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen an liposomalen Kontroll-Oligonucleotiden inkubiert. Nach drei Tagen der Inkubation wurde ein alamarBlue-Assay durchgeführt, um die wachstumshemmende Wirkung dieser Oligonucleotide auf die Leukämiezellen zu bestimmen. Die Lebensfähigkeit wurde als Prozentsatz an unbehandelten Zelllen, der über (Absorption von behandelten Zellen/Absorption von unbehandelten Zellen) × 100 bestimmt wurde.
4: cDNA und Proteinsequenz von GRB2. 5'- und 3'-untranslatierte, flankierende Sequenzen sind zusammen mit dem kodierenden Bereich und der Aminosäuresequenz illustriert. SH2- (dicke Linie) und SH3 (dünne Linie)-Domänen sind angegeben.
5: cDNA und Proteinsequenz von CRKL. 5'- und 3'-untranslatierte, flankierende Sequenzen sind zusammen mit dem kodierenden Bereich und der Aminosäuresequenz illustriert. SH2-, SH2'-,SH3- und SH4-Domänen sind durch Unterstreichungen angegeben.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN/AUSFÜHRUNGSFORMEN
A. Die vorliegende Erfindung
Chronische myeloische Leukämie oder CML ist eine klonale Erkrankung, bei der die leukämischen Stammzellen rote Zellen, Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Monozyt-Makrophagen, Scheibchen, T-Zellen und B-Zellen erzeugen. Eine reziproke Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22 führt zu einem verkürzten Chromosom 22, welches Philadelphia-Chromosom (Ph¹) genannt wird. Obwohl bis zu 10 % der CML-Fälle als Ph-negativ klassifiziert wurden, werden solche Fälle heute als sehr selten betrachtet.
Diese Translokation erzeugt ein fusioniertes Gen bcr-abl, dessen Produkt (p210) spielt eine wichtige Rolle in der Tumorerzeugung. Dieses zytoplasmische Protein hat ungefähr 1910 Aminosäurereste und beinhaltet Exon 2 und 3 von bcr und Exon 2 von abl. Trotz der Anstrengungen, die auf die Inhibierung der Synthese von bcr-abl unter Verwendung von Antisense-Konstrukten gerichtet sind, scheint es, dass der tumorerzeugende Phänotyp von Ph-positiven Zellen kurz nach Behandlung wiederkehrt.
Die vorliegende Erfindung betrifft Antisense-Oligonucleotide und -Polynucleotide, die auf Bereiche des Grb2-Gens gerichtet sind und deren Einsatz in der Behandlung von Krebs. Es wird angenommen, dass die beiden Grb2- und Crkl-Genprodukte mit dem bcr-abl-Produkt wechselwirken und deshalb an der Transformation von CML-Zellen beteiligt sind. Eine Inhibierung der Synthese von diesen Molekülen reduziert das Tumorzellenwachstum. Insbesondere wird erwartet, dass es durch Einsatz dieser Antisense-Moleküle entweder allein oder zusammen mit anderen Antisense-Molekülen möglich ist, CML und vielleicht andere Krebsarten effektiv zu behandeln. Die Oligo- oder Polynucleotide selber oder Expressionsvektoren, die für diese kodieren, können verwendet werden. Das bevorzugte Verfahren zur Bereitstellung dieser Nukleinsäuren ist via Liposome. Die Erfindung wird in ihren verschiedenen Ausführungsformen im Folgenden detailliert beschrieben.
B. Polynucleotide und Oligonucleotide
Der Begriff „Antisense" ist gedacht, um Polynucleotidmoleküle zu bezeichnen, die komplementär zu einem Bereich von einer Grb2-RNA oder der dazu entsprechenden DNAs ist. Siehe 4 und 5. „Komplementäre" Polynucleotide sind solche, die in der Lage sind, eine Basenpaarung gemäß der Standard-Watson-Crick-Komplentärregeln durchzuführen. Das heißt, dass die größeren Purine eine Basenpaarung mit den kleineren Pymiridinen eingehen, um Kombinationen von Guanin gepaart mit Cytosin (G:C) sowie entweder Adenin gepaart mit Thymin (A:T) im Fall der DNA oder Adenin gepaart mit Uracil (A:U) im Fall von RNA zu bilden. Inklusion von weniger häufigen Basen wie Inosin, 5-Methylcytosin, 6-Methyladenin, Hypoxanthin und anderen in hybridisierenden Sequenzen stören das Paaren nicht.
Targeting von Doppelstrang (ds)-DNA mit Polynucleotiden führt zur einer Triplehelix-Bildung; Targeting von RNA führt zur Doppelhelix-Bildung. Antisense-Polynucleotide, wenn in einer Zielzelle eingeführt, binden spezifisch an ihr Zielpolynucleotid und stören bei der Transkription, RNA-Bearbeitung, Transport, Translation und/oder Stabilität. Antisense-RNA-Konstrukte oder DNA, die solche Antisense-RNA kodiert, kann verwendet werden, um die Gentranskription oder -translation oder beides in einer Wirtszelle, entweder in vivo oder in vivo, wie beispielsweise in einem Wirtstier, einschließlich eines menschlichen Objekts, zu inhibieren.
Die intrazellulare Konzentration an monovalentem Kation beträgt ungefähr 160 mM (10 nM Na⁺, 150 mM K⁺). Die intrazellulare Konzentration an divalentem Kation beträgt ungefähr 20 mM (18 mM Mg⁺⁺, 2 mM Ca⁺⁺). Die intrazelluläre Proteinkonzentration, welche dazu dienen würde das Volumen der Hybridisierung zu reduzieren und dadurch die effektive Konzentration an Nukleinsäurespezies zu erhöhen, ist 150 mg/ml. Konstrukte können unter Bedingungen, die solche in vivo Bedingungen nachahmen, getestet werden.
Antisense-Konstrukte können entworfen werden, um an den Promotor und andere Kontrollregionen, Exons, Introns oder sogar Exon-Introns-Grenzbereiche eines Gens zu binden. Es wird erwartet, dass die effektivsten Antisense-Konstrukte für die vorliegende Erfindung Bereiche aufweisen, die komplementär zu dem Startpunkt der mRNA sind. Solche Konstrukte können ganz einfach durch Testen der Konstrukte in vivo, um zu bestimmen ob Mengen an dem Zielprotein beschädigt sind, getestet werden. Genauso kann die dentrimentale nicht-spezifische Inhibierung der Proteinsynthese auch durch Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zielzelle in vivo gemessen werden.
Wie hier verwendet beschreiben die Begriffe „komplementär" oder „Antisense" Polynucleotide, die im Wesentlichen komplementär über ihre gesamte Länge sind und nur wenige Basen-Mismatches aufweisen. Zum Beispiel können Sequenzen mit einer Länge von fünfzehn Basen als komplementär bezeichnet werden, wenn sie ein komplementäres Nukleotid an dreizehn oder vierzehn von fünfzehn Nucleotiden haben. Natürlich sind Sequenzen, die „vollständig komplementär sind" Sequenzen, die vollständig, über die gesamte Länge komplementär sind und keine Basen-Mismatches aufweisen.
Andere Sequenzen mit einem niedrigeren Grad an Homologie werden auch betrachtet. Zum Beispiel kann ein Antisense-Konstrukt, welches einen begrenzten Bereich mit hoher Homologie aufweist, aber auch einen nicht-homologen Bereich (zum Beispiel ein Ribozym) hergestellt werden. Diese Moleküle würden unter geeigneten Bedingungen an die Zielsequenzen binden, obwohl sie weniger als 50 % Homologie besitzen.
Die Polynucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung können ein Grb2 oder einen Bereich dieses Gens, der ausreicht um Antisense-Inhibierung der Proteinexpression zu bewirken, kodieren. Die Polynucleotide können von genomischer DNA, dass heißt direkt aus dem Genom eines bestimmten Organismuses geklont, abgeleitet sein. In anderen Ausführungsformen jedoch können die Polynucleotide komplementäre DNA (cDNA) sein. cDNA ist DNA, die unter Verwendung von Messenger-RNA (mRNA) als Templat hergestellt wurde. Deshalb enthält cDNA keine unterbrochenen, kodierenden Sequenzen und enthält üblicherweise ausschließlich die kodierenden Bereiche für die entsprechenden Proteine. In anderen Ausführungsformen kann das Antisense-Polynucleotid synthetisch hergestellt worden sein.
Es kann vorteilhaft sein, Bereiche der genomischen DNA mit cDNA oder synthetischen Sequenzen zu kombinieren, um spezifische Konstrukte zu erzeugen. Wo zum Beispiel ein Intron in dem Endkonstrukt gewünscht ist, ist es notwendig einen genomischen Klon einzusetzen. Die cDNA oder ein synthetisiertes Polynucleotid können bessere Restriktionsorte für die verbleibenden Bereiche des Konstrukts bereitstellen und würden deshalb für den Rest der Sequenz eingesetzt werden.
Die DNA- und Protein-Sequenzen für Grb2 und Crkl sind in der Literatur durch Lowenstein et al.(1992) bzw. ten Hoeve et al. (1993) veröffentlich, wobei hier auf diese Bezug genommen wird. Es wird erwartet, dass natürliche Varianten existieren, die Sequenzen haben, die von den hier offenbarten verschieden sind. Deshalb ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung der bereitgestellten Polynucleotidsequenzen für Grb2 beschränkt, sondern umfasst auch die Verwendung von natür lich vorkommenden Varianten. In Abhängigkeit von der bestimmten Sequenz solcher Varianten können diese zusätzliche Vorteile im Bereich der Zielselektivität, das heißt Vermeidung von unerwünschter Antisense-Inhibierung von verwandten Transkripts, bereitstellen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch chemisch hergestellte Mutanten dieser Sequenzen.
Wie oben angegeben können obwohl die Antisense-Sequenzen genomische DNA-Kopien in voller Länge oder cDNA-Kopien (siehe 4 und 5) oder grolle Fragmente davon sind auch kürzere Fragmente oder „Oligonucleotide" von – wie oben definiert – 50 oder weniger Basen sein. Obwohl kürzere Oligomere (8–20) leichter herzustellen sind und die in vivo Zugänglichkeit erhöhen, sind zahlreiche weitere Faktoren bei der Bestimmung der Spezifität der Basenpaarung beteiligt. So steigen zum Beispiel die Bindungsaffinität als auch die Sequenzspezifität eines Oligonucleotids zu seinem komplementären Ziel mit steigender Länge an. Es wird erwartet, dass Oligonucleotide mit 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Basenpaaren eingesetzt werden. Während die gesamte oder Teile der Gensequenz im Zusammenhang mit der Antisense-Konstruktion verwendet werden können, sollte statistisch jede Sequenz an 17 Paaren nur einmal in dem menschlichen Genom vorkommen und deshalb ausreichen, um eine einzigartige Zielsequenz zu spezifizieren.
In bestimmten Ausführungsformen ist es vielleicht wünschenswert Antisense-Konstrukte, die andere Elemente, wie zum Beispiel solche, die C-5-Pyrimidine beinhalten, einzusetzen. Es wurde gezeigt, dass Oligonucleotide, die C-5-Propin-Analoga von Uridin oder Cytidin enthalten, mit hoher Affinität an RNA binden und potente Antisense-Inhibitoren der Genexpression sind (Wagner et al., 1993).
Als Alternative zur zielgerichteten Antisense-Bereitstellung können zielgerichtete Ribozyme eingesetzt werden. Der Begriff „Ribozym" bezeichnet ein RNA-basiertes Enzym, das in der Lage ist auf bestimmte Basensequenzen der DNA und der RNA zu zielen und zu spalten. Ribozyme können entweder direkt in der Form von RNA-Nucleotiden, die die Ribozymsequenzen enthalten, auf die Zellen zielen oder in die Zelle als ein Expressionsvektor, der die gewünschte ribozymale RNA kodiert, eingeführt werden. Ribozyme können auf sehr ähnliche Weise, wie für Antisense-Polynucleo tide beschrieben, eingesetzt werden. Ribozymsequenzen können auch auf sehr ähnliche Weise, wie für die Antisense-Polynucleotide beschrieben, modifiziert werden. Zum Beispiel können Nicht-Watson-Crick-Basen eingebaut werden oder gemischte RNA/DNA-Oligonucleotide erzeugt werden oder das Phosphodiester-Rückgrat verändert werden oder die 2'-Hydroxy in der Ribosezuckergruppe der RNA modifiziert werden.
Alternativ können die Antisense-Oligonucleotide und -Polynucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung als RNA via Transkription von Expressionskonstrukten, die Nukleinsäuren tragen, die die Oligo- oder Polynucleotide kodieren bereitgestellt werden. In der gesamten Anmeldung umfasst der Begriff „Expressionskonstrukt" jeden Typ an genetischem Konstrukt, der eine Nukleinsäure, die ein Antisense-Produkt kodiert, enthält, in dem Teile oder die gesamte Nukleinsäuresequenz in der Lage ist transkribiert zu werden. Typische Expressionsvektoren umfassen bakterielle Plasmide oder Phagen, wie jede der pUC- oder Bluescript^TM-Plasmid-Serien oder wie im Folgenden weiter diskutiert, virale Vektoren, die für die Verwendung in eukaryotischen Zellen adaptiert sind.
In bevorzugten Ausführungsbeispielen kodiert die Nukleinsäure ein Antisense-Oligonucleotide oder Polynucleotid unter transkriptionaler Kontroller eines Promotors. „Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die von der synthetischen Maschine oder eingeführten Maschine der Zelle erkannt und benötigt wird, um die spezifische Transkription eines Gens zu starten. Der Ausdruck „unter transkriptionaler Kontrolle" bedeutet, dass der Promotor in der korrekten Lokation und Orientierung im Verhältnis zu der Nukleinsäure ist, um die RNA-Polymerase-Initiation zu kontrollieren.
Der Begriff Promotor wird hier verwendet, um eine Gruppe an transkriptionalen Kontrollmodulen, die um den Startort der RNA-Polymerase II geclustert sind, zu bezeichnen. Viel vom Verständnis über die Organisation von Promotoren stammt aus Analysen von einigen viralen Promotoren, einschließlich solcher für die HSV-Thymidin-Kinase (tk) und frühe Transkriptionseinheiten von SV 40. Diese Untersuchungen, erweitert durch aktuellere Arbeit, haben gezeigt, dass Promotoren aus diskreten, funktionalen Modulen zusammengesetzt sind, die jeweils aus ungefähr 7–20 bp an DNA bestehen und eine oder mehr Erkennungsstellen für transkriptionale Aktivatoren oder Repressorproteine enthalten.
Wenigstens ein Modul in jedem Promotor dient dazu, den Startort für die RNA-Synthese zu positionieren. Das am besten bekannte Beispiel davon ist die TATA-Box, aber in einigen Promotoren, denen die TATA-Box fehlt, wie zum Beispiel dem Promotor für das terminate Desoxynucleotidyl-Transferase-Gen in Säugetieren und dem Promotor für die späten SV40-Gene, hilft ein diskretes Element, welches über dem Startort liegt, um die Stelle der Initiation festzulegen.
Zusätzliche Promotorelemente regulieren die Frequenz der transkriptionalen Initiation. Typischerweise sind diese in dem Bereich 30–100 by strangaufwärts vom Startort angeordnet, obwohl kürzlich gezeigt wurde, dass auch eine Vielzahl an Promotoren funktionale Elemente strangabwärts von dem Startort enthalten. Der Abstand zwischen Promotorelementen ist flexibel, so dass die Promotorfunktion konserviert wird, wenn Elemente invertiert oder relativ zueinander bewegt werden. In dem tk-Promotor kann der Abstand zwischen Promotorelementen auf bis zu 50 by erhöht werden, bevor die Aktivität sinkt. In Abhängigkeit vom Promotor scheint es, dass einzelne Elemente entweder kooperativ oder unabhängig fungieren können, um die Transkription zu aktivieren.
Der bestimmte Promotor, der eingesetzt wird, um die Expression einer Nukleinsäure, die das inhibierende Peptid kodiert, zu kontrollieren wird nicht als wichtig angesehen solange er in der Lage ist, das Peptid in der ausgewählten Zelle zu exprimieren. Aus diesem Grund, wenn eine menschliche Zelle ausgewählt ist, ist es bevorzugt, die Nukleinsäure, die das inhibierende Peptid kodiert, benachbart zum oder unter Kontrolle eines Promotors, der in der menschliche Zelle aktiv ist, zu positionieren. Allgemein gesagt kann solch ein Promotor entweder einen menschlichen oder einen viralen Promotor umfassen.
In verschiedenen Ausführungsformen können der unmittelbar frühes Gen-Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (CMV), der unmittelbare Promotor von SV40 und die lange Wiederholung des Rous-Sarcomavirus verwendet werden, um einen hohen Expressionsgrad an verschiedenen Proteinen zu erhalten. Es wird angenom men, dass auch andere virale Promotoren oder zelluläre Promotoren von Säugetieren oder bakterielle Phagepromotoren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, eingesetzt werden können, um eine Expression von Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten, vorausgesetzt, dass der Grad an Expression für einen gegebenen Zweck ausreichend ist.
Durch Einsatz von Promotoren mit gut bekannten Eigenschaften, kann der Grad und das Muster der Expression von Antisense-Oligonucleotiden oder -Polynucleotiden optimiert werden. Weiterhin kann die Auswahl eines Promotors, der als Antwort auf spezifische pathologische Signale reguliert wird, eine induzierbare Expression eines inhibierenden Proteins ermöglichen. Eine Nukleinsäure zum Beispiel, die unter Kontrolle des menschlichen PAI-I Promotors ist, führt zu einer Expression, die durch den Tumor-Nekrose-Faktor induzierbar ist. Tabelle 2 und 3 geben einige Elemente/Promotoren an, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, um die Expression des Antisense-Konstrukts zu regulieren. Diese Liste ist nicht gedacht erschöpfend für alle möglichen Elemente, die an der Promotion der Expression beteiligt sind, zu sein, sondern ist lediglich beispielhaft dafür.
Enhancer wurden ursprünglich als genetische Elemente, die die Transkription von einem Promotor, der an einer entfernten Position auf demselben DNA-Molekül angeordnet ist, zu verstärken, entdeckt. Für diese Fähigkeit über eine große Entfernung zu agieren, gab es in den klassischen Studien zur prokaryotischen transkriptionalen Regulation nur wenige Beispiele. Anschließende Arbeit zeigte, dass Bereiche der DNA mit Enhancer-Aktivität sehr ähnlich wie Promotoren organisiert sind. Das heißt, dass sie aus vielen verschiedenen Elementen, von denen jedes an ein oder mehr transkriptionale Proteine bindet, bestehen.
Die Grundunterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren ist operativ. Ein Enhancer-Bereich als Ganzes muss in der Lage sein, Transkription aus der Ferne zu stimulieren, wobei diese Notwendigkeit nicht für einen Promotorbereich oder seine Elementbestandteile gilt. Auf der anderen Seite muss ein Promotor ein oder mehr Elemente besitzen, die direkt die RNA-Synthese an einer bestimmten Stelle und in einer bestimmten Orientierung initiieren, während Enhancern diese Spezifitäten feh len. Promotoren und Enhancer überlappen oft und grenzen aneinander. Oft scheint es, dass sie eine sehr ähnliche modulare Organisation haben.
Im Folgenden findet sich eine Liste an viralen Promotoren, zellulären Promotoren/Enhancern und induzierbaren Promotoren/Enhancern, die in Kombination mit der Nukleinsäure, die ein NF-IL6 inhibierendes Peptid in einem Expressionskonstrukt (Tabelle 1 und Tabelle 2) kodiert, verwendet werden können. Zusätzlich kann auch jede Promotor/Enhancer-Kombination (wie aus der Eukaryotischen Promotor Datenbank EPDB) verwendet werden, um die Expression einer Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung anzutreiben. Der Einsatz eines T3-, T7- oder SP6-zytoplasmischen Expressionssystems ist eine andere mögliche Ausführungsform. Eukaryotische Zellen können die zytoplasmische Transkription von bestimmten bakteriellen Promotoren unterstützen falls die geeignete bakterielle Polymerase entweder als Teil des Geburtskomplexes oder als ein zusätzliches genetisches Expressionskonstrukt bereitgestellt wird. TABELLE 1

TABELLE 2
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann die Geburt einer Nukleinsäure in einer Zelle in vivo oder in vivo durch Einfügen eines Markers in das Expressionskonstrukt identifiziert werden. Der Marker würde zu einer identifizierbaren Veränderung der transfizierten Zelle führen, die eine schnelle Identifikation der Expression erlaubt. Enzyme wie beispielsweise Herpes-Simplex-Virus-Thymidin-Kinase (tk) (eu karyotisch) oder Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) (prokaryotisch), können eingesetzt werden.
Es kann auch ein Polyadenylationssignal eingefügt werden, um eine ordnungsgemäße Polyadenylierung des Transkripts zu bewirken. Von der Natur des Polyadenylationssignal wird nicht angenommen, dass sie entscheidend für die erfolgreiche Durchführung der Erfindung ist und jede solche Sequenz kann verwendet werden. Das SV40, β-Globin oder Adenovirus-Polyadenylationssignal können eingesetzt werden. Es wird auch angenommen, dass ein Element der Expressionskassette ein Terminator ist. Diese Elemente können auch dazu dienen, Nachrichtenniveaus zu verstärken und Überlesen der Cassette in andere Sequenzen zu minimieren.
C. Liposomale Formulierungen
In der Erfindung sind die Antisense-Oligonucleotide oder -Polynucleotide und die Expressionsvektoren in einem Liposom eingeschlossen. Liposomen sind vesikuläre Strukturen, die durch eine Phospholipid-Doppelmembran und ein inneres wässriges Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen haben mehrere Lipidschichten, die durch wässriges Medium getrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Überschuss an wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidbestandteile durchlaufen vor der Bildung geschlossener Strukturen eine Neuanordnung und schließen Wasser und aufgelöste lösliche Stoffe zwischen den Lipidschichten ein (Ghosh und Bachhawat, 1991). In Betracht gezogen werden auch Lipofectam-Nukleinsäure-Komplexe.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können Komplexe aus Liposom und einem Hämaglutininvirus (HVJ) gebildet werden. Es wurde gezeigt, dass die Fusion mit der Zellmembran damit erleichtert und das Eintreten von in Liposomen verkapselter DNA in die Zelle gefördert wird (Kaneda et al., 1989). In anderen Ausführungsformen kann das Liposom komplexiert oder in Verbindung mit nukleären chromosomalen Nicht-Histonproteinen (HMG-1) verwendet werden (Kato et al., 1991). In weiteren Ausführungsformen kann das Liposom komplexiert oder in Verbindung mit HVJ und HMG-1 verwendet werden. Insofern, als solche Expressionskonstrukte erfolgreich beim Transfer und der Expression von Nukleinsäuren in vivo und in vivo eingesetzt worden sind, sind sie für die vorliegende Erfindung geeignet. Wenn in dem DNA- Konstrukt ein bakterieller Promotor verwendet wird, ist es außerdem wünschenswert, eine geeignete bakterielle Polymerase in das Liposom aufzunehmen. Liposomen-vermittelte Polynucleotidbereitstellung und Expression von fremder DNA in vivo ist sehr erfolgreich gewesen. Wong et al. (1980) haben die Durchführbarkeit der Liposomen-vermittelten Bereitstellung und Expression fremder DNA in kultivierten Hühnerembyonal-, HeLa- und Hepatom-Zellen gezeigt. Nicolau et al. (1987) gelang erfolgreich ein Liposomen-vermittelter Gentransfer in Ratten nach einer intravenösen Injektion.
„Liposom" ist ein allgemeiner Begriff, der eine Vielzahl an einfach und multilamellare Vehikel, die durch die Erzeugung von geschlossenen Lipiddoppelschichten gebildet werden, umfasst. Phospholipide werden zur Herstellung der Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt und sind neutral. Direktphosphat kann verwendet werden, um den Liposomen eine negative Ladung zu verleihen und Stearylamin kann eingesetzt werden, um den Liposomen eine positive Ladung zu verleihen.
Lipide, die für den Einsatz gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können aus kommerziellen Quellen erhalten werden. Zum Beispiel kann Dimyristylphosphatidylcholin („DMPC") von Sigma Chemical Co. bezogen werden und andere Lipide können von Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.) erhalten werden. Stammlösungen von Lipiden in Chloroform, Chloroform/Methanol oder t-Butanol können bei ungefähr –20 °C gelagert werden. Vorzugsweise wird Chloroform als einziges Lösungsmittel verwendet, da es leichter verdampft als Methanol.
Phospholipide von natürlichen Quellen, wie Ei- oder Sojabohnenphosphatidylcholin, Hirnphosphatidsäure, Hirn- oder Pflanzenphosphatidylinositol, Herzkardiolipinund Pflanzen- oder bakterielles Phosphatidylethanolamin werden aufgrund der Instabilität und Undichtigkeit der erhaltenen Liposomen vorzugsweise nicht als primäres Phophatid, dass heißt 50 % oder mehr der gesamten Phosphatidzusammensetzung darstellend, verwendet.
Liposomen, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können mittels verschiedener Verfahren hergestellt werden. Die Größe der Liposomen variiert in Abhängigkeit des Syntheseverfahrens. Ein Liposom, welches in einer wässrigen Lösung suspendiert ist, weist im Allgemeinen die Form eines sphärischen Vesikels mit einem oder mehr konzentrischen Ringen an Lipid-Doppelschichtmolekülen auf. Jede Schicht besteht aus einer parallelen Anordnung von Molekülen, die durch die Formel XY dargestellt ist, wobei X eine hydrophile Gruppe und Y eine hydrophobe Gruppe ist. In einer wässrigen Suspension sind die konzentrischen Schichten derart angeordnet, dass die hydrophilen Gruppen dazu neigen mit der wässrigen Phasen in Kontakt zu stehen und die hydrophoben Regionen dazu neigen selbst zu assoziieren. Wenn zum Beispiel wässrigen Phasen innerhalb des bzw. ohne Liposom(s) vorhanden sind, werden die Lipidmoleküle eine Doppelschicht, bekannt als Lamelle, mit der Anordnung XY-YX ausbilden.
Liposomen im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung können in Übereinstimmung mit bekannten Labortechniken hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Liposomen mittels Mischen von liposomalen Lipiden in einem Lösungsmittel in einem Gefäß, beispielsweise einem birnenförmigen Glaskolben, hergestellt. Das Gefäß sollte ein zehn Mal größeres Volumen als das Volumen der erwarteten Liposomensuspension aufweisen. Durch Einsatz eines Rotationsverdampfers wird das Lösungsmittel bei ungefähr 40 °C bei Unterdruck entfernt. Das Lösungsmittel wird üblicherweise in Abhängigkeit des gewünschten Volumens der Liposomen innerhalb von ungefähr 5 Minuten bis 2 Stunden entfernt. Die Zusammensetzung kann dann in einem Exsikkator im Vakuum weiter getrocknet werden. Die getrockneten Lipide werden im Allgemeinen aufgrund ihrer Tendenz sich mit der Zeit zu zersetzen nach ungefähr einer Woche verworfen.
Getrocknete Lipide können bei ungefähr 25–50 mM Phospholipid in sterilem, pyrogen-freiem Wasser durch Schütteln bis der gesamte Lipidfilm wieder suspendiert ist, hydratisiert werden. Die wässrigen Liposomen können dann in Aliquots getrennt, jeweils in eine Ampulle platziert, gefriergetrocknet und im Vakuum versiegelt werden.
Bei der Alternative können Liposomen in Übereinstimmung mit anderen bekannten Laborprozeduren hergestellt werden: das Verfahren von Bangham et al.(1965) auf dessen Inhalt hiermit Bezug genommen wird; das Verfahren von Gregoriadis wie es in DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis ed. (1979) S. 287–341 beschrieben ist; das Verfahren von Deamer und Ustet (1983) und die Umkehrphasen-Abdampfungsverfahren wie sie von Szoka und Papahadjopoulos (1978) beschrieben wurden. Die oben genannten Verfahren unterscheiden sich jeweils bezüglich des Einkapselns von wässrigem Material und bezüglich ihrer Raum-zu-Lipid-Verhältnisse.
Die getrockneten Lipide oder gefriergetrockneten Liposomen, die wie oben hergestellt wurden, können in einer Lösung aus Nukleinsäure wiederhergestellt und mit einem geeigneten Lösungsmittel wie zum Beispiel DPBS auf eine geeignete Konzentration verdünnt werden. Die Mischung wird dann kräftig in einem Wirbelmischer geschüttelt. Nicht eingekapselte Nukleinsäure wird mittels Zentrifugation bei 29.000 × g entfernt und die liposomalen Pellets werden gewaschen. Die gewaschenen Liposomen werden bei einer geeigneten Gesamtkonzentration an Phospholipid, zum Beispiel 50–200 mM, wieder suspendiert. Die Menge an eingekapselter Nukleinsäure kann gemäß bekannten Standardverfahren bestimmt werden. Nach der Bestimmung der Menge an Nukleinsäure, die in dem Liposomenpräparat eingekapselt ist, können die Liposomen auf eine geeignete Konzentration verdünnt und bei 4 °C bis zur Verwendung gelagert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Lipid Dioleylphosphatidylcholin eingesetzt. Nuclease-resistente Oligonucleotide wurden mit den Lipiden in der Gegenwart eines Überschusses t-Butanol gemischt. Die Mischung wurde durchwirbelt bevor sie in einem Aceton/Trockeneisbad gefroren wurde. Die gefrorene Mischung wurde gefriergetrocknet und mit Hepes-gepufferter Kochsalzlösung (1 mM Hepes, 10 mM NaCl, pH 7,5) über Nacht hydratisiert und dann wurden die Liposomen in einem Schallbad für 10 bis 15 Minuten beschallt. Die Größe der liposomalen Oligonucleotide variierte typischerweise zwischen 200–300 nm im Durchmesser, die mittels des Submicron-Partikelgrößenmeßgeräts Autodilute Modell 370 (Nicomp, Santa Barbara, CA) bestimmt wurde
D. Alternative freisetzende Systeme
Retroviren. Die Retroviren sind eine Gruppe von RNA- Einzelstrang-Viren, die sich durch eine Fähigkeit der Konvertierung ihrer RNA zu doppelsträngiger DNA in infi zierten Zellen durch einen Vorgang der reversen Transkription auszeichnen (Coffin, 1990). Die resultierende DNA integriert sich danach als Provirus stabil in die zellulären Chromosomen und steuert die Synthese viraler Proteine. Die Integration resultiert in der Beibehaltung der viralen Gensequenzen in der Empfängerzelle und deren Nachkommen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene, gag, pol und env, die für Kapsidproteine, Polymeraseenzym und Hüllbestandteile kodieren. Eine Sequenz, die sich stromaufwärts (upstream) vom gag-Gen befindet, enthält ein Signal für die Verpackung des Genoms in Virionen. An den 5'- und 3'- Enden des viralen Genoms befinden sich zwei lange terminale Repeat (LTR)- Sequenzen. Diese enthalten starke Promotor- und Enhancersequenzen und werden auch für die Integration in das Wirtszellgenom benötigt (Coffin, 1990).
Zur Konstruktion eines retroviralen Vektors wird eine Nukleinsäure, die ein Grb2- oder Crkl-Antisense-Konstrukt kodiert, in das virale Genom an die Stelle bestimmter viraler Sequenzen eingesetzt, um ein replikationsdefektes Virus herzustellen. Für die Produktion von Virionen wird eine Verpackungszelllinie konstruiert, die gag-, pol- und env-Gene, aber keine LTR-Sequenz und ✈ Bestandteile aufweist (Mann et al., 1983). Wenn ein rekombinantes Plasmid, das eine eingefügte DNA enthält, zusammen mit der retroviralen LRT-Sequenz und ✈ Sequenzen in diese Zelllinie eingeführt wird (durch Kalziumphosphatpräzipitation beispielsweise), erlaubt die ✈ Sequenz, dass das RNA-Transkript des rekombinanten Plasmids in virale Partikel verpackt wird, die dann in das Kulturmedium sezerniert werden (Nicolas und Rubenstein, 1988; Temin, 1986, Mann et al., 1983). Das Medium, das die rekombinanten Retroviren enthält, wird dann aufgefangen, wahlweise eingeengt und für den Gentransfer verwendet. Retrovirale Vektoren können sehr viele verschiedene Zelltypen infizieren. Integration und stabile Expression erfordert jedoch die Teilung von Wirtszellen (Paskind et al., 1975).
Adenoviren: Menschliche Adenoviren sind Doppelstrang-DNA-Tumorviren mit genomischen Längen von ungefähr 36 kB (Tooze, 1981). Als ein Modellsystem für die eukaryotische Genexpression sind Adenoviren intensiv untersucht und gut charakterisiert worden, was sie zu einem attraktiven System für die Entwicklung von Adenoviren als ein Gentransfersystem macht. Diese Gruppe an Viren ist einfach zu züchten und zu manipulieren und weist in vivo und in vivo einen breiten Wirtsbereich auf. In lytisch-infizierten Zellen sind Adenoviren in der Lage, die Wirtproteinsynthese abzustellen, die zellularen Mechanismen dazu zu führen hohe Mengen an viralen Proteinen zu synthetisieren und reichliche Mengen an Virus zu produzieren.
Die E1-Region (E1A und E1B) kodiert Proteine, die für die Regulierung der Transkription des viralen Genoms und einiger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die Expression der E2-Region, einschließlich E2A und E2B, ermöglicht die Synthese von viralen, replikativen Funktionen, wie zum Beispiel DNA-bindendes Protein, DNA-Polymerase und ein terminales Protein, dass die Replikation verlängert. E3-Genprodukte verhindern die Zytolyse durch zytologische T-Zellen sowie Tumor-Nekrose-Faktor und scheinen wichtig für die vitale Propagation zu sein. Funktionen, die mit den E4-Proteinen zusammenhängen, umfassen DNA-Replikation, Spätes-Gen-Expression und das Abschalten von Wirtszellen. Die spätes-Gen-Produkte umfassen die meisten der Virion-Kapsidproteine und diese werden nur exprimiert, nachdem der Hauptteil der Verarbeitung eines einfachen, primären Transkripts durch den späten Hauptpromotor erfolgt ist. Der späte Hauptpromotor (major late promotor, MLP) zeigt eine hohe Effizienz während der späten Phase der Infektion (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991).
Da es scheint, dass nur eine kleine Menge des viralen Genoms in cis benötigt wird (Tooze, 1981) bieten von Adenoviren-abgeleitete Vektoren eine exzellentes Potential für den Ersatz von großen DNA-Fragmenten, wenn sie in Kombination mit Zelllinien wie zum Beispiel 293 Zellen eingesetzt werden. Ad5-transformierte menschliche embyonische Nieren-Zelllinien (Graham, et al., 1977) sind entwickelt worden, um die essentiellen viralen Proteine in trans bereitzustellen.
Besondere Vorteile von einem Adenovirussystem zur Bereitstellung von fremden Proteinen an eine Zelle umfassen (i) die Fähigkeit relativ große Teile von vitaler DNA durch fremde DNA zu ersetzen; (ii) die strukturelle Stabilität von rekombinanten Adenoviren; (iii) die Sicherheit der adenoviralen Verabreichung an Menschen; und (iv) das Fehlen von jeglichen Assoziationen von adenoviralen Infektionen mit Krebs oder Malignitäten; (v) die Fähigkeit hohe Titer von einem rekombinanten Virus zu erhalten und (vi) die hohe Infektiösität des Adenovirus.
Weitere Vorteile von Adenovirusvektoren gegenüber Retroviren beinhalten die höheren Grade der Genexpression. Zusätzlich ist die Adenovirusreplikation anders als die retroviralen Sequenzen unabhängig von der Wirtsgenreplikation. Da die Adenovirustransformierenden Gene in der E1-Region einfach gelöscht werden können und immer noch effiziente Expressionsvektoren bereitstellen, wird angenommen, dass das onkogene Risiko von Adenovirus-Vektoren vernachlässigbar ist (Grunhaus & Horwitz, 1992).
Im Allgemeinen basieren Adenovirusgen-Transfersysteme auf rekombinantem, hergestellten Adenovirus, der durch Deletion eines Bereichs seines Genoms, wie zum Beispiel E1, Replikations-unfähig gemacht wurde, aber immer noch seine Bereitschaft für Infektionen behalten hat. Sequenzen, die relativ große, fremde Proteine kodieren, können exprimiert werden, wenn zusätzliche Deletionen in dem Adenovirusgenom vorgenommen werden. Zum Beispiel ist ein Adenovirus, der in der E1- und der E3-Region deletiert wurde, in der Lage bis zu 10 kB an fremder DNA zu tragen und kann als hoher Titer in 293 Zellen gezüchtet werden (Strafford-Perricaudet und Perricaudet, 1991). Eine überraschend persistente Expression von Transgenen, die der adenoviralen Infektion folgt, wurde auch berichtet.
Andere virale Vektoren als Expressionskonstrukte. Andere virale Vektoren können als Expressionskonstrukte in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Vektoren, die sich von Viren wie das Pockenvirus (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988) das Adeno-assoziierte Virus (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Hermonat und Muzycska, 1984) und Herpesviren können eingesetzt werden. Diese bieten einige attraktive Merkmale für verschiedene Säugetierzellen (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Balchwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
Mit der kürzlichen Entdeckung von defekten Hepatitis-B-Viren wurden neue Einsichten in das Struktur-Funktions-Verhältnis von verschiedenen viralen Sequenzen gewonnen. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass der Virus die Fähigkeit zum Helferabhängigen Verpacken und zur reversen Transkription behält, obwohl bis zu 80 % seines Genoms deletiert wurden (Horwich et al.,1990). Dies lässt vermuten, dass große Bereiche des Genoms durch fremdes genetisches Material ersetzt werden können.
Der Hepatropismus und die Persistenz (Integration) waren insbesondere attraktive Eigenschaften für einen auf die Leber gerichteten Gentransfer. Chang et al. fügten kürzlich das ChloramphenicolAcetyltransferase(CAT)-Gen in Hepatitis-B-Virusgenome von Enten anstelle der Polymerase-, Oberflächen- und Voroberflächen-kodierenden Sequenzen ein. Dies wurde mit dem Wildtyp-Virus in eine vom Vogel stammende Zelllinie co-transfiziert. Kulturmedien, enthaltend hohe Titer des rekombinanten Virus, wurden verwendet, um primäre Leberzellen von Enten zu infizieren. Eine stabile CAT-Genexpression wurde für mindestens 24 Tage nach der Transfektion detektiert (Chang et al., 1991).
Nicht-virale Verfahren. Es werden auch einige nicht-virale Verfahren für den Transfer von Expressionskonstrukten in kultivierte Säugetierzellen in Betracht gezogen. Dazu gehören Kalziumphosphatpräzipitation (Graham und Van Der Eb, 1973; Chen und Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-Dextran (Gopal, 1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), direkte Mikroinjektion (Harland und Weintraub, 1985), DNA-beladene Liposomen (Nicolau und Sene, 1982; Fraley et al., 1979) und Lipofectamin-DNA-Komplexe, Zellsonifikation (Fechheimer et al., 1987), Genbeschuss mit Hochgeschwindigkeits&divo;Mikroprojektilen (Yang et al., 1990) und rezeptorvermittelte Transfektion (Wu und Wu, 1987; Wu und Wu, 1988). Einige dieser Techniken könnten erfolgreich für die Verwendung in vivo oder ex vivo adaptiert werden.
In einer Offenbarung kann das Expressionskonstrukt einfach aus nackter rekombinanter DNA oder nackten rekombinanten Plasmiden bestehen. Der Transfer des Konstruktes kann durch jedes beliebige der oben erwähnten Verfahren erfolgen, das die Zellmembran physikalisch oder chemisch durchlässig macht. Dies eignet sich vor allem für den Transfer in vivo, lässt sich aber auch für den Gebrauch in vivo verwenden. Dubensky et al., (1984) injizierten Polyomvirus-DNA in Form von Kalziumphosphatpräzipitaten erfolgreich in Leber und Milz adulter und neugeborener Mäuse, wobei aktive virale Replikation und akute Infektion gezeigt wurden. Benvenisty und Neshif (1986) zeigten auch, dass eine direkte intraperitoneale Injektion von Kalziumphosphat-präzipitierten Plasmiden zu einer Expression der transfizierten Gene führt. Es könnte sein, dass DNA, die ein Gen von Interesse kodiert, auf ähnliche Weise in vivo übertragen werden kann und das Genprodukt exprimiert.
Eine weitere Offenbarung zur Übertragung eines Expressionskonstruktes aus nackter DNA in Zellen kann Teilchenbeschuss umfassen. Dieses Verfahren beruht auf der Möglichkeit, DNA-beschichtete Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, wodurch sie die Zellmembran durchdringen und in die Zellen hinein gelangen können, ohne sie zu töten (Klein et al., 1987). Es sind mehrere Vorrichtungen zum Beschleunigen kleiner Teilchen entwickelt worden. Eine solche Vorrichtung basiert auf einer Hochspannungsentladung zur Erzeugung eines elektrischen Flusses, der wiederum die Antriebskraft liefert (Yang et al., 1990). Die verwendeten Mikroprojektile bestanden aus biologisch inerten Substanzen wie beispielsweise Wolfram- oder Goldkügelchen.
Es sind ausgewählte Organe, einschließlich Leber, Haut und Muskelgewebe von Ratten und Mäusen in vivo bombardiert worden (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Dies kann die chirurgische Freilegung des Gewebes oder der Zellen erforderlich machen, um jedes Gewebe, das zwischen der Pistole und dem Zielorgan liegt, zu beseitigen, d. h. eine ex vivo-Behandlung. Auch eine DNA, die ein Grb2- oder Crkl-Konstrukt kodiert, kann durch dieses Verfahren eingeführt werden.
E. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Wege der Verabreichung
Wo eine klinische Anwendung von Liposomen, enthaltend Antisense-Oligonucleotide oder -Polynucleotide oder Expressionsvektoren unternommen wird, wird es notwendig sein, den Liposomenkomplex als eine pharmazeutische Zusammensetzung, die für die gedachte Anwendung geeignet ist, herzustellen. Im Allgemeinen wird dies die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die im Wesentlich frei von Pyrogenen genauso wie anderen Verunreinigungen, die schädlich für Menschen oder Tiere sein können, ist zur Folge haben. Es wird im Allgemeinen gewünscht sein, geeignete Puffer einzusetzen, um den Komplex stabil und bereit für die Aufnahme durch die Zielzellen zu machen. Wässrige Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine effektive Menge an Antisense-Expressionsvektor, der in ein Liposom wie oben beschrieben verkapselt ist, weiter in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder wässrigen Medium. Solche Zusammensetzungen werden auch als Inokula bezeichnet. Die Ausdrücke „pharmazeutisch oder pharmakologisch verträglich" beziehen sich auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die keine nachteilige, allergische oder anderweitig unpassende Reaktionen hervorrufen, wenn sie einem Tier oder einem Menschen als geeignet verabreicht werden.
Wie hierin verwendet, umfasst ein „pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes beliebige Lösungsmittel, Dispersionsmedium, Umhüllung, antibakterielle und antimykotische Wirkstoffe, isotonische und absorptionsverzögernde Wirkstoffe und Ähnliches. Die Verwendung solcher Medien und Wirkstoffe für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Fachwelt wohlbekannt. Außer im Fall, dass irgendein konventionelles Medium oder konventioneller Wirkstoff mit den aktiven Inhaltsstoffen unverträglich ist, wird ihre Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in Erwägung gezogen. Ergänzende aktive Inhaltsstoffe, beispielsweise andere anti-diabetische Wirkstoffe, können ebenfalls in die Zusammensetzungen aufgenommen werden.
Lösungen der aktiven Verbindungen als freie Base oder pharmakologisch verträgliche Salze können in Wasser zubereitet werden, wenn sie auf geeignete Weise mit einem oberflächenaktiven Stoff wie Hydroxypropylcellulose gemischt werden. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen und Gemischen davon sowie in Ölen zubereitet werden. Unter üblichen Lager- und Verwendungsbedingungen entfalten diese Zubereitungen einen Konservierungsstoff, so dass das Wachstum von Mikroorganismen verhindert wird.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden vorteilhaft in Form von injizierbaren Zusammensetzungen entweder als flüssige Lösungen oder Suspension hergestellt. Sie können auch als feste Formen, die geeignet sind für die Auflösung oder Suspendierung in Flüssigkeit vor der Injektion hergestellt werden. Diese Präparationen können auch emulgiert sein. Eine typische Zusammensetzung für solch einen Zweck enthält einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung 10 mg, 25 mg, 50 mg oder bis zu 100 mg an menschlichem Humanserumalbumin pro Milliliter an Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung enthalten. Andere pharmazeutisch akzeptable Träger umfassen wässrige Lösungen, nicht-toxische Excipienten, einschließlich Salze, Konservierungsmittel, Puffer und ähnliches.
Beispiele an nicht-wässrigen Lösungsmitteln umfassen Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Kochsalz-Lösungen, parenterale Vehikel wie zum Beispiel Natriumchlorid, Ringers Dextrose, etc.. Intravenöse Vehikel umfassen Fluid und Nährnachfülllösung. Konservierungsmittel umfassen antimikrobielle Mittel, Antioxidantien, Chelatisierungsmittel und inerte Gase. Der pH und die exakte Konzentration der verschiedenen Komponenten der pharmazeutischen Zusammensetzung werden gemäß den bekannten Parametern eingestellt.
Zusätzliche Formulierungen sind geeignet für die orale Verabreichung. Orale Formulierungen umfassen so typische Excipienten wie zum Beispiel pharmazeutische Qualitätsgrade an Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und ähnliches. Die Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit anhaltender Freisetzung oder Puder, an. Wenn die Route topisch ist, kann die Form eine Creme, Salbe oder Spray sein.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können klassische pharmazeutische Präparationen enthalten. Die Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt über eine allgemeine Route, solange das Zielgewebe über diese Route erreichbar ist. Dies schließt orale, nasale, bukkale, rektale, vaginale oder topische ein. Topische Verabreichung wäre insbesondere vorteilhaft für die Behandlung von Hautkrebsen, um Chemotherapie-induzierte Alopezie oder andere dermale hyperproliferate Störungen zu vermeiden.
Alternativ kann die Verabreichung eine orthotope, interdermal-subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion sein. Solche Zusammensetzungen würden normalerweise als pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzungen, die einen physiologisch akzeptablen Träger, Puffer oder andere Excipienten beinhalten, verabreicht werden. Zur Behandlung von Zuständen der Lunge ist die bevorzugte Route die Bereitstellung eines Aerosols in der Lunge. Das Volumen des Aerosols liegt zwischen ungefähr 0,01 ml und 0,5 ml. Gleichzeitig wäre ein bevorzugtes Ver fahren zur Behandlung von Darm-assoziierten Krankheiten ein Klistier. Das Volumen des Klistiers liegt zwischen ungefähr 1 ml und 100 ml.
Eine effektive Menge an der therapeutischen Zusammensetzung wird basierend auf dem gewünschten Ziel bestimmt. Der Begriff „Einzeldosis" oder „Dosierung" bezeichnet typischerweise diskrete Einheiten, die für den Einsatz in einer Versuchsperson geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an der pharmazeutischen Formulierung enthält, die berechnet wurde, um die gewünschte Reaktion, wie oben besprochen, im Zusammenhang mit ihrer Verabreichung, dass heißt einschließlich der geeigneten Route und des Behandlungsregimes, zu erzeugen. Die zu verabreichende Menge gemäß der Anzahl der Behandlungen und Einzeldosis hängt von dem gewünschten Schutz ab.
Präzise Mengen an der therapeutischen Zusammensetzung hängen auch von der Beurteilung des praktischen Arztes ab und sind arteigen für jedes Individuum. Faktoren, die die Dosis beeinflussen, umfassen den physischen und klinischen Zustand des Patientens, die Route der Verabreichung, das gewünschte Ziel der Behandlung (Erleichterung der Symptome versus Heilung) und die Potenz, Stabilität und Toxizität der bestimmten, therapeutischen Substanz. Zur sofortigen Anwendung wird sich vorgestellt, dass die Menge an therapeutischer Zusammensetzung bei einer Einzeldosis von ungefähr 5–30 mg an Polynucleotid variiert.
F. Klinische Protokolle
Typischerweise sind Patienten, die Kandidaten für eine Behandlung sind, solche in der chronischen Phase von CML. Bei ungefähr 7.000 neuen Patienten pro Jahr wird CML diagnostiziert und die mittlere Dauer der chronischen Phase der Krankheit beträgt fünf Jahre. Der typische Verlauf der Behandlung wird in acht Wochen-Zyklen sein, obwohl eine längere Dauer verwendet werden kann, falls keine nachteiligen Effekte bei dem Patient beobachtet werden. Kürzere Behandlungszeiten können notwendig werden, wenn der Patient die Behandlung nicht wie gehofft verträgt. Jeder Zyklus besteht aus zwischen 20 und 35 individuellen Dosen im regelmäßigen Abstand, obwohl dies in Abhängigkeit der klinischen Situation variiert werden kann.
G. Beispiele
BEISPIEL 1: Synthese von Oligonucleotiden
Nuclease-resistente p-Ethoxyoligonucleotide wurden von Oligos Tec. (Wilsonville, OR) bezogen. Die Länge der Oligonucleotide variierte zwischen 16 und 18 Basen. Die Sequenzen der Oligonucleotide, von 5' bis 3', waren wie folgt:

1. Antisense-Oligonucleotid, das auf die Translationsiniitierungsstelle von Grb2 zielt: ATATTTGGCGATGGCTTC
2. Antisense-Oligonucleotid, das auf die Translationsiniitierungsstelle von Crkl zielt: GTCGAACCGGCGGAGGA
3. Kontroll-Oligos: GAAGGGCTTCTGCGTC

BEISPIEL 2: Liposomenbildung
Das Lipid, Dioleoylphosphatidylcholin, wurde von Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster AL) bezogen. Nuclease-resistente Oligonucleotide wurden mit den Lipiden in Gegenwart eines Überschusses an t-Butanol gemischt. Die Mischung wurde durchgewirbelt bevor sie in einem Aceton/Trockeneis-Bad gefroren wurde. Die gefrorene Mischung wurde gefriergetrocknet und mit einer Hepes-gepufferten Kochsalzlösung (1 mM Hepes, 10 mM NaCl, pH 7,5) über Nacht hydratisiert. Dann wurden die Liposomen in einem Schallbad 10 bis 15 Min beschallt. Die Größe der liposomalen Oligonucleotide variierte typischerweise zwischen 200–300 nm im Durchmesser, der mittels eines Submicron-Partikelgrößenmeßgerät Autodilute Modell 370 (Nicomp, Santa Barbara, CA) bestimmt wurde.
BEISPIEL 3: Oligonucleotid-Inhibierung der Zellproliferation (Grb2).
Die CML-Zelllinien BV173 und K562 wurden eingesetzt, um die Fähigkeit von Oligonucleotiden das Zellwachstum zu inhibieren zu testen. Diese Zelllinien wurden ursprünglich von menschlichen CML- Patienten in der Seuchenkrise erhalten. Beide Zelllinien exprimieren das p210 ^Bcr-AblFusionsprotein. HL60 Zellen, welche ursprünglich von einem menschlichen promyelozytischen Patienten erhalten wurden, wurden als eine Kontrolle verwendet, da diese Zellen kein bcr-abl produzieren und ihre Proliferation unabhängig von dem Ras-Signaling-Weg ist.
Fünftausend K562-Zellen, zehntausend BV173-Zellen oder zehntausend HL60-Zellen in 0,1 ml RPMI 1640 Medium, welches 10 % fötales Kalbsserum enthielt, wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen pro Vertiefung plattiert. Nach 2 Stunden des Plattierens wurde eine Endkonzentration an 0–10 μM liposomalen Oligonucleotide zu diesen Zellen gegeben. Die Zellen wurden mit den liposomalen Oligonucleotiden für 3 Tage inkubiert. Die Wirkungen der liposomalen Oligonucleotide auf die Proliferation der leukämischen Zellen wurde mit Hilfe des alamarBlue (Alamar, Sacramento, CA) Assay getestet.
AlamarBlue ist ein Oxidation/Reduktions-Indikatorfarbstoff, bei dem das Absorptionsvermögen von der zellularen metabolischen Reduktion abhängt. Aus diesem Grund ist er ein Maß für die Zellanzahl und die metabolischen Aktivität der Zellen. Nach der Inkubation mit liposomalen Oligonucleotiden werden 50 μl aufgeteilte Zellen pro Vertiefung zu 130 μl Medium gegeben. Zwanzig μl almarBlue-Farbstoff wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Nach Inkubation für 6–8 Std. bei 37 °C wurden die Platten direkt auf einem Mikroplattenleser (Molecular Devices, Menlo Park, CA) bei 570 und 595 nm gelesen. Der Unterschied der Absorptionsfähigkeit zwischen 570 und 595 nm wurde als der Gesamtwert der Absorptionsfähigkeit der Leukämiezellen genommen. Die Lebensfähigkeit der Zellen, die mit liposomalen Oligonucleotiden behandelt wurden, wurde mit der von unbehandelten Zellen verglichen.
Liposomale Antisense-Oligonucleotide, die spezifisch für Grb2 sind, können die Proliferation von Leukämiezellen in einer Dosis-abhängigen Weise inhibieren. Wenn Konzentration von 5–7 μM an liposomalen Antisense-Oligonucleotiden, die spezifisch für Grb2 sind, verwendet wurden (1), betrug die Lebensfähigkeit der CML-Zelllinien BV 173 und K562 10–60 % der nicht behandelten Zellen. In anderen Worten 40–90 % Wachstumsinhibierung ist in die CML-Zellen induziert worden. Unter identischen Bedingungen wurde die Zelllebensfähigkeit von HL60-Zellen nicht redu ziert. Tatsächlich wurden die Lebensfähigkeiten von HL60-Zellen solange nicht reduziert bis Konzentrationen von 8–10 μM eingesetzt wurden.
VERGLEICHSBEISPIEL 4: Oligonucleotid-Inhibierung der Zellproliferation (Crkl).
Der Assay wurde wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Liposomale Antisense-Oligonucleotide, die spezifisch für Crkl sind, können die Proliferation von Leukämiezellen in einer Dosis-abhängigen Weise inhibieren. Wenn Konzentration von 5–7 μM an liposomalen Antisense-Oligonucleotiden, die spezifisch für Crkl sind, verwendet wurden (2), betrug die Lebensfähigkeit der BV173-Zellen 10–40 % der nicht behandelten Zellen. Wenn 8–9 μM an liposomalen Antisense-Oligonucleotiden eingesetzt wurden, betrug die Lebensfähigkeit von K562-Zellen 10–40 % der nicht behandelten Zellen. Die Zelllebensfähigkeiten von HL60-Zellen wurden nicht auf 40 % reduziert außer wenn Konzentrationen von 10 μM an liposomalen Antisense-Oligonucleotiden eingesetzt wurden.
BEISPIEL 5: Oligonucleotid-Inhibierung der Zellproliferation (Kontrolle)
Liposomale Kontrolloligonucleotide, die nicht an Grb2- oder Crkl-Sequenzen hybridisieren inhibieren außer bei hohen Konzentrationen die Proliferation von CML-Zellen nicht. Die Lebensfähigkeit von BV173-Zellen wird um 50 % reduziert, wenn 8 μM oder höhere Konzentrationen an liposomalen Kontrolloligonucleotiden eingesetzt werden. Die Lebensfähigkeit von K562- und HL60-Zellen wurde nicht reduziert außer bei 10 μM Konzentration.
H. Literaturverzeichnis
Die folgenden Verweise stellen exemplarisch prozesstechnische oder andere Details zusätzlich zu den bereits angegebenen bereit:

Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes, " In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, S. 117–148, 1986.
Bangham et al., J. Mol. Biol.13:238–52 (1965).
Bedi et al.,"Inhibition of apoptosis by Bcr-Abl in chronic myeloid leukemia," Blood 83:2038–2044, 1994.
Benvenisty and Neshif, "Direction introduction of genes into rats and expression of the genes," Proc. Natl. Acad Sci. USA, 83:9551–9555, 1986.
Boussif et al.,1995.
Chang et al.,"Foreign gene delivery and expression in hepatocytes using a hepatitis B virus vector," Hepatology,14:134A, 1991.
Chen and Okayama, "High-efficiency transfection of mammalian cells by plasmid DNA," Mol. Cell Biol., 7:2745–2752, 1987.
Coffin, "Retroviridae and their replication," In: Virology, Fields et al.(eds.), New York: Raven Press, S. 1437–1500, 1990.
Coupar et al.,"A general method for the construction of recombinant vaccinia virus expressing multiple foreign genes," Gene, 68:1–10, 1988.
Deamer and Uster, 1983.
Dubensky et al.,"Direct transfection of viral and plasmid DNA into the liver or spleen of mice," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7529–7533, 1984.
Fechheimer et al., "Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading," Proc. Nat'l Acad Sci. USA,84:8463–8467, 1987.
Fraley et al.,"Entrapment of a bacterial plasmid in phospholipid vesicles: Potential for gene transfer," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76:3348–3352, 1979.
Friedmann, "Progress toward human gene therapy," Science, 244:1275–1281, 1989.
Ghosh and Bachhawat, "Targeting of liposomes to hepatocytes," In:Wu G, Wu C ed., Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, New York: Marcel Dekker, S. 87–104, 1991.
Gopal, "Gene transfer method for transient gene expression, stable transfection, and cotransfection of suspension cell cultures," Mol. Cell Biol.,5:1188–1190, 1985.
Graham and van der Eb, "A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA", Virology,52:456–467, 1973.
Graham et al.,"Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5", J. Gen. Virol., 36:59–72, 1977.
Gregoriadis, Drug Carriers In Biology And Medicine,G. Gregoriadis ed. (1979). Grunhaus and Horwitz, "Adenovirus as cloning vector," Seminar in Virology, 3:237–252, 1992.
Harland and Weintraub, "Translation of mammalian mRNA injected into Xenopus oocytes is specifically inhibited by antisense RNA," J. Cell Biol., 101:1094–1099, 1985. Hermonat and Muzycska, "Use of adenoassociated virus as a mammalian DNA cloning vector: Transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells," Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81:6466–6470, 1984.
Horwich et al.,"Synthesis of hepadenovirus particles that contain replication-defective duck hepatitis B virus genomes in cultured HuH7 cells," J. Virol.,64:642–650, 1990. Kaneda et al.,"Increased expression of DNA cointroduced with nuclear protein in adult rat liver," Science, 243:375–378, 1989.
Kato et al.,"Expression of hepatitis B virus surface antigen in adult rat liver," J. Biol. Chem.,266:3361–3364, 1991.
Klein et al.,"High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells," Nature, 327:70–73, 1987.
Lowenstein et al.,"The SH2 and SH3 domain-containing protein Grb2 links receptor tyrosine kinases to ras signalling," Cell, 70:431–442, 1992.
Mann et al.,"Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus," Cell, 33:153–159, 1983.
McGahon et al.,"Bcr-Abl maintains resistance of chronic myelogneous leukemia cells to apoptotic cell death," Blood, 83:1179–1187, 1994.
Nicolas and Rubenstein, "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, S. 494–513, 1988.
Nicolau et al.,"Liposomes as carriers for invivo gene transfer and expression," Methods Enzymol.,149:157–176, 1987.
Nicolau and Sene, "Liposome-mediated DNA transfer in eukaryotic cells," Biochem. Biophys. Acta,721:185–190, 1982.
Paskind et al.,"Dependence of moloney murine leukemia virus production on cell growth," Virology, 67:242–248, 1975.
Pendergast et al.,"Bcr-Abl-induced oncogenesis is mediated by direct interaction with the SH2 domain of the GRB-2 adaptor protein," Cell, 75:175–185.
Potter et al.,"Enhancer- dependent expression of human k immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation, " Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161–7165, 1984.
Puil et al.,"Bcr-Abl oncoproteins bind directly to activators of the ras signaling pathway," EMBO J., 13(4):764–773, 1994.
Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In:Rodriguez RL, Denhardt DT, ed. Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth, S. 467–492, 1988.
Rippe et al.,"DNA- mediated gene transfer into adult rat hepatocytes in primary culture," Mol. Cell Biol., 10:689–695, 1990.
Skorski et al., "Phosphatidylinositol-3 kinase activity is regulated by BCR/ABL and is required for the growth of Philadelphia chromosome- positive cells," Blood 86:726–736, 1995.
Skorski et al.,"Negative regulation of p120^gap GTPase promoting activity by p210^Hcr- ^Abl.
Implication for RAS-dependent Philadelphia chromosome positive cell growth," J. Exp. Med., 179:1855–1865, 1994.
Skorski et al.,"Suppression of Philadelphia leukemia cell growth in mice by Bcr-Abl antisense oligodeoxynucleotides," Proc. Natl. Acad. Sci. USA.91:4504–4508, 1994.
Stratford- Perricaudet and Perricaudet, "Gene transfer into animals. the promise of adenovirus," S. 51–61, In.' Human Gene Transfer, Eds, O. Cohen- Haguenauer and M. Boiron, Editions John Libbey Eurotext, Frankreich, 1991. Szoka and Papahadjopoulos, 1978.
Szczylik et al., "Selective inhibition of Leukemia cell proliferation by BCR-ABL antisense oligonucleotides," Science, 253:562–265, 1991.
Tari et al., "Liposomal delivery of methylphosphonate oligodeoxynucleotides in chronic myelogenous leukemia," Blood 84:601–607, 1994.
ten Hoeve et al.,"Tyrosine phosphorylation of CRKL in Philadelphia+ leukemia," Blood, 84:173 1–1736, 1994.
ten Hoeve et al., "Cellular interactions of CRKL, an SH2-SH3 adaptor protein," Cancer Res., 54:2563–2567, 1994.
ten Hoeve et al.,"Isolation and chromosomal localization of CRKL, a human CRK-like gene," Oncogene, 8:2469–2475, 1993.
Temin, "Retrovirus vectors for gene transfer: Efficient integration into and expression of exogenous DNA in vertebrate cell genome," In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, S. 149–188, 1986.
Tooze, 1981.
Tur-Kaspa et al., "Use of electroporation to introduce biologically active foreign genes into primary rat hepatocytes," Mol. Cell Biol.,6:716–718, 1986.
Wagner et al., Science,260:1510–1513, 1993.
Wong et al.,"Appearance of [Beta]-lactamase activity in animal cells upon liposome mediated gene transfer," Gene,10:87–94, 1980.
Wu and Wu, "Evidence for targeted gene delivery to HepG2 hepatoma cells in vitro," Biochemistry,27:887–892, 1988.
Wu and Wu, "Receptor- mediated in vitrogene transfections by a soluble DNA carrier system," d. Biol. Chem., 262:4429–4432, 1987.
Yang et al., "in vivo and in vitrogene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment," Proc. Nat'l Acad Sci. USA, 87:9568–9572, 1990.
Zelenin et al., "High-velocity mechanical DNA transfer of the chloramphenicol acetyltransferase gene into rodent liver, kidney and mammary gland cells in organ explants and in vivo, " FEBS Lett., 280:94–96, 1991.

Claims

Zusammensetzung, umfassend eine Liposomen-Formulierung eines Polynucleotids, das an ein Grb2-kodierendes Polynucleotid hybridisiert, wobei das Liposom aus neutralen Phospholipiden hergestellt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid ein Oligonucleotid mit einer Länge von 8–50 Basen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid ein Oligonucleotid mit der Sequenz ATATTTGGCGATGGCTTC (SEQ ID NO:5) ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei besagtes Liposom das Lipid Dioleoylphosphatidylcholin umfaßt.
Zusammensetzung, umfassend eine Liposomen-Formulierung (i) eines Polynucleotids, das an ein Grb2-kodierendes Polynucleotid hybridisiert, und (ii) eines Polynucleotids, das an ein bcr-abl-kodierendes Polynucleotid hybridisiert, wobei das Liposom aus neutralen Phospholipiden hergestellt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Polynucleotid an die Translationsinitiationsstelle eines Grb2-kodierenden Polynucleotids hybridisiert.
Zusammensetzung, umfassend eine Liposomen-Formulierung eines Expressionskonstrukts, das für ein erstes Polynucleotid kodiert, das an die Translationsstartstelle eines Grb2-kodierenden Polynucleotids hybridisiert, wobei besagtes erstes Polynucleotid unter der Kontrolle eines Promoter steht, der in eukaryotischen Zellen aktiv ist, wobei das Liposom aus neutralen Phospholipiden hergestellt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zum Inhibieren der Proliferation einer Krebszelle in vitro umfassend das In-Kontakt-Bringen der Krebszelle mit der Zusammensetzung.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Krebszelle eine Leukämiezelle ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Krebszelle eine chronische myelogene Leukämiezelle ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung in einem Verfahren zum Inhibieren der Proliferation einer Krebszelle, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Krebszelle mit der Zusammensetzung.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung zum In-Kontakt-Bringen in einem Patienten formuliert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei der Patient ein Mensch ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung an den Menschen in einem Volumen von 0,50–10,0 ml pro Dosis abgegeben werden kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung an den Menschen in einer Menge von 5–30 mg Polynucleotid pro m² abgegeben werden kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung dreimal pro Woche für acht Wochen verabreicht werden kann.